JP2022050495A

JP2022050495A - 新規の蛍光色素およびバイオマーカーとしてのそれらの使用

Info

Publication number: JP2022050495A
Application number: JP2021212730A
Authority: JP
Inventors: ロマノフニコライ; Romanov Nikolai
Original assignee: Illumina Cambridge Ltd
Current assignee: Illumina Cambridge Ltd
Priority date: 2016-09-30
Filing date: 2021-12-27
Publication date: 2022-03-30
Also published as: NZ748812A; CN109476654A; US20210071005A1; IL297749B2; US10844225B2; ES2988726T3; CN109476654B; AU2022268273A1; CA3026019C; IL297749A; AU2022268273B2; JP2019531255A; KR20190057021A; EP3974425A1; EP3519410A1; AU2017335223B2; IL263871B; US11370920B2; AU2017335223A1; ES2914688T3

Abstract

【課題】核酸シークエンシングアプリケーションにおけるヌクレオチド用蛍光標識として使用され得る新規の蛍光色素を提供する。
【解決手段】約６０ｎｍ～約１００ｎｍの範囲のストークスシフトを有する下式（Ｖ）の蛍光化合物による。

【選択図】なし

Description

優先権出願の参照による援用

本出願は、２０１６年９月３０日に出願された、New Fluorescent Dyes and Their Use
s as Biomarkersと題する米国仮出願第６２／４０２６３５号の利益を主張し、その開示
をその全体で参照により本明細書に援用する。

本出願は、蛍光色素として使用するための新規のベンゾピラン誘導体に関する。当該化
合物は、蛍光標識として、特に核酸シークエンシングアプリケーションにおけるヌクレオ
チド標識用に使用され得る。

蛍光標識を利用する核酸の非放射性検出は、分子生物学における重要な技術である。組
み換えＤＮＡ技術で用いられる多くの手順は、以前は、^３２Ｐなどで放射性標識されたヌ
クレオチドまたはポリヌクレオチドの使用に大きく依存していた。放射性化合物は、核酸
および他の目的の分子の高感度の検出を可能にする。しかしながら、費用、限られた貯蔵
寿命、より重要なことである安全性への配慮など、放射性同位元素の使用には重大な制限
がある。放射性標識を不要とすることは、環境への影響を低減し、試薬廃棄などに関連す
るコストを削減しながら、安全性を高める。非放射性蛍光検出に適した方法には、非限定
的な例として、自動化ＤＮＡシークエンシング、ハイブリダイゼーション方法、ポリメラ
ーゼ連鎖反応生成物のリアルタイム検出、およびイムノアッセイが含まれる。

多くのアプリケーションにとって、複数の空間的に重なり合う被検物の独立した検出を
達成するために、複数のスペクトル的に区別可能な蛍光標識を使用することが望ましい。
このような多重方法では、反応容器の数を減らして実験プロトコルを単純化し、特定用途
向け試薬キットの製造を容易にし得る。マルチカラー自動化ＤＮＡシークエンシングなど
において、多重蛍光検出は、単一の電気泳動レーンにおける複数の核酸塩基の分析を可能
にし、それによってシングルカラーの方法よりもスループットを増加させ、レーン間の電
気泳動移動度のばらつきに関連する不正確性を減少させる。

しかしながら、多重蛍光検出は問題を含む可能性があり、蛍光標識の選択を制約する多
くの重要な因子がある。第一に、吸収および発光スペクトルが適切にスペクトル分離され
る色素化合物を見つけることは困難である。さらに、いくつかの蛍光色素が一緒に使用さ
れる場合、異なるスペクトル領域では色素の吸収帯は通常遠く離れているため、同時励起
は困難であり得る。多くの励起方法は高出力レーザーを使用し、そのため、色素はこのよ
うなレーザー励起に耐えるのに充分な光安定性を有しなければならない。分子生物学的方
法において特に重要な最後の検討事項は、蛍光色素が、例えばＤＮＡ合成溶媒および試薬
、緩衝液、ポリメラーゼ酵素、ならびにリガーゼ酵素などの使用される化学試薬と適合性
でなければならないということである。

シークエンシング技術が進歩するにつれて、上記の制約の全てを満たし、固相シークエ
ンシングおよび同種のものなどのハイスループット分子法に特に適している他の蛍光色素
化合物、それらの核酸コンジュゲート、および色素セットに対する必要性が生じてきてい
る。

特許文献１は、蛍光標識としての使用に適したローダミン化合物群を記載している。当
該広報に記載されている化合物は、固相核酸シークエンシングプロトコルにおける使用に
適している。固相核酸シークエンシングの技術およびスループットの進歩は、蛍光標識の
分子設計に対して、特に蛍光試薬と特定の塩基配列との間の相互作用において、さらなる
開発および改良をもたらした。

改良された蛍光特性（ストークスシフト、蛍光強度、蛍光極大の位置、および蛍光バン
ドの形状など）を有する蛍光色素分子は、核酸シークエンシングの速度および精度を改良
することができる。ストークスシフトは、生物学的アプリケーションでの蛍光シグナルの
同定における重要な要素である。例えば、吸収極大および蛍光極大が互いに非常に近い（
すなわち、ストークスシフトが小さい）フルオロホアを使用する場合、励起バンドおよび
発光バンドが大きく重なり合うため、発光の検出は励起光と区別することが困難であり得
る。対照的に、大きなストークスシフトを有するフルオロホアは、励起波長と発光波長と
の間が大きく離れているために区別が容易である。あるフルオロホアの発光波長が同じサ
ンプル中の別のフルオロホアと重なり合い、それゆえに励起する可能性があるため、スト
ークスシフトは多重蛍光アプリケーションでは特に重要である。また、測定が水ベースの
生物学的緩衝液中で、かつ／または高温で行われる場合に、ほとんどの色素の蛍光はその
ような条件では著しく低いので、蛍光シグナル強度は特に重要である。さらに、色素が結
合している塩基の性質も、蛍光極大、蛍光強度、および他の分光色素の特性に影響を与え
る。蛍光色素と核酸塩基との間の配列特異的相互作用は、蛍光色素の特定の設計によって
調整することができる。蛍光色素の構造の最適化は、蛍光色素の蛍光特性を改良し、ヌク
レオチドの取り込みの効率も改良し、シークエンシングエラーのレベルを低減し、核酸シ
ークエンシングにおける試薬の使用量を削減し、それにより核酸シークエンシングのコス
トを低減することができる。

本明細書に記載されているのは、新規のベンゾピラン誘導体、および生体分子標識とし
ての、特に核酸シークエンシングに使用されるヌクレオチド用標識としてのそれらの使用
である。生体分子コンジュゲートとして製造した場合に当該色素のストークスシフトが大
きくなること、ならびに新規の蛍光化合物を使用して得られるシークエンシングの読み取
りの長さ、強度、および質において、改良が見られ得る。

ＰＣＴ国際公開第２００７／１３５３６８号広報

本明細書に記載のいくつかの実施形態は、式（Ｉ）の新規のベンゾピラン誘導体または
それらのメソメリー型に関し、

式中、各Ｒ^１、Ｒ^２、およびＲ^１’は、独立して、Ｈ、アルキル、置換型アルキル、ア
ルコキシ、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルコキシアルキ
ル、アミノ、アミノアルキル、アミノスルホニル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ヒドロキ
シアルキル、ヘテロアルキル、Ｃ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、Ｃ－アミド、Ｎ－アミ
ド、ニトロ、スルホニル、スルホ、スルフィノ、スルホネート、スルホニルハライド、Ｓ
－スルホンアミド、Ｎ－スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換さ
れていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていて
もよいヘテロシクリルからなる群から選択され、
あるいは、Ｒ^１およびＲ^１’は、一緒になって、それらが結合している原子と共に、置
換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていても
よいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択さ
れる環または環系を形成し、
各Ｒ^３およびＲ^４は、独立して、Ｈ、アルキル、置換型アルキル、アルケニル、アルキ
ニル、アミノアルキル、ハロアルキル、ヘテロアルキル、アルコキシアルキル、スルホニ
ルヒドロキシド、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール
、置換されていてもよいカルボシクリル、および置換されていてもよいヘテロシクリルか
らなる群から選択され、
あるいは、Ｒ^１およびＲ^３は、それらが結合している原子と共に、置換されていてもよ
い５～１０員のヘテロアリール、または置換されていてもよい５～１０員のヘテロシクリ
ルからなる群から選択される環または環系を形成し、
あるいは、Ｒ^２およびＲ^４は、それらが結合している原子と共に、置換されていてもよ
い５～１０員のヘテロアリール、および置換されていてもよい５～１０員のヘテロシクリ
ルからなる群から選択される環または環系を形成し、
Ｒ^５およびＲ^６は、独立して、アルキル、置換型アルキル、アルコキシ、アルケニル、
アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルコキシアルキル、アミノ、アミノアル
キル、アミノスルホニル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヘテロアル
キル、Ｃ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、ニトロ、スルホニル
、スルホ、スルフィノ、スルホネート、スルホニルハライド、Ｓ－スルホンアミド、Ｎ－
スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール
、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリルか
らなる群から選択され、
Ｒは、－ＯＲ^７または－ＮＲ^８Ｒ^９から選択され、
Ｒ^７は、Ｈ、アルキル、置換型アルキル、置換されていてもよいアリール、置換されて
いてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいカルボシクリル、および置換されてい
てもよいヘテロシクリルからなる群から選択され、
各Ｒ^８およびＲ^９は、独立して、Ｈ、アルキル、置換型アルキル、アルケニル、アルキ
ニル、アミノアルキル、カルボキシアルキル、スルホナトアルキル、ハロアルキル、ヘテ
ロアルキル、アルコキシアルキル、スルホ、置換されていてもよいアリール、置換されて
いてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいカルボシクリル、および置換されてい
てもよいヘテロシクリルからなる群から選択され、
Ｘは、Ｏ、Ｓ、ＮＲ^１０、およびＳｅからなる群から選択され、
Ｒ^１０は、Ｈ、アルキル、置換型アルキル、置換されていてもよいアリール、置換され
ていてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいカルボシクリル、および置換されて
いてもよいヘテロシクリルからなる群から選択され、
ｍは、０～４から選択される整数であり、
ｎは、０～４から選択される整数であり、ただし、
各Ｒ^１、Ｒ^１’、およびＲ^２がＨであり、各Ｒ^３およびＲ^４がエチルであり、各ｍおよ
びｎが０であり、Ｒが－ＮＨＣＨ（ＣＨ_３）ＣＨ_２ＯＨである場合、ＸはＯ、Ｓ、または
Ｓｅから選択され、
各Ｒ^１、Ｒ^１’、およびＲ^２はＨであり、各Ｒ^３およびＲ^４がエチルであり、各ｍおよ
びｎが０であり、Ｒが－ＯＨである場合、ＸはＳまたはＳｅから選択され、
各Ｒ^１、Ｒ^１’、およびＲ^２はＨであり、各Ｒ^３およびＲ^４がエチルであり、ｍが１で
あり、Ｒ^５がメチルであり、ｎが０であり、Ｒが－ＯＨまたは－ＯＥｔである場合、Ｘは
Ｓ、ＮＲ^１０、またはＳｅから選択され、
各Ｒ^１、Ｒ^１’、およびＲ^２はＨであり、各Ｒ^３およびＲ^４がエチルであり、ｍが１で
あり、Ｒ^５が－Ｓ（Ｏ_２）Ｅｔであり、ｎが０であり、Ｒが－ＯＨまたは－ＯＥｔである
場合、ＸはＳ、ＮＲ^１０、またはＳｅから選択される。

本明細書に記載のいくつかの他の実施形態は、約６０ｎｍ～約１００ｎｍの範囲のスト
ークスシフトを有する式（Ｖ）の蛍光化合物に関し、

式中、各Ｒ^１、Ｒ^１’、およびＲ^２は、独立して、Ｈ、アルキル、置換型アルキル、ア
ルコキシ、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルコキシアルキ
ル、アミノ、アミノアルキル、アミノスルホニル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ヒドロキ
シアルキル、ヘテロアルキル、Ｃ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、Ｃ－アミド、Ｎ－アミ
ド、ニトロ、スルホニル、スルホ、スルフィノ、スルホネート、スルホニルハライド、Ｓ
－スルホンアミド、Ｎ－スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換さ
れていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていて
もよいヘテロシクリルからなる群から選択され、
あるいは、Ｒ^１およびＲ^１’は、一緒になって、それらが結合している原子と共に、置
換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていても
よいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択さ
れる環または環系を形成し、
各Ｒ^３およびＲ^４は、独立して、Ｈ、アルキル、置換型アルキル、アルケニル、アルキ
ニル、アミノアルキル、ハロアルキル、ヘテロアルキル、アルコキシアルキル、スルホ、
置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、置換されていて
もよいカルボシクリル、および置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択
され、
あるいは、Ｒ^１およびＲ^３は、それらが結合している原子と共に、置換されていてもよ
い５～１０員のヘテロアリール、または置換されていてもよい５～１０員のヘテロシクリ
ルからなる群から選択される環または環系を形成し、
あるいは、Ｒ^２およびＲ^４は、それらが結合している原子と共に、置換されていてもよ
い５～１０員のヘテロアリール、および置換されていてもよい５～１０員のヘテロシクリ
ルからなる群から選択される環または環系を形成し、
Ｒ^Ｈｅｔは、１以上のＲ^５で置換されていてもよいヘテロアリールであり、
各Ｒ^５およびＲ^６は、独立して、アルキル、置換型アルキル、アルコキシ、アルケニル
、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルコキシアルキル、アミノ、アミノア
ルキル、アミノスルホニル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヘテロア
ルキル、Ｃ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、ニトロ、スルホニ
ル、スルホ、スルフィノ、スルホネート、スルホニルハライド、Ｓ－スルホンアミド、Ｎ
－スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリー
ル、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリル
からなる群から選択され、
Ｒは、－ＯＲ^７または－ＮＲ^８Ｒ^９から選択され、
Ｙは、ＯまたはＮＨから選択され、
Ｒ^７は、Ｈ、アルキル、置換型アルキル、置換されていてもよいアリール、置換されて
いてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいカルボシクリル、および置換されてい
てもよいヘテロシクリルからなる群から選択され、
各Ｒ^８およびＲ^９は、独立して、Ｈ、アルキル、置換型アルキル、アルケニル、アルキ
ニル、アミノアルキル、カルボキシアルキル、スルホナトアルキル、ハロアルキル、ヘテ
ロアルキル、アルコキシアルキル、スルホ、置換されていてもよいアリール、置換されて
いてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいカルボシクリル、および置換されてい
てもよいヘテロシクリルからなる群から選択され、
ｎは、０～４の整数である。

本明細書に記載のいくつかの実施形態は、式（Ｉ）または（Ｖ）の化合物で標識された
ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドに関する。

本明細書に記載のいくつかの実施形態は、１以上のヌクレオチドを含むキットであって
、１以上のヌクレオチドが本明細書に記載の蛍光色素で標識されたヌクレオチドである、
前記キットに関する。

本明細書に記載のいくつかの他の実施形態は、シークエンシングアッセイにおいて本明
細書に記載の標識ヌクレオチドを取り込むことと、前記標識ヌクレオチドを検出すること
とを含むシークエンシング方法に関する。

本明細書に記載のいくつかの他の実施形態は、式（Ｉａ）の化合物を製造する方法に関
し、前記方法は、式（ＩＩａ）

または式（ＩＩｂ）

の化合物と式（ＩＩＩ）

の化合物を反応させて、

を形成することを含み、不確定要素Ｒ^１、Ｒ^１’、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６、Ｘ、
ｍ、およびｎは、式（Ｉ）の化合物の開示において上記で定義されており、Ｒ”は、Ｈ、
置換されていてもよいアルキル、アルケニル、アルキニル、アミノアルキル、ハロアルキ
ル、ヘテロアルキル、アルコキシアルキル、スルホ、置換されていてもよいアリール、置
換されていてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいカルボシクリル、および置換
されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択される。

本明細書に記載のいくつかの他の実施形態は、式（Ｉａ’）の化合物を製造する方法に
関し、前記方法は、式（ＩＩａ）

または式（ＩＩｂ）

の化合物と式（ＩＩＩａ）

の化合物を反応させて、

を形成することを含み、不確定要素Ｒ^１、Ｒ^１’、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６、Ｒ^７
、Ｒ”、Ｘ、ｍ、およびｎは、上記で定義されている。

本明細書に記載のいくつかの他の実施形態は、式（Ｉａ’）の化合物を製造する方法に
関し、前記方法は、カルボン酸活性化により式（Ｉａ）の化合物を式（Ｉａ’）の化合物
に変換することを含み、

不確定要素Ｒ^１、Ｒ^１’、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６、Ｒ^７、Ｒ^８、Ｒ^９、Ｘ、ｍ
、およびｎは、式（Ｉ）の化合物の開示において上記で定義されている。

本明細書に記載のいくつかの他の実施形態は、式（Ｉｂ）の化合物を製造する方法に関
し、前記方法は、カルボン酸活性化により式（Ｉａ）の化合物を式（Ｉａ’）の化合物に
変換することと、

式（Ｉａ’）の化合物を式（ＩＶ）の第一級または第二級アミンと反応させることとを
含み、

本明細書に記載のいくつかの他の実施形態は、式（Ｉｂ）の化合物を製造する方法に関
し、前記方法は、式（ＩＩａ）

または式（ＩＩｂ）

の化合物と式（ＩＩＩｂ）

の化合物を反応させて、

吸収が同じスペクトル領域にある市販の色素と比較した、本明細書に記載のベンゾピラン蛍光色素の蛍光スペクトルを示す折れ線グラフである。図２Ａおよび図２Ｂは、本明細書に記載の新規の蛍光新規色素で標識されたＣ－ヌクレオチドのシークエンシング分析への有用性を示す（黒色表示の）プロットである。本明細書に記載の新規の蛍光色素が青色（４６０ｎｍ）または緑色（５３０ｎｍ）の光で励起されたときの、当該色素で標識されたＣ－ヌクレオチドの蛍光強度を示す棒グラフである。２つの異なる温度における、市販の色素と比較した、本明細書に記載の新規の蛍光色素で標識されたＣ－ヌクレオチドの蛍光強度を示す棒グラフである。

詳細な説明
本明細書に記載の実施形態は、蛍光色素として使用するための式（Ｉ）または（Ｖ）の
構造の新規のベンゾピラン誘導体に関する。当該新規の蛍光色素は、大きいストークスシ
フトを有し、蛍光標識として、特に核酸シークエンシングアプリケーションにおけるヌク
レオチド標識用に使用され得る。当該蛍光色素の製造方法および当該色素を利用するダウ
ンストリームのシークエンシングアプリケーションも例示される。

式中、各Ｒ^１、Ｒ^２、およびＲ^１’は、独立して、Ｈ、アルキル、置換型アルキル、ア
ルコキシ、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルコキシアルキ
ル、アミノ、アミノアルキル、アミノスルホニル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ヒドロキ
シアルキル、ヘテロアルキル、Ｃ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、Ｃ－アミド、Ｎ－アミ
ド、ニトロ、スルホニル、スルホ、スルフィノ、スルホネート、スルホニルハライド、Ｓ
－スルホンアミド、Ｎ－スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換さ
れていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていて
もよいヘテロシクリルからなる群から選択され、
あるいは、Ｒ^１およびＲ^１’は、一緒になって、それらが結合している原子と共に、置
換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていても
よいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択さ
れる環または環系を形成し、
各Ｒ^３およびＲ^４は、独立して、Ｈ、アルキル、置換型アルキル、アルケニル、アルキ
ニル、アミノアルキル、ハロアルキル、ヘテロアルキル、アルコキシアルキル、スルホ、
置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、置換されていて
もよいカルボシクリル、および置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択
され、
あるいは、Ｒ^１およびＲ^３は、それらが結合している原子と共に、置換されていてもよ
い５～１０員のヘテロアリール、または置換されていてもよい５～１０員のヘテロシクリ
ルからなる群から選択される環または環系を形成し、
あるいは、Ｒ^２およびＲ^４は、それらが結合している原子と共に、置換されていてもよ
い５～１０員のヘテロアリール、および置換されていてもよい５～１０員のヘテロシクリ
ルからなる群から選択される環または環系を形成し、
Ｒ^５およびＲ^６は、独立して、アルキル、置換型アルキル、アルコキシ、アルケニル、
アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルコキシアルキル、アミノ、アミノアル
キル、アミノスルホニル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヘテロアル
キル、Ｃ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、ニトロ、スルホニル
、スルホ、スルフィノ、スルホネート、スルホニルハライド、Ｓ－スルホンアミド、Ｎ－
スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール
、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリルか
らなる群から選択され、
Ｒは、－ＯＲ^７または－ＮＲ^８Ｒ^９から選択され、
Ｒ^７は、Ｈ、アルキル、置換型アルキル、置換されていてもよいアリール、置換されて
いてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいカルボシクリル、および置換されてい
てもよいヘテロシクリルからなる群から選択され、
各Ｒ^８およびＲ^９は、独立して、Ｈ、アルキル、置換型アルキル、アルケニル、アルキ
ニル、アミノアルキル、カルボキシアルキル、スルホナトアルキル、ハロアルキル、ヘテ
ロアルキル、アルコキシアルキル、スルホ、置換されていてもよいアリール、置換されて
いてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいカルボシクリル、および置換されてい
てもよいヘテロシクリルからなる群から選択され、
Ｘは、Ｏ、Ｓ、ＮＲ^１０、およびＳｅからなる群から選択され、
Ｒ^１０は、Ｈ、アルキル、置換型アルキル、置換されていてもよいアリール、置換され
ていてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいカルボシクリル、および置換されて
いてもよいヘテロシクリルからなる群から選択され、
ｍは、０～４から選択される整数であり、
ｎは、０～４から選択される整数であり、ただし、
各Ｒ^１、Ｒ^１’、およびＲ^２がＨであり、各Ｒ^３およびＲ^４がエチルであり、各ｍおよ
びｎが０であり、Ｒが－ＮＨＣＨ（ＣＨ_３）ＣＨ_２ＯＨである場合、ＸはＯ、Ｓ、または
Ｓｅから選択され、
各Ｒ^１、Ｒ^１’、およびＲ^２がＨであり、各Ｒ^３およびＲ^４がエチルであり、各ｍおよ
びｎが０であり、Ｒが－ＯＨである場合、ＸはＳまたはＳｅから選択され、
各Ｒ^１、Ｒ^１’、およびＲ^２がＨであり、各Ｒ^３およびＲ^４がエチルであり、ｍが１で
あり、Ｒ^５がメチルであり、ｎが０であり、Ｒが－ＯＨまたは－ＯＥｔである場合、Ｘは
Ｓ、ＮＲ^１０、またはＳｅから選択され、
各Ｒ^１、Ｒ^１’、およびＲ^２がＨであり、各Ｒ^３およびＲ^４がエチルであり、ｍが１で
あり、Ｒ^５が－Ｓ（Ｏ_２）Ｅｔであり、ｎが０であり、Ｒが－ＯＨまたは－ＯＥｔである
場合、ＸはＳ、ＮＲ^１０、またはＳｅから選択される。
式（Ｉ）の化合物のいくつかの実施形態において、各Ｒ^１、Ｒ^１’、およびＲ^２がＨで
あり、各Ｒ^３およびＲ^４がエチルであり、ｍが１であり、Ｒ^５がＣｌである場合、ＸはＳ
、Ｏ、またはＳｅから選択され、好ましくはＯである。

