[go: up one dir, main page]

JP3420765B2 - レーザー励起技術を用いる生物学的および他の分析のためのアップコンバート性レポータ - Google Patents

レーザー励起技術を用いる生物学的および他の分析のためのアップコンバート性レポータ

Info

Publication number
JP3420765B2
JP3420765B2 JP50828294A JP50828294A JP3420765B2 JP 3420765 B2 JP3420765 B2 JP 3420765B2 JP 50828294 A JP50828294 A JP 50828294A JP 50828294 A JP50828294 A JP 50828294A JP 3420765 B2 JP3420765 B2 JP 3420765B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
label
probe
phosphorus
excitation
emission
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
JP50828294A
Other languages
English (en)
Other versions
JPH08501632A (ja
Inventor
ザーリング，デヴイツド・エー
ロツシ，ミシエル・ジエイ
ペツパーズ，ノーマン・エー
ケーン，ジエームズ
フアリス，グレゴリー・ダブリユー
ダイヤー，マーク・ジエー
Original Assignee
エス・アール・アイ・インターナシヨナル
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by エス・アール・アイ・インターナシヨナル filed Critical エス・アール・アイ・インターナシヨナル
Publication of JPH08501632A publication Critical patent/JPH08501632A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP3420765B2 publication Critical patent/JP3420765B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/6456—Spatial resolved fluorescence measurements; Imaging
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y15/00—Nanotechnology for interacting, sensing or actuating, e.g. quantum dots as markers in protein assays or molecular motors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/6818—Hybridisation assays characterised by the detection means involving interaction of two or more labels, e.g. resonant energy transfer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/6452—Individual samples arranged in a regular 2D-array, e.g. multiwell plates
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/6452—Individual samples arranged in a regular 2D-array, e.g. multiwell plates
    • G01N21/6454—Individual samples arranged in a regular 2D-array, e.g. multiwell plates using an integrated detector array
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/588—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with semiconductor nanocrystal label, e.g. quantum dots
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00277—Apparatus
    • B01J2219/00279—Features relating to reactor vessels
    • B01J2219/00306—Reactor vessels in a multiple arrangement
    • B01J2219/00313—Reactor vessels in a multiple arrangement the reactor vessels being formed by arrays of wells in blocks
    • B01J2219/00315—Microtiter plates
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00605—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00605—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports
    • B01J2219/0061—The surface being organic
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00605—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports
    • B01J2219/00612—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports the surface being inorganic
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00605—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports
    • B01J2219/00614—Delimitation of the attachment areas
    • B01J2219/00617—Delimitation of the attachment areas by chemical means
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00605—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports
    • B01J2219/00623—Immobilisation or binding
    • B01J2219/00626—Covalent
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00646—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being bound to beads immobilised on the solid supports
    • B01J2219/00648—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being bound to beads immobilised on the solid supports by the use of solid beads
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00659—Two-dimensional arrays
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/0068—Means for controlling the apparatus of the process
    • B01J2219/00702—Processes involving means for analysing and characterising the products
    • B01J2219/00707—Processes involving means for analysing and characterising the products separated from the reactor apparatus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B60/00—Apparatus specially adapted for use in combinatorial chemistry or with libraries
    • C40B60/14—Apparatus specially adapted for use in combinatorial chemistry or with libraries for creating libraries
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N2021/6417—Spectrofluorimetric devices
    • G01N2021/6419—Excitation at two or more wavelengths
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N2021/6417—Spectrofluorimetric devices
    • G01N2021/6421—Measuring at two or more wavelengths
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N2021/6484—Optical fibres

