JP7679941B2 - 免疫学的測定法 - Google Patents

Description

本発明は、免疫学的測定法に関する。特に、ジャカリン関連レクチン存在下で免疫反応を行う免疫学的測定法に関する。

診断薬分野における測定方法として、生体試料中に存在する測定対象物質を免疫反応を利用して測定する免疫学的測定法が挙げられる。免疫学的測定法は抗原抗体反応を利用していることから、特異性が非常に高い測定法である。
免疫学的測定法は、さらにホモジーニアス法とヘテロジーニアス法に大別される。ホモジーニアス法とは、試料と試薬液の混和溶液（反応液）中で測定対象物質により進行する反応をＢ／Ｆ（結合／非結合）分離を行うことなく特異的に検出する測定法を指し、Ｂ／Ｆ分離操作によって測定反応に関与しなかった余剰成分を完全に洗浄・除去した後、主反応を進行させて検出するヘテロジーニアス測定法と対比して呼称される測定法のことをいう。ヘテロジーニアス法は、洗浄工程を経るため、非特異反応物質による影響を受けにくい方法である一方、工程が多く煩雑であり、測定に時間を要するという問題がある。これに対してホモジーニアス法は、洗浄工程を経ないため簡便であり、測定に要する時間も短いため、臨床診断の分野で広く求められる手法である一方、非特異反応の影響を受けやすいという課題もある。
ホモジーニアス法のなかでも免疫凝集法を利用した測定方法（ＴＩＡ）は、抗体などの特異的結合パートナーによるアナライト（測定対象物質）の架橋作用によって形成される免疫複合体の凝集度合いに基づいて、試料中のアナライトを定性もしくは定量的に検出する方法である。なかでも、凝集シグナルを増幅させるために不溶性担体としてラテックス粒子を用いたラテックス免疫凝集法（以下、ＬＴＩＡということがある）は光学的な検出に適しており、自動化も容易なことから、さまざまな検査項目に適用されている汎用性の高い測定方法である。

ところで、生体試料中には様々な物質が存在しており、いわゆる非特異因子とよばれる非特異反応の原因となる物質が含まれていることが多い。
非特異反応とは、特異反応にもとづかない結合が促進されたり、特異的な免疫反応が妨げられたりする現象のことであり、測定誤差の原因となる。この非特異反応の原因因子（非特異因子）としては、異好性抗体やリウマチ因子（ＲＦ）の存在が明らかとなっている。異好性抗体とは、免疫学的測定方法の主成分である動物由来抗体に対して反応性を示すヒト抗体の総称であり、ＨＡＭＡ（ヒト抗マウス免疫グロブリン抗体）が代表的なものとして知られている。リウマチ因子とは、関節リウマチ患者に出現し、動物由来抗体に対して反応性を示すという性質においてＨＡＭＡと共通しており、その実体はいずれもヒトの免疫グロブリンＧや免疫グロブリンＭであることが知られている（非特許文献１）。
免疫学的測定法において非特異反応を抑制する技術として例えば特許文献１～２が知られている。
特許文献１には、試料中に存在するＩｇＭ型又はＩｇＧ型の自然抗体による非特異反応を抑制するために、抗ヒトＩｇＭ抗体又は抗ヒトＩｇＧ抗体を免疫測定系に添加することにより、該自然抗体による非特異反応を抑制する免疫学的測定法が開示されている。
特許文献２には、予め試料をヒトリウマチ因子（ＲＦ）の反応部位に結合能を有する動物由来抗体の十分量で前処理することによりＲＦに起因する非特異反応を抑制する方法が開示されている。動物由来抗体として抗ヒトＩｇＧ抗体、抗ヒトＩｇＡ抗体及び／又は抗ヒトＩｇＭ抗体が挙げられている。

特開平１１－２８７８０１号公報 特開平０７－０１２８１８号公報 特表平２－５０３７１４号公報 特開平４－３２６０６２号公報

臨床化学 ;第23巻補冊175a-1～175a-10 (1994）

特許文献１、２は、抗ヒトＩｇＭ抗体、抗ヒトＩｇＧ抗体、抗ヒトＩｇＡ抗体によって自然抗体やＲＦに起因する非特異反応を抑制する方法である。現在、さまざまな試薬で実用化されている方法であるが、抗体を用いることから試薬が高価となる。また、これらの抗体によってもなお、抑制できない非特異反応も存在することが、本発明者らの試験で明らかとなっていた。

