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JP2016034973A - 第ｉｘ因子ポリペプチドおよびその使用方法 - Google Patents

第ｉｘ因子ポリペプチドおよびその使用方法 Download PDF

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JP2016034973A JP2015224436A JP2015224436A JP2016034973A JP 2016034973 A JP2016034973 A JP 2016034973A JP 2015224436 A JP2015224436 A JP 2015224436A JP 2015224436 A JP2015224436 A JP 2015224436A JP 2016034973 A JP2016034973 A JP 2016034973A
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ピアース グレン
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Abstract

【課題】第ＩＸ因子ポリペプチドおよびその使用方法の提供。
【解決手段】本発明は、第ＩＸ因子の投与方法、第ＩＸ因子を含むキメラおよびハイブリッドポリペプチドの投与方法、第ＩＸ因子を含むキメラおよびハイブリッドポリペプチド；そのようなキメラおよびハイブリッドポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、そのようなポリヌクレオチドを含む細胞、ならびにそのような細胞を用いたそのようなキメラおよびハイブリッドポリペプチドの産生方法を提供する。一実施形態において、１週間に約１回またはそれより長い投与間隔で、少なくとも約２５ＩＵ／ｋｇの用量の、第ＩＸ因子およびＦｃＲｎ結合パートナー（ＦｃＲｎ ＢＰ）を含むキメラポリペプチドをヒト対象に投与することを含む、それを必要とする前記対象への第ＩＸ因子の投与方法が提供される。
【選択図】なし

Description

（発明の分野）
本発明は、一般に、止血障害の治療分野に関する。
（発明の背景）
Ｂ型血友病（クリスマス病としても知られている）は、世界中で最も一般的な遺伝性出血性疾患の１つである。これは、インビボおよびインビトロでの血液凝固活性の低下をもたらし、罹患者の生涯を通じて大規模な医療モニタリングが必要である。診療行為がない場合は、罹患した個人は、関節内の突発性出血に苦しみ、激しい痛みおよび衰弱性の強直を生じ、筋肉への出血は、それらの組織内の血液の蓄積をもたらし、喉および頸部での突発性出血は、直ちに処置されない場合、窒息する場合があり、腎出血、および外科手術、不慮の事故による軽度の負傷、もしくは抜歯の後の重度の出血もまた、よく見られる。
最低でも、通常のインビボ血液凝固は、セリンプロテアーゼ第ＩＩ因子（プロトロンビン）、第ＶＩＩ、第ＩＸ、第Ｘ、および第ＸＩ因子（可溶性血漿タンパク質）；膜貫通タンパク質組織因子および血漿タンパク質第Ｖおよび第ＶＩＩＩ因子を含む補因子；フィブリノゲン、トランスグルタミナーゼ第ＸＩＩＩ因子、リン脂質（活性化血小板を含む）、およびカルシウムを必要とする。カリクレイン、高分子量キニノゲン、および第ＸＩＩ因子を含むさらなるタンパク質が、幾つかのインビトロ凝固試験のために必要とされ、病的条件下で、インビボで影響を及ぼし得る。
血友病では、血液凝固は、ある種の血漿血液凝固因子の欠乏によって妨げられる。Ｂ型血友病は、第ＩＸ因子タンパク質の合成の低下あるいは活性低下した欠損分子のいずれかから生じ得る第ＩＸ因子の欠損によって引き起こされる。血友病の治療は、第ＩＸ因子において、高度に濃縮された外因性因子濃縮物によって不足している凝固因子の置換によって起こる。しかしながら、血液からのそのような濃縮物の生成は、以下に記載されるような、技術的な困難を伴う。
血漿からの第ＩＸ因子（血漿由来第ＩＸ因子；ｐｄＦＩＸ）の精製は、ほぼ例外なく、活性のある第ＩＸ因子を得る。しかしながら、血漿からの第ＩＸ因子のそのような精製は、第ＩＸ因子が、血漿中に低濃度で存在するのみであるため、非常に困難である（５ｕｇ／ｍＬ。非特許文献１。さらに、血液からの精製は、ＨＩＶおよびＨＣＶ等の感染性因子の除去または不活性化を必要とする。加えて、ｐｄＦＩＸは、短半減期を有し、それ故に、頻回投与を必要とする。また、組換え型第ＩＸ因子（ｒＦＩＸ）が利用可能であるが、ｐｄＦＩＸと同じ短半減期に悩まされ、頻回投与（例えば、予防のために１週間に２〜３回）を必要とする。ｒＦＩＸはまた、ｐｄＦＩＸと比較して、より低い増分回収率（Ｋ値）を有し、これは、ｐｄＦＩＸに対するものよりも高用量のｒＦＩＸの使用を必然的に伴う。
Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ，Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９７５）７：４５１ ４５９
死亡率の低下、関節損傷の予防、生活の質の改善は、血漿由来および組換え型第ＩＸ因子の開発による重要な成果である。出血からの長期保護は、Ｂ型血友病患者の治療において、別の重要な進歩を示す。しかしながら、今まで、長期保護を可能にする製品が開発されていない。したがって、現在の治療法よりもさらに耐性があり、かつさらに有効である、第ＩＸ因子欠損症に起因する血友病を治療する改善された方法が必要である。
本発明は、第ＩＸ因子を含むキメラポリペプチドおよびそのようなキメラポリペプチドのハイブリッドを用いた第ＩＸ因子の投与方法、第ＩＸ因子を含むキメラポリペプチドおよびそのようなキメラポリペプチドのハイブリッド、そのようなキメラおよびハイブリッドポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、そのようなポリヌクレオチドを含む細胞、ならびにそのような細胞を用いたそのようなキメラおよびハイブリッドポリペプチドの産生方法を提供する。幾つかの実施形態において、第ＩＸ因子キメラポリペプチドは、第ＩＸ因子Ｆｃキメラポリペプチド等の第ＩＸ因子ＦｃＲｎ結合パートナー（ＢＰ）キメラポリペプチドである。他の実施形態において、第ＩＸ因子キメラポリペプチドは、第ＩＸ因子−ＸＴＥＮポリペプチドである。
本発明は、少なくとも約１０、少なくとも約２０、または少なくとも約２５ＩＵ／ｋｇの用量の第ＩＸ因子ＦｃＲｎ ＢＰキメラポリペプチド、例えば第ＩＸ因子−Ｆｃキメラポリペプチドまたは第ＩＸ因子−ＸＴＥＮキメラポリペプチドを、１週間に約１回またはそれ以上長い投与間隔で、対象に投与することを含む、それを必要とする対象への第ＩＸ因子の投与方法を提供する。
幾つかの実施形態において、キメラポリペプチドの血漿レベルが、患者集団の少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または約１００％において、少なくとも約６日後、少なくとも約１ＩＵ／ｄＬの平均トラフに達するか、または対象において、少なくとも約６日後、少なくとも約１、２、３、４、または５ＩＵ／ｄＬのトラフに達する。幾つかの実施形態において、前記キメラポリペプチドの血漿レベルが、約１〜５または１〜３ＩＵ／ｄＬの平均トラフに達する。そのようなトラフまたは平均トラフに、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４、約３５、約３６、約３７、約３８、約３９、または約４０日後、達し得る。
幾つかの実施形態において、キメラポリペプチドは、血漿由来第ＩＸ因子と比較して、大幅に減少したリン酸化および硫酸化を有する。幾つかの実施形態において、キメラポリペプチドは、２５％未満リン酸化され、かつ２５％未満硫酸化される、例えば２５％未満完全にリン酸化され、かつ硫酸化される。幾つかの実施形態において、キメラポリペプチドは、約１０％未満リン酸化され、かつ約９％未満硫酸化される。幾つかの実施形態において、キメラポリペプチドは、実施例５〜６における第ＩＸ因子Ｆｃキメラポリペプチドのものと同様（即ち、１０％以内）または同一である、γカルボキシル化型／分布、γカルボキシル化の含有量、シアル化型／分布、および／またはシアル化の含有量を有する。
幾つかの実施形態において、キメラポリペプチドは、０．７を超える、または０．７５ｕｇ／ｍＬを超える増分回収率（抗原）を有する。幾つかの実施形態において、キメラポリペプチドは、１ＩＵ／ｋｇ当たり少なくとも約０．８、少なくとも約０．９、または少なくとも約１ＩＵ／ｄＬの平均増分回収率（Ｋ値）（活性；観察値）を有する。
幾つかの実施形態において、キメラポリペプチドは、前記患者集団または前記対象において、
（ａ）前記患者集団において、約３．３６±０．９３ｍＬ／時間／ｋｇの平均クリアランス（ＣＬ）（活性）、前記患者集団において、約３．０〜３．７２、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、または３．７２ｍＬ／時間／ｋｇの平均クリアランス（ＣＬ）（活性）、前記患者集団において、前記ＦｃＲｎ ＢＰを含まずに前記第ＩＸ因子を含むポリペプチドのクリアランスよりも約２．５倍低い平均クリアランス（ＣＬ）（活性）、前記対象において、約１．８４〜４．５８ｍＬ／時間／ｋｇのクリアランス（ＣＬ）（活性）、
（ｂ）前記患者集団において、少なくとも約６８．０５±１１．１６時間の平均平均滞留時間（ＭＲＴ）（活性）、前記患者集団において、約６０〜７８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、または７８時間の平均ＭＲＴ（活性）、前記患者集団において、前記ＦｃＲｎ ＢＰを含まずに前記第ＩＸ因子を含むポリペプチドの平均ＭＲＴよりも約３倍長い平均ＭＲＴ（活性）、前記対象において、約５３．１〜８５．８時間の平均滞留時間（ＭＲＴ）（活性）、前記対象において、少なくとも約４５、約５０、約５５、約６０、約６５、約７０、約７５、約８０、約８５、または約９０時間の平均滞留時間（ＭＲＴ）（活性）、
（ｃ）前記患者集団において、約５２．５±９．２時間の平均ｔ１／２β（活性）、前記患者集団において、約４７〜６０時間、約４７、約４８、約４９、約５０、約５１、約５２、約５３、約５４、約５５、約５６、約５７、約５８、約５９、約６０時間の平均ｔ１／２β（活性）、前記患者集団において、前記ＦｃＲｎ ＢＰを含まずに前記第ＩＸ因子を含むポリペプチドの平均ｔ１／２βよりも約３倍長い平均ｔ１／２β（活性）、前記対象において、約４０〜６７．４、約４０、約４５、約５０、約５５、約６０、約６５、約７０、または約７５時間のｔ１／２β（活性）、
（ｄ）前記患者集団において、１ＩＵ／ｋｇ当たり約０．９３±０．１８ＩＵ／ｄＬの平均増分回収率（Ｋ値）（活性；観察値）、前記患者集団において、１ＩＵ／ｋｇ当たり約０．８５〜１．０、約０．８５、約０．８６、約０．８７、約０．８８、約０．８９、約０．９０、約０．９１、約０．９２、約０．９３、約０．９４、約０．９５、約０．９６、約０．９７、約０．９８、約０．９９、約１．０、約１．０５、約１．１０、または約１．１５ＩＵ／ｄＬの平均増分回収率（Ｋ値）（活性；観察値）、前記患者集団において、前記ＦｃＲＮ ＢＰを含まずに前記第ＩＸ因子を含むポリペプチドの平均増分回収率よりも約２４％良好である平均増分回収率（Ｋ値）（活性；観察値）、前記対象において、１ＩＵ／ｋｇ当たり約０．６２〜１．１７ＩＵ／ｄＬの増分回収率（Ｋ値）（活性；観察値）、
（ｅ）前記患者集団において、約２２６±６７．７６（６９．８に修正）ｍＬ／ｋｇの平均Ｖｓｓ（活性）、前記患者集団において、約２００〜３００、約２００、約２１０、約２２０、約２３０、約２４０、約２５０、約２６０、約２７０、約２８０、約２９０、または約３００ｍＬ／ｋｇの平均Ｖｓｓ（活性）、前記対象において、約１４５〜３６５ｍＬ／ｋｇのＶｓｓ（活性）、
（ｆ）前記患者集団において、１ＩＵ／ｋｇ当たり約３２．４４±１０．７５ＩＵ＊時間／ｄＬの平均ＡＵＣ／用量（活性）、前記患者集団において、１ＩＵ／ｋｇ当たり約２６〜４０、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４、約３５、約３６、約３７、約３８、約３９、または約４０ＩＵ＊時間／ｄＬの平均ＡＵＣ／用量（活性）、前記対象において、１ＩＵ／ｋｇ当たり約２１．８０〜５４．３０ＩＵ＊時間／ｄＬのＡＵＣ／用量、からなる群から選択される、１つ以上の薬物動態パラメーターを示す。
幾つかの実施形態において、キメラポリペプチドの用量は、ＭＯＮＯＮＩＮＥ（商標）（ｐｄＦＩＸ；ＣＳＬ Ｂｅｈｒｉｎｇ））またはＢＥＮＥＦＩＸ（商標）（Ｗｙｅｔｈ；ｒＦＩＸ）（０．１％）等の現在市販されている第ＩＸ因子製品よりも、著しく低い（１０〜１００倍）レベル（０．０１〜０．００１％）の活性化されたＦＩＸ（ＦＩＸａ）を含有する。そのようなレベルは、現在市販されている製品よりも、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００倍低くても、０．０１、０．０５、０．００３３、０．００２５、０．００２、０．００１６７、０．００１４２、０．００１２５、０．００１１１、または０．００１％であってもよい。
幾つかの実施形態において、投与間隔は、６〜１８日、６〜１０日、９〜１８日、少なくとも６日、少なくとも７日、少なくとも８日、少なくとも９日、少なくとも１０日、少なくとも１１日、少なくとも１２日、少なくとも１３日、少なくとも１４日、少なくとも１５日、少なくとも１６日、少なくとも１７日、または少なくとも１８日、１週間に１回、１ヶ月に２回、または１ヶ月に１回である。投与間隔は、予防的投与間隔、一定の予防的投与間隔、または個人に合わせた予防的投与間隔であってもよい。
本発明の方法は、出血または出血症状の制御もしくは予防を必要とする、断続的治療を必要とする、予防的治療を必要とする、またはオンデマンド治療を必要とする対象に実行される。
本発明の方法で使用してもよい治療用量は、約２５〜１８０、約２０〜１８０、約２０〜５０、約２０〜１００、約１０〜１８０、約１０〜５０、約１０〜３０、または約５０〜１００ＩＵ／ｋｇである。該用量は、一定の用量であっても、個人に合わせた用量であってもよい。
幾つかの実施形態において、キメラポリペプチドは、静脈内投与されるか、または皮下投与される。
本発明の方法において、対象は、ヒト対象であっても、または非ヒト哺乳動物であってもよい。非ヒト哺乳動物には、マウス、イヌ、霊長類、サル、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ならびに他の家畜および小動物が含まれる。
キメラポリペプチドは、前記キメラポリペプチドと関連する第２ポリペプチドを含むハイブリッドの形であってもよく、前記第２ポリペプチドは、ＦｃＲｎ ＢＰ、例えばＦｃを含むか、またはそれから本質的になる。キメラポリペプチドは、シグナル配列およびプロペプチドを含む、または、含まない、表２Ａ（配列番号２）および／または２Ｂ（配列番号４）の第ＩＸ因子配列、Ｆｃ配列、あるいは第ＩＸ因子とＦｃ配列の両方の配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％同一であってよい。
キメラポリペプチドまたはハイブリッドは、少なくとも１つの賦形剤を含む医薬組成物の一部として投与されてもよい。
本発明はまた、上記のキメラおよびハイブリッドポリペプチドそれ自体、それらをコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含む培養されたヒト胚細胞、そのようなキメラおよびハイブリッドポリペプチドの産生方法、およびそのような方法によって産生されたポリペプチドも提供する。
本発明の好ましい実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
１週間に約１回またはそれより長い投与間隔で、少なくとも約２５ＩＵ／ｋｇの用量の、第ＩＸ因子およびＦｃＲｎ結合パートナー（ＦｃＲｎ ＢＰ）を含むキメラポリペプチドをヒト対象に投与することを含む、それを必要とする前記対象への第ＩＸ因子の投与方法。
（項目２）
１週間に約１回またはそれより長い投与間隔で、少なくとも約１０または少なくとも約２０ＩＵ／ｋｇの用量の、第ＩＸ因子およびＦｃＲｎ結合パートナー（ＦｃＲｎ ＢＰ）を含むキメラポリペプチドをヒト対象に投与することを含む、それを必要とする前記対象への第ＩＸ因子の投与方法。
（項目３）
１週間に約１回またはそれより長い投与間隔で、少なくとも約１０ＩＵ／ｋｇの用量の、第ＩＸ因子およびＸＴＥＮを含むキメラポリペプチドをヒト対象に投与することを含む、それを必要とする前記対象への第ＩＸ因子の投与方法。
（項目４）
前記キメラポリペプチドの血漿レベルが、少なくとも約８０％の患者集団において、少なくとも約６日後、少なくとも約１ＩＵ／ｄＬのトラフに達するか、または前記対象において、少なくとも約６日後、少なくとも約１ＩＵ／ｄＬのトラフに達する、項目１〜３のいずれかに記載の方法。
（項目５）
前記キメラポリペプチドの血漿レベルが、
患者集団において、約１〜５ＩＵ／ｄＬの平均トラフに達するか、または
前記対象において、約１〜５ＩＵ／ｄＬのトラフに達する、項目１〜３のいずれかに記載の方法。
（項目６）
前記用量中２５％未満の前記第ＩＸ因子のキメラポリペプチドが完全にリン酸化され、前記用量中２５％未満の前記第ＩＸ因子のキメラポリペプチドが完全に硫酸化される、項目１〜５のいずれかに記載の方法。
（項目７）
前記用量中約１０％未満の前記キメラポリペプチドが、リン酸化され、前記用量中約９％未満の前記キメラポリペプチドが硫酸化される、項目６に記載の方法。
（項目８）
前記用量が、１ＩＵ／ｋｇ当たり０．７５ＩＵ／ｄＬを超える平均増分回収率（Ｋ値）（活性；観察値）を有する、項目１〜７のいずれかに記載の方法。
（項目９）
前記用量が、１ＩＵ／ｋｇ当たり少なくとも約０．８、少なくとも約０．９、または少なくとも約１ＩＵ／ｄＬの平均増分回収率（Ｋ値）（活性；観察値）を有する、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記キメラポリペプチドが、前記患者集団または前記対象において、
前記患者集団において、約３．３６±０．９３ｍＬ／時間／ｋｇの平均クリアランス（ＣＬ）（活性）、
前記患者集団において、約３．０〜３．７２、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、または３．７２ｍＬ／時間／ｋｇの平均クリアランス（ＣＬ）（活性）、
前記患者集団において、前記ＦｃＲｎ ＢＰを含まずに前記第ＩＸ因子を含むポリペプチドのクリアランスよりも約２．５倍低い平均クリアランス（ＣＬ）（活性）、
前記対象において、約１．８４〜４．５８ｍＬ／時間／ｋｇのクリアランス（ＣＬ）（活性）、
前記患者集団において、少なくとも約６８．０５±１１．１６時間の平均平均滞留時間（ＭＲＴ）（活性）、
前記患者集団において、約６０〜７８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、または７８時間の平均ＭＲＴ（活性）、
前記患者集団において、前記ＦｃＲｎ ＢＰを含まずに前記第ＩＸ因子を含むポリペプチドの平均ＭＲＴよりも約３倍長い平均ＭＲＴ（活性）、
前記対象において、約５３．１〜８５．８時間の平均滞留時間（ＭＲＴ）（活性）、
前記対象において、少なくとも約４５、約５０、約５５、約６０、約６５、約７０、約７５、約８０、約８５、または約９０時間の平均滞留時間（ＭＲＴ）（活性）、
前記患者集団において、約５２．５±９．２時間の平均ｔ１／２β（活性）、
前記患者集団において、約４７〜６０時間、約４７、約４８、約４９、約５０、約５１、約５２、約５３、約５４、約５５、約５６、約５７、約５８、約５９、約６０時間の平均ｔ１／２β（活性）、前記患者集団において、前記ＦｃＲｎ ＢＰを含まずに前記第ＩＸ因子を含むポリペプチドの平均ｔ１／２βよりも約３倍長い平均ｔ１／２β（活性）、
前記対象において、約４０〜６７．４、約４０、約４５、約５０、約５５、約６０、約６５、約７０、または約７５時間のｔ１／２β（活性）、
前記患者集団において、１ＩＵ／ｋｇ当たり約０．９３±０．１８ＩＵ／ｄＬの平均増分回収率（Ｋ値）（活性；観察値）、
前記患者集団において、１ＩＵ／ｋｇ当たり約０．８５〜１．１５、約０．８５、約０．８６、約０．８７、約０．８８、約０．８９、約０．９０、約０．９１、約０．９２、約０．９３、約０．９４、約０．９５、約０．９６、約０．９７、約０．９８、約０．９９、約１．０、約１．０５、約１．１０、または約１．１５ＩＵ／ｄＬの平均増分回収率（Ｋ値）（活性；観察値）、
前記患者集団において、前記ＦｃＲＮ ＢＰを含まずに前記第ＩＸ因子を含むポリペプチドの平均増分回収率よりも約２４％良好である平均増分回収率（Ｋ値）（活性；観察値）、
前記対象において、１ＩＵ／ｋｇ当たり約０．６２〜１．１７ＩＵ／ｄＬの増分回収率（Ｋ値）（活性；観察値）、
前記患者集団において、約２２６±６７．７６ｍＬ／ｋｇの平均Ｖｓｓ（活性）、
前記患者集団において、約２００〜３００、約２００、約２１０、約２２０、約２３０、約２４０、約２５０、約２６０、約２７０、約２８０、約２９０、または約３００ｍＬ／ｋｇの平均Ｖｓｓ（活性）、前記対象において、約１４５〜３６５ｍＬ／ｋｇのＶｓｓ（活性）、
前記患者集団において、１ＩＵ／ｋｇ当たり約３２．４４±１０．７５ＩＵ＊時間／ｄＬの平均ＡＵＣ／用量（活性）、
前記患者集団において、１ＩＵ／ｋｇ当たり約２６〜４０、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４、約３５、約３６、約３７、約３８、約３９、または約４０ＩＵ＊時間／ｄＬの平均ＡＵＣ／用量（活性）、
および前記対象において、１ＩＵ／ｋｇ当たり約２１．８０〜５４．３０ＩＵ＊時間／ｄＬのＡＵＣ／用量、からなる群から選択される、１つ以上の薬物動態パラメーターを示す、項目１〜７のいずれかに記載の方法。
（項目１１）
前記投与間隔が、６〜１０日である、項目１〜１０のいずれかに記載の方法。
（項目１２）
前記用量が、約２５〜１１０、約３０〜１１０、約４０〜１１０、約５０〜１１０、約６０〜１１０、約７０〜１１０、約８０〜１１０、約９０〜１１０、および約１００〜１１０ＩＵ／ｋｇからなる群から選択される、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記用量が、約３０〜１００、約３０〜９０、約３０〜８０、約３０〜７０、約３０〜６０、約３０〜５０、および約３０〜４０ＩＵ／ｋｇからなる群から選択される、項目１１に記載の方法。
（項目１４）
前記用量が、約４０〜１１０、約５０〜１００、約６０〜９０、および約７０〜８０ＩＵ／ｋｇからなる群から選択される、項目１１に記載の方法。
（項目１５）
前記用量が、約４０〜５０、約５０〜６０、約６０〜７０、約７０〜８０、約８０〜９０、約９０〜１００、および約１００〜１１０ＩＵ／ｋｇからなる群から選択される、項目１１に記載の方法。
（項目１６）
前記用量が、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０、約５５、約６０、約６５、約７０、約７５、約８０、約８５、約９０、約９５、約１００、約１０５、および約１１０ＩＵ／ｋｇからなる群から選択される、項目１１に記載の方法。
（項目１７）
前記投与間隔が、約７〜１０、約７〜９、および約７〜８日からなる群から選択される、項目１１〜１６のいずれかに記載の方法。
（項目１８）
前記投与間隔が、約８〜１０および約９〜１０日からなる群から選択される、項目１１〜１６のいずれかに記載の方法。
（項目１９）
前記投与間隔が、約６〜７および約８〜９日からなる群から選択される、項目１１〜１６のいずれかに記載の方法。
（項目２０）
前記投与間隔が、約６、約７、約８、約９、および約１０日からなる群から選択される、項目１１〜１６のいずれかに記載の方法。
（項目２１）
前記用量が、約３０〜５０ＩＵ／ｋｇであり、前記投与間隔が、約７日である、項目１１に記載の方法。
（項目２２）
前記患者集団の少なくとも約９０％で前記トラフに達する、項目４〜２１のいずれかに記載の方法。
（項目２３）
前記患者集団の約１００％で前記トラフに達する、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
