JP2015510769A - ｐＨ感受性免疫グロブリン配列を発現する非ヒト動物 - Google Patents

Abstract

少なくとも１つのヒスチジンを含む免疫グロブリン可変ドメインを発現する、遺伝子改変された非ヒト動物であって、少なくとも１つのヒスチジンが、該動物の生殖細胞系列における非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換、または生殖細胞系列の免疫グロブリンの核酸配列におけるヒスチジンコドンの挿入によりコードされる、遺伝子改変された非ヒト動物が提供される。１つまたは複数のＣＤＲに、Ｎ末端領域に、および／またはループ４領域にヒスチジンを含む免疫グロブリン遺伝子もまた提供される。非抗原結合性の非ヒスチジン残基を置換した、１つまたは複数のヒスチジン（例えば、ヒスチジンクラスター）を含む、免疫グロブリン可変ドメインである。

Description

発明の分野
ｐＨ依存的な様式での抗原への結合が可能な抗体を発現する、遺伝子改変された非ヒト動物である。プロトン化可能なアミノ酸をコードするコドンによる少なくとも１カ所の置換またはプロトン化可能なアミノ酸をコードするコドンの少なくとも１カ所の挿入を含有するように改変された免疫グロブリン遺伝子座を含む、遺伝子改変された非ヒト動物である。免疫グロブリンの重鎖Ｖ遺伝子セグメント、重鎖Ｄ遺伝子セグメント、もしくは重鎖Ｊ遺伝子セグメント、または軽鎖Ｖセグメントもしくは軽鎖Ｊセグメント、またはこれらの再構成された重鎖ＶＤＪ領域もしくは再構成された軽鎖ＶＪ領域に少なくとも１カ所のヒスチジン置換および／または少なくとも１カ所のヒスチジン挿入を含有するように改変された免疫グロブリン遺伝子座を含む、遺伝子改変された非ヒト動物である。抗原への結合においてｐＨ感受性を示す免疫グロブリンを発現する、遺伝子改変された非ヒト動物である。少なくとも１つのヒスチジンを含む免疫グロブリン可変ドメインに関して富化されたＢ細胞集団を含む遺伝子改変動物である。免疫グロブリンの重鎖Ｖ遺伝子セグメント、重鎖Ｄ遺伝子セグメント、および／もしくは重鎖Ｊ遺伝子セグメント、ならびに／または軽鎖Ｖ遺伝子セグメントおよび／もしくは軽鎖Ｊ遺伝子セグメント、ならびに／またはこれらの再構成された重鎖ＶＤＪ配列もしくは再構成された軽鎖ＶＪ配列における挿入および／または置換として存在する２つ以上のヒスチジンのクラスターを含む、遺伝子改変された非ヒト動物である。

再構成されていないヒト重鎖可変領域のヌクレオチド配列を含む、非ヒト動物の遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座であって、再構成されていないヒト重鎖可変領域のヌクレオチド配列が、少なくとも１つのヒスチジンコドンの付加または少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む免疫グロブリン遺伝子座である。齧歯動物、例えば、マウスおよびラットを含む非ヒト動物は、それらのゲノムに、再構成されていないヒト重鎖可変領域のヌクレオチド配列を含む遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座を含み、再構成されていないヒト重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、少なくとも１つのヒスチジンコドンの付加または少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む。遺伝子操作非ヒト動物は、ｐＨ依存性抗原結合、リサイクル性の改善、および／または血清半減期の延長を特徴とする抗原結合タンパク質を発現することが可能である。

背景
免疫グロブリンの結合ドメインは、同種の軽鎖（ｃｏｇｎａｔｅ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ）と会合するホモ二量体免疫グロブリン重鎖という従来の抗体フォーマットを含む多種多様なフォーマットで治療的に使用されている。従来のフォーマットを含むこれらのフォーマットの多くは、多種多様な因子に起因して、ｉｎ ｖｉｖｏにおける最適未満の薬物動態特徴を示す。ここ数十年間において、薬物動態を改善するための異なる手法が試みられてきた。これらは、例えば、ポリマーへのコンジュゲーション（例えば、ＰＥＧ；例えば、Duncan, R.（２００６年）、「Polymer conjugates as anticancer nanomedicines」、Nat. Rev. Cancer、６巻：６８８〜７０１頁において総説されている）により流体力学半径を増加させて、腎クリアランスを低減すること；Ｎ−グリカンのシアル化（例えば、Stork, R.ら、「N-glycosylation as novel strategy to improve pharmacokinetic properties of bispecific single-chain diabodies」、J. Biol. Chem.、２８３巻（１２号）：７８０４〜７８１２頁において総説されている）；中性ｐＨではＦｃ−ＦｃＲｎ間結合を促進するが、エンドソームのｐＨでは放出を促進するためのＦｃ改変、および血清アルブミンとの会合（例えば、Chuangら（２００２年）、「Pharmaceutical Strategies Utilizing Recombinant Serum Albumin」、Pharm. Res.、１９巻（５号）：５６９〜５７７頁を参照されたい）を含む。適切な適用では、そして、適切なフォーマットでは、これらの手法の各々は、何らかの利益をもたらし得る。

Duncan, R.（２００６年）、「Polymer conjugates as anticancer nanomedicines」、Nat. Rev. Cancer、６巻：６８８〜７０１頁 Stork, R.ら、「N-glycosylation as novel strategy to improve pharmacokinetic properties of bispecific single-chain diabodies」、J. Biol. Chem.、２８３巻（１２号）：７８０４〜７８１２頁 Chuangら（２００２年）、「Pharmaceutical Strategies Utilizing Recombinant Serum Albumin」、Pharm. Res.、１９巻（５号）：５６９〜５７７頁

しかし、当技術分野には、ｐＨ依存性結合を示す可変ドメインを工学的に作製する（ｅｎｇｉｎｅｅｒ）ように免疫グロブリン可変ドメイン構造を操作すること（ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ）を含むがこれらに限定されない、生物医薬品のための治療効果および治療モダリティーの改善に対する必要性が依然としてある。様々なフォーマットの抗原結合タンパク質における使用のための可変ドメインであって、抗原結合タンパク質に、標的抗原または受容体への結合に関するｐＨ感受性を付与する可変ドメイン（またはその抗原結合断片）に対する必要性がある。当技術分野には、ｐＨ依存性の免疫グロブリン可変ドメインおよびその抗原結合断片を生成するための系および方法に対する必要性もまたある。多種多様な免疫グロブリン可変ドメインを生成し得る生物学的系であって、多種多様性が、可変ドメインに、ｐＨ感受性、例えば、１つのｐＨ（例えば、中性ｐＨ、または高ｐＨ）では標的抗原またはエピトープに結合するが、第二のｐＨ（例えば、低ｐＨまたはエンドソームのｐＨ）では標的抗原またはエピトープを放出する能力を付与し得る、滴定可能なアミノ酸に関して富化される生物学的系に対する必要性がある。

ある種のフォーマットにある免疫グロブリン軽鎖は、固有の難題を提示する。抗体は、各重鎖モノマーが同一の軽鎖と会合しているホモダイマー重鎖成分を一般的に含む。ヘテロダイマー重鎖成分を有する抗体（例えば、二重特異性抗体）は、治療抗体として望ましい。しかし、二重特異性抗体の重鎖の各々と十分に会合することができる好適な軽鎖成分を有する二重特異性抗体を作製することには、問題があることが判明した。

１つの手法では、全ての軽鎖可変ドメインの使用統計値を調査し、ヒト抗体で最も頻繁に使用される軽鎖を同定し、その軽鎖を異なる特異性の２つの重鎖とｉｎ ｖｉｔｒｏで対合させることによって、軽鎖を選択することができる可能性がある。

別の手法では、ファージディスプレイライブラリー（例えば、ヒト軽鎖可変領域配列を含むファージディスプレイライブラリー、例えばヒトｓｃＦｖライブラリー）において軽鎖配列を観察し、最も一般的に用いられる軽鎖可変領域をライブラリーから選択することによって、軽鎖を選択することができる可能性がある。次に、軽鎖を、目的の２つの異なる重鎖について試験することができる。

別の手法では、目的の両方の重鎖の重鎖可変配列をプローブとして用いて、軽鎖可変配列のファージディスプレイライブラリーを分析することによって、軽鎖を選択することができる可能性がある。両方の重鎖可変配列と会合する軽鎖は、それら重鎖のための軽鎖として選択することができる可能性がある。

別の手法では、候補軽鎖を重鎖の関連軽鎖とアラインメントさせることができ、両方の重鎖の関連軽鎖に共通する配列特性により緊密に一致するように軽鎖が改変される。免疫原性の可能性を最小にする必要がある場合、改変は好ましくは、公知のヒト軽鎖配列に存在する配列をもたらし、ここで、タンパク分解プロセシングが、免疫原性の可能性を評価するための当技術分野で公知であるパラメータおよび方法（すなわち、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏおよびウェットアッセイ）に基づいたＴ細胞エピトープを生成する可能性は低い。

このような手法のいずれも、例えば配列同一性、特異的な前選択された重鎖と会合する能力などのいくつかのアプリオリ制限を含むｉｎ ｖｉｔｒｏの方法に依存する。共通する軽鎖を含むヒトエピトープ結合タンパク質を作製するための、ｉｎ ｖｉｔｒｏ条件における操作に頼らず、代わりにより生物学的で実用的な手法を使用する組成物および方法への必要性が当技術分野にある。

加えて、治療抗体、例えば、二重特異性治療抗体は、それらが、所望の有効性を達成するには、しばしば、高用量を必要とするという点で、ある限界を有する。これは、抗体−抗原複合体がエンドソームへと内部移行して、標的介在性クリアランスと呼ばれるプロセスにおけるリソソーム分解の標的とされるという事実に部分的に起因する。したがって、当技術分野には、より効率的な抗体リサイクリング、例えば、二重特異性抗体リサイクリングをもたらし、抗体の抗原に対する特異性および親和性を損なわずに、エンドソームコンパートメント内の抗体−抗原複合体の解離を促進することにより、抗体の分解を防止する方法および組成物に対する必要性がある。

体内へと投与される、治療用モノクローナル抗体を含む薬物は、糸球体濾過（例えば、尿への）、分泌（例えば、胆汁への）、および細胞による異化を含む様々な排泄機構から影響を受ける可能性がある。低分子が体内から腎濾過を介して除去されるのに対し、分泌される抗体の大部分（例えば、ＩｇＧは糸球体を介して濾過されるには大きすぎる）は、主に細胞介在性異化、例えば、液相エンドサイトーシス（食作用）または受容体介在性エンドサイトーシスを介して体内から除去される。例えば、いくつかの反復エピトープを有する可溶性分子には、複数の循環抗体が結合し、結果として生じる大型の抗原−抗体複合体は、細胞内に迅速に貪食されて、分解される。他方、抗体が結合する細胞表面の標的受容体（すなわち、受容体−抗体複合体）は、用量依存的な様式で標的介在性エンドサイトーシスを受け、これにより、細胞内部でのリソソームによる分解を予定されたエンドソームの形成がなされる。場合によって、エンドサイトーシスを受けた受容体−抗体複合体は、エンドソームの内部において、ｐＨ依存的な様式で、胎児性Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に結合し、細胞表面へと戻り、中性の細胞外ｐＨ（例えば、ｐＨ７．０〜７．４）へと曝露されると、血漿または間質液へと放出される。

当技術分野には、系、例えば、滴定可能な残基を有する抗原結合タンパク質を生成する非ヒト動物、細胞、およびゲノム遺伝子座、例えば、ｐＨの変化に応答する重鎖可変ドメイン、例えば、プロトンを供与または受容し、例えば、それらの結合特徴がプロトン化状態に応じて異なる重鎖可変ドメインを生成するように、免疫グロブリン遺伝子セグメントを再構成する、遺伝子改変された遺伝子座に対する必要性がある。

当技術分野には、目的の抗原に対する抗原結合タンパク質の特異性および親和性を損なうことなく、抗原結合タンパク質の受容体−抗原結合タンパク質複合体からの解離を促進すること、または酸性のエンドソームコンパートメント内でのＦｃＲｎに対する抗原結合タンパク質の親和性を増大させることにより、エンドサイトーシスを受けた抗原結合タンパク質のリサイクリング効率をさらに増大させることが可能な方法および組成物に対する必要性もある。

非ヒト動物の生殖細胞系列の改変によりコードされる、少なくとも１つのヒスチジン残基を含む免疫グロブリン可変ドメインを作製する遺伝子改変動物を作製するための組成物および方法であって、生殖細胞系列における改変が、重鎖Ｖセグメント、重鎖Ｄセグメント、または重鎖Ｊセグメントへのヒスチジンコドンの挿入、軽鎖Ｖセグメントまたは軽鎖Ｊセグメントへのヒスチジンコドンの挿入、再構成された軽鎖ＶＪ遺伝子へのヒスチジンコドンの挿入、重鎖Ｖセグメント、重鎖Ｄセグメント、または重鎖Ｊセグメントにおける非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換、軽鎖Ｖセグメントまたは軽鎖Ｊセグメントにおける非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換、再構成された軽鎖ＶＪ配列における非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換のうちの少なくとも１つを含む組成物および方法が提供される。

非ヒト動物の生殖細胞系列の免疫グロブリン配列にヒスチジンコドンのクラスターを導入するための組成物および方法もまた提供される。

免疫グロブリン遺伝子のＮ末端コード領域に、免疫グロブリン遺伝子のループ４コード領域に、免疫グロブリン遺伝子のＣＤＲコード領域（例えば、再構成されたＶ（Ｄ）Ｊ配列、またはＶ遺伝子セグメント、（Ｄ）遺伝子セグメント、Ｊ遺伝子セグメント）に、ヒスチジンの挿入、または非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を導入するための組成物および方法もまた提供される。

免疫グロブリン重鎖遺伝子座および免疫グロブリン軽鎖遺伝子座の両方に、ヒスチジンコドンの挿入および／または非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む非ヒト動物の子孫を作製するための組成物および方法である。

一態様では、免疫グロブリン可変遺伝子座に、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換または挿入を含む、免疫グロブリン遺伝子座をその生殖細胞系列に含む、遺伝子改変された非ヒト動物である。一実施形態では、可変遺伝子座（例えば、再構成されていないＶ（Ｄ）Ｊセグメント遺伝子座）は、ヒト可変（Ｖ（Ｄ）Ｊセグメント）遺伝子座の少なくとも一部分を含む。

一実施形態では、遺伝子改変された非ヒト動物は、第一の可変遺伝子座（例えば、再構成されていない免疫グロブリン重鎖（Ｖ（Ｄ）Ｊセグメント遺伝子座）および第二の可変遺伝子座（例えば、再構成されていない免疫グロブリン軽鎖（Ｖセグメント遺伝子座、Ｊセグメント遺伝子座；または再構成された免疫グロブリン軽鎖ＶＪ配列）をその生殖細胞系列に含む。

一実施形態では、非ヒト動物は、第一の可変遺伝子座および第二の可変遺伝子座を含み、少なくとも第一の可変遺伝子座または第二の可変遺伝子座は、少なくとも１つのヒスチジンコドンの挿入または少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む。

一実施形態では、第一の可変遺伝子座および第二の可変遺伝子座の両方が各々、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換または挿入を含む。

一実施形態では、第一の可変遺伝子座は、再構成されていない重鎖可変遺伝子座（再構成されていないＶセグメント、Ｄセグメント、Ｊセグメント）の少なくとも機能性部分を含む。

一実施形態では、再構成されていない重鎖可変遺伝子座は、ヒト遺伝子座（再構成されていないＶセグメント、Ｄセグメント、Ｊセグメント）の少なくとも一部分を含む。

一実施形態では、再構成されていない重鎖遺伝子座は、再構成されていないＶセグメント、リンカーを含む合成Ｄセグメント、およびヒトＪセグメントを含むヒト遺伝子座である。一実施形態では、合成Ｄセグメントは、少なくとも１つのヒスチジンコドンを含む。

一実施形態では、第二の可変遺伝子座は、再構成されていない軽鎖遺伝子座（再構成されていないＶセグメント、Ｊセグメント）の少なくとも１つの機能性部分を含む。

一実施形態では、第二の可変遺伝子座は、再構成された免疫グロブリン軽鎖可変遺伝子配列（再構成されたＶＪ配列）を含む。

一実施形態では、非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換および／またはヒスチジンコドンの挿入は、可変ドメインをコードする核酸配列内においてであり、ヒスチジンは、免疫グロブリン鎖のＮ末端領域、免疫グロブリン鎖のループ４領域、重鎖のＣＤＲ１、重鎖のＣＤＲ２、重鎖のＣＤＲ３、軽鎖のＣＤＲ１、軽鎖のＣＤＲ２、軽鎖のＣＤＲ３、およびこれらの組合せから選択される領域にある。

一実施形態では、第一の可変遺伝子座または第二の可変遺伝子座の少なくとも１つは、内因性非ヒト免疫グロブリン遺伝子座において、内因性非ヒト定常領域の核酸配列に作動可能に連結されている。

一実施形態では、第一の可変遺伝子座（再構成されていないヒトＶセグメント、ヒトＤセグメント、ヒトＪセグメント）は、内因性非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域の核酸配列に作動可能に連結されている。

一実施形態では、第一の可変遺伝子座（再構成されていないヒトＶセグメント、ヒトＤセグメント、ヒトＪセグメント）は、内因性非ヒト免疫グロブリン遺伝子座において、内因性非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域の核酸配列に作動可能に連結されている。

一実施形態では、第二の可変遺伝子座（再構成されていないＶセグメント、Ｊセグメント）は、内因性非ヒト免疫グロブリン軽鎖定常領域配列に作動可能に連結されている。

一実施形態では、内因性非ヒト免疫グロブリン軽鎖定常領域配列は、内因性非ヒト免疫グロブリン遺伝子座にある。

一実施形態では、可変領域配列は、非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換および／またはヒスチジンコドンの挿入である、２つ、３つ、４つ、または５つのヒスチジンによるクラスターを含む。

一実施形態では、再構成されていない重鎖遺伝子座は、重鎖遺伝子座の配向の方向に対して反転されたＤ遺伝子セグメントを含む。一実施形態では、反転されたＤセグメントは、親水性のリーディングフレームにある。

一態様では、定常領域遺伝子配列に作動可能に連結された再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域の核酸配列（再構成されていないＶセグメント、Ｄセグメント、Ｊセグメント）の少なくとも一部分であって、Ｖ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、およびＪ遺伝子セグメントのうちの１つまたは複数が、少なくとも１カ所の非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換、または少なくとも１カ所のヒスチジンコドンの挿入を含む、再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域の核酸配列の少なくとも一部分と；定常領域遺伝子配列に作動可能に連結された再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域の核酸配列（再構成されていないＶセグメント、Ｊセグメント）の少なくとも一部分であって、Ｖ遺伝子セグメントおよびＪ遺伝子セグメントのうちの１つまたは複数が、少なくとも１カ所の非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換、または少なくとも１カ所のヒスチジンコドンの挿入を含む、再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域の核酸配列の少なくとも一部分とを含み、マウスの生殖細胞系列におけるヒスチジン置換またはヒスチジン挿入に由来するヒスチジンを含む、免疫グロブリン重鎖可変ドメインおよび／または免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを発現する、遺伝子改変された非ヒト動物が提供される。

一実施形態では、非ヒト動物は、哺乳動物である。一実施形態では、哺乳動物は、齧歯動物である。一実施形態では、齧歯動物は、マウス、ラット、およびハムスターからなる群から選択される。

一実施形態では、再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域の核酸配列は、非ヒト定常領域配列に作動可能に連結されている。

一実施形態では、再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域の核酸配列に作動可能に連結された非ヒト定常領域核酸配列は、非ヒト動物の生殖細胞系列における内因性非ヒト免疫グロブリン遺伝子座にある。

一実施形態では、再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域の核酸配列に作動可能に連結された非ヒト定常領域核酸配列は、非ヒト動物の生殖細胞系列における内因性非ヒト免疫グロブリン遺伝子座にある。

