JP4571999B1 - 検体に由来する偽陽性を抑制する方法 - Google Patents

Abstract

【課題】より確実な結果が得られる抗原検出方法を提供する。
【解決手段】検出すべき抗原に特異的であり、且つ検出可能な物質で標識された第１の抗体と、検出すべき抗原に特異的であり、且つ基体に固定化された第２の抗体と、前記抗原を含み得る試料とをＮ置換マレイミド化合物の存在において反応させ、得られた免疫複合体に含まれる標識に由来する信号を検出することにより当該抗原の存在の有無を決定することを具備する抗原の検出方法。
【選択図】なし

Description

本発明は、抗原検出方法に関する。詳しくは、抗原抗体反応を利用した抗原検出方法における偽陽性反応を抑制する方法に関する。

近年、食の安心安全に対する消費者の意識が非常に高まっており、食物アレルギーもその一例である。食品衛生法では、消費者の食品アレルギーによる健康危害の発生を防止する観点から食物アレルギーを引きおこしやすい原材料を含む旨を表示するよう推奨されている。特に、食物アレルギーの発症数、重篤度から勘案して表示する必要性の高いえび、かに、小麦、そば、卵、乳および落花生の「特定原材料」７品目については、これら特定原材料を含む旨の表示をすることが製造者等に義務付けられている。

また、「特定原材料を含む」又は「特定原材料を含まない」などの表示をすることによって、消費者に安心感を持って自己の製品を受け入れられるようにすることができるので、このような表示は製造者にとっても利益がある。

種々の原材料を混合して製造される加工食品においては、個々の原材料についての履歴を辿ることは煩雑であり、得られた製品を直接検査できることが望ましい。また、原材料としては使用していないにも関わらず、製造ラインで混入（コンタミネーション）する場合もある。従って、製品の維持管理や突発的な事故を予防する観点から、特定原材料が食品に含まれるか否かを、製造の現場であっても迅速かつ簡便に測定する必要がある。更に、消費者を保護するという安全性を考慮すると、その検出には高い精度が要求される。

検出精度を向上するために、例えば、特許文献１では、食品からアレルゲンを抽出する際に、界面活性剤であるドデシル硫酸ナトリウム(以下、「SDS」と記す）および還元剤として２−メルカプトエタノールを用いて、特定原材料に含まれるアレルゲンを効率よく抽出する方法が開示されている。

また、特許文献２では、特許文献１の方法において使用される２−メルカプトエタノールと金コロイドとの間で生じ得る偽陽性反応を抑制する方法が開示されている。この方法は、２−メルカプトエタノールに代えて亜硫酸塩を使用する方法である。

上述のように、幾つかの方法は従来技術として当業者には知られているが、現在において、消費者がより安心して食品を摂取でき、且つ生産者がより正確に製品の状態を把握するためには、より正確な結果が得られる更なる技術の開発が望まれている。

特開２００８−２９８６６４号公報 特開２００９−１３３７１２号公報

上記状況に鑑み、本発明の目的は、より正確な結果が得られる抗原検出方法を提供することである。

上記目的は、以下のような本発明により達成される；
検出すべき抗原に特異的であり、且つ検出可能な物質で標識された第１の抗体と、検出すべき抗原に特異的であり、且つ基体に固定化された第２の抗体と、前記抗原を含み得る試料とをＮ置換マレイミド化合物の存在において反応させ、得られた免疫複合体に含まれる標識に由来する信号を検出することにより当該抗原の存在の有無を決定することを具備する抗原検出方法。

本発明によって、より正確な結果が得られる抗原検出方法が提供される。

本発明に従うイムノクロマト装置の１例を示す模式図である。 本発明に従うイムノクロマト装置の１例を示す模式図である。 本発明に従うイムノクロマト装置の１例を示す模式図である。

１．定義
「対象」とは、検出されるべき抗原を含み得る物質または検出されるべき抗原を含むことが疑われる物質などであってよく、例えば、肉類、魚介類、卵類、牛乳、穀物、豆類、芋類、野菜、山菜、海草、種実類、果物、ハーブおよびそれらの加工食品、化粧品、医薬品、例えば、水道水、湖水、海水および汚泥などの環境に存在する物質、血液およびバイオプシーなどの生体由来物質などであってよい。「検体」とは、一般的に、対象から採取された少なくとも１部分をいう。このような検体から実際に試験に持ち込むための試料を調製することが可能である。

「試料」とは、対象に由来し、本発明に従う方法を行うための反応系に直接に持ち込まれる物質である。当該方法に適用するために適切となるように、予め、粉砕、均一化、分離、抽出および希釈などの工程を経てもよい。ここで「反応系」とは、そこにおいて目的の反応が行なわれる場をいい、例えば、反応容器、試験管、流路および基体表面などであってよい。

