JP2018130113A - 慢性骨髄性白血病（ｃｍｌ）の検査方法及び検査用キット、チロシンキナーゼ阻害剤（ｔｋｉ）耐性ｃｍｌの単離方法、並びにｃｍｌにおけるｔｋｉ耐性の低減剤及びそのスクリーニング方法 - Google Patents

Abstract

【課題】慢性骨髄性白血病の診断、慢性骨髄性白血病のモニタリング、慢性骨髄性白血病の治療を必要とする患者群の分類及び慢性骨髄性白血病の再発予測などのために有用な方法の提供。また、慢性骨髄性白血病におけるチロシンキナーゼ阻害剤耐性を低減するための手段の提供。【解決手段】慢性骨髄性白血病の検査方法であって、前記対象から得られた試料中の血液細胞におけるＡＤＡＭ８遺伝子の発現量を測定する工程を含む、方法。ＡＤＡＭ８遺伝子の発現阻害剤又はＡＤＡＭ８の活性阻害剤を含む、慢性骨髄性白血病におけるチロシンキナーゼ阻害剤耐性を低減するための組成物。【選択図】なし

Description

本発明は、慢性骨髄性白血病（Chronic Myelogenous Leukemia: ＣＭＬ）の検査方法及び検査用キットに関する。また本発明は、チロシンキナーゼ阻害剤（Tyrosine kinase inhibitor: ＴＫＩ）に対して耐性を有するＣＭＬの単離方法に関する。さらに本発明は、ＣＭＬにおけるＴＫＩ耐性の低減剤及びそのスクリーニング方法に関する。

慢性骨髄性白血病
ＣＭＬは、ｔ（９；２２）（ｑ３４；ｑ１１）染色体転座から生じるＢＣＲ−ＡＢＬキメラ癌遺伝子によって、造血幹細胞（ＨＳＣ）中で生じる骨髄増殖性腫瘍である（非特許文献１）。ＢＣＲ−ＡＢＬキメラ癌遺伝子は、分化能力を有する骨髄細胞の増殖増大を引き起こす。未処置の場合、慢性期のＣＭＬ（CML in chronic phase: ＣＭＬ−ＣＰ）は移行期へと移行し、最終的に急性期へと移行する。

ＢＣＲ−ＡＢＬタンパク質を標的化するイマチニブなどのチロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）は、慢性骨髄性白血病に対する生存性を改善した。ＴＫＩ治療を継続することで、慢性期から移行期及び急性期への移行を抑制することができる。

ＴＫＩ治療はＣＭＬに対して有効な手段であるが、ＴＫＩを長期間投与することによる副作用（骨髄抑制、吐き気、嘔吐、下痢など）や高額な医療費の問題がある。したがって、ＴＫＩ治療を継続すべき患者と中止しても良い患者とを分類できる方法が求められている。

ＣＭＬの診断補助方法及び治療効果のモニタリング方法として、ＢＣＲ−ＡＢＬの発現量を測定する方法が知られている（非特許文献２）。当該方法では、対象の末梢血白血球より抽出したＲＮＡ中のＢＣＲ−ＡＢＬのｍＲＮＡ量とＡＢＬのｍＲＮＡ量との比率に基づいて、ＣＭＬの診断補助及び治療効果のモニタリングを行うことが可能である。

ＡＤＡＭ８
ＡＤＡＭ（a disintegrin and metalloprotease）ファミリータンパク質は、プロドメイン、メタロプロテアーゼドメイン、ディスインテグリン様ドメイン、システインリッチなドメイン、膜貫通性ドメイン、細胞質ドメインを含む共通のドメイン構造を有するタンパク質である。当該タンパク質は、タンパク質分解と細胞−細胞間の結合という２つの機能を有する。その中でも、ＡＤＡＭ８はマクロファージ細胞株から単離された分子であり、ＥＳＴ解析により、ヒト、マウスを含む脊椎動物では造血系組織に、ゼブラフィッシュでは腎臓や造血組織に発現することが報告されており、血液や循環器の発生に関与することが示唆されている。ＡＤＡＭ８の発現抑制により血液循環が阻害され、血栓形成にいたることが知られている（特許文献１）。

ＡＤＡＭ８が、肺扁平上皮癌の悪性上皮、肺腺癌、大腸癌腫、前立腺癌腫、乳癌腫及び炎症組織などにおいて発現していることが知られている（特許文献２）。また、対象由来の生体試料におけるＡＤＡＭ８レベルを測定することにより、対象における非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の発生を判定し得ることが知られている（特許文献３）。

特開２０１０−２７５２１６号公報 特表２００１−５１３９９５号公報 特表２００７−５３０９２１号公報

Nguyen, L. V. et al., Nat. Rev. Cancer 12, 133-43 (2012) Nakamae, H. et al., Int J Hematol., 102, 304-311, 2015

例えば非特許文献２に記載の方法などを用いてＢＣＲ−ＡＢＬ遺伝子の発現が検出されず、ＴＫＩ治療の継続が不要であると判断された患者であっても、その一部においてＴＫＩ治療中断後にＣＭＬが再発することがある。これは、当該方法では検出できない量のＴＫＩ耐性ＣＭＬ細胞が患者中に存在するためである。

したがって本発明は、従来法よりも高感度にＴＫＩ耐性ＣＭＬ細胞を検出可能な新規バイオマーカーを提供することを目的とする。また、血液細胞中の当該バイオマーカーの発現を指標として、ＣＭＬの診断、ＣＭＬのモニタリング、ＣＭＬに対するＴＫＩ治療を必要とする患者の分類及びＣＭＬの再発の予測などのために有用な方法の提供を目的とする。さらに本発明は、ＣＭＬにおけるＴＫＩ耐性の低減を目的とする。

本発明者らは驚くべきことに、ＡＤＡＭ８がＴＫＩ治療後に残存するＴＫＩ耐性のＣＭＬ細胞に対するバイオマーカーとして使用できることを見出した。さらに本発明者らは、ＡＤＡＭ８遺伝子の発現又はＡＤＡＭ８の活性を阻害することにより、ＣＭＬ細胞におけるＴＫＩ耐性を低減できることを見出し、本発明に至った。

すなわち本発明は、以下の態様を有する。
［１］
慢性骨髄性白血病の検査方法であって、対象から得られた試料中の血液細胞におけるＡＤＡＭ８遺伝子の発現を検出する工程を含む、方法。
［２］
前記対象は、チロシンキナーゼ阻害剤を用いた治療を受けている対象である、［１］に記載の方法。
［３］
前記対象は、チロシンキナーゼ阻害剤を用いた治療によってＭＭＲ (major molecular response)又はＭＵＬ (molecular undetectable leukemia) を達成した対象である、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］
慢性骨髄性白血病に対する治療を必要とする患者の分類を補助する方法である、［１］〜［３］のいずれか１つに記載の方法。
［５］
慢性骨髄性白血病の再発の予測を補助する方法である、［１］〜［３］のいずれか１つに記載の方法。
［６］
チロシンキナーゼ阻害剤が、イマチニブ、ゲフィチニブ、エルロチニブ、オシメルチニブ、アファチニブ、ダサチニブ、ボスチニブ、バンデタニブ、スニチニブ、アキシチニブ、パゾパニブ、レンバチニブ、ラパチニブ、ニンテダニブ、ニロチニブ、イブルチニブ及びポナチニブから成る群から選択される、［２］〜［５］のいずれか１つに記載の方法。
［７］
前記試料は末梢血又は骨髄液である、［１］〜［６］のいずれか１つに記載の方法。
［８］
前記血液細胞はＣＤ３４陽性細胞である、［１］〜［７］のいずれか１つに記載の方法。
［９］
ＡＤＡＭ８遺伝子の発現の検出は、ＡＤＡＭ８遺伝子を発現する細胞の数を測定することを含む、［１］〜［８］のいずれか１つに記載の方法。
［１０］
ＡＤＡＭ８遺伝子の発現の検出は、ＡＤＡＭ８遺伝子から転写されたｍＲＮＡの量を測定することを含む、［１］〜［８］のいずれか１つに記載の方法。
［１１］
ＡＤＡＭ８遺伝子の発現の検出は、ＡＤＡＭ８遺伝子によってコードされるタンパク質の量を測定することを含む、［１］〜［８］のいずれか１つに記載の方法。
［１２］
対象から得られた試料中の血液細胞から、チロシンキナーゼ阻害剤に対して耐性を有する慢性骨髄性白血病細胞を単離する方法であって、
（１）試料中の血液細胞におけるＡＤＡＭ８遺伝子の発現を検出する工程、及び
（２）工程（１）の検出結果に基づいて、チロシンキナーゼ阻害剤に対して耐性を有する慢性骨髄性白血病細胞を単離する工程
を含む、方法。
［１３］
ＡＤＡＭ８遺伝子から転写されたｍＲＮＡ又はＡＤＡＭ８遺伝子によってコードされるタンパク質の検出薬を含む、慢性骨髄性白血病の検査用キット。
［１４］
ＡＤＡＭ８遺伝子の発現阻害剤又はＡＤＡＭ８の活性阻害剤を含む、慢性骨髄性白血病におけるチロシンキナーゼ阻害剤耐性を低減するための組成物。
［１５］
ＡＤＡＭ８遺伝子の発現阻害剤が、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＲＮＡｉ誘導性核酸、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、リボザイム、ゲノム編集核酸及びそれらの発現ベクター、有機低分子、アプタマー、抗体、抗体フラグメント、並びにそれらの組み合わせからなる群から選択される、［１４］に記載の組成物。
［１６］
ＡＤＡＭ８の活性阻害剤が、有機低分子、アプタマー、抗体、抗体フラグメント及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、［１４］に記載の組成物。
［１７］
慢性骨髄性白血病を治療するための組成物であって、
チロシンキナーゼ阻害剤を含み、
ＡＤＡＭ８遺伝子の発現阻害剤又はＡＤＡＭ８の活性阻害剤と組み合わせて対象に投与される、
組成物。
［１８］
ＡＤＡＭ８遺伝子の発現阻害又はＡＤＡＭ８の活性阻害を指標とする、
慢性骨髄性白血病におけるチロシンキナーゼ阻害剤耐性の低減剤のスクリーニング方法。
［１９］
ＡＤＡＭ８遺伝子発現細胞を被験物質と接触させる工程と、
前記細胞におけるＡＤＡＭ８遺伝子の発現量を測定する工程と、
前記工程で測定されたＡＤＡＭ８遺伝子の発現量を、対照の発現量と比較する工程であって、前記対照の発現量は、被験物質と接触させていないＡＤＡＭ８遺伝子発現細胞におけるＡＤＡＭ８遺伝子の発現量である、工程と、
前記対照の発現量と比較して、ＡＤＡＭ８遺伝子の発現量を低下させる被験物質を選択する工程と
を含む、［１８］に記載の方法。
［２０］
ＡＤＡＭ８遺伝子発現細胞を被験物質と接触させる工程と、
前記細胞におけるＡＤＡＭ８の活性を測定する工程と、
前記工程で測定されたＡＤＡＭ８の活性を、対照の活性と比較する工程であって、前記対照の活性は、被験物質と接触させていないＡＤＡＭ８遺伝子発現細胞におけるＡＤＡＭ８の活性である、工程と、
前記対照の活性と比較して、ＡＤＡＭ８遺伝子の活性を低下させる被験物質を選択する工程と
を含む、［１８］に記載の方法。
［２１］
ＡＤＡＭ８を被験物質と接触させる工程と、
前記ＡＤＡＭ８の活性を測定する工程と、
前記工程で測定されたＡＤＡＭ８の活性を、対照の活性と比較する工程であって、前記対照の活性は、被験物質と接触させていないＡＤＡＭ８の活性である、工程と、
前記対照の活性と比較して、ＡＤＡＭ８の活性を低下させる被験物質を選択する工程と
を含む、［１８］に記載の方法。
［２２］
慢性骨髄性白血病におけるチロシンキナーゼ阻害剤耐性を低減するための方法であって、
チロシンキナーゼ阻害剤耐性の慢性骨髄性白血病を患う対象に、ＡＤＡＭ８遺伝子の発現阻害剤又はＡＤＡＭ８の活性阻害剤を投与する工程
を含む、方法。
［２３］
慢性骨髄性白血病を治療するための方法であって、
慢性骨髄性白血病の治療を必要とする対象に、チロシンキナーゼ阻害剤を、ＡＤＡＭ８遺伝子の発現阻害剤又はＡＤＡＭ８の活性阻害剤と組み合わせて投与する工程
を含む、方法。
［２４］
慢性骨髄性白血病を治療するためのチロシンキナーゼ阻害剤であって、
ＡＤＡＭ８遺伝子の発現阻害剤又はＡＤＡＭ８の活性阻害剤と組み合わせて対象に投与される、
チロシンキナーゼ阻害剤。
［２５］
慢性骨髄性白血病を治療するための組成物を製造するためのチロシンキナーゼ阻害剤の使用であって、
前記組成物は、ＡＤＡＭ８遺伝子の発現阻害剤又はＡＤＡＭ８の活性阻害剤と組み合わせて対象に投与される、使用。

