JP4579745B2 - 細胞捕捉装置 - Google Patents

Description

この発明は、細胞に遺伝子や薬剤などを注入する際に使用される細胞固定板（捕捉用プレート）を有するシャーレにより細胞を捕捉する細胞捕捉装置に関し、特に、細胞の吸引を確実におこなうとともに、透過観察を容易におこなうことのできる細胞捕捉装置に関する。

近年、ラフサイエンス分野、特に、再生医療やゲノム創薬などの分野において、針を用いて細胞に遺伝子や薬剤を注入（導入）し、細胞の性質を改変することがおこなわれている。ここで、細胞に遺伝子や薬剤を注入する際には、この細胞が動かないように固定する必要がある。このため、従来では、細胞の外径寸法（１０μｍ〜１００μｍ程度）よりも小さな捕捉孔を複数形成した細胞固定板（以下、「捕捉用プレート」と言う。）を用いて、この細胞固定板の下方から吸引ポンプを通じて、細胞を吸引することにより、捕捉孔内に細胞を固定するようにしている。

ここで、針を介して細胞に直接、遺伝子や薬剤を注入する方法としては、マイクロインジェクション法が開発されており、このマイクロインジェクション法は、１μｍ以下の径の極細の針（先端部の外径、１μｍ、内径、０．５μｍ程度）に薬液を満たし、この針を細胞に突き刺して薬液を細胞内に注入する方法が採用されている。このマイクロインジェクション法による薬液などの導入は顕微鏡下でおこなわれる。

この従来の細胞捕捉装置に使用されるシャーレでは、細胞捕捉する捕捉用プレートと、細胞混濁液を受けるためのウエル部、下側には、細胞を捕捉用プレートの捕捉孔に吸引する吸引ポンプによる吸引チューブの接続部が必要である。このため、従来の細胞シャーレは、この細胞シャーレの所定位置に孔加工を施し、捕捉用プレートを接着してウエル部とし、吸引ポンプによる吸引接続部として切削加工したユニット上に、細胞シャーレを載置する構造が主に採用されていた。

ここで、この従来の細胞捕捉装置の概要について簡単に説明する。図１７は、従来の細胞捕捉装置に使用される細胞シャーレの概略構成図を示している。すなわち、同図に示すように、細胞シャーレ１００ａの内部には、細胞混濁液が貯留されており、この細胞シャーレ１００ａのほぼ中央部には、通孔１１２が形成され、この通孔１１２の位置に捕捉用プレート３００ａが接着などにより接合されている。

また、この捕捉用プレート３００ａには複数の微細孔３３０が形成され、通孔１１２を通じて、下側から吸引ポンプ２００で吸入することにより、この微細孔３３０に細胞を捕捉する構成となっている。この細胞シャーレ１００ａは、顕微鏡により細胞の観察をおこなうようにしている。また、この種の細胞捕捉装置に関する関連技術としては、液体の流路構造を備えた細胞培養セルについての技術が開示されている（例えば、特許文献１、特許文献２参照）。

特開２００４−１８０５５５号公報 特開２００４−１６３号公報

ところが、上述した従来の細胞シャーレ１００ａの場合、この細胞シャーレ１００ａとユニットとの間でリークが発生することがあり、これにより、必要とする細胞を確実に吸引（捕捉）することができないという問題があった。

また、細胞に対する透過観察をおこなう必要があるが、上述したように、従来の細胞シャーレの場合、切削加工によってウエル部と吸引接続部とを一体成型しているため、捕捉用プレートの下面にある切削面を光学的に研磨できないため、捕捉用プレートの下から細胞の透過観察をおこなうことができないという問題があった。

さらに、従来では、インジェクションが可能な捕捉細胞（以下、導入細胞と言う）とインジェクションが不可である余分細胞のインジェクション後の取り扱いについては、特に、考慮されておらず、この導入細胞と余分細胞とを分別できる手法は検討されていないため、このような導入細胞と余分細胞とを分別するための分別方法が望まれている。

本発明に係る請求項１に記載の発明は、捕捉用プレートが内部に配置される細胞捕捉用容器と、前記捕捉用プレートに形成された複数の捕捉孔から細胞の吸引をおこなう吸引手段とを備えた細胞捕捉装置であって、前記細胞捕捉用容器は、底板部の二箇所位置に、第一の貫通孔と第二の貫通孔と、これら第一、第二の貫通孔の下開口部とを連続する溝部とを形成し、前記溝部を底板部の下方側から封着する透明板部材を設け、前記第一の貫通孔の上開口部には捕捉用プレートを配置させ、前記第二の貫通孔の上開口部には、前記吸引手段の吸引チューブを接続する構成とすることを特徴とする。

この請求項１に記載の発明によれば、細胞捕捉用容器は、底板部の二箇所位置に、第一の貫通孔と第二の貫通孔と、これら第一、第二の貫通孔の下開口部とを連続する溝部とを形成し、溝部を底板部の下方側から封着する透明板部材を設け、第一の貫通孔の上開口部には捕捉用プレートを配置させ、第二の貫通孔の上開口部には、前記吸引手段の吸引チューブを接続する構成とする。

また、請求項２に記載の発明は、請求項１に記載の発明において、インジェクション処理された導入細胞以外の余分細胞を回収する余分細胞回収部材をさらに備え、前記余分細胞回収部材は、前記捕捉用プレートの上部位置に装着されるとともに、前記余分細胞を液体の流通により回収する余分細胞回収流路が形成され、当該余分細胞回収流路の一端部に形成された開口部には、液体を吐出する液体吐出手段が接続され、他端部に形成された開口部には、前記液体および余分細胞の吸入をおこなう吸入手段が接続されることを特徴とする。

