JP2019031575A

JP2019031575A - アリールスルファターゼａのｃｎｓ送達の方法および組成物

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Publication number: JP2019031575A
Application number: JP2018226358A
Authority: JP
Inventors: サラマット−ミラーナジラ; Salamatmiller Nazila; テイラーキャサリン; Taylor Katherine; キャンポリートポール; Campolieto Paul; シャーロクザーラ; Zahra Shahrokh; パンジン; Jing Pan; チャーナスローレンス; Charnas Lawrence; リアライトテレサ; Leah Wright Teresa; カリアスペリクルス; Calias Pericles
Original assignee: Shire Human Genetics Therapies Inc
Current assignee: Shire Human Genetics Therapies Inc
Priority date: 2010-06-25
Filing date: 2018-12-03
Publication date: 2019-02-28
Anticipated expiration: 2031-06-25
Also published as: HUE031036T2; PL2588130T3; JP6522072B2; UA125060C2; CL2012003654A1; US20200113981A1; JP2016041755A; US20230026836A1; AR081679A1; JP2023099216A; AR081680A1; BR112012033214B1; DK3626257T3; JP2016094451A; TWI876260B; LT3626257T; ES2858726T3; CN106139133A; TW201701899A; HK1218719A1

Abstract

【課題】アリールスルファターゼＡのＣＮＳ送達の方法および組成物の提供。【解決手段】本発明は、特に、リソソーム蓄積症を有効に治療する目的で、リソソーム酵素をＣＮＳ送達するための組成物および方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、直接ＣＮＳ髄腔内投与するための安定な製剤であって、異染性白質ジストロフィー症の治療のために、アリールスルファターゼＡ（ＡＳＡ）タンパク質と、塩と、ポリソルベート界面活性剤とを含む安定な製剤を含む。様々な実施形態では、本発明は、直接ＣＮＳ髄腔内投与するための安定な製剤であって、アリールスルファターゼＡ（ＡＳＡ）タンパク質と、塩と、ポリソルベート界面活性剤とを含む安定な製剤を含む。【選択図】なし

Description

（関連出願の相互参照）
本願は、米国特許仮出願第６１／３５８，８５７号（２０１０年６月２５日出願）；第６１／３６０，７８６（２０１０年７月１日出願）；第６１／３８７，８６２号（２０１０年９月２９日出願）；第６１／４３５，７１０号（２０１１年１月２４日出願）；第６１／４４２，１１５号（２０１１年２月１１日出願）；第６１／４７６，２１０号（２０１１年４月１５日出願）；および第６１／４９５，２６８号（２０１１年６月９日出願）に対する優先権を主張し、これらの記載内容は各々、参照により本明細書に援用される。

本願は、米国特許出願表題「ＣＮＳＤｅｌｉｖｅｒｙｏｆＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃＡｇｅｎｔｓ」（同日出願）、「ＭｅｔｈｏｄｓａｎｄＣｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓｆｏｒＣＮＳＤｅｌｉｖｅｒｙｏｆＨｅｐａｒａｎＮ−Ｓｕｌｆａｔａｓｅ」（同日出願）、「ＭｅｔｈｏｄｓａｎｄＣｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓｆｏｒＣＮＳＤｅｌｉｖｅｒｙｏｆＩｄｕｒｏｎａｔｅ−２−Ｓｕｌｆａｔａｓｅ」（同日出願）、「ＭｅｔｈｏｄｓａｎｄＣｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓｆｏｒＣＮＳＤｅｌｉｖｅｒｙｏｆ β−Ｇａｌａｃｔｏｃｅｒｅｂｒｏｓｉｄａｓｅ」（同日出願）、「ＴｒｅａｔｍｅｎｔｏｆＳａｎｆｉｌｉｐｐｏＳｙｎｄｒｏｍｅＴｙｐｅＢ」（同日出願）に関連し、これらの記載内容は各々、参照により本明細書に援用される。

酵素補充療法（ＥＲＴ）は、対象への天然または組換え的に得られるタンパク質および／または酵素の全身投与を伴う。認可療法は、典型的には、対象に静脈内投与され、一般的には、根元的酵素欠乏の身体症状を治療するのに有効である。中枢神経系（ＣＮＳ）の細胞および組織中への静脈内投与タンパク質および／または酵素の限定的分布の結果として、静脈内投与タンパク質および／または酵素は血液−脳関門（ＢＢＢ）を適切に横断しないため、ＣＮＳ病因を有する疾患の治療は特に挑戦的であった。

血液−脳関門（ＢＢＢ）は、ＢＢＢを横切って、根元的脳脊髄液（ＣＳＦ）およびＣＮＳ中に、血流中の有害物質、例えば細菌、高分子物質（例えばタンパク質）およびその他の親水性分子が分散するのを制限することにより、このような物質から中枢神経系（ＣＮＳ）を保護するよう機能する内皮細胞からなる構造系である。

直接脳内注射、ＢＢＢの一過性透過処理ならびに組織分布を変更するための活性作用物質の改質を含めて、治療薬の脳送達を増強するためにＢＢＢを迂回するいくつかの方法がある。脳組織中への治療薬の直接注射は血管系を完全に迂回するが、しかし、頭蓋内注射により背負い込まれる合併症（感染、組織損傷、免疫応答性）、ならびに投与部位からの活性作用物質の不十分な拡散の危険を主に蒙る。今までのところ、脳物質中へのタンパク質の直接投与は、拡散バリアおよび投与され得る治療薬の用量限定のため、有意の治療効果を達成していない。緩徐長期注入を用いた脳実質中に配置されるカテーテルによる対流拡散（非特許文献１、非特許文献２）が研究されてきたが、しかし長期療法のためにこのアプローチを一般に用いる認可療法はない。さらに、脳内カテーテルの配置は、非常に侵襲性であり、臨床的代替法として余り望ましくない。

髄腔内（ＩＴ）注射または脳脊髄液（ＣＳＦ）へのタンパク質の投与も試みられてきたが、しかし未だに治療的成功を見ていない。この治療における大きな挑戦は、脳室の上衣内張りを非常に堅く結合する活性作用物質の傾向であって、これがその後の拡散を妨げた。一般に、ＣＳＦへの直接的投与による脳遺伝子疾患の治療のための認可物質はない。
実際、脳の表面での拡散に対するバリア、ならびに有効且つ便利な送達方法の欠如は、任意の疾患に関する脳における適切な治療効果を達成するには大きすぎる障害物である、と多くの人々が考えていた。

Ｂｏｂｏ，ｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ９１，２０７６−２０８０ (１９９４) Ｎｇｕｙｅｎ，ｅｔａｌ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．９８，５８４−５９０ (２００３)

多数のリソソーム蓄積障害は神経系に影響を及ぼし、したがって伝統的療法でこれらの疾患を治療するに際して独特の挑戦を実証する。罹患個体のニューロンおよび髄膜において、グリコサミノグリカン（ＧＡＣ）の大きな蓄積がしばしば認められ、種々の型のＣＮＳ症状を生じさせる。今までのところ、リソソーム障害に起因するＣＮＳ症状は、利用可能な任意の手段により首尾よく治療されてきた。

したがって、脳に治療薬を有効に送達する必要性が依然として大いに存在する。さらに特定的には、リソソーム蓄積障害の治療のために中枢神経系に活性作用物質をより有効に送達することが大いに必要とされている。

本発明は、例えば、以下を提供する：
（項目１）
髄腔内投与用の安定な製剤であって、アリールスルファターゼＡ（ＡＳＡ）タンパク質と、塩と、ポリソルベート界面活性剤とを含む安定な製剤。
（項目２）
前記ＡＳＡタンパク質が約０〜１００ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度で存在する、項目１に記載の安定な製剤。
（項目３）
前記ＡＳＡタンパク質が、１０ｍｇ／ｍＬ、３０ｍｇ／ｍＬ、５０ｍｇ／ｍＬ、または１００ｍｇ／ｍＬから選択した濃度で存する、項目１または２に記載の安定な製剤。
（項目４）
前記ＡＳＡタンパク質が配列番号１のアミノ酸配列を含む、項目１〜３のいずれか一項に記載の安定な製剤。
（項目５）
前記ＡＳＡタンパク質がヒト細胞株から生成される、項目１〜４のいずれか一項に記載の安定な製剤。
（項目６）
前記ＡＳＡタンパク質がＣＨＯ細胞から生成される、項目１〜４のいずれか一項に記載の安定な製剤。
（項目７）
前記塩がＮａＣｌである、項目１〜６のいずれか一項に記載の安定な製剤。
（項目８）
前記ＮａＣｌが、約０〜３００ｍＭの範囲の濃度で存在する、項目７に記載の安定な製剤。
（項目９）
前記ＮａＣｌが、約１３７〜１５４ｍＭの範囲の濃度で存在する、項目７に記載の安定な製剤。
（項目１０）
前記ＮａＣｌが、約１５４ｍＭの濃度で存在する、項目９に記載の安定な製剤。
（項目１１）
前記ポリソルベート界面活性剤が、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、ポリソルベート８０、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、項目１〜１０のいずれか一項に記載の安定な製剤。
（項目１２）
前記ポリソルベート界面活性剤がポリソルベート２０である、項目１１に記載の安定な製剤。
（項目１３）
前記ポリソルベート２０が、約０〜０．２％の範囲の濃度で存在する、項目１２に記載の安定な製剤。
（項目１４）
ポリソルベート２０が、約０．００５％の濃度で存在する、項目１３に記載の安定な製剤。
（項目１５）
緩衝剤をさらに含む、項目１４に記載の安定な製剤。
（項目１６）
前記緩衝剤が、リン酸塩、酢酸塩、ヒスチジン、コハク酸塩、クエン酸塩、トリス、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、項目１５に記載の安定な製剤。
（項目１７）
前記緩衝剤がリン酸塩である、項目１〜１６のいずれか一項に記載の安定な製剤。
（項目１８）
前記リン酸塩が５０ｍＭ以下の濃度で存在する、項目１７に記載の安定な製剤。
（項目１９）
前記リン酸塩が２０ｍＭ以下の濃度で存在する、項目１７に記載の安定な製剤。
（項目２０）
ｐＨが約３〜８．０である、項目１〜１９のいずれか一項に記載の安定な製剤。
（項目２１）
ｐＨが約６．０〜６．５である、項目２０に記載の安定な製剤。
（項目２２）
ｐＨが約６．０である、項目２１に記載の安定な製剤。
（項目２３）
液状製剤である、項目１〜２２のいずれか一項に記載の安定な製剤。
（項目２４）
凍結乾燥粉末として調合される、項目１〜１５のいずれか一項に記載の安定な製剤。
（項目２５）
安定化剤をさらに含む、項目１７に記載の安定な製剤。
（項目２６）
前記安定化剤が、ショ糖、グルコース、マンニトール、ソルビトール、ＰＥＧ４０００、ヒスチジン、アルギニン、リジン、リン脂質、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、項目２５に記載の安定な製剤。
（項目２７）
髄腔内投与用の安定な製剤であって、アリールスルファターゼＡ（ＡＳＡ）タンパク質と、塩と、緩衝剤とを含む安定な製剤。
（項目２８）
前記ＡＳＡタンパク質が、約０〜１００ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度である、項目２７に記載の安定な製剤。
（項目２９）
前記緩衝剤が、リン酸塩、酢酸塩、ヒスチジン、コハク酸塩、クエン酸塩、トリス、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、項目２７または２８に記載の安定な製剤。
（項目３０）
前記緩衝剤がリン酸塩である、項目２９に記載の安定な製剤。
（項目３１）
前記リン酸塩が、約２０ｍＭ以下の濃度である、項目３０に記載の安定な製剤。
（項目３２）
前記リン酸塩が、約５０ｍＭ以下の濃度である、項目３１に記載の安定な製剤。
（項目３３）
ポリソルベート界面活性剤をさらに含む、項目２７〜３１のいずれか一項に記載の安定な製剤。
（項目３４）
前記ポリソルベート界面活性剤が、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、ポリソルベート８０、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、項目３３に記載の安定な製剤。
（項目３５）
前記ポリソルベート界面活性剤が約０〜０．２％の範囲の濃度で存在する、項目３３または３４に記載の安定な製剤。
（項目３６）
ｐＨが約６．０〜６．５である、項目２７〜３５のいずれか一項に記載の安定な製剤。
（項目３７）
項目１〜３６のいずれか一項に記載の安定な製剤の単一剤形を含む容器。
（項目３８）
アンプル、バイアル、カートリッジ、レザバー、Ｌｙｏ−ｊｅｃｔ、または前充填した注射器から選択される、項目３７に記載の容器。
（項目３９）
前充填した注射器である、項目３７または３８のいずれか一項に記載の容器。
（項目４０）
前記前充填した注射器が、シリコーンの焼付コーティングを有するホウケイ酸ガラス注射器、スプレーしたシリコーンを有するホウケイ酸ガラス注射器、または、シリコーンを含まないプラスチック樹脂注射器から選択される、項目３９に記載の容器。
（項目４１）
前記安定な製剤が約５０．０ｍＬ未満の体積で存在する、項目３７〜４０のいずれか一項に記載の容器。
（項目４２）
前記安定な製剤が約５．０ｍＬ未満の体積で存在する、項目３７〜４０のいずれか一項に記載の容器。
（項目４３）
異染性白質ジストロフィー（ＭＬＤ）症の治療方法であって、
治療の必要な対象に、項目１〜２９のいずれか一項に記載の製剤を髄腔内投与するステップ
を含む方法。
（項目４４）
前記製剤の髄腔内投与によって、前記対象において実質的な副作用が生じない、項目４３に記載の方法。
（項目４５）
前記製剤の髄腔内投与によって、前記対象において、実質的なＴ細胞媒介性適応免疫反応が生じない、項目４４に記載の方法。
（項目４６）
前記製剤の髄腔内投与によって、ＡＳＡタンパク質を深部の脳白質の乏突起グリア細胞に送達する、項目４３〜４５のいずれか一項に記載の方法。
（項目４７）
前記ＡＳＡタンパク質をニューロン、グリア細胞、血管周囲細胞、および／または髄膜細胞に送達する、項目４３〜４６のいずれか一項に記載の方法。
（項目４８）
前記ＡＳＡタンパク質をさらに脊髄のニューロンに送達する、項目４３〜４７のいずれか一項に記載の方法。
（項目４９）
前記製剤の髄腔内投与によってさらに、末梢標的組織中の前記ＡＳＡタンパク質を全身送達する、項目４３〜４８のいずれか一項に記載の方法。
（項目５０）
前記末梢標的組織が、肝臓、腎臓、および／または心臓から選択される、項目４９に記載の方法。
（項目５１）
前記製剤の髄腔内投与によって、脳標的組織、脊髄ニューロン、および／または末梢標的組織におけるリソソーム局在化が生じる、項目４３〜５０のいずれか一項に記載の方法。
（項目５２）
前記製剤の髄腔内投与によって、脳標的組織、脊髄ニューロン、および／または末梢標的組織におけるスルファチド蓄積量が減少する、項目４３〜５１のいずれか一項に記載の方法。
（項目５３）
前記スルファチド蓄積量が対照と比較して少なくとも２０％、４０％、５０％、６０％、８０％、９０％、１倍、１．５倍、または２倍減少する、項目５２に記載の方法。
（項目５４）
前記製剤の髄腔内投与によって、ＣＮＳおよびＰＮＳ内での進行性脱髄および軸索消失が低減される、項目４３〜５３のいずれか一項に記載の方法。
（項目５５）
前記製剤の髄腔内投与によって、脳標的組織、脊髄ニューロン、および／または末梢標的組織におけるＡＳＡの酵素活性が増大する、項目４３〜５４のいずれか一項に記載の方法。
（項目５６）
前記ＡＳＡの酵素活性が対照と比較して少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、または１０倍増大する、項目５６に記載の方法。
（項目５７）
前記増大したＡＳＡの酵素活性が少なくとも約１０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、２０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、４０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、５０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、６０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、７０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、８０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、９０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、１００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、１５０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、２００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、２５０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、３００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、３５０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、４００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、４５０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、５００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、５５０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、または６００ｎｍｏｌ／時・ｍｇである、項目５５または５６に記載の方法。
（項目５８）
前記ＡＳＡの酵素活性が腰部領域で増大する、項目５５に記載の方法。
（項目５９）
前記腰部領域で増大したＡＳＡの酵素活性が少なくとも約２０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、３０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、４０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、５０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、６０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、７０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、８０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、９０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、または１０,０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇである、項目５８に記載の方法。
（項目６０）
前記製剤の髄腔内投与によって、ＭＬＤ症の少なくとも１つの症状または特徴の強度、重症度、もしくは頻度が低減されるか、またはＭＬＤの少なくとも１つの症状または特徴が遅発する、項目４３〜５９のいずれか一項に記載の方法。
（項目６１）
ＭＬＤ症の前記少なくとも１つの症状または特徴が、頭蓋内圧増大、真空水頭症、中枢および末梢神経系と内臓器官とにおけるミエリン鞘中の硫酸化糖脂質蓄積、ＣＮＳおよびＰＮＳ内の進行性脱髄および軸索損失、ならびに／または運動および認知機能障害である、項目６０に記載の方法。
（項目６２）
前記髄腔内投与を２週間に１回実施する、項目４３〜６１のいずれか一項に記載の方法。
（項目６３）
前記髄腔内投与を１ヶ月に１回実施する、項目４３〜６１のいずれか一項に記載の方法。
（項目６４）
前記髄腔内投与を２ヶ月に１回実施する、項目４３〜６１のいずれか一項に記載の方法。
（項目６５）
前記髄腔内投与を静脈内投与と併用する、項目４３〜６４のいずれか一項に記載の方法。
（項目６６）
前記静脈内投与が１ヶ月に１回以下の頻度である、項目６５に記載の方法。
（項目６７）
前記静脈内投与が２ヶ月に１回以下の頻度である、項目６５に記載の方法。
（項目６８）
前記髄腔内投与を静脈内投与の非存在下で用いる、項目４３〜６４のいずれか一項に記載の方法。
（項目６９）
前記髄腔内投与を併用免疫抑制療法の非存在下で用いる、項目４３〜６８のいずれか一項に記載の方法。
本発明は、中枢神経系（ＣＮＳ）への治療薬の直接送達のための有効且つ低侵襲性のアプローチを提供する。本発明は、一部は、酵素が種々の表面を横断して有効に且つ広範に拡散して、深部脳領域を含めて脳を横断する種々の領域に浸透するよう、リソソーム蓄積症（例えばＭＬＤ）のための補充酵素（例えばアリールスルファターゼＡ（ＡＳＡ））が高濃度（例えば、約３ｍｇ／ｍｇ以上、４ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ以上）での治療を必要とする対象の脳脊髄液（ＣＳＦ）中に直接的に導入され得る、という予期せぬ発見に基づいている。さらに意外なことに、単なる生理食塩水または緩衝液ベースの製剤を用いて、そして対象において実質的副作用、例えば重篤な免疫応答を誘導することなく、このような高タンパク質濃度送達を実施することができることを本発明人等は実証した。したがって、本発明は、ＣＮＳ構成成分を有する種々の疾患および障害、特にリソソーム蓄積症の治療のための直接ＣＮＳ送達のための非常に効率的な、臨床的に望ましい、且つ患者に優しいアプローチを提供する。本発明は、ＣＮＳターゲッティングおよび酵素補充療法の分野における有意の進歩を示す。

後で詳細に説明するとおり、本発明者は、アリールスルファターゼＡ（ＡＳＡ）タンパク質を有効に髄腔内（ＩＴ）投与するための安定な製剤を開発することに成功した。ただし、本明細書に記載されている様々な安定な製剤は一般に、様々なその他のリソソーム酵素を含む治療薬のＣＮＳ送達に適していると考えられる。実際、本発明による安定な製剤は、様々な技法および経路（実質内投与、脳内投与、大脳脳室内（ＩＣＶ）投与、髄腔内（例えばＩＴ−腰椎投与、ＩＴ−大槽）投与、ならびに、ＣＮＳおよび／またはＣＳＦに直接または間接的に注入するためのその他のいずれかの技法および経路が挙げられるが、これらに限定されない）によるＣＮＳ送達に用いることができる。

本明細書に記載されている様々な安定な製剤は一般に、リソソーム蓄積症に対する様々な補充酵素を含む治療用タンパク質のような他の治療薬のＣＮＳ送達にも適していると考えられる。いくつかの実施形態では、補充酵素は、合成酵素、組換え酵素、遺伝子活性化酵素、または天然の酵素であることができる。

様々な実施形態では、本発明は、直接ＣＮＳ髄腔内投与するための安定な製剤であって、アリールスルファターゼＡ（ＡＳＡ）タンパク質と、塩と、ポリソルベート界面活性剤とを含む安定な製剤を含む。いくつかの実施形態では、このＡＳＡタンパク質は、約１〜３００ｍｇ／ｍＬ（例えば１〜２５０ｍｇ／ｍＬ、１〜２００ｍｇ／ｍＬ、１〜１５０ｍｇ／ｍＬ、１〜１００ｍｇ／ｍＬ、１〜５０ｍｇ／ｍＬ）の範囲の濃度で存在する。いくつかの実施形態では、上記のＡＳＡタンパク質は、２ｍｇ／ｍＬ以下、３ｍｇ／ｍＬ以下、４ｍｇ／ｍＬ以下、５ｍｇ／ｍＬ以下、１０ｍｇ／ｍＬ以下、１５ｍｇ／ｍＬ以下、２０ｍｇ／ｍＬ以下、２５ｍｇ／ｍＬ以下、３０ｍｇ／ｍＬ以下、３５ｍｇ／ｍＬ以下、４０ｍｇ／ｍＬ以下、４５ｍｇ／ｍＬ以下、５０ｍｇ／ｍＬ以下、６０ｍｇ／ｍＬ以下、７０ｍｇ／ｍＬ以下、８０ｍｇ／ｍＬ以下、９０ｍｇ／ｍＬ以下、１００ｍｇ／ｍＬ以下、１５０ｍｇ／ｍＬ以下、２００ｍｇ／ｍＬ以下、２５０ｍｇ／ｍＬ以下、または３００ｍｇ／ｍＬ以下から選択した濃度で存在する。

様々な実施形態では、本発明は、本明細書に記載されている実施形態のいずれかの安定な製剤であって、そのＡＳＡタンパク質が配列番号１のアミノ酸配列を含む安定な製剤を含む。いくつかの実施形態では、そのＡＳＡタンパク質は、配列番号１と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている実施形態のいずれかの安定な製剤は塩を含む。いくつかの実施形態では、この塩はＮａＣｌである。いくつかの実施形態では、このＮａＣｌは、約０〜３００ｍＭ（例えば０〜２５０ｍＭ、０〜２００ｍＭ、０〜１５０ｍＭ、０〜１００ｍＭ、０〜７５ｍＭ、０〜５０ｍＭ、または０〜３０ｍＭ）の範囲の濃度で存在する。いくつかの実施形態では、ＮａＣｌは約１３７〜１５４ｍＭの範囲の濃度で存在する。いくつかの実施形態では、ＮａＣｌは、約１５４ｍＭの濃度で存在する。

様々な実施形態では、本発明は、本明細書に記載されている実施形態のいずれかの安定な製剤であって、そのポリソルベート界面活性剤が、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、ポリソルベート８０、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される安定な製剤を含む。いくつかの実施形態では、ポリソルベート界面活性剤はポリソルベート２０である。いくつかの実施形態では、ポリソルベート２０は、約０〜０．０２％の範囲の濃度で存在する。いくつかの実施形態では、ポリソルベート２０は約０．００５％の濃度で存在する。

様々な実施形態では、本発明は、本明細書に記載されている実施形態のいずれかの安定な製剤であって、緩衝剤をさらに含む安定な製剤を含む。いくつかの実施形態では、この緩衝剤は、リン酸塩、酢酸塩、ヒスチジン、コハク酸塩、トリス、およびこれらの組み合わせからなる群から選択する。いくつかの実施形態では、緩衝剤はリン酸塩である。いくつかの実施形態では、リン酸塩は、５０ｍＭ以下（例えば４５ｍＭ以下、４０ｍＭ以下、３５ｍＭ以下、３０ｍＭ下、２５ｍＭ下、２０ｍＭ下、１５ｍＭ下、１０ｍＭ下、または５ｍＭ以下）の濃度で存在する。いくつかの実施形態では、リン酸塩は２０ｍＭ以下の濃度で存在する。様々な態様では、本発明は、本明細書に記載されている実施形態のいずれかの安定な製剤であって、ｐＨが約３〜８（例えば約４〜７．５、５〜８、５〜７．５、５〜６．５、５〜７．０、５．５〜８．０、５．５〜７．７、５．５〜６．５、６〜７．５、または６〜７．０）である安定な製剤を含む。いくつかの実施形態では、その製剤のｐＨは約５．５〜６．５（例えば５．５、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、または６．５）である。いくつかの実施形態では、その製剤のｐＨは約６．０である。

様々な実施形態では、本発明は、本明細書に記載されている実施形態のいずれかの安定な製剤であって、液状製剤である安定な製剤を含む。様々な実施形態では、本発明は、本明細書に記載されている実施形態のいずれかの安定な製剤であって、凍結乾燥粉末として調合されている安定な製剤を含む。

いくつかの実施形態では、本発明は、髄腔内投与用の安定な製剤であって、約１〜３００ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度のアリールスルファターゼＡ（ＡＳＡ）タンパク質と、約１５４ｍＭの濃度のＮａＣｌと、約０．００５％の濃度のポリソルベート２０とを含み、ｐＨが約６．０である安定な製剤を含む。いくつかの実施形態では、上記のＡＳＡタンパク質は、約１０ｍｇ／ｍＬの濃度である。いくつかの実施形態では、上記のＡＳＡタンパク質は、約３０ｍｇ／ｍＬ、４０ｍｇ／ｍＬ、５０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍｇ／ｍＬ、１５０ｍｇ／ｍＬ、２００ｍｇ／ｍＬ、２５０ｍｇ／ｍＬ、または３００ｍｇ／ｍＬの濃度である。

様々な態様では、本発明は、本明細書に記載されている様々な実施形態における安定な製剤の単一剤形を含む容器を含む。いくつかの実施形態では、この容器は、アンプル、バイアル、瓶、カートリッジ、レザバー、Ｌｙｏ−ｊｅｃｔ、または前充填した注射器から選択する。いくつかの実施形態では、この容器は前充填した注射器である。いくつかの実施形態では、前充填した注射器は、シリコーンの焼付コーティングを有するホウケイ酸ガラス注射器、スプレーしたシリコーンを有するホウケイ酸ガラス注射器、またはシリコーンを含まないプラスチック樹脂注射器から選択する。いくつかの実施形態では、安定な製剤は、約５０ｍＬ未満（例えば約４５ｍｌ未満、４０ｍｌ未満、３５ｍｌ未満、３０ｍｌ未満、２５ｍｌ未満、２０ｍｌ未満、１５ｍｌ未満、１０ｍｌ未満、５ｍｌ未満、４ｍｌ未満、３ｍｌ未満、２．５ｍｌ未満、２．０ｍｌ未満、１．５ｍｌ未満、１．０ｍｌ未満、または０．５ｍｌ未満）の体積で存在する。いくつかの実施形態では、安定な製剤は、約３．０ｍＬ未満の体積で存在する。

様々な態様では、本発明は、異染性白質ジストロフィー症の治療方法であって、本明細書に記載されている実施形態のいずれかによる製剤を、治療の必要な対象に髄腔内投与するステップを含む方法を含む。

いくつかの実施形態では、本発明は、異染性白質ジストロフィー症の治療方法であって、約１〜３００ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度のアリールスルファターゼＡ（ＡＳＡ）タンパク質と、約１５４ｍＭの濃度のＮａＣｌと、約０．００５％の濃度のポリソルベート２０とを含み、ｐＨが約６である製剤を、治療の必要な対象に髄腔内投与するステップを含む方法を含む。

いくつかの実施形態では、上記の髄腔内投与によって、実質的な副作用（例えば重度の免疫反応）が対象に起こらない。いくつかの実施形態では、上記の髄腔内投与によって、実質的なＴ細胞媒介性適応免疫反応が対象に起こらない。

いくつかの実施形態では、本発明の製剤の髄腔内投与によって、アリールスルファターゼＡタンパク質が、脳、脊髄、および／または末梢器官内の様々な標的組織に送達される。いくつかの実施形態では、本発明の製剤の髄腔内投与によって、アリールスルファターゼＡタンパク質が標的脳組織に送達される。いくつかの実施形態では、この脳標的組織は、白質および／または灰白質内のニューロンを含む。いくつかの実施形態では、アリールスルファターゼＡタンパク質は、ニューロン、グリア細胞、血管周囲細胞、および／または髄膜細胞に送達される。いくつかの実施形態では、アリールスルファターゼＡタンパク質はさらに、脊髄内のニューロンに送達される。

いくつかの実施形態では、本発明の製剤の髄腔内投与によってさらに、末梢標的組織中のＡＳＡタンパク質が全身送達される。いくつかの実施形態では、この末梢標的組織は、肝臓、腎臓、脾臓、および／または心臓から選択する。

いくつかの実施形態では、本発明の製剤の髄腔内投与によって、脳標的組織、脊髄ニューロン、および／または末梢標的組織におけるリソソーム局在化が生じる。いくつかの実施形態では、本発明の製剤の髄腔内投与によって、脳標的組織、脊髄ニューロン、および／または末梢標的組織におけるスルファチド蓄積量が減少する。いくつかの実施形態では、このスルファチド蓄積量は、対照（例えば対象における治療前のＧＡＧ蓄積量）と比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１倍、１．５倍、または２倍減少する。いくつかの実施形態では、本発明の製剤の髄腔内投与によって、ニューロンの空胞形成が低減される（例えば、対照と比較して少なくとも２０％、４０％、５０％、６０％、８０％、９０％、１倍、１．５倍、または２倍）。いくつかの実施形態では、このニューロンはプルキンエ細胞を含む。

いくつかの実施形態では、本発明の製剤の髄腔内投与によって、脳標的組織、脊髄ニューロン、および／または末梢標的組織におけるＡＳＡの酵素活性が増大する。いくつかの実施形態では、このＡＳＡの酵素活性は、対照（例えば対象における治療前の内因性酵素活性）と比較して、少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、または１０倍増大する。いくつかの実施形態では、増大したＡＳＡの酵素活性は少なくとも約１０ｎｍｏｌ／時間／ｍｇ、２０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、４０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、５０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、６０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、７０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、８０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、９０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、１００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、１５０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、２００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、２５０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、３００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、３５０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、４００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、４５０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、５００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、５５０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、または６００ｎｍｏｌ／時・ｍｇである。

いくつかの実施形態では、ＡＳＡの酵素活性は腰部領域で増大する。いくつかの実施形態では、腰部領域における、増大したＡＳＡの酵素活性は少なくとも約２０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、３０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、４０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、５０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、６０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、７０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、８０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、９０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、または１０,０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇである。

いくつかの実施形態では、本発明の製剤の髄腔内投与によって、ＭＬＤの少なくとも１つの症状または特徴の強度、重症度、もしくは頻度が低減されるか、またはＭＬＤの少なくとも１つの症状または特徴が遅発する。いくつかの実施形態では、ＭＬＤの少なくとも１つの症状または特徴は、認知障害、白質損傷、脳の実質組織、神経節、脳梁、および／もしくは脳幹における血管周囲空隙拡大、萎縮、ならびに／または脳室拡大である。

いくつかの実施形態では、髄腔内投与は２週間に１回実施する。いくつかの実施形態では、髄腔内投与は１ヶ月に１回実施する。いくつかの実施形態では、髄腔内投与は２ヶ月に１回実施する。いくつかの実施形態では、髄腔内投与を静脈内投与と併用する。いくつかの実施形態では、静脈内投与は、１週間に１回以下の頻度である。いくつかの実施形態では、静脈内投与は、２週間に１回以下の頻度である。いくつかの実施形態では、静脈内投与は、１ヶ月に１回以下の頻度である。いくつかの実施形態では、静脈内投与は、２ヶ月に１回以下の頻度である。特定の実施形態では、静脈内投与は、月々の投与の頻度（１週間に２回、１週間に１回、隔週、または１ヶ月に２回など）を上回らない。

いくつかの実施形態では、静脈内投与および髄腔内投与は同じ日に実施する。いくつかの実施形態では、静脈内および髄腔内投与は、互いに一定時間内、例えば少なくとも２日以内、少なくとも３日以内、少なくとも４日以内、少なくとも５日以内、少なくとも６日以内、少なくとも７日以内または少なくとも１週間以内には実施されない。いくつかの実施形態では、静脈内および髄腔内投与は、交互スケジュールで、例えば週１回、隔週、月２回または月１回、交互投与で実施される。いくつかの実施形態では、髄腔内投与は、例えば週１回、隔週、月２回または月１回の静脈内投与のスケジュールで、そのスケジュールの第３または第４または第５投与毎に、静脈内投与の代わりに髄腔内投与に取り替えられ得る。

