JP2018166410A

JP2018166410A - 生体試料中の核酸の長期保存方法

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Publication number: JP2018166410A
Application number: JP2017064447A
Authority: JP
Inventors: 有加北森; Yuka Kitamori; 寿一齋藤; Toshikazu Saito
Original assignee: Tosoh Corp
Current assignee: Tosoh Corp
Priority date: 2017-03-29
Filing date: 2017-03-29
Publication date: 2018-11-01

Abstract

【課題】生体試料中の細胞、細菌またはウィルス等の中に含まれる核酸を長期間安定的に保存するための方法を提供すること。上記方法を用いた検体は、細胞、細菌またはウィルス等を濃縮する工程、培養工程に供することが可能であること。【解決手段】生体試料中の細胞、細菌またはウィルス等の中に含まれる核酸を保存する方法であって、前記生体試料と還元剤を混合する工程を含み、前記還元剤が、ジチオスレイトール、ジチオエリトリトール、メルカプトエタノール、トリス（２−カルボキシエチル）フォスフィンハイドロクロライド（ＴＣＥＰ−ＨＣｌ）、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＬＣ）、およびＬ−システインハイドロクロライドからなる群より選ばれる１種以上を含む、核酸の保存方法により、前記課題を解決する。【選択図】なし

Description

本発明は、生体試料中の細胞、細菌またはウィルス等の中に含まれる核酸を長期間安定的に保存・検出するための方法、及び保存のための試薬に関する。

臨床検査、公衆衛生、食品検査の分野では、試料中に含まれる細胞、細菌、真菌、ウィルスなどのＤＮＡやＲＮＡ（標的核酸）を測定するための検査が実施される。現在、１つ、もしくは複数の標的核酸を測定するための核酸増幅試薬が多数流通している。一般的に、試料中の標的核酸は微量であるため、検査には標的核酸の核酸増幅反応を行うのが通常である。これらの核酸増幅反応には、様々な方法が利用されており、例えばＰＣＲ法（特許文献１、２、及び３参照）、ＬＡＭＰ法（非特許文献１参照）、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＮＡＳＢＡ法（特許文献４及び５参照）、ＴＭＡ法（特許文献６参照）、ＴＲＣ法（特許文献７及び非特許文献２参照）などが挙げられる。核酸増幅検査では、体液、消化液、尿、糞便、唾液、精液、膣液、擦過物、培養液などに挙げられる生体試料を用いる。通常、これらの試料中には核酸分解酵素や蛋白質分解酵素が含まれ、生体試料中に細菌やウィルスの核酸を長期間保管した試料から核酸を検出することは困難である。特に尿検体中には核酸を分解する酵素や尿特有の核酸増幅反応を阻害する物質を含んでおり、通常、尿そのものを増幅反応に供することは困難である。しかしながら、生体試料を取得したのちに、すぐさま上記検査を実施することは、設備投資が必要であったり、検査コストの増大や検査者不足の問題があったりして、困難である。

したがって、上記検査を実施する際には、安定的に核酸増幅検査用の試料中で核酸を安定的に保存する方法が求められる。

核酸増幅検査用の試料の保存液として一般的に用いられるものとして、グアニジン溶液や界面活性剤を含む溶液が挙げられる。しかしながら、これら化学物質は、核酸増幅工程や、核酸増幅検査を行う前にしばしば実施される核酸精製工程にて、反応阻害物質となることが問題となっている。また、これらの化学物質は蛋白質変性作用を持ち、細菌やウィルスの膜構造を変質させ、核酸を放出させる作用も同時に有するため、生体試料から細胞や細菌やウィルスを濃縮する工程や培養に供する工程に用いることができないという課題が存在する。

これまで還元剤の用途として、酵素反応の安定化や蛋白質の安定化などが挙げられるが、本発明で用いる生体試料、特に尿中に含まれる細胞、細菌、ウィルス等から核酸を安定的に検出するために用いられた報告例はない。

米国特許第４，６８３，１９５号米国特許第４，６８３，２０２号米国特許第４，９６５，１８８号特許２６５０１５９号公報特許３１５２９２７号公報特許３２４１７１７号公報特開２０００−１４４００号公報

ＴｈａｉＨ．Ｔ．Ｃ．ｅｔａｌ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４２，１９５６−６１（２００４）ＩｓｈｉｇｕｒｏＴ．ｅｔａｌ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３１４，７７−８６（２００３）

