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JP2018535674A - Ａｓｃｔ２特異的結合分子及びその使用 - Google Patents

Ａｓｃｔ２特異的結合分子及びその使用 Download PDF

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Abstract

本開示は、ＡＳＣＴ２結合分子、例えば抗ＡＳＣＴ２抗体、及びその抗原結合断片を提供する。特定の態様において、本ＡＳＣＴ２結合分子は細胞傷害薬にコンジュゲートされ、例えば、ＡＳＣＴ２抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）である。特定の態様において、本抗ＡＳＣＴ２抗体及びその断片は、ハイブリドーマ由来のマウスモノクローナル抗体及びそのヒト化バージョンであり得る。特定の態様において、本ＡＳＣＴ２結合分子は、ＡＳＣＴ２を発現する細胞に特異的に結合し、及び一部の例では、細胞にインターナライズされる。加えて、本開示は、ＡＳＣＴ２の過剰発現によって特徴付けられる疾患又は障害、例えば特定の種類の癌を診断及び治療するための組成物及び方法を提供する。詳細な実施形態において、本開示は、ＡＳＣＴ２ ＡＤＣを用いて癌を治療する方法を提供する。【選択図】なし

Description

本発明は、ＡＳＣＴ２特異的結合分子及びその使用に関する。
溶質キャリア（ＳＬＣ）ファミリーには、膜輸送タンパク質をコードする３００を超える遺伝子が含まれ、これらは数十のサブファミリーに組織化されている。ＳＬＣ１Ａサブファミリーは、脊椎動物細胞におけるナトリウム依存性中性アミノ酸輸送を媒介する輸送系ＡＳＣを含む。アラニン、セリン、及びシステインがＡＳＣ系の好ましい基質である。ＡＳＣ系の２つのサブタイプ、ＡＳＣトランスポーター１（ＡＳＣＴ１、別名ＳＬＣ１Ａ４）及びＡＳＣトランスポーター２（ＡＳＣＴ２、別名ＳＬＣ１Ａ５）が同定されている。
ＡＳＣＴ２は、５４１アミノ酸の、８つの膜貫通ドメインを含む複数回貫通型膜タンパク質である。ＡＳＣＴ２の分子量は、多様なグリコシル化プロファイルに応じて５５〜７５ＫＤまで異なる。Ｌ−アラニン、Ｌ−セリン、及びＬ−システインの輸送に加え、ＡＳＣＴ２はＬ−スレオニン及びＬ−グルタミンも輸送する。更に、ＡＳＣＴ２は、Ｄ型サルレトロウイルス及びＣ型ウイルスによって共有される細胞表面受容体として機能する。
ＡＳＣＴ２の過剰発現が、結腸直腸癌、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）、前立腺癌、肺癌、膵癌、及び血液癌、例えば骨髄腫及びリンパ腫を含めた様々な癌で報告されている。ＡＳＣＴ２の過剰発現は免疫組織化学的分析（ＩＨＣ）によって判定され、結腸直腸癌、前立腺癌、肺癌、及び膵癌を含め、様々な癌で予後不良を示す（Ｋ Ｋａｉｒａ，ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ；Ｓｈｉｍｉｚｕ，ｅｔ ａｌ．（２０１４）ＢＪＣ；Ｄ Ｗｉｔｔｅ，ｅｔ ａｌ．（２００２）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ；Ｒ Ｌｉ，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）。ＡＳＣＴ２は、哺乳類ラパマイシン標的タンパク質（ｍＴＯＲ）シグナル伝達経路、従って腫瘍成長の１つのドライバーであることが報告されている（Ｎｉｃｋｌｉｎ Ｐ．ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｃｅｌｌ）。
抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）は、抗体の特異性を細胞傷害性小分子又は毒素の効力と組み合わせることによって薬物関連毒性を低減しながらも癌をより有効に治療する有望な新規治療手法に相当する。ＡＤＣはサイトトキシンを含むことができ、サイトトキシンは、リンカーを含むように化学的に修飾されている小分子であり得る。次に、このリンカーを用いてサイトトキシンが抗体又はその抗原結合断片にコンジュゲートされる。ＡＤＣが標的陽性細胞の抗原表面に結合し、インターナライズされてリソソームに輸送されると、そこで切断可能なリンカーの（例えば、リソソームに存在するカテプシンＢによる）タンパク質分解、又はサイトトキシンを抗体に取り付けるのに切断不可能なリンカーが使用される場合には抗体のタンパク質分解のいずれかを受けてサイトトキシンが放出され、細胞傷害が誘導される。次に、サイトトキシンはリソソームを出てサイトゾルへと移行し、次にそこでその作用機構に応じてその標的に結合し得る。典型的には、これらのサイトトキシンは細胞周期停止を誘導し、続いてそれがアポトーシスにつながる。イメージング剤を含む対応するコンジュゲートも、インビボ又はインビトロで癌細胞を検出する有望な新規方法に相当する。
本開示は、ＡＳＣＴ２に特異的に結合する分子、及びかかる分子の、例えば、ＡＳＣＴ２の検出、細胞への異種薬剤の送達、又はＡＳＣＴ２の過剰発現によって特徴付けられる疾患又は障害、例えば癌の治療への使用方法を提供する。本開示は、ツブリシン誘導体又はピロロベンゾジアゼピンなどの細胞傷害薬にコンジュゲートされた抗ＡＳＣＴ２抗体（抗ＡＳＣＴ２−ＡＤＣ）を提供する。本発明の抗体は、ＡＳＣＴ２の過剰発現によって特徴付けられる疾患又は障害、例えば癌の治療に有用である。例えば、本発明者らは、抗ＡＳＣＴ２ ＡＤＣがヒト結腸直腸癌及び頭頸部癌の異種マウスモデルにおいて腫瘍退縮を生じさせることを明らかにしている。
本発明の主な態様の一部を以下に要約する。本開示の発明の詳細な説明、実施例、図面、及び特許請求の範囲の節に更なる態様が説明される。本開示の各節にある説明は、他の節と併せて読まれることが意図される。更に、本開示の各節に説明される様々な実施形態は、様々な異なる方法で組み合わせることができ、かかる組み合わせは全て本発明の範囲内に含まれることが意図される。
本開示は、ＡＳＣＴ２結合分子、例えば、抗ＡＳＣＴ２抗体又はその抗原結合断片、例えば、ＡＳＣＴ２との結合能を有するモノクローナル抗体を提供する。一部の態様において、本結合分子はサイトトキシンなどの薬剤にコンジュゲートされる。
一部の例では、ＡＳＣＴ２のエピトープに特異的に結合する単離結合分子又はその抗原結合断片は、１７ｃ１０又は１ｅ８の重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗体又はその抗原結合断片と同じＡＳＣＴ２エピトープに特異的に結合する。
一部の例では、１７ｃ１０のＶＨは配列番号１又は配列番号５を含み、及び１７ｃ１０のＶＬは配列番号２又は配列番号６を含む。
一部の例では、１ｅ８のＶＨは配列番号３又は配列番号７を含み、及び１ｅ８のＶＬは配列番号４又は配列番号８を含む。
一部の例では、ＡＳＣＴ２に特異的に結合する単離結合分子又はその抗原結合断片は抗体ＶＬを含み、このＶＬは、配列番号２、配列番号４、配列番号６及び配列番号８からなる群から選択される参照アミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含む。
一部の例では、ＡＳＣＴ２に特異的に結合する単離結合分子又はその抗原結合断片は抗体ＶＨを含み、このＶＨは、配列番号１、配列番号３、配列番号５、及び配列番号７からなる群から選択される参照アミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含む。
一部の例では、ＡＳＣＴ２に特異的に結合する単離結合分子又はその抗原結合断片は、抗菌剤、治療剤、プロドラッグ、ペプチド、タンパク質、酵素、脂質、生物学的反応修飾物質、医薬品、リンホカイン、異種抗体又はその断片、検出可能標識、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及び任意の前記薬剤の２つ以上の組み合わせからなる群から選択される薬剤にコンジュゲートされる。
一部の例では、ＡＳＣＴ２に特異的に結合する単離結合分子又はその抗原結合断片はサイトトキシンにコンジュゲートされる。特定の実施形態において、サイトトキシンは、ＡＺ１５０８、ＳＧ３２４９、及びＳＧ３３１５からなる群から選択される。
一部の例では、結合分子又はその断片は抗体又はその抗原結合断片を含む。
一部の例では、ＡＳＣＴ２に特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片はＶＨ及びＶＬを含み、このＶＨ及びＶＬは、それぞれ配列番号１及び配列番号２、配列番号３及び配列番号４、配列番号５及び配列番号６、及び配列番号７及び配列番号８からなる群から選択される参照アミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含む。一部の例では、ＶＨはアミノ酸配列の配列番号５を含み、且つＶＬはアミノ酸配列の配列番号６を含む。一部の例では、ＶＨはアミノ酸配列の配列番号７を含み、且つＶＬはアミノ酸配列の配列番号８を含む。
一部の例では、抗体又はその抗原結合断片は重鎖定常領域又はその断片を含む。一部の例では、重鎖定常領域又はその断片はＩｇＧ定常領域である。一部の例では、ＩｇＧ定常領域はアミノ酸配列の配列番号９を含む。一部の例では、ＩｇＧ定常領域はヒトＩｇＧ１定常ドメインである。
一部の例では、抗体又はその抗原結合断片は、ヒトκ定常領域及びヒトλ定常領域からなる群から選択される軽鎖定常領域を含む。
一部の例では、抗体又はその抗原結合断片は、マウス抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、多重特異性抗体、又はその抗原結合断片である。一部の例では、抗原結合断片は、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、及びｓｃ（Ｆｖ）２である。
一部の例では、抗体又はその抗原結合断片はヒトＡＳＣＴ２及びカニクイザル（ｃｙｎｏ）ＡＳＣＴ２に結合することができる。
一部の例では、抗体又はその抗原結合断片はヒトＡＳＣＴ１に特異的に結合しない。
一部の例では、抗体又はその抗原結合断片は、抗菌剤、治療剤、プロドラッグ、ペプチド、タンパク質、酵素、脂質、生物学的反応修飾物質、医薬品、リンホカイン、異種抗体又はその断片、検出可能標識、ＰＥＧ、及び任意の前記薬剤の２つ以上の組み合わせからなる群から選択される薬剤にコンジュゲートされる。
一部の例では、抗体又はその抗原結合断片はサイトトキシンにコンジュゲートされる。特定の実施形態において、サイトトキシンは、ＡＺ１５０８、ＳＧ３２４９、及びＳＧ３３１５からなる群から選択される。
一部の例では、本発明は、本明細書に記載されるとおりの結合分子又はその断片をコードする核酸を含む単離ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドの組み合わせを提供する。一部の例では、本発明は、本明細書に記載されるとおりの抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸を含む単離ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドの組み合わせを提供する。
一部の例では、本発明は、本明細書に記載されるポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。一部の例では、ＶＨをコードする核酸を含むポリヌクレオチドと、ＶＬをコードする核酸を含むポリヌクレオチドとが同じベクターにある。一部の例では、ＶＨをコードする核酸を含むポリヌクレオチドと、ＶＬをコードする核酸を含むポリヌクレオチドとが異なるベクターにある。
一部の例では、本発明は、（ｉ）本明細書に記載されるとおりの結合分子又はその断片と、（ｉｉ）担体とを含む組成物を提供する。一部の例では、本発明は、（ｉ）本明細書に記載されるとおりの抗体又はその抗原結合断片と、（ｉｉ）担体とを含む組成物を提供する。一部の例では、本発明は、（ｉ）本明細書に記載されるとおりの抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸と、（ｉｉ）担体とを含む組成物を提供する。一部の例では、本発明は、（ｉ）本明細書に記載されるとおりのベクターと、（ｉｉ）担体とを含む組成物を提供する。一部の態様において、担体は薬学的に許容可能な担体である。
一部の例では、本発明は、本明細書に記載されるとおりのポリヌクレオチド、本明細書に記載されるとおりのベクター、又は本明細書に記載されるとおりの組成物を含む宿主細胞を提供する。
一部の例では、本発明は、本明細書に記載されるとおりの結合分子又は断片を作製する方法を提供し、この方法は、（ａ）本明細書に記載されるとおりの宿主細胞を培養するステップと、（ｂ）結合分子又は断片を単離するステップとを含む。一部の例では、本発明は、本明細書に記載されるとおりの抗体又は抗原結合断片を作製する方法を提供し、この方法は、（ａ）本明細書に記載されるとおりの宿主細胞を培養するステップと、（ｂ）抗体又は抗原結合断片を単離するステップとを含む。
一部の例では、本発明は、本明細書に記載されるとおりの結合分子又はその断片、又は本明細書に記載されるとおりの抗体又はその抗原結合断片を含む診断試薬又はキットを提供する。
一部の例では、ＡＳＣＴ２発現細胞に薬剤を送達する方法は、本明細書に記載されるとおりの、薬剤にコンジュゲートされた結合分子若しくは断片、又は本明細書に記載されるとおりの、薬剤にコンジュゲートされた抗体若しくはその抗原結合断片に細胞を接触させるステップを含み、ここで、薬剤は細胞によってインターナライズされる。一部の例では、薬剤は、抗菌剤、治療剤、プロドラッグ、ペプチド、タンパク質、酵素、脂質、生物学的反応修飾物質、医薬品、リンホカイン、異種抗体又はその断片、検出可能標識、ＰＥＧ、及び任意の前記薬剤の２つ以上の組み合わせからなる群から選択することができる。一部の例では、薬剤はサイトトキシンであってもよい。
一部の例では、ＡＳＣＴ２発現細胞の死滅を誘導する方法は、本明細書に記載されるとおりの、サイトトキシンにコンジュゲートされた結合分子又は断片、又は本明細書に記載されるとおりの、サイトトキシンにコンジュゲートされた抗体又はその抗原結合断片に細胞を接触させるステップを含み、ここで、サイトトキシンは細胞によってインターナライズされる。好ましい一実施形態において、サイトトキシンは、ＡＺ１５０８、ＳＧ３２４９、及びＳＧ３３１５からなる群から選択される。
一部の例では、対象におけるＡＳＣＴ２の過剰発現によって特徴付けられる疾患又は障害、例えば癌を治療する方法は、治療を必要としている対象に、本明細書に記載されるとおりの結合分子又は断片、又は本明細書に記載されるとおりの抗体又は抗原結合断片、又は本明細書に記載されるとおりの組成物の有効量を投与するステップを含む。
一部の例では、ＡＳＣＴ２の過剰発現によって特徴付けられる疾患又は障害、例えば癌を治療する方法には、固形腫瘍から血液腫瘍に及ぶまでの広範囲の癌が含まれる。治療方法についてのかかる広範囲の有効性は一般的でなく、むしろ予想外である。固形及び血液腫瘍にわたって実証された広範囲の効果に加え、本明細書に記載される発明はまた、癌幹細胞（ＣＳＣ）の存在を決定する方法及びＣＳＣが関わる治療方法でも用いることができ、これにより本明細書に記載される本発明の用途及び予想外の効果の広さが更に裏付けられる。
一部の例では、癌は、結腸直腸癌、ＨＮＳＣＣ、前立腺癌、肺癌、膵癌、黒色腫、子宮内膜癌、及び血液癌（急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ））からなる群から選択される。加えて、方法は、ＣＳＣを標的化することを含む治療を含む。好ましくは、対象はヒト対象である。
一部の例では、試料中のＡＳＣＴ２発現レベルを検出する方法が、（ａ）本明細書に記載されるとおりの結合分子又は断片、又は本明細書に記載されるとおりの抗体又は抗原結合断片、又は本明細書に記載されるとおりの組成物に前記試料を接触させるステップと、（ｂ）前記試料中のＡＳＣＴ２への結合分子又はその断片、又は抗体又はその抗原結合断片の結合を検出するステップとを含む。一部の例では、試料は細胞培養物である。一部の例では、試料は単離組織である。一部の例では、試料は、対象、好ましくはヒト対象に由来する。
図１Ａ：健常試料の骨髄と比較したＡＭＬ及びＭＭ試料の骨髄穿刺液におけるＡＳＣＴ２高発現を実証するフローサイトメトリー解析の定量化を示す。図１Ｂ：白血病幹細胞集団（ＬＳＣ）を定義する既報告のマーカーであるＣＤ３４＋／ＣＤ３８＋集団におけるＡＳＣＴ２の高発現を示す。加えて、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−、ＣＤ３４＋ＣＤ３８＋及びＣＤ３４−ＣＤ３８＋集団などの他の全てのサブタイプでＡＳＣＴ２の発現を判定した。 図１Ｃ：ＭＭ試料の形質細胞（ＰＣ；ＣＤ１３８＋／ＣＤ１９−）及び幹細胞（ＳＣ；ＣＤ１３８−／ＣＤ１９＋）におけるＡＳＣＴ２発現を示す。図１Ｄ：膵臓ＣＳＣの既報告のマーカーであるＥｐＣＡＭ＋／ＣＤ２４＋／ＣＤ４４＋細胞集団で判定したＡＳＣＴ２発現を示す。フローサイトメトリー解析は膵腫瘍におけるＣＳＣのＡＳＣＴ２高発現を示唆する。 ＡＳＣＴ２−ＰＢＤ ＡＤＣ（抗体１７ｃ１０がＳＧ３２４９にコンジュゲートされている）によるインビボ処理後の膵腫瘍におけるＣＳＣ（ＥｐＣＡＭ＋／ＣＤ２４＋／ＣＤ４４＋）集団の除去を示す。 ヒトＡＳＣＴ２を発現するプラスミドをトランスフェクトした２９３Ｆ細胞への精製ヒト抗ＡＳＣＴ２ ＩｇＧ １ｅ８、３ｆ７、５ａ２、９ｂ３、１０ｃ３、１６ｂ８、１７ｃ１０、及び１７ａ１０の結合活性の倍数変化を描くグラフを示す。 図３Ａ：陰性対照で処理（未処理）；一次抗ＡＳＣＴ２抗体１ｅ８及び１７ｃ１０で処理；サポリンにコンジュゲートした抗ＡＳＣＴ２抗体で処理；又はサポリンに連結した対照抗体（ｈＩｇＧ−サポリン）で処理したＡＳＣＴ２発現２９３Ｆ細胞の未処理対照細胞に対する相対的生存率の棒グラフを示す。図３Ｂ：Ｓｗ４８細胞におけるツブリシンＡＺ１５０８に古典的にコンジュゲートした抗ＡＳＣＴ２ １Ｅ８、抗ＡＳＣＴ２ １７Ｃ１０、及びアイソタイプ対照Ｒ３４７の細胞傷害性のグラフを示す。 フローサイトメトリーによって評価したときの、ＷｉＤｒ細胞又はＡＳＣＴ２発現のｓｈＲＮＡノックダウンを有するＷｉＤｒ細胞への抗ＡＳＣＴ２抗体１７ｃ１０及び１ｅ８の結合を描く棒グラフを示す。 図５Ａ：抗ＡＳＣＴ２抗体１７ｃ１０及びアイソタイプ対照のインターナリゼーション反応速度を示す。図５Ｂ：細胞傷害性死滅によって計測したときのＡＳＣＴ２−ＡＤＣ（ＡＺ１５０８にコンジュゲートした抗体１７ｃ１０）のインターナリゼーション反応速度を示す。細胞はそれぞれの時間にわたってＡＳＣＴ２−ＡＤＣ（１７ｃ１０−ＡＺ１５０８）でパルスした。その後、ＡＤＣを含有する培地を新鮮培地に交換し、更に４日間インキュベートした。ＣＴＧキットを使用することにより細胞生存率を計測した。用量反応曲線は未処理対照細胞に対するパーセンテージとしてプロットした。 ＡＳＣＴ２発現細胞株への抗ＡＳＣＴ２抗体１７ｃ１０及び１ｅ８、及びアイソタイプ対照Ｒ３４７の結合から得られたフローサイトメトリープロットを示す。図６Ａ、ヒト癌細胞株Ｃａｌ２７；図６Ｂ、ヒト癌細胞株ＦａＤｕ；図６Ｃ ヒト癌細胞株ＳＳＣ１５；図６Ｄ ヒト癌細胞株ＷｉＤｒ。 ＡＳＣＴ２発現細胞株への抗ＡＳＣＴ２抗体１７ｃ１０及び１ｅ８、及びアイソタイプ対照Ｒ３４７の結合から得られたフローサイトメトリープロットを示す。図６Ｅ ヒトＡＳＣＴ２を安定に発現するＣＨＯＫ１細胞；図６Ｆ ｃｙｎｏ ＡＳＣＴ２を安定に発現するＣＨＯＫ１細胞；図６Ｇ ｃｙｎｏ癌細胞株ＣｙｎｏＭＫ１；及び図６Ｈ モックトランスフェクトＣＨＯＫ１細胞。 図７Ａ：ＳＫＭＥＬ−２細胞への抗ＡＳＣＴ２抗体１７ｃ１０の結合はＡＳＣＴ１ ｓｈＲＮＡによって変化しなかったが、ＡＳＣＴ２特異的ｓｈＲＮＡノックダウン後にはこの結合が有意に低下したことを示す。図７Ｂ：抗ＡＳＣＴ２抗体ＡＤＣ（ＡＺ１５０８にコンジュゲートした抗体１７ｃ１０）の細胞傷害性死滅はＡＳＣＴ１ ｓｈＲＮＡノックダウン後には影響を受けなかったが、ＡＳＣＴ２ ｓｈＲＮＡサイレンシング後には細胞傷害性死滅の有意な低下が観察されたことを示す。全てのｓｈＲＮＡノックダウン群のデータは未処理対照に対して正規化した。 ツブリシン１５０８にコンジュゲートした抗ＡＳＣＴ２抗体１７ｃ１０（図８Ａ）及び１ｅ８（図８Ｂ）がヒト若しくはｃｙｎｏ ＡＳＣＴ２タンパク質又は無関係の受容体を発現する安定ＣＨＯ−Ｋ１細胞株に対して及ぼす細胞傷害効果を示す。 ヒトＡＳＣＴ２を発現する安定ＣＨＯ−Ｋ１細胞株（図９Ａ）；ｃｙａｎｏ ＡＳＣＴ２を発現する安定ＣＨＯ−Ｋ１細胞株（図９Ｂ）；ＡＳＣＴ２を発現する結腸直腸癌細胞ＷｉＤｒ（図９Ｃ）；及びモックトランスフェクト対照細胞（図９Ｄ）への１７ｃ１０親抗体、１７ｃ１０生殖細胞系列化抗体、及びＲ３４７アイソタイプ対照抗体の結合に関するフローサイトメトリープロットを示す。 膵癌細胞（図１０Ａ）、結腸癌細胞（図１０Ｂ）、肺癌細胞（図１０Ｃ）、ＨＮＳＣＣ癌細胞（図１０Ｄ）、前立腺癌細胞（図１０Ｅ）、及び非ＡＳＣＴ２発現細胞株（図１０Ｆ）に対するツブリシンＡＺ１５０８にコンジュゲートした抗ＡＳＣＴ２抗体１７ｃ１０及びツブリシンＡＺ１５０８にコンジュゲートしたＲ３４７アイソタイプ対照抗体で処理した癌細胞株の未処理対照細胞に対して正規化した相対的生存率（％）を示す。 図１１Ａ：ＳＧ３２４９にコンジュゲートした抗ＡＳＣＴ２抗体１７ｃ１０による、ＳＧ３２４９にコンジュゲートした対照抗体で処理した細胞に対して正規化した相対的生存率を示す。図１１Ｂ：ＳＧ３３１５にコンジュゲートした抗ＡＳＣＴ２抗体１７ｃ１０による、ＳＧ３３１５にコンジュゲートした対照抗体で処理した細胞に対して正規化した相対的生存率を示す。 ツブリシン又はＰＢＤにコンジュゲートした抗ＡＳＣＴ２抗体１７ｃ１０による治療後のＷｉＤｒ結腸直腸癌又は原発性膵癌異種移植モデルにおける腫瘍容積の経時変化を示す。図１２Ａ、１７ｃ１０抗体がツブリシン１５０８にコンジュゲートされている。 ツブリシン又はＰＢＤにコンジュゲートした抗ＡＳＣＴ２抗体１７ｃ１０による治療後のＷｉＤｒ結腸直腸癌又は原発性膵癌異種移植モデルにおける腫瘍容積の経時変化を示す。図１２Ｂ、抗ＡＳＣＴ２抗体１７ｃ１０がＳＧ ３３１５にコンジュゲートされている。 ツブリシン又はＰＢＤにコンジュゲートした抗ＡＳＣＴ２抗体１７ｃ１０による治療後のＷｉＤｒ結腸直腸癌又は原発性膵癌異種移植モデルにおける腫瘍容積の経時変化を示す。図１２Ｃ、抗ＡＳＣＴ２抗体１７ｃ１０がＳＧ ３２４９にコンジュゲートされている。 図１３Ａ：播種性ＴＦ１α ＡＭＬマウスモデルにおけるＡＳＣＴ２−ＰＢＤ ＡＤＣ（抗体１７ｃ１０がＳＧ３２４９にコンジュゲートされている）の抗腫瘍有効性を示す。ＡＤＣ及びアイソタイプ対照はＱ１Ｗ×４スケジュールで投与した。罹患率及び死亡率を毎日モニタした。ＡＤＣの全ての用量レベル（０．０５、０．１、０．２５及び０．５ｍｇ／ｋｇ）が未治療対照群と比較して生存を有意に改善した。データは、各群内における個々の動物の運命を示すカプラン・マイヤー生存プロットで提供する。図１３Ｂ：播種性ＭＭ．１Ｓ ＭＭマウスモデルにおけるＡＳＣＴ２−ＰＢＤ ＡＤＣ（抗体１７ｃ１０がＳＧ３２４９にコンジュゲートされている）の抗腫瘍有効性を示す。マウスを図１３Ａに記載されるとおりＡＤＣ又はアイソタイプ対照で治療した。罹患率及び死亡率を毎日モニタした。ＡＤＣの両方の用量レベル（０．１及び０．４ｍｇ／ｋｇ）が未治療対照群（５５．５日）と比較して生存を有意に改善した（それぞれ１１７及び１２３．５日）。データは、各群内における個々の動物の運命を示すカプラン・マイヤー生存プロットで提供する。
本発明は、ＡＳＣＴ２に特異的に結合する抗体及びその抗原結合断片を提供する。特定の実施形態において、抗体、又は抗原結合断片は、薬剤、好ましくはサイトトキシンにコンジュゲートされる。抗体及びその抗原結合断片をコードするポリヌクレオチド、そのポリヌクレオチドを含むベクター、及び抗体を発現する宿主細胞が含まれる。抗ＡＳＣＴ２抗体又はその抗原結合断片を含む組成物、及び抗ＡＳＣＴ２抗体及び抗原結合断片を作製する方法も提供される。診断適用又はＡＳＣＴ２の過剰発現によって特徴付けられる疾患又は障害、例えば癌の治療方法などにおいて新規抗ＡＳＣＴ２抗体を使用する方法が更に提供される。
本発明を更に容易に理解し得るように、初めに特定の用語を定義する。追加的な定義は詳細な説明全体を通じて示される。
Ｉ．定義
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用されるとき、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」は、文脈上特に明確に指示されない限り複数の指示対象を含む。用語「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」、並びに用語「１つ以上」及び「少なくとも１つ」は、本明細書では同義的に使用することができる。
更に、「及び／又は」は、２つの指定される特徴又は構成要素の各々の、他方を伴う又は伴わない具体的な開示と解釈されるべきである。従って、用語「及び／又は」は、「Ａ及び／又はＢ」などの語句で用いられるとき、Ａ及びＢ、Ａ又はＢ、Ａ（単独）、及びＢ（単独）を含むことが意図される。同様に、用語「及び／又は」は、「Ａ、Ｂ、及び／又はＣ」などの語句で用いられるとき、Ａ、Ｂ、及びＣ；Ａ、Ｂ、又はＣ；Ａ又はＢ；Ａ又はＣ；Ｂ又はＣ；Ａ及びＢ；Ａ及びＣ；Ｂ及びＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；及びＣ（単独）を包含することが意図される。
実施形態が語句「含む」を用いて記載される場合には常に、「からなる」及び／又は「から本質的になる」によって記載される他の点で類似の実施形態が含まれる。
特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての科学技術用語は、本発明が関係する技術分野の当業者が一般に理解するのと同じ意味を有する。例えば、Ｔｈｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（５ｔｈ ｅｄ．Ｊ．Ｍ．Ｌａｃｋｉｅ ｅｄ．，２０１３）、Ｏｘｆｏｒｄ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２ｄ ｅｄ．Ｒ．Ｃａｍｍａｃｋ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，２００８）、及びＴｈｅ Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｐ−Ｓ．Ｊｕｏ，（２ｄ ｅｄ．２００２）が、本明細書で用いられる一部の用語の一般的な定義を当業者に提供し得る。
単位、接頭辞、及び記号は、それらの国際単位系（ＳＩ）で認められている形式で示される。数値範囲は、その範囲を定義する数を含む。特に指示されない限り、アミノ酸配列は左から右にアミノからカルボキシ方向に記載する。本明細書に提供される見出しは、本明細書を全体として参照することによって有され得る本発明の種々の態様又は実施形態の限定ではない。従って、この直後に定義する用語は、本明細書を全体として参照することによって更に十全に定義される。