一態様では、定常領域遺伝子配列に作動可能に連結された再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域の核酸配列（再構成されていないＶセグメント、Ｄセグメント、Ｊセグメント）の少なくとも一部分であって、再構成されていないＶ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、およびＪ遺伝子セグメントのうちの１つまたは複数が、少なくとも１カ所の非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換、または少なくとも１カ所のヒスチジンコドンの挿入を含む、再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域の核酸配列の少なくとも一部分と；軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結された再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域の核酸配列（再構成されたＶＪ配列）の少なくとも一部分であって、再構成されたＶＪ配列が、少なくとも１カ所の非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換、または少なくとも１カ所のヒスチジンコドンの挿入を含む、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域の核酸配列の少なくとも一部分とを含み、マウスの生殖細胞系列におけるヒスチジン置換またはヒスチジン挿入に由来するヒスチジンを含む、免疫グロブリン重鎖可変ドメインおよび／または免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを発現する、遺伝子改変された非ヒト動物が提供される。

一実施形態では、遺伝子改変された非ヒト動物は、哺乳動物である。一実施形態では、哺乳動物は、齧歯動物である。一実施形態では、齧歯動物は、マウス、ラット、およびハムスターからなる群から選択される。

一実施形態では、再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域の核酸配列は、非ヒト定常領域配列に作動可能に連結されている。一実施形態では、再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域の核酸配列に作動可能に連結された非ヒト定常領域配列は、非ヒト動物の生殖細胞系列における内因性非ヒト免疫グロブリン遺伝子座にある。一実施形態では、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域の核酸配列に作動可能に連結された非ヒト定常領域配列は、非ヒト動物の生殖細胞系列における内因性非ヒト免疫グロブリン遺伝子座にある。

一態様では、遺伝子改変された非ヒト動物であって、野生型の非ヒト動物と比較した、Ｂ細胞集団の免疫グロブリン重鎖におけるおよび免疫グロブリン軽鎖におけるヒスチジン残基の存在の増強を特徴とするＢ細胞集団を含む、遺伝子改変された非ヒト動物が提供される。一実施形態では、増強は、約２〜４倍である。一実施形態では、増強は、約２〜１０倍である。

一態様では、非ヒト動物の生殖細胞系列の免疫グロブリン配列における置換および／または挿入によりコードされるヒスチジンを含む免疫グロブリン軽鎖および免疫グロブリン重鎖を発現する、遺伝子改変された非ヒト動物が提供される。

一態様では、生殖細胞系列のヒスチジンコドンによりコードされるヒスチジンを有する抗体可変ドメインを作製する非ヒト動物を作製するための方法であって、非ヒト動物をその生殖細胞系列内で、少なくとも１カ所のヒスチジンコドンによる非ヒスチジンコドンの置換またはヒスチジンコドンの挿入を、再構成されていない免疫グロブリン重鎖可変（再構成されていないＶセグメント、Ｄセグメント、Ｊセグメント）遺伝子座に含むように改変するステップと；非ヒト動物をその生殖細胞系列において、少なくとも１カ所のヒスチジンコドンによる非ヒスチジンコドンの置換またはヒスチジンコドンの挿入を、再構成されていない免疫グロブリン軽鎖可変（再構成されていないＶセグメント、Ｊセグメント）遺伝子座に含むように改変するステップとを含む方法が提供される。

一実施形態では、方法は、マウスの生殖細胞系列を、再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変（Ｖセグメント、Ｄセグメント、Ｊセグメント）遺伝子座の少なくとも一部分を含むように遺伝子改変するステップと、ヒスチジン置換またはヒスチジン挿入を、再構成されていない免疫グロブリン重鎖可変（再構成されていないＶセグメント、Ｄセグメント、Ｊセグメント）ヒト遺伝子座に施すステップとを含む。

一実施形態では、方法は、マウスの生殖細胞系列を、再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖（再構成されていないＶセグメント、Ｊセグメント）遺伝子座の少なくとも一部分を含むように遺伝子改変するステップと、ヒスチジン置換またはヒスチジン挿入を、再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖遺伝子座に施すステップとを含む。

方法の一実施形態では、非ヒト動物は、齧歯動物である。一実施形態では、齧歯動物は、マウス、ラット、およびハムスターから選択される。

一態様では、生殖細胞系列のヒスチジンコドンによりコードされるヒスチジンを有する抗体可変ドメインを作製する非ヒト動物を作製するための方法であって、非ヒト動物を、少なくとも１カ所のヒスチジンコドンによる非ヒスチジンコドンの置換またはヒスチジンコドンの挿入を、再構成されていない免疫グロブリン重鎖可変（再構成されていないＶセグメント、Ｄセグメント、Ｊセグメント）遺伝子座に含むように改変するステップと；非ヒト動物を、生殖細胞系列における再構成された免疫グロブリン軽鎖可変配列（再構成されたＶＪ配列）に、少なくとも１カ所のヒスチジンコドンによる非ヒスチジンコドンの置換またはヒスチジンコドンの挿入を含むように改変するステップとを含む方法が提供される。

方法の一実施形態では、非ヒト動物は、齧歯動物である。一実施形態では、齧歯動物は、マウス、ラット、およびハムスターから選択される。

様々な態様および実施形態では、多能性細胞または全能性細胞（例えば、胚性幹（ＥＳ）細胞）を遺伝子改変し、遺伝子改変細胞をドナー細胞として、宿主胚と共に、代理母体内で使用して、遺伝子改変ドナー細胞に由来する動物を懐胎させることにより、非ヒト動物を遺伝子改変する。様々な態様および実施形態では、当技術分野で公知の他の任意の方法により、非ヒト動物を遺伝子改変する。

ｐＨ依存性の抗原結合を示す抗体可変ドメインを作製するための方法および組成物が提供される。低（例えば、エンドソームの）ｐＨでは、標的抗原に低い親和性で結合し、高（例えば、細胞外の）または中性ｐＨでは、同じ標的抗原に高い親和性で結合する、改変された抗原結合タンパク質、ならびにそれらを作製するための組成物および方法が提供される。

一態様では、ｐＨ依存性結合を示す抗体を作製するための方法であって、抗体の可変ドメインの配列を、ヒスチジン残基を付加するか、もしくは既存の残基をヒスチジン残基で置換するか、ヒスチジン改変された可変ドメインを形成するように改変するステップを含む方法が提供される。一実施形態では、置換は、抗原への結合（例えば、中性ｐＨまたは細胞外ｐＨにおける）にそれほど重要でない残基の置換である。

一実施形態では、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つ以上の残基を、ヒスチジンへと置換する。一実施形態では、ヒスチジンへと置換された２つ、３つ、４つ、５つ、または６つ以上の残基はクラスターをなす。一実施形態では、クラスターは、２カ所以上の連続のヒスチジン置換を含む。一実施形態では、クラスターは、１つまたは複数の非ヒスチジン残基で隔てられた２カ所以上のヒスチジン置換を含む。一実施形態では、クラスターは、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０残基の長さであり、抗原への結合（例えば、中性ｐＨまたは細胞外ｐＨにおける）にそれほど重要でない全ての残基を、ヒスチジンへと改変する。

一実施形態では、可変ドメインは、軽鎖可変ドメイン（例えば、κまたはλ）である。一実施形態では、可変ドメインは、重鎖可変ドメインにある。一実施形態では、軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインの配列を改変する。

一実施形態では、可変ドメインの配列は、ＣＤＲ配列である。一実施形態では、ＣＤＲ配列は、重鎖のＣＤＲ配列である。一実施形態では、ＣＤＲ配列は、軽鎖のＣＤＲ配列である。一実施形態では、ＣＤＲ配列は、重鎖のＣＤＲ配列および軽鎖のＣＤＲ配列である。

一実施形態では、ＣＤＲ配列は、ＣＤＲ３配列である。一実施形態では、ＣＤＲ配列は、ＣＤＲ２配列である。一実施形態では、ＣＤＲ配列は、ＣＤＲ３配列である。

一実施形態では、ＣＤＲ配列は、軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３配列である。一実施形態では、ＣＤＲ配列は、重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３配列である。

一実施形態では、抗体の可変ドメインの配列は、ループ４配列である。一実施形態では、ループ４配列は、重鎖のループ４配列である。一実施形態では、ループ４配列は、軽鎖のループ４配列である。

一実施形態では、抗体の可変ドメインの配列は、Ｎ末端配列である。一実施形態では、Ｎ末端配列は、重鎖のＮ末端配列である。一実施形態では、Ｎ末端配列は、軽鎖のＮ末端配列である。

一実施形態では、抗体の可変ドメインの配列は、重鎖のＣＤＲ配列、軽鎖のＣＤＲ配列、重鎖のループ４配列、軽鎖のループ４配列、重鎖のＮ末端配列、軽鎖のＮ末端配列、およびこれらの組合せから選択される。

一実施形態では、可変ドメインは、重鎖からの可変ドメインであり、可変ドメインの配列は、第一のＣＤＲ配列、ならびにＮ末端配列、ループ４配列、第二のＣＤＲ配列、第三のＣＤＲ配列、およびこれらの組合せから選択される配列を含む。具体的な実施形態では、第一のＣＤＲ配列は、ＣＤＲ３であり、可変ドメインの配列は、Ｎ末端配列、ループ４配列、ＣＤＲ２配列、ＣＤＲ１配列、およびこれらの組合せから選択される配列をさらに含む。

一実施形態では、ヒスチジン改変された可変ドメインは、重鎖からの可変ドメインであり、ヒスチジン改変は、ループ４配列に、ならびにＣＤＲ１またはＣＤＲ２またはＣＤＲ３、Ｎ末端配列、およびこれらの組合せから選択される配列にある。具体的な実施形態では、ヒスチジン改変は、ループ４配列におよびＣＤＲ３配列にある。具体的な実施形態では、ヒスチジン改変は、ループ４配列におよびＣＤＲ３配列におよびＮ末端配列にある。具体的な実施形態では、ヒスチジン改変は、ループ４配列におよびＮ末端配列にある。

一態様では、本明細書で記載される、ｈｉｓで改変した免疫グロブリン可変ドメインであって、目的の抗原に結合しないか、または６未満のｐＨでは、目的の抗原に第一の親和性で結合し、約７以上のｐＨでは、同じ目的の抗原に第二の親和性で結合する、ｈｉｓで改変した免疫グロブリン可変ドメインが提供される。一実施形態では、第一のｐＨは、５．５未満または５未満である。一実施形態では、第一のｐＨは、５．７５である。一実施形態では、第二のｐＨは、約７以上である。一実施形態では、第二のｐＨは、ヒト細胞の外のｐＨである。一実施形態では、第二のｐＨは、７．２〜７．４である。具体的な実施形態では、第二のｐＨは、７．２である。

一実施形態では、ｈｉｓで改変した可変ドメインは、１、２、３、４、５、または６カ所以上のヒスチジン置換を、ＣＤＲ、Ｎ末端、ループ４、およびこれらの組合せから選択される配列に含む。具体的な実施形態では、ｈｉｓで改変した可変ドメインはＣＤＲ３における改変を含む。一実施形態では、ｈｉｓで改変した可変ドメインは、重鎖におけるＣＤＲ３の改変、軽鎖におけるＣＤＲ３の改変、およびこれらの組合せから選択される改変を含む。一実施形態では、ｈｉｓで改変した可変ドメインは、少なくとも１カ所の置換をＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ３）に含み、少なくとも１カ所の置換を、Ｎ末端、ループ４、およびこれらの組合せから選択される配列に含む。

一実施形態では、ＣＤＲは、重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、重鎖ＣＤＲ３、軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２、軽鎖ＣＤＲ３、およびこれらの組合せからなる群から選択される。

一実施形態では、少なくとも１つのＣＤＲは、軽鎖ＣＤＲ３を含む。一実施形態では、少なくとも１つのＣＤＲは、軽鎖ＣＤＲ３および重鎖ＣＤＲ３を含む。

一実施形態では、ｈｉｓで改変した免疫グロブリン可変ドメインは、目的の抗原に、中性ｐＨまたは塩基性ｐＨ（例えば、ｐＨ７〜７．４）では、約１０^−６以下（例えば、１０^−７、１０^−８、１０^−９、１０^−１０、１０^−１１、１０^−１２）のＫ_Ｄで結合し、ｈｉｓで改変した免疫グロブリン可変ドメインは、非抗原結合性のアミノ酸残基の全てがヒスチジンで置換されているＣＤＲ１を含むか、またはヒスチジン置換のクラスターを含むＣＤＲ１を含む。一実施形態では、可変ドメインは、酸性ｐＨ（例えば、ｐＨ５〜６、一実施形態では、ｐＨ６）では、目的の抗原に結合しないか、または目的の抗原に、１０^２〜１０^６倍弱く結合する。

一実施形態では、ｈｉｓで改変した免疫グロブリン可変ドメインは、目的の抗原に、中性ｐＨまたは塩基性ｐＨ（例えば、ｐＨ７〜７．４）では、約１０^−６以下（例えば、１０^−７、１０^−８、１０^−９、１０^−１０、１０^−１１、１０^−１２）のＫ_Ｄで結合し、ｈｉｓで改変した免疫グロブリン可変ドメインは、非抗原結合性のアミノ酸残基の全てがヒスチジンで置換されているＣＤＲ２を含むか、またはヒスチジン置換のクラスターを含むＣＤＲ２を含む。一実施形態では、可変ドメインは、酸性ｐＨ（例えば、ｐＨ５〜６、一実施形態では、ｐＨ６）では、目的の抗原に結合しないか、または目的の抗原に、１０^２〜１０^６倍弱く結合する。

一実施形態では、ｈｉｓで改変した免疫グロブリン可変ドメインは、目的の抗原に、中性ｐＨまたは塩基性ｐＨ（例えば、ｐＨ７〜７．４）では、約１０^−６以下（例えば、１０^−７、１０^−８、１０^−９、１０^−１０、１０^−１１、１０^−１２）のＫ_Ｄで結合し、ｈｉｓで改変した免疫グロブリン可変ドメインは、非抗原結合性のアミノ酸残基の全てがヒスチジンで置換されているＣＤＲ３を含むか、またはヒスチジン置換のクラスターを含むＣＤＲ３を含む。一実施形態では、可変ドメインは、酸性ｐＨ（例えば、ｐＨ５〜６、一実施形態では、ｐＨ６）では、目的の抗原に結合しないか、または目的の抗原に、１０^２〜１０^６倍弱く結合する。

一態様では、ｈｉｓで改変したドメインを含むヒト抗原結合ポリペプチドを作製するための方法であって、本明細書で記載される免疫グロブリン可変ドメインヌクレオチド配列を、１つまたは複数のヒスチジンをコードするように改変して、ｈｉｓで改変したドメインをコードする核酸配列を形成するステップと、ｈｉｓで改変したドメインをコードする核酸配列をヒト免疫グロブリン配列へと融合させる（直接またはリンカーにより）ステップとを含む方法が提供される。

一実施形態では、ヒト免疫グロブリン配列は、免疫グロブリン定常ドメイン配列である。具体的な実施形態では、ヒト免疫グロブリン定常ドメイン配列は、Ｃ_Ｈ１、ヒンジ、Ｃ_Ｈ２、Ｃ_Ｈ３、およびこれらの組合せからなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする。

一態様では、本明細書で記載される通りに改変される、ｈｉｓで改変した可変ドメインを発現する細胞が提供される。一実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞である。一実施形態では、細胞は、ＨｅＬａ細胞、ＤＵ１４５細胞、Ｌｎｃａｐ細胞、ＭＣＦ−７細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−４３８細胞、ＰＣ３細胞、Ｔ４７Ｄ細胞、ＴＨＰ−１細胞、Ｕ８７細胞、ＳＨＳＹ５Ｙ（ヒト神経芽細胞腫）細胞、Ｓａｏｓ−２細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＣＨＯ細胞、ＧＨ３細胞、ＰＣ１２細胞、ヒト網膜細胞（例えば、ＰＥＲＣ．６（商標）細胞）、およびＭＣ３Ｔ３細胞から選択される。具体的な実施形態では、細胞は、ＣＨＯ細胞である。

一態様では、本明細書で記載される、ｈｉｓで改変した免疫グロブリン可変ドメインであって、５〜６（例えば、５．７５）のｐＨでは、目的の抗原に結合しないか、または目的の抗原に第一の親和性で結合し、７〜７．４（例えば、７．２）のｐＨでは、同じ目的の抗原に第二の親和性で結合し、少なくとも１つのＣＤＲが２カ所以上のヒスチジン置換を含み、少なくとも１つの非ＣＤＲ配列が１カ所または複数カ所のヒスチジン置換を含み、少なくとも１つの非ＣＤＲ配列がＮ末端配列、ループ４配列、およびこれらの組合せから選択されるｈｉｓで改変した免疫グロブリン可変ドメインが提供される。

一実施形態では、第一の親和性は、結合しないこと、または１０^−６以上（例えば、１０^−３）のＫ_Ｄを特徴とし、第二の親和性は、第一の親和性の少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１０^２倍、少なくとも１０^３倍、少なくとも１０^４倍、少なくとも１０^５倍、または少なくとも１０^６倍の強さであることとして特徴付けられる。

一実施形態では、非ＣＤＲ配列は、少なくとも１つのＣＤＲ配列と同じポリペプチド上にある。一実施形態では、非ＣＤＲ配列は、少なくとも１つのＣＤＲ配列と異なるポリペプチド上にある。

一実施形態では、少なくとも１つのＣＤＲは、重鎖および／または軽鎖のＣＤＲ３であり、ＣＤＲ３は、非抗原結合アミノ酸残基の少なくとも半分のヒスチジンへの置換を含む。具体的な実施形態では、ＣＤＲ３の非抗原結合アミノ酸残基のうちの全てを、ヒスチジンへと置換する。

一実施形態では、少なくとも１つのＣＤＲは重鎖および／または軽鎖のＣＤＲ３であり、ＣＤＲ３は３つ以上の非抗原結合アミノ酸残基のヒスチジンへの置換を含む。一実施形態では、非抗原結合アミノ酸残基のうちの４つ以上をヒスチジンへと置換する。

一実施形態では、少なくとも１つのＣＤＲは重鎖および／または軽鎖のＣＤＲ３であり、ＣＤＲ３は２つ以上の連続的な非抗原結合アミノ酸残基のヒスチジンへの置換を含む。一実施形態では、ＣＤＲ３は３つ以上の連続的な非抗原結合アミノ酸残基のヒスチジンへの置換を含む。

一実施形態では、少なくとも１つのＣＤＲは、軽鎖および／または重鎖のＣＤＲ３であり、軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２、およびこれらの組合せから選択されるＣＤＲをさらに含む。

一実施形態では、少なくとも１つのＣＤＲは、軽鎖および／または重鎖のＣＤＲ３であり、重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、およびこれらの組合せから選択されるＣＤＲをさらに含む。

一実施形態では、ＣＤＲは、重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、重鎖ＣＤＲ３、軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２、軽鎖ＣＤＲ３、およびこれらの組合せからなる群から選択される。

一実施形態では、少なくとも１つのＣＤＲは軽鎖ＣＤＲ３を含む。一実施形態では、少なくとも１つのＣＤＲは軽鎖ＣＤＲ３および重鎖ＣＤＲ３を含む。

一実施形態では、少なくとも１つのＣＤＲは軽鎖および／または重鎖のＣＤＲ３であり、少なくとも１つの非ＣＤＲ配列はループ４配列であり、ループ４配列は１カ所または複数カ所のヒスチジン置換を含む。

一実施形態では、少なくとも１つのＣＤＲは軽鎖および／または重鎖のＣＤＲ３であり、少なくとも１つの非ＣＤＲ配列はＮ末端配列であり、Ｎ末端配列は１カ所または複数カ所のヒスチジン置換を含む。

一実施形態では、少なくとも１つのＣＤＲは軽鎖のＣＤＲ３であり、少なくとも１つの非ＣＤＲ配列は、１カ所または複数カ所のヒスチジン置換を有するＮ末端配列、および１カ所または複数カ所のヒスチジン置換を有するループ４配列を含む。

一実施形態では、少なくとも１つのＣＤＲは重鎖のＣＤＲ３であり、少なくとも１つの非ＣＤＲ配列は、１カ所または複数カ所のヒスチジン置換を有するＮ末端配列、および１カ所または複数カ所のヒスチジン置換を有するループ４配列を含む。