式（Ｉ）の化合物のいくつかの実施形態において、本明細書に開示されている置換され
ていてもよいアリールは、置換されていてもよいＣ_６～１０アリール、例えばフェニルで
ある。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されている置換されていてもよいヘ
テロアリールは、置換されていてもよい５～１０員のヘテロアリール、より好ましくは、
置換されていてもよい５～６員のヘテロアリールである。いくつかの実施形態において、
本明細書に開示されている置換されていてもよいカルボシクリルは、置換されていてもよ
い３～７員のカルボシクリル、特に３～７員のシクロアルキルである。いくつかの実施形
態において、本明細書に開示されている置換されていてもよいヘテロシクリルは、置換さ
れていてもよい３～７員のヘテロシクリル、より好ましくは、５～６員のヘテロシクリル
である。

式（Ｉ）の化合物のいくつかの実施形態において、Ｒは－ＯＲ^７であり、式（Ｉ）の化
合物は、式（Ｉａ’）によっても表される。

一実施形態において、Ｒ^７はＨであり、式（Ｉ）の化合物は、式（Ｉａ）によっても表さ
れる。

式（Ｉ）の化合物のいくつかの実施形態において、Ｒは－ＮＲ^８Ｒ^９であり、式（Ｉ）
の化合物は、式（Ｉｂ）によっても表される。

一実施形態において、各Ｒ^８およびＲ^９はＨである。いくつかの他の実施形態において
、Ｒ^８はＨであり、Ｒ^９は置換型アルキルである。いくつかの他の実施形態において、Ｒ
^８およびＲ^９の両方とも置換型アルキルである。いくつかのこのような実施形態において
、置換型アルキルは、カルボキシル（－Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ）、スルホ（－ＳＯ_３Ｈ）、また
はスルホネート（－ＳＯ_３ ^－）で置換されているアルキルから選択される。いくつかの他
の実施形態において、置換型アルキルは、Ｃ－アミド基で置換されているアルキルから選
択される。

式（Ｉ）、（Ｉａ）、（Ｉａ’）、または（Ｉｂ）の化合物のいくつかの実施形態にお
いて、各Ｒ^１、Ｒ^１’、およびＲ^２はＨである。いくつかの他の実施形態において、Ｒ^１
、Ｒ^１’、およびＲ^２のうちの１つ以上は、アルキルである。

式（Ｉ）、（Ｉａ）、（Ｉａ’）、または（Ｉｂ）の化合物のいくつかの実施形態にお
いて、各Ｒ^３およびＲ^４はアルキルである。いくつかのこのような実施形態において、Ｒ
^３および／またはＲ^４は、メチルまたはエチルから選択されることができる。いくつかの
他の実施形態において、Ｒ^３はＨであり、Ｒ^４はアルキルである。いくつかの実施形態に
おいて、Ｒ^３およびＲ^４はエチルである。

式（Ｉ）、（Ｉａ）、（Ｉａ’）、または（Ｉｂ）の化合物のいくつかの他の実施形態
において、Ｒ^１およびＲ^３は、それらが結合している原子と共に、置換されていてもよい
３～７員のヘテロシクリル、例えば置換されていてもよい６員のヘテロシクリルを形成す
る。いくつかの実施形態において、ヘテロシクリル環は、１つのヘテロ原子（すなわち窒
素）を有する。いくつかの他の実施形態において、ヘテロシクリル環は、２以上のヘテロ
原子を有し得る。一実施形態において、置換されていてもよい６員のヘテロシクリルは、
構造

を有し、式中、環の炭素原子の各々が中性であり、帯電していないように、

は、単結合または二重結合を表す。いくつかのこのような実施形態において、Ｒ^４は、Ｈ
またはアルキルから選択される。一実施形態において、Ｒ^４はエチルである。いくつかの
このような実施形態において、Ｒ^１’およびＲ^２のうちの少なくとも一方は、Ｈである。
一実施形態において、Ｒ^１’およびＲ^２の両方がＨである。

式（Ｉ）、（Ｉａ）、（Ｉａ’）、または（Ｉｂ）の化合物のいくつかの他の実施形態
において、Ｒ^２およびＲ^４は、それらが結合している原子と共に、置換されていてもよい
３～７員のヘテロシクリル、例えば置換されていてもよい６員のヘテロシクリルを形成す
る。いくつかの実施形態において、ヘテロシクリル環は、１つのヘテロ原子（すなわち窒
素）を有する。いくつかの他の実施形態において、ヘテロシクリル環は、２以上のヘテロ
原子を有し得る。一実施形態において、置換されていてもよい６員のヘテロシクリルは、
構造

は、単結合または二重結合を表す。いくつかのこのような実施形態において、Ｒ^３は、Ｈ
またはアルキルから選択される。一実施形態において、Ｒ^３はエチルである。いくつかの
このような実施形態において、Ｒ^１’およびＲ^１のうちの少なくとも一方は、Ｈである。
一実施形態において、Ｒ^１’およびＲ^１の両方がＨである。

式（Ｉ）、（Ｉａ）、（Ｉａ’）、または（Ｉｂ）の化合物のいくつかの別の実施形態
において、Ｒ^１およびＲ^３は、それらが結合している原子と共に、置換されていてもよい
３～７員のヘテロシクリル、例えば置換されていてもよい６員のヘテロシクリルを形成し
、Ｒ^２およびＲ^４は、それらが結合している原子と共に、置換されていてもよい３～７員
のヘテロシクリル、例えば置換されていてもよい６員のヘテロシクリルを形成する。いく
つかの実施形態において、得られる縮合ヘテロシクリル環系は、１つのヘテロ原子（すな
わち窒素）を有する。いくつかの他の実施形態において、得られる縮合ヘテロシクリル環
系は、２以上のヘテロ原子を有し得る。一実施形態において、得られる縮合ヘテロシクリ
ル環系は、構造

は、単結合または二重結合を表す。一実施形態において、Ｒ^１’はＨである。

式（Ｉ）、（Ｉａ）、（Ｉａ’）、または（Ｉｂ）の化合物のいくつかの実施形態にお
いて、Ｒ^１／Ｒ^３および／またはＲ^２／Ｒ^４により形成される３～７員のヘテロシクリル
環は、非置換型である。いくつかの他の実施形態において、当該３～７員のヘテロシクリ
ルは、１以上のアルキル、例えばメチルで置換されている。

式（Ｉ）、（Ｉａ）、（Ｉａ’）、または（Ｉｂ）の化合物のいくつかの実施形態にお
いて、ｍは０である。いくつかの他の実施形態において、ｍは１である。いくつかのこの
ような実施形態において、Ｒ^５は、スルホ、スルホニルハライド、例えばスルホニルクロ
リド、またはアミノスルホニルから選択される。いくつかの実施形態において、Ｒ^５はハ
ロゲンである。いくつかの実施形態において、Ｒ^５は塩素である。

式（Ｉ）、（Ｉａ）、（Ｉａ’）、または（Ｉｂ）のいくつかの実施形態において、ｎ
は０である。

本明細書に開示されている式（Ｉ）、（Ｉａ）、（Ｉａ’）、または（Ｉｂ）の化合物
の実施形態のいずれか一つにおいて、ＸはＳ（硫黄）であることができる。本明細書に開
示されている式（Ｉ）、（Ｉａ）、（Ｉａ’）、または（Ｉｂ）の化合物の実施形態のい
ずれか一つにおいて、ＸはＯ（酸素）であることができる。いくつかのこのような実施形
態において、式、（Ｉａ）、（Ｉａ’）、および（Ｉｂ）の化合物は、それぞれ、式（Ｉ
ｃ）、（Ｉｃ’）、および（Ｉｄ）によっても表されることができる。

いくつかの特定の実施形態において、式（Ｉ）の例示的な化合物には、以下：

またはそれらのメソメリー型が含まれる。

式（Ｉ）の化合物のいくつかの実施形態において、当該化合物は、Ｃ（＝Ｏ）Ｒを介し
てヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドに共有結合しており、式中、Ｒは－ＯＲ^７であ
り、Ｒ^７は置換型アルキルである。

いくつかの別の実施形態において、当該化合物は、Ｃ（＝Ｏ）Ｒを介してヌクレオチド
またはオリゴヌクレオチドに共有結合しており、式中、Ｒは－ＮＲ^８Ｒ^９であり、Ｒ^８ま
たはＲ^９の少なくとも一方は、生体分子への結合に使用され得る１以上の官能基を含んで
なり、例えば、Ｒ^８またはＲ^９の一方は、１以上のカルボキシル基を含んでなる置換型ア
ルキルである。

いくつかの実施形態において、式（Ｉ）の化合物は、１以上のメソメリー型（Ｉ－Ａ）
、（Ｉ－Ｂ）、または（Ｉ－Ｃ）で存在する。

本明細書に開示されているいくつかの実施形態は、約６０ｎｍ～約１００ｎｍの範囲の
ストークスシフトを有する式（Ｖ）の蛍光化合物に関し、

式（Ｖ）のいくつかの実施形態において、Ｒ^Ｈｅｔは、置換されていてもよい５～１０
員のヘテロアリールから選択される。いくつかのこのような実施形態において、Ｒ^Ｈｅｔ
は、置換されていてもよい９員のヘテロアリールから選択され、例えば置換されていても
よいベンゾチアゾールである。一実施形態において、Ｒ^Ｈｅｔは置換されていてもよい２
－ベンゾチアゾリル：

である。一実施形態において、Ｒ^Ｈｅｔは、構造

を有する置換されていてもよい２－ベンゾオキサゾリルである。いくつかのこのような実
施形態において、Ｒ^Ｈｅｔは、スルホ、スルホニルハライド、またはアミノスルホニルか
ら選択される１以上の置換基で置換されている。いくつかのこのような実施形態において
、Ｒ^Ｈｅｔは、１以上のハロゲンで置換されている。いくつかのこのような実施形態にお
いて、Ｒ^Ｈｅｔは、塩素で置換されている。

いくつかの実施形態において、Ｒは－ＯＲ^７であり、式（Ｖ）の化合物は、式（Ｖａ）
：

によっても表される。一実施形態において、Ｒ^７はＨである。別の実施形態において、Ｒ
^７は置換型アルキルである。

いくつかの実施形態において、Ｒは－ＮＲ^８Ｒ^９であり、式（Ｖ）の化合物は、式（Ｖ
ｂ）：

によっても表される。一実施形態において、各Ｒ^８およびＲ^９はＨである。いくつかの他
の実施形態において、Ｒ^８はＨであり、Ｒ^９は置換型アルキルである。いくつかの他の実
施形態において、Ｒ^８およびＲ^９の両方とも置換型アルキルである。いくつかのこのよう
な実施形態において、置換型アルキルは、カルボキシル（－Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ）、またはス
ルホ（－ＳＯ_３Ｈ）、またはスルホネート（－ＳＯ３^－）で置換されているアルキルから
選択される。いくつかの他の実施形態において、置換型アルキルは、Ｃ－アミド基で置換
されているアルキルから選択される。

式（Ｖ）、（Ｖａ）、または（Ｖｂ）の化合物のいくつかの実施形態において、ＹはＯ
である。

式（Ｖ）、（Ｖａ）、または（Ｖｂ）の化合物のいくつかの実施形態において、各Ｒ^１
、Ｒ^１’、およびＲ^２はＨである。いくつかの他の実施形態において、Ｒ^１、Ｒ^１’、お
よびＲ^２のうちの１つ以上は、アルキルである。

式（Ｖ）、（Ｖａ）、または（Ｖｂ）の化合物のいくつかの実施形態において、各Ｒ^３
およびＲ^４はアルキルである。いくつかのこのような実施形態において、Ｒ^３および／ま
たはＲ^４は、メチルまたはエチルから選択されることができる。いくつかの他の実施形態
において、Ｒ^３はＨであり、Ｒ^４はアルキルである。

式（Ｖ）、（Ｖａ）、または（Ｖｂ）の化合物のいくつかの他の実施形態において、Ｒ
^１およびＲ^３は、それらが結合している原子と共に、置換されていてもよい３～７員のヘ
テロシクリル、例えば置換されていてもよい６員のヘテロシクリルを形成する。いくつか
の実施形態において、ヘテロシクリル環は、１つのヘテロ原子（すなわち窒素）を有する
。いくつかの他の実施形態において、ヘテロシクリル環は、２以上のヘテロ原子を有し得
る。一実施形態において、置換されていてもよい６員のヘテロシクリルは、構造

は、単結合または二重結合を表す。いくつかのこのような実施形態において、Ｒ^４は、Ｈ
またはアルキルから選択される。一実施形態において、Ｒ^４はエチルである。いくつかの
他の実施形態において、Ｒ^１’およびＲ^２のうちの少なくとも一方は、Ｈである。一実施
形態において、Ｒ^１’およびＲ^２の両方がＨである。

式（Ｖ）、（Ｖａ）、または（Ｖｂ）の化合物のいくつかの他の実施形態において、Ｒ
^２およびＲ^４は、それらが結合している原子と共に、置換されていてもよい３～７員のヘ
テロシクリル、例えば置換されていてもよい６員のヘテロシクリルを形成する。いくつか
の実施形態において、ヘテロシクリル環は、１つのヘテロ原子（すなわち窒素）を有する
。いくつかの他の実施形態において、ヘテロシクリル環は、２以上のヘテロ原子を有し得
る。一実施形態において、置換されていてもよい６員のヘテロシクリルは、構造

は、単結合または二重結合を表す。いくつかのこのような実施形態において、Ｒ^３は、Ｈ
またはアルキルから選択される。一実施形態において、Ｒ^３はエチルである。いくつかの
他の実施形態において、Ｒ^１’およびＲ^１の少なくとも一方は、Ｈである。一実施形態に
おいて、Ｒ^１’およびＲ^１の両方がＨである。

式（Ｖ）、（Ｖａ）、または（Ｖｂ）の化合物のいくつかの別の実施形態において、Ｒ
^１およびＲ^３は、それらが結合している原子と共に、置換されていてもよい３～７員のヘ
テロシクリル、例えば置換されていてもよい６員のヘテロシクリルを形成し、Ｒ^２および
Ｒ^４は、それらが結合している原子と共に、置換されていてもよい３～７員のヘテロシク
リル、例えば置換されていてもよい６員のヘテロシクリルを形成する。いくつかの実施形
態において、得られる縮合ヘテロシクリル環系は、１つのヘテロ原子（すなわち窒素）を
有する。いくつかの他の実施形態において、得られる縮合ヘテロシクリル環系は、２以上
のヘテロ原子を有し得る。一実施形態において、得られる縮合ヘテロシクリル環系は、構
造

式（Ｖ）、（Ｖａ）、または（Ｖｂ）の化合物のいくつかの実施形態において、Ｒ^１／
Ｒ^３および／またはＲ^２／Ｒ^４により形成される３～７員のヘテロシクリル環は、非置換
型である。いくつかの他の実施形態において、当該３～７員のヘテロシクリルは、１以上
のアルキル、例えばメチルで置換されている。

式（Ｖ）、（Ｖａ）、または（Ｖｂ）の化合物のいくつかの実施形態において、ｎは０
である。

式（Ｖ）、（Ｖａ）、または（Ｖｂ）のいくつかの特定の実施形態において、式（Ｖ）
の例示的な化合物には、本明細書に開示されている化合物Ｉ－１～Ｉ－１５が含まれる。

いくつかの実施形態において、式（Ｖ）の蛍光化合物は、Ｃ（＝Ｏ）Ｒを介してヌクレ
オチドまたはオリゴヌクレオチドに共有結合しており、式中、Ｒは－ＯＲ^７であり、Ｒ^７
は置換型アルキルである。

いくつかの別の実施形態において、式（Ｖ）の蛍光化合物は、Ｃ（＝Ｏ）Ｒを介してヌ
クレオチドまたはオリゴヌクレオチドに共有結合しており、式中、Ｒは－ＮＲ^８Ｒ^９であ
り、Ｒ^８またはＲ^９の少なくとも一方は、置換型アルキルである。
定義

本明細書で使用されている節の見出しは、編成目的のためにすぎず、記載されている主
題を限定するものとして解釈されるべきではない。

別段の定めがない限り、本明細書で使用されている全ての技術用語および科学用語は、
当業者が一般に理解しているのと同じ意味を有する。用語「含む（including）」、なら
びに「含む（include）」、「含む（includes）」、および「含んでいた（included）」
などの他の語形の使用は限定的なものではない。用語「有する（having）」、ならびに「
有する（have）」、「有する（has）」、および「有していた（had）」などの他の語形の
使用は限定的なものではない。本明細書で使用される場合、請求項の移行句であろうと本
体部であろうと、用語「含んでなる（comprise(s)）」および「含んでなる（comprising
）」は、開放的な意味を有するものと解釈されるべきである。すなわち、上記の用語は、
「少なくとも有する」または「少なくとも含む」という句と同義的に解釈されるべきであ
る。例えば、方法との関連で使用されている場合、用語「含んでなる（comprising）」は
、方法が少なくとも列挙された工程を含むが、追加の工程を含み得ることを意味する。化
合物、組成物、または装置との関連で使用されている場合、用語「含んでなる（comprisi
ng）」は、化合物、組成物、または装置が少なくとも列挙された特徴または構成要素を含
むが、追加の特徴または構成要素も含み得ることを意味する。

本明細書で使用される場合、一般的な有機物の略語を以下のように定義する。
Ａｃアセチル
Ａｃ_２Ｏ無水酢酸
ａｑ．水性
ＢＯＣまたはＢｏｃｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル
ＢＯＰ（ベンゾトリアゾール－１－イルオキシ）トリス（ジメチルアミノ）ホスホニ
ウムヘキサフルオロホスフェート
ｃａｔ．触媒
℃ 摂氏度の温度
ｄＡＴＰデオキシアデノシントリホスフェート
ｄＣＴＰデオキシシチジントリホスフェート
ｄＧＴＰデオキシグアノシントリホスフェート
ｄＴＴＰデオキシチミジントリホスフェート
ｄｄＮＴＰジデオキシヌクレオチド
ＤＣＭメチレンクロリド
ＤＭＡジメチルアセトアミド
ＤＭＦジメチルホルムアミド
Ｅｔエチル
ＥｔＯＡｃ酢酸エチル
ｆｆＮ充分に機能性のヌクレオチドコンジュゲート
ｆｆＣ充分に機能性のシチジンコンジュゲート
ｇグラム
ｈまたはｈｒ時間
ＩＰＡイソプロピルアルコール
ＬＣＭＳ液体クロマトグラフィー－マススペクトロメトリー
ＭｅＣＮアセトニトリル
ｍＬミリリットル
ＰＧ保護基
Ｐｈフェニル
ｐｐｔ沈殿
ＰｙＢＯＰ（ベンゾトリアゾール－１－イルオキシ）トリピロリジノホスホニウムヘ
キサフルオロホスフェート
ｒｔ室温
ＳＢＳ合成によるシークエンシング
ＴＥＡトリエチルアミン
ＴＥＡＢテトラエチルアンモニウムビカーボネート
ＴＦＡトリフルオロ酢酸
Ｔｅｒｔ，ｔ三級
ＴＨＦテトラヒドロフラン
ＴＬＣ薄層クロマトグラフィー
ＴＳＴＵＯ－（Ｎ－スクシンイミジル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニ
ウムテトラフルオロボレート
μＬマイクロリットル

