JP4510351B2 - 新規カルボニル還元酵素、その遺伝子、およびその利用法 - Google Patents
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Description
技術分野
本発明は、新規ポリペプチド、該ポリペプチドをコードする遺伝子、該ポリペプチドを発現するための発現ベクター、該発現ベクターを用いて宿主細胞を形質転換して得られた形質転換体、および該形質転換体を用いた医薬・農薬などの合成原料として有用な化合物の製造方法に関する。より詳細には、本発明は、（Ｓ）−６−クロロ−５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルを不斉的に還元して（３Ｒ，５Ｓ）−６−クロロ−３，５−ジヒドロキシヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルを生成する酵素活性を持つ微生物より単離された、該酵素活性を有するポリペプチド、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、および該発現ベクターで形質転換された形質転換体に関する。
本発明はまた、（３Ｒ，５Ｓ）−６−クロロ−３，５−ジヒドロキシヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルの製造方法に関し、この方法は、該形質転換体またはその処理物を（Ｓ）−６−クロロ−５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルと反応させる工程、および生成する（３Ｒ，５Ｓ）−６−クロロ−３，５−ジヒドロキシヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルを採取する工程を包含する。
（３Ｒ，５Ｓ）−６−クロロ−３，５−ジヒドロキシヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルは医薬・農薬等、特にＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤の合成原料として有用な化合物である。
背景技術
（Ｓ）−６−クロロ−５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルを不斉的に還元し、（３Ｒ，５Ｓ）−６−クロロ−３，５−ジヒドロキシヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルを生成する方法としては、ジエチルメトキシボランと水素化ホウ素ナトリウムを用いる方法が唯一報告されている（米国特許第５２，７８３，１３１号）。しかし、該技術には、−７８℃という極低温反応容器を必要とすること、高価な試材を用いることなど課題が多く、実用的な反応処方の開発が望まれている。
発明の開示
本発明者らは、（Ｓ）−６−クロロ−５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルを不斉的に還元し、（３Ｒ，５Ｓ）−６−クロロ−３，５−ジヒドロキシヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルを生成する微生物由来のポリペプチドを見出し、（３Ｒ，５Ｓ）−６−クロロ−３，５−ジヒドロキシヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルを効率良く製造することが可能であることを見出して本発明を完成するに至った。
本発明は、（Ｓ）−６−クロロ−５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルを不斉的に還元して、（３Ｒ，５Ｓ）−６−クロロ−３，５−ジヒドロキシヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルを生成し得るポリペプチドを提供することを課題とする。さらに、本発明は、遺伝子組み換え技術を利用して該ポリペプチドを効率よく生産することを課題とする。また、本発明は、該ポリペプチドとグルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドを同時に高生産する形質転換体を提供し、さらに、該形質転換体を用いた実用的な（３Ｒ，５Ｓ）−６−クロロ−３，５−ジヒドロキシヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルの製造方法を提供することを課題とする。
本発明は、（Ｓ）−６−クロロ−５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルを不斉的に還元して（３Ｒ，５Ｓ）−６−クロロ−３，５−ジヒドロキシヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルを生成する酵素活性を有するポリペプチドに関する。このポリペプチドは、配列表の配列番号１に示したアミノ酸配列、または配列表の配列番号１に示したアミノ酸配列中で少なくとも１つのアミノ酸の置換、挿入、欠失または付加を有するアミノ酸配列を含む。
好ましくは、このポリペプチドは、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属に属する微生物に由来し得る。さらに好ましくは、上記微生物は、キャンディダ・マグノリエ（Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｇｎｏｌｉａｅ）ＩＦＯ０７０５株であり得る。
本発明は、１つの局面で、上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。
本発明は、１つの局面で、（Ｓ）−６−クロロ−５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルを不斉的に還元して（３Ｒ，５Ｓ）−６−クロロ−３，５−ジヒドロキシヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルを生成する酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、配列表の配列番号２に示したヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。
本発明はまた、１つの局面で、上記ポリヌクレオチドを含む発現ベクターに関する。好ましくは、この発現ベクターはプラスミドｐＮＴＣＲであり得る。
上記発現ベクターは、１つの実施態様で、グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含み得る。
好ましくは、上記グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドは、バシラス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）由来のグルコース脱水素酵素であり得る。
好ましくは、上記発現ベクターは、プラスミドｐＮＴＣＲＧであり得る。
本発明はまた、１つの局面で、上記の発現ベクターにより形質転換された、形質転換体に関する。
好ましくは、上記形質転換体は大腸菌であって、より好ましくは、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＴＣＲ）またはＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＴＣＲＧ）であり得る。
本発明はまた、１つの局面で、（３Ｒ，５Ｓ）−６−クロロ−３，５−ジヒドロキシヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルの製造方法に関し、この方法は、上記の形質転換体および／またはそれらの処理物を、（Ｓ）−６−クロロ−５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルと反応させる工程、および生成した（３Ｒ，５Ｓ）−６−クロロ−３，５−ジヒドロキシヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルを採取する工程を包含する。
好ましくは、上記反応させる工程は、補酵素再生系の存在下で行われる。
発明を実施するための最良の形態
以下、詳細に本発明を説明する。本発明に含まれるポリペプチドとしては、以下の式（Ｉ）で表される（Ｓ）−６−クロロ−５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルを不斉的に還元して、以下の式（ＩＩ）で表される（３Ｒ，５Ｓ）−６−クロロ−３，５−ジヒドロキシヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルを生成する酵素活性を有するポリペプチドであればいずれも用いることができる。
このようなポリペプチドとして、例えば、配列表の配列番号１に示したアミノ酸配列を含むポリペプチド、または配列表の配列番号１に示したアミノ酸配列中で少なくとも１つのアミノ酸の置換、挿入、欠失または付加を有するアミノ酸配列またはその一部を含み、かつ（Ｓ）−６−クロロ−５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルを不斉的に還元して（３Ｒ，５Ｓ）−６−クロロ−３，５−ジヒドロキシヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルを生成する酵素活性を有するポリペプチドをあげることができる。
本発明に含まれるポリペプチドは、（Ｓ）−６−クロロ−５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルを不斉的に還元して（３Ｒ，５Ｓ）−６−クロロ−３，５−ジヒドロキシヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルを生成する活性を有する微生物から取得することができる。従って、ポリペプチドの起源として用いられる微生物は特に限定されないが、例えばキャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属酵母が挙げられ、特に好ましいものとしてはキャンディダ・マグノリエ（Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｇｎｏｌｉａｅ）ＩＦＯ０７０５を挙げることができる。この株は、もとは、Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＣＢＳ；Ｏｏｓｔｅｒｓｔｒａａｔ １， Ｐｏｓｔｂｕｓ ２７３，ＮＬ−３７４０ ＡＧ Ｂａａｒｎ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）にＣＢＳ１６６の番号の下で寄託されていた微生物であり、その単離および性質は、「Ｔｈｅ Ｙｅａｓｔｓ，ａ Ｔａｘｏｎｏｍｉｃ Ｓｔｕｄｙ．３ｒｄ ｅｄ．」ｐｐ．７３１（１９８４）に記載されている。本発明のポリペプチドを生産する微生物は、野生株または変異株のいずれでもあり得る。あるいは、細胞融合または遺伝子操作などの遺伝学的手法により誘導された微生物も用いられ得る。遺伝子操作された本発明のポリペプチドを生産する微生物は、例えば、これらの酵素を単離および／または精製して酵素のアミノ酸配列の一部または全部を決定する工程、このアミノ酸配列に基づいてポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を決定する工程、このアミノ酸配列に基づいてポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を得る工程、このヌクレオチド配列を他の微生物に導入して組換え微生物を得る工程、およびこの組換え微生物を培養して、本発明の酵素を得る工程を包含する方法により得られ得る。
本発明のポリペプチドを生産する微生物のための培養培地としては、その微生物が増殖する限り、通常の、炭素源、窒素源、無機塩類、有機栄養素などを含む液体栄養培地が用いられ得る。
本明細書で用いられる用語「微生物の培養物」は、微生物の菌体または菌体を含む培養液を意味し、そして「その処理物」は、微生物の菌体または菌体を含む培養液から抽出または精製などの処理を行って得られた抽出物または精製物を意味する。
本発明に含まれるポリペプチドを有する微生物からの該ポリペプチドの精製は、常法により行い得る。例えば、該微生物の菌体を適当な培地で培養し、培養液から遠心分離により菌体を集める。得られた菌体を例えば、ダイノミル（Ｗｉｌｌｙ Ａ． Ｂａｃｈｏｆｅｎ社製）などで破砕し、遠心分離にて菌体残さを除き、無細胞抽出液を得る。この無細胞抽出液に、例えば、塩析（硫酸アンモニウム沈殿、リン酸ナトリウム沈殿など）、溶媒沈殿（アセトンまたはエタノールなどによる蛋白質分画沈殿法）、透析、ゲル濾過、イオン交換、逆相等のカラムクロマトグラフィー、限外濾過等の手法を単独で、または組み合わせて用いて、ポリペプチドが精製され得る。該酵素活性は、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に、基質（Ｓ）−６−クロロ−５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチル５ｍＭ、補酵素ＮＡＤＰＨ０．３３ｍＭおよび酵素を添加し、３０℃で波長３４０ｎｍの吸光度の減少を測定することにより行い得る。
本発明のポリペプチドは、例えば、配列表の配列番号１に示したアミノ酸配列を含み得る。本発明の配列表の配列番号１に示したアミノ酸配列中で少なくとも１つのアミノ酸の置換、挿入、欠失または付加を有するアミノ酸配列またはその一部を含み、かつ（Ｓ）−６−クロロ−５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルを不斉的に還元して（３Ｒ，５Ｓ）−６−クロロ−３，５−ジヒドロキシヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルを生成する酵素活性を有するポリペプチドは、配列表の配列番号１に示したアミノ酸配列をもつポリペプチドから、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９８９）等に記載の公知の方法に準じて調製することができ、（Ｓ）−６−クロロ−５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルを不斉的に還元して（３Ｒ，５Ｓ）−６−クロロ−３，５−ジヒドロキシヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルを生成する酵素活性を有する限り本発明のポリペプチドに包含される。