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 本発明は一般に、たとえば蛋白質、炭水化物、核酸、
細菌、ウィルスおよび真核性細胞のような可溶性、懸濁
もしくは微粒子物質またはアナライトを検出するための
分析法に有用な検出可能なラベルおよび組成物に関し、
より詳細にはルミネセント（燐光性もしくは蛍光性）ラ
ベルを含む組成物および方法に関するものである。
たとえば蛋白質、薬物およびポリヌクレオチドのよう
な特定の巨大分子物質を検出する方法は、特に正常およ
び異常な組織試料および遺伝子物質の分子組成を特性化
するため生物学および医学において極めて価値ある分析
技術であると証明されている。種々異なる多くの種類の
この種の検出法は、生物医学研究および臨床実験医学に
て広く使用されている。この種の検出法の例は次のもの
を包含する：免疫分析、顕微鏡検査のための免疫化学染
色、蛍光活性化細胞選別（FACS）、核酸ハイブリッド
化、水試料採取、空気試料採取など。
典型的には、検出法は特定の標的巨大分子物質に結合
して検出可能な信号を発生する少なくとも１種の分析試
薬を用いる。これら分析試薬は典型的には次の２種の成
分を有する：（１）プローブ巨大分子、たとえば高度の
特異性および親和性にて標的巨大分子に結合しうる抗体
もしくはオリゴヌクレオチド、並びに（２）たとえば放
射性同位元素または共有結合した蛍光染料分子のような
検出可能なラベル。一般にプローブ巨大分子の結合性が
この検出法の特異性を規定し、関連するラベルの検出性
がこの検出法の感度を決定する。検出の感度は用いるラ
ベルの種類、並びにこれを検出すべく入手しうる装置の
品質および種類の両者に関係する。
たとえば放射性免疫分析（RIA）は、生物学的巨大分
子の検出および定量するため用いられる最も鋭敏かつ特
異的な分析法である。放射性免疫分析技術は、たとえば
ポリペプチド、薬物、ステロイドホルモン、ポリヌクレ
オチド、代謝物および腫瘍マーカーのような生物学的試
料における微量の特定アナライトの検出および測定に使
用されている。放射性免疫分析法は、分析試薬としての
１種もしくはそれ以上の放射性同位元素で標識された免
疫グロブリンを用いる。付着した放射性同位元素ラベル
の減衰により発生する放射線（α，βもしくはγ）は、
各種の放射能分析法により検出および定量しうる信号と
して作用する。
放射性同位元素ラベルはたとえば次のような数種の利
点を有する：極めて高い検出感度、極めて低いバックグ
ランド信号、および精密な放射能分析装置（シンチレー
ションおよびγカウンタ）または安価かつ鋭敏な自動放
射能写真技術による正確な測定。しかしながら、放射性
同位元素ラベルは次のような幾つかの欠点をも有する：
潜在的な健康被害、処分の困難性、特殊な認可要件、お
よび不安定性（放射能減衰および放射能分解）。さらに
放射性同位元素ラベルが典型的には電磁スペクトルの紫
外、赤外もしくは可視部分にて強力（すなわち非−セレ
ンコフ）信号を発生しないと言う事実は、放射性同位元
素を一般にたとえば顕微鏡検査、画像分光分析および流
動血球測定のような光学的検出法を用いる用途のラベル
として不適当にする。
これらおよび他の理由で臨床化学、水および空気の監
視、並びに生物医学研究の分野は、放射性同位元素を必
要としない代案の検出可能なラベルを求めている。この
種の非放射性ラベルの例は次のものを包含する：（１）
発色性基質から不溶性着色物質への変換を触媒する酵素
（たとえばアルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダ
ーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ）または蛍光性もし
くはルミネセント物質を生成する反応を触媒する酵素
（たとえばルシフェラーゼ）［ベックおよびコスター
（1990）、アナリチカル・ケミストリー、第62巻、第22
58頁;I.デュラント（1990）、ネイチャー、第346巻、第
297頁；「生物ルミネセントおよび化学ルミネセントの
分析用途」（1984）、クリッカ等（編）、アカデミック
・プレス社、ロンドン］、並びに（２）特定の吸収波長
スペクトルにて電磁エネルギーを吸収し、次いで１つも
しくはそれ以上の長い（すなわちエネルギーの低い）波
長にて可視光を発する直接的蛍光性ラベル（たとえばフ
ルオレスセインイソチオシアネート、ローダミン、カス
ケードブルー）。
酵素と燐光性／蛍光性もしくは比色検出可能なラベル
メとの使用は信号増幅の顕著な利点を与える。何故な
ら、単一の酵素分子は典型的には発色性基質から検出可
能な物質への変換を触媒する持続性の能力を有するから
である。適する反応条件および培養時間により単一の酵
素分子は多量の生成物を生産し、したがって相当な信号
増幅を与えることができる。しかしながら、ラベルとし
て酵素を用いる検出法は、着色物質の生成および検出に
適する条件下で、適切な基質濃度を与えるには追加工程
および試薬を必要とする点で不利である。さらに、酵素
ラベルに基づく検出法は典型的には、検出可能量の生成
物を生ぜしめるには長時間を必要とすると共にプローブ
分子に付着しない不溶性物質を発生する。
酵素ラベルの他の欠点は、酵素標識されたプローブに
より複数の標的物質を検出するのが困難なことである。
２種もしくはそれ以上の個々の酵素ラベル物質につき反
応条件および展開時間を最適化するには問題があり、さ
らに発色性最終生成物には顕著なスペクトル重複がしば
しば存在して反応生成物の識別を困難にする。
蛍光性ラベルは酵素ラベルにおける信号増幅の利点を
与えないが、蛍光性ラベルは免疫細胞化学にて広く承認
されうるような顕著な利点を有する。蛍光性ラベルは典
型的には小さい有機染料分子、たとえばフルオレスセイ
ン、テキサスレッドもしくはローダミンであって、たと
えば免疫グロブリンまたはスタフィロコッカス・アウレ
ウス蛋白Ａのようなプローブ分子に容易に結合すること
ができる。蛍光性分子（発蛍団）は適する励起周波数の
光で照明して検出することができ、得られるスペクトル
放出は電気光学センサまたは光学顕微鏡により検出する
ことができる。
広範な種類の蛍光染料を入手することができ、励起お
よび発光スペクトルの選択を与える。複数標的の検出お
よび識別を複数プローブ（各プローブ物質は異なる発蛍
団に結合する）にて可能にするよう充分異なる発光スペ
クトルを持った発蛍団を選択することができる。発蛍団
のスペクトルは狭いバンド励起および発光スペクトルの
選択的検出の両者に基づいて識別しうるので、２種もし
くはそれ以上の異なる標的物質を検出すると共に決定す
ることができる［チツス等（1982）、ジャーナル・イミ
ュノロジカル・メソッズ、第50巻、第193頁；ニーダー
ロフ等（1989）、サイトメトリー、第10巻、第20頁;J.
S.プロエム、アナリチカル・NYアカデミー・サイエン
ス、第177巻、第414頁］。
残念ながら、蛍光性ラベルを用いる検出法は各種の理
由で限られた感度を有する。第１に、通常の発蛍団では
非特異的バックグランド信号から特異的蛍光信号を識別
するのが困難である。最も一般的な発蛍団は幅広な吸収
および発光スペクトルを有する芳香族有機分子であっ
て、励起（すなわち吸収）波長よりも長い波長まで最大
発光スペクトルが50〜100nmだけ赤色に移動する。典型
的には、吸収バンドと発光バンドとの両者はスペクトル
のUV/可視部分に存在する。さらに、蛍光発光の寿命は
一般に１〜100nsの程度に短い。残念ながら、有機染料
蛍光のこれら一般的特徴は、他の試薬（たとえば固定剤
もしくは血清）または自己蛍光性もしくは試料自身によ
り与えられるバックグランド信号にも適用しうる［ジョ
ングキンド等（1982）、エキスペリメンタル・セル・リ
サーチ、第138巻、第409頁;J.E.オービン（1979）、ジ
ャーナル・ヒストケミカル・サイトケミストリー、第27
巻、第36頁］。光学レンズおよび反射励起光の自己蛍光
性は可視スペクトルにおけるバックグランドノイズの付
加的発生源である［ベベルロー等（1991）、サイトメト
リー、第11巻、第784頁；ベベルロー等（1992）、サイ
トメトリー、第13巻、第561頁］。したがって、典型的
な発蛍団からの特異的蛍光信号の検出限界は、非特異的
な蛍光および反射励起光により与えられる顕著なバック
グランドノイズによって制限される。
感度を制限する有機染料発蛍団の第２の問題は染料分
子の光分解（すなわち光漂白）である。すなわちバック
グランドノイズが比較的低い状況においても、弱い蛍光
信号を長い検出時間にわたり積算することがしばしば不
可能である。何故なら、染料分子が紫外および近紫外バ
ンドにおける入射光の関数として分解するからである。
しかしながら、蛍光ラベルは各種の用途に魅力的であ
るため、鋭敏な検出につき有利な性質を有する幾つかの
代案発蛍団が提案されている。１つの手段は、非特異的
蛍光性ノイズが減少するスペクトルの遠赤外もしくは近
赤外領域にて発光するフィコビリ蛋白アクセプタ分子染
料からなる有機染料を用いることである。フィコビリ蛋
白は、エネルギー移動メカニズムを介して大きいストー
クシフトの作用を示す付属分子と組合せて使用される
［米国特許第4,666,862号；オイ等（1982）、ジャーナ
ル・セル・バイオロジー、第93巻、第891頁］。フィコ
ビリ蛋白ラベルは、は励起周波数と発光周波数との間の
スペクトル重なり程度を減少させる。他の代案手法は、
黄色もしくは赤色領域にて吸収すると共に自己蛍光が減
少する赤色もしくは遠赤外にて発光するシアニン染料を
使用することである［ムジャンバール等（1989）、サイ
トメトリー、第10巻、第11頁］。
しかしながら、フィコビリ蛋白およびシアニン染料の
両者では発光周波数は赤色移動（すなわち周波数低下移
動）すると共に発光寿命が短く、したがってバックグラ
ンド自己蛍光が完全にはノイズ発生源として除去されな
い。より重要なことに、フィコビリ蛋白およびシアニン
染料は幾つかの明確な欠点を有する：（１）赤色、遠赤
外および近赤外領域における発光は肉眼による検出につ
き大して適さず、フィコビリ蛋白およびシアニンラベル
を光学蛍光顕微鏡で使用することを妨げ；（２）シアニ
ン、フィコビリ蛋白および結合付属分子（たとえばアズ
レＡ）は光漂白を受け易くかつ他の試薬との望ましくな
い化学相互作用をもたらす有機分子であり；さらに
（３）発光される照射線はダウンコンバート（down−co
nvert）され、すなわち吸収励起光よりも長い波長を有
する。たとえばアズレＡは632nmにて吸収すると共に645
nmにて発光する一方、アロフィコシアニンは645nmにて
吸収すると共に655nmにて発光し、したがって分散励起
光からの自己蛍光およびバックグランドノイズは除去さ
れない。
提案されている他の代案種類の発蛍団はダウンコンバ
ート性ルミネセントランタニドキレートである［ソイニ
およびロブグレン（1987）、CRC Crit.Rev.Anal.Che
m.、第18巻、第105頁；ライフ等（1977）、クリニカル
・ケミストリー、第23巻、第1492頁；ソイニおよびヘミ
ラ（1979）、クリニカル・ケミストリー、第25巻、第35
3頁；セベウス等（1992）、サイトメトリー、第13巻、
第329頁］。ダウンコンバート性ランタニドキレートは
大きい下方向のストークス移動（すなわち発光最大は典
型的には吸収最大よりも少なくとも100nm大である）を
有する無機燐であって、分散励起光からの信号の識別に
役立つ。ランタニド燐は、タイムゲート検出法に使用し
うるよう充分長い（すなわち１μｓより大）発光寿命を
有し、短寿命の自己蛍光および分散励起光によりもたら
されるノイズを減少させうるが、完全には除去しえな
い。さらにランタニド燐は狭いバンド発光を有し、特に
レーザー励起源を用いる場合はバックグランドノイズお
よび分散励起光に対し波長識別を容易化する（ライヒシ
ュタイン等（1988）、アナリチカル・ケミストリー、第
60巻、第1069頁］。最近、ダウンコンバート性ランタニ
ドキレートを用いる酵素増幅のランタニドルミネセント
が蛍光標識技術として提案されている［エバンゲリスタ
等（1991）、アナリチカル・バイオケミストリー、第19
7巻、第213頁；グジン−テンプレトン等（1991）、クリ
ニカル・ケミストリー、第37巻、第1506頁］。
最近までダウンコンバート性ランタニド燐は、その水
性（酸素化）溶液における量子効率が細胞化学染色には
不適にするような低さを有するという顕著な欠点を有し
た。ベベルロー等（上記）は、時間分解法により検出し
うる信号を水溶液中で発生する特定のダウンコンバート
性ランタニド燐（ヨーロピウムで活性化されたイットリ
ウムオキシスルフィド）を記載している。セベウス等
（上記）は、時間分解の蛍光顕微鏡法と組合せたダウン
コンバート性ヨーロピウムキレートを用いて即発蛍光か
らの信号を排除することにより自己蛍光を減少させてい
る。タンケ等（米国特許第5,043,265号）は、免疫グロ
ブリンおよびポリヌクレオチドのためのラベルとしてダ
ウンコンバート性燐粒子を報告している。
しかしながら、ベベルロー等のダウンコンバート性ラ
ンタニド燐およびセベウス等のヨーロピウムキレート
は、紫外範囲にある最大励起波長を必要とし、したがっ
て顕著な試料自己蛍光およびバックグランドノイズ（た
とえば血清および／または固定剤の蛍光、励起光分散、
および屈折など）を発生し、これらは排除せねばならな
い（たとえばフィルタまたは時間ゲートの信号排除によ
り）。さらに、紫外線照射による励起は核酸および他の
生物学的巨大分子を損傷し、生存細胞の生存力を保持す
ると共に細胞構造（たとえばFACS、サイト−アーキテク
チュラル−マイクロスコピー）を保持することが望まし
い免疫細胞化学用途につき重大な問題を提起する。
強力に集中するレーザーパルスの流れを用いるUV励起
性蛍光有機染料（ヘキスト33258）の２−フォトン励起
につき、レーザー走査蛍光顕微鏡法が使用されている
［デンク等（1990）、サイエンス、第248巻、第73
頁］。デンク等により使用された有機発蛍団は、画像形
成の過程で強力な高集中レーザー光により顕著に光漂白
された。
したがって、特定ラベル信号の鋭敏な光学的および／
または顕微鏡的検出を可能にすると共に非特異的なバッ
ククグランドノイズをほぼ完全に排除し、しかも生存完
全細胞および水性もしくは空気性環境に対し適合しうる
ようなラベルおよび検出法につき相当なニーズが当業界
に存在する。
本明細書に挙げた引例は本出願の出願日前に開示され
たものである。しかしながら、これらは決して本発明の
特許性を妨げるものでない。
発明の要点 本発明は、多重標的検出および標的識別につき使用し
うる超鋭敏な細胞、生物学的巨大分子および他のアナラ
イトの検出を可能にするラベル、検出法および検出装置
を提供する。
本発明のアップコンバート性（up−converting）標識
は、非特異性バックグランド自己蛍光をほぼ完全に排除
しうると共に典型的にはそれぞれスペクトルの赤外もし
くは可視部分に存在する励起波長および発光波長を特徴
とし、したがって紫外線の強力な損傷作用を防止する。
本発明のアップコンバート性ラベルは長波長の励起照射
線（たとえば近赤外）を励起波長の約1/2〜1/3の波長の
発光照射線まで変換する。可視範囲におけるバックグラ
ンド蛍光は近赤外の励起波長を用いれば無視しうるの
で、アップコンバート性ラベルの使用は実質的にバック
グランドなしの信号検出を可能にする。
要するに、本発明はマルチフォトン励起を可能にする
と共にアップシフトした発光放出スペクトルを有するル
ミネセント物質の使用を与える。本発明の一具体例にお
いては、アップコンバート性燐（すなわち低周波数バン
ドにて複数フォトンを吸収すると共に、高周波数バンド
で発光する）をたとえば免疫クロブリン、ポリヌクレオ
チド、ストレプトアビジン、蛋白Ａ、リセプタリガンド
または他のプローブ分子のような１種もしくはそれ以上
のプローブに結合しうるラベルとして使用する。他の具
体例においては、アップコンバート性有機染料がラベル
として作用する。本発明の有機染料ラベルおよび燐ラベ
ルは自動診断試験、顕微鏡画像形成用途およびコード化
粒子検出などの多くの用途に極めて適している。
本発明の特性は、これら方法を実施する装置における
相当な融通性を与える。一般的に、励起源は任意便利な
光原とすることができ、安価な近赤外レーザーダイオー
ドまたは発光ダイオード（LED）を包含し、検出器は任
意便利な検出器、たとえばフォトダイオードとすること
ができる。単一レポータの場合、装置はレポータの励起
バンドにおける１つもしくはそれ以上の波長にて発光し
うるレーザーダイオード、およびレポータの発光バンド
における少なくとも幾つかの波長に対し敏感な検出器を
包含する。レーザー光は好ましくは試料における小さい
領域に集中し、この領域から発する光を集めて検出器に
指向させる。発光バンドにて光の強度を示す電気信号
は、存在するレポータ量の尺度を示す。検出器のスペク
トル応答に応じ、フィルタを設けて励起光を阻止する必
要がある。
複数レポータの同時検出は、少なくともリポータが異
なる励起バンドもしくは異なる発光バンドを有する場合
に可能である。励起バンドが異なる場合、それぞれ適す
る波長で発光する多重レーザーダイオードを波長分割マ
ルチプレクサまたは他の適する技術、たとえば周波数標
識、周波数変調およびロックイン検出装置を用いて組合
せる。発光バンドが異なる場合（励起バンドは異なって
も異ならなくてもよい）、異なる発光バンドにおける光
を分離して多重検出器に送信する。発光バンドが重なる
場合は単一の検出器を使用しうるが、他の検出技術も使
用される。１例は、１個のみのレポータが所定時間で発
光するよう時間マルチプレキシング技術を用いることで
ある。或いは、異なるレーザーダイオードを異なる特性
周波数で変調し、ロックイン検出を行うことができる。
本発明の検出法および検出装置は、アップコンバート
性ラベルの有利な特徴であるバックグランドノイズ（た
とえば自己蛍光性、血清／固定剤蛍光、励起光散乱）の
ほぼ完全な不存在の技術を開発してアップコンバート性
燐およびアップコンバート性有機染料の超鋭敏な検出を
可能にする。本発明の幾つかの具体例は、検出感度を最
適化し、複数試料を識別し、かつ／または単一試料にお
ける複数プローブを検出するためのタイムゲート検出お
よび／または波長ゲート検出を用いる。位相敏感検波を
用いて、アップコンバート性燐に起因する信号と異なる
位相シフトを有するバックグランドノイズ（たとえば自
己蛍光）との間の識別を与えることもできる。
たとえば赤色吸収性染料のようなアップコンバート性
有機染料を、染料により吸収されたフォトンを測定しう
る一時的電圧まで電極および慣用の電子回路により変換
する代案具体例に用いることもできる。２−フォトン吸
収を受けた後、染料を光原（たとえばレーザー）からの
他のフォトンによりイオン化させて短寿命の分子イオン
をもたらし、その存在を励起照射の後の一時的光な伝導
性を測定して検出および定量することができる。この具
体例においては、共鳴マルチフォトンイオン化が試料に
おける染料分子の個数および／または濃度の定量測定に
用いられる。さらに、照射試料で形成された実質的に全
てのフォトイオンは信号に寄与するのに対し、フォトン
は全方向に放出されて１部のみが光学系を用いて回収さ
れる。一時的な光電流の測定はフォトンを比較的簡単か
つ安価なセンサ（たとえば電極）で容易に測定される電
子信号まで効果的に変換する。
ある具体例において、本発明は１つもしくはそれ以上
の個々の周波数における励起照明を発生するための１個
もしくはそれ以上の光学レーザー源を用いる。本発明の
或る種の具体例において、アップコンバート性ラベルの
レーザー照射は、直接的吸収もしくはエネルギー移行を
含むレーザー誘起の光化学的過程を介し直接的分子環境
を改変することができる。この種のエネルギーの空間制
御沈着を用いて局部的損傷を発生させ、かつ／または所
定位置の化学環境を検査することができる。この種の具
体例において、アップコンバート性ラベルは好ましくは
光物理的触媒として作用することができる。
本発明は、化学的もしくは生物学的物質における標的
損傷（たとえば触媒作用）の発生方法を与え、ここでは
プローブを用いて結合アップコンバート性ラベルをプロ
ーブにより結合された標的生物学構造の近くの位置に局
在させる。局在化したアップコンバート性ラベルは１つ
もしくはそれ以上の励起波長により励起されると共に、
直接的な細胞毒性もしくは遺伝子毒性（たとえば過酸化
物のような遊離基の発生および／またはチミン−チミン
２量体の発生による）としうる或いは局部的な光分解化
学反応を誘発してラベルの近傍で反応性化学物質をもた
らしうる（したがって標的の生物学的物質の近傍で化学
物質を発生しうる）短波長にて発光する。すなわち、１
種もしくはそれ以上のアップコンバート性ラベル（たと
えばアップコンバート性無機燐）で標識された標的プロ
ーブを用いて生物学的構造、たとえば細胞、組織、ネオ
プラスム、血管構造または他の解剖学的もしくは組織学
的構造に標的損傷を与えることができる。
さらに本発明の具体例は、電子ビームまたは充分なエ
ネルギーを有するエネルギー照射の他のビームにより励
起しうると共に陰性ルミネセントであるアップコンバー
ト性燐をも包含する。この種の電子刺激ラベルは、超鋭
敏な生物分子検出法におけるバックグランドを除去する
という新規な利点を与える。典型的には、少なくとも２
個の電子によるアップコンバート性燐の刺激を用いて、
可視光またはUVバンド発光を生ぜしめる。
さらに本発明は、数種のアップコンバート性燐もしく
はアップコンバート性染料のマルチフォトン励起とそれ
に続くバックグランドフリーの蛍光検出とを活用するこ
とによる複数標的物質の同時検出に関する。１具体例に
おいては、１波長（または狭いバンド幅）にて同時励起
を可能にするが各プローブ−ラベル種類に識別可能な蛍
光性「指紋」が付与されるよう発光特性が変化する重な
った吸収バンドを有する数種の燐／染料を選択する。種
々の方法および装置を用いることにより、各燐もしくは
染料の存在および濃度を測定することができる。
さらに本発明は、典型的には溶液における１種もしく
はそれ以上のアナライトの存在および濃度を測定するた
めの生化学的分析法を提供する。この分析法は、アップ
コンバート性燐および／またはアップコンバート性染料
で標識されたプローブの組成物を用いると共に、アナラ
イトと標識プローブとからなる粒子を磁気的および／ま
たは光学的に捕獲するための装置を用いる。１具体例に
おいてはサンドイッチ分析を行い、粒子上に固体化され
た固定化プローブが所定アナライトに結合して粒子に対
する結合アナライトの固定化をもたらす。次いでアップ
コンバート性ラベルで標識された第２プローブが結合ア
ナライトに結合して、粒子に結合したアップコンバート
性ラベルを含有する結合サンドイッチ複合体を生成する
ことができる。種々異なるプローブ−ラベルの組合せ物
と種々の寸法、色および／または形状の粒子とを異なる
固定化プローブおよび／または種々の励起波長とを組合
せることにより、複数分析をほぼ同時的に行うことがで
きる。この多重性の利点は、単一試料における複数アナ
ライト物質の検出および定量を可能にする。さらにこれ
ら分析法はたとえば物理的、化学的、生化学的もしくは
免疫学的反応のような結合反応を包含する反応の過程を
監視するにも有用である。たとえば本発明は、ハイブリ
ダイズ速度論およびハイブリダイズしたポリヌクレオチ
ドの熱力学的安定性を含めリガンド結合反応、ポリヌク
レオチドのハイブリダイズ反応などの過程を監視すべく
使用することができる。
さらに本発明は、スペクトルの赤外部分に存在するが
細胞を顕著には損傷しない励起照射線を用い、流動血球
測定により蛍光活性化細胞選別（FACS）を行うための方
法、アップコンバート性ラベルおよび標識結合試薬の組
成物を提供する。これは、DNA傷害をもたらしかつ細胞
を損傷させることが知られた波長を含むスペクトルの紫
外部分における励起照明に依存した現在のFACS法よりも
顕著な利点を与える。
さらに本発明は、無機アップコンバート性燐に付着し
た少なくとも１個の蛍光性有機染料分子を含む組成物を
も提供する。蛍光性有機染料分子はローダミン、シアニ
ン、キサンテン、アクリジン、オキサジン、ポルフィリ
ンおよびフタロシアニンよりなる群から選択され、必要
に応じ重金属と錯体化することもできる。蛍光性有機染
料は無機アップコンバート性燐結晶に吸着させることが
でき、或いは被覆された無機アップコンバート性燐、誘
導化されたガラスセラミック・アップコンバート性燐ま
たはマイクロカプセル化された無機アップコンバート性
燐に共有付着することもできる。
図面の簡単な説明 第１図は本発明により試料につき診断を行うための代
表的装置を示す光学および電子ブロック図であり； 第2A図は単一チャンネルに関連して位相敏感検波を行
う装置を示し； 第2B図は波形発生器からの信号により第１および第２
レーザーダイオードを変調する装置を示し； 第３図はゲート検出を行う装置を示し； 第４図はそれぞれλ１およびλ２に集中すると共にλ
３の近くに重なる発光バンドを有する第１および第２レ
ポータ励起バンドを用いて試料につき診断を行う装置を
示し； 第5A、5Bおよび5C図はマルチフォトン励起方式におけ
るエネルギー状態の転移を図示し； 第６図は手持プローブを用いる小型化装置を示し； 第7A図は多数の結合部位からの放出を検出すべく使用
する電荷結合装置（CCD）列の使用を示し； 第7B図はレンズ列と組合せて使用するCCD列を示し； 第８図は光学的捕獲を用いる実施例を示し； 第９図はアップコンバート性燐粒子の染料被覆および
包封を図示し； 第10図は標的の粒子速度および水力学もしくは空気力
学特性を決定する装置を示し； 第11図は977.2nmの波長最大および約541.0nmにおける
発光最大の励起レーザー源によるナトリウムイットリウ
ムフルオライド−イッテルビウム／エルビウムアップコ
ンバート性燐の燐発光スペクトルであり； 第12図は541.0nmに設定された発光収集ウインドーに
よるナトリウムイットリウムフルオライド−イッテルビ
ウム／エルビウム燐励起スペクトルの励起走査であり； 第13図はナトリウムイットリウムフルオライド−イッ
テルビウム／エルビウムに関する励起照明を終了した後
の541.0nmにおける燐ルミネセントの時間減衰測定であ
り； 第14図はナトリウムイットリウムフルオライド−イッ
テルビウム／エルビウム燐に関する励起照明強度の関数
としての燐発光強度を示し； 第15図は970nmにて200W/cm2で励起した後におけるNa
（Ｙ0.8Yb0.12Er0.08）F4の0.3μｍ粒子に関する有効な
単一フォトン燐光断面を示し； 第16図はNa（Ｙ0.8Yb0.12Er0.08）F4粒子に関する燐
光断面の寸法依存性を示し； 第17A図は970nmレーザー源での励起により誘起された
Hepes緩衝塩水におけるアップコンバート性燐レポータ
の蛍光走査を示し； 第17B図は970nmレーザー源での励起により誘起された
Hepes緩衝塩水におけるストレプトアビジン被覆された
アップコンバート性燐レポータの蛍光スペクトル走査を
示し； 第18A図は541nmにおける発光の単色検出によるHepes
緩衝塩水におけるアップコンバート性燐レポータの励起
スペクトル走査を示し； 第18B図は541nmにおける発光の単色検出によるHepes
緩衝塩水におけるストレプトアビジン被覆されたアップ
コンバート性燐レポータの励起スペクトル走査を示し； 第19図は燐濃度とアップコンバート信号との関係を示
す（Ｙ0.86Yb0.08Er0.06）2O2Sの試料から得られた積分
信号を示し； 第20図はアナライト（たとえば抗原標的）をビオチニ
ル化抗体および固定化抗体に結合させ、アナライトが固
体基質超常磁性マイクロビーズに固定化されたサンドイ
ッチ複合体を形成することによる、溶液中のアナライト
を検出するためのサンドイッチ免疫分析の１実施例を図
示し； 第21図は異なる燐光特性を有する２種の燐で標識され
た特異的抗体による２種の細胞表面抗原の検出および識
別を図示し； 第22図は位相敏感検波のための装置を図示し； 第23図はラベルとして燐を用いると共に捕獲表面にお
ける光学繊維照射を用いる競合均一分析を図示し； 第24図はラベルとして燐を用いると共に捕獲表面に集
中した収束照射ビームを用いる競合均一抗原捕獲分析を
図示し； 第25図はラベルとして燐を用いると共に捕獲表面に集
中した収束照射ビームを用い捕獲表面が免疫沈殿物を集
める均質免疫沈殿分析を図示する。
特定具体例の説明 定義 特記しない限りここで用いる全ての技術的および化学
的用語は本発明が属する技術分野の当業者により一般的
に理解されると同じ意味を有する。個々に説明すると同
様または均等な任意の方法および材料を本発明の実施ま
たは試験に使用することもできるが、好適方法および材
料につき説明する。本発明の目的で次の用語を下記に規
定する。
ここで用いる「ラベル」という用語は適する励起条件
下で検出可能な光学信号を発生する化学置換基を意味す
る。励起したラベルにより発生する光学信号は典型的に
はスペクトルの近赤外、可視もしくは紫外部分における
電磁照射線である。本発明のラベルはアップコンバート
性ラベルであって化学置換基が励起周波数にて少なくと
も２個のフォトンを吸収すると共に次いで励起周波数よ
りも高い放出周波数にて電磁エネルギーを放出すること
を意味する。すなわち、一般に初期励起周波数と最終発
光周波数との間には顕著なストロークシフトが存在す
る。ラベルは一般にプローブに付着して、プローブの存
在および／または位置を示すレポータとして作用する。
本発明は有機および無機のアップコンバート性ラベルを
包含するが、好ましくはアップコンバート性無機ランタ
ニド燐をラベルとして使用する。たとえば本発明の典型
的なラベルはサブミクロン寸法のアップコンバート性ラ
ンタニド燐粒子である。
ここで用いる「プローブ」という用語は、標的に結合
した標識プローブを非特異的に結合した標識プローブ
（すなわちバックグランド）から識別するのに充分な親
和性で１種もしくはそれ以上の標的（たとえば抗原エピ
トープ、ポリヌクレオチド配列、巨大分子リセプタ）に
優先的に結合する結合成分を意味する。一般に、プロー
ブ−標的結合は少なくとも約１×106M-1、好ましくは少
なくとも約１×107M-1、より好ましくは少なくとも約１
×108M-1もしくはそれ以上の結合親和性（KD）を有する
非共有相互作用である。抗体は典型的には同族抗原に対
し約１×1010M-1もしくはそれ以上の結合親和性を有す
る。限定はしないが、たとえば本発明のプローブは次の
ものを包含する：抗体、ポリペプチドホルモン、ポリヌ
クレオチド、ストレプトアビジン、スタフィロコッカス
・アウレウス蛋白Ａ、リセプタリガンド（たとえばステ
ロイドもしくはポリペプチドホルモン）、ロイシンジッ
パーポリペプチド、レクチン、抗原（ポリペプチド、炭
水化物、核酸およびハプテンエピトープ）など。
ここで用いる「プローブ−ラベル結合体」および「標