本発明の目的は、生体試料中の細胞、細菌またはウィルス等の中に含まれる核酸を安定的に保存するための方法、該方法で保存した核酸の検出方法、および核酸を安定化するための試薬を提供することにある。

本発明者らは、上記目的に鑑みて鋭意研究を重ねた結果、特定の還元剤を生体試料に混合することで生体試料中の核酸を安定保存できることを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち本発明は以下のとおり例示できる。
［１］生体試料中の細胞、細菌またはウィルス等の中に含まれる核酸を保存する方法であって、前記生体試料と還元剤を混合する工程を含み、前記還元剤が、ジチオスレイトール、ジチオエリトリトール、メルカプトエタノール、トリス（２−カルボキシエチル）フォスフィンハイドロクロライド（ＴＣＥＰ−ＨＣｌ）、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＬＣ）、およびＬ−システインハイドロクロライドからなる群より選ばれる１種以上を含む、核酸の保存方法。
［２］前記生体試料中の細胞、細菌、またはウィルス等が、クラミジア科に属する細菌、ナイセリア属に属する細菌、およびその混合物からなる群から選択される細菌である、［１］に記載の核酸の保存方法。
［３］［１］または［２］に記載の保存方法で保存した生体試料中の細胞、細菌、またはウィルス等に含まれる核酸を検出する方法であって、
（１）前記保存した生体試料から核酸を抽出する工程、および
（２）工程（１）で抽出した核酸を増幅し検出する工程
を含む、核酸の検出方法。
［４］前記工程（１）の前に、さらに、前記生体試料中の細胞、細菌またはウィルスを濃縮する工程、を含み、前記工程（１）が、濃縮された生体試料から核酸を抽出する工程、である、［３］に記載の方法。
［５］前記核酸を増幅し検出する工程が核酸増幅と同時に核酸増幅産物量の指標をリアルタイムモニタリングすることによってなされることを特徴とする［３］または［４］に記載の核酸の検出方法。
［６］前記核酸を増幅し検出する工程において、核酸増幅が、ＰＣＲ法、ＮＡＳＢＡ法、ＴＭＡ法、ＳＤＡ法、ＬＡＭＰ法、もしくはＴＲＣ法のいずれかより選ばれた方法によってなされることを特徴とする［３］〜［５］のいずれかに記載の核酸の検出方法。
［７］生体試料中の細胞、細菌またはウィルス等の中に含まれる核酸を保存するための試薬であって、ジチオスレイトール、ジチオエリトリトール、メルカプトエタノール、トリス（２−カルボキシエチル）フォスフィンハイドロクロライド（ＴＣＥＰ−ＨＣｌ）、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＬＣ）、およびＬ−システインハイドロクロライドからなる群より選ばれる、１種以上を含む、試薬。

本発明により、生体試料中の核酸を安定的に保存するための方法および試薬が提供される。該方法および試薬は、生体試料中の核酸を検出する方法に利用できる。本発明により、冷蔵温度以上でも、簡便に生体試料中の核酸を安定した状態で検出可能である。また、本発明を用いることで、生体試料中に含まれる細胞、細菌またはウィルス等の膜構造を破壊することなく保存することができるため、生体試料中に含まれる細胞、細菌またはウィルス等を濃縮する工程、培養する工程に供することができる。

以下、本発明を詳細に説明する。

本発明の一態様は、生体試料中の細胞、細菌またはウィルス等の中に含まれる核酸を安定保存するための方法である。前記生体試料は尿、血液、うがい液などの体液が挙げられるが、特に限定しない。

還元剤としてはジチオスレイトール、ジチオエリトリトール、メルカプトエタノール、トリス（２−カルボキシエチル）フォスフィンハイドロクロライド（ＴＣＥＰ−ＨＣｌ）、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＬＣ）、またはＬ−システインハイドロクロライド混合物などが例示的に挙げられるが、特に限定はされない。前記列挙した還元剤は単独で用いてもよく、適宜組み合わせて用いてもよい。前記還元剤の中で好ましくはジチオスレイトールもしくはメルカプトエタノールが挙げられるが、特に限定はされない。還元剤の濃度は特に限定されないが、好ましくはジチオスレイトールは１〜９１ｍＭ、メルカプトエタノールは１４２〜１２８４ｍＭ、更に好ましくはジチオスレイトールは２０〜９１ｍＭ、メルカプトエタノールは１４２〜２８６ｍＭである。

