CN112601825B - 核酸测序方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种核酸测序方法以及相应的测序装置，所述方法特征在于扩增待测核酸分子双链体时将带有荧光和磷光基团的核苷酸类似物并入起始生长核酸链的3'端，通过检测荧光和磷光信号，判断待测核酸分子3'端的核苷酸。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体地，本发明涉及核酸测序方法、核苷酸类似物、核苷酸类似物混合物及其应用。
背景技术
DNA测序技术包括以桑格(Sanger)测序法为代表的第一代DNA测序技术与以Illumina Hiseq2500,Roche 454,ABI Solid，BGISEQ-500等为代表的第二代DNA测序技术。桑格测序法具有实验操作简单、结果直观准确和实验周期短等特点，在对检测结果时效性要求很高的临床基因突变检测以及基因分型等领域有着广泛的应用。然而，桑格测序法的缺点是通量小、成本高，这限制了其在大规模基因测序中的应用。
第二代DNA测序技术与第一代DNA测序技术相比，具有测序通量大、成本低、自动化程度高和单分子测序的特点。以Hiseq2500V2的测序技术为例，其一个实验流程可以产生10-200G碱基的数据，平均每个碱基的测序成本不到桑格测序法的测序成本的1/1000，并且所获得的测序结果可通过计算机直接进行处理和分析。因此，第二代DNA测序技术非常适合大规模测序。
目前已开发的第二代DNA测序技术主要涉及，边连接边测序(sequencing byligation,SBL)技术和边合成边测序(sequencing by synthesis,SBS)技术。这些测序技术的典型实例包括，Applied Biosystems公司开发的SOLiD测序法，Complete Genomics自主开发的组合探针锚定连接法(cPAL)和华大基因开发的组合探针锚定合成法(cPAS)，Illumina公司和Solexa technology公司合作开发的Illumina测序法等等。在这些测序方式中，Illumina和Complate Genomics采用了检测光信号的方法，为了实现4种碱基(A、T/U、C和G)的鉴别和区分，通常需要使用4种荧光染料来分别对这4种碱基进行标记。在这种情况下，为了读取各个碱基携带的荧光信号，测序装置必须配备至少2种单色激发光源和至少2个相机，这导致测序装置的制造成本昂贵且体积巨大。
已有研究报道，可通过使用2种荧光染料来实现对4种碱基的鉴别和区分(SaraGoodwin,et.al.Nature Reviews Genetics 17,333-351(2016))。例如，Illumina公司开发的NextSeq测序系统和Mini-Seq测序系统即使用了基于双荧光染料的测序方法。在此类测序方法中，通过2种荧光染料的不同组合来实现4种碱基的鉴别和区分。例如，可通过用第一荧光染料标记碱基A，用第二荧光染料标记碱基G，用第一和第二荧光染料同时标记碱基C，且不对碱基T/U进行标记，从而区分四种碱基。在此类测序方法中，测序装置仅需要一个相机，但仍然需要配备至少2种单色激发光源。因此，使用2种荧光染料的测序装置的制造成本和体积仍然相对较高。此外，与使用4种荧光染料的测序方法相比，基于双荧光染料的测序方法的测序质量明显下降，这主要是因为将双色荧光与单色荧光进行区分的难度较大，准确性有所下降。而使用一种荧光材料的测序方法，例如illumina iseq100，在第一次和第二次信号采集期间，都需要对测序芯片加入特殊的试剂实现信号的变换才能区分不同的碱基，这样使测序过程更复杂，时长更长。
因而，测序方法仍有待开发和改进。
发明内容
现有技术中实现单荧光测序法主要是通过使用不同的化学切除反应和生物素/链酶亲和素相互作用实现信号的转换，而在其使用不同的化学切除反应和生物素/链酶亲和素相互作用实现信号的转换时，均在第一次图片采集和第二次图片采集之间加入了反应试剂，增加了测序生化的复杂性，增加了测序的时长，且由于使用小分子和蛋白相互作用来加入某些信号，试剂成本增加。而现有技术中的双色荧光测序法中，使用两种荧光来区分四种碱基，该方法需要使用2种激光来激发两个不同激发波长的荧光分子，因而不利于仪器的小型化发展，不能较好的降低仪器的成本。
基于上述事实和问题的发现，发明人首次提出了使用化合物光学性质的差异来区分碱基的原理，基于该原理的测序仪，仅需要一种激发光和一个滤波装置的镜头，且不需要在两次拍照之间进行化学反应，从原理上简化了测序仪的硬件条件和测序步骤，有利于降低仪器的成本和试剂的成本。同时发明人还设计出了新的核苷酸类似物，并且同时设计出了一种核苷酸类似物混合物，利用该核苷酸类似物混合物光学性质的差异能方便快捷准确地区分碱基，进而实现DNA和/或RNA测序。
在本发明的第一方面，本发明提出了一种对核酸分子进行测序的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：(1)将待测核酸分子与引物进行退火反应，以便形成起始双链体，所述待测核酸分子或引物预先固定于支持物上，所述双链体由所述待测核酸分子和所述引物构成，所述双链体固定于所述支持物上；(2)以所述双链体中的引物为第一起始生长核酸链，在聚合酶的催化作用下，将第一～第五核苷酸类似物中的一种或两种并入所述起始生长核酸链的3'端，以便在所述起始生长核酸链的3'端仅延伸一个第一新核苷酸，形成第一产物双链体；(3)移除步骤(1)和(2)反应体系中的聚合酶以及未反应的第一～第五核苷酸类似物；(4)基于所述第一产物双链体的荧光信号和磷光信号，判断待测核酸分子3'端的第一核苷酸；其中，所述第一～第五核苷酸类似物具有碱基互补配对能力，所述第一～第五核苷酸类似物的核糖或脱氧核糖的3'位置处的羟基被保护基团保护，所述保护基团为聚合酶反应阻断基团，所述第一核苷酸类似物、第二核苷酸类似物、第三核苷酸类似物和第四核苷酸类似物与所述第五核苷酸类似物具有不同的碱基，所述第一核苷酸类似物与所述第三核苷酸类似物具有相同的碱基，所述第一核苷酸类似物与所述第二核苷酸类似物具有不同的碱基，所述第一核苷酸类似物和所述第二核苷酸类似物与所述第四核苷酸类似物具有不同的碱基，以及所述第三核苷酸类似物与所述第四核苷酸类似物具有不同的碱基，所述第一、第二核苷酸类似物各自独立地携带荧光基团、不携带磷光基团，所述第三、第四核苷酸类似物各自独立地携带磷光基团、不携带荧光基团，所述第五核苷酸类似物不携带荧光基团和磷光基团。