JP2527995B2 - 生物学的活性を示す薬剤 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 この出願は、フレッド・Ｉ・チャサロー及びＨ・レオ
ン・ブラッドローの、1986年12月９日に出願された米国
特許願連続番号939,552号の部分的継続出願である。

この発明は、ヒトの女性の胸嚢液（breast cyst flui
d）から単離された新規な生物学的活性を示す薬剤に向
けられる。この新しい薬剤は、哺乳動物の高血圧の処置
に有用であり、哺乳動物の心房細動、特発性浮腫及びう
っ血性心不全の処置にも使用することができる。

発明の背景 本発明は、哺乳動物の高血圧、うっ血性心不全、心房
細動及び特発性浮腫の処置に有用な新規な生物学的活性
の薬剤に関する。

うっ血性心不全は、心室の収縮の間の心臓からの不完
全な血液の返流とそれによる心臓の拡張とによって特徴
付けられる。医薬（強心配糖体）による処置を受ける
と、心泊数が減少し、心室がより完全に充満され、心臓
の大きさが減少し、通常値に移行し始める。

心房細動は、心房が心室よりも一層頻繁に収縮して下
心室がパルス状の衝撃を受ける状態である。心室は、微
弱で無効な収縮によって応答する。心房細動の処置のた
めに用いられる医薬（強心配糖体）は、この状態を抑圧
し、心室の収縮速度を遅くし、同期された有効な心搏の
再設定を助ける。

ジギタリス、ジゴキシン、ウアバイン及び関連したス
テロイド系多糖体は、心臓の収縮力を高める心毒性薬剤
として知られる化合物の一部属である。心毒性薬剤の一
部属である強心配糖体（例えば、ジギタリス、ジゴキシ
ン及びウアバイン）は、不飽和ラクトン環がC17におい
て結合した塩基性シクロペンタノペルヒドロフェナント
レン核によって特徴付けられる。アグリコンと呼ばれる
この構造体は１〜４個の糖分子と結合している。薬理学
的作用は、アグリコンに存するが、糖部分は、溶解化性
と結果多糖体の薬効とに影響する。

強心配糖体の最も重要な治療上の用途は、うっ血性心
不全及び心房細動の処置に存する。うっ血性心不全を処
置するためにジギタリスを使用した場合に得られる有用
な効果は、この医薬の変力作用（筋肉の収縮性の変更）
の効果に帰着される。医薬の投与に起因する、より大き
な収縮力は、心臓からの血液の放出量を増大させ、心臓
からの流出量を増大させ、大循環を改善する。

ジゴキシンとその類縁物との１つの欠陥は、その治療
インデックスが低いことである。これらの医薬がうっ血
性心不全及び心房細動の処置について有効となる濃度の
窓は狭い。また、ジゴキシン及び類縁の強心配糖体によ
る治療の結果として、多くの有害な副作用を生ずる。そ
れについては、T.W.スミス等のprog.Cardiovas.Dis.26;
21−56,1984に詳細に報告されている。ジゴキシンによ
る治療の副作用には、インポテンツ、ひ弱さ及びうつ病
が含まれる。別の欠点は、或る患者がジゴキシンによる
処理に全く反応しないことである。またジゴキシン及び
ジギタリスは、以前にうっ血性心不全にかかったことの
ある患者の血圧を下げるのに有効なだけで、通常の高血
圧の患者には無効である。ウアバインは速効性で、半減
期が21時間であり、腎臓によってすみやかに排泄され
る。そのため、これらの医薬の用途は、緊急の処置に限
られている。

高血圧は、普通の状態であり、２次的な器管の損傷と
寿命の短縮とを惹起しうる心房圧の増大によって特徴付
けられる。この状態は、現在では、４つの一般的な部属
の医薬、即ち、利尿薬、交感神経遮断薬、血管拡拡張薬
及び血管圧力遮断薬（angiotension blockers）（Harri
son′s Principles of Internal Madicine,K.J.イッセ
ル・バッヒャー等、eds.1172〜1176、マグローヒル、ニ
ューヨーク、1980）によって治療されている。これらの
医薬は、どれも副作用を示し、その用途は限られてい
る。（うっ血性心不全の処置に用いられる）強心配糖体
は、高血圧の処置用としては基本的に無効である。

特発性浮腫は、浮腫又は水の保持の周期的なエピソー
ドによって特徴付けられる。現在利用可能な処置は、非
特異性であり、利尿剤又はβ−交感神経抑制薬例えばプ
ロプラノロールの投与、就寝並びに食事中の塩分の制限
を含む。

予期に反して、ヒトの胸嚢液から、新しい活性の生物
学的薬剤が誘導された。特に形式１のヒトの女性の胸嚢
液は、哺乳動物にその血圧を下げるために投与可能な、
生物学的に活性の薬剤を含有することが見出された。こ
の新しい生物学的薬剤は、周知の強心配糖体であるジゴ
キシンに対する抗体と交さ反応する。また、驚くべきこ
とに、この新規な生物学的に活性の薬剤は、ジゴキシン
又はその類縁の強心配糖体と相違して、Na⁺K⁺ATPアーゼ
酵素の活動を刺激することも見出された。この酵素の作
用は、観察された血圧降下作用を説明する利尿作用を供
与する。

本発明の主な目的は、新しい生物学的に活性の薬剤を
提供することにある。

本発明の別の目的は、哺乳動物の血圧を降下させる作
用を示すと共に、哺乳動物のうっ血性心不全、心房細動
並びに特発性浮腫の処置にも使用可能な、ヒトの女性の
胸嚢から誘導された新規な生物学的に活性の剤を提供す
ることにある。

本発明の更に別の目的は、ヒトの女性の胸嚢液から誘
導された、薬理学的に受容可能な塩及び／又は担体を含
む、哺乳動物の高血圧症を処置するための新規な製剤を
提供することにある。