本明細書で使用される場合、用語「共有結合（covalently attached）」または「共有
結合（covalently bonded）」は、原子間の電子対の共有を特徴とする化学結合の形成を
指す。例えば、共有結合ポリマーコーティングは、他の手段、例えば、接着または静電相
互作用による表面への付着と比較して、基体の官能化表面と化学結合を形成するポリマー
コーティングを指す。表面に共有結合しているポリマーは、共有結合とは別の手段によっ
て結合していることもできることが理解されよう。

本明細書で使用される用語「ハロゲン」または「ハロ」は、元素周期表の第７列の放射
線安定原子のうちのいずれか一つ、例えばフッ素、塩素、臭素、またはヨウ素を意味し、
フッ素および塩素が好ましい。

本明細書で使用される場合、「アルキル」は、完全に飽和している（すなわち、二重結
合または三重結合を含まない）直鎖状または分岐状の炭化水素鎖を指す。アルキル基は、
１～２０個の炭素原子を有し得る（「１～２０」などの数値範囲は、本明細書中に記載さ
れているときはいつでも、所定の範囲の各整数を指す；「１～２０個の炭素原子」は、１
個の炭素原子、２個の炭素原子、３個の炭素原子など、２０個以下の炭素原子からなり得
ることを意味するが、本定義は、数値範囲が指定されていない場合の用語「アルキル」の
記載も包含する）。アルキル基は、１～９個の炭素原子を有する中サイズのアルキルでも
あり得る。アルキル基は、１～６個の炭素原子を有する低級アルキルでもあり得る。アル
キル基は、「Ｃ_１～４アルキル」または同様の表記として示され得る。ただの例示として
、「Ｃ_１～６アルキル」は、アルキル鎖中に１～６個の炭素原子があることを示し、すな
わち、アルキル鎖は、メチル、エチル、プロピル、イソ－プロピル、ｎ－ブチル、イソ－
ブチル、ｓｅｃ－ブチル、およびｔ－ブチルからなる群から選択される。典型的なアルキ
ル基として、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ターシャ
リーブチル、ペンチル、ヘキシルなどが挙げられるが、これらに決して限定されるもので
はない。

本明細書で使用される場合、「アルコキシ」は、式－ＯＲを指し、ここで、Ｒは上記に
定義されているアルキルであり、例えば、「Ｃ_１～９アルコキシ」として、限定はされな
いが、メトキシ、エトキシ、ｎ－プロポキシ、１－メチルエトキシ（イソプロポキシ）、
ｎ－ブトキシ、イソ－ブトキシ、ｓｅｃ－ブトキシ、およびｔｅｒｔ－ブトキシなどが挙
げられる。

本明細書で使用される場合、「アルケニル」は、１以上の二重結合を含む直鎖状または
分岐状の炭化水素鎖を指す。アルケニル基は、２～２０個の炭素原子を有し得るが、本定
義は、数値範囲が指定されていない用語「アルケニル」の記載も包含する。アルケニル基
は、２～９個の炭素原子を有する中サイズのアルケニルでもあり得る。アルケニル基は、
２～６個の炭素原子を有する低級アルケニルでもあり得る。アルケニル基は、「Ｃ_２～６
アルケニル」または同様の表記として示され得る。ただの例示として、「Ｃ_２～６アルケ
ニル」は、アルケニル鎖中に２～６個の炭素原子があることを示し、すなわち、アルケニ
ル鎖は、エテニル、プロペン－１－イル、プロペン－２－イル、プロペン－３－イル、ブ
テン－１－イル、ブテン－２－イル、ブテン－３－イル、ブテン－４－イル、１－メチル
－プロペン－１－イル、２－メチル－プロペン－１－イル、１－エチル－エテン－１－イ
ル、２－メチル－プロペン－３－イル、ブタ－１，３－ジエニル、ブタ－１，２，－ジエ
ニル、およびブタ－１，２－ジエン－４－イルからなる群から選択される。典型的なアル
ケニル基として、エテニル、プロペニル、ブテニル、ペンテニル、およびヘキセニルなど
が挙げられるが、これらに決して限定されるものではない。

本明細書で使用される場合、「アルキニル」は、１以上の三重結合を含む直鎖状または
分岐状の炭化水素鎖を指す。アルキニル基は、２～２０個の炭素原子を有し得るが、本定
義は、数値範囲が指定されていない用語「アルキニル」の記載も包含する。アルキル基は
、２～９個の炭素原子を有する中サイズのアルキニルでもあり得る。アルキニル基は、２
～６個の炭素原子を有する低級アルキニルでもあり得る。アルキニル基は、「Ｃ_２～６ア
ルキニル」または同様の表記として示され得る。ただの例示として、「Ｃ_２～６アルキニ
ル」は、アルキニル鎖中に２～６個の炭素原子があることを示し、すなわち、アルキニル
鎖は、エチニル、プロピン－１－イル、プロピン－２－イル、ブチン－１－イル、ブチン
－３－イル、ブチン－４－イル、および２－ブチニルからなる群から選択される。典型的
なアルキニル基として、エチニル、プロピニル、ブチニル、ペンチニル、およびヘキシニ
ルなどが挙げられるが、これらに決して限定されるものではない。

本明細書で使用される場合、「ヘテロアルキル」は、主鎖中に１以上のヘテロ原子、す
なわち、炭素以外の元素、例えば、限定はされないが、窒素、酸素、および硫黄を含有す
る直鎖状または分岐状の炭化水素鎖を指す。ヘテロアルキル基は、１～２０個の炭素原子
を有し得るが、本定義は、数値範囲が指定されていない用語「ヘテロアルキル」の記載も
包含する。ヘテロアルキル基は、１～９個の炭素原子を有する中サイズのヘテロアルキル
でもあり得る。ヘテロアルキル基は、１～６個の炭素原子を有する低級ヘテロアルキルで
もあり得る。ヘテロアルキル基は、「Ｃ_１～６ヘテロアルキル」または同様の表記として
示され得る。ヘテロアルキル基は、１以上のヘテロ原子を含有し得る。ただの例示として
、「Ｃ_１～６ヘテロアルキル」は、ヘテロアルキル鎖中に１～６個の炭素原子があり、さ
らに骨格鎖中に１個以上のヘテロ原子があることを示す。

用語「芳香族」は、共役パイ電子系を有する環または環系を指し、炭素環式芳香族基（
例えば、フェニル）および複素環式芳香族基（例えば、ピリジン）の両方を含む。当該用
語は、環系全体が芳香族であるという条件の下に、単環式または縮合環多環式（すなわち
、隣接する原子の対を共有する環）基を含む。

本明細書で使用される場合、「アリール」は、環骨格中に炭素のみを含有する芳香環ま
たは環系（すなわち、２つの隣接する炭素原子を共有する２以上の縮合環）を指す。アリ
ールが環系である場合、当該系中の全ての環は芳香族である。アリール基は、６～１８個
の炭素原子を有し得るが、本定義は、数値範囲が指定されていない用語「アリール」の記
載も包含する。いくつかの実施形態において、アリール基は、６～１０個の炭素原子を有
する。アリール基は、「Ｃ_６～１０アルキル」、「Ｃ_６またはＣ_１０アリール」、または
同様の表記として示され得る。アリール基の例としては、フェニル、ナフチル、アズレニ
ル、およびアントラセニルが挙げられるが、これらに限定されない。

「アラルキル」または「アリールアルキル」は、アルキレン基を介して置換基として結
合しているアリール基であり、例えば「Ｃ_７～１４アラルキル」などとしては、限定はさ
れないが、ベンジル、２－フェニルエチル、３－フェニルプロピル、およびナフチルアル
キルが挙げられる。いくつかの場合において、アルキレン基は、低級アルキレン基（すな
わち、Ｃ_１～６アルキレン基）である。

本明細書で使用される場合、「ヘテロアリール」は、環骨格中に１以上のヘテロ原子、
すなわち、炭素以外の元素、例えば、限定はされないが、窒素、酸素、および硫黄を含有
する芳香環または環系（すなわち、２つの隣接する原子を共有する２以上の縮合環）を指
す。ヘテロアリールが環系である場合、当該系中の全ての環は芳香族である。ヘテロアリ
ール基は、５～１８の環員数（すなわち、炭素原子およびヘテロ原子を含む環骨格を構成
する原子の数）を有し得るが、本定義は、数値範囲が指定されていない用語「ヘテロアリ
ール」の記載も包含する。いくつかの実施形態において、ヘテロアリール基は、５～１０
の環員数または５～７の環員数を有する。ヘテロアリール基は、「５～７員のヘテロアリ
ール」、「５～１０員のヘテロアリール」、または同様の表記として示され得る。ヘテロ
アリール環の例として、限定はされないが、フリル、チエニル、フタラジニル、ピロリル
、オキサゾリル、チアゾリル、イミダゾリル、ピラゾリル、イソオキサゾリル、イソチア
ゾリル、トリアゾリル、チアジアゾリル、ピリジニル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピ
ラジニル、トリアジニル、キノリニル、イソキノリニル（isoquinlinyl）、ベンズイミダ
ゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾチアゾリル、インドリル、イソインドリル、および
ベンゾチエニルが挙げられる。

「ヘテロアラルキル」または「ヘテロアリールアルキル」は、アルキレン基を介して置
換基として結合しているヘテロアリール基である。例としては、２－チエニルメチル、３
－チエニルメチル、フリルメチル、チエニルエチル、ピロリルアルキル、ピリジルアルキ
ル、イソオキサゾリルアルキル、およびイミダゾリルアルキルが挙げられるが、これらに
限定されない。いくつかの場合において、アルキレン基は、低級アルキレン基（すなわち
、Ｃ_１～６アルキレン基）である。

本明細書で使用される場合、「カルボシクリル」は、環系骨格中に炭素原子のみを含有
する非芳香族環式環または環系を意味する。カルボシクリルが環系である場合、２以上の
環が、縮合、架橋、またはスピロ結合様式で共に結合していてもよい。カルボシクリルは
、環系中の少なくとも１つの環が芳香族ではないという条件の下に、任意の飽和度を有し
得る。したがって、カルボシクリルには、シクロアルキル、シクロアルケニル、およびシ
クロアルキニルが含まれる。カルボシクリル基は、３～２０個の炭素原子を有し得るが、
本定義は、数値範囲が指定されていない用語「カルボシクリル」の記載も包含する。カル
ボシクリル基は、３～１０個の炭素原子を有する中サイズのカルボシクリルでもあり得る
。カルボシクリル基は、３～６個の炭素原子を有するカルボシクリルでもあり得る。カル
ボシクリル基は、「Ｃ_３～６カルボシクリル」または同様の表記として示され得る。カル
ボシクリル環の例として、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキ
シル、シクロヘキセニル、２，３－ジヒドロ－インデン、ビシクロ［２．２．２］オクタ
ニル、アダマンチル、およびスピロ［４．４］ノナニルが挙げられるが、これらに限定さ
れない。

本明細書で使用される場合、「シクロアルキル」は、完全飽和カルボシクリル環または
環系を意味する。例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、および
シクロヘキシルが挙げられる。

本明細書で使用される場合、「ヘテロシクリル」は、環骨格中に１以上のヘテロ原子を
含有する非芳香族環式環または環系を意味する。ヘテロシクリルは、縮合、架橋、または
スピロ結合様式で共に結合していてもよい。ヘテロシクリルは、環系中の少なくとも１つ
の環が芳香族ではないという条件の下に、任意の飽和度を有し得る。ヘテロ原子は、環系
中の非芳香族環または芳香族環のいずれに存在していてもよい。ヘテロシクリル基は、３
～２０の環員数（すなわち、炭素原子およびヘテロ原子を含む環骨格を構成する原子の数
）を有し得るが、本定義は、数値範囲が指定されていない用語「ヘテロシクリル」の記載
も包含する。ヘテロシクリル基は、３～１０の環員数を有する中サイズのヘテロシクリル
でもあり得る。ヘテロシクリル基は、３～６の環員数を有するヘテロシクリルでもあり得
る。ヘテロシクリル基は、「３～６員のヘテロシクリル」または同様の表記として示され
得る。好ましい６員の単環式ヘテロシクリルでは、ヘテロ原子は、１～３のＯ、Ｎ、また
はＳから選択され、好ましい５員の単環式ヘテロシクリルでは、ヘテロ原子は、Ｏ、Ｎ、
またはＳから選択される１～２のヘテロ原子から選択される。ヘテロシクリル環の例とし
て、限定はされないが、アゼピニル、アクリジニル、カルバゾリル、シンノリニル、ジオ
キソラニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、モルホリニル、オキシラニル、オキセ
パニル、チエパニル、ピペリジニル、ピペラジニル、ジオキソピペラジニル、ピロリジニ
ル、ピロリドニル、ピロリジオニル（pyrrolidionyl）、４－ピペリドニル、ピラゾリニ
ル、ピラゾリジニル、１，３－ジオキシニル、１，３－ジオキサニル、１，４－ジオキシ
ニル、１，４－ジオキサニル、１，３－オキサチアニル、１，４－オキサチイニル、１，
４－オキサチアニル、２Ｈ－１，２－オキサジニル、トリオキサニル、ヘキサヒドロ－１
，３，５－トリアジニル、１，３－ジオキソリル、１，３－ジオキソラニル、１，３－ジ
チオリル、１，３－ジチオラニル、イソオキサゾリニル、イソオキサゾリジニル、オキサ
ゾリニル、オキサゾリジニル、オキサゾリジノニル、チアゾリニル、チアゾリジニル、１
，３－オキサチオラニル、インドリニル、イソインドリニル、テトラヒドロフラニル、テ
トラヒドロピラニル、テトラヒドロチオフェニル、テトラヒドロチオピラニル、テトラヒ
ドロ－１，４－チアジニル、チアモルホリニル、ジヒドロベンゾフラニル、ベンズイミダ
ゾリジニル、およびテトラヒドロキノリンが挙げられる。

「Ｏ－カルボキシ」基は、「－ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ」基を指し、ここで、Ｒは、本明細書で
定義されている、水素、Ｃ_１～６アルキル、Ｃ_２～６アルケニル、Ｃ_２～６アルキニル、
Ｃ_３～７カルボシクリル、Ｃ_６～１０アリール、５～１０員ヘテロアリール、および３～
１０員ヘテロシクリルから選択される。

「Ｃ－カルボキシ」基は、「－Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ」基を指し、ここで、Ｒは、本明細書で
定義されている、水素、Ｃ_１～６アルキル、Ｃ_２～６アルケニル、Ｃ_２～６アルキニル、
Ｃ_３～７カルボシクリル、Ｃ_６～１０アリール、５～１０員ヘテロアリール、および３～
１０員ヘテロシクリルから選択される。非限定的な例として、カルボキシル（すなわち、
－Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ）が挙げられる。

「シアノ」基は、「－ＣＮ」基を指す。

「スルホニル」基は、「－ＳＯ_２Ｒ」基を指し、ここで、Ｒは、本明細書で定義されて
いる、水素、Ｃ_１～６アルキル、Ｃ_２～６アルケニル、Ｃ_２～６アルキニル、Ｃ_３～７カ
ルボシクリル、Ｃ_６～１０アリール、５～１０員ヘテロアリール、および３～１０員ヘテ
ロシクリルから選択される。

「スルホニルヒドロキシド」または「スルホ」基は、「－Ｓ（＝Ｏ）_２－ＯＨ」基を指
す。

「スルフィノ」基は、「－Ｓ（＝Ｏ）ＯＨ」基を指す。

「スルホネート」基は、－ＳＯ_３ ^－を指す。

「スルホニルハライド」基は、「－Ｓ（＝Ｏ）_２－Ｘ」基を指し、ここでＸはハライド
である。

「Ｓ－スルホンアミド」基は、「－ＳＯ_２ＮＲ_ＡＲ_Ｂ」基を指し、ここで、Ｒ_Ａおよび
Ｒ_Ｂは、それぞれ独立して、本明細書で定義されている、水素、Ｃ_１～６アルキル、Ｃ_２
_～６アルケニル、Ｃ_２～６アルキニル、Ｃ_３～７カルボシクリル、Ｃ_６～１０アリール、
５～１０員ヘテロアリール、および３～１０員ヘテロシクリルから選択される。

「Ｎ－スルホンアミド」基は、「－Ｎ（Ｒ_Ａ）ＳＯ_２Ｒ_Ｂ」基を指し、ここで、Ｒ_Ａお
よびＲ_ｂは、それぞれ独立して、本明細書で定義されている、水素、Ｃ_１～６アルキル、
Ｃ_２～６アルケニル、Ｃ_２～６アルキニル、Ｃ_３～７カルボシクリル、Ｃ_６～１０アリー
ル、５～１０員ヘテロアリール、および３～１０員ヘテロシクリルから選択される。

「Ｃ－アミド」基は、「－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ_ＡＲ_Ｂ」基を指し、ここで、Ｒ_ＡおよびＲ_Ｂ
は、それぞれ独立して、本明細書で定義されている、水素、Ｃ_１～６アルキル、Ｃ_２～６
アルケニル、Ｃ_２～６アルキニル、Ｃ_３～７カルボシクリル、Ｃ_６～１０アリール、５～
１０員ヘテロアリール、および３～１０員ヘテロシクリルから選択される。

「Ｎ－アミド」基は、「－Ｎ（Ｒ_Ａ）Ｃ（＝Ｏ）Ｒ_Ｂ」基を指し、ここで、Ｒ_Ａおよび
Ｒ_Ｂは、それぞれ独立して、本明細書で定義されている、水素、Ｃ_１～６アルキル、Ｃ_２
_～６アルケニル、Ｃ_２～６アルキニル、Ｃ_３～７カルボシクリル、Ｃ_６～１０アリール、
５～１０員ヘテロアリール、および３～１０員ヘテロシクリルから選択される。

「アミノ」基は、「－ＮＲ_ＡＲ_Ｂ」基を指し、ここで、Ｒ_ＡおよびＲ_Ｂは、それぞれ独
立して、本明細書で定義されている、水素、Ｃ_１～６アルキル、Ｃ_２～６アルケニル、Ｃ
_２～６アルキニル、Ｃ_３～７カルボシクリル、Ｃ_６～１０アリール、５～１０員ヘテロア
リール、および３～１０員ヘテロシクリルから選択される。非限定的な例として、遊離ア
ミノ（すなわち－ＮＨ_２）が挙げられる。