この請求項２に記載の発明によれば、インジェクション処理された導入細胞以外の余分細胞を回収する余分細胞回収部材をさらに備え、余分細胞回収部材は、捕捉用プレートの上部位置に装着されるとともに、余分細胞を液体の流通により回収する余分細胞回収流路が形成され、当該余分細胞回収流路の一端部に形成された開口部には、液体を吐出する液体吐出手段が接続され、他端部に形成された開口部には、液体および余分細胞の吸入をおこなう吸入手段が接続される。

また、請求項３に記載の発明は、請求項１に記載の発明において、導入細胞を回収するための導入細胞流路と、導入細胞以外の余分細胞を回収するための余分細胞流路とを互いに交差させて構成される多機能流路プレートをさらに備え、前記捕捉用プレートは、前記導入細胞流路と余分細胞流路とがそれぞれ交差する位置に設けられ、前記導入細胞流路部の上流側には、液体を吐出させるための吐出口が形成され、下流側には、前記導入細胞を観察するための観察用ウエル部が設けられ、前記余分細胞流路の上流側には、液体を吐出させるための吐出口が形成され、下流側には、余分細胞を回収する回収手段が設けられることを特徴とする。

この請求項３に記載の発明によれば、導入細胞を回収するための導入細胞流路と、導入細胞以外の余分細胞を回収するための余分細胞流路とを互いに交差させて構成される多機能流路プレートをさらに備え、捕捉用プレートは、導入細胞流路と余分細胞流路とがそれぞれ交差する位置に設けられ、導入細胞流路部の上流側には、液体を吐出させるための吐出口が形成され、下流側には、導入細胞を観察するための観察用ウエル部が設けられ、余分細胞流路の上流側には、液体を吐出させるための吐出口が形成され、下流側には、余分細胞を回収する回収手段が設けられる。

また、請求項４に記載の発明は、請求項３に記載の発明において、前記導入細胞流路の吐出口と、前記余分細胞流路の吐出口とから流出される液体の流出タイミングの可変に基づいて、前記導入細胞と余分細胞との分別回収をおこなうことを特徴とする。

この請求項４に記載の発明によれば、導入細胞流路の吐出口と、余分細胞流路の吐出口とから流出される液体の流出タイミングの可変に基づいて、導入細胞と余分細胞との分別回収をおこなう。

また、請求項５に記載の発明は、請求項１から４の何れか一つに記載の発明において、前記細胞捕捉用容器の底板部に対する捕捉用プレートの接合位置は、前記透明板部材と前記捕捉用プレートに形成された捕捉孔とが近接する位置に選定されることを特徴とする。

この請求項５に記載の発明によれば、細胞捕捉用容器の底板部に対する捕捉用プレートの接合位置は、透明板部材と捕捉用プレートに形成された捕捉孔とが近接する位置に選定される。

請求項１に記載の発明によれば、細胞捕捉用容器は、底板部の二箇所位置に、第一の貫通孔と第二の貫通孔と、これら第一、第二の貫通孔の下開口部とを連続する溝部とを形成し、溝部を底板部の下方側から封着する透明板部材を設け、第一の貫通孔の上開口部には捕捉用プレートを配置させ、第二の貫通孔の上開口部には、吸引手段の吸引チューブを接続する構成となっているので、吸引方式による細胞捕捉の課題であったリークを確実に防止することができるうえ、多数の単一の細胞に対して、定量の物質を、確実且つ高速に導入することができ、さらに、捕捉用プレートの下方から細胞の透過観察を容易且つ確実におこなえるという効果を奏する。

また、細胞捕捉用容器の底板部の裏面を切削加工し、この形成された流路溝を透明板部材で封着する製作工程をおこなうだけなので、細胞を捕捉するための吸引流路を容易にコストが嵩むことなく製作することができるという効果を奏する。

また、細胞捕捉用容器の内部に形成された吸入流路は、上方側に配置された吸入手段により液体を吸入する構成となっているため、透明板部材の下方側に顕微鏡を配置することができ、これによって、細胞を吸入する針と顕微鏡とが接触するなどの不具合を解消することができるという効果を奏する。

また、請求項２に記載の発明によれば、インジェクション処理された導入細胞以外の余分細胞を回収する余分細胞回収部材をさらに備え、余分細胞回収部材は、捕捉用プレートの上部位置に装着されるとともに、余分細胞を液体の流通により回収する余分細胞回収流路が形成され、当該余分細胞回収流路の一端部に形成された開口部には、液体を吐出する液体吐出手段が接続され、他端部に形成された開口部には、液体および余分細胞の吸入をおこなう吸入手段が接続されるので、インジェクション処理がおこなわれた導入細胞と余分細胞との分別を容易且つ確実におこなうことができるという効果を奏する。

また、請求項３に記載の発明によれば、導入細胞を回収するための導入細胞流路と、導入細胞以外の余分細胞を回収するための余分細胞流路とを互いに交差させて構成される多機能流路プレートをさらに備え、捕捉用プレートは、導入細胞流路と余分細胞流路とがそれぞれ交差する位置に設けられ、導入細胞流路部の上流側には、液体を吐出させるための吐出口が形成され、下流側には、導入細胞を観察するための観察用ウエル部が設けられ、余分細胞流路の上流側には、液体を吐出させるための吐出口が形成され、下流側には、余分細胞を回収する回収手段が設けられるので、従来ではおこなわれなかった細胞シャーレ内での導入細胞と余分細胞との分別を容易におこなえるうえ、必要な導入細胞を捕捉用プレートに残し、不要となる余分細胞を効率良く回収することができるという効果を奏する。

