CN106011095B - 工程化酮还原酶多肽及使用其制备依替米贝中间体的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种工程化酮还原酶多肽及使用其制备依替米贝中间体的方法，在制备依替米贝中间体的过程中，采用本发明的工程化酮还原酶多肽，与现有技术相比，酶用量低、反应时间短、底物浓度高，更加适合产业化应用。
Description
技术领域
本发明属于生物制药和生物转化领域，具体涉及一种工程化酮还原酶多肽及使用其制备依替米贝中间体的方法。
背景技术
依替米贝(Ezetimibe)是一种新型选择性胆固醇吸收抑制剂，由于与现有的他汀类降血脂药物有不同的作用机制，因此具有稳定的市场份额。制备其中间体(S)-3-((S)-5-(4-氟苯基)-5-羟基戊酰基)-4-苯基-2-酮基-噁唑烷(2)的方法有重要的应用价值。可以通过由还原(S)-1-(4-氟苯基)-5-(2-酮-4苯基噁唑烷-3-基)-1,5-二酮戊烷(1)的反应获得：
化学法还原如专利CN 103965089、CN 104402790和文献Journal of LabelledCompounds&Radiopharmaceuticals,45(2),145-155；2002等报道，采用硼烷等高危试剂和极端反应条件，存在应用风险。生物法如专利WO 2010025085和文献Chem.Commun.,2015,51,12328-12331报道，采用醇脱氢酶和酮还原酶催化反应。目前生物法中存在的问题是方法存在酶量较高(2.3％)，反应时间长(16h)，底物浓度低(13％)和有机溶剂用量(25％)较高等问题。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种工程化酮还原酶多肽及使用其制备依替米贝中间体的方法。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：一种能够将底物(S)-1-(4-氟苯基)-5-(2-酮-4苯基噁唑烷-3-基)-1,5-二酮戊烷转化为产物(S)-3-((S)-5-(4-氟苯基)-5-羟基戊酰基)-4-苯基-2-酮基-噁唑烷的工程化酮还原酶多肽，所述的酮还原酶多肽的氨基酸序列与序列2、4、6、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46中的任一序列具有至少90％的同源性。其中，序列2为来自Candida magnoliae的野生型酮还原酶，其他的序列通过易错PCR等随机突变和活性位点盒式突变(CASTing)等定点突变方法获得，突变体获得增强的活性和稳定性，可以通过高通量筛选(HTS)等方法探知，上述的改变氨基酸序列和筛选突变体库方法，均为本领域内的常规技术。
本发明提供了一种编码多肽的多核苷酸。优选地，所述的多核苷酸，其选自序列1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45中的任一序列。
本发明提供了一种表达载体所述表达载体包含与适合指导在宿主细胞中表达的控制序列可操作地连接的多核苷酸。优选地，该多核苷酸的序列为SEQ ID NO：45。该表达载体为pET30a。
本发明还提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包含上述表达载体，如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆、黑曲霉、酿酒酵母和毕赤酵母等。优选地，该宿主细胞为大肠杆菌。
本发明的另一个目的是提供一种所述的酮还原酶多肽生物催化制备依替米贝中间体的方法，所述方法以化合物1为底物，在适于将其还原为化合物2的反应条件下与上述的酮还原酶多肽接触，其中：
所述化合物1的结构式为：
所述化合物2的结构式为：
优选地，所述反应在辅酶和辅酶再生系统的存在下，在pH为6.0～8.0、温度为25℃～30℃的缓冲溶液中进行，其中，所述的辅酶为NADP，所述的辅酶再生系统为葡萄糖和葡萄糖脱氢酶。常见的辅因子再生系统包括但不限于葡萄糖和葡萄糖脱氢酶、甲酸和甲酸脱氢酶、葡萄糖-6-磷酸和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、仲醇(如异丙醇)和仲醇脱氢酶、亚磷酸和亚磷酸脱氢酶、分子氢和氢化酶以及电化学等方法。