本発明のこれらの目的並びに他の目的は、以下の説
明、添付された請求の範囲並びに添付された図面から、
当業者にとって自明であろう。

図面の簡単な説明 第１図は、本発明の生物学的に活性な薬剤のセファソ
ルブHPカラムからの溶離プロフィルを示す線図である。

第２図は、アセトニトリル：水（7:3）溶離剤を使用
した本発明の生物学的に活性の薬剤のセファデックスLH
−20カラムからの溶離プロフィルを示す線図である。

第３図は、メタノールを溶離剤として使用した第２の
セファデックスLH−20カラムからの本発明の生物学的に
活性な薬剤の溶離プロフィルを示す線図である。

第４図は、ヒトの索血清（cord serum）中に存在する
交さ反応物質のセファソルブHPカラムからの溶離プロフ
ィルを示す線図である。

第５図は、イソ−オクタン：メタノール：酢酸エチル
（4:1:1）を溶離剤として用いた、グルサラーゼによる
消化後の本発明による生物学的に活性な薬剤のセファデ
ックスLH−20カラムからの溶離プロフィルである。

第６図は、メタノールを溶離剤として使用して抽出し
た本発明による生物学的に活性な薬剤のセファデックス
LH−20からの溶離プロフィルを示す線図である。

第７図は、アストニトリル：水の或る勾配を用いて溶
離したアミノ炭水化物高圧液クロマトグラフィ（HPLC）
からの本発明による生物学的に活性の剤の溶離プロフィ
ルを示す線図である。

第８図は、210nMにおいて吸光を示すアクリルニトリ
ル：水の或る勾配を用いて溶離した第２のアミノ炭水化
物HPLCカラムからの本発明による生物学的に活性な剤の
溶離プロフィルを示す線図である。

発明の概要 本発明は、ヒトの女性の胸嚢液から単離された生物学
的に活性の薬剤に関する。この新しい薬剤は、ジゴキシ
ンに対する抗体と免疫反応し、哺乳動物に投与された時
に抗高血圧活性を示し、哺乳動物のうっ血性心不全、心
房細動並びに特発性浮腫の処置にも使用することができ
る。

本発明は、タイプ１のヒトの女性の胸嚢液から単離さ
れた活性の生物学的ファクターを精製する方法も提供す
る。この精製方法は、ヒトの女性の粗胸嚢液を低級アル
コールと混合した後、減少する極性の溶剤で反復抽出す
ることを含む。抽出されたファクターは次に順次のカラ
ムクロマトグラフィにかけられる。

発明の詳細な説明 本発明の新規な生物学的に活性な薬剤は、ヒトの女性
の胸嚢液から単離される。

全体的（gross）な嚢の疾病をもったヒトの女性の胸
の嚢から導出された液が広汎なスペクトラムの生物学的
分子を含有することが最近示された。ヒトの女性の胸嚢
液は、電解質の組成に基づいて、次の２つの形式に分け
られる。タイプ１の液の特徴は、高レベルのカリウムと
低レベルのナトリウム及び塩化物のイオンを含むことで
あり、タイプ２の液の特徴は、低レベルのカリウムと高
レベルのナトリウム及び塩化物のイオンを含むことであ
る。

本発明の生物学的に活性の薬剤を得るには、胸の全体
的な嚢の疾病をもったヒトの女性から、針で吸引するこ
とによって、嚢液を単離する。単離された液は、イオン
組成について分析されるまで−20℃で凍結される。次に
液を融解させ、当該技術において周知の標準的な技術を
用いて、イオン選択電極によって、イオン組成（即ち、
ナトリウム、塩化物及びカリウムの濃度）を測定する。
カリウム及び塩化物の濃度が100meg/Lよりも高くナトリ
ウムの濃度が50meg/Lよりも低いことによって規定され
るタイプ１の液をプールし、使用時まで−20℃において
貯蔵する。

単離及びイオン組成の測定の後に、有機溶剤を用い
て、本発明による生物学的に活性な薬剤を精製する。最
初に強嚢液を、低級アルコール、好ましくはメタノール
の添加によって分別する。エタノール、イソプロパノー
ル又はｔ−ブタノールを用いてもよい。生物学的に活性
な薬剤を含有するアルコール上澄みを、減少する極性の
有機溶剤を順次添加することによって更に分別する。溶
剤の好ましい順序は、アルリルニトリルとアセトニトリ
ル：酢酸エチル（1:1）である。多くの種類のイオン極
性有機溶剤を抽出工程に使用することができる。即ち、
酢酸メチル、酢酸プロピル、トルエン及びベンゼンは、
抽出剤として使用可能な溶剤の限定的でない例である。
生物学的に活性の薬剤は、この時点で使用のために貯蔵
してもよいが、好ましくは、圧力安定化されたポリデキ
ストラン例えばセファソルブHP（ニュージャージー州，
ピスカタウェイ，ファーマシア社製）を用いて、また更
にセファデックスLH−20（ニュージャージー州，ピスカ
タウェイ，ファーマシア社製）上において溶離剤として
メタノールを用いて、クロマトグラフィによって更に精
製してもよい。