本発明に含まれるポリヌクレオチドとしては、上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであればいずれも用いることができるが、例えば、配列表の配列番号２に示したヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、および該ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドをあげることができる。
配列表の配列番号２に示したヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドとは、配列表の配列番号２に示したヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法、あるいはサザンハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるポリヌクレオチドを意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のポリヌクレオチドを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃の条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるポリヌクレオチドをあげることができる。
ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９）等に記載されている方法に準じて行うことができる。ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとして具体的には、配列番号２に示されるヌクレオチド配列と、少なくとも６０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチドをあげることができる。
本発明の（Ｓ）−６−クロロ−５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルを不斉的に還元して（３Ｒ，５Ｓ）−６−クロロ−３，５−ジヒドロキシヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルを生成する酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、コードされるポリペプチドが上記酵素活性を有する限り、配列表の配列番号２に示されるヌクレオチド配列と、少なくとも６０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを包含する。用語「配列の同一性」は、対比される２つのポリヌクレオチド配列が同一であることを意味し、対比される２つのポリヌクレオチド配列間の配列同一性の割合（％）は、対比される２つのポリヌクレオチド配列を最適に整列させた後、同一の核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、またはＩ）が両方の配列で生じて適合した位置の数を得て適合位置数とし、適合した位置の数を比較ポリヌクレオチド総数で除し、そして、この結果に１００を乗じて計算される。配列同一性は、例えば、以下の配列分析用ツールを用いて算出し得る：ＵｎｉｘベースのＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ（Ｐｒｏｇｒａｍ Ｍａｎｕａｌ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ８、１９９４年９月、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、ＵＳＡ５３７１１；Ｒｉｃｅ、Ｐ．（１９９６）Ｐｒｏｇｒａｍ Ｍａｎｕａｌ ｆｏｒ ＥＧＣＧ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｐｅｔｅｒ Ｒｉｃｅ、Ｔｈｅ Ｓａｎｇｅｒ Ｃｅｎｔｒｅ、Ｈｉｎｘｔｏｎ Ｈａｌｌ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＣＢ１０ １ＲＱ、Ｅｎｇｌａｎｄ）およびｔｈｅ ＥｘＰＡＳｙ Ｗｏｒｌｄ Ｗｉｄｅ Ｗｅｂ分子生物学用サーバー（Ｇｅｎｅｖａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ａｎｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｇｅｎｅｖａ、Ｇｅｎｅｖａ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）。
本発明のポリヌクレオチドは、（Ｓ）−６−クロロ−５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルを不斉的に還元して（３Ｒ，５Ｓ）−６−クロロ−３，５−ジヒドロキシヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルを生成する酵素活性を有する微生物より取得することができる。該微生物として、例えばキャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属酵母が挙げられ、特に好ましいものとしてはキャンディダ・マグノリエ（Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｇｎｏｌｉａｅ）ＩＦＯ０７０５を挙げることができる。
以下に、（Ｓ）−６−クロロ−５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルを不斉的に還元して（３Ｒ，５Ｓ）−６−クロロ−３，５−ジヒドロキシヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルを生成する酵素活性を有する微生物より、本発明に含まれるポリヌクレオチドを取得する方法の例を記載するが、本発明はこれに限定されない。
まず、精製した該ポリペプチド、および該ポリペプチドを適当なエンドペプチダーゼで消化することにより得られるペプチド断片の部分アミノ酸配列を、エドマン法により決定する。そして、このアミノ酸配列情報をもとにヌクレオチドプライマーを合成する。次に、該ポリヌクレオチドの起源となる微生物より、通常のヌクレオチド単離法、例えばＨｅｒｅｆｏｒｄ法（Ｃｅｌｌ，１８，１２６１（１９７９））により、該微生物の染色体ＤＮＡを調製する。この染色体ＤＮＡを鋳型として、先述のヌクレオチドプライマーを用いてＰＣＲを行い、該ポリペプチド遺伝子の一部を増幅する。さらに、ここで増幅された該ポリペプチド遺伝子の一部を通常用いられる方法、例えばランダムプライムラベリング法（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１３２，６（１９８３））で標識し、ヌクレオチドプローブを調製する。該微生物の染色体ＤＮＡを適当な制限酵素により切断し、該制限酵素切断断片をベクターに組み込み、これを適当な宿主細胞に導入することにより、該微生物染色体のＤＮＡライブラリーを構築する。先述のヌクレオチドプローブを用いて、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法等により、このＤＮＡライブラリーのスクリーニングを行い、該ポリペプチド遺伝子を含むＤＮＡを得ることができる。このようにして得られた該ポリペプチド遺伝子を含むＤＮＡ断片のヌクレオチド配列は、ジデオキシ・シークエンス法、ジデオキシ・チェイン・ターミネイション法などにより決定することができる。例えば、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）およびＡＢＩ ３７３Ａ ＤＮＡ Ｓｅｑｅｎｃｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）を用いて行われ得る。
本発明のポリヌクレオチドを宿主微生物内に導入し、それをその導入された宿主微生物内で発現させるために用いられるベクターとしては、適当な宿主微生物内で該酵素遺伝子を発現できるものであればいずれもが用いられ得る。このようなベクターとしては、例えば、プラスミドベクター、ファージベクター、コスミドベクター、から選ばれたものが挙げられる。また、他の宿主株との間で遺伝子交換が可能なシャトルベクターであってもよい。このようなベクターは、通常、ｌａｃＵＶ５プロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｔｕｆＢプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ｐＬプロモーター等の制御因子を含み、本発明のポリヌクレオチドと作動可能に連結された発現単位を含む発現ベクターとして好適に用いられ得る。
本願明細書で用いる用語「制御因子」は、機能的プロモーターおよび、任意の関連する転写要素（例えば、エンハンサー、ＣＣＡＡＴボックス、ＴＡＴＡボックス、ＳＰＩ部位など）を有するヌクレオチド配列をいう。
本願明細書で用いる用語「作動可能に連結」は、遺伝子が発現するように、ポリヌクレオチドが、その発現を調節するプロモーター、エンハンサー等の種々の調節エレメントとが宿主細胞中で作動し得る状態で連結されることをいう。制御因子のタイプおよび種類が、宿主細胞に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。
本発明のヌクレオチドを有するベクターを導入する宿主細胞としては、細菌、酵母、糸状菌、植物細胞、動物細胞などがあげられるが、大腸菌が特に好ましい。本発明のヌクレオチドは常法により宿主細胞に導入され得る。宿主細胞として大腸菌を用いる場合、例えば塩化カルシウム法により、本発明のヌクレオチドを導入することができる。
本発明のポリペプチドを用いて（Ｓ）−６−クロロ−５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルを不斉的に還元して（３Ｒ，５Ｓ）−６−クロロ−３，５−ジヒドロキシヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルを生産する場合、ＮＡＤＰＨ、ＮＡＤＨ等の補酵素が必要となる。しかし、酸化された該補酵素を還元型に変換する能力（以後、補酵素再生能と呼ぶ）を有する酵素をその基質とともに、つまり補酵素再生系を本発明のポリペプチドと組み合わせて反応を行うことにより、高価な補酵素の使用量を大幅に削減することができる。補酵素再生能を有する酵素としては、例えば、ヒドロゲナーゼ、ギ酸脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、アルデヒド脱水素酵素、グルコース−６−リン酸脱水素およびグルコース脱水素酵素などを用いることが出来る。好適には、グルコース脱水素酵素が用いられる。このような反応は、補酵素再生系を不斉反応系内に添加することによっても行われ得るが、本発明に含まれる、（Ｓ）−６−クロロ−５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルを不斉的に還元し（３Ｒ，５Ｓ）−６−クロロ−３，５−ジヒドロキシヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルを生成する酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、およびグルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの両者により形質転換せしめられた形質転換体を触媒として用いた場合、補酵素再生能を有する酵素を別に調製し反応系内に添加することなしに、該反応を効率良く実施し得る。このような形質転換体は、（Ｓ）−６−クロロ−５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルを不斉的に還元し（３Ｒ，５Ｓ）−６−クロロ−３，５−ジヒドロキシヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルを生成する酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、およびグルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、同一のベクターに組み込み、これを宿主細胞に導入することにより得られる他、これら２種のポリヌクレオチドを不和合性グループの異なる２種のベクターにそれぞれ組み込み、それらのポリヌクレオチドを同一の宿主細胞に導入することによっても得られ得る。
形質転換体中のグルコース脱水素酵素活性は、１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に、基質グルコース０．１Ｍ、補酵素ＮＡＤＰ２ｍＭおよび酵素を添加し、２５℃で波長３４０ｎｍの吸光度の増加を測定することにより行い得る。
本発明に含まれる形質転換体を用いた（３Ｒ，５Ｓ）−６−クロロ−３，５−ジヒドロキシヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルの生産は以下のように実施され得る。
まず最初に、適当な溶媒中に基質（Ｓ）−６−クロロ−５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチル、ＮＡＤＰ等の補酵素、および該形質転換体の培養物またはその処理物等を添加し、ｐＨ調整下、攪拌して反応させる。この反応は１０℃〜７０℃の温度で行われ、反応中反応液のｐＨは４〜１０に維持する。反応はバッチ方式あるいは連続方式で行われ得る。バッチ方式の場合、反応基質は０．１％から７０％（ｗ／ｖ）の仕込み濃度で添加される。ここで形質転換体の処理物等とは、例えば、粗抽出液、培養菌体、凍結乾燥生物体、アセトン乾燥生物体、あるいはそれらの磨砕物等を意味する。さらにそれらは、酵素自体あるいは菌体のまま公知の手段で固定化されて用いられ得る。また、本反応を行う際、形質転換体として本発明のポリペプチドとグルコース脱水素酵素の両者を生産するものを用いる場合、反応系にさらにグルコースを添加することにより、補酵素の使用量を大幅に減らすことが可能である。