識プローブ」という用語は、プローブに付着したラベル
からなる組合せ物を意味する。或る種の具体例において
は、２個以上のラベル置換基がプローブに付着するこも
できる。或いは、或る具体例においては２個以上のプロ
ーブをラベルに付着させることもできる（たとえば複数
抗体分子をサブミクロン寸法の無機アップコンバート性
燐ビーズに結合させることができる）。各種の付着化学
技術を用いてラベルをプローブに結合させることがで
き、限定はしないが次の形成を包含する：共有結合、水
素結合、イオン結合、静電気相互作用および表面張力
（相界）相互作用。さらにラベルの付着は微小球、微小
粒子、免疫ビーズおよび超常磁性ビーズ［ポリサイエン
ス・インコーポレーション社、ワーリントン、ペンシル
バニア州；バングス・ラボラトリース・インコーポレー
ション社・979キーストン・ウェイ、カルメル、IN4603
2］に対するラベルの組込をも包含する。たとえば無機
アップコンバート性燐粒子は、励起および放出電磁線の
波長範囲にて実質的に透明もしくは半透明のポリマー材
料で構成された微小球に包封することができる（米国特
許第5,132,242号、参考のためここに引用する）。この
種の微小球は、たとえば蛋白のようなプローブへの共有
結合につき１個もしくはそれ以上の反応基（たとえばカ
ルボキシル基、アミノ基、ヒドロキシル基またはポリア
クロレイン）で表面誘導化して官能化させることができ
る。プローブ−ラベル結合体はさらに燐キレートをも含
むことができる。
ここで用いる「標的」および「標的アナライト」とい
う用語は本発明の方法により分析される目的物を意味す
る。たとえば限定はしないが、標的はポリペプチド（た
とえばhGH、インシュリン、アルブミン）、グリコ蛋白
（たとえば免疫グロブリン、スロンボモジュリン、γ−
グルタミルトランスペプチダーゼ；グッドスピード等
（1989）、ジーン、第76巻、第１頁）、リポ蛋白、ウィ
ルス、微生物（たとえば病原性細菌、酵母）、ポリヌク
レオチド（たとえば細胞ゲノムDNA、現場でのハイブリ
ッド化に関する固定組織学的試料におけるRNA、ナイロ
ンもしくはニトロセルロース膜に固定化されたDNAもし
くはRNA、組織もしくは生物液におけるウィルスDNAもし
くはRNA）並びに医薬品（すなわちフィジシャンス・ド
ラグ・リフェレンスおよび／またはメルク・マニュアル
に記載された処方され或いは市販薬剤、またはたとえば
麻酔薬もしくはアナボリックステロイドのような不法物
質）を包含する。
ここで用いる「抗体」という用語は免疫グロブリン遺
伝子により実質的にコードされる１種もしくはそれ以上
のポリペプチドよりなる蛋白を意味する。認められてい
る免疫グロブリン遺伝子はκ、λ、α、γ（IgG1、Ig
G2、IgG3、IgG4）、δ、εおよびξ一定領域遺伝子、並
びに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子を包含する。
全長免疫グロブリン「軽鎖」（約25Kdもしくは214アミ
ノ酸）はNH2−末端（約110アミノ酸）にて可変領域遺伝
子によりコードされ、さらにCOOH−末端にてκもしくは
λ一定領域遺伝子によりコードされる。全長免疫グロブ
リン「重鎖」（約50Kdもしくは446アミノ酸）も同様に
可変領域遺伝子（約116アミノ酸）および他の上記一定
領域遺伝子の１種、たとえばγ（約330アミノ酸をコー
ドする）によりコードされる。免疫グロブリンの１形態
は抗体の基本的構造単位を構成する。この形態は４量体
であって、同一の２対の免疫グロブリン鎖で構成され、
各対は１個の軽鎖と１個の重鎖とを有する。各対におい
て、軽鎖および重鎖の可変領域は共に抗原に対する結合
に関与し、さらに一定領域は抗体イフェクタ機能に関与
する。抗体の他に、免疫グロブリンはたとえばFv、Fab
およびＦ（ab′）２、並びに２官能性ハイブリッド抗体
［たとえばランザベチア等、ヨーロピアン・ジャーナル
・イミュノロジー、第17巻、第105頁（1987）］のよう
な各種の他の形態、並びに一本鎖［たとえばハストン
等、プロシーディング・ナショナル・アカデミー・サイ
エンスUSA、第85巻、第5879〜5883頁（1988）；および
バード等、サイエンス、第242巻、第423〜426頁（198
8）］にて存在することもできる［一般にフード等、
「イミュノロジー」、N.Y.ベンジャーミン、第２版（19
84）；並びにフンカピラーおよびフード、ネイチャー、
第323巻、第15〜16頁（1986）参照］。すなわち必ずし
も全ての免疫グロブリンが抗体ではない［U.S.S.N.07/6
34,278号（参考のためここに引用する）およびコ等（19
91）、プロシーディング・ナショナル・アカデミー・サ
イエンスUSA、第88巻、第2869頁（参考のためここに引
用する）参照］。
ここで用いる「プローブポリヌクレオチド」という用
語は、所定の標的ポリヌクレオチドに特異的にハイブリ
ダイズするポリヌクレオチドを意味する。限定はしない
が、たとえばプローブポリヌクレオチドは特定mRNA配列
に対応するcDNAの１部、ゲノムクローンの１部、特異的
ハイブリッド化につき公知の標的配列に対し充分な配列
ホモロジーを有する合成オリゴヌクレオチド（たとえば
テロマーリピートTTAGGGもしくはAlu反復配列）、転写R
NA（たとえばSP6クローン化用ベクター挿入物から）ま
たはポリアミド核酸［ニールセン等（1991）、サイエン
ス、第254巻、第1497頁］とすることができる。各種の
標的ポリヌクレオチドは、標的配列に対する標識プロー
ブポリヌクレオチドのハイブリッド化によって検出する
ことができる。限定はしないが、たとえば標的ポリヌク
レオチドは次のものとすることができる：ゲノム配列
（たとえば構造遺伝子、染色体反復配列、調整配列な
ど）、RNA（たとえばmRNA、hnRNA、rRNAなど）、病原体
配列（たとえばウィルスもしくはマイコプラスマDNAも
しくはRNA配列）またはトランスジーン配列。
「特異的ハイブリッド化」という用語はプローブポリ
ヌクレオチドと標的ポリヌクレオチドとの間のハイブリ
ッドの形成として規定され、プローブポリヌクレオチド
はたとえば少なくとも１個のバンドが標的ポリヌクレオ
チド配列を有する真核性細胞から作成されたDNAのサウ
ザンブロットで同定されるよう標的DNに対し優先的にハ
イブリダイズし、かつ／または完全核におけるプローブ
ポリヌクレオチドは独特もしくは反復配列を特徴とする
個々の染色体位置に局在する。或る種の例においては、
標的配列が２個以上の標的ポリヌクレオチド物質に存在
することができる（たとえば特定標的配列は遺伝子群の
複数因子または既知の反復配列に存在することができ
る）。最適ハイブリッド化条件は標的とするポリヌクレ
オチドおよび標的の配列組成および長さ、並びに実施者
により選択される実験法に応じて変化することが明らか
である。種々の指針を用いて、適するハイブリッド化条
件を選択することができる［マニアチス等、モレキュラ
・クローニング：ラボラトリー・マニュアル（1989）、
第２版、コールド・スプリング・ハーバー、N.Y.、並び
にベルガーおよびキンメル、メソッズ・イン・エンチモ
ロジー、第152巻、「分子クローニング技術に対する指
針」（1987）、アカデミック・プレス・インコーポレー
ション社、サンジエゴ、CA;デュン等（1989）、ジャー
ナル・バイオロジカル・ケミストリー、第264巻、第130
57頁；さらにグッドスピード等（1989）、ジーン、第76
巻、第１頁参照］。
ここで用いる「ラベル励起波長」という用語は、アッ
プコンバート性ラベルにより吸収された際にアップコン
バート性ラベルから検出可能な蛍光発光を発する電磁線
波長を意味し、蛍光発光はラベル励起波長よりも短い波
長（すなわちより高い周波数の照射線）を意味する。こ
こで用いる「ラベル発光波長」という用語は、１つもし
くはそれ以上の励起波長でアップコンバート性ラベルを
照明した語に或いはそれと同時にアップコンバート性ラ
ベルから発光する波長を意味する。アップコンバート性
ラベルのラベル発光波長は対応の励起波長よりも短い
（すなわち、より高い周波数の照射線）。ラベル励起波
長とラベル発光波長との両者は個々のアップコンバート
性ラベルに特性的であり、簡単な励起および発光走査を
行って容易に決定される。
発明の要点 本発明は、励起波長により励起され、次いでアップシ
フト周波数（すなわち励起照射線よりも高い周波数）に
て電磁線を発する蛍光ラベルを包含する。
本発明によれば、アップコンバート性無機燐および／
またはアップコンバート性有機染料からなるラベルが種
々の用途に提供される。本発明のアップコンバート性ラ
ベルは１種もしくはそれ以上のプローブに付着されて、
プローブの位置のレポータ（すなわち検出可能なマーカ
ー）として作用することができる。アップコンバート性
ラベルはたとえば抗体、ストレプトアビジン、蛋白Ａ、
細胞リセプタのポリペプチドリガンド、ポリヌクレオチ
ドプローブ、薬物、抗原、毒素などの各種のプローブに
付着することができる。プローブに対するアップコンバ
ート性ラベルの付着は、各種の結合化学技術を用いて特
定プローブの性質に応じ行うことができる。限定はしな
いが、たとえばマイクロクリスタリン質アップコンバー
ト性ランタニド燐粒子を微粉砕に際しポリカルボン酸
（たとえばアディションXW 330、ヘキスト社、フラン
クフルト、ドイツ国）で被覆し、各種の蛋白（たとえば
免疫グロブリン、ストレプトアビジンもしくは蛋白Ａ）
を燐粒子の表面に物理的に吸着させることができる［ベ
ベルロー等（1991）、上記、参考のためここに引用す
る］。或いは、限定はしないが次のものを包含する各種
の無機燐被覆技術を用いることができる：噴霧乾燥、プ
ラズマ沈着、並びに燐粒子に付着され或いは酸化珪素と
アップコンバート性燐組成物とからなるガラスセラミッ
ク燐粒子に組込まれた−SiOH部分に対するシラン結合剤
により付着した官能基（たとえば−COOH、−NH2、−CON
H2）での誘導化。ガラスセラミック燐粒子は、たとえば
アミノ基をリンカー分子におけるガラスセラミック表面
に結合させる目的でアミノプロピルトリエトキシシラン
によりアミノ化しうるが、他のω−官能化シランを用い
て他の官能基を付着させることもできる。たとえば蛋白
もしくはポリヌクレオチドのようなプローブを次いで直
接に共有結合により、たとえばシロキサン結合もしくは
炭素−炭素結合を介し、燐粒子の表面に共有結合もしく
は吸着されたリンカー分子（たとえば有機官能性シリル
化剤）に共有結合させてガラスセラミック燐に付着させ
ることができる。
マイクロクリスタリン質アップコンバート性燐粒子は
典型的には直径が約３μｍ以下、好ましくは直径が約１
μｍ以下（すなわちサブμｍ）、より好ましくは直径が
0.1〜0.3μｍもしくはそれ以下である。一般に燐粒子を
できるだけ小さくすると共に検出可能な信号を発生する
のに充分な量子変換効率を保持することが最も好まし
い。しかしながら、任意特定の用途につき、使用すべき
燐粒子の寸法は実施者の判断で選択すべきである。たと
えば、或る種の用途（たとえば少量の細胞表面抗原の検
出）は、小さい必要はないが高い変換効率および／また
は吸収断面を持たねばならない高感度の燐ラベルを必要
とするのに対し他の用途（たとえば浸透化した細胞にお
ける多量の核抗原の検出）は、細胞下構造に容易に核酸
浸透しうるが高変換効率を持たなくてもよい極めて小さ
い燐粒子を必要とする。したがって無機燐粒子の最適寸
法は用途に依存し、本発明の各種の燐に関する量子効率
データに基づいて実施者により選択される。この種の変
換効率データは入手しうる刊行物（たとえばハンドブッ
クおよび公開された引例）から得ることができ、或いは
量子変換効率を粒子寸法の関数として測定する標準曲線
を作成して得ることもできる。たとえば小燐粒子の高感
度検出を必要とするような或る種の用途では、赤外レー
ザーダイオードが励起源として好適に選択される。
アップコンバート性燐の性質については後に詳細に説
明するが、これは関与する基本メカニズムを要約するの
に有用である。アップコンバーション（up−conversio
n）は、稀土類イオンを或る種の結晶物質中に含有する
或る種の材料で生ずることが判明した。たとえばイッテ
ルビウムおよびエルビウムは、たとえばバリウム−イッ
トリウム−フルオライドのような燐ホスト材料において
活性化剤カップルとして作用する。イッテルビウムイオ
ンは吸収剤として作用し、エネルギーを非放射的に移行
させてエルビウムイオンを励起させる。したがって、発
光はエルビウムイオンのエネルギーレベルの特徴であ
る。
アップコンバート性マイクロクリスタリン燐 本発明は各種のアップコンバート性無機燐を用いて実
施しうるが、好適具体例はそれぞれ少なくとも１種の活
性化剤カップルでドープされた数種の異なる燐ホスト材
料の１種から誘導された１個もしくはそれ以上の燐を用
いる。適する燐ホスト材料は次のものを包含する：ナト
リウムイットリウムフルオライド（NaYF4）、ランタン
フルオライド（LaF3）、ランタンオキシスルフィド、イ
ットリウムオキシスルフィド、イットリウムフルオライ
ド（YF3）、イットリウムガレート、イットリウムアル
ミニウムガーネット、ガドリニウムフルオライド（Gd
F3）、バリウムイットリウムフルオライド（BaYF5、BaY
2F8）およびガドリニウムオキシスルフィド。適する活
性化剤カップルは次のものから選択される：イッテルビ
ウム／エルビウム、イッテルビウム／ツリウムおよびイ
ッテルビウム／ホルニウム。アップコンバーションに適
する他の活性化剤カップルも使用することができる。こ
れらホスト物質と活性化剤カップルとの組合せにより、
少なくとも３種の異なる発光スペクトル（赤色、緑色お
よび青色可視光）を有する少なくとも３種の燐が得られ
る。一般に、吸収剤はイッテルビウムであり、発光中心
は次のものから選択することができる：エルビウム、ホ
ルミウム、テルビウムおよびツリウム。しかしながら、
本発明の他のアップコンバート性燐は他の吸収剤および
／または発光剤を含有することもできる。吸収剤と放出
性中心とのモル比は典型的には少なくとも約1:1、より
一般的には少なくとも約3:1〜5:1、好ましくは少なくと
も約8:1〜10:1、より好ましくは少なくとも約11:1〜20:
1、典型的には約250未満:1、一般に約100未満:1、より
一般的には約50未満:1〜25:1であるが、所望の特性（た
とえば化学特性、製造効率、吸収断面、励起波長および
発光波長、量子効率または他の考慮）に基づき実施者に
より種々の比を選択することができる。選択する比は一
般に、選択される特定の吸収剤−発光剤カップルにも基
づき、所望の特性に応じ基準値から計算することができ
る。
吸収剤（たとえばイッテルビウム）と発光中心（たと
えばエルビウム、ツリウムもしくはホリミウム）との最
適比は特定の吸収剤／発光剤カップルに応じて変化す
る。たとえばYb:Erカップルにつき吸収剤：発光剤の比
は典型的には約20:1〜約100:1の範囲であるのに対し、Y
b:TmおよびYb:Hoカップルにつき吸収剤：発光剤の比は
典型的には約500:1〜約2000:1の範囲である。これらの
異なる比は、結晶におけるYbレベルに対するEr、Tmもし
くはHoの異なる対応エネルギーレベルに起因する。大抵
の用途にて、アップコンバート性燐は便利には約10〜30
％のYbを含み、さらに約１〜２％のEr、約0.1〜0.05％
のHoもしくは約0.1〜0.05％のTmのいずれかを含むが、
他の組成も用いることができる。
本発明の幾つかの具体例は、約950〜1000nm、好まし
くは約960〜980nmの赤外線により最適に励起される無機
燐を用いる。限定はしないが、たとえば式YF3:Yb0.10Er
0.01のマイクロクリスタリン無機燐は約980nmの励起波
長にて最大ルミネセント強度を示す。本発明の無機燐は
典型的には、可視範囲にある発光最大を示す。たとえば
特定の活性化剤カップルは特徴的な発光スペクトルを有
する。イッテルビウム−エルビウムカップルは可視スペ
クトルの赤色もしくは緑色部分に燐ホストに応じて発光
最大を示す。イッテルビウム−ホルミウムカップルは一
般に緑色部分で最大発光し、イッテルビウム−ツリウム
は典型的には青色範囲に発光最大を有し、さらにイッテ
ルビウム−テルビウムは一般に緑色範囲で最大発光す
る。たとえばＹ0.80Yb0.19Er0.01F2はスペクトルの緑色
部分で最大発光する。
種々の組成のアップコンバート性無機燐結晶が本発明
での使用に適しているが、本発明を限定するものでなく
たとえば次の組成が一般に適している： Na（YxYbyErz）F4:xは0.7〜0.9であり、ｙは0.09〜0.
29であり、ｚは0.05〜0.01であり； Na（YxYbyHoz）F4:xは0.7〜0.9であり、ｙは0.0995〜
0.2995であり、ｚは0.0005〜0.001であり； Na（YxYbyTmz）F4:xは0.7〜0.9であり、ｙは0.0995〜
0.2995であり、ｚは0.0005〜0.001であり； （YxYbyErz）O2S:xは0.7〜0.9であり、ｙは0.05〜0.1
2であり、ｚは0.05〜0.12である。
（Ｙ0.86Yb0.08Er0.06）2O3が比較的効率的なアップ
コンバート性燐材料である。
限定はしないが例示の目的でイッテルビウム（Yb）−
エルビウム（Er）ドープされたイットリウムオキシスル
フィドは950nmでの励起の後に緑色にて発光する。これ
らは非線状燐であって、イッテルビウムは２個の950nm
フォトンにつき「アンテナ」（吸収剤）として作用し、
そのエネルギーを発光剤（活性化剤）として作用するエ
ルビウムに移行させる。燐の臨界的な粒子寸法は緑色発
光に関する量子収率および一般に約１〜10％、より好ま
しくは約２〜５％の範囲にあるYbとErとの両者のドープ
レベルにより与えられる。典型的なYb:Er燐結晶は約10
〜30％のYbと約１〜２％のErとを含む。すなわち、数千
のフォーミュラ単位を有する燐粒子は、典型的なレーザ
ー照射時間に際し少なくとも１個もしくはそれ以上のフ
ォトンの放出を確保する。しかしながら、吸収と放出と
の間の非直線的関係は、励起波長における強力な照明が
極めて小さい燐粒子（すなわち約0.3μｍ未満）を用い
る具体例にて満足な信号を得るのに必要であることを示
す。さらに、極めて小さい燐粒子を生成させて量子変換
効率を最大化させるには、活性化剤／放出剤カップルの
ドーピングレベルを増加させることが一般に望ましい。
稀土類活性化剤を有する無機マイクロクリスタリン燐
は一般に狭い吸収およびライン発光スペクトルを有す
る。ライン発光スペクトルは稀土類イオン内のｆ−ｆ転
移に基づく。これは遮蔽内部転移であって、狭いライン
発光をもたらす。
たとえば高感度検出が必要とされる或る種の用途にお
いて、たとえば赤外レーザー源（たとえば連続波（CW）
もしくはパルス半導体レーザーダイオード）のような市
販の発生源により強力な照明を得ることができる。たと
えばマイクロクリスタリン燐粒子を極めて小さくせねば
ならずかつ量子変換効率が低いような用途において、強
力なレーザー照明は信号を増大させると共に検出時間を
減少させることができる。或いは、本発明の或る種の用
途は固有の低い量子変換効率を有する燐組成物（たとえ
ば低ドープレベルの活性化剤カップル）を必要とする
が、他の所望の特徴（たとえば製造効率、誘導化の容易
さなど）を有する。この種の低効率のアップコンバート
性燐は好ましくは物質の吸収最大における或いはそれに
近い（約25〜75nm）の周波数にてレーザー照明により励
起される。アップコンバート性燐以外からはもはや他の
光が系で発生しないという事実は、特に励起照射源とし
て強力なレーザー照明を使用する場合、極めて敏感な信
号検出を可能にする。たとえばアップコンバート性燐に
よるフォトンエネルギーのアップコンバーションの独特
な性質は、マイクロクリスタリン無機燐の極めて小さい
粒子の検出を可能にする。超感度レポータとしての特に
細胞内レポータとしての燐の実際的使用については、燐
の粒子寸法をできるだけ小さくすることが重要であり
（典型的には約0.3未満〜0.1μｍ）、これにはレーザー
励起のアップコンバート性燐が極めて適している。
たとえばアップコンバートしうる各種の燐材料組成物
が、第Ｉ表に示すように本発明での使用に適している。
第Ｉ表に示した材料およびその変種の他にアルミネー
ト、ホスフェートおよびバナデートも適する燐ホスト材
料とすることができる。一般にホスト材料としてシリケ
ートを使用する場合、変換効率は比較的低い。或る種の
用途においては、ハイブリッドアップコンバート性燐結
晶を作成することもできる（たとえば１種もしくはそれ
以上のホスト材料および／または１種もしくはそれ以上
の吸収剤イオンおよび／または１種もしくはそれ以上の
発光剤イオンの組合せ）。
無機燐ラベルの作成 無機燐を作成するための技術および方法は従来技術に
記載されている。アップコンバート性燐結晶は各種の公
開された方法で当業者により作成することができ、限定
はしないが次のものを包含する：ヨコム等（1971）、メ
タルルジカル・トランスアクションズ、第２巻、第763
頁；カノ等（1972）、ジャーナル・エレクトロケミカル
・ソサエティー、第1561頁；ウィトケ等（1972）、ジャ
ーナル・アプライド・フィジークス、第43巻、第595
頁；バン・ウイタート等（1969）、マテリアル・リサー
チ・ブレチン、第４巻、第381頁（これらを参考のため
ここに引用する）。引用しうる他の刊行物は次の通りで
ある:J.P.ジョワルトおよびG.メリー（1990）、ジャー
ナル・ルミネセンス、第46巻、第39頁;G.L.マックファ
ーソンおよびS.L.マイエルソン（1991）、ケミカル・フ
ィジカル・レタース（４月）、第325頁；オーメン等（1
990）、ジャーナル・ルミネセンス、第46巻、第353頁;
H.ニーおよびS.C.ランド（1991）、オプチックス・レタ
ース、第16巻（９月）;R.A.マックファーレン（199
1）、オプチックス・レタース、第16巻（９月）；コッ
ホ等（1990）、アプライド・フィジカル・レタース、第
56巻、第1083頁；シルバースミス等（1989）、アプライ
ド・フィジカル・レタース、第51巻、第1977頁;W.レン
スおよびR.M.マックファーレン（1990）、ジャーナル・
ルミネセンス、第45巻、第346頁；ヒラオ等（1991）、
ジャーナル・ノンクリスタリン・ソリッズ、第135巻、
第90頁；マックファーレン等（1988）、アプライド、フ
ィジカル・レタース、第52巻、第1300頁（これらを参考
のためここに引用する）。
一般に、無機燐粒子は慣用の当業界で知られた微粉砕
法により所望の平均粒子寸法および分布まで微粉砕さ
れ、たとえば慣用のバレルミルにてジルコニアおよび／
またはアルミナ球を用いて約48時間もしくはそれ以上の
時間にわたり微粉砕する。結合分析に用いる燐粒子は典
型的には直径約3.0〜0.01μｍ（または非球状であれば
長手軸線に沿った寸法）、より一般的には約2.0〜0.1μ
ｍの寸法、より便利には約1.0〜0.3μｍの寸法である
が、これら寸法よりも大きい或いは小さい燐粒子も或る
種の具体例には好適である。燐粒子寸法は、所望の特性
に基づきここに説明した指針にしたがって実施者により
選択される。特定の粒子寸法範囲を有するフラクション
は一般に長時間（すなわち１日もしくはそれ以上）にわ
たる沈降により作成することができ、適する沈降時間の
後に所望寸法範囲のフラクションを取出す。沈降過程
は、たとえばホリバ粒子アナライザを用いて監視するこ
とができる。
燐粒子は表面活性剤（たとえばエアロゾルOTのような
陰イオン型表面活性剤）により微粉砕工程の際または微
粉砕が完結した後に被覆もしくは処理することができ
る。たとえば、これら粒子は微粉砕に際しポリカルボン
酸［たとえばアディションXW 330、ヘキスト社、フラ
ンクフルト、ドイツ国またはタモール、ビベルロー等
（1992）、上記参照］で被覆して、典型的には約pH6〜
８にて燐粒子の安定な水性懸濁液を作成することができ
る。燐粒子の水溶液のpHは、適する緩衝剤を添加すると
共に所望のpH範囲まで酸もしくは塩基で滴定して調整す
ることができる。コーチングの化学的性質に応じ、燐の
変換効率における若干の低下も被覆の結果として生じう
るが、レーザー励起源で用いうる電力は変換効率におけ
るこの種の低下を補いうると共に充分な燐発光を確保す
ることができる。
一般に、無機燐粒子の作成および結合試薬への結合は
実質的にベベルロー等（1992）（上記）およびタンケに
係る米国特許第5,043,265号に記載されたように行われ
る。
しばしば、たとえばオキシスルフィドホスト材料を有
する燐により、燐粒子は好ましくはたとえばアセトンも
しくはDMSOなどの極性溶剤に分散されて、実質的に単分
散のエマルジョン（たとえば保存溶液につき）を生成さ
せる。単分散保存溶液の１部をさらに水溶液まで希釈す
ることができる（たとえば緩衝水または緩衝塩水におけ
るアビジンの溶液）。
結合分析 アップコンバート性燐およびアップコンバート性有機
染料を、試料におけるアナライトの存在を検出および定
量するための結合分析に使用すべく、レポータ（すなわ
ち検出可能なマーカー）として使用することにより直接
または間接的に結合試薬を標識する。結合試薬は、アッ
プコンバート性レポータへの付着（たとえば表面吸着、
共有結合）により直接に標識される。直接に標識しうる
結合試薬は限定はしないが次のものを包含する：一次抗
体（すなわち標的アナライトに結合するもの）、二次抗
体（すなわち一次抗体または補綴群、たとえばビオチン
もしくはジゴシキシゲニンに結合するもの）、スタヒィ
ロコッカス・アウレウス蛋白Ａ、ポリヌクレオチド、ス
トレプトアビジンおよびリセプタリガンド。さらに結合
試薬は間接的に標識することもできる。すなわち一次抗
体（たとえばウサギ抗−erb−Ｂ抗体）を、直接標識さ
れた二次抗体（たとえばアップコンバート性無機燐に結
合したヤギ抗−ウサギ抗体）への非共有結合により間接
的に標識することができる。アナライト−プローブ複合
体の定量検出は、用いる各プローブに関する分析の適切
な検量と組合せて行うことができる。プローブは便利に
は、たとえば励起照明のためのレーザー源または集中フ
ォトダイオード源を用いて飽和励起条件下で検出され
る。
特定の結合分析は一般に均質分析および不均質分析に
分類される。均質分析においては、結合標識プローブに
より放出される信号は未結合標識プローブにより放出さ
れる信号とは異なり、したがって、これら２種を物理的
分離工程の必要なしに識別することができる。不均質分
析においては、結合および未結合の標識プローブから放
出される信号は同一であるため、これら２種を識別する
には物理的に分離せねばならない。古典的な不均質特定
結合分析は放射性免疫分析（RIA）である［ヤロウ等（1
978）、サイエンス、第200巻、第1245頁、参考のためこ
こに引用する］。他の不均質結合分析は放射性リセプタ
分析［クアトレカサス等（1974）、アニュアル・レビュ
ー・バイオケミストリー、第43巻、第109頁］、サンド
イッチ放射性免疫分析［米国特許第4,376,110号、参考
のためここに引用する］、および抗体／レクチンサンド
イッチ分析［EP ０ 166 623号、参考のためここに引
用する］を包含する。不均質分析が一般に好適であり、
均質分析よりも一般に感度および信頼性が高い。
組織抽出物を作成する場合も生物液試料を使用する場
合も、試料をその後の分析過程を実質的に阻害しない１
種もしくはそれ以上の希釈剤で希釈することがしばしば
望ましい。一般に、適する希釈剤は緩衝系（たとえば50
mM NaH2PO4もしくは５〜100mMトリス、pH4〜10）、非
干渉性イオン物質（５〜500mMKClもしくはNaClまたは蔗
糖）、および必要に応じたとえばツイーンのような非イ
オン型洗剤を含有する水溶液である。分析すべき試料を
固体支持体に固定する場合は、一般にプローブと接触さ
せる前に試料および固体支持体を希釈剤で洗浄すること
が望ましい。現物または希釈された試料を次いで診断ア
ナライトにつき分析する。
本発明の一般的方法において、試料中のアナライト
は、試料をアナライトに特異的もしくは優先的に結合し
て結合複合体を形成するプローブ−ラベル結合体と接触
させ、次いで結合複合体の形成を典型的には結合複合体
に存在するラベルの存在を測定して検出することによ
り、検出定量される。プローブ−ラベル結合体は直接標
識アナライト−結合試薬（たとえばアップコンバート性
燐に結合した一次抗体）および／または間接標識アナラ
イト−結合試薬（たとえば標識第２抗体により検出され
る一次抗体、または標識ストレプトアビジンにより検出
されるビオチニル化ポリヌクレオチド）を包含する。典
型的には、結合複合体をラベルの検出前に一般に少なく
とも１回の洗浄工程を行うことにより未結合プローブ−
ラベル結合体から分離して、未結合プローブ−ラベル結
合体に存在するラベルに起因するバックグランド信号を
除去する。したがって、一般にプローブ−ラベル結合体
をアナライト試料と共に結合条件下で適する結合時間に
わたり培養することが望ましい。
結合条件はプローブ−ラベル結合体の種類、標的アナ
ライトおよび特定分析法に応じて変化する。たとえば結
合条件は一般に、プローブが現場でのハイブリッド化、
ノーザンもしくはサウザンブロットまたは溶液ハイブリ
ッド化分析で使用されるポリヌクレオチドであるかどう
かに応じて相違する。さらに結合条件は、プローブが現
場での組織化学的染色法またはウエスタンブロットのい
ずれで用いられる抗体であるかに応じて相違する［トウ
ビン等（1979）、プロシーディング・ナショナル・アカ
デミー・サイエンスUSA、第76巻、第4350頁、参考のた
めここに引用する］。一般に、結合条件は当業界で知ら
れた一般的な結合法に応じて選択される。限定はしない
が、たとえば次の結合条件が一般的指針として与えられ
る： 抗体プローブにつき： 10〜200mMトリス、pH6〜8;一般に100mMトリス、pH7.5 15〜250mM NaCl;一般に150mM NaCl 0.01〜0.5、容量％ツイーン20 １％ウシ血清アルブミン ４〜37℃；一般に４〜15℃。
ポリヌクレオチドプローブにつき： ３〜10×SSC、pH6〜8;一般に５×SSC、pH7.5 ０〜50％脱イオン化ホルムアミド １〜10×デンハルト溶液 ０〜１％ドデシル硫酸ナトリウム 10〜200μg/ml 剪断された変性サケ精子DNA 20〜65℃、一般に50bpより長いポリヌクレオチドプロ
ーブにつき37〜45℃、一般に短いオリゴヌクレオチドプ
ローブにつき55〜65℃。
抗体およびポリヌクレオチドに関する結合条件の他の
例は次の文献に示されている：マニアチス等、モレキュ
ラ・クローニング：ラボラトリー・マニュアル（198
9）、第２版、コールド・スプリング・ハーバー、N.Y.;
並びにベルガーおよびキンメル、メソッズ・イン・エン
チモロジー、第152巻、モレキュラ・クローニング技術
の指針（1987）、アカデミック・プレス・インコーポレ