アミノ酸は、本明細書において、その一般に知られている三文字記号によるか、或いはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名委員会（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ）が推奨する一文字記号により参照される。ヌクレオチドも同様に、その一般に認められている一文字コードによって参照される。
用語「ＡＳＣＴ２」は、システムＡＳＣアミノ酸トランスポーター２タンパク質、及び／又はその活性断片を指す。ＡＳＣＴ２は、グルタミン、アラニン、及びセリン、システイン、及びスレオニンを含め、小さい中性アミノ酸の輸送をＮａ＋依存的に媒介する膜貫通タンパク質である。ＡＳＣＴ２のＲＮＡ、ＤＮＡ、及びアミノ酸配列は当業者に公知であり、多くのデータベース、例えば国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）のデータベースで検索することができる。ＮＣＢＩで検索されるこれらの配列の例は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００５６２８及びＮＰ＿００５６１９を有するヒトＡＳＣＴ２配列；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１２８４０５４及びＮＰ−００１２７０９８３を有するカニクイザル（マカカ・ファスキキュラリス（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ））ＡＳＣＴ２配列である。
用語「阻害する」、「遮断する」、及び「抑制する」は、本明細書では同義的に使用され、活性の完全な遮断を含め、生物学的活性の任意の統計学的に有意な減少を指す。例えば、「阻害」は、生物学的活性又はプロセスの約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％の減少を指し得る。
用語「抗体」又は「免疫グロブリン」は、本明細書で同義的に使用される。典型的な抗体は、ジスルフィド結合によって相互に接続した少なくとも２本の重（Ｈ）鎖及び２本の軽（Ｌ）鎖を含む。各重鎖は重鎖可変領域（本明細書ではＶＨと省略する）と重鎖定常領域とを含む。重鎖定常領域は３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３を含む。各軽鎖は軽鎖可変領域（本明細書ではＶＬと省略する）と軽鎖定常領域とを含む。軽鎖定常領域は１つのドメイン、Ｃｌを含む。ＶＨ及びＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＷ）と呼ばれるより保存された領域が間に入った、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域に更に細分することができる。各ＶＨ及びＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端に以下の順番：ＦＷ１、ＣＤＲ１、ＦＷ２、ＣＤＲ２、ＦＷ３、ＣＤＲ３、ＦＷ４で並んだ３つのＣＤＲと４つのＦＷとを含む。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、種々の免疫系細胞（例えば、エフェクター細胞）及び古典的補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）を含めた宿主組織又は因子に対する免疫グロブリンの結合を媒介することができる。本開示の例示的抗体には、ハイブリドーマによって産生されたマウスモノクローナル抗体１７ｃ１０及び１ｅ８、これらの抗体のヒト化された、親和性最適化された、生殖細胞系列化された、及び／又は他のバージョン、及び血清半減期が最適化された抗ＡＳＣＴ２ ＹＴＥ抗体（例えば、Ｋ４４ＶＨａ−Ｎ５６Ｑ、Ｋ４４ＶＨａ６−Ｎ５６Ｑ、又はＫ２Ｈａ−Ｎ５６Ｑ）が含まれる。
用語「生殖細胞系列化」は、抗体の特定の位置にあるアミノ酸が生殖細胞系列のものに復帰突然変異することを意味する。
用語「抗体」は、免疫グロブリン分子の可変領域内の少なくとも１つの抗原認識部位を介してタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、又は前述の組み合わせなどの標的を認識し、それに特異的に結合する免疫グロブリン分子を指し得る。本明細書で使用されるとき、用語「抗体」は、その抗体が所望の生物学的活性を呈する限りにおいて、インタクトなポリクローナル抗体、インタクトなモノクローナル抗体、抗体断片（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片など）、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）突然変異体、少なくとも２つのインタクトな抗体から作成された二重特異性抗体などの多重特異性抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗体の抗原決定部分を含む融合タンパク質、及び抗原認識部位を含む任意の他の修飾免疫グロブリン分子を包含する。抗体は、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと称されるその重鎖定常ドメインのアイデンティティに基づき、５つの主要な免疫グロブリンクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭ、又はそのサブクラス（アイソタイプ）（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）のいずれかのものであり得る。異なる免疫グロブリンクラスは異なる周知のサブユニット構造及び三次元配置を有する。抗体は、ネイキッドであってもよく、又は毒素、放射性同位体等の他の分子にコンジュゲートしてもよい。
用語「ＡＳＣＴ２抗体」、「ＡＳＣＴ２に結合する抗体」又は「抗ＡＳＣＴ２」は、その抗体がＡＳＣＴ２の標的化において治療剤又は診断試薬として有用となるように十分な親和性でＡＳＣＴ２と結合する能力を有する抗体を指す。無関係の非ＡＳＣＴ２タンパク質に対する抗ＡＳＣＴ２抗体の結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）（分析物として組換えＡＳＣＴ２及びリガンドとして抗体を使用するか、又はその逆）、ＫＩＮＥＸＡ（登録商標）、又は当該技術分野において公知の他の結合アッセイによって計測するときのＡＳＣＴ２に対するこの抗体の結合の約１０％未満である。特定の実施形態において、ＡＳＣＴ２に結合する抗体は、解離定数（ＫＤ）が≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦１０ｐＭ、≦１ｐＭ、又は≦０．１ｐＭである。
用語「抗原結合断片」はインタクトな抗体の一部分を指し、インタクトな抗体の相補性決定可変領域を指す。完全長抗体の断片は、抗体の抗原結合断片であり得る。抗体断片の例としては、限定はされないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片、線状抗体、一本鎖抗体（例えば、ＳｃＦｖ）、及び抗体断片で形成される多重特異性抗体が挙げられる。
「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）は、単一の抗原決定基又はエピトープの高度に特異的な認識及び結合に関与する均質な抗体集団を指す。これは、典型的には異なる抗原決定基に対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体と対照的である。用語「モノクローナル抗体」は、インタクトなモノクローナル抗体及び完全長モノクローナル抗体の両方、並びに抗体断片（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖなど）、単鎖（ｓｃＦｖ）変異体、抗体部分を含む融合タンパク質、及び抗原認識部位を含む任意の他の修飾免疫グロブリン分子を包含する。更に、「モノクローナル抗体」は、限定はされないが、ハイブリドーマ、ファージ選択、組換え発現、及びトランスジェニック動物を含めた、任意の方法で作製されたかかる抗体を指す。
用語「ヒト化抗体」は、最小限の非ヒト（例えば、マウス）配列を含むように改変された非ヒト（例えば、マウス）免疫グロブリンに由来する抗体を指す。典型的には、ヒト化抗体は、所望の特異性、親和性、及び能力を有する非ヒト種（例えば、マウス、ラット、ウサギ、又はハムスター）の相補性決定領域（ＣＤＲ）の残基によってＣＤＲの残基が置き換えられているヒト免疫グロブリンである（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６）。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＷ）残基が、所望の特異性、親和性、及び能力を有する非ヒト種由来の抗体の対応する残基で置き換えられる。
ヒト化抗体は、抗体の特異性、親和性、及び／又は能力を洗練して最適化するため、Ｆｖフレームワーク領域にあるか、及び／又は置き換えられた非ヒト残基内にある更なる残基の置換によって更に修飾することができる。一般に、ヒト化抗体は、非ヒト免疫グロブリンに対応するＣＤＲ領域の全て又は実質的に全てを含有する少なくとも１つ、典型的には２つ又は３つの可変ドメインの実質的に全てを含むことになり、一方、ＦＲ領域の全て又は実質的に全てはヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである。ヒト化抗体はまた、免疫グロブリン定常領域又はドメイン（Ｆｃ）、典型的にはヒト免疫グロブリンのそれの少なくとも一部分も含み得る。ヒト化抗体の作成に用いられる方法の例が、米国特許第５，２２５，５３９号明細書又は同第５，６３９，６４１号明細書に記載される。
「薬学的に許容可能な担体」は、対象にとって非毒性である活性成分以外の医薬製剤中の一成分を指す。薬学的に許容可能な担体には、限定はされないが、緩衝液、賦形剤、安定剤、又は保存剤が含まれる。本明細書で使用されるとき、「薬学的に許容可能な担体」には、生理学的に適合性であるあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収／再吸収遅延剤などが含まれる。
抗体の「可変領域」は、単独での、或いは組み合わせでの、抗体軽鎖の可変領域又は抗体重鎖の可変領域を指す。重鎖及び軽鎖の可変領域は、各々、超可変領域としても知られる、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）によってつながった４つのフレームワーク領域（ＦＷ）からなる。各鎖のＣＤＲはＦＷ領域によって近接して一体に保持されており、他方の鎖のＣＤＲと共に抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。ＣＤＲの決定には少なくとも２つの技法がある：（１）異種間配列多様性に基づく手法（即ち、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，（５ｔｈ ｅｄ．，１９９１，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｍｄ．））；及び（２）抗原抗体複合体の結晶学的研究に基づく手法（Ａｌ−ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２７３：９２７−９４８））。加えて、当該技術分野では、ＣＤＲの決定にこれらの２つの手法の組み合わせが用いられることもある。
「Ｋａｂａｔ付番方式」は、概して、可変ドメインの残基（およそ軽鎖の残基１〜１０７及び重鎖の残基１〜１１３）を参照するときに用いられる（例えば、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））。
Ｋａｂａｔにあるとおりのアミノ酸位置付番は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）における抗体の編成の重鎖可変ドメイン又は軽鎖可変ドメインに用いられる付番方式を指す。この付番方式を用いると、実際の線状アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＷ又はＣＤＲの短縮、又はそれへの挿入に対応するより少ない又は追加的なアミノ酸を含み得る。例えば、重鎖可変ドメインは、Ｈ２の残基５２の後に単一のアミノ酸挿入（Ｋａｂａｔによる残基５２ａ）を含み、及び重鎖ＦＷ残基８２の後に挿入された残基（例えば、Ｋａｂａｔによる残基８２ａ、８２ｂ、及び８２ｃ等）を含み得る。
残基のＫａｂａｔ付番は、所与の抗体について、相同性領域において抗体の配列を「標準」Ｋａｂａｔ付番配列とアラインメントすることにより決定し得る。Ｃｈｏｔｈｉａは、その代わりに構造ループの位置を参照する（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７））。Ｋａｂａｔ付番規則を用いて付番したときのＣｈｏｔｈｉａ ＣＤＲ−Ｈ１ループの末端は、ループの長さに応じてＨ３２〜Ｈ３４の間で異なる（これは、Ｋａｂａｔ付番スキームがＨ３５Ａ及びＨ３５Ｂに挿入を置くためである。３５Ａも３５Ｂも存在しない場合、ループは３２で終わり；３５Ａのみが存在する場合、ループは３３で終わり；３５Ａ及び３５Ｂの両方が存在する場合、ループは３４で終わる）。ＡｂＭ超可変領域は、Ｋａｂａｔ ＣＤＲとＣｈｏｔｈｉａ 構造ループとの妥協案に相当し、Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ’ｓ ＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアによって用いられている。以下の表１に、各方式による抗体の可変領域を含むアミノ酸の位置を掲載する。
Figure 2018535674
ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）も、ＣＤＲを含めた免疫グロブリン可変領域の付番方式を提供する。例えば、Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：５５−７７（２００３）を参照されたい。ＩＭＧＴ付番方式は、５，０００を超える配列のアラインメント、構造データ、及び超可変ループの特徴付けに基づくものであり、あらゆる種の可変領域及びＣＤＲ領域の容易な比較を可能にする。ＩＭＧＴ付番スキーマによれば、ＶＨ−ＣＤＲ１は２６〜３５位にあり、ＶＨ−ＣＤＲ２は５１〜５７位にあり、ＶＨ−ＣＤＲ３は９３〜１０２位にあり、ＶＬ−ＣＤＲ１は２７〜３２位にあり、ＶＬ−ＣＤＲ２は５０〜５２位にあり、及びＶＬ−ＣＤＲ３は８９〜９７位にある。
本明細書全体を通じて用いられるとおり、記載されるＶＨ ＣＤＲ配列は古典的Ｋａｂａｔ付番位置に対応し、即ち、Ｋａｂａｔ ＶＨ−ＣＤＲ１は３１〜３５位にあり、ＶＨ−ＣＤＲ２は５０〜６５位にあり、及びＶＨ−ＣＤＲ３は９５〜１０２位にある。ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２及びＶＬ−ＣＤＲ３も古典的Ｋａｂａｔ付番位置、即ち、２４〜３４位、５０〜５６位及び８９〜９７位に対応する。
用語「ヒト抗体」は、ヒトにおいて産生される抗体、又は当該技術分野において公知の任意の技法を用いて作製されるヒトにおいて産生される抗体に対応するアミノ酸配列を有する抗体を意味する。ヒト抗体のこの定義には、インタクトな又は完全長の抗体、その断片、及び／又は少なくとも１つのヒト重鎖及び／又は軽鎖ポリペプチドを含む抗体、例えば、マウス軽鎖及びヒト重鎖ポリペプチドを含む抗体などが含まれる。
用語「キメラ抗体」は、免疫グロブリン分子のアミノ酸配列が２つ以上の種に由来する抗体を指す。典型的には、軽鎖及び重鎖の両方の可変領域が、所望の特異性、親和性、及び能力を有する哺乳動物の１つの種（例えば、マウス、ラット、ウサギ等）に由来する抗体の可変領域に対応し、一方、定常領域が、別のもの（通常、ヒト）に由来する抗体の配列と同種であり、その種における免疫応答の誘発が回避される。
用語「ＹＴＥ」又は「ＹＴＥ突然変異体」は、ヒトＦｃＲｎへの結合の増加をもたらし、且つこの突然変異を有する抗体の血清半減期を改善するＩｇＧ１ Ｆｃ内の突然変異を指す。ＹＴＥ突然変異体は、ＩｇＧ１の重鎖に導入された３つの突然変異の組み合わせ、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ（ＥＵ付番、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｕ．Ｓ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）を含む。米国特許第７，６５８，９２１号明細書（参照により本明細書に援用される）を参照されたい。ＹＴＥ突然変異体は、同じ抗体の野生型バージョンと比較したときに抗体の血清半減期を約４倍増加させることが示されている（Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８１：２３５１４−２４（２００６）；Ｒｏｂｂｉｅ ｅｔ ａｌ．，（２０１３）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．５７，６１４７−６１５３）。米国特許第７，０８３，７８４号明細書（本明細書によって全体として参照により援用される）も参照されたい。
「結合親和性」は、概して、分子（例えば、抗体）の単一の結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）との間の非共有結合性相互作用の総和の強度を指す。特に指示がない限り、本明細書で使用されるとき、「結合親和性」は、結合対（例えば、抗体と抗原）のメンバー間の１：１相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は、概して解離定数（ＫＤ）によって表すことができる。親和性は、本明細書に記載されるものを含め、当該技術分野において公知の一般的な方法によって計測することができる。低親和性抗体は、概して抗原に緩徐に結合し、容易に解離する傾向があり、一方、高親和性抗体は、概して抗原に速やかに結合し、結合したまま長く留まる傾向がある。結合親和性を計測する種々の方法が当該技術分野において公知であり、本発明の目的上、そのいずれを用いることもできる。
結合分子の効力は、通常、特に指定されない限りｎｇ／ｍｌ単位のＩＣ５０値として表現される。ＩＣ５０は、抗体分子の阻害濃度中央値である。機能アッセイでは、ＩＣ５０は、生物学的反応をその最大値の５０％低下させる濃度である。リガンド結合試験では、ＩＣ５０は、受容体結合を最大特異的結合レベルの５０％低下させる濃度である。ＩＣ５０は、当該技術分野において公知の任意の手段によって計算することができる。
参照抗体と比較したときの本発明の抗体又はポリペプチドの効力の改善倍数は、少なくとも約２倍、少なくとも約４倍、少なくとも約６倍、少なくとも約８倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約６０倍、少なくとも約７０倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約９０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約１１０倍、少なくとも約１２０倍、少なくとも約１３０倍、少なくとも約１４０倍、少なくとも約１５０倍、少なくとも約１６０倍、少なくとも約１７０倍、又は少なくとも約１８０倍又はそれを超えることができる。
抗体の結合力価は、通常、特に指定されない限りｎＭ又はｐＭ単位でＥＣ５０値として表される。ＥＣ５０は、ベースラインと指定曝露時間後の最大値との間の反応中央値を誘導する薬物濃度である。ＥＣ５０は、当該技術分野において公知の幾つもの手段によって計算することができる。
「治療用抗体」は、疾患又は病態を治療又は予防するために対象に投与され得るものである。「対象」は、診断、予後判定、又は療法が所望される任意の個体、特に哺乳類である。哺乳類対象には、ヒト、家畜、農業動物、競技動物、及び動物園動物、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ウシ等が含まれる。
「治療する」とは、診断された病的状態又は障害を治癒し、それを減速させ、その症状を軽くし、及び／又はその進行を止める療法的手段を指す。従って、治療を必要としている者には、既に障害を有する者が含まれる。特定の実施形態において、患者が疾患又は障害に関連する症状の例えば全面的な、部分的な、又は一過性の軽減又は消失を示した場合、その対象は疾患又は障害、例えば癌に関して本明細書に提供される方法により成功裏に「治療される」。
「予防する」とは、標的とする病的状態又は障害の発生を防止し及び／又は遅らせる予防的又は防御的手段を指す。従って、予防を必要としている者には、障害に罹り易い又は障害に対する感受性が高い者が含まれる。特定の実施形態において、疾患又は障害は、本発明の方法に供されていない患者と比べて、患者が一過性に又は永久に発症する疾患又は障害に関連する症状が例えば少ない又はその重症度が低い、或いは疾患又は障害に関連する症状が遅発する場合、本明細書に提供される方法により成功裏に予防される。
用語「医薬組成物」は、活性成分の生物学的活性が有効であることが可能な形態の、且つその組成物が投与される対象にとって許容できないほど高毒性の追加の構成成分を含有しない製剤を指す。かかる組成物は無菌であってもよく、生理食塩水などの薬学的に許容可能な担体を含み得る。好適な医薬組成物は、緩衝液（例えば、酢酸塩、リン酸塩又はクエン酸塩緩衝液）、界面活性剤（例えば、ポリソルベート）、安定化剤（例えば、ヒトアルブミン）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール）、及びバイオアベイラビリティを促進する吸収促進剤の１つ以上、及び／又は他の従来の可溶化剤又は分散剤を含み得る。
本明細書に開示されるとおりの抗体の「有効量」は、具体的に挙げられる目的を実行するのに十分な量である。「有効量」は、挙げられる目的との関連で、実験的に及び常法で決定することができる。
「標識」は、「標識された」結合分子又は抗体を作成するため結合分子又は抗体に直接又は間接的にコンジュゲートされる検出可能な化合物又は組成物を指す。標識は、それ自体が検出可能であってもよく（例えば、放射性同位元素標識又は蛍光標識）、又は酵素標識の場合、検出可能な基質化合物又は組成物の化学的変化を触媒することができる。
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」は、本明細書では、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指して同義的に使用される。ポリマーは線状又は分枝状であってもよく、それは修飾アミノ酸を含んでもよく、且つ非アミノ酸がそれを分断していてもよい。これらの用語はまた、天然で又は介入によって修飾されている（例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、又は任意の他の操作又は修飾、例えば標識成分とのコンジュゲーションなど）アミノ酸ポリマーも包含する。また、この定義内には、例えば、アミノ酸の１つ以上の類似体（例えば、非天然アミノ酸等を含む）、並びに当該技術分野において公知の他の修飾を含有するポリペプチドも含まれる。特定の実施形態において、ポリペプチドは単鎖又は会合鎖として存在し得る。
「ポリヌクレオチド」は、本明細書で使用されるとき、１つ以上の「核酸」、「核酸分子」、又は「核酸配列」を含むことができ、任意の長さのヌクレオチドの重合体を指し、且つＤＮＡ及びＲＮＡが含まれる。ポリヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾ヌクレオチド又は塩基、及び／又はこれらの類似体、又はＤＮＡ若しくはＲＮＡポリメラーゼによって重合体に組み込むことのできる任意の基質であり得る。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチド及びその類似体など、修飾ヌクレオチドを含み得る。前述の説明は、ＲＮＡ及びＤＮＡを含め、本明細書において言及される全てのポリヌクレオチドに適用される。
用語「ベクター」は、１つ以上の目的の遺伝子又は配列を宿主細胞に送達し、及び一部の実施形態では発現する能力を有する構築物を意味する。ベクターの例としては、限定はされないが、ウイルスベクター、ネイキッドＤＮＡ又はＲＮＡ発現ベクター、プラスミド、コスミド又はファージベクター、カチオン性縮合剤に会合したＤＮＡ又はＲＮＡ発現ベクター、リポソームに封入されたＤＮＡ又はＲＮＡ発現ベクター、及びプロデューサー細胞などの特定の真核細胞が挙げられる。
「単離されている」ポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、又は組成物は、天然には見られない形態のポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、又は組成物である。単離されているポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞又は組成物には、もはや天然に見られる形態ではなくなる程度まで精製されているものが含まれる。一部の実施形態において、単離されている抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、又は組成物は実質的に純粋である。
２つ以上の核酸又はポリペプチドに関連して、用語「同一の」又はパーセント「同一性」は、最大の一致となるように比較及びアラインメント（必要に応じてギャップを導入して）したとき、いかなる保存的アミノ酸置換も配列同一性の一部として考慮することなく、同じであるか、又は指定される割合の同じであるヌクレオチド又はアミノ酸残基を有する２つ以上の配列又は部分配列を指す。パーセント同一性は配列比較ソフトウェア又はアルゴリズムを用いるか、又は目視検査によって計測することができる。アミノ酸配列又はヌクレオチド配列のアラインメントを達成するために用い得る様々なアルゴリズム及びソフトウェアが当該技術分野において公知である。