本発明は免疫反応における非特異反応を抑制することを課題とする。
本願発明者らは上記課題を解決するために、様々な物質の非特異反応抑制効果を検討した結果、ジャカリン（jacalin）存在下で免疫反応を行うことにより非特異反応を抑制できることを見出し、本願発明を完成するに至った。すなわち、本願発明は以下の構成を有する。なお、ジャカリンは、糖タンパク質の精製や免疫学的測定方法において測定対象物質の捕捉に用いられることが知られているが（特許文献３，４）、免疫学的測定方法において、非特異反応抑制効果を示すことは知られていない。
＜１＞試料中の測定対象物質を免疫学的に測定する方法において、ジャカリン関連レクチン存在下で免疫反応を行うことを特徴とする免疫学的測定法。
＜２＞免疫学的測定法が、ホモジーニアス法に基づく方法である＜１＞に記載の免疫学的測定法。
＜３＞ホモジーニアス法に基づく方法が、ラテックス免疫凝集測定法である＜１＞又は＜２＞に記載の免疫学的測定法。
＜４＞ジャカリン関連レクチンがジャカリンである、＜1＞～＜３＞のいずれかに記載の免疫学的測定法。
＜５＞試料中の測定対象物質を免疫学的に測定する方法における非特異反応抑制方法であって、ジャカリン関連レクチン存在下で免疫反応を行うことを特徴とする非特異反応抑制方法。
＜６＞免疫学的測定法が、ホモジーニアス法に基づく方法である＜５＞に記載の非特異反応抑制方法。
＜７＞ホモジーニアス法に基づく方法が、ラテックス免疫凝集測定法である＜５＞又は＜６＞に記載の非特異反応抑制方法。
＜８＞ジャカリン関連レクチンがジャカリンである、＜５＞～＜７＞のいずれかに記載の非特異反応抑制方法。
＜９＞ジャカリン関連レクチンを含む免疫学的測定用試薬。
＜１０＞免疫学的測定法が、ホモジーニアス法に基づく方法である＜９＞に記載の免疫学的測定用試薬。
＜１１＞ホモジーニアス法に基づく方法が、ラテックス免疫凝集測定法である＜１０＞に記載の免疫学的測定用試薬。
＜１２＞ジャカリン関連レクチンがジャカリンである、＜９＞～＜１１＞のいずれかに記載の免疫学的測定用試薬。
＜１３＞ジャカリン関連レクチンを含む免疫学的測定用試薬キット。
＜１４＞免疫学的測定法がラテックス免疫凝集測定法であって、以下を含む＜１３＞に記載の免疫学的測定用試薬キット。
（１）ジャカリン関連レクチンを含む第１試薬
（２）測定対象物質に対する特異的結合パートナーを担持するラテックス粒子を含む第２試薬
＜１５＞ジャカリン関連レクチンがジャカリンである、＜１３＞又は＜１４＞に記載の免疫学的測定用試薬キット。
＜１６＞ジャカリン関連レクチンを有効成分として含む、免疫学的測定方法における非特異反応抑制剤。
＜１７＞ジャカリン関連レクチンがジャカリンである、＜１６＞に記載の非特異反応抑制剤。

本発明によれば、免疫学的測定法において、ジャカリン関連レクチン存在下で免疫反応を行うことにより試料中に含まれる非特異反応を抑制することができ、正確な測定をすることが可能となった。特に、抗ヒトＩｇＡポリクロ―ナル抗体と抗ヒトＩｇＧポリクロ―ナル抗体と抗ヒトＩｇＭポリクロ―ナル抗体の混合物（以降、抗ヒトＩｇＡ＋ＩｇＧ＋ＩｇＭポリクロ―ナル抗体と記載することがある）や、抗ヒトＩｇＭポリクロ―ナル抗体、抗ヒトＩｇＡポリクロ―ナル抗体によっても十分に抑制できなかった非特異反応を抑制することが可能となった。

（免疫学的測定法）
本発明の免疫学的測定法は、試料中の測定対象物質を免疫学的に測定する方法において、ジャカリン関連レクチン存在下で免疫反応を行うことを特徴とする方法である。
免疫学的測定法は、さらにホモジーニアス法とヘテロジーニアス法に大別される。ホモジーニアス法は、試料と試薬液の混和溶液（反応液）中で測定対象物質により進行する反応をＢ／Ｆ（結合／非結合）分離を行うことなく特異的に検出する測定法を指し、具体的には、不溶性担体としてラテックスを用いたラテックス免疫凝集法（ＬＴＩＡ）、イムノクロマトグラフィー（ラテラルフロー式、フロースルー式）が挙げられる。ヘテロジーニアス法は、Ｂ／Ｆ分離操作によって測定反応に関与しなかった余剰成分を完全に洗浄・除去した後、主反応を進行させて検出する方法であり、具体的にはウェル状プレートを用いたＥＬＩＳＡ、化学発光検出法などが挙げられる。なかでも、Ｂ／Ｆ分離のための工程を含まない免疫学的測定法（ホモジーニアス免疫測定法）が、洗浄工程を経ないため簡便であり、測定に要する時間も短いため、より好ましい。

（ジャカリン関連レクチン）
多くの植物には、レクチンとして知られる糖結合タンパクが含まれている。これら植物レクチンは、７つのタンパクファミリーに分類されている（参考文献：Trends in Glycoscience and Glycotechnology, Vol.12 No.64 (March2000) pp.83-101）。
（１）アマランチンレクチンファミリー
（２）heveinドメインからなるキチン結合レクチン
（３）ウリ科の篩部レクチン
（４）ジャカリン関連レクチン
（５）マメ科レクチン
（６）単子葉植物マンノース結合レクチン
（７）２型RIP
ジャカリン関連レクチンは、ジャックフルーツ（Artocarpusintegrifolia）の種子から得られるガラクトース特異的レクチンであるジャカリンと、構造的、進化的に近縁のすべての植物レクチンを含んでいる。ジャカリンファミリーは、ガラクトース特異的なサブファミリーと、マンノース特異的なサブファミリーに分かれている。本発明のジャカリン関連レクチンはこれらのいずれをも含む意味で用いられ、このうちでも特にジャカリンが好ましく用いられる。本発明において、ジャカリン関連レクチンの代表例として以下、ジャカリンを中心に説明するが、その他のジャカリン関連レクチンは特に断らない限りジャカリンに置き換えて説明される。