一実施形態では、ｈｉｓで改変した免疫グロブリン可変ドメインは、目的の抗原に、ｐＨ７〜７．４（例えば、ｐＨ７．２）では、約１０^−７以下（例えば、１０^−８、１０^−９、１０^−１０、１０^−１１、１０^−１２）のＫ_Ｄで結合し、ｈｉｓで改変した免疫グロブリン可変ドメインは、非抗原結合性のアミノ酸残基の全てがヒスチジンで置換されているＣＤＲ１を含む。

一実施形態では、ｈｉｓで改変した免疫グロブリン可変ドメインは、目的の抗原に、ｐＨ７〜７．４（例えば、ｐＨ７．２）では、約１０^−７以下（例えば、１０^−８、１０^−９、１０^−１０、１０^−１１、１０^−１２）のＫ_Ｄで結合し、ｈｉｓで改変した免疫グロブリン可変ドメインは、非抗原結合性のアミノ酸残基の全てがヒスチジンで置換されているＣＤＲ２を含む。

一実施形態では、ｈｉｓで改変した免疫グロブリン可変ドメインは、目的の抗原に、ｐＨ７〜７．４（例えば、ｐＨ７．２）では、約１０^−７以下（例えば、１０^−８、１０^−９、１０^−１０、１０^−１１、１０^−１２）のＫ_Ｄで結合し、ｈｉｓで改変した免疫グロブリン可変ドメインは、非抗原結合性のアミノ酸残基の全てがヒスチジンで置換されているＣＤＲ３を含む。

一態様では、本明細書で記載される方法の、ヒト疾患または障害を処置するための医薬の製造における使用が提供される。一実施形態では、医薬は、抗体である。具体的な実施形態では、抗体は、ヒト抗体である。

一態様では、本明細書で記載される、ｈｉｓで改変した可変ドメインの、ヒト疾患または障害を処置するための医薬の製造における使用が提供される。一実施形態では、医薬は、抗体である。具体的な実施形態では、抗体は、ヒト抗体である。

一態様では、本明細書で記載される方法またはｈｉｓで改変した可変ドメインの、ヒト疾患または障害を処置するための医薬の製造における使用であって、医薬が、抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、ｓｃＦｖ、二重特異性ｓｃＦｖ、ダイアボディー、トリアボディー、テトラボディー、Ｖ−ＮＡＲ、ＶＨＨ、ＶＬ、Ｆ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ）２、ＤＶＤ（すなわち、二重可変ドメイン抗原結合タンパク質）、ＳＶＤ（すなわち、単一可変ドメイン抗原結合タンパク質）、または二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（すなわち、ＢｉＴＥ）から選択される抗原結合タンパク質を含む使用が提供される。

一態様では、本明細書で記載される方法であって、重鎖および／または軽鎖のｈｉｓで改変した可変領域配列をヒト重鎖定常領域配列およびヒト軽鎖定常領域配列へと融合させ（直接またはリンカーを介して）て、融合配列を形成するステップと、融合配列を細胞内で発現させるステップと、融合配列を含む発現させた抗原結合タンパク質を回収するステップとをさらに含む方法を使用して、ヒト抗原結合タンパク質を作製するための重鎖可変領域配列およびκ軽鎖可変領域配列またはλ軽鎖可変領域配列を生成する。様々な実施形態では、ヒト重鎖定常領域は、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、およびＩｇＧから選択される。様々な具体的な実施形態では、ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４から選択される。様々な実施形態では、ヒト重鎖定常領域は、Ｃ_Ｈ１、ヒンジ、Ｃ_Ｈ２、Ｃ_Ｈ３、Ｃ_Ｈ４、およびこれらの組合せを含む配列から選択される。具体的な実施形態では、組合せは、Ｃ_Ｈ１、ヒンジ、Ｃ_Ｈ２、およびＣ_Ｈ３である。具体的な実施形態では、組合せは、Ｃ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２、およびＣ_Ｈ３である。具体的な実施形態では、組合せは、ヒンジ、Ｃ_Ｈ２、およびＣ_Ｈ３である。具体的な実施形態では、組合せは、ヒンジ、Ｃ_Ｈ２、およびＣ_Ｈ３である。

一態様では、中性ｐＨでは、標的抗原に結合するが、酸性ｐＨ（例えば、ｐＨ５．０〜６．０）では、同じ抗原の結合の低減を示す抗体または抗体可変ドメインを生成するための生物学的系が提供される。生物学的系は、１つまたは複数のヒスチジン改変を含む、再構成された軽鎖配列（例えば、再構成されたＶ−Ｊ）を有する非ヒト動物、例えば、齧歯動物（例えば、マウスまたはラット）を含む。様々な態様では、１つまたは複数のヒスチジン改変は、軽鎖ＣＤＲ３コドンにおいてである。様々な態様では、非ヒト動物は、ヒト重鎖免疫グロブリン遺伝子座またはヒト化重鎖免疫グロブリン遺伝子座を含む。様々な態様では、非ヒト動物は、内因性非ヒト重鎖可変遺伝子セグメントの、１つまたは複数のヒト重鎖Ｖ_Ｈセグメント、ヒト重鎖Ｄ_Ｈセグメント、およびヒト重鎖Ｊ_Ｈセグメントによる置きかえを含み、ここで、ヒトセグメントは、非ヒト免疫グロブリン定常領域に作動可能に連結されている。様々な態様では、非ヒスチジン残基のヒスチジン残基による置換を有する軽鎖可変ドメインを含む、ユニバーサル軽鎖を有する非ヒト動物が提供される。様々な態様では、これらのヒスチジン改変ユニバーサル軽鎖非ヒト動物（例えば、齧歯動物、例えば、マウス）を、ヒスチジン−ユニバーサル軽鎖マウス、ヒスチジン−ＵＬＣマウス、またはＨＵＬＣマウスと称する。

したがって、一態様では、ヒトＶ_Ｌセグメント配列およびヒトＪ_Ｌセグメント配列を含む、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列を含む、免疫グロブリン軽鎖遺伝子座をその生殖細胞系列内に含む、遺伝子改変された非ヒト動物であって、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列が、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む、遺伝子改変された非ヒト動物が本明細書において提供される。一実施形態では、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン可変領域配列を、免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結する。一実施形態では、免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列は、非ヒト免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列である。一実施形態では、非ヒト免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列は、内因性免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列である。一実施形態では、非ヒト動物は、機能的な、再構成されていない免疫グロブリン軽鎖可変領域を欠く。一実施形態では、免疫グロブリン軽鎖遺伝子座は、内因性非ヒト免疫グロブリン軽鎖遺伝子座にある。

一実施形態では、動物は、免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結された、ヒトＶ_Ｈセグメント、ヒトＤ_Ｈセグメント、およびヒトＪ_Ｈセグメントを含む、再構成されていない免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子配列を含む、免疫グロブリン重鎖遺伝子座を、その生殖細胞系列内にさらに含む。一実施形態では、免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子配列は、非ヒト重鎖定常領域遺伝子配列である。一実施形態では、非ヒト重鎖定常領域遺伝子配列は、内因性免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子配列である。一実施形態では、免疫グロブリン重鎖遺伝子座は、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座にある。

一実施形態では、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換が、相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするヌクレオチド配列内にある。一実施形態では、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換が、ＣＤＲ３をコードするヌクレオチド配列内にある。一実施形態では、置換は、１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ超のＣＤＲ３コドンの置換である。一態様では、免疫グロブリン軽鎖遺伝子座に含まれる、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列は、ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントまたはＶκ３−２０遺伝子セグメントに由来する。一実施形態では、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域は、再構成されたＶκ１−３９／Ｊκ５遺伝子配列またはＶκ３−２０／Ｊκ１遺伝子配列に由来する。一実施形態では、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域は、再構成されたＶκ１−３９／Ｊκ５遺伝子配列に由来し、Ｖκ１−３９／Ｊκ５遺伝子配列は、１０５、１０６、１０８、１１１位、およびこれらの組合せから選択される位置においてヒスチジンを発現するようにデザインされた、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置きかえを含む。別の実施形態では、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域は、再構成されたＶκ３−２０／Ｊκ１遺伝子配列に由来し、Ｖκ３−２０／Ｊκ１遺伝子配列は、１０５、１０６、１０７、１０９位、およびこれらの組合せから選択される位置においてヒスチジンを発現するようにデザインされた、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置きかえを含む。

一態様では、本明細書に記載されている非ヒト動物は、目的の抗原に応答するＢ細胞集団であって、中性ｐＨと比較して、酸性ｐＨにおける解離半減期（ｔ_１／２）が少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、または少なくとも約３０倍の短縮を示す抗体が富化されたＢ細胞集団を含む。一実施形態では、中性ｐＨと比較して、酸性ｐＨにおけるｔ_１／２の短縮は、約３０倍以上である。

一実施形態では、動物は、免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列内で置換された少なくとも１つのコドンによりコードされるアミノ酸位置において、少なくとも１つの非ヒスチジン残基のヒスチジン残基による置換を有する、ヒト免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む抗体を発現する。一実施形態では、動物は、体細胞超変異にもかかわらず、発現するヒト免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン内に、少なくとも１つの非ヒスチジン残基のヒスチジン残基による置換を保持する抗体を発現する。

一実施形態では、非ヒト動物は、哺乳動物である。一実施形態では、哺乳動物は、齧歯動物、例えば、ラットまたはマウスである。一実施形態では、非ヒト動物は、マウスである。したがって、一態様では、ヒトＶ_Ｌセグメント配列およびヒトＪ_Ｌセグメント配列を含む、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列を含む、免疫グロブリン軽鎖遺伝子座をその生殖細胞系列内に含む遺伝子改変マウスであって、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列が、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンによる置換を含む遺伝子改変マウスもまた本明細書において提供される。一実施形態では、マウスは、機能的な、再構成されていない免疫グロブリン軽鎖可変領域を欠く。

一実施形態では、マウスの生殖細胞系列内の、単一の、再構成された免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列を、免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結する。一実施形態では、免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列は、ラットまたはマウスの免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列から選択される。一実施形態では、免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列は、マウス配列である。一実施形態では、免疫グロブリン軽鎖遺伝子座は、内因性マウス免疫グロブリン軽鎖遺伝子座にある。

さらなる実施形態では、マウスはまた、免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結された、ヒトＶ_Ｈセグメント、ヒトＤ_Ｈセグメント、およびヒトＪ_Ｈセグメントを含む、再構成されていない免疫グロブリン重鎖可変領域配列を含む、免疫グロブリン重鎖遺伝子座もその生殖細胞系列内に含む。一態様では、免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子配列は、ラットまたはマウスの重鎖定常領域遺伝子配列である。一実施形態では、免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子配列は、マウス配列である。一実施形態では、免疫グロブリン重鎖遺伝子座は、内因性マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座にある。

一態様では、マウスは、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含み、ここで、置換は、ＣＤＲをコードするヌクレオチド配列内にある。一実施形態では、置換は、ＣＤＲ３コドン、例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ超のＣＤＲ３コドンにある。一実施形態では、マウスの免疫グロブリン軽鎖遺伝子座は、ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントまたはヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントに由来する、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列を含み、例えば、単一の、再構成された免疫グロブリン軽鎖可変領域配列は、再構成されたＶκ１−３９／Ｊκ５遺伝子配列またはＶκ３−２０／Ｊκ１遺伝子配列に由来する。一実施形態では、単一の、再構成された免疫グロブリン軽鎖可変領域配列は、再構成されたＶκ１−３９／Ｊκ５遺伝子配列に由来し、Ｖκ１−３９／Ｊκ５配列は、１０５、１０６、１０８、１１１位、およびこれらの組合せから選択される位置においてヒスチジンを発現するようにデザインされた、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置きかえを含む。一実施形態では、このような置きかえを、１０５、１０６、１０８、および１１１位においてヒスチジンで置きかえるようにデザインする。別の実施形態では、このような置きかえを、１０６、１０８、および１１１位においてヒスチジンで置きかえるようにデザインする。

別の実施形態では、単一の、再構成された免疫グロブリン軽鎖可変領域配列は、再構成されたＶκ３−２０／Ｊκ１遺伝子配列に由来し、Ｖκ３−２０／Ｊκ１配列は、１０５、１０６、１０７、１０９位、およびこれらの組合せから選択される位置においてヒスチジンを発現するようにデザインされた、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置きかえを含む。一実施形態では、このような置きかえを、１０５、１０６、１０７、および１０９位においてヒスチジンで置きかえるようにデザインする。別の実施形態では、このような置きかえを、１０５、１０６、および１０９位においてヒスチジンで置きかえるようにデザインする。

一実施形態では、本明細書に記載されているマウスは、目的の抗原に応答するＢ細胞集団であって中性ｐＨと比較して、酸性ｐＨでの解離半減期（ｔ_１／２）が少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、または少なくとも約３０分倍の短縮を示す抗体が富化されたＢ細胞集団を含む。一実施形態では、中性ｐＨと比較して、酸性ｐＨにおけるｔ_１／２の短縮は約３０倍以上である。

一実施形態では、本明細書に記載されているマウスは、目的の抗原に応答する抗原特異的抗体の集団を発現し、ここで、全ての抗体は、（ａ）少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む、同じ、単一の、再構成されたヒト軽鎖可変領域遺伝子配列に由来する免疫グロブリン軽鎖可変ドメインと、（ｂ）ヒト重鎖Ｖセグメント、ヒト重鎖Ｄセグメント、およびヒト重鎖Ｊセグメントのレパートリーに由来する重鎖可変ドメインを含む免疫グロブリン重鎖とを含む。

本明細書では、ヒトＶ_Ｌセグメント配列およびヒトＪ_Ｌセグメント配列を含む、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列を含む非ヒト遺伝子座、例えば、マウス遺伝子座であって、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列が、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む非ヒト遺伝子座もまた提供される。一実施形態では、遺伝子座は、非ヒト動物の生殖細胞系列内に含まれる。一実施形態では、遺伝子座は、ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントまたはヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントに由来する、例えば、再構成されたＶκ１−３９／Ｊκ５遺伝子配列またはＶκ３−２０／Ｊκ１遺伝子配列に由来する、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列を含む。遺伝子座内に存在する、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列が、再構成されたＶκ１−３９／Ｊκ５配列に由来する一実施形態では、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を、１０５、１０６、１０８、１１１位、およびこれらの組合せから選択される位置においてヒスチジンを発現するようにデザインする。遺伝子座内に存在する、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列が、再構成されたＶκ３−２０／Ｊκ１配列に由来する別の実施形態では、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を、１０５、１０６、１０７、１０９位、およびこれらの組合せから選択される位置においてヒスチジンを発現するようにデザインする。様々な実施形態では、本明細書に記載されている非ヒト遺伝子座は、遺伝子改変された非ヒト動物を作製するための、下記で記載される方法を用いて生成することができる。

さらに別の態様では、遺伝子改変された免疫グロブリン軽鎖遺伝子座をその生殖細胞系列内に含む非ヒト動物を作製するための方法であって、非ヒト動物のゲノムを改変して、免疫グロブリン軽鎖遺伝子座内の、内因性免疫グロブリンの軽鎖Ｖセグメントおよび軽鎖Ｊセグメントを欠失させるか、または非機能的にするステップと、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む、単一の、再構成されたヒト軽鎖可変領域遺伝子配列をゲノムに配置するステップとを含む方法が本明細書において提供される。一実施形態では、このような方法は、目的の抗原へのｐＨ依存性結合を示す抗体が富化されたＢ細胞集団を含む、遺伝子改変された非ヒト動物を結果としてもたらす。一実施形態では、ゲノムに配置される、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列は、ヒトＶκ１−３９またはヒトＶκ３−２０、例えば、再構成されたＶκ１−３９／Ｊκ５遺伝子配列またはＶκ３−２０／Ｊκ１遺伝子配列に由来する。したがって、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列が、再構成されたＶκ１−３９／Ｊκ５に由来する実施形態では、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を、１０５、１０６、１０８、１１１位、およびこれらの組合せから選択される位置においてヒスチジンを発現するようにデザインする。単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列が、再構成されたＶκ３−２０／Ｊκ１に由来する実施形態では、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換が、１０５、１０６、１０７、１０９位、およびこれらの組合せから選択される位置においてヒスチジンを発現するようにデザインする。

別の態様では、目的の抗原へのｐＨ依存性結合を示す抗体を生成する方法であって、（ａ）本明細書に記載されているマウス（例えば、ヒトＶ_Ｌセグメント配列およびヒトＪ_Ｌセグメント配列を含む、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列を含み、その再構成された軽鎖可変領域配列内に、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む、免疫グロブリン軽鎖遺伝子座をその生殖細胞系列内に含むマウス）を生成するステップと、（ｂ）マウスを目的の抗原で免疫するステップと、（ｃ）中性ｐＨでは、目的の抗原に所望の親和性で結合するが、酸性ｐＨでは、抗原への結合の低減を提示する抗体を選択するステップとを含む方法が本明細書において提供される。一実施形態では、方法は、酸性ｐＨおよび３７℃で、約２分間以下のｔ_１／２を示す抗体の生成を結果としてもたらす。一実施形態では、方法は、中性ｐＨと比較して、酸性ｐＨにおける解離半減期（ｔ_１／２）が少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、または少なくとも約３０倍の短縮を提示する抗体の生成を結果としてもたらす。

他の態様では、目的の抗原へのｐＨ依存性結合を示す抗体を生成するさらなる方法が本明細書において提供される。１つのこのような方法は、（ａ）目的の抗原に所望の親和性で結合する第一の抗体を選択するステップと、（ｂ）第一の抗体の免疫グロブリン軽鎖ヌクレオチド配列を、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含むように改変するステップと、（ｃ）第一の抗体の免疫グロブリン重鎖および改変された免疫グロブリン軽鎖を細胞内で発現させるステップと、（ｄ）細胞内で発現した第二の抗体であって、中性ｐＨでは、目的の抗原に対する所望の親和性を保持し、酸性ｐＨでは、目的の抗原への結合の低減を提示する第二の抗体を選択するステップとを含む。一実施形態では、第一の抗体の免疫グロブリン軽鎖ヌクレオチド配列は、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列を含む。一実施形態では、第一の抗体を、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列に由来する免疫グロブリン軽鎖配列を含む非ヒト動物、例えば、マウスにおいて生成し、免疫グロブリン軽鎖の改変を、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン可変領域配列内に施す。一実施形態では、第一の抗体を、ヒトＶ_Ｈセグメント、ヒトＤ_Ｈセグメント、およびヒトＪ_Ｈセグメントのレパートリーに由来する免疫グロブリン重鎖配列をさらに含む非ヒト動物、例えば、マウスにおいて生成する。一実施形態では、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列は、Ｖκ１−３９／Ｊκ５遺伝子配列およびＶκ３−２０／Ｊκ１遺伝子配列から選択される。単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列が、Ｖκ１−３９／Ｊκ５である実施形態では、第一の抗体の免疫グロブリン軽鎖ヌクレオチド配列内の改変を、１０５、１０６、１０８、１１１位、およびこれらの組合せから選択される位置でＣＤＲ３コドンにおいて施す。単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列が、Ｖκ３−２０／Ｊκ１である実施形態では、第一の抗体の免疫グロブリン軽鎖ヌクレオチド配列内の改変を、１０５、１０６、１０７、１０９位、およびこれらの組合せから選択される位置でＣＤＲ３コドンにおいて施す。

一実施形態では、本明細書に記載されている、目的の抗原へのｐＨ依存性結合を示す抗体を生成する方法は、中性ｐＨと比較して、酸性ｐＨにおける解離半減期（ｔ_１／２）が少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、または少なくとも約３０倍の短縮を提示する抗体を結果としてもたらす。一実施形態では、抗体を生成する方法は、酸性ｐＨおよび３７℃で、約２分間以下のｔ_１／２を示す抗体を結果としてもたらす。

非ヒト動物の生殖細胞系列ゲノムにおける、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座であって、遺伝子改変された、再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列（例えば、１つまたは複数の遺伝子改変されたヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメント、ヒトＤ遺伝子セグメント、および／またはヒトＪ_Ｈ遺伝子セグメント）を含み、再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列が、少なくとも１つのヒスチジンコドンの付加または少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む免疫グロブリン重鎖遺伝子座が提供される。様々な実施形態では、遺伝子改変された、再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、免疫グロブリン重鎖可変ドメインをコードする少なくとも１つのリーディングフレームに少なくとも１つのヒスチジンコドンを含む。様々な実施形態では、少なくとも１つのヒスチジンコドンを含む、再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、ヒトまたは非ヒトの重鎖定常領域のヌクレオチド配列（例えば、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、およびＩｇＧから選択される免疫グロブリンアイソタイプをコードする、重鎖定常領域のヌクレオチド配列）に作動可能に連結されている。