また、請求項４に記載の発明によれば、導入細胞流路の吐出口と、余分細胞流路の吐出口とから流出される液体の流出タイミングの可変に基づいて、前記導入細胞と余分細胞との分別回収をおこなうので、導入細胞流路と余分細胞流路との間の遮蔽作用を向上させて両者の細胞（余分細胞と導入細胞）が混在することを確実に防止することができるという効果を奏する。

また、請求項５に記載の発明によれば、細胞捕捉用容器の底板部に対する捕捉用プレートの接合位置は、透明板部材と捕捉用プレートに形成された捕捉孔とが近接する位置に選定されるので、透明板部材と捕捉用プレートとの離間距離を小さくすることができ、これにより培養液（細胞混濁液）が充満する厚みも小さくすることができ、これによって、顕微鏡による観察時に光学分解能の低下を防止することができるという効果を奏する。

以下に添付図面を参照して、この発明に係る細胞捕捉装置に適用される細胞シャーレの好適な実施例を詳細に説明する。なお、以下では、各実施例に係る細胞シャーレの構造の概要および特徴を説明し、これに続いて、この細胞シャーレの構成による機能および細胞シャーレに装着される余分細胞回収部材、多機能流路プレートに関する構成および機能の詳細を説明することとする。

（細胞シャーレの特徴および構造）
ここで、本実施例１に係る細胞シャーレの特徴は、従来の課題であったリークを防止するとともに、捕捉細胞の観察を容易におこなうことにある。このため、本実施例１では、細胞シャーレ１００の上側に吸引システムを設け、上側から細胞を吸引するとともに、さらに細胞シャーレ１００に形成した流路を容易に観察できるように、この流路を、細胞シャーレ１００の下側から透明板部材４００で封着することにより、捕捉細胞の観察を容易におこなえるようにしている。

以下、図１および図２を参照して、本発明に係る細胞捕捉装置に適用される細胞シャーレについて詳細に説明する。ここで、図１は、細胞シャーレ１００の上視図を、図２は、細胞シャーレ１００の縦断面図をそれぞれ示している。

すなわち、同図に示すように、細胞シャーレ１００は、円形状の基体部（底板部１１０）および周壁部１１１とにより成形されており、この細胞シャーレ１００の底板部１１０には、互いに離隔するとともに、上側に向けて開口する２つの貫通孔１２０、１３０と、細胞を吸引するための吸入流路１４０とが形成され、この吸入流路１４０は、貫通孔１２０に通じる第１流路１４１と、第２流路１４２と、貫通孔１３０に通じる第３流路１４３とを連続することにより構成されている。

また、この吸入流路１４０の下側は、透明板部材４００により封着されており、これにより、吸入流路１４０の内部に吸入ポンプ２００からの吸入空気が流通する閉流路が形成されている。なお、本例では吸入流路１４０の吸入方向を上側に設けているが、この吸入流路１４０は、例えば、細胞シャーレ１００の横方向から吸入するようにしてもよい。

また、底板部１１０のほぼ中央部であって、貫通孔１２０の形成位置に対応する部分に捕捉用プレート３００が接着などにより固定されている。具体的に説明すると、貫通孔１２０が捕捉用プレート３００のほぼ中央に位置するように、捕捉用プレート３００の取り付け位置が選定されている。

これは、後述するように、捕捉用プレート３００に形成された複数の微細孔３３０を通じて、この捕捉用プレート３００上にある細胞を確実に吸引するためである。一方、上側に向けて開口する貫通孔１３０には、吸入流路１４０から空気を吸入するための吸入チューブ２１０が継ぎ手部材（図示せず）を介して、接着などにより取り付けられている。

また、捕捉用プレート３００の下方位置であって、貫通孔１２０および第２の流路１４１が形成された位置には、透明板部材４００が貼り付けにより封着されている。このため、透明板部材４００は、細胞シャーレ１００に形成された吸入流路１４０を下側から塞いで流通経路とする機能と、細胞を透過観察するための機能とを備えている。

ここで、図１および図２に示した捕捉用プレート３００の特徴および構造の詳細について、図３および図４を参照して説明する。図３は、細胞シャーレ１００に対する捕捉用プレート３００の取り付け状態を示す斜視図である（表面図）。また、図４は、捕捉用プレート３００の反転状態であり、透明板部材４００側から見た斜視図である（裏面図）。

すなわち、同図に示すように、捕捉用プレート３００は四角形状に構成され、そのほぼ中央部には、上方に向けて開口する矩形状の凹部３１０が形成され、この凹部３１０の下面部３２０には、ランダムに形成された複数の微細孔３３０が穿孔されている。これら複数の微細孔３３０は、吸入流路１４０の第１流路１４１を通じて、吸引ポンプ２００、吸引チューブ２１０を通じて吸引される吸入空気により細胞を捕捉するために形成されている。この吸引により、細胞を捕捉用プレート３００に捕捉することができる。

なお、微細孔３３０の直径は、捕捉の対象とする細胞の大きさに応じて決定される。例えば、直径１０〜２０μm程度の細胞を捕捉対象とする場合、この微細孔３３０の直径は、この細胞の直径より小さい径寸法に設定する。