（ジャカリン）
ジャカリンとは、ジャックフルーツ（Artocarpusintegrifolia）の種子から抽出された、a-D-ガラクトース結合性のレクチンであり、このレクチンは、4つの同一サブユニットから構成される約６６kDaの糖タンパク質である。
本発明におけるジャカリンの精製度は高い方が望ましいが、免疫反応系内に存在させることにより、所望の非特異抑制効果を発揮できる限度における精製度であればかまわない。また、前記所望の非特異抑制効果を発揮できる限度において、界面活性剤や酸、アルカリ、熱処理などを単独で、または組み合わせて変性させたものも含まれる。また、所望の非特異抑制効果を発揮できる限度において、多量体化させたジャカリン、ＰＥＧ等の高分子化合物やタンパク質等により修飾されたジャカリン、ジャカリンを酵素により分解した断片、およびこれらのいずれかがラテックス粒子等の不溶性担体に結合されたものも含まれる。また、ジャカリンは天然物からの抽出物に限らず、リコンビナントタンパク質や、配列を適宜改変したものも含まれる。なお、ジャカリンはＩｇＡの精製に利用されることは公知であるが、免疫反応における非特異反応抑制のために利用された例は存在しない。
ジャカリンを免疫反応系内に存在させる方法としては、免疫測定試薬、試料の希釈液、又は保存液等に添加する方法が挙げられる。

本発明において、ジャカリンの濃度は、免疫反応に強い影響を及ぼさず、所望の非特異反応抑制効果を発揮できる濃度であればよく、測定対象物質や検体の種類に応じて適宜当業者が設定できる。免疫反応系内におけるジャカリンの濃度としては、免疫反応系の試薬構成によっても異なるが、例えば検体１０μＬに対するジャカリンの重量として、０．１～５００μｇ、好ましくは１．０～３００μｇ、より好ましくは２．０～２００μｇ、さらに好ましくは５．０～１００μｇであるが、この濃度に限ることはない。ＬＴＩＡ測定試薬において、一般的な第一試薬に含まれるジャカリンの濃度としては、１～２０００μｇ／ｍＬ、好ましくは１０～１５００μｇ／ｍＬ、より好ましくは２０～１０００μｇ／ｍＬ、さらに好ましくは５０～５００μｇ／ｍＬであるが、この濃度に限ることはない。
また、ＬＴＩＡ測定に供する前に、検体を前処理液で処理する場合、ジャカリンは前処理液に含まれていても良く、前処理液中のジャカリン濃度は重量％にて０．０１～５０％、好ましくは０．１～２０％、より好ましくは０．１～１０％、さらに好ましくは０．２～５％であるが、この濃度に限ることはない。
免疫反応系内とは、例えば免疫測定試薬が液状試薬の場合は、試料と液状免疫測定試薬が混合され免疫反応が行われる液相である。検体をジャカリンを含む液状免疫測定試薬に混合してもよいし、検体をジャカリンを含む前処理液とあらかじめ混合した後に免疫測定試薬と混合しても良い。また、イムノクロマトなどの固相で免疫反応が行われる場合は、免疫反応系内とは、液状試料と結合性パートナーの免疫反応が行われる固相をいう。検体をジャカリンを含む前処理液とあらかじめ混合した後にイムノクロマト試験片に滴下してもよいし、ジャカリンをサンプルパッド上に乾固しておき、検体を滴下した際にジャカリンが溶解されて検体と反応できる状態になっても良い。
ジャカリンは単独で用いてもよいし、変性されたジャカリンなど複数種を併用してもよいし、ラテックス粒子等の不溶性担体に結合されたジャカリンを使用してもよい。また、複数種のジャカリンを併用する場合には、両者を併せた濃度が上記の濃度範囲であればよい。
本発明の測定試薬中にあらかじめジャカリンを含有させる場合には、反応系内における濃度が上記濃度になるようにあらかじめ測定試薬中に含有させればよい。

（免疫学的測定用試薬）
本発明の免疫学的測定法の免疫反応は、免疫学的測定用試薬を用いて行われ、当該試薬には、反応主成分の他に、後述するジャカリン関連レクチンを含むことを特徴とする。反応の主成分としては、測定対象物質に特異的な結合パートナーが含まれ、他に免疫測定用粒子などの不溶性担体が挙げられる。
免疫学的測定用試薬中には、試料のｐＨ、イオン強度、浸透圧などを緩衝、調整する成分として、例えば、酢酸、クエン酸、リン酸、トリス、グリシン、ホウ酸、炭酸、及びグッドの緩衝液や、それらのナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩などを含んでも良い。また凝集形成を増強する成分としてポリビニルピロリドン、リン脂質ポリマーなどの高分子を含んでも良い。また、凝集の形成をコントロールする成分として、タンパク質、アミノ酸、糖類、金属塩類、界面活性剤類、還元性物質やカオトロピック物質など汎用される成分を１種類、または複数の成分を組み合わせて含んでも良い。