「抗原」は、抗体との免疫学的に特異的な結合が可能な何れかの成分をいい、本方法による検出の対象となる物質である。好ましい抗原は、例えば、タンパク質、ポリペプチドおよびそれらを含む物質などである。

「抗体」とは、特定の物質を抗原として認識して結合することが可能な抗体であればよく、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥ並びにその断片などでよく、また、モノクローナル抗体であっても、ポリクローナル抗体であってもよい。当該方法において、使用される第１の抗体と第２の抗体は、同じであっても、異なっていてもよい。

ここにおいて「特異的」とは、抗体が検出すべき抗原に対して免疫学的に選択的に結合することが可能な性質を示す。

「検出可能な物質」とは、例えば、発色、発光および蛍光など、それ自身公知の何れかの検出可能な信号を生じることにより、当該物質の存在を確認することが可能な物質であればよい。また、検出可能な物質は、それ単独で検出可能な信号を生じてもよく、当該信号を生ずる助けをする補助手段と出会うことによって検出可能な信号を生じてもよい。そのような補助手段は、例えば、酵素処理および／または励起光照射などの処理において使用される酵素基質などの物質並びに励起光およびレーザー光などの光などであってよい。検出可能な物質は、「標識物質」と解されてよい。

検出可能な物質の例は、有色微粒子および特定の酵素などであってよい。「有色微粒子」とは、一般的に抗体を検出するために標識するための検出可能な物質であればよく、例えば、金コロイド、銀コロイド、白金コロイドおよびこれらの複合コロイドなどの金属コロイド、例えば、着色ラテックスなどのラテックス粒子であればよい。特定の酵素の例は、西洋ワサビペルオキシダーゼなどであればよい。

２．抗原検出方法
本発明の１側面は、検出すべき抗原に特異的であり、且つ有色微粒子で標識された第１の抗体と、検出すべき抗原に特異的であり、且つ基体に固定化された第２の抗体と、前記抗原を含み得る試料とをＮ置換マレイミド化合物の存在において反応させ、当該抗原と第１の抗体と第２の抗体による免疫複合体に含まれる標識に由来する信号を検出することにより当該抗原の存在の有無を決定することを具備する抗原検出方法である。

本発明の特徴は、Ｎ置換マレイミド化合物の存在下において、検出可能な物質で標識された第１の抗体と第２の抗体と試料とを反応させることである。それにより、検出可能な物質と試料に含まれるチオール基（即ち、ＳＨ基）とによる非特異的な結合が抑制される。ＳＨ基は、検出可能な物質、特に、金表面に対して化学的に吸着する性質を持つため、試料に含まれるＳＨ基により、偽陽性反応が生じる。しかしながら、ＳＨ基修飾作用を持つＮ置換マレイミドが存在することにより、第１の抗体と第２の抗体により特異的に結合されるべき抗原抗体反応のみを正確に反映することが可能である。

使用されるＮ置換マレイミド化合物は、式Ｉの化合物

ここで、ｎは１〜３０の整数であり、ｍは２〜３０の整数であり、Ｃ_ｎＨ_ｍは、全体としてまたはその一部に１または１以上のヘテロ基、例えば、Ｎ、Ｓおよび／またはＯなどを任意に含む１または１以上の環状構造を形成していてもよく、または直鎖若しくは枝分かれ鎖であってもよく、１または１以上のＨがＯ、Ｓ、Ｂｒ、Ｃｌ、ＮＨ_２、ＯＨおよび／またはＮＯ_２などにより置換されてもよい。当該環状構造は、３〜６員環であってよい。