前記用量が、約５０ＩＵ／ｋｇであり、前記投与間隔が、約７日である、項目１〜１１、２２、および２３のいずれかに記載の方法。
（項目２５）
前記用量が、約５０ＩＵ／ｋｇであり、前記投与間隔が、約７日であり、かつ、前記患者集団の約１００％で前記トラフに達する、項目４〜１１のいずれかに記載の方法。
（項目２６）
前記投与間隔が、９〜１８日である、項目１〜１０のいずれかに記載の方法。
（項目２７）
前記用量が、約９０〜１８０、約１００〜１８０、約１１０〜１８０、約１２０〜１８０、約１３０〜１８０、約１４０〜１８０、約１５０〜１８０、約１６０〜１８０、および約１７０〜１８０ＩＵ／ｋｇからなる群から選択される、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
前記用量が、約９０〜１７０、約９０〜１６０、約９０〜１５０、約９０〜１４０、約９０〜１３０、約９０〜１２０、約９０〜１１０、および約９０〜１００ＩＵ／ｋｇからなる群から選択される、項目２６に記載の方法。
（項目２９）
前記用量が、約１００〜１７０、約１１０〜１６０、約１２０〜１５０、および約１３０〜１４０ＩＵ／ｋｇからなる群から選択される、項目２６に記載の方法。
（項目３０）
前記用量が、約９０〜１００、約１００〜１１０、約１１０〜１２０、約１２０〜１３０、約１３０〜１４０、約１４０〜１５０、約１５０〜１６０、および約１６０〜１７０ＩＵ／ｋｇからなる群から選択される、項目２６に記載の方法。
（項目３１）
前記用量が、約９０、約９５、約１００、約１０５、約１１０、約１１５、約１２０、約１２５、約１３０、約１３５、約１４０、約１４５、約１５０、約１５５、約１６０、約１６５、約１７０、約１７５、および約１８０ＩＵ／ｋｇからなる群から選択される、項目２６に記載の方法。
（項目３２）
前記投与間隔が、約９〜１７、約９〜１６、約９〜１５、約９〜１４、約９〜１３、約９〜１２、約９〜１１、および約９〜１０日からなる群から選択される、項目２６〜３１のいずれかに記載の方法。
（項目３３）
前記投与間隔が、約１０〜１８、約１１〜１８、約１２〜１８、約１３〜１８、約１４〜１８、約１５〜１８、約１６〜１８、および約１７〜１８日からなる群から選択される、項目２６〜３１のいずれかに記載の方法。
（項目３４）
前記投与間隔が、約１０〜１１、約１１〜１２、約１２〜１３、約１３〜１４、約１４〜１５、約１５〜１６、および約１６〜１７日からなる群から選択される、項目２６〜３１のいずれかに記載の方法。
（項目３５）
前記投与間隔が、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、および約１８日からなる群から選択される、項目２６〜３１のいずれかに記載の方法。
（項目３６）
前記用量が、約１００ＩＵ／ｋｇであり、前記投与間隔が、少なくとも約１２日である、項目２６に記載の方法。
（項目３７）
前記トラフが、前記患者集団の少なくとも約７０％、約８０％、または約９０％で少なくとも約１ＩＵ／ｄＬである、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
前記投与間隔が、約１２〜１３日である、項目２６に記載の方法。
（項目３９）
前記用量が、約１００ＩＵ／ｋｇであり、前記投与間隔が、少なくとも約９日である、項目２６に記載の方法。
（項目４０）
前記トラフが、前記患者集団の約１００％で少なくとも約１ＩＵ／ｄＬである、項目３９に記載の方法。
（項目４１）
前記投与間隔が、約９〜１５日である、項目２６または３９に記載の方法。
（項目４２）
前記用量が、約１５０ＩＵ／ｋｇであり、前記投与間隔が、少なくとも約１４日である、項目２６に記載の方法。
（項目４３）
前記トラフが、前記患者集団の約１００％で少なくとも約１ＩＵ／ｄＬである、項目４２に記載の方法。
（項目４４）
前記対象が、出血または出血症状の制御または予防を必要とする、項目１〜４３のいずれかに記載の方法。
（項目４５）
前記対象が、軽度の出血、関節血症、筋肉表面の出血、軟組織出血、中等度の出血、切開による筋肉内もしくは軟組織出血、粘膜出血、血尿、重篤な出血、咽頭出血、咽頭後部の出血、腹腔後部の出血、中枢神経系の出血、打撲、切り傷、こすり傷、関節出血、鼻血、口の出血、歯茎の出血、頭蓋内出血、腹腔内出血、軽度の特発性出血、大外傷後の出血、中等度の皮膚打撲、または関節、筋肉、内臓器官、もしくは脳の特発性出血の制御または予防を必要とする、項目４４に記載の方法。
（項目４６）
前記対象が、周術期管理を必要とする、項目１〜４３のいずれかに記載の方法。
（項目４７）
前記対象が、外科手術または抜歯と関連する出血の管理を必要とする、項目４６に記載の方法。
（項目４８）
前記対象が、大外科手術を行う、行っている、または行ったことがある、項目４６に記載の方法。
（項目４９）
前記大外科手術が、整形外科手術、大規模な口腔外科手術、泌尿器外科手術、またはヘルニア外科手術である、項目４８に記載の方法。
（項目５０）
前記整形外科手術が、膝、臀部、または他の大関節の置換術である、項目４９に記載の方法。
（項目５１）
前記対象が、予防的治療を必要とする、項目１〜４３のいずれかに記載の方法。
（項目５２）
前記対象が、オンデマンド治療を必要とする、項目１〜４３のいずれかに記載の方法。
（項目５３）
前記対象が、出血症状の治療を必要とする、項目５２に記載の方法。
（項目５４）
前記対象が、関節血症、筋肉出血、口の出血、出血、筋肉への出血、口腔出血、外傷、頭部外傷（ｔｒａｕｍａ ｃａｐｉｔｉｓ）、胃腸出血、頭蓋内出血、腹腔内出血、胸腔内出血、骨折、中枢神経系の出血、咽頭後隙の出血、後腹膜腔内出血、または腸腰筋鞘（ｉｌｌｉｏｐｓｏａｓ ｓｈｅａｔｈ）内の出血のための治療を必要とする、項目５３に記載の方法。
（項目５５）
前記対象が、外科的予防、周術期の管理、または外科手術のための治療を必要とする、項目５１に記載の方法。
（項目５６）
前記外科手術が、簡単な外科手術、大外科手術、抜歯、扁桃摘出術、鼠径ヘルニア切除術、滑膜切除術、人工膝関節置換術、開頭術、骨接合術、外傷外科手術、頭蓋内外科手術、腹腔内外科手術、胸腔内外科手術、または人工関節置換術である、項目５３に記載の方法。
（項目５７）
前記対象が、ヒトである、項目１〜５６のいずれかに記載の方法。
（項目５８）
前記キメラポリペプチドにおいて前記第ＩＸ因子が、ヒト第ＩＸ因子である、項目１〜５７のいずれかに記載の方法。
（項目５９）
前記キメラポリペプチドにおいて前記第ＩＸ因子が、変異体第ＩＸ因子である、項目１〜５８のいずれかに記載の方法。
（項目６０）
前記キメラポリペプチドにおいて前記ＦｃＲｎ ＢＰが、ヒトＦｃである、項目１〜５９のいずれかに記載の方法。
（項目６１）
キメラポリペプチドにおいて前記ＦｃＲｎ ＢＰが、変異体Ｆｃである、項目１〜６０のいずれかに記載の方法。
（項目６２）
前記第ＩＸ因子が、シグナル配列およびプロペプチドを含まない表２Ａに示される第ＩＸ因子アミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸１〜４１５）と少なくとも９０％または９５％同一である、項目５８に記載の方法。
（項目６３）
前記第ＩＸ因子が、シグナル配列およびプロペプチドを含まない表２Ａに示される第ＩＸ因子アミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸１〜４１５）と同一である、項目６２に記載の方法。
（項目６４）
前記Ｆｃが、シグナル配列を含まない表２Ｂに示されるＦｃアミノ酸配列（配列番号４のアミノ酸１〜２２７）と少なくとも９０％または９５％同一である、項目６０に記載の方法。
（項目６５）
前記Ｆｃが、シグナル配列を含まない表２Ｂに示されるＦｃアミノ酸配列（配列番号４のアミノ酸１〜２２７）と同一である、項目６４に記載の方法。
（項目６６）
前記キメラポリペプチドが、前記キメラポリペプチドと会合する第２ポリペプチドを含むハイブリッドの形であり、前記第２ポリペプチドが、ＦｃＲｎ ＢＰを含む、項目１〜６５のいずれかに記載の方法。
（項目６７）
前記キメラポリペプチドが、シグナル配列およびプロペプチドを含まない表２Ａに示される前記第ＩＸ因子およびＦｃアミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸１〜６４２）と少なくとも９０％または９５％同一である配列を含む、項目６６に記載の方法。
（項目６８）
前記キメラポリペプチドが、シグナル配列およびプロペプチドを含まない表２Ａに示される前記第ＩＸ因子およびＦｃアミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸１〜６４２）と同一である配列を含む、項目６７に記載の方法。
（項目６９）
前記第２ポリペプチドが、シグナル配列を含まない表２Ｂに示されるアミノ酸配列（配列番号４のアミノ酸１〜２２７）と少なくとも９０％または９５％同一である配列を含む、項目６６〜６８のいずれかに記載の方法。
（項目７０）
前記第２ポリペプチドが、シグナル配列を含まない表２Ｂに示されるアミノ酸配列（配列番号４のアミノ酸１〜２２７）と同一である配列を含む、項目６９に記載の方法。
（項目７１）
前記患者が、１週間に１回またはそれ以上長い投与間隔で、長期治療を必要とする、項目１〜７０のいずれかに記載の方法。
（項目７２）
前記キメラポリペプチドが、少なくとも１つの賦形剤を含む医薬組成物の一部として投与される、項目１〜７１のいずれかに記載の方法。
（項目７３）
シグナル配列およびプロペプチドを含まない表２Ａに示される第ＩＸ因子アミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸１〜４１５）と少なくとも９０％または９５％同一である第ＩＸ因子、およびＦｃＲｎ ＢＰを含む、ポリペプチド。
（項目７４）
前記第ＩＸ因子が、シグナル配列およびプロペプチドを含まない表２Ａに示される第ＩＸ因子アミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸１〜４１５）と同一である、項目７３に記載のポリペプチド。
（項目７５）
シグナル配列およびプロペプチドおよびプロペプチドを含む表２Ａに示される第ＩＸ因子アミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸−４６〜４１５）と少なくとも９０％および９５％同一である第ＩＸ因子、およびＦｃＲｎ ＢＰを含む、ポリペプチド。
（項目７６）
前記第ＩＸ因子が、シグナル配列およびプロペプチドを含む表２Ａに示される第ＩＸ因子アミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸−４６〜４１５）と同一である、項目７５に記載のポリペプチド。
（項目７７）
前記ＦｃＲｎ ＢＰが、表２Ｂに示される前記Ｆｃアミノ酸配列（配列番号４のアミノ酸１〜２２７）と少なくとも９０％または９５％同一である、項目７３〜６５のいずれかに記載のポリペプチド。
（項目７８）
前記Ｆｃが、表２Ｂに示される前記Ｆｃアミノ酸配列（配列番号４のアミノ酸１〜２２７）と同一である、項目７７に記載のポリペプチド。
（項目７９）
シグナル配列およびプロペプチドを含まない表２Ａに示される前記第ＩＸ因子およびＦｃアミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸１〜６４２）と少なくとも９０％または９５％同一である配列を含む、項目７３または７５に記載のポリペプチド。
（項目８０）
シグナル配列およびプロペプチドを含まない表２Ａに示される前記第ＩＸ因子およびＦｃアミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸１〜６４２）と同一である配列を含む、項目７９に記載のポリペプチド。
（項目８１）
第２ポリペプチドを含むハイブリッドの形であり、前記第２ポリペプチドがＦｃＲｎ ＢＰを含む、項目７３〜８０のいずれかに記載のポリペプチド。
（項目８２）
前記第２ポリペプチドが、シグナル配列を含まない表２Ｂに示されるアミノ酸配列（配列番号４のアミノ酸１〜２２７）と少なくとも９０％または９５％同一である配列、またはシグナル配列を含む表２Ｂに示されるアミノ酸配列（配列番号４のアミノ酸−２０〜２２７）と少なくとも９０％または９５％同一である配列を含む、項目８１に記載のポリペプチド。
（項目８３）
前記第２ポリペプチドが、シグナル配列を含まない表２Ｂに示されるアミノ酸配列（配列番号４のアミノ酸１〜２２７）と同一である配列、またはシグナル配列を含む表２Ｂに示されるアミノ酸配列（配列番号４のアミノ酸−２０〜２２７）と少なくとも９０％または９５％同一である配列を含む、項目８１に記載のポリペプチド。
（項目８４）
血漿由来第ＩＸ因子と比較して、大幅に減少したリン酸化および硫酸化を有する、項目７３〜８３のいずれかに記載のポリペプチド。
（項目８５）
約１０％未満リン酸化され、かつ約９％未満硫酸化される、項目８４に記載のポリペプチド。
（項目８６）
０．７または０．７５を超えるＫ値を有する、項目７３〜８５のいずれかに記載のポリペプチド。
（項目８７）
少なくとも約０．８、少なくとも約０．９、または少なくとも約１のＫ値を有する、項目８６に記載のポリペプチド。
（項目８８）
前記患者集団または前記対象において、
前記患者集団において、約３．３６±０．９３ｍＬ／時間／ｋｇの平均クリアランス（ＣＬ）（活性）、
前記患者集団において、約３．０〜３．７２、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、または３．７２ｍＬ／時間／ｋｇの平均クリアランス（ＣＬ）（活性）、
前記患者集団において、前記ＦｃＲｎ ＢＰを含まずに前記第ＩＸ因子を含むポリペプチドのクリアランスよりも約２．５倍低い平均クリアランス（ＣＬ）（活性）、
前記対象において、約１．８４〜４．５８ｍＬ／時間／ｋｇのクリアランス（ＣＬ）（活性）、
前記患者集団において、少なくとも約６８．０５±１１．１６時間の平均平均滞留時間（ＭＲＴ）（活性）、
前記患者集団において、約６０〜７８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、または７８時間の平均ＭＲＴ（活性）、
前記患者集団において、前記ＦｃＲｎ ＢＰを含まずに前記第ＩＸ因子を含むポリペプチドの平均ＭＲＴよりも約３倍長い平均ＭＲＴ（活性）、
前記対象において、約５３．１〜８５．８時間の平均滞留時間（ＭＲＴ）（活性）、
前記対象において、少なくとも約４５、約５０、約５５、約６０、約６５、約７０、約７５、約８０、約８５、または約９０時間の平均滞留時間（ＭＲＴ）（活性）、
前記患者集団において、約５２．５±９．２時間の平均ｔ１／２β（活性）、
前記患者集団において、約４７〜６０時間、約４７、約４８、約４９、約５０、約５１、約５２、約５３、約５４、約５５、約５６、約５７、約５８、約５９、約６０時間の平均ｔ１／２β（活性）、前記患者集団において、前記ＦｃＲｎ ＢＰを含まずに前記第ＩＸ因子を含むポリペプチドの平均ｔ１／２βよりも約３倍長い平均ｔ１／２β（活性）、
前記対象において、約４０〜６７．４、約４０、約４５、約５０、約５５、約６０、約６５、約７０、または約７５時間のｔ１／２β（活性）、
前記患者集団において、１ＩＵ／ｋｇ当たり約０．９３±０．１８ＩＵ／ｄＬの平均増分回収率（Ｋ値）（活性；観察値）、前記患者集団において、１ＩＵ／ｋｇ当たり約０．８５〜１．１５、約０．８５、約０．８６、約０．８７、約０．８８、約０．８９、約０．９０、約０．９１、約０．９２、約０．９３、約０．９４、約０．９５、約０．９６、約０．９７、約０．９８、約０．９９、約１．０、約１．０５、約１．１０、または約１．１５ＩＵ／ｄＬの平均増分回収率（Ｋ値）（活性；観察値）、
前記患者集団において、前記ＦｃＲＮ ＢＰを含まずに前記第ＩＸ因子を含むポリペプチドの平均増分回収率よりも約２４％良好である平均増分回収率（Ｋ値）（活性；観察値）、
前記対象において、１ＩＵ／ｋｇ当たり約０．６２〜１．１７ＩＵ／ｄＬの増分回収率（Ｋ値）（活性；観察値）、
前記患者集団において、約２２６±６７．７６ｍＬ／ｋｇの平均Ｖｓｓ（活性）、
前記患者集団において、約２００〜３００、約２００、約２１０、約２２０、約２３０、約２４０、約２５０、約２６０、約２７０、約２８０、約２９０、または約３００ｍＬ／ｋｇの平均Ｖｓｓ（活性）、
前記対象において、約１４５〜３６５ｍＬ／ｋｇのＶｓｓ（活性）、
前記患者集団において、１ＩＵ／ｋｇ当たり約３２．４４±１０．７５ＩＵ＊時間／ｄＬの平均ＡＵＣ／用量（活性）、
前記患者集団において、１ＩＵ／ｋｇ当たり約２６〜４０、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４、約３５、約３６、約３７、約３８、約３９、または約４０ＩＵ＊時間／ｄＬの平均ＡＵＣ／用量（活性）、
および前記対象において、１ＩＵ／ｋｇ当たり約２１．８０〜５４．３０ＩＵ＊時間／ｄＬのＡＵＣ／用量、からなる群から選択される、１つ以上の薬物動態パラメーターを示す、項目７３〜８７のいずれかに記載のポリペプチド。
（項目８９）
項目７３〜８０のいずれかに記載のポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
（項目９０）
項目８１〜８８のいずれか１項に記載の、前記第ＩＸ因子−ＦｃＲｎ ＢＰポリペプチドおよび前記第２ペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
（項目９１）
ベクター、プラスミド、ファージ、またはウイルスである、項目８９または９０に記載のポリヌクレオチド。
（項目９２）
ＤＮＡまたはＲＮＡである、項目８９〜９１のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
（項目９３）
項目８９〜９２のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含む、ヒト胚性培養細胞。
（項目９４）
ＨＥＫ２９３細胞である、項目９３に記載の細胞。
（項目９５）
第ＩＸ因子−ＦｃＲｎ ＢＰハイブリッドタンパク質の産生方法であって、
前記コード化第ＩＸ因子ＦｃＲｎ ＢＰキメラポリペプチドおよびＦｃＲｎ ＢＰから本質的になる前記コード化ポリペプチドの発現を可能にする条件下で、項目９３または９４に記載の細胞を培養することと、
前記コード第ＩＸ因子−ＦｃＲｎ ＢＰハイブリッドタンパク質を回収することを含む方法。
（項目９６）
項目９５に記載の方法によって産生される、ハイブリッドタンパク質。
（項目９７）
血漿由来第ＩＸ因子と比較して、大幅に減少したリン酸化および硫酸化を有する、項目９６に記載のハイブリッドタンパク質。
（項目９８）
約１０％未満リン酸化され、かつ約９％未満硫酸化される、項目９７に記載のハイブリッドタンパク質。
（項目９９）
０．７または０．７５を超えるＫ値を有する、項目９６〜９８のいずれかに記載のハイブリッドタンパク質。
（項目１００）
少なくとも約８、約９、または約１のＫ値を有する、項目９９に記載のハイブリッドタンパク質。
（項目１０１）
前記キメラポリペプチドが、ハイブリッドの形であり、前記ハイブリッドが、前記キメラポリペプチドの一本鎖および前記第２ポリペプチドの一本鎖から本質的になり、前記鎖が、（ａ）非共有相互作用、（ｂ）２つのジスルフィド結合、または（ｃ）（ａ）および（ｂ）の両方を介して会合する、項目６６〜７２のいずれかに記載の方法。
（項目１０２）
前記キメラポリペプチドが、ハイブリッドの形であり、前記ハイブリッドが、前記キメラポリペプチドの一本鎖および前記第２ポリペプチドの一本鎖から本質的になり、前記鎖が、（ａ）非共有相互作用、（ｂ）２つのジスルフィド結合、または（ｃ）（ａ）および（ｂ）の両方を介して会合する、項目８１〜８８および９６〜１００のいずれかに記載のポリペプチド。
（項目１０３）
ヒトにおいて、１ＩＵ／ｋｇ当たり０．７５ＩＵ／ｄＬを超える増分回収率（Ｋ値）を有し、調製時、２５％未満のｒＦＩＸが、完全にリン酸化され、硫酸化される、組換え型第ＩＸ因子（ｒＦＩＸ）調製物。
（項目１０４）
１ＩＵ／ｋｇ当たり少なくとも約０．８、少なくとも約０．９、または少なくとも約１ＩＵ／ｄＬの増分回収率（Ｋ値）を有する、項目１０３に記載のｒＦＩＸ調製物。
（項目１０５）
前記ｒＦＩＸが、ＦｃＲｎ ＢＰを含む、項目１０３に記載のｒＦＩＸ調製物。
（項目１０６）
ＦｃのＦｃＲｎ結合領域を含む、項目１０５に記載のｒＦＩＸ調製物。
（項目１０７）
アルブミンのＦｃＲｎ結合領域を含む、項目１０５に記載のｒＦＩＸ調製物。
（項目１０８）
前記用量が１０〜５０、１０〜３０、２０〜５０、２０〜１００、１０、または２０ＩＵ／ｋｇであり、前記投与間隔が１週間に１回である、項目１〜１０のいずれかに記載の方法。
（項目１０９）
前記用量が１５〜５０または４０ＩＵ／ｋｇであり、前記投与間隔が１０日ごとである、項目１〜１０のいずれかに記載の方法。
（項目１１０）
前記用量が１００ＩＵ／ｋｇであり、前記投与間隔が２週間ごと、または１ヶ月に２回である、項目１〜１０のいずれかに記載の方法。
（項目１１１）
前記投与間隔が１週間に１回である、項目１〜１０のいずれかに記載の方法。
（項目１１２）
前記用量が１５〜１００ＩＵ／ｋｇであり、前記投与間隔が１０〜１３日である、項目１〜１０のいずれかに記載の方法。
（項目１１３）
前記用量が５０〜１００ＩＵ／ｋｇであり、前記投与間隔が１０〜１４日であり、前記用量が５０〜１５０ＩＵ／ｋｇであり、前記投与間隔が１４〜１５日であるか、または前記用量が１００〜１５０ＩＵ／ｋｇであり、前記投与間隔が１４〜１６日である、項目１〜１０のいずれかに記載の方法。
（項目１１４）
前記用量が１５〜５０ＩＵ／ｋｇであり、前記投与間隔が１０日であり、前記用量が２０〜７０ＩＵ／ｋｇであり、前記投与間隔が１１日であり、前記用量が２５〜８５ＩＵ／ｋｇであり、投与間隔が１２日であり、前記用量が３０〜１００ＩＵ／ｋｇであり、前記投与間隔が１３日であり、前記用量が４０〜１２５ＩＵ／ｋｇであり、前記投与間隔が１４日であるか、または前記用量が５０〜１５０ＩＵ／ｋｇであり、前記投与間隔が１５日である、項目１〜１０のいずれかに記載の方法。
（項目１１５）
１週間に１回の予防的投与間隔からなる、項目１〜１０のいずれかに記載の方法。
（項目１１６）
１０〜１４日の予防的投与間隔からなる、項目１〜１０のいずれかに記載の方法。
（項目１１７）
１５〜１８日または１６〜１８日の予防的投与間隔からなる、項目１〜１０のいずれかに記載の方法。
（項目１１８）
１ヶ月に２回の予防的投与間隔からなる、項目１〜１０のいずれかに記載の方法。
（項目１１９）
１ヶ月に１回の予防的投与間隔からなる、項目１〜１０のいずれかに記載の方法。
（項目１２０）
一定のまたは個人に合わせた予防的用量および／または投与間隔である、項目１〜１０のいずれかに記載の方法。
（項目１２１）
前記用量が、静脈内投与されるか、または皮下投与される、項目１〜１０のいずれかに記載の方法。