反応で生じた（３Ｒ，５Ｓ）−６−クロロ−３，５−ジヒドロキシヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルは常法により精製され得る。例えば、必要に応じ遠心分離、濾過などの処理を施して菌体等の懸濁物を除去した後、酢酸エチル、トルエン等の有機溶媒で抽出し、硫酸ナトリウム等の脱水剤で脱水後、有機溶媒を減圧下で除去する。さらに晶析またはクロマトグラフィー等の処理を行うことにより、精製され得る。
本反応において、基質となる（Ｓ）−６−クロロ−５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルは、例えば、本明細書に参考として援用される、米国特許第５２，７８３，１３１号に記載の方法で調製され得る。
（Ｓ）−６−クロロ−５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチル、（３Ｒ，５Ｓ）−６−クロロ−３，５−ジヒドロキシヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルの定量、および（３Ｒ，５Ｓ）−６−クロロ−３，５−ジヒドロキシヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルのジアステレオマー比の測定は、高速液体クロマトグラフィー（カラム：ナカライテスク社製ＣＯＳＭＯＳＩＬ ５ＣＮ−Ｒ（ＩＤ４．６×２５０ｍｍ）、溶離液：１ｍＭリン酸水溶液／アセトニトリル＝５／１、流速：０．７ｍｌ／ｍｉｎ、検出：２１０ｎｍ、カラム温度：３０℃）で行い得る。
以上のように、本発明に従えば、本発明に含まれるポリペフチドの効率的生産が可能であり、それを利用することにより、（３Ｒ，５Ｓ）−６−クロロ−３，５−ジヒドロキシヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルの優れた製造法が提供される。以下、実施例で本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。
実施例
以下の実施例において用いた組み換えＤＮＡ技術に関する詳細な操作方法などは、次の成書に記載されている。
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）
（実施例１：不斉還元酵素活性を有するポリペプチドの精製）
以下の方法に従って、キャンディダ・マグノリエ（Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｇｎｏｌｉａｅ）ＩＦＯ０７０５より（Ｓ）−６−クロロ−５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルを不斉的に還元して（３Ｒ，５Ｓ）−６−クロロ−３，５−ジヒドロキシヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルを生成する酵素活性を有するポリペプチドを単一に精製した。
（キャンディダ・マグノリエ（Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｇｎｏｌｉａｅ）ＩＦＯ０７０５株の培養）
３０Ｌジャーファーメンター（丸菱バイオエンジ社製）に下記の組成からなる液体培地１８Ｌを調製し、１２０℃で２０分間蒸気殺菌をおこなった。
培地組成：水道水中の、グルコース ４．０％、イーストエキス ０．５％、ＫＨ２ＰＯ４ ０．１％、（ＮＨ４）２ＨＰＯ４ ０．６５％、ＮａＣｌ ０．１％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．８％、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０６％、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０９％、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ ０．００５％、ＭｎＳＯ４・４〜６Ｈ２Ｏ ０．０１％、アデカノールＬＧ−１０９（日本油脂製）０．０２％、ｐＨ７．０。
この培地に、予め同培地にて前培養しておいたキャンディダ・マグノリエ ＩＦＯ０７０５（Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｇｎｏｌｉａｅ ＩＦＯ０７０５）株の培養液を１８０ｍｌずつ接種し、攪拌回転数２９５ｒｐｍ、通気量５．０ＮＬ／ｍｉｎ、３３℃で、３０％（ｗ／ｗ）水酸化ナトリウム水溶液を滴下することにより下限ｐＨを６．５に調整しながら培養した。培養開始から２２時間後と２５時間後に５５％（ｗ／ｗ）グルコース水溶液６５５ｇを添加し、３０時間培養を行った。
（無細胞抽出液の調整）
上記の培養液１０Ｌから遠心分離により菌体を集め、生理食塩水にて菌体を洗浄した。このようにして，該菌株の湿菌体１３５０ｇを得た。この湿菌体を２７００ｍｌの１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．７）に懸濁した後、２−メルカプトエタノールおよびフッ化フェニルメチルスルホニルをそれぞれ終濃度５ｍＭ、０．１ｍＭとなるよう添加し、菌体をダイノミル（Ｗｉｌｌｙ Ａ． Ｂａｃｈｏｆｅｎ社製）で破砕した。この菌体破砕物から遠心分離にて菌体残渣を除き、無細胞抽出液２８８０ｍｌを得た。
（硫酸アンモニウム分画）
上記で得た無細胞抽出液に６０％飽和となるように硫酸アンモニウムを添加して溶解し、生じた沈殿を遠心分離により除去した（この際無細胞抽出液のｐＨをアンモニア水でｐＨ６．７に維持しながら行った）。先と同様ｐＨ６．７を維持しながら、この遠心上清に７５％飽和となるようさらに硫酸アンモニウムを添加して溶解し、生じた沈殿を遠心分離により集めた。この沈殿を２ｍＭの２−メルカプトエタノールを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、同一緩衝液で１夜透析した。
（ＤＥＡＥ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬカラムクロマトグラフィー）
上記で得られた粗酵素液を、２ｍＭの２−メルカプトエタノールを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で予め平衡化したＤＥＡＥ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ６５０Ｍ（東ソー株式会社製）カラム（５００ｍｌ）に供して酵素活性を有するポリペプチドを吸着させた。同一緩衝液でカラムを洗浄した後、ＮａＣｌ（０Ｍから０．５Ｍまで）のリニアグラジエントにより活性画分を溶出させた。活性画分を集め、２ｍＭの２−メルカプトエタノールを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）にて１夜透析を行った。
（Ｐｈｅｎｙｌ ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムクロマトグラフィー）
上記で得られた粗酵素液に終濃度１Ｍとなるよう硫酸アンモニウムを溶解し（この際粗酵素液のｐＨをアンモニア水でｐＨ７．０に維持しながら行った）、２ｍＭの２−メルカプトエタノールおよび１Ｍの硫酸アンモニウムを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で予め平衡化したＰｈｅｎｙｌ ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）カラム（１４０ｍｌ）に供して酵素活性を有するポリペプチドを吸着させた。同一緩衝液でカラムを洗浄した後、硫酸アンモニウム（１Ｍから０Ｍまで）のリニアグラジエントにより活性画分を溶出させた。活性画分を集め、２ｍＭの２−メルカプトエタノールを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）にて１夜透析を行った。
（Ｂｌｕｅ ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムクロマトグラフィー）
上記で得られた粗酵素液を、２ｍＭの２−メルカプトエタノールを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で予め平衡化したＢｌｕｅ ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−６Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）カラム（４０ｍｌ）に供して酵素活性を有するポリペプチドを吸着させた。同一緩衝液でカラムを洗浄した後、ＮａＣｌ（０Ｍから１Ｍまで）のリニアグラジエントにより活性画分を溶出させた。活性画分を集めた後、２ｍＭの２−メルカプトエタノールを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）にて１夜透析を行った。
（ＳｕｐｅｒＱ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬカラムクロマトグラフィー）
上記で得られた粗酵素液を、２ｍＭの２−メルカプトエタノールを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で予め平衡化したＳｕｐｅｒＱ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ６５０Ｓ（東ソー株式会社製）カラム（１２ｍｌ）に供し、酵素活性を有するポリペプチドを吸着させた。同一緩衝液でカラムを洗浄した後、ＮａＣｌ（０Ｍから０．４Ｍまで）のリニアグラジエントにより活性画分を溶出させた。活性画分を集め、２ｍＭの２−メルカプトエタノールを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）にて１夜透析を行い、電気泳動的に単一な精製ポリペプチド標品を得た。以後、このポリペプチドをＣＲ酵素と呼ぶことにする。
（実施例２：ＣＲ酵素遺伝子のクローニング）
（合成オリゴヌクレオチドプローブの作成）
実施例１で得られた精製ＣＲ酵素を８Ｍ尿素存在下で変性した後、アクロモバクター由来のリシルエンドペプチダーゼ（和光純薬工業株式会社製）で消化し、得られたペプチド断片のアミノ酸配列をＡＢＩ４９２型プロテインシーケンサー（パーキンエルマー社製）により決定した。このアミノ酸配列をもとに、配列番号３および配列番号４に示す２種のヌクレオチドプライマーを常法に従って合成した。
（ＰＣＲによるＣＲ酵素遺伝子の増幅）
キャンディダ・マグノリエ（Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｇｎｏｌｉａｅ）ＩＦＯ０７０５の培養菌体からＨｅｒｅｆｏｒｄ法（Ｃｅｌｌ，１８，１２６１（１９７９））に従って染色体ＤＮＡを抽出した。次に、上記で調整したヌクレオチドプライマーを用い、得られた染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行ったところ、ＣＲ酵素遺伝子の一部と考えられる約３５０ｂｐのヌクレオチド断片が増幅された。
（染色体ＤＮＡライブラリーの作成）
キャンディダ・マグノリエ（Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｇｎｏｌｉａｅ）ＩＦＯ０７０５の染色体ＤＮＡを制限酵素ＡｐａＩで完全消化した後、アガロースゲル電気泳動により分離した。次に、上記で得られた約３５０ｂｐのＤＮＡ断片をプローブとして用い、サザン法（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，９８，５０３（１９７５））により該染色体ＤＮＡ消化物の解析を行った（ヌクレオチドプローブの標識およびその検出はＧｅｎｅ Ｉｍａｇｅｓラベリング・検出システム（アマシャム株式会社製）を用いて行った）。その結果、約５．５ｋｂのヌクレオチド断片が該ヌクレオチドプローブとハイブリダイズすることが判った。
そこで、該消化物をアガロースゲル電気泳動により分離した後、４．３ｋｂから６．２ｋｂのヌクレオチド断片を回収した。これらのヌクレオチド断片をベクタープラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＫＳ（−）（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）のＡｐａＩ部位に挿入した後、大腸菌ＪＭ１０９株に導入し、同菌株の染色体ＤＮＡライブラリーを作成した。
（染色体ＤＮＡライブラリーのスクリーニング）
上記で得られたヌクレオチド断片をプローブとして用い、コロニーハイブリダイゼーション法により上記で作成した染色体ＤＮＡライブラリーのスクリーニングを行った（ヌクレオチドプローブの標識およびその検出はＧｅｎｅ Ｉｍａｇｅｓラベリング・検出システム（アマシャム株式会社製）を用い、実験手順も同システムの取り扱い説明書に従った）。その結果、１個の陽性コロニーが得られた。次に、この陽性コロニーから得られた約５．５ｋｂのＤＮＡが挿入された組換えプラスミドをＥｃｏＲＩおよびＳｐｈＩで二重消化し、先と同様にサザン法で解析した結果、両制限酵素で消化した際に生じる約１．０ｋｂのヌクレオチド断片がハイブリダイズした。そこで、この約１．０ｋｂのヌクレオチド断片をプラスミドｐＵＣ１９（宝酒造株式会社製）のＥｃｏＲＩ−ＳｐｈＩ部位に挿入した組み換えプラスミドｐＵＣ−ＥＳを構築し、ＣＲ酵素遺伝子を含む染色体ＤＮＡクローンとして選択した。
（ヌクレオチド配列の決定）
上記で得られた組換えプラスミドｐＵＣ−ＥＳについて、種々の制限酵素を作用させた際に生じる消化断片の解析を行い、制限酵素切断地図を作成した。次に、この解析の際に得られた各種ヌクレオチド断片をｐＵＣ１９のマルチクローニングサイトに挿入した組換えプラスミドを構築した。これらの組み換えプラスミドを用いて、各々の挿入断片のヌクレオチド配列分析をＡＢＩ ＰＲＩＳＭ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）およびＡＢＩ ３７３Ａ ＤＮＡ Ｓｅｑｅｎｃｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）を用いて行い、目的遺伝子が含まれると予想される約１．０ｋｂのヌクレオチド断片の全ヌクレオチド配列を決定した。そのヌクレオチド配列を図２に示した。また、このヌクレオチド配列中の構造遺伝子部分については、そのヌクレオチド配列から推定されるアミノ酸配列を図１中でヌクレオチド配列の下段に示した。このアミノ酸配列と、精製ＣＲ酵素のリジルエンドペプチダーゼ消化断片の部分アミノ酸配列を比較した結果、精製ＣＲ酵素の部分アミノ酸配列は全て、ヌクレオチド配列から推定されるアミノ酸配列中に存在し、その部分で完全に一致した（図１中のアミノ酸配列の下線部分）。このことから、本遺伝子がＣＲ酵素遺伝子であると判断した。
