JP2018016610A - 卵殻膜タンパク質可溶化物及びその製造方法、並びに、該卵殻膜タンパク質可溶化物を含有する組成物、毛髪化粧料用組成物及び該毛髪化粧料用組成物を用いた毛髪処理方法 - Google Patents

Abstract

【課題】 従来の卵殻膜タンパク質の可溶化物と比較して、分子量が大きい卵殻膜タンパク質可溶化物及びその製造方法、並びに、該卵殻膜タンパク質可溶化物を含有する組成物を提供する。【解決手段】 アルカリ条件に調整した卵殻膜タンパク質の懸濁液を処理温度１３０℃以上１６０℃以下で、かつ、当該処理温度に５分以内に到達するよう加熱することによって卵殻膜タンパク質を可溶化する工程を有する卵殻膜タンパク質可溶化物の製造方法。当該方法により、分子量が大きい卵殻膜タンパク質可溶化物を好適に得ることができる。【選択図】図１

Description

本発明は、タンパク質を水溶化した卵殻膜タンパク質可溶化物及びその製造方法に関する。また、該卵殻膜タンパク質可溶化物を含有する組成物、毛髪化粧料用組成物及び該毛髪化粧料用組成物を用いた毛髪の処理方法に関する。

卵殻膜に含まれるタンパク質成分やペプチド成分は、線維芽細胞増殖作用、保湿作用、活性酵素除去作用、細胞賦活作用等を有することが知られており、従来、化粧品原料や医薬品原料、食糧品原料等として広く利用されている。特に、卵殻膜は、システイン及びシスチンの含有量が高く、アミノ酸組成が毛髪と似ているという性質を有するために、毛髪化粧料の原料として利用されている。
例えば、特許文献１や２には、卵殻膜に含まれるタンパク質成分やペプチド成分を配合したパーマネントウェーブ用剤や毛髪処理剤が開示されている。

一方、化粧品や毛髪化粧料、医薬品、食糧品等の応用製品に配合される卵殻膜は、原料として配合しやすくするために、一般的に卵殻膜に含まれるタンパク質のペプチド結合を加水分解して、より分子量の小さい可溶性の卵殻膜タンパク質可溶化物として用いられている。

タンパク質の加水分解方法として、様々な加水分解処理法等が知られている。
しかしながら、酸を用いて加水分解する方法では、装置が腐食しやすく、また卵殻膜のタンパク質が過剰に分解し、目的とする分子量分布を外れて低分子化しすぎたり、褐色に着色したり、目的とする加水分解物以外にも副生成物が生成しやすいという問題があった。
また、卵殻膜をタンパク質分解酵素で処理する酵素加水分解方法として、例えば、特許文献３には卵殻膜懸濁液中の卵殻膜に対してタンパク質分解酵素を１〜１０重量％の割合で加えてｐＨを６〜１２に調整し、温度３０〜６０℃にして酵素処理を６〜２４時間行い、乾燥させて、卵殻膜を原料とする可溶化卵殻膜の製法が報告されている。しかしながら、分子量の大きな卵殻膜タンパク質の可溶化物は得られにくく、触媒であるタンパク質分解酵素自体が高価であることから、製造コストが高くなるという問題があった。

一方、卵殻膜タンパク質を、アルカリを用いて加水分解する方法も知られている。卵殻膜タンパク質の加水分解方法として、例えば、特許文献４では溶媒としてアルカリ性含水有機溶媒を使用して加水分解を行い、得られた分解液を陰イオン交換樹脂と接触させる可溶化卵殻膜の製法が報告されている。

特開２０００−１２８７４４号公報 特開２００４−１７５６９９号公報 特開２００８−７４１９号公報 特許第５１７９８４７号公報

しかしながら、従来のアルカリ加水分解法では、卵殻膜タンパク質を、室温〜１００℃程度で長時間処理し、低分子量化させないと、可溶化させることができなかった。そのため、例えば、ダメージの大きい毛髪に対しては、十分な補修、保護効果を付与することができなかった。また、卵殻膜タンパク質加水分解物の着色を抑制するために有機溶媒を使用したりするため、これらの処理に余剰コストがかかり、製造コストも高くなりやすいという問題があった。

かかる状況下、本発明の目的は、従来の卵殻膜タンパク質の可溶化物と比較して、分子量が大きい卵殻膜タンパク質可溶化物及びその製造方法、並びに、該卵殻膜タンパク質可溶化物を含有する組成物を提供することである。

本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、アルカリ条件下においても、急速加熱することにより、低分子量化させず、かつシステイン及びシスチンを残存させたまま、卵殻膜タンパク質を可溶化できることを見出し、下記の発明が上記目的に合致することを見出し、本発明に至った。