Ｎ置換マレイミド化合物の例は、Ｎ−メチルマレイミド、Ｎ−エチルマレイミド、Ｎ−フェニルマレイミド、１，２−ビス（マレイミド）エタン、１，６−ビスマレイミドヘキサン、３−マレイミドプロピオン酸、４，４’−ビスマレイミドジフェニルメタン、６，７−メチレンジオキシ−4−メチル−３−マレイミドクマリン、ビス（３−エチル−５−メチル−４−マレイミドフェニル）メタン、Ｎ，Ｎ’−１，３−フェニレンジマレイミド、Ｎ，Ｎ’−１，４−フェニレンジマレイミド、Ｎ，Ｎ’−１，４−フェニレンジマレイミド、Ｎ−（１−ピレニル）マレイミド、Ｎ−（２，４，６−トリクロロフェニル）マレイミド、Ｎ−（４−アミノフェニル）マレイミド、Ｎ−（４−ニトロフェニル）マレイミド、Ｎ−ブロモメチル−２，３−ジクロロマレイミド、Ｎ−シクロヘキシルマレイミド、３−マレイミド安息香酸Ｎ−スクシンイミジル、３−マレイミドプロピオン酸Ｎ−スクシンイミジル、４−マレイミド酪酸Ｎ−スクシンイミジル、６−マレイミドヘキサン酸Ｎ−スクシンイミジル、Ｎ−［４−（２−ベンゾイミダゾリル）フェニル］マレイミド、Ｎ−（９−アクリジニル）マレイミドなどであるが、これらに限定するものではない。また、好ましくはＮ−メチルマレイミドおよびＮ−エチルマレイミドである。上記のＮ置換マレイミド化合物は、例えば、東京化成工業株式会社および和光純薬などから入手することが可能である。

Ｎ置換マレイミド化合物の抗原抗体反応系への持ち込みは、検体から試料を調製する際、例えば、抽出および希釈の工程においてそれらを行うための溶液に添加されること、試料と第１の抗体とを混合する際に添加されること、および／または試料と第１の抗体と第２の抗体とを混合する際に添加されることなどにより行われてよい。Ｎ置換マレイミド化合物は、その後、除去する必要はないので、試料と第１の抗体および第２の抗体とが反応する系において存在してよい。Ｎ置換マレイミド化合物が抗原抗体反応に先駆けて、例えば、試料を調製する際に添加される場合には、当該抗原抗体反応時には、試料に含まれる抗原抗体反応に寄与しない夾雑物としてのＳＨ基を有する物質、例えば、タンパク質またはポリペプチドなどと複合体を形成した状態で存在してもよい。

検体からの試料の調製は、例えば、次のように行ってよい。まず、対象から採取した検体に抽出液を加えて均質化する。次にこれを攪拌し、加熱した後に粗熱をとる。その後、遠心および濾過し、その濾液をサンプル抽出液として採取する。得られたサンプル抽出物を希釈液により、そこに含まれる抗原が反応に適した濃度になるように希釈する。

例えば、食品を検体として試料を調製するには、次のような操作を行えばよい。食品を粉砕、均質化する。均質化された検体に抽出液を加える。ボルテックスミキサーなどで攪拌する。遠心分離する。濾過して濾液を採取する。採取された濾液を必要に応じて希釈液により希釈する。得られた溶液を試料として使用すればよい。

ここで使用される抽出液は、Ｎａ_２ＳＯ_３などの還元剤、ＳＤＳ、Ｔｗｅｅｎ２０、ＮＰ−４０およびＴｒｉｔｏｎＸ−１００などの界面活性剤などを含んでよく、検出される抗原に応じてそれ自身公知の何れの抽出液を使用してよい。抽出工程においてＮ置換マレイミド化合物を存在させる場合には、Ｎ置換マレイミド化合物が当該抽出液に対して添加されればよい。抽出液にＮ置換マレイミド化合物を添加する場合には、約０．０１％〜約１０％、好ましくは約０．１％〜約５％またはより好ましくは約０．４％〜約２％の濃度で含まれればよい。

ここで使用される希釈液は、Ｔｒｉｓなどの緩衝剤、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などのタンパク質、Ｔｗｅｅｎ２０などの界面活性剤、ＥＤＴＡなどのキレート剤、およびプロクリン３００などの防腐剤を含んでよく、ｐＨ値は６〜９であってよい。希釈工程においてＮ置換マレイミド化合物を存在させる場合には、Ｎ置換マレイミド化合物が当該希釈液に添加されればよい。また、Ｎ置換マレイミド化合物が前記抽出液と希釈液の両方に含まれていてもよい。希釈液にＮ置換マレイミド化合物を添加する場合には、約０．０１％〜約１０％、好ましくは約０．１％〜約５％、より好ましくは約０．５％〜約２％の濃度で含まれればよい。

Ｎ置換マレイミド化合物の添加が反応に際して行われてもよい。その場合、試料に対して添加されても、試料と第１の抗体との混合時に添加されても、試料と第１の抗体と第２の抗体との混合時に添加されてもよい。しかしながら、Ｎ置換マレイミド化合物と夾雑物の有するＳＨ基を充分に結合させるためには、試料の調製工程において存在させることが好ましい。