いくつかの実施形態では、静脈内および髄腔内投与は、逐次的に実施され、例えば先ず、静脈内投与を実施し（例えば週１回、隔週、月２回または月１回用量投与を、２週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月または１年またはそれ以上の間）、その後、ＩＴ投与（例えば週１回、隔週、月２回または月１回用量投与を、２週間より長い間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月または１年またはそれ以上の間）を実施する。いくつかの実施形態では、髄腔内投与を先ず実施し（例えば週１回、隔週、月２回、月１回、２ヶ月に１回、３ヶ月に１回の用量投与を、２週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月または１年またはそれ以上の間）、その後、静脈内投与（例えば週１回、隔週、月２回または月１回用量投与を、２週間より長い間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月または１年またはそれ以上の間）を実施する。

いくつかの実施形態では、髄腔内投与は、静脈内投与の非存在下で用いる。

いくつかの実施形態では、髄腔内投与は、併用免疫抑制療法の非存在下で用いる。

ＩＶ投与後の例示的な血清中アリールスルファターゼＡ（ｒｈＡＳＡ）濃度データを示す図である。ＩＴ−腰椎投与後の例示的な血清中ｒｈＡＳＡ濃度データを示す図である。ＩＶ投与後の例示的なＣＳＦ中ｒｈＡＳＡ濃度を示す図である。ＩＴ−腰椎投与後の例示的なＣＳＦ中ｒｈＡＳＡ濃度を示す図である。緩衝剤およびｐＨがｒｈＡＳＡの熱安定性に及ぼす影響に関する例示的な解析を示す図である。４０±２℃で２週間置いた後のｒｈＡＳＡの例示的なＳＤＳ−ＰＡＧＥ（クマシー）解析を示す図である。５℃および２５℃で３ヶ月置いた後のＩＴ用製剤中のｒｈＡＳＡの例示的なＳＤＳ−ＰＡＧＥ（クマシー）解析を示す図である。４８時間攪拌した後（パネルＡ）および振盪した後（パネルＢ）の例示的なｒｈＡＳＡ薬剤物質および薬品の外観を示す図である。４８時間間攪拌した後の例示的なｒｈＡＳＡ薬品（Ｐ２０を含まない）（ｎ＝２）の外観と、ヘッドスペースがない場合（ｎ＝１）の外観を示す図である。塩酸で滴定した場合の、緩衝剤対照との比較におけるｒｈＡＳＡ薬剤物質の緩衝能を示す例示的なデータを示す図である。１Ｍの水酸化ナトリウムで滴定した場合の、緩衝剤対照との比較におけるｒｈＡＳＡ薬剤物質の緩衝能を示す例示的なデータを示す図である。生理食塩水（ｐＨ６．０）中の、様々な濃度の例示的なｒｈＡＳＡ試料を示す図である。１５４ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ５．９）中のｒｈＡＳＡの例示的なＳＥＣ−ＨＰＬＣ解析（ｐＨ５．５の移動相）を示す図である。１５４ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ５．９）中のｒｈＡＳＡの例示的なＳＥＣ−ＨＰＬＣ解析（ｐＨ７．０の移動相）を示す図である。１５４ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ５．）中のｒｈＡＳＡのベースラインおよび１１ヶ月の安定性試料の例示的なサイズ排除プロファイルを示す図である。処置後の脳組織、髄膜、浸潤巣（中用量および高用量群、雄雌）の例示的な顕微鏡写真を示す図である。処置後の脳組織、髄膜、浸潤巣（中用量および高用量群、雌雄）の例示的な顕微鏡写真を示す図である。処置後の脳組織、髄膜、浸潤巣（中用量および高用量群、雌雄）の例示的な顕微鏡写真を示す図である。ｒｈＡＳＡで処置した免疫寛容ＭＬＤマウスの脊髄の例示的なアルシアンブルー染色を示すとともに、１、８、１５および２２日目に５２０ｍｇ／脳１ｋｇの組換えｈＡＳＡまたはビヒクル対照を髄腔内注入した動物の頚髄のアルシアンブルー染色によって割り出した場合のスルファチド減少を示す例示的な結果を示す図である。図示されているように、組換えｈＡＳＡの髄腔内注入による処置によって、脊髄の頚椎領域を含む脊髄中のスルファチド蓄積量が減少した。ｒｈＡＳＡで処置した免疫寛容ＭＬＤマウスから採取したアルシアンブルー染色脊髄切片の例示的外形計測解析（外形計測解析により確定されるような総脊髄（Ｔ−脊髄）、総灰白質（Ｔ−ＧＭ）、腰椎灰白質（Ｌ−ＧＭ）、頚椎灰白質（Ｃ−ＧＭ）、総白質（Ｔ−ＷＭ）、腰椎白質（Ｌ−ＷＭ）および頚椎白質（Ｃ−ＷＭ）におけるアルシアンブルーの光学密度を示す結果を含む）を示す図である。図示されているように、ビヒクル対照と比較した場合、アルシアンブルー染色における統計学的に有意の低減がｒｈＡＳＡで処置した動物において観察された。ｒｈＡＳＡで処置した免疫寛容ＭＬＤマウスの白質（海馬采）におけるＬＡＭＰ染色の例示的低減を表わし、免疫組織化学により確定されるような海馬采におけるＬＡＭＰ−１レベルを示す例示的結果を表す。倍率＝２０倍。図示されているように、髄腔内注入ｒｈＡＳＡによる処置は、大脳白質におけるＬＡＭＰ−１の低減を生じた。ｒｈＡＳＡで処置した免疫寛容ＭＬＤマウスから採取した脳のＬＡＭＰ染色の例示的外形計測解析を示すとともに、２０ｍｇ／ｋｇ静脈内ｒｈＡＳＡ、３００ｍｇ／脳１ｋｇ髄腔内ｒｈＡＳＡ、５２０ｍｇ／脳１ｋｇ静脈内ｒｈＡＳＡで処置した動物またはビヒクル対照の、脳梁（ＣＣ）、海馬采（Ｆ）、小脳白質（ＣＢ−ＷＭ）および脳幹（ＢＳ）におけるＬＡＭＰ−１染色強度を示す結果を示す図である。６ヶ月間、ビヒクルを隔週（ＥＯＷ）ＩＴ投与後の投与若年カニクイザルの脳パンチ中のｒｈＡＳＡの例示的な濃度を示す図である（主剖検）。６ヶ月間、１．８ｍｇ／回でｒｈＡＳＡをＥＯＷＩＴ投与後の若年カニクイザルの脳パンチ中のｒｈＡＳＡの例示的な濃度を示す図である（主剖検）。６ヶ月間、６．０ｍｇ／回でＥＯＷＩＴ投与後の若年カニクイザルの脳パンチ中のｒｈＡＳＡの例示的な濃度を示す図である（主剖検）。６ヶ月間、１８．６ｍｇ／回でｒｈＡＳＡをＥＯＷＩＴ投与後の若年カニクイザルの脳パンチ中のｒｈＡＳＡの例示的な濃度を示す図である（主剖検）。６ヶ月間、（ＰＢＳ対照を）ＥＯＷＩＴ投与後の若年カニクイザルの脳パンチ中のＡＳＡの例示的な濃度を示す図である（回復剖検）。６ヶ月間、ビヒクルをＥＯＷＩＴ投与後の若年カニクイザルの脳パンチ中のｒｈＡＳＡの例示的な濃度を示す図である（回復剖検）。６ヶ月間、１．８ｍｇ／回でｒｈＡＳＡをＥＯＷＩＴ投与後の若年カニクイザルの脳パンチ中のｒｈＡＳＡの例示的な濃度を示す図である（回復剖検）。６ヶ月間、６．０ｍｇ／回でｒｈＡＳＡをＥＯＷＩＴ投与後の若年カニクイザルの脳パンチ中のｒｈＡＳＡの例示的な濃度を示す図である（回復剖検）。６ヶ月間、１８．６ｍｇ／回でｒｈＡＳＡをＥＯＷＩＴ投与後の若年カニクイザルの脳パンチ中のｒｈＡＳＡの例示的な濃度を示す図である（回復剖検）。デバイス対照、ビヒクル、１．８ｍｇ、６．０ｍｇ、および１８．６ｍｇで処置した動物の脳の表面から採取した選択パンチ中のｒｈＡＳＡの例示的な濃度を示す図である（雌雄別、デバイス対照データは回復剖検由来、他のデータはすべて主剖検由来）。デバイス対照、ビヒクル、１．８ｍｇ、６．０ｍｇ、および１８．６ｍｇで処置した動物の脳の深部白質域から採取した選択パンチ中のｒｈＡＳＡの例示的な濃度を示す図である（雌雄別、デバイス対照データは回復剖検由来、他のデータはすべて主剖検由来）。デバイス対照、ビヒクル、１．８ｍｇ、６．０ｍｇ、および１８．６ｍｇで処置した動物の脳の深部灰白質域から採取した選択パンチ中のｒｈＡＳＡの例示的な濃度を示す図である（雌雄別、デバイス対照データは回復剖検由来、他のデータはすべて主剖検由来）。デバイス対照、ビヒクル、１．８ｍｇ、６．０ｍｇ、および１８．６ｍｇで処置した動物の種々の領域から採取した選択パンチ中のｒｈＡＳＡの例示的な濃度を示す図である（雌雄別、デバイス対照データは回復剖検由来、他のデータはすべて主剖検由来）。６ヶ月間、ＥＯＷＩＴ投与後の若年カニクイザルの脊髄切片中のｒｈＡＳＡの例示的な濃度を示す図である（回復剖検）。６ヶ月間、ＥＯＷＩＴ投与後の若年カニクイザルの肝臓中のｒｈＡＳＡの例示的な濃度を示す図である（回復剖検）。特定の脳パンチの例示的な解剖学的位置を示す例示図である。特定の脳パンチの例示的な解剖学的位置を示す例示図である。特定の脳パンチの例示的な解剖学的位置を示す例示図である。特定の脳パンチの例示的な解剖学的位置を示す例示図である。特定の脳パンチの例示的な解剖学的位置を示す例示図である。特定の脳パンチの例示的な解剖学的位置を示す例示図である。ビヒクル、１．８ｍｇのｒｈＡＳＡ、または１８．６ｍｇのｒｈＡＳＡのいずれかを投与した成年および若年カニクイザルの脳組織から採取した抽出組織パンチ中の組換えヒトアリールスルファターゼＡ（ｒｈＡＳＡ）の濃度を示す図である。図４４Ａ〜Ｇの各々は、図３９に示した脳組織の領域に対応する。ビヒクル、１．８ｍｇのｒｈＡＳＡ、または１８．６ｍｇのｒｈＡＳＡのいずれかを投与した成年および若年カニクイザルの脳組織から採取した抽出組織パンチ中の組換えヒトアリールスルファターゼＡ（ｒｈＡＳＡ）の濃度を示す図である。図４４Ａ〜Ｇの各々は、図３９に示した脳組織の領域に対応する。ビヒクル、１．８ｍｇのｒｈＡＳＡ、または１８．６ｍｇのｒｈＡＳＡのいずれかを投与した成年および若年カニクイザルの脳組織から採取した抽出組織パンチ中の組換えヒトアリールスルファターゼＡ（ｒｈＡＳＡ）の濃度を示す図である。図４４Ａ〜Ｇの各々は、図３９に示した脳組織の領域に対応する。ビヒクル、１．８ｍｇのｒｈＡＳＡ、または１８．６ｍｇのｒｈＡＳＡのいずれかを投与した成年および若年カニクイザルの脳組織から採取した抽出組織パンチ中の組換えヒトアリールスルファターゼＡ（ｒｈＡＳＡ）の濃度を示す図である。図４４Ａ〜Ｇの各々は、図３９に示した脳組織の領域に対応する。ビヒクル、１．８ｍｇのｒｈＡＳＡ、または１８．６ｍｇのｒｈＡＳＡのいずれかを投与した成年および若年カニクイザルの脳組織から採取した抽出組織パンチ中の組換えヒトアリールスルファターゼＡ（ｒｈＡＳＡ）の濃度を示す図である。図４４Ａ〜Ｇの各々は、図３９に示した脳組織の領域に対応する。ビヒクル、１．８ｍｇのｒｈＡＳＡ、または１８．６ｍｇのｒｈＡＳＡのいずれかを投与した成年および若年カニクイザルの脳組織から採取した抽出組織パンチ中の組換えヒトアリールスルファターゼＡ（ｒｈＡＳＡ）の濃度を示す図である。図４４Ａ〜Ｇの各々は、図３９に示した脳組織の領域に対応する。ビヒクル、１．８ｍｇのｒｈＡＳＡ、または１８．６ｍｇのｒｈＡＳＡのいずれかを投与した成年および若年カニクイザルの脳組織から採取した抽出組織パンチ中の組換えヒトアリールスルファターゼＡ（ｒｈＡＳＡ）の濃度を示す図である。図４４Ａ〜Ｇの各々は、図３９に示した脳組織の領域に対応する。ｒｈＡＳＡを髄腔内（ＩＴ）または脳室内（ＩＣＶ）投与した成年および若年カニクイザルの深部白質（図４５Ａ）または深部灰白質（図４５Ｂ）脳組織中で検出された組換えヒトアリールスルファターゼＡ（ｒｈＡＳＡ）の濃度の例示的な比較を示す図である。図４６Ａは、１８．６または１．８ｍｇ用量の組換えヒトアリールスルファターゼＡ（ｒｈＡＳＡ）をＩＴ投与した若年（＜１２月齢）カニクイザルから得られたいくつかの組織パンチ中で検出されたｒｈＡＳＡの濃度を示す図である。図４０Ａ〜Ｂの両方に示したように、組織に送達されるｒｈＡＳＡの濃度は、２．５ｍｇ／ｍｇタンパク質の目標治療濃度内であったか、またはそうでなければそれを超えた。図４６Ａおよび図４６Ｂに示したパンチ数の各々に対応する脳組織の解剖学的領域を以下に示す。皮質下白質（１）；脳室周囲白質および深部白質（２）；皮質下白質（３）；皮質下白質（４）；内包（５）；内包尾状核（６）；深部白質（７）；皮質下白質および皮質（８）；被殻（９）；側頭部皮質下白質および皮質（１０）；深部灰白質（１１）；深部灰白質（１２）；前頭部脳室周囲＆皮質下（１３）；皮質下白質、皮質表在性大脳鎌周囲（１４）；脳梁および脳梁周囲皮質下白質（１５）；深部皮質下白質（１６）；深部灰白質（１７）；深部灰白質（１８）；脳室周囲白質（１９）；深部皮質下白質（２０）；海馬（２１）；脳梁（２２）；深部白質（２３）；皮質下白質、後頭葉（２４）；および小脳白質（２５）。図４７Ａは１．８ｍｇのｒｈＡＳＡをＩＴ投与したカニクイザルから抽出された深部白質組織の領域を示す図である。図４７Ｂは、深部白質組織の免疫染色、ならびに関連細胞中のＡＳＡの曝露分布を示す図である。図１４２Ｂでは、タンパク質（ＡＳＡ）は右下図に示されている。図４７Ｃは、ＩＴ投与したｒｈＡＳＡが、カニクイザルの深部白色組織において、特にリソソーム中で細胞小器官と共局在化したことを示す図である。図４７Ｃでは、ＡＳＡ免疫染色は上左図に示されている。図４７Ａは１．８ｍｇのｒｈＡＳＡをＩＴ投与したカニクイザルから抽出された深部白質組織の領域を示す図である。図４７Ｂは、深部白質組織の免疫染色、ならびに関連細胞中のＡＳＡの曝露分布を示す図である。図１４２Ｂでは、タンパク質（ＡＳＡ）は右下図に示されている。図４７Ｃは、ＩＴ投与したｒｈＡＳＡが、カニクイザルの深部白色組織において、特にリソソーム中で細胞小器官と共局在化したことを示す図である。図４７Ｃでは、ＡＳＡ免疫染色は上左図に示されている。図４７Ａは１．８ｍｇのｒｈＡＳＡをＩＴ投与したカニクイザルから抽出された深部白質組織の領域を示す図である。図４７Ｂは、深部白質組織の免疫染色、ならびに関連細胞中のＡＳＡの曝露分布を示す図である。図１４２Ｂでは、タンパク質（ＡＳＡ）は右下図に示されている。図４７Ｃは、ＩＴ投与したｒｈＡＳＡが、カニクイザルの深部白色組織において、特にリソソーム中で細胞小器官と共局在化したことを示す図である。図４７Ｃでは、ＡＳＡ免疫染色は上左図に示されている。カニクイザルに^１２４Ｉ標識化アリールスルファターゼＡ（ｒｈＡＳＡ）をＩＴ−またはＩＣＶ投与してから２４時間後、ＰＥＴスキャニングを用いてこの標識化ｒｈＡＳＡの分布を比較した図である。カニクイザルへのＩＣＶ投与直後の^１２４Ｉ標識化ＡＳＡの分布を示すとともに、２〜５時間後のＩＴ投与^１２４Ｉ標識化ＡＳＡの分布を比較する図である。図示されているように、ＩＴ投与は、ＩＣＶ投与に関して示されたものと同一の初期区画（脳槽および近位脊椎）に^１２４Ｉ標識化ＡＳＡを送達した。マウスモデルにおける例示的なＩＣＶおよびＩＴ投与を示す図である。例示的な髄腔内薬送達器具（ＩＤＤＤ）を示す図である。例示的なＰＯＲＴ−Ａ−ＣＡＴＣＨ（登録商標）というコンパクトな髄腔内埋め込み型アクセスシステムを示す図である。例示的な髄腔内薬送達器具（ＩＤＤＤ）を示す図である。例示的な髄腔内薬送達器具（ＩＤＤＤ）であって、ＣＮＳ酵素補充療法（ＥＲＴ）における在宅投与を可能にする器具を示す図である。固定機構を有する髄腔内薬送達器具（ＩＤＤＤ）の例示的な図である。図５６は、ＩＤＤＤを配置し得る、患者の身体の例示的な位置を示す図であり、図５６Ｂは、髄腔内薬送達器具（ＩＤＤＤ）の各種構成成分を示す図であり、図５６Ｃは、ＩＴ−腰椎注入の際の患者の身体への例示的な挿入位置を示す図である。図５６は、ＩＤＤＤを配置し得る、患者の身体の例示的な位置を示す図であり、図５６Ｂは、髄腔内薬送達器具（ＩＤＤＤ）の各種構成成分を示す図であり、図５６Ｃは、ＩＴ−腰椎注入の際の患者の身体への例示的な挿入位置を示す図である。図５６は、ＩＤＤＤを配置し得る、患者の身体の例示的な位置を示す図であり、図５６Ｂは、髄腔内薬送達器具（ＩＤＤＤ）の各種構成成分を示す図であり、図５６Ｃは、ＩＴ−腰椎注入の際の患者の身体への例示的な挿入位置を示す図である。

定義
本発明をより容易に理解するために、一定の用語を先ず以下で定義する。以下の用語および他の用語に関する付加的な定義は、本明細書全体を通して記述されている。

「約または約」は、本明細書中で用いる場合、「約」または「約」という用語は、１つ以上の当該値に適用される場合、記述参照値と類似する値を指す。ある実施形態では、「約」または「約」という用語は、別記しない限り、あるいはそうでない場合は本文から明らかな記述参照値のいずれかの方向で（より大きいかまたはより小さい）２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％またはそれ以下内にある一連の値を指す（このような数が考え得る値の１００％を超える場合を除く）。

「改善」：本明細書中で用いる場合、「改善」という用語は、ある状態の防止、低減または緩和、あるいは対象の状態の改善を意味する。改善は、疾患状態の完全回復または完全防止を包含するが、しかし必要とするわけではない。いくつかの実施形態では、改善は、関連疾患組織中に欠けている漸増レベルの関連タンパク質またはその活性を包含する。

「生物学的に活性な」：本明細書中で用いる場合、「生物学的に活性な」という語句は、生物学的系において、特に生物体において活性を有する任意の作用物質の特徴を指す。例えば、生物体に投与された場合、その生物体に及ぼす生物学的作用を有する作用物質は、生物学的に活性であるとみなされる。タンパク質またはポリペプチドが生物学的に活性である特定の実施形態では、当該タンパク質またはポリペプチドの少なくとも１つの生物学的活性を共有するそのタンパク質またはポリペプチドの一部分は、典型的には、「生物学的活性」部分として言及される。

「バルク剤」：本明細書中で用いる場合、「バルク剤」という用語は、凍結乾燥混合物に質量を付加し、凍結乾燥ケークの物理的構造に寄与する（例えば、開口構造を保持する本質的に均一な凍結乾燥ケークの生産を促す）化合物を指す。バルク剤の例としては、マンニトール、グリシン、塩化ナトリウム、ヒドロキシエチルデンプン、ラクトース、スクロース、トレハロース、ポリエチレングリコールおよびデキストランが挙げられる。

「陽イオン非依存性マンノース−６−ホスフェート受容体（ＣＩ−ＭＰＲ）」：本明細書中で用いる場合、「陽イオン非依存性マンノース−６−ホスフェート受容体（ＣＩ−ＭＰＲ）」という用語は、リソソームへの輸送を定められているゴルジ器具における酸加水分解酵素上のマンノース−６−ホスフェート（Ｍ６Ｐ）タグを結合する細胞受容体を指す。マンノース−６−ホスフェートのほかに、ＣＩ−ＭＰＲは、他のタンパク質、例えばＩＧＦ−ＩＩも結合する。ＣＩ−ＭＰＲは、「Ｍ６Ｐ／ＩＧＦ−ＩＩ受容体」、「ＣＩ−ＭＰＲ／ＩＧＦ−ＩＩ受容体」、「ＩＧＦ−ＩＩ受容体」または「ＩＧＦ２受容体」としても既知である。これらの用語およびその略語は、本明細書中で互換的に用いられる。

「同時免疫抑制薬療法」：本明細書中で用いる場合、「同時免疫抑制薬療法」という用語は、前治療、前状態調節として、またはある治療方法と平行して用いられる任意の免疫抑制薬両方を包含する。

「希釈剤」：本明細書中で用いる場合、「希釈剤」という用語は、再構成製剤の調整のために有用な製薬上許容可能な（例えば、ヒトへの投与のために安全且つ非毒性の）希釈物質を指す。希釈剤の例としては、滅菌水、注射用静菌性水（ＢＷＦＩ）、ｐＨ緩衝溶液（後、リン酸塩緩衝生理食塩水）、滅菌生理食塩溶液、リンガー溶液またはデキストロース溶液が挙げられる。

「剤形」：本明細書中で用いる場合、「剤形」および「単位剤形」という用語は、治療されるべき患者のための治療用タンパク質の物理的に別個の単位を指す。各単位は、所望の治療効果を生じるよう算定された予定量の活性物質を含有する。しかしながら、組成物の総投与量は、信頼できる医学的判断の範囲内で、担当医により決定される、と理解される。

「酵素補充療法（ＥＲＴ）」：本明細書中で用いる場合、「酵素補充療法（ＥＲＴ）」という用語は、失われている酵素を提供することにより酵素欠乏症を矯正する任意の治療戦略を指す。いくつかの実施形態では、失われている酵素は、髄腔内投与により提供される。いくつかの実施形態では、失われている酵素は、血流中への注入により提供される。一旦投与されると、酵素は細胞に取り込まれ、リソソームに運ばれて、そこで酵素は、酵素欠乏のためにリソソーム中に蓄積された物質を除去するよう作用する。典型的には、有効であるべきリソソーム酵素補充療法に関して、治療用酵素は、貯蔵欠陥が顕在性である標的組織中の適切な細胞中のリソソームに送達される。

「改善する、増大するまたは低減する」：本明細書中で用いる場合、「改善する」、「増大する」または「低減する」という用語、あるいは文法的等価物は、ベースライン測定値、例えば本明細書中に記載される治療の開始前の同一個体における測定値、あるいは本明細書中に記載される治療の非存在下での一対照個体（または多数の対照個体）における測定値と比較した場合の値を示す。「対照個体」は、治療されている個体と同一型のリソソーム貯蔵疾患に罹患している個体であって、治療されている個体とほぼ同年齢である（治療個体と対照個体（単数または複数）における疾患の段階が比較可能であることを保証するため）。

「個体、対象、患者」：本明細書中で用いる場合、「対象」、「個体」または「患者」という用語は、ヒトまたは非ヒト哺乳動物対象を指す。治療されている個体（「患者」または「対象」としても言及される）は、疾患に罹患している個体（胎児、幼児、小児、若者または成人）である。

「髄腔内投与」：本明細書中で用いる場合、「髄腔内投与」または「髄腔内注入」という用語は、脊柱管（脊髄周囲の髄腔内空隙）への注射を指す。種々の技法、例えば穿頭孔あるいは槽または腰椎穿刺等を通した外側脳室注射が用いられ得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、本発明による「髄腔内投与」または「髄腔内送達」は、腰椎域または領域を介したＩＴ投与または送達、すなわち、腰椎ＩＴ投与または送達を指す。本明細書中で用いる場合、「腰部領域」または「腰椎域」という用語は、第三および第四腰椎（背中下部）間の区域、さらに包括的には、脊椎のＬ２〜Ｓ１領域を指す。

「リンカー」：本明細書中で用いる場合、「リンカー」という用語は、融合タンパク質において、天然タンパク質中の特定位置に出現するもの以外のアミノ酸配列を指し、一般的に、柔軟性であるよう、または２つのタンパク質部分の間の構造物、例えばらせんを間に置くよう意図される。リンカーは、スペーサーとしても言及される。

「リオプロテクタント」：本明細書中で用いる場合、「リオプロテクタント」という用語は、凍結乾燥およびその後の貯蔵時に、タンパク質または他の物質の化学的および／または物理的不安定性を防止するかまたは低減する分子を指す。リオプロテクタントの例としては、糖、例えばスクロースまたはトレハロース；アミノ酸、例えばグルタミン酸またはヒスチジン一ナトリウム；メチルアミン、例えばベタイン；リオトロピック塩、例えば硫酸マグネシウム；ポリオール、例えば三価またはそれ以上の糖アルコール、例えばグリセリン、エリトリトール、グリセロール、アラビトール、キシリトール、ソルビトールおよびマンニトール；プロピレングリコール；ポリエチレングリコール；プルロニック；ならびにその組合せが挙げられる。いくつかの実施形態では、リオプロテクタントは、非還元糖、例えばトレハロースまたはスクロースである。

「リソソーム酵素」：本明細書中で用いる場合、「リソソーム酵素」という用語は、哺乳動物リソソーム中の蓄積物質を還元し得るか、あるいは１つ以上のリソソーム貯蔵疾患症状を救出するかまたは改善し得る任意の酵素を指す。本発明に適しているリソソーム酵素は、野生型または修飾リソソーム酵素の両方を包含し、組換えおよび合成方法を用いて生成され得るし、あるいは天然供給源から精製され得る。リソソーム酵素の例は、表１に列挙されている。

「リソソーム酵素欠乏症」：本明細書中で用いる場合、「リソソーム酵素欠乏症」は、高分子物質（例えば酵素基質）をリソソーム中でペプチド、アミノ酸、単糖、拡散および脂肪酸に分解するために必要とされる酵素の少なくとも１つにおける欠乏に起因する遺伝子障害の一群を指す。その結果、リソソーム酵素欠乏症に罹患している個体は、種々の組織（例えば、ＣＮＳ、肝臓、脾臓、腸、血管壁およびその他の器官）中に物質を蓄積している。

「リソソーム蓄積症」：本明細書中で用いる場合、「リソソーム蓄積症」という用語は、天然高分子物質を退社するために必要な１つ以上のリソソーム酵素の欠乏に起因する任意の疾患を指す。これらの疾患は、典型的には、リソソーム中に非分解分子の蓄積を生じて、貯蔵顆粒（貯蔵小胞とも呼ばれる）の数を増大する。これらの疾患および種々の例は、以下で詳細に記載される。

「ポリペプチド」：本明細書中で用いる場合、「ポリペプチド」は、概して、ペプチド結合により互いに結合された少なくとも２つのアミノ酸の紐である。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、その各々が少なくとも１つのペプチド結合により他のものと結合される少なくとも３〜５つのアミノ酸を含み得る。ポリペプチドは、時として、「非天然」アミノ酸、あるいはそれでも任意にポリペプチド鎖に一体化し得る他の実体を包含する、と当業者は理解する。

「補充酵素」：本明細書中で用いる場合、「補充酵素」という用語は、治療されるべき疾患において欠乏しているかまたは失われている酵素に少なくとも一部は取って替わるよう作用し得る任意の酵素を指す。いくつかの実施形態では、「補充酵素」という用語は、治療されるべきリソソーム蓄積症において欠乏しているかまたは失われているリソソーム酵素に少なくとも一部は取って替わるよう作用し得る任意の酵素を指す。いくつかの実施形態では、補充酵素は、哺乳動物リソソーム中の蓄積物質を低減し得るし、あるいは１つ以上のリソソーム蓄積症症状を救出するかまたは改善し得る。本発明に適している補充酵素は、野生型または修飾リソソーム酵素の両方を包含し、組換えおよび合成方法を用いて生成し得るし、あるいは天然供給源から精製され得る。補充酵素は、組換え、合成、遺伝子活性化または天然酵素であり得る。

「可溶性の」：本明細書中で用いる場合、「可溶性の」という用語は、均質溶液を生成する治療薬の能力を指す。いくつかの実施形態では、それが投与されそれが標的作用部位（例えば、脳の細胞および組織）に輸送される溶液中の治療薬の溶解度は、標的作用部位への治療的有効量の治療薬の送達を可能にするのに十分である。いくつかの因子が、治療薬の溶解度に影響を及ぼし得る。例えば、タンパク質溶解度に影響し得る関連因子としては、イオン強度、アミノ酸配列および他の同時可溶化剤または塩（例えば、カルシウム塩）の存在が挙げられる。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、カルシウム塩がこのような組成物から除去されるよう処方される。いくつかの実施形態では、本発明による治療薬は、その対応する薬学的組成物中で可溶性である。非経口投与薬のためには等張溶液が一般的に好ましいが、等張溶液の使用は、いくつかの治療薬、特にいくつかのタンパク質および／または酵素に関する適切な溶解度を制限し得る、と理解される。わずかに高張性の溶液（例えば、５ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）中に１７５ｍＭまでの塩化ナトリウム）および糖含有溶液（例えば、５ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）中に２％までのスクロース）は、サルにおいて良好に耐容されることが実証されている。例えば、最も一般に認可されたＣＮＳボーラス製剤組成物は、生理食塩水（水中１５０ｍＭのＮａＣｌ）である。

「安定性」：本明細書中で用いる場合、「安定な」という用語は、長期間に亘ってその治療効力（例えば、その意図された生物学的活性および／または物理化学的完全性のすべてまたは大部分）を保持する治療薬（例えば、組換え酵素）の能力を指す。治療薬の安定性、ならびにこのような治療薬の安定性を保持する薬学的組成物の能力は、長期間に亘って査定され得る（例えば、少なくとも１、３、６、１２、１８、２４、３０、３６ヶ月またはそれ以上）。概して、本明細書中に記載される薬学的組成物は、それらが、一緒に処方される１つ以上の治療薬（例えば、組換えタンパク質）を安定化し、あるいはそれらの分解を遅くするかまたは防止し得るよう、処方されている。一製剤の状況では、安定製剤は、貯蔵時、および加工処理（例えば、凍結／解凍、機械的混合および凍結乾燥）中に、その中の治療薬が本質的にその物理的および／または化学的完全性および生物学的活性を保持するものである。タンパク質安定性に関しては、それは、高分子量（ＨＭＷ）集合体の形成、酵素活性の損失、ペプチド断片の生成および電荷プロフィールの移動により測定され得る。

「対象」：本明細書中で用いる場合、「対象」という用語は、ヒトを含めた任意の哺乳動物を意味する。本発明のある実施形態では、対象は、成人、若者または幼児である。薬学的組成物の投与、および／または子宮内治療方法の実施も、本発明により意図される。

「実質的相同性」：「実質的相同」という語句は、アミノ酸または核酸配列間の比較に言及するために本明細書中で用いられる。当業者に理解されるように、２つの配列は、それらが、対応する位置に相同な残基を含有する場合、一般的に「実質的に相同」であるとみなされる。相同残基は、同一残基であり得る。代替的には、相同残基は、ほぼ同様の構造的および／または機能的特徴を有する非同一残基であり得る。例えば、当業者に周知であるように、あるアミノ酸は、典型的には、「疎水性」または「親水性」アミノ酸として分類され、および／または「極性」または「非極性」側鎖を有するとして分類される。一アミノ酸の、別の同一型のアミノ酸への置換は、しばしば、「相同」置換とみなされ得る。