すなわち、本発明は、以下の発明に係るものである。
＜１＞ 下記条件にて測定されたサイズ排除クロマトグラムにおいて、保持時間１６分間より短い時間にピークＡを有する卵殻膜タンパク質可溶化物。
（測定条件）
測定方法：サイズ排除クロマトグラフィー
カラム：ＧＥ製、商品名「Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ｐｅｐｔｉｄｅ ＨＲ １０／３００」１本
溶離液：３０％アセトニトリル―７０％水−０．１％トリフルオロ酢酸
流量：０．５ｍｌ／ｍｉｎ
カラム温度：４０℃
検出器：紫外吸光光度計（測定波長２１４ｎｍ）、
試料濃度：５〜１０ｍｇ／ｍｌ
試料注入量：２５μＬ
＜２＞ 前記条件にて測定されたサイズ排除クロマトグラムにおいて、
総ピーク面積に対する、前記ピークＡの面積の比が９％以上である前記＜１＞に記載の卵殻膜タンパク質可溶化物。
＜３＞ 卵殻膜タンパク質可溶化物の重量平均分子量は、９０００以上１４０００以下である前記＜１＞又は＜２＞に記載の卵殻膜タンパク質可溶化物。
＜４＞ 原料に対し、システイン及びシスチンの含有量の残存率が３０％以上である前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載の卵殻膜タンパク質可溶化物。
＜５＞ 前記＜１＞から＜４＞のいずれかに記載の卵殻膜タンパク質可溶化物を含有する組成物。
＜６＞ 前記＜１＞から＜４＞のいずれかに記載の卵殻膜タンパク質可溶化物を含有する毛髪化粧料用組成物。
＜７＞ 前記＜６＞に記載の毛髪化粧料用組成物を用いた毛髪の処理方法。
＜８＞ アルカリ条件に調整した卵殻膜タンパク質の懸濁液を処理温度１３０℃以上１６０℃以下で、かつ、当該処理温度に５分以内に到達するよう加熱することによって卵殻膜タンパク質を可溶化する工程を有する卵殻膜タンパク質可溶化物の製造方法。
＜９＞ 前記卵殻膜タンパク質の懸濁液の加熱方法が、加圧した水蒸気と前記卵殻膜タンパク質の懸濁液との接触による加熱である前記＜８＞に記載の卵殻膜タンパク質可溶化物の製造方法。
＜１０＞ 原料に対し、システイン及びシスチンの含有量の残存量が３０％以上となるよう卵殻膜タンパク質を可溶化する前記＜８＞又は＜９＞に記載の卵殻膜タンパク質可溶化物の製造方法。

本発明によれば、従来の卵殻膜タンパク質の可溶化物と比較して、分子量が大きい卵殻膜タンパク質可溶化物及びその製造方法が提供される。該卵殻膜タンパク質可溶化物は、例えば、化粧料用組成物や毛髪化粧料用組成物の原料として好適に使用できる。

実施例１の卵殻膜タンパク質可溶化物のサイズ排除クロマトグラムである。 実施例２の卵殻膜タンパク質可溶化物のサイズ排除クロマトグラムである。 実施例３の卵殻膜タンパク質可溶化物のサイズ排除クロマトグラムである。 比較例１の卵殻膜タンパク質可溶化物のサイズ排除クロマトグラムである。

以下、本発明について例示物等を示して詳細に説明するが、本発明は以下の例示物等に限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲において任意に変更して実施できる。なお、本明細書において、「〜」とはその前後の数値又は物理量を含む表現として用いるものとする。

［１］卵殻膜タンパク質可溶化物
本発明の卵殻膜タンパク質可溶化物（以下、「卵殻膜可溶化物」と称する場合がある。）は、下記条件にて測定されたサイズ排除クロマトグラムにおいて、保持時間１６分間より短い時間にピークＡを有することを特徴とする。
（測定条件）
測定方法：サイズ排除クロマトグラフィー
カラム：ＧＥ製、商品名「Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ｐｅｐｔｉｄｅ ＨＲ １０／３００」１本
溶離液：３０％アセトニトリル―７０％水−０．１％トリフルオロ酢酸
流量：０．５ｍｌ／ｍｉｎ
カラム温度：４０℃
検出器：紫外吸光光度計（測定波長２１４ｎｍ）、
試料濃度：５〜１０ｍｇ／ｍｌ
試料注入量：２５μｌ

本明細書において、「卵殻膜タンパク質」は卵殻膜に含まれるタンパク質成分を意味する。卵殻膜とは、卵殻膜は卵殻の内側にある繊維質の薄膜であり、外卵殻膜及び内卵殻膜の二層の網目状構造からなる。卵殻膜の主成分はタンパク質であるが、卵殻から卵殻膜を分離する際に卵殻由来のカルシウム成分を含むことがある。
また、「卵殻膜タンパク質可溶化物」とは、原料の卵殻膜タンパク質が水に可溶化できる状態に変化したものを意味する。ここで、本発明において、「水に可溶化できる状態」には、卵殻膜タンパク質由来の成分が、水に溶解する状態だけでなく、自然沈降せずに水に分散する状態を含む。

図１に、上記条件にて測定された本発明の卵殻膜タンパク質可溶化物のサイズ排除クロマトグラムの一例を示す。図１の卵殻膜タンパク質可溶化物の詳細については、実施例１にて後述するが、図１の卵殻膜タンパク質可溶化物は、保持時間１５．０〜１５．２分の間にピークトップを持つピークＡを有する。
ここで、上記測定条件にて測定されたサイズ排除クロマトグラムにおいて、排除限界分子量は２００００であり、分子量２００００以上のものは、保持時間１６分より短い時間にピークＡとして検出される。ピークＡは、いわゆる排除限界分子量のピークである。
すなわち、本発明の卵殻膜タンパク質可溶化物の特徴である、保持時間１６分より短い時間にピークＡを有するということは、本発明の卵殻膜タンパク質可溶化物は、一般的に可溶化しにくい高分子量の成分を含んでいるにもかかわらず可溶化しているということである。

一方、図４に、従来のアルカリ加水分解で製造された卵殻膜タンパク質の可溶化物のサイズ排除クロマトグラムの一例を示す。図４の卵殻膜タンパク質可溶化物の詳細については、比較例１にて後述するが、図４の卵殻膜タンパク質可溶化物は、保持時間１６分より短い時間にピークＡは検出されず、全体的に低分子量化することで可溶化していることがわかる。

このように本発明の卵殻膜タンパク質可溶化物は、従来の卵殻膜タンパク質可溶化物と比較して高分子量成分を含むにもかかわらず、水に可溶化することができ、従来の卵殻膜タンパク質可溶化物とは異なる性質を有したものである。