配列アラインメントアルゴリズムの１つのかかる非限定的な例は、Ｋａｒｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：５８７３−５８７７（１９９３）によって修正され、且つＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２（１９９１）））に組み込まれた、Ｋａｒｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：２２６４−２２６８（１９９０）に記載されるアルゴリズムである。特定の実施形態では、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２（１９９７）によって記載されるとおり、ギャップ付きＢＬＡＳＴを用いることができる。ＢＬＡＳＴ−２、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：４６０−４８０（１９９６））、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ−２（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ、Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）が、配列のアラインメントに用いることのできる更なる公的に利用可能なソフトウェアプログラムである。特定の実施形態において、２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、ＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラムを用いて（例えば、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰ行列及びギャップ加重４０、５０、６０、７０、又は９０及び長さ加重１、２、３、４、５、又は６を使用して）決定される。特定の代替的実施形態において、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４−４５３（１９７０））のアルゴリズムを組み込むＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラムを用いて２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントを（例えば、ＢＬＯＳＵＭ ６２行列又はＰＡＭ２５０行列のいずれか、及びギャップ加重１６、１４、１２、１０、８、６、又は４及び長さ加重１、２、３、４、５を使用して）決定することができる。或いは、特定の実施形態において、ヌクレオチド又はアミノ酸配列間の同一性パーセントは、Ｍｙｅｒｓ ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒ（ＣＡＢＩＯＳ ４：１１−１７（１９８９））のアルゴリズムを用いて決定される。例えば、同一性パーセントは、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）を用いて、及び残基テーブルのＰＡＭ１２０、１２のギャップ長ペナルティ及び４のギャップペナルティを使用して決定することができる。当業者は、特定のアラインメントソフトウェアによる最大限のアラインメントに適切なパラメータを決定することができる。特定の実施形態において、アラインメントソフトウェアのデフォルトパラメータが使用される。
特定の実施形態において、第１のアミノ酸配列の第２の配列アミノ酸に対するパーセンテージ同一性「Ｘ」は、１００×（Ｙ／Ｚ）（式中、Ｙは、第１及び第２の配列のアラインメント（目視検査によるか、又は特定の配列アラインメントプログラムによってアラインメントしたとき）において同一のマッチとしてスコア化されるアミノ酸残基の数であり、Ｚは、第２の配列の残基の総数である）として計算される。第１の配列の長さが第２の配列より長い場合、第１の配列の第２の配列に対するパーセント同一性は第２の配列の第１の配列に対するパーセント同一性より高くなる。
「保存的アミノ酸置換」は、あるアミノ酸残基が、同様の側鎖を有する別のアミノ酸残基に置き換えられているものである。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分枝側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含め、当該技術分野において定義されている。例えば、フェニルアラニンのチロシンとの置換は保存的置換である。特定の実施形態において、本発明の結合分子、抗体、及び抗原結合断片のアミノ酸配列における保存的置換は、そのアミノ酸配列を含有する結合分子、抗体、又は抗原結合断片による１つ又は複数の抗原、即ちその結合分子、抗体、又は抗原結合断片が結合するＡＳＣＴ２への結合を無効にしない。抗原結合性を消失させないヌクレオチド及びアミノ酸保存的置換を同定する方法は当該技術分野において周知である。例えば、Ｂｒｕｍｍｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２：１１８０−１ １８７（１９９３）；Ｋｏｂａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１２（１０）：８７９−８８４（１９９９）；Ｂｕｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：．４１２−４１７（１９９７）を参照されたい。
ＩＩ．抗ＡＳＣＴ２抗体及び抗原結合断片
本発明は、ＡＳＣＴ２に特異的に結合する抗ＡＳＣＴ２抗体及びその抗原結合断片を提供する。ヒト及びカニクイザルＡＳＣＴ２の完全長アミノ酸（ａａ）及びヌクレオチド（ｎｔ）配列は当該技術分野において公知であり、少なくとも、国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）データベースで検索することができる。ＮＣＢＩデータベースはオンラインで利用可能である。一部の実施形態において、本明細書に提供される抗ＡＳＣＴ２抗体又はその抗原結合断片はヒト化抗体又はヒト抗体である。一部の実施形態において、抗ＡＳＣＴ２抗体はサイトトキシンにコンジュゲートされ、従って抗ＡＳＴＣ２ ＡＤＣと称される。
一部の実施形態において、本発明の抗ＡＳＣＴ２抗体は細胞の表面上のＡＳＣＴ２に結合し、細胞にインターナライズされる。一部の実施形態において、抗ＡＳＣＴ２抗体はＡＳＣＴ２発現細胞に約１００ｎｇ／ｍｌ〜約１μｇ／ｍｌ、約１００ｎｇ／ｍｌ〜約５００ｎｇ／ｍｌ、約１００ｎｇ／ｍｌ〜約２５０ｎｇ／ｍｌ、約２５０ｎｇ／ｍｌ〜約５００ｎｇ／ｍｌ、約３５０ｎｇ／ｍｌ〜約４５０ｎｇ／ｍｌ、約５００ｎｇ／ｍｌ〜約１μｇ／ｍｌ、約５００ｎｇ／ｍｌ〜約７５０ｎｇ／ｍｌ、約７５０ｎｇ／ｍｌ〜約８５０ｎｇ／ｍｌ、又は約９００ｎｇ／ｍｌ〜約１μｇ／ｍｌの１０分時ＩＣ５０でインターナライズされる。一部の実施形態において、抗ＡＳＣＴ２抗体はＡＳＣＴ２発現細胞に約１００ｎｇ／ｍｌ〜約１μｇ／ｍｌ、約１００ｎｇ／ｍｌ〜約５００ｎｇ／ｍｌ、約１００ｎｇ／ｍｌ〜約２５０ｎｇ／ｍｌ、約２５０ｎｇ／ｍｌ〜約５００ｎｇ／ｍｌ、約２５０ｎｇ／ｍｌ〜約３５０ｎｇ／ｍｌ、約３５０ｎｇ／ｍｌ〜約４５０ｎｇ／ｍｌ、約５００ｎｇ／ｍｌ〜約１μｇ／ｍｌ、約５００ｎｇ／ｍｌ〜約７５０ｎｇ／ｍｌ、約７５０ｎｇ／ｍｌ〜約８５０ｎｇ／ｍｌ、又は約９００ｎｇ／ｍｌ〜約１μｇ／ｍｌの３０分時ＩＣ５０でインターナライズされる。一部の実施形態において、抗ＡＳＣＴ２抗体はＡＳＣＴ２発現細胞に約５０ｎｇ／ｍｌ〜約５００ｎｇ／ｍｌ、約５０ｎｇ／ｍｌ〜約１００ｎｇ／ｍｌ、約１００ｎｇ／ｍｌ〜約２００ｎｇ／ｍｌ、約２００ｎｇ／ｍｌ〜約３００ｎｇ／ｍｌ、約３００ｎｇ／ｍｌ〜約４００ｎｇ／ｍｌ、又は約４００ｎｇ／ｍｌ〜約５００ｎｇ／ｍｌの１２０分時ＩＣ５０でインターナライズされる。一部の実施形態において、抗ＡＳＣＴ２抗体はＡＳＣＴ２発現細胞に約５ｎｇ／ｍｌ〜約２５０ｎｇ／ｍｌ、約１０ｎｇ／ｍｌ〜約２５ｎｇ／ｍｌ、約２５ｎｇ／ｍｌ〜約５０ｎｇ／ｍｌ、約５０ｎｇ／ｍｌ〜約１００ｎｇ／ｍｌ、約１００ｎｇ／ｍｌ〜約１５０ｎｇ／ｍｌ、約１５０ｎｇ／ｍｌ〜約２００ｎｇ／ｍｌ、又は約２００ｎｇ／ｍｌ〜約２５０ｎｇ／ｍｌの８時間時ＩＣ５０でインターナライズされる。一部の例では、サイトトキシンにコンジュゲートした抗ＡＳＣＴ２抗体が抗ＡＳＣＴ２ ＡＤＣである。
特定の態様において、本開示は、３つの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）と３つの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）とを含む抗ＡＳＣＴ２抗体又はその抗原結合断片を提供する。特定の態様において、ＨＣＤＲ１は、配列番号１０及び配列番号１６から選択されるアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ２は、配列番号２２、配列番号１１、及び配列番号１７から選択されるアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ３は、配列番号２３、配列番号１２、及び配列番号１８から選択されるアミノ酸配列を有し、ＬＣＤＲ１は、配列番号１３及び配列番号１９から選択されるアミノ酸配列を有し、ＬＣＤＲ２は、配列番号１４、配列番号２０、及び配列番号２４から選択されるアミノ酸配列を有し、ＬＣＤＲ３は、配列番号１５、配列番号２１、及び配列番号２５から選択されるアミノ酸配列を有する。本明細書に提供されるとおり、ＶＨは配列番号１又は配列番号５のアミノ酸配列を含み、且つＶＬは配列番号２又は配列番号６のアミノ酸配列を含む。一部の態様において、抗ＡＳＣＴ２抗体は、配列番号５のアミノ酸配列のＶＨと配列番号６のアミノ酸配列のＶＬとを含む。任意選択で、抗ＡＳＣＴ２抗体は、配列番号３又は配列番号７のアミノ酸配列のＶＨと、配列番号４又は配列番号８のアミノ酸配列のＶＬとを含む。一部の実施形態において、抗ＡＳＣＴ２抗体は、配列番号７のアミノ酸配列のＶＨと配列番号８のアミノ酸配列のＶＬとを含む。
更に、本開示は、ＶＨとＶＬとを含むＡＳＣＴ２に特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片を提供し、このＶＨ及びＶＬは、参照アミノ酸配列のそれぞれ配列番号１及び配列番号２、配列番号３及び配列番号４、配列番号５及び配列番号６、又は配列番号７及び配列番号８と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％同一のアミノ酸配列をそれぞれ含有する。
一態様において、本開示は、ＶＨアミノ酸配列の配列番号５とＶＬアミノ酸配列の配列番号６とを含む抗ＡＳＣＴ２抗体又はその抗原結合断片を提供する。一態様において、本開示は、ＶＨアミノ酸配列の配列番号７とＶＬアミノ酸配列の配列番号８とを含む抗ＡＳＣＴ２抗体又はその抗原結合断片を提供する。
本明細書に記載されるとおりの抗ＡＳＣＴ２抗体又はその抗原結合断片は、例えば、マウス抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、多重特異性抗体、又はこれらの任意の組み合わせであってもよい。抗ＡＳＣＴ２抗体抗原結合断片は、Ｆｖ断片、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ’断片、ｄｓＦｖ断片、ｓｃＦｖ断片、又はｓｃ（Ｆｖ）２断片であってもよい。
一態様において、本開示は、種をまたがってＡＳＣＴ２分子に結合することのできる抗ＡＳＣＴ２抗体又はその抗原結合断片を提供し、例えば、本抗体又は断片は、マウスＡＳＣＴ２、ラットＡＳＣＴ２、ウサギＡＳＣＴ２、ヒトＡＳＣＴ２及び／又はカニクイザルＡＳＣＴ２に結合することができる。例えば、本抗体又は断片は、ヒトＡＳＣＴ２及びカニクイザルＡＳＣＴ２に結合することができる。更なる例において、本抗体又は断片はまた、マウスＡＳＣＴ２にも結合することができる。
本明細書に提供される特定の実施形態において、抗ＡＳＣＴ２抗体又はその抗原結合断片はＡＳＣＴ２、例えばヒトＡＳＣＴ２及びカニクイザルＡＳＣＴ２に特異的に結合することができ、しかし、ヒトＡＳＣＴ１には特異的に結合しない。
本明細書に記載されるとおりの抗ＡＳＣＴ２抗体又はその抗原結合断片は、ＶＨ及びＶＬに加えて、重鎖定常領域又はその断片を含み得る。特定の態様において、重鎖定常領域はヒト重鎖定常領域、例えばヒトＩｇＧ定常領域、例えばヒトＩｇＧ１定常領域である。一部の実施形態において、特に抗体又はその抗原結合断片が細胞傷害剤などの薬剤にコンジュゲートされる場合、ＩｇＧ１のＣＨ２領域のアミノ酸Ｓ２３９及びＶ２４０間にシステイン残基が挿入される。このシステインは「２３９挿入」又は「２３９ｉ」と称される。
特定の態様において、重鎖定常領域又はその断片、例えば、ヒトＩｇＧ定常領域又はその断片は、野生型ＩｇＧ定常ドメインと比べて１つ以上のアミノ酸置換を含むことができ、ここで、修飾されたＩｇＧは、野生型ＩｇＧ定常ドメインを有するＩｇＧの半減期と比較して増加した半減期を有する。例えば、ＩｇＧ定常ドメインは、位置２５１〜２５７、２８５〜２９０、３０８〜３１４、３８５〜３８９、及び４２８〜４３６［アミノ酸位置の付番は、Ｋａｂａｔに規定されるとおりのＥＵインデックスに従う］にアミノ酸残基の１つ以上のアミノ酸置換を含むことができる。特定の態様において、ＩｇＧ定常ドメインは、Ｋａｂａｔ位置２５２のアミノ酸のチロシン（Ｙ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、又はスレオニン（Ｔ）による置換、Ｋａｂａｔ位置２５４のアミノ酸のスレオニン（Ｔ）による置換、Ｋａｂａｔ位置２５６のアミノ酸のセリン（Ｓ）、アルギニン（Ｒ）、グルタミン（Ｑ）、グルタミン酸（Ｅ）、アスパラギン酸（Ｄ）、又はスレオニン（Ｔ）による置換、Ｋａｂａｔ位置２５７のアミノ酸のロイシン（Ｌ）による置換、Ｋａｂａｔ位置３０９のアミノ酸のプロリン（Ｐ）による置換、Ｋａｂａｔ位置３１１のアミノ酸のセリン（Ｓ）による置換、Ｋａｂａｔ位置４２８のアミノ酸のスレオニン（Ｔ）、ロイシン（Ｌ）、フェニルアラニン（Ｆ）、又はセリン（Ｓ）による置換、Ｋａｂａｔ位置４３３のアミノ酸のアルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）、イソロイシン（Ｉ）、プロリン（Ｐ）、又はグルタミン（Ｑ）による置換、又はＫａｂａｔ位置４３４のアミノ酸のトリプトファン（Ｗ）、メチオニン（Ｍ）、セリン（Ｓ）、ヒスチジン（Ｈ）、フェニルアラニン（Ｆ）、又はチロシンによる置換の１つ以上を含むことができる。より具体的には、ＩｇＧ定常ドメインは、Ｋａｂａｔ位置２５２のアミノ酸のチロシン（Ｙ）による置換、Ｋａｂａｔ位置２５４のアミノ酸のスレオニン（Ｔ）による置換、及びＫａｂａｔ位置２５６のアミノ酸のグルタミン酸（Ｅ）による置換を含め、野生型ヒトＩｇＧ定常ドメインと比べてアミノ酸置換を含有することができる。本開示は、重鎖がヒトＩｇＧ１ ＹＴＥ突然変異体である抗ＡＳＣＴ２抗体又はその抗原結合断片を提供する。
例えば上記に記載したとおりの、本明細書に提供される抗ＡＳＣＴ２抗体又はその抗原結合断片は、ＶＨ及びＶＬ、及び任意選択で重鎖定常領域又はその断片に加えて、軽鎖定常領域又はその断片を含み得る。特定の態様において、軽鎖定常領域はκλ軽鎖定常領域、例えば、ヒトκ定常領域又はヒトλ定常領域である。
上述のとおり、ＶＨ及び／又はＶＬアミノ酸配列は、例えば、本明細書に示される配列と８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の類似性であってもよく、及び／又は本明細書に示される配列と比べて１、２、３、４、５個又はそれを超える置換、例えば保存的置換を含んでもよい。ＶＨ領域又はＶＬ領域と特定のパーセント類似性を有するＶＨ及びＶＬ領域を有する、又は１つ以上の置換、例えば保存的置換を有するＡＳＣＴ２抗体は、本明細書に記載されるＶＨ及び／又はＶＬ領域をコードする核酸分子の突然変異誘発（例えば、部位特異的又はＰＣＲ媒介性突然変異誘発）、及び続くコードされた改変抗体のＡＳＣＴ２への結合に関する試験、並びに任意選択で、本明細書に記載される機能アッセイを用いた機能の保持に関する試験によって得ることができる。
抗原に対する抗体の親和性又はアビディティは、当該技術分野において周知の任意の好適な方法、例えば、フローサイトメトリー、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、又はラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、又は反応速度（例えば、ＫＩＮＥＸＡ（登録商標）又はＢＩＡＣＯＲＥ（商標）分析）を用いて実験的に決定することができる。直接結合アッセイ並びに競合的結合アッセイフォーマットは、容易に用いることができる。（例えば、Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ａｎｔｉｇｅｎ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ，Ｉｎ Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．，Ｅｄ．，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９８４）；Ｋｕｂｙ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９９２）；及び本明細書に記載される方法を参照されたい。）特定の抗体抗原相互作用の親和性計測値は、異なる条件下（例えば、塩濃度、ｐＨ、温度）で計測した場合に異なり得る。従って、親和性及び他の抗原結合パラメータ（例えば、ＫＤ又はＫｄ、Ｋｏｎ、Ｋｏｆｆ）の計測は、抗体及び抗原の標準化した溶液、及び当該技術分野において公知のとおりの標準化した緩衝液で行われる。
一部の実施形態において、抗ＡＳＣＴ２抗体又はその抗原結合断片は、フローサイトメトリーによって計測したとき、約５００ｎＭ未満、約３５０ｎＭ未満、約２５０ｎＭ未満、約１５０ｎＭ未満、約１００ｎＭ未満、約７５ｎＭ未満、約６０ｎＭ未満、約５０ｎＭ未満、約４０ｎＭ未満、約３０ｎＭ未満、約２０ｎＭ未満、約１５ｎＭ未満、約１０ｎＭ未満、約５ｎＭ未満、約１ｎＭ未満、約５００ｐＭ未満、約３５０ｐＭ未満、約２５０ｐＭ未満、約１５０ｐＭ未満、約１００ｐＭ未満、約７５ｐＭ未満、約６０ｐＭ未満、約５０ｐＭ未満、約４０ｐＭ未満、約３０ｐＭ未満、約２０ｐＭ未満、約１５ｐＭ未満、約１０ｐＭ未満、又は約５ｐＭ未満のＩＣ５０でＡＳＣＴ２発現細胞に結合することができる。
ＩＩＩ．抗ＡＳＣＴ２抗体及びその抗原結合断片と同じエピトープに結合する結合分子
特定の実施形態において、本開示は、本明細書に記載される抗ＡＳＣＴ２抗体が結合するのと同じエピトープに結合する抗ＡＳＣＴ２抗体を提供する。用語「エピトープ」は、本発明の抗体との結合能を有する標的タンパク質決定基を指す。エピトープは、通常、アミノ酸又は糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面基からなり、通常、特異的な三次元構造特性、並びに特異的な電荷特性を有する。立体エピトープと非立体エピトープとは、変性溶媒の存在下で前者への結合は失われるが、後者への結合は失われない点で区別される。かかる抗体は、本明細書において標準的なＡＳＣＴ２結合又は活性アッセイに記載されるものなど、抗体と交差競合する（例えば、それの結合を統計学的に有意な形で競合的に阻害する）その能力に基づき同定することができる。
従って、一実施形態において、本発明は、ＡＳＣＴ２への結合に関してマウスモノクローナル抗体１７ｃ１０又は１ｅ８などの本発明の別の抗ＡＳＣＴ２抗体又はその抗原結合断片、又は本明細書に開示されるとおりのヒト化変異体と競合する抗ＡＳＣＴ２抗体及びその抗原結合断片、例えばモノクローナル抗体を提供する。ある試験抗体が例えば１７ｃ１０又は１ｅ８の結合を阻害する能力は、その試験抗体がＡＳＣＴ２への結合に関してその抗体と競合し得ることを実証するものである。かかる抗体は、非限定的な理論によれば、それが競合する抗ＡＳＣＴ２抗体又はその抗原結合断片とＡＳＣＴ２上の同じ又は関連する（例えば、構造的に類似の、又は空間的に近接した）エピトープに結合することができる。一実施形態において、例えばマウスモノクローナル抗体１７ｃ１０又は１ｅ８とＡＳＣＴ２上の同じエピトープに結合する抗ＡＳＣＴ２抗体又はその抗原結合断片である。
ＩＶ．抗ＡＳＣＴ２抗体及び抗原結合断片の調製
モノクローナル抗ＡＳＣＴ２抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５（１９７５）によって記載されるものなどのハイブリドーマ法を用いて調製することができる。ハイブリドーマ法の使用では、マウス、ハムスター、又は他の適切な宿主動物を上記に記載したとおり免疫し、免疫抗原に特異的に結合し得る抗体のリンパ球による産生を誘発する。リンパ球はまた、インビトロで免疫することもできる。免疫後、リンパ球を単離し、例えばポリエチレングリコールを使用して好適な骨髄腫細胞株と融合することによりハイブリドーマ細胞を形成し、次にそこから未融合のリンパ球及び骨髄腫細胞を選択によって除くことができる。次に、免疫沈降、免疫ブロット法によるか、又はインビトロ結合アッセイ、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）若しくは酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって決定するとき選択の抗原を特異的に対象とするモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを、標準方法を用いたインビトロ培養か（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８６）、或いは動物の腹水腫瘍としてインビボで増殖させることができる。次に、公知の方法を使用してモノクローナル抗体を培養培地又は腹水から精製することができる。
或いは、抗ＡＳＣＴ２モノクローナル抗体はまた、米国特許第４，８１６，５６７号明細書に記載されるとおり組換えＤＮＡ方法を用いて作製することもできる。成熟Ｂ細胞又はハイブリドーマ細胞から、その抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子を特異的に増幅するオリゴヌクレオチドプライマーを使用したＲＴ−ＰＣＲによるなどして、モノクローナル抗体をコードするポリヌクレオチドを単離し、従来の手順を用いてその配列を決定する。次に、重鎖及び軽鎖をコードする単離ポリヌクレオチドを好適な発現ベクターにクローニングし、本来免疫グロブリンタンパク質を産生しない大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、又は骨髄腫細胞などの宿主細胞にその発現ベクターをトランスフェクトすると、宿主細胞によってモノクローナル抗体が生成される。また、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２−５５４（１９９０）；Ｃｌａｒｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）；及びＭａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９１）に記載されるとおり、所望の種のＣＤＲを発現するファージディスプレイライブラリから、所望の種の組換え抗ＡＳＣＴ２モノクローナル抗体又はその抗原結合断片を単離することもできる。
抗ＡＳＣＴ２抗体又はその抗原結合断片をコードするポリヌクレオチドは、組換えＤＮＡ技術を用いた何らかの種々の方法で更に修飾することができ、それにより代替的な抗体を作成し得る。一部の実施形態では、例えばマウスモノクローナル抗体の軽鎖及び重鎖の定常ドメインが、（１）例えばヒト抗体のそれらの領域に置換されてキメラ抗体が作成されるか、又は（２）非免疫グロブリンポリペプチドに置換されて融合抗体が作成され得る。一部の実施形態では、定常領域がトランケートされるか、又は除去されて、モノクローナル抗体の所望の抗体断片が作成される。可変領域の部位特異的又は高密度突然変異誘発を用いてモノクローナル抗体の特異性、親和性等を最適化することができる。
特定の実施形態において、抗ＡＳＣＴ２抗体又はその抗原結合断片はヒト抗体又はその抗原結合断片である。ヒト抗体は、当該技術分野において公知の様々な技法を用いて直接調製することができる。インビトロで免疫されるか、又は標的抗原に対する抗体を産生する免疫された個体から単離された固定化ヒトＢリンパ球を作成することができる。例えば、Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，ｐ．７７（１９８５）；Ｂｏｅｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７（１）：８６−９５（１９９１）；米国特許第５，７５０，３７３号明細書を参照されたい。
また、例えば、Ｖａｕｇｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４：３０９−３１４（１９９６）；Ｓｈｅｅｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５：６１５７−６１６２（１９９８）；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：３８１（１９９１）；及びＭａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１（１９９１）に記載されるとおり、抗ＡＳＣＴ２ヒト抗体又はその抗原結合断片はファージライブラリから選択することもでき、ここで、そのファージライブラリはヒト抗体を発現する）。抗体ファージライブラリを作成及び使用する技術は、米国特許第５，９６９，１０８号明細書、同第６，１７２，１９７号明細書、同第５，８８５，７９３号明細書、同第６，５２１，４０４号明細書；同第６，５４４，７３１号明細書；同第６，５５５，３１３号明細書；同第６，５８２，９１５号明細書；同第６，５９３，０８１号明細書；同第６，３００，０６４号明細書；同第６，６５３，０６８号明細書；同第６，７０６，４８４号明細書；及び同第７，２６４，９６３号明細書；及びＲｏｔｈｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．３７６：１１８２−１２００（２００８）（これらの各々は、全体として参照により援用される）にも記載されている。
親和性成熟戦略及びチェインシャッフリング戦略が当該技術分野において公知であり、高親和性ヒト抗体又はその抗原結合断片の作成に用いることができる。Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：７７９−７８３（１９９２）（これは全体として参照により援用される）を参照されたい。
一部の実施形態において、抗ＡＳＣＴ２モノクローナル抗体はヒト化抗体であってもよい。非ヒト又はヒト抗体の改変、ヒト化又はリサーフェシング方法も用いることができ、当該技術分野において周知である。ヒト化抗体、リサーフェシング抗体、又は同様の改変抗体は、非ヒト、例えば、限定はされないが、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長類又は他の哺乳動物である供給源由来の１つ以上のアミノ酸残基を有し得る。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば「インポート」残基と称される残基によって置き換えられ、インポート残基は、典型的には既知のヒト配列の「インポート」可変、定常又は他のドメインから取られる。かかるインポートされた配列を用いて、免疫原性を低減し、又は結合性、親和性、ｏｎ速度、ｏｆｆ速度、アビディティ、特異性、半減期、若しくは当該技術分野において公知のとおりの任意の他の好適な特性を低減し、増強し、若しくは変更することができる。一般に、ＡＳＣＴ２結合への影響としては、ＣＤＲ残基が直接的且つ最も実質的に関与する。従って、非ヒト又はヒトＣＤＲ配列の一部又は全てを維持する一方で、可変領域及び定常領域の非ヒト配列はヒト又は他のアミノ酸に置き換えることができる。