ここで、捕捉用プレート３００に形成する微細孔３３０は、そのアスペクト比が大きくなるため、この微細孔３３０を形成する部分は薄くせざるを得ない。しかし、捕捉用プレート３００全体を薄くすると強度が弱くなるため、本例では、この捕捉用プレート３００の構成材料をシリコン素材とするとともに、微細孔３３０を形成する部分（下面部３２０）だけを薄くするようにしている。このような構造であれば、捕捉用プレート３００自体の強度を保持することができる。

以上説明したように、本実施例１によれば、細胞シャーレ１００は、底板部１１０の二箇所位置に、一対の貫通孔１２０、１３０と、これら貫通孔１２０、１３０の下開口部とを連続する吸入流路１４０とを形成し、吸入流路１４０を底板部１１０の下方側から封着する透明板部材４００を設け、貫通孔１２０が形成された上開口部位置には捕捉用プレート３００を配置させ、貫通孔１３０の上開口部には、吸引ポンプ２００から通じる吸引チューブ２１０を接続する構成としているので、リークなどの不具合が発生することなく細胞を確実に捕捉することができる。また、透明板部材４００により細胞の透過観察を容易におこなうことができる。

（余分細胞除回収プレートを備えた細胞シャーレ１００の構造）
次に、本発明の細胞捕捉装置に係る実施例２の詳細を説明する。すなわち、図５〜図７に示すように、本実施例２では、細胞シャーレ１００の裏面に形成した吸引経路（吸入流路１４０）の他に、この細胞シャーレ１００に余分な細胞を回収するための余分細胞回収プレート５００を装着したことに特徴がある。

すなわち、捕捉用プレート３００の表面部には、インジェクションされた細胞（以下、この細胞を「導入細胞」と言う。）とインジェクションされていない細胞（以下、この細胞を「余分細胞」と言う。）とが混在しており、このため、本実施例２では、余分細胞回収プレート５００を細胞シャーレ１００内に装着することにより、この余分細胞を効率良く回収し、除去する構成としている。

以下、図５〜図７を参照して余分細胞回収プレート５００の構成および機能の詳細を説明する。ここで、図５は、余分細胞回収プレート５００の構成を示す上視図および縦断面図を示している。また、図６は、余分細胞回収プレート５００を装着した細胞シャーレ１００の平面図を、図７は、縦断面図をそれぞれ示している。図６および図７に示すように、この余分細胞回収プレート５００は、細胞シャーレ１００の底板部１１０に接着剤などにより貼着されている。

すなわち、図５〜図７に示すように、余分細胞回収プレート５００は、細胞シャーレ１００の内径寸法とほぼ同一寸法の四角形型に構成され、その両端部には一対の貫通孔５１０、５２０と、そのほぼ中央部にはインジェクション用の開口部５３０とが形成されるとともに、回収流路５４０とが形成されている。

また、この余分細胞回収プレート５００には、互いに離隔するとともに、上側に向けて開口する２つの貫通孔５１０、５２０と、回収用の液体が流入する回収流路５４０とが形成され、この回収流路５４０は、貫通孔５１０に通じる第１流路５４１と、第２流路５４２と、貫通孔５２０に通じる第３流路５４３とを連続することにより構成されている。

すなわち、この回収流路５４０の下側は、細胞シャーレ１００の底板部１１０の上面により封着されているため、これにより、余分細胞回収プレート５００の内部に回収用の液体を流通させる流路が形成されている。

また、貫通孔５１０は、液体（細胞混濁液、培養液、生理食塩水）の吐出用として機能し、この貫通孔５１０には、洗浄水を吐出するための吐出ポンプ６００の吐出チューブ６１０が連結されている。一方、貫通孔５２０には、吸引ポンプ２００の吸引チューブ２１０が連結されている。

以上のように構成される余分細胞回収プレート５００による余分細胞の回収について、図８−１および図８−２を参照して説明する。すなわち、図８−１は、余分細胞の回収前の状態であり、このとき図８−２に示すように、吐出ポンプ６００から供給された生理食塩水が吐出チューブ６１０を通じて、貫通孔５１０に通じる第１流路５４１と、第２流路５４２と、貫通孔５２０に通じる第３流路５４３を流通することにより、捕捉用プレート３００付近にある余分細胞を流し、次いで、吸引チューブ２１０を通じて外部に回収する。

これにより、必要な導入細胞を捕捉用プレート３００に残して、不要となる余分細胞を効率良く回収することができる。なお、吐出ポンプ６００から回収用の液体として吐出する液体（細胞混濁液、培養液、生理食塩水）は、インジェクション用に使用した液体と同一の液体を使用することとする。

ここで、実施例２として示してた余分細胞回収プレート５００は、主に余分細胞を回収する機能を備えているが、これ以外にも、単に細胞に対するインジェクションをおこなう際に細胞シャーレ１００内に液体（細胞混濁液、培養液、生理食塩水）を供給するためのインジェクション用の液体供給装置としても利用することができる。

以上説明したように、本実施例２によれば、細胞シャーレ１００の内部に不要となる余分細胞を回収するための余分細胞回収プレート５００を装着する構成としているので、従来ではおこなわれなかった細胞シャーレ１００内での導入細胞と余分細胞との分別を容易におこなえるうえ、必要な導入細胞を捕捉用プレート３００に残し、不要となる余分細胞を効率良く回収することができる。