「アミノアルキル」基は、アルキレン基を介して結合しているアミノ基を指す。

「アミノスルホニル」基は、「－Ｓ（＝Ｏ）_２ＮＨ_２」基を指す。

「アルコキシアルキル」基は、アルキレン基を介して結合しているアルコキシ基を指し
、例えば、「Ｃ_２～８アルコキシアルキル」などである。

本明細書で使用される場合、置換基は、１個以上の水素原子が他の原子または基で交換
されている非置換型親基に由来する。特段の定めがない限り、基を「置換型」と見なす場
合、当該基が、Ｃ_１～Ｃ_６アルキル、Ｃ_１～Ｃ_６アルケニル、Ｃ_１～Ｃ_６アルキニル、Ｃ
_１～Ｃ_６ヘテロアルキル、Ｃ_３～Ｃ_７カルボシクリル（ハロ、Ｃ_１～Ｃ_６アルキル、Ｃ_１
～Ｃ_６アルコキシ、Ｃ_１～Ｃ_６ハロアルキル、およびＣ_１～Ｃ_６ハロアルコキシで置換さ
れていてもよい）、Ｃ_３～Ｃ_７－カルボシクリル－Ｃ_１～Ｃ_６－アルキル（ハロ、Ｃ_１～
Ｃ_６アルキル、Ｃ_１～Ｃ_６アルコキシ、Ｃ_１～Ｃ_６ハロアルキル、およびＣ_１～Ｃ_６ハロ
アルコキシで置換されていてもよい）、３～１０員ヘテロシクリル（ハロ、Ｃ_１～Ｃ_６ア
ルキル、Ｃ_１～Ｃ_６アルコキシ、Ｃ_１～Ｃ_６ハロアルキル、およびＣ_１～Ｃ_６ハロアルコ
キシで置換されていてもよい）、３～１０員ヘテロシクリル－Ｃ_１～Ｃ_６－アルキル（ハ
ロ、Ｃ_１～Ｃ_６アルキル、Ｃ_１～Ｃ_６アルコキシ、Ｃ_１～Ｃ_６ハロアルキル、およびＣ_１
～Ｃ_６ハロアルコキシで置換されていてもよい）、アリール（ハロ、Ｃ_１～Ｃ_６アルキル
、Ｃ_１～Ｃ_６アルコキシ、Ｃ_１～Ｃ_６ハロアルキル、およびＣ_１～Ｃ_６ハロアルコキシで
置換されていてもよい）、アリール（Ｃ_１～Ｃ_６）アルキル（ハロ、Ｃ_１～Ｃ_６アルキル
、Ｃ_１～Ｃ_６アルコキシ、Ｃ_１～Ｃ_６ハロアルキル、およびＣ_１～Ｃ_６ハロアルコキシで
置換されていてもよい）、５～１０員ヘテロアリール（ハロ、Ｃ_１～Ｃ_６アルキル、Ｃ_１
～Ｃ_６アルコキシ、Ｃ_１～Ｃ_６ハロアルキル、およびＣ_１～Ｃ_６ハロアルコキシで置換さ
れていてもよい）、５～１０員ヘテロアリール（Ｃ_１～Ｃ_６）アルキル（ハロ、Ｃ_１～Ｃ
_６アルキル、Ｃ_１～Ｃ_６アルコキシ、Ｃ_１～Ｃ_６ハロアルキル、およびＣ_１～Ｃ_６ハロア
ルコキシで置換されていてもよい）、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、Ｃ_１～Ｃ_６アルコキシ
、Ｃ_１～Ｃ_６アルコキシ（Ｃ_１～Ｃ_６）アルキル（すなわち、エーテル）、アリールオキ
シ、スルフヒドリル（メルカプト）、ハロ（Ｃ_１～Ｃ_６）アルキル（例えば、－ＣＦ_３）
、ハロ（Ｃ_１～Ｃ_６）アルコキシ（例えば、－ＯＣＦ_３）、Ｃ_１～Ｃ_６アルキルチオ、ア
リールチオ、アミノ、アミノ（Ｃ_１～Ｃ_６）アルキル、ニトロ、Ｏ－カルバミル、Ｎ－カ
ルバミル、Ｏ－チオカルバミル、Ｎ－チオカルバミル、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、Ｓ－ス
ルホンアミド、Ｎ－スルホンアミド、Ｃ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、アシル、シアナ
ト、イソシアナト、チオシアナト、イソチオシアナト、スルフィニル、スルホニル、スル
ホ、スルフィノ、スルホネート、およびオキソ（＝Ｏ）から独立して選択される１つ以上
の置換基で置換されていることを意味する。基が「置換されていてもよい」と記載されて
いる場合は常に、当該基は上記の置換基で置換されていることができる。

当業者が理解しているように、化合物が正または負に帯電した置換基、例えばＳＯ^３－
を含む場合、当該化合物が全体として中性であるように、当該化合物は、負または正に帯
電した対イオンも含み得る。

特定のラジカル命名法は、文脈に応じて、モノラジカルまたはジラジカルのいずれかを
含み得ることを理解されたい。例えば、置換基が分子の残部への２つの結合点を必要とす
る場合、当該置換基はジラジカルであると理解される。例えば、２つの結合点を必要とす
るアルキルとして識別される置換基には、－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２ＣＨ_２－、－ＣＨ_２ＣＨ
（ＣＨ_３）ＣＨ_２－などのジラジカルが含まれる。他のラジカル命名法は、ラジカルが「
アルキレン」または「アルケニレン」などのジラジカルであることを明確に示している。

２つの「隣接する」Ｒ基が「それらが結合している原子と共に」環を形成すると記載さ
れている場合、原子、介在結合、および２つのＲ基の集合単位が、記載の環であることを
意味する。例えば、以下の構造が存在し、

Ｒ^１およびＲ^２が、水素およびアルキルからなる群から選択されるものとして定義され
るか、またはＲ^１およびＲ^２が、それらが結合している原子と共にアリールまたはカルボ
シクリルを形成する場合、Ｒ^１およびＲ^２が水素またはアルキルから選択され得ること、
またはその代わりに、部分構造が構造：

を有し、Ａが、描かれている二重結合を含むアリール環またはカルボシクリルであること
を意味する。
標識ヌクレオチド

本明細書に記載の色素化合物は、基体部分への結合に適している。基体部分は、本明細
書に記載の蛍光色素をコンジュゲートすることができる実質的にあらゆる分子または物質
であり得、非限定的な例としては、ヌクレオシド、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、炭
水化物、リガンド、粒子、固体表面、有機および無機ポリマー、ならびにそれらの組み合
わせまたは集合体、例えば、染色体、核、生細胞などが含まれ得る。疎水性引力、イオン
性引力、および共有結合を含む様々な手段によって、当該色素を任意のリンカーによりコ
ンジュゲートすることができる。具体的には、当該色素は共有結合によって基体にコンジ
ュゲートしている。より具体的には、当該共有結合は、リンカー基による。いくつかの場
合において、このような標識ヌクレオチドは、「修飾ヌクレオチド」とも呼ばれる。

本明細書に記載の長いストークスシフトを有する新規の蛍光色素の特に有用な用途は、
生体分子、例えば、ヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドの標識化用途である。本出
願のいくつかの実施形態は、本明細書に記載の新規の蛍光化合物で標識されたヌクレオチ
ドまたはオリゴヌクレオチドに関する。

生体分子への結合は、式（Ｉ）または（Ｖ）の化合物の－Ｃ（＝Ｏ）Ｒ部分を介し得る
。いくつかの実施形態において、Ｒは－ＯＲ^７であり、Ｒ^７は、生体分子のアミノ基への
結合に使用され得る置換型アルキルである。一実施形態において、－Ｃ（Ｏ）Ｒ部分は、
さらなるアミド／ペプチド結合形成に最も適した活性化エステル残基であり得る。本明細
書で使用される用語「活性化エステル」は、穏やかな条件下で、例えばアミノ基を含む化
合物と反応することができるカルボキシ基誘導体を指す。活性化エステルの非限定的な例
としては、ｐ－ニトロフェニル、ペンタフルオロフェニル、およびスクシンイミドエステ
ルが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの他の実施形態において、Ｒは－Ｎ
Ｒ^８Ｒ^９であり、Ｒ^８またはＲ^９の少なくとも一方は、生体分子への結合に使用され得る
１つ以上の官能基を含み、例えばＲ^８またはＲ^９の一方は、１つ以上のカルボキシルを含
んでなる置換型アルキルである。

いくつかの実施形態において、色素化合物は、核酸塩基を介してオリゴヌクレオチドま
たはヌクレオチドに共有結合していてもよい。例えば、標識ヌクレオチドまたはオリゴヌ
クレオチドは、リンカー部分を介してピリミジン塩基のＣ５位、または７－デアザプリン
塩基のＣ７位に結合した標識を有し得る。標識ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは
、ヌクレオチドのリボース糖またはデオキシリボース糖に共有結合している３’－ＯＨブ
ロッキング基も有し得る。
リンカー

本明細書に開示されている色素化合物は、当該化合物と他の分子との共有結合のための
置換基位置の一つに反応性リンカー基を含み得る。反応性連結基は、共有結合を形成する
ことができる部分である。特定の実施形態において、リンカーは、切断可能なリンカーで
あり得る。用語「切断可能なリンカー」の使用は、リンカー全体を除去する必要があるこ
とを暗示することを意図したものではない。切断後にリンカーの一部が色素および／また
は基体部分に結合したままであることを確実にするリンカー上の位置に切断部位を配置す
ることができる。切断可能なリンカーは、非限定的な例として、求電子的に切断可能なリ
ンカー、求核的に切断可能なリンカー、光により切断可能なリンカー、還元条件下で切断
可能（例えば、ジスルフィドまたはアジド含有リンカー）、酸化的条件下で切断可能、セ
ーフティー－キャッチリンカーの使用により切断可能、および除去機構により切断可能で
あり得る。色素化合物を基体部分に結合させるための切断可能なリンカーの使用は、標識
を必要に応じて検出後に除去し、ダウンストリーム工程でのいかなる干渉シグナルをも回
避することを確実にできるようにする。

リンカー基の非限定的な例として、ヌクレオチドの塩基と、例えば本明細書に記載の新
規の蛍光化合物などの標識とを結合する、ＰＣＴ国際公開第２００４／０１８４９３号広
報（参照により本明細書に援用される）に開示されているリンカー基が挙げられる。これ
らのリンカーは、遷移金属および少なくとも部分的に水溶性のリガンドから形成された、
水溶性ホスフィンまたは水溶性遷移金属触媒を使用して切断され得る。水溶液中では、後
者は、少なくとも部分的に水溶性の遷移金属錯体を形成する。使用され得る他の好適なリ
ンカーとしては、ＰＣＴ国際公開第２００４／０１８４９３号広報および国際公開第２０
０７／０２０４５７号広報（両方とも参照により本明細書に援用される）に開示されてい
るリンカーが挙げられる。ポリエチレングリコールスペーサー基を導入することにより、
蛍光色素（フルオロホア）とグアニン塩基との間のリンカーの長さを変えること、特に増
大させることによって、当分野で公知の他の結合を介してグアニン塩基に結合している同
じフルオロホアと比較して、蛍光強度を増加させることが可能であることが発見された。
リンカーの設計、特にリンカーの長さの増大は、ＤＮＡなどのポリヌクレオチドに取り込
まれたときに、グアノシンヌクレオチドのグアニン塩基に結合したフルオロホアの明るさ
の改良も可能にする。したがって、国際公開第２００７／０２０４５７号広報に記載され
ているように、色素がグアニン含有ヌクレオチドに結合した蛍光色素標識の検出を必要と
する分析方法において使用するためのものである場合、リンカーが式－（（ＣＨ_２）_２Ｏ
）_ｎ－のスペーサー基を含んでなると有利であり、ここで、ｎは、２～５０の整数である
。

ヌクレオシドおよびヌクレオチドは、糖または核酸塩基上の部位で標識されていてもよ
い。当業者が理解しているように、「ヌクレオチド」は、窒素塩基、糖、および１つ以上
のリン酸基からなる。ＲＮＡでは、糖はリボースであり、ＤＮＡでは、糖はデオキシリボ
ース、すなわちリボースに存在する１つのヒドロキシル基を欠く糖である。窒素塩基は、
プリンまたはピリミジンの誘導体である。プリンは、アデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ
）であり、ピリミジンは、シトシン（Ｃ）および、チミン（Ｔ）またはＲＮＡではウラシ
ル（Ｕ）である。デオキシリボースのＣ－１原子は、ピリミジンのＮ－１またはプリンの
Ｎ－９に結合している。ヌクレオチドはヌクレオシドのリン酸エステルでもあり、エステ
ル化は糖のＣ－３またはＣ－５に結合したヒドロキシル基で起こる。ヌクレオチドは、通
常モノ、ジ、またはトリホスフェートである。

「ヌクレオシド」は、ヌクレオチドと構造的に類似しているが、リン酸部分を欠いてい
る。ヌクレオシド類似体の一例は、標識が塩基に結合しており、糖分子に結合したリン酸
基がないものである。

塩基は通常プリンまたはピリミジンと呼ばれるが、当業者は、ワトソン－クリック塩基
対合を経るというヌクレオチドまたはヌクレオシドの性質を変えない誘導体および類似体
が利用可能であることを理解するであろう。「誘導体」または「類似体」は、そのコア構
造が親化合物のコア構造と同じであるか、または近似しているが、例えば異なる、または
追加の側鎖基などの化学的または物理的修飾を有する化合物または分子を意味し、そのた
め、誘導体ヌクレオチドまたはヌクレオシドを他の分子に連結させることが可能である。
例えば、塩基はデアザプリンであり得る。誘導体は当然ワトソン－クリック対合を経るこ
とができる。「誘導体」および「類似体」は、修飾塩基部分および／または修飾糖部分を
有する合成ヌクレオチドまたはヌクレオシド誘導体も意味する。このような誘導体および
類似体は、例えば、Scheit, Nucleotide analogs (John Wiley & Son, 1980)およびUhlma
n et al., Chemical Reviews 90:543-584, 1990で論じられている。ヌクレオチド類似体
は、修飾ホスホジエステル結合、例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、
アルキル－ホスホネート、ホスホラニリデート、ホスホルアミデート結合などを含んでな
ることもできる。

ワトソン－クリック塩基対合がなおも行われ得るという条件の下に、リンカーを介して
核酸塩基上の任意の位置に色素を結合させ得る。具体的な核酸塩基標識部位として、ピリ
ミジン塩基のＣ５位または７－デアザプリン塩基のＣ７位が挙げられる。上記のように、
リンカー基を用いて、色素をヌクレオシドまたはヌクレオチドに共有結合させ得る。

特定の実施形態において、標識ヌクレオシドまたはヌクレオチドは、酵素的に取り込み
可能かつ酵素的に伸長可能であり得る。したがって、リンカー部分は、核酸複製酵素によ
るヌクレオチドの全体的な結合および認識を化合物が著しく妨害しないように、ヌクレオ
チドを化合物に結合させるのに充分な長さであり得る。したがって、リンカーは、スペー
サー単位を含んでなることもできる。スペーサーは、例えば、切断部位または標識からヌ
クレオチド塩基を離れさせる。

本明細書に記載の新規の蛍光色素で標識されたヌクレオシドまたはヌクレオチドは、式
：

を有し得、
式中、Ｄｙｅは、色素化合物であり、Ｂは、核酸塩基、例えばウラシル、チミン、シト
シン、アデニン、グアニンなどであり、Ｌは、存在してもしなくてもよい任意のリンカー
基である。Ｒ’は、Ｈ、モノホスフェート、ジホスフェート、トリホスフェート、チオホ
スフェート、リン酸エステル類似体、反応性リン含有基に結合した－Ｏ－、またはブロッ
キング基により保護された－Ｏ－であることができる。Ｒ”は、Ｈ、ＯＨ、ホスホルアミ
ダイト、または３'－ＯＨブロッキング基であることができ、Ｒ”’は、ＨまたはＯＨで
あり、Ｒ”がホスホルアミダイトである場合、Ｒ’は、自動合成条件下でのその後のモノ
マーカップリングを可能にする酸切断可能なヒドロキシル保護基である。

いくつかの場合において、ブロッキング基は、色素化合物とは別個であり、独立してい
る、すなわち、色素化合物に結合していない。あるいは、色素は、３’－ＯＨブロッキン
グ基の全部または一部を含んでなり得る。したがって、Ｒ”は、色素化合物を含んでなっ
ても含んでならなくてもよい３’－ＯＨブロッキング基であることができる。他の代替的
な実施形態において、ペントース糖の３’炭素上にブロッキング基は存在せず、塩基に結
合した色素（または色素およびリンカーの構築物）は、例えば、３’部位以外の点からの
他のヌクレオチドの取り込みに対するブロックとして作用するのに充分なサイズまたは構
造であることができる。したがって、ブロックは、立体障害によるものあることができる
か、またはサイズ、電荷、および構造の組み合わせによるものであることができる。

ブロッキング基の使用は、修飾ヌクレオチドが取り込まれたときに伸長を停止すること
などによって、重合を制御することを可能にする。ブロッキング効果が、例えば非限定的
な例として化学的条件の変更により、または化学的ブロックの除去により、可逆的である
場合、伸長を特定の時点で停止させ、その後続けさせることができる。３’－ＯＨブロッ
キング基の非限定的な例として、参照により本明細書に援用される国際公開第２００４／
０１８４９７号および国際公開第２０１４／１３９５９６号に開示されているものが挙げ
られる。例えば、ブロッキング基は、アジドメチル（－ＣＨ_２Ｎ_３）もしくは置換型アジ
ドメチル（例えば、－ＣＨ（ＣＨＦ_２）Ｎ_３もしくはＣＨ（ＣＨ_２Ｆ）Ｎ_３）、またはア
リルであり得る。

特定の実施形態において、リンカーおよびブロッキング基は、両方とも存在し、実質的
に同様の条件下で両方とも切断可能な別個の部分である。したがって、色素化合物とブロ
ッキング基の両方を除去するために単一の処理のみが必要とされるので、脱保護工程およ
びデブロッキング工程は、より効率的であり得る。

本開示は、本明細書に記載の色素化合物を取り込んでいるポリヌクレオチドを包含する
ことも目的とする。当該ポリヌクレオチドは、ホスホジエステル結合で結合したデオキシ
リボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドからそれぞれなるＤＮＡまたはＲＮＡであり得
る。本出願に係る色素化合物で標識された１以上のヌクレオチドが存在するという条件の
下に、ポリヌクレオチドは、本明細書に記載の標識ヌクレオチド以外の天然ヌクレオチド
、非天然（または修飾）ヌクレオチド、またはそれらの任意の組み合わせを含んでなり得
る。ポリヌクレオチドは、非天然骨格結合および／または非ヌクレオチド化学修飾も含み
得る。１以上の標識ヌクレオチドを含んでなるリボヌクレオチドとデオキシリボヌクレオ
チドの混合物からなるキメラ構造体も企図されている。

本明細書に記載の標識ヌクレオチドの非限定的な例として、以下が挙げられる。

キット

本明細書で開示されているいくつかの実施形態は、本明細書に記載の新規の蛍光色素で
標識されたヌクレオシドおよび／またはヌクレオチドを含むキットである。当該キットは
、通常、色素で標識された１以上のヌクレオチドまたはヌクレオシドを１以上の他の成分
と共に含む。他の成分は、他の修飾または未修飾のヌクレオチドまたはヌクレオシドであ
り得る。例えば、色素で標識されたヌクレオチドは、非標識もしくは天然のヌクレオチド
、および／もしくは蛍光標識されたヌクレオチド、またはそれらの任意の組み合わせと組
み合わされて供給され得る。ヌクレオチドの組み合わせは、別々の個々の成分として、ま
たはヌクレオチド混合物として提供され得る。いくつかの実施形態において、キットは、
１以上のヌクレオチドを含んでなり、１以上のヌクレオチドが、本明細書に記載の新規の
蛍光化合物で標識されたヌクレオチドである。キットは、２以上の標識ヌクレオチドを含
んでなり得る。ヌクレオチドは２以上の蛍光標識で標識されていてもよい。レーザーであ
り得る単一の励起源を使用して、２以上の標識を励起し得る。

キットは、４つの標識ヌクレオチドを含み得、ここで４つのヌクレオチドうちの第１の
ヌクレオチドは、本明細書に開示されている化合物で標識されており、第２、第３、およ
び第４のヌクレオチドは、それぞれ異なる化合物で標識されており、各化合物は異なる蛍
光極大を有し、各化合物は他の３つの化合物と区別可能である。キットは、２以上の化合
物が同様の吸収極大を有するが異なるストークスシフトを有するようなものであり得る。

本明細書に記載の蛍光色素化合物、標識ヌクレオチド、またはキットは、シークエンシ
ング、発現解析、ハイブリダイゼーション解析、遺伝子解析、ＲＮＡ解析、またはタンパ
ク質結合アッセイに使用され得る。使用は、自動化シークエンシング機器での使用であり
得る。シークエンシング機器は、異なる波長で作動する２つのレーザーを含み得る。

キットが色素化合物で標識された複数の、特に２つ、さらには４つのヌクレオチドを含
んでなる場合、異なるヌクレオチドは、異なる色素化合物で標識されていてもよく、また
は１つはダークであり、色素化合物を有しなくてもよい。異なるヌクレオチドが異なる色
素化合物で標識されている場合、前記色素化合物がスペクトル的に区別可能な蛍光色素で
あることがキットの特徴である。本明細書で使用される場合、用語「スペクトル的に区別
可能な蛍光色素」は、１つのサンプル中に２以上の蛍光色素が存在する場合、蛍光検出装
置（例えば、市販のキャピラリーベースのＤＮＡシークエンシングプラットフォーム）が
区別できる波長で蛍光エネルギーを発する蛍光色素を指す。蛍光色素化合物で標識された
２つのヌクレオチドがキットの形態で供給される場合、いくつかの実施形態では、スペク
トル的に区別可能な蛍光色素を、同じ波長で、例えば同じレーザーなどによって、励起す
ることができる。蛍光色素化合物で標識された４つのヌクレオチドがキットの形態で供給
される場合、いくつかの実施形態では、スペクトル的に区別可能な蛍光色素のうちの２つ
を、両方とも、１つの波長で励起することができ、他の２つの同じスペクトル的に区別可
能な色素を、両方とも、別の波長で励起することができる。具体的な励起波長は、約４６
０ｎｍである。

一実施形態において、キットは、本明細書に記載の化合物で標識されたヌクレオチドお
よび第２の色素で標識された第２のヌクレオチドを含んでなり、色素は１０ｎｍ以上、具
体的には２０ｎｍ～５０ｎｍの吸収極大の差を有する。より具体的には、２つの色素化合
物は１５～４０ｎｍの間または２０～４０ｎｍの間のストークスシフトを有する。本明細
書で使用される場合、用語「ストークスシフト」は、同一の電子遷移の吸収スペクトルと
発光スペクトルのバンド極大の位置の間の差である。

他の実施形態において、前記キットは、蛍光色素で標識された２つの他のヌクレオチド
をさらに含んでなり、前記色素は、同じレーザーによって約４６０ｎｍ～約５４０ｎｍで
励起される。