ーション社、サンジエゴ、CA;ヤングおよびデービス（1
983）、プロシーディング・ナショナル・アカデミー・
サイエンスUSA、第80巻、第1194頁（参考のためここに
引用する）。プローブがたとえば1L−２、β−インタフ
ェロンまたは他のポリペプチドホルモン、サイトキンも
しくはリンホキンのようなリセプタ−リガンドである場
合、適する結合条件は一般に各リセプタリガンド結合分
析を行うべく従来技術に記載された条件である。
免疫分析および免疫組織化学に有用な適する結合条件
の種々の例がたとえばハロウおよびレイン、アンチボデ
ィース：ラボラトリー・マニュアル、コールド・スプリ
ング・ハーバー、ニューヨーク（1988）（参考のためこ
こに引用する）に検討されている。一般に、免疫学的反
応の適する結合条件は塩（たとえば５〜500mMNaClもし
くはKCl）と緩衝剤（たとえばトリスもしくは燐酸塩緩
衝剤、pH4〜10）と必要に応じイオン型洗剤（たとえば
ツイーン）とを含有する水性結合緩衝剤を包含する。或
る種の具体例においては、プロテナーゼ抑制剤もしくは
安定剤も含ませることができる。結合反応は抗体反応に
ついては典型的には少なくとも約１〜５分間、好ましく
は少なくとも約30分間〜数時間である適する結合時間に
わたり行われるが、典型的には約24時間未満、より好ま
しくは約数時間以下である。結合反応（洗浄を含む）は
典型的には約０〜約45℃、好ましくは約４〜約20〜25℃
の温度範囲で行われる。
その場でのハイブリッド化、その場での結合分析、お
よび免疫組織学的染色を包含する結合分析は一般に、先
ず最初に試料を封鎖用または予備ハイブリッド化用の溶
液と共に培養し、次いで試料を結合条件でプローブと共
に適する結合時間にわたり培養し、次いで未結合のプロ
ーブを洗浄または他の方法で除去し、最後に結合プロー
ブの存在、量および／または位置を検出することにより
行われる。結合プローブを検出する工程は、プローブが
直接標識される場合はラベルを検出することにより、或
いは結合複合体を標識されてプローブに結合する二次結
合試薬（たとえばストレプトアビジン）と共に培養して
プローブを間接的に標識することにより行うことができ
る。
アップコンバート性ラベルはプローブまたはプローブ
に特異的もしくは優先的に結合する第２結合試薬に、こ
こで説明する各種の方法により付着される。さらに、ア
ップコンバート性燐粒子は微小球に包封してプローブ
（たとえば特異性抗原もしくは抗体）で免疫診断分析ま
たは核酸ハイブリッド化分析における標識プローブとし
て使用すべく被覆し、試料におけるアナライト、たとえ
ば血清試料における抗体、ウィルスもしくは抗原の存在
をハリー等（1990）、バイオテクニークス、第９巻、第
342頁参考のためここに引用する）の方法により検出す
る。燐のマイクロカプセル化は当業界で知られた数種の
方法で行うことができ、たとえばモノマー溶液による燐
の被覆および燐粒子を包封するポリマーシェルを生成さ
せるためのモノマーの重合を包含する。ポリマー被覆
（たとえばゲル被覆）に埋込まれた燐粒子を官能化して
（たとえばアミノ基により）、結合成分に共有付着させ
ることができる。
同様に、アップコンバート性燐粒子は表面吸着、多重
水素結合、静電気相互作用、ファンデルワールス結合ま
たは官能化無機燐粒子（たとえばガラスセラミック燐）
上への官能基の共有結合により、たとえばプローブ蛋白
のアミノ酸側鎖アミンもしくはカルボキシレート基をそ
れぞれ官能化燐粒子におけるカルボキシレート基もしく
はアミン基に結合させることにより直接にプローブで被
覆することができる。
たとえば嵩高アップコンバート性燐粒子の立体的およ
び／または帯電干渉が標的に対する結合試薬の結合を阻
止するような或る種の具体例においては、分子スペーサ
を燐粒子と結合試薬との間に組込むことが望ましい。た
とえば誘導化されたマイクロカプセル化燐またはガラス
セラミック燐を、−（CH2）ｎ−スペーサ（ここでｎは
一般に約２〜約50の整数である）を有するヘテロ二官能
性試薬に末端官能基間で結合させることができる。同様
に、燐は長い分子内スペーサ連鎖を有する誘導化用試薬
（たとえばω−官能化シラン）で直接に誘導化すること
ができ、所望の結合試薬に対し反応性の官能基は一般に
少なくとも約15オングストロームのスペーサ（すなわち
約10個の−CH2−直鎖基に等しい）により燐の表面から
分離される。或る種の具体例において、ラベルを種々の
長さのスペーサアームにより付着させて有力な立体障害
を減少させる。スペーサアームの複数層も用いることが
できる（たとえば複数層のストレプトアビジン−ビオチ
ン結合）。
多重アナライト検出 アップコンバート性燐は励起および／または発光波長
スペクトルに基づいて区別しうるので、たとえば細胞表
面抗原もしくは可溶性巨大分子のような複数アナライト
標的を検出および識別するためアップコンバート性燐を
使用することができる。
たとえばストレプトアビジン、アビジンまたは他のリ
ンカー巨大分子（たとえば抗ジゴキシゲニン抗体）をそ
れぞれ吸収およびまたは発光スペクトルにて相違する２
種の異なる燐（例示のため、ここでは燐No.1および燐N
o.2と称する）のそれぞれに付着させて、吸収および／
または発光波長に基づく２種の燐の識別を容易化させ
る。たとえば一方の燐は青色で発光しうるのに対し、他
方は緑色にて発光することができる。限定しないが、た
とえばNa（Ｙ0.80Yb0.18Er0.02）F4は主として緑色で発
光するのに対し、Na（Ｙ0.73Yb0.27Tm0.001）のF4は主
として青色にて発光し、したがってこれら２種の燐はそ
の燐光性発光に基づき識別することができる。或いは２
種の燐は実質的に同様な発光スペクトルを発生しうる
が、異なる励起波長を有して多重アナライト検出におけ
る識別の基礎を与えることができる。第１アナライト物
質（たとえばリンパ球CD4抗原）に特異的に結合すると
共にストレプトアビジン−燐No.1結合体により結合しう
るビオチニル部分を有する第１結合成分（たとえば抗
体）を使用して、試料（たとえば血清試料）における第
１アナライトの存在をアナライト−結合成分複合体にお
ける燐No.1の燐光の測定により定量検出することができ
る。第２アナライト物質（たとえばHIV−１配列）に特
異的に結合すると共に抗ジゴキシゲニン−燐No.2結合体
により結合しうるジゴキシゲイン部分（たとえば11−UT
P−ジゴキシゲニン）を有する第２結合成分（たとえば
プローブポリヌクレオチド）を用いて、試料における第
２アナライトの存在をアナライト−結合成分複合体にお
ける燐No.2の燐光の測定により定量検出することができ
る。かくして、分化しうる信号特性を有する複数燐レポ
ータの存在を同時的に検出することにより、複数アナラ
イトを単一試料で定量検出することができる。
サンドイッチ結合分析 アップコンバート性燐ラベルをサンドイッチ結合分析
用のレポータとして使用することができる［米国特許第
4,376,110号（参考のためここに引用する）］。たとえ
ば超常磁性の免疫ビーズまたは官能化磁気化しうるポリ
マー粒子（ポリサイエンシス・インコーポレーション
社、ワーリントン、ペンシルバニア州）のような磁性ビ
ーズを固体基質として使用することができ、これはアナ
ライトの第１エピトープ（すなわち結合部位：抗原決定
子、糖部分、化学置換基もしくはヌクレオチド配列）に
結合する固定化された第１結合成分（たとえば抗体、ポ
リヌクレオチドもしくはレクチン）を有する。アナライ
トは第１結合成分に結合し、さらにアナライトの第２エ
ピトープに結合する第２結合成分（たとえば抗体、レク
チンもしくはポリヌクレオチド）にも結合する。したが
って、アナライトはこれら２種の結合成分を架橋してサ
ンドイッチ複合体を形成し、これを固体基質に対し固定
化させる。第２結合成分は典型的には付着した或いは組
込まれたラベル（たとえばビオチニル基のようなラベ
ル）を有し、このラベルはストレプトアビジン被覆され
たアップコンバート性燐に結合することができる。或い
は、第２結合成分はたとえば官能化されたガラスセラミ
ック質アップコンバート性燐との共有結合を介しアップ
コンバート性燐に直接結合することもできる。
サンドイッチ複合体は第１結合成分とアナライトと第
２結合成分とからなり、直接に或いは間接的にアップコ
ンバート性レポータで標識される。かくしてサンドイッ
チ複合体は固体基質に固定化されるが、固体基質自身は
移動性である（たとえば超常磁性ビーズは試料スラリー
にて循環する）。アナライト存在および量は、サンドイ
ッチ複合体におけるアップコンバート性レポータの存在
を検出して定量測定することができる。
たとえば固定基質は複数の異なる種類の第１結合成分
（たとえば固定支持体に固定された複数の異なるオリゴ
ペプチド）を有することができる。１種もしくはそれ以
上の第１結合成分は、固定支持体と接触するアナライト
溶液における特定アナライト（たとえばムスカリンリセ
プタ）に結合することができる。１種もしくはそれ以上
の第１結合成分に対するアナライトの結合は、アップコ
ンバート性燐により標識された（直接的に或いはビオチ
ニル化された二次抗体を介し）第２結合成分（たとえば
抗ムスカリンリセプタ抗体）で検出することができる。
固定基質は第１結合成分に付着して２種以上の異なる
アナライト（たとてば免疫交差反応性もしくはポリ特異
性とすることができる）に結合することができ或いは複
数の第１結合成分に付着して複数の異なるアナライトに
結合することができる。同様に、特定のアナライトに対
する結合特異性を有する複数の第２結合成分を用いるこ
ともできる。複数の第２結合成分を用いる場合、典型的
には吸収および／または発光特性に基づいて識別しうる
独特なアップコンバート性ラベルにより各第２結合成分
を標識することが望ましい。
種々異なる吸収剤を各種の放出剤と組合せて用いるこ
とにより励起および発光スペクトルの数種の区別可能な
組合せを有する燐のコレクションを得ることができる。
たとえば限定はしないが、６種の区別しうる燐を２種の
吸収剤および３種の発光剤から発生させることができ
る。第１の吸収剤A1はλA1の励起波長を有し、第２の吸
収剤A2はλA2の励起波長を有し、第１の発光剤E1はλE1
における発光ラインを有し、第２の発光剤E2はλE2に発
光ラインを有し、第３の発光剤E3はλE3に発光ラインを
有する。６種の燐を区別して、それぞれからの信号を個
々に試料を励起波長λA1で照明すると共に別々にλE1、
λE2およびλE3における発光照射線を検出し、さらに試
料をλA2で照明すると共に別々にλE1、λE2およびλE3
ににおける発光照射線を検出して定量することができ
る。第II表は種々の吸収剤：発光剤の組合せ物、並びに
その励起および発光波長を示す。
勿論、６種より多い区別しうる燐ラベルを得るには、
追加の吸収剤：発光剤組合せを用いることもできる。
さらに識別しうる（たとえば寸法、色、密度、磁気特
性、形状、電荷により）異なる種類の固体基質を用い
て、特定種類の固体基質を特定種類の第１結合成分と関
連させることもできる。
限定はしないが、たとえば次の３種の簡単な実施例を
示して多重アナライトサンドイッチ分析法の可能な用途
につき説明する。
基質分別化 次の実施例は、識別可能な基質種類を用いて患者の免
疫状態（たとえば特定抗原に対する患者の血清反応）に
関する診断情報を与えうる試料（たとえば患者から採取
された血清試料）における特定の免疫グロブリン遺伝子
型の存在を検出する例につき説明する。
大きい超常磁性ビーズを免疫原性ヘルペスウィルス型
IIエンベロプグリコ蛋白に結合させ、中庸寸法の超常磁
性ビーズをHIV gp120グリコ蛋白に結合させ、小さい超
常磁性ビーズを免疫原性サイトメガロウィルスエンベロ
プグリコ蛋白に結合させる。血清試料を患者から採取
し、試料における免疫グロブリンと３種の固定化された
ウィルスグリコ蛋白とを特異的に結合させうる結合条件
下で超常磁性ビーズの混合物と共に培養する。これら超
常磁性ビーズを試料から分離して非特異的に結合した免
疫グロブリンを除去すると共に、結合条件下でIgGに結
合するスタフィロコッカス・アウレス蛋白Ａで被覆され
たアップコンバート性燐と共に培養する。次いで、特異
的に結合したIgGを有する超常磁性ビーズを燐−蛋白Ａ
結合体で標識する。大型、中形および小型の超常磁性ビ
ーズを次いで別々に燐励起電磁線で照射し、時間ゲート
の発光した燐光を検出する。必要に応じ非特異的結合に
基づくバックグランドを内部標準ビーズ（超常磁性ビー
ズで被覆された牛血清アルブミン）並びに陽性および陰
性比較血清試料を用いて決定する。大型、中形および小
型ビーズに関連する燐光の強度は、ヘルペスウィルスII
型エンベロプグリコ蛋白、HIV gp120グリコ蛋白および
サイトメガロウィルスエンベロプグリコ蛋白に対しそれ
ぞれ反応性である試料における抗体の量の尺度を与え
る。この情報を用いて、個々の患者がHIV−１、ヒトCMV
および／または単純疱疹II型ウィルスで感染されている
かどうかを決定することができる。
燐分別化 次の実施例は、分別化しうるアップコンバート性燐を
用いて血清もしくは脳生検試料における特定種類のヒト
APP（アミロイド先駆体蛋白）の存在および相対的量を
検出する例につき説明する。各種のAPPが、異なるエキ
ソン使用および／または異なる蛋白分解処理過程の結果
として脳で生ずる。たとえば全ゆる種類のAPPは共通の
仮定のエピトープ（Ｘ）を有しうるが、特定種類のAPP
は独特のエピトープ（Ｙ）を有すると共に、他の種類の
APPは独特のエピトープ（Ｚ）を有することができる。
試料における特定のAPP種類の相対量は予測値とするこ
とができ、或いはアルツハイマー氏病の発病源とするこ
ともできる。
超常磁性ビーズを、全種類が有する共通のAPPエピト
ープ（Ｘ）に特異的に結合する抗体に結合させる。独特
のＹエピトープに対し反応性の特異的抗体を、波長λ１
により励起されて青色に集中する波長スペクトルで発光
する燐No.1で標識する。独特のＺエピトープに対し反応
性の特異的抗体を、波長λ２により励起されて緑色に集
中する波長スペクトルで発光する燐No.2で標識する。こ
れらAPP種類を含有する試料を超常磁性ビーズおよび標
識された特異的抗体と共に結合条件下で培養する。超常
磁性ビーズを試料から個々に或いはバルクで取出す。こ
れらビースの波長λ１で照明して青色発光を検出すると
共に測定し、さらにλ２で照明して緑色発光を検出する
と共に測定する。λ１誘起の青色発光の強度はＹエピト
ープを有するAPP種類の尺度である一方、λ２誘起の緑
色発光の強度はＺエピトープを有するAPP種類の尺度で
ある。２種の燐からの発光が容易に識別できれば、λ１
およびλ２は同一とすることができる。２種の燐の基準
化した相対強度はＹエピトープもしくはＺエピトープを
含有するAPP種類の相対量の尺度を与える。
燐および基質の分別化 次の実施例は、個人から採取した血液試料における特
定Ｔリンパ球サブ群の存在および相対量を検出するため
の識別可能な基質種類と組合せた区別しうるアップコン
バート性燐の使用につき説明する。Ｔ細胞サブ群の検出
に関しここに説明するが、アナライト多重化（すなわち
各種の固体基質および／またはアップコンバート性燐ラ
ベルを用いる試料における複数アナライトの検出および
／または特性化）も一般的に用いるうる方法であると思
われる。
大きい超常磁性ビーズを抗−CD4抗体に結合させ、中
庸寸法の超常磁性ビーズを抗−CD8抗体に結合させ、小
さい超常磁性ビーズを抗−CD28抗体に結合させる。CD2
抗原に特異的に結合する抗体を、励起波長λ１を有する
と共に赤色で発光するアップコンバート性燐で標識す
る。CD45R抗原に特異的に結合する抗体を、励起波長λ
２を有すると共に緑色で発光するアップコンバート性燐
で標識する。CDW60抗原に特異的に結合する抗体を、励
起波長λ３を有する共に青色で発光するアップコンバー
ト性燐で標識する。
血液（または血清、唾液、尿、糞、生検組織など）試
料を患者から採取し、超常磁性ビーズと燐標識抗体との
混合物と共に、３種のビーズ固定化された抗体および３
種の燐標識された抗体との血液試料における細胞の特異
的結合を可能にする結合条件下で培養する。抗原−抗体
結合が生じた後、超常磁性ビーズを分離して順次に或い
は同時にλ１、λ２およびλ３での照明および赤色、緑
色および青色の発光の定量検出によりそれぞれ検査す
る。たとえば大型ビーズに関連するλ１誘起の赤色発光
の強度は、CD4およびCD2表面抗原を有する細胞の量およ
び／またはこれら表面抗原の相対量の大凡の尺度である
（たとえばCD2を有する極めて少ないCD4+細胞も存在す
るが、これら僅かな細胞は多量のCD2抗原を有し、した
がって大きいCD2燐光信号を有する）。同様に、大型ビ
ーズに関連するλ２誘起の緑色光の強度は、CD4およびC
D45R表面抗原の両者を有する細胞の量および／または試
料におけるこれら表面抗原の相対量の大凡の尺度であ
る。
このようにして、たとえば血液試料のようなアナライ
ト試料を、各種のアナライト物質の存在および相対的分
布（たとえば同時分離および／または相関関係）につき
「特性化（fingerprint）」することができる。この種
のアナライト指紋を用いて診断もしくは治療情報を与え
ることができ、たとえば患者の免疫状態を測定し或いは
特定の血球に向けられた化学療法の反応を測定すること
ができる。同様なアナライト指紋を用いて、病原生物お
よびウィルスを分類すると共にポリヌクレオチド配列を
遺伝子地図化および／または配列決定のため用いること
ができる。
寸法、形状、色または密度に基づき区別しうる超常磁
性ビーズを個々に時期的に捕えて、適する励起照明で走
査すると共に特定アナライトに特徴的な燐放光を検出す
ることができる。たとえば単一検出器は同時的に超常磁
性ビーズを懸濁物から捕らえると共にビーズ種類（寸
法、形状および／または色）を決定し、特定燐の存在お
よび量につき走査することができる（励起波長での照明
および発光波長での検出による）。
平均して１個もしくはそれ以下のアナライト（たとえ
ばリンパ球）がマイクロビーズ１個当りに結合する希釈
条件下での結合分析を行うことにより、個々に細胞を分
類し（たとえば個々の各CD4+細胞におけるCD45Rの量を
決定し）、かくして一層正確なリンパ球サブ群を規定す
ることができる。
さらに、ビオチニル化された磁性ビーズを用いて燐粒
子に対するストレプトアビジンの結合速度を監視し、或
いはストレプトアビジン被覆されたアップコンバート性
燐粒子を反応から分離または精製することもできる。す
なわち、ストレプトアビジンとアップコンバート性燐粒
子とを、反応容器内でストレプトアビジン被覆燐粒子を
形成する結合条件下で混合する。適する結合時間の後、
未結合のストレプトアビジンを除去し（たとえば燐粒子
をペレットとして集め、上澄液における未結合のストレ
プトアビジンをデカントし、ペレットを再懸濁させる遠
心分離による）、ビオチニル化された磁性ビーズを残余
の燐懸濁物に結合条件下で添加し、ストレプトアビジン
被覆燐粒子をビオチニル化磁性ビーズに結合させて回収
する。
アップコンバート性燐による光物理的触媒作用 本発明の他の用途はプローブに結合した光物理的触媒
として燐を用い、燐により発光された照射線を典型的に
は染料分子と共に用いて検出以外の種々の目的（たとえ
ば細胞毒性、化学物質のイオン化、突然変異など）につ
きプローブに隣接した領域に強力な局在電磁線を発生さ
せる。たとえばCD8+リンパ球におけるCD8抗原のような
細胞表面抗原に特異的に結合する抗体をアップコンバー
ト性燐に結合したプローブとして使用し、CD8+リンパ球
に対し燐を局在させることができる。CD8+リンパ球を含
有する試料を抗−CD8+プローブ−燐結合体と共に培養
し、励起波長（たとえば赤外レーザーダイオードから）
を照射して抗−CD8+プローブ−燐結合体が結合したCD8+
リンパ球の近傍にアップシフトフォトン（すなわち、よ
り高い周波数の電磁線）を放出させる。放出された照射
線は直接的な突然変異性および／または細胞毒性である
波長（たとえばチミン二量体の形成をもたらす紫外線、
760〜765nmの光は染色体損傷をもたらすと思われる）と
することができ、或いは環境中に存在する化学物質の光
分解をもたらして隣接する細胞を損傷しうる反応性物質
の局部的形成をもたらしうる波長とすることができる
（たとえば、ブックミンステルフレレン（buckminsterf
ullerene）の光分解（C60からC58およびC2への分解）は
細胞膜のリピド過酸化をもたらしうる遊離基を発生しう
る）。
燐−発光照射線は等方性であるため、一般に標的（た
とえばCD8+リンパ球）を非標的（たとえばCD8-リンパ
球）から励起照射の前に物理的に分離して等方性発光に
よる非標的に対する望ましくない損傷（すなわち「二次
的損傷」）を回避することが望ましい。物理的分離は限
定はしないが次のことを包含する各種の手段により行う
ことができる：（１）標的および非標的細胞の希釈懸濁
物に対し励起照射を行い、個々の細胞を分離する平均間
隔を充分にして、非標的に対する二次的損傷を減少させ
る手段、および（２）流体力学的集中を用いて細胞（標
的および非標的の両者）を照明帯域に（たとえば蛍光活
性化細胞ソータなど）に１回通過させる手段。たとえば
抗−CD8+抗体に結合したアップコンバート性燐を用い
て、リンパ球試料におけるCD8+リンパ球を選択的に損傷
させることができ、ここで（１）燐は直接的に細胞毒性
である波長にて発光し、かつ／または（２）燐は試料中
に存在する化合物の光触媒作用により反応性化学物質を
生成する波長で発光する（たとえば、試料をバックミン
ステルフレレンでドープすることができる）。
発光照射線を組織もしくは腫瘍に対する光触媒作用に
つき直接使用する代りに、励起型の酸素（いわゆるシン
グレット励起酸素（O2′Δｇ））を染料感作剤から溶解
分子酸素へのエネルギー移行によって発生させることが
できる。この方式は、無機アップコンバート性燐に達す
る近赤外線（赤色光および紫外光、970nmを含む）の組
織浸透力を利用する。赤外フォトンの２個が赤色、緑色
もしくは青色フォトンのいずれかに、感作剤染料の吸収
スペクトルに応じて変化する。この染料をアップコンバ
ート性照射線によりトリプレット状態まで励起させて、
そのエネルギーを溶解酸素分子に移行させることにより
励起（シングレット）酸素分子を生ぜしめる。シングレ
ット酸素の細胞毒性活性については光力学療法および他
の生物医療用途に充分説明されている［ワグニエレス
等、1990年１月19〜21日、「光力学療法の将来の指針お
よび用途、第249頁；光学的装置工学の高度光学技術協
会のSPIEインスチチュート、私書箱10、ベリンガム、ワ
シントン98277;ペレグリン等（1991）、キャンサー、第
67巻、第2529頁；ワグニエレス等、1991年５月24〜25
日、「光力学療法の将来の指針および用途」、第219
頁；ホリー等（1991年12月17日）、フルオレスセイン・
クリニーク、第４頁；ブライコッテ等（1991年５月）、
ENT−クリニーク、ローザンヌ、スイス国、参照］。
この用途においては、アップコンバート性燐をたとえ
ばメチレンブルー、ローズベンガルもしくはフタロシア
ニン誘導体（たとえばZn−フタロシアニン）のような感
作性染料と混合し或いは組合せる。第１および第３の場
合は赤色発光性燐を用いるのに対し、ローズベンガルに
ついては緑色発光性燐が特に適している。フタロシアニ
ン誘導体がこの目的に理想的である。何故なら、水溶液
もしくは生物学的溶液に全く不溶性であるからである。
したがって、これら染料は発光剤の直ぐ近傍に留まっ
て、細胞表面−レポータ／プローブ／染料複合体の特異
性が制限因子になる。この場合、好ましくは0.1〜0.3μ
ｍの寸法範囲におけるレポータ／プローブ／染料組成物
の特定組合せ物を合成して、効率的なエネルギー移行を
可能にせねばならない：先ず最初に、アップコンバート
照射線をできるだけ完全に染料により吸収させる。第２
に、染料励起エネルギー（トリプレット状態）を溶解分
子酸素に移行させる。これら両過程は、感作剤染料の吸
収スペクトルがアップコンバート照射線に適合すれば極
めて効率的である。
この方式は、赤色光を追跡および診断の両者に使用し
うると共にアップコンバートの後に治療目的にも使用し
うる点で従来の光力学療法よりも優れた手段を与え、し
たがって約1000nmにおける１個のみの（赤外）光源しか
必要としない。他の利点は、他の公知の光力学療法の励
起方式（750〜850nm）と対比し、生物学的試料における
赤外照射線の大きい範囲である。
光物理的触媒としてアップコンバート性燐を用いる具
体例につき、一般に次のことが望ましい：（１）励起照
射線の波長は基質化合物の顕著な光触媒作用を与えない
こと、（２）励起照射線の波長は直接的に細胞毒性もし
くは突然変異性でないこと並びに（３）発光照射線は直
接的に細胞毒性でなく或いは生物学上有効量の基質化合
物（たとえばバックミンステルフレレン、プソラレン、
アジド置換基もしくは他の光活性基を有する化合物）を
発生するのに適する波長を有すること。或いは、ポリペ
プチドのヒスチジン側鎖を染料感作剤（たとえばメチレ
ンブルーもしくはローズベンガル）の存在下に光により
酸化させることもできる［蛋白、構造および分子原則
（1984）、クレイトン（編）、W.H.フリーマン・アンド
・カンパニー社、ニューヨーク；「蛋白構造の序論」
（1991）、C.ブランデンおよびJ.ツーゼ、ガーランド・
パブリッシング社、ニューヨーク、NY、参考のためここ
に引用する］。たとえば、抗−CD8抗体に結合したアッ
プコンバート性燐を光物理的触媒として使用することに
より、CD8型＋リンパ球に対し選択的かつ局在した損傷
を生ぜしることができる。本発明によれば、実質的に任
意の抗体を適するアップコンバート性燐に直接的に或い
は蛋白Ａに対する結合により結合させ、次いで免疫グロ
ブリンに結合させることができる。たとえば本発明によ
るアップコンバート性の光物理的触媒を用いて実質的に
任意所望の抗原または細胞種類を標的とし、同定された
抗原の存在により識別することができる。
アップコンバート性有機染料 アップコンバート性無機燐レポータと同様に、蛍光が
光電子手段により検出されるような「分子」ラベルを使
用することも提案される。赤外光もしくは赤色光は標的
に結合したプローブ−レポータ複合体を励起させ、その
後に光を照明源に比べ短い波長にて発光させる。このア
ップコンバートした光は光源からの分散光を含まず、或
いはその高エネルギーにより自己蛍光を示さない。さら
に、自己蛍光は赤外もしくは赤色スペクトル範囲におけ
る励起により著しく減少する。光源はポンプパルスが短
いポンプレーザーであって、高出力および低エネルギー
を得ることにより染料における非直線的光学過程を可能
にする。その目的は、染料における第２励起シングレッ
ト状態（S2）を２個の赤色もしくは赤外フォトンにより
調整可能な染料レーザからのpsパルスで励起させること
である。S2状態をポンピングした後、染料は数ps内で蛍
光性状態（S1）まで弛緩して、光電子手段により検出す
ることができる。２個のフォトンを用いてS2状態に到達
する目標は、２−フォトン断面を増加させる利点を利用
し埋める点にある。何故なら、２−フォトン吸収を用い
てS2状態に達するからである。非共鳴２−フォトン吸収
断面は10-49〜10-50cm4sの程度あるのに対し、S2吸収に
対応する断面はその２〜３倍程度大である。幾つかの特
定例を挙げれば次の通りである：一般にシアニン、キサ
ンテン、ローダミン、アクリジンおよびオキサジンがこ
の目的に極めて適している。さらに青色染料も使用しう
るが、励起波長は赤色である。ローダミンは２個のフォ
トンを用いて650〜700nmにて励起させることができ、蛍
光は約555nmであると予想される。たとえばIR−140、IR
−132およびIR−125のような多くのIR染料はNd:YAGに基
づく２個のフォトンを用いて1060nmで励起することがで
き、蛍光は850〜950nm範囲にあると予想される。青色染
料の例は480nmで励起されるBBQであって240nmでS2状態
に達し、蛍光は390nmにあると予想される。これら染料
の多くは水溶液に対し極く僅かに可溶性であって極性を
有し（シアニン）、或いは極性置換基を有する。プロー
ブの性質に応じ、全く或いは殆ど付着化学を行う必要が
ない。何故なら、染料発色団には官能基が多いからであ
る。数会社が全ゆる種類の染料を販売している：その例
はコダック社、エクサイトン社およびラムダ・フィジー
ク社である。有機染料分子における２−フォトンレーザ
励起の科学的基礎が幾つかの実験論文で処理されてい
る:A.ペンズコファーおよびW.ロイパッハー、オプチカ
ル・アンド・クウォンタム・エレクトロニクス、第19巻
（1987）、第327〜349頁;C.H.チェンおよびM.P.マック
キャン、オプチックス・コミュニケーション、第63巻
（1987）、第335頁;J.P.ハーマンおよびJ.ズクーイン
グ、オプチックス・コミュニケーション、第６巻（197
2）、第101頁;B.フーコールトおよびJ.P.ハーマン、オ
プチックス・コミュニケーション、第15巻（1975）、第
412頁；リー・シチュンおよびC.Y.シー、オプチカ・ア
クタ、第29巻（1982）、第281〜287頁;D.J.ブラッドレ
ー、M.H.R.ハッチンソンおよびH.ケーツァー、Proc.R.S
oc.Lond.A、第329巻（1972）、第105〜119頁。
共鳴多重フォトンイオン化 極めて高いレーザ強度でアップコンバート性有機染料
を誘起させて、集中したレーザー照射線のフィールドに
てさらに励起フォトンを吸収させる。これら高いレーザ
ー強度にて、蛍光は追加フォトンの吸収に有利となるよ
う抑制される。この過程は一般に有機染料分子を溶液に
おけるイオン化限界より高くし、電子を溶剤シェル中に
放出して安定化する。この３−フォトン相互作用の結果
は分子イオンおよび付着もしくは溶媒和電子となる。こ
の荷電分離が電場で生ずる際、電荷が移動すると共に電
圧を発生し、これを極めて鋭敏に検出することができ
る。これは溶剤系における一時的導電率の測定値とな
り、一般に光検出よりも鋭敏である。この方法の欠点
は、移動する電荷を検知する電極を必要とすることであ
る。その意味で光検出と同様な非浸蝕的方法でない。他
方、これは極めて有利である光電気信号への光の変換を
迂回する。全ての光学系は効率を低下させる制限された
視野角度を有するのに対し、光イオン化は発生した電荷
の100％近くを常に「検知」する。効果的に、レーザー
フィールドの非線状相互作用は全ての励起有機染料分子
を充分高いフィールド強度にて充分に電気パルスに変換
し、これら強度は市販レーザー源を用いて日常的に達成
することができる。その特定例は約650〜700nmのローダ
ミンの励起、または約480nmのBBQ励起である。赤色にて
吸収する有機染料はS2まで励起された後に２個の追加フ
ォトンを吸収し、したがって全過程を４−フォトン励起
過程にし、これは３−フォトン非線状工程よりも遅い。
しかしながら、この種の４−フォトン過程が望ましい場