当該技術分野で周知であるように、アミノ酸または核酸配列は、種々のアルゴリズム、例えば市販のコンピュータープログラム、例えばヌクレオチド配列に関するＢＬＡＳＴＮ、ならびにアミノ酸配列に関するＢＬＡＳＴＰ、ギャップ化ＢＬＡＳＴおよびＰＳＩ−ＢＬＡＳＴを用いて比較され得る。このようなプログラムの例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔａｌ．，Ｂａｓｉｃｌｏｃａｌａｌｉｇｎｍｅｎｔｓｅａｒｃｈｔｏｏｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５(３):４０３−４１０，１９９０；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔａｌ．，ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔａｌ．，“ＧａｐｐｅｄＢＬＡＳＴａｎｄＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：ａｎｅｗｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆｐｒｏｔｅｉｎｄａｔａｂａｓｅｓｅａｒｃｈｐｒｏｇｒａｍｓ”，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２５:３３８９−３４０２，１９９７、Ｂａｘｅｖａｎｉｓ，ｅｔａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＧｕｉｄｅｔｏｔｈｅＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＧｅｎｅｓａｎｄＰｒｏｔｅｉｎｓ，Ｗｉｌｅｙ，１９９８、およびＭｉｓｅｎｅｒ，ｅｔａｌ．，(ｅｄｓ．)，ＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓＭｅｔｈｏｄｓａｎｄＰｒｏｔｏｃｏｌｓ (ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１３２)，ＨｕｍａｎａＰｒｅｓｓ，１９９９に記載されている。相同配列を同定することのほかに、上記のプログラムは、典型的には、相同性の程度の指示を提供する。いくつかの実施形態では、２つの配列は、それらの対応する残基の少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上が関連残基鎖上で相同である場合、実質的に相同であるとみなされる。いくつかの実施形態では、関連鎖は完全配列である。いくつかの実施形態では、関連鎖は、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００残基またはそれ以上の残基である。

「実質的同一性」：「実質的同一性」という語句は、アミノ酸または核酸配列間の比較に言及するために本明細書中で用いられる。当業者に理解されるように、２つの配列は、それらが、対応する位置に同一の残基を含有する場合、一般的に「実質的に同一」であるとみなされる。当該技術分野で周知であるように、アミノ酸または核酸配列は、種々のアルゴリズム、例えば市販のコンピュータープログラム、例えばヌクレオチド配列に関するＢＬＡＳＴＮ、ならびにアミノ酸配列に関するＢＬＡＳＴＰ、ギャップ化ＢＬＡＳＴおよびＰＳＩ−ＢＬＡＳＴを用いて比較され得る。このようなプログラムの例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔａｌ．，Ｂａｓｉｃｌｏｃａｌａｌｉｇｎｍｅｎｔｓｅａｒｃｈｔｏｏｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５(３)：４０３−４１０，１９９０、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔａｌ．，ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２５:３３８９−３４０２，１９９７、Ｂａｘｅｖａｎｉｓ，ｅｔａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＧｕｉｄｅｔｏｔｈｅＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＧｅｎｅｓａｎｄＰｒｏｔｅｉｎｓ，Ｗｉｌｅｙ，１９９８、およびＭｉｓｅｎｅｒ，ｅｔａｌ．，(ｅｄｓ．)，ＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓＭｅｔｈｏｄｓａｎｄＰｒｏｔｏｃｏｌｓ (ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１３２)，ＨｕｍａｎａＰｒｅｓｓ，１９９９に記載されている。同一配列を同定することのほかに、上記のプログラムは、典型的には、同一性の程度の指示を提供する。いくつかの実施形態では、２つの配列は、それらの対応する残基の少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上が関連残基鎖上で同一である場合、実質的に同一であるとみなされる。いくつかの実施形態では、関連鎖は完全配列である。いくつかの実施形態では、関連鎖は、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００残基またはそれ以上の残基である。

「合成ＣＳＦ」：本明細書中で用いる場合、「合成ＣＳＦ」という用語は、脳脊髄液と一致するｐＨ、電解質組成、グルコース含量および浸透圧を有する溶液を指す。合成ＣＳＦは、人工ＣＳＦとも呼ばれる。いくつかの実施形態では、合成ＣＳＦはエリオットＢ溶液である。

「ＣＮＳ送達に適している」：本明細書中で用いる場合、「ＣＮＳ送達に適している」または「髄腔内送達に適している」という語句は、それが本発明の薬学的組成物に関する場合、一般的に、このような組成物の安定性、耐容性および溶解度特性、ならびに標的送達部位（例えば、ＣＳＦまたは脳）にその中に含有される有効量の治療薬を送達するこのような組成物の能力を指す。

「標的組織」：本明細書中で用いる場合、「標的組織」は、治療されるべきリソソーム蓄積症により影響を及ぼされる任意の組織、あるいは欠乏リソソーム酵素が正常に発現される任意の組織を指す。いくつかの実施形態では、標的組織は、リソソーム蓄積症に罹患しているかまたは罹患し易い患者において、検出可能な、または以上に高量の酵素基質が存在する、例えば当該組織の細胞リソソーム中に貯蔵される組織を包含する。いくつかの実施形態では、標的組織は、疾患関連病態、症状または特徴を示す組織を包含する。いくつかの実施形態では、標的組織は、欠乏リソソーム酵素が高レベルで正常に発現される組織を包含する。本明細書中で用いる場合、標的組織は、脳標的組織、脊髄標的組織および／または末梢標的組織であり得る。標的組織の例は、以下で詳細に記載される。

「治療的部分」：本明細書中で用いる場合、「治療的部分」という用語は、分子の治療作用を果たす分子の一部分を指す。いくつかの実施形態では、治療的部分は、治療活性を有するポリペプチドである。

「治療的有効量」：本明細書中で用いる場合、「治療的有効量」という用語は、任意の医学的治療に適用可能な合理的利益／危険比で、治療対象に治療効果を付与する治療用タンパク質（例えば、補充酵素）の量を指す。治療作用は、客観的（すなわち、何らかの試験またはマーカーにより測定可能）または主観的（すなわち、対象は、作用の指示を与えるかまたは作用を感じる）であり得る。特に、「治療的有効量」は、例えば疾患に伴う症状を改善し、疾患の開始を防止するかまたは遅延し、および／または疾患の症状の重症度または頻度を下げることにより、所望の疾患または症状を治療し、改善し、または防止するために、あるいは検出可能な治療的または予防的作用を示すために有効な治療用タンパク質または組成物の量を指す。治療的有効量は、一般に、多重単位用量を含み得る用量投与レジメンで投与される。任意の特定治療用タンパク質に関して、治療的有効量（および／または有効用量投与レジメン内の適切な単位用量）は、例えば、投与経路、他の薬学的作用物質との組合せによって変わり得る。さらにまた、任意の特定患者に関する具体的治療的有効量（および／または単位用量）は、種々の因子、例えば治療されている障害、および障害の重症度；用いられる具体的な薬学的作用物質の活性；用いられる具体的組成物；患者の年齢、体重、全身健康状態、性別および食事；投与時間、投与経路および／または用いられる具体的融合タンパク質の排出または代謝の速度；治療の持続期間；ならびに医療業界で周知であるような同様の因子によって決まる。

「耐容可能な」：本明細書中で用いる場合、「耐容可能な」および「耐容性」という用語は、このような組成物が投与される対象において悪反応を引き出さないか、代替的には、このような組成物が投与される対象において重篤な悪反応を引き出さない本発明の薬学的組成物の能力を指す。いくつかの実施形態では、本発明の薬学的組成物は、このような組成物が投与される対象により良好に耐容される。

「治療」：本明細書中で用いる場合、「治療」（さらにまた「治療する」または「治療すること」）という用語は、特定の疾患、障害および／または症状（例えば、ハンター症状群、サンフィリッポ症状群Ｂ型）の１つ以上の症状または特徴を、部分的にまたは完全に、緩和し、改善し、軽減し、抑制し、その開始を遅延し、その重症度を低減し、および／またはその発生率を低減する治療用タンパク質（例えば、リソソーム酵素）の任意の投与を指す。このような治療は、関連疾患、障害および／または症状の徴候を示さない対象の、および／または疾患、障害および／または症状の早期徴候のみを示す対象のものであり得る。代替的にまたは付加的に、このような治療は、関連疾患、障害および／または症状の１つ以上の確立された徴候を示す対象のものであり得る。

本発明は特に、中枢神経系（ＣＮＳ）への治療薬の有効な直接送達のための改良された方法および組成物を提供する。上記のように、本発明は、リソソーム蓄積症（例えば異染性白質ジストロフィー症）に関する補充酵素（例えばＡＳＡタンパク質）が、被験者における実質的副作用を誘導することなく、高濃度で治療を必要とする対象の脳脊髄液（ＣＳＦ）中に直接導入され得る、という予期せぬ発見に基づいている。さらに意外なことに、合成ＣＳＦを用いることなく、補充酵素が単なる生理食塩水または緩衝液ベースの製剤中で送達され得る、ということを本発明人等は見出した。さらに予期せぬことに、本発明による髄腔内送達は、対象における実質的副作用、例えば重症免疫応答を生じない。したがって、いくつかの実施形態では、本発明による髄腔内送達は、同時免疫抑制薬療法の非存在下で（例えば、前治療または前状態調節による免疫寛容の誘導なしで）、用いられ得る。

いくつかの実施形態では、本発明による髄腔内送達は、種々の脳組織を通した効率的拡散を可能にして、表面、浅在および／または深部脳領域における種々の標的脳組織における補充酵素の効果的送達を生じる。いくつかの実施形態では、本発明による髄腔内送達は、末梢循環に進入するのに十分な量の補充酵素を生じた。その結果、いくつかの場合には、本発明による髄腔内送達は、肝臓、心臓、脾臓、および腎臓のような末梢組織における補充酵素の送達を生じた。この発見は予期せぬものであり、典型的には定期的髄腔内投与および静脈内投与を必要とするＣＮＳおよび末梢構成成分の両方を有するリソソーム蓄積症の治療のために特に有用であり得る。本発明による髄腔内送達は、末梢の症状を治療するに際して治療効果を危うくすることなく、静脈内注射の用量投与および／または頻度低減を可能にし得る、ということが意図される。

本発明は、種々の脳標的組織への補充酵素の効率的且つ便利な送達を可能にして、ＣＮＳ指標を有するリソソーム蓄積症の有効な治療を生じる種々の予期せぬ且つ有益な特徴を提供する。

本発明の種々の態様は、以下の節で詳細に記載される。節の記載内容は、本発明を限定するものではない。各説は、本発明の任意の態様に適用し得る。この出願において、「または」は、別記しない限り「および／または」を意味する。
治療用タンパク質

いくつかの実施形態では、本発明が提供する本発明の方法および組成物を用いて、異染性白質ジストロフィー症の治療のために、アリールスルファターゼＡ（ＡＳＡ）タンパク質をＣＮＳに送達する。適切なＡＳＡタンパク質は、天然のアリールスルファターゼＡ（ＡＳＡ）タンパク質活性を置換できるか、または、ＡＳＡ欠損と関連する１つ以上の表現型または症状をレスキューできるいずれかの分子または分子の一部であることができる。いくつかの実施形態では、本発明に適している補充酵素は、Ｎ末端およびＣ末端、ならびに、成熟ヒトＡＳＡタンパク質と実質的に類似または同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドである。

典型的には、ヒトＡＳＡは、プロセシングされると成熟形態となる前駆体分子として産生される。このプロセスは一般に、１８個のアミノ酸シグナルペプチドを除去することによって行われる。典型的には、この前駆体形態は、完全長前駆体または完全長ＡＳＡタンパク質とも称され、５０７個のアミノ酸を含む。そのＮ末端の１８個のアミノ酸が切断されると、４８９個のアミノ酸の長さの成熟形態となる。したがって、Ｎ末端の１８個のアミノ酸は一般に、ＡＳＡタンパク質活性には必須ではないと考えられる。典型的な野生型または天然のヒトＡＳＡタンパク質の成熟形態のアミノ酸配列（配列番号１）および完全長前駆体のアミノ酸配列（配列番号２）を表１に示す。

すなわち、いくつかの実施形態では、本発明に適している治療用部分は、成熟ヒトＡＳＡタンパク質（配列番号１）である。いくつかの実施形態では、適切な治療用部分は、成熟ヒトＡＳＡタンパク質の相同体または類似体であってもよい。例えば、成熟ヒトＡＳＡタンパク質の相同体または類似体は、野生型または天然のＡＳＡタンパク質（例えば配列番号１）と比べて１つ以上のアミノ酸置換、欠失、および／または挿入を含む修飾成熟ヒトＡＳＡタンパク質であって、実質的なＡＳＡタンパク質活性を保持する修飾成熟ヒトＡＳＡタンパク質であってもよい。したがって、いくつかの実施形態では、本発明に適している治療用部分は、成熟ヒトＡＳＡタンパク質（配列番号１）と実質的に相同性を有する。いくつかの実施形態では、本発明に適している治療用部分は、配列番号１と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９％超の相同性を有するアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、本発明に適している治療用部分は、成熟ヒトＡＳＡタンパク質（配列番号１）と実質的に同一である。いくつかの実施形態では、本発明に適している治療用部分は、配列番号１と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９％超同一であるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、本発明に適している治療用部分は、成熟ヒトＡＳＡタンパク質の断片または一部を含む。

あるいは、本発明に適している補充酵素は、完全長ＡＳＡタンパク質である。いくつかの実施形態では、適切な補充酵素は、完全長ヒトＡＳＡタンパク質の相同体または類似体であってよい。例えば、完全長ヒトＡＳＡタンパク質の相同体または類似体は、野生型または天然の完全長ＡＳＡタンパク質（例えば配列番号２）と比べて１つ以上のアミノ酸置換、欠失、および／または挿入を含む修飾完全長ヒトＡＳＡタンパク質であって、実質的なＡＳＡタンパク質活性を保持する修飾完全長ヒトＡＳＡタンパク質であってよい。したがって、いくつかの実施形態では、本発明に適している補充酵素は、完全長ヒトＡＳＡタンパク質（配列番号２）と実質的に相同性を有する。いくつかの実施形態では、本発明に適している補充酵素は、配列番号２と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９％超の相同性を有するアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、本発明に適している補充酵素は、配列番号２と実質的に同一である。いくつかの実施形態では、本発明に適している補充酵素は、配列番号２と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９％超同一であるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、本発明に適している補充酵素は、完全長ヒトＡＳＡタンパク質の断片または一部を含む。本明細書で用いる場合、完全長ＡＳＡタンパク質は典型的にはシグナルペプチド配列を含む。

いくつかの実施形態では、治療用タンパク質は、標的部分（例えばリソソーム標的配列）および／または膜透過性ペプチドを含む。いくつかの実施形態では、標的配列および／または膜透過性ペプチドは、治療用部分の内在性部分（例えば化学結合によるか、融合タンパク質によるもの）である。いくつかの実施形態では、標的配列はマンノース−６−リン酸塩部分を含む。いくつかの実施形態では、標的配列はＩＧＦ−Ｉ部分を含む。いくつかの実施形態では、標的配列はＩＧＦ−ＩＩ部分を含む。
その他のリソソーム蓄積症および補充酵素

本発明による方法および組成物を用いて、その他のリソソーム蓄積症、特にＣＮＳの病因および／または症状を有するリソソーム蓄積症、例えば、アスパルチルグルコサミン尿症、コレステロールエステル蓄積症、ウォルマン病、シスチン症、ダノン病、ファブリー病、ファーバー脂肪肉芽腫症、ファーバー病、フコシドーシス、ガラクトシアリドーシス
Ｉ／ＩＩ型、ゴーシェ病Ｉ／ＩＩ／ＩＩＩ型、グロボイド細胞白質ジストロフィー症、クラッベ病、糖原病ＩＩ型、ポンペ病、ＧＭ１−ガングリオシドーシスＩ／ＩＩ／ＩＩＩ型、ＧＭ２−ガングリオシドーシスＩ型、テイ・サックス病、ＧＭ２−ガングリオシドーシスＩＩ型、サンドホッフ病、ＧＭ２−ガングリオシドーシス、α−マンノーシドーシスＩ／ＩＩ型、β−マンノーシドーシス、異染性白質ジストロフィー症、ムコリピドーシスＩ型、シアリドーシスＩ／ＩＩ型、ムコリピドーシスＩＩ／ＩＩＩ型、Ｉ−細胞病、ムコリピドーシスＩＩＩＣ型、偽性ハーラーポリジストロフィー、ムコ多糖症Ｉ型、ムコ多糖症ＩＩ型、ムコ多糖症ＩＩＩＡ型、サンフィリッポ症状群、ムコ多糖症ＩＩＩＢ型、ムコ多糖症ＩＩＩＣ型、ムコ多糖症ＩＩＩＤ型、ムコ多糖症ＩＶＡ型、モルキオ症状群、ムコ多糖症ＩＶＢ型、ムコ多糖症ＶＩ型、ムコ多糖症ＶＩＩ型、スライ症状群、ムコ多糖症ＩＸ型、多重スルファターゼ欠乏症、ニューロンセロイド脂褐素沈着症、ＣＬＮ１バッテン病、ＣＬＮ２バッテン病、ニーマン・ピック病Ａ／Ｂ型、ニーマン・ピック病Ｃ１型、ニーマン・ピック病Ｃ２型、濃化異骨症、シンドラー病Ｉ／ＩＩ型、ゴーシェ病およびシアル酸蓄積症（これらに限定されない）を治療できると考えられる。

リソソーム蓄積症の遺伝的病因、臨床症状発現および分子生物学知見は、Ｓｃｒｉｖｅｒｅｔａｌ．，ｅｄｓ．，ＴｈｅＭｅｔａｂｏｌｉｃａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢａｓｉｓｏｆＩｎｈｅｒｉｔｅｄＤｉｓｅａｓｅ，７．ｓｕｐ．ｔｈＥｄ．，Ｖｏｌ．ＩＩ，ＭｃＧｒａｗＨｉｌｌ，(１９９５)に詳述されている。したがって、上記疾患における酵素欠乏は当業者に既知であり、これらのいくつかは、以下の表２に示されている。

本発明による方法は、様々なその他の補充酵素を送達するために用いてよい。本明細書で用いる場合、本発明に適した補充酵素は、治療されるべきリソソーム蓄積症において欠乏しているかまたは失われているリソソーム酵素の少なくとも一部の活性に取って替わるよう作用し得る任意の酵素を包含し得る。いくつかの実施形態では、補充酵素は、リソソーム中の蓄積物質を低減し得るし、あるいは１つ以上のリソソーム蓄積症症状を救出するかまたは改善し得る。

いくつかの実施形態では、適切な補充酵素は、治療されるべきリソソーム蓄積症に関連づけられることが既知の任意のリソソーム酵素であり得る。いくつかの実施形態では、適切な補充酵素は、上記の表２に列挙された酵素から選択される酵素である。

いくつかの実施形態では、本発明に適している補充酵素は、野生型または天然の配列を有し得る。いくつかの実施形態では、本発明に適している補充酵素は、野生型または天然の配列と実質的相同性または同一性を有する（例えば、野生型または天然の配列と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％の配列同一性を有する）修飾配列を有し得る。

本発明に適している補充酵素は、任意の利用可能な手段により産生され得る。例えば、補充酵素は、補充酵素コード核酸を発現するよう工学処理された宿主細胞系を利用することにより、組換え的に産生され得る。代替的または付加的には、補充酵素は、内因性遺伝子を活性化することにより産生され得る。代替的または付加的には、補充酵素は、化学合成により、部分的にまたは完全に、調製され得る。代替的または付加的には、補充酵素は、天然供給源からも精製され得る。

酵素が組換え的に産生される場合、任意の発現系が用いられ得る。２〜３ではあるが例を挙げると、既知の発現系としては、例えば卵細胞、バキュロウイルス、植物細胞、酵母または哺乳動物細胞が挙げられる。

いくつかの実施形態では、本発明に適している酵素は、哺乳動物中で産生される。本発明にしたがって用いられ得る哺乳動物細胞の非限定例としては、以下のものが挙げられる：
ＢＡＬＢ／ｃマウス骨髄腫株（ＮＳＯ／ｌ、ＥＣＡＣＣ番号：８５１１０５０３）；ヒト網膜芽細胞（ＰＥＲ．Ｃ６、ＣｒｕＣｅｌｌ，Ｌｅｉｄｅｎ，ＴｈｅＮｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）；ＳＶ４０により形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣＣＲＬ１６５１）；ヒト胚性腎臓株（２９３または２９３細胞（懸濁液培養中での増殖のためにサブクローン化）、Ｇｒａｈａｍｅｔａｌ．，Ｊ．ＧｅｎＶｉｒｏｌ．，３６:５９,１９７７）；ヒト繊維肉腫細胞株（例えば、ＨＴ１０８０）；ハムスター幼仔腎細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣＣＣＬ１０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞＋／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、ＵｒｌａｕｂａｎｄＣｈａｓｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７:４２１６，１９８０）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，２３:２４３−２５１，１９８０）；サル腎細胞（ＣＶ１ＡＴＣＣＣＣＬ７０）；アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頚部癌細胞（ＨｅＬａ、ＡＴＣＣＣＣＬ２）；イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣＣＣＬ３４）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ３Ａ、ＡＴＣＣＣＲＬ１４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣＣＣＬ７５）；ヒト肝細胞（ＨｅｐＧ２、ＨＢ８０６５）；マウス乳癌（ＭＭＴ０６０５６２、ＡＴＣＣＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒｅｔａｌ．，ＡｎｎａｌｓＮ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，３８３:４４−６８，１９８２）；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；およびヒト肝細胞癌株（ＨｅｐＧ２）。

いくつかの実施形態では、本発明の方法は、ヒト細胞から産生される補充酵素を送達するために用いられる。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、ＣＨＯ細胞から産生される補充酵素を送達するために用いられる。

いくつかの実施形態では、本発明の方法を用いて送達される補充酵素は、細胞取込みおよび／またはリソソームターゲッティングを助長するために脳細胞の表面の受容体と結合する部分を含有する。例えば、このような受容体は、マンノース−６−ホスフェート（Ｍ６Ｐ）残基を結合する陽イオン非依存性マンノース−６−ホスフェート受容体（ＣＩ−ＭＰＲ）であり得る。さらに、ＣＩ−ＭＰＲは、他のタンパク質、例えばＩＧＦ−ＩＩとも結合する。いくつかの実施形態では、本発明に適している補充酵素は、タンパク質の表面にＭ６Ｐ残基を含有する。いくつかの実施形態では、本発明に適している補充酵素は、ＣＩ−ＭＰＲに対するより高い結合親和性を有するビス−ホスホリル化オリゴ糖を含有し得る。いくつかの実施形態では、適切な酵素は、酵素当たり約少なくとも２０％のビス−ホスホリル化オリゴ糖のほぼ平均まで含有する。他の実施形態では、適切な酵素は、酵素当たり約１０％、１５％、１８％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％のビス−ホスホリル化オリゴ糖を含有し得る。このようなビス−ホスホリル化オリゴ糖は酵素上に天然に存在し得るが、酵素はこのようなオリゴ糖を保有するよう修飾され得る、ということに留意すべきである。例えば、適切な補充酵素は、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃからリソソーム酵素上のα−１，２−連結マンノースの６’位置へのＮ−アセチルグルコサミン−Ｌ−ホスフェートの移動を触媒し得るある種の酵素により修飾され得る。このような酵素を産生し、使用するための方法および組成物は、例えば、Ｃａｎｆｉｅｌｄ等により米国特許第６，５３７，７８５号および米国特許第６，５３４，３００号（これらの記載内容は各々、参照により本明細書に援用される）に記載されている。

いくつかの実施形態では、本発明に用いるための補充酵素は、脳細胞の表面の受容体と結合し得るリソソームターゲッティング部分と共役されるかまたは融合され得る。適切なリソソームターゲッティング部分は、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＲＡＰ、ｐ９７、ならびにその変異体、相同体または断片（例えば、野生型成熟ヒトＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＲＡＰ、ｐ９７ペプチド配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％同一な配列を有するペプチド）であり得る。

いくつかの実施形態では、本発明に適している補充酵素は、ＢＢＢを横断し、ＣＮＳ中にこのような作用物質を送達するかまたは輸送するのを増強するよう修飾されていない。

いくつかの実施形態では、治療用タンパク質は、標的部分（リソソーム標的配列）および／または膜透過性ペプチドを含む。いくつかの実施形態では、標的配列および／または膜透過性ペプチドは、治療用部分の内在性部分（例えば化学結合によるか、融合タンパク質によるもの）を含む。いくつかの実施形態では、標的配列はマンノース−６−リン酸塩部分を含む。いくつかの実施形態では、標的配列はＩＧＦ−Ｉ部分を含む。いくつかの実施形態では、標的配列はＩＧＦ−ＩＩ部分を含む。
製剤

対象のＣＮＳに治療薬を送達する目的で伝統的に用いられている水性医薬溶液および組成物（すなわち製剤）は、非緩衝化等張生理食塩水およびエリオットのＢ溶液（人工ＣＳＦ）を含む。エリオットのＢ溶液に対するＣＳＦの組成を表す比較は、以下の表３に含まれている。表３に示されているように、エリオットＢ溶液の濃度は、ＣＳＦの濃度と密接に類似している。しかしながら、エリオットのＢ溶液は、極度に低い緩衝剤濃度を含有し、したがって、特に長期間に亘って（例えば、貯蔵状態の間）、治療薬（例えばタンパク質）を安定化するために必要とされる適切な緩衝能力を提供し得ない。さらに、エリオットのＢ溶液は、いくつかの治療薬、特にタンパク質または酵素を送達するよう意図された製剤と非相溶性であり得るある種の塩を含有する。例えば、エリオットのＢ溶液中に存在するカルシウム塩は、タンパク質沈降を媒介し、それにより製剤の安定性を低減し得る。

本発明は、その製剤とともに調合した１つ以上の治療薬（例えば組換えタンパク質）を安定化するか、あるいは、その治療薬の分解を遅延または防止することができるように、調合した治療薬用に、製剤を水性形態、凍結乾燥前形態、凍結乾燥形態、または再構成形態のいずれかで提供する。いくつかの実施形態では、本発明の製剤は、治療薬用の凍結乾燥製剤を提供する。いくつかの実施形態では、本発明の製剤は、治療薬用の水性製剤を提供する。いくつかの実施形態では、本発明の製剤は安定な製剤である。
安定な製剤

本明細書で用いる場合、「安定な」という用語は、長期間に亘ってその治療効力（例えば、その意図された生物学的活性および／または物理化学的完全性のすべてまたは大多数）を保持する治療薬（例えば、組換え酵素）の能力を指す。治療薬の安定性、ならびにこのような治療薬の安定性を保持する薬学的組成物の能力は、長期間（例えば、好ましくは少なくとも１、３、６、１２、１８、２４、３０、３６ヶ月またはそれ以上）に亘って査定され得る。製剤の状況では、安定製剤は、貯蔵時および加工処理（例えば、凍結／解凍、機械的混合および凍結乾燥）の間、その中の治療薬が本質的にはその物理的および／または化学的完全性ならびに生物学的活性を保持するものである。タンパク質安定性に関しては、それは、高分子量（ＨＭＷ）集合体の形成、酵素活性の損失、ペプチド断片の生成、および電荷プロフィールの移動により測定され得る。

治療薬の安定性は、その治療薬が意図どおりの治療作用を発揮するのに必要な特定の範囲の治療薬濃度の保持との関連で、特別な重要性を有する。治療薬の安定性は、長期間に亘る治療薬の生物学的活性または物理化学的完全性に関してさらに査定され得る。例えば、所定の時点での安定性は、早期時点（例えば、処方０日目）での安定性に対して、あるいは非処方治療薬に対して比較され得る。この比較の結果は、パーセンテージとして表される。好ましくは、本発明の薬学的組成物は、長期間に亘って（例えば、室温で、または加速貯蔵条件下で、少なくとも６〜１２ヶ月間に亘って測定）、治療薬の生物学的活性または物理化学的完全性の少なくとも１００％、少なくとも９９％、少なくとも９８％、少なくとも９７％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６５％、少なくとも６０％、少なくとも５５％または少なくとも５０％を保持する。

治療薬は好ましくは、本発明の医薬組成物に可溶性である。「可溶性の」という用語は、均質溶液を生成するこのような治療薬の能力を指す。好ましくは、それが投与されそれが標的作用部位（例えば、脳の細胞および組織）に輸送される溶液中の治療薬の溶解度は、標的作用部位への治療的有効量の治療薬の送達を可能にするのに十分である。いくつかの因子が、治療薬の溶解度に影響を及ぼし得る。例えば、タンパク質溶解度に影響し得る関連因子としては、イオン強度、アミノ酸配列および他の同時可溶化剤または塩（例えば、カルシウム塩）の存在が挙げられる。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、カルシウム塩がこのような組成物から除去されるよう処方される。

水性形態、凍結乾燥前形態、凍結乾燥形態、または再構成形態のいずれかの適切な製剤は、様々な濃度で当該治療薬を含んでよい。いくつかの実施形態では、製剤は、当該タンパク質または治療薬を約０．１ｍｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬ（例えば約０．１ｍｇ／ｍＬ〜８０ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜６０ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜５０ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜４０ｍｇ／ｍＬ〜約０．１ｍｇ／ｍＬ〜３０ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜２５ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜２０ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜６０ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜５０ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜４０ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜３０ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜２５ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜２０ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜１５ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜５ｍｇ／ｍＬ、約１ｍｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬ、約１ｍｇ／ｍＬ〜２０ｍｇ／ｍＬ、約１ｍｇ／ｍＬ〜４０ｍｇ／ｍＬ、約５ｍｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬ、約５ｍｇ／ｍＬ〜５０ｍｇ／ｍＬ、または約５ｍｇ／ｍＬ〜２５ｍｇ／ｍＬ）の範囲の濃度で含んでよい。いくつかの実施形態では、本発明による製剤は、治療薬を約１ｍｇ／ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、１５ｍｇ／ｍＬ、２０ｍｇ／ｍＬ、２５ｍｇ／ｍＬ、３０ｍｇ／ｍＬ、４０ｍｇ／ｍＬ、５０ｍｇ／ｍＬ、６０ｍｇ／ｍＬ、７０ｍｇ／ｍＬ、８０ｍｇ／ｍＬ、９０ｍｇ／ｍＬ、または１００ｍｇ／ｍＬの濃度でを含んでよい。

本発明の製剤は、水溶液としてまたは再構成させた凍結乾燥溶液としての耐容性によって特徴付けられる。本明細書で用いる場合、「耐容可能な」および「耐容性」という用語は、本発明の医薬組成物が、本発明の医薬組成物を投与される対象の体内で有害反応を引き出さないか、あるいは、本発明の医薬組成物を投与される対象の体内で重篤な有害反応を引き出さない能力を指す。いくつかの実施形態では、本発明の医薬組成物を投与される対象は、本発明の医薬組成物に十分に耐えられる。

多数の治療薬、特に本発明のタンパク質および酵素は、本発明の薬学的組成物中でそれらの溶解性および安定性を保持するために、制御されたｐＨおよび特定の賦形剤を要する。以下の表４には、本発明のタンパク質治療薬の溶解性および安定性を保持するとみなされるタンパク質製剤の典型的な態様が特定されている。
緩衝剤

本発明の製剤のｐＨは、水性製剤中、または凍結乾燥前製剤用の治療薬（例えば酵素またはタンパク質）の溶解度を変更できる付加的因子である。したがって、本発明の製剤は好ましくは１つ以上の緩衝剤を含む。いくつかの実施形態では、本発明の水性製剤は、約４．０〜８．０（例えば約４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．２、６．４、６．５、６．６、６．８、７．０、７．５、または８．０）という、前記組成物の最適なｐＨを保持するのに十分な量の緩衝剤を含む。いくつかの実施形態では、本発明の製剤のｐＨは約５．０〜７．５、約５．５〜７．０、約６．０〜７．０、約５．５〜６．０、約５．５〜６．５、約５．０〜６．０、約５．０〜６．５、および約６．０〜７．５である。適切な緩衝剤としては例えば、酢酸塩、クエン酸塩、ヒスチジン、リン酸塩、コハク酸塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（「トリス」）、およびその他の有機酸が挙げられる。本発明の医薬組成物の緩衝剤の濃度およびｐＨ範囲は、本発明の製剤の耐容性を制御または調節する因子である。いくつかの実施形態では、緩衝剤は、約１ｍＭ〜約１５０ｍＭ、約１０ｍＭ〜約５０ｍＭ、約１５ｍＭ〜約５０ｍＭ、約２０ｍＭ〜約５０ｍＭ、約２５ｍＭ〜約５０ｍＭの範囲の濃度で存在する。いくつかの実施形態では、適切な緩衝剤は、約１ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、４０ｍＭ、４５ｍＭ、５０ｍＭ、７５ｍＭ、１００ｍＭ、１２５ｍＭ、または１５０ｍＭの濃度で存在する。
等張度