本発明の別の態様は、前記生体試料中の細胞、細菌またはウィルス等の中に含まれる核酸を安定保存するための方法で保存した生体試料中の細胞、細菌、またはウィルス等に含まれる核酸を検出する方法であって、
（１）前記保存した生体試料から核酸を抽出する工程、および
（２）工程（１）で抽出した核酸を増幅し検出する工程
を含む、核酸の検出方法を提供する。

本発明の一実施態様に係る生体試料中の細胞、細菌またはウィルス等を保存する方法においては、特定の還元剤を用いているがゆえに、該細胞、細菌またはウィルス等の膜構造が破壊されにくい。膜構造が破壊されると核酸が膜の外に放出されると、濃縮や培養に供することができないが、本発明の保存方法を用いることにより保存後に生体試料中に含まれる細胞、細菌またはウィルス等を濃縮または培養することができる。濃縮または培養により検出に供する核酸量を増やすことができ、少量の試料からの核酸の検出にも適し得る。核酸検出工程の前に該細胞、細菌またはウィルス等の核酸量を増やす手段としては特に限定はないが、操作の簡便性の点から、濃縮、特に遠心濃縮が好ましい。

核酸増幅反応に採用しうる方法としては核酸を増幅する方法であれば特に限定はされず、例えばＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法、ＮＡＳＢＡ法、ＴＭＡ法、ＳＤＡ法もしくはＴＲＣ法などである。

本発明に用いられる生体試料中に含まれる細菌としては、クラミジア科に属する菌、ナイセリア属に属する菌もしくはその混合物からなる群から選択される細菌が挙げられる。本発明に用いられる生体試料中に含まれるウィルスとしては、アデノウィルス、サイトメガロウィルス、Ｃ型肝炎ウィルス、Ｂ型肝炎ウィルスもしくはその混合物からなる群から選択されるウィルスなどが挙げられる。本発明に用いられる生体試料中に含まれる細胞としては、寄生性細菌やウィルスが感染する上皮細胞などが挙げられるが、特に限定しない。

以下実施例により本発明の実施の形態を説明するが、本発明はこれら実施例により限定されるものではない。

実施例１インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドの調製
下記（Ａ）に示す、インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブ（以下、ＩＮＡＦプローブと記載する）を特開２０００−３１６５８７号公報で開示の方法に基づき作製した。
（Ａ）配列番号１に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋＮｏ．ＨＥ６０１７９４の８５６８３８番目から８５６８５６番目までの塩基配列の相補配列）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドのうち、５’末端から１０番目のシトシンと１１番目のグアニンとの間に、リンカーを介して式（１）に記載の色素を標識したもの。

実施例２尿中に含まれるクラミジアトラコマチスの核酸の検出試験１
クラミジアトラコマチスＵＷ−３／Ｃｘ株（ＡＴＣＣＮｏ．ＶＲ−８８５）の培養物０．３４ｍＬを、各種尿検体をプールしたもの１００ｍＬに添加し、試料とした。

調製した該試料を１０ｍＬずつ分注して取り分け、１Ｍジチオスレイトールまたは１００％メルカプトエタノールを表１に記載の量添加し、十分に混合した上で１０℃にて保存した。

保存した試料を表３記載の日数経過後、表１記載の検体量を、市販の核酸精製キット（ＴＲＣＲ核酸精製キット、東ソー（株））に添加し、該キットの取扱説明書に従って、核酸を精製した。