特に好ましい精製形態は、タイプ１のヒトの女性の胸
嚢液をメタノールと共に撹拌することによって、液中の
不所望の成分を沈澱させ、沈澱物を廃棄することによっ
て行なう。上澄みは次にアセトニトニルで処理する。こ
れにより別の不所望の成分が沈澱する。沈澱物を廃棄し
た後、普通の回転蒸発器を用いて、メタノール及びアセ
トニトリルを蒸発させ、本発明の薬剤を含有した第１水
性相を回収する。第１水性相を、1:1アクリロニトリル
／酢酸エチル溶液にて更に抽出し、活性の薬剤を含有し
た有機相を取得する。アセトニトリルと酢酸エチルとを
有機相から除去し、薬剤を含有した第２水性相を取得す
る。次に第２水性相を凍結乾燥し、凍結乾燥物をメタノ
ール：水（1:1）にて抽出する。次に抽出物を圧力安定
化されたポリデキストランカラム上においてクロマトグ
ラフィ処理し、生物学的に活性の薬剤を含有した画分回
収する。活性の薬剤を含有した画分は、抗体との免疫活
性についてのアツセイによって、後述するように、ジオ
キシンと同定される。本発明による生物学的に活性の薬
剤は、これらの抗体との免疫活性を示すことが見出され
た。次に、薬剤を含有した画分から、メタノール−水を
除去する。

本発明による活性の薬剤は、この時点で投与してもよ
いが、好ましくは、ひと先ずセファデックスLH−20カラ
ムを用いたクロマトグラフィによって更に精製する。特
に好ましい形態は、セファソルブHPとセファデックスLH
−20の各々のカラムを使用した交互の順次のクロマトグ
ラフィを含む形態であろう。この順序は、アクリロニト
リル：水（7:3）を溶離剤として使用した、セファソル
ブHP及びセファデックスLH−20と、メタノールを溶離剤
として使用した、セファソルブHP及びセファデックスHL
−20であろう。

別の方法として、本発明による生物学的に活性な薬剤
は、次のより有用な手順の使用によって、タイプ１のヒ
トの女性の胸嚢液から抽出し精製することができる。イ
オン組成を定めた後、前述したように、減少するイオン
極性の有機溶剤を２回順次添加することによって、タイ
プ１のヒトの女性の胸嚢液を直接に分別する。しかしこ
の手順は、前述した低級アルコール抽出の使用を排除す
る。このように分別された薬剤は、次の疎水性アフィニ
ティクロマトグラフィ（例えば、セファデックスLH−2
0）とアミノ炭水化物カラムとを使用した順次のクロマ
トグラフィにかけられる。この流線形の抽出−精製手順
は、下記の例５に示されている。

前述した分別及びクロマトグラフィ精製手順を使用す
ることの利点は便利さ、高速（全部の精製は、１〜２日
間で終了させうる）、簡単さ（３又は４カラム工程の代
りに、わずか２カラム工程で済む）並びに、最終生成物
の高純度である。この高純度は画分をクロマトグラフィ
再分析にかけた場合に、210nmにおいて光を吸収する物
質のピークが只１つしか検出されなかった（第８図）こ
とによって立証される。210nmにおいての吸光能力は、
後述するようにジゴキシン抗体に結合する能力に加え
て、本発明による活性の薬剤の別の特徴を形成する。

本発明による活性の薬剤は、抗体と交さ反応してジゴ
キシンを形成する能力によって検出される。これらの抗
体は、マサチューセッツ州，ボストン，ニュー・イング
ランド，ニュークレア社から市販されている（cat,no.A
082）。別の方法として、マサチューセッツ州ケンブリ
ッジ、クリニカル・アッセイ社から入手されるジゴキシ
ンに対する抗体も、本発明による生物学的に活性の薬剤
の存在をアッセイするために使用することができる。

本発明の活性な生物学的な薬剤に対するアッセイは、
放射能ラベルされたジゴキシンと抗体の測定された量と
を未知溶液に添加することによって行なう。抗体が結合
するための十分な時間放置した後、結合した物質と結合
してない物質とを遠心分離によって分離する。未知溶液
中の薬剤の存在は、シンチレーシヨンカウンターを用い
て、結合したフラクション（画分）中において検出す
る。本発明による生物学的に活性の薬剤の量は、ngジゴ
キシン等量として表現される。1ngジゴキシン等量は、
標準ジゴキシン1ngについて得られる応答を得るために
このアッセイにおいて必要とする生物学的に活性の剤の
量を表わしている。このアッセイの詳細な説明は、以下
に例について行なう。

本発明による生物学的に活性な薬剤は、それが共役ス
テロイドであることを示唆する性質（例えばクロマトグ
ラフィ挙動及び消化生成物）を表現する。

タイプ１の胸嚢液から導出された生物学的に活性な薬
剤を、哺乳動物に投与したところ、顕著な血圧降下作用
が示された。本発明による活性の生物学的薬剤を投与し
たところ、最初の（投与前の）血圧レベルに比較して、
約45％までの、健康な哺乳動物の血圧の降下が得られ
た。

本発明による精製された生物学的に活性の薬剤は、ユ
ニークな予期しなかった性状を表現する。この薬剤は、
Na⁺K⁺−ATPアーゼ酵素を刺激するのに対し、強心配糖体
であるジゴキシンとジギタリスとは、この酵素活性を禁
止する。

Na⁺K⁺−ATPアーゼ酵素は、温和な利尿作用を示し、こ
れは、血圧降下活性について、患者にとって有意義であ
りうる。従ってタイプ１のヒトの女性の胸嚢液から単離
された活性の薬剤は、特発性浮腫のようにナトリウムの
バランスがくずれている状態の処置のために、哺乳動物
に投与することができる。

また、本発明による生物学的に活性な薬剤は、（例６
において後に示される）その細胞リセプターへのウアバ
インの結合を刺激することが見出されている。これは、
Na⁺K⁺−ATPアーゼ系に対する生物学的に活性の薬剤の最
も予期されない効果である。本発明の生物学的に活性の
薬剤は、 Na⁺K⁺−ATPアーゼの活性を刺激するので、ウアバインの
そのレセプターへの結合を禁止するであろうということ
は期待されていた。しかし、予期に反して、本発明の生
物学的に活性の薬剤は、そのレセプターへのウアバイン
の結合量を増大させる。本発明者らの知りえたところで
は、この性状を示す他の物質は存在しない。