发明人首次提出了使用化合物光学性质的差异来区分碱基，基于此原理，发明人设计了一种新的核酸测序的方法，利用上述第一～第五核苷酸类似物的光学信号(同时有磷光和荧光，只有磷光没有荧光，只有荧光没有磷光，没有磷光和荧光)从而来鉴别待测序核酸分子中对应的碱基(A、T/U、C和G)。利用根据本发明实施例的测序方法，仅需一个激发光和一个滤波装置，并且两次检测信号之间不需要进行化合物反应。由此，简化了测序步骤，降低了测序成本，且测序结果准确。
在本发明的第二方面，本发明提出了一种核苷酸类似物。根据本发明的实施例，所述核苷酸类似物具有式(I)所示的结构式，
其中，Base1表示腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶；D1表示磷光基团；C1表示可切割键或任选取代的可切割基团；B1表示聚合酶反应阻断基团；R1为-OH或-H，P1为H或磷酸基团。发明人首次提出并设计出了携带磷光基团的核苷酸类似物，携带磷光基团的核苷酸类似物可单独用于DNA和/或RNA测序中，取代现有技术中的双色荧光测序法、单色荧光测序法等用到荧光染料的测序方法中的携带荧光基团的核苷酸类似物，同时利用携带磷光基团的核苷酸类似物与携带荧光基团类似物的光学性质的差异，可实现本申请首次提出的利用核苷酸类似物的光学性质差异来区分碱基的测序方法。根据本发明实施例的核苷酸类似物携带磷光基团，是一种新的可以用于DNA和/或RNA测序中的核苷酸类似物。
在本发明的第三方面，本发明提出了一种核苷酸类似物混合物。根据本发明的实施例，所述核苷酸类似物混合物包括前面所述的核苷酸类似物。发明人首次提出包含携带磷光基团的核苷酸类似物的核苷酸类似物混合物，进而可利用所述核苷酸类似物混合物中的携带磷光基团的核苷酸类似物产生磷光光学信号来实现核酸的测序。
在本发明的第四方面，本发明提出了一种核苷酸类似物混合物。根据本发明的实施例，所述核苷酸类似物混合物包括：第一核苷酸类似物和第二核苷酸类似物，其分别独立地具有式II所示的结构式，
其中，Base2表示腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶；D2表示荧光基团；C2表示可切割键或任选取代的可切割基团；B2表示聚合酶反应阻断基团；R2为-OH或-H；P2表示H或磷酸基团；
第三核苷酸类似物和第四核苷酸类似物，其分别独立地具有式I所示的结构式，
其中，Base1表示腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶；D1表示磷光基团；C1表示可切割键或任选取代的可切割基团；B1表示聚合酶反应阻断基团；R1为-OH或-H；P1为H或磷酸基团；
第五核苷酸类似物，所述第五核苷酸类似物具有式III所示的结构式，
其中，Base3表示腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶胸腺嘧啶或尿嘧啶；B3表示聚合酶反应阻断基团；R3为-OH或-H；P3为H或磷酸基团；
其中，所述第一核苷酸类似物、第二核苷酸类似物、第三核苷酸类似物和第四核苷酸类似物与所述第五核苷酸类似物具有不同的碱基；所述第一核苷酸类似物与所述第三核苷酸类似物具有相同的碱基；所述第一核苷酸类似物与所述第二核苷酸类似物具有不同的碱基；所述第一核苷酸类似物和所述第二核苷酸类似物与所述第四核苷酸类似物具有不同的碱基；以及所述第三核苷酸类似物与所述第四核苷酸类似物具有不同的碱基。发明人首次提出了使用化合物光学性质的差异来区分碱基，基于此原理，发明人设计了一种核苷酸类似物混合物，利用上述第一～第五核苷酸类似物进行核酸测序，通过检测不同的光学信号(同时有磷光和荧光，只有磷光没有荧光，只有荧光没有磷光，没有磷光和荧光)来快速准确鉴别出核酸链上对应的碱基的类型，利用根据本发明实施例的核苷酸类似物混合物进行测序，仅需一个激发光和一个滤波装置，并且两次检测信号之间不需要进行化合物反应，由此，简化了测序步骤，降低了测序成本，且测序结果准确。
在本发明的第五方面，本发明提出了一种试剂盒。根据本发明的实施例，所述试剂盒包括：前面所述的核苷酸类似物，或者前面所述的核苷酸类似物混合物。发明人首次提出并设计了携带磷光基团的核苷酸类似物，携带磷光基团的核苷酸类似物可单独用于DNA和/RNA测序中，取代现有技术中的双色荧光测序法、单色荧光测序法等用到荧光染料的测序方法中的携带荧光基团的核苷酸类似物。同时利用携带磷光基团的核苷酸类似物与携带荧光基团类似物的光学性质的差异，可实现本申请首次提出的利用化合物的光学性质差异来区分碱基的测序方法，进而设计了前面所述的核苷酸类似物混合物，并将前面所述的核苷酸类似物混合物应用到试剂盒的制备中。根据本发明实施例的试剂盒，成本低廉，操作简便，能快速、准确地检测出核酸分子中碱基的类型。