１種類の第ＩＸ因子キメラポリペプチド、第ＩＸ因子−Ｆｃハイブリッドの概略図。 群平均ＦＩＸＦｃ濃度対時間プロファイル、名目用量比較。 群平均ＦＩＸＦｃ活性対時間プロファイル、名目用量比較。 ベースライン減算法の決定木。 ＦＩＸ活性についてのＣｍａｘおよびＡＵＣの用量に比例した増加。 ５０（Ａ）および１００（Ｂ）ＩＵ／ｋｇでの、ｒＦＩＸＦｃの推定された治療持続時間。 ＦＩＸ抗原についてのＣｍａｘおよびＡＵＣの用量に比例した増加。 ５０（Ａ）および１００（Ｂ）ＩＵ／ｋｇの名目用量での、ｒＦＩＸＦｃ抗原について推定される薬物動態。 ｒＦＩＸＦｃ活性とｒＦＩＸＦｃ抗原レベルとの間の卓越した相関関係。実施例１１において論じられる、活性ＰＫの再計算により、Ｒ２＝０．９４６であることに留意すること。 ｒＦＩＸ−Ｆｃドメイン構造および翻訳後修飾。ＰＲＯ：プロセッシング酵素により切断されたプロペプチド。ＧＬＡ：１２個のγカルボキシル化グルタミン酸（Ｇｌａ）残基を含有。ＡＣＴ ＰＥＰ：活性型プロテアーゼを生じる切断された活性化ペプチド。他の修飾：ＮおよびＯグリコシル化、Ａｓｐ（６４）βヒドロキシル化、Ｔｙｒ硫酸化、Ｓｅｒリン酸化。 精製中間体および精製されたＦＩＸＦｃモノマーのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル。ＦＩＸＦｃの精製時の異なるステップからの試料が、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析された。レーン１：ＳｅｅＢｌｕｅ Ｐｌｕｓ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｗｅｉｇｈｔ Ｍａｒｋｅｒｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を参照。レーン２：空のレーン。レーン３：プロテインＡ負荷物。レーン４：プロテインＡ溶出物。レーン５：Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＤＥＡＥ溶出物。レーン６：Ｑ Ｓｅｐｈ ＦＦ溶出物。レーン７：最終バルクＦＩＸＦｃ。レーン８：空のレーン。レーン９：最終バルクの還元化ＦＩＸＦｃ。 ＦＩＸ欠損マウスにおける、ＦＩＸＦｃの機能活性。ＦＩＸ欠損マウスは、時間＝０で、２１９ＩＵ／ｋｇ ＦＩＸＦｃ（１群当たり３または４匹、６群、ｎ＝２３）または２００ＩＵ／ｋｇ ｒＦＩＸ（１群当たり３または４匹、５群、ｎ＝２３）を静脈内投与された。血液試料が、投与後、様々な時間（０．２５時間〜９６時間）で採取され、ＦＩＸ活性アッセイを用いて、凝固活性について分析された。＊ｒＦＩＸ活性は、投与後、４８時間よりも遅い時点では、全てのマウスにおいて検出できない。 ＦＩＸ欠損マウスにおける、ＦＩＸＦｃの全血凝固時間対組み換えＦＩＸの全血凝固時間。ＦＩＸ欠損マウス（１群当たり６匹）は、５０ＩＵ／ｋｇ ＦＩＸＦｃまたは５０ＩＵ／ｋｇ ｒＦＩＸを静脈内投与された。血液試料が、投与前、および投与後の様々な時間で採取された。血液試料は、３７℃でインキュベートされ、１分間に１回、血液凝固の存在について視覚的に検査された。凝固が形成するために必要とされた時間が記録され、一旦凝固活性がベースラインに戻る（即ち、凝固形成がない）と、さらなる試料を得なかった（試料は、ＦＩＸＦｃでは１５分間〜１４４時間まで、またはｒＦＩＸでは１５分間〜７２時間まで採取された）。 ＦＩＸ欠損マウスにおける、ＦＩＸＦｃの薬力学。ＦＩＸ欠損マウスは、０、４、および８日目に、２１９ＩＵ／ｋｇ ＦＩＸＦｃ（１群当たり５匹、６群、ｎ＝３０）または２００ＩＵ／ｋｇ ｒＦＩＸ（１群当たり４または５匹、６群、ｎ＝２８）を投与された。血漿試料が、それぞれの投与から１５分後、および９６時間後、心穿刺によって採取され、ＦＩＸ活性アッセイを用いて、凝固活性について測定された。血漿はまた、それぞれの投与から８、２４、４８、および７２時間後、尾部採血法によっても採取された。ＦＩＸＦｃレベルは、ＦＩＸＦｃに特異的なＥＬＩＳＡを用いて、試料の全てにおいて測定された。（Ａ）活性の測定値対計算値。ＦＩＸＦｃについての凝固活性は、３回の投与から１５分後および９６時間後、ＦＩＸ活性アッセイを用いて測定された。ＦＩＸＦｃについてのインビトロ凝固活性は、４３．８±５．４ＩＵ／ｍｇであると決定された。この活性（ＩＵ／ｍｇ）および測定されたタンパク質レベルに基づいて、計算上の血漿凝固活性レベルが、それぞれの投与から１５分後、８、２４、４８、７２、および９６時間後の時点について決定された。（Ｂ）２００ＩＵ／ｋｇ ｒＦＩＸの最大３回の投与により処置されたＦＩＸ欠損マウスでは、ＦＩＸレベルは、ＦＩＸに特異的なＥＬＩＳＡを用いて測定された。ＦＩＸＦｃおよびｒＦＩＸの測定された具体的な活性を用いて、ＥＬＩＳＡによって分析された全ての試料について計算上の凝固活性を比較することが可能であった。 ＦＩＸ欠損イヌにおける、ＦＩＸＦｃの薬物動態学および薬力学。Ｂ型血友病を患っている２匹のイヌは、１４０ＩＵ／ｋｇ ＦＩＸＦｃを静脈内に注入された。血液試料が、５、１５、および３０分で、ならびに１、２、４、６、８、１２、２４、２７、３０、４８、５１、５４、７２、８０、９６、１２６、１４４、および１６８時間で採取された。（Ａ）ＦＩＸ捕捉抗体およびＦｃ−ＨＲＰ検出抗体を利用するサンドイッチＥＬＩＳＡを使用して、Ｂ型血友病のイヌ血漿試料中の無傷ＦＩＸＦｃの濃度を測定した。（Ｂ）ＦＩＸ凝固活性は、ＦＩＸＦｃを用いて生成された標準曲線に関して全ての時点において測定された。（Ｃ）動物から採取した血液は、全血凝固時間について直ちに分析された。血液試料は、２８℃でインキュベートされ、１分間に１回凝固の存在について視覚的に検査され、凝固が形成された時間が記録された。 カニクイザルにおける、ＦＩＸＦｃの薬物動態学。サルは、ＦＩＸＦｃの単一用量（約２５、１００、または５００ＩＵ／ｋｇに相当する、０．５、２、および１０ｍｇ／ｋｇ）を投与された（それぞれ、ｎ＝２、３、および３）。血液試料が、投与から０．２５、０．５、１、８、２４、４８、７２、９６、１２０、１４４、および１６８時間後、採取され、血漿が、ＦＩＸＦｃに特異的なＥＬＩＳＡによってタンパク質濃度の分析のために調製された。 ｒＦＩＸＦｃおよびＢＥＮＥＦＩＸ（商標）は、Ｂ型血友病マウス由来の全血において、同等の活性および用量反応を示す。（Ａ）ＲＯＴＥＭ（登録商標）パラメーター ｒＦＩＸまたはＢＥＮＥＦＩＸ（商標）は、Ｂ型血友病マウスの血液に混入され、凝固パラメーターがＲＯＴＥＭ（登録商標）によって測定された。（Ｂ）〜（Ｄ）（Ｂ）ＣＴ、（Ｃ）ＣＦＴ、および（Ｄ）α角度を測定する、用量反応。 血友病マウスの尾部切断出血モデルにおける急激な有効性の評価。 （Ａ）ｒＦＩＸＦｃまたはＢＥＮＥＦＩＸ（商標）により処置された個々のＢ型血友病マウスにおける尾部切断後の血液損失。（Ｂ）Ｂ型血友病マウスにおける尾部切断後の血液損失中央値におけるｒＦＩＸＦｃおよびＢＥＮＥＦＩＸ（商標）の用量反応。 Ｂ型血友病マウスの尾静脈切断（ＴＶＴ）出血モデル：重篤な血友病患者に特徴的な静脈出血のためのモデル。 全血ＲＯＴＥＭ（登録商標）による処置されたＢ型血友病マウスにおける、ＢＥＮＥＦＩＸ（商標）と比較したｒＦＩＸＦｃの長期活性。（Ａ）ＣＴ、（Ｂ）ＣＦＴ、（Ｃ）α角度、および（Ｄ）ＲＯＴＥＭ（登録商標）による全血凝固活性（ＣＴ）対ａＰＴＴによる血漿活性の部分相関。 Ｂ型血友病マウスの尾静脈切断（ＴＶＴ）出血モデルにおける、ＢＥＮＥＦＩＸ（商標）と比較したＦＩＸＦｃの長期有効性。（Ａ）生存：生存率は、ＴＶＴの７２時間前にｒＦＩＸＦｃを受容しているマウスとＴＶＴの２４時間前にＢＥＮＥＦＩＸ（商標）を受容しているマウスで同等であり、（Ｂ）再出血：出血率は、ＴＶＴの７２時間前にｒＦＩＸＦｃを受容しているマウスとＴＶＴの２４時間前にＢＥＮＥＦＩＸ（商標）を受容しているマウスで同等であった。 １２．５〜１００ＩＵ／ｋｇのｒＦＩＸＦｃの単回投与を受容した１２人の対象における、ｒＦＩＸＦｃ活性の増分回収率対体重の相関。 １週間に１回（Ａ）、１０日ごと（Ｂ）、または２週間ごと（Ｃ）の投与レジメン後、ベースラインよりも１ＩＵ／ｄＬ上のトラフに達するために、活性時間プロファイルを構築するためのｒＦＩＸＦｃ活性の構造的ＰＫモデルを用いた、モンテカルロシミュレーション。中央集団ＰＫパラメーターおよび関連する対象間および対象内の変動性を臨床第１／２ａ相試験から採用した。１０００人の対象が、各対象に対して１４〜１６のサンプリング点で、投与レジメンごとに想定され、１０００人の対象の活性−時間プロファイルの平均値±標準偏差が、異なる投与レジメンに対してグラフを使って構築された。 再計算された薬物動態データに基づいた、１ＩＵ／ｄＬ（１％）のトラフに達するためのｒＦＩＸＦｃ用量に対するモンテカルロシミュレーション。（Ａ）１週間に１回、（Ｂ）１０日ごと、および（Ｃ）２週間ごと。
本発明は、より長い投与間隔および／または現在知られている第ＩＸ因子製品を用いて可能であるよりも改善された薬物動態パラメーターを用いる、第ＩＸ因子欠損症、例えばＢ型血友病の第ＩＸ因子による治療方法を提供する。本発明はまた、改善された第ＩＸ因子キメラポリペプチド、第ＩＸ因子キメラポリヌクレオチド、および産生方法も提供する。
本明細書で使用される「投与」とは、薬剤的に許容される経路によって、薬剤的に許容される本発明の第ＩＸ因子ポリペプチドを対象に投与することを意味する。投与の好ましい経路は、静脈内であり、例えば中心静脈アクセスによる、例えば静脈内注射および静脈内注入である。投与のさらなる経路には、皮下、筋肉内、経口、経鼻、および肺投与が含まれ、好ましくは、皮下投与である。第ＩＸ因子キメラポリペプチドおよびハイブリッドタンパク質は、少なくとも１つの賦形剤を含む医薬組成物の一部として投与されてもよい。本発明の利点には、改善されたレジメンのコンプライアンス、破断出血の低下、出血からの関節保護の向上、関節損傷の予防、罹患率の低下、死亡率の低下、出血からの長期保護、血栓事象の低下、および改善された生活の質が含まれる。
本明細書で使用される「キメラポリペプチド」は、その中に、異なる源からの少なくとも２つのポリペプチド（または例えば部分配列もしくはペプチド等のその一部）を含むポリペプチドを意味する。キメラポリペプチドは、異なる遺伝子、異なるｃＤＮＡ、または異なる動物もしくは他の種等の異なる源からの２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、またはそれ以上のポリペプチドまたはその一部を含んでもよい。キメラポリペプチドは、異なるポリペプチドまたはその一部を連結する１つ以上のリンカーを含んでもよい。したがって、ポリペプチドまたはその一部は、単一のキメラポリペプチド内で直接連結され得るか、またはリンカーを介して、間接的に連結され得るか、あるいはそれらの両方であり得る。キメラポリペプチドは、さらなるペプチド、例えば、シグナル配列、ならびにタンパク質の精製または検出に役立つ６ＨｉｓおよびＦＬＡＧ等の配列等を含んでもよい。加えて、キメラポリペプチドは、Ｎおよび／またはＣ末端へのアミノ酸またはペプチド付加を有してもよい。本発明の例示的なキメラポリペプチドは、第ＩＸ因子ＦｃＲｎ ＢＰキメラポリペプチド、例えば、そのシグナル配列およびプロペプチドを含む、または、含まない、図１、配列番号２（表２）、および実施例１〜４のＦＩＸＦｃ等の第ＩＸ因子−Ｆｃキメラポリペプチドである。本発明の別の例示的なキメラポリペプチドとしては、第ＩＸ因子−ＸＴＥＮキメラポリペプチドが挙げられるが、これに限定されない。第ＩＸ因子は、ＸＴＥＮのＮ末端またはＣ末端のいずれかに融合することができる。
キメラポリペプチドは、表２Ａに示される第ＩＸ因子およびＦｃＲｎ ＢＰ、例えば、Ｆｃのアミノ酸配列でシグナル配列およびプロペプチド配列を含まない配列（配列番号２のアミノ酸１〜６４２）、または代わりに、プロペプチド配列を含む配列、または代わりに、シグナル配列およびプロペプチド配列を含む配列と、少なくとも９０％または少なくとも９５％または１００％同一である配列を含んでよい。
本明細書で使用される「培養する（Ｃｕｌｔｕｒｅ）」、「培養すること（ｔｏ ｃｕｌｔｕｒｅ）」、および「培養（ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ）」は、細胞増殖または細胞分割を可能にするインビトロ条件下で、細胞をインキュベートするか、または生存状態で細胞を維持することを意味する。本明細書で使用される「培養細胞」は、インビトロで増殖する細胞を意味する。
本明細書で使用される「第ＩＸ因子」および「ＦＩＸ」は、特に明記されない限り、凝血におけるその通常の役割において、機能的第ＩＸ因子ポリペプチドを意味する。したがって、用語第ＩＸ因子には、機能的である変異体ポリペプチド、およびそのような機能的変異体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが含まれる。好ましい第ＩＸ因子ポリペプチドは、ヒト、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、およびネズミ第ＩＸ因子ポリペプチドである。第ＩＸ因子の全長ポリペプチドおよびポリヌクレオチド配列は、多くの機能的変異体、例えば、フラグメント、突然変異体、および修飾された変形等が知られている。第ＩＸ因子ポリペプチドには、全長第ＩＸ因子、全長第ＩＸ因子からＮ末端のＭｅｔを引いたもの、全長第ＩＸ因子からシグナル配列を引いたもの、成熟第ＩＸ因子（シグナル配列およびプロペプチドを引いたもの）、およびＮ末端でさらにＭｅｔを有する成熟第ＩＸ因子が含まれる。第ＩＸ因子は、好ましくは、組み換え手段によって作製される（「組換え型第ＩＸ因子」または「ｒＦＩＸ」）、即ち、それは、自然発生でも、血漿由来でもない。
非常に多くの機能的第ＩＸ因子変異体が知られている。国際公開ＷＯ第０２／０４０５４４ Ａ３号（参照によってその全体が本明細書に組み込まれる）は、４頁の９〜３０行、および１５頁の６〜３１行で、ヘパリンによる阻害に対する耐性の増加を示す変異体を開示する。国際公開ＷＯ第０３／０２０７６４ Ａ２号（参照によってその全体が本明細書に組み込まれる）は、表２および３（１４〜２４頁）、および１２頁の１〜２７行で、Ｔ細胞免疫原性の低下を有する第ＩＸ因子変異体を開示する。国際公開ＷＯ第２００７／１４９４０６ Ａ２号（参照によってその全体が本明細書に組み込まれる）は、４頁の１行〜１９頁の１１行で、タンパク質安定性の増加、インビボおよびインビトロ半減期の増加、およびプロテアーゼに対する耐性の増加を示す、第ＩＸ因子の機能的変異体の分子を開示する。国際公開ＷＯ第２００７／１４９４０６ Ａ２号はまた、１９頁の１２行〜２０頁の９行で、第ＩＸ因子のキメラおよび他の変異体分子も開示する。国際公開ＷＯ第０８／１１８５０７ Ａ２号（参照によってその全体が本明細書に組み込まれる）は、５頁の１４行〜６頁の５行で、凝固活性の増加を示す第ＩＸ因子変異体を開示する。国際公開ＷＯ第０９／０５１７１７ Ａ２号（参照によってその全体が本明細書に組み込まれる）は、９頁の１１行〜２０頁の２行で、半減期の増加および／または回復の増加をもたらす、Ｎ結合型および／またはＯ結合型糖鎖付加部位数の増加を有する第ＩＸ因子変異体を開示する。国際公開ＷＯ第０９／１３７２５４ Ａ２号（参照によってその全体が本明細書に組み込まれる）はまた、２頁の段落［００６］〜５頁の段落［０１１］および１６頁の段落［０４４］〜２４頁の段落［０５７］で、糖鎖付加部位数の増加を有する第ＩＸ因子変異体も開示する。国際公開ＷＯ第０９／１３０１９８ Ａ２号（参照によってその全体が本明細書に組み込まれる）は、４頁の２６行〜１２頁の６行で、半減期の増加をもたらす、糖鎖付加部位数の増加を有する、機能的な第ＩＸ因子変異体の分子を開示する。国際公開ＷＯ第０９／１４００１５ Ａ２号（参照によってその全体が本明細書に組み込まれる）は、１１頁の段落［００４３］〜１３頁の段落［００５３］で、ポリマー（例えばＰＥＧ）の結合のために使用され得るＣｙｓ残基の数の増加を有する機能的な第ＩＸ因子変異体を開示する。
加えて、第ＩＸ因子における数百の非機能的変異体が、血友病患者において特定されており、これらの多くは、国際公開ＷＯ第０９／１３７２５４ Ａ２号（参照によってその全体が本明細書に組み込まれる）の１１〜１４頁の表１に開示される。そのような非機能的変異体は、本発明には含まれないが、どの変異が、機能的な第ＩＸ因子ポリペプチドをもたらす可能性が高く、または、低いかということについて、さらなるガイダンスを提供する。
第ＩＸ因子（またはキメラポリペプチドの第ＩＸ因子部分）は、表２Ａに示される第ＩＸ因子アミノ酸配列でシグナル配列およびプロペプチド配列を含まない配列（配列番号２のアミノ酸１〜４１５）、または代わりに、プロペプチド配列を含む配列、またはプロペプチドおよびシグナル配列を含む配列（全長第ＩＸ因子）と少なくとも９０％または少なくとも９５％または１００％同一であってもよい。
第ＩＸ因子の凝固活性は、国際単位（ＩＵ）として表される。第ＩＸ因子活性の１ＩＵは、正常ヒト血漿の１ミリリットル中の第ＩＸ因子の量にほぼ相当する。幾つかのアッセイが、第ＩＸ因子活性を測定するために利用可能であり、これには、一段階凝固アッセイ（活性部分トロンボプラスチン時間；ａＰＴＴ）、トロンビン生成時間（ＴＧＡ）、および回転トロンボエラストメトリー（ＲＯＴＥＭ（登録商標））が含まれる。例えば、実施例３を参照のこと。
本明細書で使用される「ＦｃＲｎ結合パートナー」または「ＦｃＲｎ ＢＰ」は、特に明記されない限り、機能的な新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）結合パートナーを意味する。ＦｃＲｎ結合パートナーは、ＦｃＲｎ受容体によって特異的に結合され得、その結果、ＦｃＲｎ受容体によって該ＦｃＲｎ結合パートナーが能動輸送される、任意の分子である。したがって、ＦｃＲｎ ＢＰという用語には、機能的であるＩｇＧ Ｆｃの任意の変異体が含まれる。例えば、ＦｃＲｎ受容体に結合するＩｇＧのＦｃ部分の領域は、Ｘ線結晶学に基づいて、記載されている（Ｂｕｒｍｅｉｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．１９９４，Ｎａｔｕｒｅ ３７２：３７９、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる）。ＦｃＲｎとＦｃの主な接触領域は、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインの接合部付近である。Ｆｃ−ＦｃＲｎ接点は全て、単一Ｉｇ重鎖内である。ＦｃＲｎ ＢＰは、ＩｇＧ全体、ＩｇＧのＦｃ断片、およびＦｃＲｎの完全結合領域を含む他の断片を含む。主な接触部位には、ＣＨ２ドメインのアミノ酸残基２４８、２５０〜２５７、２７２、２８５、２８８、２９０〜２９１、３０８〜３１１、および３１４、ならびにＣＨ３ドメインのアミノ酸残基３８５〜３８７、４２８、および４３３〜４３６が含まれる。免疫グロブリンまたは免疫グロブリン断片、あるいは領域のアミノ酸番号付けに対して行う言及は全て、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．１９９１，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ；ＭＤに基づき、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。（ＦｃＲｎ受容体は、ヒトを含む幾つかの哺乳類種から単離されている。ヒトＦｃＲｎ、ラットＦｃＲｎ、およびマウスＦｃＲｎの配列が知られている（Ｓｔｏｒｙ ｅｔ ａｌ．１９９４，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８０：２３７７）、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。）。ＦｃＲｎ ＢＰは、免疫グロブリンのＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを免疫グロブリンのヒンジ領域と共に、または、ヒンジ領域無しで含んでもよい。例示的なＦｃＲｎ ＢＰ変異体は、国際公開ＷＯ第２００４／１０１７４０号およびＷＯ第２００６／０７４１９９号に提供され、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。
ＦｃＲｎ ＢＰはまた、ＦｃＲｎに結合するアルブミンおよびその断片も含む。好ましくは、アルブミンは、ヒトアルブミンである。第ＩＸ因子アルブミン融合タンパク質の第ＩＸ因子要素が、酵素的に活性な前駆タンパク質転換酵素によって処理されて、処理された第ＩＸ因子含有ポリペプチドを得ることが可能である場合、第ＩＸ因子は、アルブミンのＮ末端またはアルブミンのＣ末端のいずれかに融合され得る。アルブミンの例、例えば、本発明で使用され得るその断片が、知られている。例えば、米国特許第７，５９２，０１０号、米国特許第６，６８６，１７９号、およびＳｃｈｕｌｔｅ，Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ
Ｒｅｓ．１２４ Ｓｕｐｐｌ．２：Ｓ６−Ｓ８（２００９）であり、これらのそれぞれは、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。
ＦｃＲｎ ＢＰ（またはキメラポリペプチドのＦｃＲｎ ＢＰ部分）は、１つ以上の変異、および変異の組み合わせを含有してもよい。
ＦｃＲｎ ＢＰ（またはキメラポリペプチドのＦｃＲｎ ＢＰ部分）は、Ｏｇａｎｅｓｙａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４６：１７５０（２００９）（参照によってその全体が本明細書に組み込まれる）に開示される、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ、およびその組み合わせ、ならびにＶａｃｃａｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：１２８３（２００５）（参照によってその全体が本明細書に組み込まれる）に開示される、Ｈ４３３Ｋ、Ｎ４３４Ｆ、およびその組み合わせ等の半減期の増加を与える変異、１〜２頁の段落［００１２］、および米国特許第２００９／０２６４６２７ Ａ１号の実施例９および１０（参照によってその全体が本明細書に組み込まれる）に開示される変異体、ならびに米国特許第２００９０１６３６９９ Ａ１号の２頁の段落［００１４］〜［００２１］（参照によってその全体が本明細書に組み込まれる）に開示される変異体を含んでもよい。