タイプ１のヒトの女性の胸嚢液から単離された薬剤
は、内生的な低血圧ファクターである。この形式の物質
は、これらの性状のため、ジギタリス、ジゴキシン又は
ウアバインが現用されている疾病の処置だけでなく、一
般的な抗高血圧剤としても有用であることが期待され
る。また、本発明による薬剤は、ウアバインと併用され
た場合、ウアバインの効力に従ってその用途を増大させ
ることも期待される。

高血圧症の哺乳動物を生物学的に活性の薬剤によって
処置する場合の本発明による化合物の有効用量は、症状
の度合、処置される各々の哺乳動物の段階及び個々の特
性に依存する。哺乳動物の高血圧症、うっ血性心不全又
は心房細動を処置するためには、１日当たり、体重1kg
について、約10ngジゴキシン当量から約1000ngジゴキシ
ン当量の用量範囲で組成物を一般に投与することが期待
される。特発性浮腫及びナトリウムのアンバランスによ
って特徴付けられる他の疾病の処置にも、同様の用量及
び養生法が使用されよう。

本発明による新規な薬剤は、非経口的に投与してもよ
く、これが好ましいが、経口的に、鼻骨間に、又は、周
知の方法によって作成した医薬組成物においての皮膚間
パッチによって、それぞれ投与してもよい。経口的な用
量形態の例には、等張食塩水、５％グルコース又は他の
周知の薬理学的に認容される液中の活性の薬剤の水溶液
が含まれる。医薬組成物は、経口投与に適するように調
合することができる。活性の成分は（液の形で）カプセ
ル中に、又は錠剤中に含有させる。全用量は１個以上の
カプセル又は錠剤又はその両方の投与によって達せられ
るので、各々のカプセル又は錠剤によって投与される有
効な用量は、それほど重要ではない。使用されたカプセ
ルは、ゼラチン、セルロース誘導体のような周知の薬理
学的に認容される物質を含有していてもよい。各々のカ
プセルは、例えばポリエチレングリコールUSP、エチレ
ングリコールUSP、エチルアルコールUSP、精製水USP及
びその混合物を含む適切な溶剤中に溶解させた適切な量
の生物学的に活性の薬剤を含有している。錠剤は、当業
界において周知の固体の担体、滑沢剤その他を用いて、
慣用の手順に従って調製することができる。固体の担体
の例には、澱粉、砂糖、ベントナイト及び他の普通に用
いられる担体が含まれる。本発明の生物学的な薬剤は、
例えばラクトース又はマニトールを結合剤として、また
普通の充填剤及び錠剤形成剤を含有するカプセル又は、
かたい外殻の錠剤の形状に乾燥し投与してもよい。

以下に本発明を限定的にでなく説明するための特定的
な例について説明する。内生的な生物学的に活性の薬剤
の抽出、精製、特徴付け及び利用のための方法も、これ
らの例において示される。

例 １ ヒトの女性の胸嚢液からの生物学的に活性の薬
剤の単離 工程１ 抽 出 全体的な胸部の嚢疾患をもった婦人から針バイオプシ
ーによって得た、タイプ１のヒトの女性の胸嚢液250ml
に、メタノール250mlを添加した。混合物を16000xgで遠
心分離して変性蛋白質及び他の不溶性の成分を除去し
た。沈澱物は廃棄した。残留不澄み液は、同量（1500m
l）のアクリロニトリルと混合し、室温に10分間放置し
た後、遠心分離し、変性した物質及び不溶性の成分を除
去した。沈澱物は廃棄した。アクリロニトリル及びメタ
ノールは、40℃の水浴中において、回転蒸発器（ニュー
ジャージー州，フォートリー，ビュヒラー社）を用いて
真空中にて除去した、水性相（200ml）は、アセトニト
リル200mlと酢酸エチル200mlとの混合物を用いて再抽出
した。下部の水性層は廃棄し、有機相は真空中におい
て、前記のように除去した。残留した水（63ml）は、凍
結乾燥によって抽出物から除去した。固形物はメタノー
ル：水（1:1）10mlにて抽出し、不溶性物質は、前記の
ように遠心分離によって除去した。

最終抽出物は、血清ガラスびんに入れ、メタノール−
水溶剤、室温において、窒素ガス流下に除去した。最終
生成物K3は、最初のプールされたサンプル中の7.2ngジ
ゴキシン当量と等価の生物学的に活性な薬剤の1800ngジ
ゴキシン当量を含有していた。

工程２ セファソルブHP上のクロマトグラフィ 工程１からの最終的な抽出物は、SR−25カラム（幅2.
5cm、高さ30cm）を用いて、セファソルブHP（ニュージ
ャージー州ピスカタウェイ，ファーマシア社）上におい
てクロマトグラフ処理した。カラムに適用された溶剤混
合物は、メタノール：水（1:1）であった。カラムは、W
IZモデルＰポンプ（NB,リンカーン,ISCO社）によって、
上向き流モード（200ml/時）中において溶離した。各々
4mlの60画分を集収した。２個の４方向弁（SRV−4,NJ,
ピスカタウェイ，ファーマシア社）によって発生させた
1.8mlサンプルのループを介してサンプルを適用した。
この方法においては、非特異性の結合をさけるために、
溶剤流と接触した全ての材料は、ステンレス鋼、テフロ
ン又は硼珪酸ガラスであった。前記の工程１において調
製した最終的な抽出物は全量が9mlであり、５つの部分
に分けてクロマトグラフィ処理した。クロマトグラフィ
画分の整数分の１量ずつを、抗体とトレーサーとを0.5m
l宛使用する代りに0.2ml宛使用したことを除いては、メ
ーカーの指針に従って、下記例２に示すように、ニュー
イングランドニュークレア社（ボストン,MA）から取得
した試薬を用いてジゴキシン免疫反応性についてアッセ
イした。これは、アッセイの感度を高めるために行なっ
た。結果を第１図に示す。このカラムを用いて、４個の
活動のピークが解像された。これは、ジゴキシン抗体と
交さ反応するが低血圧作用は示さないヒトの索血清から
単離された物質の挙動を示す第４図と比較すべきであ
る。本発明の生物学的に活性の薬剤のピークが同じ条件
の下にセファソルブHPカラムを用いて検出されたクロマ
トグラムの領域では、索血清から単離された活性はほと
んど見られなかった。