本発明によれば、従来法よりも高感度にＴＫＩ耐性ＣＭＬ細胞を検出でき、かつ単離することができる。また、ＣＭＬの診断、ＣＭＬのモニタリング、ＣＭＬの治療を必要とする患者群の分類及びＣＭＬの再発予測などを効率的に行うことが可能である。また本発明によれば、ＣＭＬにおけるＴＫＩ耐性を低減することが可能である。

図１は、ＣＭＬ−ＣＰ患者由来のｉＰＳＣにおける内因性幹細胞遺伝子及びＢＣＲ−ＡＢＬの発現のＲＴ−ＰＣＲ分析結果を示す。 図２は、実施例１（１）の実験スキームを示す。 図３は、イマチニブの非存在下での細胞増殖アッセイの結果を示す。 図４は、２．５μＭのイマチニブの存在下での細胞増殖アッセイの結果を示す。 図５は、アポトーシスアッセイの結果を示す。 図６は、イマチニブの存在下又は非存在下における、プレ−ＨＰＣとＤＣでのＩＫ１ＲＬ１及びＭＥＩＳ１の発現量の評価結果を示す。 図７は、リアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲを用いて、イマチニブ処置後のＡＤＡＭ８の相対的ｍＲＮＡ発現量を評価した結果を示す。 図８は、ＡＤＡＭ８陽性のＣＭＬ−プレ−ＨＰＣ細胞とＡＤＡＭ８陰性のＣＭＬ−プレ−ＨＰＣ細胞の細胞生存性アッセイの結果を示す。 図９は、ＦＡＣＳによる、ＣＤ３４＋ＡＤＡＭ８＋細胞画分及びＣＤ３４＋ＡＤＡＭ８−細胞画分の分離を示す。 図１０は、ＣＭＬ−ＣＰ患者、ＮＨＬ患者（正常対照）及び他の悪性血液疾患の患者由来の、ＣＤ３４＋細胞画分中のＡＤＡＭ８＋細胞の頻度測定の結果を示す。 図１１は、ＣＤ３４＋ＡＤＡＭ８＋細胞及びＣＤ３４＋ＡＤＡＭ８−細胞を用いた、細胞生存性アッセイの結果を示す。 図１２は、ＣＤ３４＋ＡＤＡＭ８＋細胞及びＣＤ３４＋ＡＤＡＭ８−細胞を用いた、アポトーシスアッセイの結果を示す。 図１３は、ＣＭＬ−ＣＰ患者、ＮＨＬ患者（正常対照）及び他の悪性血液疾患の患者由来の、ＣＤ３４＋ＣＤ３８＋細胞画分及びＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞画分中のＡＤＡＭ８＋細胞の頻度測定の結果を示す。 図１４は、ＦＡＣＳによる、ＣＤ３４＋ＣＤ３８＋ＡＤＡＭ８＋細胞画分及びＣＤ３４＋ＡＤＡＭ８−細胞画分の分離を示す。 図１５は、８ＣＤ３４＋ＣＤ３８＋ＡＤＡＭ８＋細胞及びＣＤ３４＋ＣＤ３８＋ＡＤＡＭ８−細胞を用いた、細胞生存性アッセイの結果を示す。 図１６は、ＣＤ３４＋ＣＤ３８＋ＡＤＡＭ８＋細胞及びＣＤ３４＋ＣＤ３８＋ＡＤＡＭ８−細胞を用いた、アポトーシスアッセイの結果を示す。 図１７は、ＴＫＩ治療によってＭＭＲ及びＭＵＬとなった患者の試料中におけるＢＣＲ−ＡＢＬ陽性の細胞の頻度を示す。 図１８は、ＡＤＡＭ８遺伝子の発現を阻害するｓｈＲＮＡの有効性を評価した結果を示す。 図１９は、ＡＤＡＭ８遺伝子の発現を阻害するｓｈＲＮＡでＡＤＡＭ８遺伝子発現細胞を処理した後に、イマチニブの非存在下及び存在下で細胞生存性アッセイを行った結果を示す。 図２０は、ＡＤＡＭ８遺伝子発現細胞をＧＭ６００１で処理した場合における細胞生存性アッセイの結果を示す。 図２１は、ＧＭ６００１でＣＭＬ−ＣＰ９由来のＡＤＡＭ８遺伝子発現細胞を処理した後に、イマチニブの非存在下及び存在下で細胞生存性アッセイを行った結果を示す。 図２２は、ＧＭ６００１でＣＭＬ−ＣＰ２３由来のＡＤＡＭ８遺伝子発現細胞を処理した後に、イマチニブの非存在下及び存在下で細胞生存性アッセイを行った結果を示す。

＜本発明の検査方法＞
第一の態様において、本発明は慢性骨髄性白血病の検査方法であって、対象から得られた試料中の血液細胞におけるＡＤＡＭ８遺伝子の発現を検出する工程を含む、方法に関する。以下で「本発明の検査方法」とも呼ぶ。

本明細書において「検査」とは、慢性骨髄性白血病の評価に必要な情報を得るために、対象から得られた試料中のＡＤＡＭ８遺伝子の発現を検出することを意味する。例えばこの検査結果に基づいて、医師は被験者が慢性骨髄性白血病に罹患しているか否か、慢性骨髄性白血病のＴＫＩ治療を継続すべきか否か、あるいはＴＫＩ治療中止後に慢性骨髄性白血病が再発するか否かを判定及び／又は診断し、適切な治療方針を決定し得る。すなわち、「検査」は当該医師によってなされる行為とは明確に区別される。また、本明細書における「検査」は、診断補助用途のみならず、イン・ビトロでの試験研究用途も含む。

本明細書における「慢性骨髄性白血病の検査方法」には、慢性骨髄性白血病に罹患しているか否かの診断を補助する方法、慢性骨髄性白血病に対する治療効果のモニタリングを補助する方法、慢性骨髄性白血病に対する治療を必要とする患者の分類を補助する方法、及び慢性骨髄性白血病の再発の予測を補助する方法が含まれる。好ましくは、本発明の検査方法は、慢性骨髄性白血病に対する治療を必要とする患者の分類を補助する方法、又は慢性骨髄性白血病の再発の予測を補助する方法である。

本発明の検査方法が慢性骨髄性白血病に対する治療を必要とする患者の分類を補助する方法である場合、当該患者の分類は、例えば、本発明の検査方法において測定されたＡＤＡＭ８発現細胞の数又はＡＤＡＭ８遺伝子の発現量と基準値とを比較する工程と、ＡＤＡＭ８発現細胞数又はＡＤＡＭ８遺伝子の発現量が基準値より高い場合に（例えば、統計的に有意に高い場合に）、慢性骨髄性白血病の治療が必要な患者であると分類する工程を含む方法によって行うことができる。

また、本発明の検査方法が慢性骨髄性白血病の再発の予測を補助する方法である場合、当該再発の予測は、例えば、本発明の検査方法において測定されたＡＤＡＭ８発現細胞の数又はＡＤＡＭ８遺伝子の発現量と基準値とを比較する工程と、ＡＤＡＭ８発現細胞の数又はＡＤＡＭ８遺伝子の発現量が基準値より高い場合に（例えば、統計的に有意に高い場合に）、慢性骨髄性白血病を再発すると予測する工程を含む方法によって行うことができる。

上記の患者の分類方法及び再発の予測方法における「基準値」は、例えば健常者由来の試料中のＡＤＡＭ８発現細胞の数又は健常者由来の試料中の血液細胞のＡＤＡＭ８遺伝子の発現量に基づいて、又はＴＫＩ治療中止後に再発をしていない対象（例えば、ＴＫＩ治療中止後に少なくとも２年間再発していない対象）由来の試料中のＡＤＡＭ８発現細胞の数又はＴＫＩ治療中止後に再発をしていない対象由来の試料中の血液細胞のＡＤＡＭ８遺伝子の発現量に基づいて定めてもよい。また基準値は、複数の対象から得られる試料中のＡＤＡＭ８発現細胞数の平均値又は中央値、あるいは複数の対象から得られる試料中の血液細胞のＡＤＡＭ８遺伝子の発現量の平均値又は中央値であってもよい。

本明細書において「対象」とは、哺乳動物（例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウサギ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、シカなど）であれば特に限定されないが、好ましくはヒトである。

本発明の検査方法における「対象から得られた試料」は、血液細胞を含む対象由来の組織及び体液を含む。また当該試料は、対象から得られた細胞をリプログラミングして得られる誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を造血系分化することで得られる血液細胞を含む培養液を含む。本発明の検査方法における試料は、好ましくは対象から得られた末梢血又は骨髄液である。

本明細書において「血液細胞」は、造血幹細胞の前駆細胞、及び造血幹細胞から最終的に末梢血に分化するまでの全ての分化のプロセス上に存在する血液細胞の全ての形態が含まれる。特に限定されないが、例えば白血球（好中球、好酸球、好塩基球、リンパ球（Ｔ細胞及びＢ細胞）、単球、樹状細胞）、造血細胞、造血幹細胞、造血前駆細胞、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）などが挙げられる。

本発明の検査方法における血液細胞は、好ましくはＣＤ３４陽性細胞である。本明細書において「ＣＤ３４陽性」とは、ＣＤ（cluster of differentiation）３４抗原を細胞表面上に発現していることを意味する。この抗原は造血幹細胞及び造血前駆細胞のマーカーであり、分化するに従って消失する。ＣＤ３４陽性細胞（集団）は造血幹細胞及び造血前駆細胞をより多く含む細胞集団である。なお、以下で陽性は「＋」で表記され得、陰性を「−」で表記され得る。