（免疫測定用粒子）
本発明に用いられる免疫測定用粒子は、所望される目的成分に対して特異的な結合パートナーを担持できるものであれば、公知の粒子を使用できる。好適にはポリスチレン等の高分子材料を用いたラテックス粒子を使用できるが、測定対象物質に対して特異的な結合パートナーを担持する方法に応じて、金属コロイド、シリカ、カーボン等の無機物粒子も、本発明の免疫測定用粒子として用いることができる。
免疫測定用粒子のサイズは、使用する光学的測定法（例えば、透過光を測定する比濁法、散乱光を測定する比朧法など）を考慮し、所望の測定感度、測定範囲などが得られるよう、０．０５～１μｍの範囲から適宜選択することができる。なお、自動分析装置における光学的測定においては平均粒子径０．１～０．４μｍが汎用されているが、これに限定されない。
免疫測定用粒子の平均粒子径は粒度分布計や透過型電子顕微鏡像などで確認することができる。免疫測定用粒子の試液中の濃度は、使用する免疫測定用粒子の粒径や測定系全体の設計にあわせ、例えば０．０００１ｍｇ／ｍＬ～１０ｍｇ／ｍＬの範囲から適宜選択をすることができる。

本発明の免疫測定用粒子としてラテックス粒子を採用する場合、ラテックス粒子を構成する合成高分子としては特に限定はないが、例えば、ポリスチレン、スチレン－スチレンスルホン酸塩共重合体、メタクリル酸重合体、アクリル酸重合体、イタコン酸重合体、スチレン－親水性カルボキシモノマー共重合体：例えば、スチレン－メタクリル酸共重合体、スチレン－アクリル酸共重合体、スチレン－イタコン酸共重合体等が挙げられる。その中で、好ましくはスチレン－メタクリル酸共重合体、スチレン－イタコン酸共重合体、スチレンおよびスチレン－スチレンスルホン酸塩共重合体である。特に好ましくは、スチレン及びスチレン－（メタ）アクリル酸共重合体である。

スチレンスルホン酸塩の塩としては、特に限定されず、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、アンモニウム塩等が挙げられる。これらは単独で用いられてもよく、２種以上が併用されてもよい。なかでも、スチレンスルホン酸ナトリウムが好ましく用いられる。
本発明に使用される親水性カルボキシルモノマーとしては、メタクリル酸、アクリル酸、イタコン酸、マレイン酸、フマル酸などを用いることができる。好ましくは、メタクリル酸、アクリル酸を用いることができる。
免疫測定用粒子としてラテックス粒子を採用する免疫凝集法を特にラテックス免疫凝集法（ＬＴＩＡ）という。

（特異的結合パートナー）
本発明において、ラテックス粒子に担持される測定対象物質に対する特異的結合パートナーとしては、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、脂質、糖質、核酸、ハプテンなどが挙げられ、分子量の高低および天然、合成といった由来に特に制限はないが、免疫反応を利用する免疫学的測定法に使用され得る抗体または抗原が挙げられる。

（抗体）
本発明に用いる抗体は、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよい。より好ましくは、モノクローナル抗体である。
本発明の抗体としては、抗体分子全体のほかに抗原抗体反応活性を有する抗体の機能性断片を使用することも可能である。一般的な動物（マウス、ヤギ、ヒツジなど）への免疫工程を経て得られたもののほか、遺伝子組み換え技術等により免疫原（測定対象物質）を免疫する動物とは異なる動物種のアミノ酸配列に変化させた抗体（キメラ抗体、ヒト化抗体、又は完全ヒト化抗体等）であってもよい。抗体の機能性断片としては抗原抗体反応活性を有する断片であるＦ（ａｂ'）₂、Ｆａｂ'や一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）などが挙げられる。これらの抗体の機能性断片は前記のようにして得られた抗体をタンパク質分解酵素（例えば、ペプシンやパパインなど）で処理することにより製造できる。

（試料）
本発明の測定対象物質を含む検体としては、例えばヒト又は動物の血液、血清、血漿、培養上清、尿、髄液、唾液、汗、腹水、又は細胞あるいは組織の抽出液等が挙げられる。
本発明における試料は、生体から得られた前記検体そのもののほかに、希釈、精製などの前処理を行った検体も含まれる。

（測定対象物質）
本発明の免疫測定試薬は、前記試料に含有される種々の物質を測定対象物質とすることができる。測定対象物質としては、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、脂質、糖質、核酸、ハプテンなどが挙げられるが、理論的に測定可能な物質であれば特に制限はない。例えばＣＲＰ（Ｃ反応性タンパク質）、Ｌｐ（ａ）、ＭＭＰ３（マトリクスメタロプロテイナーゼ３）、抗リン脂質抗体、ＩＶ型コラーゲン、ＰＳＡ、ＢＮＰ（脳性ナトリウム利尿ペプチド）、インスリン、アルブミン、シスタチンＣ、ＲＦ（リウマチ因子）、ＫＬ－６、プロカルシトニン、ＦＤＰ、Ｄダイマー、ＳＦ（可溶性フィブリン）、ＴＡＴ（トロンビン－アンチトロンビンＩＩＩ複合体）、ＰＡＩ－１や、フェニトイン、フェノバルビタール、カルバマゼピン、バルプロ酸、テオフィリンなどが挙げられる。

