JP3006615B2 - Ｄ―β―ヒドロキシアミノ酸の製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はグリシンとアルデヒド化合物とをＤ−スレオ
ニンアルドラーゼの存在下で反応させて対応するＤ−β
−ヒドロキシアミノ酸を製造する方法に関する。Ｄ−β
−ヒドロキシアミノ酸は抗生物質、酵素阻害剤等の各種
医薬、農薬、その他各種の生理活性物質の合成原料とし
て有用である。

〔従来の技術及び発明が解決しようとする課題〕

従来、Ｄ−β−ヒドロキシアミノ酸を製造する方法と
しては、ラセミ混合物を優先晶析する方法（特公昭54−
25006号公報）が知られているが、操作が煩雑であり、
又収率も極めて低い。一方、酵素・微生物を用いる方法
として、５−置換ヒダントイン化合物に微生物を作用さ
せてＤ−β−ヒドロキシアミノ酪酸に変換する方法（特
開昭61−212292号公報）、Ｄ−β−ヒドロキシアミノ酪
酸アミドに微生物を作用させて不斉加水分解する方法
（特開昭61−274690号公報）等が知られているが、これ
らの方法は高価な出発物質を必要とする。

〔課題を解決する為の手段〕

本発明は、グリシンと、脂環式アルデヒド、芳香族ア
ルデヒド又は複素環式アルデヒドをＤ−スレオニンアル
ドラーゼの存在下、反応させることを特徴とするＤ−β
−ヒドロキシアミノ酸の製造法でる。

本発明に用いる脂環式アルデヒド、芳香族アルデヒド
又は複素環式アルデヒドは、例えば、 脂環式アルデヒドとして、シクロペンチルアルデヒ
ド、シクロペンテニルアルデヒド、シクロヘキシルアル
デヒド、シクロヘキセニルアルデヒド、シクロヘキシル
アセトアルデヒド、シクロヘキセニルアセトアルデヒド
等、 芳香族アルデヒドとして、ベンズアルデヒド、フロロ
ベンズアルデヒド、クロロベンズアルデヒド、ブロモベ
ンズアルデヒド、ニトロベンズアルデヒド、クロロニト
ロベンズアルデヒド、ヒドロキシニトロベンズアルデヒ
ド、メトキシベンズアルデヒド、フロロメトキシベンズ
アルデヒド、トルアルデヒド、トリフロロトルアルデヒ
ド、フエニルアセトアルデヒド等、 複素環式アルデヒドとして、２−チオフエンアルデヒ
ド、ブロモ−２−チオフエンアルデヒド、４−フオルミ
ルイミダゾール、４−メチル−５−フオルミルイミダゾ
ール等を用いることが出来る。

本発明に用いるグリシンは通常の方法で製造したもの
でよく、その製法は問わない。

本発明で用いるＤ−スレオニンアルドラーゼはＤ−ス
レオニンに作用してグリシンとアセトアルデヒドとに分
解する酵素であり、例えば、アルカリゲネス・ハエカリ
ス（Alcaligenes faecalis）（IFO12669）、シユードモ
ナス（Pseudomonas）DK−２（微工研磨寄6200号）、ア
リスロバクター（Arthrobacter）（DK−19微工研磨寄62
01号）、及びキサントモナス・オリザエ（Xanthomonaso
ryzae）（IAM1657）等がこのＤ−スレオニンアルドラー
ゼを生産する能力を有する。

本発明に用いる微生物は常法に従つて培養することが
出来る。培養に用いられる培地は微生物の生育に必要な
炭素源、窒素源、無機物質等を含む通常の培地である。
更に、ビタミン、アミノ酸等の有機微量栄養素を添加す
ると望ましい結果が得られる場合が多い。培養は、好気
的条件下でpH4から10、温度20から60℃の任意の範囲に
制御して１〜10日間培養を行なえばよい。

酵素反応にあたつては、微生物の培養液から分離した
培養菌体、乾燥菌体、菌体破砕液等のほか、無機塩や有
機溶媒等で分画した粗精製酵素、単離された酵素、さら
には、菌体、菌体処理物、あるいは、酵素自体の固定化
物、その他何れも使用できる。