試料と第１の抗体と第２の抗体との反応は同時に行ってもよい。この場合、試料と第１の抗体と第２の抗体とが同時に１つの反応系に存在する状態で試料に含まれる抗原、第１の抗体および第２の抗体を互いに接触させ、それらの免疫複合体を形成すればよい。或いは段階的に反応を行ってもよい。即ち、試料と第１の抗体とを接触させて、試料に含まれる抗原と第１の免疫複合体を得た後に、第１の免疫複合体と第２の抗体とを接触させて第２の免疫複合体を得ればよい。この場合の接触は、容器内の液相中で混合することによって行ってもよく、毛管現象により展開が得られる反応系において、展開による液相の移動によって行ってもよい。

また、本発明の方法は、例えば、イムノクロマト法およびＥＬＩＳＡ（enzyme-linked immunosorbent assay、即ち、酵素免疫測定）法などの抗原検出方法に分類されてよい。

イムノクロマト法に利用される場合、後述するようなイムノクロマト装置と組み合わされて使用されればよい。

ＥＬＩＳＡ法に利用する場合、検出すべき抗原に特異的であり、且つ検出可能な物質で標識された第１の抗体と、例えば、９６ウェルプレートなどの基体に固定化された第２の抗体と、前記抗原を含む得る試料とをＮ置換マレイミド化合物の存在において反応させ、得られた免疫複合体に含まれる標識に由来する信号を検出することにより当該抗原の存在の有無を決定すればよい。ＥＬＩＳＡ法においては、検出可能な物質は、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼなどであってよい。

本発明の方法により、抗原抗体を利用した抗原検出方法において、偽陽性反応の発生を抑制することが可能である。

３．イムノクロマトキット
本発明の１側面は、基体と、前記基体上で反応成分を展開するための展開部と、前記展開部上流に附合化され、検出すべき抗原に特異的であり、且つ有色微粒子で標識された第１の抗体と、前記展開部下流の観察可能な領域に固定化された前記抗原に特異的な第２の抗体とを具備するイムノクロマト装置と、
偽陽性反応抑制剤としてのＮ置換マレイミド化合物と、
抽出液および／または希釈液と、
を具備するイムノクロマトキットである。

Ｎ置換マレイミド化合物は、水、トリス緩衝液、塩酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、酒石酸緩衝液およびアンモニア緩衝液などの適切な溶媒に溶解した形態、抽出液に溶解された形態および／または希釈液に溶解された形態で提供されればよい。抽出液および希釈液は上述した組成物であってよい。

イムノクロマトキットは、更に試料を調製するための容器を具備してもよく、陽性対照および／または陰性対照を具備してもよい。

（１）イムノクロマト装置
（ａ）ハウジングタイプ
図１および図２にイムノクロマト装置の１例を示す。図１は、図２のイムノクロマト装置を線ｋ−ｋ’に沿った断面図である。図２はイムノクロマト装置の平面図である。

イムノクロマト装置１は、基体２と、基体２上で反応成分を展開するための展開部３と、展開部３を構成する外壁４と、展開部３の上流に開口された添加部５と、添加部５の位置よりも下流に附合化された第１の抗体６と、それよりも更に下流に固定化された第２の抗体７と、第２の抗体７が固定化された領域を使用者が観察するための窓８を具備する。ここで、展開部３における上流とは、展開開始点側をいい、下流とは展開終了点側をいう。展開の開始は、添加部５への試料の添加により行なわれる。ここで「附合化」とは、第１の抗体６が所望の場所に付着された状態をいうが、当該付着の状態は、例えば、水分との接触などの外部からの影響または環境の変化によって解消され、第１の抗体６が環境中に遊離することが可能な付着である。

展開部３は、毛管現象を得られる展開部材９および／または流路１０により構成されればよい。展開部材９を構成する材料は、それ自身公知の毛管現象を得られる材料、例えば、紙、樹脂および多孔体などであればよい。

展開部３への試料の添加は、添加部５から行われる。添加部５から添加された試料は、毛管現象により下流へと展開される。添加された試料が展開部３の下流方向に適切な速度で移動するために、添加部５に対応する場所に吸収体１２が配されてもよい。

添加された試料は、先ず附合化された第１の抗体６と接触する。附合化された第１の抗体６は、液体との接触により固相から液相に遊離する。第１の抗体６の附合化は、展開部３を構成する何れかの面、即ち、展開部材９の内部若しくは表面、流路７の内壁または基体２の内面に対して、それ自身公知の何れかの手段により液体により遊離可能に付着されることにより達成される。