免疫グロブリン重鎖のゲノム遺伝子座を、それらの生殖細胞系列ゲノムに含有するように遺伝子操作された非ヒト動物（哺乳動物、例えば、マウス、ラット、またはハムスターなどの齧歯動物）であって、ゲノム遺伝子座が、再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列（例えば、１つまたは複数の遺伝子改変されたヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメント、ヒトＤ遺伝子セグメント、および／またはヒトＪ_Ｈ遺伝子セグメント）を含み、再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列が、少なくとも１つのヒスチジンコドンの付加または少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む非ヒト動物が提供される。様々な実施形態では、非ヒト動物のゲノムは、（ｉ）内因性免疫グロブリンのＶ_Ｈ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、および／またはＪ_Ｈ遺伝子セグメントの全てまたは実質的に全てを欠失させるか、または非機能性にする（例えば、免疫グロブリン遺伝子座内にヌクレオチド配列、例えば、外因性ヌクレオチド配列の挿入を介して、または内因性のＶ_Ｈ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、および／もしくはＪ_Ｈ遺伝子セグメントの非機能性の再構成もしくは反転を介して）改変；ならびに（ｉｉ）再構成されていないヒト重鎖可変領域のヌクレオチド配列（例えば、遺伝子改変されたヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメント、ヒトＤ遺伝子セグメント、またはヒトＪ_Ｈ遺伝子セグメント）を導入する改変であって、再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列が、少なくとも１つのヒスチジンコドンの付加または少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む改変を含む。様々な実施形態では、再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、内因性遺伝子座に存在する（すなわち、再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列が野生型の非ヒト動物にある場合）か、または異所性に（例えば、そのゲノムにおける内因性免疫グロブリンの重鎖遺伝子座と異なる遺伝子座に）存在するか、またはその内因性の遺伝子座内に存在する（例えば、免疫グロブリン可変遺伝子座内に存在し、ここで、該内因性の遺伝子座は、ゲノムにおける異なる位置に配置されるか、またはゲノムにおける異なる位置へと移動している）。様々な実施形態では、免疫グロブリン重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、ヒトまたは非ヒトの重鎖定常領域のヌクレオチド配列（例えば、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、およびＩｇＧから選択される免疫グロブリンアイソタイプをコードする、重鎖定常領域のヌクレオチド配列）に作動可能に連結されている。

１つまたは複数のヒスチジンを含む、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖可変ドメインを発現させることが可能な、遺伝子改変された非ヒト動物であって、１つまたは複数のヒスチジンが、対応する野生型非ヒト動物の生殖細胞系列遺伝子セグメントによりコードされない非ヒト動物が提供される。

対応する野生型非ヒト動物の生殖細胞系列遺伝子セグメントによりコードされない、１つまたは複数のヒスチジンを有する免疫グロブリン重鎖可変ドメインをコードする、再構成された免疫グロブリン重鎖可変遺伝子を特徴とするＢ細胞集団を含む、遺伝子改変された非ヒト動物が提供される。

重鎖可変ドメインをコードする少なくとも１つのリーディングフレームに１つまたは複数のヒスチジンコドンを含有する、再構成されていないヒト重鎖可変領域のヌクレオチド配列を含む、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖可変遺伝子座を含む非ヒト動物を作製するための方法および組成物が提供される。

抗原のｐＨ依存性結合を示す、抗原結合タンパク質を作製する非ヒト動物のための方法および組成物が提供される。ｐＨ依存性の抗原結合タンパク質、例えば、特に、重鎖可変ドメインおよび／またはこれらの抗原結合断片が富化された（対応する野生型動物と比較して）、Ｂ細胞集団または抗体集団を有する非ヒト動物を作製するための方法および組成物が提供される。

一態様では、再構成されていないヒト重鎖可変領域のヌクレオチド配列を含む、非ヒト動物の生殖細胞系列ゲノムにおける遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座であって、再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列が、少なくとも１つのヒスチジンコドンの付加または少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む免疫グロブリン遺伝子座が提供される。

一実施形態では、非ヒト動物は、齧歯動物、例えば、マウス、ラット、またはハムスターを含む哺乳動物である。

一実施形態では、付加または置換されたヒスチジンコドンは、ヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメント、ヒトＤ遺伝子セグメント、ヒトＪ_Ｈ遺伝子セグメント、およびこれらの組合せから選択される、免疫グロブリン重鎖遺伝子セグメントに存在する。一実施形態では、免疫グロブリン重鎖遺伝子セグメントは、ヒト生殖細胞系列Ｖ_Ｈ遺伝子セグメント、ヒト生殖細胞系列Ｄ遺伝子セグメント、ヒト生殖細胞系列Ｊ_Ｈ遺伝子セグメント、およびこれらの組合せから選択される。

一実施形態では、ヒトＶ遺伝子セグメント（Ｖ_Ｈ）は、Ｖ_Ｈ１−２、Ｖ_Ｈ１−３、Ｖ_Ｈ１−８、Ｖ_Ｈ１−１８、Ｖ_Ｈ１−２４、Ｖ_Ｈ１−４５、Ｖ_Ｈ１−４６、Ｖ_Ｈ１−５８、Ｖ_Ｈ１−６９、Ｖ_Ｈ２−５、Ｖ_Ｈ２−２６、Ｖ_Ｈ２−７０、Ｖ_Ｈ３−７、Ｖ_Ｈ３−９、Ｖ_Ｈ３−１１、Ｖ_Ｈ３−１３、Ｖ_Ｈ３−１５、Ｖ_Ｈ３−１６、Ｖ_Ｈ３−２０、Ｖ_Ｈ３−２１、Ｖ_Ｈ３−２３、Ｖ_Ｈ３−３０、Ｖ_Ｈ３−３０−３、Ｖ_Ｈ３−３０−５、Ｖ_Ｈ３−３３、Ｖ_Ｈ３−３５、Ｖ_Ｈ３−３８、Ｖ_Ｈ３−４３、Ｖ_Ｈ３−４８、Ｖ_Ｈ３−４９、Ｖ_Ｈ３−５３、Ｖ_Ｈ３−６４、Ｖ_Ｈ３−６６、Ｖ_Ｈ３−７２、Ｖ_Ｈ３−７３、Ｖ_Ｈ３−７４、Ｖ_Ｈ４−４、Ｖ_Ｈ４−２８、Ｖ_Ｈ４−３０−１、Ｖ_Ｈ４−３０−２、Ｖ_Ｈ４−３０−４、Ｖ_Ｈ４−３１、Ｖ_Ｈ４−３４、Ｖ_Ｈ４−３９、Ｖ_Ｈ４−５９、Ｖ_Ｈ４−６１、Ｖ_Ｈ５−５１、Ｖ_Ｈ６−１、Ｖ_Ｈ７−４−１、Ｖ_Ｈ７−８１、およびこれらの組合せからなる群から選択される。

一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントは、Ｄ１−１、Ｄ１−７、Ｄ１−１４、Ｄ１−２０、Ｄ１−２６、Ｄ２−２、Ｄ２−８、Ｄ２−１５、Ｄ２−２１、Ｄ３−３、Ｄ３−９、Ｄ３−１０、Ｄ３−１６、Ｄ３−２２、Ｄ４−４、Ｄ４−１１、Ｄ４−１７、Ｄ４−２３、Ｄ５−１２、Ｄ５−５、Ｄ５−１８、Ｄ５−２４、Ｄ６−６、Ｄ６−１３、Ｄ６−１９、Ｄ６−２５、Ｄ７−２７、およびこれらの組合せからなる群から選択される。

一実施形態では、ヒトＪ遺伝子セグメントは、Ｊ_Ｈ１、Ｊ_Ｈ２、Ｊ_Ｈ３、Ｊ_Ｈ４、Ｊ_Ｈ５、Ｊ_Ｈ６、およびこれらの組合せからなる群から選択される。

一実施形態では、付加または置換されたヒスチジンコドンは、Ｎ末端領域、ループ４領域、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、またはこれらの組合せをコードする、再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列に存在する。

一実施形態では、再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上、１０以上、１１以上、１２以上、１３以上、１４以上、１５以上、１６以上、１７以上、１８以上、１９以上、２０以上、２１以上、２２以上、２３以上、２４以上、または２５以上、２６以上、２７以上、２８以上、２９以上、３０以上、３１以上、３２以上、３３以上、３４以上、３５以上、３６以上、３７以上、３８以上、３９以上、４０以上、４１以上、４２以上、４３以上、４４以上、４５以上、４６以上、４７以上、４８以上、４９以上、５０以上、５１以上、５２以上、５３以上、５４以上、５５以上、５６以上、５７以上、５８以上、５９以上、６０以上、または６１以上のヒスチジンコドンを含む。

一実施形態では、再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、およびＩｇＡから選択される免疫グロブリンアイソタイプをコードする、ヒトまたは非ヒトの重鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。

一実施形態では、再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、Ｃ_Ｈ１、ヒンジ、Ｃ_Ｈ２、Ｃ_Ｈ３、およびこれらの組合せから選択される、ヒトまたは非ヒトの重鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｃ_Ｈ１、ヒンジ、Ｃ_Ｈ２、およびＣ_Ｈ３（Ｃ_Ｈ１−ヒンジ−Ｃ_Ｈ２−Ｃ_Ｈ３）を含む。

一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、内因性遺伝子座に存在する（すなわち、ヌクレオチド配列が野生型の非ヒト動物にある場合）か、または異所性に存在する（例えば、そのゲノムにおける内因性免疫グロブリン鎖の遺伝子座と異なる遺伝子座に存在する、またはその内因性の遺伝子座内に、例えば、免疫グロブリン可変遺伝子座内に存在し、ここで、該内因性の遺伝子座は、ゲノムにおける異なる位置に配置されるか、またはゲノムにおける異なる位置へと移動している）。

一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｃ_Ｈ２におけるまたはＣ_Ｈ３における改変であって、酸性の環境で（例えば、ｐＨが、約５．５〜約６．０の範囲であるエンドソーム内で）重鎖定常領域アミノ酸配列のＦｃＲｎへの親和性を増大させる改変を含む。

一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、２５０位における改変（例えば、ＥまたはＱ）；２５０および４２８位における改変（例えば、ＬまたはＦ）；２５２位における改変（例えば、Ｌ／Ｙ／Ｆ／ＷまたはＴ）、２５４位における改変（例えば、ＳまたはＴ）、および２５６位における改変（例えば、Ｓ／Ｒ／Ｑ／Ｅ／ＤまたはＴ）；または４２８および／もしくは４３３位における改変（例えば、Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｐ／ＱまたはＫ）、および／もしくは４３４位における改変（例えば、Ｈ／ＦまたはＹ）；または２５０および／もしくは４２８位における改変；または３０７もしくは３０８位における改変（例えば、３０８Ｆ、Ｖ３０８Ｆ）、ならびに４３４位における改変を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。一実施形態では、改変は、４２８Ｌ（例えば、Ｍ４２８Ｌ）および４３４Ｓ（例えば、Ｎ４３４Ｓ）の改変；４２８Ｌ、２５９Ｉ（例えば、Ｖ２５９Ｉ）、および３０８Ｆ（例えば、Ｖ３０８Ｆ）の改変；４３３Ｋ（例えば、Ｈ４３３Ｋ）および４３４位（例えば、４３４Ｙ）の改変；２５２、２５４、および２５６位（例えば、２５２Ｙ、２５４Ｔ、および２５６Ｅ）における改変；２５０Ｑおよび４２８Ｌの改変（例えば、Ｔ２５０ＱおよびＭ４２８Ｌ）；ならびに３０７および／または３０８位における改変（例えば、３０８Ｆまたは３０８Ｐ）であって、酸性の環境で（例えば、ｐＨが、約５．５〜約６．０の範囲であるエンドソーム内で）重鎖定常領域アミノ酸配列のＦｃＲｎへの親和性を増大させる改変を含む。

一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、２５２位のアミノ酸残基と２５７位のアミノ酸残基との間に、少なくとも１つの改変であって、酸性の環境で（例えば、ｐＨが、約５．５〜約６．０の範囲であるエンドソーム内で）ヒトＣ_Ｈ２のアミノ酸配列のＦｃＲｎへの親和性を増大させる改変を含む、ヒトＣ_Ｈ２のアミノ酸配列をコードする。

一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、３０７位のアミノ酸残基と３１１位のアミノ酸残基との間に、少なくとも１つの改変であって、酸性の環境で（例えば、ｐＨが、約５．５〜約６．０の範囲であるエンドソーム内で）ヒトＣ_Ｈ２のアミノ酸配列のＦｃＲｎへの親和性を増大させる改変を含む、ヒトＣ_Ｈ２のアミノ酸配列をコードする。

一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、４３３位のアミノ酸残基と４３６位のアミノ酸残基との間に、少なくとも１つの改変であって、酸性の環境で（例えば、ｐＨが、約５．５〜約６．０の範囲であるエンドソーム内で）ヒトＣ_Ｈ３のアミノ酸配列のＦｃＲｎへの親和性を増大させる改変を含む、ヒトＣ_Ｈ３のアミノ酸配列をコードする。

一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｍ４２８Ｌ、Ｎ４３４Ｓ、およびこれらの組合せからなる群から選択される変異を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。

一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｍ４２８Ｌ、Ｖ２５９Ｉ、Ｖ３０８Ｆ、およびこれらの組合せからなる群から選択される変異を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。

一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｎ４３４Ａ変異を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。

一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ、およびこれらの組合せからなる群から選択される変異を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。

一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｔ２５０Ｑ、Ｍ２４８Ｌ、またはこれらの両方からなる群から選択される変異を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。

一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｈ４３３Ｋ、Ｎ４３４Ｙ、またはこれらの両方からなる群から選択される変異を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。

一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、（１）本明細書に記載されている、再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域のヌクレオチド配列が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４、およびこれらの組合せから選択されるヒトＩｇＧの第一のＣＨ_３のアミノ酸配列をコードする第一の重鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結されている、第一の対立遺伝子；ならびに（２）本明細書に記載されている、再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域のヌクレオチド配列が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４、およびこれらの組合せから選択されるヒトＩｇＧの第二のＣ_Ｈ３のアミノ酸配列をコードする第二の重鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結されており、第二のＣＨ_３のアミノ酸配列が、第二のＣＨ_３のアミノ酸配列のプロテインＡへの結合を低減するか、または消失させる改変（例えば、ＵＳ２０１０／０３３１５２７Ａ１を参照されたい）を含む、第二の対立遺伝子を含む。

一実施形態では、第二のＣＨ_３のアミノ酸配列は、Ｈ９５Ｒの改変（ＩＭＧＴエクソン番号付けによる；ＥＵ番号付けによるＨ４３５Ｒ）を含む。一実施形態では、第二のＣＨ_３のアミノ酸配列は、Ｙ９６Ｆの改変（ＩＭＧＴエクソン番号付けによる；ＥＵによるＨ４３６Ｆ）をさらに含む。別の実施形態では、第二のＣＨ_３のアミノ酸配列は、Ｈ９５Ｒの改変（ＩＭＧＴエクソン番号付けによる；ＥＵ番号付けによるＨ４３５Ｒ）およびＹ９６Ｆの改変（ＩＭＧＴエクソン番号付けによる；ＥＵによるＨ４３６Ｆ）の両方を含む。

一実施形態では、第二のＣＨ_３のアミノ酸配列は、改変ヒトＩｇＧ１からのアミノ酸配列であり、Ｄ１６Ｅ、Ｌ１８Ｍ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴ；ＥＵによるＤ３５６Ｅ、Ｌ３８Ｍ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、およびＶ４２２Ｉ）からなる群から選択される変異をさらに含む。

一実施形態では、第二のＣＨ_３のアミノ酸配列は、改変ヒトＩｇＧ２からのアミノ酸配列であり、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴ：ＥＵによるＮ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、およびＶ４２２Ｉ）からなる群から選択される変異をさらに含む。

一実施形態では、第二のＣＨ_３のアミノ酸配列は、改変ヒトＩｇＧ４からのアミノ酸配列であり、Ｑ１５Ｒ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、Ｒ６９Ｋ、Ｅ７９Ｑ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴ：ＥＵによるＱ３５５Ｒ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、Ｒ４０９Ｋ、Ｅ４１９Ｑ、およびＶ４２２Ｉ）からなる群から選択される変異をさらに含む。

一実施形態では、重鎖定常領域アミノ酸配列は、非ヒト定常領域のアミノ酸配列であり、重鎖定常領域アミノ酸配列は、上記の種類の改変のうちのいずれかのうちの１つまたは複数を含む。

一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、ヒト重鎖定常領域のアミノ酸配列であり、ヒト重鎖定常領域のアミノ酸配列は、上記で記載した種類の改変のうちのいずれかのうちの１つまたは複数を含む。

一実施形態では、全てまたは実質的に全ての内因性のＶ_Ｈ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、およびＪ_Ｈ遺伝子セグメントを、免疫グロブリン重鎖遺伝子座から欠失させるか、または非機能性にする（例えば、免疫グロブリン遺伝子座内にヌクレオチド配列（例えば、外因性ヌクレオチド配列）の挿入を介して、または内因性のＶ_Ｈセグメント、Ｄセグメント、Ｊ_Ｈセグメントの非機能性の再構成または反転を介して）。一実施形態では、例えば、全ての内因性のＶ_Ｈ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、またはＪ_Ｈ遺伝子セグメントのうちの約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、約９６％以上、約９７％以上、約９８％以上、または約９９％以上を欠失させるか、または非機能性にする。一実施形態では、例えば、内因性の機能性Ｖ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、またはＪ遺伝子セグメントのうちの少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を欠失させるか、または非機能性にする。

一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座は、全てまたは実質的に全ての内因性のＶ_Ｈ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、およびＪ_Ｈ遺伝子セグメントを欠失させるか、または非機能性にする改変を含み、遺伝子改変された遺伝子座は、１つまたは複数のヒスチジンコドンを有する、１つまたは複数のヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメント、ヒトＤ遺伝子セグメント、および／またはヒトＪ_Ｈ遺伝子セグメントを含む、再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列を含み、再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、内因性位置に存在する（すなわち、ヌクレオチド配列が野生型の非ヒト動物にある場合）か、または異所性に存在し（例えば、そのゲノムにおける内因性免疫グロブリン鎖の遺伝子座と異なる遺伝子座に存在するか、またはその内因性の遺伝子座内、例えば、免疫グロブリン可変遺伝子座内に存在し、ここで、該内因性の遺伝子座は、ゲノムにおける異なる位置に配置されるか、またはゲノムにおける異なる位置へと移動している）。

一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、内因性Ａｄａｍ６ａ遺伝子、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子、またはこれらの両方を含み、遺伝子改変は、内因性のＡｄａｍ６ａ遺伝子、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子、またはこれらの両方の発現および／または機能に影響を及ぼさない。

一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、異所性に存在するＡｄａｍ６ａ遺伝子、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子、またはこれらの両方を含む。一実施形態では、Ａｄａｍ６ａ遺伝子は、非ヒトＡｄａｍ６ａ遺伝子である。一実施形態では、Ａｄａｍ６ａ遺伝子は、ヒトＡｄａｍ６ａ遺伝子である。一実施形態では、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子は、非ヒトＡｄａｍ６ｂ遺伝子である。一実施形態では、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子は、ヒトＡｄａｍ６ｂ遺伝子である。

一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、ヒト化された、再構成されていないλ軽鎖可変遺伝子配列および／またはκ軽鎖可変遺伝子配列をさらに含む。一実施形態では、ヒト化された、再構成されていないλ軽鎖可変遺伝子配列および／またはκ軽鎖可変遺伝子配列は、λ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列およびκ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列から選択される、免疫グロブリン軽鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。一実施形態では、ヒト化された、再構成されていないλ軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、λ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。一実施形態では、λ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列は、マウス配列、ラット配列、またはヒト配列である。一実施形態では、ヒト化された、再構成されていないκ軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、κ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。一実施形態では、κ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列は、マウス配列、ラット配列、またはヒト配列である。