合も存在する。
検出装置 無機アップコンバート性燐の検出および定量は一般に
次の操作によって行われる：（１）アップコンバート性
燐を含有すると思われる試料に励起波長の電磁線を照射
し、さらに（２）燐光放射線を１つもしくはそれ以上の
発光波長バンドで検出する。
試料の照明は、試料を少なくとも１個の励起源により
発生した電磁線に露出して行われる。各種の励起源、た
とえば赤外レーザーダイオードおよび白熱フィラメント
並びに他の適する発生源を用いることができる。励起波
長範囲にて高い透過性および１つもしくはそれ以上の望
ましくない波長バンドにて低い透過性を有する光学フィ
ルタを用いて、望ましくない波長を光源照明から除去す
ることができる。望ましくない波長範囲は一般に、検出
可能な試料の自己蛍光を発生するか或いは励起最大波長
の約25〜100nm内にあって散乱励起照明からのバックグ
ランドノイズの有力な発生源となる波長を包含する。励
起照明はさらに多重化し或いは視準することもできる。
たとえば複数コヒーレント発生源（たとえばレーザー）
からの種々の周波数を有するビームを視準すると共に一
連の２色ミラーを用いて多重化することができる。この
ようにして、異なる励起波長バンドを有する複数の燐物
質を含有した試料をその励起周波数にて同時に照明する
ことができる。照明は連続的またはパルスとすることが
でき、或いは連続波（CW）およびバルス照明を組合せて
複数照明ビームを多重化し（たとえばパルスビームをCW
ビームと多重化し）、CW源により誘起された燐光とパル
ス源により誘起された燐光との間の信号識別を可能に
し、同様な発光スペクトルを有するが異なる励起スペク
トルを有する複数燐物質を識別することができる。限定
はしないが、たとえば市販入手しうる砒素化ガリウムレ
ーザーダイオードを近赤外光を与えるための照明源とし
て使用することができる。
アップコンバート性燐を刺激するため赤外励起を使用
しうる可能性は幾つかの利点を与える。第１に、安価な
IRおよび近IRダイオードレーザーを、特に水により吸収
されないIR波長バンドにて、維持された高強度励起照明
につき使用することができる。高強度照明のこのレベル
は、たとえは通常の蛍光染料（たとえばFITC）のような
慣用のラベルと共に使用するには適さない。何故なら、
高強度UVもしくは可視光線はラベルの強力な光漂白をも
たらし、試料を強力に損傷するからである。光漂白また
は試料損傷なしに高照明強度を用いうる可能性はより大
きい有力な信号をもたらし、したがってより感度の高い
分析を可能にする。
照明源としてのダイオードレーザーの使用に対するア
ップコンバート性ラベルの適合性は、ランプ発生源およ
び他の大抵のレーザー源よりも明確な他の利点を与え
る。第１に、ダイオードレーザー強度は駆動電流の変調
により直接に変調することができる。これは、時間ゲー
トもしくは位相敏感検波の技術に関する光の変調を可能
にして、追加変調器を用いることなく感度向上を与え
る。変調器は高電圧回路と高価な結晶とを必要とし、コ
ストおよび装置寸法の増大をもたらす。レーザーダイオ
ードまたは発光ダイオードは直流変調により脈動にする
ことができる。第２に、レーザー照明源は全く単色であ
る照明を与えると共に、極めて小さいスポット寸法に密
に集中させることができ、信号とノイズとの比および感
度における利点を所望の励起スペクトル領域および照明
量の範囲外における減少したバックグランド光に基づい
て与える。ダイオードレーザーは、他の慣用レーザー源
の追加経費および寸法を伴わずに顕著な利点を与える。
励起アップコンバート性燐からの燐光照射線の検出お
よび定量は、各種の手段により行うことができる。燐光
発光を検出する種々の手段を用いることができ、限定は
しないが次のものを包含する：光電子増倍管デバイス、
電子なだれフォトダイオード、電荷結合素子（CCD）、C
IDデバイス、写真フィルム乳液、検出可能な生成物をも
たらす光化学反応、並びに肉眼観察（たとえば蛍光顕微
鏡）。レポータが有機染料であれば、静電位置感受性検
出器を用いて共鳴マルチフォトンイオン化を検知するこ
とができる。検出は時間ゲートおよび／または周波数ゲ
ートの光収集を用いて残留バックグランドノイズを排除
することができる。時間ゲート検出が一般に望ましい。
何故なら、これは照明を終了した後に長時間発光の記録
方法を与えるからである。したがって、アップコンバー
ト性燐の燐光または遅延蛍光に起因する信号を記録する
と共に、存在する場合には短寿命の自己蛍光および散乱
照明光が排除される。時間ゲート検出は、回転羽根（す
なわち機械的チョッパ）での特定の時間的機械封鎖によ
り或いは電子手段により行うことができ、即発信号（す
なわち照明を終了してから約0.1〜0.3μｓ以内で生ず
る）が排除される（たとえば電子制御の固相光学シャッ
タ、たとえばポッケルもしくはケールセル）。アップコ
ンバート性燐およびアップコンバート性遅延蛍光染料は
典型的には約数ミリ秒（恐らく10ms程度であるが、典型
的には1msの程度）の発光寿命を有するのに対し、バッ
クグランドノイズは一般に約100ns以内で減衰する。し
たがって、パルス励起源を用いる場合、一般に時間ゲー
ト検出を用いて即発信号を排除することが望ましい。
アップコンバート性燐は光漂白を受けないので、極め
て弱い放出燐信号を集めると共に極めて長い検出時間
（連続照明または多重パルス照明）にわたり積算して検
出感度を増大させることができる。この種の時間積算は
電子的または化学的（たとえば写真フィルム）とするこ
とができる。非赤外写真フィルムを弱い放出信号を検出
するための手段として使用する場合、アップコンバート
性レポータはダエンコンバー性（down−converting）燐
と比較して励起源が典型的にはフィルムの顕著な露出を
生ぜしめない（すなわち暗室の安全光と同様）波長範囲
（たとえば赤外および近赤外）における照明を与える点
で有利である。すなわち、アップコンバート性燐を免疫
組織化学的染色および／または現場でのハイブリッド化
につき赤外発生源（たとえば赤外レーザーダイオード）
を用い蛍光顕微鏡と組合せて便利な超感度ラベルとして
使用することができ、さらに可視範囲ルミネセンスの信
号および画像検出につき写真フィルム（たとえばコダッ
ク・エクタクローム）として使用することができる（赤
外遮蔽フィルタと共にまたはそれなしに）。
装備の要約 第１図は、本発明により試料15に関する診断を実施す
るための代表的装置10を示す光学および電子ブロック図
である。本発明は１個もしくは複数のレポータを用いて
行うことができる。例示の目的で、この装置は２個の燐
レポータを使用して単一試料につき２つの診断を行うシ
ステムを示す。第１レポータはλ１に集中する励起バン
ドとλ１′に集中する発光バンドとを有する一方、第２
レポータはそれぞれλ２およびλ２′に集中する励起お
よび発光バンドを有する。本発明のレポータはマルチフ
ォトン励起に依存するので、波長λ１およびλ２は
λ１′およびλ２′よりも長い。前者は典型的には近赤
外であり、後者は可視範囲である。
レーザーダイオードまたは発光ダイオード（LED）と
しうる１対の光源20（１）および20（２）は所望の励起
波長にて光を発する一方、光ダイオードとしうる各検出
器22（１）および22（２）は所望の発光波長にて光を検
出する。発光線は指数法則による入射光束に関係し、し
たがって効率は試料に対し明確に集中する入射束を有す
ることにより最大化される。この目的で、２つの光源か
らの光を適する組合せ素子25により単一光路に合体さ
せ、レンズまたは他の集束メカニズム27により小領域に
集束させ、試料に当てる。燐レポータにより放出された
光をレンズ30によって集め、２つの発光バンドにおける
各成分を適する分離素子32により分離すると共に各検出
器に指向させる。
レーザーダイオードを作動させると共に異なる波長バ
ンドにて放出光を検出するための多くの可能な方式が存
在する。これを一般的にレーザーダイオードおよび検出
器に連通する制御電子ブロック35として示す。制御電子
装置の特定の調時および他の特性を特定実施例につき以
下説明する。
異なる発光バンドを有するが共通の励起バンドを有す
る複数のレポータを存在させることができる。この種の
場合、システムは単一のレーザーダイオードにつき複数
の検出器を備える。同様に、異なる励起バンドを有する
が共通の発光バンドを有する複数のレポータも存在させ
うる。この種の場合は、システムは単一の検出器につき
複数のレーザーダイオードを備え、時間多重化技術など
を用いて波長を分離する。
２個の光源からの光を、共通の集束メカニズムにより
単一位置に集中させるよう組合せて示す。これは、たと
え試料の同じ領域を照明することが望ましい場合にも必
要でない。同様に、集光は単一集光メカニズムによって
行う必要もない。全ての光を保持する必要があれば、合
体および分離素子は波長分割マルチプレクサおよび２色
フィルタによるデマルチプレクサを備えることができ
る。損失を許容しうる限り、50％ビームスプリッタおよ
びフィルタを使用することができる。
図面は、試料を通過してライン内で検出される光を示
す。一般的に、燐レポータからの発光は等方性であり、
光を入射光の方向から所定角度で集光して励起源からの
バックグランドを回避することが好ましい。しかしなが
ら、励起バンドおよび発光バンドは広く分離されるの
で、この種のバックグランドは大抵の場合問題にならな
いと思われる。寧ろ、他の配慮が他の形状を支配する。
たとえば、入射光線の光路に沿って戻る光を検出して、
光学経路における所定の素子を励起光路と検出光路との
間に共有することが望ましい。
共有素子を有する典型的な種類の機器は顕微鏡であっ
て、対物レンズを用いて試料に励起照射線を集中させる
と共に発光照射線を集める。この種の構成における極め
て有利な実施例は光学捕獲の現象を利用する。レポータ
を小ビーズに結合させる場合は、ビーズを光束焦点近く
の領域で捕獲することができる。同一の発生源または異
なる発生源を用いてレポータを励起させることができ
る。小粒子を捕獲するための赤外ダイオードレーザーの
使用についてはサトー等、「1.3μｍ小型InGaAsPレーザ
ーを用いる小粒子の光学捕獲」、オプチックス・レター
ス、第16巻、第５号（1991年３月１日）（参考のためこ
こに引用する）に記載されている。
特定検出技術 上記に要約したように、多チャンネル検出はたとえば
フィルタまたは２色ビームスプリッタのような光学装置
を使用し、燐レポータの発光バンドを充分に分離する。
同様に、共通発光バンドを有する複数レポータを電子技
術により検出しうることも指摘された。これら電子技術
については多重発生源に関し以下説明する。しかしなが
ら、これら技術については単一チャンネルに関し最初に
説明する。これら技術は、この点に関し、測定しようと
する信号と同じ波長範囲にあるバックグランドの発生源
が存在するので有益である。
第2A図は、単一チャンネルに関し位相敏感検波を実施
するための装置を示す。対応する参照符号を上記図面の
符号に対応する部材につき使用する。この点に関し、制
御電子装置35は波形発生器37と周波数ミキサ40とを備え
る。波形発生器37は周波数f1にてレーザーダイオード20
（１）を作動させると共に、f1にて信号を周波数ミキサ
に送信する。さらに周波数ミキサは検出器22（１）から
信号を受信すると共に位相制御入力信号を受信する。こ
の回路は、バックグランドが測定しようとする信号より
もずっと短い寿命（ミリ秒と比較しナノ秒もしくはマイ
クロ秒）を有するので、バックグランド識別をさらに可
能にする。これは、信号およびバックグランドが異なる
位相を有するようにする（これらは両者とも波形発生器
の特徴的周波数にて変調される）。寿命依存性の位相シ
フトの説明についてはデムトレーダ、レーザー・スペク
トロスコピー、スプリンガ・フェアラーク出版、ニーヨ
ーク（1988）、第557〜559頁（参考のためここに引用す
る）を参照することができる。位相入力信号を制御し
て、信号を最大化させると共にバックグランドに対し識
別する。このバックグランド識別は、信号を変調すると
共にバックグランドを変調しない位相敏感検波に典型的
な識別とは相違する。未変調バックグランドに対する識
別もここでは有利であって、２種類の識別を与える。
信号は２−フォトン励起に依存するので、２個の変調
レーザーダイオードを使用する共に変調周波数の合計も
しくは差にて信号を検出することができる。第2B図はこ
の種の配置を示し、第１および第２レーザーダイオード
20（１）および20（１）′（同じ波長λ１または恐らく
異なる波長にて発光）はそれぞれ周波数faおよびfbで作
動する波形発生器37aおよび37bからの信号により変調さ
れる。波形発生器の出力信号を第１周波数ミキサ42に連
通すると共に、fa±fbにおける信号を第２周波数ミキサ
45に連通する。検出器22（１）からの信号および位相入
力信号をも周波数ミキサ45に連通する。
第３図はゲート検出の実施装置を示す。バックグラン
ドは信号よりも短寿命であるため、検出の遅延は識別向
上を可能にする。この目的でレーザーダイオードはパル
ス発生器50により作動され、その遅延出力を用いてゲー
ト積算器または他のゲートアナライザ55を作動させう
る。
第４図は、λ１およびλ２に集中する励起バンドを有
すると共にλ３近くに重なる発光バンドを有する第１お
よび第２レポータを用いた試料に関する診断の実施装置
を示す。試料にはレーザーダイオード20（１）および20
（２）からの光を第１図に関し上記したように照射す
る。第１および第２波形発生器37（１）および37（２）
はそれぞれ周波数f1およびf2にてレーザーダイオードを
作動させ、f1およびf2にて信号を各周波数ミキサ60
（１）および60（２）に送信する。検出器22（３）から
の信号を両周波数ミキサに連通し、これらミキサはそれ
ぞれ位相入力信号をも受信する。したがって、周波数ミ
キサ60（１）は周波数f1にて変調された放出光の量に対
応する出力信号を発生し、この信号は試料における第１
レポータの存在の尺度となる。同様に、周波数ミキサ60
（２）は周波数f2で変調された放出光の量に対応する出
力信号を発生し、この信号は試料における第２レポータ
の存在の尺度となる。
２種の異なる波長の使用につき、異なる励起バンドを
有する２種のレポータに関し上記に説明した。しかしな
がら、この説明は単一レポータの場合にも適用しうる。
励起は２−フォトン過程であるため、２個のフォトンが
同じエネルギーを有する必要はない。寧ろ、２個のフォ
トンの全エネルギーが励起バンド内にあることのみが必
要である。すなわち、レーザーダイオードで異なる波長
を与えるのは比較的簡単かつ安価であるため、より可能
な組合せ（すなわちより可能な全励起エネルギーの選
択）が存在する。これは、アップコンバータのための稀
土類イオンの選択をより容易にする。何故なら、励起工
程は単一フォトンエネルギーを含むエネルギー移動一致
性に依存する必要がないからである。さらに、他の吸収
性イオン（実施例におけるイッテルビウムイオン）から
のエネルギー移動を用いることなく中間レベルの共鳴増
大を利用して、発光性イオン（上記実施例にてエルビウ
ムイオン）の直接的な段階励起を達成することもでき
る。さらに、単一レポータにつき異なる波長を用いて、
励起依存性多重化およびバックグランド識別技術につき
他の手法を与えることもできる。
単一燐の多重波長励起は、第5A〜5C図に示したように
多数の方法で生ぜしめることができる。２個のレーザー
は単一イオンの段階的励起を第5A図に示したように生ぜ
しめる。第１レーザーはレベル１からレベル２への励起
を刺激すると共に第２レーザーはレベル２からレベル３
への励起を刺激し、このレベルにて発光が生ずる。単一
イオン励起は第5B図に示したようにエネルギー移動によ
り生ずることもある。この場合、第１レーザーはレベル
１からレヘル２への励起を刺激し、エネルギー移動はレ
ベル２からレベル３まで生じ、第２レーザーはレベル３
からレベル４への励起を刺激する。後者の過程の変法に
おいては、レベル１および２は第１イオン（すなわち感
作剤イオン）とすることができ、レベル３および４は第
２イオン（すなわち活性化剤イオン）とすることができ
る（第5C図に示す）。
第5A図に示した段階的励起方式においてエネルギー移
動は必要でなく、したがって励起レーザーの分極に関す
る情報が保持されて発光照射線の分極を生ぜしめ、この
場合、光の分極解除は信号とバックグランドノイズとの
間の識別を向上させうる。
第5C図に示した多重イオンマルチレーザー励起方式に
ついては、共通の励起波長を有する数種の燐が存在す
る。この場合、異なる燐の間の識別は、異なる発光波長
に基づきおよび／または時間ゲート、周波数変調および
／または位相敏感検波により励起波長の変調を用いて実
施することができる。
特定機器の具体例 第６図は、手持プローブを用いて試料につき本発明を
実施するための装置の特定実施例に関する光学列を示す
略図である。この実施例は小形化された機器の形態を採
用し、ハウジング75（ファントムで示す）と手持プロー
ブとを備えると共に光学繊維接続ケーブル82を備える。
光学および電子部品をハウジング内に位置せしめる。例
示の目的で、３−チャンネル系の光学部品を示す。試料
は、たとえば可視スペクトルの青色、緑色および青色部
分における異なる発光バンドを持った３個までのレポー
タを含むことができる。さらに、レポータは近赤外に異
なる励起バンドを有すると思われる。
３個のレーザーダイオード85a〜ｃからの出力ビーム
を目盛指数（GRIN）レンズ87a〜ｃを介して連通し、各
繊維セグメント88a〜ｃの端部に集束させると共に、方
向性結合器90または他の適するデバイスによって単一繊
維90に連結する。繊維90の端部から発する光をGRINレン
ズ95により視準し、この光は２色ビームスプリッタ97を
通過してGRINレンズ100により光学繊維ケーブル82の端
部に再集束する。ビームスプリッタは、レーザーダイオ
ードから赤外線を通過させるが可視光を反射すると思わ
れる。
手持プローブ80はハンドピース102と内部GRINレンズ1
05と裁頭円錐状の整列チップ110とを備える。繊維82か
ら発する光をGRINレンズ105により整列チップ110を僅か
に越えた焦点115に集中させる。整列チップを試料を保
持する試験管に近接させて、焦点115を試料に集中させ
る。試験管はレーザー照射線に対し透過性であると思わ
れる。
試料における焦点115の領域から発する光の１部をGRI
Nレンズ105によって集め、繊維82中に集束させると共に
GRINレンズ100により視準し、２色ビームスプリッタ97
にて反射させる。この光は３つまでの発光バンドにおけ
る波長を有することができる。光学繊維120a〜ｃは特定
成分を各光検出器125a〜ｃに指向させる。特定フィルタ
装置を示し、各フィルタは各発光バンドにて光を反射す
るが、たとえば１個もしくはそれ以上のフィルタが発光
バンドの帯域フィルタであれば他の配置も使用される。
制御電子装置は図示しないが、上記の時間多重化もし
くはヘテロダイン技術を用いることもできる。この種の
技術は、たとえば発光バンドが明確でない場合に必要で
ある。
第7A図は、電荷結合素子（CCD）画像形成列150をガラ
スもしくはプラスチック基板に沈着したペプチドもしく
は他の生物学上活性な物質の二次元列152と組合せ検出
器として使用する本発明による実施例の図面である。CC
D列は重なる不働態化層157を持った多数の個々にアドレ
スしうる感光性検出素子155を有する一方、ペプチド列
は多数の個々の結合部位160を有する。燐を含有するプ
ローブはこのペプチド列における１つもしくはそれ以上
の素子に対し反応特異性であり、したがってこれら素子
のみに物理的に付着する。ペプチド列は画像形成列に対
し１対１の幾何学関係を有するよう示され、１個のピク
セルがペプチド列における各素子に対応する。しかしな
がら、必要であれば１群の検出器素子を有する大型ペプ
チド素子を設けることも可能である。
上記各種の技術を用いて、検出器列により赤外レーザ
ー刺激から燐の発光を識別することができる。
第１に、検出器列の感度範囲を越えたIR刺激に応答す
る燐を使用することができる。この種の燐の列はガドリ
ニウムオキシスルフィド:10％エルビウムである。この
燐は1.5μｍ照射線により刺激され、960nmおよび520nm
にて発光する。検出器列は1.5μｍ照射線に対し非感受
性であるが、アップコンバート照射線に対し感受性であ
る。
さらに、燐発光は立上および下降時間が比較的遅いの
で、CCD検出器列によりパルスレーザー刺激源から決定
した時間とすることができる。アップコンバーション過
程の減衰時間は特定の発光移動および燐ホストに応じて
可変である。しかしながら、一般にこれは500μｓ秒〜1
0msの範囲である。これはレーザー励起パルスおよび検
出器列の能力と比較して極めて遅い。
CCD列を加工する技術は、CCD画像形成列が永年にわた
り市販入手されているので周知されている。この種の各
種のデバイスはダビッド・サルノフ・リサーチ・センタ
ー、プリンストン、NJから入手することができる。
ペプチド列を加工する技術はホドル等、「光指向の空
間アドレス可能な平行化学合成」、サイエンス、第251
巻、第767〜773頁（1991年２月15日）（参考のためここ
に引用する）による論文に記載されている。記載された
特定列は1.28cm×1.28cmの面積に1024個の別々の素子を
有する。
第7A図の実施例は、CCD列と緊密接触したペプチド列
を示す。実際に、ペプチドを別途の基質なしに不働化層
に対し直接付着させることができる。しかしながら、空
間分離された列が好適である場合も存在し、第7B図はペ
プチド列とCCD列とが分離された実施例を示す。レンズ1
65の列は各結合部位からの光を集光すると共に、これを
各検出素子に集束させる。この配置は、励起照射線を排
除する他の技術を使用しない程度までフィルタの使用を
容易化させる。
光学捕獲を用いて、粒子上における燐の存在もしくは
不存在を決定すべく試料粒子を一時的に固定化すること
ができる。便利には、試料粒子を捕えるべく使用する波
長範囲は選択されるアップコンバート性燐のための励起
波長範囲と実質的に同一とすることができ、光学的捕獲
および励起照明が同じ発生源で行われる。第８図は、小
粒子の単光束勾配力（single−beam gradient force）
捕獲につき使用する装置のブロック図を示す。
蛍光活性化細胞選別 ここに説明したアップコンバート性燐を流動血球測定
法による蛍光性細胞選別における燐光ラベルとして使用
することができる。従来の蛍光染料と異なり、アップコ
ンバート性燐は遺伝物質および細胞を損傷する波長範囲
（たとえばUV）における励起照明を必要としない明確な
利点を有する。典型的には、アップコンバート性燐ラベ
ルを、懸濁物における細胞集団のサブ群細胞に存在する
細胞表面蛋白に高い親和性および特異性を以て結合する
たとえば抗体のような結合試薬に付着させる。燐標識さ
れた結合成分を結合条件下で細胞懸濁物と接触させて、
細胞表面蛋白を有する細胞が標識結合試薬に結合するよ
うにし、これに対し細胞表面蛋白を欠如する細胞は標識
結合試薬に実質的に結合しない。懸濁細胞は、ほぼ１個
しか個別細胞が１度に試料検出帯域に存在しないような
条件下で試料検出器に通過させる。典型的にはIRレーザ
ーである発生源は各細胞および検出器（典型的には光電
子増倍管または光ダイオード）を照明して発光照射線を
検出する。検出器は、検出された信号に基づき複数の試
料収集領域の１つへの検出帯域における細胞のゲートを
制御する。FACS装置および方法の一般的説明は米国特許
第4,172,227号；第4,347,935号；第4,661,913号；第4,6
67,830号；第5,093.234号；第5,094,940号；および第5,
144,224号（参考のため、ここに引用する）に示されて
いる。FACS法につきラベルとして使用されるアップコン
バート性燐は細胞もしくは遺伝物質を損傷しない励起範
囲（好ましくはさらに発光範囲）を有することが好まし
い。一般に、遠赤外および赤外範囲における照射が励起
に好適である。200〜400nmの範囲の照射はできれば回避
すべきであると思われ、波長範囲760〜765nmは生存細胞
の維持が望ましい用途では回避することができる。
他の改変 アップコンバートした燐照射線の吸収が高い環境にお
いては、燐微粒子を蛍光染料または染料の組合せにより
選択比率で被覆してアップコンバートした周波数で吸収
し、次いで他の波長にて再放出させる。これらフルオル
に対する単一フォトン吸収断面は典型的には極めて高い
ので、薄い層のみが燐発光の完全吸収につき必要とされ
る。この被覆粒子は次いで包封されて適する抗原もしく
は抗体レセプタ（たとえば微粒子）にて被覆することが
できる。この層状化の例を第９図に図示する。可視範囲
に強力な吸収移行部を有する広範な種類の蛍光染料が存
在し、その発光は可視範囲を包含すると共に赤外まで及
ぶ。大抵のものは10％もしくはそれ以上の蛍光効率を有
する。このようにして、発光波長は粒子環境を通過する
よう企画することができ、光学干渉フィルタを再び使用
して、励起波長と発光波長とを識別することができる。
試験媒体に比較的大きい波長「ウインドー」が存在すれ
ば、単一種類の燐に被覆しうる発光波長の種類は入手し
うる染料および染料組合せの数によってのみ制限され
る。各種のリポータ間の識別は分光技術およびここに説
明した多重化技術により容易に行われる。すなわち、複
数標的の不均質混合物にて案出使用しうるプローブ／レ
ポータ「指紋」の個数は実質的に無制限である。
上記原理は、スペシース特異性の光触媒的および光化
学的反応を行うにも適用することができる。分光法の選
択の他に、燐の長い発光減衰時間は比較的遅い反応もし
くは一連の反応を光露出の後の発光時間内に生ぜしめる
ことができる。これは、燐−「触媒もしくは反応体」結
合体が励起波長の侵入しえない環境に入る際に特に有用
である。この遅い放出は、より多数の標的が粒子と相互
作用する可能性を増大させる。
燐粒子の独特な減衰速度は動的研究をも可能にする。
励起源への連続露出が可能でない或いは浸蝕的であるた
め望ましくないシステムにおいては、パルス励起に続く
遅延蛍光検出が必要である。燐レポータが光励起された
後、燐または燐／染料結合粒子からの発光は典型的には
約１ミリ秒間にわたり持続する。動的環境（たとえば運
動する標的を有する静的もしくは流動的システム）にお
いて、粒子は励起／検出装置に対し相対移動する際に特
徴的に減衰する強度の光を発する。システムの規模およ
びシステム内の速度に適する画像形成光学系と組合せ
て、CCD光電気センサ列を用いて列視野を横切る粒子運
動を検出する。充分特性化された時間の関数である燐の
遅延発光は個々の粒子位置、方向および速度の動的追跡
を可能にすると共に、必要に応じ粒子寸法、密度および
流体力学構成の計算をも可能にする。粒子が運動する
際、これはより多くの列の素子に露出するが常に減少す
る強度を有する。減衰時間の所定部分にわたり露出され
る素子が多いほど急速に移動する。したがって、列によ
り収集される粒子発光「トラック」の積算強度パターン
は粒子の速度に直接関係する。これら粒子は再びパルス
もしくはチョップCW励起源により任意の時間で更新され
る。第10図はこの経過を示す。「サイドオン」励起およ
び検出のみを図示するが、サイドオンおよびエンドオン
の検出および励起配置もしくは組合せも可能である。コ
ンピュータ分析によるCCD列強度情報の整理は、動的に
関与するシステムにおける粒子の実時間に近い追跡を可
能にする。コンピュータにより行われるデータ分析およ
び整理は燐発光の固有減衰、照明されるピクセルの個数
およびその信号レベル、列に対する減衰信号の方向性、
および列の焦点面に対し移動する粒子の錯乱円からの強
度寄与を包含する。エンドオン流動検出配置において、
錯乱円の寸法は、粒子がどのように迅速に焦点から移動
するかに直接関係し、粒子の速度を測定しうる１つの可
能な手段は反応カラムにおける化学および速度論を監視
することであり、或いは流動血球測定に対するこの方法
の適用は流体力学特性（寸法、形状、密度）に基づく細
胞の解析を可能にする。さらに、この方法はインビボ診
断用途（たとえば血液還流速度）にも有用である。
さらにアップコンバート性燐ラベルを用いて、アップ
コンバート性燐ラベルが結合する領域における温度を検
知することもできる。アップコンバート性燐の温度測定
法はH.バーソウおよびC.K.ヨルゲンセン（1990年10
月）、オプチックス・レタース、第15（19）巻、第1100
頁（参考のためここに引用する）に記載されている。
理解を明瞭にする目的で例示のため本発明を詳細に説
明したが、本発明の範囲内で多くの改変をなしうること
が了解されよう。
以下、限定はしないが実施例により本発明をさらに説
明する。
実験例 レポータとしてのアップコンバート性無機燐の確認 イッテルビウム−エルビウムでドープされたナトリウ
ムイットリウムフルオライドからなるアップコンバート
性燐粒子をサブミクロン寸法まで微粉砕し、粒子寸法に
より分別すると共に、ポリカルボン酸で被覆した。Na
（Ｙ0.80Yb0.18Er0.02）F4を範囲940〜960nmにおける励
起に基づくその高効率につき選択した。Nd;Yagポンプ染
料レーザー/IR染料組合せを用いて、上記周波数範囲に
おける8ns〜10ns時間のパルスを発生させた。
レーザーパルスを用いて液体における微粉砕燐粒子の
懸濁物を照明すると共に、その場でガラススライドに付
着させた。直角で観察された懸濁物ルミネセンスを集光
レンズと最大可能範囲まで分散励起光を濾過する空間フ
ィルタと光電子増倍管と減圧光ダイオードもしくは簡単
な固相光ダイオードとを用いて監視した（観察される光
レベルに応ずる）。
ルミネセント信号レベルを溶液pH（範囲６〜８）、粒
子寸法、粒子量（μg/cm3）および安定化用陰イオン型
表面活性剤の種類の関数として決定した。信号をボック
スカー積算器および長RC時間定数からの時間積分として
或いは一時的デジタイザによる一時的信号として記録
し、特定実験条件下におけるルミネセンス寿命を示し
た。その場での信号をもレーザー走査顕微鏡法により測
定した。第11図は977.2nmの波長最大におけるレーザー
源での励起に入射する燐発光スペクトルの蛍光走査図で
あり、発光最大は約541.0nmである。第12図は燐励起ス
ペクトルの励起走査図であり、発光収集ウインドーを54
1.0nmに設定し、燐の励起最大を541.0nmに設定し、発光
波長を約977nmに設定した。第13図は励起照明の終了後
における541.0nmの燐ルミネセンスの時間−減衰測定図
である。最大燐光は約400μｓで出現し、約1000μｓに
て燐光の低い安定レベルまで徐々に減衰する。第14図は
燐発光強度を励起照明強度の関数として示す。燐光強度
は励起強度と共に、ほぼ約1000W/cm3まで増大する。
サブミクロンのNa（Ｙ0.8Yb0.12Er0.08）F4粒子の燐
光効率を測定した。Ti:サファイヤレーザーを励起源と