（実施例３：ＣＲ酵素遺伝子を含む組み換えプラスミドの作製）
ＣＲ酵素の構造遺伝子の開始コドン部分にＮｄｅＩ部位を付加し、終始コドンの直後に新たな終止コドン（ＴＡＡ）とＥｃｏＲＩ切断点を付加し、さらに、同遺伝子内に存在するＳａｌＩ切断点をアミノ酸コードを変更せずに破壊する目的で同遺伝子の５’末端から６ヌクレオチド目のＧをＴに変換した二本鎖ＤＮＡを以下の方法により取得した。実施例２で決定されたヌクレオチド配列を基に、ＣＲ酵素遺伝子の開始コドン部分にＮｄｅＩ部位を付加し、同遺伝子の５’末端から６ヌクレオチド目のＧをＴに変換したＮ末端ヌクレオチドプライマーと、同遺伝子の終始コドンの直後に新たな終止コドン（ＴＡＡ）とＥｃｏＲＩ部位を付加したＣ末端ヌクレオチドプライマーを合成した。これら２つのプライマーのヌクレオチド配列を配列番号５および配列番号６に示した。これら２つの合成ヌクレオチドプライマーを用い、実施例２で得たプラスミドｐＵＣ−ＥＳを鋳型としてＰＣＲにより二本鎖ＤＮＡを増幅した。得られたＤＮＡ断片をＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、プラスミドｐＵＣＮＴ（ＷＯ９４／０３６１３）のｌａｃプロモーターの下流のＮｄｅＩ、ＥｃｏＲＩ部位に挿入することにより、組換えプラスミドｐＮＴＣＲを得た。
（実施例４：ＣＲ酵素遺伝子およびグルコース脱水素酵素遺伝子の両者を同時に含む組換えプラスミドの作製）
バシラス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）ＩＡＭ１０３０株由来のグルコース脱水素酵素（以後、ＧＤＨと呼ぶことにする）の遺伝子の開始コドンから５ヌクレオチド上流に大腸菌のＳｈａｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列（９ヌクレオチド）を、さらにその直前にＥｃｏＲＩ切断点を、また、終止コドンの直後にＳａｌＩ切断点を付加した二本鎖ＤＮＡを、以下の方法により取得した。ＧＤＨ遺伝子のヌクレオチド配列情報を基に、ＧＤＨの構造遺伝子の開始コドンから５ヌクレオチド上流に大腸菌のＳｈａｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列（９ヌクレオチド）を、さらにその直前にＥｃｏＲＩ切断点を付加したＮ末端ヌクレオチドプライマーと、ＧＤＨの構造遺伝子の終始コドンの直後にＳａｌＩ部位を付加したＣ末端ヌクレオチドプライマーを常法に従って合成した。これら２つのヌクレオチドプライマーのヌクレオチド配列を配列番号７および配列番号８に示した。これら２つのヌクレオチドプライマーを用い、プラスミドｐＧＤＫ１（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８６，３８９（１９８９））を鋳型としてＰＣＲにより二本鎖ＤＮＡを合成した。得られたＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩで消化し、実施例３において構築したｐＮＴＣＲのＥｃｏＲＩ、ＳａｌＩ部位（ＣＲ酵素遺伝子の下流に存在する）に挿入した組み換えプラスミドｐＮＴＣＲＧを得た。ｐＮＴＣＲＧの作製法および構造を図２に示す。
（実施例５：組み換え大腸菌の作製）
実施例３で得た組み換えプラスミドｐＮＴＣＲおよび実施例４で得た組み換えプラスミドｐＮＴＣＲＧを用いて大腸菌ＨＢ１０１（宝酒造株式会社製）を形質転換し、各々から組み換え大腸菌ＨＢ１０１（ｐＮＴＣＲ）およびＨＢ１０１（ｐＮＴＣＲＧ）を得た。こうして得られた形質転換体である大腸菌ＨＢ１０１（ｐＮＴＣＲ）およびＨＢ１０１（ｐＮＴＣＲＧ）は、それぞれ、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６８９７およびＦＥＲＭ ＢＰ−６８９８として１９９９年９月２８日付けで、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約に基づいて工業技術院生命工学工業技術研究所（日本国茨城県つくば市東１丁目１−３）に寄託されている。
（実施例６：組み換え大腸菌におけるＣＲ酵素の発現）
実施例５で得た組み換え大腸菌ＨＢ１０１（ｐＮＴＣＲ）を１２０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２×ＹＴ培地で培養し、集菌後、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に懸濁し、超音波破砕により無細胞抽出液を得た。この無細胞抽出液のＣＲ酵素活性を以下のように測定した。ＣＲ酵素活性の測定は、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に、基質（Ｓ）−６−クロロ−５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチル５ｍＭ、補酵素ＮＡＤＰＨ０．３３３ｍＭおよび酵素を添加し、３０℃で波長３４０ｎｍの吸光度の減少を測定することにより行った。この反応条件において、１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＰＨをＮＡＤＰに酸化する酵素活性を１ｕｎｉｔと定義した。この様に測定した無細胞抽出液中のＣＲ酵素活性を比活性として表し、コントロールとしてベクタープラスミドを保持する形質転換体の値と比較した。また、実施例１と同様の方法で調製したキャンディダ・マグノリエ（Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｇｎｏｌｉａｅ）ＩＦＯ０７０５の無細胞抽出液中のＣＲ酵素活性についても同様に比較した。それらの結果を表１に示す。
表１に示されるように、大腸菌ＨＢ１０１（ｐＮＴＣＲ）では、ベクタープラスミドのみの形質転換体である大腸菌ＨＢ１０１（ｐＵＣＮＴ）と比較して明らかなＣＲ酵素活性の増加が見られ、キャンディダ・マグノリエ（Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｇｎｏｌｉａｅ）ＩＦＯ０７０５と比較して約３４倍の活性が得られた。
（実施例７：組換え大腸菌におけるＣＲ酵素およびＧＤＨの同時発現）
実施例５で得た組み換え大腸菌ＨＢ１０１（ｐＮＴＣＲＧ）を、実施例６と同様に処理して得られる無細胞抽出液のＧＤＨ活性を、以下のように測定した。ＧＤＨ活性の測定は１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に、基質グルコース０．１Ｍ、補酵素ＮＡＤＰ２ｍＭ及び酵素を添加し、２５℃で波長３４０ｎｍの吸光度の増加を測定することにより行った。この反応条件において、１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＰをＮＡＤＰＨに還元する酵素活性を１ｕｎｉｔと定義した。また、ＣＲ酵素活性についても実施例５と同様に測定した。このように測定した無細胞抽出液中のＣＲ酵素およびＧＤＨ活性を比活性として表し、大腸菌ＨＢ１０１（ｐＮＴＣＲ）およびベクターのみの形質転換体ＨＢ１０１（ｐＵＣＮＴ）と比較した結果を表２に示す。
表２に示されるように、大腸菌ＨＢ１０１（ｐＮＴＣＲＧ）では、ベクタープラスミドのみの形質転換体である大腸菌ＨＢ１０１（ｐＵＣＮＴ）と比較して、明らかなＣＲ酵素およびＧＤＨ活性の増加が見られた。
（実施例８：ＣＲ酵素遺伝子を導入した組換え大腸菌による（Ｓ）−６−クロロ−５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルからの（３Ｒ，５Ｓ）−６−クロロ−３，５−ジヒドロキシヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルの合成）
実施例５で得た組換え大腸菌ＨＢ１０１（ｐＮＴＣＲ）を、５００ｍｌ容坂口フラスコ中で滅菌した５０ｍｌの２×ＹＴ培地（バクト・トリプトン１．６％（ｗ／ｖ）、バクト・イーストエキス１．０％（ｗ／ｖ）、ＮａＣｌ０．５％（ｗ／ｖ）、ｐＨ７．０）に接種し、３７℃で１６時間振とう培養した。得られた培溶液２５ｍｌにグルコース脱水素酵素（天野製薬株式会社製）６８０ｕｎｉｔ、グルコース５．０ｇ、ＮＡＤＰ ３．０ｍｇ、（Ｓ）−６−クロロ−５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチル４．５ｇを添加し、５Ｍの水酸化ナトリウム水溶液を滴下することによりｐＨ６．５に調整しながら、３０℃で４０時間撹拌した。反応終了後、反応液を酢酸エチルで抽出し、脱溶剤した後抽出物の分析を行ったところ、収率９６．９％で（３Ｒ，５Ｓ）−６−クロロ−３，５−ジヒドロキシヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルが得られた。この際、生成した（３Ｒ，５Ｓ）−６−クロロ−３，５−ジヒドロキシヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルのジアステレオマー過剰率は、９８．２％ｄｅであった。
（Ｓ）−６−クロロ−５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチル、（３Ｒ，５Ｓ）−６−クロロ−３，５−ジヒドロキシヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルの定量、および（３Ｒ，５Ｓ）−６−クロロ−３，５−ジヒドロキシヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルのジアステレオマー比の測定は、高速液体クロマトグラフィー（カラム：ナカライテスク社製 ＣＯＳＭＯＳＩＬ ５ＣＮ−Ｒ（ＩＤ４．６×２５０ｍｍ）、溶離液：１ｍＭリン酸水溶液／アセトニトリル＝５／１、流速：０．７ｍｌ／ｍｉｎ、検出：２１０ｎｍ、カラム温度：３０℃）で行った。
（実施例９：ＣＲ酵素およびグルコース脱水素酵素を同時発現させた組み換え大腸菌による（Ｓ）−６−クロロ−５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルからの（３Ｒ，５Ｓ）−６−クロロ−３，５−ジヒドロキシヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルの合成）
実施例４で得た組換え大腸菌ＨＢ１０１（ｐＮＴＣＲＧ）を、５００ｍｌ容坂口フラスコ中で滅菌した１００ｍｌの２×ＹＴ培地（バクト・トリプトン１．６％（ｗ／ｖ）、バクト・イーストエキス１．０％（ｗ／ｖ）、ＮａＣｌ ０．５％（ｗ／ｖ）、ｐＨ７．０）に接種し、３７℃で１６時間振とう培養した。得られた培養液２５ｍｌにグルコース５．０ｇ、ＮＡＤＰ１．５ｍｇ、（Ｓ）−６−クロロ−５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチル５．０ｇを添加し、５Ｍの水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ６．５に調製しつつ３０℃で２４時間撹拌した。反応終了後、反応液を酢酸エチルで抽出し、脱溶剤した後抽出物の分析を行ったところ、収率９７．２％で（３Ｒ，５Ｓ）−６−クロロ−３，５−ジヒドロキシヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルが得られた。この際、生成した（３Ｒ，５Ｓ）−６−クロロ−３，５−ジヒドロキシヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルのジアステレオマー過剰率は、９８．５％ｄｅであった。
産業上の利用可能性
（Ｓ）−６−クロロ−５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルを不斉的に還元して（３Ｒ，５Ｓ）−６−クロロ−３，５−ジヒドロキシヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルを生成する酵素活性を有するポリペプチド遺伝子のクローニング、およびそのヌクレオチド配列の解析により、該ポリペプチド産生能の高い形質転換体を得ることが可能になった。また、該ポリペプチドおよびグルコース脱水素酵素を同時に高生産する能力を有する形質転換体をも得ることが可能になった。さらに、これらの形質転換体を用いることにより、（Ｓ）−６−クロロ−５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルからの（３Ｒ，５Ｓ）−６−クロロ−３，５−ジヒドロキシヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルの合成を効率良く行うことが可能となった。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明のポリヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す図である。
図２は、組換えプラスミドｐＮＴＣＲＧの作製方法を示す図である。
本発明は、新規ポリペプチド、該ポリペプチドをコードする遺伝子、該ポリペプチドを発現するための発現ベクター、該発現ベクターを用いて宿主細胞を形質転換して得られた形質転換体、および該形質転換体を用いた医薬・農薬などの合成原料として有用な化合物の製造方法に関する。より詳細には、本発明は、（Ｓ）−６−クロロ−５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルを不斉的に還元して（３Ｒ，５Ｓ）−６−クロロ−３，５−ジヒドロキシヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルを生成する酵素活性を持つ微生物より単離された、該酵素活性を有するポリペプチド、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、および該発現ベクターで形質転換された形質転換体に関する。
本発明はまた、（３Ｒ，５Ｓ）−６−クロロ−３，５−ジヒドロキシヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルの製造方法に関し、この方法は、該形質転換体またはその処理物を（Ｓ）−６−クロロ−５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルと反応させる工程、および生成する（３Ｒ，５Ｓ）−６−クロロ−３，５−ジヒドロキシヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルを採取する工程を包含する。