ＦｃＲｎ ＢＰ（またはキメラポリペプチドのＦｃＲｎ ＢＰ部分）はまた、以下の変異体も含んでよい。部位特異的変異形成等のよく認識される手法に従って、ＩｇＧのＦｃ領域を修飾して、ＦｃＲｎによって結合されるであろう修飾ＩｇＧまたはＦｃ断片またはその部分を得ることも可能である。そのような修飾には、ＦｃＲｎ接触部位から遠く離れた修飾、ならびにＦｃＲｎへの結合を保持するかまたは増進しさえする、接触部位内の修飾が含まれる。例えば、ＦｃＲｎへのＦｃ結合親和性を著しく損なうことなく、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ（Ｆｃｙ１）中の以下の単一アミノ酸残基を置換することも可能である：Ｐ２３８Ａ、Ｓ２３９Ａ、Ｋ２４６Ａ、Ｋ２４８Ａ、Ｄ２４９Ａ、Ｍ２５２Ａ、Ｔ２５６Ａ、Ｅ２５８Ａ、Ｔ２６０Ａ、Ｄ２６５Ａ、Ｓ２６７Ａ、Ｈ２６８Ａ、Ｅ２６９Ａ、Ｄ２７０Ａ、Ｅ２７２Ａ、Ｌ２７４Ａ、Ｎ２７６Ａ、Ｙ２７８Ａ、Ｄ２８０Ａ、Ｖ２８２Ａ、Ｅ２８３Ａ、Ｈ２８５Ａ、Ｎ２８６Ａ、Ｔ２８９Ａ、Ｋ２９０Ａ、Ｒ２９２Ａ、Ｅ２９３Ａ、Ｅ２９４Ａ、Ｑ２９５Ａ、Ｙ２９６Ｆ、Ｎ２９７Ａ、Ｓ２９８Ａ、Ｙ３００Ｆ、Ｒ３０１Ａ、Ｖ３０３Ａ、Ｖ３０５Ａ、Ｔ３０７Ａ、Ｌ３０９Ａ、Ｑ３１１Ａ、Ｄ３１２Ａ、Ｎ３１５Ａ、Ｋ３１７Ａ、Ｅ３１８Ａ、Ｋ３２０Ａ、Ｋ３２２Ａ、Ｓ３２４Ａ、Ｋ３２６Ａ、Ａ３２７Ｑ、Ｐ３２９Ａ、Ａ３３０Ｑ、Ａ３３０Ｓ、Ｐ３３１Ａ、Ｐ３３１Ｓ、Ｅ３３３Ａ、Ｋ３３４Ａ、Ｔ３３５Ａ、Ｓ３３７Ａ、Ｋ３３８Ａ、Ｋ３４０Ａ、Ｑ３４２Ａ、Ｒ３４４Ａ、Ｅ３４５Ａ、Ｑ３４７Ａ、Ｒ３５５Ａ、Ｅ３５６Ａ、Ｍ３５８Ａ、Ｔ３５９Ａ、Ｋ３６０Ａ、Ｎ３６１Ａ、Ｑ３６２Ａ、Ｙ３７３Ａ、Ｓ３７５Ａ Ｄ３７６Ａ、Ａ３７８Ｑ、Ｅ３８０Ａ、Ｅ３８２Ａ、Ｓ３８３Ａ、Ｎ３８４Ａ、Ｑ３８６Ａ、Ｅ３８８Ａ、Ｎ３８９Ａ、Ｎ３９０Ａ、Ｙ３９１Ｆ、Ｋ３９２Ａ、Ｌ３９８Ａ、Ｓ４００Ａ、Ｄ４０１Ａ、Ｄ４１３Ａ、Ｋ４１４Ａ、Ｒ４１６Ａ、Ｑ４１８Ａ、Ｑ４１９Ａ、Ｎ４２１Ａ、Ｖ４２２Ａ、Ｓ４２４Ａ、Ｅ４３０Ａ、Ｎ４３４Ａ、Ｔ４３７Ａ、Ｑ４３８Ａ、Ｋ４３９Ａ、Ｓ４４０Ａ、Ｓ４４４Ａ、およびＫ４４７Ａ。ここで、例えば、Ｐ２３８Ａは、位置番号２３８で野生型プロリンがアラニンによって置換されたことを示す。アラニンに加えて、他のアミノ酸が、上記に明記する位置で野生型アミノ酸を置換することも可能である。Ｆｃに単一変異を導入して、天然Ｆｃと異なる、１００を超えるＦｃＲｎ結合パートナーを生じることも可能である。さらに、これらの個々の変異のうちの２つ、３つ、またはそれ以上からなる組み合わせを、一緒に導入して、さらに数百のＦｃＲｎ結合パートナーを生じることも可能である。ある種のこれらの変異は、ＦｃＲｎ結合パートナーに新たな機能性を与えることも可能である。例えば、１つの実施形態は、Ｎ２９７Ａを取り込み、非常に保存されたＮ−グリコシル化部位を取り除く。この変異の影響は、免疫原性を減少させて、それによって、ＦｃＲｎ結合パートナーの循環半減期を向上させ、ＦｃＲｎ結合パートナーが、ＦｃＲｎへの親和性を損なうことなく、ＦｃｙＲＩ、ＦｃｙＲＩＩＡ、ＦｃｙＲＩＩＢ、およびＦｃｙＲＩＩＩＡに結合不能であるようにすることである（Ｒｏｕｔｌｅｄｇｅ ｅｔ ａｌ．１９９５，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ６０：８４７、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる；Ｆｒｉｅｎｄ ｅｔ ａｌ．１９９９，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ６８：１６３２、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる；Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．１９９５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：６５９１、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる）。さらに、少なくとも３つのヒトＦｃガンマ受容体が、ヒンジ領域下部内にあるＩｇＧ上の結合部位、一般には、アミノ酸２３４〜２３７を認識するようである。したがって、新規機能性および潜在的に減少した免疫原性の別の例は、この領域の変異から生じることも可能であり、例えば、ヒトＩｇＧ１のアミノ酸２３３〜２３６の「ＥＬＬＧ」を、ＩｇＧ２由来の対応する配列「ＰＶＡ」で置換することによって生じることも可能である（１つのアミノ酸欠失を伴う）。様々なエフェクター機能を仲介するＦｃｙＲＩ、ＦｃｙＲＩＩ、およびＦｃｙＲＩＩＩは、そのような転移が導入されるとき、ＩｇＧ１に結合しないことが示されている（Ｗａｒｄ ａｎｄ Ｇｈｅｔｉｅ １９９５，Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２：７７、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる；およびＡｒｍｏｕｒ ｅｔ ａｌ．１９９９，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９：２６１３、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる）。上記の変異から生じる新たな機能性のさらなる例として、幾つかの場合、ＦｃＲｎに対する親和性を、野生型のものより増加させることも可能である。この親和性の増加は、「オン」速度の増加、「オフ」速度の減少、または「オン」速度の増加および「オフ」速度の減少の両方を反映する可能性がある。ＦｃＲｎに対する親和性を増加させると考えられる変異には、Ｔ２５６Ａ、Ｔ３０７Ａ、Ｅ３８０Ａ、およびＮ４３４Ａが含まれる（Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．２００１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：６５９１、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる）。
ＦｃＲｎ ＢＰ（またはキメラポリペプチドのＦｃＲｎ ＢＰ部分）は、表２ＡまたはＢに示されるＦｃアミノ酸配列であってシグナル配列を含まない配列（配列番号２のアミノ酸１〜２２７）、または代わりに、シグナル配列を含む配列と少なくとも９０％または少なくとも９５％または１００％同一であってもよい。
本明細書で使用される「ハイブリッド」ポリペプチドおよびタンパク質は、キメラポリペプチドと第２ポリペプチドの組み合わせを意味する。ハイブリッドにおけるキメラポリペプチドおよび第２ポリペプチドは、電荷−電荷または疎水性相互作用等の非共有タンパク質−タンパク質相互作用を介して互いに会合し得る。ハイブリッドにおけるキメラポリペプチドおよび第２ポリペプチドは、ジスルフィド結合等の共有結合を介して互いに会合し得る。キメラポリペプチドおよび第２ポリペプチドは、非共有結合およびジスルフィド結合等の１種類よりも多い結合を介して互いに会合し得る。ハイブリッドは、国際公開ＷＯ第２００４／１０１７４０号、ＷＯ第２００５／００１０２５号、米国特許第７，４０４，９５６号、米国特許第７，３４８，００４号、およびＷＯ第２００６／０７４１９９号に記載されており、これらのそれぞれは、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。第２ポリペプチドは、同一のキメラポリペプチドの２つ目のコピーであっても、同一でないキメラポリペプチドであってもよい。好ましい実施形態において、第２ポリペプチドは、ＦｃＲｎ ＢＰ、例えばＦｃを含むポリペプチドである。好ましい実施形態において、キメラポリペプチドは、第ＩＸ因子−ＦｃＲｎ ＢＰ、例えば、第ＩＸ因子−Ｆｃキメラポリペプチドであり、第２ポリペプチドは、Ｆｃから本質的になる。例えば、図１、実施例１〜３、および表２（配列番号２および４）を参照のこと。例えば、米国特許第７４０４９５６号を参照されたく、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。
ハイブリッドにおける第２ポリペプチドは、表２Ｂに示されるアミノ酸配列であってシグナル配列を含まない配列（配列番号４のアミノ酸１〜２２７）、または代わりに、シグナル配列を含む配列と、少なくとも９０％または少なくとも９５％または１００％同一である配列を含んでも、配列から本質的になってもよい。
本発明のポリペプチドはまた、１つ以上のＸＴＥＮポリペプチドに融合される第ＩＸ因子も含む。Ｓｃｈｅｌｌｅｎｂｕｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２７：１１８６−９０（２００９）を参照されたく、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。第ＩＸ因子は、ＸＴＥＮポリペプチドのＮ末端またはＸＴＥＮポリペプチドのＣ末端のいずれかに融合され得る。ＸＴＥＮポリペプチドとしては、国際公開ＷＯ第２００９／０２３２７０号、ＷＯ第２０１０／０９１１２２号、ＷＯ第２００７／１０３５１５号、米国特許第２０１０／０１８９６８２号および米国特許第２００９／００９２５８２号に開示されるものが挙げられるが、これらに限定されず、これらのそれぞれは、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。
本明細書で使用される「投与間隔」は、対象に投与される複数回投与間で経過する時間を意味する。キメラＦＩＸ−ＦｃＲｎ ＢＰ、例えばキメラＦＩＸ−Ｆｃを用いる本発明の方法において、投与間隔は、ＦｃＲｎ ＢＰ、例えばＦｃ部分を含まない前記第ＩＸ因子（即ち、前記ＦＩＸからなるポリペプチド）の当量（ＩＵ／ｋｇ）に対して必要とされる投与間隔よりも少なくとも約１．５〜８倍長くてもよい。例えば、本発明の第ＩＸ因子−Ｆｃキメラポリペプチド（またはハイブリッド）を投与するとき、投与間隔は、ＦｃＲｎ
ＢＰ、例えばＦｃ部分を含まない前記第ＩＸ因子（即ち、前記ＦＩＸからなるポリペプチド）の当量に対して必要とされる投与間隔よりも少なくとも約１．５〜８倍長くてもよい。投与間隔は、例えば、Ｆｃ部分を含まない前記第ＩＸ因子（すなわち、前記第ＩＸ因子からなるポリペプチド）の当量に対して必要とされる投与間隔よりも少なくとも約１．５〜８倍長くてもよい。
幾つかの実施形態において、投与間隔は、６〜１８、６〜１０、９〜１８、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、または少なくとも１８日である。投与間隔は、１週間に少なくとも約１回であってもよく、６〜１０日、例えば約７〜１０、約７〜９、約７〜８、約８〜１０、約９〜１０、約６〜７、約８〜９、約６、約７、約８、約９、または約１０日であってもよい。
投与間隔は、９〜１８日、例えば、約９〜１７、約９〜１６、約９〜１５、約９〜１４、約９〜１３、約９〜１２、約９〜１１、約９〜１０日、約１０〜１８、約１１〜１８、約１２〜１８、約１３〜１８、約１４〜１８、約１５〜１８、約１６〜１８、約１７〜１８日、約１０〜１１、約１１〜１２、約１２〜１３、約１３〜１４、約１４〜１５、約１５〜１６、および約１６〜１７日、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、または約１８日であってもよい。投与間隔は、約１０〜１４日であってもよい。投与間隔は、約２週間ごと、または１ヶ月に２回であってもよい。投与間隔は、１８日より長い、例えば、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４、約３５、約３６、約３７、約３８、約３９、または約４０日であってもよい。投与間隔は、一定の間隔、例えば、２５〜５０ＩＵ／ｋｇにおいては７日、５０〜１００ＩＵ／ｋｇにおいては１０〜１３日、または１００〜１５０ＩＵ／ｋｇにおいては１４日であってもよい。一定の間隔および用量は、間隔および用量の組み合わせが、対象の集団または個人の対象において、少なくとも約１〜５、少なくとも約１〜３、少なくとも約１、少なくとも約２、または少なくとも約３ＩＵ／ｄＬのＦＩＸ活性のトラフをもたらすように、決定される。一定の投与間隔はまた、２０〜５０ＩＵ／ｋｇにおいては７日、５０〜１００ＩＵ／ｋｇにおいては１０〜１４日、１００〜１５０ＩＵ／ｋｇにおいては１４〜１６日、１０〜５０ＩＵ／ｋｇにおいては７日、１５〜１００ＩＵ／ｋｇにおいては１０〜１３日、または５０〜１５０ＩＵ／ｋｇにおいては１４〜１５日であってもよい。一定の投与間隔はまた、１０〜３０ＩＵ／ｋｇにおいては７日、１５〜５０ＩＵ／ｋｇにおいては１０日、２０〜７０ＩＵ／ｋｇにおいては１１日、２５〜８５ＩＵ／ｋｇにおいては１２日、３０〜１００ＩＵ／ｋｇにおいては１３日、４０〜１２５ＩＵ／ｋｇにおいては１４日、および５０〜１５０ＩＵ／ｋｇにおいては１５日であってもよい。
好ましい実施形態において、投与間隔は、２０ＩＵ／ｋｇで１週間に１回、４０ＩＵ／ｋｇで１０日ごと、または１００ＩＵ／ｋｇで２週間ごと（１ヶ月に２回）である。
投与間隔は、あるいは、その対象に関する薬物動態データまたは他の情報に基づいて、それぞれの対象に対して決定される個人に合わせた間隔であってもよい。個人に合わせた用量／投与間隔の組み合わせは、実施例に示されるように、前の段落における一定した間隔レジメンに対するものと同一であっても、異なってもよい。レジメンは、初めに、一定した投与間隔であってよく、その後、個人に合わせた投与間隔に変更してもよい。
本明細書で使用される「オンデマンド治療」は、短期間で行われることを意図され、出血症状等の現状、または予定されている手術等の予測される短期間の必要性に応える治療を意味する。オンデマンド治療を必要とし得る状態には、出血症状、関節血症、筋肉出血、口の出血、出血、筋肉への出血、口腔出血、外傷、頭部外傷（ｔｒａｕｍａ ｃａｐｉｔｉｓ）、胃腸出血、頭蓋内出血、腹腔内出血、胸腔内出血、骨折、中枢神経系の出血、咽頭後隙の出血、後腹膜腔内出血、または腸腰筋鞘（ｉｌｌｉｏｐｓｏａｓ ｓｈｅａｔｈ）内の出血が含まれる。これら以外の出血症状も含まれる。対象は、外科的予防、周術期の管理、または外科手術のための治療を必要とし得る。そのような外科手術には、簡単な外科手術、大外科手術、抜歯、扁桃摘出術、他の歯／胸〜顔の外科手術、鼠径ヘルニア切除術、滑膜切除術、人工膝関節置換術、他の人工関節置換術、開頭術、骨接合術、外傷外科手術、頭蓋内外科手術、腹腔内外科手術、胸腔内外科手術が含まれる。これら以外の外科手術も含まれる。オンデマンド治療を必要とし得るさらなる状態には、表２６に列記されるものが含まれる。
オンデマンド治療を必要とし得るさらなる状態には、軽度の出血、関節血症、筋肉表面の出血、軟組織出血、中等度の出血、切開による筋肉内もしくは軟組織出血、粘膜出血、血尿、重篤な出血、咽頭出血、咽頭後部の出血、腹腔後部の出血、中枢神経系の出血、打撲、切り傷、こすり傷、関節出血、鼻血、口の出血、歯茎の出血、頭蓋内出血、腹腔内出血、軽度の特発性出血、大外傷後の出血、中等度の皮膚打撲、または関節、筋肉、内臓器官、もしくは脳の特発性出血が含まれる。オンデマンド治療のさらなる理由には、外科手術または抜歯の周術期の管理、大外科手術、大規模な口腔外科手術、泌尿器外科手術、ヘルニア外科手術、膝、臀部、または他の大関節等の整形外科手術の必要性が含まれる。
薬物動態（ＰＫ）パラメーターには、特に示されていない限り、上記の用語、および当該技術分野でそれらの通常の意味を有する、以下の用語が含まれる。用語の幾つかは、実施例においてより詳細に説明される。ＰＫパラメーターは、ＦＩＸ抗原レベル（しばしば、「抗原」として本明細書で挿入句的に示される）またはＦＩＸ活性レベル（しばしば、「活性」として本明細書で挿入句的に示される）に基づき得る。文献では、一部の患者の血漿における内因性の不活性ＦＩＸの存在が、ＦＩＸに対する抗体を用いて投与された（即ち、外因性）ＦＩＸを測定する能力を妨げるため、ＰＫパラメーターは、しばしば、ＦＩＸ活性レベルに基づく。しかしながら、ＦＩＸが、ＦｃＲｎ ＢＰ等の異種ポリペプチドを含有する融合タンパク質の一部として投与されるとき、投与された（即ち、外因性）ＦＩＸ抗原は、異種ポリペプチドへの抗体を用いて、正確に測定することができる。加えて、ある種のＰＫパラメーターは、モデル予測データ（しばしば、「モデル予測」として本明細書で挿入句的に示される）または観察されたデータ（しばしば、「観察値」として本明細書で挿入句的に示される）に基づくことができ、好ましくは、観察されたデータに基づく。
本明細書で使用される「ベースライン」は、用量を投与する前、対象における最低の測定された血漿第ＩＸ因子レベルである。実施例１に記載されるヒト初回試験では、第ＩＸ因子の血漿レベルは、スクリーニング訪問時および投与直前の投与前の２つの時点で測定された。投与前時間は、計算の目的のために、即ち、「ベースラインを差し引いた」データを生成するために、０（ベースライン）として処理された。例えば、図４を参照のこと。あるいは、（ａ）処置前のＦＩＸ活性が１％未満であり、検出可能なＦＩＸ抗原がなく、ナンセンス遺伝子型を有する患者のベースラインは、０％として定義され、（ｂ）処置前のＦＩＸ活性が１％未満であり、検出可能なＦＩＸ抗原を有する患者のベースラインは、０．５％で設定され、（ｃ）処置前のＦＩＸ活性が１〜２％の間である患者のベースラインは、Ｃｍｉｎ（ＰＫ試験を通して最低活性）であり、（ｄ）処置前のＦＩＸ活性が２％以上である患者のベースラインは、２％である。投与前にベースラインよりも上の活性は、事前の治療からの薬物が残留していると考えられ、ベースラインまで減少させ、ｒＦＩＸＦｃ投与後、ＰＫデータから差し引かれた。実施例１１を参照のこと。
本明細書で使用される「血漿濃度対時間曲線下面積」（「ＡＵＣ」）は、投与後の第ＩＸ因子の消失の速度および程度に基づく。ＡＵＣは、１２、１８、２４、３６、４８、または７２時間等の特定の時間に関して決定され、または無限大については、曲線の傾きに基づいた外挿を用いて決定される。特に本明細書で特定されない限り、ＡＵＣは、無限大（ＡＵＣＩＮＦ）について決定される。ＡＵＣはまた、１用量当たりを基準に計算され得る。多くの他のＰＫパラメーターと同様に、ＡＵＣの決定は、単一対象または対象の集団において実行されることができ、対象の集団について、平均が計算される。実施例１では、患者集団において、ＡＵＣ／用量は、１ＩＵ／ｋｇ当たり３２．４４ＩＵ＊時間／ｄＬであり、個人の対象についてその範囲は、１ＩＵ／ｋｇ当たり２１．８０〜５４．３０ＩＵ＊時間／ｄＬであった（活性に基づく平均ＡＵＣ／用量については、表１３を参照のこと）。したがって、患者集団において、平均ＡＵＣ／用量は、１ＩＵ／ｋｇ当たり約２６〜４０、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４、約３５、約３６、約３７、約３８、約３９、または約４０ＩＵ＊時間／ｄＬであり得る。ＡＵＣ／用量および抗原に基づく他のＡＵＣパラメーターについては、表１４を参照のこと。
「生体内回収率」（「ＩＶＲ」）は、観察されたピーク活性から投与前レベルを差し引き、その用量で除算された、増分回収率（Ｋ値）によって示される。ＩＶＲはまた、実施例に記載されるような、百分率基準で計算されてもよい。明確にするために、単位（Ｋ値、すなわち、％に対して１ＩＵ／ｋｇ当たりＩＵ／ｄＬ）が、本明細書で使用される。平均ＩＶＲが、患者集団において決定され得るか、または個々のＩＶＲが、単一対象において決定され得る。実施例１に記載されるヒト初回試験に使用されたＦＩＸＦｃは、患者集団において、１ＩＵ／ｋｇ当たり約０．９３ＩＵ／ｄＬの平均ＩＶＲを示し、それぞれの対象におけるＩＶＲは、１ＩＵ／ｋｇ当たり０．６２〜１．１７ＩＵ／ｄＬの範囲であった（表１３）。したがって、本発明のキメラポリペプチドは、患者集団において、１ＩＵ／ｋｇ当たり０．８５〜１．１５（例えば、約０．８５、約０．８６、約０．８７、約０．８８、約０．８９、約０．９０、約０．９１、約０．９２、約０．９３、約０．９４、約０．９５、約０．９６、約０．９７、約０．９８、約０．９９、約１．０、約１．０５、約１．１０、約１．１５）の平均ＩＶＲ、および対象において、少なくとも約０．６、約０．７、０．８、約０．９、約１．０、約１．１、または約１．２ＩＵ／ｄＬのＩＶＲを示す。
本明細書で使用される「クリアランス率」（「ＣＬ」）は、薬物を消失する体の能力の尺度であり、時間と共に、薬物の除去された血漿の体積として表される。実施例１に記載される試験に使用されたＦＩＸＦｃは、約３．３６ｍＬ／時間／ｋｇの平均ＣＬを示し（表１３を参照）、これは、第ＩＸ因子（ＢＥＮＥＦＩＸ（商標））からなるポリペプチドのＣＬ（８．２ｍＬ／時間／ｋｇ）よりも約２．５倍低く、個々の対象におけるＣＬ値の範囲は、１．８４〜４．５８ｍＬ／時間／ｋｇであった。したがって、本発明のキメラポリペプチドは、集団において、３．０〜３．７２、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、または３．７２ｍＬ／時間／ｋｇの平均ＣＬを示す。抗原に基づくＣＬについては、表１４を参照のこと。
本明細書で使用される「平均滞留時間」（「ＭＲＴ」）は、体内の薬物分子の平均寿命の尺度である。実施例１に記載される試験に使用されたＦＩＸＦｃは、約６８．０５時間の平均ＭＲＴを示し（表１３を参照）、ＭＲＴ値の範囲は、個々の対象において、５３．１〜８５．８時間であった。したがって、本発明のキメラポリペプチドは、集団において、６０〜７８、約６０、約６２、約６４、約６６、約６８、約７０、約７２、約７４、約７６、または約７８時間の平均ＭＲＴ、および対象において、少なくとも約５０、約５５、約６０、約６５、約７０、約７５、約８０、約８５、または約９０時間のＭＲＴを示す。抗原に基づくＭＲＴに関しては、表１４を参照のこと。
本明細書で使用される「ｔ１／２β」または「ｔ１／２ベータ」、または「ベータＨＬ」は、消失相と関連する半減期であり、ｔ１／２β＝（ｌｎ２）／終末相と関連する消失速度定数である。実施例１に記載される試験では、使用されたＦＩＸＦｃは、患者集団において、約５２．５時間である平均ｔ１／２ｚを示し（表１３を参照）、個々の対象において、ｔ１／２β値の範囲は、４７〜６０時間であった。したがって、本発明のキメラポリペプチドは、約４７、約４８、約４９、約５０、約５１、約５２、約５３、約５４、約５５、約５６、約５７、約５８、約５９、または約６０時間を超える平均ｔ１／２βを示す。抗原に基づくｔ１／２βに関しては、表１４を参照のこと。
本明細書で使用される「トラフ」は、本発明のキメラポリペプチドまたは別の第ＩＸ因子の分子の用量を投与した後、およびもしあれば、次の用量が投与される前に達する、最低血漿第ＩＸ因子活性レベルである。トラフは、本明細書で「閾値」と互換的に使用される。ベースラインの第ＩＸ因子レベルは、測定された第ＩＸ因子レベルから差し引かれ、トラフレベルを計算する。幾つかの実施形態において、トラフは、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、または約１４日後、１〜５または１〜３ＩＵ／ｄＬである。幾つかの実施形態において、キメラポリペプチドの血漿レベルが、患者集団の少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または約１００％において、少なくとも約６日後、少なくとも約１ＩＵ／ｄＬの平均トラフに達するか、または対象において、少なくとも約６日後、少なくとも約１、２、３、４、または５ＩＵ／ｄＬのトラフに達する。幾つかの実施形態において、前記キメラポリペプチドの血漿レベルが、約１〜５または１〜３ＩＵ／ｄＬの平均トラフに達する。そのようなトラフまたは平均トラフは、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４、約３５、約３６、約３７、約３８、約３９、または約４０日後、達し得る。
本明細書で使用される「定常状態での分布容積（Ｖｓｓ）」は、薬物が分布する見かけのスペース（体積）である。Ｖｓｓ＝定常状態での血漿濃度で除算された体内の薬物量。実施例１では、集団において見出されるＶｓｓは、約２２６ｍＬ／ｋｇであり、対象についてその範囲は、約１４５〜３６５ｍＬ／ｋｇであった（表１３を参照）。したがって、患者集団において、平均Ｖｓｓは、２００〜３００、約２００、約２１０、約２２０、約２３０、約２４０、約２５０、約２６０、約２７０、約２８０、約２９０、または約３００ｍＬ／ｋｇであり得る。個々の対象におけるＶｓｓは、約１４５、約１５０、約１６０、約１７０、約１８０、約１９０、約２００、約２１０、約２２０、約２３０、約２４０、約２５０、約２６０、約２７０、約２８０、約２９０、約３００、約３１０、約３２０、約３３０、約３４０、約３５０、約３６０、または約３７０ｍＬ／ｋｇであり得る。抗原に基づくＶｓｓについては、表１４を参照のこと。
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、互換的に使用され、共有結合しているアミノ酸残基からなる高分子化合物を指す。
「ポリヌクレオチド」および「核酸」は、互換的に使用され、共有結合しているヌクレオチド残基からなる高分子化合物を指す。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、一本鎖、または二重鎖、ベクター、プラスミド、ファージ、またはウイルスであり得る。ポリヌクレオチドは、表２のポリペプチドをコードする表１にあるものを含む（表１を参照）。ポリヌクレオチドはまた、表１のポリヌクレオチドの断片、例えば、第ＩＸ因子、Ｆｃ、シグナル配列、プロペプチド、６Ｈｉｓおよび表２のポリペプチドの他の断片などの表２のポリペプチドの断片をコードするものも含む。
本明細書で使用される「予防的治療」は、対象の血漿中の第ＩＸ因子活性レベルを増加させるために、時間の経過と共に、対象に複数回投与で第ＩＸ因子ポリペプチドを投与することを意味する。好ましくは、増加したレベルは、突発性出血の発生を減少させる、または不慮の損傷の場合の出血を予防するのに十分である。予防的治療は、出血症状、例えば、オンデマンド治療下で記載されるものを減少または予防する。予防的治療は、例えば、患者間の変動性を補うために、「投与間隔」で論じられるように、一定であっても、個人に合わせてもよい。
本明細書で使用される「対象」は、ヒトまたは非ヒト哺乳動物を意味する。非ヒト哺乳動物には、マウス、イヌ、霊長類、サル、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ならびに他の家畜および小動物が含まれる。対象はまた、小児期のヒトも含む。小児期のヒト対象は、出生〜２０歳、好ましくは、出生〜１８歳、出生〜１６歳、出生〜１５歳、出生〜１２歳、出生〜１１歳、出生〜６歳、出生〜５歳、出生〜２歳、および２〜１１歳である。