代替的実施形態において、キットは、同じ塩基が２つの異なる化合物で標識されている
ヌクレオチドを含み得る。第１のヌクレオチドは、本明細書に記載の化合物で標識されて
いることがあり得る。第２のヌクレオチドは、スペクトル的に異なる化合物、例えば６０
０ｎｍを超える波長で吸収する「赤色」色素で標識されていることがあり得る。第３のヌ
クレオチドは、本明細書に記載の蛍光色素化合物とスペクトル的に異なる化合物との混合
物として標識されていることがあり得、第４のヌクレオチドは「ダーク」であり、標識を
含まないことがあり得る。したがって、簡単に言えば、ヌクレオチド１～４は、「緑色」
、「赤色」、「赤色／緑色」、およびダークで標識されていることがあり得る。機器類を
さらに単純化するために、単一のレーザーで励起される２つの色素で４つのヌクレオチド
を標識することができ、したがって、ヌクレオチド１～４の標識は、「緑色１」、「緑色
２」、「緑色１／緑色２」、およびダークであり得る。

他の実施形態において、キットは、ポリヌクレオチドへのヌクレオチドの取り込みを触
媒することができるポリメラーゼ酵素を含み得る。当該キットに含まれる他の成分には、
緩衝液などが含まれ得る。本明細書に記載の新規の蛍光色素で標識されたヌクレオチド、
および異なるヌクレオチドの混合物を含む他のヌクレオチド成分は、使用前に希釈される
濃縮形態でキット中に提供され得る。このような実施形態では、好適な希釈緩衝液も含ま
れ得る。
シークエンシング方法

本明細書に記載の新規の蛍光色素を含んでなるヌクレオチド（またはヌクレオシド）は
、単独でも、またはより大きな分子構造もしくはコンジュゲートに組み込まれているか、
もしくはこれらと会合していても、ヌクレオチドまたはヌクレオシドに結合した蛍光標識
の検出を必要とする分析方法に使用され得る。本出願のいくつかの実施形態は、（ａ）本
明細書に記載の１以上の標識ヌクレオチドをポリヌクレオチドに取り込むことと、（ｂ）
前記修飾ヌクレオチドに結合した新規の蛍光色素からの蛍光シグナルを検出することによ
り、ポリヌクレオチドに取り込まれた標識ヌクレオチドを検出することとを含むシークエ
ンシング方法に関する。

いくつかの実施形態において、１以上の標識ヌクレオチドは、合成工程においてポリメ
ラーゼ酵素の作用によってポリヌクレオチドに取り込まれる。しかしながら、標識ヌクレ
オチドをポリヌクレオチドに取り込む他の方法、例えば化学的オリゴヌクレオチド合成ま
たは標識オリゴヌクレオチドと非標識オリゴヌクレオチドの連結は除外されない。したが
って、ヌクレオチドをポリヌクレオチドに「取り込む」という用語は、化学的方法および
酵素的方法によるポリヌクレオチド合成を包含する。

当該方法の全ての実施形態において、標識ヌクレオチドが取り込まれているポリヌクレ
オチド鎖を鋳型鎖にアニールさせる間に、または２つの鎖を分離する変性工程の後に、検
出工程を実施し得る。さらなる工程、例えば化学的もしくは酵素的反応工程または精製工
程が、合成工程と検出工程との間に含まれ得る。特に、標識ヌクレオチドを取り込んでい
る標的鎖を、単離または精製し、次いでさらに処理するか、またはその後の分析に使用し
得る。例として、合成工程において本明細書に記載の修飾ヌクレオチドで標識された標的
ポリヌクレオチドを、その後、標識プローブまたはプライマーとして使用し得る。他の実
施形態において、合成工程（ａ）の生成物を、さらなる反応工程に付してもよく、所望に
より、これらの後続工程の生成物を精製または単離する。

合成工程の好適な条件は、標準的な分子生物学的技術に精通している者に周知であろう
。一実施形態において、合成工程は、好適なポリメラーゼ酵素の存在下で鋳型鎖に相補的
な伸長標的鎖を形成する、本開示に係る修飾ヌクレオチドを含むヌクレオチド前駆体を使
用する標準的プライマー伸長反応に類似し得る。他の実施形態において、合成工程は、そ
れ自体、標的および鋳型ポリヌクレオチド鎖のコピー由来のアニーリングした相補鎖から
なる標識二本鎖増幅産物を産生する増幅反応の一部を形成し得る。他の例示的な「合成」
工程としては、ニックトランスレーション、鎖置換型重合、ランダムプライムドＤＮＡラ
ベリングなどが挙げられる。合成工程で使用されるポリメラーゼ酵素は、本開示に係る修
飾ヌクレオチドの取り込みを触媒することができなければならない。その他の点では、ポ
リメラーゼの詳細な性質は特に限定されないが、合成反応の条件に依存し得る。例として
、合成反応がサーモサイクリングを用いて行われる場合、熱安定性ポリメラーゼが必要と
されるが、熱安定性ポリメラーゼは、標準的なプライマー伸長反応では必須ではない場合
がある。本開示に係る修飾ヌクレオチドを取り込むことができる好適な熱安定性ポリメラ
ーゼには、国際公開第２００５／０２４０１０号または国際公開第２００６／１２０４３
３号に記載されているものが含まれる。３７℃などの低温で行われる合成反応では、ポリ
メラーゼ酵素は、必ずしも熱安定性ポリメラーゼである必要はなく、したがって、ポリメ
ラーゼの選択は、反応温度、ｐＨ、鎖置換活性などの多数の要因に依存するであろう。

特定の非限定的な実施形態において、本出願に係る長いストークスシフトを有する新規
の蛍光色素で標識された修飾ヌクレオチドまたはヌクレオシドは、核酸シークエンシング
、再シークエンシング、全ゲノムシークエンシング、一塩基多型スコアリング、ポリヌク
レオチドに取り込まれたときの修飾ヌクレオチドまたはヌクレオシドの検出を伴う他のア
プリケーション、または本出願に係る蛍光色素を含んでなる修飾ヌクレオチドで標識され
たポリヌクレオチドの使用を必要とする他のアプリケーションの方法で使用され得る。

特定の実施形態において、本出願は、ポリヌクレオチド「合成によるシークエンシング
」反応における、本明細書に記載の色素化合物を含んでなる修飾ヌクレオチドの使用を提
供する。合成によるシークエンシングは、通常、配列決定される鋳型核酸に相補的な伸長
ポリヌクレオチド鎖を形成するために、ポリメラーゼまたはリガーゼを使用して、５’か
ら３’の方向に１つ以上のヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを伸長しているポリヌ
クレオチド鎖に順次付加することを伴う。１つ以上の付加されたヌクレオチド中に存在す
る塩基の同一性は、検出または「画像化」工程において決定される。付加された塩基の同
一性は、各ヌクレオチド取り込み工程の後に決定され得る。次いで、鋳型の配列は、従来
のワトソン－クリック塩基対合規則を使用して推測され得る。一塩基の同一性の決定のた
めの本開示に係る色素で標識された修飾ヌクレオチドの使用は、例えば一塩基多型のスコ
アリングにおいて有用であり得、このような一塩基伸長反応は、本出願の範囲内である。

ある実施形態において、鋳型ポリヌクレオチドの配列は、取り込まれたヌクレオチドに
結合した蛍光標識の検出により、配列決定される鋳型ポリヌクレオチドに相補的な新生鎖
への１以上のヌクレオチドの取り込みを検出することによって決定される。鋳型ポリヌク
レオチドのシークエンシングは、好適な（または、ヘアピンの一部としてプライマーを含
むヘアピン構築物として作製された）プライマーでプライミングされ、新生鎖は、ポリメ
ラーゼ触媒反応において、プライマーの３’末端へのヌクレオチドの付加により段階的様
式で伸長される。

特定の実施形態では、異なるヌクレオチド三リン酸（Ａ、Ｔ、Ｇ、およびＣ）の各々は
、特有のフルオロホアで標識されていてもよく、制御されない重合を防ぐために３’位に
ブロッキング基も含んでなる。あるいは、４つのヌクレオチドのうちの１つは、非標識（
ダーク）であり得る。ポリメラーゼ酵素は、鋳型ポリヌクレオチドに相補的な新生鎖にヌ
クレオチドを取り込ませ、ブロッキング基は、ヌクレオチドのさらなる取り込みを防ぐ。
取り込まれていないヌクレオチドを除去し、取り込まれた各ヌクレオチドからの蛍光シグ
ナルを、レーザー励起を用いる電荷結合素子および好適な発光フィルターなどの好適な手
段によって、光学的に「読み取る」。次いで、３’ブロッキング基および蛍光色素化合物
を、特に同じ化学的方法または酵素的方法によって、除去（脱保護）して、さらなるヌク
レオチドの取り込みのために新生鎖を露出させる。典型的には、取り込まれたヌクレオチ
ドの同一性は、各取り込み工程の後に決定されるであろうが、これは、絶対に必須という
わけではない。同様に、米国特許第５，３０２，５０９号は、固体支持体上に固定化され
たポリヌクレオチドをシークエンシングする方法を開示している。当該方法は、ＤＮＡポ
リメラーゼの存在下での、固定化ポリヌクレオチドに相補的な伸長鎖への蛍光標識された
３'－ブロック化ヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｃ、およびＴの取り込みに依拠している。ポリメ
ラーゼは、標的ポリヌクレオチドに相補的な塩基を取り込むが、３’－ブロッキング基に
より、さらなる付加は防止される。次いで、取り込まれたヌクレオチドの標識を測定し、
化学的切断によってブロッキング基を除去して、さらなる重合を起こさせることができる
。合成によるシークエンシング反応で配列決定される核酸鋳型は、配列決定することが望
まれる任意のポリヌクレオチドであり得る。シークエンシング反応用の核酸鋳型は、典型
的には、シークエンシング反応においてさらなるヌクレオチドを付加するためのプライマ
ーまたは開始点として機能する遊離３’ヒドロキシル基を有する二本鎖領域を含んでなる
だろう。配列決定される鋳型の領域は、相補鎖上のこの遊離３’ヒドロキシル基をオーバ
ーハングするであろう。配列決定される鋳型のオーバーハング領域は、一本鎖であり得る
が、シークエンシング反応の開始のために遊離３’ＯＨ基を与えるように、配列決定され
る鋳型鎖に相補的な鎖上に「ニックが存在する」という条件の下に、二本鎖であることが
できる。このような実施形態では、シークエンシングは、鎖置換により進行し得る。特定
の実施形態において、遊離３’ヒドロキシル基を有するプライマーを、配列決定される鋳
型の一本鎖領域にハイブリダイズする別個の成分（例えば、短いオリゴヌクレオチド）と
して添加し得る。あるいは、配列決定されるプライマーおよび鋳型鎖はそれぞれ、例えば
ヘアピンループ構造などの分子内二重鎖を形成することができる部分的に自己相補的な核
酸鎖の一部を形成し得る。ヘアピンポリヌクレオチドおよびそれらを固体支持体に結合さ
せ得る方法は、ＰＣＴ国際公開第２００１／０５７２４８号広報および国際公開第２００
５／０４７３０１号広報に開示されている。ヌクレオチドが遊離３'－ヒドロキシル基に
連続的に付加され、結果として、５’から３’方向のポリヌクレオチド鎖の合成が起こる
。付加された塩基の性質を、必須ではないが特に各ヌクレオチド付加の後に、測定し、そ
れにより、核酸鋳型についての配列情報を与え得る。このこととの関連における核酸鎖（
またはポリヌクレオチド）へのヌクレオチドの「取り込み」という用語は、ヌクレオチド
の５’リン酸基とのホスホジエステル結合の形成を介した、核酸鎖の遊離３’ヒドロキシ
ル基へのヌクレオチドの結合を指す。

配列決定される核酸鋳型は、ＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはさらにはデオキシヌクレオ
チドおよびリボヌクレオチドからなるハイブリッド分子であり得る。核酸鋳型は、シーク
エンシング反応における鋳型のコピーを妨げないという条件の下に、天然および／または
非天然のヌクレオチドならびに天然または非天然の骨格結合を含んでなり得る。

特定の実施形態において、配列決定される核酸鋳型を、当分野において公知の好適な連
結方法によって、例えば共有結合によって、固体支持体に結合し得る。特定の実施形態に
おいて、鋳型ポリヌクレオチドを、固体支持体（例えば、シリカ系支持体）に直接結合し
得る。しかしながら、他の実施形態において、固体支持体の表面を、鋳型ポリヌクレオチ
ドの直接的な共有結合を可能にするように、またはそれ自体が非共有結合的に固体支持体
に結合し得るヒドロゲルもしくは高分子電解質多層により鋳型ポリヌクレオチドを固定化
するように、修飾し得る。

ポリヌクレオチドがシリカ系支持体に直接結合しているアレイには、ＰＣＴ国際公開第
２０００／００６７７０号広報に開示されているものなどがあり、このアレイでは、ポリ
ヌクレオチドは、ガラス上のペンダントエポキシド基とポリヌクレオチド上の内部アミノ
基との反応によって、ガラス支持体上に固定化されている。また、ＰＣＴ国際公開第２０
０５／０４７３０１号広報は、硫黄系求核剤と固体支持体との反応により、ＳＭＡの作製
における使用等のため、固体支持体に結合させたポリヌクレオチドのアレイを開示してい
る。固体支持鋳型ポリヌクレオチドのさらに他の例には、鋳型ポリヌクレオチドがシリカ
系または他の固体支持体上に支持されたヒドロゲルに結合している場合がある。ＰＣＴ国
際公開第００／３１１４８号広報、国際公開第０１／０１１４３号広報、国際公開第０２
／１２５６６号広報、国際公開第０３／０１４３９２号広報、国際公開第００／５３８１
２号広報、および米国特許第６，４６５，１７８号に記載されているように、シリカ系支
持体は、典型的には、ヒドロゲルおよびヒドロゲルアレイを支持するために使用される。

鋳型ポリヌクレオチドが固定化され得る具体的な表面は、ポリアクリルアミドヒドロゲ
ルである。ポリアクリルアミドヒドロゲルは、先行技術に記載されており、そのうちのい
くつかは上記で論じられている。本出願において使用され得る具体的なヒドロゲルとして
は、国際公開第２００５／０６５８１４号および米国公開第２０１４／００７９９２３号
に記載されているものが挙げられる。一実施形態において、ヒドロゲルは、ＰＡＺＡＭ（
ポリ（Ｎ－（５－アジドアセトアミジルペンチル）アクリルアミド－コ－アクリルアミド
））である。

ＤＮＡ鋳型分子は、例えば米国特許第６，１７２，２１８号に記載されているように、
シークエンシングのためにビーズまたは微粒子に結合させることができる。各ビーズが異
なるＤＮＡ配列を含むビーズライブラリーの作製の他の例は、Margulies et al., Nature
437, 376-380 (2005)；Shendure et al., Science. 309(5741):1728-1732 (2005)で見る
ことができる。記載されているヌクレオチドを用いるこのようなビーズのアレイのシーク
エンシングは、本出願の範囲内である。

配列決定される鋳型は、固体支持体上の「アレイ」の一部を形成し得、この場合、アレ
イは任意の利便性のある形態をとり得る。したがって、本開示の方法は、単分子アレイ、
クラスターアレイ、およびビーズアレイを含む、あらゆる種類の「高密度」アレイに適用
可能である。本出願の色素化合物で標識された修飾ヌクレオチドは、固体支持体上に核酸
分子を固定化することによって形成された実質的にあらゆる種類のアレイ、より詳細には
、あらゆる種類の高密度アレイ上の鋳型のシークエンシングに使用され得る。しかしなが
ら、本明細書に記載の新規の蛍光色素で標識された修飾ヌクレオチドは、クラスターアレ
イのシークエンシングにおいて特に有利である。

マルチポリヌクレオチドまたはクラスターアレイにおいて、アレイ上の別個の領域は、
複数のポリヌクレオチド鋳型分子を含んでなる。用語「クラスターアレイ」は、アレイ上
の別個の領域または部位が、光学的手段により個々に解像することができない複数のポリ
ヌクレオチド分子を含んでなるアレイを指す。アレイの形成方法に応じて、アレイ上の各
部位は、１つの個別のポリヌクレオチド分子の複数のコピー、またはさらには少数の異な
るポリヌクレオチド分子の複数のコピー（例えば、２つの相補的核酸鎖の複数のコピー）
を含んでなり得る。マルチポリヌクレオチドまたは核酸分子のクラスターアレイは、当分
野において公知の技術を使用して作製され得る。例として、国際公開第９８／４４１５１
号および国際公開第００／１８９５７号は両方とも、固定化核酸分子のクラスターまたは
「コロニー」からなるアレイを形成するために、鋳型および増幅産物の両方が固体支持体
上に固定化されたままとなる、核酸の増幅方法を記載している。これらの方法に従って作
製されたクラスターアレイ上に存在する核酸分子は、本明細書に記載の新規の蛍光色素で
標識された修飾ヌクレオチドを使用してシークエンシングするための好適な鋳型である。

本出願の色素化合物で標識された修飾ヌクレオチドは、単一分子アレイ上の鋳型のシー
クエンシングにおいても有用である。本明細書で使用される用語「単一分子アレイ」また
は「ＳＭＡ」は、固体支持体上に配置（または配列）されたポリヌクレオチド分子の集団
を指し、１つのポリヌクレオチドと集団の他の全てとの間隔は、ポリヌクレオチドの個々
の解像を達成することが可能であるようになっている。したがって、固体支持体の表面上
に固定化された標的核酸分子は、当然、光学的手段によって解像可能である。これは、使
用される特定のイメージングデバイスの解像可能な領域内に、それぞれが１つのポリヌク
レオチドを表す１以上の別個のシグナルが存在しなければならないことを意味する。

これは、アレイ上の隣接するポリヌクレオチド分子間の間隔が、１００ｎｍ以上、より
具体的には２５０ｎｍ以上、さらにより具体的には３００ｎｍ以上、なおいっそう具体的
には３５０ｎｍ以上である場合に達成され得る。したがって、各分子は個々に解像可能で
あり、単一分子の蛍光点として検出可能であり、前記単一分子の蛍光点からの蛍光も単一
段階のフォトブリーチングを示す。

用語「個々に解像」および「個々の解像」は、視覚化したときに、アレイ上の１つの分
子をその隣接分子と区別することが可能であることを明示するために本明細書において使
用される。アレイ上の個々の分子間の間隔は、ある程度、個々の分子を解像するために使
用される具体的な技術によって決められるであろう。単一分子アレイの一般的特徴は、Ｐ
ＣＴ国際公開第２０００／００６７７０号広報および国際公開第２００１／０５７２４８
号広報を参照することによって理解されよう。本開示の修飾ヌクレオチドの一つの用途は
、合成によるシークエンシング反応におけるものであるが、当該標識ヌクレオチドの有用
性は、当該方法に限定されない。実際、ヌクレオチドは、ポリヌクレオチドに取り込まれ
たヌクレオチドに結合した蛍光標識の検出を必要とするシークエンシング方法に有利に使
用され得る。

特に、本出願の色素化合物で標識された修飾ヌクレオチドは、自動化蛍光シークエンシ
ングプロトコル、特にサンガーと共同研究者の鎖停止配列決定法に基づく蛍光色素－ター
ミネーターサイクルシークエンシングに使用され得る。当該方法は、通常、プライマー伸
長シークエンシング反応において蛍光標識ジデオキシヌクレオチドを取り込むために酵素
およびサイクルシークエンシングを使用する。いわゆるサンガー配列決定法、および関連
プロトコル（サンガー型）は、標識ジデオキシヌクレオチドを用いるランダム化鎖停止に
依拠する。

したがって、本開示は、３’位および２’位の両方にヒドロキシル基を欠くジデオキシ
ヌクレオチドである本明細書に記載の色素化合物で標識された修飾ヌクレオチドも包含し
、当該修飾ジデオキシヌクレオチドは、サンガー型配列決定法などにおける使用に好適で
ある。
製造方法

または式（ＩＩｂ）

の化合物と式（ＩＩＩ）

の化合物を反応させて、

を形成することを含み、不確定要素Ｒ^１、Ｒ^１’、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６、Ｘ、
ｍ、およびｎは、式（Ｉ）の化合物の開示において上記で定義されており、Ｒ”は、Ｈ、
置換されていてもよいアルキル、アルケニル、アルキニル、アミノアルキル、ハロアルキ
ル、ヘテロアルキル、アルコキシアルキル、スルホ、置換されていてもよいアリール；置
換されていてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいカルボシクリル、および置換
されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択される。

または式（ＩＩｂ）

の化合物と式（ＩＩＩａ）

の化合物を反応させて、

または式（ＩＩｂ）

の化合物と式（ＩＩＩｂ）

の化合物を反応させて、

式（Ｉａ）の化合物の製造は、式（ＩＩａ）または（ＩＩｂ）の出発物質を式（ＩＩＩ
）の中間化合物と、好ましくは有機溶媒中１対１のモル比で、触媒を用いて、または触媒
を用いずに、反応させることによって達成することができる。有機触媒（例えば、トリフ
ルオロ酢酸またはメタンスルホン酸）および無機触媒（例えば、リン酸または硫酸）の両
方を使用し得る。いくつかの実施形態において、製造は、溶媒なしで、または溶媒として
触媒を使用して達成し得る。