进一步优选地，所述的葡萄糖脱氢酶为购自苏州汉酶生物技术有限公司生产的牌号为EW002的葡萄糖脱氢酶。
优选地，所述的还原反应在助溶剂条件下进行，所述的助溶剂为甲苯。
由于上述技术方案的运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：在制备依替米贝中间体的过程中，采用了工程化酮还原酶，克服了现有技术中采用化学法制备中所存在的应用风险；采用生物法制备过程中存在的酶用量高、反应时间长、底物浓度低、有机溶剂用量高的问题，本发明采用了工程化酮还原酶作为生物催化剂，使得整个制备过程中，酶用量低(1％)、反应时间短(12h)，底物浓度高，可达15％，更加适合产业化应用。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的说明，但本发明并不限于以下实施例。实施例中采用的实施条件可以根据具体使用的不同要求做进一步调整，未注明的实施条件为常规实验中的条件。
实施例1(酮还原酶的制备)：
采用常规方法制备获得了酮还原酶催化剂：序列表中1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45的基因片段是由苏州金唯智生物科技有限公司合成，与pET30a(Novagen)质粒的酶切产物连接，转入感受态E.coli BL21(DE3)菌株，筛选得到阳性克隆子，接种到含有抗性的液体LB培养基中，于37℃培养至OD600至0.8，加入诱导剂IPTG，继续培养16小时，离心收集沉淀，加入磷酸盐缓冲液悬浮，冰水浴中超声波破碎10分钟，离心取上清，冷冻得到酮还原酶酶粉。
实施例2(酮还原酶的筛选)
由序列1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45分别在大肠杆菌中表达获得的酮还原酶2mg，葡萄糖脱氢酶(采购自苏州汉酶生物技术有限公司，牌号EW002)2mg，NADP 1mg，底物(S)-1-(4-氟苯基)-5-(2-酮-4苯基噁唑烷-3-基)-1,5-二酮戊烷50mg、葡萄糖50mg加至装有2mL 0.05M三乙醇胺缓冲液的5mL反应器中，30℃1000rpm搅拌，1h后取样，HPLC检测，序列45的转化率和ee均为>99％。因此，采用序列45作为进一步研究对象。
实施例3(酶催化反应)：
向50mL反应三口瓶中依次加入50mg酮还原酶(由序列45在大肠杆菌中表达获得)，10mg葡萄糖脱氢酶(采购自苏州汉酶生物技术有限公司，牌号EW002)和4mg NADP的三乙醇胺缓冲液，5g底物(S)-1-(4-氟苯基)-5-(2-酮-4苯基噁唑烷-3-基)-1,5-二酮戊烷，3.5g葡萄糖，27mL 0.05M pH 7.0三乙醇胺缓冲液，6mL甲苯，温度调节至30℃，900r/min搅拌，15％Na2CO3溶液维持pH至7.0，反应12h，HPLC检测转化率99％，等体积乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，旋蒸得到产品4.8g，含量98％。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种制备依替米贝中间体的方法，其特征在于，所述方法以化合物1为底物，在适于将其还原为化合物2的反应条件下与酮还原酶多肽接触，其中：
所述化合物1的结构式为：
所述化合物2的结构式为：
所述的酮还原酶多肽的氨基酸序列如序列46所示。
2.根据权利要求1所述的制备依替米贝中间体的方法，其特征在于，所述反应在辅酶和辅酶再生系统的存在下，在pH为6.0~8.0、温度为25℃~30℃的缓冲溶液中进行，其中，所述的辅酶为NADP，所述的辅酶再生系统为葡萄糖和葡萄糖脱氢酶。
3.根据权利要求2所述的制备依替米贝中间体的方法，其特征在于，所述的葡萄糖脱氢酶为购自苏州汉酶生物技术有限公司生产的牌号为EW002的葡萄糖脱氢酶。
4.根据权利要求1所述的制备依替米贝中间体的方法，其特征在于，所述的还原反应在助溶剂条件下进行，所述的助溶剂为甲苯。
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