一実施形態において、本発明の検査方法における血液細胞は、ＡＢＬ遺伝子の発現量に対するＢＣＲ−ＡＢＬ遺伝子の発現量の比率が０．１％以下である血液細胞であり、好ましくは、ＡＢＬ遺伝子の発現量に対するＢＣＲ−ＡＢＬ遺伝子の発現量の比率が０．１％以下であるＣＤ３４陽性細胞である。

一実施形態において、本発明の検査方法における対象は、チロシンキナーゼ阻害剤を用いた治療を受けている対象である。

本明細書において「チロシンキナーゼ阻害剤」は、受容体型及び／又は非受容体型チロシンキナーゼの選択的もしくは非選択的阻害剤として作用する、全ての治療薬が含まれる。特に限定されないが、例えば、イマチニブ（Imatinib）、ゲフィチニブ（Gefitinib）、エルロチニブ（Erlotinib）、オシメルチニブ（Osimertinib）、アファチニブ（Afatinib）、ダサチニブ（Dasatinib）、ボスチニブ（Bosutinib）、バンデタニブ（Vandetanib）、スニチニブ（Sunitinib）、アキシチニブ（Axitinib）、パゾパニブ（Pazopanib）、レンバチニブ（Lenvatinib）、ラパチニブ（Lapatinib）、ニンテダニブ（Nintedanib）、ニロチニブ（Nilotinib）、イブルチニブ（Ibrutinib）、ポナチニブ（ponatinib）などが挙げられる。好ましくはイマチニブである。

慢性骨髄性白血病の治療効果判定基準として、ＭＭＲ（major molecular response）が知られている。例えばＢＣＲ−ＡＢＬ評価において、ＡＢＬ遺伝子の発現量に対するＢＣＲ−ＡＢＬ遺伝子の発現量の比率が０．１％以下となった場合に対象はＭＭＲであると判定される。さらに、ＢＣＲ−ＡＢＬ評価においてＢＣＲ−ＡＢＬが２回連続で検出できなかった場合に、対象はＭＵＬ (molecular undetectable leukemia)（又はＣＭＲ(complete molecular response)とも呼ぶ）であると判定される。ＢＣＲ−ＡＢＬ評価は当業者に公知の方法（例えば非特許文献２に記載の方法）により行われ得る。

一実施形態において、本発明の検査方法における対象は、チロシンキナーゼ阻害剤を用いた治療によってＭＭＲ又はＭＵＬを達成した対象である。

本明細書において、「検出」は、細胞、ｍＲＮＡ及びタンパク質の存在を定性的又は定量的に決定することをいう。また本明細書において、「測定」は、細胞数、ｍＲＮＡ発現量及び／又はタンパク質発現量を定量的に決定することをいう。

一実施形態において、本発明の検査方法における「ＡＤＡＭ８遺伝子の発現の検出」は、ＡＤＡＭ８遺伝子を発現する細胞を検出すること、及び／又は細胞の数を測定することを含む。そのような検出及び／又は測定は、特に限定されないが、例えばフローサイトメトリーにより行うことができる。

別の実施形態において、本発明の検査方法における「ＡＤＡＭ８遺伝子の発現の検出」は、ＡＤＡＭ８遺伝子から転写されたｍＲＮＡを検出すること、及び／又はｍＲＮＡの量を測定することを含む。ヒトＡＤＡＭ８由来のｍＲＮＡ配列を配列番号１として示す。そのような検出及び／又は測定は、特に限定されないが、例えばノーザンブロッティング、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ；例えば定量的ＲＴ−ＰＣＲ）、リアルタイムＰＣＲ、in situ ハイブリダイゼーション（例えば、定量的ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション）、マイクロアレイ（例えば、オリゴヌクレオチドアレイ又は遺伝子チップ）を用いた方法などにより行うことができる。

ｍＲＮＡの量の測定は、当該ｍＲＮＡ（又は当該ｍＲＮＡに対するｃＤＮＡ若しくはｃＲＮＡ）にハイブリダイズするヌクレオチドプローブ又はプライマーの使用により測定することができる。プローブ又はプライマーの塩基長は、１０〜５０ヌクレオチド、好ましくは１５〜２５ヌクレオチドである。本発明の検査方法においてＲＴ−ＰＣＲを用いてｍＲＮＡの量を測定する場合、対象由来試料から抽出されたＲＮＡの逆転写により得られたｃＤＮＡを、プライマー（例えば配列番号３及び４で表されるプライマー）を用いて増幅することにより、ｍＲＮＡの量の測定を行うことができる。

また、別の実施形態において、本発明の検査方法における「ＡＤＡＭ８遺伝子の発現の検出」は、ＡＤＡＭ８遺伝子によってコードされるタンパク質を検出すること、及び／又はタンパク質の量を測定することを含む。ヒトＡＤＡＭ８タンパク質のアミノ酸配列を配列番号２として示す。そのような検出及び／又は測定は、特に限定されないが、例えば当該タンパク質に対する特異性の高いポリクローナル抗体やモノクローナル抗体を用いる免疫化学的方法によって行われ得る。免疫化学的方法には、特に限定されないが、例えばウェスタンプロット法、ＥＩＡ法、ＲＩＡ法、化学発光免疫測定法（ＣＬＩＡ法）などが含まれる。なお検出及び／又は測定に用いるための抗体は、既に特異性の確認された市販されている抗体を利用してもよいし、ＡＤＡＭ８の配列情報をもとに標準的な抗体作製法により新たに作製してもよい。

＜本発明の単離方法＞
第二の態様において、本発明は、対象から得られた試料中の血液細胞から、チロシンキナーゼ阻害剤に対して耐性を有する慢性骨髄性白血病細胞を単離する方法であって、
（１）試料中の血液細胞におけるＡＤＡＭ８遺伝子の発現を検出する工程、及び
（２）工程（１）の検出結果に基づいて、チロシンキナーゼ阻害剤に対して耐性を有する慢性骨髄性白血病細胞を単離する工程
を含む、単離方法に関する。以下で「本発明の単離方法」とも呼ぶ。

本発明の単離方法における「対象」、「試料」、「血液細胞」、及び「ＡＤＡＭ８遺伝子の発現の検出」は、第一の態様で記載したものと同様である。

本明細書において、「チロシンキナーゼ阻害剤に対して耐性を有する慢性骨髄性白血病細胞」（以下で、「ＴＫＩ耐性ＣＭＬ細胞」とも呼ぶ）は、チロシンキナーゼ阻害剤に対して抵抗性を有し、チロシンキナーゼ阻害剤を投与してもその生存率が有意に低減できない慢性骨髄性白血病細胞のことである。特に限定されないが、例えば、ＣＭＬ患者由来のＴＫＩ耐性ＣＤ３４陽性細胞であり得る。また、ＣＭＬ患者由来のＴＫＩ耐性ＣＤ３４陽性ＣＤ３８陽性細胞（前駆体細胞集団）及び／又はＴＫＩ耐性ＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞（幹細胞集団）であり得る。ＴＫＩ耐性ＣＭＬ細胞は、慢性骨髄性白血病幹細胞（以下で「ＣＭＬ幹細胞」とも呼ぶ）を含み得る。ＣＭＬ幹細胞とは、造血幹細胞の幹細胞性（Stemness）を保持したまま、がん幹細胞化している細胞である。なお本明細書において「ＴＫＩ耐性ＣＭＬ細胞」には、以下の実施例１で調製されたＴＫＩ耐性ＣＭＬ細胞モデルも含まれる。

一実施形態において、本発明の単離方法は、試料中の血液細胞に含まれるＡＤＡＭ８遺伝子を発現している細胞数を測定し、当該細胞数が基準値より高い場合に（例えば、統計的に有意に高い場合に）、当該細胞を単離することを含む。また別の実施形態において、本発明の単離方法は、試料中の血液細胞のＡＤＡＭ８遺伝子の発現量を測定し、当該遺伝子の発現量が基準値より高い場合に（例えば、統計的に有意に高い場合に）、当該細胞を単離することを含む。基準値は、第一の態様で記載したものと同様である。

本発明の方法において、細胞の単離工程は当業者にとって公知の細胞単離法が使用される。特に限定されないが、例えば、ＡＤＡＭ８タンパク質に対する抗体を用いるフローサイトメトリーによって細胞を単離する方法（ＦＡＣＳ）、あるいは抗体を担持させた磁気ビーズを用いて、細胞を磁石で捕集及び単離する方法（ＭＡＣＳ）などによって行われる。

＜キット＞
第三の態様において、本発明は、ＡＤＡＭ８遺伝子から転写されたｍＲＮＡ又はＡＤＡＭ８遺伝子によってコードされるタンパク質の検出薬を含む、慢性骨髄性白血病の検査用キットに関する。当該キットは、例えば本発明の検査方法及び本発明の単離方法において使用される。

検出対象がＡＤＡＭ８遺伝子から転写されたｍＲＮＡである場合、本発明のキットは、検出薬として、ＰＣＲに用いるためのプライマー及びＰＣＲ反応に必要な試薬類を含ませることができる。あるいは、ノーザンブロッティングに用いるためのプローブとして、ｍＲＮＡに対するｃＤＮＡ、ｃＲＮＡ又はそれらの一部が含まれても良い。例えば検出薬は、配列番号３及び４に示されるプライマーであり得る。

検出対象がＡＤＡＭ８遺伝子によってコードされるタンパク質である場合、本発明のキットは、本発明の検査用キットに含まれる「検出薬」として、免疫化学的方法に用いるための特異的一次抗体、二次抗体、二次抗体に結合した酵素の検出試薬などを含ませることができる。例えば検出薬は、本実施例で使用された、Miltenyi Biotec社製のヒトＡＤＡＭ８用抗体であり得る。

＜ＴＫＩ耐性の低減用組成物＞
第四の態様において、本発明は、ＡＤＡＭ８遺伝子の発現阻害剤又はＡＤＡＭ８の活性阻害剤を含む、慢性骨髄性白血病におけるチロシンキナーゼ阻害剤耐性を低減するための組成物に関する。以下で、「本発明のＴＫＩ耐性の低減用組成物」とも呼ぶ。ここで「慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）におけるチロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）耐性の低減」とは、ＴＫＩ耐性のＣＭＬ細胞を有する対象において、当該ＴＫＩ耐性を部分的に低減させるか、又は当該耐性を完全に解消させることを意味する。

本発明のＴＫＩ耐性の低減用組成物の効果は、ＴＫＩ耐性ＣＭＬ細胞（例えば上記第二の態様の方法に従って単離される細胞や、以下の実施例１で調製されるＴＫＩ耐性ＣＭＬ細胞モデル）を、本発明のＴＫＩ耐性の低減用組成物で処理した後にＴＫＩで処理した場合の細胞生存率と、対照の細胞生存率とを比較した場合に、対照と比較して細胞生存率が低い（例えば統計的に有意に低い）という点から確認できる。ここで対照の細胞生存率は、ＴＫＩ耐性ＣＭＬ細胞を、本発明のＴＫＩ耐性の低減用組成物で処理せずに、チロシンキナーゼ阻害剤で処理した場合の細胞生存率である。

（ＡＤＡＭ８の活性阻害剤）
本明細書において「ＡＤＡＭ８の活性阻害剤」は、直接的及び／又は間接的にＡＤＡＭ８タンパク質の活性（例えばメタロプロテアーゼ活性、ディスインテグリン活性）を阻害する、又は有意に抑制する生物学的効果を示す、天然の、又は合成された化合物を意味する。ＡＤＡＭ８の活性阻害剤とは、例えば、有機低分子、アプタマー、抗体、抗体フラグメント及びそれらの組み合わせであってもよい。好ましくは抗体又は抗体フラグメントである。