抗体はまた、任意選択で、抗原ＡＳＣＴ２に対する高親和性及び他の有利な生物学的特性を保持しつつ改変されたヒト化抗体、リサーフェシング抗体、改変抗体又はヒト抗体であってもよい。この目標を達成するため、任意選択で、ヒト化（又はヒト）又は改変抗ＡＳＣＴ２抗体及びリサーフェシング抗体を、親配列、改変配列、及びヒト化配列の三次元モデルを使用した親配列及び様々な概念的ヒト化産物及び改変産物の分析プロセスによって調製することができる。三次元免疫グロブリンモデルは一般に利用可能であり、当業者は熟知している。選択した候補免疫グロブリン配列の推定上の三次元立体構造を図解及び表示するコンピュータプログラムが利用可能である。これらの表示を調べることにより、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の見込まれる役割の分析、即ち、候補免疫グロブリンがＡＳＣＴ２などのその抗原に結合する能力に影響を及ぼす残基の分析が可能になる。このようにして、コンセンサス配列及びインポート配列からＦＷ残基を選択して組み合わせることにより、標的抗原に対する親和性の増加など、所望の抗体特性を実現することができる。
本発明の抗ＡＳＣＴ２抗体又はその抗原結合断片のヒト化、リサーフェシング又は改変は、限定はされないが、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４（１９８８）；Ｓｉｍｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６（１９９３）；Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１（１９８７）；Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：４２８５（１９９２）；Ｐｒｅｓｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２６２３（１９９３）；米国特許第５，６３９，６４１号明細書、同第５，７２３，３２３号明細書；同第５，９７６，８６２号明細書；同第５，８２４，５１４号明細書；同第５，８１７，４８３号明細書；同第５，８１４，４７６号明細書；同第５，７６３，１９２号明細書；同第５，７２３，３２３号明細書；同第５，７６６，８８６号明細書；同第５，７１４，３５２号明細書；同第６，２０４，０２３号明細書；同第６，１８０，３７０号明細書；同第５，６９３，７６２号明細書；同第５，５３０，１０１号明細書；同第５，５８５，０８９号明細書；同第５，２２５，５３９号明細書；同第４，８１６，５６７号明細書；同第７，５５７，１８９号明細書；同第７，５３８，１９５号明細書；及び同第７，３４２，１１０号明細書；ＰＣＴ／米国特許出願第９８／１６２８０号明細書；ＰＣＴ／米国特許出願第９６／１８９７８号明細書；ＰＣＴ／米国特許出願第９１／０９６３０号明細書；ＰＣＴ／米国特許出願９１／０５９３９号明細書；ＰＣＴ／米国特許出願９４／０１２３４号明細書；ＰＣＴ／英国特許出願第８９／０１３３４号明細書；ＰＣＴ／英国特許出願第９１／０１１３４号明細書；ＰＣＴ／英国特許出願９２／０１７５５号明細書；国際公開第９０／１４４４３号パンフレット；国際公開第９０／１４４２４号パンフレット；国際公開第９０／１４４３０号パンフレット；及び欧州特許第２２９２４６号明細書（これらの各々は、そこに引用される文献を含め、全体として参照により本明細書に援用される）に記載されるものなど、任意の公知の方法を用いて実施することができる。
抗ＡＳＣＴ２ヒト化抗体及びその抗原結合断片はまた、免疫時に内因性免疫グロブリンを産生することなくヒト抗体の完全レパートリーを産生する能力を有するヒト免疫グロブリン遺伝子座を含有するトランスジェニックマウスでも作製することができる。この手法は、米国特許第５，５４５，８０７号明細書；同第５，５４５，８０６号明細書；同第５，５６９，８２５号明細書；同第５，６２５，１２６号明細書；同第５，６３３，４２５号明細書；及び同第５，６６１，０１６号明細書に記載されている。
特定の実施形態において、抗ＡＳＣＴ２抗体断片が提供される。抗体断片の作製について様々な技法が公知である。従来、これらの断片は、例えば、Ｍｏｒｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｅｔｈ．２４：１０７−１１７（１９９３）及びＢｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：８１（１９８５）に記載のとおり、インタクトな抗体のタンパク質分解による消化によって得られている。特定の実施形態において、抗ＡＳＣＴ２抗体断片は組換えで作製される。Ｆａｂ、Ｆｖ、及びｓｃＦｖ抗体断片は、いずれも大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）又は他の宿主細胞で発現させて、そこから分泌させることができ、このようにしてこれらの断片を大量に作製することが可能である。かかる抗ＡＳＣＴ２抗体断片はまた、上記で考察した抗体ファージライブラリから単離することもできる。抗ＡＳＣＴ２抗体断片はまた、米国特許第５，６４１，８７０号明細書に記載されるとおりの線状抗体であってもよい。抗体断片の他の作製技法が当業者に明らかであろう。
本発明によれば、ＡＳＣＴ２に特異的な一本鎖抗体の作製技法を適合させることができる。例えば、米国特許第４，９４６，７７８号明細書を参照されたい）。加えて、ＡＳＣＴ２に対して所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂ断片、又はその誘導体、断片、類似体若しくは相同体の迅速且つ有効な同定を可能にするＦａｂ発現ライブラリの構築方法を適合させることができる。例えば、Ｈｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５−１２８１（１９８９）を参照されたい。抗体断片は、限定はされないが、抗体分子のペプシン消化によって作製されるＦ（ａｂ’）２断片；Ｆ（ａｂ’）２断片のジスルフィド架橋の還元によって生成されるＦａｂ断片；抗体分子をパパイン及び還元剤で処理することによって生成されるＦａｂ断片；又はＦｖ断片を含め、当該技術分野で公知の技法によって作製することができる。
特定の態様において、抗ＡＳＣＴ２抗体又はその抗原結合断片は、その血清半減期が増加するように修飾することができる。これは、例えば、抗体又は抗体断片の適切な領域の突然変異によって抗体又は抗体断片にサルベージ受容体結合エピトープを組み込むことによるか、又は後に抗体又は抗体断片にいずれかの末端若しくは中央で（例えば、ＤＮＡ又はペプチド合成によって）融合するペプチドタグにそのエピトープを組み込むことによるか、又はＹＴＥ突然変異によって達成し得る。抗体又はその抗原結合断片の血清半減期を増加させる他の方法、例えば、ＰＥＧなどの異種分子とのコンジュゲーションが、当該技術分野において公知である。
本明細書に提供されるとおりの修飾抗ＡＳＣＴ２抗体又はその抗原結合断片は、抗体又はポリペプチドとＡＳＣＴ２との会合をもたらす任意のタイプの可変領域を含み得る。この点で、可変領域は、所望の抗原に対して体液性応答を開始して免疫グロブリンを生成するように誘導することのできる任意のタイプの哺乳動物を含み得るか、又はそれに由来し得る。従って、抗ＡＳＣＴ２抗体又はその抗原結合断片の可変領域は、例えば、ヒト、マウス、非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル、マカク等）又はルピナス起源のものであり得る。一部の実施形態では、修飾抗ＡＳＣＴ２抗体又はその抗原結合断片の可変領域及び定常領域の両方がヒトである。他の実施形態では、適合抗体（通常非ヒト供給源に由来する）の可変領域が、分子の結合特性が向上し又は免疫原性が低下するように改変され又は特異的に調整される。この点で、本発明において有用な可変領域はヒト化されるか、又は他に移入アミノ酸配列を含めることによって変更されてもよい。
特定の実施形態では、抗ＡＳＣＴ２抗体又はその抗原結合断片の重鎖及び軽鎖の両方の可変ドメインが、１つ以上のＣＤＲの少なくとも部分的な置換、並びに／又は部分的フレームワーク領域置換及び配列変化によって変更される。ＣＤＲは、フレームワーク領域が由来する抗体と同じクラス又は更にはサブクラスの抗体に由来し得るが、ＣＤＲが異なるクラスの抗体、特定の実施形態では異なる種の抗体に由来することが想定される。ある可変ドメインの抗原結合能を別の可変ドメインに移すために、全てのＣＤＲをドナー可変領域の完全なＣＤＲに置き換える必要はない。むしろ、抗原結合部位の活性の維持に必要な残基を移しさえすれば十分である。米国特許第５，５８５，０８９号明細書、同第５，６９３，７６１号明細書及び同第５，６９３，７６２号明細書に記載される説明を所与とすれば、ルーチンの実験を実施して、免疫原性が低下した機能性抗体を得ることは、十分に当業者の能力の範囲内にある。
可変領域の変更にも関わらず、当業者は、本発明の修飾抗ＡＳＣＴ２抗体又はその抗原結合断片に、定常領域ドメインの１つ以上の少なくとも一部が欠失しているか、又は他に変更されている抗体（例えば、完全長抗体又はその抗原結合断片）が含まれてもよく、天然の又は変更されていない定常領域を含むほぼ同じ免疫原性の抗体と比較したときに腫瘍局在の増加又は血清半減期の低下などの所望の生化学的特性がもたらされるようにし得ることを理解するであろう。一部の実施形態において、修飾抗体の定常領域はヒト定常領域を含み得る。本発明と適合性がある定常領域の修飾は、１つ以上のドメインにおける１つ以上のアミノ酸の付加、欠失又は置換を含む。即ち、本明細書に開示される修飾抗体は、３つの重鎖定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２又はＣＨ３）の１つ以上及び／又は軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）に対する変更又は修飾を含み得る。一部の実施形態では、１つ以上のドメインが部分的又は完全に欠失している修飾定常領域が企図される。一部の実施形態において、修飾抗体は、ＣＨ２ドメイン全体が取り除かれたドメイン欠失コンストラクト又は変異体（ΔＣＨ２コンストラクト）を含み得る。一部の実施形態において、削除された定常領域ドメインは、典型的には欠けている定常領域によって付与される分子可動性の一部を提供する短いアミノ酸スペーサー（例えば、１０残基）に置き換えられ得る。
その構成に加えて、当該技術分野では、定常領域が幾つかのエフェクター機能を媒介することが知られている。例えば、抗体はＦｃ領域を介して細胞に結合し、ここで、抗体Ｆｃ領域上のＦｃ受容体部位が細胞上のＦｃ受容体（ＦｃＲ）に結合する。ＩｇＧ（γ受容体）、ＩｇＥ（η受容体）、ＩｇＡ（α受容体）及びＩｇＭ（μ受容体）を含め、異なる抗体クラスに特異的なＦｃ受容体が幾つもある。抗体が細胞表面上のＦｃ受容体に結合すると、抗体被覆粒子の貪食及び破壊、免疫複合体のクリアランス、キラー細胞による抗体被覆標的細胞の溶解（抗体依存性細胞媒介性細胞傷害、又はＡＤＣＣと呼ばれる）、炎症性メディエーターの放出、胎盤通過及び免疫グロブリン産生の制御を含めた幾つもの重要且つ多様な生物学的反応が惹起される。
特定の実施形態において、抗ＡＳＣＴ２抗体又はその抗原結合断片は、変更されたエフェクター機能を提供し、従って投与される抗体又はその抗原結合断片の生物学的プロファイルが影響を受ける。例えば、定常領域ドメインを（点突然変異又は他の手段によって）欠失又は不活性化させると、循環中の修飾抗体のＦｃ受容体結合が低下し得る。他の場合、定常領域を修飾すると、本発明と一致して、補体結合が調節され、従ってコンジュゲートした細胞毒の血清半減期及び非特異的な会合が低下し得る。定常領域の更に他の修飾を用いると、抗原特異性又は抗体可動性の増加による局在化の増進を可能にするジスルフィド結合又はオリゴ糖部分を除去することができる。同様に、本発明における定常領域に対する修飾は、十分に当業者の範囲内にある周知の生化学的又は分子工学的技法を用いて容易に作製することができる。
特定の実施形態において、抗体又はその抗原結合断片であるＡＳＣＴ２結合分子は、１つ以上のエフェクター機能を有しない。例えば、一部の実施形態において、抗体又はその抗原結合断片は抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性及び／又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性を有しない。特定の実施形態において、抗ＡＳＣＴ２抗体又はその抗原結合断片はＦｃ受容体及び／又は補体因子に結合しない。特定の実施形態において、抗体又はその抗原結合断片はエフェクター機能を有しない。
特定の実施形態において、抗ＡＳＣＴ２抗体又はその抗原結合断片は、それぞれの修飾抗体又はその断片のＣＨ３ドメインがヒンジ領域に直接融合するように改変し得る。他のコンストラクトでは、ヒンジ領域と修飾ＣＨ２及び／又はＣＨ３ドメインとの間にペプチドスペーサーを挿入し得る。例えば、適合性コンストラクトを発現させることができ、ここで、ＣＨ２ドメインが欠失しており、且つ残りのＣＨ３ドメイン（修飾又は非修飾）が５〜２０アミノ酸のスペーサーでヒンジ領域に結合している。かかるスペーサーを加えると、例えば、定常ドメインの調節エレメントが空いて利用可能なままであること、又はヒンジ領域が可動なままであることが確実になり得る。ある場合には、アミノ酸スペーサーが免疫原性で、且つコンストラクトに対する望ましくない免疫応答を誘導することが判明し得る。従って、特定の実施形態では、修飾抗体の所望の生化学的品質を維持するため、コンストラクトに加えられる任意のスペーサーは比較的免疫原性が低いか、又は更には完全に省かれてもよい。
全定常領域ドメインの欠失に加えて、本明細書に提供される抗ＡＳＣＴ２抗体又はその抗原結合断片は、定常領域における数個又は更には単一のアミノ酸の部分欠失又は置換によって修飾することができる。例えば、ＣＨ２ドメインの選択された範囲にある単一のアミノ酸の突然変異が、Ｆｃ結合を実質的に低下させて、それにより腫瘍局在を増加させるのに十分であり得る。同様に、エフェクター機能（例えば、補体Ｃ１Ｑ結合）を制御する１つ以上の定常領域ドメインを完全に又は部分的に欠失させることができる。定常領域のかかる部分欠失は、インタクトな対象定常領域ドメインに付随する他の望ましい機能はそのままにしておきながら抗体又はその抗原結合断片の選択された特性（例えば、血清半減期）を改善することができる。更に、開示される抗ＡＳＣＴ２抗体及びその抗原結合断片の定常領域は、得られるコンストラクトのプロファイルを強化する１つ以上のアミノ酸の突然変異又は置換によって修飾することができる。この点で、修飾抗体又はその抗原結合断片の構成及び免疫原性プロファイルを実質的に維持しながら、保存された結合部位によって提供される活性（例えば、Ｆｃ結合）を破壊することが可能である。特定の実施形態は、エフェクター機能の低下若しくは増加などの望ましい特性を増強し、又はより多くの細胞毒又は炭水化物結合を提供するため、定常領域に対する１つ以上のアミノ酸の付加を含み得る。かかる実施形態では、選択された定常領域ドメインに由来する特定の配列を挿入又は複製することが望ましい場合もある。
本発明は、本明細書に示されるマウス、キメラ、ヒト化又はヒト抗ＡＳＣＴ２抗体、又はその抗原結合断片と実質的に相同な変異体及び均等物を更に包含する。これらは、例えば、保存的置換突然変異、即ち１つ以上のアミノ酸の、同様のアミノ酸による置換を含み得る。例えば、保存的置換は、アミノ酸を同じ一般クラス内の別のアミノ酸で置換すること、例えば、ある酸性アミノ酸を別の酸性アミノ酸で置換すること、ある塩基性アミノ酸を別の塩基性アミノ酸で置換すること、又はある中性アミノ酸を別の中性アミノ酸によって置換することを指す。保存的アミノ酸置換によって意味されるものは、当該技術分野において周知である。
抗ＡＳＣＴ２抗体又はその抗原結合断片は、通常、そのタンパク質の一部でない追加的な化学的部分を含むように更に修飾することができる。それらの誘導体化部分は、タンパク質の溶解度、生物学的半減期又は吸収を向上させることができる。これらの部分はまた、タンパク質の任意の望ましい副作用などを低減し又は消失させることもできる。それらの部分についての概要は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２２ｎｄ Ｅｄ．Ｌｌｏｙｄ Ｖ．Ａｌｌｅｎ，Ｊｒ．（２０１２）を参照することができる。
Ｖ．抗ＡＳＣＴ２抗体コンジュゲート
本開示は、異種薬剤にコンジュゲートされた、上記に記載したとおりの抗ＡＳＣＴ２抗体又はその断片を更に提供する。本発明の目的上、「コンジュゲートされた」は、共有結合又はイオン結合によって連結されていることを意味する。特定の態様において、薬剤は、抗菌剤、治療剤、プロドラッグ、ペプチド、タンパク質、酵素、脂質、生物学的反応修飾物質、医薬品、リンホカイン、異種抗体又はその断片、検出可能標識、ＰＥＧ、又は任意の前記薬剤の２つ以上の組み合わせであってもよい。一部の実施形態において、かかるＡＳＣＴ２結合分子はＡＳＣＴ２−ＡＤＣである。
従って、本開示はまた、少なくとも１つの細胞傷害剤を更に含む、本明細書に開示される抗ＡＳＣＴ２抗体を含むＡＤＣも提供する。一部の態様において、本ＡＤＣは少なくとも１つの任意選択のスペーサーを更に含む。一部の態様において、この少なくとも１つのスペーサーはペプチドスペーサーである。一部の態様において、少なくとも１つのスペーサーは非ペプチドスペーサーである。
細胞傷害剤又はサイトトキシンは、細胞の機能を阻害し又は妨げる、及び／又は細胞の破壊（細胞死）を引き起こす、及び／又は抗新生物／抗増殖効果を及ぼす当該技術分野において公知の任意の分子であり得る。幾つものクラスの細胞傷害剤がＡＤＣ分子において潜在的な有用性を有することが知られている。これらとしては、限定はされないが、アマニチン、アウリスタチン、ダウノマイシン、ドキソルビシン、デュオカルマイシン、ドラスタチン、エンジイン、レキシトロプシン、タキサン、ピューロマイシン、メイタンシノイド、ビンカアルカロイド、ツブリシン及びピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）が挙げられる。かかる細胞傷害剤の例は、ＡＦＰ、ＭＭＡＦ、ＭＭＡＥ、ＡＥＢ、ＡＥＶＢ、アウリスタチンＥ、パクリタキセル、ドセタキセル、ＣＣ−１０６５、ＳＮ−３８、トポテカン、モルホリノドキソルビシン、リゾキシン、シアノモルホリノドキソルビシン、ドラスタチン−１０、エキノマイシン、コンブレタスタチン、カリケアミシン、メイタンシン、ＤＭ−１、ビンブラスチン、メトトレキサート、及びネトロプシン、並びにこれらの誘導体及び類似体である。ＡＤＣにおける使用に好適なサイトトキシンに関する更なる開示は、例えば、国際公開第２０１５／１５５３４５号パンフレット及び同第２０１５／１５７５９２号パンフレット（全体として参照により本明細書に援用される）を参照することができる。
一実施形態において、細胞傷害剤はツブリシン又はツブリシン誘導体である。ツブリシンＡは以下の化学構造を有する。
Figure 2018535674
ツブリシンは、粘液細菌種から単離された天然産物のクラスのメンバーである（Ｓａｓｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．５３：８７９−８８５（２０００））。細胞骨格と相互作用する薬剤として、ツブリシンは、チューブリン重合を阻害して細胞周期停止及びアポトーシスをもたらす細胞分裂毒である（Ｓｔｅｉｎｍｅｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．４３：４８８８−４８９２（２００４）；Ｋｈａｌｉｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７：６７８−６８３（２００６）；Ｋａｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３９６：２３５−２４２（２００６））。本明細書で使用されるとき、用語「ツブリシン」は、集合的にも個別的にも、天然に存在するツブリシン並びにツブリシンの類似体及び誘導体を指す。ツブリシンの例示的な例が、例えば、国際公開第２００４００５３２６Ａ２号パンフレット、国際公開第２０１２０１９１２３Ａ１号パンフレット、国際公開第２００９１３４２７９Ａ１号パンフレット、国際公開第２００９０５５５６２Ａ１号パンフレット、国際公開第２００４００５３２７Ａ１号パンフレット、米国特許第７７７６８４１号明細書、米国特許第７７５４８８５号明細書、米国特許出願公開第２０１００２４０７０１号明細書、米国特許第７８１６３７７号明細書、米国特許出願公開第２０１１００２１５６８号明細書、及び米国特許出願公開第２０１１０２６３６５０号明細書（参照により本明細書に援用される）に開示されている。かかる誘導体には、例えば、ツブリシンプロドラッグ又は１つ以上の保護基（ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｇｒｏｕｐ）若しくは保護基（ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ ｇｒｏｕｐ）、１つ以上の連結部分を含むツブリシンが含まれることが理解されるべきである。
特定の態様において、ツブリシンは、本明細書で「ＡＺ１５０８」とも称され、且つ国際公開第２０１５１５７５９４号パンフレット（参照により本明細書に援用される）に更に詳細に記載される、以下の構造を有するツブリシン１５０８である。
Figure 2018535674
別の実施形態において、細胞傷害剤はピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）又はＰＢＤ誘導体であってもよい。ＰＢＤは核に移行し、そこでＤＮＡを架橋して有糸分裂の間の複製を妨げ、一本鎖切断を誘導することによりＤＮＡに損傷を与え、続いてアポトーシスをもたらす。一部のＰＢＤは、ＤＮＡの特異的配列を認識してそれに結合する能力を有する。好ましい配列はＰｕＧＰｕである。ＰＢＤは以下の一般構造である。
Figure 2018535674
ＰＢＤは、その芳香族Ａ環及びピロロＣ環の両方における置換基の数、種類及び位置、並びにＣ環の飽和度が異なる。Ｂ環には、Ｎ１０〜Ｃ１１位にイミン（Ｎ＝Ｃ）、カルビノールアミン（ＮＨ−ＣＨ（ＯＨ））、又はカルビノールアミンメチルエーテル（ＮＨ−ＣＨ（ＯＭｅ））のいずれかがあり、これがＤＮＡのアルキル化に関与する求電子中心である。公知の天然産物は全てがキラルＣ１１ａ位に（Ｓ）配置を有し、そのため、ＰＢＤには、Ｃ環からＡ環の方に見たとき右回りのねじれが付与される。これによりＰＢＤはＢ型ＤＮＡの副溝を含むイソヘリシティに適切な三次元形状となり、結合部位に密に嵌まることにつながる（Ｋｏｈｎ，Ｉｎ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ＩＩＩ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．３−１１（１９７５）；Ｈｕｒｌｅｙ ａｎｄ Ｎｅｅｄｈａｍ−ＶａｎＤｅｖａｎｔｅｒ，Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．，１９，２３０−２３７（１９８６））。副溝に付加物を形成するその能力により、ＰＢＤはＤＮＡプロセシングの妨害と、従って抗腫瘍薬剤としてのその使用とが可能となる。
最初のＰＢＤ抗腫瘍抗生物質アントラマイシンは、１９６５年に発見された（Ｌｅｉｍｇｒｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８７：５７９３−５７９５（１９６５）；Ｌｅｉｍｇｒｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８７：５７９１−５７９３（１９６５））。それ以降、幾つもの天然に存在するＰＢＤが報告されており、種々の類似体に至る１０を超える合成経路が開発されている（Ｔｈｕｒｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１９９４：４３３−４６５（１９９４）；Ａｎｔｏｎｏｗ，Ｄ．ａｎｄ Ｔｈｕｒｓｔｏｎ，Ｄ．Ｅ．，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１１１：２８１５−２８６４（２０１１））。ファミリーメンバーには、アベイマイシン（Ｈｏｃｈｌｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ４０：１４５−１４８（１９８７））、チカマイシン（Ｋｏｎｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ３７：２００−２０６（１９８４））、ＤＣ−８１（特開昭５８−１８０４８７号公報；Ｔｈｕｒｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｂｒｉｔ．２６：７６７−７７２（１９９０）；Ｂｏｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ４８：７５１−７５８（１９９２））、マゼトラマイシン（Ｋｕｍｉｎｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ３３：６６５−６６７（１９８０））、ネオトラマイシンＡ及びＢ（Ｔａｋｅｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ２９：９３−９６（１９７６））、ポロトラマイシン（Ｔｓｕｎａｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ４１：１３６６−１３７３（１９８８））、プロトラカルシン（Ｓｈｉｍｉｚｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ２９：２４９２−２５０３（１９８２）；Ｌａｎｇｌｅｙ ａｎｄ Ｔｈｕｒｓｔｏｎ，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５２：９１−９７（１９８７））、シバノミシン（ＤＣ−１０２）（Ｈａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ４１：７０２−７０４（１９８８）；Ｉｔｏｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ４１：１２８１−１２８４（１９８８））、シビロマイシン（Ｌｅｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１０：２９９２−２９９３（１９８８））及びトママイシン（Ａｒｉｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ２５：４３７−４４４（１９７２））が含まれる。ＰＢＤ及びそれを含むＡＤＣはまた、国際公開第２０１５／１５５３４５号パンフレット及び同第２０１５／１５７５９２号パンフレット（参照により本明細書において全体として参照により援用される）にも記載されている。