免疫活性ピークに対応する画分（K3A,K3B,K3C及びK3
D）は、プールし、溶剤は真空下において除去し、水は
凍結乾燥によって除去した。

工程３ アクリロニトリル：水（7:3）の溶離型による
セファデックスLH−20上においてのK3Bのクロマトグラ
フィ 工程３から取得されたK3Bピーク（画分23〜26）は、
アクリロニトリル：水（7:3）から成る溶剤混合物を用
いて、セファデックスLH−20上においてクロマトグラフ
処理した。カラム（幅1.9cm×高さ3cm）は、重力によっ
て溶離し、各2.7mlの40画分を集収した。サンプル（5m
l）をカラムの床に直接に適用した。次に、活性のフラ
クションが溶離されるまで追加の溶剤を適用した。前述
したアッセイを使用して、各々の画分において、生物学
的に活性の薬剤の量を定めた。結果を第２図に示す。こ
の薬剤は、画分16〜22において見出された。画分16〜22
は、プールし、凍結乾燥によって乾燥させ、セファソル
ブHP上において再クロマトグラフ処理した。ピーク活性
は、画分22〜26において見出され、この物質の挙動の再
現可能性が証明された（以前はこのカラム上の薬剤のピ
ークは、画分23〜26にあった）。

工程４ メタノール溶離剤を用いたセファデックスLH−
20上のクロマトグラフィ 溶離工程のためにメタノールを使用したことを除いて
は工程３に用いたと同一のプロトコールを用いて、第２
セファソリブHPカラムから単離した画分22〜26のクロマ
トグラフ処理を行なった。結果を第３図に示し、ここに
薬剤は、フラクション19〜22において溶離した。各々の
ピークは、別々にプールし、凍結乾燥によって乾燥させ
た。各々の画分は、水2ml中に再溶解させ、貯蔵のため
に凍結乾燥によって乾燥させた。

例 ２ ジゴキシン免疫反応性を定めるためのアッセイ 本発明の生物学的に活性の薬剤の存在を、ジゴキシン
抗体と反応する能力によって検出する。典型的なアッセ
イは次のように行なった。既知量のジゴキシンを含有す
る標準溶液を、メーカーによって供与された標準試料を
希釈することによって作成した（MA.ボストン，ニュー
イングランド・ニュークレア社,cat.no.A082）12×75mm
硼珪酸培養管（フィッシャー・サイエンティフィック
社）に、0.05,0.1,0.2,0.5,1.0及び2.0ng/mlのジゴキシ
ンを含有する標準溶液0.1mlを添加し、後述するように
アッセイを行なうことによって、標準曲線を作成した。

未知試料を、12×75mm培養管にピペットで注入し、窒
素気流下に蒸発乾固させた。［¹²⁵I］−ラベルされたジ
ゴキシントレーサー0.2ml及びジゴキシン抗体0.2mlを各
々の管に添加した。各管は、渦流によって混合し、室温
で30分間培養した。その後に各管を４℃で30分間2600xg
にて遠心分離し、フォームデカンティングラック（CA.
ロスアンゼルス、ダイアグノステイックス・プロダクツ
社製）に移し、デカンテーションした。各々の管をブロ
ットし、ガンマカウンター（MD,ゲイサーズバーグ,LKB,
1275ミニーガンマモデル）を用いて、［¹²⁵I］の量を定
めた。ジゴキシンの個別の値は、LKBからのスムースラ
インベストフイットプログラムを同時に使用して得た標
準曲線に対する間挿法によって定め、前述したようにng
ジゴキシン当量として表わした。

例 ３ 内生的な生物学的に活性の薬剤についてのアッ
セイ 270〜305gのスプラーグ−ドーリー系ラットを、全て
の実験に使用した。４匹のラットは、30〜40mg/kg体重
のペントバルビトールを１回腹腔内に注射することによ
って麻酔させた。ポリエチレンカテーテルを、右頚動
脈、左外頚静脈及び膀胱に挿入した。外科手順の終了後
に各ラットに、体重の0.5％に等しい量の0.15M NaCl溶
液のプライミングインジェクションを行なった。腎機能
をモニターするために、0.045ml/分において、0.15M Na
Clの浸剤を開始した。この浸剤は、２つの放射性同位元
素を１時間に５μCi及び10μCu与えるだけの量におい
て、¹⁴C−イヌリン及び³H−PAH（パラ−アミノ馬尿酸）
（MA,ボストン、ニュー・イングランド・ニュークレア
製）を含有していた。40〜50分の平衡期間の後に実験を
開始した。

トランスジューサ及び８チャンネルのフィシオグラフ
ィ（Ca.パロ・アルト，ベックマン社製）を用いて、動
脈内血圧を記録した。手動スフィグモマノメーターを使
用して、血圧トレーシングを較正した。当該技術におい
て周知の技法によって、ヘマトクリット値を測定した。
ベータシンチレーションカウンター（MD,ゲイサースバ
ーグ，ラックベータ、LKBインスツルメンツ製）を使用
して、¹⁴C−イヌリン及び³H−PAHの血漿及び尿道の活動
を測定した。火炎フォトメーター（CA、パロ・アルト、
クリナフレーム、ベックマン・インスツルメンツ社製）
を用いて、血漿電解質を測定した。標準式を用いて、糸
球体濾過値（GFR）及び腎血流をそれぞれ¹⁴C−イヌリン
及び³H−PAHのクリアランスとから計算した。