式（Ｉａ’）または（Ｉｂ）の化合物の製造は、有機溶媒中の式（Ｉａ）の出発物質を
、例えばカルボジイミド、Ｏ－（ベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’
－テトラメチルウロニウム塩、ＢＯＰ、またはＰｙＢＯＰを活性化試薬として用いて、室
温で最初に酸活性化し、続いてカップリング工程のための適当なヒドロキシ誘導体ＨＯＲ
^７または式（ＩＶ）のアミンとの反応により、達成することができる。

式（Ｖ）、（Ｖａ）、または（Ｖｂ）の化合物は、式（Ｉａ）、（Ｉａ’）、または（
Ｉｂ）の化合物の製造において上述したのと同様の合成スキームに従って製造し得る。

式（Ｉ）の化合物は、いくつかの有機反応において、例えば新規の色素合成用の出発材
料として求電子性芳香族置換反応において使用され得る。例えば、スルホン化反応による
いくつかのシアニン色素分子の修飾が当該誘導体の蛍光特性を改良し得ることは、これま
でにAlan S. Waggoner (Bioconjugate Chemistry, 1993, 4(2):105-111；米国特許公開第
２０１５／０２７４９７６号も参照)によって実証されている。

化合物（Ｉ）のスルホン化は、三酸化硫黄との反応によって、三酸化硫黄誘導体または
溶液との反応によって、例えば硫酸中で達成することができる。

化合物（Ｉ）のスルホクロル化は、クロロスルホン酸との反応によって達成することが
できる。

スルホン酸基またはクロロスルホン酸基を含む式（Ｉ）の化合物は、例えば、アンモニ
ア、式（ＩＶ）の第一級または第二級アミンと反応させることによって、さらに修飾する
ことができ、

不確定要素Ｒ^１、Ｒ^１’、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６、Ｒ^７、Ｒ^８、Ｒ^９、Ｘ、ｎ
は、式（Ｉ）の化合物の開示において上記で定義されている。

他の実施形態を、特許請求の範囲を限定することを決して意図するものではない以下の
実施例において、さらに詳細に開示する。
式（Ｉａ）の化合物の合成の一般的な手順

エチルベンゾチアゾリル－２酢酸（２．２ｇ，０．０１ｍｏｌ）とヒドロキシベンゾイ
ル安息香酸の適当な誘導体（０．０１１ｍｏｌ）との混合物を濃硫酸（５ｍＬ）に溶解し
た。この反応混合物を室温で１時間撹拌し、次いで、反応が完了するまで、例えば８０～
１２０℃で１～２時間加熱した。反応混合物を氷（約５０ｇ）に注ぎ入れ、生成物を濾過
し、水で洗浄した。多くの場合、最終生成物はさらなる精製を必要としない。
式（Ｉａ’）の化合物の合成の一般的な手順

式（Ｉａ）の化合物（０．００１ｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（１．５ｍＬ）に溶解した。こ
の溶液にカルボジイミド（０．００１２ｍｏｌ）または他の活性化試薬を加えた。この反
応混合物を室温で３時間撹拌し、次いで適当なヒドロキシ誘導体Ｒ^７ＯＨを加えた。反応
混合物を一晩撹拌し、次いで濾過し、氷（約５０ｇ）に注ぎ入れた。生成物を濾別し、水
で洗浄した。収率：５５～７５％。多くの場合、最終生成物はさらなる精製を必要としな
い。
式（Ｉｂ）の化合物の合成の一般的な手順

式（Ｉａ）の化合物（０．００１ｍｏｌ）を好適な無水有機溶媒（ＤＭＦ，１．５ｍＬ
）に溶解した。この溶液にＴＳＴＵ、ＢＯＰ、またはＰｙＢＯＰを活性化試薬として加え
た。この反応混合物を室温で約２０分間撹拌し、次いで適当なアミンＮＨＲ^８Ｒ^９を加え
た。反応混合物を一晩撹拌し、濾過し、過剰の活性化試薬を０．１ＭＴＥＡＢ水溶液で
クエンチした。溶媒を真空中で蒸発させ、残渣をＨＰＬＣにより精製した。収率：６５～
７５％。
実施例１
２－［３－（ベンゾチアゾール－２－イル）－９－エチル－２－オキソ－６，７，８，９
－テトラヒドロ－２Ｈ－ピラノ［３，２－ｇ］キノリン－４－イル］安息香酸（化合物Ｉ
－３）

硫酸（２ｍＬ）を丸底フラスコに入れ、次いで約０～５℃に冷却し、０．３２５ｇ（１
．０ｍｍｏｌ，１当量）の２－（１－エチル－７－ヒドロキシ－１，２，３，４－テトラ
ヒドロキノリン－６－カルボニル）安息香酸を撹拌しながら加え、次いで０．３ｇ（１．
４ｍｍｏｌ，１．４当量）の２－（ベンゾチアゾール－２－イル）酢酸エチルを加えた。
この反応混合物を室温（約２０℃）で３０分間撹拌し、次いで、１００℃で撹拌しながら
１．５時間加熱した。反応の進行をＴＬＣ（ＤＣＭ－ＭｅＯＨ，１０％）およびＬＣＭＳ
によってモニタリングした。

反応混合物を室温（約２０℃）に０．５時間置き、次いで、砕氷（約１００ｇ）と酢酸
ナトリウム（約５ｇ）との混合物に注ぎ入れた。１時間後、生成物を濾別し、中性になる
まで水で洗浄し、次いで濾液を風乾した。収率：０．３５ｇ（０．７３ｍｍｏｌ，７３％
）。最終生成物をさらに精製することなく使用した。ＭＳ（ＤＵＩＳ）：ＭＷ計算値482.
13.実測値： (-) 481 (M-1), (+) 483 (M+1). ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 12.71 (s,
1H), 8.11 - 8.02 (m, 1H), 7.96 (dd, J = 7.4, 1.6 Hz, 1H), 7.56 (tt, J = 7.5, 5.
8 Hz, 2H), 7.40 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 7.39 - 7.25 (m, 2H), 7.16 (dd, J = 6.6, 2.1
Hz, 1H), 6.67 (s, 1H), 6.35 (s, 1H), 3.48 (q, J = 7.0 Hz, 2H), 3.36 (t, J = 5.7
Hz, 2H), 2.65 - 2.55 (m, 2H), 1.79 (q, J= 6.3 Hz, 2H), 1.15 (t, J = 7.0 Hz, 3H)
.
実施例２
２－［１０－（ベンゾチアゾール－２－イル）－１，１，７，７－テトラメチル－１１－
オキソ－２，３，６，７－テトラヒドロ－１Ｈ，５Ｈ，１１Ｈ－ピラノ［２，３－ｆ］ピ
リド［３，２，１－ｉｊ］キノリン－９－イル］安息香酸（化合物Ｉ－５）

０．７５ｇ（１．９０ｍｍｏｌ，１当量）の２－（８－ヒドロキシ－１，１，７，７－
テトラメチル－２，３，６，７－テトラヒドロ－１Ｈ，５Ｈ－ピリド［３，２，１－ｉｊ
］キノリン－９－カルボニル）安息香酸と０．４４ｇ（１．９９ｍｍｏｌ，１．０４当量
）の２－（ベンゾチアゾール－２－イル）酢酸エチルとの混合物を、室温（約２０℃）で
濃硫酸（７ｍＬ）に攪拌しながら加えた。この反応混合物を室温で３０分間撹拌し、次い
で、１２０℃で撹拌しながら２．５時間加熱した。反応の進行をＴＬＣ（ＤＣＭ－ＭｅＯ
Ｈ，１０％）およびＬＣＭＳによってモニタリングした。反応混合物を室温（約２０℃）
に０．５時間置き、次いで、砕氷（約５０ｇ）と酢酸ナトリウム（約５ｇ）との混合物に
注ぎ入れた。１時間後、生成物を濾別し、中性になるまで水で洗浄し、風乾した。収率：
０．５８ｇ（１．０５ｍｍｏｌ，５５％）。最終生成物をさらに精製することなく使用し
た。ＭＳ（ＤＵＩＳ）：ＭＷ計算値550.19.実測値： (-) 549 (M-1).
実施例３
２－［３－（ベンゾチアゾール－２－イル）－７－（エチルアミノ）－６－メチル－２－
オキソ－２Ｈ－クロメン－４－イル］安息香酸（化合物Ｉ－８）

硫酸（５ｍＬ）を丸底フラスコに入れ、次いで約０～５℃に冷却し、０．７ｇ（２．３
４ｍｍｏｌ，１当量）の２－（４－（エチルアミノ）－２－ヒドロキシ－５－メチルベン
ゾイル）安息香酸を撹拌しながら加え、次いで０．７ｇ（３．１６ｍｍｏｌ，１．３５当
量）の２－（ベンゾチアゾール－２－イル）酢酸エチルを加えた。この反応混合物を室温
（約２０℃）で３０分間撹拌し、次いで、９５℃で撹拌しながら１時間加熱した。反応の
進行をＴＬＣ（ＤＣＭ－ＭｅＯＨ，１０％）およびＬＣＭＳによってモニタリングした。

反応混合物を室温（約２０℃）に０．５時間置き、次いで、砕氷（約１００ｇ）と酢酸
ナトリウム（約５ｇ）との混合物に注ぎ入れた。１時間後、生成物を濾別し、中性になる
まで水で洗浄し、風乾した。収率：１．０１ｇ（２．２２ｍｍｏｌ，９５％）。最終生成
物をさらに精製することなく使用した。ＭＳ（ＤＵＩＳ）：ＭＷ計算値456.11.実測値：
(-) 455 (M-1), (+) 457 (M+1). ¹H NMR (400 MHz, Methanol-d₄) δ 8.19 - 8.12 (m, 1
H), 7.92 - 7.78 (m, 1H), 7.64 (dd, J = 8.3, 1.1 Hz, 1H), 7.61 - 7.48 (m, 2H), 7.
43 - 7.36 (m, 1H), 7.36 - 7.26 (m, 1H), 7.21 - 7.14 (m, 1H), 6.60 (s, 1H), 6.56
(d, J = 1.1 Hz, 1H), 3.41 - 3.34 (m, 2H), 2.03 (s, 3H), 1.38 - 1.27 (m, 3H).
実施例４－１
２－［１０－（ベンゾチアゾール－２－イル）－１１－イミノ－２，３，６，７－テトラ
ヒドロ－１Ｈ，５Ｈ，１１Ｈ－ピラノ［２，３－ｆ］ピリド［３，２，１－ｉｊ］キノリ
ン－９－イル］安息香酸（化合物Ｉ－４Ａ）

硫酸（１０ｍＬ）を丸底フラスコに入れ、次いで１ｇ（２．９６ｍｍｏｌ，１当量）の
２－（８－ヒドロキシ－２，３，６，７－テトラヒドロ－１Ｈ，５Ｈ－ピリド［３，２，
１－ｉｊ］キノリン－９－カルボニル）安息香酸を撹拌しながら加え、次いで０．５７ｇ
（３．２６ｍｍｏｌ，１．１当量）の２－（ベンゾチアゾール－２－イル）アセトニトリ
ルを加えた。この反応混合物を室温（約２０℃）で３０分間撹拌し、次いで、８０℃で撹
拌しながら１．５時間加熱し、９０℃で１時間加熱した。反応の進行をＴＬＣ（ＤＣＭ－
ＭｅＯＨ，１０％）およびＬＣＭＳによってモニタリングした。

反応混合物を室温（約２０℃）に０．５時間置き、次いで、砕氷（約１００ｇ）の混合
物に注ぎ入れた。０．５時間後、生成物を濾別し、中性になるまで水で洗浄し、風乾した
。収率：０．８ｇ（１．６２ｍｍｏｌ，５５％）。最終生成物をさらに精製することなく
使用した。ＭＳ（ＤＵＩＳ）：ＭＷ計算値493.15.実測値： (-) 492 (M-1), (+) 494 (M+
1).
実施例４－２
２－［１０－（ベンゾチアゾール－２－イル）－１１－オキソ－２，３，６，７－テトラ
ヒドロ－１Ｈ，５Ｈ，１１Ｈ－ピラノ［２，３－ｆ］ピリド［３，２，１－ｉｊ］キノリ
ン－９－イル］安息香酸（化合物Ｉ－４）．

前の工程（実施例４－１）からのイミン（Ｉ－４Ａ）および水（２５ｍｌ）の懸濁液を
８０℃で５時間撹拌した。この時間が終わったとき、出発材料の赤色はほとんど消失し、
非常に強い蛍光が発生した。反応の進行をＴＬＣ（ＤＣＭ－ＭｅＯＨ，１０％）およびＬ
ＣＭＳによってモニタリングした。反応混合物を室温（約２０℃）に０．５時間置き、次
いで、生成物を濾別し、水で洗浄し、風乾した。収率：０．７７ｇ（１．５６ｍｍｏｌ，
９６％）。最終生成物をさらに精製することなく使用した。ＭＳ（ＤＵＩＳ）：ＭＷ計算
値494.13。実測値： (-) 493 (M-1), (+) 495 (M+1).
実施例５
２－［１０－（ベンゾチアゾール－２－イル）－１１－オキソ－２，３，６，７－テトラ
ヒドロ－１Ｈ，５Ｈ，１１Ｈ－ピラノ［２，３－ｆ］ピリド［３，２，１－ｉｊ］キノリ
ン－９－イル］安息香酸（化合物Ｉ－４）

硫酸（１０ｍＬ）を丸底フラスコに入れ、次いで１ｇ（２．９６ｍｍｏｌ，１当量）の
２－（８－ヒドロキシ－２，３，６，７－テトラヒドロ－１Ｈ，５Ｈ－ピリド［３，２，
１－ｉｊ］キノリン－９－カルボニル）安息香酸を撹拌しながら加え、次いで０．５７ｇ
（３．２６ｍｍｏｌ，１．１当量）の２－シアノメチルベンゾチアゾールを加えた。この
反応混合物を室温（約２０℃）で３０分間撹拌し、次いで、９５℃で撹拌しながら２時間
加熱した。反応混合物を放置して室温（約２０℃）に冷却し、次いで水と砕氷（約７５ｇ
）との混合物に注ぎ入れた。この混合物を室温で一晩撹拌し、生成物を濾別し、中性にな
るまで水で洗浄し、風乾した。最終生成物をさらに精製することなく使用した。収率：１
．０９ｇ（２．２１ｍｍｏｌ，７５％）。ＭＳ（ＤＵＩＳ）：ＭＷ計算値494.13.実測値
： (-) 493 (M-1), (+) 495 (M+1).
実施例６
２－［３－（ベンゾチアゾール－２－イル）－７－（ジメチルアミノ）－２－オキソ－２
Ｈ－クロメン－４－イル］安息香酸（化合物Ｉ－２）

０．２８５ｇ（１．０ｍｍｏｌ，１当量）の２－［４－（ジメチルアミノ）－２－ヒド
ロキシベンゾイル］安息香酸と０．２４３ｇ（１．１ｍｍｏｌ，１．１当量）の２－（ベ
ンゾチアゾール－２－イル）酢酸エチルとの混合物を、室温（約２０℃）で硫酸（５ｍＬ
）に攪拌しながら加えた。この反応混合物を室温で３時間撹拌し、次いで、１００℃で撹
拌しながら４時間加熱した。反応の進行をＴＬＣ（ＤＣＭ－ＭｅＯＨ，１０％）およびＬ
ＣＭＳによってモニタリングした。反応混合物を室温（約２０℃）に一晩置き、次いで、
水－砕氷（約１００ｇ）と酢酸ナトリウム（約５ｇ）との混合物に注ぎ入れた。１時間後
、生成物を濾別し、中性になるまで水で洗浄し、風乾した。収率：０．４２９ｇ（０．９
６ｍｍｏｌ，９７％）。最終生成物をさらに精製することなく使用した。ＭＳ（ＤＵＩＳ
）：ＭＷ計算値 442.10。実測値： (-) 441 (M-1). ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 12.
70 (s, 1H), 8.14 - 8.04 (m, 1H), 8.04 - 7.94 (m, 1H), 7.58 (h, J = 6.5 Hz, 2H),
7.43 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.40 - 7.29 (m, 2H), 7.19 (dd, J = 7.2, 1.7 Hz, 1H), 6
.78 - 6.63 (m, 3H), 3.07 (s, 6H).
実施例７－１
２－［３－（ベンゾチアゾール－２－イル）－７－（ジエチルアミノ）－２－オキソ－２
Ｈ－クロメン－４－イル］安息香酸（化合物Ｉ－１）．

硫酸（８ｍＬ）を丸底フラスコに入れ、次いで０．２５ｇ（０．８ｍｍｏｌ，１当量）
の２－［４－（ジエチルアミノ）－２－ヒドロキシベンゾイル］安息香酸を撹拌しながら
加え、次いで０．１４ｇ（０．８ｍｍｏｌ，１当量）の２－シアノメチルベンゾチアゾー
ルを加えた。この反応混合物を室温（約２０℃）で３０分間撹拌し、次いで、９５℃で撹
拌しながら２時間加熱した。この反応混合物を氷－冷水（約７５ｇ）に注ぎ入れた。この
段階で、対応するイミン中間体（Ｉ－１Ａ）が形成され、濾過により単離し得る。水中、
または水の存在下での、特に酸性条件下での有機溶媒中、イミン中間体のさらなる加水分
解を達成し得る。

この混合物を室温で一晩撹拌し、生成物を濾別し、中性になるまで水で洗浄し、風乾し
た。収率：０．３３ｇ（０．７ｍｍｏｌ，８８％）。最終生成物をさらに精製することな
く使用した。ＭＳ（ＤＵＩＳ）：ＭＷ計算値470.13.実測値： (-) 469 (M-1), (+) 471 (
M+1). ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 12.71 (s, 1H), 8.08 (dt, J = 7.6, 1.7 Hz, 1H)
, 8.03 - 7.92 (m, 1H), 7.64 - 7.52 (m, 2H), 7.45 - 7.39 (m, 1H), 7.39 - 7.27 (m,
2H), 7.19 (dd, J= 6.9, 2.3 Hz, 1H), 6.70 (d, J= 1.9 Hz, 1H), 6.69 - 6.61 (m, 2H
), 3.47 (q, J = 7.2 Hz, 4H), 1.23 - 1.05 (m, 6H).
実施例７－２
２－（７－（ジエチルアミノ）－２－オキソ－３－（６－スルホベンゾチアゾール－２－
イル）－２Ｈ－クロメン－４－イル）安息香酸（化合物Ｉ－１３）．

２－［３－（ベンゾチアゾール－２－イル）－７－（ジエチルアミノ）－２－オキソ－
２Ｈ－クロメン－４－イル］安息香酸（化合物Ｉ－１）（１．３ｇ，２．７６ｍｍｏｌ）
を丸底フラスコに入れ、高真空中で乾燥し、次いでアセトン－ドライアイス浴で冷却した
。発煙硫酸（２０％，５．８ｍＬ，２７ｍｍｏｌ）を撹拌しながら滴下した。この反応混
合物を室温で１時間撹拌し、次いで５０℃で１時間加熱し、出発物質を溶解した。反応混
合物を冷まし、無水エーテルを慎重に加えた。灰白色の吸湿性沈殿を濾別し、濾液を再度
エーテルで、次にＥｔＯＨで微細化した。淡紅色の沈殿を採取した。収率１．２１ｇ（
８０％）。最終生成物をさらに精製することなく使用した。ＭＳ（ＤＵＩＳ）：ＭＷ計算
値 550.09.実測値： (-) 549 (M-1), (+) 551 (M+1). ¹H NMR (400 MHz, TFA) δ 8.85
- 8.78 (m, 1H), 8.69 (s, 1H), 8.57 - 8.45 (m, 2H), 8.26 - 8.15 (m, 2H), 7.94 (s,
1H), 7.67 (d, J = 9.4 Hz, 1H), 7.63 - 7.56 (m, 1H), 7.45 (dd, J = 8.8, 4.5 Hz,
1H), 3.94 (q, J = 7.2 Hz, 4H), 1.38 (t, J = 7.1 Hz, 6H). ＨＰＬＣおよびＮＭＲス
ペクトル分析によると、この生成物は主に１つの異性体からなる。
実施例７－３
２－（７－（ジエチルアミノ）－２－オキソ－３－（６－クロロスルホニルベンゾチアゾ
ール－２－イル）－２Ｈ－クロメン－４－イル）安息香酸（化合物Ｉ－１４）．

クロロスルホン酸（５ｍｌ，７５ｍｍｏｌ）を氷浴で冷却し、色素Ｉ－１（１．２ｇ，
２．５５ｍｍｏｌ）を５分間かけて少しずつ撹拌しながら注意深く加えた。まとめた混合
物を室温（約２０℃）で１．５時間撹拌し、次いで、９５～１００℃で６時間加熱した。
室温に冷却した後、混合物を非常にゆっくりと約２０ｍｌの氷／水混合物に加えた。赤色
の固体が分離し、これを素早く濾別し、冷水（２×３０ｍｌ）で洗浄し、真空中で乾燥し
た。収率１．２ｇ（８３％，２．１１ｍｍｏｌ）。この化合物をさらに精製することなく
次の工程に使用した。
実施例７－４
２－（７－（ジエチルアミノ）－２－オキソ－３－（６－アミノスルホニルベンゾチアゾ
ール－２－イル）－２Ｈ－クロメン－４－イル）安息香酸（化合物Ｉ－１５）．