なお、サイズ排除クロマトグラフィーは、例えば、株式会社島津製作所社製高速液体クロマトグラフ、装置名「プロミネンス」等により測定することができる。

化粧料用組成物や毛髪化粧料用組成物の原料としては、高分子量成分をより含有することが好ましく、上記条件にて測定されたサイズ排除クロマトグラムにおいて、総ピーク面積に対する、ピークＡの面積の比（（ピークＡの面積／総ピーク面積）×１００）が３％以上であることが好ましく、５％以上であることがより好ましく、９％以上であることがさらに好ましい。
高分子量成分をより含有することで、爪、まつげ、まゆげ、毛髪等に対してより高い保護効果が期待できる。

なお、「総ピーク面積」とは、測定開始から測定終了までの全てのピークの面積の和を意味する。測定終了点は、その保持時間以降のピーク強度及びピークの傾きが実質的に０となる点とする。
また、「ピークＡの面積」は、ピークＡの立ち上がりの点（測定開始後、ピーク強度が実質的に０より大きくなる最初の点）の保持時間から、ピークＡのピークトップ検出後、最初にピークの傾きが０となる点（変曲点）の保持時間までの間の面積とする。

また、本発明の卵殻膜可溶化物は、上記の条件において、サイズ排除クロマトグラムにおいて、保持時間１６分より短い時間にピークＡを有すれば、使用目的等に応じて、重量平均分子量は適宜調整することができ、卵殻膜可溶化物の重量平均分子量の上限及び下限は、使用目的に応じて、安全面等を考慮して適宜決定すればよい。例えば、重量平均分子量の上限は、感作性の発現しない範囲で、適宜決定すればよい。
化粧料用途や毛髪化粧料用途においては、保護効果をより高めるために、卵殻膜可溶化物の重量平均分子量が９０００〜１４０００であることが好ましい。なお、本明細書において、卵殻膜タンパク質可溶化物の重量平均分子量とは、上記の条件にて測定されたサイズ排除クロマトグラムより算出した重量平均分子量のことである。

また、化粧料用途や毛髪化粧用組成物の原料として用いた場合、保護効果に加えて補修効果を向上させるためには、卵殻膜タンパク質の可溶化物は、システイン及びシスチンを多く含有することが好ましい。本発明の卵殻膜可溶化物は、高分子量成分を多く含むため、システイン及びシスチンの含有量を高めやすい。システイン及びシスチンの含有量を高めることで、爪、まつげ、まゆげ、毛髪等に対してより高い保護効果や補修効果が期待できる。

本発明の卵殻膜可溶化物のシステイン及びシスチンの含有量は、原料に対しシステイン及びシスチンの含有量の残存率が３０％以上であることが好ましく、４０％以上であることがより好ましい。システイン及びシスチンの含有量の算出方法、残存率については、実施例にて後述する。

また、卵殻膜可溶化物のシステイン及びシスチンの含有量が１．５質量％以上であることが好ましく、より好ましくは２．０質量％以上であり、４．０質量％がさらに好ましい。

本発明の卵殻膜可溶化物は、液状（可溶化した状態）で用いてもよいし、乾燥させて粉末や顆粒などの固形物として使用してもよい。
本発明の卵殻膜可溶化物は、水に可溶であり、着色がほとんどないと共に、人体に対する毒性や刺激性が少ないため、各種化粧料用組成物、医薬品用組成物（外用剤、服用剤）、機能性食品等の用途に使用することができる。詳しくは、［３］本発明の卵殻膜タンパク質可溶化物を含む組成物において、後述する。

また、本発明の卵殻膜可溶化物の製造方法は、後述する本発明の卵殻膜タンパク質可溶化物の製造方法で好適に製造することができる。

［２］卵殻膜タンパク質可溶化物の製造方法
本発明の卵殻膜タンパク質可溶化物の製造方法（以下、「本発明の製造方法」と称する場合がある。）は、アルカリ条件に調整した卵殻膜タンパク質懸濁液（以下、単に「懸濁液」と称する場合がある。）を温度１３０℃以上１６０℃以下で、かつ、当該処理温度に５分以内に到達するように加熱することによって卵殻膜タンパク質を可溶化する工程を有することを特徴とする。

本発明の製造方法により、上述した本発明の卵殻膜タンパク質の可溶化物を好適に製造できる。

本発明の製造方法の特徴のひとつは、１３０℃〜１６０℃の設定温度に急速加熱し、卵殻膜タンパク質の可溶化をすることである。１３０℃〜１６０℃の設定温度に急速加熱し、反応系内を急速に高温することで、変性や凝集を抑制しつつ、タンパク質の構造を変化に伴う可溶化反応を優先的に進行させつつ、適度な加水分解をもされるので、短時間であっても、十分に可溶化させることができると推察される。また、アルカリ条件下で急速加熱し、短時間で卵殻膜タンパク質を可溶化することで、タンパク質の変性を抑制しやすく、タンパク質可溶化物同士が電荷によって反発しあうため凝集を抑制しやすい傾向にあるため、従来のアルカリの処理液を室温ないしは８０〜１００℃程度の温度で、長時間、処理することによって得られる卵殻膜タンパク質加水分解物と比較して、分子量の大きなものであっても可溶化できる。

また、酸条件下での可溶化方法と比較して、分子量分布の狭いものが得られやすいため、高分子量化成分を多く含む卵殻膜可溶化物が得られやすく、副生成物の生成も抑制することができる。

また、従来の製法で得られる卵殻膜可溶化物は、可溶化物を得るためにアルカリ条件下で長時間の加熱処理が必要となるために、システイン及びシスチンが分解し、システイン及びシスチンの含有量が低下しやすかった。
本発明の製造方法では、短時間で卵殻膜タンパク質を可溶化させることができるので、従来のアルカリ加水分解法では分解されやすい、卵殻膜の機能性に影響するシスチン及びシステインも分解されにくい。