試料に抗原が含まれる場合、抗原が第１の抗体６と特異的に結合し、第１の免疫複合体を形成する。第１の免疫複合体は、展開されて第２の抗体７と特異的に結合し、第２の免疫複合体が形成される。ここで、第２の抗体７は、展開部３を構成する何れかの面、即ち、展開部材９の内部若しくは表面、流路１０の内壁または基体２の内面に対してそれ自体公知の何れかの手段により固定化されている。また、第２の抗体７の固定化の領域は、窓８により観察が可能な領域である。第２の免疫複合体に含まれる検出可能な物質からの信号を窓８から観察することにより、試料における抗原を有無が判定される。従って、窓８は判定部として機能する。観察の容易さから、第２の抗体７の固定化は、展開部材９の内部若しくは表面であることが好ましい。第２の免疫複合体に含まれる検出可能な物質からの信号は、そのものの性質に応じて、例えば、発色、発光および蛍光を検出することにより行われればよい。図２には、検出可能な物質からの信号２１が窓８から観察される様子を示した。

イムノクロマト装置は、それ自身公知のイムノクロマト装置が使用されてもよい。

本発明のイムノクロマトキットにより、迅速且つ簡便に、高精度な抗原の検出を確実に行うことが可能である。

（ｂ）浸漬用スティックタイプ
更なるイムノクロマト装置の１例を図３に示す。この例は、浸漬用スティックタイプの装置の例である。図３を参照されたい。

イムノクロマト装置３１は、毛管現象を得られる展開部材３２と、展開部材３２の展開開始点側に設けられた浸漬部３３と、浸漬部３３よりも下流に設けられた第１の抗体６の附合化領域３４と、その下流に設けられた第２の抗体７の固定化領域３５と、更にその下流に設けられた領域３６とを具備する。

検査においては、浸漬部３３が直接に試料に浸漬される。その後、毛管現象により試料が展開する。試料に抗原が含まれる場合、抗原は領域３４において第１の抗体６と特異的に結合し、第１の免疫複合体を形成する。第１の免疫複合体は、展開されて第２の抗体７と特異的に結合し、第２の免疫複合体が形成される。第２の免疫複合体に含まれる検出可能な物質からの信号を観察することにより、試料における抗原を有無が判定される。領域３６および／またはそれよりも下流側に展開により移動した液体を吸収するための吸収領域が設けられてもよい。また、図示しないが、検査が正しく行なわれたことを確認することが可能な確認部が領域３６に設けられてもよい。更に、試験実施者が当該イムノクロマト装置３１を保持するための領域（即ち、保持領域）を領域３６の外側に設けてもよい。保持領域は、展開終了点よりも外側に設けられることが好ましい。それにより、検査に人為的な影響を与える可能性を抑えることができる。

（２）特定原材料を検出するためのイムノクロマトキット
イムノクロマトキットは、食品において特定原材料を使用しているか否か、または特定原材料を含むか否かを確認するために使用されてもよい。

その場合のイムノクロマトキットは、
基体と、前記基体上で反応成分を毛管現象により展開するための展開部と、前記展開部上流に附合化され、食品由来の特定原材料に特異的であり、且つ金コロイドで標識された第１の抗体と、前記展開部下流の観察可能な領域に固定化された前記食品由来の特定原材料に特異的な第２の抗体とを具備するイムノクロマト装置と、
偽陽性反応抑制剤としてのＮ置換マレイミド化合物、並びに界面活性剤、還元剤、緩衝剤、キレート剤および/または防腐剤を含む希釈液と、
を具備するイムノクロマトキットであってよい。

好ましい食品由来の特定原材料は、例えば、卵、牛乳、小麦、そばおよび落花生などである。これらの特定原材料が抗原として検出される。検出される抗原は、例えば、卵では卵白アルブミン、牛乳ではカゼイン、小麦ではグリアジン、そばではそば可溶性タンパク質、落花生では落花生可溶性タンパク質であってよい。これらに対する第１の抗体の例は、卵では金コロイド標識抗鶏卵白アルブミンポリクローナル抗体、牛乳では金コロイド標識抗カゼインポリクローナル抗体、小麦では金コロイド標識抗グリアジンポリクローナル抗体、そばでは金コロイド標識抗そばタンパク質ポリクローナル抗体、落花生では金コロイド標識抗落花生タンパク質ポリクローナル抗体である。これらの抗体の製造方法は、それ自身公知の何れの方法を使用してもよい。

好ましい第２の抗体の例は、上述の第１の抗体と同様に、卵では抗鶏卵白アルブミンポリクローナル抗体、牛乳では抗カゼインポリクローナル抗体、小麦では抗グリアジンポリクローナル抗体、そばでは抗そばタンパク質ポリクローナル抗体、落花生では抗落花生タンパク質ポリクローナル抗体であるが、これらに限定するものではない。１つのイムノクロマト装置に含まれる第１の抗体と第２の抗体は同じ抗体であっても、異なっていてもよい。