（３Ｒ，５Ｓ）−６−クロロ−３，５−ジヒドロキシヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルは医薬・農薬等、特にＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤の合成原料として有用な化合物である。
背景技術
（Ｓ）−６−クロロ−５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルを不斉的に還元し、（３Ｒ，５Ｓ）−６−クロロ−３，５−ジヒドロキシヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルを生成する方法としては、ジエチルメトキシボランと水素化ホウ素ナトリウムを用いる方法が唯一報告されている（米国特許第５２，７８３，１３１号）。しかし、該技術には、−７８℃という極低温反応容器を必要とすること、高価な試材を用いることなど課題が多く、実用的な反応処方の開発が望まれている。
発明の開示
本発明者らは、（Ｓ）−６−クロロ−５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルを不斉的に還元し、（３Ｒ，５Ｓ）−６−クロロ−３，５−ジヒドロキシヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルを生成する微生物由来のポリペプチドを見出し、（３Ｒ，５Ｓ）−６−クロロ−３，５−ジヒドロキシヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルを効率良く製造することが可能であることを見出して本発明を完成するに至った。
本発明は、（Ｓ）−６−クロロ−５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルを不斉的に還元して、（３Ｒ，５Ｓ）−６−クロロ−３，５−ジヒドロキシヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルを生成し得るポリペプチドを提供することを課題とする。さらに、本発明は、遺伝子組み換え技術を利用して該ポリペプチドを効率よく生産することを課題とする。また、本発明は、該ポリペプチドとグルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドを同時に高生産する形質転換体を提供し、さらに、該形質転換体を用いた実用的な（３Ｒ，５Ｓ）−６−クロロ−３，５−ジヒドロキシヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルの製造方法を提供することを課題とする。
本発明は、（Ｓ）−６−クロロ−５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルを不斉的に還元して（３Ｒ，５Ｓ）−６−クロロ−３，５−ジヒドロキシヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルを生成する酵素活性を有するポリペプチドに関する。このポリペプチドは、配列表の配列番号１に示したアミノ酸配列、または配列表の配列番号１に示したアミノ酸配列中で少なくとも１つのアミノ酸の置換、挿入、欠失または付加を有するアミノ酸配列を含む。
好ましくは、このポリペプチドは、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属に属する微生物に由来し得る。さらに好ましくは、上記微生物は、キャンディダ・マグノリエ（Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｇｎｏｌｉａｅ）ＩＦＯ０７０５株であり得る。
本発明は、１つの局面で、上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。
本発明は、１つの局面で、（Ｓ）−６−クロロ−５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルを不斉的に還元して（３Ｒ，５Ｓ）−６−クロロ−３，５−ジヒドロキシヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルを生成する酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、配列表の配列番号２に示したヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。
本発明はまた、１つの局面で、上記ポリヌクレオチドを含む発現ベクターに関する。好ましくは、この発現ベクターはプラスミドｐＮＴＣＲであり得る。
上記発現ベクターは、１つの実施態様で、グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含み得る。
好ましくは、上記グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドは、バシラス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）由来のグルコース脱水素酵素であり得る。
好ましくは、上記発現ベクターは、プラスミドｐＮＴＣＲＧであり得る。
本発明はまた、１つの局面で、上記の発現ベクターにより形質転換された、形質転換体に関する。
好ましくは、上記形質転換体は大腸菌であって、より好ましくは、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＴＣＲ）またはＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＴＣＲＧ）であり得る。
本発明はまた、１つの局面で、（３Ｒ，５Ｓ）−６−クロロ−３，５−ジヒドロキシヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルの製造方法に関し、この方法は、上記の形質転換体および／またはそれらの処理物を、（Ｓ）−６−クロロ−５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルと反応させる工程、および生成した（３Ｒ，５Ｓ）−６−クロロ−３，５−ジヒドロキシヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルを採取する工程を包含する。
好ましくは、上記反応させる工程は、補酵素再生系の存在下で行われる。
発明を実施するための最良の形態
以下、詳細に本発明を説明する。本発明に含まれるポリペプチドとしては、以下の式（Ｉ）で表される（Ｓ）−６−クロロ−５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルを不斉的に還元して、以下の式（ＩＩ）で表される（３Ｒ，５Ｓ）−６−クロロ−３，５−ジヒドロキシヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルを生成する酵素活性を有するポリペプチドであればいずれも用いることができる。
本発明に含まれるポリペプチドは、（Ｓ）−６−クロロ−５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルを不斉的に還元して（３Ｒ，５Ｓ）−６−クロロ−３，５−ジヒドロキシヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルを生成する活性を有する微生物から取得することができる。従って、ポリペプチドの起源として用いられる微生物は特に限定されないが、例えばキャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属酵母が挙げられ、特に好ましいものとしてはキャンディダ・マグノリエ（Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｇｎｏｌｉａｅ）ＩＦＯ０７０５を挙げることができる。この株は、もとは、Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＣＢＳ；Ｏｏｓｔｅｒｓｔｒａａｔ １， Ｐｏｓｔｂｕｓ ２７３，ＮＬ−３７４０ ＡＧ Ｂａａｒｎ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）にＣＢＳ１６６の番号の下で寄託されていた微生物であり、その単離および性質は、「Ｔｈｅ Ｙｅａｓｔｓ，ａ Ｔａｘｏｎｏｍｉｃ Ｓｔｕｄｙ．３ｒｄ ｅｄ．」ｐｐ．７３１（１９８４）に記載されている。本発明のポリペプチドを生産する微生物は、野生株または変異株のいずれでもあり得る。あるいは、細胞融合または遺伝子操作などの遺伝学的手法により誘導された微生物も用いられ得る。遺伝子操作された本発明のポリペプチドを生産する微生物は、例えば、これらの酵素を単離および／または精製して酵素のアミノ酸配列の一部または全部を決定する工程、このアミノ酸配列に基づいてポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を決定する工程、このアミノ酸配列に基づいてポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を得る工程、このヌクレオチド配列を他の微生物に導入して組換え微生物を得る工程、およびこの組換え微生物を培養して、本発明の酵素を得る工程を包含する方法により得られ得る。
本発明のポリペプチドを生産する微生物のための培養培地としては、その微生物が増殖する限り、通常の、炭素源、窒素源、無機塩類、有機栄養素などを含む液体栄養培地が用いられ得る。
本明細書で用いられる用語「微生物の培養物」は、微生物の菌体または菌体を含む培養液を意味し、そして「その処理物」は、微生物の菌体または菌体を含む培養液から抽出または精製などの処理を行って得られた抽出物または精製物を意味する。
本発明に含まれるポリペプチドを有する微生物からの該ポリペプチドの精製は、常法により行い得る。例えば、該微生物の菌体を適当な培地で培養し、培養液から遠心分離により菌体を集める。得られた菌体を例えば、ダイノミル（Ｗｉｌｌｙ Ａ． Ｂａｃｈｏｆｅｎ社製）などで破砕し、遠心分離にて菌体残さを除き、無細胞抽出液を得る。この無細胞抽出液に、例えば、塩析（硫酸アンモニウム沈殿、リン酸ナトリウム沈殿など）、溶媒沈殿（アセトンまたはエタノールなどによる蛋白質分画沈殿法）、透析、ゲル濾過、イオン交換、逆相等のカラムクロマトグラフィー、限外濾過等の手法を単独で、または組み合わせて用いて、ポリペプチドが精製され得る。該酵素活性は、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に、基質（Ｓ）−６−クロロ−５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチル５ｍＭ、補酵素ＮＡＤＰＨ０．３３ｍＭおよび酵素を添加し、３０℃で波長３４０ｎｍの吸光度の減少を測定することにより行い得る。
本発明のポリペプチドは、例えば、配列表の配列番号１に示したアミノ酸配列を含み得る。本発明の配列表の配列番号１に示したアミノ酸配列中で少なくとも１つのアミノ酸の置換、挿入、欠失または付加を有するアミノ酸配列またはその一部を含み、かつ（Ｓ）−６−クロロ−５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルを不斉的に還元して（３Ｒ，５Ｓ）−６−クロロ−３，５−ジヒドロキシヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルを生成する酵素活性を有するポリペプチドは、配列表の配列番号１に示したアミノ酸配列をもつポリペプチドから、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９８９）等に記載の公知の方法に準じて調製することができ、（Ｓ）−６−クロロ−５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルを不斉的に還元して（３Ｒ，５Ｓ）−６−クロロ−３，５−ジヒドロキシヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルを生成する酵素活性を有する限り本発明のポリペプチドに包含される。
本発明に含まれるポリヌクレオチドとしては、上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであればいずれも用いることができるが、例えば、配列表の配列番号２に示したヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、および該ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドをあげることができる。
配列表の配列番号２に示したヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドとは、配列表の配列番号２に示したヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法、あるいはサザンハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるポリヌクレオチドを意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のポリヌクレオチドを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃の条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるポリヌクレオチドをあげることができる。
ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９）等に記載されている方法に準じて行うことができる。ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとして具体的には、配列番号２に示されるヌクレオチド配列と、少なくとも６０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチドをあげることができる。