２－（７－（ジエチルアミノ）－２－オキソ－３－（６－クロロスルホニルベンゾチア
ゾール－２－イル）－２Ｈ－クロメン－４－イル）安息香酸（Ｉ－１４）（１．２ｇ，２
．１１ｍｍｏｌ）を、氷浴で冷却したアンモニア溶液（５ｍｌ，２５％）に、５分間かけ
て少しずつ撹拌しながら注意深く加えた。反応混合物を室温（約２０℃）で１時間撹拌し
、溶媒を真空中で室温で留去した。化合物をフラッシュカラム（シリカゲル，溶離液とし
てＤＣＭ－ＭｅＯＨ）によって精製した。収率０．３４ｇ（３０％，０．６２ｍｍｏｌ）
。この化合物は少量の他の異性体を含有し、この化合物をさらに精製することなく次の工
程に使用した。ＭＳ（ＤＵＩＳ）：ＭＷ計算値549.10.実測値： (-) 548 (M-1), (+) 550
(M+1). ¹H NMR (400 MHz, TFA) δ 8.83-8.73 (m, 1H), 8.62 (d, J = 1.6 Hz, 1H), 8.
57 (d, J= 8.9 Hz, 1H), 8.42 (dd, J = 8.9, 1.8 Hz, 1H), 8.24-8.13 (m, 2H), 7.82 (
d, J = 2.1 Hz, 1H), 7.64-7.52 (m, 2H), 7.38 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 3.90 (q, J = 7.
2 Hz, 4H), 1.37 (t, J = 7.2 Hz, 6H).
実施例８
４－ニトロフェニル２－［３－（ベンゾチアゾール－２－イル）－７－（ジエチルアミノ
）－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－４－イル］ベンゾエート（化合物Ｉ－１Ｂ）

無水ＤＭＦ（１．５ｍＬ）に、９４ｍｇ（０．２ｍｍｏｌ，１当量）の２－［３－（ベ
ンゾチアゾール－２－イル）－７－（ジエチルアミノ）－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－
４－イル］安息香酸（Ｉ－１，ＮＲ４４０）を溶解した。この溶液に、ジシクロヘキシル
カルボジイミド（６２ｍｇ，０．３ｍｍｏｌ，１．５当量）を加えた。この反応混合物を
室温で３時間撹拌し、次いでｐ－ニトロフェノール（３３ｍｇ，０．２４ｍｍｏｌ，１．
２当量）を加えた。反応混合物を一晩撹拌し、次いでジシクロヘキシル尿素を濾別した。
溶媒を室温で真空中で留去し、油状残渣を氷（約５ｇ）に注ぎ入れた。黄色の固体生成物
を濾別し、水で洗浄した。収率：７９ｍｇ（６７％，０．１３４ｍｍｏｌ）。ＭＳ（ＤＵ
ＩＳ）：ＭＷ計算値 591.15.実測値： (-) 590 (M-1), (+) 592 (M+1).
実施例９
トリエチルアンモニオ３－（２－（１０－（ベンゾチアゾール－２－イル）－１１－オキ
ソ－２，３，６，７－テトラヒドロ－１Ｈ，５Ｈ，１１Ｈ－ピラノ［２，３－ｆ］ピリド
［３，２，１－ｉｊ］キノリン－９－イル）－Ｎ－（４－（ｔｅｒｔ－ブトキシ）－４－
オキソブチル）ベンズアミド）プロパン－１－スルホネート（化合物１－９Ａ’）

化合物Ｉ－４（１５０ｍｇ，０．３ｍｍｏｌ，１当量）を無水ＤＭＦ（１．５ｍＬ）に
溶解した。この溶液に、活性化試薬として過剰のトリエチルアミン（１ｍＬ）および［（
１Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－イル）オキシ］トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウム
テトラフルオロボレート（１４０ｍｇ，０．３６ｍｍｏｌ，１．２当量）を加えた。この
反応混合物を室温で約２０分間撹拌し、次いで、３－（（３－（ｔｅｒｔ－ブトキシ）カ
ルボニル）アミノ）プロパン－１－スルホン酸（１４０ｍｇ，０．５ｍｍｏｌ，１．６当
量）を加えた。反応の進行をＴＬＣ（アセトニトリル－水，１０％）およびＬＣＭＳによ
ってモニタリングした。

反応混合物を一晩撹拌し、濾過し、過剰の活性化試薬を０．１ＭＴＥＡＢ水溶液でク
エンチした。溶媒を真空中で蒸発させ、残渣をＨＰＬＣにより精製した。収率：１８０ｍ
ｇ（０．２１ｍｍｏｌ，６９％）。ＭＳ（ＤＵＩＳ）：ＭＷ計算値 757.25.実測値：対
応するプロトン化アニオン化合物Ｉ－９Ａ：

について(-) 756 (M-1), (+) 758 (M+1)
実施例１０
トリエチルアンモニオ４－（２－（１０－（ベンゾチアゾール－２－イル）－１１－オキ
ソ－２，３，６，７－テトラヒドロ－１Ｈ，５Ｈ，１１Ｈ－ピラノ［２，３－ｆ］ピリド
［３，２，１－ｉｊ］キノリン－９－イル）－Ｎ－（３－スルホナトプロピル）ベンズア
ミド）ブタノエート（化合物Ｉ－９’）

溶媒の蒸発後の前の工程からの化合物Ｉ－９Ａ’（１８０ｍｇ，０．２１ｍｍｏｌ）を
ＤＣＭ（１５０ｍＬ）に溶解し、トリフルオロ酢酸（５ｍＬ）を加えた。反応混合物を室
温に一晩置いた。脱保護反応の進行をＴＬＣ（溶離液としてアセトニトリル－水，１０％
）およびＬＣＭＳによってモニタリングした。ＤＣＭを留去した。残渣をアセトニトリル
に溶解し、トリエチルアミン（１ｍＬ）を加えた。黄色沈殿を濾別した。ＭＳ（ＤＵＩＳ
）：ＭＷ計算値 701.19。実測値：対応するプロトン化アニオン化合物Ｉ－９：

について(-) 700 (M-1)
実施例１１
トリエチルアンモニオ３－（２－（３－（ベンゾチアゾール－２－イル）－７－（ジエチ
ルアミノ）－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－４－イル）－Ｎ－（４－（ｔｅｒｔ－ブトキ
シ）－４－オキソブチル）ベンズアミド）プロパン－１－スルホネート，（化合物Ｉ－６
Ａ’）

２－（３－（ベンゾチアゾール－２－イル）－７－（ジエチルアミノ）－２－オキソ－
２Ｈ－クロメン－４－イル）安息香酸（化合物Ｉ－１）（９４ｍｇ，０．２ｍｍｏｌ，１
当量）を無水ＤＭＡ（２ｍＬ）に溶解した。この溶液に過剰のＮ－エチル－Ｎ，Ｎ－ジイ
ソプロピルアミン（１ｍＬ）を加えた。この溶液に、活性化試薬として［（１Ｈ－ベンゾ
トリアゾール－１－イル）オキシ］トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムテトラフルオ
ロボレート（８０ｍｇ，０．２１ｍｍｏｌ，１．０４当量）を加えた。反応混合物を室温
で撹拌した。

反応の進行をＴＬＣ（溶離液としてアセトニトリル－水，１０％）によってモニタリン
グした。次に３－（（３－（ｔｅｒｔ－ブトキシ）カルボニル）アミノ）プロパン－１－
スルホン酸（７０ｍｇ，０．２５ｍｍｏｌ，１．２５当量）を加えた。反応混合物を室温
で一晩撹拌し、濾過し、過剰の活性化試薬を０．１ＭＴＥＡＢ水溶液（３ｍＬ）でクエ
ンチした。溶媒を真空中で蒸発させ、残渣をＨＰＬＣにより精製した。収率：１１３ｍｇ
（０．１３６ｍｍｏｌ，６８％）。ＭＳ（ＤＵＩＳ）：ＭＷ計算値 733.25.実測値：対
応するプロトン化アニオン化合物Ｉ－６Ａ：

について(-) 732 (M-1)
実施例１２
トリエチルアンモニオ４－（２－（３－（ベンゾチアゾール－２－イル）－７－（ジエチ
ルアミノ）－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－４－イル）－Ｎ－（３－スルホナトプロピル
）ベンズアミド）ブタノエート，（化合物１－６’）

溶媒の蒸発後の前の工程からの化合物Ｉ－６Ａ’（１８０ｍｇ，０．２１ｍｍｏｌ）を
ＤＣＭ（５０ｍＬ）に溶解し、トリフルオロ酢酸（２．５ｍＬ）を加えた。反応混合物を
室温に撹拌しながら一晩置いた。反応の進行をＴＬＣ（溶離液としてアセトニトリル－水
，１０％）によってモニタリングした。溶媒を留去し、残渣をアセトニトリルに溶解し、
トリエチルアミン（１．８ｍＬ）を加えた。アセトニトリルおよび過剰のトリエチルアミ
ンを留去した。フラスコ中の残渣に無水ジエチルエーテルを加え、生成物を黄色の結晶性
沈殿として形成させ、濾別した。ＭＳ（ＤＵＩＳ）：ＭＷ計算値 677.19.実測値：酸Ｉ
－６：

について(-)676(M-1)
実施例１３
ｔｅｒｔ－ブチル４－（２－（１０－（ベンゾチアゾール－２－イル）－１１－オキソ－
２，３，６，７－テトラヒドロ－１Ｈ，５Ｈ，１１Ｈ－ピラノ［２，３－ｆ］ピリド［３
，２，１－ｉｊ］キノリン－９－イル）ベンズアミド）ブタノエート（Ｉ－１０Ａ）

化合物Ｉ－４（９７ｍｇ，０．１９６ｍｍｏｌ，１当量）を蒸留したばかりの無水ＤＭ
Ｆ（２．５ｍＬ）に溶解した。この溶液に、活性化試薬として過剰のＮ－エチル－Ｎ，Ｎ
－ジイソプロピルアミン（０．２５３ｍｇ，１．９６１ｍｍｏｌ，１０当量）および［（
１Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－イル）オキシ］トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウム
テトラフルオロボレート（１１３ｍｇ，０．２９４ｍｍｏｌ，１．５当量）を加えた。反
応混合物を室温で約２０分間撹拌し、次いで、ｔｅｒｔ－ブチル４－アミノブタノエート
ハイドロクロライド（５８ｍｇ，０．２９４ｍｍｏｌ，１．５当量）を加えた。反応の進
行をＴＬＣ（アセトニトリル－水，１０％）およびＬＣＭＳによってモニタリングした。

反応混合物を一晩撹拌し、濾過し、過剰の活性化試薬を０．１ＭＴＥＡＢ水溶液でク
エンチした。溶媒を真空中で蒸発させ、残渣をＨＰＬＣにより精製した。収率：１０５ｍ
ｇ（０．１６５ｍｍｏｌ，８４％）。ＭＳ（ＤＵＩＳ）：ＭＷ計算値635.25.実測値： (-
) 634 (M-1), (+) 636 (M+1).
実施例１４
４－（２－（１０－（ベンゾチアゾール－２－イル）－１１－オキソ－２，３，６，７－
テトラヒドロ－１Ｈ，５Ｈ，１１Ｈ－ピラノ［２，３－ｆ］ピリド［３，２，１－ｉｊ］
キノリン－９－イル）ベンズアミド）ブタン酸（化合物Ｉ－１０）

溶媒の蒸発後の前の工程からの化合物Ｉ－１０Ａ（６４ｍｇ，０．１ｍｍｏｌ）をＤＣ
Ｍ（２５ｍＬ）に溶解し、トリフルオロ酢酸（３．５ｍＬ）を加えた。反応混合物を室温
に一晩置いた。反応の進行をＴＬＣ（溶離液としてアセトニトリル－水，１０％）および
ＬＣＭＳによってモニタリングした。溶媒を留去した。残渣をアセトニトリルに溶解し、
トリエチルアミン（１ｍＬ）を加えた。アセトニトリルおよび過剰のトリエチルアミンを
留去した。フラスコ内の残渣を真空中で一晩乾燥させ、次いで石油エステル（２５ｍｌ）
と共に１時間超音波処理した。黄色沈殿を濾別した。ＭＳ（ＤＵＩＳ）：ＭＷ計算値 57
9.18.実測値： (-) 578 (M-1), (+) 580 (M+1).
実施例１５
４－（２－（１０－（ベンゾチアゾール－２－イル）－１１－オキソ－２，３，６，７－
テトラヒドロ－１Ｈ，５Ｈ，１１Ｈ－ピラノ［２，３－ｆ］ピリド［３，２，１－ｉｊ］
キノリン－９－イル）ベンズアミド）ブタン酸（化合物Ｉ－７）

化合物１－１Ｂ（１８０ｍｇ，０．３ｍｍｏｌ，１当量）を無水ＤＭＦ（５ｍＬ）に溶
解し、ジメチルアミノピリジン（５６ｍｇ，０．４５ｍｍｏｌ，１．５当量）を加えた。
この反応混合物に４－アミノブタン酸（４７ｍｇ，０．４５ｍｍｏｌ，１．５当量）を加
え、この反応混合物を室温に一晩置いた。反応の進行をＴＬＣ（溶離液としてアセトニト
リル－水，１０％）およびＬＣＭＳによってモニタリングした。溶媒を室温で真空中で留
去した。残渣を水（２５ｍｌ）で希釈し、生成物を黄色沈殿として形成させ、濾別した。
ＭＳ（ＤＵＩＳ）：ＭＷ計算値 555.18.実測値： (-) 554 (M-1), (+) 556 (M+1).
実施例１６
２－（３－（５－クロロベンゾオキサゾール－２－イル）－７－（ジエチルアミノ）－２
－オキソ－２Ｈ－クロメン－４－イル）安息香酸（化合物Ｉ－１６）

０．３１３ｇ（１．０ｍｍｏｌ，１当量）の２－［４－（ジエチルアミノ）－２－ヒド
ロキシベンゾイル］安息香酸と０．２６３ｇ（１．１ｍｍｏｌ，１．１当量）の２－（５
－クロロベンゾオキサゾール－２－イル）酢酸エチルとの混合物を、室温（約２０℃）で
硫酸（５ｍＬ）に攪拌しながら加えた。この反応混合物を室温で３時間撹拌し、次いで、
１００℃で撹拌しながら４時間加熱した。反応の進行をＴＬＣ（溶離液としてＤＣＭ－Ｍ
ｅＯＨ，１０％）およびＬＣＭＳによってモニタリングした。反応混合物を室温（約２０
℃）に一晩置き、次いで、水－砕氷（約１００ｇ）と酢酸ナトリウム（約５ｇ）との混合
物に注ぎ入れた。１時間後、生成物を濾別し、中性反応（ｐＨ約７）になるまで水で洗浄
し、風乾した。収率：０．４５３ｇ（０．９３ｍｍｏｌ，９３％）。最終生成物をさらに
精製することなく使用した。ＭＳ（ＤＵＩＳ）：ＭＷ計算値488.11.実測値： (-) 487 (M
-1).
実施例１７
充分に機能性のヌクレオチドコンジュゲートの合成の一般的な手順

新規の色素－ヌクレオチドコンジュゲートを、化合物（Ｉ）または化合物（Ｖ－Ｏ）か
ら、適当なヌクレオチド誘導体と結合させることにより合成した。

無水ＤＭＡ（２．５ｍＬ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチル－Ｏ－（Ｎ－スクシン
イミジル）ウロニウムテトラフルオロボレート（２０ｍｇ，６０μｍｏｌ）、およびヒュ
ーニッヒ塩基（０．０５ｍＬ）を適当な色素の乾燥サンプル（５０μｍｏｌ）に加えた。
反応混合物を室温で撹拌した。ＴＬＣ（アセトニトリル－水，１０％）によれば、活性化
は通常２０～３０分で完了した。活性化が完了した後、ＤＭＡ（０．７５ｍＬ）と水（０
．３０ｍＬ）との混合物中のトリエチルアンモニウム塩（５５μｍｏｌ）としてのｐｐｐ
Ｃ－ＬＮ３の溶液を反応混合物に加えた。反応混合物を室温で窒素雰囲気下で一晩撹拌し
た。反応混合物を氷浴で約４℃に冷却し、次いで０．１ＭＴＥＡＢ（５ｍＬ）の水溶液
を加え、混合物を室温で１０分間撹拌した。反応混合物を０．０５ＭＴＥＡＢ水溶液中
の約２５ｇのＤＥＡＥ Sephadex樹脂懸濁液を含むカラムに加え、ＴＥＡＢ（０．１Ｍか
ら１Ｍまでの濃度勾配）で洗浄した。着色画分を採取し、蒸発させ、次いで再び水と共蒸
発させて、さらにＴＥＡＢを除去し、減圧乾燥した。次いで、残渣をＴＥＡＢ０．１Ｍ
に再溶解した。この溶液を０．２ｎｍ孔径のシリンジフィルターを通して濾過した。生成
物を、アセトニトリル－０．１ＭＴＥＡＢを含むＣ１８逆相カラムを使用するＨＰＬＣ
によって精製した。収率：６０～７５％。

上記の一般的な手順を用いて、以下のヌクレオチドコンジュゲートを作製した。

実施例１８

本実施例では、本明細書に記載の様々な蛍光色素および対応するヌクレオチドコンジュ
ゲートのスペクトル特性を試験し、市販の色素と比較した。

テーブル１Ａは、エタノール溶液中の吸収が同じスペクトル領域にあるいくつかの例示
的な市販の色素と比較した、本明細書に記載の新規の蛍光色素のスペクトル特性を示す。
本出願の新規の蛍光色素の各々は、Star440sxと比較してより長いストークスシフトを有
することを観察することができる。

さらに、色素Ｉ－１のスペクトル特性をメタノール溶液中のスルホン化色素Ｉ－１３お
よびＩ－１５と比較し、結果をテーブル１Ｂにまとめた。これらのデータは、スルホン化
誘導体Ｉ－１３およびＩ－１５が、対応する非置換型類似体Ｉ－１と比較した場合に、溶
液中で２～５倍強い蛍光を有することを実証している。これらの結果は、スルホン化色素
をバイオマーカーとして使用できる可能性を実証している。

図１は、同じスペクトル領域に吸収を有する市販の色素Star440sx（Universal Scannin
g Mixture中の溶液；色素は４６０ｎｍで励起された）と比較した本出願の新規の蛍光色
素の蛍光スペクトルを示す。より大きいストークスシフトに起因して、これらの新規に開
発された色素は、４６０ｎｍでの励起光とより良好に分離して、検出領域においてより多
くのシグナルを与えることができる。

テーブル２は、同じスペクトル領域に吸収を有する市販の色素で標識した適当なヌクレ
オチドと比較した、新規の色素で標識したＣ－ヌクレオチドの相対的蛍光強度を示す。本
明細書に記載の新規の蛍光色素は、それらのより強い蛍光およびより大きなストークスシ
フトに起因して、４６０ｎｍの光で励起したときに５７０ｎｍ（検出領域）で６０～４０
０％多いシグナルを与えることができることが示されている。

テーブル３は、本明細書に記載の新規の蛍光色素で標識されたＣ－ヌクレオチドの溶液
中のスペクトル特性を示しており、これは、本出願の蛍光色素で標識されたヌクレオチド
の大部分が、同じスペクトル領域の市販の色素と比較して、より長いストークスシフトを
有するというテーブル１の観察と一致する。

図２は、本明細書に記載の新規の蛍光色素で標識されたＣ－ヌクレオチド（黒色で示さ
れている）のシークエンシング分析への有用性を示す。このシークエンシング例では、２
チャンネル検出法を使用した。本明細書に記載の２チャンネル法に関して、その開示がそ
の全体で参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２０１３／００７９２３２
号に記載の方法およびシステムを利用して、核酸をシークエンシングすることができる。
２チャンネル検出では、第１のチャンネルで検出される第１のヌクレオチド型、第２のチ
ャンネルで検出される第２のヌクレオチド型、第１と第２のチャンネル両方で検出される
第３のヌクレオチド型、およびどちらのチャネルにおいても検出されないか、または極僅
かにしか検出されない、標識を欠く第４のヌクレオチド型を提供することによって、核酸
をシークエンシングすることができる。

図２Ａおよび２Ｂの各々において、「Ｇ」ヌクレオチドは、非標識であり、左下の雲と
して示されている。右上の雲として示されている、２つの標識された「Ａ」ヌクレオチド
の混合物があり、一方は０．５μＭのクマリン誘導体色素で標識されおり、他方は１．５
μＭのベンゾピラン誘導体Ｉ－６で標識されている。ＮＲ５５０Ｓ０色素で標識された「
Ｔ」ヌクレオチドからのシグナルは、左上の雲によって示されており、標識された「Ｃ」
ヌクレオチドシグナルは、右下の雲によって示されている。Ｘ軸は一方のチャンネルの信
号強度を示し、Ｙ軸は他方のチャンネルの信号強度を示す。図２Ａおよび図２Ｂにおいて
、ｆｆＣは、それぞれＩ－６およびＩ－１で標識されている。実験の設定：機器：Ｍ１５
サイクル数：Ｃ－Ｉ－６はＣ５，Ｃ－Ｉ－１はＣ９，シークエンシングライブラリー：標
準PhiX。色素Ｉ－６およびＩ－１で標識された充分に機能性のＣ－ヌクレオチドコンジュ
ゲートが充分なシグナル強度およびより良好な雲の分離を与えたことが示されている。