なお配列番号１〜４に記載の塩基配列を表２に示す。

得られた精製物を回収し、以下に示す方法で核酸増幅反応を行い、核酸が検出されるか検証した。
（１）以下の組成からなる反応液を蒸発乾燥用チューブに分注し、蒸発乾燥させた。
反応液の組成：濃度は後述のように精製物及び開始液を添加後（３０ μＬ中）の最終濃度
６０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．６）
３００ｍＭトレハロース
各０．２５ｍＭｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各２．６ｍＭＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ
１．９ｍＭＧＴＰ
３．１ｍＭＩＴＰ
０．１６μＭ切断用オリゴヌクレオチド（３’末端の水酸基をアミノ基で修飾）：配列番号２（ＧｅｎＢａｎｋＮｏ．ＨＥ６０１７９４の８５６７３０番目から８５６７４９番目までの塩基配列の相補配列）
０．５μＭ第一のプライマー：配列番号３（ＧｅｎＢａｎｋＮｏ．ＨＥ６０１７９４の８５６７６７番目から８５６７９１番目までの塩基配列の５’末端にＴ７プロモーターを付加したもの）
０．５μＭ第二のプライマー：配列番号４（ＧｅｎＢａｎｋＮｏ．ＨＥ６０１７９４の８５６９６５番目から８５６９８６番目までの塩基配列の相補配列）
４０ｎＭＩＮＡＦプローブ（実施例１で調製したもの）
０．０２５ｍｇ／ｍＬ牛血清アルブミン
１４２ＵＴ７ＲＮＡポリメラーゼ
６．４ＵＡＭＶ逆転写酵素
（２）上記の蒸発乾燥後に精製物を１５μＬ添加後、４６℃で５分間保温し、その後、以下の組成からなる開始液１５μＬを添加し撹拌した。
開始液の組成：反応時（３０μＬ中）の最終濃度
１１％ジメチルスルホキシド
２０ｍＭ塩化マグネシウム
８５ｍＭ塩化カリウム
２％グリセロール
（３）引き続き蒸発乾燥用チューブを直接測定可能な温調機能付き蛍光分光光度計を用い、４６℃で反応させると同時に反応溶液の蛍光強度を経時的に３０分間測定した。開始液を加え撹拌を終えた時点を０分として、反応液の蛍光強度比（所定時間の蛍光強度値をバックグラウンドの蛍光強度比で割った値）が１．２８を超えた場合を陽性判定とし、そのときの時間を陽性時間とした。結果を表３に示す。表３の「Ｎ．Ｄ．」は反応開始後３０分後の蛍光強度比が１．２８以下（陰性判定）であったことを意味する。

表３の結果より、還元剤を混合していない系では２０日経過時点で核酸が検出されなくなったが、還元剤を混合した系では、核酸が検出された。これより、尿中のクラミジアトラコマチスの核酸を安定的に検出するために還元剤が有効であると考えられる。

実施例３尿中に含まれるクラミジアトラコマチスの核酸の検出試験２
クラミジアトラコマチスＵＷ−３／Ｃｘ株（ＡＴＣＣＮｏ．ＶＲ−８８５）の培養物０．８０ｍＬを、各種尿検体をプールしたもの８０ｍＬに添加し、試料とした。

調製した該試料０．５ｍＬに対し、１Ｍジチオスレイトールまたは５％ラウリル硫酸ナトリウム（比較例）を表４に記載の量比で添加し、十分に混合した上で１０℃にて保存した。

保存した試料を表５記載の日数経過後、表４記載の検体量を採取し、市販の核酸精製キット（ＴＲＣＲ核酸精製キット、東ソー（株））に添加し、キットの取扱説明書に従い、核酸を精製した。

得られた精製物を回収し、実施例２と同様の方法で核酸増幅反応を行い、核酸が検出されるか検証した。なお、開始液を加え撹拌を終えた時点を０分として、反応液の蛍光強度比（所定時間の蛍光強度値をバックグラウンドの蛍光強度比で割った値）が１．２８を超えた場合を陽性判定とし、そのときの時間を陽性時間とした。結果を表５に示す。表５の「Ｎ．Ｄ．」は反応開始後１０分後の蛍光強度比が１．２８以下（陰性判定）であったことを意味する。

表５の結果より、ラウリル硫酸ナトリウムを混合した系では１日経過後に核酸が検出されなくなり、無添加の系では７日経過時点で核酸が検出されなくなる場合があった。ジチオスレイトールを混合した系では、１１日経過時点でもすべての核酸が検出された。これより、尿中のクラミジアトラコマチスの核酸を安定的に検出するために還元剤が有効であると考えられる。

実施例４尿中に含まれるクラミジアトラコマチスの核酸の検出試験３
クラミジアトラコマチスＵＷ−３／Ｃｘ株（ＡＴＣＣＮｏ．ＶＲ−８８５）の培養物０．７０ｍＬを、各種尿検体をプールしたもの２１０ｍＬに添加し、試料とした。