本明細書において「有機低分子」は、医薬品で一般的に使用される有機分子と同程度の大きさの分子のことである。本発明において用いることができるＡＤＡＭ８の活性阻害剤としての有機低分子の大きさは、好ましくは、約５０００Ｄａ以下、より好ましくは約２０００Ｄａ以下、最も好ましくは約１０００Ｄａ以下の範囲である。ＡＤＡＭ８の活性阻害剤として使用できる有機低分子としては、例えばＧＭ６００１（(2R)-N⁴-Hydroxy-N¹-[(1S)-2-(1H-indol-3-ylmethyl)-2-(methylamino)-2-oxoethyl]-2-(2-methylpropyl)butanediamide；CAS番号142880-36-2；分子量388.47）が挙げられる。

本明細書において「アプタマー」は、特異的に標的物質に結合する能力を持つ合成ＤＮＡ又はＲＮＡ分子及びペプチド性分子をいい、試験管内において化学的に短時間で合成することができる。本発明に用いられるアプタマーは、ＡＤＡＭ８タンパク質に結合し、ＡＤＡＭ８タンパク質の活性を阻害し得るものである。本発明に用いられるアプタマーは、例えば、ＳＥＬＥＸ法を用い、小分子、タンパク質、核酸など各種の分子標的への結合を、イン・ビトロで反復して選択することにより得ることができる（Ｔｕｅｒｋ Ｃ．，Ｇｏｌｄ Ｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９０，２４９（４９６８），５０５−５１０；Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ ＡＤ，Ｓｚｏｓｔａｋ ＪＷ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９９０，３４６（６２８７）：８１８−８２２；米国特許第６，８６７，２８９号明細書；米国特許第５，５６７，５８８号明細書；米国特許第６，６９９，８４３号明細書を参照）。

本明細書において「抗体又は抗体フラグメント」は、ＡＤＡＭ８タンパク質に結合し、ＡＤＡＭ８活性を阻害するものであれば、ヒト由来抗体、マウス由来抗体、ラット由来抗体、ウサギ由来抗体及びヤギ由来抗体などのいずれの抗体でもよく、さらにそれらのポリクローナル若しくはモノクローナル抗体、完全型若しくは短縮型（例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ＦａｂまたはＦｖフラグメント）抗体、キメラ化抗体、ヒト化抗体又は完全ヒト型抗体のいずれのものでもよい。本明細書において「抗体フラグメント」は、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ又はｓｃＦｖ抗体フラグメントのことであり、抗体をプロテアーゼ酵素により処理し、場合により還元することによって得ることができる。

本発明に用いることができる抗体又は抗体フラグメントは、ＡＤＡＭ８タンパク質又はその一部を抗原として、公知の抗体又は抗血清の製造法に従って製造することができる。ＡＤＡＭ８タンパク質又はその一部は、公知のタンパク質発現法及び精製法によって調製することができる。ＡＤＡＭ８タンパク質としては、例えば配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるヒトＡＤＡＭ８などが挙げられるが、これに限定されるものではない。種々の生物由来のＡＤＡＭ８タンパク質を免疫原として好適に用いることができる。これらのアミノ酸配列は公知のデータベース（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋなど）から容易に取得することができる。また、本発明に用いることができる抗体又は抗体フラグメントは、ファージ・ディスプレー法（例えば、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒ，１９９８年，第４４１巻，ｐ．２０−２４を参照）を介して作製することもできる。

（ＡＤＡＭ８遺伝子の発現阻害剤）
本明細書において「ＡＤＡＭ８遺伝子の発現阻害剤」は、直接的及び／又は間接的にＡＤＡＭ８遺伝子の発現を阻害する、又は有意に抑制する生物学的効果を有する天然の、又は合成された化合物を意味する。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＲＮＡｉ誘導性核酸、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、リボザイム、ゲノム編集核酸及びそれらの発現ベクター、有機低分子、アプタマー、抗体、抗体フラグメント、並びにそれらの組み合わせが挙げられる。好ましくは、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又はアンチセンスオリゴヌクレオチドである。

本明細書において「アンチセンスオリゴヌクレオチド」とは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）など、ある機能を持つＲＮＡ（センスＲＮＡ）と相補的な塩基配列（例えば５〜１００個の塩基配列）を持ち、センスＲＮＡと２本鎖を形成することで、そのセンスＲＮＡが担うべきタンパク質の合成を阻害する機能を有するＤＮＡ又はＲＮＡである。本発明において、アンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡ分子を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＡＤＡＭ８のｍＲＮＡに結合することによってタンパク質に翻訳されることを阻害する。それにより、ＡＤＡＭ８タンパク質の発現量を低下させることができる。またアンチセンスオリゴヌクレオチドは、機能に支障がない限り修飾されたものであってもよい。アンチセンスオリゴヌクレオチドを合成する方法は、当該技術分野で周知であり、例えば、市販のＤＮＡ合成装置によって容易に合成することができる。標的となるｍＲＮＡの配列は、例えば配列番号１に示されるヒトＡＤＡＭ８由来のｍＲＮＡの塩基配列であるが、これに限定されるものではない。種々の生物のＡＤＡＭ８由来のｍＲＮＡの塩基配列は、公知のデータベース（ＧｅｎＢａｎｋ等）から容易に取得することができる。

本明細書において「ＲＮＡｉ誘導性核酸」は、細胞内に導入されることにより、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を誘導し得るポリヌクレオチドをいい、通常、１９〜３０ヌクレオチド、好ましくは１９〜２５ヌクレオチド、より好ましくは１９〜２３ヌクレオチドを含むＲＮＡ、ＤＮＡ、又はＲＮＡとＤＮＡのキメラ分子であってよく、任意の修飾が施されていてもよい。ＲＮＡｉは、ｍＲＮＡに対して生じてもよいし、プロセッシング前の転写直後のＲＮＡ、すなわちエキソン、イントロン、３’非翻訳領域、及び５’非翻訳領域を含むヌクレオチド配列のＲＮＡであってもよい。本発明で使用可能なＲＮＡｉ法は、（１）短い二重鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を細胞内に直接導入するか、（２）低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を各種発現ベクターに組み込み、そのベクターを細胞内に導入するか、或いは（３）対立方向に並ぶ２個のプロモーターを持つベクターに、ｓｉＲＮＡに対応する短い二重鎖ＤＮＡをプロモーター間に挿入してｓｉＲＮＡを発現させるベクターを作製し、細胞内に導入する、などの手法によりＲＮＡｉを誘導させてもよい。ＲＮＡｉ誘導性核酸は、ＡＤＡＭ８のｍＲＮＡの切断又はその機能抑制を可能にするｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又はｍｉＲＮＡを含んでもよく、これらのＲＮＡｉ誘導性核酸は、リポソームなどを用いて直接導入されてもよいし、これらのＲＮＡｉ核酸を誘導する発現ベクターを用いて導入されてもよい。標的となるＲＮＡの配列は、例えば配列番号１に示されるヒトＡＤＡＭ８由来のｍＲＮＡの塩基配列であるが、これに限定されるものではない。種々の生物のＡＤＡＭ８由来のｍＲＮＡの塩基配列は、公知のデータベース（ＧｅｎＢａｎｋ等）から容易に取得することができる。

本発明で用いられるＡＤＡＭ８に対するＲＮＡｉ誘導性核酸は、ＲＮＡｉ誘導性核酸の標的となるＡＤＡＭ８のＲＮＡ配列に基づいて、周知の化学合成技術を用いて合成することができる。例えば、固相ホスホアミダイト法などのＤＮＡ合成技術を利用したＤＮＡ（／ＲＮＡ）自動合成装置を使用して化学的に合成するか、或いは、ｓｉＲＮＡ関連の受託合成会社（例えばＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社など）に委託して合成することも可能である。本発明の実施形態によれば、本発明に用いられるｓｉＲＮＡは、その前駆体であるｓｈｏｒｔ−ｈａｉｒｐｉｎ型二本鎖ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）から、細胞内ＲＮａｓｅであるダイサー（Ｄｉｃｅｒ）によるプロセシングを介して誘導されてもよい。本発明において使用されるＲＮＡｉ誘導性核酸は、例えば配列番号４５〜４７のｓｈＲＮＡである。

本明細書において「マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）」は、２１〜２５塩基長の１本鎖ＲＮＡ分子であり、真核生物において遺伝子の転写後発現調節に関与する。ｍｉＲＮＡは、一般にｍＲＮＡの３’ＵＴＲを認識して、標的ｍＲＮＡの翻訳を抑制し、タンパク質産生を抑制する。従って、ＡＤＡＭ８遺伝子の発現量を直接的及び／又は間接的に低減させることができるｍｉＲＮＡも、本発明の範囲に含まれる。

本明細書において「リボザイム」は、ＲＮＡの特異的切断を触媒することができる酵素的ＲＮＡ分子の総称である。リボザイムには種々の活性を有するものが存在するが、中でもＲＮＡを切断する酵素としてのリボザイムに焦点を当てた研究により、ＲＮＡを部位特異的に切断するリボザイムの設計が可能となった。リボザイムには、グループＩイントロン型やＲＮａｓｅ Ｐに含まれるＭ１ ＲＮＡのように４００ヌクレオチド以上の大きさのものもあるが、ハンマーヘッド型やヘアピン型と呼ばれる４０ヌクレオチド程度の活性ドメインを有するものもある。リボザイムを用いてＡＤＡＭ８遺伝子の転写産物を特異的に切断することで、ＡＤＡＭ８遺伝子の発現を阻害することができる。

本明細書において「ゲノム編集核酸」とは、遺伝子ターゲッティングに用いられるヌクレアーゼを利用したシステムにおいて、所望の遺伝子を編集するために用いられる核酸のことである。遺伝子ターゲッティングに用いられるヌクレアーゼは、公知のヌクレアーゼの他、今後遺伝子ターゲッティングのために使用される新たなヌクレアーゼも包含される。例えば、公知のヌクレアーゼとしては、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９（Ｒａｎ，Ｆ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２０１３，１５４，１３８０−１３８９）、ＴＡＬＥＮ（Ｍａｈｆｏｕｚ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，２０１１，１０８，２６２３−２６２８）、ＺＦＮ（Ｕｒｎｏｖ，Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２００５，４３５，６４６−６５１）などが挙げられる。

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、ＤＮＡの任意の部位に二本鎖切断を導入することを可能とする。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを用いるためには、少なくとも、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ配列）、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、Ｃａｓタンパク質（Ｃａｓ，Ｃａｓ９）の３つの要素を必要とする。

ＰＡＭ配列（５’−ＮＧＧ）に隣接する標的部位に相補的な配列を形成するようにｇＲＮＡを設計し、所望の細胞にＣａｓタンパク質と共に導入する。導入されたｇＲＮＡとＣａｓタンパク質は複合体を形成する。ｇＲＮＡがゲノム上の標的配列に結合し、Ｃａｓタンパク質がそのヌクレアーゼ活性によって標的のゲノムＤＮＡの二重鎖を切断する。