（余分細胞回収プレートの変形例１）
以下、図９−１〜図９−３を参照して、本実施例２における余分細胞回収プレートの各変形例について詳細に説明する。図９−１は、余分細胞回収プレート５００ａの構造である第１例を示している。図９−１に示すように、本例では、貫通孔５１０から吐出された捕捉用プレート３００までに至る流路を二股上の流路５４４とし、これら複数の流路５４４から液体を供給する（吐出側の流路を複数にする）ことによって、捕捉用プレート３００が配置された付近で渦状の流路を形成する構成とすることに特徴がある。

すなわち、これによって、複数の流路５４４から液体が流入されることから、捕捉用プレート３００の近辺で渦状の流れが発生し、これにより、余分細胞を除去することができ、この結果、必要な細胞のみを捕捉することができる。

（余分細胞回収プレートの変形例２）
図９−２は、余分細胞回収プレートの構造である第２例を示している。すなわち、本例では、図９−２に示すように、吐出用の貫通孔５１１、５１１を２個設け、これら２個の貫通孔５１１、５１１にそれぞれ接続された流路５４５、５４５を二股状に形成する構成としている。この第２例では、両方の貫通孔５１１、５１１を通じて流路が形成されるため、これによって、二方向の流路５４５、５４５から流れる液体の勢いが増大することから、これにより、余分細胞の除去をより効果的におこなうことができる。

ここで、この場合、それぞれの二カ所の貫通孔５１１、５１１から液体の吐出をおこなう際には、それぞれの液体の特性を変えるようにしてもよい。例えば濃度、温度などの条件を変えることで、より渦様の流れを生じやすくすることができる。

（余分細胞回収プレートの変形例３）
図９−３は、余分細胞回収プレートの構造である第３例を示している。すなわち、図９−３に示すように、本例では、捕捉用プレート３００に至る手前の流路の位置に、複数の凸部５４７を設けていることに特徴がある。すなわち、第１流路５４１から流入する水は複数の凸部５４７に到達した際には、これら複数の凸部５４７が流路の障害物となり、流路が分散するため、捕捉用プレート３００付近で渦様の流れを生じ、これにより、余分細胞の除去をより効果的におこなうことができる。

（多機能流路プレート９００の構成）
次に、図１０を参照して、本発明の細胞捕捉装置に係る実施例３の詳細を説明する。図１０は、多機能流路プレート９００の構成を示す斜視図を示している。同図に示すように、この実施例３においては、細胞捕捉装置に多機能流路プレート９００を備える構成としたことに特徴があり、この多機能流路プレート９００は、（１）細胞、培養液などを供給する機能と、（２）余分細胞を回収する機能と、（３）インジェクションされた細胞（導入細胞）を流すための機能と、（４）導入細胞を回収する機能とを備えている。

すなわち、同図に示すように、多機能流路プレート９００は、導入細胞を流して、この導入細胞を回収するための導入細胞流路部９１０と、余分細胞を流して、この余分細胞を回収するための余分細胞流路部９３０とがほぼ直交する十字型に構成されている。捕捉用プレート３００は、導入細胞流路部９１０と余分細胞流路部９３０とがそれぞれ交差する位置（中央部）に設けられている。

また、導入細胞流路部９１０の上流側端部（図１０の上側）には、液体が吐出される吐出口９２０が形成され、下流側端部（図１０の下側）には、円形状に形成された、細胞を観察するための観察用ウエル部８００が設けられている。この観察用ウエル部８００には、吐出口９２０から吐出された液体により、捕捉用プレート３００から流された導入細胞が流れ込むようになっており、この観察用ウエル部８００の下面には、ガラス材などが使用された透明板部材４１０が貼り付け固定されている。これにより、この透明板部材４１０を介して、観察用ウエル部８００内に流れ込んだ導入細胞の透過観察や蛍光観察を容易におこなうことができる。

また、捕捉用プレート３００と観察用ウエル部８００との間には、捕捉用プレート３００の上面位置から上方に向けて傾斜する第一傾斜部９１２と、この第一傾斜部９１２の頂部から観察用ウエル部８００に向けて下方に傾斜する第二傾斜部９１３とが設けられている。つまり、捕捉用プレート３００から観察用ウエル部８００に至る流路の途中に、これら第一、二傾斜部９１２、９１３を設けることにより、観察用ウエル部８００に流れ込んだ導入細胞が、この観察用ウエル部８００から外部に逆流することを有効に阻止する構成としている。

さらに、この多機能流路プレート９００において、余分細胞と導入細胞とが混在しないように、導入細胞回収のための流路と余分細胞除去のための流路とが交差する位置には、捕捉用プレート３００に向かう程、その位置が低下する段差９１１が設けられている。

また、余分細胞流路部９３０の上流側端部（図１０の左側）には、液体が吐出される吐出口９４０が形成され、下流側端部（図１０の右側）には、余分細胞を回収するための余分細胞回収口９５０が設けられている。この余分細胞回収口９５０には、吐出口９４０から吐出された液体により、捕捉用プレート３００付近に存在する余分細胞が流れ込むようになっている。

ここで、この多機能流路プレート９００による導入細胞および余分細胞の回収をおこなう際には、導入細胞を回収する場合と、余分細胞を回収する場合とでは、液体を流すタイミングを時間差でおこなうことにより実施する。なお、細胞シャーレ１００内に細胞や培養液を供給する場合は、液体吐出口９２０或は液体吐出口９４０のいずれか一方の液体吐出口を利用することとなる。