本発明の（Ｓ）−６−クロロ−５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルを不斉的に還元して（３Ｒ，５Ｓ）−６−クロロ−３，５−ジヒドロキシヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルを生成する酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、コードされるポリペプチドが上記酵素活性を有する限り、配列表の配列番号２に示されるヌクレオチド配列と、少なくとも６０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを包含する。用語「配列の同一性」は、対比される２つのポリヌクレオチド配列が同一であることを意味し、対比される２つのポリヌクレオチド配列間の配列同一性の割合（％）は、対比される２つのポリヌクレオチド配列を最適に整列させた後、同一の核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、またはＩ）が両方の配列で生じて適合した位置の数を得て適合位置数とし、適合した位置の数を比較ポリヌクレオチド総数で除し、そして、この結果に１００を乗じて計算される。配列同一性は、例えば、以下の配列分析用ツールを用いて算出し得る：ＵｎｉｘベースのＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ（Ｐｒｏｇｒａｍ Ｍａｎｕａｌ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ８、１９９４年９月、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、ＵＳＡ５３７１１；Ｒｉｃｅ、Ｐ．（１９９６）Ｐｒｏｇｒａｍ Ｍａｎｕａｌ ｆｏｒ ＥＧＣＧ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｐｅｔｅｒ Ｒｉｃｅ、Ｔｈｅ Ｓａｎｇｅｒ Ｃｅｎｔｒｅ、Ｈｉｎｘｔｏｎ Ｈａｌｌ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＣＢ１０ １ＲＱ、Ｅｎｇｌａｎｄ）およびｔｈｅ ＥｘＰＡＳｙ Ｗｏｒｌｄ Ｗｉｄｅ Ｗｅｂ分子生物学用サーバー（Ｇｅｎｅｖａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ａｎｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｇｅｎｅｖａ、Ｇｅｎｅｖａ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）。
本発明のポリヌクレオチドは、（Ｓ）−６−クロロ−５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルを不斉的に還元して（３Ｒ，５Ｓ）−６−クロロ−３，５−ジヒドロキシヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルを生成する酵素活性を有する微生物より取得することができる。該微生物として、例えばキャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属酵母が挙げられ、特に好ましいものとしてはキャンディダ・マグノリエ（Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｇｎｏｌｉａｅ）ＩＦＯ０７０５を挙げることができる。
以下に、（Ｓ）−６−クロロ−５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルを不斉的に還元して（３Ｒ，５Ｓ）−６−クロロ−３，５−ジヒドロキシヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルを生成する酵素活性を有する微生物より、本発明に含まれるポリヌクレオチドを取得する方法の例を記載するが、本発明はこれに限定されない。
まず、精製した該ポリペプチド、および該ポリペプチドを適当なエンドペプチダーゼで消化することにより得られるペプチド断片の部分アミノ酸配列を、エドマン法により決定する。そして、このアミノ酸配列情報をもとにヌクレオチドプライマーを合成する。次に、該ポリヌクレオチドの起源となる微生物より、通常のヌクレオチド単離法、例えばＨｅｒｅｆｏｒｄ法（Ｃｅｌｌ，１８，１２６１（１９７９））により、該微生物の染色体ＤＮＡを調製する。この染色体ＤＮＡを鋳型として、先述のヌクレオチドプライマーを用いてＰＣＲを行い、該ポリペプチド遺伝子の一部を増幅する。さらに、ここで増幅された該ポリペプチド遺伝子の一部を通常用いられる方法、例えばランダムプライムラベリング法（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１３２，６（１９８３））で標識し、ヌクレオチドプローブを調製する。該微生物の染色体ＤＮＡを適当な制限酵素により切断し、該制限酵素切断断片をベクターに組み込み、これを適当な宿主細胞に導入することにより、該微生物染色体のＤＮＡライブラリーを構築する。先述のヌクレオチドプローブを用いて、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法等により、このＤＮＡライブラリーのスクリーニングを行い、該ポリペプチド遺伝子を含むＤＮＡを得ることができる。このようにして得られた該ポリペプチド遺伝子を含むＤＮＡ断片のヌクレオチド配列は、ジデオキシ・シークエンス法、ジデオキシ・チェイン・ターミネイション法などにより決定することができる。例えば、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）およびＡＢＩ ３７３Ａ ＤＮＡ Ｓｅｑｅｎｃｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）を用いて行われ得る。
本発明のポリヌクレオチドを宿主微生物内に導入し、それをその導入された宿主微生物内で発現させるために用いられるベクターとしては、適当な宿主微生物内で該酵素遺伝子を発現できるものであればいずれもが用いられ得る。このようなベクターとしては、例えば、プラスミドベクター、ファージベクター、コスミドベクター、から選ばれたものが挙げられる。また、他の宿主株との間で遺伝子交換が可能なシャトルベクターであってもよい。このようなベクターは、通常、ｌａｃＵＶ５プロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｔｕｆＢプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ｐＬプロモーター等の制御因子を含み、本発明のポリヌクレオチドと作動可能に連結された発現単位を含む発現ベクターとして好適に用いられ得る。
本願明細書で用いる用語「制御因子」は、機能的プロモーターおよび、任意の関連する転写要素（例えば、エンハンサー、ＣＣＡＡＴボックス、ＴＡＴＡボックス、ＳＰＩ部位など）を有するヌクレオチド配列をいう。
本願明細書で用いる用語「作動可能に連結」は、遺伝子が発現するように、ポリヌクレオチドが、その発現を調節するプロモーター、エンハンサー等の種々の調節エレメントとが宿主細胞中で作動し得る状態で連結されることをいう。制御因子のタイプおよび種類が、宿主細胞に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。
本発明のヌクレオチドを有するベクターを導入する宿主細胞としては、細菌、酵母、糸状菌、植物細胞、動物細胞などがあげられるが、大腸菌が特に好ましい。本発明のヌクレオチドは常法により宿主細胞に導入され得る。宿主細胞として大腸菌を用いる場合、例えば塩化カルシウム法により、本発明のヌクレオチドを導入することができる。
本発明のポリペプチドを用いて（Ｓ）−６−クロロ−５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルを不斉的に還元して（３Ｒ，５Ｓ）−６−クロロ−３，５−ジヒドロキシヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルを生産する場合、ＮＡＤＰＨ、ＮＡＤＨ等の補酵素が必要となる。しかし、酸化された該補酵素を還元型に変換する能力（以後、補酵素再生能と呼ぶ）を有する酵素をその基質とともに、つまり補酵素再生系を本発明のポリペプチドと組み合わせて反応を行うことにより、高価な補酵素の使用量を大幅に削減することができる。補酵素再生能を有する酵素としては、例えば、ヒドロゲナーゼ、ギ酸脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、アルデヒド脱水素酵素、グルコース−６−リン酸脱水素およびグルコース脱水素酵素などを用いることが出来る。好適には、グルコース脱水素酵素が用いられる。このような反応は、補酵素再生系を不斉反応系内に添加することによっても行われ得るが、本発明に含まれる、（Ｓ）−６−クロロ−５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルを不斉的に還元し（３Ｒ，５Ｓ）−６−クロロ−３，５−ジヒドロキシヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルを生成する酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、およびグルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの両者により形質転換せしめられた形質転換体を触媒として用いた場合、補酵素再生能を有する酵素を別に調製し反応系内に添加することなしに、該反応を効率良く実施し得る。このような形質転換体は、（Ｓ）−６−クロロ−５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルを不斉的に還元し（３Ｒ，５Ｓ）−６−クロロ−３，５−ジヒドロキシヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルを生成する酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、およびグルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、同一のベクターに組み込み、これを宿主細胞に導入することにより得られる他、これら２種のポリヌクレオチドを不和合性グループの異なる２種のベクターにそれぞれ組み込み、それらのポリヌクレオチドを同一の宿主細胞に導入することによっても得られ得る。
形質転換体中のグルコース脱水素酵素活性は、１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に、基質グルコース０．１Ｍ、補酵素ＮＡＤＰ２ｍＭおよび酵素を添加し、２５℃で波長３４０ｎｍの吸光度の増加を測定することにより行い得る。
本発明に含まれる形質転換体を用いた（３Ｒ，５Ｓ）−６−クロロ−３，５−ジヒドロキシヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルの生産は以下のように実施され得る。
まず最初に、適当な溶媒中に基質（Ｓ）−６−クロロ−５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチル、ＮＡＤＰ等の補酵素、および該形質転換体の培養物またはその処理物等を添加し、ｐＨ調整下、攪拌して反応させる。この反応は１０℃〜７０℃の温度で行われ、反応中反応液のｐＨは４〜１０に維持する。反応はバッチ方式あるいは連続方式で行われ得る。バッチ方式の場合、反応基質は０．１％から７０％（ｗ／ｖ）の仕込み濃度で添加される。ここで形質転換体の処理物等とは、例えば、粗抽出液、培養菌体、凍結乾燥生物体、アセトン乾燥生物体、あるいはそれらの磨砕物等を意味する。さらにそれらは、酵素自体あるいは菌体のまま公知の手段で固定化されて用いられ得る。また、本反応を行う際、形質転換体として本発明のポリペプチドとグルコース脱水素酵素の両者を生産するものを用いる場合、反応系にさらにグルコースを添加することにより、補酵素の使用量を大幅に減らすことが可能である。
反応で生じた（３Ｒ，５Ｓ）−６−クロロ−３，５−ジヒドロキシヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルは常法により精製され得る。例えば、必要に応じ遠心分離、濾過などの処理を施して菌体等の懸濁物を除去した後、酢酸エチル、トルエン等の有機溶媒で抽出し、硫酸ナトリウム等の脱水剤で脱水後、有機溶媒を減圧下で除去する。さらに晶析またはクロマトグラフィー等の処理を行うことにより、精製され得る。
本反応において、基質となる（Ｓ）−６−クロロ−５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルは、例えば、本明細書に参考として援用される、米国特許第５２，７８３，１３１号に記載の方法で調製され得る。
（Ｓ）−６−クロロ−５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチル、（３Ｒ，５Ｓ）−６−クロロ−３，５−ジヒドロキシヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルの定量、および（３Ｒ，５Ｓ）−６−クロロ−３，５−ジヒドロキシヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルのジアステレオマー比の測定は、高速液体クロマトグラフィー（カラム：ナカライテスク社製ＣＯＳＭＯＳＩＬ ５ＣＮ−Ｒ（ＩＤ４．６×２５０ｍｍ）、溶離液：１ｍＭリン酸水溶液／アセトニトリル＝５／１、流速：０．７ｍｌ／ｍｉｎ、検出：２１０ｎｍ、カラム温度：３０℃）で行い得る。
以上のように、本発明に従えば、本発明に含まれるポリペフチドの効率的生産が可能であり、それを利用することにより、（３Ｒ，５Ｓ）−６−クロロ−３，５−ジヒドロキシヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルの優れた製造法が提供される。以下、実施例で本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。
実施例
以下の実施例において用いた組み換えＤＮＡ技術に関する詳細な操作方法などは、次の成書に記載されている。