して使用すると共に、分光光度計および光電子増倍管を
検出システムとして使用した。２種類の測定を行った。
第１の測定は、燐懸濁物につき粒子１個当りの絶対発光
を540nmおよび660nmにおける発光バンドで測定する直接
的測定とした。検定した断面を第15図に示し、寸法依存
性を第16図に示す。これは、975nmにおける励起光およ
び約20W/cm3の強度にて0.3μｍの粒子につき約１×10
-16cm2の燐光断面に相当する。約25μｍの乾燥燐粉末の
発光効率も測定した。結晶ホストにおけるYb+3の吸収断
面に関する既知の数値［ラコバラ等（1991）、オプチッ
クス・レタース、第16巻、第1089頁、参考のためここに
引用する］および粒子寸法に対する燐光発光の測定され
た依存性に基づき、約１×10-15cm2の燐光断面が判明し
た。これら２種の測定値の間の差は、乾燥燐と水性懸濁
液との間の燐光効率の差または乾燥燐における多重分散
フォトンの吸収に起因する。これら断面推定値のいずれ
かに基づき、断面は中庸レーザー強度における単一サブ
ミクロン燐粒子の検出を可能にするのに充分大である。
約10W/cm2のレーザー強度にて燐光はレーザー強度とし
て1.5乗まで増大する。
燐粒子性能：検出の感度 （Ｙ0.86Yb0.08Er0.06）2O2Sよりなる単分散の0.3μ
ｍアップコンバート性燐粒子のシリーズ希釈物を含有す
る一連のテラサキプレートを、IRダイオードレーザー照
明の下でプロトタイプ機器でアップコンバーション蛍光
につき試験した。
燐粒子をDMSOでの沈降により作成し、0.1％アラビヤ
ゴム水溶液にシリーズで希釈した。これは全ゆる水分散
問題を完全に排除すると思われた。使用したシリーズ希
釈物を第III表に示す。
保存DMSO分散物は、４−1mL試料を蒸発させることに
より重力測定して、1.70±0.09mg/mL（95％信頼限界）
の燐密度を有した。これは23.6×109粒子/mLに相当する
（0.3μｍの平均粒子寸法および5.3g/mLの粒子密度と仮
定する）。110〜120℃にて週末にわたり試料を蒸発させ
た後の残留物は顕著に黄色であったが、IRダイオードレ
ーザーで試験した際に燐光を発した。
目に見える緑色光が10-3（すなわち0.7μg/mLもしく
は23.6×106粒子/mL）までの全てのシリーズ希釈物か
ら、1mLのポリプロピレン微小遠沈管で手持ダイオード
レーザーにより暗室にて発した。10-1および10-2希釈物
は肉眼で濁っていた。各シリーズ希釈物の１μＬまたは
その次の高い希釈物の0.1μＬをピペットでテラサキプ
レートの穴に入れた。１μＬは穴の底部を埋め、0.1μ
Ｌは穴の縁部に沿って広がったが全表面を覆わないこと
が判明した。低い粒子濃度を有する小容積に関連した統
計的問題およびピペット操作問題のため、２〜４反復を
各希釈物につき作成した。
テラサキプレートの穴は10μＬ容積の試料を保持す
る。この容積に含まれる全燐粒子が試料穴の底部に付着
すると仮定して、等価検出器感度を推定することができ
る（第III表）。10-15〜10-18Mが酵素結合表面分析の正
常範囲であることに注目すべきである。
比較試料の結果 比較試料を、プロトタイプのアップコンバーション蛍
光測定装置（ダビッド・サルノフ・リサーチ・センタ
ー）を用いて走査した。モータ操作Ｘ−Ｙ位置決定段階
を用い、プレートを赤外ダイオードレーザーの焦点に対
し50μｍ増し分にて移動させることにより試料を走査し
た。
IRダイオードレーザーを63mW（100mA）にて操作し
た。ビームを焦点に2.4×10-3cm2まで集束させた。試料
穴の底部が約1.4×10-2cm2（直径1365μｍ）であるた
め、ビームは個々の位置にて穴底部表面の17％以下を覆
う。さらに穴は傾斜側壁部をも有し、この側壁部は試料
穴の底部から頂部まで拡開すると共に徐々に発散するレ
ーザービームにより応答する。光学系におけるロスを無
視し、焦点（試料穴の底部）のIR光強度は980nmの波長
にて約26〜27W/cm2であった。光電子増倍管（PMT）を試
料から放出され可視光（アップコンバート光）の検出に
使用した。レーザービーム幅は試料穴の底部における表
面積よりも小さいので、プレートをダイオードレーザー
の焦点に対し肉眼検査により整列させて、レーザーを中
央穴に集中させた（穴C5、C6およびC7を読取る際にはC6
また穴D5、D6およびD7を読取る際にはD6とした）。
PMT信号（amp）を各プレート位置で記録し、試料穴の
幅（約4000μｍ）にわたり数字的に積算した。10-2〜10
0希釈試料の穴における種々異なる位置で数回の走査を
行って、粒子分布の均一性を決定した。4000μｍ距離に
わたるPMTの平均的暗視野電流を積算することによりバ
ックグランド信号を決定して、１×10-9μａ−ｍの積算
バックグランド信号を得た。試料穴の積算値をこのバッ
クグランド信号に変換し、これを第19図に示す。
免疫診断試料検出 免疫収着分析形式におけるアップコンバート性燐レポ
ータの能力を示すため一連のIgG/抗−IgG試料を作成し
た。これら試料は抗原（マウスIgG）および牛血清アル
ブミン（BSA）で被覆された６個の個々の穴（陽性試
料）、並びにBSAのみで被覆された６個の穴（陰性比
較）で構成した。ヤギ抗−マウスIgG抗体（抗−IgG）で
被覆した公称0.3μｍの（Ｙ0.86Yb0.08Er0.06）2O2S燐
粒子を次いでレポータ−抗体結合体として使用した。
透明なポリスチレン製テラサキプレートの６個の穴
（C5、C6、C7、D5、D6およびD7）をマウスIgGで被覆
し、その際37℃にて燐酸塩緩衝塩水（PBS）における５
μＬの100μg/μＬマウスIgG溶液に対し培養した。１時
間の後、この溶液を吸引すると共に各試料穴をPBSにお
ける10μＬの３％BSAで洗浄した。これを直ちに吸引除
去し、PBSにおける20μＬの30％BSAで置換した。各試料
穴をBSAで後被覆し、その際20μＬのBSA/PBS溶液に対し
37℃で１時間培養した。後被覆溶液を吸引除去し、プレ
ートを４℃にて１晩貯蔵した。これら穴を陽性試料とみ
なした。第２のテラサキプレートにおける同じ６個の穴
を同様に作成したが、ただしマウスIgGで被覆しなかっ
た。この第２群の試料穴を陰性比較とみなした。
燐−抗体結合体 乾燥燐をDMSOに懸濁させることにより、（Ｙ0.86Yb
0.08Er0.06）2OSSの燐粒子の溶液を作成した。初期粒子
密度は、光学顕微鏡の視野に含まれる粒子の個数を計数
することにより測定して、約107粒子/mLであった。0.3
μｍの基礎粒子寸法は顕微鏡の解像限界以下であること
に注目すべきである。この溶液を３日間にわたり乱すこ
となく沈降させた。濁って恐らく殆ど単分散の小粒子を
含有する上澄液をその後の結合に使用した。
ヤギ抗−マウスIgG抗体（Ab）をDMSO分別された燐粒
子に（吸着により）結合させた。これは、200μＬのAb
溶液（0.1MトリスHCl、pH7.2における）をDMSOにおける
100μＬの燐懸濁物と混合して行った。数種の異なるAb
濃度を0.025〜１μg/μＬの範囲で試みた。0.25μg/μ
Ｌの濃度が最も効率的な被覆をもたらすと思われた（す
なわち、最小の燐粒子の凝集を伴って最大のAb利用
率）。燐を室温にて１晩にわたりこのDMSO/トリス溶液
におけるAbとゆっくり撹拌しながら平衡化させた。得ら
れた燐−Ab結合体をこの溶液から遠心分離すると共に、
後被覆するためPBSにおける３μg/mLのBSA溶液に再懸濁
させた。得られたBSA/PSA再懸濁物を分析のため直接使
用した。
燐に対するAb吸着程度および残留Ab活性のを、燐結合
したAbをフルオレスセインイソチオシアネート（FITC）
結合−マウスIgGで滴定して測定した。得られたFITC標
識燐をサイテロン・アブソルート流動血球測定計に通過
させ、この測定計は粒子の相対寸法を測定することがで
きる。２種の異なる寸法のサブ集団を観察し、計数した
粒子の約65％が小さい恐らく単分散の粒子として出現
し、35％がずっと大きい恐らく凝集体として出現した。
小さいサブ集団の60％のみが著量の活性Abを有すると思
われた（FITC蛍光により測定）。目的とする凝集体のう
ち、約90％が活性Abを含有すると思われた（FITC蛍光に
よる）。これは、燐−Ab結合体の40％未満が適する寸法
（公称0.3μｍ）であって抗−マウスIgI活性を示したこ
とを示唆する。燐−Ab結合体の同様な割合（31％）が活
性であったが、顕著に大きい燐レポータを有した。
PMT信号（amp）を各プレート位置で記録し、試料穴の
幅（約4000μｍ）にわたり数値的に積算した。平均信号
（95％信頼限界）は次の通りであった： 陽性試料の平均値＝1.30×10-4±1.25×10-4μａ−m; 陰性比較の平均値＝4.20×10-6±6.82×10-6μａ−
ｍ。
陽性試料および陰性比較は99.9％信頼レベルにて統計
的に相違する。陽性試料は平均で陰性比較よりも30.0±
29.7倍多い光を発する。
生物学的巨大分子に対する燐の結合 生化学レポータとしてのアップコンバート性燐に関す
るパラメータをさらに評価するため、生物学的リンカを
燐粒子に付着させた。ナトリウムイットリウムフルオラ
イド−イッテルビウム／エルビウム燐粒子をストレプト
アビジンで被覆した。燐単独およびストレプトアビジン
で被覆された燐の励起および発光スペクトル特性を測定
し（第17A、17B、18Aおよび18B図）、未被覆およびスト
レプトアビジン被覆の両燐はその吸収および発光特性に
おいてほぼ同一であり、このことは巨大分子リンカ（た
とえば蛋白）の付着がたとえ存在したとしてもアップコ
ンバート性燐の燐光性に対し殆ど作用を示さないことを
示唆する。次いでストレプトアビジン被覆された燐はビ
オチニル化された磁性ビーズに特異的に結合し、これは
たとえば免疫分析、免疫組織化学、核酸ハイブリッド化
および他の分析のような生化学分析におけるレポータと
してのリンカ結合無機燐の利用可能性を示す。磁性ビー
ズ技術は溶液からのビオチン結合ストレプトアビジン被
覆燐の容易な分離を可能にし、磁性ビーズが固体基質で
あるサンドイッチ分析につき特に適している。
有利には、ストレプトアビジン−ビオチン化学は、ア
ップコンバート性燐レポータが適している各種の生物学
的分析に広く使用される。第20図は、限定はしないがた
とえばアナライト（たとえば抗原標的）をビオチニル化
抗体に結合させることにより溶液中のアナライトを検出
するための免疫分析の１実施例を示し、ここでアナライ
トは固体支持体（たとえば磁性ビーズ）に固定化された
サンドイッチ複合体を形成し、これは最初に固体基質に
直接結合した第１結合成分を第２結合成分（たとえばビ
オチニル化抗体）に結合させて行われる。次いでストレ
プトアビジン被覆されたアップコンバート性燐はサンド
イッチにおけるビオチニル化抗体に特異的に結合して、
固体支持体におけるサンドイッチ複合体の形成をリポー
トするよう作用する（これはアナライト濃度の尺度であ
る）。固体基質が磁性ビーズである場合、これは磁気分
離により試料溶液から容易に除去され、サンドイッチ複
合体におけるビーズに付着した燐の量は特定アップコン
バート性燐光を測定して決定される。すなわち、サンド
イッチ複合体の燐光はアナライト濃度の定量的尺度を与
える。
さらにビオチニル化ポリヌクレオチドもハイブリッド
化プローブとして便利に使用され、これらプローブはス
トレプトアビジン被覆アップコンバート性燐により結合
されてハイブリッド形成をリポートすることができる。
生物学的試料におけるバックグランド燐光 免疫分析における生じうるバックグランドを決定すべ
く、２種の生物学的試料にてバックグランド信号を測定
した。唾液および尿を、燐光感度測定（上記）につき使
用したと同じ装置で試料として使用した。光電子増倍管
の暗電流により設定されたシステムのノイズレベルより
高いバックグランドレベルは観察されなかった。このノ
イズレベルは数百個の粒子/cm3の程度にて信号の検出を
可能にする。これは、システムの検出量にて単一の粒子
に近い。
光電子増倍管はアップコンバート性燐の高感度測定に
つき好適な検出器の選択である。何故なら、光電子増倍
管はアップコンバート（すなわち発光）された波長にて
高い量子効率を発生すると共に長い励起波長の範囲では
反応しないよう選択しうるからである。
燐標識抗体による細胞抗原の検出 ストレプトアビジンを上記と同様にアップコンバート
性燐粒子に付着させる。マウスのリンパ腫細胞ラインEL
−４を、30kD細胞表面EL−４ CD3 Ｔリンパ球分化抗
原に対し特異的に結合するハムスター抗−CD3抗体で検
査する。次いで一次ハムスター抗体をビオチニル化ヤギ
−抗ハムスター二次抗体により特異的に結合させる。次
いでビオチニル化された二次抗体をストレプトアビジン
−燐結合体で検出する。この種類の多重抗体付着および
標識を抗体レイヤリング（layering）と称する。
複数層の付加（たとえば一次ハムスターAbとヤギ−抗
ハロスターAbとの結合に続く、ビオチニル化ウサギ−抗
ヤギAbとの結合）を用いて、標的から燐を分離する距離
を増大させる。信号強度と標的検出特異性とに対するレ
イヤリング作用を検量すると共に、１つの層（一次抗体
はビオチニル化される）から少なくとも５層への層抗体
レイアリングを行いかつEL−４細胞におけるCD3を検出
するための最適層数を確認することにより個々の使用に
つき最適化した。
第21図は、励起スペクトルおよび／または発光スペク
トルに基づいて識別しうる燐を用いた２種のEL−４細胞
表面抗原の同時的検出を図示する。第21図に示した方式
における両抗原の検出は、Ab層状化試料と共に培養する
前にストレプトアビジン被覆燐（No.1もしくはNo.2）に
結合させるビオチニル化末端抗体を使用する。すなわ
ち、燐−抗体特異性はストレプトアビジンと一次抗体結
合試料と共に培養する前に予備生成されるビオチンとの
間の異常に強い（KD約１×1015M-1）非共有結合により
保持される。各抗原の定量は、それぞれ個々の燐物質に
起因する異なる信号を検出して行われる。燐光信号は励
起スペクトル、発光スペクトル、蛍光減衰時間またはこ
れらもしくは他の性質の組合せに基づいて識別すること
ができる。
第22図は、さらにバックグランド識別を与える位相敏
感検波の装置の図面である。パルスもしくは周波数ミキ
サを、信号を通過させると共に最大バックグランド排除
のため周波数検定の後にバックグランドを識別するよう
設定する。
アビジンに対するアップコンバート性燐ラベルの共有結
合 アップコンバート性イットリウム−イッテルビウム−
エルビウム（Ｙ0.86Yb0.08Er0.06）オキシスルフィド
（O2S）燐を次の手順によりアビジンに結合させた： 単分散アップコンバート性燐粒子を、アルクレスによ
り詳述された手順［シリコーン化合物：レジスタ・アン
ド・レビュー、ヒルス・アメリカ、第59〜75頁（199
1）］に従いチオプロピルトリエトキシシラン（Huls）
でシラン化した。これはチオプロピルトリエトキシシラ
ン（2g）と95％水性エタノール（100mL）とを500mLの三
角フラスコに添加して行い、２分間撹拌した。次いで、
DMSOにおける約8mLの65mg/mL燐懸濁物を混合物に添加し
た。この懸濁物をさらに２分間攪拌し、次いで遠沈管に
移して遠心分離することにより燐粒子を分離した。ペレ
ットをそれぞれ95％水性エタノールで遠心分離して２回
洗浄した。得られた粒子を集め、減圧下で約30℃にて１
晩乾燥させた。所定量（127mg）の乾燥シラン化燐を1.5
mLのDMSOに再懸濁させた（燐保存液）。
1.0mLの硼酸塩緩衝液（50mLの脱イオン水における954
mgの硼酸ナトリウム十水塩および17.7mLの0.1M HCl、p
H8.3）に1.19mgのアビジン（ピアス社）を含有する溶液
を作成した（アビジン保存液）。1.2mLのDMSO中に1.7mg
のＮ−スクシニミジル（４−イオドアセチル）−アミノ
ベンゾエート（ピアス・ケミカル社）を含有する他の溶
液を作成した（SIAB保存液）。所定量（10μＬ）のSIAB
保存液を1.0mLのアビジン保存液に添加し、室温にて30
分間撹拌してSIABのＮ−ヒドロキシスクシミドエステル
をアビジンにおける第一アミンと反応させた（アビジン
−SIAB保存液）。
10mLの硼酸塩緩衝液（pH8.3）を含有する20mLのシン
チレーション小瓶を作成した。次いで、この小瓶に対し
次の添加を行った:21.6μＬのアビジン−SIAB保存液に
続く1.5mLの燐保存液。この反応混合物を暗所にて室温
で１晩撹拌して、SIAB活性化アビジンをシラン化燐表面
に存在するチオール基と反応させ、燐粒子に対するアビ
ジンの共有結合を生ぜしめた。
１晩培養した後、1.0mLの反応混合物を遠心分離し（1
0,000gにて１分間）、上澄液を除去した。ペレットを1.
0mLの燐酸塩緩衝塩水（pH7.2、ピアス社）に再懸濁さ
せ、再び遠心分離して未結合の蛋白を燐から洗浄除去し
た。この洗浄工程を反復した。洗浄されたペレットを1.
0mLの燐酸塩緩衝塩水に再懸濁させ、下記する診断分析
に直接使用した。
測定装置 燐試料からの蛍光スペクトルを測定すべく改変SLMア
ミンコ48000型フルオリメータを使用した。この装置の
改変はレーザーダイオード（ダビッド・サルノフCD−29
9R−FA No.13）を付加することからなり、これをポー
ト３によりフルオリメータに入力した。このレーザーダ
イオードはλ＝985.1nmにて発光する。ダビッド・サル
ノフ・リサーチ・センターにより提供されるスペクトル
データも980.2nmにて小ピークを示す。このピークは、9
85nmにおけるピーク強度の15％を有する。
5.08cm焦点長さのレンズを用いてダイオードレーザー
ビームを視準した。IRレーザー光線の出力は、75mAの作
動電流にてキュベット位置で6.1mWとして測定された。
このビームはキュベットの中心に集束しなかった。これ
はフルオリメータ励起モノクロメータからの標準可視光
線についても言える。レーザーダイオードビームはキュ
ベットホルダに突入する際に発散し、セルの中心に達す
る時点で約4mm（Ｈ）×2mm（Ｖ）となる（セル壁部およ
び液体の屈折率における変化を無視する）。
放出される光をモノクロメータで走査すると共に、励
起光の方向から90゜にて光電子増倍管（PMT）により検
出する。改変SLMアミンコ48000の型フルオリメータ検出
限界は、PBSにおける４×10-16M（1mL当り240,000個の
燐粒子）までシリーズ希釈して決定した。スペクトルに
おける燐発光ピークは406±2nm、434±2nm、522±2nmお
よび548±2nmの波長にて見られた。最大ピークは548nm
であった。548nmピークの強度を用いて試料を識別し
た。
細胞表面マーカーに対するアビジン−燐結合体の結合 リンパ芽球腫細胞ライン（ヒト遺伝子突然変異細胞寄
託No.GM 07090）を、15％熱失活胎児牛血清を含有する
RPMI 1640培地で培養した。細胞の懸濁物（107細胞）
を遠心分離し、等容積の燐酸塩緩衝塩水（PBS）（pH7.
4）に再懸濁させた。細胞をPBSで２回洗浄し、５×106
細胞/mLの最終濃度まで再懸濁させた。次いで、これら
細胞をヒトβ２−マイクログロブリン（すなわち種類Ｉ
組織適合性抗原）に対するマウスIgG1モノクローナル抗
体と共にポリスチレン遠沈管で培養した。細胞を４℃に
て30分間にわたり10μg/mLの抗体濃度にて免疫沈殿させ
た。これら細胞を遠心分離により回収し、PBSで２回洗
浄し、PBSに再懸濁させ、次いで６本の新たな遠沈管に
分けた（250μＬ）。これら試料の４種にはビオチニル
化ヤギ抗−マウスIgIを添加する一方、残余の２種にはF
ITC標識ヤギ抗−マウスIgGを添加した。これら免疫沈殿
は、400μＬの容積にて４℃で30分間にわたり20μg/mL
の最終的な第２抗体濃度にて行った。細胞を回収すると
共に上記と同様にPBSで洗浄したが、50μＬの封鎖用緩
衝液（PBSにおける0.2％精製カゼイン、トロピックス
社、ベッドフォード、MA）に再懸濁させた。細胞−抗体
複合体をこの溶液にて室温で30分間にわたり封鎖し、次
いで新たな試験管に移した。
アビジン−燐結合体、アビジン−FITC、アビジンまた
は未結合燐のいずれかである予備封鎖された懸濁物（40
μＬ）を、ビオチニル化抗−マウスIgG（Ｈ＆Ｌ）と結
合した細胞試料の４種に添加した。さらに、同量の予備
封鎖されたアビジン−燐または未結合燐を非ビオチニル
化FITC標識抗−マウスIgG（Ｈ＆Ｌ）で免疫沈殿された
残余の２種の細胞試料に添加した。アビジン−レポータ
結合体または陰性比較を次のように予備封鎖した。アビ
ジン−燐および燐単独を、100μＬの最終容積まで10μ
Ｌの6.7mg/mL懸濁物を添加することにより封鎖緩衝液で
希釈した。アビジン−FITCおよびアビジン単独比較を
も、100μＬの最終容積まで27μＬの2.5mg/mL溶液を添
加することにより封鎖緩衝液で希釈した。これら試薬を
室温にて３時間にわたり中間的に再懸濁しながら封鎖
し、次いでビオチニル化もしくは非ビオチニル化第２抗
体で標識された50μＬの細胞に添加した。アビジン−ビ
オチン反応を、時々再懸濁させながら室温にて30分間行
った。遠心分離により細胞を回収すると共に封鎖用緩衝
液で２回洗浄することにより反応を停止させた。これら
試料を100μＬの封鎖用緩衝液に再懸濁させ、４〜５分
間にわたり沈降させた。画像形成用のスライドを、５μ
Ｌの沈降細胞を試験管の底部からピペット採取すること
により作成した。細胞を適する条件下での共焦点レーザ
ー顕微鏡法により画像形成して、細胞表面FITCおよびア
ップコンバート性燐信号を観察した。これら観察を第IV
表に要約する。
残余の試料を用いて、ヒツジ抗−マウスIgGと結合し
た常磁性ポリスチレンビーズを再懸濁させた。６種の各
試料につき、３×107ビーズを封鎖用緩衝液で室温にて
１時間にわたりエッペンドルフ管中で予備洗浄した。緩
衝液を、エッペンドルフ管を磁気ラックに入れながら吸
引して除去した。抗−マウスIgGを有する磁性ビーズを
抗体標識細胞に室温にて１時間にわたり間歇的に再懸濁
させながら結合させた。次いで磁性ビーズを磁気ラック
に集め、封鎖用緩衝液で４回洗浄し、100μＬの封鎖用
緩衝液に再懸濁し、新たなチューブに移し、次いでアッ
プコンバート性燐光をフルオリメータで測定した。
燐発光につき走査するため発光モノクロメータバンド
幅を8nmに設定し、スペクトルを500〜700nmにて2nmの段
階寸法で走査した。さらに試料を2nmのバンド幅にてλ
＝490nmで37μＭにより励起させてFITC信号につき測定
した。励起波長（490nm）および発光波長（514nm）はFI
TCにつき極めて近似するので、分離可能な信号を得るに
は燐標識の場合よりも高い解像が必要とされた。490nm
信号の強度は穴の中心にて240μW/cm2であった。FITC発
光スペクトルを450nmから750nmまで2nmのバンド幅にて
発光モノクロメータにより0.5nmの増し分にて走査し
た。試料１は陽性比較であり、最高の発光信号を明かに
与えた。試料２は、試料に対する燐の非特異的吸着が制
限されると共にアビジン結合燐に起因する信号から容易
に識別されることを示し、さらにアビジン結合燐がプロ
ーブと結合する際にのみ、この実施例ではビオチン−ア
ビジン結合を介して特異的に結合しうることを示す。試
料３は陰性比較であって、燐を含有せず、アビジンのみ
を含有する。試料４はFITC結合アビジンを示す。FITC信
号はレーザー顕微鏡法により細胞表面で観察されたが、
これら信号はFITCの測定につきフルオリメータでの検出
レベルより低く、また試料には燐が存在しなかったので
顕著な燐信号も存在しなかった。試料５および６は、FI
TC結合一次抗体を検出することができ、さらに燐もしく
はアビジン−燐の存在が標的抗原に対する一次抗体の結
合を顕著には阻害しないことを示す。
DNAに対するアビジン−燐結合体の結合 プラスミドDNA（25μｇ）の20mMのdGTPと20mMのdCTP
と20mMのビオチン−14 dATPと13mMのdTTPと7mMのジゴ
キシゲニン−11 dUTPとの存在下にニック翻訳すると共
に、エタノール沈殿により精製した。ビオチニル化され
たジゴキシゲニン標識断片の平均寸法は、ゲル電気泳動
により推定して200〜300ヌクレオチドの範囲であると推
定された。約20μｇのDNAを、200μＬ容積における10μ
g/mLのマウスモノクローナル抗−ジゴキシゲニンIgG1溶
液（PBS）により22℃にて１時間にわたり免疫沈殿させ
た。DNAを含有しない均等な反応物も作成した。これら
２種の試料のそれぞれを次いで３本の新たなエッペンド
ルフ管に分け入れた（50μＬ）。
アビジン結合体を、500μｇのアビジン−燐懸濁物、
未結合燐懸濁物またアビジン溶液を300μＬの封鎖緩衝
液で希釈して室温で１時間にわたり封鎖した。各試料
（第Ｖ表に要約する）のそれぞれにつき、50μＬの抗−
ジゴキシゲニン結合体1150μＬの予備封鎖されたアビジ
ン結合体もしくはアビジンに添加し、室温にて30分間培
養した。
ヒツジ抗−マウスIgG（封鎖緩衝液で予備封鎖）と結
合させた３×107個の常磁性ビーズを再懸濁させること
により未結合アビジン−結合体を除去した。間歇的に再
懸濁しながら室温にて30分間培養した後、ビーズを磁気
ラック上で分離すると共にPBSで４〜６回洗浄した。抗
体−DNA結合ビーズを次いでフルオリメータで測定し
た。
各試料を8nmのバンド幅および2nmの段階寸法にて500
〜700nmで走査した。示した各PMT値（第Ｖ表）は５回の
走査の平均値を示す。試料１は最高のPMT信号を与える
と予想される。何故なら、ビオチニル化DNAが存在して
アビジン結合燐に結合しうるからである。試料２は、顕
著でないことが判明した試料への燐の非特異的吸着のレ
ベルを示す。何故なら、PMT信号は燐を含有しない陰性
比較（試料４）におけると同じであると観察されたから
である。試料３は他の比較であって、アビジン結合燐が
DNAの不存在下で常磁性ビーズに結合しないことを示
す。試料５および６は分析を確認すべく用いたFITC標識
アビジンの結果を示す。
燐ダウンコンバーションの評価 （Ｙ0.86Yb0.08Er0.06）2O2S燐の試料をダウンコンバ
ート信号の存在につき走査した。これは、上記単分散燐
の試料（DMSO中４×10-12M）を350nmにて励起源につき1
6nmバンド幅で1.3mWの単色光により励起させて行った。
検出は、この試料を350〜800nmにて8nmのモノクロメー
タバンド幅で走査することにより行った。走査は2nmの
増し分で行った。ダウンコンバーションは観察されなか
った。さらに、タンケ等（米国特許第5,043,265号）に
引用された励起波長でもダウンコンバーションは見られ
なかった。すなわち、試験したアップコンバート性燐は
タンケ等に報告されたものとは異なる。
均質分析 アップコンバート性燐に特徴的なマルチフォトン活性
化法を開発して、試料洗浄工程を必要としない分析を行
うことができる。未結合の燐ラベルを試料から除去する
必要がないこの種の診断分析をここでは均質分析と称
し、プソイド均質分析と称することもできる。
均質分析例１ 均質分析の１実施例は、適するプローブ（たとえば抗
体もしくはDNA）に結合したアップコンバート性燐ラベ
ルを使用する。燐標識されたプローブは、捕獲表面に結
合する標的（たとえば抗原もしくは核酸）に対し特異的
に結合する。適する捕獲表面は光伝導性光学繊維の先端
（第23図）または試料容器の底部表面（第24図）とする
ことができる。標的標識された捕獲表面を燐標識プロー
ブと共に培養すると、燐粒子は捕獲表面上に存在する標
的の量に応じて捕獲表面に蓄積する。標的な捕獲表面に
直接に結合することができ、或いはそれ自身で捕獲表面
に結合する結合剤（たとえば標的に対し反応性の特異的
抗体、標的を結合するポリヌクレオチドなど）との相互
作用により固定化することもできる。
捕獲表面に結合した燐の検出は、大断面の低強度ビー
ムから小断面の高強度ビームまで、捕獲表面に存在する
或いはそれに極めて近いビームの焦点で集束する励起光
を用いて行われる。励起光の集束は、極めて小さい焦点
距離を有する光学部材に対する伝送によって行われ、ビ
ームが捕獲表面の短距離内で発散して強度が低くなる。
アップコンバート性燐ラベルから放出される光の強度
は２乗もしくはそれ以上まで上昇する励起光強度に比例
するので、励起源の焦点近くの燐は、捕獲表面から離れ
た試料における懸濁状態に保たれる燐よりも顕著に多い
光を発光する。したがって、アップコンバート性燐結合
プローブと捕獲表面との結合は、全体として試料から測
定される或いは燐が捕獲表面に結合しない比較試料から
測定される発光光強度の増加をもたらす。発光光強度
は、所定の標的濃度を有する一連の試料を基準化（検
量）につき用いて、標的濃度の関数としてプロットする
ことができる。試験試料（未知濃度の標的）からの発光
光強度を標準曲線と比較して、標的の濃度を測定するこ
とができる。
適する均質分析形式の例は限定はしないが免疫診断サ
ンドイッチ分析、並びに抗原および／または抗体表面競
合分析を包含する。
均質分析例２ 他の実施例は、遠心分離もしくは重力沈降を用いて検
出表面におけるアップコンバート性燐結合プローブの蓄
積を可能にする。この実施例において、アップコンバー
ト性燐は複数プローブに結合する。全てのプローブは同
じ標的に結合せねばならないが、この結合は異なる位置
で得ることができる（たとえば抗体プローブは単一抗原
における種々異なるエピトープを標的とすることができ
る）。次いでマルチプローブ燐を用いて、試料における
溶液もしくは懸濁物の標的の凝集を行うことができる。
この凝集は、溶液もしくは懸濁物から沈殿する大きい不
溶性燐−プローブ−標的複合体の形成をもたらす。燐を
含有する凝集複合体は検出表面に蓄積する一方、非凝集
物質は溶液もしくは懸濁物に残留する。検出は、急激に
収束する励起ビームを用いて上記例に記載したように行
われる。
以上、明瞭に理解する目的で実施例により本発明を詳
細に説明したが、本発明の範囲内において多くの改変を
なしうることが当業者には了解されよう。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ペツパーズ，ノーマン・エー アメリカ合衆国カリフオルニア州94002 ベルモント、ヒルクレスト・ドライヴ 3619 (72)発明者 ケーン，ジエームズ アメリカ合衆国ニユージヤージー州 08648 ローレン スヴイル、ロイヤ ル・オーク・ロード 32 (72)発明者 フアリス，グレゴリー・ダブリユー アメリカ合衆国カリフオルニア州94025 メンロ・パーク、フーヴアー・ストリ ート 1259 (72)発明者 ダイヤー，マーク・ジエー アメリカ合衆国カリフオルニア州95123 サン・ホゼ、ブラツクフツト・コート 705 (56)参考文献 特表 昭63−500400（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 33/48 - 33/98