特定の態様において、ＰＢＤは、本明細書で「ＳＧ３２４９」とも称され、且つ国際公開第２０１４／０５７０７４号パンフレット（参照により本明細書に援用される）に更に詳細に記載される、以下の構造を有するＰＢＤ３２４９である。
Figure 2018535674
特定の態様において、ＰＢＤは、本明細書で「ＳＧ３３１５」とも称され、且つ国際公開第２０１５／０５２３２２号パンフレット（参照により本明細書に援用される）に更に詳細に記載される、以下の構造を有するＰＢＤ３３１５である。
Figure 2018535674
本明細書に開示される抗ＡＳＣＴ２抗体及びその抗原断片は、部位特異的又は非部位特異的コンジュゲート方法を用いて異種薬剤にコンジュゲートすることができる。一部の態様において、ＡＤＣは、１、２、３、４つ又はそれを超える治療用部分を含む。一部の態様において、全ての治療用部分が同じである。
抗体又はその抗原結合断片の従来のコンジュゲーション戦略は、リジン又はシステインを介してペイロードを抗体又は断片にランダムにコンジュゲートすることに頼るものである。従って、一部の態様において、抗体又はその抗原結合断片は薬剤に対し、例えば抗体又は断片の部分的還元と、続くリンカー部分が付加された又は付加されていない所望の薬剤との反応によってランダムにコンジュゲートされる。抗体又は断片はＤＴＴ又は同様の還元剤を使用して還元し得る。次に、リンカー部分が付加された又は付加されていない薬剤を、ＤＭＳＯの存在下で還元された抗体又は断片にモル過剰で加えることができる。コンジュゲーション後、過剰量の遊離システインを加えて未反応の薬剤をクエンチし得る。次に、この反応混合物を精製し、ＰＢＳで緩衝液交換し得る。
他の態様では、特異的な位置にある反応性アミノ酸残基を使用した治療用部分の抗体への部位特異的なコンジュゲーションにより、一様な化学量論比の均一なＡＤＣ調製物が得られる。部位特異的コンジュゲーションは、システイン残基又は非天然アミノ酸を介することができる。一実施形態において、細胞傷害剤又はイメージング剤は少なくとも１つのシステイン残基を介して抗体又はその抗原結合断片にコンジュゲートされる。一部の態様において、各治療用部分はＦｃ領域における特異的なＫａｂａｔ位置でアミノ酸の側鎖に化学的にコンジュゲートされる。一部の実施形態において、細胞傷害剤又はイメージング剤は、位置２３９、２４８、２５４、２７３、２７９、２８２、２８４、２８６、２８７、２８９、２９７、２９８、３１２、３２４、３２６、３３０、３３５、３３７、３３９、３５０、３５５、３５６、３５９、３６０、３６１、３７５、３８３、３８４、３８９、３９８、４００、４１３、４１５、４１８、４２２、４４０、４４１、４４２、４４３及び４４６（付番はＫａｂａｔのＥＵインデックスに対応する）の少なくとも１つのシステイン置換によって抗体又はその抗原結合断片にコンジュゲートされる。一部の態様において、特異的なＫａｂａｔ位置は、２３９、４４２、又は両方である。一部の態様において、特異的な位置は、Ｋａｂａｔ位置４４２、Ｋａｂａｔ位置２３９及び２４０間のアミノ酸挿入、又は両方である。一部の態様において、薬剤はチオール−マレイミド連結を介して抗体又はその抗原結合断片にコンジュゲートされる。一部の態様において、アミノ酸側鎖はスルフヒドリル側鎖である。
一実施形態において、ＡＳＣＴ２結合分子、例えば、ＡＳＣＴ２−ＡＤＣ、抗ＡＳＣＴ２抗体、又はその抗原結合断片は細胞傷害性ペイロードをＡＳＣＴ２発現細胞に送達し、増殖を少なくとも１０％、又は少なくとも２０％、又は少なくとも３０％、又は少なくとも４０％、又は少なくとも５０％、又は少なくとも６０％、又は少なくとも７０％、又は少なくとも８０％、又は少なくとも９０％又は約１００％阻害又は抑制する。細胞増殖は、細胞分裂速度、及び／又は細胞集団内において細胞分裂を起こす細胞の割合、及び／又は終末分化又は細胞死に起因する細胞集団からの細胞損失率（例えば、チミジン取込み）を計測する当該技術分野で認められている技法を用いてアッセイすることができる。
ＶＩ．ＡＳＣＴ２結合分子をコードするポリヌクレオチド及びその発現
本開示は、ＡＳＣＴ２に特異的に結合するポリペプチド又はその抗原結合断片をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを提供する。例えば、本発明は、抗ＡＳＣＴ２抗体をコードするか、又はかかる抗体の抗原結合断片をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを提供する。本発明のポリヌクレオチドはＲＮＡの形態であっても、又はＤＮＡの形態であってもよい。ＤＮＡには、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、及び合成ＤＮＡが含まれ；且つ二本鎖又は一本鎖であってもよく、及び一本鎖の場合、コード鎖又は非コード鎖（アンチセンス鎖）であってもよい。
特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは単離されてもよい。特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは実質的に純粋であってもよい。特定の実施形態において、ポリヌクレオチドはｃＤＮＡであってもよく、又はｃＤＮＡに由来する。特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは組換え産生されてもよい。特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、同じリーディングフレームでポリヌクレオチドに融合した、例えば宿主細胞からのポリペプチドの発現及び分泌を促進する成熟ポリペプチドのためのコード配列（例えば、細胞からのポリペプチドの輸送を制御するための分泌配列として機能するリーダー配列）を含んでもよい。リーダー配列を有するポリペプチドはプレタンパク質であり、リーダー配列が宿主細胞によって切断されると成熟形態のポリペプチドを形成し得る。ポリヌクレオチドはまた、成熟タンパク質＋追加の５’アミノ酸残基であるＡＳＣＴ結合プロタンパク質をコードしてもよい。
本開示は、抗体ＶＨをコードする核酸を含む単離ポリヌクレオチドを更に提供し、このＶＨは、配列番号１、配列番号３、配列番号５、及び配列番号７からなる群から選択される参照アミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含む。
更に、本開示は、抗体ＶＬをコードする核酸を含む単離ポリヌクレオチドを提供し、このＶＬは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、及び配列番号８からなる群から選択される参照アミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含む。
特定の実施形態において、本開示は、抗体ＶＨをコードする核酸であって、ＶＨが参照アミノ酸配列の配列番号１と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含む核酸と、抗体ＶＬをコードする核酸であって、ＶＬが参照アミノ酸配列の配列番号２と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含む核酸とを含む単離ポリヌクレオチドを提供する。特定の実施形態において、本開示は、抗体ＶＨをコードする核酸であって、ＶＨが参照アミノ酸配列の配列番号３と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含む核酸と、抗体ＶＬをコードする核酸であって、ＶＬが参照アミノ酸配列の配列番号４と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含む核酸とを含む単離ポリヌクレオチドを提供する。特定の実施形態において、本開示は、抗体ＶＨをコードする核酸であって、ＶＨが参照アミノ酸配列の配列番号５と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含む核酸と、抗体ＶＬをコードする核酸であって、ＶＬが参照アミノ酸配列の配列番号６と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含む核酸とを含む単離ポリヌクレオチドを提供する。特定の実施形態において、本開示は、抗体ＶＨをコードする核酸であって、ＶＨが参照アミノ酸配列の配列番号７と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含む核酸と、抗体ＶＬをコードする核酸であって、ＶＬが参照アミノ酸配列の配列番号８と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含む核酸とを含む単離ポリヌクレオチドを提供する。
特定の態様において、上記に記載したとおりのポリヌクレオチドによってコードされるＶＨ又はＶＬを含む抗体又はその抗原結合断片は、ＡＳＣＴ２、例えばヒト又はカニクイザルＡＳＣＴ２に特異的に結合することができる。特定の場合、かかる抗体又はその抗原結合断片は、１７ｃ１０又は１ｅ８のＶＨ及びＶＬを含む抗体又はその抗原結合断片と同じエピトープに特異的に結合することができる。特定の態様において、本開示は、ＡＳＣＴ２に特異的に結合する結合分子、例えば抗体又はその抗原結合断片をコードするポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドの組み合わせを提供する。
更に、上記に記載したとおりのポリヌクレオチドを含むベクターが提供される。好適なベクターは本明細書に記載され、及び当業者に公知である。
特定の態様において、本開示は、上記に記載したとおりのポリヌクレオチド又はベクターを含み、任意選択で１つ以上の担体、希釈剤、賦形剤、又は他の添加剤を更に含む組成物、例えば医薬組成物を提供する。
上記に記載したとおりのポリヌクレオチド組成物において、ＶＨをコードする核酸を含むポリヌクレオチドと、ＶＬをコードする核酸を含むポリヌクレオチドとは単一のベクターに存在してもよく、又は別個のベクター上にあってもよい。従って、本開示は、上記に記載されるポリヌクレオチド組成物を含む１つ以上のベクターを提供する。
本開示は、上記に提供されるとおりのポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド組成物、又はベクターを含む宿主細胞を更に提供し、ここで、宿主細胞は、一部の例では、ＡＳＣＴ２に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片を発現することができる。かかる宿主細胞は、本明細書に提供されるとおりの抗体又はその抗原結合断片を作製する方法において利用することができ、この方法は、（ａ）宿主細胞を培養するステップと、（ｂ）宿主細胞から発現した抗体又はその抗原結合断片を単離するステップとを含む。
特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、例えばコードされたポリペプチドの精製を可能にするマーカー配列に同じリーディングフレーム内で融合した成熟ＡＳＣＴ２結合ポリペプチド、例えば抗ＡＳＣＴ２抗体又はその抗原結合断片のコード配列を含む。例えば、マーカー配列は、細菌宿主の場合にｐＱＥ−９ベクターによって供給されるヘキサヒスチジンタグであってもよく、それによりマーカーに融合した成熟ポリペプチドの精製が提供され、又はマーカー配列は、哺乳類宿主（例えば、ＣＯＳ−７細胞）を使用するときは、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質に由来するヘマグルチニン（ＨＡ）タグであってもよい。
ポリヌクレオチド変異体も提供される。ポリヌクレオチド変異体は、コード領域、非コード領域、又は両方に変化を含み得る。一部の実施形態において、ポリヌクレオチド変異体は、サイレント置換、付加、又は欠失を生じさせるが、コードされるポリペプチドの特性又は活性を変化させない変化を含む。一部の実施形態において、ポリヌクレオチド変異体は、遺伝子コードの縮重によるサイレント置換によって作製される。ポリヌクレオチド変異体は、種々の理由で、例えばコドン発現を特定の宿主に最適化する（ヒトｍＲＮＡのコドンを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの細菌宿主に好ましいコドンに変更する）ために作製され得る。本明細書に記載されるポリヌクレオチドを含むベクター及び細胞も提供される。
一部の実施形態において、ＡＳＣＴ２結合分子をコードするＤＮＡ配列は、オリゴヌクレオチド合成機を使用した化学合成によって構築することができる。かかるオリゴヌクレオチドは、所望のポリペプチドのアミノ酸配列、及び目的の組換えポリペプチドが産生される宿主細胞において有利なコドンの選択に基づき設計することができる。標準方法を適用して、目的の単離ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド配列を合成することができる。例えば、完全なアミノ酸配列を使用して逆翻訳遺伝子を構築することができる。更に、特定の単離ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含有するＤＮＡオリゴマーを合成することができる。例えば、所望のポリペプチドの一部分をコードする幾つかの小さいオリゴヌクレオチドを合成し、次にライゲートすることができる。個々のオリゴヌクレオチドは、典型的には相補的アセンブリのための５’又は３’オーバーハングを含有する。
アセンブル後（合成、部位特異的突然変異誘発又は別の方法による）、目的とする特定の単離ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は発現ベクターに挿入され、所望の宿主におけるそのタンパク質の発現に適切な発現制御配列に作動可能に連結され得る。適切なアセンブリは、例えば、ヌクレオチドシーケンシング、制限マッピング、及び／又は好適な宿主における生物学的に活性なポリペプチドの発現によって確認することができる。宿主におけるトランスフェクトした遺伝子の高い発現レベルを達成するために、その遺伝子を、選択の発現宿主で機能する転写及び翻訳発現制御配列に作動可能に連結するか又はそれに会合させ得る。
特定の実施形態では、組換え発現ベクターを使用して、抗ＡＳＣＴ２抗体又はその抗原結合断片をコードするＤＮＡを増幅し、発現させる。組換え発現ベクターは、哺乳類、微生物、ウイルス又は昆虫遺伝子に由来する好適な転写又は翻訳調節エレメントに作動可能に連結された、抗ＡＳＣＴ２抗体及び／又はその抗原結合断片のポリペプチド鎖をコードする合成又はｃＤＮＡ由来のＤＮＡ断片を有する複製可能なＤＮＡコンストラクトである。転写単位は、概して、本明細書で更に詳細に記載するとおり、（１）遺伝子発現において調節的役割を有する１つ又は複数の遺伝エレメント、例えば転写プロモーター又はエンハンサーと、（２）ｍＲＮＡに転写され且つタンパク質に翻訳される構造又はコード配列と、（３）適切な転写及び翻訳開始及び終結配列との集合を含む。かかる調節エレメントは、転写を制御するためオペレーター配列を含み得る。一般に複製起点によって付与される宿主における複製能、及び形質転換体の認識を促進する選択遺伝子が、更に組み込まれ得る。ＤＮＡ領域は、それらが機能上互いに関係しているとき、作動可能に連結している。例えば、シグナルペプチド（分泌リーダー）のＤＮＡは、それがポリペプチドの分泌に関与する前駆体として発現する場合、そのポリペプチドのＤＮＡに作動可能に連結している。プロモーターは、それが配列の転写を制御する場合、コード配列に作動可能に連結しているか、又はリボソーム結合部位は、それが翻訳を可能にするような位置にある場合、コード配列に作動可能に連結している。酵母発現系での使用が意図される構造エレメントは、宿主細胞による翻訳タンパク質の細胞外分泌を可能にするリーダー配列を含む。或いは、組換えタンパク質がリーダー配列又は輸送配列なしに発現する場合、このタンパク質はＮ末端メチオニン残基を含み得る。この残基は、任意選択で、後に発現した組換えタンパク質から切断されて、最終産物を提供し得る。
発現制御配列及び発現ベクターの選択は、宿主の選択に依存することになる。幅広い種類の発現宿主／ベクターの組み合わせを用いることができる。真核生物宿主に有用な発現ベクターとしては、例えば、ＳＶ４０、ウシパピローマウイルス、アデノウイルス及びサイトメガロウイルス由来の発現制御配列を含むベクターが挙げられる。細菌宿主に有用な発現ベクターとしては、ｐＣＲ １、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９及びそれらの誘導体を含めた大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来のプラスミドなどの公知の細菌プラスミド、Ｍ１３及び繊維状一本鎖ＤＮＡファージなどのより広い宿主域のプラスミドが挙げられる。
ＡＳＣＴ２結合分子、例えば抗ＡＳＣＴ２抗体の発現に好適な宿主細胞には、適切なプロモーターの制御下にある原核生物、酵母、昆虫又は高等真核生物細胞が含まれる。原核生物には、グラム陰性又はグラム陽性生物、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）又は桿菌が含まれる。高等真核生物細胞には、本明細書に記載するとおりの哺乳類起源の樹立細胞株が含まれる。無細胞翻訳系も用いることができる。抗体作製を含めたタンパク質作製方法に関する更なる情報については、例えば、米国特許出願公開第２００８／０１８７９５４号明細書、米国特許第６，４１３，７４６号明細書、及び同第６，６６０，５０１号明細書、並びに国際特許公開国際公開第０４００９８２３号パンフレット（これらの各々は本明細書によって全体として参照により本明細書に援用される）を参照することができる。
種々の哺乳類又は昆虫細胞培養系も、組換えＡＳＣＴ２結合分子の発現に有利に用いることができる。哺乳類細胞における組換えタンパク質の発現を実施してもよく、なぜならかかるタンパク質は概して正しく折り畳まれ、適切に修飾され、且つ完全に機能性であるためである。好適な哺乳類宿主細胞株の例としては、ＨＥＫ−２９３及びＨＥＫ−２９３Ｔ、Ｇｌｕｚｍａｎ，Ｃｅｌｌ ２３：１７５（１９８１）によって記載されるサル腎細胞のＣＯＳ−７株、及び他の細胞株、例えば、Ｌ細胞、Ｃ１２７、３Ｔ３、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ＨｅＬａ及びＢＨＫ細胞株が挙げられる。哺乳類発現ベクターは、非転写エレメント、例えば、複製起点、発現させる遺伝子に連結した好適なプロモーター及びエンハンサー、及び他の５’又は３’フランキング非転写配列、及び５’又は３’非翻訳配列、例えば、必須リボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライス供与・受容部位、及び転写終結配列などを含み得る。昆虫細胞における異種タンパク質産生用のバキュロウイルス系が、Ｌｕｃｋｏｗ ａｎｄ Ｓｕｍｍｅｒｓ，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：４７（１９８８）によってレビューされている。
形質転換宿主によって産生されるＡＳＣＴ２結合分子は、任意の好適な方法によって精製することができる。かかる標準方法には、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティー及びサイズ排除カラムクロマトグラフィー）、遠心、溶解度差、又は任意の他の標準的なタンパク質精製技法によるものが含まれる。ヘキサヒスチジン、マルトース結合ドメイン、インフルエンザコート配列及びグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼなどのアフィニティータグをタンパク質に付加すると、適切なアフィニティーカラムに通過させることによる容易な精製が可能となり得る。単離されたタンパク質はまた、タンパク質分解、核磁気共鳴及びＸ線結晶学などの技法を用いて物理的に特徴付けることもできる。
例えば、組換えタンパク質を培養培地中に分泌する系からの上清を、初めに市販のタンパク質濃縮フィルタ、例えばＡｍｉｃｏｎ又はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外ろ過ユニットを使用して濃縮し得る。この濃縮ステップ後、濃縮物を好適な精製マトリックスに適用し得る。或いは、陰イオン交換樹脂、例えば、ペンダントジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基を有するマトリックス又は基質を用いてもよい。マトリックスは、アクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロース又はタンパク質精製において一般的に用いられる他のタイプであってもよい。或いは、陽イオン交換ステップが用いられてもよい。好適な陽イオン交換体としては、スルホプロピル基又はカルボキシメチル基を含む種々の不溶性マトリックスが挙げられる。最後に、疎水性ＲＰ−ＨＰＬＣ媒体、例えばペンダントメチル基又は他の脂肪族基を有するシリカゲルを用いる１つ以上の逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）ステップを用いて、ＡＳＣＴ２結合分子を更に精製することができる。均一な組換えタンパク質を提供するため、前述の精製ステップの一部又は全てを様々に組み合わせて用いることもできる。
細菌培養で産生された組換えＡＳＣＴ２結合分子は、例えば、細胞ペレットからの初期抽出と、続く１つ以上の濃縮、塩析、水性イオン交換又はサイズ排除クロマトグラフィーステップによって単離することができる。最終精製ステップには、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いることができる。組換えタンパク質の発現に用いられる微生物細胞は、凍結融解サイクル処理、音波処理、機械的破壊、又は細胞溶解剤の使用を含めた、任意の好都合な方法によって破壊することができる。
抗体及び他のタンパク質を精製するための当該技術分野において公知の方法としてはまた、例えば、米国特許出願公開第２００８／０３１２４２５号明細書、同第２００８／０１７７０４８号明細書、及び同第２００９／０１８７００５号明細書（これらの各々は、本明細書によって全体として参照により本明細書に援用される）に記載されるものも挙げられる。
ＶＩＩ．医薬組成物及び投与方法
本明細書に提供されるＡＳＣＴ２結合分子を調製し、それを必要としている対象に投与する方法は、当業者に周知であり、当業者によって容易に決定される。ＡＳＣＴ２結合分子の投与経路は、例えば、経口、非経口、吸入による、又は局所であり得る。用語の非経口とは、本明細書で使用されるとき、例えば、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、直腸、又は腟内投与を含む。これらの投与形態は全て、明らかに本発明の範囲内にあるものとして企図されるが、投与形態の別の例を挙げるのであれば、注射用、詳細には静脈内若しくは動脈内注射又は点滴用の溶液であろう。通常、好適な医薬組成物は、緩衝液（例えば、酢酸塩、リン酸塩又はクエン酸塩緩衝液）、界面活性剤（例えば、ポリソルベート）、任意選択で安定剤（例えば、ヒトアルブミン）等を含み得る。本明細書の教示と適合性のある他の方法において、本明細書に提供されるＡＳＣＴ２結合分子は有害な細胞集団の部位に直接送達してもよく、それにより罹患組織の治療剤への曝露を増加させることができる。一実施形態において、投与は、例えば吸入又は鼻腔内投与による、気道への直接の投与である。
本明細書で考察するとおり、本明細書に提供されるＡＳＣＴ２結合分子は、ＡＳＣＴ２の過剰発現によって特徴付けられる疾患又は障害、例えば、結腸直腸癌、ＨＮＳＣＣ、前立腺癌、肺癌、膵癌、黒色腫、子宮内膜癌、血液癌（ＡＭＬ、ＭＭ、ＤＬＢＣＬ）、及びＣＳＣを含む癌のインビボ治療に薬学的に有効な量で投与することができる。これに関連して、本開示の結合分子は、活性薬剤の投与を容易にし、且つ安定性を促進するように製剤化し得ることが理解されるであろう。本発明における医薬組成物は、生理食塩水、非毒性緩衝液、保存剤など、薬学的に許容可能な非毒性の無菌担体を含み得る。本願の目的上、ＡＳＣＴ２結合分子の薬学的に有効な量とは、標的への有効な結合を実現すると共に、利益を実現する、例えば疾患又は病態の症状を改善したり、或いは物質又は細胞を検出したりするのに十分な量を意味する。本明細書に開示される治療方法における使用に好適な製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２２ｎｄ ｅｄ．，Ｅｄ．Ｌｌｏｙｄ Ｖ．Ａｌｌｅｎ，Ｊｒ．（２０１２）に記載される。
本明細書に提供される特定の医薬組成物は、例えば、カプセル、錠剤、水性懸濁液、又は溶液を含めた許容可能な剤形で経口的に投与することができる。特定の医薬組成物はまた、鼻エアロゾル又は吸入によって投与することもできる。かかる組成物は、ベンジルアルコール又は他の好適な保存剤、バイオアベイラビリティを向上させる吸収促進剤、及び／又は他の従来の可溶化剤又は分散剤を用いて、生理食塩水中の溶液として調製することができる。
単一の剤形を作製するため担体材料と組み合わせることのできるＡＳＣＴ２結合分子の量は、治療対象及び詳細な投与方法に応じて変わり得る。本組成物は、単回用量、複数回用量として、又は輸液で確立された期間にわたって投与することができる。投薬レジメンも最適な所望の反応がもたらされるように調整することができる。
本開示の範囲を踏まえて、ＡＳＣＴ２結合分子は、治療効果を生じさせるのに十分な量で前述の治療方法に従いヒト又は他の動物に投与することができる。本明細書に提供されるＡＳＣＴ２結合分子は、本発明のＡＳＣＴ２結合分子を従来の薬学的に許容可能な担体又は希釈剤と公知の技法に従い組み合わせることにより調製された従来の剤形でかかるヒト又は他の動物に投与することができる。薬学的に許容可能な担体又は希釈剤の形態及び特性は、それを組み合わせる活性成分の量、投与経路及び他の周知の変数に左右され得る。本発明のＡＳＣＴ２結合分子の１つ以上の種、例えば、ＡＳＣＴ２−ＡＤＣ、抗ＡＳＣＴ２抗体、又はその抗原結合断片、変異体、若しくは誘導体を含むカクテルも使用することができる。
「治療有効用量又は治療有効量」又は「有効量」とは、投与したときに、治療すべき疾患又は病態を有する患者の治療に関連して好ましい治療応答をもたらすＡＳＣＴ２結合分子の量が意図される。
本発明の組成物の治療有効用量は、特定の癌など、ＡＳＣＴ２が過剰発現する疾患又は障害の治療について、投与手段、標的部位、患者の生理学的状態、患者がヒトであるか動物であるか、及び投与される他の医薬を含め、多くの異なる要因に応じて変わる。通常、患者はヒトであるが、トランスジェニック哺乳類を含めた非ヒト哺乳類も治療され得る。治療的投薬量は、当業者に公知の常法を用いて安全性及び有効性を最適化することにより用量設定することができる。
少なくとも１つのＡＳＣＴ２結合分子の投与量は、本開示を所与とすれば当業者によって過度の実験を行うことなく容易に決定される。投与方法及びそれぞれの、少なくとも１つのＡＳＣＴ２結合分子の量に影響を与える要因としては、限定はされないが、疾患の重症度、その疾患の病歴、並びに治療を受ける個体の年齢、身長、体重、健康、及び体調が挙げられる。同様に、ＡＳＣＴ２結合分子の投与量は、投与方法及び対象がこの薬剤の単一用量を受けるか、それとも複数用量を受けるかに依存することになる。