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）
（実施例１：不斉還元酵素活性を有するポリペプチドの精製）
以下の方法に従って、キャンディダ・マグノリエ（Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｇｎｏｌｉａｅ）ＩＦＯ０７０５より（Ｓ）−６−クロロ−５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルを不斉的に還元して（３Ｒ，５Ｓ）−６−クロロ−３，５−ジヒドロキシヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルを生成する酵素活性を有するポリペプチドを単一に精製した。
（キャンディダ・マグノリエ（Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｇｎｏｌｉａｅ）ＩＦＯ０７０５株の培養）
３０Ｌジャーファーメンター（丸菱バイオエンジ社製）に下記の組成からなる液体培地１８Ｌを調製し、１２０℃で２０分間蒸気殺菌をおこなった。
培地組成：水道水中の、グルコース ４．０％、イーストエキス ０．５％、ＫＨ２ＰＯ４ ０．１％、（ＮＨ４）２ＨＰＯ４ ０．６５％、ＮａＣｌ ０．１％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．８％、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０６％、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０９％、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ ０．００５％、ＭｎＳＯ４・４〜６Ｈ２Ｏ ０．０１％、アデカノールＬＧ−１０９（日本油脂製）０．０２％、ｐＨ７．０。
この培地に、予め同培地にて前培養しておいたキャンディダ・マグノリエ ＩＦＯ０７０５（Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｇｎｏｌｉａｅ ＩＦＯ０７０５）株の培養液を１８０ｍｌずつ接種し、攪拌回転数２９５ｒｐｍ、通気量５．０ＮＬ／ｍｉｎ、３３℃で、３０％（ｗ／ｗ）水酸化ナトリウム水溶液を滴下することにより下限ｐＨを６．５に調整しながら培養した。培養開始から２２時間後と２５時間後に５５％（ｗ／ｗ）グルコース水溶液６５５ｇを添加し、３０時間培養を行った。
（無細胞抽出液の調整）
上記の培養液１０Ｌから遠心分離により菌体を集め、生理食塩水にて菌体を洗浄した。このようにして，該菌株の湿菌体１３５０ｇを得た。この湿菌体を２７００ｍｌの１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．７）に懸濁した後、２−メルカプトエタノールおよびフッ化フェニルメチルスルホニルをそれぞれ終濃度５ｍＭ、０．１ｍＭとなるよう添加し、菌体をダイノミル（Ｗｉｌｌｙ Ａ． Ｂａｃｈｏｆｅｎ社製）で破砕した。この菌体破砕物から遠心分離にて菌体残渣を除き、無細胞抽出液２８８０ｍｌを得た。
（硫酸アンモニウム分画）
上記で得た無細胞抽出液に６０％飽和となるように硫酸アンモニウムを添加して溶解し、生じた沈殿を遠心分離により除去した（この際無細胞抽出液のｐＨをアンモニア水でｐＨ６．７に維持しながら行った）。先と同様ｐＨ６．７を維持しながら、この遠心上清に７５％飽和となるようさらに硫酸アンモニウムを添加して溶解し、生じた沈殿を遠心分離により集めた。この沈殿を２ｍＭの２−メルカプトエタノールを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、同一緩衝液で１夜透析した。
（ＤＥＡＥ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬカラムクロマトグラフィー）
上記で得られた粗酵素液を、２ｍＭの２−メルカプトエタノールを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で予め平衡化したＤＥＡＥ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ６５０Ｍ（東ソー株式会社製）カラム（５００ｍｌ）に供して酵素活性を有するポリペプチドを吸着させた。同一緩衝液でカラムを洗浄した後、ＮａＣｌ（０Ｍから０．５Ｍまで）のリニアグラジエントにより活性画分を溶出させた。活性画分を集め、２ｍＭの２−メルカプトエタノールを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）にて１夜透析を行った。
（Ｐｈｅｎｙｌ ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムクロマトグラフィー）
上記で得られた粗酵素液に終濃度１Ｍとなるよう硫酸アンモニウムを溶解し（この際粗酵素液のｐＨをアンモニア水でｐＨ７．０に維持しながら行った）、２ｍＭの２−メルカプトエタノールおよび１Ｍの硫酸アンモニウムを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で予め平衡化したＰｈｅｎｙｌ ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）カラム（１４０ｍｌ）に供して酵素活性を有するポリペプチドを吸着させた。同一緩衝液でカラムを洗浄した後、硫酸アンモニウム（１Ｍから０Ｍまで）のリニアグラジエントにより活性画分を溶出させた。活性画分を集め、２ｍＭの２−メルカプトエタノールを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）にて１夜透析を行った。
（Ｂｌｕｅ ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムクロマトグラフィー）
上記で得られた粗酵素液を、２ｍＭの２−メルカプトエタノールを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で予め平衡化したＢｌｕｅ ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−６Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）カラム（４０ｍｌ）に供して酵素活性を有するポリペプチドを吸着させた。同一緩衝液でカラムを洗浄した後、ＮａＣｌ（０Ｍから１Ｍまで）のリニアグラジエントにより活性画分を溶出させた。活性画分を集めた後、２ｍＭの２−メルカプトエタノールを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）にて１夜透析を行った。
（ＳｕｐｅｒＱ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬカラムクロマトグラフィー）
上記で得られた粗酵素液を、２ｍＭの２−メルカプトエタノールを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で予め平衡化したＳｕｐｅｒＱ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ６５０Ｓ（東ソー株式会社製）カラム（１２ｍｌ）に供し、酵素活性を有するポリペプチドを吸着させた。同一緩衝液でカラムを洗浄した後、ＮａＣｌ（０Ｍから０．４Ｍまで）のリニアグラジエントにより活性画分を溶出させた。活性画分を集め、２ｍＭの２−メルカプトエタノールを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）にて１夜透析を行い、電気泳動的に単一な精製ポリペプチド標品を得た。以後、このポリペプチドをＣＲ酵素と呼ぶことにする。
（実施例２：ＣＲ酵素遺伝子のクローニング）
（合成オリゴヌクレオチドプローブの作成）
実施例１で得られた精製ＣＲ酵素を８Ｍ尿素存在下で変性した後、アクロモバクター由来のリシルエンドペプチダーゼ（和光純薬工業株式会社製）で消化し、得られたペプチド断片のアミノ酸配列をＡＢＩ４９２型プロテインシーケンサー（パーキンエルマー社製）により決定した。このアミノ酸配列をもとに、配列番号３および配列番号４に示す２種のヌクレオチドプライマーを常法に従って合成した。
（ＰＣＲによるＣＲ酵素遺伝子の増幅）
キャンディダ・マグノリエ（Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｇｎｏｌｉａｅ）ＩＦＯ０７０５の培養菌体からＨｅｒｅｆｏｒｄ法（Ｃｅｌｌ，１８，１２６１（１９７９））に従って染色体ＤＮＡを抽出した。次に、上記で調整したヌクレオチドプライマーを用い、得られた染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行ったところ、ＣＲ酵素遺伝子の一部と考えられる約３５０ｂｐのヌクレオチド断片が増幅された。
（染色体ＤＮＡライブラリーの作成）
キャンディダ・マグノリエ（Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｇｎｏｌｉａｅ）ＩＦＯ０７０５の染色体ＤＮＡを制限酵素ＡｐａＩで完全消化した後、アガロースゲル電気泳動により分離した。次に、上記で得られた約３５０ｂｐのＤＮＡ断片をプローブとして用い、サザン法（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，９８，５０３（１９７５））により該染色体ＤＮＡ消化物の解析を行った（ヌクレオチドプローブの標識およびその検出はＧｅｎｅ Ｉｍａｇｅｓラベリング・検出システム（アマシャム株式会社製）を用いて行った）。その結果、約５．５ｋｂのヌクレオチド断片が該ヌクレオチドプローブとハイブリダイズすることが判った。
そこで、該消化物をアガロースゲル電気泳動により分離した後、４．３ｋｂから６．２ｋｂのヌクレオチド断片を回収した。これらのヌクレオチド断片をベクタープラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＫＳ（−）（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）のＡｐａＩ部位に挿入した後、大腸菌ＪＭ１０９株に導入し、同菌株の染色体ＤＮＡライブラリーを作成した。
（染色体ＤＮＡライブラリーのスクリーニング）
上記で得られたヌクレオチド断片をプローブとして用い、コロニーハイブリダイゼーション法により上記で作成した染色体ＤＮＡライブラリーのスクリーニングを行った（ヌクレオチドプローブの標識およびその検出はＧｅｎｅ Ｉｍａｇｅｓラベリング・検出システム（アマシャム株式会社製）を用い、実験手順も同システムの取り扱い説明書に従った）。その結果、１個の陽性コロニーが得られた。次に、この陽性コロニーから得られた約５．５ｋｂのＤＮＡが挿入された組換えプラスミドをＥｃｏＲＩおよびＳｐｈＩで二重消化し、先と同様にサザン法で解析した結果、両制限酵素で消化した際に生じる約１．０ｋｂのヌクレオチド断片がハイブリダイズした。そこで、この約１．０ｋｂのヌクレオチド断片をプラスミドｐＵＣ１９（宝酒造株式会社製）のＥｃｏＲＩ−ＳｐｈＩ部位に挿入した組み換えプラスミドｐＵＣ−ＥＳを構築し、ＣＲ酵素遺伝子を含む染色体ＤＮＡクローンとして選択した。
（ヌクレオチド配列の決定）
上記で得られた組換えプラスミドｐＵＣ−ＥＳについて、種々の制限酵素を作用させた際に生じる消化断片の解析を行い、制限酵素切断地図を作成した。次に、この解析の際に得られた各種ヌクレオチド断片をｐＵＣ１９のマルチクローニングサイトに挿入した組換えプラスミドを構築した。これらの組み換えプラスミドを用いて、各々の挿入断片のヌクレオチド配列分析をＡＢＩ ＰＲＩＳＭ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）およびＡＢＩ ３７３Ａ ＤＮＡ Ｓｅｑｅｎｃｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）を用いて行い、目的遺伝子が含まれると予想される約１．０ｋｂのヌクレオチド断片の全ヌクレオチド配列を決定した。そのヌクレオチド配列を図２に示した。また、このヌクレオチド配列中の構造遺伝子部分については、そのヌクレオチド配列から推定されるアミノ酸配列を図１中でヌクレオチド配列の下段に示した。このアミノ酸配列と、精製ＣＲ酵素のリジルエンドペプチダーゼ消化断片の部分アミノ酸配列を比較した結果、精製ＣＲ酵素の部分アミノ酸配列は全て、ヌクレオチド配列から推定されるアミノ酸配列中に存在し、その部分で完全に一致した（図１中のアミノ酸配列の下線部分）。このことから、本遺伝子がＣＲ酵素遺伝子であると判断した。
（実施例３：ＣＲ酵素遺伝子を含む組み換えプラスミドの作製）
ＣＲ酵素の構造遺伝子の開始コドン部分にＮｄｅＩ部位を付加し、終始コドンの直後に新たな終止コドン（ＴＡＡ）とＥｃｏＲＩ切断点を付加し、さらに、同遺伝子内に存在するＳａｌＩ切断点をアミノ酸コードを変更せずに破壊する目的で同遺伝子の５’末端から６ヌクレオチド目のＧをＴに変換した二本鎖ＤＮＡを以下の方法により取得した。実施例２で決定されたヌクレオチド配列を基に、ＣＲ酵素遺伝子の開始コドン部分にＮｄｅＩ部位を付加し、同遺伝子の５’末端から６ヌクレオチド目のＧをＴに変換したＮ末端ヌクレオチドプライマーと、同遺伝子の終始コドンの直後に新たな終止コドン（ＴＡＡ）とＥｃｏＲＩ部位を付加したＣ末端ヌクレオチドプライマーを合成した。これら２つのプライマーのヌクレオチド配列を配列番号５および配列番号６に示した。これら２つの合成ヌクレオチドプライマーを用い、実施例２で得たプラスミドｐＵＣ−ＥＳを鋳型としてＰＣＲにより二本鎖ＤＮＡを増幅した。得られたＤＮＡ断片をＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、プラスミドｐＵＣＮＴ（ＷＯ９４／０３６１３）のｌａｃプロモーターの下流のＮｄｅＩ、ＥｃｏＲＩ部位に挿入することにより、組換えプラスミドｐＮＴＣＲを得た。
（実施例４：ＣＲ酵素遺伝子およびグルコース脱水素酵素遺伝子の両者を同時に含む組換えプラスミドの作製）