（試薬構成）
本発明の免疫学的測定用試薬は、一試液、もしくは二試液以上の複数の試液から構成される。複数の試液の例としては、測定対象物質を測定に好適な濃度に調整したり、抗原抗体反応の環境を調整したりするなどを目的とする緩衝液からなる試液、抗体結合粒子を含有する試液等が挙げられる。本発明のジャカリンは測定時の混液状態において試料に由来する非特異抑制効果を発揮でき、構成試薬の安定性に影響がない範囲において、構成試薬のいずれかあるいはすべてに含まれてもよい。
ラテックス粒子を用いる免疫学的測定用試薬の場合は、緩衝液を含む第一試薬とラテックスを含む第二試薬とを含み、いずれか一方あるいは両方にジャカリン関連レクチンを含有する試薬が例示できる。また、検体前処理液にジャカリンを含有してもよい。ジャカリン関連レクチンの各構成試薬中における濃度は、測定時である、試薬と試料の混合状態において前記免疫反応系内の濃度に調整しうるような形態で含まれていればよく、各試薬型により異なる。

（ラテックス免疫凝集法（ＬＴＩＡ）
ＬＴＩＡにより測定対象物質を測定する方法としては、大きく二つに大別することができる。
一つ目は、測定対象物質に対する特異的結合パートナーを固定化したラテックス粒子と、測定対象物質とを反応させ、サンドイッチ型の免疫複合体を形成させ、免疫複合体形成に伴う当該ラテックス粒子の凝集の程度から測定対象物質を測定する方法である。
二つ目は、試薬中に複数の測定対象物質又はその類縁体（これらの断片を含む）を固定化した蛋白質等を添加しておき、これらと試料中の測定対象物質とを競合させて、試薬中に含まれる測定対象物質と測定対象物質に対する特異的結合パートナーを固定化したラテックス粒子との免疫複合体の形成を阻害し、免疫複合体の形成阻害に伴う当該ラテックス粒子の凝集阻害の程度から測定対象物質（抗原）を測定する方法である。
測定対象物質と測定対象物質に対する特異的結合パートナーは、目的に応じて任意の物質を選択することができる。例えば、測定対象物質が抗原であれば、測定対象物質に対する特異的結合パートナーとしてポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（組み換え型抗体および各抗体の機能性断片を含む）などの抗体を選択することができる。測定対象物質が抗体であれば、測定対象物質に対する特異的結合パートナーとして天然型および組み換え型抗原などの抗原を選択することができる。本願発明は上記いずれの方法にも用いることができ、具体的には、以下の工程が例示される。
（１）液相中で、試料とジャカリンとを接触させる工程
（２）（１）工程の後に、前記ラテックス粒子を液相中に添加する工程
（３）（２）の工程の後に、当該測定対象物質と当該ラテックス粒子の凝集反応を測定する工程
ここで、（３）の工程は、「（２）の工程の途中、あるいは（２）の工程の後に、洗浄・分離工程を経ることなく当該測定対象物質と当該ラテックス粒子の凝集反応を測定する工程」であることを意味する。

ＬＴＩＡの測定方法としては、生じた凝集の程度を光学的あるいは電気化学的に観察することにより被検物質を測定できる。光学的に観察する方法としては、散乱光強度、吸光度、又は透過光強度を光学機器で測定する方法（エンドポイント法、レート法等）が挙げられる。 試料を測定して得た吸光度等の測定値を、標準物質（測定対象物質の濃度が既知の試料）を測定して得た吸光度等の測定値と比較して、試料中に含まれていた測定対象物質の濃度（定量値）を算出する。なお、透過光又は散乱光などの吸光度等の測定は、１波長測定であっても、又は２波長測定（２つの波長による差又は比）であってもよい。測定波長は、５００ｎｍから９００ｎｍの中から選ばれるのが一般的である。

本発明の試料中の測定対象物質の測定は、用手法により行ってもよいし、又は測定装置等の装置を用いて行ってもよい。測定装置は、汎用自動分析装置であっても、専用の測定装置（専用機）であってもよい。また、この測定は、２ステップ法（２試薬法）等の複数の操作ステップにより行う方法によって実施することが好ましい。

（特異的結合パートナーを担持したラテックス粒子）
測定対象物質に対する特異的結合パートナーは、物理的吸着法、化学的結合法又はこれらの併用等の公知の方法によりラテックス粒子に固定化して担持させることができる。
物理的吸着法による場合は、公知の方法に従い、測定対象物質に対する特異的結合パートナーと、ラテックス粒子とを、緩衝液等の溶液中で混合し接触させたり、又は緩衝液等に溶解した測定対象物質に対する特異的結合パートナーを、担体に接触させたりすること等により行うことができる。
また、化学的結合法により行う場合は、日本臨床病理学会編「臨床病理臨時増刊特集第５３号 臨床検査のためのイムノアッセイ－技術と応用－」，臨床病理刊行会，１９８３年発行；日本生化学会編「新生化学実験講座１ タンパク質IV」，東京化学同人，１９９１年発行等に記載の公知の方法に従い、測定対象物質に対する特異的結合パートナーと、担体とを、グルタルアルデヒド、カルボジイミド、イミドエステル又はマレイミド等の二価性の架橋試薬と混合、接触させ、測定対象物質に対する特異的結合パートナーと、担体の、それぞれのアミノ基、カルボキシル基、チオール基、アルデヒド基又は水酸基等と前記の二価性の架橋試薬とを反応させること等により行うことができる。