本発明の製造方法で使用される懸濁液はアルカリ条件に調整される。本発明の卵殻膜可溶化物をより効率に得るためには、アルカリ条件として、ｐＨは８．０以上が好ましく、ｐＨ９．０以上がより好ましく、ｐＨ１０．０以上がさらに好ましく、ｐＨ１１．０以上が最も好ましい。なお、本発明におけるｐＨは、卵殻膜タンパク質懸濁液をｐＨメータで測定した値である。

処理温度は、使用目的に応じて１３０℃〜１６０℃の間で適宜選択され、処理温度への到達時間は、５分以内である。処理温度が温度１３０℃未満の場合には可溶化反応が徐々に起こり、反応に時間を有し、低分子量化しやすい。また、１６０℃を超えると、可溶化反応より卵殻膜タンパク質の変性及び過度の加水分解が優先的に起こりやすく、本発明の卵殻膜タンパク質を得にくい。
また、目的とする温度までに到達する時間が長すぎると、可溶化反応が徐々に起こるために、卵殻膜タンパク質の変性及び過度の加水分解が起こりやすくなり、本発明の卵殻膜タンパク質を得るのが困難である。

ここで、卵殻膜タンパク質の可溶化の程度は、懸濁液のｐＨと処理温度に依存して、好適な処理温度範囲が異なる。例えば、ｐＨ８．０以上１２以下の範囲における好適な条件は、処理温度が１５０〜１６０℃である。また、ｐＨ１２以上範囲における好適な条件は、処理温度が１３０〜１５０℃である。

また、本発明の卵殻膜可溶化物をより効率に得るためには、処理温度への到達時間は１分以内が好適である。

なお、「処理温度」とは、急速加熱のときの最高到達温度のことであり、装置により試料が加熱される箇所における試料の測定温度である。本発明においては、処理温度は、１３０℃〜１６０℃の間から適宜決定される。また、昇温の速度は、処理温度への到達時間は５分以内となるように、目的等を考慮して適宜調節可能である。

また、処理温度に到達後、速やかに１００℃以下に冷却されることが好ましい。冷却は、熱交換器や減圧装置の装置を利用してもよい。

また、本発明の目的を損なわない範囲で、１３０〜１６０℃の処理温度へ到達後、処理温度で保持してもよい。なお、「保持時間」には、処理時間到達後の処理温度で保持する時間のことであり、昇温時間は含まない。

加熱手段は上記処理条件に懸濁液を加熱できれば特に制限されず、加圧した水蒸気と前記卵殻膜タンパク質の懸濁液との接触による加熱や電磁誘導による加熱、マイクロウェーブ照射により加熱、熱交換機を介した間接的な加熱等が挙げられる。
このような加熱方法には、例えば、超高温瞬間殺菌装置（ＵＨＴ殺菌装置）を用いたり、マイクロ波加熱装置、誘導加熱装置等を用いることができる。なお、上述の処理条件を満たし、急速に卵殻膜タンパク質の懸濁液を加熱できるものであれば、例示した装置に限定されず、使用する設備に特に限定はなく、従来公知の装置を使用することができ、卵殻膜可溶化物の生産量を考慮して適宜好適な装置を選択すればよい。

この中でも、加熱手段は、加圧した水蒸気と前記卵殻膜タンパク質の懸濁液との接触による加熱であると、短時間で効率的に熱が伝わり、可溶化できるので、分子量の大きな卵殻膜可溶化物を得ることができ好ましい。また、多量の懸濁液を連続的に可溶化することができる点でも、加圧した水蒸気と前記卵殻膜タンパク質の懸濁液との接触による加熱が好適である。
加圧した水蒸気と前記卵殻膜タンパク質の懸濁液との接触による加熱の場合、加圧した水蒸気を懸濁液に吹き込んで加圧した水蒸気を懸濁液に接触させても、懸濁液を加圧した水蒸気中に吹き込んで加圧した水蒸気を懸濁液に接触させてもよい。

加圧した水蒸気と前記卵殻膜タンパク質の懸濁液との接触による加熱ができる装置としては、例えば、超高温瞬間殺菌装置（ＵＨＴ殺菌装置）を用いることができる。
一般的に、超高温瞬間殺菌装置（ＵＨＴ殺菌装置）は、液状食品の殺菌に用いられ、液状食品に蒸気を吹き込む又は上記に液状食品を吹き込むことにより、食品の温度を極めて短時間で殺菌温度（１５０℃前後）まで加熱し、数秒保持することで、熱による食品のダメージを抑えつつ殺菌することができる装置である。本発明の製造方法は、一般的に殺菌のために用いられる超高温瞬間殺菌装置（ＵＨＴ殺菌装置）を転用し、卵殻膜可溶化物の製造のために用いることができる。
また、超高温瞬間殺菌装置の方式は特に限定されず、例えば、スチームインジェクション式でもよく、スチームインフュージョン式でもよい。このような装置として、例えば、イズミフードマシナリー製スチームインジェクションＳＤＩ―１５０殺菌テスト機等が挙げられる。

このような直接懸濁液に水蒸気を接触させて急速に温度を上げる装置は、懸濁液を連続的に処理できる点と、蒸気を直接接触させることにより懸濁液を効率よく撹拌、可溶化できる点で好適である。

また、本発明の製造方法では、短時間で卵殻膜タンパク質を可溶化させることができるので、シスチン及びシステインが分解されにくいが、原料（可溶化処理前の卵殻膜タンパク質）に対し、システイン及びシスチンの含有量の残存量が３０％以上となるよう卵殻膜タンパク質を可溶化することが好ましい。このような製造方法は、化粧料用組成物や毛髪化粧料用組成物の原料となる卵殻膜可溶化物の製造に特に好適である。

ｐＨ調整に使用するアルカリとしては、本発明の目的が達成される限り、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム等の無機アルカリであっても、有機アルカリであってもよいが、通常、無機アルカリが用いられ、特に水酸化ナトリウムは好適なアルカリのひとつである。