その後、ヌクレアーゼによる二本鎖切断を受けた細胞では、相同組換え型修復（Ｈｏｍｏｌｏｇｙ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｒｅｐａｉｒ（ＨＤＲ））、又は非相同性末端結合修復（ｎｏｎ−ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｅｎｄ ｊｏｉｎｉｎｇ（ＮＨＥＪ））が生じる。当該細胞内に適切なＤＮＡ断片（例えば、ＨＤＲ修復用鋳型）が存在する場合には、相同組換えが生じ、任意のゲノムにおいて欠失、挿入、破壊などの改変を行うことができる。ＨＤＲ修復用鋳型が存在しない場合は、ＮＨＥＪの過程で数塩基の欠失又は追加が生じる場合がある。これにより、タンパク質をコードする領域においてフレームシフトが生じ、タンパク質の読み取り枠が崩壊したり、未成熟な終止コドンが導入され、結果として、所望のタンパク質をノックアウトすることが可能となる。

本発明で用いられるゲノム編集核酸は、ＡＤＡＭ８遺伝子をターゲティングするｇＲＮＡであってもよく、該ｇＲＮＡを発現するベクターであってもよい。他の実施態様において、ゲノム編集核酸は、さらに、遺伝子ターゲッティングに用いられるヌクレアーゼを発現する核酸を含んでもよい。ｇＲＮＡと遺伝子ターゲッティングに用いられるヌクレアーゼ（好ましくは、Ｃａｓタンパク質）は、同一のベクターにコードされたものであってもよく、別々にコードされたベクターを用いてもよい。他の実施態様において、ゲノム編集核酸は、さらに、ＨＤＲ修復用鋳型核酸を含んでも良い。ゲノム編集核酸は、プラスミドベクターであってもよく、ウイルスベクターであってもよい。ゲノム編集核酸によって、任意の細胞に導入する方法については、公知の方法を用いることができ、特に限定されない。

ＡＤＡＭ８遺伝子の発現阻害剤は、上述のアンチセンスオリゴヌクレオチド、ＲＮＡｉ誘導性核酸、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、リボザイム又はゲノム編集核酸が任意のベクターにコードされた発現ベクターとして提供されてもよい。本発明において、ＡＤＡＭ８遺伝子の発現阻害剤を発現させるために使用されるベクターは特に限定されず、公知のものを適宜選択可能である。例えば、プラスミドベクター、コスミドベクター、フォスミドベクター、ウイルスベクター、人工染色体ベクターなどが挙げられる。ＡＤＡＭ８発現の阻害剤をベクターに導入する方法は、公知の遺伝子組換え技術を用いて導入することが可能であり、特に限定されない。

（製剤化）
本発明のＴＫＩ耐性の低減用組成物は、ＡＤＡＭ８遺伝子の発現阻害剤又はＡＤＡＭ８の活性阻害剤を有効成分とし、薬学的に許容される担体または添加剤を適宜配合して製剤化することができる。具体的には錠剤、被覆錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、液剤、懸濁剤、乳剤等の経口剤；注射剤、輸液、坐剤、軟膏、パッチ剤等の非経口剤とすることができる。担体または添加剤の配合割合については、医薬品分野において通常採用されている範囲に基づいて適宜設定すればよい。配合できる担体または添加剤は特に制限されないが、例えば、水、生理食塩水、その他の水性溶媒、水性または油性基剤等の各種担体；賦形剤、結合剤、ｐＨ調整剤、崩壊剤、吸収促進剤、滑沢剤、着色剤、矯味剤、香料等の各種添加剤が挙げられる。

（投与対象）
本発明のＴＫＩ耐性の低減用組成物の投与対象は、ヒト又は非ヒト哺乳動物である。非ヒト哺乳動物としては具体的には、サル、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウサギ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、シカなどが挙げられる。好ましくは、投与対象はヒトであり、より好ましくはＣＭＬを患うヒト患者であって、より好ましくはＴＫＩ耐性のＣＭＬ細胞を有するヒト患者である。また、本発明のＴＫＩ耐性の低減用組成物は、イン・ビトロでヒト又は非ヒト哺乳動物の細胞に対して使用することもできる。

（投与経路及び投与量）
本発明のＴＫＩ耐性の低減用組成物の投与経路は、経口及び非経口投与のいずれでもよい。非経口投与としては具体的には、注射投与、経鼻投与、経肺投与、経皮投与などが挙げられる。注射投与としては、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などが挙げられる。例えば注射投与によって当該組成物を全身または局部的に投与できる。また、患者の年齢、症状により適宜投与方法を選択することができる。投与量としては、例えば、一回の投与につき体重１ｋｇあたり０．０００１ｍｇ〜１，０００ｍｇの範囲で、有効成分であるＡＤＡＭ８遺伝子の発現阻害剤又はＡＤＡＭ８の活性阻害剤の投与量が選択できる。あるいは、例えば、患者あたり０．００１ｍｇ／ｂｏｄｙ〜１００，０００ｍｇ／ｂｏｄｙの範囲で上記有効成分の投与量が選択され得る。しかしながら、本発明のＴＫＩ耐性の低減用組成物の投与量は、これらに制限されるものではない。

＜ＣＭＬの治療用組成物＞
第五の態様において、本発明は、慢性骨髄性白血病を治療するための組成物であって、チロシンキナーゼ阻害剤を含み、ＡＤＡＭ８遺伝子の発現阻害剤又はＡＤＡＭ８の活性阻害剤と組み合わせて対象に投与される、組成物に関する。以下で「本発明のＣＭＬの治療用組成物」とも呼ぶ。

ＡＤＡＭ８遺伝子の発現阻害剤又はＡＤＡＭ８の活性阻害剤を、慢性骨髄性白血病を患う対象に投与することによって、チロシンキナーゼ阻害剤に対する耐性が低減される。その結果、チロシンキナーゼ阻害剤をより有効に対象に作用させることができる。また、チロシンキナーゼ阻害剤の効果を増強することができる。

本発明のＣＭＬの治療用組成物において、「組み合わせて対象に投与」とは、対象へのＡＤＡＭ８遺伝子の発現阻害剤又はＡＤＡＭ８の活性阻害剤の投与前に、当該阻害剤の投与後に、あるいは当該阻害剤の投与と同時に、本発明のＣＭＬの治療用組成物を投与することを意味する。好ましくは、対象へのＡＤＡＭ８遺伝子の発現阻害剤又はＡＤＡＭ８の活性阻害剤の投与後に、本発明のＣＭＬの治療用組成物を投与する。

本発明のＣＭＬの治療用組成物と組み合わせて投与される「ＡＤＡＭ８遺伝子の発現阻害剤」及び「ＡＤＡＭ８の活性阻害剤」、ならびに本発明のＣＭＬの治療用組成物の「製剤化」及び「投与経路」は、第四の態様で記載したものと同様である。

本発明のＣＭＬの治療用組成物における投与対象は、ヒト又は非ヒト哺乳動物である。非ヒト哺乳動物としては具体的には、サル、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウサギ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、シカなどが挙げられる。好ましくは、投与対象はヒトであり、より好ましくはＣＭＬを患うヒト患者であって、より好ましくはＴＫＩ耐性のＣＭＬ細胞を有するヒト患者である。

本発明のＣＭＬの治療用組成物の投与量としては、例えば、一回の投与につき体重１ｋｇあたり０．０００１ｍｇ〜１，０００ｍｇの範囲で、有効成分であるチロシンキナーゼ阻害剤の投与量が選択できる。あるいは、例えば、患者あたり０．００１ｍｇ／ｂｏｄｙ〜１００，０００ｍｇ／ｂｏｄｙの範囲で有効成分であるチロシンキナーゼ阻害剤の投与量が選択され得る。しかしながら、本発明のＣＭＬの治療用組成物の投与量は、これらに制限されるものではない。

＜スクリーニング方法＞
第六の態様において、本発明は、ＡＤＡＭ８遺伝子の発現阻害又はＡＤＡＭ８の活性阻害を指標とする、慢性骨髄性白血病におけるチロシンキナーゼ阻害剤耐性の低減剤のスクリーニング方法に関する。以下で「本発明のスクリーング方法」とも呼ぶ。

（ＡＤＡＭ８遺伝子発現細胞を用いる方法）
本発明のスクリーング方法は、
ＡＤＡＭ８遺伝子発現細胞を被験物質と接触させる工程と、
前記細胞におけるＡＤＡＭ８遺伝子の発現量又はＡＤＡＭ８の活性を測定する工程と、
前記工程で測定されたＡＤＡＭ８遺伝子の発現量又はＡＤＡＭ８の活性を、対照の発現量又は対照の活性と比較する工程であって、前記対照の発現量は、被験物質と接触させていないＡＤＡＭ８遺伝子発現細胞におけるＡＤＡＭ８遺伝子の発現量であり、前記対照の活性は、被験物質と接触させていないＡＤＡＭ８遺伝子発現細胞におけるＡＤＡＭ８の活性である、工程と、
前記対照の発現量又は対照の活性と比較して、ＡＤＡＭ８遺伝子の発現量又はＡＤＡＭ８の活性を低下させる被験物質を選択する工程と
を含む、方法によって行われてもよい。

上記方法において使用されるＡＤＡＭ８遺伝子発現細胞は、本発明のスクリーニングに使用できる限り特に限定されないが、例えば、第二の態様で単離されるＴＫＩ耐性ＣＭＬ細胞であってもよい。また、以下の実施例１で調製されるＴＫＩ耐性ＣＭＬ細胞モデルであってもよい。

上記の方法におけるＡＤＡＭ８遺伝子発現細胞と被験物質との接触時間及び接触温度は、特に限定されず、適宜選択すればよい。

また、上記の方法におけるＡＤＡＭ８遺伝子の発現量は、第一の態様に記載された方法に従って測定することができる。

上記の方法におけるＡＤＡＭ８の活性の評価は、特に限定されないが、例えばＡＤＡＭ８タンパク質のメタロプロテアーゼ活性を評価することによって行うことができる。ＡＤＡＭ８タンパク質が、メタロプロテアーゼ活性によりＣＤ２３タンパク質を分解することが知られている。例えば、ＡＤＡＭ８遺伝子発現細胞にＣＤ２３タンパク質を同時に発現させ、分解されたＣＤ２３タンパク質の量を測定することで、ＡＤＡＭ８タンパク質の活性を測定できる。（例えば、U. Schlomann et al, “ADAM8 as a drug target in pancreatic cancer”, Nature communications, 6, 6175 (2015)を参照）。

被験物質と接触させたＡＤＡＭ８遺伝子発現細胞におけるＡＤＡＭ８遺伝子の発現量と対照の発現量を比較して、対照よりも発現量が低下する場合（例えば、統計的に有意に低下する場合）、被験物質が慢性骨髄性白血病におけるチロシンキナーゼ阻害剤耐性の低減剤であると判定して、これを選択すればよい。好ましくは、被験物質と接触させたＡＤＡＭ８遺伝子発現細胞におけるＡＤＡＭ８遺伝子の発現量が、対照の発現量の９０％以下、８０％以下、７０％以下、６０％以下、又は５０％以下である場合に、当該被験物質が慢性骨髄性白血病におけるチロシンキナーゼ阻害剤耐性の低減剤であると判定して、これを選択する。

あるいは、被験物質と接触させたＡＤＡＭ８遺伝子発現細胞におけるＡＤＡＭ８の活性と対照の活性を比較して、対照よりも活性が低下する場合（例えば、統計的に有意に低下する場合）、被験物質が慢性骨髄性白血病におけるチロシンキナーゼ阻害剤耐性の低減剤であると判定して、これを選択すればよい。好ましくは、被験物質と接触させたＡＤＡＭ８遺伝子発現細胞におけるＡＤＡＭ８の活性が、対照の活性の９０％以下、８０％以下、７０％以下、６０％以下、又は５０％以下である場合に、当該被験物質が慢性骨髄性白血病におけるチロシンキナーゼ阻害剤耐性の低減剤であると判定して、これを選択する。