酵素反応を実施する方法は、水性媒体中にてグリシン
とアルデヒド化合物を上記した微生物の培養液、菌体、
菌体処理物、酵素、あるいはこれらを通常の方法で固定
化したものと接触させれば良い。かかる反応時の水性媒
体としては、例えば、水、緩衝液、及び、含水有機溶媒
等が使用出来る。

反応液のアルデヒド化合物の濃度は酵素を著しく阻
害、失活させない程度であれば良く、0.05から2.0M/Lが
好ましい。一方の基質であるグリシンは、アルデヒド化
合物と等モル程度でよい。かかるグリシン、およびアル
デヒド化合物の添加は反応の任意の段階で可能であり、
一括、連続、分割のいずれの手段でも実施できる。

反応温度は、10から70℃が良く、10から40℃がより好
適である。反応時のpHは５から10、好ましくは5.5から
7.0である。補酵素として、ピリドキサール５′リン酸
を反応系に添加すると酵素活性を高めて反応を促進させ
ることが出来る。

また、反応系に２−メルカプトエタノールや亜硫酸水
素ナトリウムなどを添加することにより反応収率を高め
ることが出来る場合がある。

反応形式はバツチ方式、連続方式のいずれでも良い。
かくして、反応は0.5から50時間程度で終了する。

このようにして得られたＤ−β−ヒドロキシアミノ酸
を酵素液から採取するには、通常の方法、例えば遠心分
離や限外ろ過等で除菌・除タンパクし、活性炭やイオン
交換樹脂等で分離・精製するなどの方法により行なうこ
とが出来る。

〔実施例〕

例中％は重量％を示す。

酵素製造例１ ポリペプトン0.5％、酵母エキス0.5％、KH₂PO₄0.1％
から成るpH7.5の培地を調製し、５の培養槽にその３
を添加し、120℃で15分間加熱殺菌した。その培地に
アリスロバクター（Arthrobacter）（DK−19微工研菌寄
6201号）を接種し、pH7.5に保ちながら30℃で20時間通
気及び、攪はんをしつつ培養した。

培養終了後、培養液から菌体を遠心分離で集菌、水洗
後、0.01mMピリドキサール−５′−リン酸、及び1.0mM
塩化マンガンを含むpH7.5の0.01Mトリス−塩酸緩衝液10
0mlに懸濁し、この懸濁液を20KHz,3分間の超音波破砕処
理を４回行い、破砕枠の懸濁物質を遠心分離で除去して
粗製酵素液を調製した。

次に、この粗製酵素液に冷アセトンを攪はんしながら
徐々に添加し、アセトン濃度45から65％画分の析出物を
分取し、上記緩衝液10mlに溶解してアセトン分画酵素液
を調製した。

酵素製造例２ シユードモナス（Pseudomonas）DK−２（微工研菌寄6
200号）、アルカリゲネス・ハエカリス（Alcaligenes f
aecalis）（IFO12699）、及びキサントモナス・オリザ
エ（Xanthomonas oryzae）（IAM1657）を酵素製造例１
と同様の方法で菌体、及びアセトン分画酵素液を調製し
た。

実施例１ 酵素製造例１で得たアリスロバクター（Arthrobacte
r）DK−19（微工研菌寄6201号）の酵素液10mlにグリシ
ンを2.0mモル、アルデヒド化合物2.0mモル、２−メルカ
プトエタノール2.0mモル、ピリドキサール−５′−リン
酸2.0μモル、塩化マンガン（２価）20μモル、及びpH
6.8の0.5M−HEPES緩衝液（Dctite Good's緩衝液）10ml
より成る基質溶液を加え30℃で20時間反応させた。

反応終了後、薄層クロマトグラフイーで生成β−ヒド
ロキシアミノ酸を分離・定量した。薄層クロマトグラフ
イーは、１−プロパノールと25％アンモニア水の比が2:
1の混合液を展開溶媒としてシリカゲル薄層上でクロマ
トグラフイーを行い、ニンヒドリンで発色させ、デンシ
トメーター（CS−910、島津製作所）で定量した。これ
らの分析結果を第１表に示す。