本発明に従う抗体は、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。モノクローナル抗体は、例えば、当業者に既知の手法を用いて、免疫したマウスの脾細胞とミエローマ細胞株などの細胞融合用のペアレントセルを融合させ、得られたハイブリドーマの中から好適なものを選択してクローン化し、次いで、その融合細胞を生体外または生体内で培養し、この培養混合物より特異性の高いモノクローナル抗体を採取できる。

更に、本発明の抗体として、上記のようなポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の他に、それらの抗体を酵素消化処理して得られるような当該抗体の反応性フラグメントも用いることもできる。当該抗体のフラグメントの例には、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆ（ｖ）フラグメント、Ｈ鎖モノマーまたはダイマー、Ｌ鎖モノマーまたはダイマー、１個のＨ鎖および１個のＬ鎖からなるダイマーなどが含まれる。当該フラグメントは、例えば、ペプシンやパパインなどのプロテアーゼによって完全な抗体を消化するか、消化後に必要に応じて還元剤で処理することにより得ることができる。Ｈ鎖およびＬ鎖モノマーは、完全な抗体をジチオスレイトールなどの還元剤で処理した後に精製した鎖状体を分離することにより得ることもできる。第１の抗体および第２の抗体は、それぞれ上記ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体若しくはそれらのフラグメントの何れかであってもよく、または前記ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体およびそれらのフラグメントからなる群より２または２以上で選択される何れかの組み合わせであってもよい。また、第１の抗体と第２の抗体との組み合わせは、前記ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体およびそれらのフラグメントからなる群より選択される何れかの組み合わせであってよい。

本発明のイムノクロマトキットにより、迅速且つ簡便に抗原の検出を確実に行うことが可能である。

４．偽陽性反応抑制剤
本発明の更なる側面は、Ｎ置換マレイミド化合物を活性成分として含む偽陽性反応抑制剤である。偽陽性反応抑制剤は、上述したような抗原検出方法において使用される。特に好ましくは、イムノクロマト装置において金コロイド標識抗体およびラテックス粒子などの有色微粒子で標識された抗体との特異的結合によって抗原を検出する方法において使用される。

Ｎ置換マレイミド化合物は、上述した希釈剤および抽出剤に溶解された状態で提供されてもよく、或いは他の溶媒、例えば、水、トリス緩衝液、塩酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、酒石酸緩衝液およびアンモニア緩衝液などに溶解された状態で提供されてもよい。

［例］
以下、例を挙げて、抗原検出方法におけるＮ置換マレイミド化合物の偽陽性反応抑制効果について説明する。

例１ 偽陽性反応の抑制
・標準品の調製
平成１６年度食品等試験検査費報告書「アレルギー物質を含む食品の検査方法における標準液の規格策定」記載の方法において、抽出液中の０．５％ＳＤＳを０．６％ＳＤＳに、０．５％ ２−ＭＥを０．１Ｍ Ｎａ_２ＳＯ_３に置き換えて、卵、牛乳、小麦、そば、落花生標準品を調製した。

・抽出液の調製
０．６％ＳＤＳ、０．１Ｍ Ｎａ_２ＳＯ_３、０．１５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、０．１％ＢＳＡ、０．０４％Ｔｗｅｅｎ、２ｍＭ ＥＤＴＡおよび０．００２５％ ｐｒｏｃｌｉｎ３００を含む抽出液を調製した。

・抽出
均質化した米１ｇに抽出液を１９ｍＬ添加し、最大出力のボルテックスミキサーで３０秒間攪拌した。沸騰水浴中で１０分間加熱した後、粗熱を取ってから３０００ｘｇ、２０分間、２５℃で遠心分離した（ＢＥＣＫＭＡＮＣＯＵＬＴＥＲ社製、Ａｖａｎｔｉ Ｊ−ＨＣ）。上清を採取し、５Ａの濾紙（ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製）で濾過し、サンプル抽出液を得た。また、大豆、ひえ、あわ、きび、ライクリスプ（ライ麦）、大麦麦芽、ハト麦について同様の操作を行なった。

・希釈液の調製
コントロール希釈液として、０．１５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、０．１％ＢＳＡ、０．０４％Ｔｗｅｅｎ、２ｍＭ ＥＤＴＡおよび０．００２５％ ｐｒｏｃｌｉｎ３００を含む希釈液を調製した。

また、Ｎ−エチルマレイミド（以下、ＮＥＭと記す）添加希釈液として、１％ＮＥＭ、０．１５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、０．１％ＢＳＡ、０．０４％Ｔｗｅｅｎ、２ｍＭ ＥＤＴＡおよび０．００２５％ ｐｒｏｃｌｉｎ３００を含む希釈液を調製した。また同様に、０．３％、０．５％のＮＥＭを含むＮＥＭ添加希釈液を調製した。