（ＡＤＡＭ８タンパク質を用いる方法）
また本発明のスクリーング方法は、
ＡＤＡＭ８を被験物質と接触させる工程と、
前記ＡＤＡＭ８の活性を測定する工程と、
前記工程で測定されたＡＤＡＭ８の活性を、対照の活性と比較する工程であって、前記対照の活性は、被験物質と接触させていないＡＤＡＭ８の活性である、工程と、
前記対照の活性と比較して、ＡＤＡＭ８の活性を低下させる被験物質を選択する工程と
を含む、方法によって行われても良い。

上記のＡＤＡＭ８タンパク質を用いる方法におけるＡＤＡＭ８タンパク質と被験物質との接触時間及び接触温度は、特に限定されず、適宜選択すればよい。

上記のＡＤＡＭ８タンパク質を用いる方法におけるＡＤＡＭ８タンパク質の活性の評価は、特に限定されないが、例えばＡＤＡＭ８タンパク質のメタロプロテアーゼ活性を評価することによって行うことができる。例えば、ＡＤＡＭ８タンパク質とＣＤ２３タンパク質を混在させて至適条件とした後、分解されたＣＤ２３タンパク質の量を測定することでＡＤＡＭ８タンパク質の活性を測定できる。また例えば、ＡＤＡＭ８タンパク質のディスインテグリン活性を評価することによってＡＤＡＭ８タンパク質の活性の評価を行うことができる（例えば、Fourie, A. M. et al., “Catalytic activity of ADAM8, ADAM15, and MDC-L (ADAM28) on synthetic peptide substrates and in ectodomain cleavage of CD23”, J. Biol. Chem. 278, 30469-30477 (2003)を参照）。

被験物質と接触させたＡＤＡＭ８の活性を対照の活性と比較して、対照よりも発現量が低下する場合（例えば統計的に有意に低下する場合）、被験物質が慢性骨髄性白血病におけるチロシンキナーゼ阻害剤耐性の低減剤であると判定して、これを選択すればよい。好ましくは、被験物質と接触させたＡＤＡＭ８の活性が、対照の活性の９０％以下、８０％以下、７０％以下、６０％以下、又は５０％以下である場合に、当該被験物質が慢性骨髄性白血病におけるチロシンキナーゼ阻害剤耐性の低減剤であると判定して、これを選択する。

本発明のスクリーング方法は、ＴＫＩ耐性ＣＭＬ細胞を、選択された被験物質で処理した後、チロシンキナーゼ阻害剤で処理し、耐性が低減されるか否かを確認する工程をさらに含んでも良い。当該工程で使用されるＴＫＩ耐性ＣＭＬ細胞は、例えば本発明の第二の態様の方法に従って単離される細胞であってもよいし、以下の実施例１で調製されるＴＫＩ耐性ＣＭＬ細胞モデルであってもよい。耐性の低減の確認方法は特に限定されないが、例えば、ＴＫＩ耐性ＣＭＬ細胞を、選択された被験物質で処理した後、チロシンキナーゼ阻害剤で処理した場合の細胞生存率と、対照の細胞生存率とを比較し、対照と比較して細胞生存率が低い場合（例えば統計的に有意に低い場合）、好ましくは、細胞生存率が対照の９０％以下、８０％以下、７０％以下、６０％以下、又は５０％以下である場合に、選択された被験物質が慢性骨髄性白血病におけるチロシンキナーゼ阻害剤耐性の低減剤であると確認できる。ここで対照の細胞生存率は、ＴＫＩ耐性ＣＭＬ細胞を、選択された被験物質で処理せずに、チロシンキナーゼ阻害剤で処理した場合の細胞生存率である。

本明細書において言及される全ての文献はその全体が引用により本明細書に取り込まれる。本発明の技術的範囲は特許請求の範囲の記載によってのみ限定される。本発明の趣旨を逸脱しないことを条件として、本発明の変更、例えば、本発明の構成要件の追加、削除及び置換を行うことができる。

以下に示す実施例を参照して本発明をさらに詳しく説明するが、本発明の範囲は、これらの実施例によって限定されるものでないことは言うまでもない。

患者試料
本実施例で使用した全ての患者の骨髄由来の一次試料 (primary sample)は、インフォームドコンセントの後に得られた。ヒト細胞を用いる全ての実施例は、東京大学の施設審査委員会（ＩＲＢ）により審査され、そして承認された。Ｇ−バンド染色体分析に基づいてｔ（９；２２）（ｑ３４；ｑ１１）染色体転座のみを決定する、ＣＭＬ−ＣＰ患者の試料が選択された。単核細胞（ＭＮＣ）を、Ｆｉｃｏｌｌ勾配遠心分離により単離した。各実施例で使用した患者試料の詳細を以下に示す。

ＲＮＡ抽出、ＲＴ−ＰＣＲ、リアルタイム定量ＰＣＲ、１ステップ定量ＲＴ−ＰＣＲ分析
ＲＮＡeasy試薬（ＱＩＡＧＥＮ）による全ＲＮＡの抽出の後、逆転写をReverTra Ace qPCR RT Master Mix (ＴＯＹＯＢＯ社）により行った。ＰＣＲのために使用したプライマー配列を以下に示す。リアルタイム定量ＰＣＲを、THUNDERBIRD SYBR qPCR Mixを備えたＡＢＩ−７０００配列検出システムにおいて、製造業者の説明書（ＴＯＹＯＢＯ社）に従って実施した。各アッセイは三回反復して行われた。内在性コントロールとして１８Ｓ ｒＲＮＡ及びβ−アクチンを使用した。

フローサイトメトリー（ＦＣＭ）
ｉＰＳＣ由来の造血細胞及び白血病患者由来の一次サンプルからの各細胞画分の単離は、ＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩ及びＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩＩセルソーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いて実施された。ＦｌｏｗＪｏ（ＴｒｅｅＳｔａｒ，Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ，ＵＳＡ）を用いてデータ分析した。抗体として以下のものを使用した。

実施例で用いた各種試薬は、特に記載の無い限り市販品を使用した。

実施例１
ＴＫＩ耐性ＣＭＬ細胞のモデルの調製
ＣＭＬ−ＣＰ患者の一次サンプルは、ＴＫＩ耐性を有するＣＭＬ幹細胞を分析するために最も効果的なモデルの１つである。しかし、一次サンプルから得られるＣＭＬ幹細胞の量は少量かつ不均一であるため、新規マーカーの効率的探索が困難である。この問題を解消するために、ＣＭＬ−ＣＰ患者の骨髄から得られた細胞をリプログラミングして、遺伝子挿入のないｉＰＳＣを調製した。その後当該ｉＰＳＣの造血系分化を誘導し、ＴＫＩ耐性ＣＭＬ細胞のモデルの調製を行った。

（１）ＣＭＬ−ＣＰ患者のＣＤ３４＋細胞からのｉＰＳＣ（誘導多能性幹細胞）細胞の調製
Kumano, K. et al., Blood 119, 6234-42 (2012) に記載された方法に従ってＣＭＬ−ＣＰ患者由来の細胞からｉＰＳＣを調製した。ＣＭＬ−ＣＰであると新たに診断された２人の患者の骨髄試料から精製されたＣＤ３４＋細胞を、文献に記載された通りに、２０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３リガンド（Ｆｌｔ３Ｌ）、インターロイキン（ＩＬ）−３、ＩＬ−６及びトロンボポエチン（ＴＰＯ）を補足したα−ＭＥＭ培地中で２日間増殖させた。ｐＣＸＬＥ−ｈＯＣＴ３／４−ｓｈｐ５３−Ｆ、ｐＣＸＬＥ−ｈＳＫ、ｐＣＸＬＥ−ｈＵＬ及びｐＣＸＷＢ−ＥＢＮＡ１を含むプラスミド混合物を、文献に記載の通りに、２×１０⁵個のＣＤ３４＋細胞中にエレクトロポレーションした。その後、当該ＣＤ３４＋細胞をマウス胚線維芽細胞と共に２０〜３０日間培養することで、ＣＭＬ−ＣＰ患者由来の胚性幹細胞（ＥＳ）様コロニーを得た。幹細胞遺伝子及びＢＣＲ−ＡＢＬの発現がＲＴ−ＰＣＲにより確認された（図１）。例外として、一人の患者由来のｉＰＳＣ（ＣＭＬ Ｐｔ２ ｉＰＳＣｓ Ｎｏ．３）は、ＢＣＲ−ＡＢＬを発現せず、正常なｉＰＳＣであった。ＣＭＬ−ＣＰ患者由来であって、ＢＣＲ−ＡＢＬを発現しているｉＰＳＣ（図１のＣＭＬ Ｐｔ１ ｉＰＳＣｓ Ｎｏ．３及び５、並びにＣＭＬ Ｐｔ２ ｉＰＳＣｓ Ｎｏ．４）を以下で「ＣＭＬ−ｉＰＳＣ］」と呼ぶ。なお、上記と同様の方法を用いて、健常者由来の細胞をリプログラミングしてｉＰＳＣを調製した。得られたｉＰＳＣを以下で「正常ｉＰＳＣ (normal iPSC)」とも呼ぶ。本実験のスキームを図２に示す。

（２）ｉＰＳＣの造血系分化
ＣＭＬ−ｉＰＳＣの造血系分化 (hematopoietic differentiation)を、Takayama, N. et al., J. Exp. Med. 207, 2817-30 (2010)に従って行った。ｉＰＳＣのクラスターを、マイトマイシンＣで処理されたＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞上に移し、２０ｎｇ／ｍｌのヒト血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）の存在下にて造血系分化用培地中で共培養した。当該培地は、１０ｍｇ／ｍｌのヒトインスリン、５．５ｍｇ／ｍｌのヒトトランスフェリン、５ｎｇ／ｍｌの亜セレン酸ナトリウム、２ｍｍｏｌ／ＬのＬ−グルタミン、０．４５ｍｍｏｌ／Ｌのモノチオグリセロール、５０ｍｇ／ｍｌのアスコルビン酸、及び１５％の高度にろ過されたウシ胎児血清（ＦＢＳ）のカクテルを含むイスコブ変法ダルベッコ培地から成る。培養開始４、７、１０、１２、１４及び１６日目に培地を交換した。１７〜１８日間の培養後、ピペット端で押しつぶされたｉＰＳＣ嚢を、セルストレーナーでろ過した。ＣＤ４３＋造血細胞（ＨＣ）から、ＣＤ３４＋／ＣＤ４５−であるプレ造血前駆体細胞(pre-hematopietic progenitor cells)（以下で「ＣＭＬ−プレ−ＨＰＣ」とも呼ぶ）及びＣＤ３４−／ＣＤ４５＋である分化細胞 (differentiated cells)（以下で「ＣＭＬ−ＤＣ」とも呼ぶ）を、フローサイトメトリーにより単離した。同様にして、正常ｉＰＳＣを分化誘導して、プレ−ＨＰＣ及びＤＣを調製した（それぞれ以下で「正常−プレ−ＨＰＣ」及び「正常−ＤＣ」と呼ぶ）。