ラテックス粒子が担持する特定物質に対する特異的結合パートナーは、サンドイッチを形成するために複数種類であることが好ましい。特定物質に抗体認識部位が複数存在する場合は、特異的結合パートナーは一種類でも良い。例えば、特異的結合パートナーがモノクローナル抗体の場合には、認識部位の異なる複数のモノクローナル抗体を用いる。また、例えば、特異的結合パートナーがポリクローナル抗体の場合には、１種の抗血清由来のポリクローナル抗体でもよいし、複数種の抗血清由来のものでもよい。また、モノクローナル抗体とポリクローナル抗体を組み合わせて用いてもよい。

なお、ラテックス粒子の自然凝集や、非特異的反応等を抑制するために処理を行う必要があれば、ラテックス粒子の表面に、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイン、ゼラチン、卵白アルブミン若しくはその塩などのタンパク質、界面活性剤又は脱脂粉乳等を接触させ被覆させること等の公知の方法により処理して、担体のブロッキング処理（マスキング処理）を行ってもよい。

（非特異反応の抑制方法）
生体試料中に含まれる何らかの成分により、測定対象物質に対する特異的結合パートナーを固定化した免疫測定用粒子に生じるべきでない凝集が生じたり（正の測定誤差）、あるいは生じるべき凝集が生じなかったり（負の測定誤差）することがしばしば発生する。
これらは非特異的反応と呼ばれ、様々な測定誤差の原因となることが知られている。
本発明において、非特異反応を抑制するとは、生体試料中の上記の非特異反応を生じさせる因子（非特異因子）に働きかけ、免疫反応以外の反応による測定への影響を抑制することをいう。本発明はジャカリン関連レクチン存在下で免疫反応を行うことにより、非特異反応を抑制することができる。

(試薬キット)
本発明の試薬キットは、キット構成に少なくともジャカリン関連レクチンを含むことを特徴とする。キット構成としては、免疫測定に関わる試薬のほか、試料希釈液、試料抽出液などが挙げられるが、本発明のジャカリン関連レクチンはこのいずれか１つ、あるいは２つ以上に含むことができる。
特に、免疫学的測定法がラテックス免疫凝集測定法である場合は、以下の試薬構成を含むことが好ましい。
（１）ジャカリン関連レクチンを含む第１試薬
（２）測定対象物質に対する特異的結合パートナーを担持するラテックス粒子を含む第２試薬
第１試薬は典型的には緩衝液を含み、ジャカリン関連レクチンの緩衝液中における濃度は、測定時である、試薬と試料の混合状態において前記好ましいジャカリン関連レクチン濃度に調整しうるような形態で含まれていればよく、各試薬型により異なる。ジャカリン関連レクチンは第１試薬のほかに第２試薬に含まれていてもよい。
キットの構成は、上記のほかに、使用説明書、試料採取用具（採取ピペット、シリンジ、綿棒、ろ過フィルターなど）が挙げられる。

（非特異反応抑制剤）
本発明の非特異反応抑制剤は、免疫学的測定法における試料に由来する非特異反応を抑制するための薬剤であり、少なくともジャカリン関連レクチンを有効成分として含む。上記試薬キット中のジャカリンを含む構成をそのまま使用することができる。

（その他の試薬成分）
本発明の免疫測定試薬は、不溶性担体粒子の凝集形成を増強する成分としてポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、リン脂質ポリマーなどの高分子を含んでもよい。
また、凝集の形成をコントロールする成分として、タンパク質、アミノ酸、糖類、金属塩類、界面活性剤類、還元性物質やカオトロピック物質など汎用される成分を１種類、または複数の成分を組み合わせて含んでもよい。
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

以下に本願発明のジャカリン及びその他の非特異反応抑制物質を添加した試薬により可溶性インターロイキン２受容体（以下、ｓＩＬ－２Ｒという）の測定を行った試験について示す。なお、試料としては、非特異反応を呈し、真値から測定値が大きく乖離する試料を用いた。具体的には、非特異反応の主原因がＩｇＡと思われる試料Ａ、同じくＩｇＧと思われる試料Ｂ、ＩｇＭと思われる試料Ｃを被検試料として用いた。

[参考例１]（抗ｓＩＬ－２Ｒモノクローナル抗体の取得）
ｓＩＬ－２Ｒに対するモノクローナル抗体を、ＷＯ２０１７／０５７６２２記載の方法で取得した。さらにＷＯ２０１７／０５７６２２記載の方法に則り、サンドイッチ免疫測定に適用可能な抗体の組み合わせ（クローン番号９２２１２、９２２０４Ｒ）を選択した。