一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、軽鎖可変ドメインをコードする少なくとも１つのリーディングフレームに少なくとも１つのヒスチジンコドンを導入する少なくとも１つの改変を含有する、再構成されていない軽鎖可変遺伝子配列を含む。一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、軽鎖ＣＤＲに１つ、２つ、３つ、または４つのヒスチジンコドンを含む、再構成された（例えば、再構成されたλまたはκのＶ／Ｊ配列）配列を含む。一実施形態では、ＣＤＲは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、およびこれらの組合せから選択される。一実施形態では、再構成されていないかまたは再構成された軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、再構成されていないかまたは再構成されたヒトλ軽鎖可変領域またはヒトκ軽鎖可変領域のヌクレオチド配列である。一実施形態では、再構成されていないかまたは再構成されたヒトλ軽鎖可変領域またはヒトκ軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、内因性のマウス免疫グロブリン軽鎖遺伝子座に存在する。一実施形態では、マウス免疫グロブリン軽鎖遺伝子座は、マウスκ遺伝子座である。一実施形態では、マウス免疫グロブリン軽鎖遺伝子座は、マウスλ遺伝子座である。

一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、マウスの免疫グロブリン重鎖遺伝子座に存在する。一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスにおけるヒト化免疫グロブリン重鎖遺伝子座に存在する。

一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質は、酸性の環境で（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨで）、遺伝子改変なしの、対応する野生型の重鎖可変ドメインより弱い抗原結合を示す。

一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ_１／２）は、２５℃、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、２分間未満である。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ_１／２）は、３７℃、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、２分間未満である。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ_１／２）は、２５℃、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、１分間未満である。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ_１／２）は、３７℃、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、１分間未満である。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質は、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、解離半減期（ｔ_１／２）を、中性ｐＨ（例えば、約７．０〜約７．４のｐＨ）における抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ_１／２）と比較して、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、または少なくとも約３０倍短縮する。

一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、目的の抗原で刺激されると、抗原結合タンパク質、例えば、１つまたは複数のヒスチジン残基を有する重鎖可変ドメインを含む抗体を産生することが可能なＢ細胞集団を含む。本明細書に記載されている抗原結合タンパク質は、被験体へと投与されると、重鎖可変ドメインをコードするが、重鎖可変ドメインにヒスチジン残基を含まない、類似するか、または十分に類似するアミノ酸配列を保有する、対応する野生型の抗原結合タンパク質を凌駕する血清半減期の延長を示す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている抗原結合タンパク質は、重鎖可変ドメインをコードするが、重鎖可変ドメインにヒスチジン残基を含まない、類似するか、または十分に類似するアミノ酸配列を保有する、対応する野生型の抗原結合タンパク質の少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍の血清半減期の延長を示す。

一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質は、本明細書に記載されている遺伝子改変なしの、野生型の抗原結合タンパク質と比較して、ｐＨ依存性リサイクル性の改善、血清半減期の延長、またはこれらの両方を特徴とする。

一態様では、再構成されていないヒト重鎖可変領域のヌクレオチド配列を含む、非ヒト動物の生殖細胞系列ゲノムにおける遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座であって、再構成されていないヒト重鎖可変領域のヌクレオチド配列が、少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む免疫グロブリン遺伝子座が提供される。

一実施形態では、非ヒト動物は、齧歯動物、例えば、マウス、ラット、またはハムスターを含む哺乳動物である。

一実施形態では、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上、１０以上、１１以上、１２以上、１３以上、１４以上、１５以上、１６以上、１７以上、１８以上、１９以上、２０以上、２１以上、２２以上、２３以上、２４以上、２５以上、２６以上、２７以上、２８以上、２９以上、３０以上、３１以上、３２以上、３３以上、３４以上、３５以上、３６以上、３７以上、３８以上、３９以上、４０以上、４１以上、４２以上、４３以上、４４以上、４５以上、４６以上、４７以上、４８以上、４９以上、５０以上、５１以上、５２以上、５３以上、５４以上、５５以上、５６以上、５７以上、５８以上、５９以上、６０以上、または６１以上の内因性の非ヒスチジンコドンを、ヒスチジンコドンで置きかえる。

一実施形態では、内因性の非ヒスチジン（histone）コドンは、Ｙ、Ｎ、Ｄ、Ｑ、Ｓ、Ｗ、およびＲから選択されるアミノ酸をコードする。

一実施形態では、ヒスチジンコドンによって置換された内因性の非ヒスチジンコドンは、Ｎ末端領域、ループ４領域、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、これらの組合せから選択される免疫グロブリン可変ドメインをコードする、再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列に存在する。

一実施形態では、置換されたヒスチジンコドンは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、およびこれらの組合せから選択される相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードする、再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列に存在する。

一実施形態では、置換されたヒスチジンコドンは、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４、およびこれらの組合せから選択されるフレーム領域（ＦＲ）をコードする、再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列に存在する。

一実施形態では、再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、ヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントの少なくとも１つのリーディングフレームにおける１つまたは複数の内因性非ヒスチジンコドンが、ヒスチジンコドンで置きかえられた、遺伝子改変されたヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントを含む。

一実施形態では、再構成されていないヒト重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、ヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントの少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変であって、ヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントが、Ｖ_Ｈ１−２、Ｖ_Ｈ１−３、Ｖ_Ｈ１−８、Ｖ_Ｈ１−１８、Ｖ_Ｈ１−２４、Ｖ_Ｈ１−４５、Ｖ_Ｈ１−４６、Ｖ_Ｈ１−５８、Ｖ_Ｈ１−６９、Ｖ_Ｈ２−５、Ｖ_Ｈ２−２６、Ｖ_Ｈ２−７０、Ｖ_Ｈ３−７、Ｖ_Ｈ３−９、Ｖ_Ｈ３−１１、Ｖ_Ｈ３−１３、Ｖ_Ｈ３−１５、Ｖ_Ｈ３−１６、Ｖ_Ｈ３−２０、Ｖ_Ｈ３−２１、Ｖ_Ｈ３−２３、Ｖ_Ｈ３−３０、Ｖ_Ｈ３−３０−３、Ｖ_Ｈ３−３０−５、Ｖ_Ｈ３−３３、Ｖ_Ｈ３−３５、Ｖ_Ｈ３−３８、Ｖ_Ｈ３−４３、Ｖ_Ｈ３−４８、Ｖ_Ｈ３−４９、Ｖ_Ｈ３−５３、Ｖ_Ｈ３−６４、Ｖ_Ｈ３−６６、Ｖ_Ｈ３−７２、Ｖ_Ｈ３−７３、Ｖ_Ｈ３−７４、Ｖ_Ｈ４−４、Ｖ_Ｈ４−２８、Ｖ_Ｈ４−３０−１、Ｖ_Ｈ４−３０−２、Ｖ_Ｈ４−３０−４、Ｖ_Ｈ４−３１、Ｖ_Ｈ４−３４、Ｖ_Ｈ４−３９、Ｖ_Ｈ４−５９、Ｖ_Ｈ４−６１、Ｖ_Ｈ５−５１、Ｖ_Ｈ６−１、Ｖ_Ｈ７−４−１、Ｖ_Ｈ７−８１、およびこれらの組合せからなる群から選択される改変を含む。

一実施形態では、再構成されていないヒト重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、遺伝子改変されたヒトＪ_Ｈ遺伝子セグメントであって、ヒトＪ_Ｈ遺伝子セグメントの少なくとも１つのリーディングフレームにおける１つまたは複数の内因性非ヒスチジンコドンが、ヒスチジンコドンで置きかえられた遺伝子改変されたヒトＪ_Ｈ遺伝子セグメントを含む。

一実施形態では、再構成されていないヒト重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、ヒトＪ_Ｈセグメントの少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変であって、ヒトＪ_Ｈ遺伝子セグメントが、Ｊ_Ｈ１、Ｊ_Ｈ２、Ｊ_Ｈ３、Ｊ_Ｈ４、Ｊ_Ｈ５、Ｊ_Ｈ６、およびこれらの組合せからなる群から選択される改変を含む。

一実施形態では、置換されたヒスチジンコドンは、ＣＤＲ３の一部をコードする重鎖可変領域のヌクレオチド配列に存在する。一実施形態では、ＣＤＲ３の一部は、リーディングフレームにおける少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変を含む、遺伝子改変されたヒトＤ遺伝子セグメントのリーディングフレームに由来するアミノ酸配列を含む。

一実施形態では、ヒスチジンコドンで置換される内因性非ヒスチジンコドンは、Ｙ、Ｎ、Ｄ、Ｑ、Ｓ、Ｗ、およびＲから選択されるアミノ酸をコードする。

一実施形態では、置換されるヒスチジンコドンは、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ヒト化免疫グロブリンマウス内で最も高頻度に観察されるヒトＤ遺伝子セグメントの少なくとも１つのリーディングフレームに存在する。

一実施形態では、ＣＤＲ３の一部をコードする、遺伝子改変されたヒトＤ遺伝子セグメントのリーディングフレームは、疎水性フレーム、終止フレーム、および親水性フレームから選択される。

一実施形態では、リーディングフレームは、ヒトＤ遺伝子セグメントの疎水性フレームである。

一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの疎水性フレームは、Ｄ１−１（ＧＴＴＧＴ；配列番号８８）、Ｄ１−７（ＧＩＴＧＴ；配列番号８９）、Ｄ１−２０（ＧＩＴＧＴ；配列番号８９）、およびＤ１−２６（ＧＩＶＧＡＴ；配列番号９０）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変をさらに含む。

一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの疎水性フレームは、Ｄ２−２（ＤＩＶＶＶＰＡＡＩ；配列番号９２）、Ｄ２−８（ＤＩＶＬＭＶＹＡＩ；配列番号９４）、Ｄ２−１５（ＤＩＶＶＶＶＡＡＴ；配列番号９５）、およびＤ２−２１（ＨＩＶＶＶＴＡＩ；配列番号９７）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変をさらに含む。

一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの疎水性フレームは、Ｄ３−３（ＩＴＩＦＧＶＶＩＩ；配列番号９８）、Ｄ３−９（ＩＴＩＦ^＊ＬＶＩＩ；配列番号９９、配列番号１００）、Ｄ３−１０（ＩＴＭＶＲＧＶＩＩ；配列番号１０１）、Ｄ３−１６（ＩＭＩＴＦＧＧＶＩＶＩ；配列番号１０２）、およびＤ３−２２（ＩＴＭＩＶＶＶＩＴ；配列番号１０３）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性コドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変をさらに含む。

一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの疎水性フレームは、Ｄ４−４（ＴＴＶＴ；配列番号１０５）、Ｄ４−１１（ＴＴＶＴ；配列番号１０５）、Ｄ４−１７（ＴＴＶＴ；配列番号１０５）、Ｄ４−２３（ＴＴＶＶＴ；配列番号１０６）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変をさらに含む。

一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの疎水性フレームは、Ｄ５−５（ＶＤＴＡＭＶ；配列番号１０７）、Ｄ５−１２（ＶＤＩＶＡＴＩ；配列番号１０８）、Ｄ５−１８（ＶＤＴＡＭＶ；配列番号１０７）、およびＤ５−２４（ＶＥＭＡＴＩ；配列番号１０９）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変をさらに含む。

一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの疎水性フレームは、Ｄ６−６（ＳＩＡＡＲ；配列番号１１１）、Ｄ６−１３（ＧＩＡＡＡＧ；配列番号１１３）、およびＤ６−１９（ＧＩＡＶＡＧ；配列番号１１５）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変をさらに含む。

一実施形態では、疎水性フレームは、ヒトＤ７−２７（ＬＴＧ）をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変をさらに含む。

一実施形態では、リーディングフレームは、ヒトＤ遺伝子セグメントの終止リーディングフレームである。

一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの終止リーディングフレームは、Ｄ１−１（ＶＱＬＥＲ；配列番号８）、Ｄ１−７（Ｖ^＊ＬＥＬ）、Ｄ１−２０（Ｖ^＊ＬＥＲ）、Ｄ１−２６（Ｖ^＊ＷＥＬＬ；配列番号１２）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変をさらに含む。

一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの終止リーディングフレームは、Ｄ２−２（ＲＩＬ^＊＊ＹＱＬＬＹ；配列番号１４）、Ｄ２−８（ＲＩＬＹ^＊ＷＣＭＬＹ；配列番号１６および配列番号１７）、Ｄ２−１５（ＲＩＬ^＊ＷＷ^＊ＬＬＬ）、およびＤ２−２１（ＳＩＬＷＷ^＊ＬＬＦ；配列番号１９）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変をさらに含む。

一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの終止リーディングフレームは、Ｄ３−３（ＶＬＲＦＬＥＷＬＬＹ；配列番号２１）、Ｄ３−９（ＶＬＲＹＦＤＷＬＬ^＊；配列番号２３）、Ｄ３−１０（ＶＬＬＷＦＧＥＬＬ^＊；配列番号２５）、Ｄ３−１６（ＶＬ^＊ＬＲＬＧＥＬＳＬＹ；配列番号２７）、およびＤ３−２２（ＶＬＬ^＊＊＊ＷＬＬＬ；配列番号２９）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変を含む。

一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの終止リーディングフレームは、Ｄ４−４（^＊ＬＱ^＊Ｌ）、Ｄ４−１１（^＊ＬＱ^＊Ｌ）、Ｄ４−１７（^＊ＬＲ^＊Ｌ）、およびＤ４−２３（^＊ＬＲＷ^＊Ｌ）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変を含む。

一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの終止リーディングフレームは、Ｄ５−５（ＷＩＱＬＷＬ；配列番号３５）；Ｄ５−１２（ＷＩ^＊ＷＬＲＬ；配列番号３７）、Ｄ５−１８（ＷＩＱＬＷＬ；配列番号３５）、およびＤ５−２４（^＊ＲＷＬＱＬ；配列番号３９）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変を含む。

一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの終止リーディングフレームは、Ｄ６−６（Ｖ^＊ＱＬＶ）、Ｄ６−１３（Ｖ^＊ＱＱＬＶ；配列番号４１）、およびＤ６−１９（Ｖ^＊ＱＷＬＶ；配列番号４３）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変をさらに含む。

一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの終止リーディングフレームは、Ｄ７−２７（^＊ＬＧ）をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列におけるヒトＤ遺伝子セグメントの少なくとも１つの内因性コドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変をさらに含む。

一実施形態では、リーディングフレームは、ヒトＤ遺伝子セグメントの親水性フレームである。

一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの親水性フレームは、Ｄ１−１（ＹＮＷＮＤ；配列番号４５）、Ｄ１−７（ＹＮＷＮＹ；配列番号４７）、Ｄ１−２０（ＹＮＷＮＤ；配列番号４５）、およびＤ１−２６（ＹＳＧＳＹＹ；配列番号４９）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性コドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変をさらに含む。一実施形態では、親水性フレームは、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、およびこれらの組合せからなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。

一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの親水性フレームは、Ｄ２−２（ＧＹＣＳＳＴＳＣＹＴ；配列番号５１）、Ｄ２−８（ＧＹＣＴＮＧＶＣＹＴ；配列番号５３）、Ｄ２−１５（ＧＹＣＳＧＧＳＣＹＳ；配列番号５５）、およびＤ２−２１（ＡＹＣＧＧＤＣＹＳ；配列番号５７）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性コドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変をさらに含む。一実施形態では、親水性フレームは、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、およびこれらの組合せからなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。

一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの親水性フレームは、Ｄ３−３（ＹＹＤＦＷＳＧＹＹＴ；配列番号５９）、Ｄ３−９（ＹＹＤＩＬＴＧＹＹＮ；配列番号６１）、Ｄ３−１０（ＹＹＹＧＳＧＳＹＹＮ；配列番号６３）、Ｄ３−１６（ＹＹＤＹＶＷＧＳＹＲＹＴ；配列番号６５）、およびＤ３−２２（ＹＹＹＤＳＳＧＹＹＹ；配列番号６７）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性コドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変をさらに含む。一実施形態では、親水性フレームは、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、およびこれらの組合せからなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。

一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの親水性フレームは、Ｄ４−４（ＤＹＳＮＹ；配列番号６９）、Ｄ４−１１（ＤＹＳＮＹ；配列番号６９）、Ｄ４−１７（ＤＹＧＤＹ；配列番号７１）、およびＤ４−２３（ＤＹＧＧＮＳ；配列番号７３）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性コドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変を含む。一実施形態では、親水性フレームは、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、およびこれらの組合せからなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。

一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの親水性フレームは、Ｄ５−５（ＧＹＳＹＧＹ；配列番号７５）、Ｄ５−１２（ＧＹＳＧＹＤＹ；配列番号７７）、Ｄ５−１８（ＧＹＳＹＧＹ；配列番号７５）、およびＤ５−２４（ＲＤＧＹＮＹ；配列番号７９）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性コドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変をさらに含む。一実施形態では、親水性フレームは、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、およびこれらの組合せからなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。

一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの親水性フレームは、Ｄ６−６（ＥＹＳＳＳＳ；配列番号８１）、Ｄ６−１３（ＧＹＳＳＳＷＹ；配列番号８３）、およびＤ６−１９（ＧＹＳＳＧＷＹ；配列番号８５）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性コドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変をさらに含む。一実施形態では、親水性フレームは、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号７６、およびこれらの組合せからなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。

一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの親水性フレームは、Ｄ７−２７（ＮＷＧ）をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性コドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変をさらに含む。

一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの親水性フレームは、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、およびこれらの組合せからなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。

一実施形態では、再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、Ｃ_Ｈ１、ヒンジ、Ｃ_Ｈ２、Ｃ_Ｈ３、およびこれらの組合せから選択される、ヒトまたは非ヒトの重鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｃ_Ｈ１、ヒンジ、Ｃ_Ｈ２、およびＣ_Ｈ３（Ｃ_Ｈ１−ヒンジ−Ｃ_Ｈ２−Ｃ_Ｈ３）を含む。

一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、内因性遺伝子座に存在する（すなわち、ヌクレオチド配列が野生型の非ヒト動物にある場合）か、または異所性に存在する（例えば、そのゲノムにおける内因性免疫グロブリン鎖の遺伝子座と異なる遺伝子座に存在するか、またはその内因性の遺伝子座内に、例えば、免疫グロブリン可変遺伝子座内に存在し、ここで、該内因性の遺伝子座は、ゲノムにおける異なる位置に配置されるか、またはゲノムにおける異なる位置へと移動している）。

一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｃ_Ｈ２におけるまたはＣ_Ｈ３における改変であって、酸性の環境で（例えば、ｐＨが、約５．５〜約６．０の範囲であるエンドソーム内で）重鎖定常領域アミノ酸配列のＦｃＲｎへの親和性を増大させる改変を含む。

一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、２５０位における改変（例えば、ＥまたはＱ）；２５０および４２８位における改変（例えば、ＬまたはＦ）；２５２位における改変（例えば、Ｌ／Ｙ／Ｆ／ＷまたはＴ）、２５４位における改変（例えば、ＳまたはＴ）、および２５６位における改変（例えば、Ｓ／Ｒ／Ｑ／Ｅ／ＤまたはＴ）；または４２８および／もしくは４３３位における改変（例えば、Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｐ／ＱまたはＫ）、および／もしくは４３４位における改変（例えば、Ｈ／ＦまたはＹ）；または２５０および／もしくは４２８位における改変；または３０７もしくは３０８位における改変（例えば、３０８Ｆ、Ｖ３０８Ｆ）、ならびに４３４位における改変を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。一実施形態では、改変は、４２８Ｌ（例えば、Ｍ４２８Ｌ）および４３４Ｓ（例えば、Ｎ４３４Ｓ）の改変；４２８Ｌ、２５９Ｉ（例えば、Ｖ２５９Ｉ）、および３０８Ｆ（例えば、Ｖ３０８Ｆ）の改変；４３３Ｋ（例えば、Ｈ４３３Ｋ）および４３４位（例えば、４３４Ｙ）の改変；２５２、２５４、および２５６位（例えば、２５２Ｙ、２５４Ｔ、および２５６Ｅ）における改変；２５０Ｑおよび４２８Ｌの改変（例えば、Ｔ２５０ＱおよびＭ４２８Ｌ）；ならびに３０７および／または３０８位における改変（例えば、３０８Ｆまたは３０８Ｐ）であって、酸性の環境で（例えば、ｐＨが、約５．５〜約６．０の範囲であるエンドソーム内で）重鎖定常領域アミノ酸配列のＦｃＲｎへの親和性を増大させる改変を含む。