いくつかの実施形態では、水性形態、凍結乾燥前形態、凍結乾燥形態、または再構成形態のいずれかの製剤は、製剤を等張に保つために等張剤を含む。典型的には、ＩＴ送達と結びつけて用いられる場合、「等張」とは、当該製剤が本質的にはヒトの血液と同じ浸透圧を有することを意味する。等張製剤は一般に、約２４０ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約３５０ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧を有する。等張度は、例えば、蒸気圧または凝固点型浸透圧計を用いて測定できる。例示的等張剤としては、グリシン、ソルビトール、マンニトール、塩化ナトリウムおよびアルギニンが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、適切な等張剤は、水性および／または凍結乾燥前製剤中に、約０．０１〜５重量％（例えば０．０５、０．１、０．１５、０．２、０．３、０．４、０．５、０．７５、１．０、１．２５、１．５、２．０、２．５、３．０、４．０、または５．０重量％）の濃度で存在してよい。いくつかの実施形態では、凍結乾燥用の製剤は、凍結乾燥前製剤または再構成製剤を等張に保つために等張剤を含む。

一般に、非経口投与薬には等張液が好ましいが、等張液の使用によって、いくつかの治療薬の溶解度、特には、いくつかのタンパク質および／または酵素の溶解度を変えることができる。やや高張性の溶液（例えば５ｍＭのリン酸ナトリウム中に最高で１７５ｍＭの塩化ナトリウム（ｐＨ７．０））、および糖含有溶液（例えば５ｍＭリン酸ナトリウム中に最高で２％のショ糖（ｐＨ７．０））は、耐容性の高いことが示されている。最も一般的な認可ＣＮＳボーラス製剤組成物は、生理食塩水（約１５０ｍＭのＮａＣｌ水溶液）である。
安定化剤

いくつかの実施形態では、製剤は、タンパク質を保護するために安定化剤またはリオプロテクタントを含んでよい。典型的には、適切な安定化剤は、糖、非還元糖、および／またはアミノ酸である。例示的な糖としては、デキストラン、ラクトース、マンニトール、マンノース、ソルビトール、ラフィノース、ショ糖、およびトレハロースが挙げられるが、これらに限定されない。例示的なアミノ酸としては、アルギニン、グリシン、およびメチオニンが挙げられるが、これらに限定されない。さらなる安定化剤としては、塩化ナトリウム、ヒドロキシエチルでんぷん、およびポリビニルピロリドンを挙げてよい。凍結乾燥製剤中の安定化剤の量は一般に、製剤が等張であるような量である。しかしながら、高張性の再構成製剤も適切であり得る。さらに、安定化剤の量は、治療薬の許容不可能な量の分解／凝集が起きるほど低すぎてはならない。製剤中の例示的な安定化剤濃度は、約１ｍＭ〜約４００ｍＭ（例えば約３０ｍＭ〜約３００ｍＭ、および約５０ｍＭ〜約１００ｍＭ）、あるいは、０．１重量％〜１５重量％（例えば１重量％〜１０重量％、５重量％〜１５重量％、５重量％〜１０重量％）の範囲であってよい。いくつかの実施形態では、安定化剤と治療薬の質量比は、約１：１である。別の実施形態では、安定化剤と治療薬の質量比は、約０．１:１、０．２:１、０．２５:１、０．４:１、０．５:１、１:１、２:１、２．６:１、３:１、４:１、５:１、１０：１、または２０:１であることができる。凍結乾燥に適しているいくつかの実施形態では、安定化剤はリオプロテクタントでもある。

いくつかの実施形態では、本発明に適している液状製剤は非晶質物質を含む。いくつかの実施形態では、本発明に適している液状製剤は、相当量の非晶質物質を含む（例えばショ糖系製剤）。いくつかの実施形態では、本発明に適している液状製剤は、部分的に結晶性／部分的に非晶質な物質を含む。
充填剤

いくつかの実施形態では、凍結乾燥に適している製剤は、１つ以上の充填剤をさらに含む。「充填剤」は、凍結乾燥混合物に質量を加えるとともに、凍結乾燥ケーキの物理的構造に寄与する化合物である。例えば、充填剤は、凍結乾燥ケーキの外観を向上させることができる（例えば本質的に均一な凍結乾燥ケーキ）。適切な充填剤としては、塩化ナトリウム、ラクトース、マンニトール、グリシン、ショ糖、トレハロース、ヒドロキシエチルでんぷんが挙げられるが、これらに限定されない。充填剤の例示的な濃度は約１％〜約１０％（例えば１．０％、１．５％、２．０％、２．５％、３．０％、３．５％、４．０％、４．５％、５．０％、５．５％、６．０％、６．５％、７．０％、７．５％、８．０％、８．５％、９．０％、９．５％、および１０．０％）である。
界面活性剤

いくつかの実施形態では、製剤に界面活性剤を付加することが望ましい。界面活性剤の例としては、ポリソルベート（例えば、ポリソルベート２０または８０）；ポロキサマー（例えば、ポロキサマー１８８）；トリトン；ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）；ラウリル硫酸ナトリウム；ナトリウムオクチルグリコシド；ラウリル−、ミリスチル−、リノレイル−またはステアリル−スルホベタイン；ラウリル−、ミリスチル−、リノレイル−またはステアリル−サルコシン；リノレイル−、ミリスチル−またはセチル−ベタイン；ラウロアミドプロピル−、コカミドプロピル−、リノレアミドプロピル−、ミリスタミドプロピル−、パルミドプロピル−またはイソステアラミドプロピル−ベタイン（例えば、ラウロアミドプロピル）；ミリスタルニドプロピル−、パルミドプロピル−またはイソステアラミドプロピル−ジメチルアミン；ナトリウムメチルココイル−または二ナトリウムメチルオフェイル−タウレート；およびＭＯＮＡＱＵＡＴ（商標）シリーズ（ＭｏｎａＩｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｐａｔｅｒｓｏｎ，Ｎ．Ｊ．）、ポリエチルグリコール、ポリプロピルグリコール、ならびにエチレンおよびプロピレングリコールのコポリマー（例えば、プルロニック、ＰＦ６８等）が挙げられる。典型的には、付加される界面活性剤の量は、それがタンパク質の凝集を低減し、粒子の形成または泡立ちを最小限にするような量である。例えば、界面活性剤は、約０．００１〜０．５％（例えば、約０．００５〜０．０５％または０．００５〜０．０１％）の濃度で製剤中に存在し得る。特に、界面活性剤は、約０．００５％、０．０１％、０．０２％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％または０．５％等の濃度で製剤中に存在し得る。この代わりに、またはこれに加えて、界面活性剤を凍結乾燥製剤、凍結乾燥前洗剤、および／または再構成製剤に加えてもよい。

Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ１６ｔｈｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）に記載されているようなその他の製薬学的に許容可能な担体、賦形剤、または安定剤を本発明の製剤（および／または凍結乾燥製剤および／または再構成製剤）に含めてよい。ただし、本発明の製剤の所望の特徴に悪影響を及ぼさないことを条件とする。許容可能な担体、賦形剤、または安定剤は、用いる用量および濃度において、受容者に対する毒性がないものであり、許容可能な担体、賦形剤、または安定剤としては、追加の緩衝剤、保存剤、共溶媒、抗酸化剤（アスコルビン酸およびメチオニンが挙げられる）、キレート剤（ＥＤＴＡなど）、金属錯体（例えばＺｎ−タンパク質錯体）、生分解性ポリマー（ポリエステルなど）、および／または塩形成対イオン（ナトリウムなど）が挙げられるが、これらに限定されない。

本発明による、水性形態、凍結乾燥前形態、凍結乾燥形態、または再構成形態のいずれかの製剤は、生成物の品質解析結果、再構成時間（凍結乾燥した場合）、再構成の質（凍結乾燥した場合）、高分子量、水分、およびガラス転移温度に基づいて評価できる。典型的には、タンパク質の質および生成物解析としては、サイズ排除ＨＰＬＣ（ＳＥ−ＨＰＬＣ）、陽イオン交換−ＨＰＬＣ（ＣＥＸ−ＨＰＬＣ）、Ｘ線回析（ＸＲＤ）、変調型示差走査熱量測定（ｍＤＳＣ）、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）、多角度光散乱（ＭＡＬＳ）、蛍光、紫外線吸収、ネフェロメトリー、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、およびこれらの組合せ（これらに限定されない）を含む方法を用いる生成物分解率解析が挙げられる。いくつかの実施形態では、本発明による生成物の評価は、外観（液体またはケーキの外観）を評価するステップを含んでよい。

一般的に、製剤（凍結乾燥化または水性）は、室温で長期間保存され得る。貯蔵温度は、典型的には、０℃〜４５℃（例えば、４℃、２０℃、２５℃、４５℃等）の範囲であり得る。製剤は、吸うかげる〜数年の間貯蔵され得る。貯蔵時間は、一般的に、２４ヶ月、１２ヶ月、６ヶ月、４．５ヶ月、３ヶ月、２ヶ月または１ヶ月である。製剤は、投与のために用いられる容器中に直接貯蔵されて、移送ステップを排除し得る。

製剤は、凍結乾燥容器（凍結乾燥される場合）中に直接貯蔵され得るが、これは、再構成容器としても機能して、移送ステップを排除し得る。代替的には、凍結乾燥物質製剤は、貯蔵のためにより小さい増分で測定され得る。貯蔵は、一般的に、タンパク質の分解を生じさせる環境、例えば日光、紫外線他の形態の電磁放射線、過剰な熱または寒冷、休息名熱ショック、ならびに機械的衝撃への曝露（これらに限定されない）を避けるべきである。
凍結乾燥

本発明による本発明の方法を用いて、いずれかの物質、特に治療薬を凍結乾燥することができる。典型的には、凍結乾燥前の製剤は、適切な選択の賦形剤、または、凍結乾燥および貯蔵中に、当該化合物の分解（例えばタンパク質凝集、アミド分解、および／または酸化）を防ぐのを目的とする安定剤、緩衝剤、充填剤、および界面活性剤のようなその他の構成成分をさらに含む。凍結乾燥用の製剤は、リオプロテクタント、または安定化剤、緩衝剤、充填剤、等張剤、および界面活性剤を含め、１つ以上の追加の成分を含むことができる。

当該物質といずれかの追加の構成成分を合わせて混合したら、その製剤を凍結乾燥する。凍結乾燥は一般に、凍結、一次乾燥、および二次乾燥という３つの主な段階を含む。凍結は、水を氷に、または何らかの非晶質の製剤構成成分を結晶形態に変換するのに必要である。一次乾燥は、低圧および低温での直接昇華によって、凍結生成物から氷を除去するステップ段階である。二次乾燥は、残留水の蒸発表面への拡散を利用して、生成物マトリックスから、結合している水分を除去するステップ段階である。二次乾燥中の生成物温度は通常、一次乾燥中よりも高い。ＴａｎｇＸ．ｅｔａｌ．（２００４）“Ｄｅｓｉｇｎｏｆｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｙｉｎｇｐｒｏｃｅｓｓｅｓｆｏｒｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ：Ｐｒａｃｔｉｃａｌａｄｖｉｃｅ,”Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．，２１:１９１−２００、ＮａｉｌＳ．Ｌ．ｅｔａｌ．（２００２）“Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓｏｆｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｙｉｎｇ,”ｉｎＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｎｄｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅｏｆｐｒｏｔｅｉｎｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ．ＮａｉｌＳ．Ｌ．ｅｄｉｔｏｒＮｅｗＹｏｒｋ：ＫｌｕｗｅｒＡｃａｄｅｍｉｃ/ＰｌｅｎｕｍＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，ｐｐ２８１−３５３、Ｗａｎｇｅｔａｌ．（２０００）“Ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎａｎｄｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｓｏｌｉｄｐｒｏｔｅｉｎｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ,”Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．，２０３:１−６０、ＷｉｌｌｉａｍｓＮ．Ａ．ｅｔａｌ．（１９８４）“Ｔｈｅｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎｏｆｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ；Ａｌｉｔｅｒａｔｕｒｅｒｅｖｉｅｗ．”Ｊ．ＰａｒｅｎｔｅｒａｌＳｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，３８:４８−５９を参照されたい。一般に、本発明に関しては、いずれの凍結乾燥プロセスを用いることもできる。

いくつかの実施形態では、生成物の初期凍結中に、アニーリング工程を組み込んでもよい。アニーリング工程は、総サイクルタイムを短縮する場合がある。いずれの理論にも束縛されるものではないが、アニーリング工程は、過冷却中に形成された小結晶の再結晶化により、賦形剤の結晶化と、より大きい結晶の形成の促進を助けることができ、ひいては、再構成を高めると考えられる。典型的には、アニーリング工程は、凍結中の温度での間欠期または振動を含む。例えば、凍結温度は−４０℃であってよく、アニーリング工程は、その温度を例えば−１０℃まで上昇させ、その温度を設定期間にわたって保持することになる。アニーリング工程時間は、０．５時間〜８時間（例えば０．５時間、１．０時間、１．５時間、２．０時間、２．５時間、３時間、４時間、６時間、および８時間）の範囲であってよい。アニーリング温度は、凍結温度〜０℃であってよい。

凍結乾燥は、管、バッグ、瓶、トレー、バイアル（例えばガラスバイアル）、注射器のような容器、またはいずれかのその他の適切な容器の中で行ってよい。この容器は使い捨て式であってよい。凍結乾燥は、大規模で行っても小規模で行ってもよい。場合によっては、移転工程を無くすために、そのタンパク質製剤のタンパク質の再構成を行うことになる容器内で、タンパク質製剤を凍結乾燥するのが望ましい場合がある。この場合の容器は、例えば３ｃｃ、４ｃｃ、５ｃｃ、１０ｃｃ、２０ｃｃ、５０ｃｃ、または１００ｃｃのバイアルであってよい。

上記の目的では、Ｈｕｌｌというパイロットスケールドライヤー（米国のＳＰＩｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）、Ｇｅｎｅｓｉｓ（ＳＰＩｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）というラボラトリー用フリーズドライヤー、または、所定の凍結乾燥プロセスパラメーターを制御できるいずれかのフリーズドライヤーのような多種多様なフリーズドライヤーを利用可能である。凍結乾燥は、製剤を凍結してから、一次乾燥に適した温度で、凍結内容物から氷を昇華させることによって実施する。初期凍結によって、典型的には約４時間以内（例えば約３時間以内、約２．５時間以内、約２時間以内）で、製剤を約−２０℃未満（例えば−５０℃、−４５℃、−４０℃、−３５℃、−３０℃、−２５℃など）の温度にする。この条件下では、生成物温度は典型的には、製剤の共融点または崩壊温度未満である。典型的には、一次乾燥の棚温は、典型的には約２０〜２５０ミリトールの範囲である適切な圧力において、約−３０〜２５℃の範囲となる（ただし、生成物が一次乾燥中に融点未満を保つことを条件とする）。主に、製剤、試料を入れる容器（例えばガラスバイアル）の大きさおよび種類、ならびに、液体の体積によって、乾燥に要する時間決まることになり、この時間は、数時間〜数日の範囲になり得る。二次乾燥段階は、主に容器の種類および大きさ、ならびに、用いる治療用タンパク質の種類に応じて、約０〜６０℃で行う。二次乾燥においても、主に、液体の体積によって、乾燥に要する時間決まることになり、この時間は、数時間〜数日の範囲になり得る。

一般命題としては、凍結乾燥によって、含水率が約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、約１％未満、および約０．５％未満である凍結乾燥製剤が得られることになる。
再構成

本発明の医薬組成物は一般に、対象への投与時には水性形態であるが、いくつかの実施形態では、本発明の医薬組成物は凍結乾燥されている。このような組成物は、対象への投与前に、その組成物に１つ以上の希釈剤を加えることによって再構成しなければならない。所望の段階において、典型的には、患者に投与前の適切な時に、凍結乾燥製剤を希釈剤で再構成して、その再構成製剤のタンパク質濃度が所望のものになるようにしてよい。

本発明に従って各種希釈剤を用いてよい。いくつかの実施形態では、再構成に適している希釈剤は水である。希釈剤として用いる水は、逆浸透、蒸留、脱イオン化、ろ過（例えば活性炭、精密ろ過、ナノろ過）、およびこれらの処理方法を組み合わせたものを含む様々な方法で処理することができる。一般に、この水は、注入に適しているものである必要があり、そのような水としては、注入用の滅菌水または静菌水が挙げられるが、これらに限定されない。

追加の例示的な希釈剤としては、ｐＨ緩衝液（例えばリン酸緩衝生理食塩水）、滅菌生理食塩水、エリオット溶液、リンガー溶液、またはデキストロース溶液が挙げられる。適切な希釈剤は任意で保存剤を含んでもよい。例示的な保存剤としては、ベンジルアルコールまたはフェノールアルコールのような芳香族アルコールが挙げられる。用いる保存剤の量は、様々な保存剤濃度の当該タンパク質との適合性、および保存剤の効力試験を評価することによって決定する。例えば、保存剤が芳香族アルコール（ベンジルアルコールなど）の場合、その保存剤は、約０．１〜２．０％、約０．５〜１．５％、または約１．０〜１．２％の量で存在することができる。

本発明に適している希釈剤としては様々な添加剤を挙げてよく、この添加剤としては、ｐＨ緩衝剤（例えばトリス、ヒスチジン）、塩（例えば塩化ナトリウム）、および、上記の添加剤（例えば安定化剤、等張剤）を含むその他の添加剤（例えばショ糖）が挙げられるが、これらに限定されない。

本発明によれば、凍結乾燥物質（例えばタンパク質）は、少なくとも２５ｍｇ／ｍＬ（例えば少なくとも５０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも７５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも１００ｍｇ／）の濃度、およびこれらの範囲の間のいずれかの濃度に再構成できる。いくつかの実施形態では、凍結乾燥物質（例えばタンパク質）は、約１ｍｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬ（例えば約１ｍｇ／ｍＬ〜５０ｍｇ／ｍＬ、１ｍｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬ、約１ｍｇ／ｍＬ〜約５ｍｇ／ｍＬ、約１ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬ、約１ｍｇ／ｍＬ〜約２５ｍｇ／ｍＬ、約１ｍｇ／ｍＬ〜約７５ｍｇ／ｍＬ、約１０ｍｇ／ｍＬ〜約３０ｍｇ／ｍＬ、約１０ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬ、約１０ｍｇ／ｍＬ〜約７５ｍｇ／ｍＬ、約１０ｍｇ／ｍＬ〜約１００ｍｇ／ｍＬ、約２５ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬ、約２５ｍｇ／ｍＬ〜約７５ｍｇ／ｍＬ、約２５ｍｇ／ｍＬ〜約１００ｍｇ／ｍＬ、約５０ｍｇ／ｍＬ〜約７５ｍｇ／ｍＬ、約５０ｍｇ／ｍＬ〜約１００ｍｇ／ｍＬ）の範囲の濃度に再構成してよい。いくつかの実施形態では、再構成製剤中のタンパク質の濃度は、凍結乾燥前製剤の濃度よりも高くてもよい。再構成製剤の高いタンパク質濃度は、再構成製剤の皮下または筋内送達が意図されている場合に特に有用であるとみなされている。いくつかの実施形態では、再構成製剤のタンパク質濃度は、凍結乾燥前製剤の約２〜５０倍（例えば約２〜２０倍、約２〜１０倍、または約２〜５倍）であってよい。いくつかの実施形態では、再構成製剤のタンパク質濃度は、凍結乾燥前製剤の少なくとも約２倍（例えば少なくとも約３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、４０倍）であってよい。

本発明による再構成は、いずれの容器内で行ってもよい。本発明に適している例示的な容器としては、管、バイアル、注射器（例えばシングルチャンバーまたはデュアルチャンバー）、バッグ、瓶、トレーなどが挙げられるが、これらに限定されない。適切な容器は、ガラス、プラスチック、金属のようないずれの物質から作られていてもよい。この容器は使い捨て式であっても、再利用可能であってもよい。再構成は、大規模で行っても小規模で行ってもよい。

場合によっては、移転工程を無くすために、そのタンパク質製剤のタンパク質の再構成を行うことになる容器内で、タンパク質製剤を凍結乾燥するのが望ましい場合がある。この場合の容器は、例えば３ｃｃ、４ｃｃ、５ｃｃ、１０ｃｃ、２０ｃｃ、５０ｃｃ、または１００ｃｃのバイアルであってよい。いくつかの実施形態では、凍結乾燥および再構成に適している容器は、デュアルチャンバー注射器（例えばＬｙｏ−Ｊｅｃｔ（登録商標）（Ｖｅｔｔｅｒ）という注射器）である。例えば、デュアルチャンバー注射器には、凍結乾燥物質と希釈剤の両方を入れてよく、それぞれ、ストッパーによって仕切られている別個のチャンバー内に入れる（実施例５を参照されたい）。再構成するには、プランジャーを希釈剤側のストッパーに取り付けて、プランジャーを押して希釈剤を生成物チャンバー内に移動させて、希釈剤が凍結乾燥物質と接触できるようにするとともに、本明細書に記載のように再構成できるようにすることができる（実施例５を参照されたい）。

本発明の医薬組成物、製剤、および関連する方法は、様々な治療薬を対象のＣＮＳに（例えば髄腔内、脳内、または槽内）送達するのと、関連する疾患の治療するのに有用である。本発明の医薬組成物は、タンパク質および酵素（例えば酵素補充療法）をリソソーム蓄積障害の対象に送達するのに特に有用である。リソソーム蓄積症は、リソソーム機能の欠損に起因する比較的まれな遺伝性代謝性疾患群を表す。リソソーム疾患は、未消化巨大分子のリソソーム内での蓄積によって特徴付けられ、この蓄積によって、当該リソソームの大きさおよび数が増大し、最終的には、細胞機能障害および臨床的異常が起こる。
ＣＮＳ送達

本明細書に記載されている様々な安定な製剤は一般に、治療薬のＣＮＳ送達に適していると考えられる。本発明による安定な製剤は、様々な技法および経路によるＣＮＳ送達に用いることができ、この技法および経路としては、実質内投与、脳内投与、大脳脳室内（ＩＣＶ）投与、髄腔内（例えばＩＴ−腰椎、ＩＴ−大槽）投与、および、直接または間接的にＣＮＳおよび／またはＣＳＦに注入するためのいずれかのその他の技法および経路が挙げられるが、これらに限定されない。
髄腔内送達

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている製剤で、補充酵素をＣＮＳに送達する。いくつかの実施形態では、治療を必要とする対象の脳脊髄液（ＣＳＦ）中に投与することによって、補充酵素をＣＮＳに送達する。いくつかの実施形態では、髄腔内投与を用いて、所望の補充酵素（例えばＡＳＡタンパク質）をＣＳＦ中に送達する。本明細書で用いる場合、髄腔内投与（髄腔内注入とも称する）とは、脊柱管（脊髄を取り囲む髄腔内の空間）への注入を指す。様々な技法（穿頭、大槽穿刺、または腰椎穿刺による側方脳室内注入などが挙げられるが、これらに限定されない）を用いてよい。例示的な方法は、Ｌａｚｏｒｔｈｅｓｅｔａｌ．ＡｄｖａｎｃｅｓｉｎＤｒｕｇＤｅｌｉｖｅｒｙＳｙｓｔｅｍｓａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｉｎＮｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ，１４３−１９２、およびＯｍａｙａｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＤｒｕｇＤｅｌｉｖｅｒｙ，１：１６９−１７９に記載されており、これらの内容は参照により本明細書に組み込まれる。

本発明によれば、脊柱管を取り囲むいずれかの領域に酵素を注入してよい。いくつかの実施形態では、酵素を腰椎区域または大槽中に注入するか、脳室空間に脳内注入する。本明細書で用いる場合、「腰部領域」または「腰椎区域」という用語は、第三腰椎と第四腰椎（腰）との間の区域を指し、より包括的には、脊椎のＬ２〜Ｓ１領域を指す。典型的には、腰部領域または腰部区域を介する髄腔内注入は、「腰椎ＩＴ送達」または「腰椎ＩＴ投与」とも称される。「大槽」という用語は、頭蓋と脊椎の最上部との間の開口部を介する小脳の周囲および下方の空間を指す。典型的には、大槽を介する髄腔内注入は、「大槽送達」とも称される。「脳室」という用語は、脊髄の中心管に続く、脳内の腔を指す。典型的には、脳室腔を介する注入は、大脳脳室内（ＩＣＶ）送達と称される。

いくつかの実施形態では、本発明による「髄腔内投与」または「髄腔内送達」とは、例えば第三腰椎と第四腰椎（腰部）との間、より包括的には脊椎のＬ２〜Ｓ１領域に送達する腰椎ＩＴ投与または送達を指す。本発明による腰椎ＩＴ投与または送達は、より良好に、かつより有効に遠位脊柱管に送達させる一方で、特に大槽送達は典型的には、遠位脊柱管に十分には送達させないという点で、腰椎ＩＴ投与または送達は大槽送達とは区別されると考えられる。
髄腔内送達のための器具

本発明による髄腔内送達のために、種々の器具が用いられ得る。いくつかの実施形態では、髄腔内投与のための器具は、流体アクセスポート（例えば注射用口）；流体アクセスポートと流体連絡する第一流出口、および脊髄中への挿入のために設計された第二流出口；ならびに脊髄における中空体の挿入を固定するための固定機構を含有する。図６２に示した非限定例として、適切な固定機構は、中空体の表面に載せられる１つ以上のノブ、および１つ以上のノブを覆って、中空体が脊髄から滑り落ちないようにする調整可能な縫合環を含有する。種々の実施形態では、流体アクセスポートはレザバーを含む。いくつかの実施形態では、流体アクセスポートは、機械的ポンプ（例えば、注入ポンプ）を含む。いくつかの実施形態では、埋込みカテーテルは、レザバー（例えば、ボーラス送達のため）または注入ポンプと連結される。流体アクセスポートは、埋め込まれるかまたは外側に存在し得る。

いくつかの実施形態では、髄腔内投与は、腰椎穿刺（すなわち、緩徐ボーラス投与）により、またはポート・カテーテル送達系（すなわち注入またはボーラス投与）を介して実施され得る。いくつかの実施形態では、カテーテルは腰椎の薄板間に挿入され、尖端は、包膜空隙に所望のレベル（一般的にＬ３〜Ｌ４）に装填される（図６３）。

静脈内投与に比して、髄腔内投与に適した単回用量投与容積は典型的に小さい。典型的には、本発明による髄腔内送達は、ＣＳＦの組成の平衡、ならびに対象の頭蓋内圧を保持する。いくつかの実施形態では、髄腔内送達は、対象からのＣＳＦの対応する除去がない時に実施される。いくつかの実施形態では、適切な単回用量投与容積は、例えば約１０ｍｌ、８ｍｌ、６ｍｌ、５ｍｌ、４ｍｌ、３ｍｌ、２ｍｌ、１．５ｍｌ、１ｍｌまたは０．５ｍｌ未満であり得る。いくつかの実施形態では、適切な単回用量投与容積は、約０．５〜５ｍｌ、０．５〜４ｍｌ、０．５〜３ｍｌ、０．５〜２ｍｌ、０．５〜１ｍｌ、１〜３ｍｌ、１〜５ｍｌ、１．５〜３ｍｌ、１〜４ｍｌまたは０．５〜１．５ｍｌであり得る。いくつかの実施形態では、本発明による髄腔内送達は、所望量のＣＳＦを除去するステップを最初に包含する。いくつかの実施形態では、約１０ｍｌ未満（例えば、約９ｍｌ、８ｍｌ、７ｍｌ、６ｍｌ、５ｍｌ、４ｍｌ、３ｍｌ、２ｍｌ、１ｍｌ未満）のＣＳＦが先ず除去された後、ＩＴ投与がなされる。それらの場合、適切な単回用量投与容積は、例えば約３ｍｌ、４ｍｌ、５ｍｌ、６ｍｌ、７ｍｌ、８ｍｌ、９ｍｌ、１０ｍｌ、１５ｍｌまたは２０ｍｌより大きい。

治療用組成物の髄腔内投与を実行するために、種々の他の装置が用いられ得る。例えば、所望の酵素を含有する製剤は、髄膜癌腫症のための薬剤を髄腔内投与するために一般に用いられるオンマヤ（Ommaya）レザバーを用いて投与され得る（Ｌａｎｃｅｔ２：９８３−８４，１９６３）。さらに具体的には、この方法では、脳室チューブは前角中に形成される穴を通して挿入され、頭皮下に設置されるオンマヤレザバーに連結され、レザバーは皮下穿刺されて、レザバー中に注入される補充されるべき特定酵素を髄腔内送達する。個体への治療用組成物または製剤の髄腔内投与のための他の装置は、米国特許第６，２１７，５５２号（この記載内容は参照により本明細書に援用される）に記載されている。代替的には、薬剤は、例えば単回注射または連続注入により、髄腔内投与され得る。投薬治療は、単回用量投与または多数回用量投与の一形態であり得る、と理解されるべきである。

注射のためには、本発明の製剤は、液体溶液中に処方され得る。さらに、酵素は固体形態で処方され、使用直前に再溶解または懸濁され得る。凍結乾燥形態も包含される。注射は、例えば、酵素のボーラス注射または連続注入（例えば、注入ポンプを用いる）の形態であり得る。

本発明の一実施形態では、酵素は、対象の脳への外側脳室注射により投与される。注射は、例えば、対象の頭蓋骨に作られる穿頭孔を通してなされ得る。別の実施形態では、酵素および／または他の薬学的製剤は、対象の脳室中に外科的に挿入されるシャントを通して投与される。例えば、注射は、より大きい外側脳室中になされ得る。いくつかの実施形態では、より小さい第三および第四脳室への注射もなされ得る。

さらに別の実施形態では、本発明に用いられる薬学的組成物は、対象の大槽または腰椎区域への注射により投与される。

本発明の方法の別の実施形態では製薬上許容可能な製剤は、製薬上許容可能な製剤が対象に投与された後、少なくとも１、２、３、４週間またはそれ以上の間、対象に、本発明で用いられる酵素または他の薬学的組成物の持続性送達、例えば「緩徐放出」を提供する。

本明細書で用いる場合、「持続性送達」という用語は、投与後、長期間に亘って、好ましくは少なくとも数日間、１週間または数週間、ｉｎｖｉｖｏで本発明の薬学的製剤を連続送達することを指す。組成物の持続性送達は、例えば、長時間に亘る酵素の連続治療効果により実証され得る（例えば、酵素の持続性送達は、対象における貯蔵顆粒の量の連続的低減により実証され得る）。代替的には、酵素の持続性送達は、長時間に亘るｉｎｖｉｖｏでの酵素の存在を検出することにより実証され得る。
標的組織への送達

上記のように、本発明の意外な且つ重要な特徴の１つは、本発明の方法を用いて投与される治療薬、特に補充酵素、ならびに本発明の組成物は、脳表面全体に効果的に且つ広範囲に拡散し、脳の種々の層または領域、例えば深部脳領域に浸透し得る、という点である。さらに、本発明の方法および本発明の組成物は、現存するＣＮＳ送達方法、例えばＩＣＶ注射では標的化するのが困難である脊髄の出の組織、ニューロンまたは細胞、例えば腰部領域に治療薬（例えばＡＳＡ酵素）を効果的に送達する。さらに、本発明の方法および組成物は、血流ならびに種々の末梢器官および組織への十分量の治療薬（例えばＡＳＡ酵素）を送達する。

したがって、いくつかの実施形態では、治療用タンパク質（例えばＡＳＡ酵素）は、対象の中枢神経系に送達される。いくつかの実施形態では、治療用タンパク質（例えばＡＳＡ酵素）は、脳、脊髄および／または末梢期間の標的組織の１つ以上に送達される。本明細書で用いる場合、「標的組織」という用語は、治療されるべきリソソーム蓄積症により影響を及ぼされる任意の組織、あるいは欠損リソソーム酵素が正常では発現される任意の組織を指す。いくつかの実施形態では、標的組織としては、リソソーム蓄積症に罹患しているかまたは罹り易い患者において、例えば組織の細胞リソソーム中に貯蔵される酵素基質が検出可能量でまたは異常に高い量で存在する組織が挙げられる。いくつかの実施形態では、標的組織としては、疾患関連病態、症状または特徴を示す組織が挙げられる。いくつかの実施形態では、標的組織としては、欠損リソソーム酵素が抗レベルで正常では発現される組織が挙げられる。本明細書で用いる場合、標的組織は、脳標的組織、脊髄標的組織および／または末梢標的組織であり得る。標的組織の例は、以下で詳細に記載される。脳標的組織