在本发明的第六方面，本发明提出了一种进行聚合酶反应的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：(1)将含有单链模板、引物、前面所述的核苷酸类似物混合物以及聚合酶的混合物置于适于引物延伸的条件，其中，所述引物与所述单链模板的一部分匹配，以便在所述引物的3'末端仅延伸一个第一新核苷酸。发明人首次提出了使用化合物光学性质的差异来区分碱基，基于此原理，发明人设计了一种核苷酸类似物混合物，利用上述第一～第五核苷酸类似物来进行核酸测序，通过检测不同的光学信号(同时有磷光和荧光，只有磷光没有荧光，只有荧光没有磷光，没有磷光和荧光)来进行准确识别核酸链中对应的碱基的类型。根据本发明实施例的方法，核苷酸类似物能与核酸链进行精准配对，进而方便快速准确地进行核酸测序。
在本发明的第七方面，本发明提出了一种核酸序列测定的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：利用前面所述的方法对待测序核酸序列进行可控链式聚合酶反应。根据本发明实施例的方法，在测序过程中仅需一个激发光和一个滤波装置的镜头，且不需要在两次拍照之间进行化学反应，简化了测序步骤，减少了测序时长，降低了测序成本，且测序结果准确。
在本发明的第八方面，本发明提出了一种测序仪。根据本发明的实施例，所述测序仪包括：壳体；链式聚合酶反应区域，所述链式聚合酶反应区域设置在所述壳体中；激发光发射器，所述激光发射器适于向所述链式聚合酶反应区域发射预定波长的激发光；以及信号采集装置，所述信号采集装置适于采集所述链式聚合酶反应区域中的荧光信号和磷光信号。发明人首次提出了使用化合物光学性质的差异来区分碱基，基于此原理，发明人设计了一种核苷酸类似物混合物，利用上述第一～第五核苷酸类似物来进行核酸测序，通过检测不同的光学信号(同时有磷光和荧光，只有磷光没有荧光，只有荧光没有磷光，没有磷光和荧光)来进行识别核酸链相应的碱基的类型，并且基于上述测序方法，发明人提出了一种新的测序仪，所述测序仪仅需要一种激发光和一个滤波装置的镜头，而且不需要在两次拍照之间进行化学反应，简化了测序仪的硬件条件和测序步骤，降低了仪器成本和试剂成本。根据本发明实施例的测序仪成本低廉、测序过程简单、测序时间短、且测序结果准确，有利于测序仪的小型化发展。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1为根据本发明实施例的测序仪；
图2为根据本发明实施例的测序仪(包括控制器)；
图3为根据本发明实施例的光学通道图像，其中左侧为荧光通道图像，右侧为磷光通道图像，其中附图标记：测序仪1000，壳体100，链式聚合酶反应区域11，激光发射器12，信号采集装置13，控制器14。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
对核酸分子进行测序的方法
在本发明的第一方面，本发明提出了一种对核酸分子进行测序的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：(1)将待测核酸分子与引物进行退火反应，以便形成起始双链体，所述待测核酸分子或引物预先固定于支持物上，所述双链体由所述待测核酸分子和所述引物构成，所述双链体固定于所述支持物上；(2)以所述双链体中的引物为第一起始生长核酸链，在聚合酶的催化作用下，将第一～第五核苷酸类似物中的一种或两种并入所述起始生长核酸链的3'端，以便在所述起始生长核酸链的3'端仅延伸一个第一新核苷酸，形成第一产物双链体；(3)移除步骤(1)和(2)反应体系中的聚合酶以及未反应的第一～第五核苷酸类似物；(4)基于所述第一产物双链体的荧光信号和磷光信号，判断待测核酸分子3'端的第一核苷酸；其中，所述第一～第五核苷酸类似物具有碱基互补配对能力，所述第一～第五核苷酸类似物的核糖或脱氧核糖的3'位置处的羟基被保护基团保护，所述保护基团为聚合酶反应阻断基团，所述第一核苷酸类似物、第二核苷酸类似物、第三核苷酸类似物和第四核苷酸类似物与所述第五核苷酸类似物具有不同的碱基，所述第一核苷酸类似物与所述第三核苷酸类似物具有相同的碱基，所述第一核苷酸类似物与所述第二核苷酸类似物具有不同的碱基，所述第一核苷酸类似物和所述第二核苷酸类似物与所述第四核苷酸类似物具有不同的碱基，所述第三核苷酸类似物与所述第四核苷酸类似物具有不同的碱基，所述第一、第二核苷酸类似物各自独立地携带荧光基团、不携带磷光基团，所述第三、第四核苷酸类似物各自独立地携带磷光基团、不携带荧光基团，所述第五核苷酸类似物不携带荧光基团和磷光基团。发明人首次提出了使用化合物光学性质的差异来区分碱基，基于此原理，发明人设计了一种新的核酸测序的方法，利用上述第一～第五核苷酸类似物的光学信号(同时有磷光和荧光，只有磷光没有荧光，只有荧光没有磷光，没有磷光和荧光)从而来鉴别待测序核酸分子中对应的碱基(A、T/U、C和G)。利用根据本发明实施例的测序方法，仅需一个激发光和一个滤波装置，并且两次检测信号之间不需要进行化合物反应。由此，简化了测序步骤，降低了测序成本，且测序结果准确。
根据本发明的实施例，所述方法进一步包括：(5)将所述第一产物双链体在含有溶液相和固相的反应体系中进行切割处理，以便去除所述核苷酸类似物中的核糖或脱氧核糖的3'位置处的保护基团和/或光信号基团，(6)移除步骤(5)中的反应体系的溶液相，(7)以步骤(6)反应体系中的切割处理产物为第二初始生长核酸链，在聚合酶的催化作用下，将第一～第五核苷酸类似物中的一种或两种并入所述起始生长核酸链的3'端，以便在所述第二起始生长核酸链的3'端仅延伸一个第二新核苷酸，形成第二产物双链体；(8)重复步骤(3)和(4)，判断待测核酸分子3'端的第二核苷酸序列。通过切除核苷酸类似物上的3'位置处的保护基团以便确保下一轮的聚合物链式反应，同时通过切除核苷酸类似物上的发光基团(荧光基团或磷光基团)以便能更好的检测出下一轮聚合酶链式反应扩增上的核苷酸类似物所携带的光学信号。需要说明的是，本发明中涉及的溶液相是指发生反应的反应液，固相是指固定模板的支持物。