ｐＨ調整に使用するアルカリの量は、懸濁液のｐＨが所望のアルカリ条件となるように調整され、原料となる未処理卵殻膜に含まれるカルシウム成分の量を考慮して適宜決定される。アルカリの濃度が高すぎると塩が残留しやすいため、アルカリ濃度３％以下の処理液を用いて卵殻膜タンパク質の懸濁液を調整することがより好ましい。

また、本発明の卵殻膜可溶化物の製造方法は、上記工程を含めばよく、その前後に別の工程を設けてもよい。例えば、上記工程のあとに、脱塩処理等の精製を行ってもよい。

卵殻から卵殻膜を分離する際に卵殻由来のカルシウム成分を含むことがある。これをそのまま使用すると、カルシウム成分が残留し、得られる卵殻膜可溶化物の品質が劣化するおそれがある。そこで、このカルシウム成分を除去した卵殻膜タンパク質を使用することで卵殻膜可溶化物の品質が向上する。

より高品質な卵殻膜可溶化物を得ることができる点で、原料の（未処理）卵殻膜タンパク質は、卵殻膜に含まれるカルシウム成分を酸性溶液で溶解させた後に、固液分離して得られる卵殻膜タンパク質であってもよい。すなわち、卵殻膜タンパク質を可溶化する工程の前工程として、原料である（未処理）卵殻膜タンパク質を酸性溶液で処理し、含有するカルシウム成分を溶解させ、固液分離することによりカルシウム成分を除去した卵殻膜タンパク質を得る工程を含んでもよい。

例えば、卵殻膜タンパク質を可溶化する工程の前工程として、原料である（未処理）卵殻膜タンパク質を乳酸で処理し、含有するカルシウム成分を溶解させ、固液分離することによりカルシウム成分を除去した卵殻膜タンパク質を得る工程を含んでもよい。
このようにすることで、カルシウム成分は乳酸カルシウムとして可溶化し、比重の低い不溶性のカルシウム塩は乳酸溶液に浮き、卵殻膜は乳酸溶液に沈降するために、容易に卵殻膜からカルシウム成分を除去することができる。

使用する酸としては、卵殻膜タンパク質の品質劣化を惹起するものでなく、カルシウム成分を溶解することができるものであればよく、塩酸等の無機酸であっても、乳酸やクエン酸、酢酸等の有機酸であってもよい。

［３］本発明の卵殻膜タンパク質可溶化物を含む組成物
本発明の卵殻膜タンパク質可溶化物は、上述のように水溶性であり、着色がほとんどないと共に、人体に対する毒性や刺激性が少ない。そのため、本発明の卵殻膜可溶化物を含む組成物（以下、「本発明の組成物」と称する場合がある。）は、各種化粧料用組成物、医薬品用組成物（外用剤、服用剤）、機能性食品等の用途に使用することができ、その用途は特に限定されないが、好適な用途の一つとして、毛髪化粧料用組成物が挙げられる。
なお、本発明の卵殻膜可溶化物は、その用途に合わせて所望の分子量分布に調整して使用してもよい。

また、本発明の組成物は、目的を損なわない範囲で、本発明の卵殻膜可溶化物のみならず、加水分解が進行した、より低分子化した成分を含んでいてもよい。

（化粧料用組成物）
本発明の組成物は化粧料用組成物の用途に使用してもよい。本発明の卵殻膜可溶化物は、従来の卵殻膜可溶化物に比べて、分子量が大きいため、皮膚やまゆげ、まつげ、ネイル、毛髪の表面で膜を形成しやすく、保湿効果や保護効果を発揮しやすい。各種化粧料基材及び化粧料添加物に対する安定性も高いため、化粧料用組成物に好適に配合することができる。なお、本発明において、化粧料用組成物は、化粧品のみならず医薬部外品も含む。

化粧料用組成物への卵殻膜可溶化物の配合割合は任意であるが、化粧料用組成物が、保湿作用等の卵殻膜可溶化物に由来する作用を発現する範囲で適宜選択される。卵殻膜可溶化物の化粧料用組成物に対する割合は、卵殻膜可溶化物における溶媒の割合や溶媒の種類等にもよるが、例えば、化粧料用組成物の形態がジェルの場合は１〜５０重量％程度、形態が乳液の場合は１〜５０重量％程度、形態がクリームの場合は１〜５０重量％程度である。

本発明の化粧料用組成物は、慣用の化粧料基材を適宜配合し、所望の剤型とすることができる。その形態は特に制限はないが、ジェル、乳液、クリーム等の形態が挙げられる。

化粧料基材としては、目的とする剤型に合わせて、水、水溶性有機溶媒、油脂、ロウ、高級脂肪酸、高級アルコール、エステル類等の従来公知の化粧料基材が適宜選択される。

また、本発明の化粧料用組成物には、本発明の効果を損なわない範囲で通常化粧料や皮膚外用医薬で使用される任意の成分を添加することができる。かかる任意成分の具体例としては、増粘・ゲル化剤、酸化防止剤、紫外線吸収剤、色素剤、金属封鎖剤、防腐剤、ｐＨ調整剤、香料、ミツロウ等が挙げられる。これら任意成分の配合割合は、その目的に応じて適宜選択して決定することができる。

本発明の化粧料用組成物は、当業者が通常用いる方法によって製造することができ、卵殻膜可溶化物の配合量、配合方法、配合時期は適宜選択することができる。

本発明の化粧料用組成物は、スキンケア化粧料用、浴用化粧料用、毛髪化粧料用又はメイクアップ化粧料用等に用いることができるが、好適な用途としては、まゆげ用化粧品、まつげ用化粧品、ネイル用品、毛髪化粧料用組成物（ヘアケア製品）等が挙げられる。