・希釈
２５０ｎｇ／ｍＬの各標準品または各サンプル抽出液の１００μＬに対して９００μＬの割合でコントロール希釈液、ＮＥＭ添加希釈液を添加して抗体との反応に供するための試料を得た。

・判定
得られた試料の２００μＬをモリナガ特定原料イムノクロマト法キットであるナノトラップ（登録商標）卵（卵白アルブミン）、ナノトラップ（登録商標）牛乳（カゼイン）、ナノトラップ（登録商標）小麦（グリアジン）、ナノトラップ（登録商標）ソバ（ソバ可溶性タンパク質）またはナノトラップ（登録商標）落花生（落花生可溶性タンパク質）、に具備されるテストスティックの滴下部に滴下することにより反応を開始した。判定は１５分後に、判定ラインの有無を確認して行なった。判定ラインについて、「−」を陰性、「±」を弱陽性、「＋」を陽性と判定した。

・結果

以上の結果から、米および他穀類の偽陽性反応がＮＥＭを添加することにより抑制されることが分かった。大豆の偽陽性もＮＥＭを添加することにより３割程度に低下した。金コロイドを用いた抗原検出方法における偽陽性は、各サンプル抽出液中に存在するＳＨ基を有する物質が金コロイドと化学的に結合し、凝集することにより引き起こされることが考えられる。ＮＥＭを添加することにより、金表面と結合する可能性のあるＳＨ基がマレイミド基とも結合するため、偽陽性の原因となる金コロイドの凝集を抑制できたのではないかと考えられた。

例２ Ｎ置換マレイミド化合物の効果と有効濃度
例１と同様に標準品の調製、抽出液の調製および抽出を行なった。

・希釈液の調製
コントロール希釈液として、０．１５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、０．１％ＢＳＡ、０．０４％Ｔｗｅｅｎ、２ｍＭ ＥＤＴＡおよび０．００２５％ ｐｒｏｃｌｉｎ３００を含む希釈液を調製した。

また、ＮＥＭ添加希釈液として、２％ＮＥＭ、０．１５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、０．１％ＢＳＡ、０．０４％Ｔｗｅｅｎ、２ｍＭ ＥＤＴＡおよび０．００２５％ ｐｒｏｃｌｉｎ３００を含む希釈液を調製した。また同様に０．０００１％、０．００１％、０．０１％、０．１％、０．３％、０．５％、１％のＮＥＭまたはＮ−メチルマレイミド（以下、ＮＭＭと記す）を含むＮＥＭ添加希釈液またはＮＭＭ添加希釈液を調製した。

・希釈
２５０ｎｇ／ｍＬの各標準品または各サンプル抽出液の１００μＬに対して９００μＬの割合でコントロール希釈液、ＮＥＭ添加希釈液またはＮＭＭ添加希釈液を添加して抗体との反応に供するための試料を得た。

・判定
得られた試料の２００μＬをモリナガ特定原料イムノクロマト法キットであるナノトラップ（登録商標）卵（卵白アルブミン）、ナノトラップ（登録商標）牛乳（カゼイン）、ナノトラップ（登録商標）小麦（グリアジン）、ナノトラップ（登録商標）ソバ（ソバ可溶性タンパク質）またはナノトラップ（登録商標）落花生（落花生可溶性タンパク質）、に具備されるテストスティックの滴下部に滴下することにより反応を開始した。判定は１５分後に、判定ラインの有無を確認して行なった。判定ラインについて、「−」を陰性、「±」を弱陽性、「＋」を陽性と判定した。

・結果

以上の結果から、ＮＥＭは０．０１％から顕著に偽陽性反応を抑制することが確認された。また更に０．００１％の低濃度であっても極々薄い線は観察されたものの、偽陽性反応を抑制できた。また、同様にＮ置換マレイミド基を有するＮＭＭにおいても偽陽性反応を抑制することが確認された。

以上の例から、Ｎ置換マレイミド化合物は抗原検出方法において偽陽性を抑制する効果があった。Ｎ置換マレイミド化合物は０．００１％と低い濃度から偽陽性反応を抑制することが可能であり、その効果を得るために、Ｎ置換マレイミド化合物を溶解可能な限界濃度まで使用することが可能である。

本発明は、食品における特定原材料の含有の有無を判定するために有用である。更に、抗原抗体反応により抗原を検出することが必要な分野、例えば、医療、医薬、香粧品、農業および漁業などの分野並びにそれらの基礎研究に関連する産業において幅広く有用である。