根据本发明的实施例，延伸的第一新核苷酸为第一或第二核苷酸类似物，所述切割的光信号基团为荧光基团。
根据本发明的实施例，延伸的第一新核苷酸为第三、第四核苷酸类似物，所述切割的光信号基团为磷光基团。
根据本发明的实施例，延伸的第一新核苷酸为第五核苷酸类似物，只切割所述保护基团中的核糖或脱氧核糖的3'位置处的保护基团。
根据本发明的实施例，所述方法还包括下述步骤(9)：所述方法还包括下述步骤(9)：(9)重复进行步骤(5)～(8)一次或多次，以便判断待测核酸分子的核苷酸序列。重复步骤(5)～(8)一次或多次，直至测完整段待测序核酸分子的序列。
根据本发明的实施例，所述荧光信号和磷光信号同时存在表示所述待测序的核酸分子对应的碱基为所述第一核苷酸类似物和第三核苷酸类似物所对应的碱基，所述荧光信号和所述磷光信号均不存在表示所述待测序的核酸分子对应的碱基为所述第五核苷酸类似物所对应的碱基，存在所述荧光信号，但不存在所述磷光信号表示所述待测序的核酸分子对应的碱基为所述第二核苷酸类似物所对应的碱基，不存在所述荧光信号，但存在所述磷光信号表示所述待测序的核酸分子对应的碱基为所述第四核苷酸类似物所对应的碱基。由此，可以通过不同的光信号快速准确地确定待测序的核酸分子对应的碱基。
根据本发明的实施例，所述待测核酸分子为DNA，所述待测核酸分子预先经过变性处理，以便获得单链待测核酸分子。
核苷酸类似物
在本发明的第二方面，本发明提出了一种核苷酸类似物。根据本发明的实施例，所述核苷酸类似物具有式(I)所示的结构式，
其中，Base1表示腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶；D1表示磷光基团；C1表示可切割键或任选取代的可切割基团；B1表示聚合酶反应阻断基团；R1为-OH或-H，P1为H或磷酸基团。发明人首次提出并设计出了携带磷光基团的核苷酸类似物，携带磷光基团的核苷酸类似物可单独用于DNA和/或RNA测序中，取代现有技术中的双色荧光测序法、单色荧光测序法等用到荧光染料的测序方法中的携带荧光基团的核苷酸类似物，同时利用携带磷光基团的核苷酸类似物与携带荧光基团类似物的光学性质的差异，可实现本申请首次提出的利用核苷酸类似物的光学性质差异来区分碱基的测序方法。根据本发明实施例的核苷酸类似物携带磷光基团，是一种新的可以用于DNA和/或RNA测序中的核苷酸类似物。
需要说明的是，磷光基团没有特别限制，磷光基团只要满足能在特定的激发光的条件下发射可控检测的磷光信号即可。例如，磷光基团可以为下列结构：
其中，所述R4为H、F、Cl、Br、I、CN、NO2、C1-6烷基、C1-6卤代烷基，C1-6烷氧基。上述基团能在特定的激发光的作用下，发磷光。
根据本发明的实施例，所述磷酸基团为单磷酸基团、双磷酸基团、三磷酸基团或多聚磷酸基团。
需要说明的是，可切割基团没有特别限制，只要能满足在特定的条件下被切割开即可。例如，所述可切割基团可为包括以下基团-S-S-、CH2CH＝CH2、-CH2N3等现有技术中常见的可切割基团。
根据本发明的实施例，所述C1进一步包括聚合酶反应阻断基团。需要说明的是，如果上述可切割基团中包括聚合酶反应的位点，则需要在所述聚合酶反应的位点上引入一个聚合酶反应的阻断基团，以便防止聚合酶链式反应或者测序过程中在上述位点上进行反应而影响测序结果。
例如，所述C1包括但不限于如下结构：
其中，n1～n17各自独立为0～7之间的整数。
需要说明的是，聚合酶反应阻断基团没有特别限制，只要能满足在特定条件下阻断该位点进行聚合酶反应，以及在另一特定条件下，能脱除，以便进行聚合酶反应即可。例如所述聚合酶反应阻断基团可为包括以下基团-S-S-、CH2CH＝CH2、-CH2N3等现有技术中常见的聚合酶反应阻断基团。上述基团能在聚合酶链式反应或者测序过程中控制每次仅扩增一个新的核苷酸，之后检测光学信号后，再切除再进行下一轮的扩增。
根据本发明的实施例，式(I)所示结构为下列之一的结构：
核苷酸类似物混合物
在本发明的第三方面，本发明提出了一种核苷酸类似物混合物。根据本发明的实施例，所述核苷酸类似物混合物包括前面所述的核苷酸类似物。发明人首次提出包含携带磷光基团的核苷酸类似物的核苷酸类似物混合物，进而可利用所述核苷酸类似物混合物中的携带磷光基团的核苷酸类似物产生磷光光学信号来实现核酸的测序。
核苷酸类似物混合物
在本发明的第四方面，本发明提出了一种核苷酸类似物混合物。根据本发明的实施例，所述核苷酸类似物混合物包括：第一核苷酸类似物和第二核苷酸类似物，其分别独立地具有式II所示的结构式，
其中，Base2表示腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶；D2表示荧光基团；C2表示可切割键或任选取代的可切割基团；B2表示聚合酶反应阻断基团；R2为-OH或-H；P2表示H或磷酸基团；
第三核苷酸类似物和第四核苷酸类似物，其分别独立地具有式I所示的结构式，
其中，Base1表示腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶；D1表示磷光基团；C1表示可切割键或任选取代的可切割基团；B1表示聚合酶反应阻断基团；R1为-OH或-H；P1为H或磷酸基团；
第五核苷酸类似物，所述第五核苷酸类似物具有式III所示的结构式，
其中，Base3表示腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶胸腺嘧啶或尿嘧啶；B3表示聚合酶反应阻断基团；R3为-OH或-H；P3为H或磷酸基团；