まゆげ用化粧品としては、例えば、アイブロウペンシル、アイブロウマスカラ、アイブロウパウダー等が挙げられる。

まつげ用化粧品としては、例えば、まつげエクステ用グルー、まつげエクステ用リムーバー、まつげエクステ用前処理剤、まつげ美容液、まつげエクステ用コーティング剤、マスカラ、マスカラ下地、吸着剤、クレンジング、アイライナー等が挙げられる。

ネイル用品としては、例えば、プレプライマー、クリアジェル、カラージェル、クレンザー、リムーバー、ベースジェル、トップジェル、キューティクルオイル、キューティクルリムーバー、ポリッシュ、ネイルトリートメント等が挙げられる。

以下、本発明の化粧料用組成物の好適な用途の一つである毛髪化粧料用組成物について説明する。

（毛髪化粧料用組成物）
本発明の卵殻膜可溶化物組成物は、毛髪化粧料組成物として好適に使用できる。本発明の卵殻膜可溶化物は、従来の卵殻膜可溶化物と比較して分子量が大きいため、低分子化した卵殻膜可溶化物では十分に補修、保護効果が発揮されないようなダメージの大きい毛髪に対しても、十分な補修、保護効果が発揮されやすい。

毛髪化粧料用組成物としては、例えば、染毛剤やパーマ剤、シャンプー、ヘアリンス、ヘアコンディショナー、ヘアトリートメント、ヘアクリーム、ヘアジェル、ヘアムース、ヘアオイル、スタイリング剤、カーリング剤、縮毛矯正剤、頭髪用カールジェル、育毛剤等が挙げられる。なお、本発明において、毛髪化粧料用組成物には、化粧品のみならず医薬部外品も含む。
すなわち、本発明の毛髪化粧料用組成物は、染色やパーマ、トリートメント、毛髪ケア等の毛髪処理に用いることができる。

毛髪化粧料用組成物への卵殻膜可溶化物の配合割合は任意であるが、毛髪化粧料用組成物が、髪のダメージの保護、補修効果等の卵殻膜可溶化物に由来する作用を発現する範囲で適宜選択される。卵殻膜可溶化物の毛髪化粧料用組成物に対する割合は、卵殻膜可溶化物における溶媒の割合や溶媒の種類等に応じて適宜決定されるが、卵殻膜可溶化物の含有量は、毛髪化粧料用組成物の全体に対して１〜５０重量％程度である。

本発明の毛髪化粧料用組成物は、慣用の化粧料基材を適宜配合し、所望の剤型とすることができる。その形態は特に制限はないが、例えば、液状、乳液状、クリーム状、ジェル状、ペースト状、ムース状、エアゾール等の形態が挙げられる。

化粧料基材としては、目的とする剤型に合わせて、水、水溶性有機溶媒、油脂、ロウ、高級脂肪酸、高級アルコール、エステル類等の従来公知の化粧料基材が適宜選択される。

なお、毛髪化粧料用組成物は、本発明の卵殻膜タンパク質可溶化物以外の卵殻膜タンパク質可溶化物を含有してもよいし、卵殻膜タンパク質を含有してもよい。
また、本発明の化粧料用組成物には、本発明の効果を損なわない範囲で通常使用される任意の成分を添加することができる。かかる任意成分の具体例としては、還元剤、界面活性剤、増粘・ゲル化剤、アルカリ剤、酸化剤、乳化安定剤、酸化防止剤、紫外線吸収剤、色素剤、金属封鎖剤、防腐剤、ｐＨ調整剤、香料、保湿剤、油剤、ミツロウ、シリコーン、キレート剤、着色料等が挙げられる。これら任意成分の配合割合は、その目的に応じて適宜選択して決定することができる。

本発明の毛髪化粧料用組成物は、当業者が通常用いる方法によって製造することができ、本発明の卵殻膜タンパク質可溶化物の配合量、配合方法、配合時期は適宜選択することができる。

（医薬品用組成物）
本発明の組成物は、医薬品用組成物の用途に使用してもよい。なお、本発明の医薬品用組成物は、医薬品のみならず、医薬部外品に配合してもよい。
本発明の医薬品用組成物の形態としては特に限定はないが、一般に皮膚に塗布する形の皮膚外用剤として用いられる場合には、液状やクリーム状である。この場合、医薬品用組成物は、必要に応じて、通常医薬品、医薬部外品に配合される、油性成分、可溶化剤、保湿剤、色素、乳化剤、増粘剤、香料等の任意の成分を含有することができる。

また、本発明の医薬品用組成物は、入浴剤、ボディーソープ、シャンプー等の入浴用組成物に配合して用いてもよい。剤型としては、一般に用いられる、水溶液、Ｗ／Ｏ型又はＯ／Ｗ型エマルション、適当な賦形剤等を用いて顆粒剤その他の粉末、錠剤等としてもよい。

また、本発明の医薬品用組成物は、人体に対する毒性や刺激性が少なく、安全であるため、外用剤としてのみならず、服用剤として経口投与とすることもできる。
経口投与に利用される剤形としては、具体的には、固形製剤として、粉末剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、トローチ等が挙げられる。また、液状製剤として内用液剤、外用液剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤等が例示され、これら剤形やその他の剤形が目的に応じて適宜選択される。また、経口投与用の医薬品組成物として、薬学的に許容される通常の担体、結合剤、安定化剤、賦形剤、希釈剤、ｐＨ緩衝剤、崩壊剤、可溶化剤、溶解補助剤、等張剤等の各種調剤用配合成分をさらに適宜含有していてもよい。

本発明の医薬品組成物は、当業者が通常用いる方法によって製造することができ、卵殻膜タンパク質可溶化物の配合量、配合方法、配合時期は適宜選択することができる。医薬品組成物の投与量は、対象者の性別や年齢、体重、投与形態等に応じて適宜選定することができる。