概して、脳は、異なる領域、層および組織に分けられ得る。例えば、髄膜組織は、脳を含めた中枢神経系を包む膜系である。髄膜は、３つの層、例えば硬膜、くも膜および軟膜を含有する。概して、髄膜の、ならびに脳脊髄液の主な機能は、脳神経系を保護することである。いくつかの実施形態では、本発明による治療用タンパク質は、髄膜の１つ以上の層に送達される。

脳は、大脳、小脳および脳幹を含めた３つの主な細区画を有する。大脳半球は、ほとんどの他の脳構造の上に位置し、皮質層で覆われている。大脳の下層には脳幹が横たわり、これは茎に似ており、その上に大脳が取り付けられている。脳の後部、大脳の下および脳幹の背後には、小脳が存在する。

脳の正中線近くおよび中脳の上に位置する間脳は、視床、視床後部、視床下部、視床上部、腹側視床および視蓋腹部を含有する。中脳（mesencephalon）は、midbrainとも呼ばれ、視蓋、外被、導管、ならびに大脳脚、赤核および第三脳神経核を含有する。中脳は、視覚、聴覚、運動制御、睡眠／覚醒、警戒および温度調節に関連する。

脳を含めた中枢神経系の組織の領域は、組織の深さに基づいて特性化され得る。ＣＮＳ（例えば脳）組織は、表面または浅在組織、中深部組織および／または深部組織として特性化され得る。

本発明によれば、治療用タンパク質（例えば、補充酵素）は、対象において治療されるべき特定疾患に関連した任意の適切な脳標的組織（単数または複数）に送達され得る。いくつかの実施形態では、本発明による治療用タンパク質（例えば、補充酵素）は、表面および浅在脳標的組織に送達される。いくつかの実施形態では、本発明による治療用タンパク質は、中深部脳標的組織に送達される。いくつかの実施形態では、本発明による治療用タンパク質は、深部脳標的組織に送達される。いくつかの実施形態では、本発明による治療用タンパク質は、表面または浅在脳標的組織、中深部脳標的組織および／または深部脳標的組織の組合せに送達される。いくつかの実施形態では、本発明による治療用タンパク質は、脳の外表面の少なくとも４ｍｍ、５ｍｍ、６ｍｍ、７ｍｍ、８ｍｍ、９ｍｍ、１０ｍｍまたはそれより下（または内側）の深部脳組織に送達される。

いくつかの実施形態では、治療薬（例えば酵素）は、大脳の１つ以上の表面または浅在組織に送達される。いくつかの実施形態では、大脳の標的化表面または浅在組織は、大脳の表面から４ｍｍ内に位置する。いくつかの実施形態では、大脳の標的化表面または浅在組織は、軟膜組織、大脳皮質リボン組織、海馬、フィルヒョー・ロバン腔隙、ＶＲ腔隙内の血管、海馬、脳の下面の視床下部の部分、視神経および視索、嗅球および嗅突起ならびにその組合せから選択される。

いくつかの実施形態では、治療薬（例えば酵素）は、大脳の１つ以上の深部組織に送達される。いくつかの実施形態では、大脳の標的化表面または浅在組織は、大脳の表面から４ｍｍより下（例えば、５ｍｍ、６ｍｍ、７ｍｍ、８ｍｍ、９ｍｍまたは１０ｍｍ）に位置する。いくつかの実施形態では、大脳の標的化深部組織は、大脳皮質リボンを包含する。いくつかの実施形態では、大脳の標的化深部組織は、間脳(例えば、視床下部、視床、腹側視床および視床腹部等)、後脳、レンズ核、基底核、尾状核、被核、扁桃、淡蒼球およびその組合せの１つ以上を包含する。

いくつかの実施形態では、治療薬(例えば酵素)は、小脳の１つ以上の組織に送達される。ある実施形態では、小脳の１つ以上の標的化組織は、分子層の組織、プルキンエ細胞層の組織、顆粒細胞層の組織、小脳脚およびその組合せからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、治療薬（例えば酵素）は、小脳の１つ以上の深部組織、例えばプルキンエ細胞層の組織、顆粒細胞層の組織、深部小脳白質組織（例えば、顆粒細胞層に比して深部）および深部小脳核組織（これらに限定されない）に送達される。

いくつかの実施形態では、治療薬（例えば酵素）は、脳幹の１つ以上の組織に送達される。いくつかの実施形態では、脳幹の１つ以上の標的化組織は、脳幹白質組織および／または脳幹核組織を包含する。

いくつかの実施形態では、治療薬（例えば酵素）は、種々の脳組織、例えば灰白質、白質、脳室周囲域、軟膜−くも膜、髄膜、新皮質、小脳、大脳皮質の深部組織、分子層、尾状核／被殻領域、中脳、脳橋または延髄の深部領域、およびその組合せ（これらに限定されない）に送達される。

いくつかの実施形態では、治療薬(例えば酵素)は、脳中の種々の細胞、例えばニューロン、グリア細胞、血管周囲細胞および／または髄膜細胞（これらに限定されない）に送達される。いくつかの実施形態では、治療用タンパク質は、深部白質の乏突起グリア細胞に送達される。
脊髄

概して、脊髄の領域または組織は、組織の深度に基づいて特性化され得る。例えば、脊髄組織は、表面または浅在組織、中深部組織、および／または深部組織として特性化され得る。

いくつかの実施形態では、治療薬（例えば酵素）は、脊髄の１つ以上の表面または浅在組織に送達される。いくつかの実施形態では、脊髄の標的化表面または浅在組織は、脊髄の表面から４ｍｍ内に位置する。いくつかの実施形態では、脊髄の標的化表面または浅在組織は、軟膜および／または白質路を含有する。

いくつかの実施形態では、治療薬（例えば酵素）は、脊髄の１つ以上の深部組織に送達される。いくつかの実施形態では、脊髄の標的化深部組織は、脊髄の表面から４ｍｍ内部に位置する。いくつかの実施形態では、脊髄の標的化深部組織は、脊髄灰白質および／または上衣細胞を含有する。

いくつかの実施形態では、治療薬（例えば酵素）は、脊髄のニューロンに送達される。末梢標的組織

本明細書で用いる場合、末梢器官または組織は、中枢神経系（ＣＮＳ）の一部ではない任意の器官または組織を指す。末梢標的組織としては、血管系、肝臓、腎臓、心臓、内皮、骨髄および骨髄由来細胞、脾臓、肺、リンパ節、骨、軟骨、卵巣および精巣が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、本発明による治療用タンパク質（例えば補充酵素）は、末梢標的組織の１つ以上に送達される。
生体分布およびバイオアベイラビリティ

様々な実施形態において、標的組織に一旦送達されると、治療薬（例えばＡＳＡ酵素）は、細胞内に局在化される。例えば、治療薬（例えば酵素）は、標的細胞（例えば、プルキンエ細胞のようなニューロン）のエキソン、軸索、リソソーム、ミトコンドリアまたは空胞に局在化され得る。例えば、いくつかの実施形態では、髄腔内投与酵素は、酵素が血管周囲腔隙内に移動するよう（例えば、拍動補助対流機構により）、移動力学を実証する。さらに、投与タンパク質または酵素と神経細繊維との会合に関する活性軸索輸送機構も、中枢神経系の深部組織中への、髄腔内投与タンパク質または酵素の分布に寄与し得るし、そうでなければそれを助長し得る。

いくつかの実施形態では、本発明に従って送達される治療薬（例えばＡＳＡ酵素）は、本明細書中に記載される種々の標的組織において、治療的または臨床的有効レベルまたは活性を達成し得る。本明細書で用いる場合、治療的または臨床的有効レベルまたは活性は、標的組織において治療作用を付与するのに十分なレベルまたは活性である。治療作用は、客観的（すなわち、何らかの試験またはマーカーにより測定）または主観的（すなわち、対象が作用の指標または感覚を提示する）であり得る。例えば、治療的または臨床的有効レベルまたは活性は、標的組織における疾患に伴う症状（例えばＧＡＧ蓄積）を改善するのに十分である酵素レベルまたは活性であり得る。

いくつかの実施形態では、本発明に従って送達される治療薬（例えば補充酵素）は、標的組織における対応するリソソーム酵素の正常レベルまたは活性の少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％である酵素レベルまたは活性を達成し得る。いくつかの実施形態では、本発明に従って送達される治療薬（例えば補充酵素）は、対照（例えば、治療を伴わない内因性レベルまたは活性）と比較して、少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍または１０倍増大される酵素レベルまたは活性を達成し得る。いくつかの実施形態では、本発明に従って送達される治療薬（例えば補充酵素）は、標的組織中で、少なくとも約１０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、２０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、４０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、５０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、６０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、７０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、８０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、９０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、１００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、１５０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、２００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、２５０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、３００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、３５０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、４００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、４５０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、５００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、５５０ｎｍｏｌ／時・ｍｇまたは６００ｎｍｏｌ／時・ｍｇの酵素レベルまたは活性増大を達成し得る。

いくつかの実施形態では、本発明の方法は、腰部領域を標的化するために特に有用である。いくつかの実施形態では、本発明に従って送達される治療薬（例えば補充酵素）は、少なくとも約５００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、６００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、７００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、８００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、９００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、１０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、１５００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、２０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、３０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、４０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、５０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、６０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、７０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、８０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、９０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇまたは１０，０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇの腰部領域における酵素レベルまたは活性増大を達成し得る。

概して、本発明に従って送達される治療薬（例えば補充酵素）は、ＣＳＦならびに脳、脊髄および末梢器官の標的組織中で十分に長い半減期を有する。いくつかの実施形態では、本発明に従って送達される治療薬（例えば補充酵素）は、少なくとも約３０分、４５分、６０分、９０分、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１２時間、１６時間、１８時間、２０時間、２５時間、３０時間、３５時間、４０時間、３日まで、７日まで、１４日まで、２１日まで、または１ヶ月までの半減期を有し得る。いくつかの実施形態では、本発明に従って送達される治療薬（例えば補充酵素）は、投与の１２時間、２４時間、３０時間、３６時間、４２時間、４８時間、５４時間、６０時間、６６時間、７２時間、７８時間、８４時間、９０時間、９６時間、１０２時間または１週間後に、ＣＳＦまたは血流中に検出可能なレベルまたは活性を保持し得る。検出可能なレベルまたは活性は、当該技術分野で既知の種々の方法を用いて決定され得る。

ある実施形態では、本発明に従って送達される治療薬（例えば補充酵素）は、投与後（例えば、対象への薬学的組成物の髄腔内投与の、１週間、３日、４８時間、３６時間、２４時間、１８時間、１２時間、８時間、６時間、４時間、３時間、２時間、１時間、３０分後、またはそれ未満の後）、対象のＣＮＳ組織および細胞中で、少なくとも３０μｇ／ｍｌの濃度を達成する。ある実施形態では、本発明に従って送達される治療薬（例えば補充酵素）は、対象の標的化組織または細胞（例えば、脳組織またはニューロン）中で、このような対象への投与後（例えば、対象へのこのような薬学的組成物の髄腔内投与の、１週間、３日、４８時間、３６時間、２４時間、１８時間、１２時間、８時間、６時間、４時間、３時間、２時間、１時間、３０分後、またはそれ未満の後）、少なくとも２０μｇ／ｍｌ、少なくとも１５μｇ／ｍｌ、少なくとも１０μｇ／ｍｌ、少なくとも７．５μｇ／ｍｌ、少なくとも５μｇ／ｍｌ、少なくとも２．５μｇ／ｍｌ、少なくとも１．０μｇ／ｍｌまたは少なくとも０．５μｇ／ｍｌの濃度を達成する。
異染性白質ジストロフィー症（ＭＬＤ）の治療

異染性白質ジストロフィー症（ＭＬＤ）は、酵素アリールスルファターゼＡ（ＡＳＡ）の欠乏に起因する常染色体劣性障害である。ヒトにおけるＡＲＳＡ遺伝子によりコードされるＡＳＡは、セレブロシド３−スルフェートまたはスフィンゴリピド３−Ｏ−スルホガラクトシルセラミド（スルファチド）をセレブロシドおよびスルフェートに分解する酵素である。当該酵素の非存在下では、スルファチドは神経系（例えばミエリン鞘、ニューロンおよびグリア細胞）に蓄積するが、内臓中に蓄積する程度は低い。これらの分子および細胞性事象は、ＣＮＳおよびＰＮＳ内の進行性脱髄および軸索損失であって、これは、臨床的に、重度の運動および認知機能障害を伴う。

この障害の限定性臨床的特徴は中枢神経系（ＣＮＳ）変性であって、これにより、認知障害（例えば、精神遅滞、神経障害および失明等）が生じる。

ＭＬＤは、それ自体、幼児において症状発現し得る（後期乳児型）が、この場合、罹患小児は、典型的には、出生初年後（例えば、約１５〜２４ヶ月）直ぐに症状を示し始め、一般的に、５歳を過ぎると生存しない。ＭＬＤは、それ自体、小児において症状発現し得る（若年型）が、この場合、罹患小児は、典型的には、約３〜１０歳までに認知障害を示し、寿命は種々であり得る（例えば、症状開始後１０〜１５年の範囲）。ＭＬＤは、それ自体、成年において症状発現し（成年開始型）、あらゆる年齢（例えば、典型的には１６歳以降）の個体に現れ、疾患の進行は大きく異なり得る。

ＭＬＤを罹患しているか、またはＭＬＤを罹患しやすい個体を有効に治療する目的で、本発明の組成物および方法を用いてよい。本明細書で用いる場合、「治療する」または「治療」という用語は、当該疾患に伴う１つ以上の症状の改善、当該疾患の１つ以上の症状の開始の防止または遅延、および／または当該疾患の１つ以上の症状の重症度または頻度の低下を指す。例示的な症状としては、頭蓋内圧増大、真空水頭症，中枢および末梢神経系と内臓器官とにおけるミエリン鞘中の硫酸化糖脂質蓄積、ＣＮＳおよびＰＮＳ内の進行性脱髄および軸索損失、ならびに／または運動および認知機能障害が挙げられるが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態では、治療は、ＭＬＤ患者における神経学的障害の重症度および／または発生率を部分的にまたは完全に緩和し、改善し、軽減し、抑制し、開始を遅延し、重症度および／または発生率を低減することを指す。本明細書で用いる場合、「神経学的障害」という用語は、中枢神経系（例えば、脳および脊髄）の機能障害に伴う種々の症状を包含する。いくつかの実施形態では、ＭＬＤの様々な症状は、末梢神経系（ＰＮＳ）の機能障害と関連する。いくつかの実施形態では、ＭＬＤ患者の神経学的障害は、全体的運動機能の低下によって特徴付けられる。全体的運動機能は、いずれかの適切な方法によって評価できると理解される。例えば、いくつかの実施形態では、全体的運動機能は、ＧｒｏｓｓＭｏｔｏｒＦｕｎｃｔｉｏｎＭｅａｓｕｒｅ−８８（ＧＭＦＭ−８８）の総素点を用いて、運動機能のベースラインからの変化として測定する。

いくつかの実施形態では、治療とは、各種組織におけるスルファチド蓄積量の減少を指す。いくつかの実施形態では、治療とは、脳標的組織、脊髄ニューロン、および／または末梢標的組織におけるスルファチド蓄積量の減少を指す。特定の実施形態では、スルファチド蓄積量は、対照と比較して約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、または１００％超減少する。いくつかの実施形態では、スルファチド蓄積量は、対照と比較して少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、または１０倍減少する。スルファチド蓄積量は、いずれかの適切な方法によって評価できると理解される。例えば、いくつかの実施形態では、スルファチド蓄積量は、アルシアンブルー染色によって測定する。いくつかの実施形態では、スルファチド蓄積量は、ＬＡＭＰ−１染色によって測定する。

いくつかの実施形態では、治療とは、ニューロン（例えばプルキンエ細胞を含むニューロン）の空胞形成の低減を指す。特定の実施形態では、ニューロンの空胞形成を対照と比較して約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、または１００％超低減する。いくつかの実施形態では、空胞形成を対照と比較して少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、または１０倍低減する。

いくつかの実施形態では、治療とは、各種組織内のＡＳＡの酵素活性の増大を指す。いくつかの実施形態では、治療とは、脳の標的組織、脊髄ニューロン、および／または末梢の標的組織内のＡＳＡの酵素活性の増大を指す。いくつかの実施形態では、ＡＳＡの酵素活性は、対照と比較して、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％、または１０００％超増大する。いくつかの実施形態では、ＡＳＡの酵素活性は、対照と比較して、少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、または１０倍増大する。いくつかの実施形態では、増大したＡＳＡの酵素活性は少なくとも約１０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、２０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、４０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、５０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、６０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、７０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、８０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、９０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、１００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、１５０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、２００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、２５０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、３００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、３５０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、４００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、４５０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、５００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、５５０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、６００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、または６００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ超である。いくつかの実施形態では、ＡＳＡの酵素活性は、腰部領域内で増大する。いくつかの実施形態では、腰部領域内での増大したＡＳＡの酵素活性は少なくとも約２０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、３０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、４０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、５０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、６０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、７０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、８０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、９０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、１０，０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、または１０，０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ超である。

いくつかの実施形態では、治療は、認知能力の喪失の進行低減を指す。ある実施形態では、認知能力の喪失の進行は、対照と比較して、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％またはそれ以上低減される。いくつかの実施形態では、治療は、発育遅延低減を指す。ある実施形態では、発育遅延は、対照と比較して、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％またはそれ以上低減される。

いくつかの実施形態では、治療は、生存（例えば、生存時間）増大を指す。例えば、治療は、患者の平均余命増大を生じ得る。いくつかの実施形態では、本発明による治療は、治療を伴わない同様の疾患を有する１人以上の対照個体の平均余命と比較して、約５％より多く、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約１００％、約１０５％、約１１０％、約１１５％、約１２０％、約１２５％、約１３０％、約１３５％、約１４０％、約１４５％、約１５０％、約１５５％、約１６０％、約１６５％、約１７０％、約１７５％、約１８０％、約１８５％、約１９０％、約１９５％、約２００％またはそれ以上、患者の平均余命を増大する。いくつかの実施形態では、本発明による治療は、治療を伴わない同様の疾患を有する１人以上の対照個体の平均余命と比較して、約６ヵ月より長く、約７ヵ月、約８ヵ月、約９ヵ月、約１０ヵ月、約１１ヵ月、約１２ヵ月、約２年、約３年、約４年、約５年、約６年、約７年、約８年、約９年、約１０年またはそれ以上、患者の平均余命を増大する。いくつかの実施形態では、本発明による治療は、患者の長期間生存を生じる。本明細書で用いる場合、「長期間生存」という用語は、約４０年、４５年、５０年、５５年、６０年またはそれより以上の生存時間または平均余命を指す。

「改善する」、「増大する」または「低減する」という用語は、本明細書で用いる場合、対照と対比する値を示す。いくつかの実施形態では、適切な対照は、ベースライン測定値、例えば、本明細書中に記載される治療の開始前の同一個体における測定値、あるいは本明細書中に記載される治療の非存在下での一対照個体（または多数の対照個体）における測定値である。「対照個体」は、治療されている個体とほぼ同一年齢および／または性別である、同一の型（例えば遅発乳児型、若年性、または成人発症型）のＭＬＤに苦しむ個体である（治療個体および対照個体（単数または複数）における疾患の段階が比較可能であることを保証するため）。

治療されている個体（「患者」または「対象」とも呼ばれる）は、ＭＬＤを有するかまたはＭＬＤを発症する可能性を有する個体（胎児、幼児、小児、若者または成人）である。その個体は、ＡＳＡの発現および／または活性を有することも、測定可能な活性を有さないこともあり得る。例えば、ＭＬＤを有する個体は、正常ＡＳＡ発現レベルの約３０〜５０％未満、約２５〜３０％未満、約２０〜２５％未満、約１５〜２０％未満、約１０〜１５％未満、約５〜１０％未満、約０．１〜５％未満であるＡＳＡ発現レベルを有し得る。

いくつかの実施形態では、この個体は、上記の疾患を罹患していると最近診断された個体である。典型的には、早期治療（診断後すぐに開始する治療）は、疾患の影響を最小限にし、治療の利点を最大限にするのに重要である。
免疫寛容

一般的に、本発明による治療薬（例えば補充酵素）の髄腔内投与は、対象において重篤な副作用を生じない。本明細書で用いる場合、重症副作用は、実質的免疫応答、毒性または死（これらに限定されない）を誘導する。本明細書で用いる場合、「実質的免疫応答」という用語は、重症または重篤免疫応答、例えば適応Ｔ細胞免疫応答を指す。

したがって、多くの実施形態において、本発明の方法は、同時免疫抑制剤療法（すなわち、前治療／前状態調節として、あるいは当該方法と平行して用いられる任意の免疫抑制剤療法）を包含しない。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、治療されている対象における免疫寛容誘導を包含しない。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、Ｔ細胞免疫抑制剤を用いる対象の前治療または前状態調節を包含しない。

いくつかの実施形態では、治療薬の髄腔内投与は、これらの作用物質に対する免疫応答を高め得る。したがって、いくつかの実施形態では、酵素補助療法に対して寛容な補助酵素を患者に接種させることが有用であり得る。免疫寛容は、当該技術分野で既知の種々の方法を用いて誘導され得る。例えば、Ｔ細胞免疫抑制剤、例えばシクロスポリンＡ（ＣｓＡ）および抗増殖剤、例えばアザチオプリン（Ａｚａ）を、低用量の所望の補充酵素の毎週髄腔内注入と組合せた初期３０〜６０日レジメンが、用いられ得る。

当業者に既知の任意の免疫抑制剤は、本発明の組合せ療法と一緒に用いられ得る。このような免疫抑制剤としては、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ＣＴＬＡ４−Ｉｇおよび抗ＴＮＦ剤、例えばエタネルセプト(例えば、Ｍｏｄｅｒ，２０００，Ａｎｎ．ＡｌｌｅｒｇｙＡｓｔｈｍａＩｍｍｕｎｏｌ．８４，２８０−２８４、Ｎｅｖｉｎｓ，２０００，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｅｄｉａｔｒ．１２，１４６−１５０、Ｋｕｒｌｂｅｒｇｅｔａｌ．，２０００，Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５１，２２４−２３０、Ｉｄｅｇｕｃｈｉｅｔａｌ．，２０００，Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ９５，２１７−２２６、Ｐｏｔｔｅｒｅｔａｌ．，１９９９，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８７５，１５９−１７４、Ｓｌａｖｉｋｅｔａｌ．，１９９９，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ．１９，１−２４、Ｇａｚｉｅｖｅｔａｌ．，１９９９，ＢｏｎｅＭａｒｒｏｗＴｒａｎｓｐｌａｎｔ．２５，６８９−６９６、Ｈｅｎｒｙ，１９９９，Ｃｌｉｎ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．１３，２０９−２２０、Ｇｕｍｍｅｒｔｅｔａｌ．，１９９９，Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．１０，１３６６−１３８０、Ｑｉｅｔａｌ．，２０００，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ６９，１２７５−１２８３参照)が挙げられるが、これらに限定されない。抗ＩＬ２受容体(アルファ−サブユニット)抗体ダクリズマブ(例えば、ゼナパックスＴＭ)（これは、移植患者において有効であることが実証されている）も、免疫抑制剤として用いられ得る(例えば、Ｗｉｓｅｍａｎｅｔａｌ．，１９９９，Ｄｒｕｇｓ５８，１０２９−１０４２、Ｂｅｎｉａｍｉｎｏｖｉｔｚｅｔａｌ．，２０００，Ｎ．ＥｎｇｌＪ．Ｍｅｄ．３４２，６１３−６１９、Ｐｏｎｔｉｃｅｌｌｉｅｔａｌ．，１９９９，ＤｒｕｇｓＲ．Ｄ．１，５５−６０、Ｂｅｒａｒｄｅｔａｌ．，１９９９，Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ１９，１１２７−１１３７、Ｅｃｋｈｏｆｆｅｔａｌ．，２０００，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ６９，１８６７−１８７２、Ｅｋｂｅｒｇｅｔａｌ．，２０００，Ｔｒａｎｓｐｌ．Ｉｎｔ．１３，１５１−１５９参照)。付加的免疫抑制剤としては、抗ＣＤ２(Ｂｒａｎｃｏｅｔａｌ．，１９９９，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ６８，１５８８−１５９６、Ｐｒｚｅｐｉｏｒｋａｅｔａｌ．，１９９８，Ｂｌｏｏｄ９２，４０６６−４０７１)、抗ＣＤ４(Ｍａｒｉｎｏｖａ−Ｍｕｔａｆｃｈｉｅｖａｅｔａｌ．，２０００，ＡｒｔｈｒｉｔｉｓＲｈｅｕｍ．４３，６３８−６４４、Ｆｉｓｈｗｉｌｄｅｔａｌ．，１９９９，Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９２，１３８−１５２)および抗ＣＤ４０リガンド(Ｈｏｎｇｅｔａｌ．，２０００，Ｓｅｍｉｎ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．２０，１０８−１２５、Ｃｈｉｒｍｕｌｅｅｔａｌ．，２０００，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４，３３４５−３３５２、Ｉｔｏｅｔａｌ．，２０００，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４，１２３０−１２３５)が挙げられるが、これらに限定されない。
投与

本発明の方法は、治療的有効量の本明細書中に記載される治療薬（例えば補充酵素）の単回ならびに多数回投与を意図する。治療薬（例えば補充酵素）は、対象の症状（例えば、リソソーム蓄積症）の性質、重症度および程度によって、一定間隔で投与され得る。いくつかの実施形態では、本発明の治療的有効量の治療薬（例えば補充酵素）は、一定間隔で（例えば、年１回、６ヶ月に１回、５ヶ月に１回、３ヶ月に１回、隔月（２ヶ月に１回）、毎月（１ヶ月に１回）、隔週（２週間に１回）、毎週）、定期的に髄腔内投与され得る。

いくつかの実施形態では、髄腔内投与は、他の投与経路（例えば、静脈内、皮下、筋肉内、腸管外、経皮的、または経筋肉的に（例えば、経口的または鼻に））と共同で用いられ得る。いくつかの実施形態では、他の投与経路（例えば、静脈内投与）は、隔週、毎月、２ヶ月に１回、３ヶ月に１回、４ヶ月に１回、５ヶ月に１回、６ヶ月に１回、毎年投与以下の頻度で実施され得る。

本明細書で用いる場合、「治療的有効量」という用語は、主として、本発明の薬学的組成物中に含有される治療薬の総量に基づいて確定される。一般的に、治療的有効量は、対象に対して意義のある利益（例えば、根元的疾患または症状を治療し、調整し、治癒し、防止し、および／または改善すること）を達成するのに十分である。例えば、治療的有効量は、所望の治療的および／または予防的作用を達成するのに十分な量、例えばリソソーム酵素受容体またはそれらの活性を調整し、それによりこのようなリソソーム蓄積症またはその症状を治療する（例えば、対象への本発明の組成物の投与後の、「ゼブラ体」の存在または出現の、あるいは細胞空胞形成の低減または排除）ために十分な量であり得る。一般的に、それを必要とする対象に投与される治療薬（例えば、組換えリソソーム酵素）の量は、対象の特質によって決まる。このような特質としては、対象の症状、疾患重症度、全身健康状態、年齢、性別および体重が挙げられる。これらのおよびその他の関連因子によって、適切な投与量を、当業者は容易に決定し得る。さらに、最適投与量範囲を同定するために、客観的および主観的検定がともに任意に用いられ得る。

治療的有効量は、多重単位用量を含み得る用量投与レジメンで一般に投与される。任意の特定の治療用タンパク質に関しては、治療的有効量（および／または有効用量投与レジメン内の適切な単位用量）は、例えば投与経路、他の薬学的作用物質との組合せによって変わり得る。さらにまた、任意の特定患者のための具体的治療的有効量（および／または単位用量）は、種々の因子、例えば治療されている障害および障害の重症度；用いられる具体的薬学的作用物質の活性；用いられる具体的組成物；患者の年齢、体重、全身健康状態、性別および食餌；投与時間；投与経路、および／または用いられる具体的融合タンパク質の排出または代謝速度；治療の持続期間；ならびに医療業界で周知であるような因子によって決まり得る。

いくつかの実施形態では、治療的有効用量は、約０．００５ｍｇ／脳１ｋｇ〜５００ｍｇ／脳１ｋｇ、例えば、約０．００５ｍｇ／脳１ｋｇ〜４００ｍｇ／脳１ｋｇ、約０．００５ｍｇ／脳１ｋｇ〜３００ｍｇ／脳１ｋｇ、約０．００５ｍｇ／脳１ｋｇ〜２００ｍｇ／脳１ｋｇ、約０．００５ｍｇ／脳１ｋｇ〜１００ｍｇ／脳１ｋｇ、約０．００５ｍｇ／脳１ｋｇ〜９０ｍｇ／脳１ｋｇ、約０．００５ｍｇ／脳１ｋｇ〜８０ｍｇ／脳１ｋｇ、約０．００５ｍｇ／脳１ｋｇ〜７０ｍｇ／脳１ｋｇ、約０．００５ｍｇ／脳１ｋｇ〜６０ｍｇ／脳１ｋｇ、約０．００５ｍｇ／脳１ｋｇ〜５０ｍｇ／脳１ｋｇ、約０．００５ｍｇ／脳１ｋｇ〜４０ｍｇ／脳１ｋｇ、約０．００５ｍｇ／脳１ｋｇ〜３０ｍｇ／脳１ｋｇ、約０．００５ｍｇ／脳１ｋｇ〜２５ｍｇ／脳１ｋｇ、約０．００５ｍｇ／脳１ｋｇ〜２０ｍｇ／脳１ｋｇ、約０．００５ｍｇ／脳１ｋｇ〜１５ｍｇ／脳１ｋｇ、約０．００５ｍｇ／脳１ｋｇ〜１０ｍｇ／脳１ｋｇの範囲である。

いくつかの実施形態では、治療的有効用量は、約０．１ｍｇ／脳１ｋｇより多く、約０．５ｍｇ／脳１ｋｇより多く、約１．０ｍｇ／脳１ｋｇより多く、約３ｍｇ／脳１ｋｇより多く、約５ｍｇ／脳１ｋｇより多く、約１０ｍｇ／脳１ｋｇより多く、約１５ｍｇ／脳１ｋｇより多く、約２０ｍｇ／脳１ｋｇより多く、約３０ｍｇ／脳１ｋｇより多く、約４０ｍｇ／脳１ｋｇより多く、約５０ｍｇ／脳１ｋｇより多く、約６０ｍｇ／脳１ｋｇより多く、約７０ｍｇ／脳１ｋｇより多く、約８０ｍｇ／脳１ｋｇより多く、約９０ｍｇ／脳１ｋｇより多く、約１００ｍｇ／脳１ｋｇより多く、約１５０ｍｇ／脳１ｋｇより多く、約２００ｍｇ／脳１ｋｇより多く、約２５０ｍｇ／脳１ｋｇより多く、約３００ｍｇ／脳１ｋｇより多く、約３５０ｍｇ／脳１ｋｇより多く、約４００ｍｇ／脳１ｋｇより多く、約４５０ｍｇ／脳１ｋｇより多く、約５００ｍｇ／脳１ｋｇより多い。

いくつかの実施形態では、治療的有効用量は、ｍｇ／体重１ｋｇによっても定義され得る。当業者が理解するように、脳重量および体重は相関し得る（ＤｅｋａｂａｎＡＳ．“Ｃｈａｎｇｅｓｉｎｂｒａｉｎｗｅｉｇｈｔｓｄｕｒｉｎｇｔｈｅｓｐａｎｏｆｈｕｍａｎｌｉｆｅ：ｒｅｌａｔｉｏｎｏｆｂｒａｉｎｗｅｉｇｈｔｓｔｏｂｏｄｙｈｅｉｇｈｔｓａｎｄｂｏｄｙｗｅｉｇｈｔｓ,” ＡｎｎＮｅｕｒｏｌ１９７８；４:３４５−５６）。したがって、いくつかの実施形態では、投与量は、表５に示されるように換算され得る。

いくつかの実施形態では、治療的有効用量は、ｍｇ／ＣＳＦ１５ｃｃによっても定義され得る。当業者が理解するように、脳重量および体重に基づいた治療的有効用量は、ｍｇ／ＣＳＦ１５ｃｃに換算され得る。例えば、成人におけるＣＳＦの容積は約１５０ｍＬである（ＪｏｈａｎｓｏｎＣＥ，ｅｔａｌ．“Ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙｏｆｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌｆｌｕｉｄｆｕｎｃｔｉｏｎｓ：Ｎｅｗｃｈａｌｌｅｎｇｅｓｉｎｈｅａｌｔｈａｎｄｄｉｓｅａｓｅ,”ＣｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌＦｌｕｉｄＲｅｓ．２００８Ｍａｙ１４;５:１０）。したがって、成人への０．１ｍｇ〜５０ｍｇの単一用量注射は、成人では約０．０１ｍｇ／ＣＳＦ１５ｃｃ（０．１ｍｇ）〜５．０ｍｇ／ＣＳＦ１５ｃｃ（５０ｍｇ）用量である。