一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、２５２位のアミノ酸残基と２５７位のアミノ酸残基との間に、少なくとも１つの改変であって、酸性の環境で（例えば、ｐＨが、約５．５〜約６．０の範囲であるエンドソーム内で）ヒトＣ_Ｈ２のアミノ酸配列のＦｃＲｎへの親和性を増大させる改変を含む、ヒトＣ_Ｈ２のアミノ酸配列をコードする。

一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、３０７位のアミノ酸残基と３１１位のアミノ酸残基との間に、少なくとも１つの改変であって、酸性の環境で（例えば、ｐＨが、約５．５〜約６．０の範囲であるエンドソーム内で）ヒトＣ_Ｈ２のアミノ酸配列のＦｃＲｎへの親和性を増大させる改変を含む、ヒトＣ_Ｈ２のアミノ酸配列をコードする。

一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、４３３位のアミノ酸残基と４３６位のアミノ酸残基との間に、少なくとも１つの改変であって、酸性の環境で（例えば、ｐＨが、約５．５〜約６．０の範囲であるエンドソーム内で）ヒトＣ_Ｈ３のアミノ酸配列のＦｃＲｎへの親和性を増大させる改変を含む、ヒトＣ_Ｈ３のアミノ酸配列をコードする。

一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｍ４２８Ｌ、Ｎ４３４Ｓ、およびこれらの組合せからなる群から選択される変異を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。

一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｍ４２８Ｌ、Ｖ２５９Ｉ、Ｖ３０８Ｆ、およびこれらの組合せからなる群から選択される変異を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。

一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｎ４３４Ａ変異を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。

一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ、およびこれらの組合せからなる群から選択される変異を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。

一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｔ２５０Ｑ、Ｍ２４８Ｌ、またはこれらの両方からなる群から選択される変異を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。

一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｈ４３３Ｋ、Ｎ４３４Ｙ、またはこれらの両方からなる群から選択される変異を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。

一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、（１）本明細書に記載されている、再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域のヌクレオチド配列が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４、およびこれらの組合せから選択されるヒトＩｇＧの第一のＣＨ_３のアミノ酸配列をコードする第一の重鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結されている、第一の対立遺伝子；ならびに（２）本明細書に記載されている、再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域のヌクレオチド配列が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４、およびこれらの組合せから選択されるヒトＩｇＧの第二のＣ_Ｈ３のアミノ酸配列をコードする第二の重鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結されており、第二のＣＨ_３のアミノ酸配列が、第二のＣＨ_３のアミノ酸配列の、プロテインＡへの結合を低減するか、または消失させる改変（例えば、ＵＳ２０１０／０３３１５２７Ａ１を参照されたい）を含む、第二の対立遺伝子を含む。

一実施形態では、第二のＣＨ_３のアミノ酸配列は、Ｈ９５Ｒの改変（ＩＭＧＴエクソン番号付けによる；ＥＵ番号付けによるＨ４３５Ｒ）を含む。一実施形態では、第二のＣＨ_３のアミノ酸配列は、Ｙ９６Ｆの改変（ＩＭＧＴエクソン番号付けによる；ＥＵによるＨ４３６Ｆ）をさらに含む。別の実施形態では、第二のＣＨ_３のアミノ酸配列は、Ｈ９５Ｒの改変（ＩＭＧＴエクソン番号付けによる；ＥＵ番号付けによるＨ４３５Ｒ）およびＹ９６Ｆの改変（ＩＭＧＴエクソン番号付けによる；ＥＵによるＨ４３６Ｆ）の両方を含む。

一実施形態では、第二のＣＨ_３のアミノ酸配列は、改変ヒトＩｇＧ１からのアミノ酸配列であり、Ｄ１６Ｅ、Ｌ１８Ｍ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴ；ＥＵによるＤ３５６Ｅ、Ｌ３８Ｍ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、およびＶ４２２Ｉ）からなる群から選択される変異をさらに含む。

一実施形態では、第二のＣＨ_３のアミノ酸配列は、改変ヒトＩｇＧ２からのアミノ酸配列であり、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴ：ＥＵによるＮ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、およびＶ４２２Ｉ）からなる群から選択される変異をさらに含む。

一実施形態では、第二のＣＨ_３のアミノ酸配列は、改変ヒトＩｇＧ４からのアミノ酸配列であり、Ｑ１５Ｒ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、Ｒ６９Ｋ、Ｅ７９Ｑ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴ：ＥＵによるＱ３５５Ｒ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、Ｒ４０９Ｋ、Ｅ４１９Ｑ、およびＶ４２２Ｉ）からなる群から選択される変異をさらに含む。

一実施形態では、重鎖定常領域アミノ酸配列は、非ヒト定常領域のアミノ酸配列であり、重鎖定常領域アミノ酸配列は、上記の種類の改変のうちのいずれかのうちの１つまたは複数を含む。

一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、ヒト重鎖定常領域アミノ酸配列であり、ヒト重鎖定常領域アミノ酸配列は、上記の種類の改変のうちのいずれかのうちの１つまたは複数を含む。

一実施形態では、全てまたは実質的に全ての内因性のＶ_Ｈ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、およびＪ_Ｈ遺伝子セグメントを、免疫グロブリン重鎖遺伝子座から欠失させるか、または非機能性にする（例えば、免疫グロブリン遺伝子座にヌクレオチド配列（例えば、外因性ヌクレオチド配列）の挿入を介して、または内因性のＶ_Ｈセグメント、Ｄセグメント、Ｊ_Ｈセグメントの非機能性の再構成または反転を介して）。一実施形態では、例えば、全ての内因性のＶ_Ｈ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、またはＪ_Ｈ遺伝子セグメントのうちの約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、約９６％以上、約９７％以上、約９８％以上、または約９９％以上を欠失させるか、または非機能性にする。一実施形態では、例えば、内因性の機能性Ｖ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、またはＪ遺伝子セグメントのうちの少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を欠失させるか、または非機能性にする。

一実施形態では、遺伝子改変された遺伝子座は、全てまたは実質的に全ての内因性のＶ_Ｈ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、およびＪ_Ｈ遺伝子セグメントを欠失させるか、または非機能性にする改変を含み、ゲノム遺伝子座は、少なくとも１つのリーディングフレームに少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む、遺伝子改変された、再構成されていないヒト重鎖可変領域のヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、遺伝子改変された、再構成されていない免疫グロブリン重鎖可変遺伝子配列は、内因性位置に存在する（すなわち、ヌクレオチド配列が野生型の非ヒト動物にある場合）か、または異所性に存在する（例えば、そのゲノムにおける内因性免疫グロブリン鎖の遺伝子座と異なる遺伝子座に存在するか、またはその内因性の遺伝子座内に、例えば、免疫グロブリン可変遺伝子座内に存在し、ここで、該内因性の遺伝子座は、ゲノムにおける異なる位置に配置されるか、またはゲノムにおける異なる位置へと移動している）。

一実施形態では、遺伝子改変された遺伝子座は、内因性Ａｄａｍ６ａ遺伝子、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子、またはこれらの両方を含み、遺伝子改変は、内因性のＡｄａｍ６ａ遺伝子、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子、またはこれらの両方の発現および／または機能に影響を及ぼさない。

一実施形態では、遺伝子改変された遺伝子座は、異所性に存在するＡｄａｍ６ａ遺伝子、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子、またはこれらの両方を含む。一実施形態では、Ａｄａｍ６ａ遺伝子は、非ヒトＡｄａｍ６ａ遺伝子である。一実施形態では、Ａｄａｍ６ａ遺伝子は、マウスＡｄａｍ６ａ遺伝子である。一実施形態では、Ａｄａｍ６ａ遺伝子は、ヒトＡｄａｍ６ａ遺伝子である。一実施形態では、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子は、非ヒトＡｄａｍ６ｂ遺伝子である。一実施形態では、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子は、マウスＡｄａｍ６ｂ遺伝子である。一実施形態では、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子は、ヒトＡｄａｍ６ｂ遺伝子である。

一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、ヒト化された、再構成されていないλ軽鎖可変遺伝子配列および／またはκ軽鎖可変遺伝子配列をさらに含む。一実施形態では、ヒト化された、再構成されていないλ軽鎖可変遺伝子配列および／またはκ軽鎖可変遺伝子配列は、λ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列およびκ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列から選択される、免疫グロブリン軽鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。一実施形態では、ヒト化された、再構成されていないλ軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、λ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。一実施形態では、λ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列は、マウス配列、ラット配列、またはヒト配列である。一実施形態では、ヒト化された、再構成されていないκ軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、κ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。一実施形態では、κ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列は、マウス配列、ラット配列、またはヒト配列である。

一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、軽鎖可変ドメインをコードする少なくとも１つのリーディングフレームに少なくとも１つのヒスチジンコドンを導入する少なくとも１つの改変を含有する、再構成されていない軽鎖可変遺伝子配列を含む。一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、軽鎖ＣＤＲに１つ、２つ、３つ、または４つのヒスチジンコドンを含む、再構成された（例えば、再構成されたλまたはκのＶ／Ｊ配列）配列を含む。一実施形態では、ＣＤＲは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、およびこれらの組合せから選択される。一実施形態では、再構成されていないかまたは再構成された軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、再構成されていないかまたは再構成されたヒトλ軽鎖可変領域またはヒトκ軽鎖可変領域のヌクレオチド配列である。一実施形態では、再構成されていないかまたは再構成されたヒトλ軽鎖可変領域またはヒトκ軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、内因性のマウス免疫グロブリン軽鎖遺伝子座に存在する。一実施形態では、マウス免疫グロブリン軽鎖遺伝子座は、マウスκ遺伝子座である。一実施形態では、マウス免疫グロブリン軽鎖遺伝子座は、マウスλ遺伝子座である。

一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、マウスの免疫グロブリン重鎖遺伝子座に存在する。一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスにおけるヒト化免疫グロブリン重鎖遺伝子座に存在する。

一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質は、酸性の環境で（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨで）、本明細書に記載されている遺伝子改変なしの、対応する野生型の重鎖可変ドメインより弱い抗原結合を示す。

一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ_１／２）は、２５℃、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、２分間未満である。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ_１／２）は、３７℃、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、２分間未満である。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ_１／２）は、２５℃、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、１分間未満である。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ_１／２）は、３７℃、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、１分間未満である。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質は、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、解離半減期（ｔ_１／２）を、中性ｐＨ（例えば、約７．０〜約７．４のｐＨ）における抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ_１／２）と比較して、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、または少なくとも約３０倍短縮する。

一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質は、遺伝子改変なしの野生型の抗原結合タンパク質と比較して、ｐＨ依存性リサイクル性の改善、血清半減期の延長、またはこれらの両方を特徴とする。

一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、目的の抗原で刺激されると、１つまたは複数のヒスチジン残基を含む重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質、例えば、抗体を産生することが可能なＢ細胞集団を含む。本明細書に記載されている、抗原結合タンパク質は、被験体へと投与されると、重鎖可変ドメインをコードするが、重鎖可変ドメインにヒスチジン残基を含まない、類似するか、または十分に類似するアミノ酸配列を保有する、対応する野生型の抗原結合タンパク質を凌駕する血清半減期の延長を示す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている抗原結合タンパク質は、重鎖可変ドメインをコードするが、重鎖可変ドメインにヒスチジン残基を含まない、類似するか、または十分に類似するアミノ酸配列を保有する、対応する野生型の抗原結合タンパク質の少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍の血清半減期の延長を示す。

一態様では、ヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメント、ヒトＤ遺伝子セグメント、およびヒトＪ_Ｈ遺伝子セグメントを含む、非ヒト動物の遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座であって、ヒトＤ遺伝子セグメントの少なくとも１つを、５’側から３’側にかけて、対応する野生型配列に対して反転させており、反転させたヒトＤ遺伝子セグメントの少なくとも１つのリーディングフレームが、ヒスチジンコドンを含む遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座が提供される。

一実施形態では、非ヒト動物は、齧歯動物、例えば、マウス、ラット、またはハムスターを含む哺乳動物である。

一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、生殖細胞系列ゲノムに存在する。

一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、１つまたは複数、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上、１０以上、１１以上、１２以上、１３以上、１４以上、１５以上、１６以上、１７以上、１８以上、１９以上、２０以上、２１以上、２２以上、２３以上、２４以上、２５以上、２６以上、２７以上、２８以上、２９以上、３０以上、３１以上、３２以上、３３以上、または３４以上のヒスチジン残基を含む免疫グロブリン重鎖可変ドメインをコードする。

一実施形態では、機能性ヒトＤ遺伝子セグメントのうちの少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、または全てもしくは実質的に全ては、対応する野生型配列に対して逆配向である。

一実施形態では、内因性免疫グロブリンのＶ_Ｈ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、Ｊ_Ｈ遺伝子セグメントの全てまたは実質的に全てを、免疫グロブリン重鎖遺伝子座から欠失させるか、または非機能性にする（例えば、免疫グロブリン遺伝子座にヌクレオチド配列、例えば、外因性ヌクレオチド配列の挿入を介して、または内因性の免疫グロブリンＶ_Ｈセグメント、Ｄセグメント、Ｊ_Ｈセグメントの全てもしくは実質的に全ての非機能性の再構成もしくは反転を介して）が、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、ヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメント、ヒトＤ遺伝子セグメント、およびヒトＪ_Ｈ遺伝子セグメントを含み、ヒトＤ遺伝子セグメントの少なくとも１つは、対応する野生型配列に対して逆配向で存在し、反転させたヒトＤ遺伝子セグメントにおける少なくとも１つのリーディングフレームは、少なくとも１つのヒスチジンコドンを含む。

一実施形態では、反転させたヒトＤ遺伝子セグメントは、ヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントおよび／またはヒトＪ_Ｈ遺伝子セグメントに作動可能に連結されている。

一実施形態では、対応する野生型配列と比べて逆配向で存在するヒトＤ遺伝子セグメントは、Ｄ１−１、Ｄ１−７、Ｄ１−２０、Ｄ１−２６、Ｄ２−２、Ｄ２−８、Ｄ２−１５、Ｄ２−２１、Ｄ３−３、Ｄ３−９、Ｄ３−１０、Ｄ３−１６、Ｄ３−２２、Ｄ４−４、Ｄ４−１１、Ｄ４−１７、Ｄ４−２３、Ｄ５−５、Ｄ５−１２、Ｄ５−１８、Ｄ５−２４、Ｄ６−６、Ｄ６−１３、Ｄ６−１９、Ｄ７−２７、およびこれらの組合せからなる群から選択される。

一実施形態では、対応する野生型配列と比べて逆配向で存在するヒトＤ遺伝子セグメントは、Ｄ１−１、Ｄ１−７、Ｄ１−２０、Ｄ１−２６、およびこれらの組合せからなる群から選択されるＤ１遺伝子セグメントである。

一実施形態では、対応する野生型配列と比べて逆配向で存在するヒトＤ遺伝子セグメントは、Ｄ２−２、Ｄ２−８、Ｄ２−１５、Ｄ２−２１、およびこれらの組合せからなる群から選択されるＤ２遺伝子セグメントである。

一実施形態では、対応する野生型配列と比べて逆配向で存在するヒトＤ遺伝子セグメントは、Ｄ３−３、Ｄ３−９、Ｄ３−１０、Ｄ３−１６、Ｄ３−２２、およびこれらの組合せからなる群から選択されるＤ３遺伝子セグメントである。

一実施形態では、対応する野生型配列と比べて逆配向で存在するヒトＤ遺伝子セグメントは、Ｄ４−４、Ｄ４−１１、Ｄ４−１７、Ｄ４−２３、およびこれらの組合せからなる群から選択されるＤ４遺伝子セグメントである。

一実施形態では、対応する野生型配列と比べて逆配向で存在するヒトＤ遺伝子セグメントは、Ｄ５−５、Ｄ５−１２、Ｄ５−１８、Ｄ５−２４、およびこれらの組合せからなる群から選択されるＤ５遺伝子セグメントである。

一実施形態では、対応する野生型配列と比べて逆配向で存在するヒトＤ遺伝子セグメントは、Ｄ６−６、Ｄ６−１３、Ｄ６−１９、およびこれらの組合せからなる群から選択されるＤ６遺伝子セグメントである。

一実施形態では、対応する野生型配列と比べて逆配向で存在するヒトＤ遺伝子セグメントは、Ｄ７−２７である。

一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントのリーディングフレームは、終止リーディングフレーム、親水性リーディングフレーム、および疎水性リーディングフレームから選択され、反転させたヒトＤ遺伝子セグメントの少なくとも１つのリーディングフレームは、ヒスチジンコドンを含む。

一実施形態では、反転させたヒトＤ遺伝子セグメントを含む、再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、およびＩｇＡから選択される免疫グロブリンアイソタイプをコードする、ヒトまたは非ヒトの重鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。

一実施形態では、反転させたヒトＤ遺伝子セグメントを含む、再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、およびＩｇＡから選択される免疫グロブリンアイソタイプをコードする、ヒトまたは非ヒトの重鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。

一実施形態では、再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、Ｃ_Ｈ１、ヒンジ、Ｃ_Ｈ２、Ｃ_Ｈ３、およびこれらの組合せから選択される、ヒトまたは非ヒトの重鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｃ_Ｈ１、ヒンジ、Ｃ_Ｈ２、およびＣ_Ｈ３（すなわち、Ｃ_Ｈ１−ヒンジ−Ｃ_Ｈ２−Ｃ_Ｈ３）を含む。

一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、内因性遺伝子座に存在する（すなわち、ヌクレオチド配列が野生型の非ヒト動物にある場合）か、または異所性に存在する（例えば、そのゲノムにおける内因性免疫グロブリン鎖の遺伝子座と異なる遺伝子座に存在するか、またはその内因性の遺伝子座内に、例えば、免疫グロブリン可変遺伝子座内に存在し、ここで、該内因性の遺伝子座は、ゲノムにおける異なる位置に配置されるか、またはゲノムにおける異なる位置へと移動している）。

一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｃ_Ｈ２におけるまたはＣ_Ｈ３における改変であって、酸性の環境で（例えば、ｐＨが、約５．５〜約６．０の範囲であるエンドソーム内で）重鎖定常領域アミノ酸配列のＦｃＲｎへの親和性を増大させる改変を含む。

一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、２５０位における改変（例えば、ＥまたはＱ）；２５０および４２８位における改変（例えば、ＬまたはＦ）；２５２位における改変（例えば、Ｌ／Ｙ／Ｆ／ＷまたはＴ）、２５４位における改変（例えば、ＳまたはＴ）、および２５６位における改変（例えば、Ｓ／Ｒ／Ｑ／Ｅ／ＤまたはＴ）；または４２８および／もしくは４３３位における改変（例えば、Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｐ／ＱまたはＫ）、および／もしくは４３４位における改変（例えば、Ｈ／ＦまたはＹ）；または２５０および／もしくは４２８位における改変；または３０７もしくは３０８位における改変（例えば、３０８Ｆ、Ｖ３０８Ｆ）、ならびに４３４位における改変を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。一実施形態では、改変は、４２８Ｌ（例えば、Ｍ４２８Ｌ）および４３４Ｓ（例えば、Ｎ４３４Ｓ）の改変；４２８Ｌ、２５９Ｉ（例えば、Ｖ２５９Ｉ）、および３０８Ｆ（例えば、Ｖ３０８Ｆ）の改変；４３３Ｋ（例えば、Ｈ４３３Ｋ）および４３４位（例えば、４３４Ｙ）の改変；２５２、２５４、および２５６位（例えば、２５２Ｙ、２５４Ｔ、および２５６Ｅ）における改変；２５０Ｑおよび４２８Ｌの改変（例えば、Ｔ２５０ＱおよびＭ４２８Ｌ）；ならびに３０７および／または３０８位における改変（例えば、３０８Ｆまたは３０８Ｐ）であって、酸性の環境で（例えば、ｐＨが、約５．５〜約６．０の範囲であるエンドソーム内で）重鎖定常領域アミノ酸配列のＦｃＲｎへの親和性を増大させる改変を含む。