調製した該試料１０ｍＬをそのまま、市販の核酸精製キット（ＴＲＣＲ核酸精製キット、東ソー（株））に添加したもの、１０ｍＬを１０００〜６０００×Ｇの強度にて高速冷却遠心機（型番ＭＸ−３０１、ＴＯＭＹ精工）に供することで上清と沈澱に分離させた上で、沈殿と上清それぞれを上記核酸精製キットに添加したものを調製した。また、同様に調製した該試料１０ｍＬに対し、１．０ｍＬの１Ｍジチオスレイトールの割合で添加したものを調製し、上記と同様に、市販の核酸精製キットに添加したもの、１１ｍＬ（尿検体とクラミジアトラコマチス培養液およびジチオスレイトールを含む）を遠心した上で、上清と沈澱に分離したものをそれぞれ上記核酸精製キットに供したものを調製した。

得られたそれぞれの試料をキットの取扱説明書に従い、精製した。

上記精製物を回収し、実施例２と同様の方法で核酸増幅反応を行い、核酸が検出されるか検証した。なお、開始液を加え撹拌を終えた時点を０分として、反応液の蛍光強度比（所定時間の蛍光強度値をバックグラウンドの蛍光強度比で割った値）が１．２８を超えた場合を陽性判定とし、そのときの時間を陽性時間とした。結果を表６に示す。表６の「Ｎ．Ｄ．」は反応開始後１０分後の蛍光強度比が１．２８以下（陰性判定）であったことを意味する。

表６の結果より、無添加の系では４日経過時点で核酸が検出されなくなり、遠心濃縮した場合も２８日経過時点で核酸が検出されなくなった。一方で、ジチオスレイトールを混合した系では、遠心濃縮した系および遠心濃縮しなかった系の両者で、２８日経過時点においてすべての核酸が検出された。これより、上記方法を用いることで、遠心濃縮に供することも可能であり、尿中のクラミジアトラコマチスの核酸を安定的に検出するために還元剤が有効であると考えられる。

Claims

生体試料中の細胞、細菌またはウィルス等の中に含まれる核酸を保存する方法であって、
前記生体試料と還元剤を混合する工程を含み、
前記還元剤が、ジチオスレイトール、ジチオエリトリトール、メルカプトエタノール、トリス（２−カルボキシエチル）フォスフィンハイドロクロライド（ＴＣＥＰ−ＨＣｌ）、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＬＣ）、およびＬ−システインハイドロクロライドからなる群より選ばれる１種以上を含む、核酸の保存方法。
前記生体試料中の細胞、細菌、またはウィルス等が、クラミジア科に属する細菌、ナイセリア属に属する細菌、およびその混合物からなる群から選択される細菌である、請求項１に記載の核酸の保存方法。
請求項１または２に記載の保存方法で保存した生体試料中の細胞、細菌、またはウィルス等に含まれる核酸を検出する方法であって、
（１）前記保存した生体試料から核酸を抽出する工程、および
（２）工程（１）で抽出した核酸を増幅し検出する工程
を含む、核酸の検出方法。
前記工程（１）の前に、さらに、前記生体試料中の細胞、細菌またはウィルスを濃縮する工程、を含み、前記工程（１）が、濃縮された生体試料から核酸を抽出する工程、である、請求項３に記載の方法。
前記核酸を増幅し検出する工程が核酸増幅と同時に核酸増幅産物量の指標をリアルタイムモニタリングすることによってなされることを特徴とする請求項３または４に記載の核酸の検出方法。
前記核酸を増幅し検出する工程において、核酸増幅が、ＰＣＲ法、ＮＡＳＢＡ法、ＴＭＡ法、ＳＤＡ法、ＬＡＭＰ法、もしくはＴＲＣ法のいずれかより選ばれた方法によってなされることを特徴とする請求項３〜５のいずれかに記載の核酸の検出方法。
生体試料中の細胞、細菌またはウィルス等の中に含まれる核酸を保存するための試薬であって、ジチオスレイトール、ジチオエリトリトール、メルカプトエタノール、トリス（２−カルボキシエチル）フォスフィンハイドロクロライド（ＴＣＥＰ−ＨＣｌ）、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＬＣ）、およびＬ−システインハイドロクロライドからなる群より選ばれる、１種以上を含む、試薬。