本発明の方法は、出血または出血症状の制御または予防を必要とする対象において実行され得る。そのような対象には、軽度の出血、関節血症、筋肉表面の出血、軟組織出血、中等度の出血、切開による筋肉内もしくは軟組織出血、粘膜出血、血尿、重篤な出血、咽頭出血、咽頭後部の出血、腹腔後部の出血、中枢神経系の出血、打撲、切り傷、こすり傷、関節出血、鼻血、口の出血、歯茎の出血、頭蓋内出血、腹腔内出血、軽度の特発性出血、大外傷後の出血、中等度の皮膚打撲、または関節、筋肉、内臓器官、もしくは脳の特発性出血の制御または予防を必要とする者が含まれる。そのような対象はまた、外科手術または抜歯と関連する出血の管理等の周術期の管理を必要とする者も含まれる。
本明細書で使用される「治療用量」は、本明細書に記載される、治療の目的を達成する用量を意味する。血漿由来第ＩＸ因子（ｐｄＦＩＸ）の必要とされる投与量の計算は、平均して、体重１ｋｇ当たり１ＩＵのｐｄＦＩＸが、血漿第ＩＸ因子活性を約１ＩＵ／ｄＬ（１％）上昇させる、実証的事実に基づく。そのような方式で、必要とされる投与量は、以下の式を用いて決定される：

必要な単位＝体重（ｋｇ）×所望の第ＩＸ因子上昇（ＩＵ／ｄＬまたは正常値に対する％）×１（１ＩＵ／ｄＬ当たりＩＵ／ｋｇ）
例えば、実施例および図１に記載される、ＦＩＸＦｃが、ｐｄＦＩＸ（ＢＥＮＥＦＩＸ（商標）のものとは異なる）と同様の増分回収率を有するため、必要とされる用量は、上記の式を用いて決定されるか、またはそれを若干調節して決定される。様々なオンデマンド治療に必要とされる特定の推奨された用量については、表２６も参照のこと。ｐｄＦＩＸを用いる小児期の対象については、投与量ガイダンスは、成人と同様である。しかしながら、小児期の患者は、より低い増分回収率を有する場合があり、したがって、投与量は、上方に調節される必要があり得る。
本発明の方法に使用され得る治療用量は、１０〜１８０、２０〜１８０、または２５〜１８０ＩＵ／ｋｇであり、より具体的には、６〜１０日の投与間隔における好ましい用量は、以下の通りである：約２５〜１１０、約３０〜１１０、約４０〜１１０、約５０〜１１０、約６０〜１１０、約７０〜１１０、約８０〜１１０、約９０〜１１０、および約１００〜１１０；約３０〜１００、約３０〜９０、約３０〜８０、約３０〜７０、約３０〜６０、約３０〜５０、約３０〜４０ＩＵ／ｋｇ；約４０〜１１０、約５０〜１００、約６０〜９０、および約７０〜８０ＩＵ／ｋｇ；約４０〜５０、約５０〜６０、約６０〜７０、約７０〜８０、約８０〜９０、約９０〜１００、および約１００〜１１０ＩＵ／ｋｇ；約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０、約５５、約６０、約６５、約７０、約７５、約８０、約８５、約９０、約９５、約１００、約１０５、および約１１０ＩＵ／ｋｇ。６〜１０日の投与間隔には、１週間に１回の投与間隔が含まれる。６〜１０日、例えば、１週間に１回の投与間隔におけるさらなる治療用量には、２０〜５０、２０〜１００、および２０〜１８０ＩＵ／ｋｇ、より具体的には、６〜１０日、例えば、１週間に１回の投与間隔における好ましい用量は、以下の通りである：約２０〜１１０、約２０〜１００、約２０〜９０、約２０〜８０、約２０〜７０、約２０〜６０、約２０〜５０、約２０〜４０、約２０〜３０、約２０〜４０、および約２０ＩＵ／ｋｇ。実施例１０および１１も参照のこと。用量は、特定の患者において有効である場合、２０ＩＵ／ｋｇより低い、例えば、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、または約１９ＩＵ／ｋｇであってもよい。
９〜１８日、例えば、１ヶ月に２回の投与間隔における好ましい治療用量は、以下の通りである：約５０〜１８０、約６０〜１８０、約７０〜１８０、約８０〜１８０、約９０〜１８０、約１００〜１８０、約１１０〜１８０、約１２０〜１８０、約１３０〜１８０、約１４０〜１８０、約１５０〜１８０、約１６０〜１８０、および約１７０〜１８０ＩＵ／ｋｇ；約９０〜１７０、約９０〜１６０、約９０〜１５０、約９０〜１４０、約９０〜１３０、約９０〜１２０、約９０〜１１０、および約９０〜１００ＩＵ／ｋｇ；約１００〜１７０、約１１０〜１６０、約１２０〜１５０、および約１３０〜１４０ＩＵ／ｋｇ；約９０〜１００、約１００〜１１０、約１１０〜１２０、約１２０〜１３０、約１３０〜１４０、約１４０〜１５０、約１５０〜１６０、および約１６０〜１７０ＩＵ／ｋｇ；約６０、約７０、約８０、約９０、約９５、約１００、約１０５、約１１０、約１１５、約１２０、約１２５、約１３０、約１３５、約１４０、約１４５、約１５０、約１５５、約１６０、約１６５、約１７０、約１７５、および約１８０ＩＵ／ｋｇ。実施例１０および１１も参照のこと。
好ましい治療用量は、１０〜５０、１５〜１００、２０〜１００、２０〜５０、５０〜１００、１０、２０、４０、５０、および１００ＩＵ／ｋｇである。
治療用量は、約２０〜５０、約２０〜１００、約２０〜１８０、２５〜１１０、約３０〜１１０、約４０〜１１０、約５０〜１１０、約６０〜１１０、約７０〜１１０、約８０〜１１０、約９０〜１１０、約１００〜１１０、約３０〜１００、約３０〜９０、約３０〜８０、約３０〜７０、約３０〜６０、約３０〜５０、約３０〜４０ＩＵ／ｋｇ、約４０〜１１０、約５０〜１００、約６０〜９０、約７０〜８０ＩＵ／ｋｇ、約４０〜５０、約５０〜６０、約６０〜７０、約７０〜８０、約８０〜９０、約９０〜１００、約１００〜１１０ＩＵ／ｋｇ、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０、約５５、約６０、約６５、約７０、約７５、約８０、約８５、約９０、約９５、約１００、約１０５、および約１１０ＩＵ／ｋｇであってもよい。そのような用量は、約６〜１０、約７〜１０、約７〜９、約７〜８、約８〜１０、約９〜１０、約６〜７、約８〜９、約６、約７、約８、約９、および約１０日、ならびに１週間に１回の投与間隔において好ましい。
治療用量は、約９０〜１８０、約１００〜１８０、約１１０〜１８０、約１２０〜１８０、約１３０〜１８０、約１４０〜１８０、約１５０〜１８０、約１６０〜１８０、および約１７０〜１８０ＩＵ／ｋｇであってもよい。用量は、約９０〜１７０、約９０〜１６０、約９０〜１５０、約９０〜１４０、約９０〜１３０、約９０〜１２０、約９０〜１１０、および約９０〜１００ＩＵ／ｋｇであってもよい。用量は、約１００〜１７０、約１１０〜１６０、約１２０〜１５０、および約１３０〜１４０ＩＵ／ｋｇであってもよい。用量は、約９０〜１００、約１００〜１１０、約１１０〜１２０、約１２０〜１３０、約１３０〜１４０、約１４０〜１５０、約１５０〜１６０、および約１６０〜１７０ＩＵ／ｋｇであってもよい。用量は、約９０、約９５、約１００、約１０５、約１１０、約１１５、約１２０、約１２５、約１３０、約１３５、約１４０、約１４５、約１５０、約１５５、約１６０、約１６５、約１７０、約１７５、および約１８０ＩＵ／ｋｇであってもよい。そのような用量は、約９〜１８、約９〜１７、約９〜１６、約９〜１５、約９〜１４、約９〜１３、約９〜１２、約９〜１１、約９〜１０、約１０〜１８、約１１〜１８、約１２〜１８、約１３〜１８、約１４〜１８、約１５〜１８、約１６〜１８、約１７〜１８、約１０〜１１、約１１〜１２、約１２〜１３、約１３〜１４、約１４〜１５、約１５〜１６、および約１６〜１７日、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、および約１８日、１ヶ月に１回、および１ヶ月に２回（２週間ごと）の投与間隔において好ましい。
好ましい治療用量および投与間隔は、以下の通りである：１週間に１回２０ＩＵ／ｋｇ、１０日ごとに４０ＩＵ／ｋｇ、および２週間ごとに（１ヶ月に２回）１００ＩＵ／ｋｇ。用量および投与間隔のさらなる組み合わせには、：１用量少なくとも約５０ＩＵ／ｋｇおよび少なくとも約７日の投与間隔、１用量少なくとも約１００ＩＵ／ｋｇおよび少なくとも約９日の投与間隔、１用量少なくとも約１００ＩＵ／ｋｇおよび少なくとも約１２日の投与間隔、１用量少なくとも約１５０ＩＵ／ｋｇおよび少なくとも約１４日の投与間隔、２０〜５０または２０〜１００ＩＵ／ｋｇおよび前記投与間隔が１週間に１回であり、１用量２０〜５０ＩＵ／ｋｇおよび７日の投与間隔、１用量５０〜１００ＩＵ／ｋｇおよび１０〜１４日の投与間隔、または１用量１００〜１５０ＩＵ／ｋｇおよび１４〜１６日の投与間隔が含まれる。また、投与間隔および用量の好ましい組み合わせにはまた、７日間で１０〜５０ＩＵ／ｋｇ、１０〜１３日間で１５〜１００ＩＵ／ｋｇ、１４〜１５日間で５０〜１５０ＩＵ／ｋｇ、７日間で１０〜３０ＩＵ／ｋｇ、１０日間で１５〜５０ＩＵ／ｋｇ、１１日間で２０〜７０ＩＵ／ｋｇ、１２日間で２５〜８５ＩＵ／ｋｇ、１３日間で３０〜１００ＩＵ／ｋｇ、１４日間で４０〜１２５ＩＵ／ｋｇ、および１５日間で５０〜１５０ＩＵ／ｋｇが含まれる。
本明細書で使用される「変異体」とは、元のポリヌクレオチドまたはポリペプチドとは異なるが、その基本的な性質、例えば第ＩＸ因子の凝固活性またはＦｃ（ＦｃＲｎ結合）活性を維持する、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドを指す。概して、変異体は、全般的にほぼ同様であり、多くの領域では、元のポリヌクレオチドまたはポリペプチドと同一である。変異体には、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの断片、元のポリペプチドの欠失、挿入、および修飾された変形が含まれる。
変異体ポリヌクレオチドは、例えば、配列番号１または３におけるヌクレオチドコード配列（第ＩＸ因子部分、Ｆｃ部分、個別にもしくは一緒に）またはそれに相補的な鎖、本明細書で参照される刊行物および特許に開示されているもの等の公知の変異体および組換え型第ＩＸ因子またはＦｃのヌクレオチドコード配列またはそれに相補的な鎖、配列番号２または４のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（第ＩＸ因子部分、Ｆｃ部分、個別にもしくは一緒に）、ならびに／またはこれらの核酸分子のいずれかのポリヌクレオチド断片（例えば、本明細書に記載されるこれらの断片）と、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるヌクレオチド配列を含んでも、または代わりに、それらからなってもよい。また、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件または低ストリンジェントな条件下で、これらの核酸分子にハイブリダイズするポリヌクレオチドは、それらが機能的である限り、これらのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドと同様、変異体として含まれる。
変異体ポリペプチドは、例えば、配列番号２または４に示されるポリペプチド配列（第ＩＸ因子部分、Ｆｃ部分、個別にもしくは一緒に）、ならびに／またはこれらのポリペプチドのいずれかのポリペプチド断片（例えば、本明細書に記載されるこれらの断片）と、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一であるアミノ酸配列を含んでも、または代わりに、それらからなってもよい。
参照ヌクレオチド配列と、少なくとも、例えば、９５％「同一である」ヌクレオチド配列を有する核酸という表現によって、ヌクレオチド配列が参照ヌクレオチド配列の各１００ヌクレオチド当たり最大５個の点変異を含んでもよいことを除いては、核酸のヌクレオチド配列が、参照配列と同一であることが意図される。つまり、参照ヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を有する核酸を得るために、参照配列において、最大５％のヌクレオチドが、欠失されても、別のヌクレオチドと置換されてもよいか、あるいは、参照配列において、全ヌクレオチドの最大５％の多くのヌクレオチドが、参照配列に挿入されてもよい。クエリー配列は、例えば、配列番号１または３に示される配列全体、ＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）、または本明細書に記載されるように、特定される任意の断片であってもよい。
実際問題として、任意の特定の核酸分子またはポリペプチドが、本発明のヌクレオチド配列またはポリペプチドと少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるかどうかは、公知のコンピュータプログラムを用いて、通常決定することができる。グローバル配列アラインメントとしても称される、クエリー配列（参照または元の配列）と対象配列との間の最良の全体の一致を決定するための好ましい方法はまた、Ｂｒｕｔｌａｇらのアルゴリズムに基づいたＦＡＳＴＤＢコンピュータプログラムを用いて決定することができ（Ｃｏｍｐ．Ａｐｐ．Ｂｉｏｓｃｉ．（１９９０）６：２３７〜２４５）、これは、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。配列アラインメントでは、クエリーおよび対象配列は両方とも、ＤＮＡ配列である。ＲＮＡ配列は、Ｕ（ウリジン）をＴ（チミン）に転換することにより、比較することができる。前記グローバル配列アラインメントの結果は、パーセント同一性で表される。パーセント同一性を計算するためのＤＮＡ配列のＦＡＳＴＤＢアラインメントに使用される好ましいパラメーターは、以下である：マトリックス＝単一、ｋ−タプル＝４、ミスマッチペナルティ＝１、結合ペナルティ＝３０、ランダム化グループ長＝０、カットオフスコア＝１、ギャップペナルティ＝５、ギャップサイズペナルティ０．０５、ウィンドウサイズ＝５００または対象ヌクレオチド配列の長さのどちらか短い方。
対象配列が、内部欠失ではなく、５′または３′欠失のため、クエリー配列よりも短い場合、結果に手作業による補正を行わなければならない。これは、ＦＡＳＴＤＢプログラムが、パーセント同一性を計算するとき、対象配列の５′および３′短縮には対処しないためである。５′または３′末端で短縮された対象配列については、クエリー配列と比較して、一致／アラインされない、対象配列の５′および３′であるクエリー配列の塩基数をクエリー配列の総塩基のパーセントとして計算することによって、パーセント同一性が補正される。ヌクレオチドが、一致／アラインされるかどうかは、ＦＡＳＴＤＢ配列アラインメントの結果によって決定される。次いで、このパーセンテージは、パーセント同一性から減算され、特定のパラメーターを用いて上記のＦＡＳＴＤＢプログラムによって計算され、最終パーセント同一性スコアに到達する。この補正されたスコアは、本発明の目的のために使用されるものである。クエリー配列と一致／アラインされない、ＦＡＳＴＤＢアラインメントによって示される、対象配列の５′および３′塩基の外側の塩基のみが、パーセント同一性スコアの手作業による調節の目的のために計算される。
例えば、９０塩基の対象配列が、パーセント同一性を決定するために、１００塩基のクエリー配列とアラインされる。欠失は、対象配列の５′末端で起こり、それ故に、ＦＡＳＴＤＢアラインメントは、５′末端における最初の１０塩基の一致／アラインメントを示さない。１０個の不対塩基が、配列の１０％（一致しない５′末端および３′末端における塩基の数／クエリー配列における塩基の総数）を示すため、１０％が、ＦＡＳＴＤＢプログラムによって計算されたパーセント同一性スコアから減算される。残りの９０塩基が、完全に一致した場合、最終パーセント同一性は、９０％である。別の例では、９０塩基の対象配列が、１００塩基のクエリー配列と比較される。今回は欠失が内部欠失であり、その結果、クエリーと一致／アラインしない、対象配列の５′末端または３′末端上の塩基は存在しない。この場合、ＦＡＳＴＤＢによって計算されたパーセント同一性は、手作業で補正されない。再度、クエリー配列と一致／アラインしない、対象配列の塩基の５′および３′への塩基のみが、手作業で補正される。他の手作業の補正は、本発明の目的のためには行われない。
本発明のクエリーアミノ酸配列と、少なくとも、例えば、９５％「同一である」アミノ酸配列を有するポリペプチドという表現によって、対象ポリペプチド配列がクエリーアミノ酸配列の各１００アミノ酸当たり最大５個のアミノ酸の変化を含んでもよいこと以外は、対象ポリペプチドのアミノ酸配列が、クエリー配列と同一であることが意図される。つまり、クエリーアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るために、対象配列において、最大５％のアミノ酸残基が、挿入、欠失、（消失）、または別のアミノ酸で置換されてもよい。参照配列のこれらの変化は、参照アミノ酸配列のアミノ末端もしくはカルボキシ末端の位置で、またはこれらの末端間の任意の位置に、参照配列中の残基間でばらばらに、もしくは参照配列内の１つ以上の連続する残基の群としてのどちらかで散在して生じてもよい。
実際問題として、任意の特定のポリペプチドが、例えば、配列番号２（第ＩＸ因子部分、Ｆｃ部分、個々にもしくは一緒に）もしくは４のアミノ酸配列、または公知の第ＩＸ因子もしくはＦｃポリペプチド配列と、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるかどうかは、公知のコンピュータプログラムを用いて、通常決定することができる。グローバル配列アラインメントとしても称される、クエリー配列（参照または元の配列）と対象配列との間の最良の全体の一致を決定するための好ましい方法はまた、ＢｒｕｔｌａｇらのＣｏｍｐ．Ａｐｐ．Ｂｉｏｓｃｉ．６：２３７−２４５（１９９０）のアルゴリズムに基づいたＦＡＳＴＤＢコンピュータプログラムを用いて決定することができ、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。配列アラインメントでは、クエリーおよび対象配列は、両方ともヌクレオチド配列であるか、両方ともアミノ酸配列であるかのいずれかである。前記グローバル配列アラインメントの結果は、パーセント同一性で表される。ＦＡＳＴＤＢアミノ酸アラインメントにおいて使用される好ましいパラメーターは、以下である：マトリックス＝ＰＡＭ ０、ｋ−タプル＝２、ミスマッチペナルティ＝１、結合ペナルティ＝２０、ランダム化グループ長＝０、カットオフスコア＝１、ウィンドウサイズ＝配列長、ギャップペナルティ＝５、ギャップサイズペナルティ＝０．０５、ウィンドウサイズ＝５００または対象アミノ酸配列の長さのどちらか短い方。
対象配列が、内部欠失ではなく、Ｎ末端またはＣ末端欠失のため、クエリー配列よりも短い場合、結果に手作業による補正を行わなければならない。これは、ＦＡＳＴＤＢプログラムが、グローバルパーセント同一性を計算するとき、対象配列のＮ末端およびＣ末端短縮には対処しないためである。Ｎ末端およびＣ末端で短縮された対象配列については、クエリー配列と比較して、対応する対象残基と一致／アラインされない、対象配列のＮ末端およびＣ末端であるクエリー配列の残基数をクエリー配列の総塩基のパーセントとして計算することによって、パーセント同一性が補正される。残基が、一致／アラインされるかどうかは、ＦＡＳＴＤＢ配列アラインメントの結果によって決定される。次いで、このパーセンテージは、パーセント同一性から減算され、特定のパラメーターを用いて上記のＦＡＳＴＤＢプログラムによって計算され、最終パーセント同一性スコアに到達する。この最終パーセント同一性スコアは、本発明の目的のために使用されるものである。クエリー配列と一致／アラインされない、対象配列のＮ末端およびＣ末端に属する残基のみが、パーセント同一性スコアを手作業で調節する目的のためのものと見なされる。即ち、クエリー残基のみが、対象配列の最も遠いＮ末端およびＣ末端の残基の外側に位置合わせされる。
例えば、９０アミノ酸残基の対象配列が、パーセント同一性を決定するために、１００残基のクエリー配列とアラインされる。欠失は、対象配列のＮ末端で起こり、それ故に、ＦＡＳＴＤＢアラインメントは、Ｎ末端における最初の１０残基の一致／アラインメントを示さない。１０個の不対残基が、配列の１０％（一致しないＮ末端およびＣ末端における残基の数／クエリー配列における残基の総数）を示すため、１０％が、ＦＡＳＴＤＢプログラムによって計算されたパーセント同一性スコアから減算される。残りの９０残基が、完全に一致した場合、最終パーセント同一性は、９０％である。別の例では、９０残基の対象配列が、１００残基のクエリー配列と比較される。今回は欠失が内部欠失であり、その結果、クエリーと一致／アラインしない、対象配列のＮ末端およびＣ末端上の残基は存在しない。この場合、ＦＡＳＴＤＢによって計算されたパーセント同一性は、手作業で補正されない。再度、ＦＡＳＴＤＢアラインメントに示されるような、クエリー配列と一致／アラインしない、対象配列のＮ末端およびＣ末端の外側で位置合わせされる残基のみが、手作業で補正される。他の手作業の補正は、本発明の目的のためには行われない。
ポリヌクレオチド変異体は、コード領域、非コード領域、または両方に変化を含んでもよい。特に好ましいものは、サイレント置換、付加、または欠失を生じるが、コードされたポリペプチドの性質または活性は変えない改変を含む、ポリヌクレオチド変異体である。遺伝コードの縮重によるサイレント置換によって産生したヌクレオチド変異体が好ましい。さらに、５〜１０、１〜５、または１〜２個のアミノ酸が、任意の組み合わせで置換、欠失、または付加した変異体も好ましい。ポリヌクレオチド変異体は、例えば、特定の宿主に対してコドン発現を最適化すること（大腸菌等の細菌宿主によって好まれるものにヒトｍＲＮＡ中のコドンを変化させること）等の様々な理由で産生され得る。
自然に発生する変異体は、「対立遺伝子変異体」と呼ばれ、生物体の染色体上の特定の座を占める遺伝子の幾つかの代替形態の１つを指す（Ｇｅｎｅｓ ＩＩ，Ｌｅｗｉｎ，Ｂ．，ｅｄ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８５））。これらの対立変異体は、ポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドレベルで異なってよく、および本発明に含まれる。あるいは、自然に発生しない変異体は、突然変異誘発技法または直接合成によって産生してもよい。
タンパク質工学および組換えＤＮＡ技法の公知の方法を用いて、ポリペプチドの特徴を改善または改変するために変異体が作製されてもよい。例えば、生物学的機能の実質的な損失を伴わずに、分泌されたタンパク質のＮ末端またはＣ末端から、１つ以上のアミノ酸を欠失させることができる。Ｒｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２９８４−２９８８（１９９３）（参照によってその全体が本明細書に組み込まれる）の著者らは、３、８、または２７個のアミノ末端のアミノ酸残基を欠失した後でさえ、ヘパリン結合活性を有する変異体ＫＧＦタンパク質を報告した。同様に、インターフェロンガンマは、このタンパク質のカルボキシ末端から８〜１０個のアミノ酸残基を欠失した後、活性が最高１０倍まで高くなることが示された（Ｄｏｂｅｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７：１９９−２１６（１９８８）、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる）。
さらに、変異体が、多くの場合天然タンパク質のものと類似する生物活性を保持することを、十分な証拠が立証している。例えば、Ｇａｙｌｅと共同研究者ら（Ｊ． Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ． ２６８：２２１０５−２２１１１（１９９３）、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる）は、ヒトサイトカインＩＬ−１ａの大規模な変異分析を行った。彼らは、ランダムな突然変異誘発を利用して、分子全長にわたって、１変異体当たり平均２．５個のアミノ酸の変化がある、３，５００個を超える個々のＩＬ−１ａ変異体を作製した。起こり得る各アミノ酸位置について複数の突然変異を調べた。研究者らは、結合または生物活性のいずれかにほとんど影響することなく、分子の大部分が改変できることを見出した。（要約を参照）実際に、調べた３，５００個を超えるヌクレオチド配列のうち、わずか２３個のユニークなアミノ酸配列のみが、野生型の活性とは著しく異なるタンパク質を生じた。