最初の研究において、タイプ１の高カリウム含量のヒ
トの女性の胸嚢液（前記のK3）から得た25倍濃度の１％
量（17ngジゴキシン当量）を、0.15M NaC lml中に溶解
させ、全量を静脈内注射した。第２回及び第３回の研究
において、タイプ１のヒトの女性の胸嚢液（K3）から得
た第２の１％量を、0.15M NaCl 2ml中に溶解させ、1ml
を投与した（8.5ngジゴキシン当量）。第４回の研究で
は、前記工程４から得た最初の胸嚢吸引物の濃度の100
倍になっている物質（画分19〜22、K3B）を、0.15M NaC
l 1ml中に溶解させ、0.2ml（13.5ジゴキシン当量）を注
射した。

研究の間連続的に血圧を記録した。30分毎に0.3ml容
量の血液試料を除去し、同量の塩水と交換した。第１回
の研究の間のみ適切な尿道ドレナージが成功のうちに保
たれた。その後の３回の実験では、技術上の問題のた
め、腎機能の測定はできなかった。

実験の結果を表１に示す。

１匹の動物が生物学的に活性の薬剤を受けた各々の研
究において、血圧の際立った減少が見られ、こ減少は、
実験１では非可逆的であり、その結果として実験動物は
死亡したが、実験２、３では部分的に可逆的であった。
実験３では血圧の降下は、15分以内において最大とな
り、その後、20〜40分の間に基線の血圧値に徐々に復元
した。ヘマクリット値は均等に降下したので最終的な決
定は、４回の実験対象においての初値のそれぞれ51,69,
57,58％であった。ヘマクリットの減少の理由は明らか
ではない。しかし、細胞数をカウントしたところ、実際
の細胞数は減少していなかった（ヘマクリットは細胞数
にではなく、容積に依存する）。

糸球体濾過値を定めることのできた唯一の動物である
動物１において、本発明の生物学的に活性の薬剤の注入
前の単一腎値は、0.18ml/分であった。この値は、本発
明の生物学的に活性の薬剤の投与後に完成した２回の尿
集収においては0.32及び0.24ml/分に増大した。動物が
最も精製された物質を受けた第４回の実験の終了時にお
いて測定した血漿のナトリウム濃度及びカリウム濃度
は、それぞれ141mmol/L及び5.4mmol/Lであり、これらの
値はいずれも正常値であった。

また、前記工程４からの最終的な抽出物として得た、
高度に精製された画分を、１匹の動物に投与した。表１
に示した研究のものと同一のプロトコールに従った。こ
のときのデータを次表２に示す。

この研究では、前記の工程４からの最も精製された画
分を使用した。この画分を投与した場合、精製度のより
低い試料において見られたように、血圧が急激に降下し
た。さらに、同一の動物に、160pgジゴキシン当量を表
わす活性の生物学的薬剤（５′，表２）の第２の用量を
与えた。この場合血圧は更に低下した。

この例の結果は、本発明の生物学的に活性の薬剤を哺
乳動物に投与することによって血圧レベルが急速に低下
することを示している。これらの実験から明らかなよう
に、本発明による生物学的に活性の薬剤は、抗高血圧剤
として（即ち低血圧剤として）十分によく機能する。

例 ４ グルサラーゼによる処置後の胸嚢液誘導薬剤の
挙動 スルファターゼとグルコロニターゼとの混合物を含有
する、かたつむりヘリックス・ポマチア抽出物（NY.カ
ーデンシティ、エンド・ラボラトリーズ）であるグルサ
ラーゼによって、（例１からの）試料K3Bの一部分を処
置した。処置前にはこれらの試料は、酢酸エチルによっ
て水から抽出できなかったが、酵素消化後は、酢酸エチ
ルは、水から薬剤を抽出した。従って、これらの試料は
スルフェート及び／又はグルコロン酸を含有するステロ
イド共役体の性状を備えている。

グルサラーゼー消化試料は、イソオクタン：メタノー
ル：酢酸エチル（4:1:1）を溶離剤として使用して試料
の溶離を行なったことを除いては、前述したようにし
て、セファソルブHP上において再クロマトグラフ処理
し、各々の画分の整数分の１量を前述したようにジゴキ
シンのラジオイムノアッセイによってアッセイした。こ
のデータを第５図に示す。グルサラーゼ消化後の早い時
期に溶離した薬剤は、未消化の物質に比べて溶離速度が
早かった（第１図との比較）。これは前述の抽出データ
と合致しており、本発明による生物学的に活性の薬剤が
ステロイド共役体であることを立証している。

これらの画分中に存在する（ジゴキシンイムノアッセ
イによって検出された）生物学的に活性の薬剤の量は、
加水分解によっては変更されなかった。これは、共役体
の性質もその存在又は不在もこのアッセイには影響しな
いことを示している。

以上に本発明をその好ましい実施例について説明した
が、当業者には明らかなように、以下に請求の範囲にお
いて示される本発明の範囲から逸脱することなく、多く
の付加、削除及び／又は変更を行なうことができる。

例 ５ 流線形の抽出及び精製手順 タイプ１のプールされた液を、同量のアセトニトリル
と混合し、不溶物を遠心分離によって除去した。抽出物
（上澄み）を等量の酢酸エチルと混合し、分離斗間に
おいて２相に分離した。下部の水性相は廃棄した。真空
下、室温で、普通の回転蒸発器（NJ,フォートリー，ビ
ュヒラー社製）によって、上部相から、揮発性の溶剤を
除去し、残りの液は凍結乾燥によって除去した。