任意の特定の対象に関して、具体的投与量レジメンは、個体の必要性、ならびに酵素補充療法の投与を施すかまたは指図する専門家の判断によって経時的に調整されるべきであり、そして本明細書中に記述される投与量範囲は単なる例であって、本発明の範囲または実行を限定するものではない、とさらに理解されるべきである。
キット

本発明はさらに、本発明の製剤を含有するキットまたは他の製品を提供し、そしてその再構成（凍結乾燥された場合）および／または使用のための機器を提供する。キットまたはその他の製品としては、容器、ＩＤＤＤ、カテーテル、ならびに髄腔内投与および関連外科手術に有用な任意のその他の物質、装置または設備が挙げられ得る。適切な容器としては、例えばボトル、バイアル、注射器（薬剤充填済み注射器）、アンプル、カートリッジ、レザバーまたはｌｙｏ−ｊｅｃｔｓが挙げられる。容器は、種々の材料、例えばガラスまたはプラスチックから作られ得る。いくつかの実施形態では、容器は薬剤充填済み注射器である。適切な薬剤充填済み注射器としては、ベイクドシリコーン被覆膜を有するホウケイ酸ガラス注射器、噴霧シリコーンを有するホウケイ酸ガラス注射器またはシリコーンを含有しないプラスチック樹脂注射器が挙げられるが、これらに限定されない。

典型的には、容器は、製剤、ならびに再構成および／または使用に関する指示を示し得る容器上の、または容器に付随したラベルを保持し得る。例えば、ラベルは、製剤が上記のようなタンパク質濃度に再構成される、ということを示し得る。ラベルはさらに、製剤が、例えばＩＴ投与のために有用であるかまたは意図される、ということを示し得る。いくつかの実施形態では、容器は、治療薬（例えば補充酵素）を含有する単一用量の安定製剤を含有し得る。種々の実施形態において、単一用量の安定製剤は、約１５ｍｌ未満、１０ｍｌ、５．０ｍｌ、４．０ｍｌ、３．５ｍｌ、３．０ｍｌ、２．５ｍｌ、２．０ｍｌ、１．５ｍｌ、１．０ｍｌまたは０．５ｍｌの容量で存在する。代替的には、製剤を保持するよう基は、多数回使用バイアルであって、これは、製剤の反復投与（例えば、２〜６回投与）を可能にし得る。キットまたは他の製品はさらに、適切な希釈剤（例えば、ＢＷＦＩ、生理食塩水、緩衝化生理食塩水）を含む第二容器を包含し得る。希釈剤および製剤の混合時に、再構成化製剤中の最終タンパク質濃度は、一般的に、少なくとも１ｍｇ／ｍｌ（例えば、少なくとも５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも２５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも５０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも７５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１００ｍｇ／ｍｌ）である。キットまたは他の製品はさらに、商業的および使用者の見地から望ましい他の物質、例えば他の緩衝剤、希釈剤、充填剤、針、ＩＤＤＤ、カテーテル、注射器および使用説明書を伴う添付文書を包含し得る。

本発明は、以下の実施例を参照することにより、さらに十分に理解されるであろう。しかしながら、それらは本発明の範囲を限定するよう意図されるべきでない。引用文献はすべて、参照により本明細書に援用される。

実施例１：ＩＴ投与したアリールスルファターゼＡの毒性
他の髄腔内投与した組換え酵素がＣＮＳの細胞および組織内に分布する能力を評価するために、幼若の（１２か月齢未満）カニクイザルにおいて１か月の期間にわたりＧＬＰ試験を行って、組換えにより調製したヒトアリールスルファターゼＡ（ｒｈＡＳＡ）の反復髄腔内（ＩＴ）投与を毒性学および安全性薬理学の観点から評価した。ｐＨ６．０の１５４ｍＭＮａＣｌ、０．００５％ポリソルベート２０の溶媒で、ｒｈＡＳＡの製剤を調製し製剤化した。

これを実施するために、９匹の雄および９匹の雌の幼若体カニクイザルを、下の表６に示すように、体重により３つの処置群の１つに無作為に割り当てた。個体（投与１の１雄個体を除く）に０、３または３１ｍｇ／ｍｌのｒｈＡＳＡを隔週、０．６ｍＬ（０、１．８または１８．６ｍｇの総用量）の短時間のＩＴ注入で、１個体当たり計３用量になるように投与した。体重、臨床観察、神経学的および生理学的検査、臨床病理、眼科検査、ならびに毒物動態試料採取をモニターした。２９、３０または３１日目（最後のＩＴ投与の約２４時間後）に全個体の剖検を行った。選択した組織を採取し、顕微鏡により検査した。

カニクイザルのＣＮＳ組織で検出されたｒｈＡＳＡの濃度をＥＬＩＳＡにより解析し、約２．５ｎｇ／組織ｍｇに相当する正常ヒトｒｈＡＳＡ濃度の１０％の治療標的と比較した。カニクイザルの脳の異なる領域から組織試料またはパンチ試料を摘出し、ｒｈＡＳＡの存在に関してさらに解析した。図２４は、パンチ試料を摘出した組織を示している。パンチした組織試料は、図２５Ａ〜Ｇに示されるように、大脳皮質から深部白質および深部灰白質にかけての沈着の勾配を伴うｒｈＡＳＡ濃度の増加を示した。

１８．６ｍｇ用量のｒｈＡＳＡを投与した６匹のサルのＩＴおよびＩＣＶの両投与経路の同じパンチ試料を用いて検出されたｒｈＡＳＡの濃度を、図２６Ａ〜Ｂに示す。ｒｈＡＳＡを髄腔内（ＩＴ）または脳室内（ＩＣＶ）に投与した成体および幼若体カニクイザルの深部白質（図２５Ａ）および深部灰白質（図２６Ｂ）脳組織で検出されたｒｈＡＳＡの濃度は同等であった。

次いで、成体および幼若体カニクイザルの脳から摘出したパンチ組織試料を解析して、摘出組織試料中に蓄積したｒｈＡＳＡの濃度を決定し、この濃度を、タンパク質１ｍｇ当たり２．５ｎｇのｒｈＡＳＡの治療標的濃度（健常対象における正常ｒｈＡＳＡ濃度の１０％に相当する）と比較した。図２７Ａに示されるように、解析した各組織試料パンチにおいて、１８．６ｍｇ用量のｒｈＡＳＡをＩＴ投与することにより、２．５ｎｇ／タンパク質ｍｇの標的治療濃度を上回るｒｈＡＳＡ濃度を生じた。同様に、１．８ｍｇ用量のｒｈＡＳＡを幼若カニクイザルにＩＴ投与した場合、解析した各組織試料パンチは、２．５ｎｇ／タンパク質ｍｇの治療濃度内または治療濃度を上回るｒｈＡＳＡの濃度を示し、ｒｈＡＳＡ濃度の中央値は、試験した全組織パンチ試料で治療標的を上回っていた（図２７Ｂ）。

ＩＴ投与したｒｈＡＳＡが適切な細胞に分布するか否かを判定するために、１．８ｍｇのＡＳＡをＩＴ投与したカニクイザルの図２８Ａに示される領域の深部白質の組織を解析した。図２８Ｂに示されるように、深部白質組織の免疫染色により、カニクイザルのオリゴデンドロサイト細胞内のｒｈＡＳＡ分布が明らかとなった。同様に、図２８Ｃは、ＩＴ投与したｒｈｒＡＳＡがカニクイザルの深部白質組織での共局在を示したことを表している。具体的には、染色下で、リソソームのような標的細胞小器官における共局在が明らかであり（図２８Ｃ）、このことは、ＩＴ投与したｒｈＡＳＡが、オリゴデンドロサイトのリソソームを含めた、ＣＮＳの適切な細胞、組織および細胞小器官に分布することが可能であるという結論を支持する。上記によって、ｒｈＡＳＡの送達においてはＩＣＶ送達とＩＴ送達との差異が最小限であることも明らかになったという結論が支持される。
実施例２：放射体標識タンパク質による生体内分布

陽電子放射体^１２４Ｉで標識されたｒｈＡＳＡを、ｐＨ６．０の１５４ｍＭＮａＣｌ、０．００５％ポリソルベート２０の溶媒で調製および製剤化した。３ｍｇのｒｈＡＳＡに相当する量の製剤（約３８ｍｇ／脳ｋｇに相当する）を、脳室内（ＩＣＶ）および髄腔内（ＩＴ）の投与経路で成体カニクイザルに投与した。カニクイザルの高解像度ＰＥＴスキャン画像解析（ｍｉｃｒｏＰＥＴＰ４）を行って、投与した^１２４Ｉ標識ｒｈＡＳＡの分布を判定した。

ＰＥＴ画像データ（図２９）は、ＩＣＶ投与した^１２４Ｉ標識ｒｈＡＳＡおよびＩＴ投与した^１２４Ｉ標識ｒｈＡＳＡはともにＣＮＳの組織に効率的に分布し、特にＩＴ腰椎カテーテルにより投与した^１２４Ｉ標識ｒｈＡＳＡは、脊髄の全長にわたる脳脊髄液（ＣＳＦ）中に迅速かつ均一に広がったことを示している。具体的には、図２９に示されるように、ＩＣＶ投与およびＩＴ投与後に、治療濃度の^１２４Ｉ標識ｒｈＡＳＡが対象カニクイザルの脳、脊髄およびＣＳＦを含めたＣＮＳ組織内で検出された。ＣＮＳ組織内、特に脳組織内で検出されたｒｈＡＳＡの濃度は、２．５ｎｇ／タンパク質ｍｇの治療標的濃度を上回った。

ｒｈＡＳＡタンパク質の分布はＩＴおよびＩＣＶの投与経路において同程度であったが、図２９から明らかなように、ＩＣＶの方が脊柱内での沈着が著しく少なかった。

製剤投与の２４時間後、ＩＣＶ投与した^１２４Ｉ標識ＡＳＡおよびＩＴ投与した^１２４Ｉ標識ｒｈＡＳＡはともにＣＮＳの組織に効率的に分布した。具体的には、ＩＴ投与の２４時間後に、ＩＣＶ投与の１６．７％に対し投与量の１２．４％が頭部領域内にあった。したがって、ｒｈＡＳＡをＩＴで投与した場合、このようなＣＮＳ組織内、特に脳組織内で検出されたｒｈＡＳＡの濃度は、同じ用量のＩＣＶ投与後に検出された濃度に近かった。

図３０に示されるように、^１２４Ｉ標識ｒｈＡＳＡのＩＣＶ注射では、注射した量が大槽、橋槽、脚間槽および近位脊柱へ迅速に移動する。また図３０で示されるように、ＩＴ投与でも、ＩＣＶ投与で示されたのと同じ最初の区画（槽および近位脊柱）へ^１２４Ｉ標識ｒｈＡＳＡが２〜５時間以内に送達された。図３１に示されるように、ＩＣＶおよびＩＴの両投与の２４時間後に、^１２４Ｉ標識ｒｈＡＳＡの分布は、槽および近位脊柱領域において同程度であった。したがって、小分子薬とは異なり、上記の結果では、ＩＣＶ投与には、ｒｈＡＳＡのＩＴ−投与に勝る利点が最小限であることが暗示されている。

これらの結果により、ｒｈＡＳＡを侵襲性の少ないＩＴ投与経路で対象に送達して、標的細胞および組織内での治療濃度を達成し得るということが確認される。

リソソーム蓄積症は、酵素の欠損または不全を原因とする異常な基質蓄積を生じる遺伝性疾患ファミリーの代表的なものである。これらの疾患のいくつかと関連する末梢症状は、組換え酵素の静脈内投与により効果的に軽減されるが、このような組換え酵素の静脈内投与は、大部分のリソソーム蓄積症に関連したＣＮＳ発症に大きな影響を与えることは期待されない。例えば、ハンター症状群の身体症状の治療用に組換えヒトイズロン酸−２−スルファターゼ（イデュルスルファーゼ、Ｅｌａｐｒａｓｅ（登録商標）；ＳｈｉｒｅＨｕｍａｎＧｅｎｅｔｉｃＴｈｅｒａｐｉｅｓ，Ｉｎｃ．Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）が認可されているが、発達遅延および進行性の精神障害を含み得るの神経発症の治療のための薬物療法はない。その原因の一つは、Ｉ２Ｓが分子量約７６ｋＤの大型で高度にグリコシル化された酵素であり、静脈内投与後に血液脳関門を横断しないという性質にある。

したがって、本発明者らは、組換えヒト酵素、例えばイズロン酸−２−スルファターゼ（Ｉ２Ｓ）、アリールスルファターゼＡ（ｒｈＡＳＡ）およびα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（Ｎａｇｌｕ）などの髄腔内製剤の髄腔内（ＩＴ）送達を調べる計画に取り組んだ。本明細書に提供される結果は、組換えリソソームタンパク質のＩＴ腰椎投与により、投与したタンパク質のかなりの割合が脳に送達される、具体的には、このようなタンパク質がカニクイザルおよびイヌ両者の脳および脊髄のニューロン内に広範に蓄積されることを初めて示すものである。ＣＮＳ組織の免疫組織化学的解析では、リソソーム蓄積症における病的なグリコサミノグリカン蓄積の部位であるリソソームに対してタンパク質が標的化されることが示された。さらに、ハンター症状群のＩＫＯマウスモデル、サンフィリッポ症状群Ｂ型のＮａｇｌｕ−欠損マウスモデルおよび異染性白質ジストロフィー症（ＭＬＤ）のＡＳＡノックアウトマウスモデルで示された形態学的改善は、ＩＴ投与した酵素が適切な組織に分布し、適切な細胞区画および細胞小器官へ輸送されるという観察を補強するものである。

Ｉ２ＳのＩＴ腰椎投与後およびＩＣＶ投与後に検出された脳内分布パターンの類似性は、ＣＳＦの総体流および活発な再混合を示唆するものである。したがって、臨床状況においてＩＴ投与およびＩＣＶ投与の両経路が潜在的に実行可能であるが、ＩＴ投与後に脊髄内でＩ２Ｓ蓄積が観察されたことは、ハンター症状群のようなリソソーム蓄積症の脊椎での続発症および構成要素に対処する上での明らかな利点を提供する。さらに、脊髄注射ポートは侵襲性が少なく、特に小児対象で長期にわたって使用するのにより適していることが予想される。

血管周囲細胞染色、および上記のＰＥＴ画像解析で観察されたタンパク質移行動態による証拠は、酵素が、おそらく拍動による対流機序により血管周囲腔内に移動することを示している。活発な軸索輸送を示すＩ２Ｓと神経フィラメントとの関連が観察されたことにより、さらなる輸送機序が示唆される。後者はおそらく、脊髄および脳の細胞で広く発現され、脳実質への直接投与時にＩ２Ｓ酵素が標的細胞に取り込まれやすくするニューロンマンノース−６−リン酸（Ｍ６Ｐ）受容体と、タンパク質との相互作用から始まるのであろう（Ｂｅｇｌｅｙら，ＣｕｒｒＰｈａｒｍＤｅｓ（２００８）１４：１５６６−１５８０）。

リソソーム酵素の軸索輸送が、ｉｎｖｉｖｏでの間接的な方法およびｉｎｖｉｖｏでのイメージングにより既に示唆されているが、本試験は、ＣＳＦを介して輸送される、ウイルスによらないまたは発現された酵素の軸索輸送の最初の直接的な証拠を提供するものである。したがって、ＣＳＦから脳表面および深部脳組織へのタンパク質送達は、活発な移動プロセスに依存すると思わるが、このようなプロセスはいずれもまだ記載されていない、すなわち、脳の細胞、組織および細胞小器官へのタンパク質または酵素の送達を明らかにするものである。

実質間質およびＣＳＦの流動力学がＩＴ腰椎投与したタンパク質の脳白質への分布を妨げるという一般的な見解に反して、本試験は、リソソーム酵素のＩＴ送達が、全脳組織内でのタンパク質の分布および蓄積、ならびに病的なグリコサミノグリカン蓄積の部位である標的細胞のリソソーム区画内での沈着を生じさせることを明らかに示している。（例えば、Ｆｅｎｓｔｅｒｍａｃｈｅｒら，ＡｎｎＮＹＡｃａｄＳｃｉ（１９８８）５３１：２９−３９およびＤｉＣｈｉｒｏら，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ（１９７６）２６：１−８を参照されたい）。ＩＴ腰椎送達が侵襲性の少ない性質であることに加え、この経路は、特に小児において、生物学的治療剤を脳に送達するための臨床上適切な手段を提供する。
実施例３：ＩＴ投与用アリールスルファターゼＡ製剤

この実施例では、ｒｈＡＳＡ（アリールスルファターゼＡ）の高濃度液状剤形を構築する作業と、髄腔内（ＩＴ）投与によって異染性白質ジストロフィー症（ＭＬＤ）を治療するための薬剤物質および薬品の調合を概説する。

安定性データによって、薬剤物質および薬品の生理食塩水製剤（ＰＢＳ２０を含まない）が、＜−６５℃で１８ヶ月、および２〜８℃で１８ヶ月置いた後も安定していることが示されている。上記タンパク質の医薬開発中、ＣＮＳへの送達という意図により、ｒｈＡＳＡの溶解度および安定性を限られた緩衝剤および賦形剤の条件下で調査した。静脈内（ＩＶ）用製剤を開発する目的で、予め製剤開発研究を行った。３回の実験の結果に基づき、１３７ｍＭのＮａＣｌと０．１５％のポロキサマー１８８をを含む１０ｍＭのクエン酸塩−リン酸緩衝剤（ｐＨ５．５）中の３０ｍｇ／ｍＬのｒｈＡＳＡを含む製剤をリードＩＶ製剤として選択した。ｒｈＡＳＡをＩＴ送達用に３つの製剤で調合し、このタンパク質の安定性データを３つの条件下で調査した。１つの部位の上流物質生成物に由来するｒｈＡＳＡロットを利用した。この結果によって、ｒｈＡＳＡが、０．００５％のポリソルベート２０（Ｐ２０）を含む１５４ｍＭの塩化ナトリウム溶液（ｐＨ６．０）中で、２〜８℃において、少なくとも１８ヶ月間、安定していたことが示された。加えて、調査を行ったところ、凍結融解および攪拌誘発分解に対する安定性が示された。

開発ロットを精製し、限外ろ膜とダイアフィルター（ＵＦ／ＤＦ）にかけ、１０ｍＭのクエン酸塩／リン酸塩、１３７ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ５．５）に入れてから、ＵＦ／ＤＦにかけて、約４０ｍｇ／ｍＬの濃度の最終的な生理食塩水を得た。ＵＦ／ＤＦの操作の概要が表７に示されている。
ｒｈＡＳＡ

１３７ｍＭのＮａＣｌを含む１０ｍＭのクエン酸・リン酸ナトリウム（ｐＨ５．６）中に４０ｍｇ／ｍＬのｒｈＡＳＡで調合したｒｈＡＳＡを透析して、ＩＴプレフォーミュレーション研究で用いるための５つの製剤にした（表８）。
方法

示差走査熱量測定（ＤＳＣ）による融解温度（Ｔｍ）の決定のために、キャピラリーＤＳＣマイクロカロリメーター（ＭｉｃｒｏＣａｌ）を毎時６０℃の走査速度、および１０〜１１０℃の温度範囲で用いた。緩衝液のベースラインをタンパク質の走査結果から差し引いた。この走査結果を各試料のタンパク質濃度に対して正規化した（２８０ｎｍにおける紫外吸光度によって測定したとともに、０．６９（ｍｇ／ｍＬ）−１．ｃｍ−１の吸光係数を用いた）。最初の短期安定性実験は、ｒｈＡＳＡ薬剤物質に対して、４０℃で２週間、または４０℃で１ヶ月のいずれかで行った。追加の試料に対して、２〜８℃で３ヶ月という短期安定性実験を行った。試料をろ過し（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｐ／ＮＳＬＧＶ０３３ＲＳ）、０．５ｍＬのアリコートを１３ｍｍのＦｌｕｒｏｔｅｃストッパーで２ｍＬに分注した。

ＤＳＣを用いて、製剤組成物（表８）のＴｍ（熱誘導変性の温度中心点）に対する影響を調べた。様々な製剤組成物のＴｍ値が図５に示されている。これらのＴｍ値によって、大半の製剤のほどける温度は似通っていたことが示された。ただし、１５４ｍＭのＮａＣｌを含む５ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）中、または、２ｍＭのＣａＣｌ_２および１３７ｍＭのＮａＣｌを含む１ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）中のいずれかで調合したｒｈＡＳＡでは、低いＴｍ値が観察された。

５つの選択製剤（表８）中のｒｈＡＳＡの熱誘導変性の影響も調べた。試料を２週間もしくは１ヶ月間４０℃、または、３ヶ月間２〜８℃のいずれかで貯蔵した。２週間４０℃で貯蔵した試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（クマシー）解析では、１５４ｍＭのＮａＣｌを含む５ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）中、および、２ｍＭのＣａＣｌ_２および１３７ｍＭのＮａＣｌを含む１ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）中に調合したｒｈＡＳＡの断片化が検出された（図６）。このような分解は他の製剤では観察されなかった。

分解生成物の存在は、同じ時点においてＲＰ−ＨＰＬＣによって観察された低いメインピーク率（パーセント）と整合している（表１０）。２ｍＭのＣａＣｌ_２を含む１ｍＭのＰＢＳ（ｐＨ７．０）中に調合したｒｈＡＳＡが、開始時、および熱ストレス条件に短期間曝露させた後に、そのｐＨを保持していなかったことも観察された。

サイズ排除および逆相ＨＰＬＣ解析では、ＷａｔｅｒｓのＨＰＬＣシステムを用いた。最初のＳＥＣ−ＨＰＬＣ解析では、５０μｇのｒｈＡＳＡをＡｇｉｌｅｎｔＺｏｒｂａｘＧＦ−２５０というカラム（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ）に注入し、２８０ｎｍの検出波長で、１００ｍＭのクエン酸ナトリウム（ｐＨ５．５）の移動相（８量体検出）を用いて、０．２４ｍＬ／分にて均一濃度で流した。１００ｍＭのクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）の移動相条件（２量体検出）を用いて、解析を繰り返した。

すべての緩衝剤交換および濃度調査は、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−Ｐｌｕｓ２０（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、１０ｋＤａＭＷＣＯ）を用いて行った。
プレフォーミュレーションスクリーニング調査−緩衝剤の種類およびｐＨの影響

ＣＮＳ投与用に用いられる認可溶液組成物の数が限られているので、表８に列挙されているような５つの等張溶液組成物のみをスクリーニング用に選択した。
ｐＨ記憶

長期安定性用の緩衝剤を選択する前に、２回の「ｐＨ記憶」実験を行って、タンパク質緩衝剤を生理食塩水に交換しても、元々の緩衝剤のｐＨを保持できるか調べた。最初の実験では、まず、１３７ｍＭのＮａＣｌを含む１０ｍＭのクエン酸塩−リン酸塩（ｐＨ値は５．５または７．０のいずれか）に約８ｍｇ／ｍＬのｒｈＡＳＡを透析してから、生理食塩水への２回目の透析を行った。２回目の実験では、１３７ｍＭのＮａＣｌを含む１０ｍＭのクエン酸塩−リン酸塩（ｐＨ値は５．５または７．０のいずれか）にｒｈＡＳＡを透析してから、緩衝剤を交換し、生理食塩水中に入れて、約３５ｍｇ／ｍＬまで濃縮した。

１３７ｍＭのＮａＣｌを含む１０ｍＭのクエン酸塩−リン酸塩（ｐＨ値は５．５または７．０のいずれか）中に調合したｒｈＡＳＡを生理食塩水に透析した場合には、混濁の増大は観察されなかった。最終的な生理食塩水のｐＨは、曝露させた前のクエン酸塩−リン酸塩緩衝剤のｐＨと同様であった。クエン酸塩−リン酸塩系緩衝剤（ｐＨ値は５．５または７．０のいずれか）中に調合したｒｈＡＳＡを生理食塩水に透析してから、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎを用いて約３５ｍｇ／ｍＬまで濃縮した場合には、タンパク質生理食塩水のｐＨはそれぞれ、ｐＨ５．５から５．８、またはｐＨ７．０から６．８に変化した。濃縮した、生理食塩水中のｒｈＡＳＡ溶液のいずれも、わずかに乳白色を帯びていたとともに、そのＯＤ３２０値は、０．０６４（ｐＨ６．８）〜０．０８０（ｐＨ５．５）の範囲内であった。
賦形剤の選択

選択した５つの溶液組成物のすべてに、ポリソルベート２０（Ｐ２０）を最終濃度０．００５％で含有させた。その他のＳｈｉｒｅタンパク質のＣＮＳ送達における０．００５％のＰ２０のｉｎｖｉｖｏ耐性に関する事前の実験に基づき、界面活性剤の選択を行った。５％のＰ２０の溶液（ｖ／ｖ）を調製し、適切な体積分を各タンパク質製剤に加えて、０．００５％の最終濃度を得た。
製剤のロバストネス調査−安定性調査

様々な緩衝剤およびｐＨ値のスクリーニングから得た最初の結果に基づき、長期安定性調査のために、３つの溶液組成物を選択した（表８と同様の試料調製）。提案の製剤（表９）で、１年にわたる調査を開始した。ＳＥＣ−ＨＰＬＣ、ＲＰ−ＨＰＬＣ、ＯＤ３２０、タンパク質濃度、ｐＨ、比活性度、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（クマシー）、および外観によって、各時点における安定性試料を解析した。

ストレス付加後の試料では、比活性度の有意な変化は観察されなかった（表１０）。サイズ排除ＨＰＬＣによる解析では、２週間熱ストレスを付加した試料であって、１５４ｍＭのＮａＣｌを含む５ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）中に調合した試料において、いくらかの分解が検出された。この分解は、ｒｈＡＳＡの８量体への結合を誘発するｐＨ５．５の移動相条件を用いたＳＥＣ−ＨＰＬＣによって、より明白であった。この移動相条件下では、ｐＨ７．０で、２ｍＭのＣａＣｌ_２を含む１ｍＭのＰＢＳ中に調合したｒｈＡＳＡも、有意な分解を示した。

４０℃で１ヶ月曝露させた後、５ｍＭのＰＢＳ（ｐＨ７．０）中、および２ｍＭのＣａＣｌ_２を含む１ｍＭのＰＢＳ（ｐＨ７．０）中に調合した試料は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる断片化を示した（データは示されていない）。この観察結果と整合して、ｐＨ７のこれら２つの製剤で貯蔵した試料では、ＲＰ−ＨＰＬＣおよびＳＥＣ−ＨＰＬＣによって、メインピーク率（パーセント）の低下も観察された（表１１）。ただし、比活性度の低下は、５ｍＭのＰＢＳ（ｐＨ７．０）中に調合したｒｈＡＳＡで観察されたのみであった。

２〜８℃で３ヶ月貯蔵後、ｒｈＡＳＡは、すべての製剤においてその活性を保持していた（表１２）。加えて、ＳＥＣ−ＨＰＬＣによって評価したところ、いずれの移動相条件下でも、ｒｈＡＳＡはメインピーク面積の＞９９．８％を保持していた。２〜８℃で３ヶ月貯蔵した場合の安定性データの概要は、表１２に示されている。

生理食塩水（ｐＨ７．０）、および２ｍＭのＣａＣｌ_２を含む１ｍＭのＰＢＳ（ｐＨ７．０）中に調合したＲｈＡＳＡも、２５℃の加速条件で３ヶ月貯蔵後に評価した。図７に示されているように、ｒｈＡＳＡは、上記の製剤中で、わずかな量の断片化を見せた（０．５％のＢＳＡ不純物のスパイクの強度と同程度の強度）。

総合的には、プレフォーミュレーション研究によって、ｒｈＡＳＡの安定性は、５．５〜６．０の範囲内のｐＨ値で保持されることが示された。ｐＨ７．０の製剤溶液を用いたすべての調査において、ｒｈＡＳＡは、その分解経路の１つとして、断片化を示した。ｐＨ７．０においてＩＴ用製剤候補で得られた熱ストレス結果は、ｐＨ７．０におけるＩＶ用製剤（１３７ｍＭのＮａＣｌを含む１０ｍＭのクエン酸ナトリウム−リン酸塩）で得られた熱ストレス結果（断片化が観察された）と同様であった。これらの調査に基づき、表９に示されているような下記の３つの製剤を長期安定性調査用に選択した。
凍結融解調査

ＶｅｒｔｉｓＧｅｎｅｓｉｓ３５ＥＬという凍結乾燥機の棚の上で、０．１℃／分にて周囲温度〜−５０℃で制御凍結融解を３サイクル実施することによって、凍結融解実験を実施した。３０ｍｇ／ｍＬで上記の５つの溶液組成物（表８）のそれぞれの中に調合した薬剤物質の１ｍＬのアリコートを、この調査のために３ｍＬのガラスバイアルに分注した。

すべての凍結融解調査において、薬剤物質（３８±４ｍｇ／ｍＬ）を用いた。小規模の制御速度凍結融解実験では、薬剤物質の２ｍＬのアリコートを、２０ｍｍのＦｌｕｒｏｔｅｃストッパー付きの５ｍＬのガラスバイアルに分注した。凍結乾燥機ＶｉｒｔｉｓＧｅｎｅｓｉｓ３５ＥＬの棚、または、制御速度フリーザー（ＴｅｎｎｅｙＪｒＵｐｒｉｇｈｔＴｅｓｔＣｈａｍｂｅｒ、モデル：ＴＵＪＲ−Ａ−ＶＥＲＶ）の棚のいずれかの上で、凍結融解ストレス実験を行った。０．１℃／分の凍結・融解速度（制御速度フリーザーを用いる場合）、または、０．１℃／分の凍結速度および０．０３℃／分の融解速度（凍結乾燥機を用いる場合）のいずれかで−５０℃まで凍結し、２５℃まで融解させるサイクルを３回行った。大規模凍結融解調査では、９０ｍＬの薬剤物質を２５０ｍＬのポリカーボネート瓶に分注した。ドライアイス上での凍結融解調査では、３ｍＬの薬剤物質を、ポリプロピレンのねじぶたが付いているか、または付いていない５ｍＬのポリカーボネート（ＢｉｏｔａｉｎｅｒＰ/Ｎ３５００−０５）バイアルに分注した。この試料をオーバーナイトで≦−６５℃で凍結させてから、閉じたバケット内のドライアイス上に置いた。これらの実験では、同じ試料体積を含むストッパー付きガラスバイアルを調査対照として用いた。希釈薬剤物質の凍結融解調査では、１および５ｍｇ／ｍＬの１ｍＬのアリコートを２ｍＬのポリプロピレン管に分注し、≦−６５℃で凍結させた。続いて、凍結した試料を卓上で融解させた。このサイクルを最大で１０回繰り返し、対照標準アリコートの取り扱いで生じる可能性のあるあらゆる潜在的ストレスを模倣した。

速度制御凍結融解（０．１℃／分）を３サイクル行った後、０．００５％のＰ２０を含む提案製剤中のｒｈＡＳＡの品質に凍結融解が及ぼす影響を割り出した。ｒｈＡＳＡの外観の変化は観察されず、ＳＥＣまたはＲＰ−ＨＰＬＣ法のいずれかを用いても、可溶性凝集体または分解生成物は同定されなかった。加えて、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析（データは示されていない）において、断片化または凝集バンドは観察されなかった。表１３は、これらの調査の結果の概要を示している。

３連にて薬剤物質の２ｍＬのアリコートで行った小規模の制御速度凍結融解調査の結果の概要が表１４に示されている。薬剤物質の品質の変化は観察されなかった。凍結融解させた薬剤物質の外観は、ベースライン試料の外観と同程度であった。タンパク質濃度または材料の純度の低下は観察されなかった。

いずれの実験によっても、凍結融解後も、ｒｈＡＳＡがその品質特性を保持することが示された。表１５に示されているように、１ｍｇ／ｍＬのｒｈＡＳＡ試料において、１０サイクルの凍結融解後、活性および逆相メインピーク率（パーセント）に、わずかな低下傾向が観察されたことに留意されたい。
攪拌調査

３０ｍｇ／ｍＬで、５つの選択溶液組成物（表８）のそれぞれの中にＰ２０とともに調合した滅菌ろ過タンパク質の１．０ｍＬのアリコートを、１３ｍｍのＦｌｕｒｏｔｅｃストッパー付きの３ｍＬのガラスバイアルに分注した。バイアルを横向きにしてＬａｂｌｉｎｅＯｒｂｉｔａｌＳｈａｋｅｒの上に置き、２４時間、１００ｒｐｍで振盪した。続いて、次の２４時間の振盪期間中、この設定を２００ｒｐｍまで速くした。