上記のように、ポリペプチド変異体には、修飾されたポリペプチドが含まれる。修飾には、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトール（ｐｈｏｓｐｈｏｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ）の共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合による架橋の形成、システインの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、ガンマ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリスチル化、酸化、ペグ化、タンパク質分解プロセッシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、トランスファーＲＮＡが仲介するタンパク質へのアミノ酸の付加（例えば、アルギニル化）、およびユビキチン化が挙げられる。
「約」という用語は、ほぼ、およそ、大体、または〜の辺りを意味するために本明細書で使用される。「約」という用語が、数値域と併せて使用されるとき、これは、示された数値の上下の境界を拡大することによりその範囲を修飾している。一般に、「約」という用語は、１０％の分散により表示値よりも上下（より高いまたはより低い）に数値を修飾するために本明細書で使用される。
これまで詳細に本発明を説明してきたが、これの理解が以下の実施例への言及によりより明確になり、これらは、例示のみの目的で本明細書に含まれるが、本発明の限定を限定するものではない。本明細書で言及する全ての特許および刊行物は、参照により明示的に組み込まれる。

実施例１．ヒト初回（ＦｉＨ）試験
ヒト初回試験は、ＦＩＸＦｃ（組換え型ヒト凝固第ＩＸ因子融合タンパク質）の安全性、耐性、および薬物動態（ＰＫ）パラメーターを決定するために、非盲検第１／２相用量増加試験であった。ＦＩＸＦｃは、ヒトＩｇＧ１からのＦｃドメインに結合されるヒト凝固第ＩＸ因子を含む組換え融合タンパク質である。融合タンパク質は、ヒト胚腎臓細胞（ＨＥＫ２９３）中に発現される。実施例３を参照のこと。
ＦＩＸＦｃは、Ｂ型血友病（先天性第ＩＸ因子欠損症またはクリスマス病）を患っている患者における、外科手術設定における出血の制御および予防を含む、出血症状の制御および予防のために開発されている。
ＦＩＸＦｃは、凝固第ＩＸ因子（ＦＩＸ）およびヒト抗体（ＩｇＧ１イソタイプ）のＦｃドメインからなる組換え融合タンパク質である。ＦＩＸＦｃ分子はヘテロ二量体型であり、Ｆｃのヒンジ領域内の２つのジスルフィド結合によりＦＩＸＦの一本鎖（ＦＩＸＦｃ−ｓｃ）およびＦｃの一本鎖（Ｆｃ−ｓｃ）が一緒に結合される。図１および表２を参照のこと。
ｒＦＩＸＦｃ製剤は、静脈内（ＩＶ）投与を対象にした透明無色溶液である。ｒＦＩＸＦｃは、１０ｍＬの使い捨てのみのバイアル中に５ｍＬの体積当たり１０００ＩＵとして供給される。製剤は、ブロモブチル製のゴム栓および切り取り線のある普通のアルミニウムの封止用キャップを用いて、ＵＳＰのタイプＩガラス製バイアル中にパッケージ化される。ｒＦＩＸＦｃ製剤は、１４５ｍＭのＮａＣｌおよび０．１％ ポリソルベート２０を添加した１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．０中に２００ＩＵ／ｍＬ含有する。ｒＦＩＸＦｃ溶液は、希釈してはならない。
試験設計。重篤なＢ型血友病に罹患している合計１４人の以前に治療されたことのある患者が、登録され、約１０分間にわたって静脈内（ＩＶ）注入として、ＦＩＸＦｃにより治療された。６つの用量レベルの１、５、１２．５、２５、５０、および１００ＩＵ／ｋｇが、本研究において評価された。１、５、１２．５、および２５ＩＵ／ｋｇの用量レベルで１用量レベル当たり１人の患者が登録され、５０および１００ＩＵ／ｋｇで１用量レベル当たり少なくとも３人の評価可能な患者が登録された。
スクリーニング後（ＦＩＸＦｃ投与から１４日以内に予定された）、患者に対する治療期間を開始した。各用量レベルの治療期間には、１および５ＩＵ／ｋｇの用量レベルについてはＦＩＸＦｃの単回投与（１日目）から７２時間の安全性観察期間（３日）の完了まで、または１２．５〜１００ＩＵ／ｋｇの用量レベルの患者について最終ＰＫ試料が採取されるまで（約１０日）が含まれた。１、５、１２．５、または２５ＩＵ／ｋｇを用いて治療される患者が登録され、１ＩＵ／ｋｇから始めて逐次的に治療された。５０ＩＵ／ｋｇを受容している患者は、同日に治療されず、少なくとも１日あけて投与された。５０ＩＵ／ｋｇの患者の治療後、１００ＩＵ／ｋｇの患者の治療が開始された。
治療後期間は、患者がＦＩＸＦｃの投与を受けた日から始まる３０日の安全性観察期間であり、この期間中、患者がＰＫサンプリング等の必要とされる試験評価を受けるので、治療期間と重複した。
１２．５〜１００ＩＵ／ｋｇの用量レベルに割り当てられた患者は、血液試料を採取され、ＦＩＸ活性およびＦＩＸＦｃ濃度を評価された。血液試料は、ＦＩＸＦｃの投与直前、注入が終了してから１５分後、注入が終了してから１、３、６、９、２４、４８、７２、９６、１２０、１６８、および２４０時間後、またはベースラインＦＩＸレベルに達するまで採取された。患者が、２４０時間の時点（研究１１日目）でベースラインを超えるＦＩＸレベルを継続して有する場合、２８８時間（研究１３日目）で試料が採取され、ＦＩＸレベルが、研究１３日目でベースラインを超えた場合、３３６時間（研究１５日目）で試料が再度採取された。
患者１０は、投与後２１６時間で、予定されていたＦＩＸＦｃサンプリング前に、出血のためＢＥＮＥＦＩＸ（商標）治療を受けた。そのため、２１６時間およびその後の時点のＦＩＸＦｃ活性および抗原データは、分析から除外された。本研究の中間解析結果に影響を及ぼしたと思われるさらなる逸脱は起こらなかった。
第ＩＸ因子抗原については、薬物動態解析が、ＦＩＸＦｃの静脈内注入後、個々の患者に観察されたＦＩＸＦｃ濃度対時間データに行われた。一次解析は、モデル依存的方法を用いて行われた。ＦＩＸＦｃ濃度データは、初期パラメーター値の計算のために、ユーザ定義された初期パラメーターの推定値を用いて、中央コンパートメントからの消失を有する２コンパートメントオープンモデルにコンピュータで適合された。ＷｉｎＮｏｎｌｉｎで推定された微視的速度定数が生成され、ＦＩＸＦｃ濃度データが１／（Ｙ−ｈａｔ ＊Ｙ−ｈａｔ）の関数で加重された。２人の対象（例えば、患者５および６）について観察されたデータは、２コンパートメントモデルによって不適切に記載された。その結果として、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ非コンパートメント解析ＩＶ注入投与モデル（ＡＵＣの計算については、線形台形法則）を用いて、これらの２人の患者についてモデル非依存的解析が行われた。非コンパートメント解析については、半減期は、回帰状態の終末対数線形の減少を説明するデータ点を用いてβ相から計算された。最低３点を使用して、消失相を説明した。これは、ほぼ４〜１４日に生じた。抗原のＰＫ解析については、「ｍｇ／ｋｇ」用量当量が利用された。これらの値は、６０．２ＩＵ／ｍｇのＦＩＸＦｃの特定の活性に基づいて決定された。実際のサンプリング時間、用量、および注入期間が、計算のために使用された。名目サンプリング時間および用量が、表の作成および濃度−時間の図のために使用された。個々および平均ＰＫパラメーターおよび記述統計が示される。各コホートにおける対象の用量範囲および数が、有意な解析には小さすぎたため、正式な統計的解析は、行われなかった。
第ＩＸ因子活性については、ベースライン減算法が、ベースライン減算決定木に従って活性対時間プロファイルに適用された（図４）。１％未満の活性値は、ベースライン減衰について、１ＩＵ／ｄＬで定義された。投与前時間は、計算の目的のためにゼロとして処理された。加えて、ベースライン補正した活性データは、ベースラインレベルへの回帰を示した時点で切り捨てられた。薬物動態解析は、ＦＩＸＦｃの静脈内注入投与後に得られた、ベースラインを減算したＦＩＸ活性対時間データに行われた。モデル依存的評価は、静脈内注入投与群の解析のために利用された。ベースラインを減算したデータは、初期パラメーター値の計算のために、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎで定義されたパラメーターの境界を用いて、中央コンパートメントからの消失を有する２コンパートメントオープンモデルにコンピュータで適合された。ＷｉｎＮｏｎｌｉｎで推定された微視的速度定数が生成され、ＦＩＸＦｃ濃度データが１／（Ｙ−ｈａｔ ＊Ｙ−ｈａｔ）の関数で加重された。実際のサンプリング時間、用量、および注入期間が、計算のために使用された。名目サンプリング時間および用量が、表の作成および濃度−時間の図のために使用された。
実際のデータから得られないときは、ＦＩＸＦｃ活性レベル対時間データをシミュレートするためのＷｉｎＮｏｎｌｉｎが生成した微視的速度定数を用いて、ｒＦＩＸＦｃの投与から１６８時間後（Ｃ１６８）の活性およびベースラインよりも１ＩＵ／ｄＬ上に至るまでの時間（ＴＢＬＰ１）を得た。個々および平均ＰＫパラメーターおよび記述統計が、本実施例において示される。各コホートにおける対象の用量範囲および数が、有意な解析には小さすぎたため、正式な統計的解析は、行われなかった。
ＦＩＸＦｃ抗原薬物動態の結果は、ＦＩＸＦｃ血漿濃度が、ＦＩＸＦｃの短期ＩＶ注入後、急速に増加し、それぞれ、１２．５、２５、５０、および１００ＩＵ／ｋｇの名目用量レベルに対して１６７０（ｎ＝１）、２７３０（ｎ＝１）、７５１０±２４８０、および１５４００±３９６０ｎｇ／ｍＬの平均（±標準偏差）Ｃｍａｘ値を有し、全ての患者について開始から３０分以内に達したことを示した。全てのＦＩＸＦｃで治療した患者は、全身のＦＩＸＦｃ血漿曝露において、用量依存的な増加があった（ＣｍａｘおよびＡＵＣＩＮＦによって評価される）。１２．５および２５ＩＵ／ｋｇの名目用量で１人の評価可能な患者に限定されるが、ＣｍａｘおよびＡＵＣＩＮＦの両方において観察された増加は、評価された用量範囲について用量に対して適度に比例した。（表３は、個々の患者および群平均ＦＩＸＦｃ抗原濃度対時間データを示し、名目用量、実際の用量、注入期間、および患者番号別に分類される。表４は、個々の患者および群平均ＦＩＸＦｃ抗原の薬物動態の要約データを示し、個々の患者および群平均ＦＩＸＦｃ抗原の薬物動態の要約データを示し、名目用量、実際の用量、「ｍｇ／ｋｇ」用量当量、および患者番号別により分類される。表１１を参照のこと）。
ＦＩＸＦｃ血漿濃度は、短期ＩＶ注入後、二重指数関数的に低下した。分布（α）半減期値および消失（β）半減期値の両方は、個々の患者のαおよびβ半減期値が、それぞれ、９．７９〜２１．２時間および７１．０〜１４０時間の範囲である、評価された用量範囲にわたって用量非依存的であると思われた。５０および１００ＩＵ／ｋｇの名目用量レベルに対する平均α半減期値（±標準偏差）は、それぞれ、１３．１±４．７７および１２．１±２．３３時間であった。５０および１００ＩＵ／ｋｇの名目用量レベルに対する平均β半減期値（±標準偏差）は、それぞれ、１１０±２６．５および９５．８±１１．１時間であった。加えて、Ｃｌ、ＶＳＳ、およびＭＲＴの一次ＰＫパラメーター値が決定され、一般に、全てが、評価された用量範囲にわたって用量非依存的であると思われた。示されたように、この評価は、１２．５および２５ＩＵ／ｋｇの名目用量レベルでの１人の患者データによって限定される（表１２ならびに図２、７、および８）。
さらに、５０および１００ＩＵ／ｋｇの名目用量レベルに対する平均ＣＬ値は、それぞれ、２．２８±０．３７４および２．１１±０．４６４ｍＬ／ｈ／ｋｇであった。５０および１００ＩＵ／ｋｇの名目用量レベルに対する平均ＶＳＳ値は、それぞれ、２５９±７８．５および２３８±５２．２ｍＬ／ｋｇであった。加えて、５０および１００ＩＵ／ｋｇの名目用量レベルに対する平均ＭＲＴ値は、１１２±２１．５および１１４±１７．１時間であった。
ベースライン補正したＦＩＸＦｃ活性薬物動態の結果は、ＦＩＸＦｃ活性が、ＦＩＸＦｃの短期ＩＶ注入後、急速に増加し、それぞれ、１２．５、２５、５０、および１００ＩＵ／ｋｇの名目用量レベルに対して１１．９（ｎ＝１）、１９．９（ｎ＝１）、４１．６±８．９７、および９８．２±８．２１ＩＵ／ｄＬのモデル予測された平均Ｃｍａｘ値（±標準偏差）を有し、全ての患者について開始から３０分以内に達したことを示した。（表５は、名目用量、実際の用量、注入期間、および患者番号別に分類された、個々の患者および群平均のベースライン補正したＦＩＸＦｃ活性対時間データを示す。表６は、名目用量、実際の用量、「ｍｇ／ｋｇ」の等価用量、および患者番号別に分類された、個々の患者および群平均ＦＩＸＦｃ活性ＰＫの要約データを示す。）
全てのＦＩＸＦｃで治療した患者に用量依存的なＦＩＸ活性の増加があった（投与前ベースライン応答と比較して）。１２．５および２５ＩＵ／ｋｇの名目用量で１人の評価可能な患者に限定されるが、ＣｍａｘおよびＡＵＣＩＮＦの両方において観察された増加は、評価された用量範囲について用量に対して適度に比例した（表６、９、および１３ならびに図３および５）。
注入終了後、ベースライン補正したＦＩＸ活性の低下は、二重指数関数減衰を示し、急速な分布（α）相、続いて、対数線形消失（β）相によって特徴付けられた。α相の期間中、ＦＩＸＦｃ活性の低下速度は、０．１４０〜１６．６時間の範囲に及ぶ、個々の患者のα半減期値と共に可変的であった。一見したところ、平均α半減期値の用量依存的な増加は、１２．５および２５ＩＵ／ｋｇの名目用量レベルで１人の患者により予想を裏切られた。対照的に、消失（β）半減期値は、２５〜１００ＩＵ／ｋｇの用量範囲にわたって、個々の患者のβ半減期値は４２．１〜６７．４時間の範囲であり、この用量範囲にわたって用量非依存的であるように思われた。推定され、報告されたが、１２．５ＩＵ／ｋｇのｒＦＩＸＦｃにより治療された患者１の消失半減期は、この患者のＦＩＸレベルが最長９６時間までのみ検出可能であり、短縮された終末相をもたらし、終末消失半減期の過小評価の一因となるため、要約の評価に含まれない。５０および１００ＩＵ／ｋｇの名目用量レベルに対する平均β半減期値（±標準偏差）は、それぞれ、５２．１±１０．４および５２．５±１０．１時間であり、２５、５０、および１００ＩＵ／ｋｇを組み合わせた名目用量に対しては、５２．５±９．２（範囲４０〜６７．４）時間であった（表６、８、および１３）。
加えて、Ｃｌ、Ｖ１、ＶＳＳ、およびＭＲＴに対する一次ＰＫパラメーター値が決定され、一般に、全ては、評価された用量範囲にわたって用量非依存的であるように思われた。
さらに、５０および１００ＩＵ／ｋｇの名目用量レベルに対する平均Ｃｌ値は、それぞれ、３．７７±１．１２および２．８９±０．６１５ｍＬ／時間／ｋｇであり、２５、５０、および１００ＩＵ／ｋｇを組み合わせた名目用量に対しては、３．３６±０．９２８ｍＬ／時間／ｋｇであった（表６、８、および１３）。
５０および１００ＩＵ／ｋｇの名目用量レベルに対する平均ＶＳＳ値は、それぞれ、２６４±７７．６および１７９±３１．１ｍＬ／ｋｇであり、２５、５０、および１００ＩＵ／ｋｇを組み合わせた名目用量に対しては、２２６±６９．８ｍＬ／ｋｇであった。（表６、８、および１３）。加えて、５０および１００ＩＵ／ｋｇの名目用量レベルに対する平均ＭＲＴ値は、それぞれ、７１．７±１３．０および６２．８±８．８２時間であり、２５、５０、および１００ＩＵ／ｋｇを組み合わせた名目用量に対しては、６８．０５±１１．１６時間であった。（表６、８、および１３）。
一次ＰＫパラメーターに加えて、二次ＰＫパラメーター（例えば、Ｃ１６８、Ｋ値、ＩＶＲ等）を決定して、ＦＩＸＦｃ効果の持続時間を評価した。予想される通りに、Ｃ１６８、ＴＢＬＰ１、ＴＢＬＰ３、およびＴＢＬＰ５値において、用量依存的な増加が、観察された。対照的に、Ｋ値およびＩＶＲ値は、評価された用量範囲にわたって用量非依存的であるように思われた。全用量範囲にわたって、個々の患者のモデル予測および観察されたＫ値は、それぞれ、１ＩＵ／ｋｇ当たり０．６１〜１．０２および０．６２〜１．１７ＩＵ／ｄＬであった。５０および１００ＩＵ／ｋｇの名目用量レベルに対するモデル予測された平均Ｋ値は、それぞれ、１ＩＵ／ｋｇ当たり０．７６および０．９０ＩＵ／ｄＬであり、２５、５０、および１００ＩＵ／ｋｇを組み合わせた名目用量に対しては、１ＩＵ／ｋｇ当たり０．８２１±０．１３８７（範囲０．６１〜１．０２）ＩＵ／ｄＬであった。５０および１００ＩＵ／ｋｇの名目用量レベルに対するモデル予測された平均ＩＶＲ値は、それぞれ、３４．５および３５．１％であった。５０および１００ＩＵ／ｋｇの名目用量レベルに対する観察された平均Ｋ値は、それぞれ、１ＩＵ／ｋｇ当たり０．８６および１．０２ＩＵ／ｄＬであり、２５、５０、および１００ＩＵ／ｋｇを組み合わせた名目用量に対しては、１ＩＵ／ｋｇ当たり０．９２６±０．１７８７（範囲０．９７〜１．１７）ＩＵ／ｄＬであった。５０および１００ＩＵ／ｋｇの名目用量レベルに対する観察された平均ＩＶＲ値は、それぞれ、３９．２および３９．８％であった（表６、７、８、および１３）。表７Ａ〜７Ｂは、名目用量、実際の用量、および患者番号別に分類された、個々の患者および群平均ＦＩＸＦｃ活性二次ＰＫの要約データを示す。
注入されたｒＦＩＸＦｃは、１ＩＵ／ｋｇごとに血漿ＦＩＸ活性を平均で０．９３±０．１８ＩＵ／ｄＬ上昇させ、この増分回収率（Ｋ値）は、体重と弱い正の相関を示した（Ｒ２＝０．３３６、ｐ＝０．０４８）（図２３）。
ＦＩＸＦｃ活性の薬物動態の推定値は、ｒＦＩＸＦｃ抗原のものと一致した（例えば、表１３および１４を比較）。さらに、ｒＦＩＸＦｃインビボ活性の保持を示す、ｒＦＩＸＦｃ活性と抗原レベルとの間に卓越した相関があった（図９）。加えて、ＢＥＮＥＦＩＸ（商標）（Ｗｙｅｔｈ）の過去のデータと比較して、ｒＦＩＸＦｃは、以下の通りに示した（表８）：
２５〜１００ＩＵ／ｋｇの用量線形性
ｔ１／２βの３倍の増加
平均滞留時間の３倍の増加
２４％改善された増分回収率
クリアランスの２．５倍の低下
ＦＩＸＦｃは、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインに結合したＦＩＸからなる組換え融合タンパク質である。ＦＩＸＦｃは、ＦＩＸの長時間作用型バージョンであるように設計されている。ＦＩＸＦｃを用いた前臨床研究は、市販の組換え型ＦＩＸ製品のＢＥＮＥＦＩＸ（商標）と比較して、ＦＩＸ活性の半減期の延長を示している。本研究の理論的根拠は、重篤なＢ型血友病患者における、ＦＩＸＦｃの安全性およびＰＫを評価することであった。本研究のために、１８〜７６歳の１２人の評価可能な対象が、ＰＫ評価に利用できた。各対象は、約１０分間静脈内注入により体重に対して１２．５、２５、５０、または１００ＩＵ／ｋｇの名目用量でＦＩＸＦｃの単回投与を受けた。ＦＩＸＦｃ活性および抗原濃度の両方のＰＫ評価のために血漿試料を、注入前、ならびに投与から１４日後まで得た。ＦＩＸＦｃ抗原および活性の両方の薬物動態は、本研究において、モデル依存的およびモデル非依存的方法を用いて、独立して特徴付けられた。
ＦＩＸＦｃは、体重に対して１２．５、２５、５０、および１００ＩＵ／ｋｇの単回ＩＶ用量の投与後、良好な忍容性を示した。本研究において、薬物関連の重篤な副作用の兆候はなかった。ｒＦＩＸＦｃに対する中和または結合抗体は、いかなる対象においても検出されなかった。
ＣｍａｘおよびＡＵＣＩＮＦにおけるほぼ用量に比例した増加が、１２．５〜１００ＩＵ／ｋｇの用量の投与後、ＦＩＸＦｃ抗原および活性の両方について観察されたが、ＶおよびＣｌは、全ての用量にわたって同様であった。これらの結果は、ＦＩＸＦｃ抗原および活性が、評価された用量範囲にわたって線形薬物動態を示したことを示す。比較的小さいＶパラメーター値は、ＦＩＸＦｃが、間質液に侵入するが、細胞膜を通過して細胞内液まで至ってはいないことを示し得る。
ＦＩＸＦｃ抗原および活性のピーク血漿レベルは、注入終了後０．５時間以内に観察され、投与後数日間検出可能であった。クリアランス低下および半減期の延長の証拠が、ＦＩＸＦｃ抗原および活性の両方において観察された。
５０および１００ＩＵ／ｋｇの用量レベルにおけるＦＩＸＦｃ抗原濃度と関連する平均クリアランスおよび終末消失半減期の値は、それぞれ、２．２８および２．１１ｍＬ／時間／ｋｇならびに１１０および９５．８時間であった。同様に、同一の用量範囲にわたるＦＩＸＦｃ活性レベルと関連する平均クリアランスおよび終末消失半減期の値は、それぞれ、３．７７および２．８９ｍＬ／時間／ｋｇならびに５２．１および５２．５時間であった。ＢＥＮＥＦＩＸ（商標）活性に対して報告されたＰＫ（２００９年１１月１８日付のＢＥＮＥＦＩＸ（商標）の製品概要）との、本研究において観察されたＦＩＸＦｃ活性ＰＫの結果の比較は、ＢＥＮＥＦＩＸ（商標）と比較して、ＦＩＸＦｃクリアランスの約３倍の低下ならびにＦＩＸＦｃ終末消失半減期および平均滞留時間の両方の約３倍の増加を示した。
ＰＫにおける観察された改善により、ＦＩＸＦｃは、出血からの長期保護を提供し、Ｂ型血友病に罹患している個人について、注射頻度の低下を可能にする。この試験の結果に基づいて、ｒＦＩＸＦｃは、１００ＩＵ／ｋｇの用量を用いて、２週間ごとまたは１ヶ月に２回、およびより低い用量を用いて少なくとも１週間に１回投与され得る。そのようなレジメンは、より少ない注射を必要とする。加えて、ｒＦＩＸＦｃの使用は、 中心静脈アクセス、改善されたレジメンのコンプライアンス、破断出血の低下、および出血からの関節保護の増加等の他の潜在的な臨床的影響を有する。
実施例２．Ｂ−ＬＯＮＧの第１／２／３相試験
これは、重篤なＢ型血友病に罹患している以前に治療されたことのある対象における、出血の保護および治療時の組換え型長時間作用型凝固第ＩＸ因子Ｆｃ融合（ｒＦＩＸＦｃ）の安全性、薬物動態、および有効性の非盲検多施設評価である。現在市販されているＦＩＸ製品による治療は、１週間に２〜３回の投与を必要とする。１週間に１回またはそれより長くまで所要投与間隔を延長する長期間の半減期を有する製品が、重篤な血友病患者の治療のために著しい改善として医学界で検討されている。
臨床的予防研究において、用量レベルは、ｒＦＩＸ製品について大きく異なる： 報告された用量は、１０〜１７１ＩＵ／ｋｇ（Ｒｏｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ９８：３６００（２００１））または４０〜１００ＩＵ／ｋｇ （ＭＡＳＡＣ Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎ １７７，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ（Ｏｃｔ．２００６））である。さらに、出血の臨床的兆候のない対象における、予防治療中のＦＩＸ活性のトラフレベルは、０．２〜３．８ＩＵ／ｄＬの範囲であると予測される（Ｃａｒｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ ４：８３（１９９８））。患者個人間の変動性を考慮して、患者の臨床状態に基づいた個人に合わせた用量レジメンが、一般的な慣行である。
ｒＦＩＸＦｃの冷凍液剤の単回投与の安全性および薬物動態を評価する第１／２ａ相試験の結果（実施例１）は、薬物が１〜１００ＩＵ／ｋｇの範囲に及ぶ用量で忍容性が良好であることを示し、ＰＫ特性が現在利用可能な治療を超える幾つかの利点、即ち、ＢＥＮＥＦＩＸ（商標）に対して以前に報告されたものよりも３倍長い半減期およびＭＲＴ（６１時間対１９時間）を示唆している。本研究の目的は、ヒトにおける凍結乾燥されたｒＦＩＸＦｃのＰＫパラメーターの推定値を予測決定すること、ヒトにおけるＢＥＮＥＦＩＸ（商標）ＰＫパラメーターの推定値とこれらを比較することと、ならびに出血の予防および治療時の凍結乾燥されたｒＦＩＸＦｃの有効性および重篤なＢ型血友病に罹患している以前に治療されたことのある対象に対するその反復投与の安全性を示すことである。
本研究は、４つの治療群：低用量の予防レジメン（ｎ＝２５）、高用量の予防レジメン（ｎ＝２５）、オンデマンドレジメン（ｎ＝２０）、および大外科手術レジメン（ｎ＝５）を必要とする。低用量のレジメン治療群は、ＢＥＮＥＦＩＸ（商標）による投与後、ｒＦＩＸＦｃとの交差混合を有するＰＫ亜群（ｎ＝１６）を含む。