其中，所述第一核苷酸类似物、第二核苷酸类似物、第三核苷酸类似物和第四核苷酸类似物与所述第五核苷酸类似物具有不同的碱基；所述第一核苷酸类似物与所述第三核苷酸类似物具有相同的碱基；所述第一核苷酸类似物与所述第二核苷酸类似物具有不同的碱基；所述第一核苷酸类似物和所述第二核苷酸类似物与所述第四核苷酸类似物具有不同的碱基；以及所述第三核苷酸类似物与所述第四核苷酸类似物具有不同的碱基。发明人首次提出了使用化合物光学性质的差异来区分碱基，基于此原理，发明人设计了一种核苷酸类似物混合物，利用上述第一～第五核苷酸类似物进行核酸测序，通过检测不同的光学信号(同时有磷光和荧光，只有磷光没有荧光，只有荧光没有磷光，没有磷光和荧光)来快速准确鉴别出核酸链上对应的碱基的类型，利用根据本发明实施例的核苷酸类似物混合物进行测序，仅需一个激发光和一个滤波装置，并且两次检测信号之间不需要进行化合物反应，由此，简化了测序步骤，降低了测序成本，且测序结果准确。
需要说明的是，磷光基团没有特别限制，磷光基团只要满足能在特定的激发光的条件下发射可控检测的磷光信号即可。例如，磷光基团可以为下列结构：
其中，所述R4为H、F、Cl、Br、I、CN、NO2、C1-6烷基、C1-6卤代烷基，C1-6烷氧基。上述基团能在特定的激发光的作用下，发磷光。
根据本发明的实施例，所述磷酸基团为单磷酸基团、双磷酸基团、三磷酸基团或多聚磷酸基团。
需要说明的是，可切割基团没有特别限制，只要能满足在特定的条件下被切割开即可。例如，所述可切割基团可为包括以下基团-S-S-、CH2CH＝CH2、-CH2N3等现有技术中常见的可切割基团。
根据本发明的实施例，所述C1和/或C2进一步包括聚合酶反应阻断基团。需要说明的是，如果上述可切割基团中包括聚合酶反应的位点，则需要在所述聚合酶反应的位点上引入一个聚合酶反应的阻断基团，以便防止聚合酶链式反应或者测序过程中在上述位点上进行反应而影响测序结果。
例如，所述C1和/或C2包括但不限于如下结构：
其中，n1～n17各自独立为0～7之间的整数。
需要说明的是，聚合酶反应阻断基团没有特别限制，只要能满足在特定条件下阻断该位点进行聚合酶反应，以及在另一特定条件下，能脱除，以便进行聚合酶反应即可。例如所述聚合酶反应阻断基团可为包括以下基团-S-S-、CH2CH＝CH2、-CH2N3等现有技术中常见的聚合酶反应阻断基团。上述基团能在聚合酶链式反应或者测序过程中控制每次仅扩增一个新的核苷酸，之后检测光学信号后，再切除再进行下一轮的扩增。
需要说明的是，荧光基团没有特别限制，荧光基团只要满足能在特定的激发光的条件下发射可控检测的荧光信号即可。例如D2包括但不限于如下结构：
根据本发明的实施例，式(I)所示结构为下列之一的结构：
根据本发明的一个具体实施例，所述第一核苷酸类似物具有式(5)所示的结构：
所述第二核苷酸类似物具有式(6)所示的结构：
所述第三核苷酸类似物具有式(2)所示的结构：
所述第四核苷酸类似物具有式(1)所示的结构：
所述第五核苷酸类似物具有式(7)所示的结构：
具有上述结构的核苷酸类似物混合物仅为其中一种可以用来实现前面所述的测序方法的核苷酸类似物混合物。
试剂盒
在本发明的第五方面，本发明提出了一种试剂盒。根据本发明的实施例，所述试剂盒包括：前面所述的核苷酸类似物，或者前面所述的核苷酸类似物混合物。发明人首次提出并设计了携带磷光基团的核苷酸类似物，携带磷光基团的核苷酸类似物可单独用于DNA和/RNA测序中，取代现有技术中的双色荧光测序法、单色荧光测序法等用到荧光染料的测序方法中的携带荧光基团的核苷酸类似物。同时利用携带磷光基团的核苷酸类似物与携带荧光基团类似物的光学性质的差异，可实现本申请首次提出的利用化合物的光学性质差异来区分碱基的测序方法，进而设计了前面所述的核苷酸类似物混合物，并将前面所述的核苷酸类似物混合物应用到试剂盒的制备中。根据本发明实施例的试剂盒，成本低廉，操作简便，能快速、准确地检测出核酸分子中碱基的类型。
根据本发明的实施例，所述试剂盒进一步包括：切断试剂，所述切断试剂可作用于可切割基团或者可切割键。利用上述切断试剂可以切断前面所述的核苷酸类似物或者核苷酸类似物混合物中的可切割基团或者可切割键，进而使得聚合酶反应阻断基团脱除，暴露出聚合酶反应的位点，以便进行下一个新的碱基扩增。
需要说明的是，切断试剂没有特别限制，只要能满足切断核苷酸类似物中的可切割键或可切割基团，且对待测序核酸分子以及聚合酶链式反应不会造成实质影响即可。例如，可采用TCEP/THPP作为切断试剂来高效切割二硫键，利用有机膦化物作为切断试剂来高效切割叠氮基团。
聚合酶反应的方法
在本发明的第六方面，本发明提出了一种进行聚合酶反应的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：(1)将含有单链模板、引物、前面所述的核苷酸类似物混合物以及聚合酶的混合物置于适于引物延伸的条件，其中，所述引物与所述单链模板的一部分匹配，以便在所述引物的3'末端仅延伸一个第一新核苷酸。发明人首次提出了使用化合物光学性质的差异来区分碱基，基于此原理，发明人设计了一种核苷酸类似物混合物，利用上述第一～第五核苷酸类似物来进行核酸测序，通过检测不同的光学信号(同时有磷光和荧光，只有磷光没有荧光，只有荧光没有磷光，没有磷光和荧光)来进行准确识别核酸链中对应的碱基的类型。根据本发明实施例的方法，核苷酸类似物能与核酸链进行精准配对，进而方便快速准确地进行核酸测序。
根据本发明的实施例，所述单链模板或引物固定在固相载体上。
根据本发明的实施例，所述单链模板或引物固定在芯片上。
根据本发明的实施例，所述方法进一步包括：(2)切除所述新核苷酸的所述聚合酶反应阻断基团，并返回至步骤(1)以便在所述第一新核苷酸的3'末端继续延伸仅一个第二新碱基。利于上述方法，可以准确快速进行核酸分子的测序。
根据本发明的实施例，在步骤(1)之后，进一步包括：(1-1)分别检测所述第一新碱基的荧光信号和磷光信号。通过检测第一新碱基的光学信号，能准确鉴别出所述第一新碱基的类型。