本開示はまた、ＡＳＣＴ２の過剰発現によって特徴付けられる疾患又は障害、例えば、結腸直腸癌、ＨＮＳＣＣ、前立腺癌、肺癌、膵癌、又は血液癌の治療に用いられる、ＡＳＣＴ２結合分子、例えば、ＡＳＣＴ２−ＡＤＣ、抗ＡＳＣＴ２抗体、又はその抗原結合断片、変異体、若しくは誘導体の使用も提供する。
本開示はまた、ＡＳＣＴ２の過剰発現によって特徴付けられる疾患又は障害、例えば、結腸直腸癌、ＨＮＳＣＣ、前立腺癌、肺癌、膵癌、又は血液癌の治療用医薬の製造における、ＡＳＣＴ２結合分子、例えば、ＡＳＣＴ２−ＡＤＣ、抗ＡＳＣＴ２抗体又はその抗原結合断片、変異体、若しくは誘導体の使用も提供する。
ＶＩＩＩ．診断
本開示は、特定の癌など、ＡＳＣＴ２過剰発現によって特徴付けられる疾患の診断において有用な診断方法を更に提供し、この方法は、個体の細胞又は組織におけるＡＳＣＴ２の発現レベルを計測するステップと、計測された発現レベルを正常細胞又は組織における標準的なＡＳＣＴ２発現と比較するステップとを含み、ここで、標準と比較した発現レベルの増加は、本明細書に提供されるＡＳＣＴ２結合分子によって治療可能な障害であることを示す。
本明細書に提供されるＡＳＣＴ２結合分子は、当業者に公知の古典的な免疫組織学的方法を用いた生体試料のＡＳＣＴ２タンパク質レベルのアッセイに用いることができる。Ｊａｌｋａｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１０５：３０８７−３０９６（１９８７）；Ｊａｌｋａｎｅｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０１：９７６−９８５（１９８５）を参照されたい。ＡＳＣＴ２タンパク質発現の検出に有用な他の抗体ベースの方法としては、イムノアッセイ、例えば、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降、又はウエスタンブロッティングが挙げられる。
「ＡＳＣＴ２ポリペプチドの発現レベルをアッセイする」とは、第１の生物学的試料中のＡＳＣＴ２ポリペプチドのレベルを直接（例えば、絶対タンパク質レベルを決定又は推定することによる）、或いは相対的に（例えば、第２の生物学的試料中の疾患関連ポリペプチドレベルと比較することによる）、定性的又は定量的に計測又は推定することが意図される。第１の生物学的試料中のＡＳＣＴ２ポリペプチド発現レベルを計測又は推定して標準ＡＳＣＴ２ポリペプチドレベルと比較することができ、この標準は、障害を有しない個体から得た第２の生物学的試料から取られるか、又は障害を有しない個体集団のレベルを平均することにより決定される。当該技術分野では理解されるであろうとおり、一度「標準」ＡＳＣＴ２ポリペプチドレベルが分かれば、それを比較の標準として繰り返し使用することができる。
「生物学的試料」とは、潜在的にＡＳＣＴ２を発現する個体、細胞株、組織培養物、又は他の細胞供給源から得られる任意の生物学的試料が意図される。哺乳動物から組織生検及び体液を得る方法は、当該技術分野において周知である。
ＩＸ．ＡＳＣＴ２結合分子を含むキット
本開示は、本明細書に記載されるＡＳＣＴ２結合分子を含む、且つ本明細書に記載される方法の実施に使用することのできるキットを更に提供する。特定の実施形態において、キットは１つ以上の容器に少なくとも１つの精製抗ＡＳＣＴ２抗体又はその抗原結合断片を含む。一部の実施形態において、キットは１つ以上の容器に少なくとも１つの精製ＡＳＣＴ２−ＡＤＣを含む。一部の実施形態において、キットには、全ての対照、アッセイの実施に関する説明書、並びに結果の分析及び発表に必要な任意のソフトウェアを含め、検出アッセイの実施に必要及び／又は十分な構成要素の全てが含まれる。当業者は、本開示のＡＳＣＴ２結合分子を当該技術分野において周知の確立されたキットフォーマットの１つに容易に組み込み得ることを容易に認識するであろう。
Ｘ．イムノアッセイ
本明細書に提供されるＡＳＣＴ２結合分子は、当該技術分野において公知の任意の方法による免疫特異的結合に関するアッセイにおいて使用することができる。用いることのできるイムノアッセイとしては、限定はされないが、ウエスタンブロット、ＲＩＡ、ＥＬＩＳＡ、ＥＬＩＳＰＯＴ、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降反応、ゲル内拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集反応アッセイ、補体結合アッセイ、イムノラジオメトリックアッセイ、蛍光イムノアッセイ、及びプロテインＡイムノアッセイなどの技法を用いた競合及び非競合アッセイシステムが挙げられる。かかるアッセイは常法であり、当該技術分野において周知である。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ，（１９９４）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ）Ｖｏｌ．１（参照により全体として本明細書に援用される）を参照されたい。
本明細書に提供されるＡＳＣＴ２結合分子は、例えばＡＳＣＴ２又はその保存された変異体若しくはペプチド断片のインサイチュー検出のため、免疫蛍光法、免疫電子顕微鏡法、又は非免疫学的アッセイにあるように、組織学的に利用することができる。インサイチュー検出は、患者から組織標本を採取して、それに標識ＡＳＣＴ２結合分子を適用することにより（例えば、標識ＡＳＣＴ２結合分子を生体試料上に重ね合わせることにより適用される）達成することができる。かかる手順を用いることにより、ＡＳＣＴ２、又は保存された変異体若しくはペプチド断片の存在のみならず、被験組織におけるその分布も決定することが可能である。本発明を用いることにより、当業者は、かかるインサイチュー検出を実現するため、多種多様な組織学的方法の任意のもの（染色手順など）を変更し得ることを容易に理解するであろう。
ＡＳＣＴ２結合分子の所与のロットの結合活性は、周知の方法により決定することができる。当業者は、ルーチンの実験を用いて各決定に有効且つ最適なアッセイ条件を決定することができるであろう。
単離ＡＳＣＴ２結合分子の結合特性の決定に好適な方法及び試薬は、当該技術分野において公知であり、及び／又は市販されている。かかる反応速度論的分析用に設計された機器及びソフトウェアは市販されている（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ（登録商標）ソフトウェア、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；ＫＩＮＥＸＡ（登録商標）ソフトウェア、Ｓａｐｉｄｙｎｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）。
本発明の実施には、特に指示されない限り、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、及び免疫学の従来技術が用いられ、それらは当該技術分野の技術の範囲内にある。かかる技法は、文献に十全に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ ｅｄ．；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．（１９９２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ）；Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ ｅｄ．，（１９８５）ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ；Ｇａｉｔ，ｅｄ．（１９８４）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；Ｍｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．米国特許第４，６８３，１９５号明細書；Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ；Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．（１９８４）Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（１９８７）Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ（Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ）（１９８６）；Ｐｅｒｂａｌ（１９８４）Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ；ｔｈｅ ｔｒｅａｔｉｓｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．）；Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｃａｌｏｓ ｅｄｓ．（１９８７）Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．１５４ ａｎｄ １５５；Ｍａｙｅｒ ａｎｄ Ｗａｌｋｅｒ，ｅｄｓ．（１９８７）Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｃｅｌｌ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ）；Ｗｅｉｒ ａｎｄ Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，（１９８６）Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ−ＩＶ；Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，（１９８６）；及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ．）を参照されたい。
抗体工学の一般原理は、Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ，ｅｄ．（１９９５）Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（２ｎｄ ｅｄ．；Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ）に記載される。タンパク質工学の一般原理は、Ｒｉｃｋｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．（１９９５）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇ．）に記載される。抗体及び抗体−ハプテン結合の一般原理は、Ｎｉｓｏｎｏｆｆ（１９８４）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２ｎｄ ｅｄ．；Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，Ｍａｓｓ．）；及びＳｔｅｗａｒｄ（１９８４）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｔｈｅｉｒ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ（Ｃｈａｐｍａｎ ａｎｄ Ｈａｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．）に記載される。加えて、当該技術分野において公知の、具体的には記載されない免疫学の標準方法が、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｓｔｉｔｅｓ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．（１９９４）Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（８ｔｈ ｅｄ；Ａｐｐｌｅｔｏｎ＆Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，Ｃｏｎｎ．）及びＭｉｓｈｅｌｌ ａｎｄ Ｓｈｉｉｇｉ（ｅｄｓ）（１９８０）Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，ＮＹ）にあるとおり、一般に用いられる。
免疫学の一般原理について記載する標準的な参考文献としては、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｋｌｅｉｎ（１９８２）Ｊ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｏｆ Ｓｅｌｆ−Ｎｏｎｓｅｌｆ Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ）；Ｋｅｎｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．（１９８０）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ：Ａ Ｎｅｗ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｅｓ（Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ）；Ｃａｍｐｂｅｌｌ（１９８４）“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”ｉｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄ．Ｂｕｒｄｅｎ ｅｔ ａｌ．，（Ｅｌｓｅｖｅｒｅ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ）；Ｇｏｌｄｓｂｙ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．（２０００）Ｋｕｂｙ Ｉｍｍｕｎｎｏｌｏｇｙ（４ｔｈ ｅｄ．；Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎｄ＆Ｃｏ．）；Ｒｏｉｔｔ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（６ｔｈ ｅｄ．；Ｌｏｎｄｏｎ：Ｍｏｓｂｙ）；Ａｂｂａｓ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（５ｔｈ ｅｄ．；Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）；Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｄｕｂｅｌ（２００１）Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｎ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ）；Ｌｅｗｉｎ（２００３）Ｇｅｎｅｓ ＶＩＩＩ（Ｐｒｅｎｔｉｃｅ Ｈａｌｌ２００３）；Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ）；Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ ａｎｄ Ｄｖｅｋｓｌｅｒ（２００３）ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ）が挙げられる。
本開示に引用される全ての参考文献が、本明細書によって全体として参照により援用される。加えて、本明細書に引用又は言及される任意の製品の任意の製造者説明書又はカタログが参照によって援用される。本明細書に参照によって援用される資料、又はそれらにある任意の教示は、本発明の実施において用いることができる。本明細書に参照によって援用される資料が先行技術であると承認するものではない。
ＸＩ．実施形態
実施形態１．中性アミノ酸トランスポーター２（ＡＳＣＴ２）のエピトープに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片であって、重鎖可変領域（ＶＨ）の３つの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）と軽鎖可変領域（ＶＬ）の３つの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）［ＨＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列番号１０に示され、ＨＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列番号２２に示され、ＨＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列番号２３に示され、ＬＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列番号１３に示され、ＬＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列番号２４に示され、及びＬＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列番号２５に示される］とを含む抗体又はその抗原結合断片と同じＡＳＣＴ２エピトープに特異的に結合する、抗体又はその抗原結合断片。
実施形態２．配列番号１０又は配列番号１６のアミノ酸配列のＨＣＤＲ１、配列番号１１又は配列番号１７のアミノ酸配列のＨＣＤＲ２、配列番号１２又は配列番号１８のアミノ酸配列のＨＣＤＲ３、配列番号１３又は配列番号１９のアミノ酸配列のＬＣＤＲ１、配列番号１４又は配列番号２０のアミノ酸配列のＬＣＤＲ２、及び配列番号１５又は配列番号２１のアミノ酸配列のＬＣＤＲ３を含む、実施形態１の抗体又は抗原結合断片。
実施形態３．ＶＨが、配列番号１、配列番号３、配列番号５、及び配列番号７から選択されるアミノ酸配列を含み、ＶＬが、配列番号２、配列番号４、配列番号６、及び配列番号８から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態１又は実施形態２のいずれかの抗体又は抗原結合断片。
実施形態４．ＶＨが配列番号５のアミノ酸配列を含み、且つＶＬが配列番号６のアミノ酸配列を含む、実施形態１〜３のいずれか１つに係る抗体又は抗原結合断片。
実施形態５．ＶＨがアミノ酸配列の配列番号７を含み、且つＶＬがアミノ酸配列の配列番号８を含む、実施形態１〜３のいずれか１つに係る抗体又は抗原結合断片。
実施形態６．ＩｇＧ定常領域が位置２３９のセリン（Ｓ）と位置２４０のＶとの間にシステイン（Ｃ）挿入を含む、実施形態１〜５のいずれか１つに係る抗体又は抗原結合断片。
実施形態７．抗体が配列番号９のアミノ酸配列の重鎖を含む、実施形態６に係る抗体又は抗原結合断片。
実施形態８．抗体が細胞表面上のＡＳＣＴ２に結合すると、抗体が細胞にインターナライズする、実施形態１〜７のいずれか１つに係る抗体又は抗原結合断片。
実施形態９．ヒトκ定常領域及びヒトλ定常領域からなる群から選択される軽鎖定常領域を含む、実施形態１〜８のいずれか１つに係る抗体又は抗原結合断片。
実施形態１０．抗体が配列番号２６のヒトκ定常領域を含む、実施形態９に係る抗体又は抗原結合断片。
実施形態１１．抗菌剤、治療剤、プロドラッグ、ペプチド、タンパク質、酵素、脂質、生物学的反応修飾物質、医薬品、リンホカイン、異種抗体、異種抗体の断片、検出可能標識、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、放射性同位元素、及び任意の前記サイトトキシンの２つ以上の組み合わせからなる群から選択されるサイトトキシンに更にコンジュゲートされる、実施形態１〜１０のいずれか１つに係る抗体又は抗原結合断片。
実施形態１２．サイトトキシンにコンジュゲートされる、実施形態１１に係る抗体又は抗原結合断片。
実施形態１３．サイトトキシンがツブリシン誘導体及びピロロベンゾジアゼピンから選択される、実施形態１２に係る抗体又は抗原結合断片。
実施形態１４．ツブリシン誘導体がツブリシンＡＺ１５０８である、実施形態１３に係る抗体又は抗原結合断片。
実施形態１５．ピロロベンゾジアゼピンがＳＧ３３１５及びＳＧ３２４９から選択される、実施形態１３に係る抗体又は抗原結合断片。
実施形態１６．ピロロベンゾジアゼピンがＳＧ３３１５である、実施形態１５に係る抗体又は抗原結合断片。
実施形態１６Ａ．ピロロベンゾジアゼピンがＳＧ３２４９である、実施形態１５に係る抗体又は抗原結合断片。
実施形態１７．抗体がヒトＡＳＣＴ２及びカニクイザルＡＳＣＴ２に結合する、実施形態１〜１６のいずれか１つに係る抗体又は抗原結合断片。
実施形態１８．抗体がヒトＡＳＣＴ１に特異的に結合しない、実施形態１〜１７のいずれか１つに係る抗体又は抗原結合断片。
実施形態１９．実施形態１〜１８のいずれか１つの抗体又は抗原結合断片と薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物。
実施形態２０．実施形態１〜１９のいずれか１つに係る抗体又はその抗原結合断片をコードするポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドの組み合わせ。
実施形態２１．実施形態２０に係るポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドの組み合わせを含むベクター。
実施形態２２．請求項２０に係るポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドの組み合わせ又は実施形態２１に係るベクターを含む宿主細胞。
実施形態２３．配列番号１０のアミノ酸配列のＨＣＤＲ１、配列番号２２のアミノ酸配列のＨＣＤＲ２、配列番号２３のアミノ酸配列のＨＣＤＲ３、配列番号１３のアミノ酸配列のＬＣＤＲ１、配列番号２４のアミノ酸配列のＬＣＤＲ２、及び配列番号２３のアミノ酸配列のＬＣＤＲ３を含み、サイトトキシンにコンジュゲートされる、抗体又はその抗原結合断片。
実施形態２３Ａ．配列番号１０のアミノ酸配列のＨＣＤＲ１、配列番号２２のアミノ酸配列のＨＣＤＲ２、配列番号２３のアミノ酸配列のＨＣＤＲ３、配列番号１３のアミノ酸配列のＬＣＤＲ１、配列番号２４のアミノ酸配列のＬＣＤＲ２、及び配列番号２５のアミノ酸配列のＬＣＤＲ３を含み、サイトトキシンにコンジュゲートされる、抗体又はその抗原結合断片。
実施形態２４．アミノ酸配列の配列番号７を含むＶＨドメインと、アミノ酸配列の配列番号８を含むＶＬドメインとを含む、実施形態２３に係る抗体又はその抗原結合断片。
実施形態２４Ａ．アミノ酸配列の配列番号５を含むＶＨドメインと、アミノ酸配列の配列番号６を含むＶＬドメインとを含む、実施形態２３に係る抗体又はその抗原結合断片。
実施形態２５．サイトトキシンが、抗菌剤、治療剤、プロドラッグ、ペプチド、タンパク質、酵素、脂質、生物学的反応修飾物質、医薬品、リンホカイン、異種抗体、異種抗体の断片、検出可能標識、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、放射性同位元素、及び任意の前記サイトトキシンの２つ以上の組み合わせからなる群から選択される、実施形態２３又は実施形態２４に係る抗体又は抗原結合断片。
実施形態２６．サイトトキシンがツブリシン誘導体及びピロロベンゾジアゼピンから選択される、実施形態２３又は実施形態２４に係る抗体又は抗原結合断片。
実施形態２７．ツブリシン誘導体がツブリシンＡＺ１５０８である、実施形態２６に係る抗体又は抗原結合断片。
実施形態２８．ピロロベンゾジアゼピンがＳＧ３３１５及びＳＧ３２４９から選択される、実施形態２６に係る抗体又は抗原結合断片。
実施形態２９．ピロロベンゾジアゼピンがＳＧ３３１５である、実施形態２８に係る抗体又は抗原結合断片。
実施形態２９Ａ．ピロロベンゾジアゼピンがＳＧ３２４９である、実施形態２８に係る抗体又は抗原結合断片。
実施形態３０．実施形態２３〜２９に係る抗体又は抗原結合断片と薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物。
実施形態３１．抗体又はその抗原結合断片を作製する方法であって、実施形態２２の宿主細胞を培養するステップと、抗体又は抗原結合断片を単離するステップとを含む方法。
実施形態３２．実施形態１〜１８又は２３〜２９のいずれか１つに係る抗体又は抗原結合断片を含む診断試薬。
実施形態３３．実施形態１〜１８若しくは２３〜２９のいずれか１つに係る抗体若しくは抗原結合断片、又は実施形態１９若しくは３０に係る組成物を含むキット。
実施形態３４．ＡＳＣＴ２発現細胞に薬剤を送達する方法であって、実施形態２３〜２９のいずれか１つに係る抗体又は抗原結合断片に細胞を接触させるステップを含み、薬剤が細胞によってインターナライズされる、方法。
実施形態３５．ＡＳＣＴ２発現細胞の死滅を誘導する方法であって、実施形態２３〜２９のいずれか１つに係る抗体又は抗原結合断片を細胞に接触させるステップを含み、サイトトキシンにコンジュゲートされた抗体がＡＳＣＴ２発現細胞の死滅を誘導する、方法。
実施形態３６．対象におけるＡＳＣＴ２の過剰発現によって特徴付けられる癌を治療する方法であって、治療を必要としている対象に、実施形態１〜１８若しくは２３〜２９のいずれか１つに係る抗体若しくは抗原結合断片、又は実施形態１９若しくは実施形態３０に係る組成物の有効量を投与するステップを含む方法。
実施形態３７．癌が、結腸直腸癌、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）、前立腺癌、肺癌、膵癌、黒色腫、子宮内膜癌、及び血液癌（ＡＭＬ、ＭＭ、ＤＬＢＣＬ）からなる群から選択される、実施形態３６に係る方法。
実施形態３７Ａ 癌がＣＳＣを含む、実施形態３６に係る方法。
実施形態３８．血液癌が、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性単球性白血病（ＡＭｏＬ）、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、及び多発性骨髄腫から選択される、実施形態３７に係る方法。
実施形態３９．試料中のＡＳＣＴ２発現レベルを検出する方法であって、実施形態１〜１８若しくは又は２３〜２９のいずれか１つに係る抗体若しくはその抗原結合断片、又は実施形態１９若しくは実施形態３０に係る組成物に試料を接触させるステップと、試料中のＡＳＣＴ２への抗体又はその抗原結合断片の結合を検出するステップとを含む方法。
実施形態４０．試料が細胞培養物である、実施形態３９に係る方法。
実施形態４１．試料が単離組織である、実施形態３９に係る方法。
実施形態４２．試料がヒト由来である、実施形態３９に係る方法。