（機能性食品）
一方、日常的に飲食することで、本発明の卵殻膜タンパク質可溶化物を摂取したい場合には、該食品、飲料に含有させて機能性食品としてもよい。
ここでいう「機能性食品」とは、一般食品に加えて、健康食品、栄養補助食品、栄養機能食品、栄養保険食品等、健康の維持の目的で摂取する食品及び／又は飲料を意味している。なお、機能性食品として製品化する場合には、食品に用いられる様々な添加剤、具体的には、着色料、保存料、増粘安定剤、酸化防止剤漂白剤、防菌防黴剤、酸味料、調味料、乳化剤、強化剤、製造用剤、香料等を添加していてもよい。

本発明の機能性食品の対象となる、食品、飲料は特に限定されるものではない。例えば、食品として、ソーセージ、ハム、魚介加工品、ゼリー、キャンディー、チューインガム等の食品類が挙げられる。また、飲料としては、各種の茶類、清涼飲料水、酒類、栄養ドリンク等が挙げられる。本発明の卵殻膜可溶化物は、このような食品、飲料に添加することにより、簡易に経口摂取することができる。また、卵殻膜可溶化物の配合量は、食品、飲料の種類、目的とする作用に応じて適宜決定すればよい。

以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

「実施例１」
（１．卵殻膜の乳酸による前処理）
水９４．４重量部及びＬ−乳酸（和光純薬工業（株）、濃度８５〜９２％）５．６重量部の乳酸溶液に、粉末状の卵殻膜１０重量部を添加し、常温（約２５℃）下、１２時間撹拌し、卵殻膜に含まれるカルシウム成分を溶解させた。なお、撹拌後の混合液のｐＨをｐＨメーター（東亜ディーケーケー製、ＨＭ−３０Ｒ）で測定したところ、ｐＨ３．１９であった。次いで、撹拌後の混合液を、ろ過器を用い、固形物と液体に分離した。得られた固形物を４０℃で減圧乾燥し、乾燥物を得た。最終的に得られた固形物（卵殻膜タンパク質）は、３．１重量部であった。この固形物のタンパク質量をケルダール法により評価したところ、タンパク質の割合が９４．２重量％であった。得られた卵殻膜は、カルシウム顔料にして０．５％以下の高純度であった。

（２．卵殻膜タンパク質の可溶化処理）
前処理後の卵殻膜タンパク質の可溶化処理は、以下の手順で行った。
まず、純水に水酸化ナトリウムを添加して混合し、水酸化ナトリウム濃度１重量％の処理溶液を調整した。次いで、水酸化ナトリウム濃度１重量％の処理溶液９５重量部に対し、卵殻膜タンパク質５重量部を添加し、均一になるように撹拌し、懸濁液を得た。この懸濁液のｐＨをｐＨメータ（東亜ディーケーケー製、ＨＭ−３０Ｒ）で測定したところ、ｐＨ１２以上であった。
さらに、１４０℃まで１分以内に到達するように直接蒸気吹き込み式連続殺菌装置（イズミフードマシナリー製スチームインジェクションＳＤＩ―１５０殺菌テスト機）を用いて、１４０℃まで加熱を行い、同温度で２０秒間保持し、卵殻膜タンパク質を可溶化し、卵殻膜タンパク質可溶化物を得た。可溶化処理後、室温まで冷却し、実施例１の卵殻膜タンパク質の可溶化物を得た。

「実施例２」
水酸化ナトリウム濃度１重量％の処理溶液に代えて、水酸化ナトリウム濃度２重量％の処理溶液を用いた以外は、実施例１と同様にして卵殻膜タンパク質の可溶化物を得た。

「実施例３」
水酸化ナトリウム濃度１重量％の処理溶液に代えて、水酸化ナトリウム濃度３重量％の処理溶液を用いた以外は、実施例１と同様にして卵殻膜タンパク質の可溶化物を得た。

「比較例１」
水酸化ナトリウム濃度３重量％の処理を用いて、卵殻膜タンパク質の懸濁液を調整した。この懸濁液のｐＨをｐＨメータ（東亜ディーケーケー製、ＨＭ−３０Ｒ）で測定したところ、ｐＨ１２以上であった。
さらに、１００℃まで２０分かけて昇温し、同温度で３時間保持し、卵殻膜タンパク質を可溶化し、卵殻膜タンパク質可溶化物を得た。可溶化処理後、室温まで冷却し、比較例１の卵殻膜タンパク質の可溶化物を得た。

「評価」
（１）卵殻膜タンパク質可溶化物の重量平均分子量
実施例１〜３の卵殻膜タンパク質可溶化物及び比較例１の卵殻膜タンパク質可溶化物について、サイズ排除クロマトグラフィーを測定した。なお、卵殻膜タンパク質可溶化物は、下記試料濃度に調整後、精密ろ過フィルター（ザルトリウス製ミニザルトＲＣ１５、孔径０．２μｍ）を通して、装置に注入した。得られたサイズ排除クロマトグラムを図１〜４に示す。
また、サイズ排除クロマトグラフィーで得られた分子量分布から重量平均分子量を算出した。結果を表１に示す。

なお、サイズ排除クロマトグラフィーの条件は以下のとおりである；
株式会社島津製作所社製高速液体クロマトグラフ、装置名「プロミネンス」
カラム：ＧＥ製、商品名「Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ｐｅｐｔｉｄｅ ＨＲ １０／３００」１本
溶離液：３０％アセトニトリル―７０％水−０．１％トリフルオロ酢酸
流量：０．５ｍｌ／ｍｉｎ
カラム温度：４０℃
検出器：紫外吸光光度計（測定波長２１４ｎｍ）、
試料濃度：５〜１０ｍｇ／ｍｌ
試料注入量：２５μＬ