図３は、青色（４６０ｎｍ）または緑色（５３０ｎｍ）の光で励起されたときの、様々
な蛍光色素で標識されたＣ－ヌクレオチドの相対的蛍光強度を示す。この棒グラフは、示
されている色素を取り込んだクラスターの未処理の強度を示す。各測定は手動でＥｘ４６
０ｎｍで行い、６０℃で１秒間露光した。MTS [MiSeq R&D (Test) Software]をM15で使用
して画像を撮り、画像解析ツールFirecrestを使用して強度データを抽出した。

結果は、同じスペクトル領域の長いストークスの市販の色素と比較したときに、本明細
書に記載の新規の蛍光色素で標識されたｆｆＣが最大３００％明るいシグナルを与えたこ
とを示す。

図４は、２つの異なる温度（２２℃の室温および６０℃の高温）で青色（４６０ｎｍ）
光で励起されたときの、市販および新規の蛍光色素Ｉ－６で標識されたコンジュゲート化
Ｃ－ヌクレオチドの相対輝度を示す。新規の蛍光色素Ｉ－６で標識されたｆｆＣは、両方
の温度で、一部のスペクトル領域について、市販の長いストークスの色素Star440lsで標
識されたｆｆＣと比較して、より明るいシグナルを与えた。

本明細書で使用される見出しおよび小見出しは、読みやすくするためだけのものであり
、本開示の範囲を定義または限定することが意図されたものではない。上記の本出願は、
方法および材料における改変、ならびに製造方法および機器における変更をしやすい化合
物および方法に関する。このような改変は、本開示を検討することにより、または本明細
書に開示されているアプリケーションを実施することにより、当業者に明らかになるであ
ろう。したがって、本開示が本明細書に開示されている具体的な実施形態に限定されるこ
とではなく、本開示の真の範囲および精神に入る全ての改変および代替を包含することが
意図されている。

Claims

式（Ｉ）の化合物またはそのメソメリー型であって、

式中、各Ｒ^１、Ｒ^２、およびＲ^１’が、独立して、Ｈ、アルキル、置換型アルキル、ア
ルコキシ、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルコキシアルキ
ル、アミノ、アミノアルキル、アミノスルホニル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ヒドロキ
シアルキル、ヘテロアルキル、Ｃ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、Ｃ－アミド、Ｎ－アミ
ド、ニトロ、スルホニル、スルホ、スルフィノ、スルホネート、スルホニルハライド、Ｓ
－スルホンアミド、Ｎ－スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換さ
れていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていて
もよいヘテロシクリルからなる群から選択され、
あるいは、Ｒ^１およびＲ^１’が、一緒になって、それらが結合している原子と共に、置
換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていても
よいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択さ
れる環または環系を形成し、
各Ｒ^３およびＲ^４が、独立して、Ｈ、アルキル、置換型アルキル、アルケニル、アルキ
ニル、アミノアルキル、ハロアルキル、ヘテロアルキル、アルコキシアルキル、スルホニ
ルヒドロキシド、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール
、置換されていてもよいカルボシクリル、および置換されていてもよいヘテロシクリルか
らなる群から選択され、
あるいは、Ｒ^１およびＲ^３が、それらが結合している原子と共に、置換されていてもよ
い５～１０員のヘテロアリール、または置換されていてもよい５～１０員のヘテロシクリ
ルからなる群から選択される環または環系を形成し、
あるいは、Ｒ^２およびＲ^４が、それらが結合している原子と共に、置換されていてもよ
い５～１０員のヘテロアリール、および置換されていてもよい５～１０員のヘテロシクリ
ルからなる群から選択される環または環系を形成し、
Ｒ^５およびＲ^６が、独立して、アルキル、置換型アルキル、アルコキシ、アルケニル、
アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルコキシアルキル、アミノ、アミノアル
キル、アミノスルホニル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヘテロアル
キル、Ｃ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、ニトロ、スルホニル
、スルホ、スルフィノ、スルホネート、スルホニルハライド、Ｓ－スルホンアミド、Ｎ－
スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール
、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリルか
らなる群から選択され、
Ｒが、－ＯＲ^７または－ＮＲ^８Ｒ^９から選択され、
Ｒ^７が、Ｈ、アルキル、置換型アルキル、置換されていてもよいアリール、置換されて
いてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいカルボシクリル、および置換されてい
てもよいヘテロシクリルからなる群から選択され、
各Ｒ^８およびＲ^９が、独立して、Ｈ、アルキル、置換型アルキル、アルケニル、アルキ
ニル、アミノアルキル、カルボキシアルキル、スルホナトアルキル、ハロアルキル、ヘテ
ロアルキル、アルコキシアルキル、スルホ、置換されていてもよいアリール、置換されて
いてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいカルボシクリル、および置換されてい
てもよいヘテロシクリルからなる群から選択され、
Ｘが、Ｏ、Ｓ、ＮＲ^１０、およびＳｅからなる群から選択され、
Ｒ^１０が、Ｈ、アルキル、置換型アルキル、置換されていてもよいアリール、置換され
ていてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいカルボシクリル、および置換されて
いてもよいヘテロシクリルからなる群から選択され、
ｍが、０～４から選択される整数であり、
ｎが、０～４から選択される整数であり、ただし、
各Ｒ^１、Ｒ^１’、およびＲ^２がＨであり、各Ｒ^３およびＲ^４がエチルであり、各ｍおよ
びｎが０であり、Ｒが－ＮＨＣＨ（ＣＨ_３）ＣＨ_２ＯＨである場合、ＸはＯ、Ｓ、または
Ｓｅから選択され、
各Ｒ^１、Ｒ^１’、およびＲ^２がＨであり、各Ｒ^３およびＲ^４がエチルであり、各ｍおよ
びｎが０であり、Ｒが－ＯＨである場合、ＸはＳまたはＳｅから選択され、
各Ｒ^１、Ｒ^１’、およびＲ^２がＨであり、各Ｒ^３およびＲ^４がエチルであり、ｍが１で
あり、Ｒ^５がメチルであり、ｎが０であり、Ｒが－ＯＨまたは－ＯＥｔである場合、Ｘは
Ｓ、ＮＲ^１０、またはＳｅから選択され、
各Ｒ^１、Ｒ^１’、およびＲ^２がＨであり、各Ｒ^３およびＲ^４がエチルであり、ｍが１で
あり、Ｒ^５が－Ｓ（Ｏ_２）Ｅｔであり、ｎが０であり、Ｒが－ＯＨまたは－ＯＥｔである
場合、ＸはＳ、ＮＲ^１０、またはＳｅから選択される、化合物。
ＸがＳまたはＯである、請求項１に記載の化合物。
Ｒが－ＯＲ^７である、請求項１または２に記載の化合物。
Ｒ^７がＨまたはアルキルである、請求項１～３のいずれか一項に記載の化合物。
Ｒが－ＮＲ^８Ｒ^９である、請求項１または２に記載の化合物。
各Ｒ^８およびＲ^９がＨである、請求項５に記載の化合物。
Ｒ^８がＨであり、Ｒ^９がアルキルまたは置換型アルキルである、請求項５に記載の化合
物。
Ｒ^８およびＲ^９の両方がアルキルまたは置換型アルキルである、請求項５に記載の化合
物。
前記置換型アルキルが、カルボキシルまたはスルホニルヒドロキシドで置換されている
アルキルから選択される、請求項７または８に記載の化合物。
各Ｒ^１、Ｒ^１’、およびＲ^２がＨである、請求項１～９のいずれか一項に記載の化合物
。
Ｒ^１、Ｒ^１’、およびＲ^２の少なくとも１つがアルキルである、請求項１～９のいずれ
か一項に記載の化合物。
各Ｒ^３およびＲ^４がアルキルである、請求項１～１１のいずれか一項に記載の化合物。
各Ｒ^３およびＲ^４がメチルまたはエチルから選択される、請求項１２に記載の化合物。
Ｒ^３がＨであり、Ｒ^４がアルキルである、請求項１～１１のいずれか一項に記載の化合
物。
Ｒ^１およびＲ^３が、それらが結合している原子と共に、置換されていてもよい３～７員
のヘテロシクリルを形成する、請求項１～９のいずれか一項に記載の化合物。
Ｒ^１およびＲ^３が、それらが結合している原子と共に、置換されていてもよい６員のヘ
テロシクリルを形成する、請求項１５に記載の化合物。
Ｒ^４がＨまたはアルキルから選択される、請求項１５または１６に記載の化合物。
Ｒ^１’およびＲ^２のうちの少なくとも一方がＨである、請求項１５～１７のいずれか一
項に記載の化合物。
Ｒ^２およびＲ^４が、それらが結合している原子と共に、置換されていてもよい３～７員
のヘテロシクリルを形成する、請求項１～９のいずれか一項に記載の化合物。
Ｒ^２およびＲ^４が、それらが結合している原子と共に、置換されていてもよい６員のヘ
テロシクリルを形成する、請求項１９に記載の化合物。
Ｒ^３がＨまたはアルキルから選択される、請求項１９または２０に記載の化合物。
Ｒ^１’およびＲ^１のうちの少なくとも一方がＨである、請求項１９～２１のいずれか一
項に記載の化合物。
Ｒ^１およびＲ^３が、それらが結合している原子と共に、置換されていてもよい３～７員
のヘテロシクリルを形成し、Ｒ^２およびＲ^４が、それらが結合している原子と共に、置換
されていてもよい３～７員のヘテロシクリルを形成する、請求項１～９のいずれか一項に
記載の化合物。
Ｒ^１およびＲ^３が、それらが結合している原子と共に、置換されていてもよい３～７員
のヘテロシクリルを形成し、Ｒ^２およびＲ^４が、それらが結合している原子と共に、置換
されていてもよい６員のヘテロシクリルを形成する、請求項２３に記載の化合物。
前記へテロシクリルが１つのヘテロ原子を含む、請求項１５～２４のいずれか一項に記
載の化合物。
前記ヘテロシクリルが１以上のアルキルで置換されている、請求項２４に記載の化合物
。
ｍが０である、請求項１～２６のいずれか一項に記載の化合物。
ｍが１であり、Ｒ^５がハロ、スルホ、アミノスルホニル、またはスルホニルハライドか
ら選択される、請求項１～２６のいずれか一項に記載の化合物。
ｎが０である、請求項１～２８のいずれか一項に記載の化合物。
またはそれらのメソメリー異性体からなる群から選択される、請求項１または２に記載の
化合物。
前記化合物が、Ｃ（＝Ｏ）Ｒを介してヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドに共有結
合しており、Ｒが－ＯＲ^７であり、Ｒ^７が置換型アルキルである、請求項１または２に記
載の化合物。
前記化合物が、Ｃ（＝Ｏ）Ｒを介してヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドに共有結
合しており、Ｒが－ＮＲ^８Ｒ^９であり、Ｒ^８またはＲ^９の少なくとも一方が置換型アルキ
ルである、請求項１または２に記載の化合物。
約６０ｎｍ～約１００ｎｍの範囲のストークスシフトを有する式（Ｖ）の蛍光化合物で
あって、

式中、各Ｒ^１、Ｒ^１’、およびＲ^２が、独立して、Ｈ、アルキル、置換型アルキル、ア
ルコキシ、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルコキシアルキ
ル、アミノ、アミノアルキル、アミノスルホニル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ヒドロキ
シアルキル、ヘテロアルキル、Ｃ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、Ｃ－アミド、Ｎ－アミ
ド、ニトロ、スルホニル、スルホ、スルフィノ、スルホネート、スルホニルハライド、Ｓ
－スルホンアミド、Ｎ－スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換さ
れていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていて
もよいヘテロシクリルからなる群から選択され、
あるいは、Ｒ^１およびＲ^１’が、一緒になって、それらが結合している原子と共に、置
換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていても
よいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択さ
れる環または環系を形成し、
各Ｒ^３およびＲ^４が、独立して、Ｈ、アルキル、置換型アルキル、アルケニル、アルキ
ニル、アミノアルキル、ハロアルキル、ヘテロアルキル、アルコキシアルキル、スルホ、
置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、置換されていて
もよいカルボシクリル、および置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択
され、
あるいは、Ｒ^１およびＲ^３が、それらが結合している原子と共に、置換されていてもよ
い５～１０員のヘテロアリール、または置換されていてもよい５～１０員のヘテロシクリ
ルからなる群から選択される環または環系を形成し、
あるいは、Ｒ^２およびＲ^４が、それらが結合している原子と共に、置換されていてもよ
い５～１０員のヘテロアリール、および置換されていてもよい５～１０員のヘテロシクリ
ルからなる群から選択される環または環系を形成し、
Ｒ^Ｈｅｔが、１以上のＲ^５で置換されていてもよいヘテロアリールであり、
各Ｒ^５およびＲ^６が、独立して、アルキル、置換型アルキル、アルコキシ、アルケニル
、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルコキシアルキル、アミノ、アミノア
ルキル、アミノスルホニル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヘテロア
ルキル、Ｃ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、ニトロ、スルホニ
ル、スルホ、スルフィノ、スルホネート、スルホニルハライド、Ｓ－スルホンアミド、Ｎ
－スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリー
ル、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリル
からなる群から選択され、
Ｒが、－ＯＲ^７または－ＮＲ^８Ｒ^９から選択され、
Ｙが、ＯまたはＮＨから選択され、
Ｒ^７が、Ｈ、アルキル、置換型アルキル、置換されていてもよいアリール、置換されて
いてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいカルボシクリル、および置換されてい
てもよいヘテロシクリルからなる群から選択され、
各Ｒ^８およびＲ^９が、独立して、Ｈ、アルキル、置換型アルキル、アルケニル、アルキ
ニル、アミノアルキル、カルボキシアルキル、スルホナトアルキル、ハロアルキル、ヘテ
ロアルキル、アルコキシアルキル、スルホ、置換されていてもよいアリール、置換されて
いてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいカルボシクリル、および置換されてい
てもよいヘテロシクリルからなる群から選択され、
ｎが、０～４の整数である、蛍光化合物。
Ｒ^Ｈｅｔが、置換されていてもよい５～１０員のヘテロアリールから選択される、請求
項３３に記載の蛍光化合物。
Ｒ^Ｈｅｔが、置換されていてもよい９員のヘテロアリールから選択される、請求項３３
または３４に記載の蛍光化合物。
Ｒ^Ｈｅｔが、構造

を有する置換されていてもよい２－ベンゾチアゾリル、または構造

を有する置換されていてもよい２－ベンゾオキサゾリルである、請求項３３～３５のいず
れか一項に記載の蛍光化合物。
ＹがＯである、請求項３３～３６のいずれか一項に記載の蛍光化合物。
請求項１～３７のいずれか一項に記載の化合物で標識されたヌクレオチドまたはオリゴ
ヌクレオチド。
前記化合物が、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒを介してヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドに共有
結合しており、Ｒが－ＯＲ^７であり、Ｒ^７が置換型アルキルである、請求項３８に記載の
標識ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド。
前記化合物が、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒを介してヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドに共有
結合しており、Ｒが－ＮＲ^８Ｒ^９であり、Ｒ^８またはＲ^９の少なくとも一方が置換型アル
キルである、請求項３８に記載の標識ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド。
前記化合物が、リンカー部分を介して、前記ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの
ピリミジン塩基のＣ５位または７－デアザプリン塩基のＣ７位に結合している、請求項３
８～４０のいずれか一項に記載の標識ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド。
前記ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドのリボースまたはデオキシリボース糖に共
有結合している３’－ＯＨブロッキング基をさらに含んでなる、請求項３８～４１のいず
れか一項に記載の標識ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド。
１以上のヌクレオチドを含んでなるキットであって、１以上のヌクレオチドが請求項３
８～４２に記載の標識ヌクレオチドである、前記キット。
２以上の標識ヌクレオチドを含んでなる、請求項４３に記載のキット。
前記２つの標識ヌクレオチドが単一レーザーを用いて励起される、請求項４４に記載の
キット。
第３および第４のヌクレオチドをさらに含んでなり、前記第２、第３、および第４のヌ
クレオチドの各々が異なる化合物で標識されており、前記各化合物が異なる吸収極大を有
し、前記各化合物が他の化合物と区別可能である、請求項４３～４５のいずれか一項に記
載のキット。
シークエンシングアッセイにおいて請求項３８～４２のいずれか一項に記載の標識ヌク
レオチドを取り込むことを含んでなるシークエンシング方法。
前記ヌクレオチドの検出をさらに含んでなる、請求項４７に記載の方法。
前記シークエンシングアッセイを自動化シークエンシング機器で行い、前記自動化シー
クエンシング機器が異なる波長で作動する２つの光源を含んでなる、請求項４７または４
８に記載の方法。
式（Ｉａ）の化合物を製造する方法であって、
式（ＩＩａ）

または（ＩＩｂ）

の化合物と式（ＩＩＩ）

の化合物を反応させて、

を形成することを含んでなり、
式中、各Ｒ^１、Ｒ^２、およびＲ^１’が、独立して、Ｈ、アルキル、置換型アルキル、ア
ルコキシ、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルコキシアルキ
ル、アミノ、アミノアルキル、アミノスルホニル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ヒドロキ
シアルキル、ヘテロアルキル、Ｃ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、Ｃ－アミド、Ｎ－アミ
ド、ニトロ、スルホニル、スルホ、スルフィノ、スルホネート、スルホニルハライド、Ｓ
－スルホンアミド、Ｎ－スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換さ
れていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていて
もよいヘテロシクリルからなる群から選択され、
あるいは、Ｒ^１およびＲ^１’が、一緒になって、それらが結合している原子と共に、置
換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていても
よいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択さ
れる環または環系を形成し、
各Ｒ^３およびＲ^４が、独立して、Ｈ、アルキル、置換型アルキル、アルケニル、アルキ
ニル、アミノアルキル、ハロアルキル、ヘテロアルキル、アルコキシアルキル、スルホニ
ルヒドロキシド、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール
、置換されていてもよいカルボシクリル、および置換されていてもよいヘテロシクリルか
らなる群から選択され、
あるいは、Ｒ^１およびＲ^３が、それらが結合している原子と共に、置換されていてもよ
い５～１０員のヘテロアリール、または置換されていてもよい５～１０員のヘテロシクリ
ルからなる群から選択される環または環系を形成し、
あるいは、Ｒ^２およびＲ^４が、それらが結合している原子と共に、置換されていてもよ
い５～１０員のヘテロアリール、および置換されていてもよい５～１０員のヘテロシクリ
ルからなる群から選択される環または環系を形成し、
Ｒ^５およびＲ^６が、独立して、アルキル、置換型アルキル、アルコキシ、アルケニル、
アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルコキシアルキル、アミノ、アミノアル
キル、アミノスルホニル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヘテロアル
キル、Ｃ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、ニトロ、スルホニル
、スルホ、スルフィノ、スルホネート、スルホニルハライド、Ｓ－スルホンアミド、Ｎ－
スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール
、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリルか
らなる群から選択され、
Ｘが、Ｏ、Ｓ、ＮＲ^１０、およびＳｅからなる群から選択され、
Ｒ^１０が、Ｈ、アルキル、置換型アルキル、置換されていてもよいアリール、置換され
ていてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいカルボシクリル、および置換されて
いてもよいヘテロシクリルからなる群から選択され、
Ｒ”が、Ｈ、置換されていてもよいアルキル、アルケニル、アルキニル、アミノアルキ
ル、ハロアルキル、ヘテロアルキル、アルコキシアルキル、スルホ、置換されていてもよ
いアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいカルボシクリ
ル、および置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択され、
ｍが、０～４から選択される整数であり、
ｎが、０～４から選択される整数である、方法。
式（Ｉｂ）の化合物を製造する方法であって、
カルボン酸活性化により式（Ｉａ）の化合物を式（Ｉａ’）の化合物に変換することと
、

式（Ｉａ’）の化合物を式（ＩＶ）の第一級または第二級アミンと反応させることと、

を含んでなり、
前記式（Ｉａ）の化合物を請求項５０に従って製造し、
Ｒ^７が、Ｈ、アルキル、置換型アルキル、置換されていてもよいアリール、置換されて
いてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいカルボシクリル、および置換されてい
てもよいヘテロシクリルからなる群から選択され、
各Ｒ^８およびＲ^９が、独立して、Ｈ、アルキル、置換型アルキル、アルケニル、アルキ
ニル、アミノアルキル、カルボキシアルキル、スルホナトアルキル、ハロアルキル、ヘテ
ロアルキル、アルコキシアルキル、スルホ、置換されていてもよいアリール、置換されて
いてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいカルボシクリル、および置換されてい
てもよいヘテロシクリルからなる群から選択される、方法。