根据本发明的实施例，在步骤(1-1)之前进一步包括：移除延伸所述第一新核苷酸后体系中的反应物。通过移除延伸所述第一新核苷酸后体系中的反应物后，再进行光学信号检测，可提高其光学信号检测的灵敏度和准确度。
根据本发明的实施例，步骤(1-1)之后，进一步包括：(1-2)基于所述荧光信号和磷光信号的至少之一，确定所述第一新碱基和所述单链模板上与所述第一新碱基所对应位置碱基至少之一的类型。
根据本发明的实施例，所述荧光信号和磷光信号同时存在表示所述第一新核苷酸的碱基为所述第一核苷酸类似物和第三核苷酸类似物所对应的碱基，所述荧光信号和所述磷光信号均不存在表示所述第一新核苷酸的碱基为所述第五核苷酸类似物所对应的碱基，存在所述荧光信号，但不存在所述磷光信号表示所述第一新核苷酸的碱基为所述第二核苷酸类似物所对应的碱基，不存在所述荧光信号，但存在所述磷光信号表示所述第一新核苷酸的碱基为所述第四核苷酸类似物所对应的碱基。由此，根据所述第一新核苷酸的碱基的光学信号的不同，能准确地鉴别出待测序核酸分子中相应位置的碱基类型。
根据本发明的实施例，在步骤(1-2)中，采用400～480nm的激发波长，以及500～570nm的信号采集滤波片。发明人发现，在上述激发波长和信号采集滤波片的基础上，能先后检测到荧光信号和磷光信号，且仅需要一个激发光和一个信号采集滤波片即可满足检测需求，同时，两次信号采集过程中不需要进行化学反应。由此，节约了测序的时间和测序的成本。
根据本发明的实施例，所述荧光信号在激发光打开的时间段采集，所述磷光信号在激发光关闭之后0.5～100毫秒之间采集。利用本发明实施例的方法进行聚合酶反应，在两次信号采集中间不需要进行化学反应，且两次信号采集的时间间隔短。由此，节约了测序的时间和测序的成本。
核酸序列测定的方法
在本发明的第七方面，本发明提出了一种核酸序列测定的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：利用前面所述的方法对待测序核酸序列进行可控链式聚合酶反应。根据本发明实施例的方法，在测序过程中仅需一个激发光和一个滤波装置的镜头，且不需要在两次拍照之间进行化学反应，简化了测序步骤，减少了测序时长，降低了测序成本，且测序结果准确。
测序仪
在本发明的第六方面，本发明提出了一种测序仪。根据本发明的实施例，参考图1，所述测序仪1000包括：壳体100；
链式聚合酶反应区域11，所述链式聚合酶反应区域11设置在所述壳体100中；
激发光发射器12，所述激光发射器12适于向所述链式聚合酶反应区域11发射预定波长的激发光；根据本发明的一个具体实施例，所述预定波长为400～480nm。
以及信号采集装置13，所述信号采集装置13适于采集所述链式聚合酶反应区域11中的荧光信号和磷光信号。
根据本发明的又一个具体实施例，参考图2，所述测序仪1000进一步包括控制器14，所述控制器14分别与所述信号采集装置13和所述激光发射器12相连，用于控制所述激发光发射器12的开启和关闭，以及控制所述信号采集装置13在采集荧光信号和所述磷光信号之间切换。根据本发明的再一个具体实施例，所述控制器14适于在所述激发光发射器12启动的过程中，控制所述信号采集装置13采集荧光信号，在关闭所述激发光发射器12之后预定时间范围内采集所述磷光信号。根据本发明的再一个具体实施例，所述预定时间为0.5～100毫秒。
发明人首次提出了使用化合物光学性质的差异来区分碱基，基于此原理，发明人设计了一种核苷酸类似物混合物，利用上述第一～第五核苷酸类似物来进行核酸测序，通过检测不同的光学信号(同时有磷光和荧光，只有磷光没有荧光，只有荧光没有磷光，没有磷光和荧光)来进行识别核酸链相应的碱基的类型，并且基于上述测序方法，发明人提出了一种新的测序仪，所述测序仪仅需要一种激发光和一个滤波装置的镜头，而且不需要在两次拍照之间进行化学反应，简化了测序仪的硬件条件和测序步骤，降低了仪器成本和试剂成本。根据本发明实施例的测序仪成本低廉、测序过程简单、测序时间短、且测序结果准确，有利于测序仪的小型化发展。
制备方法
本申请涉及的核苷酸类似物混合物中的式(II)和式(III)所示的化合物为现有技术中常见的核苷酸类似物，可参考现有技术中的方法完成合成，例如可参考WO 2017/058953 A1、WO 2017/087887A1、US 2017/0130051A1等专利中的方法进行合成。
本申请涉及的核苷酸类似物混合物中的式(I)所示的化合物为发明人首次提出的核苷酸类似物，其合成方法也可参考现有技术中的方法合成，不同之处在于，其需要在合成过程中将荧光基团转换成磷光基团进行合成。磷光基团的合成，可参考现有技术中的相关磷光基团的合成方法来进行合成，例如可参考Fraser,C.L.,NATURE MATERIALS,2009,08,747-751(DOI:10.1038/NMAT2509)中的方法。
例如利用Fraser,C.L.,NATURE MATERIALS,2009,08,747-751(DOI:10.1038/NMAT2509)文献中的方法可到如下原料1：
n可以根据需要，选择任意整数(包括0)，
利用WO 2017/058953 A1、WO 2017/087887A1、US 2017/0130051A1等专利中的方法得到带有待连接荧光基团的原料2(在本发明中也可认为是待连接磷光基团的原料2)；
之后将上述原料1和待连接磷光基团的原料2在适合的条件下进行缩合反应、取代反应或加成反应等经典的化学反应进行合成，以便得到携带磷光基团的核苷酸类似物。
实施例1：
发明人通过利用如下化合物对于测序方法进行验证：
上述化合物所携带的光学信号如表1所示：
表1：光学信号信息
| 碱基类型 | 荧光通道 | 磷光通道 |
| A | 发光 | 不发光 |
| G | 不发光 | 不发光 |
| C | 不发光 | 发光 |
| T | 发光 | 发光 |
其中，T碱基使用了磷光修饰和荧光修饰dTTP混合物.