（２）システイン及びシスチンの含有量
実施例１〜３の卵殻膜タンパク質可溶化物及び比較例１の卵殻膜タンパク質可溶化物について、アミノ酸組成分析によりシステイン及びシスチンの含有量を算出した。
なお、アミノ酸組成分析は、酸化剤であるアジ化ナトリウム存在下塩酸加水分解してシステイン及びシスチンについてはシステイン酸の形にし、AccQTag誘導体化（日本ウォーターズ株式会社）して超高圧高速液体クロマトグラフィー（日本ウォーターズ株式会社製UPLC H class）で分析した。
また、システイン及びシスチンの含有量は、原料となる可溶化処理前の卵殻膜タンパク質のシステイン及びシスチンの含有量に対する残存率として求めた。すなわち、残存率は以下の式で表される。
残存率（％） ＝ （卵殻膜タンパク質可溶化物のシステイン及びシスチンの含有量／可溶化処理前の卵殻膜タンパク質のシステイン及びシスチンの含有量）×１００
結果を表２に示す。

図１に示すように、実施例１の卵殻膜タンパク質可溶化物は、上記測定条件でサイズ排除クロマトグラフィーを測定し得られたサイズ排除クロマトグラムおいて、保持時間１５分にピークＡを有し、また、総ピーク面積(保持時間０分から、実質的にピーク強度及びピークの傾きが０となる保持時間４５分までの間のピークの面積の和）に対する、前記ピークＡの面積の比が１５．５％である。
また、図２に示すように、実施例２の卵殻膜タンパク質可溶化物は、上記測定条件でのサイズ排除クロマトグラムおいて、保持時間１５分にピークＡを有し、また、総ピーク面積に対する、前記ピークＡの面積の比が１０．８％である。
また、図３に示すように、実施例３の卵殻膜タンパク質可溶化物は、上記測定条件でのサイズ排除クロマトグラムおいて、保持時間１５分にピークＡを有し、また、総ピーク面積に対する、前記ピークＡの面積の比が９．４％である。

一方、図４に示すように、比較例１の卵殻膜可溶化物は、上記測定条件でのサイズ排除クロマトグラムにおいて、保持時間１６分より短い時間にピークは検出されなかった。

また、実施例１〜３の卵殻膜タンパク質可溶化物と比較例１の卵殻膜タンパク質可溶化物の重量平均分子量の比較からも、本発明の卵殻膜タンパク質の可溶化物は高分子量成分を多く含むことがわかる。

また、表２に示すように、実施例１〜３の卵殻膜タンパク質可溶化物は、比較例１の卵殻膜タンパク質可溶化物と比較して、原料に対するシステイン及びシスチンの含有量の残存率が多く、本製造方法では、システイン及びシスチンが分解しにくいことが分かる。そのため、得られた卵殻膜タンパク質可溶化物は、まゆげ用化粧品やまつげ用化粧品、ネイル用品、毛髪化粧料用組成物の原料として用いることで、高い保護効果が期待できる。

このように、実施例１〜３の卵殻膜タンパク質の可溶化物は、従来の卵殻膜タンパク質可溶化物と比較して高分子量を多く含むにもかかわらず、水に可溶化することができ、システイン及びシスチンも多く含有しており、従来の卵殻膜タンパク質可溶化物とは異なる性質を有したものである。

本発明によれば、化粧料用組成物、医療用組成物、機能性食品の原料として好適に用いられる卵殻膜タンパク質可溶化物及び、該卵殻膜タンパク質を低コストに生産することができる製造方法が提供されるので、工業的に有望である。

Claims (10)

1. 下記条件にて測定されたサイズ排除クロマトグラムにおいて、
   保持時間１６分間より短い時間にピークＡを有する卵殻膜タンパク質可溶化物。
   （測定条件）
   測定方法：サイズ排除クロマトグラフィー
   カラム：ＧＥ製、商品名「Sｕｐｅｒｄｅｘ ｐｅｐｔｉｄｅ ＨＲ １０／３００」１本
   溶離液：３０％アセトニトリル―７０％水−０．１％トリフルオロ酢酸
   流量：０．５ｍｌ／ｍｉｎ
   カラム温度：４０℃
   検出器：紫外吸光光度計（測定波長２１４ｎｍ）
   試料濃度：５〜１０ｍｇ／ｍｌ
   試料注入量：２５μＬ
2. 前記条件にて測定されたサイズ排除クロマトグラムにおいて、
   総ピーク面積に対する、前記ピークＡの面積の比が９％以上である請求項１に記載の卵殻膜タンパク質可溶化物。
3. 卵殻膜タンパク質可溶化物の重量平均分子量は、９０００以上１４０００以下である請求項１又は２に記載の卵殻膜タンパク質可溶化物。
4. 原料に対し、システイン及びシスチンの含有量の残存率が３０％以上である請求項１から３のいずれかに記載の卵殻膜タンパク質可溶化物。
5. 請求項１から４のいずれかに記載の卵殻膜タンパク質可溶化物を含有する組成物。
6. 請求項１から４のいずれかに記載の卵殻膜タンパク質可溶化物を含有する毛髪化粧料用組成物。
7. 請求項６に記載の毛髪化粧料用組成物を用いた毛髪の処理方法。
8. アルカリ条件に調整した卵殻膜タンパク質の懸濁液を処理温度１３０℃以上１６０℃以下で、かつ、当該処理温度に５分以内に到達するよう加熱することによって卵殻膜タンパク質を可溶化する工程を有する卵殻膜タンパク質可溶化物の製造方法。
9. 前記卵殻膜タンパク質の懸濁液の加熱方法が、加圧した水蒸気と前記卵殻膜タンパク質の懸濁液との接触による加熱である請求項８に記載の卵殻膜タンパク質可溶化物の製造方法。
10. 原料に対し、システイン及びシスチンの含有量の残存量が３０％以上となるよう卵殻膜タンパク質を可溶化する請求項８又は９に記載の卵殻膜タンパク質可溶化物の製造方法。