一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、２５２位のアミノ酸残基と２５７位のアミノ酸残基との間に、少なくとも１つの改変であって、酸性の環境で（例えば、ｐＨが、約５．５〜約６．０の範囲であるエンドソーム内で）ヒトＣ_Ｈ２のアミノ酸配列のＦｃＲｎへの親和性を増大させる改変を含む、ヒトＣ_Ｈ２のアミノ酸配列をコードする。

一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、３０７位のアミノ酸残基と３１１位のアミノ酸残基との間に、少なくとも１つの改変であって、酸性の環境で（例えば、ｐＨが、約５．５〜約６．０の範囲であるエンドソーム内で）ヒトＣ_Ｈ２のアミノ酸配列のＦｃＲｎへの親和性を増大させる改変を含む、ヒトＣ_Ｈ２のアミノ酸配列をコードする。

一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、４３３位のアミノ酸残基と４３６位のアミノ酸残基との間に、少なくとも１つの改変であって、酸性の環境で（例えば、ｐＨが、約５．５〜約６．０の範囲であるエンドソーム内で）ヒトＣ_Ｈ３のアミノ酸配列のＦｃＲｎへの親和性を増大させる改変を含む、ヒトＣ_Ｈ３のアミノ酸配列をコードする。

一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｍ４２８Ｌ、Ｎ４３４Ｓ、およびこれらの組合せからなる群から選択される変異を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。

一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｍ４２８Ｌ、Ｖ２５９Ｉ、Ｖ３０８Ｆ、およびこれらの組合せからなる群から選択される変異を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。

一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｎ４３４Ａ変異を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。

一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ、およびこれらの組合せからなる群から選択される変異を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。

一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｔ２５０Ｑ、Ｍ２４８Ｌ、またはこれらの両方からなる群から選択される変異を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。

一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｈ４３３Ｋ、Ｎ４３４Ｙ、またはこれらの両方からなる群から選択される変異を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。

一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、（１）本明細書に記載されている、再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域のヌクレオチド配列が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４、およびこれらの組合せから選択されるヒトＩｇＧの第一のＣＨ_３のアミノ酸配列をコードする第一の重鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結されている、第一の対立遺伝子；ならびに（２）本明細書に記載されている、再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域のヌクレオチド配列が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４、およびこれらの組合せから選択されるヒトＩｇＧの第二のＣ_Ｈ３のアミノ酸配列をコードする第二の重鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結されており、第二のＣＨ_３のアミノ酸配列が、第二のＣＨ_３のアミノ酸配列の、プロテインＡへの結合を低減するか、または消失させる改変（例えば、ＵＳ２０１０／０３３１５２７Ａ１を参照されたい）を含む、第二の対立遺伝子を含む。

一実施形態では、第二のＣＨ_３のアミノ酸配列は、Ｈ９５Ｒの改変（ＩＭＧＴエクソン番号付けによる；ＥＵ番号付けによるＨ４３５Ｒ）を含む。一実施形態では、第二のＣＨ_３のアミノ酸配列は、Ｙ９６Ｆの改変（ＩＭＧＴエクソン番号付けによる；ＥＵによるＨ４３６Ｆ）をさらに含む。別の実施形態では、第二のＣＨ_３のアミノ酸配列は、Ｈ９５Ｒの改変（ＩＭＧＴエクソン番号付けによる；ＥＵ番号付けによるＨ４３５Ｒ）およびＹ９６Ｆの改変（ＩＭＧＴエクソン番号付けによる；ＥＵによるＨ４３６Ｆ）の両方を含む。

一実施形態では、第二のＣＨ_３のアミノ酸配列は、改変ヒトＩｇＧ１からのアミノ酸配列であり、Ｄ１６Ｅ、Ｌ１８Ｍ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴ；ＥＵによるＤ３５６Ｅ、Ｌ３８Ｍ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、およびＶ４２２Ｉ）からなる群から選択される変異をさらに含む。

一実施形態では、第二のＣＨ_３のアミノ酸配列は、改変ヒトＩｇＧ２からのアミノ酸配列であり、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴ：ＥＵによるＮ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、およびＶ４２２Ｉ）からなる群から選択される変異をさらに含む。

一実施形態では、第二のＣＨ_３のアミノ酸配列は、改変ヒトＩｇＧ４からのアミノ酸配列であり、Ｑ１５Ｒ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、Ｒ６９Ｋ、Ｅ７９Ｑ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴ：ＥＵによるＱ３５５Ｒ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、Ｒ４０９Ｋ、Ｅ４１９Ｑ、およびＶ４２２Ｉ）からなる群から選択される変異をさらに含む。

一実施形態では、重鎖定常領域アミノ酸配列は、非ヒト定常領域のアミノ酸配列であり、重鎖定常領域アミノ酸配列は、上記の種類の改変のうちのいずれかのうちの１つまたは複数を含む。

一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、ヒト重鎖定常領域アミノ酸配列であり、ヒト重鎖定常領域アミノ酸配列は、上記の種類の改変のうちのいずれかのうちの１つまたは複数を含む。

一実施形態では、全てまたは実質的に全ての内因性のＶ_Ｈ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、およびＪ_Ｈ遺伝子セグメントを、免疫グロブリン重鎖遺伝子座から欠失させるか、または非機能性にする（例えば、免疫グロブリン遺伝子座におけるヌクレオチド配列（例えば、外因性ヌクレオチド配列）の挿入を介して、または内因性のＶ_Ｈセグメント、Ｄセグメント、Ｊ_Ｈセグメントの非機能性の再構成または反転を介して）。一実施形態では、例えば、全ての内因性のＶ_Ｈ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、またはＪ_Ｈ遺伝子セグメントのうちの約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、約９６％以上、約９７％以上、約９８％以上、または約９９％以上を欠失させるか、または非機能性にする。一実施形態では、例えば、内因性の機能性Ｖ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、またはＪ遺伝子セグメントのうちの少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を欠失させるか、または非機能性にする。

一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座は、全てまたは実質的に全ての内因性のＶ_Ｈ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、およびＪ_Ｈ遺伝子セグメントを欠失させるか、または非機能性にする改変を含み、遺伝子改変された遺伝子座は、本明細書に記載されている、少なくとも１つの反転させたヒトＤ遺伝子セグメントを含む、再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列を含み、再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、内因性位置に存在する（すなわち、ヌクレオチド配列が野生型の非ヒト動物にある場合）か、または異所性に存在する（例えば、そのゲノムにおける内因性免疫グロブリン鎖の遺伝子座と異なる遺伝子座に存在する、またはその内因性の遺伝子座内に、例えば、免疫グロブリン可変遺伝子座内に存在し、ここで、該内因性の遺伝子座は、ゲノムにおける異なる位置に配置されるか、またはゲノムにおける異なる位置へと移動している）。

一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、内因性Ａｄａｍ６ａ遺伝子、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子、またはこれらの両方を含み、遺伝子改変は、内因性のＡｄａｍ６ａ遺伝子、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子、またはこれらの両方の発現および／または機能に影響を及ぼさない。

一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、異所性に存在するＡｄａｍ６ａ遺伝子、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子、またはこれらの両方を含む。一実施形態では、Ａｄａｍ６ａ遺伝子は、非ヒトＡｄａｍ６ａ遺伝子である。一実施形態では、Ａｄａｍ６ａ遺伝子は、マウスＡｄａｍ６ａ遺伝子である。一実施形態では、Ａｄａｍ６ａ遺伝子は、ヒトＡｄａｍ６ａ遺伝子である。一実施形態では、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子は、非ヒトＡｄａｍ６ｂ遺伝子である。一実施形態では、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子は、マウスＡｄａｍ６ｂ遺伝子である。一実施形態では、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子は、ヒトＡｄａｍ６ｂ遺伝子である。

一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、ヒト化された、再構成されていないλ軽鎖可変遺伝子配列および／またはκ軽鎖可変遺伝子配列をさらに含む。一実施形態では、ヒト化された、再構成されていないλ軽鎖可変遺伝子配列および／またはκ軽鎖可変遺伝子配列は、λ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列およびκ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列から選択される、免疫グロブリン軽鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。一実施形態では、ヒト化された、再構成されていないλ軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、λ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。一実施形態では、λ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列は、マウス配列、ラット配列、またはヒト配列である。一実施形態では、ヒト化された、再構成されていないκ軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、κ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。一実施形態では、κ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列は、マウス配列、ラット配列、またはヒト配列である。

一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、軽鎖可変ドメインをコードする少なくとも１つのリーディングフレームに少なくとも１つのヒスチジンコドンを導入する少なくとも１つの改変を含有する、再構成されていない軽鎖可変遺伝子配列を含む。一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、軽鎖ＣＤＲに１つ、２つ、３つ、または４つのヒスチジンコドンを含む、再構成された（例えば、再構成されたλまたはκのＶ／Ｊ配列）配列を含む。一実施形態では、ＣＤＲは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、およびこれらの組合せから選択される。一実施形態では、再構成されていないかまたは再構成された軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、再構成されていないかまたは再構成されたヒトλ軽鎖可変領域またはヒトκ軽鎖可変領域のヌクレオチド配列である。一実施形態では、再構成されていないかまたは再構成されたヒトλ軽鎖可変領域またはヒトκ軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、内因性のマウス免疫グロブリン軽鎖遺伝子座に存在する。一実施形態では、マウス免疫グロブリン軽鎖遺伝子座は、マウスκ遺伝子座である。一実施形態では、マウス免疫グロブリン軽鎖遺伝子座は、マウス免疫グロブリン軽鎖遺伝子座は、マウスλ遺伝子座である。

一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、マウスの免疫グロブリン重鎖遺伝子座に存在する。一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスにおけるヒト化免疫グロブリン重鎖遺伝子座に存在する。

一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質は、酸性の環境で（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨで）、遺伝子改変なしの、対応する野生型の重鎖可変ドメインより弱い抗原結合を示す。

一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ_１／２）は、２５℃、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、２分間未満である。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ_１／２）は、３７℃、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、２分間未満である。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ_１／２）は、２５℃、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、１分間未満である。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ_１／２）は、３７℃、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、１分間未満である。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質は、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、解離半減期（ｔ_１／２）を、中性ｐＨ（例えば、約７．０〜約７．４のｐＨ）における抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ_１／２）と比較して、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、または少なくとも約３０倍短縮する。

一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質は、遺伝子改変なしの野生型の抗原結合タンパク質と比較して、ｐＨ依存性リサイクル性の改善、血清半減期の延長、またはこれらの両方を特徴とする。

一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、目的の抗原で刺激されると、１つまたは複数のヒスチジン残基を含む重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質、例えば、抗体を産生することが可能なＢ細胞集団を含む。本明細書に記載されている抗原結合タンパク質は、被験体へと投与されると、重鎖可変ドメインをコードするが、重鎖可変ドメインにヒスチジン残基を含まない、類似するか、または十分に類似するアミノ酸配列を保有する、対応する野生型の抗原結合タンパク質を凌駕する血清半減期の延長を示す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている抗原結合タンパク質は、重鎖可変ドメインをコードするが、重鎖可変ドメインにヒスチジン残基を含まない、類似するか、または十分に類似するアミノ酸配列を保有する、対応する野生型の抗原結合タンパク質の少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍の血清半減期の延長を示す。

一態様では、その生殖細胞系列ゲノムに、再構成されていないヒト重鎖可変領域のヌクレオチド配列を含む、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座を含む非ヒト動物であって、再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列が、少なくとも１つのヒスチジンコドンの付加または少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む非ヒト動物が提供される。

一実施形態では、非ヒト動物は、齧歯動物、例えば、マウス、ラット、またはハムスターを含む哺乳動物である。

一実施形態では、付加または置換されたヒスチジンコドンは、ヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメント、ヒトＤ遺伝子セグメント、ヒトＪ_Ｈ遺伝子セグメント、およびこれらの組合せから選択される、免疫グロブリン重鎖遺伝子セグメントに存在する。一実施形態では、免疫グロブリン重鎖遺伝子セグメントは、ヒト生殖細胞系列Ｖ_Ｈ遺伝子セグメント、ヒト生殖細胞系列Ｄ遺伝子セグメント、ヒト生殖細胞系列Ｊ_Ｈ遺伝子セグメント、およびこれらの組合せから選択される。

一実施形態では、ヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントは、Ｖ_Ｈ１−２、Ｖ_Ｈ１−３、Ｖ_Ｈ１−８、Ｖ_Ｈ１−１８、Ｖ_Ｈ１−２４、Ｖ_Ｈ１−４５、Ｖ_Ｈ１−４６、Ｖ_Ｈ１−５８、Ｖ_Ｈ１−６９、Ｖ_Ｈ２−５、Ｖ_Ｈ２−２６、Ｖ_Ｈ２−７０、Ｖ_Ｈ３−７、Ｖ_Ｈ３−９、Ｖ_Ｈ３−１１、Ｖ_Ｈ３−１３、Ｖ_Ｈ３−１５、Ｖ_Ｈ３−１６、Ｖ_Ｈ３−２０、Ｖ_Ｈ３−２１、Ｖ_Ｈ３−２３、Ｖ_Ｈ３−３０、Ｖ_Ｈ３−３０−３、Ｖ_Ｈ３−３０−５、Ｖ_Ｈ３−３３、Ｖ_Ｈ３−３５、Ｖ_Ｈ３−３８、Ｖ_Ｈ３−４３、Ｖ_Ｈ３−４８、Ｖ_Ｈ３−４９、Ｖ_Ｈ３−５３、Ｖ_Ｈ３−６４、Ｖ_Ｈ３−６６、Ｖ_Ｈ３−７２、Ｖ_Ｈ３−７３、Ｖ_Ｈ３−７４、Ｖ_Ｈ４−４、Ｖ_Ｈ４−２８、Ｖ_Ｈ４−３０−１、Ｖ_Ｈ４−３０−２、Ｖ_Ｈ４−３０−４、Ｖ_Ｈ４−３１、Ｖ_Ｈ４−３４、Ｖ_Ｈ４−３９、Ｖ_Ｈ４−５９、Ｖ_Ｈ４−６１、Ｖ_Ｈ５−５１、Ｖ_Ｈ６−１、Ｖ_Ｈ７−４−１、Ｖ_Ｈ７−８１、およびこれらの組合せからなる群から選択される。

一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントは、Ｄ１−１、Ｄ１−７、Ｄ１−１４、Ｄ１−２０、Ｄ１−２６、Ｄ２−２、Ｄ２−８、Ｄ２−１５、Ｄ２−２１、Ｄ３−３、Ｄ３−９、Ｄ３−１０、Ｄ３−１６、Ｄ３−２２、Ｄ４−４、Ｄ４−１１、Ｄ４−１７、Ｄ４−２３、Ｄ５−１２、Ｄ５−５、Ｄ５−１８、Ｄ５−２４、Ｄ６−６、Ｄ６−１３、Ｄ６−１９、Ｄ６−２５、Ｄ７−２７、およびこれらの組合せからなる群から選択される。

一実施形態では、ヒトＪ_Ｈ遺伝子セグメントは、Ｊ_Ｈ１、Ｊ_Ｈ２、Ｊ_Ｈ３、Ｊ_Ｈ４、Ｊ_Ｈ５、Ｊ_Ｈ６、およびこれらの組合せからなる群から選択される。

一実施形態では、付加または置換されたヒスチジンコドンは、Ｎ末端領域、ループ４領域、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、またはこれらの組合せをコードする、再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列に存在する。

一実施形態では、再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上、１０以上、１１以上、１２以上、１３以上、１４以上、１５以上、１６以上、１７以上、１８以上、１９以上、２０以上、２１以上、２２以上、２３以上、２４以上、または２５以上、２６以上、２７以上、２８以上、２９以上、３０以上、３１以上、３２以上、３３以上、３４以上、３５以上、３６以上、３７以上、３８以上、３９以上、４０以上、４１以上、４２以上、４３以上、４４以上、４５以上、４６以上、４７以上、４８以上、４９以上、５０以上、５１以上、５２以上、５３以上、５４以上、５５以上、５６以上、５７以上、５８以上、５９以上、６０以上、または６１以上のヒスチジンコドンを含む。

一実施形態では、反転させたヒトＤ遺伝子セグメントを含む、再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、およびＩｇＡから選択される免疫グロブリンアイソタイプをコードする、ヒトまたは非ヒトの重鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。

一実施形態では、再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、Ｃ_Ｈ１、ヒンジ、Ｃ_Ｈ２、Ｃ_Ｈ３、およびこれらの組合せから選択される、ヒトまたは非ヒトの重鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｃ_Ｈ１、ヒンジ、Ｃ_Ｈ２、およびＣ_Ｈ３（Ｃ_Ｈ１−ヒンジ−Ｃ_Ｈ２−Ｃ_Ｈ３）を含む。

一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、内因性遺伝子座に存在する（すなわち、ヌクレオチド配列が野生型の非ヒト動物にある場合）か、または異所性に存在する（例えば、そのゲノムにおける内因性免疫グロブリン鎖の遺伝子座と異なる遺伝子座に存在するか、またはその内因性の遺伝子座内に、例えば、免疫グロブリン可変遺伝子座内に存在し、ここで、該内因性の遺伝子座は、ゲノムにおける異なる位置に配置されるか、またはゲノムにおける異なる位置へと移動している）。

一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｃ_Ｈ２におけるまたはＣ_Ｈ３における改変であって、酸性の環境で（例えば、ｐＨが、約５．５〜約６．０の範囲であるエンドソーム内で）重鎖定常領域アミノ酸配列のＦｃＲｎへの親和性を増大させる改変を含む。

一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、２５０位における改変（例えば、ＥまたはＱ）；２５０および４２８位における改変（例えば、ＬまたはＦ）；２５２位における改変（例えば、Ｌ／Ｙ／Ｆ／ＷまたはＴ）、２５４位における改変（例えば、ＳまたはＴ）、および２５６位における改変（例えば、Ｓ／Ｒ／Ｑ／Ｅ／ＤまたはＴ）；または４２８および／もしくは４３３位における改変（例えば、Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｐ／ＱまたはＫ）、および／もしくは４３４位における改変（例えば、Ｈ／ＦまたはＹ）；または２５０および／もしくは４２８位における改変；または３０７もしくは３０８位における改変（例えば、３０８Ｆ、Ｖ３０８Ｆ）、ならびに４３４位における改変を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。一実施形態では、改変は、４２８Ｌ（例えば、Ｍ４２８Ｌ）および４３４Ｓ（例えば、Ｎ４３４Ｓ）の改変；４２８Ｌ、２５９Ｉ（例えば、Ｖ２５９Ｉ）、および３０８Ｆ（例えば、Ｖ３０８Ｆ）の改変；４３３Ｋ（例えば、Ｈ４３３Ｋ）および４３４位（例えば、４３４Ｙ）の改変；２５２、２５４、および２５６位（例えば、２５２Ｙ、２５４Ｔ、および２５６Ｅ）における改変；２５０Ｑおよび４２８Ｌの改変（例えば、Ｔ２５０ＱおよびＭ４２８Ｌ）；ならびに３０７および／または３０８位における改変（例えば、３０８Ｆまたは３０８Ｐ）であって、酸性の環境で（例えば、ｐＨが、約５．５〜約６．０の範囲であるエンドソーム内で）重鎖定常領域アミノ酸配列のＦｃＲｎへの親和性を増大させる改変を含む。

一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、２５２位のアミノ酸残基と２５７位のアミノ酸残基との間に、少なくとも１つの改変であって、酸性の環境で（例えば、ｐＨが、約５．５〜約６．０の範囲であるエンドソーム内で）ヒトＣ_Ｈ２のアミノ酸配列のＦｃＲｎへの親和性を増大させる改変を含む、ヒトＣ_Ｈ２のアミノ酸配列をコードする。

一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、３０７位のアミノ酸残基と３１１位のアミノ酸残基との間に、少なくとも１つの改変であって、酸性の環境で（例えば、ｐＨが、約５．５〜約６．０の範囲であるエンドソーム内で）ヒトＣ_Ｈ２のアミノ酸配列のＦｃＲｎへの親和性を増大させる改変を含む、ヒトＣ_Ｈ２のアミノ酸配列をコードする。