ｒｈＡＳＡの攪拌に対する感受性を評価するために、薬剤物質と薬品の両方に対して、薬剤物質は３５．４ｍｇ／ｍＬの濃度で、薬品は３０ｍｇ／ｍＬの濃度で、振盪および攪拌調査を行った。これらの調査では、薬剤物質の１．０ｍＬのアリコートを、１３ｍｍのＦｌｕｒｏｔｅｃストッパー付きの３ｍＬのガラスバイアルに分注した。最初の８時間では１時間おきに、それ以降は２４時間および８４時間の時点に、攪拌したバイアルを調べた。曇りの兆候が最初に現れたら、バイアルを取り出し、解析した。試料の外観を文書化し、ｐＨ、ＳＥＣ−ＨＰＬＣ、比活性度、およびＯＤ３２０を用いて、試料をアッセイした。薬品の攪拌調査を３連で行い（０．００５％のＰ２０を含む１５４ｍＭのＮａＣｌ中、ｐＨ６．０）、薬剤物質の１つの複製物（１５４ｍＭのＮａＣｌ中、ｐＨ６．０）と比較した。振盪調査も、Ｐ２０を生理食塩水製剤に含めずに繰り返した。これらの調査では、３０ｍｇ／ｍＬの薬品の１ｍＬまたは３ｍＬのいずれかのアリコートを３ｍＬバイアルに分注し、振盪およびヘッドスペース体積がｒｈＡＳＡの品質に及ぼす影響を調べた。これらの振盪調査では、２２０ｒｐｍという速度を用いた。

ＩＶ用製剤の開発調査のためにｒｈＡＳＡについて行われた最初の振盪調査では、界面活性剤の存在に関する潜在的な利点が示された。ＩＴ用製剤の開発では、０．００５％のＰ２０を選択し、振盪調査用の製剤に含めた。いずれの製剤においても、１５〜２４時間、１００ｒｐｍで振盪後も視覚的な変化は観察されず、振盪速度を２００ｒｐｍまで速くした。１００および２００ｒｐｍで合わせて４８時間振盪した後も、提案候補製剤のうち、振盪した試料の外観の変化は観察されなかった。上記の期間後、試料を解析した。その結果の概要が表１６に示されている。いずれのアッセイによっても、変化は観察されなかった。クマシーによるＳＤＳ−ＰＡＧＥでも、振盪した試料では、追加の高または低分子量バンドは示されなかった（データは示されていない）。

最初の４時間の攪拌では、薬剤物質（１５４ｍＭのＮａＣｌ中、ｐＨ６．０）または薬品（０．００５％のＰ２０を含む１５４ｍＭのＮａＣｌ中、ｐＨ６．０）の外観の変化は観察されなかった。６時間の攪拌後には、薬剤物質および薬品のいずれも、わずかに曇った（データは示されいない）。Ｐ２０が製剤中に存在していなかった場合、この曇りは、４８時間の攪拌後、より顕著になった。加えて、振盪した薬剤物質および薬品は、２４時間で曇った。図８には、４８時間の攪拌の観察結果が示されている。

表１７および表１８は、攪拌調査の観察結果の概要を示している。

攪拌した試料も、ＯＤ３２０、ｐＨ、比活性度、ＲＰ−ＨＰＬＣ、およびＳＥＣ−ＨＰＬＣによって解析した。その結果は、表１９および表２０に示されている。全体的に、攪拌および振盪後も、ｒｈＡＳＡの品質には、外観を除いて有意な変化は観察されなかった。

６時間後、薬品を０．００５％のＰ２０とともに攪拌したところ、３つの複製物の１つが濁った。この試料を除去し、他の２つの試料を最長４８時間攪拌した。表２０には、複製試料の平均データが示されている。

上記の結果および目視観察によれば、薬剤物質および薬品は、攪拌誘発性分解の影響を容易には起こさない。外観の変化を生じさせるには、約４時間の連続的な攪拌（設定番号５）および８時間の連続的な激しい振盪（２２０ｒｐｍ）を要するからである。

Ｐ２０を含まない薬品で、上記の振盪調査を繰り返した。これらの調査では、振盪およびヘッドスペース体積がｒｈＡＳＡの品質に及ぼす影響を調べるために、各バイアルに１ｍＬまたは３ｍＬの薬品を入れた。１ｍＬ入れた３ｍＬのバイアルでは、２２０ｒｐｍでの８時間の振盪を通じて、薬品の変化は観察されなかった（ｎ＝２、データは示されていない）。ヘッドスペースのないバイアル（ｎ＝１）では、ヘッドスペースがこれよりも大きいバイアルと比べて速い速度で、小さいフレーク、数本の繊維、および綿状物が形成されたことが示された。４８時間の観察結果が図９に示されている。

目視の結果の概要も表２１および表２２に示されている。
タンパク質濃度の変化は観察されなかった。加えて、ＳＥＣ−ＨＰＬＣを用いても、１ｍＬまたは３ｍＬのいずれの注入体積（表２３および表２４）においても、可溶性凝集体は検出されなかった。還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（クマシー）アッセイでは、いずれの高または低分子量バンドも検出されなかった（データは示されていない）。
緩衝能調査

ｒｈＡＳＡの緩衝能を割り出すために、製品を３連で、希酸または希塩基のいずれかで滴定した。マイクロスターラーバーを入れた２０ｍＬのガラスバイアルに、３８ｍｇ／ｍＬまたは３０ｍｇ／ｍＬ（後者は薬品を模倣する濃度）のいずれかの薬剤物質の１０ｍＬのアリコートを入れた。１Ｎの塩酸（ＨＣｌ）の１μＬのアリコートを上記のタンパク質溶液に加え、その内容物を混合し、ｐＨを記録した。ＨＣｌを１μＬずつ増やしながら加え、いずれの希釈も回避するために、ｐＨが約５．５になるまでは、測定の間にｐＨプローブをすすがずに実験を継続した。実験は３連で行い、比較のために、１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む５ｍＭのリン酸緩衝剤（ｐＨ６．０）を並列で滴定した。同様に、最終的なｐＨが約６．５になるまで、上記の両方の濃度の薬剤物質を１Ｍの水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）で滴定した。ｒｈＡＳＡ中にいずれかの残存リン酸塩が存在するか調べるために、誘導結合プラズマ質量解析法（ＩＣＰ−ＭＳ）によって薬剤物質を解析した。希釈したｒｈＡＳＡ薬剤物質の緩衝能も調べて、タンパク質溶液の希釈時に、溶液のｐＨ値が変化しないようにした。１．５ｍＬのエッペンチューブで、３０ｍｇ／ｍＬ〜１ｍｇ／ｍＬの範囲の希釈試料を調製し、希釈開始時、および、２〜８℃で１週間貯蔵後に、ｐＨ値を測定した。

希酸および希塩基による滴定調査の結果によって、ｒｈＡＳＡ溶液の十分な緩衝能が示された。ＨＣｌを用いた滴定調査では、最初は、１Ｍの酸を約２μＬ加えても、薬剤物質または緩衝剤対照のいずれのｐＨも変化しなかった。しかし、酸の体積を増やしていったところ、ｒｈＡＳＡ薬剤物質と比べて、緩衝剤のｐＨが劇的に低下したことが示された。１９ＭのＨＣｌを１３μＬ加えた後、緩衝剤対照のｐＨは、２ｐＨ単位超、薬剤物質のｐＨよりも低かった。薬品濃度を模倣するために、この実験には、３０ｍｇ／ｍＬの薬剤物質濃度も含めた。図１０は、酸で滴定した場合の、１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む５ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ６．３）と比較におけるｒｈＡＳＡ薬剤物質の緩衝能を示している。

ｒｈＡＳＡ薬剤物質の水酸化ナトリウムによる滴定では、ｐＨの保持という点では、比較的異なる結果が示された（図１１）。ｐＨ変化の速度は、実質的に薬剤物質と緩衝剤対照との間で差はなかった。

観察結果に基づき、かつ、いずれの理論にも拘束されることを意図しなければ、アスパラギン酸側鎖、グルタミン酸側鎖、およびヒスチジン側鎖は、溶液のｐＨを保持するように、プロトン受容体および／または供与体として機能できるので、ｒｈＡＳＡは溶液の緩衝能に寄与していると思われる。このタンパク質の緩衝能は、「ｐＨ記憶」の影響を見出したプレフォーミュレーション研究中にもすでに観察した。ｐＨの保持は、実験室規模および大規模操作の両方において、何度か示してきた。総合的に、これらの２つの実験の結果によって、生理食塩水中のｒｈＡＳＡの緩衝能は、酸性方向における方が高いことが暗示されている。文献によれば、低ｐＨ値の緩衝能ほど、所定のタンパク質内のアスパラギン酸およびグルタミン酸残基の数が、ヒスチジン残基よりも多いことを直接示している。いずれの理論に束縛されるものではないが、実際、このようなケースは、１８個のヒスチジン残基に対して、グルタミン酸残基とアスパラギン酸が合わせて４５個存在するアリールスルファターゼＡに当てはめることができる。

薬剤物質の緩衝能は、結合している残存のリン酸塩（ＩＣＰ−ＭＳを用いて、薬剤物質中に存在することが明らかになった）に起因する場合もある。表２５は、ＬＳＤＬ薬剤物質の３種類のロットに存在する残存リン酸塩の量を示している。このデータによって、パイロットスケールのプロセスで、限外ろ膜およびダイアフィルターにかけるステップの整合性も確認される。

このタンパク質の緩衝能をさらに理解するために、希釈のｐＨに対する影響も調べた。ｒｈＡＳＡ薬剤物質を生理食塩水で希釈して、タンパク質濃度を低下させても、薬剤物質のｐＨ値の変化は観察されなかった。続いて、希釈した薬剤物質を２〜８℃で１週間貯蔵した後、ｐＨ測定値を記録した。表２６にそのデータの概要が示されている。この結果によって、希釈、および２〜８℃での貯蔵は、希釈した薬剤物質のｐＨ値に影響を及ぼさないことが示されている。さらに、これらの観察結果によって、生理食塩水中に調合したｒｈＡＳＡ薬剤物質の十分な緩衝能を示した酸および塩基滴定調査の結論が擁護される。

ｒｈＡＳＡの希釈およびｐＨの調査中、希釈した試料の外観において、濃度依存的な乳白色の低減が観察された。すなわち、高濃度のｒｈＡＳＡ試料ほど、ほぼ透明な外観を有する低濃度試料よりも、乳白色が濃かった。図１２は、希釈したｒｈＡＳＡの外観の観察結果を示している。１ｍｇ／ｍＬのｒｈＡＳＡ溶液は、水と同様の外観を呈していたが、３０ｍｇ／ｍＬにおける外観は、対照懸濁液ＩＩとＩＩＩとの中間、または、対照懸濁液ＩＩＩとＩＶとの中間のいずれかと評価された。
安定性調査

安定性調査のために、１５４ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ６．０）中に薬剤物質を３８±４ｍｇ／ｍＬで調合し、１５４ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ６．０）中に、０．００５％のポリソルベート２０の存在下または非存在下で薬品を３０±３ｍｇ／ｍＬで調合した。薬剤物質の１ｍＬのアリコートを、ポリプロピレンのねじ込みクロージャーの付いた５ｍＬのポリカーボネート瓶に分注し、≦−６５℃、−１５℃〜−２５℃、および２〜８℃で貯蔵した。薬品の１．０〜１．１ｍＬのアリコートを、１３ｍｍのＦｌｕｒｏｔｅｃストッパー付きの３ｍＬのガラスバイアルに分注し、２〜８℃、２５±２℃、および４０±２℃で貯蔵した。最初の安定性調査のために、薬品バイアルを直立配向で貯蔵し、次の調査のために、Ｐ２０を含まない薬品を用いて、逆の配向に変更した。各時点において、ＳＥＣ−ＨＰＬＣ、ＲＰ−ＨＰＬＣ、ＯＤ３２０、タンパク質濃度、ｐＨ、比活性度、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（クマシー）、および外観によって、安定性試料を試験した。ペプチドマップ、グリカンマップ、およびホルミルグリシンの割合を毎年行った。加えて、後者のアッセイは、ストレス付加および加速条件でも行った。
総合的に、プレフォーミュレーション、凍結融解、および攪拌調査の結果によって、３つの製剤のみが、さらなる開発に適していることが暗示されている。これらの３つの製剤で、０．００５％のＰ２０の存在下にて、長期安定性調査を開始した。表２７、表２８、および表２９に、所定の時点における３つの製剤の安定性データの概要が示されている。

２〜８℃で最長１１ヶ月間行った安定性調査によって、プロトタイプ製剤中でｒｈＡＳＡの品質が保持されることが暗示されている。生理食塩水（ｐＨ５．９）中のｒｈＡＳＡの代表的なサイズ排除ＨＰＬＣプロファイルが図１３および１４に示されている。サイズ排除ＨＰＬＣでは、２〜８℃で１１ヶ月貯蔵後も、ｒｈＡＳＡの会合状態の有意な変化は検出されなかった。

全体的に、３つのいずれの候補製剤での薬品の品質は、２〜８℃で１１ヶ月貯蔵後も保持された。
実施例４−毒性

本実施例は、６か月の期間にわたるｒｈＡＳＡの髄腔内（ＩＴ）投与の反復投与を、毒性学的および安全性薬理学的観点から示すものである。本試験のＩＴ被検試料はｒｈＡＳＡであった。３６匹の雄および３６匹の雌カニクイザルを無作為に５つの処置群に割り当てた。群１の個体は未処置の埋植物デバイス対照（ポートおよびカテーテル）であり、これらの個体には溶媒も被検試料も投与しなかったが、被検試料の投与計画に合わせた計画で０．６ｍＬのＰＢＳを投与した。群２〜５の個体には、０、３、１０または３１ｍｇ／ｍｌのｒｈＡＳＡを隔週、０．６ｍＬ（０、１．８、６．０または１８．６ｍｇの総用量）のＩＴ注入で投与した（すなわち、合計１２回の投与）。６か月後（最後のＩＴ投与の２４時間後）に個体の剖検を行い、４週間の回復期間の終わりに残りの４個体／性別／群の剖検を行った。選択した組織を採取して保存し、顕微鏡で調べた。

全般的に、被検試料に関連する変化は、２つの大きな種類に分類することが可能であり、全用量レベル（１．８、６．０および１８．６ｍｇ／投与）で見られた。髄膜、脳実質、脊髄実質、三叉神経節、および場合により脊髄神経根／節（またはこれらの構造を取り囲む神経上膜）における浸潤（通常は好酸性成分が顕著な白血球）の増加。いずれの理論にも束縛されるものではないが、この増加は、被検試料（タンパク質）が髄腔内腔および神経系組織内に存在することによると解釈した。一部の個体の脊髄および脳でミクログリア細胞のわずかな局所的増加（小膠細胞症は高用量のいずれの個体でも観察されなかった）。いずれの理論にも束縛されるものではないが、形態学的変化は２種類とも、被検試料の存在に対する反応であると解釈した。どの個体においても、ニューロン壊死の証拠は見られなかった。被検試料に関連する変化はいずれも、脳、脊髄、脊髄神経根または脊髄神経節におけるいかなる生物学的に有害な反応とも関連しなかった。具体的には、ニューロン壊死または生物学的に重要なグリア反応の証拠が見られなかった。被検試料に関連する非神経系組織の病変は見られなかった。

１か月の回復期間（無投与期間）の後、被検試料に関連する変化は、完全に消散するか、または被検試料の存在に伴って以前に増加した炎症性応答の残存物に限定されていた。回復個体において有害な形態学的影響は見られなかった。半定量的染色スコアを付ける盲目下での顕微鏡検査に基づけば、最終殺処分時に、アリールスルファターゼＡ（ｒｈＡＳＡ；被検試料）に対する免疫組織化学染色が、全被検試料処置群でニューロンを除く脳および脊髄の各種細胞型において増加していた。またこの増加は、肝臓のＫｕｐｆｆｅｒ細胞においても明らかであった。１か月の回復期間の後、被検試料処置個体（全用量群）におけるｒｈＡＳＡ染色が対照（装置および／または溶媒対照）レベルに戻っていた。低用量群の回復雄の１個体では、大脳皮質において、複数の領域での以前の虚血を示すアストロサイト増加およびニューロン損失の複数の病巣が見られた。この個体でのこれらの病変の正確な病因は明らかでなかったが、１０倍の用量を投与した高用量個体を含めた他の被検試料処置個体で同様の病変が見られなかったことは、これらの病変が被検試料に関係するものではなかったことを示している。

本試験のＩＴ被検試料はｒｈＡＳＡであった。３６匹の雄および３６匹の雌カニクイザルを無作為に５つの処置群に割り当てた。群１の個体は未処置の埋植物デバイス対照（ポートおよびカテーテル）であり、これらの個体には溶媒も被検試料も投与しなかったが、被検試料の投与計画に合わせた計画で０．６ｍＬのＰＢＳを投与した。群２〜５の個体には、０、３、１０または３１ｍｇ／ｍｌのｒｈＡＳＡを隔週、０．６ｍＬ（０、１．８、６．０または１８．６ｍｇの総用量）のＩＴ注入で投与した（すなわち、合計１２回の投与）。６か月後（最後のＩＴ投与の２４時間後）に個体の剖検を行い、４週間の回復期間の終わりに残りの４つ個体／性別／群の剖検を行った。選択した組織を採取して保存し、顕微鏡で調べた。下の表は、本試験の病理学的側面に関連する試験計画を示すものである。

殺処分時に、脳を脳マトリックスで約３ｍｍの冠状スライス厚に切った。最初のスライスと、そこから１枚おきのスライスを、組織病理学的評価および免疫組織化学的解析用にホルマリン中で固定した。脳を完全な冠状切片として処理した。これらの切片には、少なくとも以下の脳領域が含まれていた。
・新皮質（前頭皮質、頭頂皮質、側頭皮質および後頭皮質を含む：脳切片１〜８（および存在すればスライス９）
・古皮質（嗅球および／または梨状葉）：脳切片１〜３
・大脳基底核（尾状核および被殻を含む）：脳切片３および４
・辺縁系（海馬および帯状回を含む）：脳切片４および５
・視床／視床下部、および黒質を含めた中脳領域：脳切片４および５
・小脳、脳橋および延髄：脳切片６〜８（および存在すればスライス９）。

脳切片を切片１〜８／９（一部の個体に関して切片９は試験施設により提供された）としてデータ表に挙げられている。切片作成は個体間で若干異なっていた。上に挙げた脳切片（１〜８／９）は、様々な解剖学的領域の約の位置であった。脳切片は、後に可能性のあるさらなるスライド再検査（それがある場合）を容易にするために、その切片と関係のある診断とともに個々の切片としてデータ表に挙げられている。データ解釈の際には、被検試料による固有の影響（すなわち、特定の脳領域に固有）を同定するために、脳の個々の解剖学的部位（上記）を比較した。ＴＰＳでは、全個体の脳切片をすべてパラフィンに包埋して、５ミクロンに薄切し、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色して、顕微鏡により調べた。さらに、対照および高用量の個体の脳をフルオロ−ＪａｄｅＢ（神経変性に関する脳の評価の感度を増強する染色）およびＢｉｅｌｓｃｈｏｗｓｋｙの銀染色（軸索、樹状突起および神経フィラメントを直接可視化することができる処理）で染色して調べた。

脊髄（頸部、胸部および腰部）を１センチメートルの切片に切った。次いで、最初のスライスと、そこから１枚おきのスライスを、組織病理学的評価および免疫組織化学的解析用にホルマリン中で固定した。全個体の脊髄切片（頸部、胸部（カテーテル先端を含む）および腰部）を約５ミクロンに薄切して、Ｈ＆Ｅで染色し、各レベルで得られた横断切片および斜位切片を調べた。対照群および高用量群の脊髄の連続切片をＢｉｅｌｓｃｈｏｗｓｋｙ銀染色および抗ＧＦＡＰ（アストロサイトとその突起を直接可視化することができる免疫組織化学的染色）でさらに染色した。

脊髄神経後根および神経節（中頸部、中胸部および中腰部で得られた）をパラフィンに包埋し、連続切片をＨ＆Ｅで染色した。さらに、対照群および高用量群の連続切片をＢｉｅｌｓｃｈｏｗｓｋｙ銀染色で染色した。

全個体の坐骨神経、脛骨神経および腓腹神経の切片に関しては、各神経の縦断切片をパラフィンに包埋して、約５ミクロンに薄切し、Ｈ＆Ｅで染色した。各神経の横断切片をオスミウムで後固定し、Ｓｐｕｒｒ樹脂に包埋して、約１〜２ミクロンに薄切し、トルイジンブルーで染色した。オスミウム後固定および樹脂包埋は末梢神経のミエリン保存性に優れているため、神経をより詳細に調べることができる。

剖検時に全個体から採取した全組織および肉眼的病変もパラフィンに包埋して、Ｈ＆Ｅで染色し、顕微鏡で調べた。組織病理学的な処理および評価、ならびに免疫組織化学的解析をＴＰＳにより行った。
アリールスルファターゼＡ（ｒｈＡＳＡ）の染色

陽性対照スライドは試験依頼者から提供された。スライドはｒｈＡＳＡを注射したマウスの肝臓切片であった。陽性対照スライドはすべて、肝臓Ｋｕｐｆｆｅｒ細胞（類洞マクロファージ）内にｒｈＡＳＡの十分な証拠を示していた。陽性対照スライドを本試験の他のスライドとともに保管する。最初に、ｒｈＡＳＡ染色した切片のすべての評価を個体の処置群に対して盲目下で行った。これは、最初に病理学者が、ラベルの個体番号を隠した（評価される実際の個体を知っている助手による）状態でｒｈＡＳＡ染色スライドを読み取り、評価する際にスコア（重症度）を口述し、同じ助手が直ちに染色スコア（重症度）をデータ表に記入することにより行われた。次いで、正確なデータ記入を保証するために、試験神経病理学者と助手の両者が個体ＩＤを照合した。このような手順を踏んだのは、細胞内ｒｈＡＳＡ検出のための免疫組織化学的染色による染色の全体の強度の判断に偏りが生じないようにするためである。ニューロン、髄膜マクロファージ、血管周囲マクロファージおよびグリア細胞（アストロサイトとミクログリア細胞であるが、おそらくは大部分がミクログリア細胞である）の相対的な染色の程度を、脳および脊髄のすべての切片で等級付けした。各群の各脳および脊髄レベルでの平均重症度スコアを合計し（群ごと）、脳一般ｒｈＡＳＡ染色、および脊髄一般ｒｈＡＳＡ染色という組織項目下での合計として記録した。

一般に、脳のニューロンのｒｈＡＳＡ染色は、脳の大脳皮質および他の核野におけるニューロンの尺度であった。髄膜マクロファージのｒｈＡＳＡ染色は、髄膜マクロファージによる被検試料の取込みおよび／または髄膜マクロファージに内在するｒｈＡＳＡの証拠であった。血管周囲マクロファージのｒｈＡＳＡ染色は、脳／脊髄のマクロファージによるｒｈＡＳＡの取込み（または内在するｒｈＡＳＡ）の尺度であったが、脳および脊髄の血管周囲腔（Ｖｉｒｃｈｏｗ−Ｒｏｂｉｎ腔）は髄膜と繋がっていることに留意するべきである。一般に、グリア細胞におけるｒｈＡＳＡ染色の等級付けは主として、特に大脳皮質の灰白質および／または白質（放線冠は大脳皮質下の白質である）内への被検試料の取込み／被検試料の透過の尺度であった。白質でのｒｈＡＳＡ染色は、アストロサイトおよびミクログリア細胞に見られるようであった。

以下に挙げる等級付けスキームを用いて、各種細胞型（ニューロン、グリア細胞、マクロファージ）のｒｈＡＳＡ染色の程度を採点した。
等級の説明（染色された可能性のある細胞の％）
１１０％未満
２１０〜２５％
３２５〜５０％
４５０〜７５％
５７５％以上

このスキームは厳密に定量的なものではないことに留意されたい。このスキームは、ｒｈＡＳＡによる脳および脊髄の染色の程度を評価するための効率的で半定量的な方法として用いたものである。試験神経病理学者は、すべてのニューロン領域がｒｈＡＳＡ染色で等しく染色されるわけではないことに留意した。また、一部の対照個体では内因性のニューロン染色が見られること、および脈絡叢の細胞および後根神経節のニューロンは対照個体においてもｒｈＡＳＡで強く染色されやすいことにも留意した。脈絡叢および後根神経節の染色の等級付けは行わなかったが、試験神経病理学者は対照動物においても染色が顕著であることに留意した。

注：全用量群：低用量＝１．８ｍｇ／投与；中用量＝６．０ｍｇ／投与；高用量＝１８．６ｍｇ／投与。全用量群（雌雄；下を参照）の肝臓におけるｒｈＡＳＡ染色の増加を除いては、被検試料に関連した非神経系組織の病変は見られなかった。
終了時に殺処分した個体（６か月間のＥＯＷ投与）：ｒｈＡＳＡ染色切片

以下に挙げる組織／細胞型においてｒｈＡＳＡ染色の増加が見られた。特定の用量群の特定の細胞におけるｒｈＡＳＡ染色の程度に対する被検試料の影響を考察する際には、比較のために同時溶媒対照およびデバイス対照（回復後に殺処分した個体とともに殺処分）の染色レベルを考慮した。

・脳、髄膜、マクロファージ（全用量群、雌雄）
・脳、血管周囲、マクロファージ（全用量群、雌雄）
・脳、グリア細胞（全用量群、雌雄）
・脊髄、髄膜、マクロファージ（全用量群、雌雄）
・脊髄、血管周囲、マクロファージ（全用量群、雌雄）
・脊髄、グリア細胞（中用量および高用量の雌雄）
・肝臓、Ｋｕｐｆｆｅｒ細胞（全用量群、雌雄）

内因性の染色があるため、脳および脊髄のニューロンにおけるｒｈＡＳＡ染色レベルを明確に定めることが最も困難であった。ｒｈＡＳＡ染色では、髄膜および脳／脊髄の血管周囲マクロファージにおいて、およびグリア細胞内においても一貫してｒｈＡＳＡレベルの増加が示された。対照個体と被検試料処置個体との間で、ニューロンにおけるｒｈＡＳＡ染色の検出可能な差は見られなかった。
回復後に殺処分した個体（６か月間のＥＯＷ投与後に、１か月間の無投与期間）

全般的に、剖検前に１か月の無投与期間を設けた個体では、被検試料関連の変化が完全に消散するか、または著しく減少した。以下のような顕微鏡的変化が、被検試料との関連性を示す発生率および／または重症度で見られた。

被検試料に関連する顕微鏡的変化（回復個体）
・脳、髄膜、浸潤（中用量および高用量群、雌雄）（図１６および１７）
・脳、髄膜、浸潤、好酸球の％（中用量の雄；高用量の雌）
・脳、血管周囲、浸潤（中用量の雄；高用量の雌）（図１８）
・脳、血管周囲、浸潤、好酸球の％（中用量の雄；高用量の雌）
・脳、灰白質、浸潤（全用量群、雌雄）
・脳、灰白質、浸潤、好酸球の％（低用量の雄）
・脳、灰白質、好酸球、壊死（低用量の雄）
・脊髄、髄膜、浸潤（中用量および高用量の雄；低用量および高用量の雌）
・脊髄、髄膜、浸潤、好酸球の％（中用量の雄；低用量の雌）
・脊髄、灰白質、浸潤（低用量の雌）
・脊髄、灰白質、浸潤、好酸球の％（低用量の雌）
・後根神経節および神経根、神経上膜、浸潤（中用量の雌）
・脊髄神経根および神経節、浸潤、好酸球（中用量および高用量の雄；全用量の雌）
・三叉神経節、浸潤、好酸球（中用量の雌雄）

これらの変化はすべて、終了時に殺処分した個体で認められた炎症性変化の増加の残存物であると解釈した。終了時に殺処分した個体の場合と同様に、一部の回復個体に依然として存在する炎症性の細胞浸潤の増加が、有害な作用を引き起こす形態学的変化を示すという証拠は見られなかった。被検試料に関連する非神経系組織の病変は見られなかった。回復後に殺処分した個体（６か月間のＥＯＷ投与後に、１か月間の無投与期間）：ｒｈＡＳＡ染色

回復雄または雌において、装置および／または溶媒対照と比べてｒｈＡＳＡ染色の増加は示されなかった。実際には、低用量、中用量および高用量の回復雄の脳では、一部の細胞型（治療群間で異なる）において、装置および／または溶媒対照と比較してｒｈＡＳＡ染色の減少が示された。これが実際の影響であるか否かを含め、その理由はわからなかった。可能性のある１つの説明は、外来性のｒｈＡＳＡの投与が内因性のｒｈＡＳＡ産生をいくらか減少させた可能性があるということであろう。同様の所見は雄の脊髄では見られなかった。回復雄および雌では、肝臓における染色が、対照で認められたものと類似していた。

全般的に、被検試料に関連する変化は、２つの大きな種類に分類可能であり、全用量レベル（１．８、６．０および１８．６ｍｇ／投与）で見られた。

髄膜、脳実質、脊髄実質、三叉神経節、および場合により脊髄神経根／節（またはこれらの構造を取り囲む神経上膜）における浸潤（通常は好酸性成分が顕著な白血球）の増加。この増加は、被検試料（タンパク質）が髄腔内腔および神経系組織内に存在することによると解釈した。

一部の個体の脊髄および脳でミクログリア細胞のわずかな局所的増加（小膠細胞症は高用量のいずれの個体でも観察されなかった）。形態学的変化は２種類とも、被検試料の存在に対する反応であると解釈した。どの個体においても、ニューロン壊死の証拠は見られなかった。被検試料に関連する変化はいずれも、脳、脊髄、脊髄神経根または神経節におけるいかなる生物学的に有害な反応とも関連しなかった。具体的には、ニューロン壊死または生物学的に重要なグリア反応の証拠が見られなかった。被検試料に関連する非神経系組織の病変は見られなかった。１か月の回復期間（無投与期間）の後、被検試料に関連する変化は、完全に消散するか、または被検試料の存在に伴って以前に増加した炎症性応答の残存物に限定されていた。回復個体において有害な影響は見られなかった。

半定量的染色スコアを与える盲目下での顕微鏡検査に基づけば、アリールスルファターゼＡ（ｒｈＡＳＡ；被検試料）に対する免疫組織化学染色が、全被検試料処置群でニューロンを除く脳および脊髄の各種細胞型において増加していた。またこの増加は、肝臓のＫｕｐｆｆｅｒ細胞においても明らかであった。１か月の回復期間の後、被検試料処置個体（全用量群）におけるｒｈＡＳＡ染色が対照（装置および／または溶媒対照）レベルに戻っていた。低用量群の回復雄の１個体では、大脳皮質において、複数の領域での以前の虚血を示すアストロサイト増加およびニューロン損失の複数の病巣が見られた。この個体でのこれらの病変の正確な病因は明らかではなかったが、１０倍の用量を投与した高用量個体を含めた他の被検試料処置個体で同様の病変が見られなかったことは、これらの病変が被検試料に関係するものではなかったことを示している。本試験における肉眼所見および顕微鏡所見（パラフィン包埋、ヘマトキシリン／エオシン染色切片による）に厳密に基づけば、無毒性量（ＮＯＡＥＬ）は１８．６ｍｇであった。
実施例５−薬物動態データ
６か月の個体のデータ

本実施例では、ｒｈＡＳＡおよびＮｏｒｔｈｅｒｎＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈ社の抗ｒｈＡＳＡ血清抗体の血清中およびＣＳＦ中濃度の解釈的解析を提供する。

本実施例の目的は、幼若（１２か月齢未満）カニクイザルにおいて、反復投与によるｒｈＡＳＡの髄腔内（ＩＴ）投与を、毒性学および安全性薬理学の観点から評価することであった。６か月間で全１２回の投与を行った。最後の投与の２４時間後または１か月後に個体の剖検を行った。試験計画を表３０に示す。
アッセイ方法−抗体解析

有効な方法を用いて、カニクイザル血清中およびＣＳＦ中の抗ｒｈＡＳＡ抗体の定量化を行った。簡潔に述べれば、ＭＳＤストレプトアビジンでコートしたプレートのブロッキングからアッセイを始め、次いでビオチン標識ｒｈＡＳＡとのインキュベーションを実施する。洗浄段階の後、希釈試料、較正物質およびＱＣをプレートに加え、インキュベートする。さらなる洗浄段階の後、ＳＵＬＦＯＴＡＧ標識剤を加え、インキュベートする。最後の洗浄段階を行い、ＭＳＤリード緩衝液を加える。直ちにプレートを読み取る。ＳＯＦＴＭａｘＰｒｏテンプレートを用いて、相対発光量（ＲＬＵ）のシグナルデータを解析する。
血清中およびＣＳＦ中濃度