[比較例１](ＥＬＩＳＡによる測定)
参考例１で取得した抗ｓＩＬ－２Ｒモノクローナル抗体（クローン番号９２２１２）を１０μｇ／ｍＬになるよう、１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２；以下、ＰＢＳという）に溶解し、該溶解液１００μＬを９６穴マイクロプレートの各ウェルに分注して、４℃で１晩静置した。
前記各ウェルを０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を含むＰＢＳ（以下、ＰＢＳＴという）４００μＬで３回洗浄した後、１％牛血清アルブミンを含むＰＢＳＴ（以下、ＢＳＡ－ＰＢＳＴという）２００μＬを加え、室温で１時間ブロッキングを行った。これをＥＬＩＳＡ用プレートとした。
前記ＥＬＩＳＡ用プレートの各ウェルをＰＢＳＴ４００μＬで３回洗浄した後、ＢＳＡ－ＰＢＳＴで４０倍に希釈した試料１００μＬを前記各ウェルに添加し、室温で１時間静置した。前記各ウェルをＰＢＳＴ４００μＬで３回洗浄した後、ＢＳＡ－ＰＢＳＴで０．５０μg/mLに希釈したビオチン標識抗ｓＩＬ－２Ｒモノクローナル抗体（クローン番号９２２０４Ｒ）を、１００μＬを前記各ウェルに分注し、室温で１時間静置した。前記各ウェルをＰＢＳＴ４００μＬで３回洗浄した後、ＢＳＡ－ＰＢＳＴで０．２０μg/mLに希釈したＨＲＰ標識ストレプトアビジン(ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社) を１００μＬ前記各ウェルに分注し、室温で３０分間静置した。前記各ウェルをＰＢＳＴ４００μＬで３回洗浄した後、０．２％オルトフェニレンジアミン及び０．０２％過酸化水素を含むクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）５０μＬを加え、室温で１０分間放置後、４．５Ｎ硫酸５０μＬを加えて酵素反応を停止させ、波長４９２ｎｍにおける吸光度を測定した。
キャリブレーターとして濃度既知の標準物質を使用し、被検試料中のｓＩＬ－２Ｒ値を算出した。測定結果を表に示した。ＥＬＩＳＡ法はＢ／Ｆ分離をおこなうため、本比較例１で得られたｓＩＬ－２Ｒ測定値が、被検試料の真値と考えた。

[比較例２]（ＬＴＩＡによる測定：非特異反応抑制物質の添加なし）
１．試薬
特開２０１７－１８１３７７記載の方法に従い、第１試薬と第２試薬を調製した。

２．測定方法
第１試薬と第２試薬を組み合わせ、日立７１８０形自動分析装置を用いて、比較例１で検証した試料中のｓＩＬ－２Ｒ濃度を測定した。具体的には、試料５．６μＬに第１試薬１２０μＬを加えて３７℃で５分間保温した後、第２試薬４０μＬを加えて攪拌した。
凝集形成に伴う吸光度変化を、その後５分間にわたり、主波長５７０ｎｍ、副波長８００ｎｍで測定し、その吸光度変化量を濃度既知の標準物質を測定して得られる検量線にあてはめ、ｓＩＬ－２Ｒ値を算出した。測定結果を表に示した。

[比較例３]（ＬＴＩＡによる測定：抗ヒトＩｇＡ＋ＩｇＧ＋ＩｇＭポリクロ―ナル抗体添加）
比較例２で示した第１試薬に、抗ヒトＩｇＡポリクローナル抗体、抗ヒトＩｇＧポリクローナル抗体、及び抗ヒトＩｇＭポリクロ―ナル抗体の混合物（Ｓｅｒａ Ｃａｒｅ社、ＫＰＬ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｐｕｒｉｆｉｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｏ Ｈｕｍａｎ ＩｇＡ＋ＩｇＧ＋ＩｇＭ（Ｈ＋Ｌ）［Ｇｏａｔ］ ＭＳＡ）を終濃度１００μｇ／ｍＬとなるよう添加したほかは同一の方法で測定を行った。測定結果を表に示した。

[比較例４]（ＬＴＩＡによる測定：抗ヒトＩｇＭポリクロ―ナル抗体添加）
比較例２で示した第１試薬に、抗ヒトＩｇＭポリクロ―ナル抗体（ＷｕＸｉ ＡｐｐＴｅｃ社、Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＭ）を終濃度１００μｇ／ｍＬとなるよう添加したほかは同一の方法で測定を行った。測定結果を表１に示した。

[比較例５]（ＬＴＩＡによる測定：抗ヒトＩｇＡポリクロ―ナル抗体添加）
比較例２で示した第１試薬に、抗ヒトＩｇＡポリクロ―ナル抗体（ＷｕＸｉ ＡｐｐＴｅｃ社、Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＡ）を終濃度１００μｇ／ｍＬとなるよう添加したほかは同一の方法で測定を行った。測定結果を表１に示した。

[実施例１]（ＬＴＩＡによる測定：ジャカリン添加）
比較例２で示した第１試薬に、ジャカリン－I（有限会社 細胞外基質研究所製）を終濃度１００または４００μｇ／ｍＬとなるよう添加したほかは同一の方法で測定を行った。測定結果を表１に示した。