为了进行基于该原理的碱基区分验证，在荧光显微镜下，在玻璃芯片上面通过点样仪分别固定了不同序列的DNA若干。每个点直径大小在50微米，荧光显微镜的激发波长选取为400-480纳米范围，荧光和磷光的采集信号滤波片范围为500-570纳米。荧光信号采集在激发光是打开时间段，磷光信号采集在激发光关闭之后的0.5ms-100ms之间。
在验证实验中，试剂均采用BGISEQ-500试剂中的酶和各种缓冲液。其中测序试剂的荧光修饰探针改为上述5种荧光和磷光修饰的可逆阻断核苷酸。
首先购买了硅片上的DNA array(博奥生物芯片定制服务)，使用了四个同序列的DNA，在被测区域对应的每个位置四个序列的碱基情况均不同含有四种碱基，其中四个序列分别如表2所示。
表2：序列信息
在DNA被固定之后，加入部分互补序列的测序引物(如上表2)。在硅片加入含有上面五种核苷酸的DNA聚合酶混合物之后，在PCR延伸条件下，每个DNA引物的3’端被聚合上对应的碱基，之后洗掉未反应的核苷酸，加入含有维他命C的磷酸盐缓冲液，在荧光显微镜下进行图像的采集，通过设置显微镜的采集信号时间可获得磷光的信号图像。
第一个循环首先获得了图3，左边为荧光通道的图像，右边为磷光通道的图像，其中最左侧两列为混合DNA定位区域，所以6个点均在两个通道有信号，3-10列为单一种类DNA序列点，共6×8个点。
经过5个循环的测序分别判定了上述48个点的序列为；
4a、4e、4f、5a、5e、6a、6c、7a、8b、8c、8f、9b、9c、9e、10c、10d和10e为序列1。
3b、3c、3e、4c、6b、7b、9a和10b为序列2。
3a、4d、5b、5c、6f、7d、7f、8a、9f和10a为序列3。
3d、3f、4b、5d、5f、6d、6e、7c、7e、8d、8e、9d和10f为序列4。
上述序列与定制芯片设计的序列完全相同，在短的测序读长是达到了100％准确率。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (23)
1.一种对核酸分子进行测序的方法，其特征在于，
(1)将待测核酸分子与引物进行退火反应，以便形成起始双链体，所述待测核酸分子或引物预先固定于支持物上，所述双链体由所述待测核酸分子和所述引物构成，所述双链体固定于所述支持物上；
(2)以所述双链体中的引物为第一起始生长核酸链，在聚合酶的催化作用下，将第一～第五核苷酸类似物中的一种或两种并入所述起始生长核酸链的3'端，以便在所述起始生长核酸链的3'端仅延伸一个第一新核苷酸，形成第一产物双链体；
(3)移除步骤(1)和(2)反应体系中的聚合酶以及未反应的第一～第五核苷酸类似物；
(4)基于所述第一产物双链体的荧光信号和磷光信号，判断待测核酸分子3'端的第一核苷酸；
其中，所述第一～第五核苷酸类似物具有碱基互补配对能力，所述第一～第五核苷酸类似物的核糖或脱氧核糖的3'位置处的羟基被保护基团保护，所述保护基团为聚合酶反应阻断基团，
所述第一核苷酸类似物、第二核苷酸类似物、第三核苷酸类似物和第四核苷酸类似物与所述第五核苷酸类似物具有不同的碱基，
所述第一核苷酸类似物与所述第三核苷酸类似物具有相同的碱基，
所述第一核苷酸类似物与所述第二核苷酸类似物具有不同的碱基，
所述第一核苷酸类似物和所述第二核苷酸类似物与所述第四核苷酸类似物具有不同的碱基，
所述第三核苷酸类似物与所述第四核苷酸类似物具有不同的碱基，
所述第一、第二核苷酸类似物各自独立地携带荧光基团、不携带磷光基团，
所述第三、第四核苷酸类似物各自独立地携带磷光基团、不携带荧光基团，
所述第五核苷酸类似物不携带荧光基团和磷光基团。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，进一步包括：
(5)将所述第一产物双链体在含有溶液相和固相的反应体系中进行切割处理，以便去除所述核苷酸类似物中的核糖或脱氧核糖的3'位置处的保护基团和/或光信号基团，
(6)移除步骤(5)中的反应体系的溶液相，
(7)以步骤(6)反应体系中的切割处理产物为第二初始生长核酸链，在聚合酶的催化作用下，将第一～第五核苷酸类似物中的一种或两种并入所述起始生长核酸链的3'端，以便在所述第二起始生长核酸链的3'端仅延伸一个第二新核苷酸，形成第二产物双链体；
(8)重复步骤(3)和(4)，判断待测核酸分子3'端的第二核苷酸序列。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，延伸的第一新核苷酸为第一或第二核苷酸类似物，所述切割的光信号基团为荧光基团；
任选地，延伸的第一新核苷酸为第三、第四核苷酸类似物，所述切割的光信号基团为磷光基团；
任选地，延伸的第一新核苷酸为第五核苷酸类似物，只切割所述保护基团中的核糖或脱氧核糖的3'位置处的保护基团。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法还包括下述步骤(9)：
(9)重复进行步骤(5)～(8)一次或多次，以便判断待测核酸分子的核苷酸序列。
5.根据权利要求1～4任一项所述的方法，其特征在于，所述荧光信号和磷光信号同时存在表示所述待测序的核酸分子对应的碱基为所述第一核苷酸类似物和第三核苷酸类似物所对应的碱基，
所述荧光信号和所述磷光信号均不存在表示所述待测序的核酸分子对应的碱基为所述第五核苷酸类似物所对应的碱基，
存在所述荧光信号，但不存在所述磷光信号表示所述待测序的核酸分子对应的碱基为所述第二核苷酸类似物所对应的碱基，
不存在所述荧光信号，但存在所述磷光信号表示所述待测序的核酸分子对应的碱基为所述第四核苷酸类似物所对应的碱基；
任选地，所述待测核酸分子为DNA，所述待测核酸分子预先经过变性处理，以便获得单链待测核酸分子。
6.一种核苷酸类似物混合物，其特征在于，包括：
第一核苷酸类似物和第二核苷酸类似物，其分别独立地具有式II所示的结构式，
其中，
Base2表示腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶；