（余分細胞／導入細胞の混在を防止する遮蔽流路）
図１１は、余分細胞と導入細胞の混在を防止するための遮蔽流路を示す上視図である。すなわち、本実施例３では、図１１に示すように、余分細胞除去用の液体吐出口９２０の両端部に、それぞれ洗浄水を流出する吐出口９１５を形成することに特徴がある。具体的に説明すると、余分細胞除去工程をおこなう前に、先ず、左右に設けた一対の液体吐出口９１５から液体を流すようにしている。

これにより、所謂、遮蔽流路（流れのカーテン）が形成されるため、これにより、導入細胞用の吐出口９２０や観察用ウエル部８００回収用の吐出口９４０に余分細胞が流れることを確実に防止することができる。なお、この時、導入細胞を流すときの流路速度は、余分細胞を流すときの流路速度よりも速い速度とすることで、より遮蔽効果を向上させて両者の細胞（余分細胞と導入細胞）が混在することを防止することができる。

（導入細胞回収用の回収ポンプ構造）
次に、図１２および図１３を参照して、多機能流路プレート９００による導入細胞の回収方法の一例を説明する。ここで、図１２は、図１１の要部縦断面図であり、導入細胞の回収前の状態を示している。また、図１３は、同じく導入細胞の回収時の状態を示している。すなわち、本例では、ウエル部８００の一端側に導入細胞を回収するための回収用ポンプ９６０を設けており、この回収用ポンプ９６０のよる吸入圧力を可変（正圧／負圧）することにより、導入細胞と余分細胞との混在を防止する構造としている。具体的に説明すると、導入細胞の回収前では、図１２に示すように、回収用ポンプ９６０による吸入圧力を正圧とする制御をおこなう。

この場合、同図に示すように、ウエル部８００の観察位置まで液体は侵入することはなく、これにより、このウエル部８００まで液体が流入することを防止することができる。この結果、導入細胞と余分細胞との分別を確実におこなうことができる。一方、導入細胞を回収する時には、回収用ポンプ９６０による吸入圧力を正圧から負圧に切り換える制御をおこなう。これにより、図１３に示すように、液体吐出口９２０（図１１）から吐出された細胞混濁液とともに、導入細胞がウエル部８００内に流れ込み、この導入細胞に対する観察をおこなうことができる。

次に、図１４を参照して、本発明の実施例４の詳細について説明する。本実施例４では、細胞シャーレ１００に対する捕捉用プレート３００の固定方法（捕捉用プレート３００の接合向き）に特徴がある。すなわち、細胞捕捉装置に備えた顕微鏡によって細胞の透過観察をおこなう際には、捕捉用プレート３００と顕微鏡の対物レンズとの間には、捕捉用プレート３００の凹部３１０内に存在する細胞混濁液（培養液）および空気と透明板部材４００とが介在するが、この透明板部材４００と捕捉用プレート３００との間に気泡があると、良好な細胞観察がおこなえないため、透明板部材４００と捕捉用プレート３００との間は、培養液が充満した状態で観察をおこなうようにしている。

ところで、顕微鏡により観察する際の光学分解能は培養液の厚さに影響されるため、捕捉用プレート３００の凹部３１０内に培養液が充満していると、光学分解能が低下することとなる。このような理由から、培養液の厚さ（充満量）を少なくすれば光学分解能の低下を防止することができる。この点に着目し、本実施例４では、細胞シャーレ１００の裏面に封着した透明板部材４００と捕捉用プレート３００との離間距離がなるべく短くなる構成としている。

具体的に説明すると、図１４に示すように、前述した実施例１に示す捕捉用プレート３００の接合向きとは異なり、細胞シャーレ１００の底板部１１０面側に捕捉用プレート３００の下面部３２０を当接させる構成としている。この実施例４の構成によると、透明板部材４００と捕捉用プレート３００との距離を短くすることができ、これにより培養液が充満する厚みを小さくすることができる。この結果、観察時に培養液の光学分解能の低下を防止することができる。

ここで、捕捉用プレート３００の下面部を細胞シャーレ１００の底板部１１０に僅かでも埋め込むようすることで、透明板部材４００と捕捉用プレート３００との距離を短くする構成としてもよい。

以上説明したように、本実施例４では、細胞シャーレ１００の底板部１１０面側に捕捉用プレート３００の下面部を当接させる構成としているので、透明板部材４００と捕捉用プレート３００との離間距離を小さくすることができ、これにより培養液が充満する厚みも小さくすることができ、これによって、顕微鏡による観察時に光学分解能の低下を防止することができる。

次に、図１５−１および図１５−２を参照して、本発明に係る実施例５の詳細について説明する。図１５−１は、本実施例５に係る捕捉用プレート３００の細胞シャーレ１００に対する接合方向を示す概略図を、図１５−２は、従来の捕捉用プレート３００の細胞シャーレ１００に対する接合方向を示す概略図をそれぞれ示している。

すなわち、従来では、図１５−２に示すように、細胞シャーレ１００の底板部１１０に対してほぼ平行位置となるように、捕捉用プレート３００を設けているが、この場合、余分細胞の回収時、凹部３１０を乗り越えて回収される余分細胞は、凹部３１０の壁面により抜け出るのに多少の障害がある。

この点に着目し、本実施例５では、図１５−１に示すように、細胞シャーレ１００における捕捉用プレート３００の設置方向を、液体の流れに対して向きが略４５度の位置となるように設定している（液体の流路に対して斜めに回転させて設置）。すなわち、同図に示すように、捕捉用プレート３００の向きを略４５度となるように設定することで凹部３１０の壁部の角度が小さくなるため、余分細胞を除去しやすくなる。