バシラス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）ＩＡＭ１０３０株由来のグルコース脱水素酵素（以後、ＧＤＨと呼ぶことにする）の遺伝子の開始コドンから５ヌクレオチド上流に大腸菌のＳｈａｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列（９ヌクレオチド）を、さらにその直前にＥｃｏＲＩ切断点を、また、終止コドンの直後にＳａｌＩ切断点を付加した二本鎖ＤＮＡを、以下の方法により取得した。ＧＤＨ遺伝子のヌクレオチド配列情報を基に、ＧＤＨの構造遺伝子の開始コドンから５ヌクレオチド上流に大腸菌のＳｈａｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列（９ヌクレオチド）を、さらにその直前にＥｃｏＲＩ切断点を付加したＮ末端ヌクレオチドプライマーと、ＧＤＨの構造遺伝子の終始コドンの直後にＳａｌＩ部位を付加したＣ末端ヌクレオチドプライマーを常法に従って合成した。これら２つのヌクレオチドプライマーのヌクレオチド配列を配列番号７および配列番号８に示した。これら２つのヌクレオチドプライマーを用い、プラスミドｐＧＤＫ１（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８６，３８９（１９８９））を鋳型としてＰＣＲにより二本鎖ＤＮＡを合成した。得られたＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩで消化し、実施例３において構築したｐＮＴＣＲのＥｃｏＲＩ、ＳａｌＩ部位（ＣＲ酵素遺伝子の下流に存在する）に挿入した組み換えプラスミドｐＮＴＣＲＧを得た。ｐＮＴＣＲＧの作製法および構造を図２に示す。
（実施例５：組み換え大腸菌の作製）
実施例３で得た組み換えプラスミドｐＮＴＣＲおよび実施例４で得た組み換えプラスミドｐＮＴＣＲＧを用いて大腸菌ＨＢ１０１（宝酒造株式会社製）を形質転換し、各々から組み換え大腸菌ＨＢ１０１（ｐＮＴＣＲ）およびＨＢ１０１（ｐＮＴＣＲＧ）を得た。こうして得られた形質転換体である大腸菌ＨＢ１０１（ｐＮＴＣＲ）およびＨＢ１０１（ｐＮＴＣＲＧ）は、それぞれ、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６８９７およびＦＥＲＭ ＢＰ−６８９８として１９９９年９月２８日付けで、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約に基づいて工業技術院生命工学工業技術研究所（日本国茨城県つくば市東１丁目１−３）に寄託されている。
（実施例６：組み換え大腸菌におけるＣＲ酵素の発現）
実施例５で得た組み換え大腸菌ＨＢ１０１（ｐＮＴＣＲ）を１２０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２×ＹＴ培地で培養し、集菌後、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に懸濁し、超音波破砕により無細胞抽出液を得た。この無細胞抽出液のＣＲ酵素活性を以下のように測定した。ＣＲ酵素活性の測定は、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に、基質（Ｓ）−６−クロロ−５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチル５ｍＭ、補酵素ＮＡＤＰＨ０．３３３ｍＭおよび酵素を添加し、３０℃で波長３４０ｎｍの吸光度の減少を測定することにより行った。この反応条件において、１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＰＨをＮＡＤＰに酸化する酵素活性を１ｕｎｉｔと定義した。この様に測定した無細胞抽出液中のＣＲ酵素活性を比活性として表し、コントロールとしてベクタープラスミドを保持する形質転換体の値と比較した。また、実施例１と同様の方法で調製したキャンディダ・マグノリエ（Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｇｎｏｌｉａｅ）ＩＦＯ０７０５の無細胞抽出液中のＣＲ酵素活性についても同様に比較した。それらの結果を表１に示す。
（実施例７：組換え大腸菌におけるＣＲ酵素およびＧＤＨの同時発現）
実施例５で得た組み換え大腸菌ＨＢ１０１（ｐＮＴＣＲＧ）を、実施例６と同様に処理して得られる無細胞抽出液のＧＤＨ活性を、以下のように測定した。ＧＤＨ活性の測定は１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に、基質グルコース０．１Ｍ、補酵素ＮＡＤＰ２ｍＭ及び酵素を添加し、２５℃で波長３４０ｎｍの吸光度の増加を測定することにより行った。この反応条件において、１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＰをＮＡＤＰＨに還元する酵素活性を１ｕｎｉｔと定義した。また、ＣＲ酵素活性についても実施例５と同様に測定した。このように測定した無細胞抽出液中のＣＲ酵素およびＧＤＨ活性を比活性として表し、大腸菌ＨＢ１０１（ｐＮＴＣＲ）およびベクターのみの形質転換体ＨＢ１０１（ｐＵＣＮＴ）と比較した結果を表２に示す。
（実施例８：ＣＲ酵素遺伝子を導入した組換え大腸菌による（Ｓ）−６−クロロ−５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルからの（３Ｒ，５Ｓ）−６−クロロ−３，５−ジヒドロキシヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルの合成）
実施例５で得た組換え大腸菌ＨＢ１０１（ｐＮＴＣＲ）を、５００ｍｌ容坂口フラスコ中で滅菌した５０ｍｌの２×ＹＴ培地（バクト・トリプトン１．６％（ｗ／ｖ）、バクト・イーストエキス１．０％（ｗ／ｖ）、ＮａＣｌ０．５％（ｗ／ｖ）、ｐＨ７．０）に接種し、３７℃で１６時間振とう培養した。得られた培溶液２５ｍｌにグルコース脱水素酵素（天野製薬株式会社製）６８０ｕｎｉｔ、グルコース５．０ｇ、ＮＡＤＰ ３．０ｍｇ、（Ｓ）−６−クロロ−５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチル４．５ｇを添加し、５Ｍの水酸化ナトリウム水溶液を滴下することによりｐＨ６．５に調整しながら、３０℃で４０時間撹拌した。反応終了後、反応液を酢酸エチルで抽出し、脱溶剤した後抽出物の分析を行ったところ、収率９６．９％で（３Ｒ，５Ｓ）−６−クロロ−３，５−ジヒドロキシヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルが得られた。この際、生成した（３Ｒ，５Ｓ）−６−クロロ−３，５−ジヒドロキシヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルのジアステレオマー過剰率は、９８．２％ｄｅであった。
（Ｓ）−６−クロロ−５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチル、（３Ｒ，５Ｓ）−６−クロロ−３，５−ジヒドロキシヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルの定量、および（３Ｒ，５Ｓ）−６−クロロ−３，５−ジヒドロキシヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルのジアステレオマー比の測定は、高速液体クロマトグラフィー（カラム：ナカライテスク社製 ＣＯＳＭＯＳＩＬ ５ＣＮ−Ｒ（ＩＤ４．６×２５０ｍｍ）、溶離液：１ｍＭリン酸水溶液／アセトニトリル＝５／１、流速：０．７ｍｌ／ｍｉｎ、検出：２１０ｎｍ、カラム温度：３０℃）で行った。
（実施例９：ＣＲ酵素およびグルコース脱水素酵素を同時発現させた組み換え大腸菌による（Ｓ）−６−クロロ−５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルからの（３Ｒ，５Ｓ）−６−クロロ−３，５−ジヒドロキシヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルの合成）
実施例４で得た組換え大腸菌ＨＢ１０１（ｐＮＴＣＲＧ）を、５００ｍｌ容坂口フラスコ中で滅菌した１００ｍｌの２×ＹＴ培地（バクト・トリプトン１．６％（ｗ／ｖ）、バクト・イーストエキス１．０％（ｗ／ｖ）、ＮａＣｌ ０．５％（ｗ／ｖ）、ｐＨ７．０）に接種し、３７℃で１６時間振とう培養した。得られた培養液２５ｍｌにグルコース５．０ｇ、ＮＡＤＰ１．５ｍｇ、（Ｓ）−６−クロロ−５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチル５．０ｇを添加し、５Ｍの水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ６．５に調製しつつ３０℃で２４時間撹拌した。反応終了後、反応液を酢酸エチルで抽出し、脱溶剤した後抽出物の分析を行ったところ、収率９７．２％で（３Ｒ，５Ｓ）−６−クロロ−３，５−ジヒドロキシヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルが得られた。この際、生成した（３Ｒ，５Ｓ）−６−クロロ−３，５−ジヒドロキシヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルのジアステレオマー過剰率は、９８．５％ｄｅであった。
産業上の利用可能性
（Ｓ）−６−クロロ−５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルを不斉的に還元して（３Ｒ，５Ｓ）−６−クロロ−３，５−ジヒドロキシヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルを生成する酵素活性を有するポリペプチド遺伝子のクローニング、およびそのヌクレオチド配列の解析により、該ポリペプチド産生能の高い形質転換体を得ることが可能になった。また、該ポリペプチドおよびグルコース脱水素酵素を同時に高生産する能力を有する形質転換体をも得ることが可能になった。さらに、これらの形質転換体を用いることにより、（Ｓ）−６−クロロ−５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルからの（３Ｒ，５Ｓ）−６−クロロ−３，５−ジヒドロキシヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルの合成を効率良く行うことが可能となった。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明のポリヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す図である。
図２は、組換えプラスミドｐＮＴＣＲＧの作製方法を示す図である。
Claims (16)
- （Ｓ）−６−クロロ−５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルを不斉的に還元して（３Ｒ，５Ｓ）−６−クロロ−３，５−ジヒドロキシヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルを生成する酵素活性を有するポリペプチドであって、配列表の配列番号１に示したアミノ酸配列、または配列表の配列番号１に示したアミノ酸配列中で少なくとも１つのアミノ酸の置換、挿入、欠失または付加を有するアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
- キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属に属する微生物に由来する、請求項１に記載のポリペプチド。
- 前記微生物が、キャンディダ・マグノリエ（Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｇｎｏｌｉａｅ）ＩＦＯ０７０５株である、請求項２に記載のポリペプチド。
- 請求項１ないし３のいずれかに記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
- （Ｓ）−６−クロロ−５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルを不斉的に還元して（３Ｒ，５Ｓ）−６−クロロ−３，５−ジヒドロキシヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルを生成する酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、配列表の配列番号２に示したヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
- 請求項４および５に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
- プラスミドｐＮＴＣＲである、請求項６記載の発現ベクター。
- グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項６に記載の発現ベクター。
- 前記グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドがバシラス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）由来のグルコース脱水素酵素である、請求項８に記載の発現ベクター。
- プラスミドｐＮＴＣＲＧである、請求項９に記載の発現ベクター。
- 請求項６から１０のいずれかに記載の発現ベクターを用いて宿主細胞を形質転換して得られた、形質転換体。
- 前記宿主細胞が大腸菌である、請求項１１に記載の形質転換体。
- Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＴＣＲ）である、請求項１２に記載の形質転換体。
- Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＴＣＲＧ）である請求項１２に記載の形質転換体。
- 請求項１１から１４のいずれかに記載の形質転換体および／またはそれらの処理物を、（Ｓ）−６−クロロ−５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルと反応させる工程、および生成した（３Ｒ，５Ｓ）−６−クロロ−３，５−ジヒドロキシヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルを採取する工程を包含する、（３Ｒ，５Ｓ）−６−クロロ−３，５−ジヒドロキシヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルの製造方法。
- 前記反応させる工程が、補酵素再生系の存在下で行われる、請求項１５に記載の方法。
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