本研究の第１の目的は、全ての治療群におけるｒＦＩＸＦｃの安全性および忍容性を評価すること、全ての治療群におけるｒＦＩＸＦｃの有効性を評価すること、ならびにオンデマンド療法について予防効果を評価すること（治療群１および２対オンデマンドレジメン治療群３の間での出血症状の年率の比較）である。
本研究の第２の目的は、ｒＦＩＸＦｃおよびＢＥＮＥＦＩＸ（商標）のＰＫパラメーターの推定値を比較すること、オンデマンドおよび外科手術治療群におけるｒＦＩＸＦｃの有効性を評価すること、ＰＫ亜群におけるベースラインおよび２６週目（±１週間）のｒＦＩＸＦｃのＰＫパラメーターの推定値を評価し、比較すること、全ての治療群における治療に対する対象の応答を評価すること、ならびに全ての治療群におけるｒＦＩＸＦｃの消費量を評価することである。
主な組み入れ基準：
１２歳以上の少なくとも４０ｋｇの体重のある男性
Ｂ型血友病（２％以下のベースライン第ＩＸ因子レベル）であると診断される
いかなる第ＩＸ因子製品に対して少なくとも１００日の曝露日の経歴
血小板数が１００，０００細胞／μＬ以上
試験室の正常範囲によって定義される、１．４０以下のＩＮＲ（国際標準比）
ＣＤ４数が２００細胞／μＬ以上
主な除外基準：
第ＩＸ因子インヒビターの経歴
腎臓または肝機能障害
Ｂ型血友病以外の別の凝固障害であると診断される
いかなるＦＩＸまたはＩＶ免疫グロブリン投与に伴うアナフィラキシーの前歴
全身免疫抑制薬を摂取（例えば、全身性コルチコステロイド；しかしながら、ＨＡＡＲＴ（高活性抗レトロウイルス療法）は認められる）
実施例３．ＨＥＫ２９３細胞におけるＦＩＸＦｃ産生
ＦＩＸＦｃは、ＦＩＸＦｃ（Ｆｃ領域に直接融合される天然ＦＩＸ）の発現カセットおよびＦｃのみの発現カセットを含む安定にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞中で産生された。細胞はまた、ＦＩＸプロペプチドの全てのプロセシングを可能にするプロセシング酵素である、ＰＣ５の発現カセットでもトランスフェクトされた。トランスフェクトされた細胞は、ビタミンＫを含有する無血清懸濁培地中で増殖し、それらは、３つのタンパク質：ＦＩＸＦｃダイマー、ＦＩＸＦｃモノマー（１本のＦＩＸＦｃ鎖および１本のＦｃ鎖）、Ｆｃダイマーを分泌した。ＦＩＸＦｃモノマー（「ＦＩＸＦｃ」）は、カラムクロマトグラフィー（プロテインＡ、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＤＥＡＥ、および低イオン強度のＣａＣｌ２により溶出した擬似親和性のＱセファロース）によって精製し、ヒト対象への投与のために、ウイルス不活性化、および濾過された。Ｐｅｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２０１０ Ｍａｒ １１；１１５（１０）：２０５７−６４（Ｅｐｕｂ ２０１０ Ｊａｎ ７）、および米国特許第７，５６６，５６５号も参照されたく、これらのそれぞれは、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。
ＦＩＸＦｃの凝固活性は、ＭＬＡ Ｅｌｅｃｔｒａ １６００Ｃ（Ｍｅｄｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ／Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｌａｂｓ，Ｐｌｅａｓａｎｔｖｉｌｌｅ，ＮＹ）を用いて、ＦＩＸ欠損血漿の凝固活性を回復されるその能力を定量化することによって測定された。結果は、世界保健機関のＦＩＸ標準品の連続希釈を用いて生成した較正曲線と比較された。
第ＩＸ因子のセリンリン酸化およびチロシン硫酸化は、生体内回収において重要であると考えられている。ＭＯＮＯＮＩＮＥ（商標）（ＣＳＬ Ｂｅｒｈｉｎｇにより市販されている血漿を精製した第ＩＸ因子（ｐｄＦＩＸ））が、ＭＯＮＯＮＩＮＥ（商標）のより高いリン酸化／硫酸化レベル（＞９０％／＞９０％対＜１０％／５％）のため、ＢＥＮＥＦＩＸ（商標）（Ｗｙｅｔｈにより市販されている組換え型ＦＩＸ（ｒＦＩＸ））よりもより良好な生体内回収率を有することが報告されている。しかしながら、ＨＥＫ２９３細胞中で産生されたＦＩＸＦｃは、ほとんどリン酸化／硫酸化（＜１０％／４％、これは、ＢＥＮＥＦＩＸ（商標）と非常に類似している）がなく、ＢＥＮＥＦＩＸ（商標）（０．７）よりも良好なＩＶＲ（１ＩＵ／ｋｇ当たり１．０ＩＵ／ｄＬ）を示す。
加えて、上記のように産生されたＦＩＸＦｃは、ＭＯＮＯＮＩＮＥ（商標）（ｐｄＦＩＸ）またはＢＥＮＥＦＩＸ（商標）（ｒＦＩＸ）（０．１％）のいずれかよりも、著しく低い（１０〜１００倍）レベル（０．０１〜０．００１％）の製品関連の不純物である活性化ＦＩＸ（ＦＩＸａ）を有した。得られたＦＩＸＦｃは、投与時、ＭＯＮＯＮＩＮＥ（商標）またはＢＥＮＥＦＩＸ（商標）よりも望ましくない血栓事象が少ない。
実施例４．小児科研究：成人および小児科集団における発達間の外挿および相互関係
ＦＩＸ薬物動態との関係を示す患者特性には、年齢によって異なる生理的変化（Ｂｊoｒｋｍａｎ ａｎｄ Ｂｅｒｎｔｏｒｐ，Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ４０：８１５−３２（２００１）；およびＢｊｏｒｋｍａｎ，Ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ ９（ｓｕｐｐｌ １）：１０１−１０（２００３））、ならびに体の大きさおよび構成（Ｓｈａｐｉｒｏ，Ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ １１：５７１−８２（２００５））が含まれる。したがって、ＦＩＸの体重によって調整されたクリアランス（ＣＬ）は、概して、幼年期から成人期への成長期間中、年齢および／または体重と共に減少し、対応して終末相半減期（ｔｌ／２）が増加することが分かっている。ｒＦＩＸ製品（ＢＥＮＥＦＩＸ（商標））については、ＣＬおよび定常状態での分布容積（Ｖｓｓ）は、子供において増加し、成人期中、一定のままであり、それ故に、これらのパラメーターは、小児科研究において、注意深く監視される。
ＦＩＸ凝固促進剤の活性（ＦＩＸ：Ｃ）のピークレベルは、ＦＩＸの単回および／または反復投与後、ＦＩＸ：Ｃの初期分布容積によって異なる。ＦＩＸの初期分布は、急速である。しかしながら、ＢＥＮＥＦＩＸ（商標）の生体内回収率（平均増分回収率）は、一般に、モノクローナル抗体で精製した血漿由来凝固因子（ｐｄＦＩＸ）のものよりも３０％低い（Ｒｏｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ９８：３６００−３６０６（２００１））。さらに、ｐｄＦＩＸを用いた研究は、１５歳以下の対象は、１５歳を超えるものよりも著しく低い回収率を有することを示している（Ｗｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．７３：７７９−８４（１９９５））。したがって、トラフおよびピークレベルのモニタリングもまた、小児科研究において行われる。
子供が、成人と比較して異なる応答を示すことを研究が示しているので、、５０ＩＵ／ｋｇのｒＦＩＸＦｃを用いるベースラインでの薬物動態評価は、簡易な薬物動態サンプリングを用いて子供において行われる。
重篤なＢ型血友病に罹患している１８歳以上のＰＴＰにおける、ｒＦＩＸＦｃの単回静脈内投与の安全性および薬物動態プロファイルを評価する第１／２ａ相試験（ＳＹＮ−ＦＩＸＦｃ−０７−００１）が、最近、完了した。ヒトにおけるこの最初の調査からの予備試験の結果は、ＢＥＮＥＦＩＸ（商標）についての文献において報告されているものと比較して、ｒＦＩＸＦｃの薬物動態パラメーター（平均終末相半減期、ＭＲＴ、およびＡＵＣ）における約３倍の増加を示す（上記参照）。さらに、ｒＦＩＸＦｃは、良好な忍容性を示し、注射部位反応の兆候、ならびにインヒビターの発生もなかった。同時に、これらの安全性および薬物動態の結果は、重篤なＢ型血友病に罹患している１２歳以上（＜２％）の１０４人のＰＴＰ（既存の製品に少なくとも１００治療ＥＤ）において、出血の予防および治療時、ｒＦＩＸＦｃの安全性、薬物動態、および有効性を評価する第１／２／３相登録研究（９９８ＨＢ１０２研究（Ｂ−ＬＯＮＧ）、上記参照）の開始を支持する。一旦十分な安全性データが登録研究から利用可能になると、子供におけるｒＦＩＸＦｃの安全性および有効性をさらに調査するために小児科プログラムが開始される。ヒトにおけるｒＦＩＸの長期間の半減期の表示は、出血の予防および治療に必要とされる、Ｂ型血友病に罹患している個人への注射頻度がより少ないことを意味する。
以前に治療されたことがある子供（１２歳未満）における第２／３相の小児科ＰＴＰ試験
一旦、登録研究（９９８ＨＢ １０２研究）から２６ＥＤの間の１０人のＰＴＰ（１２歳以上）についてデータが利用可能になると、小児科研究の第３相が開始される。この第２／３相小児科研究は、登録前にＦＩＸ製品に対して少なくとも５０ＥＤを有したことがあるＰＴＰにおいて、約２５の臨床施設で世界的に行われる。重篤なＢ型血友病（２ＩＵ／ｄＬ未満［２％未満］の内因性ＦＩＸ）に罹患している２〜１１歳の約２５人のＰＴＰ（２０人の評価可能な対象を確保するため）が、予め定められた基準に従ってスクリーニングおよび選択される。全ての評価可能な対象は、本研究の薬物動態部分（試験前のＦＩＸ製品のＰＫ、次いで、ｒＦＩＸＦｃのＰＫ）を完了し、５２週間、１週間に１回、ｒＦＩＸＦｃの投与を受ける。本研究は、ｒＦＩＸＦｃの増分回収率、インビボ半減期、ＡＵＣ、およびクリアランスを記録する。全ての対象は、試験前のＦＩＸおよびｒＦＩＸＦｃについてベースラインで薬物動態評価を行い、各対象に対する試験期間は、スクリーニングおよび追跡試験を含み、約６９週間である。
各対象は、薬物動態評価に関してベースラインで５０ＩＵ／ｋｇのｒＦＩＸＦｃを受け、続いて、１週間に１回、５０〜６０ＩＵ／ｋｇのｒＦＩＸＦｃによる反復投与を受ける。患者のコンプライアンスに関しては、簡易な薬物動態サンプリングが、試験前製品およびｒＦＩＸＦｃについて以下のように利用される： 投与前、注射終了、注射終了から３０＋１０分後、３±１時間後、２４±３（１日目）、７２±３（３日目）、１２０±３（５日目）、および１６８±３時間後（７日目）。免疫原性に対処するために、全ての対象は、最低５０ ＥＤの間、１週間に１回、ｒＦＩＸＦｃにより治療される。（ａ）ｒＦＩＸＦｃの注入前および注入から３０分後のバイタルサイン（脈、血圧、呼吸数、温度）、（ｂ）血液学および凝固パラメーター、（ｃ）臨床化学、（ｄ）Ｎｉｊｍｅｇｅｎ改変Ｂｅｔｈｅｓｄａアッセイを用いた頻繁なＦＩＸインヒビターの判定（第１の曝露直前、ＥＤ４［４週目］、ＥＤ１２、ＥＤ２４、ＥＤ３６、およびＥＤ５０）、ならびに（ｅ）副作用等の安全性パラメーターが、即時的な安全性および忍容性評価に含まれる。
有効性は、出血症状数、出血間隔、年および事象当たりのＦＩＸの治療数および消費量の評価によって評価される。
以前に治療されたことがない子供（０〜１１歳）における第２／３相の小児科ＰＵＰ試験
一旦、薬物動態を完了し、および５０ＥＤを有する１０人の以前に治療されたことがある子供（２〜１１歳）からのデータが先行する研究において利用可能になると、第２／３相の小児科ＰＵＰ研究が開始される。本研究は、約６０の臨床施設で世界的に行われる。重篤なＢ型血友病（２ＩＵ／ｄＬ未満［２％未満］の内因性ＦＩＸ）に罹患している０歳以上の最大３０人のＰＵＰ（２０人の評価可能な対象を確保するため）が、予め定められた基準に従ってスクリーニングおよび選択される。
本研究への参加は、治療の開始が修正された予防レジメンとしてｒＦＩＸＦｃを用いて始まり得るため、異なる。患者当たりの研究の参加は、スクリーニングおよび追跡試験を含む、約４年であると期待される。この期間中、ほとんどの患者は、ｒＦＩＸＦｃに対して５０ＥＤを達することが期待される。免疫原性に対処するために、全ての対象は、約５０ＥＤのｒＦＩＸＦｃまたは最高４年間、治療される。（ａ）Ｎｉｊｍｅｇｅｎ改変Ｂｅｔｈｅｓｄａアッセイを用いた頻繁なＦＩＸインヒビターの判定および（ｂ）副作用等の安全性パラメーターが即時的な安全性および忍容性に含まれる。
有効性は、出血症状数、出血間隔、年および事象当たりのＦＩＸの治療数および消費量の評価によって評価される。
実施例５．非ヒト動物における生化学特性、活性、およびＰＫ解析
実施例３において産生されたｒＦＩＸＦｃは、その翻訳後修飾について特徴を調べられ、以下の結果を得た（表１５および図１１を参照）。ｒＦＩＸＦｃのプロペプチドは、産生中、適切にプロセッシングを受けた。ｒＦＩＸＦｃのγカルボキシル化型は、ｒＦＩＸのものと同様であった。さらに、ｒＦＩＸＦｃの全Ｇｌａ／分子（１１．２±０．７）は、ｒＦＩＸに匹敵する。ある残基でのγカルボキシル化は、ＦＩＸ活性にとって不可欠であるため、これらは、重要な結果である。加えて、ｒＦＩＸＦｃのＳｅｒ１５８のリン酸化およびＴｙｒ１５５の硫酸化は、ｒＦＩＸに匹敵する。ＦＩＸにおけるＮ結合型グルカンは、完全にシアル化されず、ｒＦＩＸと同様である。第１のＥＧＦドメインにおけるｒＦＩＸＦｃ Ｏ結合型グルコシル化は、異なる相対比率であっても、ＦＩＸと同一であった。ｒＦＩＸＦｃのＡｓｐ ６４は、ｒＦＩＸまたは血漿由来ＦＩＸ（ｐｄＦＩＸ）よりもより高度のβヒドロキシル化があった。活性化ＦＩＸは、実施例３に詳細が論じられるように、ｒＦＩＸまたはｐｄＦＩＸ調製物においてよりもｒＦＩＸＦｃ調製物においてはるかに低いレベルで存在した。
加えて、ｒＦＩＸＦｃは、様々な動物種に投与され、その活性およびＰＫパラメーターを決定した。結果を表１６および図１２〜１６に示す。
実施例６．γカルボキシル化
本研究の目的は、前臨床ロットのＦＩＸＦｃ材料および市販されているＦＩＸ製品におけるグルタミン酸のγカルボキシル化（Ｇｌａ）を分析および特徴付けること、擬似親和性クロマトグラフィーのイオン交換ステップに由来する濃縮された「ピーク」画分および高塩溶出「ストリップ」画分のＧｌａの含有を特徴付けること、陰イオン交換ＨＰＬＣによって濃縮された「ピーク」画分および高塩溶出「ストリップ」画分をさらに分離すること、ならびに分離された種をさらに特徴付けることであった。
これらの目的を達成するために、多くの相補的解析方法が開発された。これらには、（全）Ｇｌａの含有を判定するために塩基性加水分解を用いるアミノ酸分析（ＡＡＡ）、Ｇｌａ分布を判定するためのＬｙｓ−Ｃペプチドを用いるペプチドマップ（ＬＣ／ＭＳ）、アイソフォームを分離するための無傷分子の分析的陰イオン交換ＨＰＬＣ、および生物活性を判定するための活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）が含まれる。
２つのＧｌａ（Ｅ）を含有するペプチドは、以下のものである
３０マイクログラムの試料（濃縮されたピーク画分、高塩ストリップ画分、分析的陰イオン交換ＨＰＬＣからのそれぞれの種に由来）が、変性、還元、アルキル化、およびＬｙｓ−Ｃ（１：２０、Ｅ：Ｓ）で消化された。この消化は、２％ ＴＦＡで反応停止させ、Ｊｕｐｉｔｅｒ Ｃ１８（２．０×２５０ｍｍ）Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘカラム上に注入された。分離は、Ａｇｉｌｅｎｔ １１００システムにおいて行われた。カラムは、２５℃で維持され、ペプチドは、マルチステップのアセトニトリル勾配で溶出された。質量分析法（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ ＬＣＱ）は、「トリプルプレー（Ｔｒｉｐｌｅ Ｐｌａｙ）」モードで行われた。
前臨床ｒＦＩＸＦｃ材料のＧｌａの含有および分布を分析および特徴付けるために相補的方法が開発された。前臨床のロットのｒＦＩＸＦｃ（濃縮されたピーク画分）において、γカルボキシル化されたグルタミン酸（Ｇｌａ）の含有および分布が行われ、市販されている製品と比較された。分析は、市販されている製品について同様のＧｌａの含有および分布を示した。高塩溶出「ストリップ」画分が分析され、濃縮されたピーク画分と比較された。分析は、γカルボキシル化レベルの低下を示した。
ＦＩＸＦｃ（濃縮ピーク画分）は、擬似親和性クロマトグラフィーのイオン交換ステップから単離され、分析的陰イオン交換ＨＰＬＣによって、３つのアイソフォームにさらに分離された。ＡＥＸカラムロードおよび分離された種は、高度にγカルボキシル化されていた（ＡＥＸカラムロードは、擬似親和性クロマトグラフィーのイオン交換ステップからの高塩溶出ステップ中に回収されたストリップ画分である。）。ＡＥＸカラムロードおよび分離された種は、生物学的に活性があった。Ｇｌａの含有および分布は、ｒＦＩＸと同様であった。ペプチドマップは、Ｋ３ペプチドにおける４／５／６Ｇｌａの分布を示す。ペプチドマップは、Ｋ１Ｋ２ペプチドにおける高集団の６Ｇｌａおよびトレースレベルの５Ｇｌａを示す。
ＦＩＸＦｃ（ストリップピーク画分）は、擬似親和性クロマトグラフィーのイオン交換ステップから単離され、分析的陰イオン交換ＨＰＬＣによって、２つのアイソフォームにさらに分離された。ＡＥＸカラムロードおよび分離された種は、γカルボキシル化レベルが低下していた。ＦＩＸＦｃが濃縮されたピーク画分と比較して、Ｇｌａの含有量の低下があった。生物活性レベルの低下が観察された。ペプチドマップは、濃縮されたピーク画分と比較して、Ｋ１Ｋ２において、増加した集団の５ Ｇｌａを示し、生物活性における影響を示唆し得る。
参照文献（これらのそれぞれは、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる）：Ｄｕｍｏｎｔ ＪＡ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ Ｆｃ Ｆｕｓｉｏｎ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｂｓ−Ｆｒｏｍ Ｂｅｎｃｈ ｔｏ Ｃｌｉｎｉｃ，Ｃｈ．３３ ｐ７７９−７９５、Ｇｉｌｌｉｓ Ｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９７）６：１８５、Ｗｈｉｔｅ ＧＣ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ａｎｄ Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ（１９９７）７８：２６１、Ｈａｎｓｓｏｎ Ｋ，ａｎｄ Ｓｔｅｎｆｌｏ Ｊ，Ｊｏｕｒｎａｌ Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ａｎｄ Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ（２００５）３：２６３３、およびＰｅｔｅｒｓ ＲＴ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ（２０１０）１１５：２０５７。
実施例７．Ｂ型血友病マウス出血モデルにおけるｒＦＩＸＦｃ凝固促進剤活性の評価
ｒＦＩＸＦｃおよびＢＥＮＥＦＩＸ（商標）の同等の効能が、インビトロでのＢ型血友病マウスの全血ＲＯＴＥＭおよびインビボでのＢ型血友病マウスの尾部切断出血モデルにおいて示された。
強力かつ安定した凝固を形成するｒＦＩＸＦｃの能力は、活性剤として塩化カルシウムを用いるＲｏｔａｔｉｏｎ Ｔｈｒｏｍｏｂｏｅｌａｓｔｏｍｅｔｒｙ（ＲＯＴＥＭ（登録商標）、Ｐｅｎｔａｐｈａｒｍ ＧｍｂＨ，Ｍｕｎｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）（ＮＡＴＥＭ）によって評価された。Ｂ型血友病マウスからの大静脈を介して採取されたプールされた全血を、７つのアリコートに分割し、これに、最終濃度が正常な血漿ＦＩＸ活性の７．４％、０．７４％、および０．０７４％になるようにｒＦＩＸＦｃを混入するか、または正常な血漿ＦＩＸ活性の１０％、１％、０．１％になるようにＢＥＮＥＦＩＸ（商標）を混入した。陰性対照として、血液試料に、ＦＩＸ配合緩衝液を混入した。５匹のＢ型血友病マウスから合計１０個の血液プールを生成して、評価を完成させた。ＮＡＴＥＭ反応は、ＣａＣｌ２の添加によって開始された。凝固時間（ＣＴ）、凝固形成時間（ＣＦＴ）、およびα角度を含む、凝固パラメーターを評価した。ＣＴ、ＣＦＴ、およびα角度の平均および標準偏差を表１７に要約する。３つのパラメーターに対する用量反応を図１７にプロットする。３つのパラメーターは全て、試験した用量範囲において、ｒＦＩＸＦｃとＢＥＮＥＦＩＸ（商標）との間で同等であった（一元配置分散（クラスカルワリス）分析によりｐ＞０．０５）。
ｒＦＩＸＦｃの急激な有効性もまた、Ｂ型血友病マウス尾部切断出血モデルにおいて評価された（図１８）。雄Ｂ型血友病マウスを、異なる処置群において体重および年齢の同等の提示のために階級化した。尾部切断損傷前に、マウスを、５０ｍｇ／ｋｇのケタミンおよび０．５ｍｇ／ｋｇのデクスメデトミジンのカクテルで麻酔し、加温パッド上に置いて、体温の維持に役立てた。次いで、マウスの尾を３７℃の水中で１０分間浸漬し、尾静脈を拡張させた。静脈を拡張させた後、ｒＦＩＸＦｃ、ＢＥＮＥＦＩＸ（商標）、または媒体を、尾静脈を介して注入し、５分後、尾の先端から４ｍｍを、直刃の１１番外科用メスを用いて切断した。流出した血液を１３ｍＬの温生理食塩水中に３０分間採取し、血液損失を重量測定法で定量化した。６つのｒＦＩＸＦｃ処置群（７２０、３６０、２４０、１２０、８０、４０ＩＵ／ｋｇ、ｎ＝１５）および３つのＢＥＮＥＦＩＸ（商標）処置群（３６０、１２０、４０ＩＵ／ｋｇ、ｎ＝１５）を試験した。個々の動物の血液損失値および中央血液損失の用量反応曲線を図１９（Ａ）に示し、各処置群の中央血液損失体積を表１８に要約する。ｒＦＩＸＦｃおよびＢＥＮＥＦＩＸ（商標）の両方について中央血液損失体積の用量反応は、同等である（ウェルチ補正付き不対ｔ検定によりｐ＝０．９３１５）。
ＢＥＮＥＦＩＸ（商標）と比較して、ｒＦＩＸＦｃの３倍延長した半減期が、ｒＦＩＸＦｃの有効性の延長をもたらすか判定するために、本発明の発明者は、エクスビボＲＯＴＥＭ（登録商標）アッセイおよびＢ型血友病マウスにおける尾静脈切断出血モデル（ＴＶＴ）の両方において、ｒＦＩＸＦｃおよびＢＥＮＥＦＩＸ（商標）の有効性を評価した。図２０。
エクスビボＲＯＴＥＭ（登録商標）のために、雄Ｂ型血友病マウスは、静脈内注入によって５０ＩＵ／ｋｇのｒＦＩＸＦｃまたは１００ＩＵ／ｋｇのＢＥＮＥＦＩＸ（商標）を受容した。全血を、ｒＦＩＸＦｃを投与してから５分後、２４、７２、９６、１２０、１６８、および２１６時間後（各時点でｎ＝８匹のマウス）、またはＢＥＮＥＦＩＸ（商標）を投与してから５分後、２４、４８、７２、および９６時間後（ｎ＝４匹のマウス／時点）、処置した動物の大静脈から採取した。血液試料は、ＮＡＴＥＭによって直ちに分析された。ＣＴ、ＣＦＴ、およびα角度の平均および標準偏差を表１９に要約し、ＣＴ、ＣＦＴ、およびα角度対時間曲線を図２１に示す。ＢＥＮＥＦＩＸ（商標）と比較して、ｒＦＩＸＦｃは、５分で、同等のＣＴ、ＣＦＴ、およびα角度を示したが、ＢＥＮＥＦＩＸ（商標）と比較して２倍低い用量にもかかわらず、７２時間後、著しく改善されたＣＴ、ＣＦＴ、およびα角度を示した。