凍結乾燥物をメタノール（５〜10ml）にて抽出し、同
一の溶剤中において調製したセファデックスLH−20（N
J,ピスカタウェイ，ファーマシア社）に適用した。5ml
の画分を集収し、その整数分の１量宛を蒸発乾固し、前
述したように、ジゴキシン等量についてアッセイした。
これは第６図に示されている。生物学的に活性の薬剤を
含有するフラクションをプールし、窒素ガス下に室温で
蒸発乾固した。

アミノ炭水化物カラム（IL,シカゴ，アルテック製）
を用いて、HPLCカラム（MD,ゲイサーズバーグ,LKB製）
によって、生物学的に活性の薬剤を更に精製した。95％
アセトニトリル、５％水に出発して、55％アセトニトリ
ル、45％水まで、20分の勾配によって、カラムを溶離し
た。別の方法として、同一のアセトニトリル：水濃度比
又はメタノール−水混合物を（勾配をもって、又は等力
的に）使用した等力的な（即ち、一定の濃度又は無勾配
の）溶離計画を使用してもよい。カラム画分（各々0.5m
l,1分間当り１画分）を、第７図に示すように集収し、
画分19,20は、生物学的に活性の薬剤を含有することが
見出された。これらの画分は、同一の吸収剤（マミノ炭
水化物）を用いて、HPLCカラム中に再注入した。第２ア
ミノ炭水化物カラムから回収した生物学的に活性の薬剤
の代表的なクロマトグラムは、第８図に図示されてい
る。画分22は、精製された生物学的に活性の薬剤を含有
していた。

例 ６ 生物学的に活性の薬剤によるウアバインレセプ
ターへのウアバインの結合の刺激 本発明者らは、期待に反して、本発明による生物学的
に活性の薬剤が細胞面上にあるウアバインレセプターへ
のウアバインの結合を刺激する能力をもつことを見出し
た。本発明による生物学的に活性の薬剤が細胞のNa⁺K⁺
−ATPアーゼ酵素を刺激することは、他方でウアバイン
がこの酵素を禁止することが知られているので、特に驚
くべき発見であった。

これは次のように立証された。牛の腎臓をウエアリン
グ混練機中において、0.25M庶糖（3:1 容量：重量）中
において均質化し、GSAローター（DE,ウイルミントン，
デュポン・ソルバル）を7000xg及び38000xgで使用し、S
A−600ローター（デラウェア州，ウイルミントン，デュ
ポン・ソルバル）を各30分間使用して、差動的な遠心分
離に付した。結果した微粒体の粗調製物を、緩衝液１
（緩衝液１＝100mM NaCl,50mMトリス/HCl,0.25mM Na₂ED
TA,5mM MgCl₂,pH＝7.4）中に再懸濁させ、ウアバインレ
セプターとして使用した。この緩衝液には、20％グリセ
ロールを（牛の新鮮な腎臓3g当り1mlの割合で）前もっ
て添加したものを使用した。ウアバインレセプターに結
合したウアバインは、0.5mM ATPを予め添加した緩衝液
１中において［³H］−ウアバイン（MA.ボストン，ニュ
ー・イングランド・ニュークレア製）を培養することに
よって測定した。窒素ガス気流下において室温で蒸発乾
固させ緩衝液１中に再溶解させた生物学的に活性の薬剤
の整数分の１量を次に添加した。生物学的に活性の薬剤
の使用量は、１つの管当り１〜50ピコグラムジオキシン
等量であった。牛の腎臓の微粒子の調製物50μｌを添加
し、次にこの混合物を、ラベルされたウアバイン（5nCi
［³H］−ウアバイン）の添加前に、そしてラベルされた
ウアバイントレーサーの添加後20分間37℃において培養
した。培養終了時に混合物を氷浴中において10分間深冷
した。ガラス繊維フィルター（NJ.スプリングフィール
ド、ワットマン、GFCフィルターズ製）を通る濾過によ
って結合ウアバインを無結合ウアバインから分離した。

前述した条件の下に、生物学的に活性の薬剤は、添加
された全量の初値９％から約20％までウアバインの結合
量を増大させた（これは2.2倍の増加である）。このデ
ータを次表３に示す。

表 ３ 添 加 総合CPM＊ ％ 結合蛋白質 761 9.3 結合蛋白質＋10ul（1.2pg） 1039 12.8 結合蛋白質＋15ul（1.8pg） 1234 15.2 結合蛋白質＋25ul（3.0pg） 1437 17.7 結合蛋白質＋50ul（6.0pg） 1688 20.8 ＊挿入〔³H〕−ウアバイン＝8098 CPM ラベルされた結合ウアバインの増大量は、カイネチッ
クコンスタントを全く変えずに、ラベルされないウアバ
インによって排除されることができ、これは、そのレセ
プターへのウアバインの結合の力が本発明の薬剤によっ
て影響されなかったことを表わしている。このウアバイ
ンのウアバイン結合蛋白質への結合の増大は、高ナトリ
ウムレベルの胸嚢液（タイプ２の胸嚢液）からの抽出に
おいて観察された。本発明者らの知る限り、この性質を
発現する他のどんな性質も存在しない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭53−133617（ＪＰ，Ａ)