(結果と考察)
試料Ａについて、ＥＬＩＳＡによるｓＩＬ－２Ｒ値は２６６Ｕ／ｍＬであった（比較例１）。ＬＴＩＡにて、非特異反応抑制物質を添加しない場合、本試料の測定値は１１７９Ｕ／ｍＬであり（比較例２）、比較例１に対して大きく乖離した。試料中に含まれる非特異因子ＩｇＡを主要因とする非特異反応と示唆された。
これに対して、抗ヒトＩｇＡポリクローナル抗体、抗ヒトＩｇＧポリクローナル抗体及び抗ヒトＩｇＭポリクロ―ナル抗体の混合物を添加した場合の測定値は１０４７Ｕ／ｍＬ（比較例３）、抗ヒトＩｇＭポリクロ―ナル抗体を添加した場合の測定値は１１６０Ｕ／ｍＬ（比較例４）と比較例２と同等の値を示し、非特異反応の抑制効果は認められなかった。抗ヒトＩｇＡポリクロ―ナル抗体を添加した場合の測定値は５６４Ｕ／ｍＬ（比較例５）となり、非特異反応の抑制効果は認められたものの、比較例１に対して依然として約２倍の値を示していたことから、本物質による非特異反応の抑制効果は不十分であった。
一方、本願発明であるジャカリンを１００μｇ／ｍＬ添加した場合の測定値は３４２Ｕ／ｍＬ、ジャカリンを４００μｇ／ｍＬ添加した場合の測定値は３３７Ｕ／ｍＬとなり、比較例１に近い値を示した。このように、本願発明であるジャカリンにより、試料中の非特異因子ＩｇＡによって生じる非特異反応を抑制する効果があることが示された。
試料Ｂ、試料Ｃにおいても同様に、本願発明のジャカリンを添加した場合の測定値は、非特異反応抑制物質を添加しない場合（比較例２）、および他の非特異反応抑制物質等を添加した場合（比較例３、４、５）と比較して、ＥＬＩＳＡ（比較例１）によるｓＩＬ－２Ｒ値に近い値を示した。従って、本願発明であるジャカリンにより、試料中の非特異因子ＩｇＧやＩｇＭを主要因とする非特異反応を抑制する効果があることが示された。
なお、ジャカリンは、糖タンパク質の精製や免疫学的測定方法において測定対象物質の捕捉に用いられることが知られているが（特許文献３，４）、免疫学的測定方法において、非特異反応抑効果を示すことは知られておらず、本願発明によって初めて見出された知見といえる。
特に、抗ヒトＩｇＡ＋ＩｇＧ＋ＩｇＭポリクロ―ナル抗体や抗ヒトＩｇＭポリクロ―ナル抗体、抗ヒトＩｇＡポリクロ―ナル抗体によっても十分に抑制できなかった非特異反応を本願発明のジャカリンによって抑制することができた意義は大きい。

本発明により、ジャカリン存在下で免疫反応を行うことにより試料中に非特異因子が含まれている場合でも正確な免疫測定方法を実現することが可能となった。

Claims (17)

1. 試料中の測定対象物質を免疫学的に測定する方法において、非特異反応抑制剤としてのジャカリン関連レクチン存在下で免疫反応を行うことを特徴とする免疫学的測定法。
2. 免疫学的測定法が、ホモジーニアス法に基づく方法である請求項１に記載の免疫学的測定法。
3. ホモジーニアス法に基づく方法が、ラテックス免疫凝集測定法である請求項１又は２に記載の免疫学的測定法。
4. ジャカリン関連レクチンがジャカリンである、請求項１～３のいずれかに記載の免疫学的測定法。
5. 試料中の測定対象物質を免疫学的に測定する方法における非特異反応抑制方法であって、
   非特異反応抑制剤としてのジャカリン関連レクチン存在下で免疫反応を行うことを特徴とする非特異反応抑制方法。
6. 免疫学的測定法が、ホモジーニアス法に基づく方法である請求項５に記載の非特異反応抑制方法。
7. ホモジーニアス法に基づく方法が、ラテックス免疫凝集測定法である請求項５又は６に記載の非特異反応抑制方法。
8. ジャカリン関連レクチンがジャカリンである、請求項５～７のいずれかに記載の非特異反応抑制方法。
9. ジャカリン関連レクチンを非特異反応抑制剤として含む免疫学的測定用試薬。
10. 免疫学的測定法が、ホモジーニアス法に基づく方法である請求項９に記載の免疫学的測定用試薬。
11. ホモジーニアス法に基づく方法が、ラテックス免疫凝集測定法である請求項１０に記載の免疫学的測定用試薬。
12. ジャカリン関連レクチンがジャカリンである、請求項９～１１のいずれかに記載の免疫学的測定用試薬。
13. ジャカリン関連レクチンを非特異反応抑制剤として含む免疫学的測定用試薬キット。
14. 免疫学的測定法がラテックス免疫凝集測定法であって、以下を含む請求項１３に記載の免疫学的測定用試薬キット。
    （１）ジャカリン関連レクチンを非特異反応抑制剤として含む第１試薬
    （２）測定対象物質に対する特異的結合パートナーを担持するラテックス粒子を含む第２試薬
15. ジャカリン関連レクチンがジャカリンである、請求項１３又は１４に記載の免疫学的測定用試薬キット。
16. ジャカリン関連レクチンを有効成分として含む、免疫学的測定方法における非特異反応抑制剤。
17. ジャカリン関連レクチンがジャカリンである、請求項１６に記載の非特異反応抑制剤。