有効な方法を用いて、カニクイザル血清中およびＣＳＦ中のｒｈＡＳＡの定量化を行った。この方法は酵素結合免疫吸着測定（ＥＬＩＳＡ）技術に基づくものである。簡潔に述べればマイクロタイタープレートを組換えヒトアリールスルファターゼＡ（ＡＳＡ）に対するウサギポリクローナル抗体（ＳＨ０４０）でコートする。ＡＳＡ対照標準および試験試料とのインキュベーション後、結合したＡＳＡタンパク質を西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート抗ＡＳＡモノクローナル抗体（クローン１９−１６−３）により検出する。次いで、プレートをＨＲＰの基質であるＴＭＢペルオキシダーゼとともにインキュベートする。この酵素−基質反応を２Ｎ硫酸（Ｈ_２ＳＯ_４）の添加により停止させ、吸光波長４５０ｎｍでの各ウェルの吸光度を参照波長を６５５ｎｍとして測定する。同じプレートでのｒｈＡＳＡ検量曲線を用いて、試料中のＡＳＡの濃度を計算する。

ｒｈＡＳＡの血清中濃度、ｒｈＡＳＡのＣＳＦ中濃度、抗ｒｈＡＳＡの血清中抗体濃度、抗ｒｈＡＳＡのＣＳＦ中抗体濃度、および群および性別による抗体の出現率の概要が、下記の表３３〜３９に示されている。

カニクイザル血清中のｒｈＡＳＡの定量下限は３９．１ｎｇ／ｍＬであり、群１および２の血清試料はすべて定量下限未満（ＢＱＬ）であった（表３３を参照）。投与２、４、６、８、１０および１２の前およびの２４時間後（６か月後の剖検）、回復期間の途中、ならびに回復後剖検前にｒｈＡＳＡの血清中レベルを試験した。群３（１．８ｍｇ／投与）、群４（６．０ｍｇ／投与）および群５（１８．６ｍｇ／投与）では、投与２、４、６、８、１０および１２の前、投与１２の後、回復期間の途中、ならびに回復後剖検前のｒｈＡＳＡレベルは検出不可能であった。投与２の後では、血清中ｒｈＡＳＡのレベルは用量依存的であった。投与４（群３）、投与６（群３および４）および投与８および１０（群３および４、ならびに群５の雄）の後では、ｒｈＡＳＡレベルは検出不可能であった。ｒｈＡＳＡの血清中レベルは、群４（６．０ｍｇ／投与）では投与４の後に、群５（１８．６ｍｇ／投与）では、雄で投与４および６の後、雌で投与４、６、８および１０の後に減少した。この血清中ｒｈＡＳＡレベルの明らかな減少は、抗ｒｈＡＳＡ抗体濃度の増加に関連している可能性がある。本試験における試料のばらつきおよび少ない群数を考えれば、ｒｈＡＳＡの血清中レベルでの雌雄間の明らかな差はなかった。

カニクイザルＣＳＦ中のｒｈＡＳＡの定量下限は１９．５ｎｇ／ｍＬであり、群１および２のＣＳＦ試料はすべてＢＱＬであった（表３４参照）。全投与群において、投与２、４、６、８、１０および１２（６か月後の剖検）の前および後に、ＣＳＦ中のｒｈＡＳＡが検出可能であった。そのレベルは投与後（投与の約２４時間後）の方が高く、用量依存的であった。ＣＳＦ中のレベルは血清中のレベルよりも大幅に高かった。本試験における試料のばらつきおよび少ない群数を考えれば、ｒｈＡＳＡのＣＳＦ中レベルでの雌雄間の明らかな差はなかった。全投与群において、回復期間の途中および回復後剖検前にｒｈＡＳＡは検出されなかった。ｒｈＡＳＡ処置群の投与１２（剖検）で採取されたＣＳＦ中のレベルは、投与８および１１の後のレベルよりも低かった。剖検時の方がｒｈＡＳＡレベルが低い理由としては、剖検時に採取した量（細胞計数、化学、ｒｈＡＳＡおよび抗ＲＨＡＳＡ抗体用に合計約２．２５ｍＬ）の方が、生存中の投与間に採取した量（ｒｈＡＳＡ濃度用に投与前または投与後に０．５ｍＬ以下）よりも多かったということが考えられる。さらに、一部の個体は剖検時にカテーテルが塞がっていたため、カテーテルではなくＣＭ穿刺により採取した。この経路は、カテーテルを介した試料採取に比べて、ｒｈＡＳＡ濃度が常に低い。これはＣＳＦの体軸方向の総体流が制限されていることによるものと思われ、このような現象は、サルおよびヒトのような体が垂直方向に伸びている動物で生じることが認められている（例えば、ＣＳＦの成分が個体の生涯を通して顕著な体軸方向の勾配を示すことがよく知られている）。

いくつかの時点では、ＲＨＡＳＡで処置した全個体において血清中に抗ｒｈＡＳＡ抗体が検出された（表３５を参照）。抗ｒｈＡＳＡ抗体のレベルが定量下限（７８．１ｎｇ／ｍＬ）を上回っていれば、その個体を抗ｒｈＡＳＡ抗体に関して陽性であると定めた。一度血清転換した個体は、抗ｒｈＡＳＡ抗体に関して陽性のままであった。投与２の前の時点では、抗ｒｈＡＳＡ抗体に関して陽性の個体は見られなかった。投与４の前の時点では、番号０２６の雄（群４；６．０ｍｇ／投与）を除く全ｒｈＡＳＡ個体が血清中抗ｒｈＡＳＡ抗体に関して陽性であった。番号０２６の雄は、投与６の前の時点で血清中抗体に関して陽性であった。群５（１８．６ｍｇ／ｋｇ）では、剖検抗体試料の抗体レベルが低くなっていた。この明らかな減少は、アッセイに干渉するｒｈＡＳＡの存在によるものであろう。力価は全般的に、低用量個体（１．８ｍｇ／投与）よりも中用量および高用量群（６．０および１８．６ｍｇ／投与）の方が高かった。抗ｒｈＡＳＡ抗体の存在は、組換えヒトタンパク質でカニクイザルを処置することから得られる予測された結果である。結果のばらつきを考えれば、雌雄間の明らかな差はなかった。

ＣＳＦ中の抗ｒｈＡＳＡ抗体が検出可能な個体では、番号０４９（群３；１．８ｍｇ／投与）および番号０５７（群４；６．０ｍｇ／投与）の雌を除き、すべてが血清中のｒｈＡＳＡ抗体も検出可能であった。抗体の濃度および出現率にばらつきがあるため、用量反応を決定することができない。抗ｒｈＡＳＡ抗体のレベルが定量下限（７８．１ｎｇ／ｍＬ）を上回った個体を、抗ＲＨＡＳＡ抗体に関して陽性であると定める。

血清中およびＣＳＦ中ＲＨＡＳＡレベルならびに抗ＲＨＡＳＡ抗体に関する雌雄の合計数値を表３６および表３７に示す。上述のように、雌雄を合わせた結果は雌雄別々の結果と同様であった。
実施例６−有効性

本実施例では、１１匹の野生型対照（ｍＡＳＡ＋／＋ｈＡＳＡ−／−）マウスを群Ａに割り付け、これらには処置を行わなかった。３４匹のｈＡＳＡＣ６９Ｓ／ＡＳＡ−／−マウスを５つの各用量群に割り付け、これらには１、９、１５／１６および２２日目に溶媒（群Ｂ）またはを２０ｍｇ／ｋｇ（静脈内［ＩＶ］；群Ｃ）もしくは０．０４、０．１２および０．２１ｍｇ（それぞれ群Ｄ、ＥおよびＦ）の用量のｒｈＡＳＡ（ｒｈＡＳＡ）を投与した。ＩＶ投与はすべて尾静脈から行った。髄腔内（ＩＴ）投与はすべて、約２μＬ／２０秒の範囲で１２μＬの量の注入として行った（表４０）。

ＡＳＡノックアウトマウスｈＡＳＡＣ６９Ｓ／ＡＳＡ（−／−）はＭＬＤのモデルとして認められており、この疾患に対して可能性のある治療法を試験するために用いられてきた。髄腔内経路はヒトでの投与経路を意図したものである。静脈内投与経路は、この化合物および同様の化合物に関して、ＭＬＤマウスで試験されている。末梢器官で予想される組織学的変化の陽性対照として、静脈内対照群を加えた。１００、３００または５２０ｍｇ／脳重量ｋｇ（それぞれ０．０４、０．１２、０．２１ｍｇ）のｒｈＡＳＡをマウスに投与した。本試験のために選択した、脳重量に対して正規化した用量レベルは、ヒトでの使用が計画されている用量、または毒性学試験もしくは以前のリソソーム蓄積症の有効性モデルで使用された用量に相当する。これらの用量は全く毒性を有さないと予想された。受容体
種マウス（Ｍｕｓｍｕｓｃｕｌｕｓ）
系統ｈＡＳＡＣ６９Ｓ／ＡＳＡ（−／−）マウスおよび野生型対照
齢数到着時で約１４〜１７か月齢
群数６
個体数ＡＳＡノックアウトマウス３４匹＋野生型対照１１匹
到着後、健康状態を評価するために各個体を検査した。
飼育
マウスを、ＣａｒｅＦｒｅｓｈ紙床敷と給水ボトルとを備えた高温ポリカーボネート製のフィルタートップケージで集団飼育した。各ゲージを、計画、群番号および個体番号、ならびに雌雄を明記したケージカードでわかりやすく標識した。耳パンチ方式を用いて、各個体を１個体ずつ区別した。個体は、連邦のガイドラインに従って処置した。
個体の室内環境および光周期の目標条件は以下の通りであった：
温度２２℃±３℃
湿度５０％±２０％
光周期１２時間の明期と１２時間の暗期

用量投与の間、および用量投与後、光周期を一時的に中断した場合もある。このような中断は、本調査の結果または質に影響を及ぼさないものとみなす。使用可能な野生型個体（１１匹）をすべて群Ａに割り付け、３５〜４５の番号を付した。順化期間中に、ケージから取り出して、体重を量り、耳パンチを実施する際に、ＡＳＡ（−／−）ｈＡＳＡ（＋／−）個体に連続する番号（１〜３４）を割り付けた。次いで、２０１１年１月３日にＲｅｓｅａｒｃｈＲａｎｄｏｍｉｚｅｒ（ｗｗｗ．ｒａｎｄｏｍｉｚｅｒ．ｏｒｇ）を用いて、マウスを治療群に割り付けた。最初の９つの番号を群Ｂに、次の５つの番号を群Ｃに、その次の５つの番号を群Ｄに、その次の５つの番号を群Ｅに、最後の１０個の番号を群Ｆに割り付けた。個体は以下の表４１のように割り付けた。
被検試料および溶媒
被検試料
アイデンティティｒｈＡＳＡ
種類ヒト組換えアリールスルファターゼＡ（ｒｈＡＳＡ）
保管条件約４℃

溶媒
アイデンティティｒｈＡＳＡ溶媒（１５４ｍＭＮａＣｌ、０．００５％ポリソルベート２０、ｐＨ約６．０）
保管条件約４℃
溶媒の調製

溶媒を記載の通りに使用した。溶媒を卓上で温めた（周囲温度）。溶媒が温まってから、緩やかに回転および反転させて物質を混合した。ボトルをボルテックスしたり振盪させたりしなかった。物質を利用する前にボトルを乾燥させた。残った溶媒は冷蔵庫に戻した（１℃〜８℃）。
投与製剤の調製

ｒｈＡＳＡを溶媒で希釈して必要な濃度にした。被検試料を卓上で温めた（周囲温度）。被検試料が温まってから、緩やかに回転および反転させて物質を混合した。ボトルをボルテックスしたり振盪させたりしなかった。
注射剤を追跡するための色素：

赤外色素（例えばＩＲＤｙｅ（登録商標）、ＬＩ−ＣＯＲＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｌｉｎｃｏｌｎ、ＮＥなど）を注射剤の追跡に用いた。このような色素は、髄腔内投与後の残存解析法として髄腔内注入剤で用いられてきた。投与前に色素を被検試料混合した。すなわち、１μＬの１ｎｍｏｌ色素を被検試料に加えた。赤外色素のほかに、１μＬのＦＤ＆ＣｂｌｕｅＮｏ．１（０．２５％）を注射剤の追跡に用いた。この青色の色素は一般的な食品添加物であり、一般に安全で無毒であると考えられている。
ｒｈＡＳＡまたは溶媒の腰仙部ＩＴ注射

１、９、１５または１６日目と２２日目に、群Ｂ、Ｄ、ＥおよびＦの個体に髄腔内注入を行った。

１．２５％の２，２，２−トリブロモエタノール（Ａｖｅｒｔｉｎ）を体重１０ｇ当たり２００〜３００μＬ（２５０〜３５０ｍｇ／ｋｇ）で腹腔内注射により使用して、成体マウスを麻酔した。クリッパーを用いて尾の基部から肩甲骨までの背中の体毛を除去した。剃毛した部分を、ｐｏｖｉｄｉｎｅ／ｂｅｔａｄｉｎｅ洗浄、次いでイソプロピルアルコールにより消毒した。腰仙部脊椎の上で小さな正中皮膚切開（１〜２ｃｍ）を行い、背側正中線と回腸の頭側の翼との交点を確認した。腸骨窩の筋肉（中殿筋）はハート型の筋肉である。この「ハート」の上部両側がほぼ回腸の翼の位置にある。気密性の１０〜２０μＬガラス製Ｈａｍｉｌｔｏｎシリンジに装着した３２ゲージの針を、下にある骨の抵抗を感じるまで挿入した。被検試料１０μＬ、赤外色素１μＬおよび１μＬのＦＤ＆ＣｂｌｕｅＮｏ．１（合計注射量１２μＬ）を、約２μＬ／２０秒（１２μＬ／２分）の速度で注射した。創傷クリップを用いて皮膚切開を閉じた。注射が成功したか否かの判断を、赤外色素および可視性の青色色素がＣＮＳ全体に分布したか否かを画像で判定することにより行った。画像化の後、回復用チャンバーでマウスを回復させた。
ｒｈＡＳＡの静脈内注射

１、９、１５および２２日目に、群Ｃの個体に静脈内注射を行った。

ＩＶ注射のために、マウスを必要に応じてイソフルランを用いて麻酔し、保定器に入れた。尾を指で軽くはじいて温めることにより、尾静脈を拡大させた。次いで、注射部位を７０％エタノールでぬぐった。あるいは、マウスを暖かいチャンバー（４０℃）に１〜１．５分間置いた。２８〜３０ゲージの針を用いて被検物質を注射した。注射量は５〜１０ｍＬ／ｋｇであった。

４回目の投与の約２４時間後に群Ｂ〜Ｆの個体を安楽死させた。これらの個体を以下に詳述するような様々な組織採取法に供した。群Ａには処置を施さなかったが、２０１１年１月の２７日または２８日に安楽死させ、以下に詳述するような組織採取法に供した。
血清（全個体）

イソフルラン麻酔下、全個体（Ａ〜）から後眼窩穿孔により終了時の血液試料（約０．５ｍＬ）を採取した。ガラス製チューブを眼窩に当て、眼球の下部に静かに差し込んで、眼球後部にある静脈排出路を破壊した。血液を毛管作用および／または自然流下により採取した。血液採取後に、眼窩を圧迫して止血した。

全血試料を血清になるまで処理し、−８０℃未満で凍結させた。血清を−８０℃で保管し、抗体に関して解析した。
光学顕微鏡検査用の組織（群Ａ〜Ｆ；１群当たりマウス５匹）

血液採取後に、ＣＯ_２窒息によりマウスを安楽死させた。灌流前に尾部小片を採取し、可能性のある遺伝子型同定のために保管した。心膜腔を露出させた。１群当たり３匹のマウスを、ヘパリン処理した氷冷生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ中１Ｕ／ｍＬのナトリウムヘパリン、滅菌ろ過済み）、次いで約４℃の４％パラホルムアルデヒドで経心的に灌流した。脳を取り出し、腹部を切開して内臓をさらに露出させた。凍結させた尾部小片を除く、脳および死体をパラホルムアルデヒドに漬けた。
脂質解析用の組織（群Ａ、ＢおよびＦ；それぞれ６、４および５個体）

血液採取後に、ＣＯ_２窒息により個体を安楽死させた。灌流前に尾部小片を採取し、可能性のある遺伝子型同定のために保管した。心膜腔を露出させた。脂質解析用に、１群当たり４〜６匹のマウスを、ヘパリン処理した氷冷生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ中１Ｕ／ｍＬのナトリウムヘパリン、滅菌ろ過済み）で経心的に灌流した。脂質解析のために採取した例示的な組織は、表４２に示されている。．
採取時に、重量を量ってから組織をドライアイス上で、または−８０℃の冷凍庫に入れて凍結させた。脳を左半球と右半球に分割した。右半球をＭＳによる脂質解析に用いる。左半球を可能性のあるＮ−アセチル−Ｌ−アスパラギン酸解析用に解析する。解析まで組織を−８０℃で保管した（表４３を参照されたい）。

ｒｈＡＳＡにより、ＭＬＤマウスの脊髄、特に白質におけるスルファチドの蓄積が減少した（図１９）。ｒｈＡＳＡ投与後にアルシアンブルー染色剤の光学濃度が統計的に有意に減少することが、脊髄の形態計測解析により示された（図２０）。ｒｈＡＳＡ処置したＭＬＤマウスも脳におけるリソソーム活性の減少を示した（図２１）。この減少は、溶媒処置個体と比べて、高用量群（０．２１ｍｇ〜５２０ｍｇ／脳重量ｋｇ）において統計的に有意であった（図２２）

１歳を超えた免疫耐性のＭＬＤマウス（ｈＡＳＡＣ６９Ｓ／ＡＳＡ（−／−））に毎週１回で４週間、ｒｈＡＳＡの髄腔内腰椎投与を行った（合計４回の投与）。用量は、溶媒（１５４ｍＭＮａＣｌ、０．００５％ポリソルベート２０、ｐＨ約６．０）、０．０４、０．１２、０．２１ｍｇ／投与（正規化された用量はそれぞれ１００、３００および５２０ｍｇ／脳重量ｋｇ）であった。終了時点で、脳および脊髄内でのスルファチドクリアランスおよびリソソーム活性の免疫組織化学的評価により有効性を評価した。組織中のスルファチドを標的としたアルシアンブルー染色を用いて、脊髄および脳切片を染色した。また脳切片を、リソソームプロセスの指標であるリソソーム膜タンパク質（ＬＡＭＰ）の有無に関しても染色した。さらに、アルシアンブルーおよびＬＡＭＰで染色した脊髄（頸部、胸部および腰部）および脳切片の形態計測解析を行った。

これらの予備結果は、ｒｈＡＳＡの髄腔内腰椎投与の有効性を示している。溶媒対照マウスに比べて、ｒｈＡＳＡ処置ＭＬＤマウスは、脳内のスルファチド蓄積（アルシアンブルー染色により認められる）およびリソソーム活性の減少ような、疾患の組織学的マーカーにおける向上の証拠を示している。これらの組織病理学的変化は、投与部位付近（脊髄）だけでなく、脳の末梢部でも観察された。
実施例７−生体内分布２
概略

本試験では、３６匹の雄および３６匹の雌の幼若体カニクイザル（開始時に１２か月齢未満）を５つの各用量群に割り付け、０（デバイス対照；０．６ｍＬのＰＢＳを投与）、０（溶媒対照）、１．８、６．０または１８．６ｍｇ（それぞれ群１、２、３、４および５）の用量のｒｈＡＳＡ（ｒｈＡＳＡ）を、隔週で６か月間、合計１２回投与した。全投与を０．６ｍＬの量の注入で行い、次いで、約１０分間の０．５ｍＬＰＢＳによる洗い流しを行った（表４４）。
材料および方法
組織採取

脳を脳マトリックスで約３ｍｍの冠状スライス厚に切った。各脳を以下のものを含む完全な冠状スライスに薄切した：新皮質（前頭皮質、頭頂皮質、側頭皮質および後頭皮質を含む）、古皮質（嗅球および／または梨状葉）、大脳基底核（尾状核および被殻を含む）、辺縁系（海馬および帯状回を含む）、視床／視床下部、中脳領域（黒質を含む）、小脳、脳橋および延髄。各組織試料が（４ｍｍの生検パンチにより）得られた位置を図３２〜３７に示す。図３２〜３７の画像は、ウィスコンシン大学およびミシガン州ＣｏｍｐａｒａｔｉｖｅＭａｍｍａｌｉａｎＢｒａｉｎＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ（および国立健康医学博物館）のものである。パンチ番号２２は、この構造が剖検時に存在しなかったため採取されなかった。すべての脳試料を、酵素結合免疫吸着測定を用いたｒｈＡＳＡの解析まで−６０℃以下で凍結させ保管した。

最初のスライスと、そこから１枚おきのスライスを、組織病理学的評価および免疫組織化学的解析用にホルマリン中で固定した。２枚目の脳スライスと、そこから１枚おきのスライスを、被検試料濃度の解析用に凍結させた。凍結前に、生体内分布解析用に、偶数番号を付した被検試料解析用の脳スライスの右側部分から脳試料を採取した。脳試料の位置を剖検時に写真撮影し、脳スライス番号を記録した。採取される白質の量が最適になるように、４ｍｍの円形パンチを用いて、または解剖用メスで切り取って試料を採取した。すべてのパンチを被検試料解析用に−６０℃以下で凍結させ保管した。残りの脳スライスを、可能性のある被検試料解析用に−６０℃以下で凍結させ保管した。パンチの位置は付録Ｂに示されている。

脊髄（頸部、胸部および腰部）を１センチメートルの切片に切った。次いで、最初のスライスと、そこから１枚おきのスライスを、組織病理学的評価および免疫組織化学的解析用にホルマリン中で固定した。次いで、２枚目の脊髄スライスと、そこから１枚おきのスライスを、被検試料濃度の解析用に−６０℃以下で凍結させ保管した。髄腔内カテーテルの先端部を含むスライス（スライス０）がホルマリンで固定され、組織病理に関して解析されるように、スライスの配分を調節した。
脳、肝臓および脊髄抽出物の調製ならびにｒｈＡＳＡ濃度の決定

米国食品医薬品局（ＦＤＡ）医薬品の安全性に関する非臨床試験の実施基準（ＧＬＰ）の規則２１ＣＦＲ、Ｐａｒｔ５８および適用されるＭｉｄｗｅｓｔＢｉｏＲｅｓｅａｒｃｈ社の標準操作手順書を遵守した有効な方法を用いて、脳パンチ、脊髄および肝臓の試料を解析した。組織試料を溶解緩衝液中でホモジナイズし、遠心分離により組織残骸を除去し、アッセイまで−８０℃で保管した。捕捉抗体としてポリクローナルウサギ抗体ＳＨ０４０および検出抗体としてＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）コンジュゲート抗ＡＳＡモノクローナル抗体１９−１６−３を用いたＥＬＩＳＡにより、ホモジネートの可溶性画分中のｒｈＡＳＡ濃度を決定した。未結合物質を除去する洗浄段階の後、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質溶液をＨＲＰコンジュゲート抗体の存在下で過酸化物と反応させて、最初の段階で抗ＡＳＡ抗体と結合したＡＳＡの量に比例する比色シグナルを発生させた。各組織ホモジネート中の得られたｒｈＡＳＡの量を、標準曲線から内挿した。

また、試料をビシンコニン酸（ＢＣＡ）タンパク質決定アッセイでも解析し、未知の試料中のタンパク質の濃度を得た。各試料のタンパク質濃度をアルブミン標準曲線の内挿により決定した。次いで、ｒｈＡＳＡ濃度の結果を、ビシンコニン酸アッセイにより決定された組織抽出物中の総タンパク質に対して正規化した。

溶媒、１．８ｍｇ／投与、６．０ｍｇ／投与および１８．６ｍｇ／投与群の全パンチのＡＳＡレベルを、それぞれ図２３、図２４、図２５、および図２６に示す。デバイス対照、溶媒、１．８ｍｇ／投与、６．０ｍｇ／投与および１８．６ｍｇ／投与群の回復個体の全パンチのＡＳＡレベルを、それぞれ図２７、図２８、図２９、図３０、および図３１に示す。

脳の表面付近（髄膜）で採取した、選択したパンチのＡＳＡレベルを図３２に示す。主に深部の脳白質を含むと考えられる、選択したパンチのＡＳＡレベルを図３３に示す。白質は、有髄神経細胞突起（または軸索）の束で構成されている。主に深部の脳灰白質を含む、選択したパンチを図３４に示す。白質とは対照的に、灰白質は神経細胞体を含む。表面、深部白質、深部灰白質の選択したパンチのＡＳＡの値を、各用量群について図３５に示す。

脊髄中濃度のデータを図３６に示す。

肝臓中濃度のデータを図３７に示す。

デバイス対照および溶媒投与対照群の肝臓、脊髄および脳中のＡＳＡ濃度のレベルは、場合によって測定可能であった。肝臓および脊髄中のレベルは、いずれのｒｈＡＳＡ処置群よりも低かった（図２３、図３２、および図３３）。デバイス対照および溶媒投与個体で測定されたｒｈＡＳＡレベルは、ＥＬＩＳＡで使用した抗ｒｈＡＳＡ抗体と天然のカニクイザルタンパク質との交差反応性を示している。抗体とカニクイザルＡＳＡとの間の交差反応性の程度が不明であるということ、およびアッセイ対照標準でヒトＡＳＡを使用しているということから、デバイス対照および溶媒の組織で報告された値は組織中のカニクイザルｒｈＡＳＡの定量値を表すものではない。しかし、いずれの理論にも束縛されるものではないが、デバイス対照と溶媒投与の組織の間で検出されたＡＳＡレベルの相違は、異なる組織および解剖学的領域におけるカニクイザルＡＳＡの相対量のばらつきを示すものであると解釈され得る。

脊髄スライス中のＡＳＡレベルは、１．８、６．０および１８．６ｍｇ／投与群においてそれぞれ、雄では１６０〜２３５２、１０８１〜６６０７および１８９３〜９２５２ｎｇ／タンパク質ｍｇの範囲、雌では０〜３１５１、６６９〜６６３７および１４０４〜１６４２４ｎｇ／タンパク質ｍｇの範囲であった（図３２）。ＡＳＡレベルは、脊椎の頸部領域よりも腰部領域の方が高かった。肝臓で検出されたＡＳＡタンパク質レベルは、ｒｈＡＳＡ処置群では用量依存的であり、溶媒群では非常に低かった。平均ＡＳＡレベルは、１．８、６．０および１８．６ｍｇ／投与群においてそれぞれ、雄では８８、６７４および２４２４ｎｇ／タンパク質ｍｇ、雌では１４０、４６２および１９９６ｎｇ／タンパク質ｍｇであった（図３３）。

全体的に、ＡＳＡレベルは、ｒｈＡＳＡ投与群の脊髄スライスおよび肝臓から調製した試料では、用量依存的であるようであった。試験した多くの脳領域において、ＡＳＡレベルとｒｈＡＳＡ投与の間の明らかな用量相関が示されたが、他のものはこれほど明らかではなかった。一般に、脳のＡＳＡレベルはｒｈＡＳＡ用量とともに増加した。
実施例８：薬物動態および生体内分布試験

本試験の目的は、カニクイザルへの髄腔内（ＩＴ）および静脈内（ＩＶ）投与後の様々な治療用補充酵素の薬物動態（ＰＫ）および生体内分布を評価することである。

本試験では、第１ａ相（ＩＳ２投与）および第１ｂ相（ＡＳＡ投与）のために、髄腔内−腰椎（ＩＴ−Ｌ）および髄腔内−大槽（ＩＴ−ＣＭ）カテーテルを有する合計１２匹の雄および１２匹の雌カニクイザルを、体重により４つの処置群に無作為に割り付けた。

両相では、投与後の特定の間隔で血液およびＣＳＦを（ＩＴ−ＣＭカテーテルから）採取した。第１ａ相の最後の試料を採取した後、第１ｂ相の開始前に７日間のウォッシュアウト期間を設けた。

第１ｂ相の最後の試料を採取した後、第２相の開始までに７日間のウォッシュアウト期間を設ける。第１ｂ相の合計１２匹の雄および雌カニクイザルを、体重によりＩＳ２（群１ａ〜６ａ）およびＡＳＡ（群１ｂ〜６ｂ）の１２の処置群に無作為に割り付けた。

ＩＴ−Ｌ投与後の血清中でのＡＳＡの絶対バイオアベイラビリティは、約３０〜４０％である。これに対し、ＩＶ投与の０．５％のみがＣＳＦ中で生物学的に利用可能であった。

ＩＴ−Ｌ投与後、血清中でのＡＳＡへの曝露量は、比例するよりも多く増加する。

ＩＴ−Ｌ投与後、ＣＳＦ中でのＡＳＡへの曝露量は、用量の増加に比例するよりも少ない増加であった。血清中のｒｈＡＳＡのＰＫパラメーター、ＣＳＦの血清中のｒｈＡＳＡのＰＫパラメーター、およびバイオアベイラビリティの概要が表４５〜４７に示されいている。

ＩＴ−Ｌ投与後の血清中のＡＳＡのバイオアベイラビリティは、約３０〜４０％である。これに対し、ＩＶ経路により投与した用量の０．５％のみがＣＳＦ中で生物学的に利用可能であった。ＣＳＦの血清分配が表４８に示されている。
実施例９−ＭＬＤ患者の治療

例えばＩＴ送達による、ＣＮＳへの直接投与を用いて、ＭＬＤ患者を効果的に治療することができる。本実施例は、遅発乳児型ＭＬＤの患者に対して、隔週（ＥＯＷ）、全４０週で、髄腔内薬物送達装置（ＩＤＤＤ）により投与する、３用量レベルまでのＩ２Ｓの安全性を評価するために計画された、多施設用量漸増試験を示すものである。ヒト治療に適した髄腔内薬物送達装置の様々な例を、図４５〜４８に図示する。

最大２０患者まで登録：
コホート１：５患者（最低用量）
コホート２：５患者（中間用量）
コホート３：５患者（最高用量）
無作為に５患者を無治療とする。

以下の基準を含むか否かに基づき、試験する患者を選択する：（１）生後３０か月までに最初の症状が現れた；（２）スクリーニング時に歩行可能である（自力で立ち上がり、片手を持たれた状態で１０歩前へ歩く能力と定義される）；（３）スクリーニング時に神経学的兆候が見られる。通常、造血幹細胞移植の経歴がある患者は除外される。

遅発乳児型ＭＬＤの小児において、４０週間、用量を漸増してＩＴ注射により投与するｒｈＡＳＡの安全性を判定する。さらに、粗大運動機能に対するｒｈＡＳＡの臨床活性、ならびに単回および反復投与の血清中薬物動態および脳脊髄液（ＣＳＦ）中濃度を評価する。

本明細書に記載の化合物、組成物および方法は、特定の実施形態に従って具体的に記載されているが、後の実施例は単に本発明の化合物を例示するためのものであり、これらを限定することを意図するものではない。

本明細書および特許請求の範囲で使用される冠詞「ａ」および「ａｎ」は、そうでないことが明記されない限り、複数形の指示対象を含むということを理解するべきである。あるグループの１つ以上の要素の間に「または（もしくは、あるいは）」が含まれる請求項または記載事項は、そうでないことが明記されるかまたは文脈から明らかでない限り、１つ、２つ以上またはすべてのグループの要素が所与の製品または工程に存在する、使用されるまたは関連する場合に満たされるものとする。本発明は、グループの中の正確に１つの要素が所与の製品または工程に存在する、使用されるまたは関連する実施形態を含む。また本発明は、グループの２つ以上の要素または全要素が所与の製品または工程に存在する、使用されるまたは関連する実施形態も含む。さらに本発明は、別途明記されない限り、または矛盾もしくは不一致が生じることが当業者に明らかでない限り、列挙されている１つ以上の請求項の１つ以上の制限、要素、条項、記述用語などが、基本請求項に従属する別の請求項に（または関連する他の任意の請求項として）組み込まれるすべての変更、組合せおよび置換を包含するということを理解するべきである。要素が列挙されている場合（例えば、マーカッシュ群またはこれと同様の形式において）、要素の各下位グループも開示され、任意の要素（１つまたは複数）がそのグループから除外され得ることを理解するべきである。一般に、本発明または本発明の態様が特定の要素、特徴などを含むという場合、本発明の特定の実施形態または本発明の特定の態様は、このような要素、特徴などからなる、またはこのような要素、特性などから本質的になるということを理解するべきである。簡潔にするために、これらの実施形態があらゆる場合に正確に本明細書に具体的に記載されているわけではない。本発明の任意の実施形態または態様が、本明細書において具体的に除外されることが記載されているか否かにかかわらず、請求項から明確に除外され得ることも理解するべきである。本発明の背景を説明するために、および本発明の実施に関するさらなる詳細を提供するために本明細書において参照される刊行物、ウェブサイトおよびその他の参考資料は、参照により本明細書に組み込まれる。

Claims

アリールスルファターゼＡのＣＮＳ送達の方法および組成物など。