以上説明したように、本実施例５では細胞シャーレ１００における捕捉用プレート３００の設置方向を、液体の流れに対して向きが略４５度の位置となるように設定しているので、余分細胞の除去（回収）や導入細胞の回収時の流れが一直線上となり、これによって、余分細胞の回収効率を向上させることができるうえ、余分な細胞の回収不良などを防止することができる。

次に、図１６を参照して、本発明に係る実施例６の詳細について説明する。図１６は、本実施例６に係る捕捉用プレート３００の構成概略図を示している。すなわち、同図に示すように、本実施例６では捕捉用プレート３００に形成された凹部の一方の肉厚部分を薄肉状とする加工を施すことにより、凹部の一方が液体の流れを流通させる凹部３１１としていることに特徴がある。

本実施例６による捕捉用プレート３００の場合、捕捉用プレート３００の厚い部分を薄くするように加工を施して捕捉用プレート３００上に流路を形成することにより、余分細胞の除去（回収）や導入細胞の回収時の流れを一直線上とするとともに、これによって、余分細胞や導入細胞の回収効率を向上させることができる。

以上説明したように、本実施例６では捕捉用プレート３００の内部に形成された凹部の一方には、液体が流通する流路方向に向けた流通経路が形成されるので、余分細胞の除去（回収）や導入細胞の回収時の流れが一直線上となり、これによって、余分細胞および導入細胞の回収効率を向上させることができる。

（付記１）捕捉用プレートが内部に配置される細胞捕捉用容器と、前記捕捉用プレートに形成された複数の捕捉孔から細胞の吸引をおこなう吸引手段とを備えた細胞捕捉装置であって、
前記細胞捕捉用容器は、底板部の二箇所位置に、第一の貫通孔と第二の貫通孔と、これら第一、第二の貫通孔の下開口部とを連続する溝部とを形成し、
前記溝部を底板部の下方側から封着する透明板部材を設け、
前記第一の貫通孔の上開口部には前記捕捉用プレートを配置させ、前記第二の貫通孔の上開口部には、前記吸引手段の吸引チューブを接続する構成とすることを特徴とする細胞捕捉装置。

（付記２）インジェクション処理された導入細胞以外の余分細胞を回収する余分細胞回収部材をさらに備え、前記余分細胞回収部材は、前記捕捉用プレートの上部位置に装着されるとともに、前記余分細胞を液体の流通により回収する余分細胞回収流路が形成され、当該余分細胞回収流路の一端部に形成された開口部には、液体を吐出する液体吐出手段が接続され、他端部に形成された開口部には、前記液体および余分細胞の吸入をおこなう吸入手段が接続されることを特徴とする付記１に記載の細胞捕捉装置。

（付記３）前記捕捉用プレートに至るまでの回収流路の途中には、当該回収流路を流通する液体の流路を妨げる障害物が設けられることをことを特徴とする付記２に記載の細胞捕捉装置。

（付記４）前記捕捉用プレートに至るまでの回収流路は、複数の流路に分岐されていることを特徴とする付記２に記載の細胞捕捉装置。

（付記５）前記捕捉用プレートに至るまでの回収流路は、複数の流路に分岐されるとともに、前記回収流路を流通する液体が捕捉用プレートに至る際には、前記複数の流路が１つの統合した流路となることを特徴とする付記２に記載の細胞捕捉装置。

（付記６）前記捕捉用プレートに至るまでの回収流路の途中には、当該回収流路を流通する液体の流路を妨げる複数の凸部が形成されていることを特徴とする付記２に記載の細胞捕捉装置。

（付記７）前記捕捉用プレートの内部に設けられた凹部面の一端側には、前記液体が流通する流路方向に向けた流通経路が形成されていることを特徴とする付記２に記載の細胞捕捉装置。

（付記８）導入細胞を回収するための導入細胞流路と、導入細胞以外の余分細胞を回収するための余分細胞流路とを互いに交差させて構成される多機能流路プレートをさらに備え、
前記捕捉用プレートは、前記導入細胞流路と余分細胞流路とがそれぞれ交差する位置に設けられ、前記導入細胞流路部の上流側には、液体を吐出させるための吐出口が形成され、下流側には、前記導入細胞を観察するための観察用ウエル部が設けられ、前記余分細胞流路の上流側には、液体を吐出させるための吐出口が形成され、下流側には、余分細胞を回収する回収手段が設けられることを特徴とする付記１に記載の細胞捕捉装置。

（付記９）前記導入細胞流路の吐出口と、前記余分細胞流路の吐出口とから流出される液体の流出タイミングの可変に基づいて、前記導入細胞と余分細胞との分別回収をおこなうことを特徴とする付記８に記載の細胞捕捉装置。

（付記１０）前記導入細胞流路と余分細胞流路とがそれぞれ交差する位置には段差が設けられることを特徴とする付記８に記載の細胞捕捉装置。

（付記１１）前記導入細胞流路の下流側であって、前記捕捉用プレートから前記観察用ウエル部に至る流路の途中には、前記観察用ウエル部に流入した導入細胞の逆流を阻止する傾斜部が設けられることを特徴とする付記８に記載の細胞捕捉装置。

（付記１２）前記導入細胞流路の吐出口の両側位置に、第一の吐出口および第二の吐出口を形成し、前記導入細胞の回収時には、前記吐出口からの液体の流出以前に、前記第一、二の吐出口の両者から液体を流出することを特徴とする付記８に記載の細胞捕捉装置。