Claims (19)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】ヒトの女性の胸嚢液から単離され、哺乳動
   物において抗高血圧活性を発現する抗高血圧剤。
2. 【請求項２】該剤が酵素Na⁺K⁺−ATPアーゼを刺激する特
   性を有する請求の範囲第１項記載の抗高血圧剤。
3. 【請求項３】該剤が低級アルコール中に可溶である請求
   の範囲第２項記載の抗高血圧剤。
4. 【請求項４】前記胸嚢液がタイプ１の胸嚢液である請求
   の範囲第１項記載の抗高血圧剤。
5. 【請求項５】前記剤がジゴキシンに対する抗体に免疫反
   応性がある請求の範囲第４項記載の抗高血圧剤。
6. 【請求項６】前記剤がタイプ１のヒトの女性の胸嚢液か
   ら、 該タイプ１のヒトの女性の胸嚢液を低級アルコールと共
   に撹拌して該液中に不所望の成分を沈澱させ、 沈澱物を廃棄し、 アルコールで可溶化された剤を第１極性溶剤と混合して
   第２沈澱物を形成し、 該第２沈澱物を廃棄し、 該第１極性溶剤を蒸発させて、前記剤を含有する第１水
   性相を回収し、 該第１極性溶剤よりも極性の低い第２極性溶剤にて該第
   １水性相を更に抽出し、 前記剤を含有する有機相を取得し、 該第２極性溶剤を該有機相から除去して、前記剤を含有
   する第２水性相を取得し、 該第２水性相を凍結乾燥し、 前記凍結乾燥物をメタノール−水で抽出し、 前記抽出物を、圧力安定させたポリデキストラン上のク
   ロマトグラフィーにかけ、 前記剤を回収する ことによって単離される請求の範囲第５項記載の抗高血
   圧剤。
7. 【請求項７】タイプ１のヒトの女性の胸嚢液から単離さ
   れた生物学的に活性な剤を薬剤学的に認容される担体及
   び／又は塩と共に含有する抗高血圧製剤。
8. 【請求項８】前記抗高血圧剤を約10ngジゴキシン当量な
   いし約1000ngジゴキシン当量含有する請求の範囲第７項
   記載の抗高血圧製剤。
9. 【請求項９】前記投与形態が、錠剤とカプセルとから成
   る群中より選択された経口投与形態である請求の範囲第
   ８項記載の抗高血圧製剤。
10. 【請求項１０】非経口投与形態を含む請求の範囲第７項
    記載の抗高血圧製剤。
11. 【請求項１１】ヒトの胸嚢液中に見出され哺乳動物中に
    おいて抗高血圧活性を示す生物学的に活性な剤の水溶液
    から成る抗高血圧製剤。
12. 【請求項１２】ジゴキシン抗体と免疫反応性があり、哺
    乳動物においての抗高血圧活性を発現させるタイプ１の
    ヒトの女性の胸嚢液から単離されたファクターを含有す
    る生物学的に活性な剤を精製する方法において、 該タイプ１のヒトの女性の胸嚢液を低級アルコールと共
    に撹拌して該液中に不所望の成分を沈澱させ、 沈澱物を廃棄し、 アルコールで可溶化されたファクターを第１極性溶剤と
    混合して 第２沈澱物を形成し、 該第２沈澱物を廃棄し、 該第１極性溶剤を蒸発させて前記ファクターを含有する
    第１水性相を回収し、 該第１極性溶剤よりも極性の低い第２極性溶剤にて該第
    １水性相を更に抽出し、 前記ファクターを含有する有機相を取得し、 該第２極性溶剤を該有機相から除去して、前記ファクタ
    ーを含有する第２水性相を取得し、 該第２水性相を凍結乾燥し、 前記凍結乾燥物をメタノール−水で抽出し、 前記抽出物を、圧力安定させたポリデキストラン上のク
    ロマトグラフィにかけ、前記ファクターを含有する画分
    を回収する 各工程から成る精製方法。
13. 【請求項１３】前記ファクターがセファデックスLH−20
    上のクロマトグラフィによって精製される請求の範囲第
    12項記載の精製方法。
14. 【請求項１４】タイプ１のヒトの女性の胸嚢液から単離
    されたファクターであって、ジゴキシン抗体と免疫反応
    性があり、哺乳動物において抗高血圧活性を発現するフ
    ァクターを含有し、請求の範囲第12項の方法によって精
    製された抗高血圧剤。
15. 【請求項１５】タイプ１のヒトの女性の胸嚢液から単離
    されたファクアーであって、ジゴキシン抗体と免疫反応
    性があり、哺乳動物において抗高血圧活性を発現するフ
    ァクターを含有する生物学的に活性な剤を精製する方法
    において、 タイプ１のヒトの女性の胸嚢液を第１極性溶剤と共に撹
    拌して、 不所望な成分を該液中に沈澱させ、 沈澱物を廃棄し、 溶解化されたファクターを、該第１極性溶剤よりも極性
    の低い第２極性溶剤と混合し、該ファクターを含有する
    有機相を回収し、 該第２極性溶剤を該有機相から除去して該ファクターを
    含有する水性相を取得し、 該水性相を凍結乾燥し、 前記凍結乾燥物をメタノール−水混合物にて抽出し、 前記抽出された凍結乾燥物を疎水性アフィニティクロマ
    トグラフィにかけ、 該ファクターを含有するフラクションを回収する 各工程から成る精製方法。
16. 【請求項１６】前記ファクターをアミノ炭水化物カラム
    上のクロマトグラフィによって更に精製する請求の範囲
    第13項記載の精製方法。
17. 【請求項１７】タイプ１のヒトの女性の胸嚢液から単離
    されたファクターであって、ジゴキシン抗体と免疫反応
    性があり、哺乳動物において抗高血圧活性を発現するフ
    ァクターを含有し、請求の範囲第13項の方法によって精
    製された抗高血圧剤。
18. 【請求項１８】前記剤が、細胞ウアバインレセプターへ
    のウアバインの結合を刺激する性質も備えている請求の
    範囲第15項記載の抗高血圧剤。
19. 【請求項１９】スペクトラムの210mmに吸光性を示すこ
    とをさらに特徴とする請求の範囲第15項記載の抗高血圧
    剤。