ｒＦＩＸＦｃおよびＢＥＮＥＦＩＸ（商標）の予防的有効性を評価するために、雄Ｂ型血友病マウスを、９つの異なる処置群において体重および年齢の同等の提示のために階級化した。ｒＦＩＸＦｃは、尾静脈切断の７２時間前に、４ＩＵ／ｋｇ、１３ＩＵ／ｋｇ、４０ＩＵ／ｋｇ、および１２０ＩＵ／ｋｇの用量で、静脈内注入によって投与され、一方、同じ用量のＢＥＮＥＦＩＸ（商標）が、損傷の２４時間前に投与された。尾静脈切断前に、マウスを、５０ｍｇ／ｋｇのケタミン／０．１２５ｍｇ／ｋｇのデクスメデトミジン／０．１ｍｇ／ｋｇのＢｕｐｒｅｎｅｘのカクテルで麻酔した。尾静脈切断後、マウスに正常な活動を維持させるために、１ｍｇ／ｋｇのアチパメゾール溶液を与えて、デクスメデトミジンの作用を低減し、尾の直径が約３ｍｍである領域で直刃の１１番外科手術用ナイフを用いて直ちに尾静脈切断を行った。流出する血液を温生理食塩水で洗浄し、外傷の観察を確保し、マウスを、その後２４時間、白色紙を敷いた清潔なケージに一匹ずつ収容した。損傷後、最高１２時間まで１時間ごとに再出血および身体的活性を観察し、記録した。瀕死のマウスは、同定後直ちに殺処分し、損傷から２４時間後の検査を行い、本研究を完了した。殺処分までの時間のカプランマイヤー曲線およびＴＶＴから２４時間後の生存率の図表を図２２に示す。ログランク検定は、４ＩＵ／ｋｇよりも高い用量を用いた全ての処置群が、媒体群よりも有意に良好であると判定した（ｐ＜０．００１）。さらに、生存率は、損傷の２４時間前にＢＥＮＥＦＩＸ（商標）の用量と、損傷の７２時間前に同じ用量のｒＦＩＸＦｃを受容したマウス間で同等である（４、１３、４０、および１２０ＩＵ／ｋｇの用量群で、それぞれ、ｐ＝０．４８８６、０．９２６８、０．７２７９、および０．５２０９）。ＴＶＴから２４時間後の生存率が、プロットされ、各分子のＥＤ５０値が、曲線から補外法により推定され、２つの処置のＥＤ５０は、ｒＦＩＸＦｃについては１７．８ＩＵ／ｋｇで、ｒＦＩＸについては１５．４ＩＵ／ｋｇで同様である。したがって、ｒＦＩＸＦｃは、尾静脈切断損傷後の生存および再出血によって測定されたように、ＢＥＮＥＦＩＸ（商標）の同等の用量と比較して、Ｂ型血友病マウスにおいて、３倍長い保護持続時間を提供した。したがって、ｒＦＩＸＦｃは、尾静脈切断損傷後の生存および再出血によって測定されたように、ＢＥＮＥＦＩＸ（商標）の同等の用量と比較して、Ｂ型血友病マウスにおいて、３倍長い保護持続時間を提供した。
結論として、データが示すように、１５．４ＩＵ／ｋｇのＢＥＮＥＦＩＸ（商標）により、投与から２４時間後に５０％のＢ型血友病マウスが尾静脈切断から生存する結果になるのに対して、１７．８ＩＵ／ｋｇのｒＦＩＸＦｃが、投与から７２時間後、損傷した動物において、５０％の生存率を達成した。したがって、ｒＦＩＸＦｃは、ＢＥＮＥＦＩＸ（商標）と比較してその半減期延長との相関において、３倍長い予防的有効性を示す。出血モデルからの結果は、１００ＩＵ／ｋｇのＢＥＮＥＦＩＸ（商標）または５０ＩＵ／ｋｇのｒＦＩＸＦｃのいずれかで処置されたＢ型血友病マウスからの全血のエクスビボＲＯＴＥＭ（登録商標）分析によってさらに確認される。投与から５分後、凝固形成における同等の改善が、両方の処置群において観察された。しかしながら、凝固時間、凝固形成時間、およびα角度等の主要なＲＯＴＥＭ（登録商標）パラメーターが、ＢＥＮＥＦＩＸ（商標）と比較して２倍低い用量のｒＦＩＸＦｃにもかかわらず、投与から７２〜２１６時間後、ｒＦＩＸＦｃで処置されたマウスにおいて、著しく改善された。
要約すると、ｒＦＩＸＦｃの急激な効能は、インビトロでの全血ＲＯＴＥＭ（登録商標）およびＢ型血友病マウスにおける尾部切断出血モデルの両方において示されるように、ＢＥＮＥＦＩＸ（商標）のものと同等である。ｒＦＩＸＦｃの予防的有効性の延長が、処置されたＢ型血友病マウスからのエクスビボ全血ＲＯＴＥＭ（登録商標）において示され、Ｂ型血友病マウスにおける尾静脈切断出血モデルにおいて、ＢＥＮＥＦＩＸ（商標）と比較して、約３倍長いと決定された。ｒＦＩＸＦｃの有効性の延長は、Ｂ型血友病マウスにおける薬物動態研究において上に示されるＢＥＮＥＦＩＸ（商標）と比較して、３倍長いｒＦＩＸＦｃのＴ１／２とよく相関する。したがって、ｒＦＩＸＦｃは、投与頻度を軽減する可能性と共に予防的保護の著しい延長を達成しつつ、オンデマンド治療に対して十分活性があるが、このことは、第３相試験において調査中である。
実施例８．ＦＩＸ欠損マウスにおける単回皮下投与後のｒＦＩＸＦｃおよびＢＥＮＥＦＩＸ（商標）の薬物動態および薬力学的分析
組換え型第ＩＸ因子Ｆｃ（ｒＦＩＸＦｃ）およびＢＥＮＥＦＩＸ（商標）（ｒＦＩＸ）の薬物動態（ＰＫ）および薬力学的（ＰＤ）プロファイルは、ＦＩＸ欠損マウスにおいて、２００または４００ＩＵ／ｋｇの単回静脈内注入または皮下注入後、決定された。全血が、大静脈を介して採取された（ｎ＝４匹のマウス／時点／処置）。血漿中のｒＦＩＸＦｃおよびＢＥＮＥＦＩＸ（商標）の濃度は、ヒトＦＩＸに特異的なＥＬＩＳＡを用いて測定された。ｒＦＩＸＦｃおよびＢＥＮＥＦＩＸ（商標）の活性は、活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）アッセイを用いて、決定された。ＰＫ分析は、ＷｉｎＮｏｎＬｉｎを使用するモデル依存的方法を用いて行われた。これらの結果を表２２および２３に示す。
ＦＩＸＦｃについては、ＦＩＸ欠損マウスにおけるバイオアベイラビリティは、それぞれ、２３％および１９％であるｒＦＩＸと比較して、２００ＩＵ／ｋｇの用量で、３８％、混合した用量で、３８〜４６％（抗原ＥＬＩＳＡ）であり、２００ＩＵ／ｋｇの用量で、２９％、混合した用量で、２９〜３９％（ａＰＴＴ活性アッセイ）であった。ｒＦＩＸＦｃは、ＢＥＮＥＦＩＸ（商標）と比較して、１．５〜１．７倍（２００ＩＵ／ｋｇの用量）および１．５〜２．５倍（混合した用量）の改善されたバイオアベイラビリティを有した。
ｒＦＩＸＦｃについては、終末相半減期（抗原ＥＬＩＳＡ）は、２００ＩＵ／ｋｇの用量で、６２時間、混合した用量で、５１〜６２時間であり、終末相半減期（ａＰＴＴ活性アッセイ）は、２００ＩＵ／ｋｇの用量で、４２時間であり、混合した用量で、４０〜４２時間であった、一方、ＢＥＮＥＦＩＸ（商標）については、終末相半減期は、２００ＩＵ／ｋｇの用量で、２４時間（抗原ＥＬＩＳＡ）であり、２００ＩＵ／ｋｇの用量で、１７時間（ａＰＴＴ活性アッセイ）であった。これは、ｒＦＩＸＦｃについて、２．５〜２．６倍（２００ＩＵ／ｋｇの用量および混合した用量）の半減期の改善を示す。
加えて、表２２および２３が示すように、ｒＦＩＸＦｃに、ＢＥＮＥＦＩＸ（商標）に対して、ＡＵＣ／用量の４．５〜５．６倍の増加およびＣｍａｘ／用量の１．９〜３．７倍の増加があった。
組換え型第ＩＸ因子Ｆｃ融合（ｒＦＩＸＦｃ）タンパク質は、Ｂ型血友病の治療のためにｒＦＩＸのより少ない頻度の投与を提供する長時間作用型の組換え型ＦＩＸ（ｒＦＩＸ）である。マウスから非ヒト霊長類まで、およびＢ型血友病患者において、ｒＦＩＸＦｃは、ｒＦＩＸ（ＢＥＮＥＦＩＸ（商標））に対して、約３倍長い半減期を有する。予防的治療については、ｒＦＩＸの静脈内送達は、特に、子供およびアクセスしにくい血管を有する患者にとっては、依然として負担となる送達方法である。ｒＦＩＸの皮下投与は、より低侵襲的であり、かつより少ない頻度の投与による、より魅力のある送達経路として存在する。したがって、ｒＦＩＸＦｃの皮下投与は、静脈内経路よりも投与しやすく、より短時間で投与されるため、静脈内送達よりも痛みも不快感も少なく、改善されたコンプライアンスをもたらす。予防レジメンはまた、生活の質も改善し、臨床転帰には、出血の発生を減少が含まれるであろう。
マウス血漿中のｒＦＩＸＦｃの濃度は、分子のＦＩＸ部分を測定するヒトＦＩＸに特異的なＥＬＩＳＡを用いて測定され、ｍｇ／ｋｇの名目用量が、分析において使用された。ｒＦＩＸＦｃおよびＢＥＮＥＦＩＸ（商標）についてのＰＫパラメーターの要約を、ｎ＝４／群について、表２０（抗原ＥＬＩＳＡ）および表２１（ａＰＴＴ活性アッセイ）に示す。抗原および活性による両方の分析は、ＣｍａｘおよびＡＵＣが、ＢＥＮＥＦＩＸ（商標）に対してｒＦＩＸＦｃにおいて著しく改善されたことを示した。抗原ＥＬＩＳＡを用いるとき、バイオアベイラビリティ（Ｆ％）は、ＢＥＮＥＦＩＸ（商標）で２３％であるのに対してｒＦＩＸＦｃで３８％であった。同様に、ａＰＴＴ活性アッセイを用いるとき、バイオアベイラビリティは、ＢＥＮＥＦＩＸ（商標）で１９％であるのに対して、ｒＦＩＸＦｃで２９％であった。したがって、ｒＦＩＸＦｃは、ＢＥＮＥＦＩＸ（商標）に対して１．５〜１．６倍のバイオアベイラビリティの増加を示した。消失半減期の測定は、ｒＦＩＸＦｃが、抗原アッセイ（ＢＥＮＥＦＩＸ（商標）の２４時間に対してｒＦＩＸＦｃの６２時間）によって測定されようとも、活性アッセイ（ＢＥＮＥＦＩＸ（商標）の１７時間に対してｒＦＩＸＦｃの４２時間）によって測定されようとも、半減期を著しく増加したことを示した。これらのデータは、ｒＦＩＸＦｃが、ＢＥＮＥＦＩＸ（商標）と比較して、２．６〜２．５倍延長した半減期を有したことを示す。
ＦＩＸ欠損マウスに皮下投与されたｒＦＩＸＦｃは、ＢＥＮＥＦＩＸ（商標）と比較して、ｒＦＩＸＦｃに対してＣｍａｘおよびＡＵＣの増加を有するＰＫおよびＰＤプロファイルを示した。それぞれ、１９〜２３％のバイオアベイラビリティおよび１７〜２４％の半減期を有するＢＥＮＥＦＩＸ（商標）と比較して、ｒＦＩＸＦｃに対するバイオアベイラビリティは、概して、２９％（活性）〜３８％（抗原）に及び、４２時間（活性）〜６２時間（抗原）の半減期を有する。したがって、ＦＩＸ欠損マウスにおいて皮下送達されたｒＦＩＸＦｃの半減期は、静脈内投与された現在市販されているｒＦＩＸ製品に対して約２．２（抗原）〜３．３（活性）倍の増加を示した。概して、これらのデータは、皮下送達されたｒＦＩＸＦｃは、Ｂ型血友病患者における予防的治療に臨床的有益性があるという考えを支持する。
実施例９．カニクイザルにおける単回皮下投与後のｒＦＩＸＦｃの薬物動態分析
組換え型第ＩＸ因子Ｆｃ（ｒＦＩＸＦｃ）の薬物動態（ＰＫ）プロファイルは、５０ＩＵ／ｋｇ、１００ＩＵ／ｋｇ、または２００ＩＵ／ｋｇの単回皮下投与後のカニクイザルにおいて、研究された。血漿中のｒＦＩＸＦｃの濃度は、ＦＩＸに特異的なＥＬＩＳＡを用いて測定された。一次解析は、ＷｉｎＮｏｎＬｉｎを使用するモデル依存的方法を用いて行われた。表２２〜２５を参照のこと。
血漿濃度対時間データ（ＦＩＸに特異的なＥＬＩＳＡにより測定）の薬物動態分析は、バイオアベイラビリティおよび終末相半減期が用量間で同様であったことを示した。ｒＦＩＸＦｃのバイオアベイラビリティは、４０％（５０ＩＵ／ｋｇ）、３４％（１００ＩＵ／ｋｇ）、３６％（２００ＩＵ／ｋｇ）、および３６〜４５％（混合した用量）であった。ｒＦＩＸＦｃの終末相半減期は、６１時間（５０ＩＵ／ｋｇ）、４５時間（１００ＩＵ／ｋｇ）、４９時間（２００ＩＵ／ｋｇ）、および４４〜５８時間（混合した用量）であった。
サル血漿中のｒＦＩＸＦｃの濃度は、分子のＦＩＸ部分を測定するＦＩＸに特異的なＥＬＩＳＡを用いて測定され、ｍｇ／ｋｇの名目用量が、分析において使用された。スパイクおよび回収解析は、評価した血漿濃度の範囲にわたって、ｒＦＩＸＦｃを検出するためのこのＦＩＸに特異的なＥＬＩＳＡアッセイの正確性を示した。ｒＦＩＸＦｃのＰＫパラメーターの要約を、ｎ＝３／群について、表２２（５０ＩＵ／ｋｇ）、表２３（１００ＩＵ／ｋｇ）、および表２４（２００ＩＵ／ｋｇ）に示す。ｒＦＩＸＦｃについては、ＳＣ、幾何平均、およびＣｍａｘについての幾何平均のＣＶ％は、それぞれ、８６０＋２２（５０ＩＵ／ｋｇ）、１６３０＋９７（１００ＩＵ／ｋｇ）、および３，７５０＋２６（２００ＩＵ／ｋｇ）であり、用量依存的な増加を示した。同様の増加が、ＡＵＣに対して見られた。バイオアベイラビリティ（Ｆ％）についての幾何平均は、４０＋１６（５０ＩＵ／ｋｇ）、３０＋７５（１００ＩＵ／ｋｇ）、および３６＋２７（２００ＩＵ／ｋｇ）であり、バイオアベイラビリティが用量間で同様であったことを示した。終末相半減期の測定は、半減期が５８＋３９時間（５０ＩＵ／ｋｇ）、４５＋１３時間（１００ＩＵ／ｋｇ）、および４６＋４４時間（２００ＩＵ／ｋｇ）で用量間で同様であったことを示した。
カニクイザルに皮下投与されたｒＦＩＸＦｃは、ＣｍａｘおよびＡＵＣの用量依存的な増加を有するＰＫプロファイルを示した。概して、バイオアベイラビリティは、３０〜４０％に及び、４５〜５８時間の半減期を有した。したがって、サルにおいて皮下送達されたｒＦＩＸＦｃの半減期は、静脈内投与された現在市販ｒＦＩＸ製品に対して約２．８倍の増加を示した。概して、これらのデータは、皮下送達されたｒＦＩＸＦｃが、Ｂ型血友病患者における予防的治療に臨床的有益性があるという考えを支持する。
実施例１０．予測される予防的投与レジメン
１週間に２回または３回、２５〜４０ＩＵ／ｋｇのＦＩＸの標準的な推奨される用量レジメンと比較して、上記の第１／２ａ相試験からの中央ｒＦＩＸＦｃ活性ＰＫ結果は、約２２．５ＩＵ／ｋｇで１週間に約１回、約４５ＩＵ／ｋｇで約１０日ごと、または約１２０ＩＵ／ｋｇで約２週間ごとのｒＦＩＸＦの投与が、ベースラインよりも１％上のトラフを維持するのに十分であることを示唆している（図２４）。これらのモデルシミュレートされた推定値は、第１／２ａ相試験から利用可能なデータによって検証され、これらはシミュレートされた活性−時間曲線の９５％信頼間隔内に完全に入る。これらのレジメンは、しばしば、療法の開始時に役立つ。血漿ＦＩＸ活性のトラフレベルに対して、報告された臨床的破断出血事象の不均一性を考慮すると、維持量は、個人に合わせて調整される必要がある。
第１／２相試験（実施例１１を参照）からのＰＫ結果の再計算後の、例えば予防のための新しい予測される投与レジメンは、１週間に１回、２０ＩＵ／ｋｇ、１０日ごとに４０ＩＵ／ｋｇ、または２週間ごと（１ヶ月に２回）に１００ＩＵ／ｋｇである。表２７および図２５も参照のこと。
実施例１１．ヒト初回（ＦｉＨ）試験（実施例１）からの薬物動態データの再計算
終止コドン／ナンセンス変異およびミスセンス変異等の様々なＢ型血友病の遺伝子型を有する対象は、実施例１において論じられるＦｉＨ試験に含まれた。幾人かの対象は、著しく減少したＦＩＸ活性と相関する著しく減少した内因性ＦＩＸ抗原レベルを有したが、一方、ミスセンス遺伝子型を有する対象の中には測定された活性よりも多い抗原を有する者もあり、これは循環タンパク質の機能異常を示す。２人の対象における治療前ＦＩＸ活性は、２ＩＵ／ｄＬを超え、これは、過去の試験および疾病表現型に基づき、ＦＩＸ濃縮物の最終注入からの不完全なウォッシュアウトによる可能性がある。この情報に基づいて、実施例１からのＰＫデータは、以下に詳細されるように、ベースライン減算することなく、再計算された。表２７を参照のこと。
糖ＰＥＧ化ｒＦＩＸのＰＫ解析について最近報告された（Ｎｅｇｒｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ＤＯＩ １０．１１８２／ｂｌｏｏｄ ２０１１ ０２ ３３５５９６（２０１１）、これは、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる）ように、ｒＦＩＸＦｃ活性ＰＫがベースライン減算することなく、モデル化される場合、実施例１におけるＰＫ計算（活性に基づく）と対照的に、消失半減期およびＭＲＴの得られた推定値は、それぞれ、８２．２±２１．６および９６．８±２２．０時間（平均値±標準偏差）で、実施例１における推定値よりもはるかに長い。しかしながら、全ての重篤なＢ型血友病患者が、０％の内因性ＦＩＸ活性を有するとは限らないと知っているので、患者の遺伝子型および内因性ＦＩＸ抗原レベルを考慮して、本発明の発明者は、ＰＫモデリングにおいて、ベースライン減算解析法を採用した。具体的には、（ａ）２人の患者におけるベースラインは、治療前ＦＩＸ活性が１％未満であり、これらの患者はＦＩＸ抗原が検出されず、ナンセンス遺伝子型を有したため、０％として定義され、（ｂ）３人の患者のベースラインは、治療前ＦＩＸ活性が１％未満であり、これらの患者はＦＩＸ抗原が検出されたため、０．５％で設定され、（ｃ）治療前ＦＩＸ活性が１〜２％であった患者については、Ｃｍｉｎ（ＰＫ研究を通しての最低活性）がベースラインとして定義され、（ｄ）治療前ＦＩＸ活性が２％以上であった患者については、（本試験への登録の上限であった）２％がベースラインであった。投与前にベースラインを超える活性は、事前の治療からの薬物が残留していると考えられ、ベースラインまで減少させ、ｒＦＩＸＦｃ投与後、ＰＫデータから差し引かれた。
ｒＦＩＸＦｃの得られた平均終末相半減期（５６．７±１０．９時間、４２．４〜７４．５時間の範囲）およびＭＲＴ（７１．８±１０時間、５３．２〜８５．９時間の範囲）は、ｒＦＩＸについて報告されたものよりも約３倍長い。ｒＦＩＸの報告された終末相半減期は、１９．３±４．９７時間（１１．１〜３６．４時間の範囲）であり、ＭＲＴは、２６．０±６．０７時間（１５．８〜４６．１時間の範囲）である。Ｒｏｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ９８：３６００−３６０６（２００１）、およびＢＥＮＥＦＩＸ（商標）の製品特性の概要、Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ（２０１０）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ．ｏｒｇ．ｕｋ／ｅｍｃ／ｍｅｄｉｃｉｎｅ／２０３７６／ＳＰＣ／ＢＥＮＥＦＩＸＴＭ／＃ＰＨＡＲＭＡＣＯＤＹＮＡＭＩＣ＿ＰＲＯＰＳ）、これらのそれぞれは、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。したがって、ｒＦＩＸＦｃの範囲は、ｒＦＩＸの範囲と重複しない。同様に、ｒＦＩＸＦｃ活性の平均ＣＬ（３．１８±０．７８ｍＬ／時間／ｋｇ、２．０５〜４．１８ｍＬ／時間／ｋｇの範囲）は、ｒＦＩＸに対して報告されたもの（８．４０±２．０１ｍＬ／時間／ｋｇ、４．６６〜１３．６４ｍＬ／時間／ｋｇの範囲）よりも約２．６倍少ないが、その一方、両方のタンパク質のＶｓｓは、血漿体積の４〜５倍で同等である。
改善に向かっての同じ傾向がｒＦＩＸＦｃ抗原ＰＫにおいて観察されたが、ｒＦＩＸＦｃ抗原のＴ１／２αおよびＴ１／２βの両方は、ＦＩＸ活性測定に由来したものよりも著しく長かった。ｒＦＩＸＦｃ抗原について推定されたＴ１／２αは、ＦＩＸと通常関連するもの（２〜３時間）から明らかに逸脱する。さらに、ｒＦＩＸＦｃの注入前に試験前置換療法からのありそうな不完全なウォッシュアウトが、時々、より高いベースライン値をもたらすことがあり、これは、つまり、ＦＩＸ活性によって測定される、ｒＦＩＸＦｃのＴ１／２βの過小評価をもたらし得る。多くの対象は、投与から最高３３６時間（１４日）後の時点で、ａＰＴＴアッセイの定量限度（１ＩＵ／ｄＬ）を軽く超えて、最大３ＩＵ／ｄＬのａＰＴＴ活性があった。しかしながら、これらの時点は、値が治療前のベースラインであるか、またはわずかに上回っただけのため、終末相半減期の推定値から除外され、それ故に、ベースラインに戻ったと見なされた。対照的に、低いが検出可能なｒＦＩＸＦｃの終末相レベルは、１．０ＩＵ／ｄＬというａＰＴＴの下限と比較して、たった０．１ＩＵ／ｄＬを検出する特異的かつ感受性の高いｒＦＩＸＦｃ抗原ＥＬＩＳＡによって明らかにされ得る。
残りのＰＫパラメーター（活性）は、消失半減期およびＭＲＴに関して、少量変化した。表２７（Ｂ）を参照のこと。ＦＩＸ活性の用量に比例した線形増加が、注入直後に生じるＣｍａｘおよびＡＵＣＩＮＦに基づいて観察された（表４）。ＦＩＸ活性は、ｒＦＩＸＦｃの注入後、二重指数関数的減衰を示し、急速な分布（α）相、続いて、対数線形消失（β）相によって特徴付けられた。平均分布半減期（Ｔ１／２α）は、個々の対象について極めて可変的であった（２つのより高用量群について、３．４および１０．３時間という平均値）（表２７（Ｂ））。平均消失半減期（Ｔ１／２β）は、試験した治療用量の範囲にわたって用量非依存的、即ち、２５ＩＵ／ｋｇ、５０ＩＵ／ｋｇ、および１００ＩＵ／ｋｇで、それぞれ、５３．５時間、５７．５±８．２時間、および５６．５±１４．１時間であった。ｒＦＩＸＦｃ活性の評価値であるベースラインよりも１％（１ＩＵ／ｄＬ）上に至るまでの時間は、用量に比例した増加を示した。それは、２５、５０、および１００ＩＵ／ｋｇの用量について、それぞれ、７．３、１０．１±１．５、および１２．３±２．５日であった。投与から１６８時間（１週間）後、血漿ＦＩＸ活性は、２５、５０、および１００ＩＵ／ｋｇの用量群に対して、それぞれ、ベースラインよりも１．１ＩＵ／ｄＬ、２．５±０．９ＩＵ／ｄＬ、および４．６±１．７ＩＵ／ｄＬ上で持続した。また、２５〜１００ＩＵ／ｋｇの用量範囲にわたってＭＲＴ、ＣＬ、およびＶｓｓは、用量非依存的であった。さらに、注入されたｒＦＩＸＦｃの１ＩＵ／ｋｇごとに、血漿ＦＩＸ活性が平均で０．９３±０．１８ＩＵ／ｄＬ上昇し（表２７（Ｂ））、この増分回収率（Ｋ）は、体重と弱い正の相関を示した（Ｒ２＝０．３３６、ｐ＝０．０４８）。
長期間の実験的な臨床経験が、１〜２ＩＵ／ｄＬもの低さである持続的な血漿因子活性が、重篤なＡ型およびＢ型血友病患者において、突発性出血事象を防ぐのに十分であり（Ｎｉｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．２３２：２５−３２（１９９２）、これは参照することによってその全体が本明細書に組み込まれる）、出血事象の増加は、正常なＦＶＩＩＩ活性が１％未満である時間と関連していることを示唆している。Ｃｏｌｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ ７：４１３−４２０（２００９）、これは参照することによってその全体が本明細書に組み込まれる。したがって、ＰＫ解析は、ベースラインの１％（１ＩＵ／ｄＬ）上のトラフレベルの持続を達成し、ピーク／トラフ変動を減少させ、治療の費用対効果を改善するために、個人に合わせた用量モデリングを用いて予防的治療を最適化するための手段を提供する。Ｃａｒｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ ４：８３−８８（１９９８）、Ｋｉｓｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ ９：２７９〜２８４（２００３）、これらのそれぞれは参照することによってその全体が本明細書に組み込まれる。
異なる投与レジメン後、濃度−時間プロファイルを作成するために、ｒＦＩＸＦｃの集団ＰＫモデルを用いて、モンテカルロシミュレーションを行った。試験した集団におけるモデルパラメーター（ＣＬ、分布容積、コンパートメント間クリアランス、第２のコンパートメント容積）の平均推定値、個人間分散、および残差変動が、この第１／２ａ相試験において採用された。Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４９：１０１２〜１０２４（２００９）、これは参照することによってその全体が本明細書に組み込まれる。各対象について１４〜１６のサンプリング点を有する投与レジメンにつき、１０００人の対象がシミュレートされた。１週間に１回の投与について１４のサンプリング点、１０日ごとの投与について１５のサンプリング点、２週間ごとの投与について１６のサンプリング点があった。体重（ＢＷ）を、Ｗａｎｇら（２００９）の公開された方法に従って、即ち、Ｚ＝ＢＷ−０．５の指数方程式に基づいて得た。１０００人の対象における中央ＢＷ値は、７５ｋｇであると仮定された。シミュレートされた濃度−時間プロファイルに基づいて、１０００人の対象の薬物濃度−時間プロファイルの平均値±標準偏差（ＳＤ）が、異なる投与レジメンについてグラフを使って構築された。図２５。
１週間に２回、２５〜４０ＩＵ／ｋｇのＦＩＸの標準的な推奨される用量レジメンと比較して、本研究からの中央ｒＦＩＸＦｃ活性ＰＫモデリングの結果は、約２０ＩＵ／ｋｇで１週間に約１回、約４０ＩＵ／ｋｇで１０日ごと、または約１００ＩＵ／ｋｇで２週間ごとのｒＦＩＸＦの投与が、ベースラインよりも１％上にトラフを維持するのに十分であることを示す。図２５。これらのモデルシミュレートされた推定値は、第１／２ａ相試験から利用可能なデータによって検証され、これらはシミュレートされた活性−時間曲線の９５％信頼間隔内に完全に入る。しかしながら、血漿ＦＩＸ活性のトラフレベルに対して、報告された臨床的破断出血事象の不均一性を考慮すると（Ｂｊｏｒｋｍａｎ，Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ ９：１０１−１１０（２００３）、Ａｈｎｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ １０：６８９−６９７（２００４）、これらのそれぞれは、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる）、維持用量は、個人に合わせて調整される必要がある可能性があるであろう。

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  1. 明細書に記載された発明。
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