（３）細胞増殖アッセイ
Kumano, K. et al., Blood 119, 6234-42 (2012)に記載の方法に従って細胞増殖アッセイを行った。ｉＰＳＣ由来の５０００個のプレ−ＨＰＣ及びＤＣを、チロシンキナーゼ阻害剤であるイマチニブ（２．５Ｍ）の存在又は非存在下で、１００ｎｇ／ｍｌのＳＣＦ、１０ｎｇ／ｍｌのＴＰＯ、１００ｎｇ／ｍｌのＦｌｔ３Ｌ、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ３及び１００ｎｇ／ｍｌのＩＬ６で補足された２０％ＦＣＳを含むα−ＭＥＭ中で培養した。各アッセイを２回反復して行った。イマチニブ非存在下及び存在下での結果をそれぞれ図３及び４に示す。

ＣＭＬ−プレ−ＨＰＣは、正常−プレ−ＨＰＣと比較して、高い細胞増殖を示した（図３）。また、イマチニブ存在下であってもＣＭＬ−プレ−ＨＰＣは増殖を続けた。一方、イマチニブ存在下ではＣＭＬ−ＤＣの細胞数は減少した（図４）。

（４）アポトーシスアッセイ
上記（２）の造血系分化工程において、工程開始１６日目に、５μＭのイマチニブを含む又は含まない培地に培地交換することで、アポトーシスアッセイを行った。培地交換後、４８時間経過後の結果を図５に示す。ＣＭＬ−プレ−ＨＰＣはイマチニブを添加されてもアポトーシスを誘発されなかった。（３）及び（４）の結果は、ＣＭＬ−プレ−ＨＰＣがＣＭＬ疾患の表現型を再現するのみならず、ＣＭＬ幹細胞の主要な特徴である、イマチニブに対する耐性を有することを示唆している。

（５）マイクロアレイ分析
遺伝子発現分析を、SurePrint G3 Human GE 8x60K v2 Microarray (Agilent社)を用いて実施した。また、Gene Expression Omnibus (GEO) データベース(GEO GSE40721)からのヒト試料にに基づく、公開された遺伝子発現マイクロアレイデータを分析した。生データの標準化及びクラスタリング分析を、CLC Genomics Workbenchを用いて実施した。プレ−ＨＰＣ及びＤＣの発現プロファイルを比較するために、精選された遺伝子セットを用いる遺伝子セットエンリッチメント解析（ＧＳＥＡ）に関して、標準化されたデータを試験した。ＣＭＬ−ＤＣと比較してＣＭＬ−プレ−ＨＰＣにおいて高い発現レベルを有する遺伝子をスクリーニングするために、個々の遺伝子の発現を、グループ間で比較した。独立スチューデントｔ検定 (unpaired Student’s t-test)（Ｐ＜０．０５）により、ＣＭＬ−ＤＣと比較して、ＣＭＬ−プレ−ＨＰＣにおいて発現が増大した遺伝子を選択した。

イマチニブが存在しない条件下での、ＣＭＬ−ＤＣと比較されるＣＭＬ−プレ−ＨＰＣに関するＧＳＥＡによって、３２６７個の精選された遺伝子セットから以下の２３個の遺伝子セットが濃縮された（偽発見率 ｑ値＜０．０５）。これらは、ｐ５３の不活性化によって上方制御される遺伝子及びＮＵＰ９８−ＨＯＸＡ９の標的遺伝子を含む。いずれの遺伝子も、ＣＭＬのＴＫＩ耐性に関与することが知られている。

（６）ＣＭＬ−プレ−ＨＰＣのＴＫＩ抵抗性の評価
イマチニブ耐性に関与する遺伝子の候補として、イマチニブ処理によりＣＭＬ−プレ−ＨＰＣ中で発現レベルが増大した１６６個の遺伝子を選択した。当該１６６個のうち、イマチニブ抵抗性に関与する遺伝子として報告されているＩＫ１ＲＬ１が最も高い発現レベルを示した。ＩＫ１ＲＬ１と、ＮＵＰ９８−ＨＯＸＡ９の標的であるＭＥＩＳ１の両方の発現量をリアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲによって評価した。結果を図６に示す。この結果は、ＣＭＬ−プレ−ＨＰＣがＴＫＩ抵抗性のＣＭＬ幹細胞のモデルとして利用できることを示している。

実施例２
ＴＫＩ耐性ＣＭＬ細胞に対するマーカーとしてのＡＤＡＭ８の同定
ＣＭＬ患者の公開されたアレイデータ（ＧＳＥ４０７２１）中のＣＭＬ幹細胞に関する分析に基づいて、上記の１６６個の候補遺伝子から６個の遺伝子（ＣＹＴＨ４、ＰＴＭＡ、ＯＬＦＭ２、ＡＤＡＭ８、ＰＯＧＫ、ＰＣＫＤＫ）を選択した。当該６個の遺伝子は、ＴＫＩ感受性ＣＭＬ前駆体細胞画分（ＣＤ３４＋／ＣＤ３８＋）よりも、ＴＫＩ抵抗性ＣＭＬ幹細胞画分（ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−）において発現レベルが向上した遺伝子である。リアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲによって当該６個の遺伝子の発現量を確認した。当該６個の遺伝子の１つであるＡＤＡＭ８のＲＮＡ発現量の評価結果を図７に示す。細胞生存性アッセイの結果、ＡＤＡＭ８陽性のＣＭＬ−プレ−ＨＰＣ細胞は、ＡＤＡＭ８陰性のＣＭＬ−プレ−ＨＰＣ細胞と比較してＴＫＩ抵抗性を示した（図８）。この結果は、ＡＤＡＭ８がＴＫＩ耐性ＣＭＬ細胞の優れたバイオマーカーであることを示している。

実施例３
ＣＭＬ−ＣＰであると新たに診断された患者の一次試料を用いた試験
（１）ＣＤ３４＋ＡＤＡＭ８＋細胞画分の評価
ＣＭＬ−ＣＰ患者においてＡＤＡＭ８がＴＫＩ耐性ＣＭＬ細胞のマーカーとして機能することを確認するために、ＣＭＬ−ＣＰであると新たに診断された患者の一次試料の蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）によって精製されたＣＤ３４＋ＡＤＡＭ８＋細胞画分を評価した（図９）。

ＣＭＬ−ＣＰ患者の骨髄試料中におけるＣＤ３４＋幹細胞／前駆体細胞画分は、ＮＨＬ（正常対照）患者由来の試料中のＣＤ３４＋幹細胞／前駆体細胞画分及び他の悪性血液疾患患者由来の試料中のＣＤ３４＋幹細胞／前駆体細胞画と比較して、ＡＤＡＭ８＋細胞が豊富に存在することがＦＣＭ分析により示された（図１０）。

（２）ＣＤ３４＋ＡＤＡＭ８＋細胞画分及びＣＤ３４＋ＡＤＡＭ８−細胞画分の細胞生存性アッセイ及びアポトーシスアッセイ
細胞生存性アッセイ及びアポトーシスアッセイを、Ma, L. et al., Sci. Transl. Med. 6, 252ral21(2014)に記載された方法に従って行った。精製されたＣＭＬ−ＣＰ試料を、イマチニブの存在又は非存在下で、１００ｎｇ／ｍｌのＳＣＦ、１００ｎｇ／ｍｌの顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、２０ｎｇ／ｍｌのＦＬ３Ｌ、２０ｎｇ／ｍｌのＩＬ３、及び２０ｎｇ／ｍｌのＩＬ６で補足された２０％ＦＣＳを含むα−ＭＥＭ中で培養した。イマチニブの曝露から４８時間後、製造業者のプロトコルに従って、アネキシン−Ｖ及び４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール用抗体によって細胞を染色した。得られた結果を図１１及び１２に示す。

ＣＭＬ−ＣＰ患者におけるＡＤＡＭ８＋ＣＭＬ細胞は、ＡＤＡＭ８−ＣＭＬ細胞と比較してイマチニブ耐性を示した（図１１）。また、イマチニブによって誘導されるアポトーシスは、ＡＤＡＭ８−ＣＭＬ細胞と比較してＡＤＡＭ８＋ＣＭＬ細胞において抑制された（図１２）。

（３）ＣＤ３４＋ＣＤ３８＋ＡＤＡＭ８＋細胞画分及びＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＡＤＡＭ８＋細胞画分の評価
ＣＤ３４＋ＣＤ３８＋細胞画分（前駆体画分）及びＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞画分（幹細胞画分）中のＡＤＡＭ８＋細胞の頻度を測定した。結果を図１３に示す。ＣＤ３４＋ＣＤ３８＋前駆体画分においては、ＡＤＡＭ８＋細胞の頻度は、ＮＨＬ患者（ｎ＝３）及び他の血液悪性腫瘍患者（ＡＭＬ；ｎ＝１、ＡＬＬ：ｎ＝１、ＭＤＳ：ｎ＝１、ＣＭＭＬ：ｎ＝３）よりも、ＣＭＬ−ＣＰ患者（ｎ＝１８）において、有意に高かった。

（４）ＣＤ３４＋ＣＤ３８＋ＡＤＡＭ８＋細胞画分及びＣＤ３４＋ＣＤ３８＋ＡＤＡＭ８−細胞画分の細胞生存性アッセイ
ＣＤ３４＋ＣＤ３８＋細胞画分（前駆体細胞画分）から、ＦＡＣＳによりＡＤＡＭ８＋細胞画分とＡＤＡＭ８−細胞画分を分離した（図１４）。上記（２）と同様にして、ＣＤ３４＋ＣＤ３８＋ＡＤＡＭ８＋細胞画分及びＣＤ３４＋ＣＤ３８＋ＡＤＡＭ８−細胞画分を用いて細胞生存性アッセイ及びアポトーシスアッセイを実施した。結果を図１５に及び１６に示す。

ＴＫＩ感受性として知られているＣＤ３４＋／ＣＤ３８＋前駆体細胞においてでさえ、ＡＤＡＭ８＋細胞は、ＡＤＡＭ８−細胞と比較してＴＫＩ耐性を示した。このことはまた、ＡＤＡＭ８がＴＫＩ耐性ＣＭＬ細胞の有用なバイオマーカーであることを示している。

実施例４
ＴＫＩ治療によってＭＭＲ及びＭＵＬとなった患者の試料を用いた試験
ＴＫＩ治療によってＭＭＲ（major molecular response）（ｎ＝２）及びＭＵＬ（molecular undetectable leukemia）（ｎ＝１）を達成した患者から得られた試料を限界希釈アッセイによって評価した。

ＦＡＣＳにより分離したＣＤ３４＋ＣＤ３８＋ＡＤＡＭ８＋細胞画分から、９６ウェルプレート上に３００細胞／ウェル、１００細胞／ウェル、３３細胞／ウェル及び１１細胞／ウェルとなるように希釈系列を８つ作成した。また、ＣＤ３４＋ＣＤ３８＋ＡＤＡＭ８−細胞画分から、９６ウェルプレート上に９００細胞／ウェル、３００細胞／ウェル、１００細胞／ウェル及び３３細胞／ウェルとなるように希釈系列を８つ作成した。その後各ウェルにおいて、ＢＣＲ−ＡＢＬに関して１ステップＲＴ−ＰＣＲをChu, S. et al., Blood. 2011 Nov 17; 118(20):5565-72に記載された方法に従って行い、ＢＣＲ−ＡＢＬ発現細胞の絶対頻度をHu, Y et al., J Immunol Methods. 347, 70-8 (2009)に従って計算した。結果を図１７に示す。