生成β−ヒドロキシアミノ酸の同定は、反応液を限外
ろ過し、イオン交換樹脂カラムで精製後、上記した条件
の薄層クロマトグラフイーで展開し、生成物を抽出、真
空乾燥してC¹³−NMR、及びH¹−NMR分析により行なつ
た。

また、生成β−ヒドロキシアミノ酸の光学純度はＮ−
カルボキシアラニン無水物（NCA）と反応させジアステ
レオマーに変換した後、CDSカラムを用いる液体クロマ
トグラフイーによる分析、光学分割カラム（キラルパツ
ク、ダイセル社製）を用いる液体クロマトグラフイーに
よる分析、及びシフト試薬を用いたNMR分析により測定
した。上記の方法で生成β−ヒドロキシアミノ酸を分析
したところ全てＤ−体であつた。

実施例２ 酵素製造例２で得たシユードモナス（Pseudomonas）D
K−２（微工研菌寄6200号）、アルカリゲネス・ハエカ
リス（Alcaligenes faecalis）（IFO12669）、及びキサ
ントモナス・オリザエ（Xanthomonas oryzae）（IAM165
7）の酵素液を用い、グリシンとベンズアルデヒドを基
質とし、実施例１と同様の方法で酵素反応を行い、生成
物を分離・定量した。これらの分析結果を第２表に示
す。尚、生成フエニルセリンは全てＤ−体であつた。

実施例３ 酵素製造例１で得たアリスロバクター（Arthrobacte
r）DK−19（微工研菌寄6201号）の酵素液100mlにグリシ
ン3.0g、２−メルカプトエタノール3.0ml、塩化マンガ
ン0.1mモル及びｏ−フロロベンズアルデヒド0.5mlを30
分毎に10回添加（合計5.0ml）して、攪はん下で30℃
で、20時間反応を行なつた。反応中は密閉状態を保ち、
0.2N−NaOHで反応pHを6.5に保つた。

反応終了後、濃塩酸で反応液のpHを2.0に低下させ、
遠心分離で不溶物を除去した後、分画分子量５万の限下
ろ過膜で懸濁物質と高分子量物質を除去した。次に、こ
の反応液を50mlの活性炭カラム（ツルミコールGL−30）
に通液して生成物を吸着させ、脱イオン水で十分に洗浄
した後、酢酸20重量％、フエノール5.0％の混合水溶液
で吸着物質を溶出させ、ｏ−フロロフエニルセリンの溶
出部分を採取した。

次に、このｏ−フロロフエニルセリンの溶出部分を脱
イオン水1.0に希釈し、H⁺型にしたDowex50Wx8（50か
ら100メツシユ、ダウケミカル社製）を充填した100mlの
カラムに通液し、脱イオン水で洗浄後、0.5Mのアンモニ
ア水で吸着物質を溶出させ、ｏ−フロロフエニルセリン
の溶出部分を採取した。

次に、１−プロパノールと25％アンモニア水の比が2:
1の混合液を展開溶媒としてシリカゲル薄層上でクロマ
トグラフイーを行い、生成物を抽出後、エタノールで結
晶化して0.1gの結晶を得た。この結晶はIR,NMR、及び元
素分析からｏ−フロロフエニルセリンであることを確認
した。また、実施例１と同様の方法で光学純度を測定し
たところ全てＤ−体であつた。

〔発明の効果〕

本発明の方法によれば、大量に生産されているグリシ
ンとアルデヒド化合物から一挙に対応するＤ−β−ヒド
ロキシアミノ酸を製造しうるので、工業的なＤ−β−ヒ
ドロキシアミノ酸の製造法として極めて優れている。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:64） (56)参考文献 特開 昭50−63192（ＪＰ，Ａ) 特開 昭49−117684（ＪＰ，Ａ) 特開 昭58−116690（ＪＰ，Ａ)

Claims (1)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】グリシンと、脂環式アルデヒド、芳香族ア
   ルデヒド又は複素環式アルデヒドをＤ−スレオニンアル
   ドラーゼの存在下、反応させることを特徴とするＤ−β
   −ヒドロキシアミノ酸の製造法。