実施形態４３．配列番号１０のアミノ酸配列のＨＣＤＲ１、配列番号１１のアミノ酸配列のＨＣＤＲ２、配列番号１２のアミノ酸配列のＨＣＤＲ３、配列番号１３のアミノ酸配列のＬＣＤＲ１、配列番号１４のアミノ酸配列のＬＣＤＲ２、配列番号１５のアミノ酸配列のＬＣＤＲ３を含む抗体又はその抗原結合断片と、ツブリシンＡＺ１５０８とを含むＡＳＣＴ２抗体−薬物コンジュゲート（ＡＳＣＴ２−ＡＤＣ）。
実施形態４４．配列番号１０のアミノ酸配列のＨＣＤＲ１、配列番号１１のアミノ酸配列のＨＣＤＲ２、配列番号１２のアミノ酸配列のＨＣＤＲ３、配列番号１３のアミノ酸配列のＬＣＤＲ１、配列番号１４のアミノ酸配列のＬＣＤＲ２、配列番号１５のアミノ酸配列のＬＣＤＲ３を含む抗体又はその抗原結合断片と、ＰＢＤ ＳＧ３２４９とを含むＡＳＣＴ２−ＡＤＣ。
実施形態４５．配列番号１０のアミノ酸配列のＨＣＤＲ１、配列番号１１のアミノ酸配列のＨＣＤＲ２、配列番号１２のアミノ酸配列のＨＣＤＲ３、配列番号１３のアミノ酸配列のＬＣＤＲ１、配列番号１４のアミノ酸配列のＬＣＤＲ２、配列番号１５のアミノ酸配列のＬＣＤＲ３を含む抗体又はその抗原結合断片と、ツブリシンと、ＰＢＤ ＳＧ３３１５とを含むＡＳＣＴ２−ＡＤＣ。
実施形態４６．配列番号１６のアミノ酸配列のＨＣＤＲ１、配列番号１７のアミノ酸配列のＨＣＤＲ２、配列番号１８のアミノ酸配列のＨＣＤＲ３、配列番号１９のアミノ酸配列のＬＣＤＲ１、配列番号２０のアミノ酸配列のＬＣＤＲ２、及び配列番号２１のアミノ酸配列のＬＣＤＲ３を含む抗体又はその抗原結合断片と、ツブリシンＡＺ１５０８とを含むＡＳＣＴ２−ＡＤＣ。
実施形態４７．配列番号１６のアミノ酸配列のＨＣＤＲ１、配列番号１７のアミノ酸配列のＨＣＤＲ２、配列番号１８のアミノ酸配列のＨＣＤＲ３、配列番号１９のアミノ酸配列のＬＣＤＲ１、配列番号２０のアミノ酸配列のＬＣＤＲ２、及び配列番号２１のアミノ酸配列のＬＣＤＲ３を含む抗体又はその抗原結合断片と、ＰＢＤ ＳＧ３２４９とを含むＡＳＣＴ２−ＡＤＣ。
実施形態４８．配列番号１６のアミノ酸配列のＨＣＤＲ１、配列番号１７のアミノ酸配列のＨＣＤＲ２、配列番号１８のアミノ酸配列のＨＣＤＲ３、配列番号１９のアミノ酸配列のＬＣＤＲ１、配列番号２０のアミノ酸配列のＬＣＤＲ２、及び配列番号２１のアミノ酸配列のＬＣＤＲ３を含む抗体又はその抗原結合断片と、ＰＢＤ ＳＧ３３１５とを含むＡＳＣＴ２−ＡＤＣ。
以下の例は、限定としてではなく、例示として提供される。
本開示の実施形態は、以下の非限定的な例を参照することによって更に定義され得る。これらの例は、本開示の特定の抗体の調製及び本開示の抗体の使用方法を詳細に記載するものである。当業者には、本開示の範囲から逸脱することなく材料及び方法の両方に対して多くの変更を行い得ることが明らかであろう。
実施例１．ヒト正常組織及び癌組織におけるＡＳＣＴ２発現
ＩＨＣによって分析した正常組織及び腫瘍組織におけるＡＳＣＴ２タンパク質発現
ＡＳＣＴ２のタンパク質発現を評価するため、正常ヒト及びヒト腫瘍ホルムアルデヒド固定組織の切片でＩＨＣを行った。クエン酸塩緩衝液（ｐＨ＝６．０）による抗原回復処理後、製造者のプロトコルに従い抗ＡＳＣＴ２ウサギポリクローナル抗体（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ；カタログ番号ＡＢＮ７３）によって組織を試験した。ＨＴ２９細胞株を陽性対照として使用し、及び初代ヒトヘパトサイト細胞を陰性対照として使用してプロトコルの最適化を実施した。
正常組織では、肝臓、心臓、肺細胞、糸球体、及び脳にＡＳＣＴ２の染色は観察されなかった。
ヒト腫瘍におけるＡＳＣＴ２発現
様々な癌性組織にわたってＡＳＣＴ２発現をＩＨＣによって判定した。結腸癌、肺扁平上皮癌、頭頸部癌、及び前立腺癌組織を含めた固形腫瘍、並びにＡＭＬ、ＭＭ、及びＤＬＢＣＬなどの血液癌に強力なＡＳＣＴ２膜発現が観察された。加えて、卵巣子宮内膜癌組織及び黒色腫組織にＡＳＣＴ２高発現が観察された。以下の表２は、ヒト癌組織におけるＡＳＣＴ２発現の概要を提供する。
Figure 2018535674
ＡＭＬ及びＭＭの癌幹細胞にＡＳＣＴ２発現が観察された。癌幹細胞におけるＡＳＣＴ２は、フルオロフォアＡｌｅｘａ ６４７をコンジュゲートしたＡＳＣＴ２抗体１７ｃ１０を使用したフローサイトメトリーによって判定した。図１Ａに示されるとおり、ＡＭＬ及びＭＭ患者におけるＡＳＣＴ２の発現は正常骨髄よりも実質的に高かった。ＣＤ３８＋、ＣＤ３８−、ＣＤ３４＋；ＣＤ３４−；ＣＤ３８＋及びＣＤ３４＋；並びにＣＤ３８−及びＣＤ３４−など、種々のサブ集団を分類するフローサイトメトリーを用いることにより、細胞を単離し、各サブ集団でクローン原性アッセイを実施することによりその幹細胞特性を更に特徴付けた。本発明者らは、ＣＤ３８＋、ＣＤ３４＋細胞のみがコロニーを形成したことを見出し、これは文献に記載されている知見を更に裏付けるものである（Ｌａｐｉｄｏｔ Ｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ １９９４；３６７（６４６４）：６４５−８；Ｂｏｎｎｅｔ Ｄ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｍｅｄ １９９７；３（７）：７３０−７）。上記に記載されるサブ集団の全てにおいてＡＳＣＴ２発現を判定した。図１Ｂは、ＡＭＬ患者試料の白血病幹細胞集団、即ち、ＣＤ３８＋、ＣＤ３４＋集団におけるＡＳＣＴ２高発現を示す。同様に、ＡＳＣＴ２発現はまた、図１Ｃに示されるとおり、ＡＭＬにおけるバルク又は非白血病幹細胞集団でも高い。更に、ＭＭ腫瘍のＣＤ１３８＋、ＣＤ１９−（形質細胞）及びＣＤ１３８−、ＣＤ１９＋（幹細胞）細胞でもＡＳＣＴ２発現を判定した。図１Ｃのヒストグラムは、ＭＭの幹細胞と比較した形質細胞におけるＡＳＣＴ２高発現を示唆する。このデータは、健常ドナーの骨髄と比較してＡＭＬ及びＭＭ患者試料の骨髄でＡＳＣＴ２発現が観察されたことを裏付けている。更に、ＡＳＣＴ２はＡＭＬ患者試料の白血病幹細胞（ＬＳＣ）（ＣＤ３４＋／ＣＤ３８＋）で高度に過剰発現する。更に、ＭＭ形質細胞としても定義されるＣＤ１３８＋、ＣＤ１９−細胞が、幹細胞集団（ＣＤ１３８−、ＣＤ１９＋）と比較してより高いＡＳＣＴ２発現を示す。
ＡＳＣＴ２発現はまた、膵腫瘍の癌幹細胞にも観察された。膵臓固形腫瘍断片をＩＩＩ型コラーゲンで消化して単一細胞懸濁液を作製した。解離した細胞を、細胞表面タンパク質、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ４４、ＣＤ２４に対する抗体、及び先述のＡＳＣＴ２抗体で染色した。膵癌幹細胞の細胞表面タンパク質シグネチャは十分に特徴付けられている。ＥｐＣＡＭ＋ ＣＤ４４＋ ＣＤ２４＋細胞が、膵腫瘍の癌幹細胞として定義される（Ｌｉ，Ｃ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００７；６７：１０３０−１０３７）。ＣＳＣ集団（ＥｐＣＡＭ＋、ＣＤ４４＋、ＣＤ２４＋）におけるＡＳＣＴ２発現の例が図１Ｄに示される。この同じ戦略を用いて、ＡＳＣＴ２−ＰＢＤ ＡＤＣ又はアイソタイプ対照ＡＤＣによる単回投与処理後の膵腫瘍の癌幹細胞集団におけるＡＳＣＴ２発現を判定した。図１Ｅは、ＡＳＣＴ２−ＰＢＤ ＡＤＣが癌幹細胞集団を除去することを実証している。本明細書におけるデータは、ＡＳＣＴ２のターゲティングが固形腫瘍のみならず、血液癌及び癌幹細胞でも有効となり得ることを実証している。
実施例２．抗ＡＳＣＴ２抗体の作成
免疫化及びハイブリドーマ作成
ヒトＡＳＣＴ２遺伝子を有するプラスミドのＤＮＡ免疫化（Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４９：１４７，２００１）により、ＡＳＣＴ２に対する抗体を作成した。ヒトＡＳＣＴ２の遺伝子を発現プラスミドｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にクローニングした。８週齢ＶｅｌｏｃＩｍｍｕｎｅ ＩＩマウス（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ、Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ，ＮＹ）の尾基底部に１００μｇのＡＳＣＴ２発現プラスミドをＰＢＳ中１ｍｇ／ｍＬで１週間おきに皮内注射した。初回の注射後２８日目から開始して２週間間隔で被験血液を採取し、フローサイトメトリーによってＡＳＣＴ２特異抗体をアッセイした。被験血液の段階希釈物を、ＡＳＣＴ２又は無関係の細胞表面タンパク質のいずれかを発現する２９３Ｆ細胞と共にインキュベートした。５６日目及び７０日目、比力価が最も高いマウスを犠牲にした。リンパ節及び脾臓からリンパ球を単離し、ポリエチレングリコール（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）融合方法に従い骨髄腫細胞株Ｐ３ｘ／６３Ａｇ８．６５３と１：１比で融合させた。ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン（ＨＡＴ）含有ハイブリドーマ成長培地で融合した細胞を選択した。
フローサイトメトリースクリーニングアッセイ
ＡＳＣＴ２を発現するＨＥＫ ２９３Ｆ細胞への結合に関してハイブリドーマ上清を評価した。ＡＳＣＴ２を発現するＨＥＫ ２９３Ｆ細胞に特異的に結合することがフローサイトメトリーによって分かった上清について、ＡＳＣＴ２発現癌細胞株のパネルによるフローサイトメトリー染色によってＡＳＣＴ２特異的結合を更に確認した。最後に、確認された上清を更なる結合評価のためヒトＩｇＧ１に変換した。
ヒト抗ＡＳＣＴ２ ＩｇＧ ｍＡｂ及びＦａｂのクローニング及び発現
ハイブリドーマを限界希釈によってサブクローニングした。プロテインＡアフィニティー精製ＩｇＧサブクローンの上清を親ハイブリドーマについて上記に記載したとおりフローサイトメトリーによってＡＳＣＴ２特異抗体に関してスクリーニングした。サブクローニングしたハイブリドーマのｍＲＮＡをＤｙｎａｂｅａｄｓ ｍＲＮＡ Ｄｉｒｅｃｔキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して単離した。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びランダムヘキサマープライマーを使用してｃＤＮＡの第１の鎖を合成した。ヒトＩｇ ＶＬ及びＶＨ遺伝子をＮｏｖａｇｅｎ（登録商標）変性Ｉｇ−プライマー（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号６９８３０）のセットでＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ増幅したＶＬ及びＶＨ産物をプラスミドｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、シーケンシングした。各ハイブリドーマからのＶＨ及びＶＬ遺伝子をＰＣＲによって再増幅して、ヒトＩｇＧκ ｐＯＥベクターにクローニングするための制限酵素部位を加え、ここで、ＶＬは、ヒトｃ−κと融合したＢｓｓＨＩＩ／ＢｓｉＷＩ部位にクローニングされ、及びＶＨは、ヒトＩｇＧ−１重鎖定常領域（又はＦａｂ作成についてはＣＨ１領域）と融合したＢｓｒＧＩ／ＳａｌＩ部位にクローニングされた。得られたｐＯＥプラスミドをＤＮＡシーケンシングによって確認した。
抗ＡＳＣＴ２抗体をＨｅｋ２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）又はＣＨＯ−Ｇ２２細胞のいずれかで一過性に発現させた。Ｈｅｋ２９３Ｆ細胞での発現については、製造者のプロトコルに従い２９３ｆｅｃｔｉｎ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；カタログ番号１２３４７−０１９）を使用してトランスフェクションを実施した。この細胞をＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３発現培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；カタログ番号１２３３８−０１８）で培養し、トランスフェクション後３及び６日目に培養容積を二倍にした。トランスフェクトＨｅｋ２９３Ｆ細胞を合計１１日間培養した。ＣＨＯ−Ｇ２２細胞での発現については、製造者のプロトコルを用いて２５ｋＤａ線状ポリエチレンイミン（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ，ＰＡ）を使用して細胞をトランスフェクトした。この細胞をＣＤ ＣＨＯ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で培養し、インハウスフィードを隔日で供給した。トランスフェクトしたＣＨＯ−Ｇ２２細胞を合計１２日間培養した。
プロテインＡクロマトグラフィーによる完全長ヒトＩｇＧの単離後、結合をフローサイトメトリーによって再度評価した。図２は、モックトランスフェクト細胞と比較したときのヒトＡＳＣＴ２を発現する細胞への単離ヒトＩｇＧの１ｅ８、３ｆ７、５ａ２、９ｂ３、１０ｃ３、１６ｂ８、１７ｃ１０、及び１７ａ１０の結合の倍数変化を示す棒グラフを描く。この図に見られるとおり、完全長ヒトＩｇＧの幾つかはＡＳＣＴ２結合活性を保持することが分かった。
実施例３．抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）としてのＡＳＣＴ２結合抗体
ＡＳＣＴ２結合抗体のＡＤＣ媒介細胞傷害性の評価
親抗体のインターナリゼーションを確かめるため、及びそれらが細胞傷害性ペイロードを送達することができるかどうかを予測するため、製造者の指示に従いＨｕｍ−ＺＡＰ抗体インターナリゼーションアッセイ（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）で親抗体を試験した。簡潔に言えば、ＡＳＣＴ２陽性ＷｉＤｒ細胞を組織培養処理９６ウェルプレートの１ウェル当たり１，０００細胞の密度で培養培地に播き、３７℃／５％ＣＯ２で一晩接着させた。被験物質を調製するため、リボソーム不活性化タンパク質であるサポリンにコンジュゲートした二次抗体（ヤギ抗ヒトＩｇＧ）と共に各親抗体を室温で３０分間インキュベートして二次コンジュゲートを形成した。次に、この二次コンジュゲートの段階希釈物を調製し、細胞が入ったウェルに加えた。
３７℃／５％ＣＯ２で７２時間インキュベートした後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）発光生存率アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して相対的細胞傷害性を決定した。簡潔に言えば、各ウェルにＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）試薬を加え、軽く振盪しながら室温で１０分間インキュベートさせておいた。各試料の吸光度をＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＥｎＶｉｓｉｏｎ（登録商標）ルミノメーターを使用して５６０ｎＭで読み取った。親抗体１Ｅ８又は１７Ｃ１０、サポリンに化学的に連結した抗ＡＳＣＴ２抗体（ｈＩｇＧ−サポリン）、又はサポリンに化学的に連結したアイソタイプ対照で処理した細胞の相対的増殖率（％）を未処理対照細胞の相対的生存率と比較した。図３Ａに示されるとおり、サポリンに化学的に連結されていない抗ＡＳＣＴ２抗体で処理した細胞では、サポリンコンジュゲート抗体で処理した細胞と比べて相対的細胞増殖率が低かった。
ツブリシンペイロードと古典的にコンジュゲートした抗ＡＳＣＴ２抗体のＡＤＣ媒介細胞傷害性の評価
ツブリシンペイロードにコンジュゲートした抗ＡＳＣＴ２抗体によるＡＤＣ媒介死滅を確認するため、リード抗体１Ｅ８及び１７Ｃ１０をツブリシンクラスの毒素と直接コンジュゲートし、コンジュゲート抗体による細胞傷害性死滅をＡＳＣＴ２陽性結腸癌細胞で試験した。簡潔に言えば、ＳＷ４８細胞を組織培養処理９６ウェルプレートの１ウェル当たり１，０００細胞の密度で培養培地に播き、３７℃／５％ＣＯ２で一晩接着させた。被験物質を調製するため、ツブリシンペイロードとコンジュゲートした各抗体（ＡＳＣＴ２リード１Ｅ８及び１７Ｃ１０、及びアイソタイプ対照）を段階希釈し、それぞれのウェルに加えた。３７℃／５％ＣＯ２で７２時間インキュベートした後、上記に記載したとおり、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）発光生存率アッセイを用いて相対的細胞傷害性を決定した。
パーセント細胞生存率は、以下の式：（処理した試料の平均発光／対照試料の平均発光）×１００によって計算した。ＩＣ５０値はＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアでロジスティック非線形回帰分析を用いて決定した。図３Ｂは、ツブリシンＡＺ１５０８に古典的にコンジュゲートした抗ＡＳＣＴ２ １Ｅ８、抗ＡＳＣＴ２ １７Ｃ１０、及びアイソタイプ対照Ｒ３４７の細胞傷害性のグラフを示す。この図は、両方の抗ＡＳＣＴ２抗体が同程度の細胞傷害性を有することを示す。計算されたＩＣ５０値を以下の表３に示す。
Figure 2018535674
部位特異的コンジュゲーション用のシステイン突然変異のクローニング
標準的なオーバーラップＰＣＲ方法を用いて、抗ＡＳＣＴ２抗体１Ｅ８及び１７Ｃ１０のＣＨ２領域のアミノ酸Ｓ２３９及びＶ２４０間にシステイン残基を導入した。「２３９挿入」又は「２３９ｉ」と称されるこのシステインは、抗ＡＳＣＴ２ ＡＤＣ抗体の調製において細胞傷害薬のコンジュゲーション部位として働くことになる。Ｍａｉａ挿入を含む重鎖骨格のアミノ酸配列を配列番号９に示す。導入されたシステインを含む抗体を、本質的に以下に記載するとおり、ツブリシンペイロード（ツブリシンＡＺ１５０８）又はピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）ペイロード（ＳＧ３２４９又はＳＧ３３１５）にコンジュゲートした。
マレイミド含有薬物のコンジュゲーション
ＡＤＣペイロード（ＡＺ１５０８、ＳＧ３２４９、ＳＧ３３１５）に関して判定した全ての化合物が、リンカー及び抗体のチオール残基に容易にコンジュゲートするマレイミド基を含み、チオール−マレイミド連結を形成する。マレイミド基を含むサイトトキシン（例えば、ツブリシン１５０８）は、本発明の抗ＡＳＣＴ２抗体（例えば、１７ｃ１０、１ｅ８）に操作して入れた特異的システイン残基にコンジュゲートし得る。或いは又は任意選択で、古典的なコンジュゲーション方法を用いて細胞傷害剤を記載の抗体に付加してもよい。サイトトキシンを抗体上の天然のリジン及びシステイン残基にコンジュゲートする方法は、当該技術分野において周知である。部位特異的コンジュゲーション（操作されたシステイン残基における）及び古典的コンジュゲーション（天然システイン残基における）の代表的な方法を以下に提供する。
代表的な部位特異的抗体−薬物コンジュゲーション方法は、（ａ）誘導体化可能なアミノ酸（例えば、システイン）の側鎖のキャップを除去するステップ、（ｂ）酸化ステップ、（ｃ）ペイロード（例えば、ツブリシン１５０８などの細胞傷害剤）をコンジュゲートするステップ、及び（ｄ）コンジュゲーション試薬及び非反応性ペイロードを取り除くことによるポリッシングステップを含む。例えば、操作されたシステインへのコンジュゲーションは、１×ＰＢＳ中の抗体を１ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）と共に配合することにより行ってもよい。１抗体当たり４０当量のトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩を加えて３７℃で３時間インキュベートすることにより、軽い還元を用いて遊離チオールを生じさせる。１ｍＭ ＥＤＴＡを含む１×ＰＢＳでの３回連続の透析を用いてトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩を除去する。或いは、脱塩カラムを用いてトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩を除去してもよい。約２０当量のデヒドロアビエチン酸（ｄｈＡＡ）を加えて室温で約４時間インキュベートすることにより、抗体鎖間ジスルフィド結合を再形成させた。
コンジュゲーション調製において、抗ＡＳＣＴ２抗体に１０％ｖ／ｖとなるようにジメチルスルホキシドを加えた。ジメチルスルホキシド中８又は１２当量のツブリシン１５０８ペイロード（それぞれ２Ｔ及び４Ｔ薬物負荷用）を加え、この混合物を室温で約１時間インキュベートした。或いは、インキュベーションは４℃で約１６時間行うことができる。１ペイロード当たり約４モル当量（即ち、３２又は４８）のＮ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）を加えることにより反応をクエンチした。製造者の推奨に従いセラミックヒドロキシアパタイトを使用することにより、コンジュゲート抗体から遊離ペイロードを除去した。必要に応じて最終産物を緩衝液交換に供してもよい。純度及び重鎖へのコンジュゲーションを確認するため、コンジュゲート抗体は当該技術分野において公知の任意の方法により分析し得る。一部の例では、非還元及び還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて純度及び重鎖へのコンジュゲーションを確認してもよい。
薬物が天然システイン残基にランダムにコンジュゲートされたＡＤＣは、抗体の部分的還元と、続く所望のリンカー−薬物との反応によって調製する。ｐＨ８．０の約３モル当量のＤＴＴを加え、続いて約３７℃で約２時間インキュベートすることにより、５ｍｇ／ｍＬの濃度の抗体を部分的に還元する。次に、還元反応物を氷で冷却し、過剰なＤＴＴを例えばダイアフィルトレーションによって除去する。次に、リンカー−薬物を約１：１０のリンカー−薬物／チオールモル比で加える。約１０％ｖ／ｖのＤＭＳＯの存在下でコンジュゲーション反応を行う。コンジュゲーション後、過剰な遊離システイン（リンカー−薬物に対して約２倍のモル比）を加えて未反応のリンカー−薬物をクエンチすると、システイン−リンカー−薬物付加物が生成される。この反応混合物を（例えば、疎水性相互作用クロマトグラフィーによって）精製し、ＰＢＳでの緩衝液交換に供した。疎水性相互作用クロマトグラフィー及び還元逆相クロマトグラフィーなど、標準方法を用いて薬物負荷分布を決定した。
実施例４．ＡＳＣＴ２結合ｍＡｂ及びＡＤＣの特徴付け
結腸直腸癌細胞におけるＡＳＣＴ２抗体のＡＳＣＴ２特異的結合
特定のハイブリドーマクローンの結合がＡＳＣＴ２抗原に特異的であったかどうかを決定するため、ＡＳＣＴ２発現のｓｈＲＮＡノックダウン後に結合を評価した。簡潔に言えば、ＷｉＤｒ細胞に、ＡＳＣＴ２ ｓｈＲＮＡ又は非標的ｓｈＲＮＡ（ＮＴｓｈＲＮＡ）を発現するレンチウイルスを形質導入した。感染後７２時間で２つの抗ＡＳＣＴ２ハイブリドーマクローン１７ｃ１０及び１ｅ８の結合を評価した。図４に見られるとおり、ＡＳＣＴ２発現をノックダウンすると、それぞれのクローンの結合が有意に消失し、ＡＳＣＴ２ ｍＡｂ １７ｃ１０及び１ｅ８の抗原特異的結合が更に確認された。
抗ＡＳＣＴ２非コンジュゲート抗体のインターナリゼーション反応速度
標的抗原との結合時における抗体のインターナリゼーションは、所望のＡＤＣ効果の実現に必須である。従って、ＡＳＣＴ２抗体のインターナリゼーション特性を調べた。Ａｌｅｘａ ４８８にコンジュゲートした抗ＡＳＣＴ２抗体１７ｃ１０（１７ｃ１０−Ａｌｅｘａ ４８８）と共にＷｉＤｒ細胞を様々な時間にわたってインキュベートした。次に、細胞を洗浄し、抗Ａｌｅｘａ ４８８抗体と共に又は無しで氷上で４５分間インキュベートして細胞表面シグナルをクエンチした。総シグナル及びクエンチされたシグナル（インターナライズされた抗体を表す）の蛍光強度をフローサイトメトリー解析によって計測した。図５Ａに見られるとおり、抗ＡＳＣＴ２抗体１７ｃ１０は、インターナリゼーションを示さなかったアイソタイプ対照抗体と比較して、時間と共にインターナリゼーションの増加を示した。
細胞傷害性死滅によって計測したＡＳＣＴ２−ＡＤＣ（１７ｃ１０ＡＺ１５０８）のインターナリゼーション反応速度
ツブリシンＡＺ１５０８にコンジュゲートした抗ＡＳＣＴ２抗体（１７Ｃ１０−ＡＺ１５０８）で細胞を様々な時間にわたってパルスした。その後、ＡＤＣ含有培地を新鮮培地に交換し、細胞を更に４日間インキュベートした。ＣＴＧキットを使用することにより細胞生存率を計測した。未処理対照細胞に対するパーセンテージとして用量反応曲線をプロットし、代表的なグラフを図５Ｂに示す。上記に記載したとおりＩＣ５０値を計算し、結果を以下の表４に要約する。
Figure 2018535674
親和性測定（ＡＳＣＴ２発現細胞株に対する１７ｃ１０及び１ｅ８の結合）
ＡＳＣＴ２を発現するヒト、カニクイザル、及びＣＨＯ由来細胞株を利用して、ＡＳＣＴ２特異抗体の結合親和性及び交差反応性を評価した。フルオロフォア標識抗体を力価測定することにより見かけの親和性を計測した。代表的な結果を以下の表６に要約し、及び図６に示す。
図６は、ＡＳＣＴ２発現細胞株への抗ＡＳＣＴ２抗体１７ｃ１０及び１ｅ８、及びアイソタイプ対照Ｒ３４７の結合から得られたフローサイトメトリープロットを示す。ヒト癌細胞株Ｃａｌ２７の結果を図６Ａに示す；ヒト癌細胞株ＦａＤｕの結果を図６Ｂに示す；ヒト癌細胞株ＳＳＣ１５の結果を図６Ｃに示す；ヒト癌細胞株ＷｉＤｒの結果を図６Ｄに示す；ヒトＡＳＣＴ２を安定に発現するＣＨＯＫ１細胞の結果を図６Ｅに示す；ｃｙｎｏ ＡＳＣＴ２を安定に発現するＣＨＯＫ１細胞の結果を図６Ｆに示す）；ｃｙｎｏ癌細胞株ＣｙｎｏＭＫ１の結果を図６Ｇに示す；及びモックトランスフェクトＣＨＯＫ１細胞の結果を図６Ｈに示す。ＡＳＣＴ２発現細胞株への１７ｃ１０及び１ｅ８結合のＥＣ５０値は、以下の表５に示す。
Figure 2018535674
ＡＳＣＴ２抗原に対する１７ｃ１０抗体の特異性
抗ＡＳＣＴ２抗体１７ｃ１０は、ＳＬＣ１Ａファミリーの他のメンバーであるＡＳＣＴ１（ＳＬＣ１Ａ４）に対して親和性を有しない。ｓｈＲＮＡによってＡＳＣＴ１発現をサイレンシングしても、図７Ａに示されるグラフに見られるとおり、ＳＫＭＥＬ−２細胞における１７ｃ１０のＡＳＣＴ２特異的結合は消失しない。ｓｈＲＮＡのノックダウン効率をウエスタンブロット分析によって更に確認した。更に、図７Ｂに示されるグラフに見られるとおり、それぞれのｓｈＲＮＡによってＡＳＣＴ１発現をサイレンシングした細胞の細胞傷害プロファイルに変化は観察されなかった。結果を表６に要約する。
Figure 2018535674
Ｃｙｎｏ ＡＳＣＴ２に対するＡＳＣＴ２−ＡＤＣ抗体の交差反応性及び細胞傷害性
ツブリシンＡＺ１５０８にコンジュゲートした抗ＡＳＣＴ２抗体クローン１７ｃ１０及び１ｅ８について、ＣＨＯＫ１細胞で安定に発現するｃｙｎｏ ＡＳＣＴ２、ＣＨＯＫ１細胞で安定に発現するヒトＡＳＣＴ２、及びＣＨＯＫ１細胞で発現する対照分子に対する結合を評価した。ＡＳＣＴ２抗体１７ｃ１０（図８Ａ）及びＡＳＣＴ２抗体１ｅ８（図８Ｂ）は、ツブリシン１５０８ペイロードにコンジュゲートしたとき、ヒトＡＳＣＴ２及びｃｙｎｏ ＡＳＣＴ２を発現するＣＨＯＫ１細胞において強力な細胞傷害活性を示すが、非トランスフェクトＣＨＯＫ１又はＣＨＯＫ１−ＡＢＣＢ５では示さない。これらの結果を以下の表７に要約する。
Figure 2018535674
１７ｃ１０の生殖細胞系列化