Claims (32)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】ホスト材料中にイッテルビウムおよびエル
    ビウムよりなる群から選択される少なくとも１種の稀土
    類元素を含み、励起照射線を該励起照射線よりも短波長
    の発光照射線に変換し得るアップコンバート性無機燐か
    らなるラベルをプローブに付着させて標識プローブを形
    成し； 標的アナライトを含有する試料を結合条件下で標識プロ
    ーブと接触させて標識プローブ−標的複合体を形成し； 未結合の標識プローブを試料中の標識プローブ−標的複
    合体から除去し； ラベル励起波長で照明すると共に少なくとも１つのラベ
    ル発光波長の発光を検出することにより標識プローブ−
    標的複合体を検出する ことを特徴とする試料におけるアナライトの検出方法。
  2. 【請求項２】アップコンバート性無機燐がナトリウム
    イットリウム フルオライド イッテルビウム エルビ
    ウムもしくはイットリウム イッテルビウム エルビウ
    ムオキシスルフィドからなる請求の範囲第１項に記載の
    方法。
  3. 【請求項３】プローブが抗体、ポリヌクレオチド、ポリ
    ペプチドホルモン、ストレプトアビジン、スタフィロコ
    ッカス・アウレウス蛋白Ａ、レクチンおよび抗原よりな
    る群から選択される請求の範囲第１項に記載の方法。
  4. 【請求項４】プローブも共有もしくは非共有結合により
    標識に付着させる請求の範囲第１項に記載の方法。
  5. 【請求項５】プローブがストレプトアビジンもしくはア
    ビジンである請求の範囲第４項に記載の方法。
  6. 【請求項６】未結合の標識プローブを試料中の標識プロ
    ーブ−標的複合体から除去する工程を、水溶液により試
    料を洗浄して可溶性の未結合標識プローブを除去するこ
    とにより行う請求の範囲第１項に記載の方法。
  7. 【請求項７】標識プローブ−標的複合体を固体支持体に
    固定化する請求の範囲第６項に記載の方法。
  8. 【請求項８】標識プローブ−標的複合体が結合サンドイ
    ッチ複合体である請求の範囲第７項に記載の方法。
  9. 【請求項９】標的アナライトがポリヌクレオチド、ポリ
    ペプチド、ウィルス、微生物、ハプテン、哺乳動物細
    胞、ステロイドホルモン、グリコ蛋白、リポ蛋白、ビオ
    チニル化磁性ビーズおよび医薬品よりなる群から選択さ
    れる請求の範囲第１項に記載の方法。
  10. 【請求項１０】ラベル励起波長で照明する工程を赤外レ
    ーザーダイオードもしくは発光ダイオードで行う請求の
    範囲第１項に記載の方法。
  11. 【請求項１１】赤外レーザーダイオードもしくは発光ダ
    イオードがパルス照明を発する請求の範囲第10項に記載
    の方法。
  12. 【請求項１２】赤外レーザーダイオードもしくは発光ダ
    イオードを直流変調により脈動させる請求の範囲第11項
    に記載の方法。
  13. 【請求項１３】少なくとも１つのラベル発光波長の発光
    を検出する工程をタイムゲートもしくはロックイン検出
    により行う請求の範囲第11項に記載の方法。
  14. 【請求項１４】発光を検出する工程を位相敏感検波によ
    り行う請求の範囲第10項に記載の方法。
  15. 【請求項１５】レーザーダイオードもしくは発光ダイオ
    ードが960〜980nmの範囲および約1500nmにピーク発光を
    有する請求の範囲第10項に記載の方法。
  16. 【請求項１６】発光を検出する工程を光電子増倍管、CC
    D、CIDまたは写真フィルム乳液で行う請求の範囲第１項
    に記載の方法。
  17. 【請求項１７】標的アナライトを組織学的組織セクショ
    ンまたは固体支持体に固定化させる請求の範囲第１項に
    記載の方法。
  18. 【請求項１８】標的アナライトを含有する試料を結合条
    件下でプローブと接触させてプローブ−標的複合体を形
    成し； ホスト材料中にイッテルビウムおよびエルビウムよりな
    る群から選択される少なくとも１種の稀土類元素を含
    み、励起照射線を該励起照射線よりも短波長の発光照射
    線に変換し得るアップコンバート性無機燐からなるラベ
    ルをプローブ−標的複合体に付着させて標識プローブ−
    標的複合体を形成し； 未結合のアップコンバート性無機燐ラベルを試料中の標
    識プローブ−標的複合体から除去し； ラベル励起波長で照明すると共に少なくとも１つのラベ
    ル発光波長の発光を検出することにより標識プローブ−
    標的複合体を検出する ことを特徴とする試料におけるアナライトの検出方法。
  19. 【請求項１９】標的アナライトがポリヌクレオチドであ
    り、プローブが実質的な相補配列を有するビオチニル化
    ポリヌクレオチドであって、結合条件下で標的ポリヌク
    レオチドに対し特異的にハイブリダイズする請求の範囲
    第18項に記載の方法。
  20. 【請求項２０】前記アップコンバート性無機燐ラベルを
    ストレプトアビジンに結合させる請求の範囲第19項に記
    載の方法。
  21. 【請求項２１】プローブが一次抗体であり、前記ラベル
    を少なくとも１種の二次抗体を介しプローブに結合させ
    る請求の範囲第18項に記載の方法。
  22. 【請求項２２】前記二次抗体をビオチニル化すると共
    に、前記ラベルをストレプトアビジンに結合させる請求
    の範囲第21項に記載の方法。
  23. 【請求項２３】ホスト材料中にイッテルビウムおよびエ
    ルビウムよりなる群から選択される少なくとも１種の稀
    土類元素を含み、励起照射線を該励起照射線よりも短波
    長の発光照射線に変換し得るアップコンバート性無機燐
    からなるラベルをストレプトアビジンと接触させて、ス
    トレプトアビジン被覆されたアップコンバート性無機燐
    ラベルを形成し； 前記ビオチニル化された標的を、ストレプトアビジン被
    覆されたアップコンバート性無機燐ラベルと結合条件下
    で接触させて標的−ラベル複合体を形成し； 標的−標識複合体を未結合のストレプトアビジン被覆さ
    れたアップコンバート性燐ラベルから分離し； ラベル励起波長で照明すると共に少なくとも１つのラベ
    ル発光波長の発光を検出することにより標的−ラベル複
    合体を検出する ことを特徴とするビオチニル化標的の検出方法。
  24. 【請求項２４】標的がビオチニル化磁性ビーズである請
    求の範囲第23項に記載の方法。
  25. 【請求項２５】ホスト材料中にイッテルビウムおよびエ
    ルビウムよりなる群から選択される少なくとも１種の稀
    土類元素を含み、励起照射線を該励起照射線よりも短波
    長の発光照射線に変換し得るアップコンバート性無機燐
    からなるラベルを、前記ラベルと共に標識プローブを形
    成するための結合成分であって、抗体、アビジン、スト
    レプトアビジン、スタフィロコッカス・アウレウス蛋白
    Ａ、抗原およびポリヌクレオチドよりなる群から選択さ
    れるプローブに付着してなる組成物。
  26. 【請求項２６】前記アップコンバート性無機燐ラベル
    が、吸収剤としてイッテルビウムと、エルビウム、ホル
    ミウム、ツリウムおよびテルビウムよりなる群から選択
    される発光剤とからなる請求の範囲第25項に記載の組成
    物。
  27. 【請求項２７】プローブが非共有結合により前記アップ
    コンバート性無機燐ラベルに付着される請求の範囲第25
    項に記載の組成物。
  28. 【請求項２８】プローブがストレプトアビジンであり、
    アップコンバート性無機燐ラベルが非共有結合によりプ
    ローブに付着される請求の範囲第25項に記載の組成物。
  29. 【請求項２９】ビオチニル化磁性ビーズ、ストレプトア
    ビジン被覆磁性ビーズ、アビジン被覆磁性ビーズまたは
    免疫グロブリン被覆磁性ビーズをさらに含む請求の範囲
    第28項に記載の組成物。
  30. 【請求項３０】標的アナライトの存在を検出するための
    均一分析の実施方法において： ホスト材料中にイッテルビウムおよびエルビウムよりな
    る群から選択される少なくとも１種の稀土類元素を含
    み、励起照射線を該励起照射線よりも短波長の発光照射
    線に変換し得るアップコンバート性無機燐からなるラベ
    ルをプローブに付着させて標識プローブを形成し； 標的アナライトを含有する試料を結合条件下で標識プロ
    ーブと接触させて標識プローブ−標的複合体を形成し；
    標識プローブ−標的複合体を、標識プローブ−標的複合
    体が未結合標識プローブと対比して、接触表面に優先的
    に局在する接触表面と接触させ； ラベル励起波長で照明すると共に少なくとも１つのラベ
    ル発光波長の発光を検出することにより前記接触表面に
    おける標識プローブ−標的複合体を検出する ことを特徴とする均一分析の実施方法。
  31. 【請求項３１】接触表面に焦点を有すると共に接触表面
    以外の箇所にて発散する共焦ビームで照明することによ
    り検出工程を行う請求の範囲第30項に記載の方法。
  32. 【請求項３２】前記プローブ−標的複合体を未結合標識
    プローブと対比し、磁性ビーズに優先的に局在させる、
    前記接触表面への磁性ビーズの磁気局在化； 沈降プローブ−標的複合体を未結合標識プローブと対比
    し接触表面に優先的に局在させる、未結合標識プローブ
    からのプローブ−標的複合体の重力沈降；または前記プ
    ローブ−標的複合体を未結合標識プローブと対比し接触
    表面に優先的に局在させる、接触表面にわたる濾過 によりプローブ−標的複合体を接触表面に優先的に局在
    させる請求の範囲第30項に記載の方法。
JP50828294A 1992-09-14 1993-09-14 レーザー励起技術を用いる生物学的および他の分析のためのアップコンバート性レポータ Expired - Lifetime JP3420765B2 (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US94606892A 1992-09-14 1992-09-14
US07/946,068 1992-09-14
PCT/US1993/008712 WO1994007142A1 (en) 1992-09-14 1993-09-14 Up-converting reporters for biological and other assays using laser excitation techniques