１．イムノクロマト装置 ２．基体 ３．展開部 ４．外壁 ５．添加部 ６．第１の抗体 ７．第２の抗体 ８．窓 ９．展開部剤 １０．流路
１１．確認部 １２．吸収体 １３．吸収体 ２１．信号 ３１．イムノクロマト装置 ３２.展開部材 ３３.浸漬部 ３４.附合化領域 ３５.固定化領域 ３６．領域

Claims (12)

1. 検体と亜硫酸塩を含有する抽出液とを混合し、タンパク質、ポリペプチドおよびそれらを含む物質からなる群より少なくとも１選択される成分を抽出すること、および
   抽出により得られた試料と、目的とする抗原に特異的であり、且つ有色微粒子で標識された第１の抗体と、前記抗原に特異的であり、且つ基体に固定化された第２の抗体とをＮ−メチルマレイミドまたはＮ−エチルマレイミドの存在において反応させることを特徴とする検体に由来する偽陽性を抑制する方法。
2. 前記反応が、第１の抗体と前記試料との反応より第１の免疫複合体が形成されることと、前記第１の免疫複合体と前期第２の抗体との反応により第２の免疫複合体が形成されることとを具備する請求項１に記載の方法。
3. Ｎ−メチルマレイミドまたはＮ−エチルマレイミドの反応系への持ち込みが、抗原抗体反応に供される試料を調製する際に添加されることにより行われる請求項１または２に記載の方法。
4. 前記有色微粒子が、金属コロイドまたはラテックス粒子である請求項１〜３の何れか１項に記載の方法。
5. 前記金属コロイドが、金コロイドである請求項４に記載の方法。
6. 全ての工程が、毛管現象により成分を展開することを特徴とするイムノクロマト装置において行われる請求項１〜５の何れか１項に記載の方法。
7. 請求項１〜６の何れか１項に記載の方法を利用する抗原検出方法であって、
   検体と亜硫酸塩を含有する抽出液とを混合し、タンパク質、ポリペプチドおよびそれらを含む物質からなる群より少なくとも１選択される成分を抽出すること、
   抽出により得られた試料と、目的とする抗原に特異的であり、且つ有色微粒子で標識された第１の抗体と、前記抗原に特異的であり、且つ基体に固定化された第２の抗体とをＮ−メチルマレイミドまたはＮ−エチルマレイミドの存在において反応させること、および
   前記反応により得られた免疫複合体に含まれる標識に由来する信号を検出することにより前記抗体の有無を決定すること
   を具備する抗原検出方法。
8. 基体と、前記基体上で反応成分を展開するための展開部と、前記展開部上流に附合化され、検出すべき抗原に特異的であり、且つ有色微粒子で標識された第１の抗体と、前記展開部下流の観察可能な領域に固定化された前記抗原に特異的な第２の抗体とを具備するイムノクロマト装置と、
   亜硫酸塩を含有する抽出液と、
   検体に由来する偽陽性反応抑制剤としてのＮ−メチルマレイミドまたはＮ−エチルマレイミドと、
   を具備する請求項１〜７の何れか１項に記載の方法を利用するイムノクロマトキット。
9. 前記有色微粒子が金属コロイドまたはラテックス粒子である請求項８に記載のイムノクロマトキット。
10. 基体と、前記基体上で反応成分を毛管現象により展開するための展開部と、前記展開部上流に附合化され、食品中の特定原材料に特異的であり、且つ金コロイドで標識された第１の抗体と、前記展開部下流の観察可能な領域に固定化され、且つ前記特定原材料に特異的な第２の抗体とを具備するイムノクロマト装置と、
    検体に由来する偽陽性反応抑制剤としてのＮ−メチルマレイミドまたはＮ−エチルマレイミド、並びに界面活性剤、還元剤、緩衝剤、キレート剤および/または防腐剤を含む希釈液と、
    亜硫酸塩を含有する抽出液と、
    を具備する請求項１〜７の何れか１項に記載の方法を利用するイムノクロマトキット。
11. 前記特定原材料が、卵、牛乳、小麦、そばおよび落花生からなる群より選択される少なくとも１に由来する請求項１０に記載のイムノクロマトキット。
12. イムノクロマト装置において、亜硫酸塩を含有する抽出液により検体から抽出された試料に含まれる目的とする抗原と有色微粒子で標識された抗体との特異的結合により当該抗原を検出する方法において使用するためのＮ−メチルマレイミドまたはＮ−エチルマレイミドを活性成分として含む検体に由来する偽陽性反応抑制剤。

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