１７ｃ１０のＶＨ及びＶＬドメインのアミノ酸配列をＶＢＡＳＥデータベースにある既知のヒト生殖系列配列とアラインメントし、最も近縁の生殖細胞系列を配列類似性によって同定した。ＶＨドメインについて、これはＩｇＶｈ４−３４＊０１であった。ＶＬドメインについて、これはＩｇＫｖ１−５＊０３であった。１７ｃ１０は、生殖細胞系列化プロセスにＶＨドメインの１フレームワーク残基及びＶＬドメインの５残基を復帰させることが含まれた。ＶＨドメインにおいて、復帰突然変異はＫａｂａｔ位置８２ａであり、ここではスレオニン（Ｔ）をセリン（Ｓ）に復帰させた。ＶＬドメインにおいて、突然変異はＫａｂａｔ位置１３、２１、３９、７０、及び７６であり、ここではＫａｂａｔ位置１３でスレオニン（Ｔ）をアラニン（Ａ）に復帰させ；Ｋａｂａｔ位置２１でロイシン（Ｌ）をイソロイシン（Ｉ）に復帰させ；Ｋａｂａｔ位置３９でアスパラギン（Ｎ）をリジン（Ｋ）に復帰させ；Ｋａｂａｔ位置７０でアスパラギン酸塩（Ｄ）をグルタミン酸塩（Ｅ）に復帰させ、及びＫａｂａｔ位置７６でスレオニン（Ｔ）をセリン（Ｓ）に復帰させた。これらの変化は、これらの突然変異を含むＶＨ及びＶＬドメインを合成し、且つ制限消化及びライゲーションを用いて既存のＶＨ及びＶＬを置き換えることにより作製した。生殖細胞系列化した１７ｃ１０及び元の（非生殖細胞系列化）１７ｃ１０の両方ともにＩｇＧとして発現させ、複数のＡＳＣＴ２発現細胞株に対するそれらの親和性をフローサイトメトリーによって評価した。図９Ａ〜図９Ｄに見られるとおり、ＷｉＤｒ細胞、又はＨｕＡＳＣＴ２若しくはＣｙＡＳＣＴ２を発現するＣＨＯ細胞に対する生殖細胞系列化１７ｃ１０又は親１７ｃ１０の結合に差はなかった。
実施例５．様々な癌におけるＡＳＣＴ２−ＡＤＣによる細胞傷害性死滅
１７ｃ１０抗体をＰＢＤ（ＳＧ３３１５）又はツブリシン（ＡＺ１５０８）ペイロードと上記に記載したとおり部位特異的コンジュゲーション部位でコンジュゲートした。各アッセイについて薬物−抗体比（ＤＡＲ）は約２．０と推定された。膵癌、結腸癌、肺癌、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）、前立腺癌、及びＡＳＣＴ２陰性肺癌など、様々な適応からの癌細胞を用いて細胞傷害アッセイを実施した。図１０Ａ〜図１０Ｆに示されるとおり、ＡＺ１５０８にコンジュゲートした１７ｃ１０ ＡＤＣ抗体は、ツブリシンに結合した対照抗体よりも高い細胞傷害活性を有した。ＳＧ３２４９又はＳＧ３３１５にコンジュゲートした抗ＡＳＣＴ２抗体１７ｃ１０も、ツブリシンＡＺ１５０８に結合した、又はＰＢＤ ＳＧ３２４９に結合した、又はＳＧ３３１５に結合した対照抗体よりも高い細胞傷害活性を有した。ＳＧ３２４９にコンジュゲートした１７ｃ１０を用いた細胞傷害アッセイの結果を示すグラフを図１１Ａに示し、及びＳＧ３３１５にコンジュゲートした１７ｃ１０を用いた細胞傷害アッセイの結果を示すグラフを図１１Ｂに示す。以下の表８にＩＣ５０値を要約する。
Figure 2018535674
実施例６．ＡＳＣＴ２−ＡＤＣはインビボで腫瘍成長を阻害する
全てのインビボ手順はＡＡＡＬＡＣ認証施設の施設内ガイドラインに従い実施し、ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ，ＬＬＣ施設内動物管理・使用委員会によって承認された。ＡＳＣＴ２−ＡＤＣ抗体が腫瘍細胞を死滅させる能力を試験するため、ＷｉＤｒ（１００μｌ／１０６細胞／マウス）又は原発性膵腫瘍（ＰＤＸ）を雌３〜５週齢ヌードマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）の右側腹部に皮下接種した。マウスを数週間生かして腫瘍を発達させた。腫瘍が約１５０〜２００ｍｍ３に達したところでマウスを無作為化して治療群（１０匹マウス／群）に割り付けた。その後、マウスに種々の用量の抗ＡＳＣＴ２ ＡＤＣ（１７ｃ１０−Ａｚ１５０８又は１７ｃ１０−ＳＧ３３１５又は１７ｃ１０−ＳＧ３２４９）又はアイソタイプ対照薬物−コンジュゲート抗体を静脈内注射した。治療した異種移植マウスの体重及び腫瘍容積をそれぞれの時間にわたってモニタした。腫瘍容積は、以下の式：（最も短い直径）２×（最も長い直径）×０．５を用いて計算し、及び結果を図１２Ａ、図１２Ｂ、及び図１２Ｃに示す。
加えて、様々なレベルのＡＳＣＴ２を発現する種々のサブ集団を代表する血液学的悪性腫瘍モデルのパネルにおいて１７ｃ１０−ＳＧ３２４９のインビボ有効性を判定した。播種性腫瘍異種移植モデルにおいてＡＤＣを０．４ｍｇ／ｋｇ（又は０．５ｍｇ／ｋｇ）及び０．１ｍｇ／ｋｇの用量で週１回、合計４用量にわたって投与した。カプラン・マイヤー曲線は、図１３Ａ及び図１３Ｂに示されるとおり、未治療又はアイソタイプＡＤＣ対照と比較して１７ｃ１０−ＳＧ３２４９コホートについての生存利益の有意な増加を実証する。幾つかのＡＭＬ異種移植腫瘍モデルにおける１７ｃ１０−ＳＧ３２４９の投与は、ＳＯＣ、未治療及びアイソタイプ対照ＡＤＣなどの他のコホートと比較して生存利益の実質的な増加を示した。ＴＦ１ａ ＡＭＬモデルでは、１７ｃ１０−ＳＧ３２４９は、アイソタイプ対照ＡＤＣ（６６日）と比較して優れた活性（生存期間中央値＞２０５日）を実証した。同様に、１７ｃ１０−ＳＧ３２４９は幾つかのＭＭ１．Ｓ多発性骨髄腫（ＭＭ）モデルにおいてロバストな腫瘍成長阻害及び生存利益を実証した（生存期間中央値１２３．５日対未治療対照５５．５日）。幾つかの血液学的悪性腫瘍における１７ｃ１０−ＳＧ３２４９の結果を以下の表９に要約する。
Figure 2018535674
実施例７．化学的部分を抗ＡＳＣＴ２抗体にコンジュゲートすることによるＡＤＣの形成
抗ＡＳＣＴ２ ｍＡｂの精製方法を開発した。簡潔に言えば、回収した細胞培養液をＭＡｂＳｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して実施されるプロテインＡ捕捉ステップに供して細胞培養上清からタンパク質を捕捉し、工程関連及び生成物関連の不純物を除去した。全ての工程ステップを３００ｃｍ／時の線形流量で実施した。樹脂は５０ｍＭトリス、ｐＨ７．４で平衡化し、及びカラムに３０ｇ／Ｌ樹脂のロードチャレンジとなるように馴化培地をロードした。カラムを５０ｍＭトリス、ｐＨ７．４で再平衡化し、次に、馴化培地中に存在する不純物が低下し且つ過剰な軽鎖が減少するように最適化した２回の洗浄ステップに曝した。最初の洗浄ステップは５０ｍＭトリス、５００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７からなり、２回目の洗浄は５０ｍＭ酢酸ナトリウム、５００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ５．０を含んだ。次に、カラムを５０ｍＭトリス、ｐＨ７．４で再平衡化し、２５ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ３．６で生成物を溶出させた。溶出ピークの上り側の０．５ＯＤから下り側の０．５ＯＤまでの生成物を回収した。各精製サイクル後、カラムを１００ｍＭ酢酸でストリッピングし、次に５０ｍＭトリス、ｐＨ７．４で再平衡化し、０．１Ｎ水酸化ナトリウムで衛生化し、及び２％（ｖ／ｖ）ベンジルアルコール、１００ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０に保存した。このステップの典型的な収率は７０〜７５％である。
ウイルス不活性化のため低ｐＨ処理を実施した。簡潔に言えば、１Ｍ酢酸を添加することによりＭＡｂＳｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ生成物を３．５の目標ｐＨに調整した。６０分の保持時間後、１Ｍトリスを７．４の目標ｐＨとなるように添加してこの溶液を中和した。続いて、この生成物をろ過した。
中間精製ステップとして、樹脂Ｃａｐｔｏ Ａｄｈｅｒｅ樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して混合モードクロマトグラフィーを実施した。このカラムはフロースルーモードで動作させた。カラムを５０ｍＭトリス、ｐＨ７．４で平衡化し、中和したタンパク質溶液をカラムにロードした。不純物が樹脂に結合し、一方、生成物はフロースループール中に回収される。典型的なステップ収率は８０〜８４％であった。
陽イオン交換樹脂ＨＳ ５０（ＰＯＲＯＳ）を使用してポリッシングステップを実施した。このステップは結合−溶出モードで実施され、工程関連不純物を更に減少させることを促進する。カラムを５０ｍＭトリス、ｐＨ７．４で平衡化し、混合モードクロマトグラフィーステップからの生成物をカラムにロードした。続いて、カラムを５０ｍＭトリス、ｐＨ７．４、次に５０ｍＭトリス、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．４で洗浄し、次に５０ｍＭトリス、４００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．４で溶出させた。溶出ピークの上り側の０．５ＯＤから下り側の０．５ＯＤまでの生成物を回収した。各精製サイクル後、カラムを５０ｍＭトリス、５００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．４を用いてストリッピングし、１Ｎ水酸化ナトリウムで衛生化し、及び０．１Ｎ ＮａＯＨに保存した。このステップの典型的な収率は９５〜９８％であった。
３０ｋＤａ分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）のＰｅｌｌｉｃｏｎ ３ Ｕｌｔｒａｃｅｌ膜を使用して精製ｍＡｂ中間体を濃縮し、ダイアフィルトレーションによって製剤化緩衝液（２０ｍＭヒスチジン、２４０ｍＭスクロース ｐＨ６．０）に移した。最終的なタンパク質濃度は約２０ｍｇ／ｍｌであった。必要に応じて、タンパク質はコンジュゲーションまで−８０℃で凍結保存した。以下の表１０は、モノクローナル抗体精製工程における生成物品質を要約する。
Figure 2018535674
抗ＡＳＣＴ２抗体とツブリシンＡＺ１５０８とのコンジュゲーション
ツブリシン（ＡＺ１５０８）をマレイミド化学によって２つの操作された遊離システイン残基に部位特異的にコンジュゲートすることにより抗体−薬物コンジュゲートを調製した。
精製したｍＡｂ中間体を解凍し、１Ｍトリス塩基を添加することによりｐＨをｐＨ７．０に調整した。タンパク質溶液を２０ｍＭヒスチジン緩衝液、ｐＨ７．０で７．５ｍｇ／ｍｌの最終濃度に希釈し、ＥＤＴＡを添加して１ｍＭの最終濃度にした。このタンパク質を好適な反応ベッセルに移し、温度を３７℃に調整した。還元剤トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）を調製したての５０ｍＭストック溶液からＴＣＥＰ：ｍＡｂ＝３０：１のモル比で添加した。この溶液を軽く撹拌しながら３７℃で３時間インキュベートした。このインキュベーション時間後、２０ｍＭヒスチジン／１ｍＭ ＥＤＴＡ緩衝液、ｐＨ７．０での透析又はダイアフィルトレーションによって還元剤を除去した。回収された生成物を０．２２μｍフィルタでろ過した。酸化のため、タンパク質溶液をデヒドロアスコルビン酸（ＤＨＡ）と共に１０：１（ＤＨＡ：ｍＡｂ）のモル比でインキュベートした。インキュベーションは軽く（５０ｒｐｍの混合速度で）撹拌しながら２２〜２５℃で４時間実施した。この時間後、ツブリシンペイロード（ＡＺ１５０８）をＤＭＳＯ中１０ｍＭストック溶液から８：１ペイロード：ｍＡｂのモル比で添加した。更なるＤＭＳＯを１０％（ｖ／ｖ）の最終濃度に達するように滴下して添加した。この混合物を軽く撹拌しながら２２〜２５℃で１時間インキュベートして、抗体−薬物コンジュゲートを形成させた。次に、Ｎ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）を１００ｍＭストック溶液から５：１のＮＡＣ：ツブリシンのモル比で添加することにより反応をクエンチした。
タンパク質断片、凝集物、及び過剰な遊離ツブリシンペイロードを除去するため、セラミックヒドロキシアパタイト（ＣＨＴ）Ｉ型（Ｂｉｏｒａｄ）を使用してコンジュゲーション後精製を実施した。カラムは結合−溶出モードで１８０ｃｍ／時の線形流量で動作させた。クエンチした抗体−薬物コンジュゲート混合物に、３００ｍＭストック溶液から１０ｍＭの最終濃度となるようにリン酸ナトリウムを添加した。ＣＨＴカラムは３００ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．５で予備平衡化し、１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．５で平衡化した。抗体−薬物コンジュゲート混合物を２０ｇ／Ｌのロードチャレンジまでロードし、カラムを１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．５で再平衡化した。１０カラム容積にわたる１０ｍＭリン酸ナトリウム中１Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ６．５への線形グラジエントで溶出を実施した。溶出ピークを分画し、画分をＨＰ ＳＥＣによって分析した。モノマー純度＞９５％のコンジュゲートタンパク質を含有する画分をプールした。各精製サイクル後、カラムを３００ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．５でストリッピングし、１Ｎ水酸化ナトリウムで衛生化し、及び０．１Ｎ水酸化ナトリウムに保存した。
プールした抗体薬コンジュゲート（ＡＤＣ）を濃縮し、３０ｋＤａ ＭＷＣＯの再生セルロース又はＰＥＳ膜のいずれかを使用したタンジェンシャルフローろ過によって最終製剤化緩衝液に交換した。１０％ストック溶液から賦形剤ＰＳ８０をスパイクした。最終ＡＤＣ濃度は、２０ｍＭヒスチジン、２４０ｍＭスクロース、０．０２％ＰＳ８０、ｐＨ６．０中５ｍｇ／ｍｌであった。これらの条件下で、生成されたＡＤＣは、＜１２％の非コンジュゲート重鎖、７５〜８２％のモノコンジュゲート重鎖、及び１．８〜１．９の薬物対抗体比を示した。
抗ＡＳＣＴ２抗体とピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）ＳＧ３２４９とのコンジュゲーション
ＰＢＤ（ＳＧ３２４９）をマレイミド化学によって２つの操作された遊離システイン残基に部位特異的にコンジュゲートすることにより、抗体−薬物コンジュゲートを調製した。工程順序は、上記に要約したツブリシンコンジュゲーションについての考察と同じであり、但し正確な条件は異なる。
精製したｍＡｂ中間体を解凍し、１Ｍトリス塩基を添加することによりｐＨをｐＨ７．０に調整した。ＰＢＤコンジュゲートの還元、酸化、及びコンジュゲーションステップを、２０ｍＭヒスチジン、１ｍｍ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．０中２０ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度で実施した。このタンパク質を好適な反応ベッセルに移し、温度を３７℃に調整した。還元剤ジチオスレイトール（ＤＴＴ）を調製したての５０ｍＭストック溶液からＤＴＴ：ｍＡｂ＝３０：１のモル比で添加した。この溶液を軽く撹拌しながら３７℃で１時間インキュベートした。このインキュベーション時間後、２０ｍＭヒスチジン／１ｍＭ ＥＤＴＡ緩衝液、ｐＨ７．０での透析又はダイアフィルトレーションによって還元剤を除去した。回収された生成物を０．２２μｍフィルタでろ過した。酸化のため、タンパク質溶液をデヒドロアスコルビン酸（ＤＨＡ）と共に１０：１（ＤＨＡ：ｍＡｂ）のモル比でインキュベートした。インキュベーションは軽く（５０ｒｐｍの混合速度で）撹拌しながら２２〜２５℃で１時間実施した。この時間後、ＰＢＤペイロード（ＳＧ３２４９）をＤＭＳＯ中１０ｍＭストック溶液から８．５：１のペイロード：ｍＡｂのモル比で添加した。この反応に更なるＤＭＳＯは添加せず、ＤＨＡ及びペイロードの添加に起因する有効ＤＭＳＯ濃度は約１１．４％であった。この混合物を軽く撹拌しながら２２〜２５℃で１時間インキュベートして、抗体−薬物コンジュゲートを形成させた。次に、Ｎ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）を１００ｍＭストック溶液から４：１のＮＡＣ：ＰＢＤのモル比で添加することにより反応をクエンチした。
タンパク質断片、凝集物、及び過剰な遊離ＰＢＤペイロードを除去するため、セラミックヒドロキシアパタイト（ＣＨＴ）Ｉ型（ＢｉｏＲａｄ）を使用してコンジュゲーション後精製を実施した。カラムは結合−溶出モードで１８０ｃｍ／時の線形流量で動作させた。１Ｍトリス塩基を添加することにより、クエンチした抗体−薬物反応混合物のｐＨをｐＨ７．０に調整した。ＣＨＴカラムは３００ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．５で予備平衡化し、１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．５で平衡化した。抗体−薬物コンジュゲート混合物を２０ｇ／Ｌのロードチャレンジまでロードし、カラムを１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．５で再平衡化した。次に、結合したタンパク質を１０ｍＭリン酸ナトリウム、２５ｍＭカプリル酸ナトリウム、ｐＨ６．５で洗浄して過剰な遊離薬物を除去し、続いて１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．５で再平衡化した。１０カラム容積にわたる１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．５中０．３〜１Ｍ塩化ナトリウムの線形グラジエントで溶出を実施した。溶出ピークを分画し、全ての画分をＨＰ ＳＥＣによって分析した。モノマー純度＞９５％のコンジュゲートタンパク質を含有する画分をプールした。各精製サイクル後、カラムを２Ｍ塩化ナトリウムでストリッピングし、１Ｎ水酸化ナトリウムで衛生化し、及び０．１Ｎ水酸化ナトリウムに保存した。
ＡＤＣを濃縮し、３０ｋＤａ ＭＷＣＯの再生セルロース又はＰＥＳ膜のいずれかを使用したタンジェンシャルフローろ過によって最終製剤化緩衝液に交換した。１０％ストック溶液から賦形剤ＰＳ８０をスパイクした。最終ＡＤＣ濃度は、２０ｍＭヒスチジン、２４０ｍＭスクロース、０．０２％ＰＳ８０、ｐＨ６．０中５ｍｇ／ｍｌであった。
アミノ酸配列：
元の１７ｃ１０ ＶＨ；配列番号１
Figure 2018535674
 元の１７ｃ１０ ＶＬ；配列番号２
Figure 2018535674
 元の１ｅ８ ＶＨ；配列番号３
Figure 2018535674
 元の１ｅ８ ＶＬ；配列番号４
Figure 2018535674
 生殖細胞系列化１７ｃ１０ ＶＨ；配列番号５
Figure 2018535674
 生殖細胞系列化１７ｃ１０ ＶＬ；配列番号６
Figure 2018535674
 生殖細胞系列化１ｅ８ ＶＨ；配列番号７
Figure 2018535674
 生殖細胞系列化１ｅ８ ＶＬ；配列番号８
Figure 2018535674
 Ｍａｉａ重鎖骨格（システイン挿入は囲み線及び太字）；配列番号９
Figure 2018535674
 １７ｃ１０生殖細胞系列化ＨＣＤＲ１（Ｋａｂａｔ付番）配列番号１０
ＧＹＹＷＳ
１７ｃ１０生殖細胞系列化ＨＣＤＲ２（Ｋａｂａｔ付番）；配列番号１１
ＥＩＨＨＳＧＧＡＮＹＮＰＳＬＫＳ
１７ｃ１０生殖細胞系列化ＨＣＤＲ３（Ｋａｂａｔ付番）；配列番号１２
ＧＱＧＫＮＷＨＹＤＹＦＤＹ
１７ｃ１０生殖細胞系列化ＬＣＤＲ１（Ｋａｂａｔ付番）；配列番号１３
ＲＡＳＱＳＩＲＳＷＬＡ
１７ｃ１０生殖細胞系列化ＬＣＤＲ２（Ｋａｂａｔ付番）；配列番号１４
ＫＡＳＩＬＫＩ
１７ｃ１０生殖細胞系列化ＬＣＤＲ３（Ｋａｂａｔ付番）；配列番号１５
ＱＱＹＹＳＹＳＲＴ
１ｅ８生殖細胞系列化ＨＣＤＲ１ （Ｋａｂａｔ付番）；配列番号１６
ＧＹＹＷＳ
１ｅ８生殖細胞系列化ＨＣＤＲ２（Ｋａｂａｔ付番）；配列番号１７
ＥＩＨＨＳＧＳＴＮＹＮＰＳＬＫＳ
１ｅ８生殖細胞系列化ＨＣＤＲ３（Ｋａｂａｔ付番）；配列番号１８
ＧＱＧＫＮＷＮＹＤＹＦＤＹ
１ｅ８生殖細胞系列化ＬＣＤＲ１（Ｋａｂａｔ付番）；配列番号１９
ＲＡＳＱＳＩＲＳＷＬＡ
１ｅ８生殖細胞系列化ＬＣＤＲ２（Ｋａｂａｔ付番）；配列番号２０
ＫＡＳＳＬＫＳ
１ｅ８生殖細胞系列化ＬＣＤＲ３（Ｋａｂａｔ付番）；配列番号２１
ＱＱＹＹＳＦＳＲＴ
コンセンサスＨＣＤＲ２；配列番号２２
ＥＩＨＨＳＧＸ１Ｘ２ＮＹＮＰＳＬＫＳ；式中、Ｘ１はＳ又はＧであり、及びＸ２はＡ又はＴである
コンセンサスＨＣＤＲ３；配列番号２３
ＧＱＧＫＮＷＸ１ＹＤＹＦＤＹ；式中、Ｘ１はＨ又はＮである
コンセンサスＬＣＤＲ２；配列番号２４
ＫＡＳＸ１ＬＫＸ２；式中、Ｘ１はＩ又はＳであり、及びＸ２はＩ又はＳである
コンセンサスＬＣＤＲ３；配列番号２５
ＱＱＹＹＳＸ１ＳＲＴ；式中、Ｘ１はＹ又はＦである
ヒトκ軽鎖；配列番号２６
Figure 2018535674
具体的な実施形態の前出の説明は、本発明の一般的性質を十分に完全に明らかにするものであり、従って第三者が、当該技術分野の範囲内の知識を適用することにより、本発明の一般的概念から逸脱することなく、過度の実験を行うことなしにかかる具体的な実施形態を容易に改良し及び／又はそれを様々な適用に適合させることができる。従って、かかる適合形態及び改良形態は、本明細書に提供される教示及び指針に基づけば、開示される実施形態の均等物の意味及び範囲内にあることが意図される。本明細書における用語法又は表現法は、限定ではなく、説明を目的とするものであり、従って本明細書の用語法又は表現法は当業者によって教示及び指針を踏まえて解釈されるべきであることが理解されなければならない。本発明は以下の特許請求の範囲によって更に記載される。

Claims (20)

  1. 中性アミノ酸トランスポーター２（ＡＳＣＴ２）のエピトープに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片であって、重鎖可変領域（ＶＨ）の３つの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）と軽鎖可変領域（ＶＬ）の３つの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）とを含み、配列番号１０又は配列番号１６のアミノ酸配列のＨＣＤＲ１、配列番号１１又は配列番号１７のアミノ酸配列のＨＣＤＲ２、配列番号１２又は配列番号１８のアミノ酸配列のＨＣＤＲ３、配列番号１３又は配列番号１９のアミノ酸配列のＬＣＤＲ１、配列番号１４又は配列番号２０のアミノ酸配列のＬＣＤＲ２、及び配列番号１５又は配列番号２１のアミノ酸配列のＬＣＤＲ３を含む、抗体又はその抗原結合断片。
  2. 前記ＶＨが、配列番号１、配列番号３、配列番号５、及び配列番号７から選択されるアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが、配列番号２、配列番号４、配列番号６、及び配列番号８から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗体又は抗原結合断片。
  3. 前記ＶＨが配列番号５のアミノ酸配列を含み、且つ前記ＶＬが配列番号６のアミノ酸配列を含む、請求項１又は２に記載の抗体又は抗原結合断片。
  4. 前記ＶＨがアミノ酸配列の配列番号７を含み、且つ前記ＶＬがアミノ酸配列の配列番号８を含む、請求項１又は２に記載の抗体又は抗原結合断片。
  5. 位置２３９のセリン（Ｓ）と位置２４０のバリン（Ｖ）との間にシステイン（Ｃ）挿入を含むＩｇＧ定常領域を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合断片。
  6. 前記抗体が配列番号９のアミノ酸配列の重鎖を含む、請求項５に記載の抗体又は抗原結合断片。
  7. 前記抗体が細胞表面上のＡＳＣＴ２に結合すると、前記抗体が細胞にインターナライズする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合断片。
  8. ヒトκ定常領域及びヒトλ定常領域からなる群から選択される軽鎖定常領域を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合断片。
  9. 前記抗体が配列番号２６のヒトκ定常領域を含む、請求項９に記載の抗体又は抗原結合断片。
  10. 抗菌剤、治療剤、プロドラッグ、ペプチド、タンパク質、酵素、脂質、生物学的反応修飾物質、医薬品、リンホカイン、異種抗体、異種抗体の断片、検出可能標識、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、放射性同位元素からなる群から選択されるサイトトキシン又は任意の前記サイトトキシンの２つ以上の組み合わせからなる群から選択されるサイトトキシンに更にコンジュゲートされる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合断片。
  11. サイトトキシンにコンジュゲートされる、請求項１０に記載の抗体又は抗原結合断片。
  12. 前記サイトトキシンがツブリシン誘導体及びピロロベンゾジアゼピンから選択される、請求項１１に記載の抗体又は抗原結合断片。
  13. 前記ツブリシン誘導体がツブリシンＡＺ１５０８である、請求項１２に記載の抗体又は抗原結合断片。
  14. 前記ピロロベンゾジアゼピンがＳＧ３３１５及びＳＧ３２４９から選択される、請求項１２に記載の抗体又は抗原結合断片。
  15. 前記抗体がヒトＡＳＣＴ２及びカニクイザルＡＳＣＴ２に結合する、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合断片。
  16. 前記抗体がヒトＡＳＣＴ１に特異的に結合しない、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合断片。
  17. 請求項１〜１６のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合断片と薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物。
  18. 請求項１〜１６のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片をコードするポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドの組み合わせ。
  19. 請求項１８に記載のポリヌクレオチドを含む宿主を培養するステップを含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片を作製する方法。
  20. 対象におけるＡＳＣＴ２の過剰発現によって特徴付けられる癌を治療する方法であって、治療を必要としている対象に、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の抗体若しくは抗原結合断片又は請求項１７に記載の医薬組成物の有効量を投与するステップを含む方法。
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