D2表示荧光基团；
C2表示可切割键或任选取代的可切割基团；
B2表示聚合酶反应阻断基团；
R2为-OH或-H；
P2表示H或磷酸基团；
第三核苷酸类似物和第四核苷酸类似物，其分别独立地具有式I所示的结构式，
其中，
Base1表示腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶；
D1表示磷光基团；
C1表示可切割键或任选取代的可切割基团；
B1表示聚合酶反应阻断基团；
R1为-OH或-H；
P1为H或磷酸基团；
第五核苷酸类似物，所述第五核苷酸类似物具有式III所示的结构式，
其中，
Base3表示
腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶；
B3表示聚合酶反应阻断基团；
R3为-OH或-H；
P3为H或磷酸基团；
其中，所述第一核苷酸类似物、第二核苷酸类似物、第三核苷酸类似物和第四核苷酸类似物与所述第五核苷酸类似物具有不同的碱基；
所述第一核苷酸类似物与所述第三核苷酸类似物具有相同的碱基；
所述第一核苷酸类似物与所述第二核苷酸类似物具有不同的碱基；
所述第一核苷酸类似物和所述第二核苷酸类似物与所述第四核苷酸类似物具有不同的碱基；以及
所述第三核苷酸类似物与所述第四核苷酸类似物具有不同的碱基。
7.根据权利要求6所述的核苷酸类似物混合物，其特征在于，式(I)所示结构为下列之一的结构：
8.根据权利要求6所述的核苷酸类似物混合物，其特征在于，所述第一核苷酸类似物具有式(5)所示的结构：
所述第二核苷酸类似物具有式(6)所示的结构：
所述第三核苷酸类似物具有式(2)所示的结构：
所述第四核苷酸类似物具有式(1)所示的结构：
所述第五核苷酸类似物具有式(7)所示的结构：
9.一种试剂盒，包括：
权利要求6所述的核苷酸类似物混合物。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，进一步包括：
切断试剂，所述切断试剂可作用于可切割基团或者可切割键。
11.一种进行聚合酶反应的方法，其特征在于，包括：
(1)将含有单链模板、引物、权利要求6所述的核苷酸类似物混合物以及聚合酶的混合物置于适于引物延伸的条件，
其中，所述引物与所述单链模板的一部分匹配，以便在所述引物的3'末端仅延伸一个第一新核苷酸。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述单链模板或引物固定在固相载体上。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述单链模板或引物固定在芯片上。
14.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，进一步包括：
(2)切除所述第一新核苷酸的所述聚合酶反应阻断基团，并返回至步骤(1)以便在所述第一新核苷酸的核糖或脱氧核糖的3'末端继续延伸仅一个第二新核苷酸。
15.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，在步骤(1)之后，进一步包括：
(1-1)分别检测所述第一新碱基的荧光信号和磷光信号。
16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，在步骤(1-1)之前进一步包括：移除延伸所述第一新核苷酸后体系中反应物。
17.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，在步骤(1-1)之后，进一步包括：
(1-2)基于所述荧光信号和磷光信号的至少之一，确定所述第一新碱基和所述单链模板上与所述第一新碱基所对应位置碱基至少之一的类型。
18.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，所述荧光信号和磷光信号同时存在表示所述第一新核苷酸的碱基为所述第一核苷酸类似物和第三核苷酸类似物所对应的碱基，
所述荧光信号和所述磷光信号均不存在表示所述第一新核苷酸的碱基为所述第五核苷酸类似物所对应的碱基，
存在所述荧光信号，但不存在所述磷光信号表示所述第一新核苷酸的碱基为所述第二核苷酸类似物所对应的碱基，
不存在所述荧光信号，但存在所述磷光信号表示所述第一新核苷酸为所述第四核苷酸类似物所对应的碱基。
19.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，在步骤(1-2)中，采用400～480nm的激发波长，以及500～570nm的信号采集滤波片。
20.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，所述荧光信号在激发光打开的时间段采集，所述磷光信号在激发光关闭之后0.5～100毫秒之间采集。
21.一种核酸序列测定方法，其特征在于，包括：利用权利要求11～20任一项所述的方法对待测核酸序列进行可控链式聚合酶反应。
22.一种测序仪，其特征在于，包括：
壳体；
链式聚合酶反应区域，所述链式聚合酶反应区域设置在所述壳体中；
激发光发射器，所述激光发射器适于向所述链式聚合酶反应区域发射预定波长的激发光；
信号采集装置，所述信号采集装置适于采集所述链式聚合酶反应区域中的荧光信号和磷光信号；以及
控制器，所述控制器分别与所述信号采集装置和所述激光发射器相连，用于控制所述激发光发射器的开启和关闭，以及控制所述信号采集装置在采集荧光信号和所述磷光信号之间切换，所述控制器适于在所述激发光发射器启动的过程中，控制所述信号采集装置采集荧光信号，在关闭所述激发光发射器之后预定时间范围内采集所述磷光信号。
23.根据权利要求22所述的测序仪，其特征在于，所述信号采集装置包括：
相机；和
滤波片，所述滤波片的滤波范围是500～570nm。
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