ＭＭＲのＣＭＬ患者において、ＢＣＲ−ＡＢＬ＋細胞の細胞頻度は、ＣＤ３４＋／ＣＤ３８＋／ＡＤＡＭ８−細胞画分と比較してＣＤ３４＋／ＣＤ３８＋／ＡＤＡＭ８＋細胞画分において高かった。ＢＣＲ−ＡＢＬ＋細胞の細胞頻度は、ＣＤ３４＋／ＣＤ３８＋／ＡＤＡＭ８＋細胞画分とＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞画分とでは同程度であった。ＭＵＬの患者において、ＡＤＡＭ８＋細胞画分ではＢＣＲ−ＡＢＬ＋細胞が検出された。一方、ＣＤ３４＋／ＣＤ３８＋／ＡＤＡＭ８−細胞画分ではＢＣＲ−ＡＢＬ＋細胞は検出されなかった。これらの知見は、ＴＫＩに対して良好な応答を示すＣＭＬ−ＣＰ患者中に存在する、ＴＫＩ耐性である残存ＣＭＬ細胞のバイオマーカーとしてＡＤＡＭ８が使用できることを示している。

実施例５
ＡＤＡＭ８遺伝子の発現阻害の効果
（１）ｓｈＲＮＡによる、ＡＤＡＭ８遺伝子の発現阻害の評価
ＨＬ６０ＡＭＬ細胞株をＡＤＡＭ８_ｓｈＲＮＡ_１（配列番号４５）、ＡＤＡＭ８_ｓｈＲＮＡ_２（配列番号４６）及びＡＤＡＭ８_ｓｈＲＮＡ_３（配列番号４７）で処理した場合における、細胞中のＡＤＡＭ８遺伝子から転写されたｍＲＮＡの量を測定した。なお、ＡＤＡＭ８_ｓｈＲＮＡ_１、ＡＤＡＭ８_ｓｈＲＮＡ_２及びＡＤＡＭ８_ｓｈＲＮＡ_３の標的配列は、それぞれ配列番号４９、５０及び５１である。具体的には、ＨＥＫ２９３細胞株に、ｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡを組み込んだｐＬＫＯ．１−ｐｕｒｏ−ＣＭＶ−ｔＧＦＰ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ Ｊａｐａｎ）を、ｐＭＩＳＳＩＯＮ ＧＡＧ ＰＯＬ （Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ Ｊａｐａｎ）及びｐＭＩＳＳＩＯＮ ＶＳＶ-Ｇ （Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ Ｊａｐａｎ）と共に導入し、ｓｈＲＮＡを発現するレンチウイルスを得た。得られたレンチウイルスをＨＬ６０に感染させ、１μg/mlのピューロマイシンを用いて７２時間選択し、選択された細胞のＡＤＡＭ８遺伝子の発現を解析した。結果を図１８に示す。なお、ＡＤＡＭ８ではない遺伝子を標的とするｎｏｎ−ｔａｒｇｅｔ_ｓｈＲＮＡ（配列番号４８、標的配列は配列番号５２）を使用した場合（図中の「ｎｏｎ−ｔａｒｇｅｔ」）のＡＤＡＭ８遺伝子の発現量を１とした。ＡＤＡＭ８_ｓｈＲＮＡ_１〜３は、ＡＤＡＭ８をノックダウンできることが確認された。

（２）ＣＤ３４＋ＡＤＡＭ８＋細胞を用いた細胞生存性アッセイ
上記（１）で得られたｓｈＲＮＡを発現するレンチウイルスを、ＣＭＬ−ＣＰ２３由来のＣＤ３４＋ＡＤＡＭ８＋細胞に感染させた。２．５μｇ／ｍｌのピューロマイシンで６０時間処理してピューロマイシン耐性細胞を選択した。得られた細胞に対して、イマチニブ非存在下および１．０μＭイマチニブ存在下にて、細胞生存性アッセイを実施例３（２）と同様の方法で行った。結果を図１９に示す。ＡＤＡＭ８遺伝子の発現を阻害することにより、ＴＫＩ耐性が低減されることが示された。

実施例６
ＡＤＡＭ８の活性阻害の効果
（１）ＡＤＡＭ８の活性阻害剤がＣＤ３４＋ＡＤＡＭ８＋細胞及びＣＤ３４＋ＡＤＡＭ８−細胞に与える影響の評価
ＣＤ３４＋ＡＤＡＭ８＋細胞及びＣＤ３４＋ＡＤＡＭ８−細胞を用いて、ＧＭ６００１（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）の非存在下および特定の濃度（２．５μＭ、５μＭ、２０μＭ）のＧＭ６００１存在下で、細胞生存性アッセイを行った。細胞生存性アッセイは、イマチニブの代わりにＧＭ６００１を使用すること以外は実施例３（２）と同様の方法で行った。結果を図２０に示す。ＧＭ６００１は、ＣＤ３４＋ＡＤＡＭ８＋細胞及びＣＤ３４＋ＡＤＡＭ８−細胞のいずれの細胞生存性にも２．５μＭの濃度では影響を及ぼさないことが確認された。

ＣＤ３４＋ＡＤＡＭ８＋細胞及びＣＤ３４＋ＡＤＡＭ８−細胞を用いて、イマチニブ及びＧＭ６００１の非存在下、１．０μＭイマチニブ存在下、あるいは、１．０μＭイマチニブ及び２．５μＭのＧＭ６００１存在下で、細胞生存性アッセイを行った。イマチニブ及びＧＭ６００１の非存在下、並びに１．０μＭイマチニブ存在下での細胞生存性アッセイは、実施例３（２）と同様の方法で行った。１．０μＭイマチニブ及び２．５μＭのＧＭ６００１存在下での細胞生存性アッセイは、イマチニブに加えてＧＭ６００１を使用すること以外は実施例３（２）と同様の方法で行った。結果を図２１及び２２に示す。ＡＤＡＭ８の活性を阻害することにより、ＴＫＩ耐性が低減されることが示された。

本発明は、チロシンキナーゼ阻害剤耐性の慢性骨髄性白血病細胞を高感度に検出し、かつ単離するために好適に利用することができる。また本発明によって、慢性骨髄性白血病の診断、慢性骨髄性白血病のモニタリング、慢性骨髄性白血病の治療を必要とする患者群の分類、慢性骨髄性白血病の再発予測などを効率的に行うことが可能である。また本発明によって、ＣＭＬにおけるＴＫＩ耐性を低減することが可能である。

Claims (21)

1. 慢性骨髄性白血病の検査方法であって、対象から得られた試料中の血液細胞におけるＡＤＡＭ８遺伝子の発現を検出する工程を含む、方法。
2. 前記対象は、チロシンキナーゼ阻害剤を用いた治療を受けている対象である、請求項１に記載の方法。
3. 前記対象は、チロシンキナーゼ阻害剤を用いた治療によってＭＭＲ (major molecular response)又はＭＵＬ (molecular undetectable leukemia) を達成した対象である、請求項１又は２に記載の方法。
4. 慢性骨髄性白血病に対する治療を必要とする患者の分類を補助する方法である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
5. 慢性骨髄性白血病の再発の予測を補助する方法である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
6. チロシンキナーゼ阻害剤が、イマチニブ、ゲフィチニブ、エルロチニブ、オシメルチニブ、アファチニブ、ダサチニブ、ボスチニブ、バンデタニブ、スニチニブ、アキシチニブ、パゾパニブ、レンバチニブ、ラパチニブ、ニンテダニブ、ニロチニブ、イブルチニブ及びポナチニブから成る群から選択される、請求項２〜５のいずれか１項に記載の方法。
7. 前記試料は末梢血又は骨髄液である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
8. 前記血液細胞はＣＤ３４陽性細胞である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
9. ＡＤＡＭ８遺伝子の発現の検出は、ＡＤＡＭ８遺伝子を発現する細胞の数を測定することを含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
10. ＡＤＡＭ８遺伝子の発現の検出は、ＡＤＡＭ８遺伝子から転写されたｍＲＮＡの量を測定することを含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
11. ＡＤＡＭ８遺伝子の発現の検出は、ＡＤＡＭ８遺伝子によってコードされるタンパク質の量を測定することを含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
12. 対象から得られた試料中の血液細胞から、チロシンキナーゼ阻害剤に対して耐性を有する慢性骨髄性白血病細胞を単離する方法であって、
    （１）試料中の血液細胞におけるＡＤＡＭ８遺伝子の発現を検出する工程、及び
    （２）工程（１）の検出結果に基づいて、チロシンキナーゼ阻害剤に対して耐性を有する慢性骨髄性白血病細胞を単離する工程
    を含む、方法。
13. ＡＤＡＭ８遺伝子から転写されたｍＲＮＡ又はＡＤＡＭ８遺伝子によってコードされるタンパク質の検出薬を含む、慢性骨髄性白血病の検査用キット。
14. ＡＤＡＭ８遺伝子の発現阻害剤又はＡＤＡＭ８の活性阻害剤を含む、慢性骨髄性白血病におけるチロシンキナーゼ阻害剤耐性を低減するための組成物。
15. ＡＤＡＭ８遺伝子の発現阻害剤が、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＲＮＡｉ誘導性核酸、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、リボザイム、ゲノム編集核酸及びそれらの発現ベクター、有機低分子、アプタマー、抗体、抗体フラグメント、並びにそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１４に記載の組成物。
16. ＡＤＡＭ８の活性阻害剤が、有機低分子、アプタマー、抗体、抗体フラグメント及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１４に記載の組成物。
17. 慢性骨髄性白血病を治療するための組成物であって、
    チロシンキナーゼ阻害剤を含み、
    ＡＤＡＭ８遺伝子の発現阻害剤又はＡＤＡＭ８の活性阻害剤と組み合わせて対象に投与される、
    組成物。
18. ＡＤＡＭ８遺伝子の発現阻害又はＡＤＡＭ８の活性阻害を指標とする、
    慢性骨髄性白血病におけるチロシンキナーゼ阻害剤耐性の低減剤のスクリーニング方法。
19. ＡＤＡＭ８遺伝子発現細胞を被験物質と接触させる工程と、
    前記細胞におけるＡＤＡＭ８遺伝子の発現量を測定する工程と、
    前記工程で測定されたＡＤＡＭ８遺伝子の発現量を、対照の発現量と比較する工程であって、前記対照の発現量は、被験物質と接触させていないＡＤＡＭ８遺伝子発現細胞におけるＡＤＡＭ８遺伝子の発現量である、工程と、
    前記対照の発現量と比較して、ＡＤＡＭ８遺伝子の発現量を低下させる被験物質を選択する工程と
    を含む、請求項１８に記載の方法。
20. ＡＤＡＭ８遺伝子発現細胞を被験物質と接触させる工程と、
    前記細胞におけるＡＤＡＭ８の活性を測定する工程と、
    前記工程で測定されたＡＤＡＭ８の活性を、対照の活性と比較する工程であって、前記対照の活性は、被験物質と接触させていないＡＤＡＭ８遺伝子発現細胞におけるＡＤＡＭ８の活性である、工程と、
    前記対照の活性と比較して、ＡＤＡＭ８遺伝子の活性を低下させる被験物質を選択する工程と
    を含む、請求項１８に記載の方法。
21. ＡＤＡＭ８を被験物質と接触させる工程と、
    前記ＡＤＡＭ８の活性を測定する工程と、
    前記工程で測定されたＡＤＡＭ８の活性を、対照の活性と比較する工程であって、前記対照の活性は、被験物質と接触させていないＡＤＡＭ８の活性である、工程と、
    前記対照の活性と比較して、ＡＤＡＭ８の活性を低下させる被験物質を選択する工程と
    を含む、請求項１８に記載の方法。