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2002306847A Division JP3636705B2 (ja) 1992-09-14 2002-10-22 レーザー励起技術を用いる生物学的および他の分析のためのアップコンバート性レポータ

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPH08501632A JPH08501632A (ja) 1996-02-20
JP3420765B2 true JP3420765B2 (ja) 2003-06-30

Family

ID=25483910

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP50828294A Expired - Lifetime JP3420765B2 (ja) 1992-09-14 1993-09-14 レーザー励起技術を用いる生物学的および他の分析のためのアップコンバート性レポータ
JP2002306847A Expired - Lifetime JP3636705B2 (ja) 1992-09-14 2002-10-22 レーザー励起技術を用いる生物学的および他の分析のためのアップコンバート性レポータ
JP2004278564A Pending JP2005104980A (ja) 1992-09-14 2004-09-24 レーザー励起技術を用いる生物学的および他の分析のためのアップコンバート性レポータ

Family Applications After (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2002306847A Expired - Lifetime JP3636705B2 (ja) 1992-09-14 2002-10-22 レーザー励起技術を用いる生物学的および他の分析のためのアップコンバート性レポータ
JP2004278564A Pending JP2005104980A (ja) 1992-09-14 2004-09-24 レーザー励起技術を用いる生物学的および他の分析のためのアップコンバート性レポータ

Country Status (8)

Country Link
EP (3) EP0660936B1 (ja)
JP (3) JP3420765B2 (ja)
AT (3) ATE266195T1 (ja)
CA (1) CA2144527C (ja)
DE (3) DE69333502T2 (ja)
DK (2) DK0723146T3 (ja)
ES (2) ES2123063T3 (ja)
WO (1) WO1994007142A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20210035823A (ko) * 2018-07-05 2021-04-01 위니베르시떼 드 스트라스부르 더 긴 여기 상태 수명을 갖는 테르븀을 포함하는 초광도 발광성 란타나이드 나노 입자

Families Citing this family (120)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1994007138A1 (en) 1992-09-14 1994-03-31 Fodstad Oystein Detection of specific target cells in specialized or mixed cell population and solutions containing mixed cell populations
NO180658C (no) 1994-03-10 1997-05-21 Oeystein Fodstad Fremgangsmåte og anordning for deteksjon av spesifikke målceller i spesialiserte eller blandede cellepopulasjoner og opplösninger som inneholder blandede cellepopulasjoner
FI101829B (fi) * 1995-03-07 1998-08-31 Erkki Juhani Soini Biospesifinen määritysmenetelmä
US5891738A (en) * 1995-01-16 1999-04-06 Erkki Soini Biospecific multiparameter assay method
FI98765C (fi) 1995-01-16 1997-08-11 Erkki Soini Virtaussytometrinen menetelmä ja laite
EP0862432A4 (en) * 1995-09-06 2003-03-19 Univ New York State Res Found DYES OF FREQUENCY RISE TO TWO PHOTONS AND THEIR APPLICATIONS
NO961031D0 (no) 1996-03-13 1996-03-13 Det Norske Radiumshospital Tum Fremgangsmåte til å drepe uönskede målceller
CA2255599C (en) 1996-04-25 2006-09-05 Bioarray Solutions, Llc Light-controlled electrokinetic assembly of particles near surfaces
US7144119B2 (en) 1996-04-25 2006-12-05 Bioarray Solutions Ltd. System and method for programmable illumination pattern generation
US6958245B2 (en) 1996-04-25 2005-10-25 Bioarray Solutions Ltd. Array cytometry
DE69732510T2 (de) * 1996-10-31 2005-08-25 Fuji Photo Film Co., Ltd., Minami-Ashigara Bilderzeugende Vorrichtung
JP3761898B2 (ja) 1996-12-03 2006-03-29 ソイニ，エルッキ 生体特異性二光子励起蛍光検出方法およびそのための装置
US6310354B1 (en) 1996-12-03 2001-10-30 Erkki Soini Method and a device for monitoring nucleic acid amplification reactions
NO308755B1 (no) * 1996-12-20 2000-10-23 Iystein Fodstad FremgangsmÕte til karakterisering av unormale celler, anvendelse og sett for utførelse av fremgangsmÕten
US5827748A (en) * 1997-01-24 1998-10-27 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Chemical sensor using two-dimensional lens array
US20030027126A1 (en) 1997-03-14 2003-02-06 Walt David R. Methods for detecting target analytes and enzymatic reactions
US7622294B2 (en) 1997-03-14 2009-11-24 Trustees Of Tufts College Methods for detecting target analytes and enzymatic reactions
US6327410B1 (en) 1997-03-14 2001-12-04 The Trustees Of Tufts College Target analyte sensors utilizing Microspheres
US6023540A (en) 1997-03-14 2000-02-08 Trustees Of Tufts College Fiber optic sensor with encoded microspheres
EP0968411A1 (en) * 1997-03-25 2000-01-05 Photonic Research Systems Limited Luminescence assays
US6406845B1 (en) 1997-05-05 2002-06-18 Trustees Of Tuft College Fiber optic biosensor for selectively detecting oligonucleotide species in a mixed fluid sample
WO1998053093A1 (en) 1997-05-23 1998-11-26 Bioarray Solutions Llc Color-encoding and in-situ interrogation of matrix-coupled chemical compounds
DE19725050C2 (de) 1997-06-13 1999-06-24 Fraunhofer Ges Forschung Anordnung zur Detektion biochemischer oder chemischer Substanzen mittels Fluoreszenzlichtanregung und Verfahren zu deren Herstellung
GB9718477D0 (en) * 1997-09-02 1997-11-05 Photonic Research Systems Limi Luminescence detection
US7348181B2 (en) 1997-10-06 2008-03-25 Trustees Of Tufts College Self-encoding sensor with microspheres
US7115884B1 (en) 1997-10-06 2006-10-03 Trustees Of Tufts College Self-encoding fiber optic sensor
US6607829B1 (en) 1997-11-13 2003-08-19 Massachusetts Institute Of Technology Tellurium-containing nanocrystalline materials
US6207392B1 (en) 1997-11-25 2001-03-27 The Regents Of The University Of California Semiconductor nanocrystal probes for biological applications and process for making and using such probes
US6210910B1 (en) 1998-03-02 2001-04-03 Trustees Of Tufts College Optical fiber biosensor array comprising cell populations confined to microcavities
GB9811483D0 (en) * 1998-05-29 1998-07-29 Photonic Research Systems Limi Luminescence assay using cyclical excitation wavelength sequence
GB9811480D0 (en) * 1998-05-29 1998-07-29 Photonic Research Systems Limi Evanescent-wave excitation of upconverting labels
US6342397B1 (en) 1998-06-04 2002-01-29 Erkki Soini Homogeneous biospecific assay using a solid phase, two-photon excitation and confocal fluorescence detection
CA2335951C (en) 1998-06-24 2013-07-30 Mark S. Chee Decoding of array sensors with microspheres
EP1115424A1 (de) * 1998-08-28 2001-07-18 Febit Ferrarius Biotechnology GmbH Verfahren und messeinrichtung zur bestimmung einer vielzahl von analyten in einer probe
AU2149300A (en) * 1998-11-13 2000-06-05 Bangs Laboratories, Inc. Labeling microparticles capable of absorbing infrared light and methods of making and using the same
US7510841B2 (en) 1998-12-28 2009-03-31 Illumina, Inc. Methods of making and using composite arrays for the detection of a plurality of target analytes
US6429027B1 (en) 1998-12-28 2002-08-06 Illumina, Inc. Composite arrays utilizing microspheres
US6846460B1 (en) 1999-01-29 2005-01-25 Illumina, Inc. Apparatus and method for separation of liquid phases of different density and for fluorous phase organic syntheses
GB9906929D0 (en) * 1999-03-26 1999-05-19 Univ Glasgow Assay system
US6355431B1 (en) 1999-04-20 2002-03-12 Illumina, Inc. Detection of nucleic acid amplification reactions using bead arrays
US20060275782A1 (en) 1999-04-20 2006-12-07 Illumina, Inc. Detection of nucleic acid reactions on bead arrays
US6544732B1 (en) 1999-05-20 2003-04-08 Illumina, Inc. Encoding and decoding of array sensors utilizing nanocrystals
EP2360270B1 (en) 1999-05-20 2016-11-09 Illumina, Inc. Combinatorial decoding of random nucleic acid arrays
US8080380B2 (en) 1999-05-21 2011-12-20 Illumina, Inc. Use of microfluidic systems in the detection of target analytes using microsphere arrays
US8481268B2 (en) 1999-05-21 2013-07-09 Illumina, Inc. Use of microfluidic systems in the detection of target analytes using microsphere arrays
DK1218545T3 (da) 1999-08-18 2012-02-20 Illumina Inc Fremgangsmåder til fremstilling af oligonukleotidopløsninger
US6942968B1 (en) 1999-08-30 2005-09-13 Illumina, Inc. Array compositions for improved signal detection
US7332344B2 (en) 1999-12-01 2008-02-19 Photonic Research Systems Limited Luminescence assays
US6235483B1 (en) 2000-01-31 2001-05-22 Agilent Technologies, Inc. Methods and kits for indirect labeling of nucleic acids
US7582420B2 (en) 2001-07-12 2009-09-01 Illumina, Inc. Multiplex nucleic acid reactions
CA2401962A1 (en) 2000-02-07 2001-08-09 Illumina, Inc. Nucleic acid detection methods using universal priming
US8076063B2 (en) 2000-02-07 2011-12-13 Illumina, Inc. Multiplexed methylation detection methods
US7361488B2 (en) 2000-02-07 2008-04-22 Illumina, Inc. Nucleic acid detection methods using universal priming
US7955794B2 (en) 2000-09-21 2011-06-07 Illumina, Inc. Multiplex nucleic acid reactions
US6913884B2 (en) 2001-08-16 2005-07-05 Illumina, Inc. Compositions and methods for repetitive use of genomic DNA
EP1990428B1 (en) 2000-02-07 2010-12-22 Illumina, Inc. Nucleic acid detection methods using universal priming
US7611869B2 (en) 2000-02-07 2009-11-03 Illumina, Inc. Multiplexed methylation detection methods
AU779659B2 (en) * 2000-02-08 2005-02-03 Cornell Research Foundation Inc. Multiphoton excitation through optical fibers for fluorescence spectroscopy
US6770441B2 (en) 2000-02-10 2004-08-03 Illumina, Inc. Array compositions and methods of making same
EP1967595A3 (en) 2000-02-16 2008-12-03 Illumina, Inc. Parallel genotyping of multiple patient samples
US7057704B2 (en) 2000-09-17 2006-06-06 Bioarray Solutions Ltd. System and method for programmable illumination pattern generation
US20030045005A1 (en) 2000-10-17 2003-03-06 Michael Seul Light-controlled electrokinetic assembly of particles near surfaces
CA2436448A1 (en) * 2001-02-02 2002-08-15 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Rare event detection system
DE10123439A1 (de) * 2001-05-14 2002-11-21 Bernhard Trier Fluoreszenzmikroskop
US7336988B2 (en) * 2001-08-08 2008-02-26 Lucent Technologies Inc. Multi-photon endoscopy
US6885440B2 (en) * 2001-11-07 2005-04-26 S31, Llc System and method for detecting and classifying biological particles
US6643071B2 (en) 2001-12-21 2003-11-04 Lucent Technologies Inc. Graded-index lens microscopes
US6750266B2 (en) 2001-12-28 2004-06-15 3M Innovative Properties Company Multiphoton photosensitization system
DE10200499A1 (de) * 2002-01-03 2003-07-10 Zeiss Carl Jena Gmbh Verfahren und/oder Anordnung zur Identifikation von fluoreszierenden, lumineszierenden und/oder absorbierenden Substanzen auf und/oder in Probenträgern
US7499806B2 (en) 2002-02-14 2009-03-03 Illumina, Inc. Image processing in microsphere arrays
JP4526004B2 (ja) 2002-03-05 2010-08-18 大日本印刷株式会社 希土類元素含有微粒子およびそれを用いた蛍光プローブ
CN1157462C (zh) 2002-04-15 2004-07-14 清华大学 一种制备纳米级氟化物基质上转换荧光材料的方法
AU2003269968A1 (en) * 2002-08-16 2004-03-11 Clinical Microarrays, Inc. Substrates for isolating, reacting and microscopically analyzing materials
DE10245432A1 (de) 2002-09-27 2004-04-08 Micronas Gmbh Verfahren und Vorrichtung zum Detektieren mindestens eines Lumineszenz-Stoffs
DE10245435B4 (de) 2002-09-27 2006-03-16 Micronas Gmbh Vorrichtung zur Detektion mindestens eines in einer zu untersuchenden Probe enthaltenen Liganden
US7091500B2 (en) 2003-06-20 2006-08-15 Lucent Technologies Inc. Multi-photon endoscopic imaging system
US7323696B2 (en) 2004-01-09 2008-01-29 Applera Corporation Phosphor particle coded beads
KR20070003879A (ko) * 2004-01-26 2007-01-05 안티캔서, 인코포레이티드 휴대용 관찰 시스템을 사용한 전신 이미징
CN1280623C (zh) * 2004-07-16 2006-10-18 北京博奥生物芯片有限责任公司 一种用于荧光仪器校准测量的校准基片及其制备方法
JP4653983B2 (ja) * 2004-08-23 2011-03-16 菊治 山下 遠赤外線を放射する癌治療器具
EP1845367A1 (en) * 2005-01-27 2007-10-17 Nippon Sheet Glass Company, Limited Detection method, micro-chemical system using the detection method, signal detection method, thermal lens spectrophotometry system, fluorescent detection system, signal detection device, signal detection system, signal detection program, and storage medium
JP2006234794A (ja) * 2005-01-27 2006-09-07 Nippon Sheet Glass Co Ltd 信号検出方法、熱レンズ分光分析システム、蛍光検出システム、信号検出装置、信号検出システム、信号検出プログラム、及び記憶媒体
JP2007071729A (ja) * 2005-09-07 2007-03-22 Nippon Sheet Glass Co Ltd 検出方法及び当該検出方法を用いたマイクロ化学システム
GB2424946A (en) * 2005-04-05 2006-10-11 Stratec Biomedical Systems Ag A detection system for substance binding using up-converting fluorescent probes
US20060246576A1 (en) 2005-04-06 2006-11-02 Affymetrix, Inc. Fluidic system and method for processing biological microarrays in personal instrumentation
FR2884920B1 (fr) * 2005-04-21 2007-08-10 Horiba Abx Sa Sa Dispositif et procede d'analyse multiparametrique d'elements microscopiques
AU2006244617B2 (en) 2005-05-09 2013-04-18 Labrador Diagnostics Llc Point-of-care fluidic systems and uses thereof
US7738099B2 (en) * 2005-07-15 2010-06-15 Biovigilant Systems, Inc. Pathogen and particle detector system and method
US20070160175A1 (en) * 2005-09-23 2007-07-12 Lang Matthew J Systems and methods for force-fluorescence microscopy
EP1801593A1 (en) * 2005-12-22 2007-06-27 Koninklijke Philips Electronics N.V. A method of imaging biological specimens using inorganic nanoparticles as label agents
US8435472B2 (en) 2006-01-06 2013-05-07 National University Of Singapore Method of preparing nano-structured material(s) and uses thereof
US11287421B2 (en) 2006-03-24 2022-03-29 Labrador Diagnostics Llc Systems and methods of sample processing and fluid control in a fluidic system
US8007999B2 (en) 2006-05-10 2011-08-30 Theranos, Inc. Real-time detection of influenza virus
US8012744B2 (en) 2006-10-13 2011-09-06 Theranos, Inc. Reducing optical interference in a fluidic device
US20080113391A1 (en) 2006-11-14 2008-05-15 Ian Gibbons Detection and quantification of analytes in bodily fluids
US8063384B2 (en) 2006-11-28 2011-11-22 Nippon Sheet Glass Company, Limited Detection system and probe therefor
DE102006056949B4 (de) * 2006-11-30 2011-12-22 Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg Verfahren und Vorrichtung zur Detektion mindestens einer Eigenschaft von mindestens einem Objekt mit einem Mikrochip
WO2008105435A1 (ja) 2007-02-28 2008-09-04 Nippon Sheet Glass Company, Limited 蛍光検出システム
WO2008110974A1 (en) * 2007-03-13 2008-09-18 Koninklijke Philips Electronics N. V. Analyzing biological cell material based on different interactions between illumination light and cell components
US8158430B1 (en) 2007-08-06 2012-04-17 Theranos, Inc. Systems and methods of fluidic sample processing
CN103323610B (zh) 2007-10-02 2016-12-28 赛拉诺斯股份有限公司 模块化现场护理装置及其应用
EP4535370A3 (en) 2009-10-19 2025-06-25 Labrador Diagnostics LLC Integrated health data capture and analysis system
DE102010019095B4 (de) 2010-04-30 2016-12-08 Deutsches Zentrum für Luft- und Raumfahrt e.V. Verfahren und Vorrichtung zur Fluoreszenzlebensdauermessung
BR112013018656B1 (pt) 2011-01-21 2021-03-02 Labrador Diagnostics Llc método para detectar a presença ou concentração de um analito numa amostra de fluido contido num recipiente, e, método de medição da concentração de analito numa amostra de fluido
JP5487150B2 (ja) * 2011-03-31 2014-05-07 富士フイルム株式会社 光学的測定方法および光学的測定装置
US9588113B2 (en) 2012-02-22 2017-03-07 Church & Dwight Co., Inc. Methods for electronic analyte assaying
SG193046A1 (en) * 2012-02-23 2013-09-30 Histoindex Pte Ltd A digital imaging system for biopsy inspection
DE102012007862A1 (de) * 2012-04-18 2013-10-24 Heribert Broicher Vorrichtung zur Identifizierung und Qualitätskontrolle von Material
KR101364649B1 (ko) 2012-04-27 2014-02-20 한국과학기술연구원 코어/쉘 구조의 다기능성 자성 나노형광체 및 그 제조방법
ES2791279T3 (es) 2013-08-19 2020-11-03 Univ Houston Indicadores fosforescentes
AU2015236470B2 (en) * 2014-03-24 2019-03-07 Instrumentation Laboratory Company Bioassay system and method for detecting analytes in body fluids
US10379046B2 (en) * 2015-04-08 2019-08-13 Molecular Devices, Llc Method and system for multiplexed time-resolved fluorescence detection
DE102015117939A1 (de) * 2015-10-21 2017-04-27 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Verfahren zur Bestimmung einer Strahlendosis und Produkt
US20200124521A1 (en) * 2016-04-28 2020-04-23 National University Corporation Nagoya University Fluorescent probe for flow cytometry, and method for screening fluorescence-labeled cells
JP6633978B2 (ja) * 2016-06-17 2020-01-22 積水化学工業株式会社 検査キット及び検査方法
DE102017105159B4 (de) 2017-03-10 2020-09-24 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Verfahren zur Validierung einer Bestrahlungsanlage
US20180364150A1 (en) * 2017-06-14 2018-12-20 Cypress Semiconductor Corporation Optical monitoring of target characteristics
RU195925U1 (ru) * 2019-11-19 2020-02-11 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Рязанский государственный радиотехнический университет имени В.Ф. Уткина" Сканирующий зонд атомно-силового микроскопа с отделяемым телеуправляемым нанокомпозитным излучающим элементом, легированным квантовыми точками, апконвертирующими и магнитными наночастицами структуры ядро-оболочка
CN113637048B (zh) * 2020-04-27 2023-07-25 中国科学院理化技术研究所 一种γ-谷氨酰转肽酶的双光子荧光探针及其制备方法和应用
CN115267169A (zh) * 2022-08-16 2022-11-01 南昌富泰力诺检测应用系统有限公司 一种用于多重上转换发光磁分离均相免疫检测的组合物、制备方法及其应用

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US634278A (en) 1899-06-03 1899-10-03 Leon Stilmant Speed-changing gear for cycles.
US4100416A (en) * 1977-03-02 1978-07-11 Block Engineering, Inc. Serum fluorescence suppression
US4172227A (en) 1978-07-21 1979-10-23 Becton, Dickinson And Company Flow microfluorometer
US4347935A (en) 1979-05-16 1982-09-07 The United States Of America As Represented By The United States Department Of Energy Method and apparatus for electrostatically sorting biological cells
US4667830A (en) 1981-06-15 1987-05-26 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Method and means for sorting individual particles into containers for culturing, cloning, analysis, or the like
US4724217A (en) * 1983-10-31 1988-02-09 The United States Of America As Represented By The United States Department Of Energy Ultratrace analysis of transuranic actinides by laser-induced fluorescence
US4661913A (en) 1984-09-11 1987-04-28 Becton, Dickinson And Company Apparatus and method for the detection and classification of articles using flow cytometry techniques
US5093234A (en) 1984-12-24 1992-03-03 Caribbean Microparticles Corporation Method of aligning, compensating, and calibrating a flow cytometer for analysis of samples, and microbead standards kit therefor
WO1987000926A1 (en) * 1985-08-05 1987-02-12 Rijksuniversiteit Leiden Labelled macromolecules; a process for their preparation and their use for immunological or immunocytochemical assays
DE3541033A1 (de) 1985-11-19 1987-05-21 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur quantifizierung von zellpopulationen bzw. subpopulationen sowie hierfuer geeignetes reagenz
US5132242A (en) * 1987-07-15 1992-07-21 Cheung Sau W Fluorescent microspheres and methods of using them
EP0476556A3 (en) * 1990-09-18 1992-11-19 Takeda Chemical Industries, Ltd. Method for determination of a light sensitive substance
US5144224A (en) 1991-04-01 1992-09-01 Larsen Lawrence E Millimeter wave flow cytometer

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20210035823A (ko) * 2018-07-05 2021-04-01 위니베르시떼 드 스트라스부르 더 긴 여기 상태 수명을 갖는 테르븀을 포함하는 초광도 발광성 란타나이드 나노 입자
KR102772855B1 (ko) 2018-07-05 2025-02-26 위니베르시떼 드 스트라스부르 더 긴 여기 상태 수명을 갖는 테르븀을 포함하는 초광도 발광성 란타나이드 나노 입자

Also Published As

Publication number Publication date
EP0723146B1 (en) 2004-05-06
JP3636705B2 (ja) 2005-04-06
DK0660936T3 (da) 1999-05-25
JP2003177096A (ja) 2003-06-27
DE69320484T2 (de) 1998-12-24
DE69334326D1 (de) 2010-05-20
DE69333502T2 (de) 2005-04-14
DE69320484D1 (de) 1998-09-24
EP0660936B1 (en) 1998-08-19
DE69333502D1 (de) 2004-06-09
EP0723146A1 (en) 1996-07-24
ES2123063T3 (es) 1999-01-01
CA2144527C (en) 2010-08-17
DK0723146T3 (da) 2004-08-30
CA2144527A1 (en) 1994-03-31
EP1333274A3 (en) 2003-10-22
ATE170004T1 (de) 1998-09-15
WO1994007142A1 (en) 1994-03-31
EP1333274B1 (en) 2010-04-07
EP1333274A2 (en) 2003-08-06
EP0660936A1 (en) 1995-07-05
ES2216034T3 (es) 2004-10-16
JPH08501632A (ja) 1996-02-20
JP2005104980A (ja) 2005-04-21
ATE463744T1 (de) 2010-04-15
ATE266195T1 (de) 2004-05-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP3420765B2 (ja) レーザー励起技術を用いる生物学的および他の分析のためのアップコンバート性レポータ
US6537829B1 (en) Up-converting reporters for biological and other assays using laser excitation techniques
US6399397B1 (en) Up-converting reporters for biological and other assays using laser excitation techniques
US6312914B1 (en) Up-converting reporters for biological and other assays
US5674698A (en) Up-converting reporters for biological and other assays using laser excitation techniques
US5698397A (en) Up-converting reporters for biological and other assays using laser excitation techniques
JP2638085B2 (ja) 生物特異的な多重分析物アッセイ法
US5043265A (en) Inorganic phosphor labelled macromolecules; a process for their preparation and their use for immunological or immunocytochemical assays
US7267948B2 (en) SERS diagnostic platforms, methods and systems microarrays, biosensors and biochips
US7332344B2 (en) Luminescence assays
US9643180B2 (en) Method for detecting analytes
JP4247770B2 (ja) 微粒子標識を使用した分析物アッセイ
EP1428018B1 (en) Rapid and sensitive detection of molecules
US9274056B2 (en) Use of non-chelated fluorochromes in rapid test systems
JP2001502055A (ja) ホモジニアスルミネセンスエネルギー転移アッセイ
US20140170674A1 (en) Membraine-Based Assay Devices Utilizing Time-Resolved Up-Converting Luminescence
US20130171623A1 (en) Binding Assays Utilizing Time-Resolved Up-Converting Luminescence Detection
Soini et al. Two-photon fluorescence excitation in detection of biomolecules
Faris et al. Upconverting reporters for biomedical diagnostics: Applications in antibody and DNA detection
HK1058236A (en) Up-converting reporters for biological and other assays using laser excitation techniques
CN118891510A (zh) 分析物检测方法
Sun et al. Protein Array Detection with Nanoparticle Fluorescent Probes by Laser Confocal Scanning Fluorescence Detection

Legal Events

Date Code Title Description
R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090418

Year of fee payment: 6

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090418

Year of fee payment: 6

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100418

Year of fee payment: 7

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100418

Year of fee payment: 7

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110418

Year of fee payment: 8

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120418

Year of fee payment: 9

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120418

Year of fee payment: 9

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130418

Year of fee payment: 10

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130418

Year of fee payment: 10

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20140418

Year of fee payment: 11