（付記１３）前記細胞捕捉用容器の底板部に対する捕捉用プレートの接合位置は、前記透明板部材と前記捕捉用プレートに形成された捕捉孔とが近接する位置に選定されることを特徴とする付記１〜１２のいずれか一つに記載の細胞捕捉装置。

（付記１４）前記細胞捕捉用容器の内部に設置される捕捉用プレートの配置方向は、前記余分細胞回収部材により流通される液体流路に対して、ほぼ４５度の位置となるように設定されていることを特徴とする付記２〜１３の何れか一つに記載の細胞捕捉装置。

以上のように、本発明に係る細胞シャーレは、細胞に薬剤などを注入する際に使用される細胞固定板（捕捉用プレート）を備えた細胞捕捉装置に関し、特に、細胞の吸引を確実におこなうことのできる細胞捕捉装置に有用である。

本実施例１に係る細胞シャーレの構成を示す上視図である。 本実施例１に係る細胞シャーレの構成を示す縦断面図である。 捕捉用プレートの構成を示す斜視図である（表面図）。 捕捉用プレートの構成を示す斜視図である（裏面図）。 本実施例２に係る余分細胞回収プレートを示す上視図および縦断面図である。 余分細胞回収プレートの装着状態を示す細胞シャーレの上視図である。 余分細胞回収プレートの装着状態を示す細胞シャーレの縦断面図である。 余分細胞回収前の状態を示す説明図である。 余分細胞回収時の状態を示す説明図である。 余分細胞回収プレートの構成を示す図である（第１例）。 余分細胞回収プレートの構成を示す図である（第２例）。 余分細胞回収プレートの構成を示す図である（第３例）。 本実施例３に係る多機能流路プレートを示す構成図である。 多機能流路プレートを示す要部上視図である。 導入細胞回収前の状態を示す縦断面図である。 導入細胞回収時の状態を示す縦断面図である。 本実施例４に係る捕捉用プレートの構成を示す斜視図である。 本実施例５に係る捕捉用プレートの配置説明図である。 捕捉用プレートの配置説明図である。 本実施例６に係る捕捉用プレートの構成を示す斜視図である。 従来の細胞シャーレの構造を示す要部縦断面図である。

符号の説明

１００、１００ａ 細胞シャーレ
１４０ 吸入流路
１４１ 第１流路
１４２ 第２流路
１４３ 第３流路
１２０、１３０ 貫通孔
２００ 吸引ポンプ
２１０ 吸引チューブ
３００、３００ａ 捕捉用プレート
３１０、３１１ 凹部
３３０ 微細孔
４００、４１０ 透明板部材
５００ 余分細胞回収プレート
５３０ 開口部
５４０ 回収流路
５４１ 第１流路
５４２ 第２流路
５４３ 第３流路
６００ 吐出ポンプ
６１０ 吐出チューブ
８００ ウエル部
９００ 多機能流路プレート
９１０ 導入細胞流路部
９１２ 第一傾斜部
９１３ 第二傾斜部
９２０、９４０ 液体吐出口
９３０ 余分細胞流路部
９５０ 余分細胞回収口
９６０ 回収用ポンプ

Claims (5)

1. 捕捉用プレートが内部に配置される細胞捕捉用容器と、前記捕捉用プレートに形成された複数の捕捉孔から細胞の吸引をおこなう吸引手段とを備えた細胞捕捉装置であって、
   前記細胞捕捉用容器は、底板部の二箇所位置に、第一の貫通孔と第二の貫通孔と、これら第一、第二の貫通孔の下開口部とを連続する溝部とを形成し、
   前記溝部を底板部の下方側から封着する透明板部材を設け、前記第一の貫通孔の上開口部には捕捉用プレートを配置させ、前記第二の貫通孔の上開口部には、前記吸引手段の吸引チューブを接続する構成とすることを特徴とする細胞捕捉装置。
2. インジェクション処理された導入細胞以外の余分細胞を回収する余分細胞回収部材をさらに備え、前記余分細胞回収部材は、前記捕捉用プレートの上部位置に装着されるとともに、前記余分細胞を液体の流通により回収する余分細胞回収流路が形成され、当該余分細胞回収流路の一端部に形成された開口部には、液体を吐出する液体吐出手段が接続され、他端部に形成された開口部には、前記液体および余分細胞の吸入をおこなう吸入手段が接続されることを特徴とする請求項１に記載の細胞捕捉装置。
3. 導入細胞を回収するための導入細胞流路と、導入細胞以外の余分細胞を回収するための余分細胞流路とを互いに交差させて構成される多機能流路プレートをさらに備え、前記捕捉用プレートは、前記導入細胞流路と余分細胞流路とがそれぞれ交差する位置に設けられ、前記導入細胞流路の上流側には、液体を吐出させるための吐出口が形成され、下流側には、前記導入細胞を観察するための観察用ウエル部が設けられ、前記余分細胞流路の上流側には、液体を吐出させるための吐出口が形成され、下流側には、余分細胞を回収する回収手段が設けられることを特徴とする請求項１に記載の細胞捕捉装置。
4. 前記導入細胞流路の吐出口と、前記余分細胞流路の吐出口とから流出される液体の流出タイミングの可変に基づいて、前記導入細胞と余分細胞との分別回収をおこなうことを特徴とする請求項３に記載の細胞捕捉装置。
5. 前記細胞捕捉用容器の底板部に対する捕捉用プレートの接合位置は、前記透明板部材と前記捕捉用プレートに形成された捕捉孔とが近接する位置に選定されることを特徴とする請求項１から４の何れか一つに記載の細胞捕捉装置。