一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、４３３位のアミノ酸残基と４３６位のアミノ酸残基との間に、少なくとも１つの改変であって、酸性の環境で（例えば、ｐＨが、約５．５〜約６．０の範囲であるエンドソーム内で）ヒトＣ_Ｈ３のアミノ酸配列のＦｃＲｎへの親和性を増大させる改変を含む、ヒトＣ_Ｈ３のアミノ酸配列をコードする。

一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｍ４２８Ｌ、Ｎ４３４Ｓ、およびこれらの組合せからなる群から選択される変異を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。

一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｍ４２８Ｌ、Ｖ２５９Ｉ、Ｖ３０８Ｆ、およびこれらの組合せからなる群から選択される変異を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。

一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｎ４３４Ａ変異を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。

一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ、およびこれらの組合せからなる群から選択される変異を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。

一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｔ２５０Ｑ、Ｍ２４８Ｌ、またはこれらの両方からなる群から選択される変異を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。

一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｈ４３３Ｋ、Ｎ４３４Ｙ、またはこれらの両方からなる群から選択される変異を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。

一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、（１）本明細書に記載されている、再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域のヌクレオチド配列が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４、およびこれらの組合せから選択されるヒトＩｇＧの第一のＣＨ_３のアミノ酸配列をコードする第一の重鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結されている、第一の対立遺伝子；ならびに（２）本明細書に記載されている、再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域のヌクレオチド配列が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４、およびこれらの組合せから選択されるヒトＩｇＧの第二のＣ_Ｈ３のアミノ酸配列をコードする第二の重鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結されており、第二のＣＨ_３のアミノ酸配列が、第二のＣＨ_３のアミノ酸配列の、プロテインＡへの結合を低減するか、または消失させる改変（例えば、ＵＳ２０１０／０３３１５２７Ａ１を参照されたい）を含む、第二の対立遺伝子を含む。

一実施形態では、第二のＣＨ_３のアミノ酸配列は、Ｈ９５Ｒの改変（ＩＭＧＴエクソン番号付けによる；ＥＵ番号付けによるＨ４３５Ｒ）を含む。一実施形態では、第二のＣＨ_３のアミノ酸配列は、Ｙ９６Ｆの改変（ＩＭＧＴエクソン番号付けによる；ＥＵによるＨ４３６Ｆ）をさらに含む。別の実施形態では、第二のＣＨ_３のアミノ酸配列は、Ｈ９５Ｒの改変（ＩＭＧＴエクソン番号付けによる；ＥＵ番号付けによるＨ４３５Ｒ）およびＹ９６Ｆの改変（ＩＭＧＴエクソン番号付けによる；ＥＵによるＨ４３６Ｆ）の両方を含む。

一実施形態では、第二のＣＨ_３のアミノ酸配列は、改変ヒトＩｇＧ１からのアミノ酸配列であり、Ｄ１６Ｅ、Ｌ１８Ｍ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴ；ＥＵによるＤ３５６Ｅ、Ｌ３８Ｍ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、およびＶ４２２Ｉ）からなる群から選択される変異をさらに含む。

一実施形態では、第二のＣＨ_３のアミノ酸配列は、改変ヒトＩｇＧ２からのアミノ酸配列であり、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴ：ＥＵによるＮ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、およびＶ４２２Ｉ）からなる群から選択される変異をさらに含む。

一実施形態では、第二のＣＨ_３のアミノ酸配列は、改変ヒトＩｇＧ４からのアミノ酸配列であり、Ｑ１５Ｒ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、Ｒ６９Ｋ、Ｅ７９Ｑ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴ：ＥＵによるＱ３５５Ｒ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、Ｒ４０９Ｋ、Ｅ４１９Ｑ、およびＶ４２２Ｉ）からなる群から選択される変異をさらに含む。

一実施形態では、重鎖定常領域アミノ酸配列は、非ヒト定常領域のアミノ酸配列であり、重鎖定常領域アミノ酸配列は、上記の種類の改変のうちのいずれかのうちの１つまたは複数を含む。

一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、ヒト重鎖定常領域アミノ酸配列であり、ヒト重鎖定常領域アミノ酸配列は、上記の種類の改変のうちのいずれかのうちの１つまたは複数を含む。

一実施形態では、全てまたは実質的に全ての内因性のＶ_Ｈ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、およびＪ_Ｈ遺伝子セグメントを、免疫グロブリン重鎖遺伝子座から欠失させるか、または非機能性にする（例えば、免疫グロブリン遺伝子座内にヌクレオチド配列（例えば、外因性ヌクレオチド配列）の挿入を介して、または内因性のＶ_Ｈセグメント、Ｄセグメント、Ｊ_Ｈセグメントの非機能性の再構成または反転を介して）。一実施形態では、例えば、全ての内因性のＶ_Ｈ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、またはＪ_Ｈ遺伝子セグメントのうちの約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、約９６％以上、約９７％以上、約９８％以上、または約９９％以上を欠失させるか、または非機能性にする。一実施形態では、例えば、内因性の機能性Ｖ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、またはＪ遺伝子セグメントのうちの少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を欠失させるか、または非機能性にする。

一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座は、全てまたは実質的に全ての内因性のＶ_Ｈ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、およびＪ_Ｈ遺伝子セグメントを欠失させるか、または非機能性にする改変を含み、遺伝子改変された遺伝子座は、１つまたは複数のヒスチジンコドンを有する、１つまたは複数のヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメント、ヒトＤ遺伝子セグメント、および／またはヒトＪ_Ｈ遺伝子セグメントを含む、再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列を含み、再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、内因性位置に存在する（すなわち、ヌクレオチド配列が野生型の非ヒト動物にある場合）か、または異所性に存在する（例えば、そのゲノムにおける内因性免疫グロブリン鎖の遺伝子座と異なる遺伝子座に存在する、またはその内因性の遺伝子座内に、例えば、免疫グロブリン可変遺伝子座内に存在し、ここで、該内因性の遺伝子座は、ゲノムにおける異なる位置に配置されるか、またはゲノムにおける異なる位置へと移動している）。

一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、内因性Ａｄａｍ６ａ遺伝子、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子、またはこれらの両方を含み、遺伝子改変は、内因性のＡｄａｍ６ａ遺伝子、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子、またはこれらの両方の発現および／または機能に影響を及ぼさない。

一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、異所性に存在するＡｄａｍ６ａ遺伝子、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子、またはこれらの両方を含む。一実施形態では、Ａｄａｍ６ａ遺伝子は、非ヒトＡｄａｍ６ａ遺伝子である。一実施形態では、Ａｄａｍ６ａ遺伝子は、ヒトＡｄａｍ６ａ遺伝子である。一実施形態では、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子は、非ヒトＡｄａｍ６ｂ遺伝子である。一実施形態では、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子は、ヒトＡｄａｍ６ｂ遺伝子である。

一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、ヒト化された、再構成されていないλ軽鎖可変遺伝子配列および／またはκ軽鎖可変遺伝子配列をさらに含む。一実施形態では、ヒト化された、再構成されていないλ軽鎖可変遺伝子配列および／またはκ軽鎖可変遺伝子配列は、λ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列およびκ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列から選択される、免疫グロブリン軽鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。一実施形態では、ヒト化された、再構成されていないλ軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、λ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。一実施形態では、λ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列は、マウス配列、ラット配列、またはヒト配列である。一実施形態では、ヒト化された、再構成されていないκ軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、κ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。一実施形態では、κ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列は、マウス配列、ラット配列、またはヒト配列である。

一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、軽鎖可変ドメインをコードする少なくとも１つのリーディングフレームに少なくとも１つのヒスチジンコドンを導入する少なくとも１つの改変を含有する、再構成されていない軽鎖可変遺伝子配列を含む。一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、軽鎖ＣＤＲに１つ、２つ、３つ、または４つのヒスチジンコドンを含む、再構成された（例えば、再構成されたλまたはκのＶ／Ｊ配列）配列を含む。一実施形態では、ＣＤＲは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、およびこれらの組合せから選択される。一実施形態では、再構成されていないかまたは再構成された軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、再構成されていないかまたは再構成されたヒトλ軽鎖可変領域またはヒトκ軽鎖可変領域のヌクレオチド配列である。一実施形態では、再構成されていないかまたは再構成されたヒトλ軽鎖可変領域またはヒトκ軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、内因性のマウス免疫グロブリン軽鎖遺伝子座に存在する。一実施形態では、マウス免疫グロブリン軽鎖遺伝子座は、マウスκ遺伝子座である。一実施形態では、マウス免疫グロブリン軽鎖遺伝子座は、マウスλ遺伝子座である。

一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、マウスの免疫グロブリン重鎖遺伝子座に存在する。一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスにおけるヒト化免疫グロブリン重鎖遺伝子座に存在する。

一実施形態では、非ヒト動物は、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座についてヘテロ接合性であり、非ヒト動物は、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座に主に由来する、少なくとも１つのヒスチジン残基を含むヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインを発現させることが可能である。

一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質は、酸性の環境で（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨで）、遺伝子改変なしの、対応する野生型の重鎖可変ドメインより弱い抗原結合を示す。

一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ_１／２）は、２５℃、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、２分間未満である。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ_１／２）は、３７℃、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、２分間未満である。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ_１／２）は、２５℃、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、１分間未満である。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ_１／２）は、３７℃、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、１分間未満である。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質は、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、解離半減期（ｔ_１／２）を、中性ｐＨ（例えば、約７．０〜約７．４のｐＨ）における抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ_１／２）と比較して、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、または少なくとも約３０倍短縮する。

一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質は、遺伝子改変なしの野生型の抗原結合タンパク質と比較して、ｐＨ依存性リサイクル性の改善、血清半減期の延長、またはこれらの両方を特徴とする。

一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、目的の抗原で刺激されると、１つまたは複数のヒスチジン残基を含む重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質、例えば、抗体を産生することが可能なＢ細胞集団を含む。本明細書に記載されている抗原結合タンパク質は、被験体へと投与されると、重鎖可変ドメインをコードするが、重鎖可変ドメインにヒスチジン残基を含まない、類似するか、または十分に類似するアミノ酸配列を保有する、対応する野生型の抗原結合タンパク質を凌駕する血清半減期の延長を示す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている抗原結合タンパク質は、重鎖可変ドメインをコードするが、重鎖可変ドメインにヒスチジン残基を含まない、類似するか、または十分に類似するアミノ酸配列を保有する、対応する野生型の抗原結合タンパク質の少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍の血清半減期の延長を示す。

一態様では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座を含む非ヒト動物であって、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座が、再構成されていないヒト重鎖可変領域のヌクレオチド配列を含み、再構成されていないヒト重鎖可変領域のヌクレオチド配列が、少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む非ヒト動物が提供される。

一実施形態では、非ヒト動物は、齧歯動物、例えば、マウス、ラット、またはハムスターを含む哺乳動物である。

一実施形態では、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上、１０以上、１１以上、１２以上、１３以上、１４以上、１５以上、１６以上、１７以上、１８以上、１９以上、２０以上、２１以上、２２以上、２３以上、２４以上、２５以上、２６以上、２７以上、２８以上、２９以上、３０以上、３１以上、３２以上、３３以上、３４以上、３５以上、３６以上、３７以上、３８以上、３９以上、４０以上、４１以上、４２以上、４３以上、４４以上、４５以上、４６以上、４７以上、４８以上、４９以上、５０以上、５１以上、５２以上、５３以上、５４以上、５５以上、５６以上、５７以上、５８以上、５９以上、６０以上、または６１以上の内因性の非ヒスチジンコドンを、ヒスチジンコドンで置きかえる。

一実施形態では、内因性の非ヒスチジンコドンは、Ｙ、Ｎ、Ｄ、Ｑ、Ｓ、Ｗ、およびＲから選択されるアミノ酸をコードする。

一実施形態では、置換されたヒスチジンコドンは、Ｎ末端領域、ループ４領域、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、これらの組合せから選択される免疫グロブリン可変ドメインをコードする、再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列に存在する。

一実施形態では、置換されたヒスチジンコドンは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、およびこれらの組合せから選択される相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードする、再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列に存在する。

一実施形態では、置換されたヒスチジンコドンは、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４、およびこれらの組合せから選択されるフレーム領域（ＦＲ）をコードする、再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列に存在する。

一実施形態では、再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、ヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントの少なくとも１つのリーディングフレームにおける１つまたは複数の内因性非ヒスチジンコドンが、ヒスチジンコドンで置きかえられた、遺伝子改変されたヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントを含む。

一実施形態では、再構成されていないヒト重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、ヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントの少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変であって、ヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントが、Ｖ_Ｈ１−２、Ｖ_Ｈ１−３、Ｖ_Ｈ１−８、Ｖ_Ｈ１−１８、Ｖ_Ｈ１−２４、Ｖ_Ｈ１−４５、Ｖ_Ｈ１−４６、Ｖ_Ｈ１−５８、Ｖ_Ｈ１−６９、Ｖ_Ｈ２−５、Ｖ_Ｈ２−２６、Ｖ_Ｈ２−７０、Ｖ_Ｈ３−７、Ｖ_Ｈ３−９、Ｖ_Ｈ３−１１、Ｖ_Ｈ３−１３、Ｖ_Ｈ３−１５、Ｖ_Ｈ３−１６、Ｖ_Ｈ３−２０、Ｖ_Ｈ３−２１、Ｖ_Ｈ３−２３、Ｖ_Ｈ３−３０、Ｖ_Ｈ３−３０−３、Ｖ_Ｈ３−３０−５、Ｖ_Ｈ３−３３、Ｖ_Ｈ３−３５、Ｖ_Ｈ３−３８、Ｖ_Ｈ３−４３、Ｖ_Ｈ３−４８、Ｖ_Ｈ３−４９、Ｖ_Ｈ３−５３、Ｖ_Ｈ３−６４、Ｖ_Ｈ３−６６、Ｖ_Ｈ３−７２、Ｖ_Ｈ３−７３、Ｖ_Ｈ３−７４、Ｖ_Ｈ４−４、Ｖ_Ｈ４−２８、Ｖ_Ｈ４−３０−１、Ｖ_Ｈ４−３０−２、Ｖ_Ｈ４−３０−４、Ｖ_Ｈ４−３１、Ｖ_Ｈ４−３４、Ｖ_Ｈ４−３９、Ｖ_Ｈ４−５９、Ｖ_Ｈ４−６１、Ｖ_Ｈ５−５１、Ｖ_Ｈ６−１、Ｖ_Ｈ７−４−１、Ｖ_Ｈ７−８１、およびこれらの組合せからなる群から選択される改変を含む。

一実施形態では、再構成されていないヒト重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、遺伝子改変されたヒトＪ_Ｈ遺伝子セグメントであって、ヒトＪ_Ｈ遺伝子セグメントの少なくとも１つのリーディングフレームにおける１つまたは複数の内因性非ヒスチジンコドンが、ヒスチジンコドンで置きかえられた遺伝子改変されたヒトＪ_Ｈ遺伝子セグメントを含む。

一実施形態では、再構成されていないヒト重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、ヒトＪ_Ｈセグメントの少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変であって、ヒトＪ_Ｈ遺伝子セグメントが、Ｊ_Ｈ１、Ｊ_Ｈ２、Ｊ_Ｈ３、Ｊ_Ｈ４、Ｊ_Ｈ５、Ｊ_Ｈ６、およびこれらの組合せからなる群から選択される改変を含む。

一実施形態では、置換されたヒスチジンコドンは、ＣＤＲ３の一部をコードする重鎖可変領域のヌクレオチド配列に存在する。一実施形態では、ＣＤＲ３の一部は、リーディングフレームにおける少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変を含む、遺伝子改変されたヒトＤ遺伝子セグメントのリーディングフレームに由来するアミノ酸配列を含む。

一実施形態では、ヒスチジンコドンで置換される内因性非ヒスチジンコドンは、Ｙ、Ｎ、Ｄ、Ｑ、Ｓ、Ｗ、およびＲから選択されるアミノ酸をコードする。

一実施形態では、置換されるヒスチジンコドンは、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ヒト化免疫グロブリンマウス内で最も高頻度に観察されるヒトＤ遺伝子セグメントの少なくとも１つのリーディングフレームに存在する。

一実施形態では、ＣＤＲ３の一部をコードする、遺伝子改変されたヒトＤ遺伝子セグメントのリーディングフレームは、疎水性フレーム、終止フレーム、および親水性フレームから選択される。

一実施形態では、リーディングフレームは、ヒトＤ遺伝子セグメントの疎水性フレームである。

一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの疎水性フレームは、Ｄ１−１（ＧＴＴＧＴ；配列番号８８）、Ｄ１−７（ＧＩＴＧＴ；配列番号８９）、Ｄ１−２０（ＧＩＴＧＴ；配列番号８９）、およびＤ１−２６（ＧＩＶＧＡＴ；配列番号９０）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変をさらに含む。

一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの疎水性フレームは、Ｄ２−２（ＤＩＶＶＶＰＡＡＩ；配列番号９２）、Ｄ２−８（ＤＩＶＬＭＶＹＡＩ；配列番号９４）、Ｄ２−１５（ＤＩＶＶＶＶＡＡＴ；配列番号９５）、およびＤ２−２１（ＨＩＶＶＶＴＡＩ；配列番号９７）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変をさらに含む。

一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの疎水性フレームは、Ｄ３−３（ＩＴＩＦＧＶＶＩＩ；配列番号９８）、Ｄ３−９（ＩＴＩＦ^＊ＬＶＩＩ；配列番号９９、配列番号１００）、Ｄ３−１０（ＩＴＭＶＲＧＶＩＩ；配列番号１０１）、Ｄ３−１６（ＩＭＩＴＦＧＧＶＩＶＩ；配列番号１０２）、およびＤ３−２２（ＩＴＭＩＶＶＶＩＴ；配列番号１０３）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性コドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変をさらに含む。

一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの疎水性フレームは、Ｄ４−４（ＴＴＶＴ；配列番号１０５）、Ｄ４−１１（ＴＴＶＴ；配列番号１０５）、Ｄ４−１７（ＴＴＶＴ；配列番号１０５）、Ｄ４−２３（ＴＴＶＶＴ；配列番号１０６）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変をさらに含む。

一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの疎水性フレームは、Ｄ５−５（ＶＤＴＡＭＶ；配列番号１０７）、Ｄ５−１２（ＶＤＩＶＡＴＩ；配列番号１０８）、Ｄ５−１８（ＶＤＴＡＭＶ；配列番号１０７）、およびＤ５−２４（ＶＥＭＡＴＩ；配列番号１０９）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変をさらに含む。

一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの疎水性フレームは、Ｄ６−６（ＳＩＡＡＲ；配列番号１１１）、Ｄ６−１３（ＧＩＡＡＡＧ；配列番号１１３）、およびＤ６−１９（ＧＩＡＶＡＧ；配列番号１１５）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変をさらに含む。

一実施形態では、疎水性フレームは、ヒトＤ７−２７（ＬＴＧ）をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変をさらに含む。

一実施形態では、リーディングフレームは、ヒトＤ遺伝子セグメントの終止リーディングフレームである。

一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの終止リーディングフレームは、Ｄ１−１（ＶＱＬＥＲ；配列番号８）、Ｄ１−７（Ｖ^＊ＬＥＬ）、Ｄ１−２０（Ｖ^＊ＬＥＲ）、Ｄ１−２６（Ｖ^＊ＷＥＬＬ；配列番号１２）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変をさらに含む。

一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの終止リーディングフレームは、Ｄ２−２（ＲＩＬ^＊＊ＹＱＬＬＹ；配列番号１４）、Ｄ２−８（ＲＩＬＹ^＊ＷＣＭＬＹ；配列番号１６および配列番号１７）、Ｄ２−１５（ＲＩＬ^＊ＷＷ^＊ＬＬＬ）、およびＤ２−２１（ＳＩＬＷＷ^＊ＬＬＦ；配列番号１９）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変をさらに含む。

一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの終止リーディングフレームは、Ｄ３−３（ＶＬＲＦＬＥＷＬＬＹ；配列番号２１）、Ｄ３−９（ＶＬＲＹＦＤＷＬＬ^＊；配列番号２３）、Ｄ３−１０（ＶＬＬＷＦＧＥＬＬ^＊；配列番号２５）、Ｄ３−１６（ＶＬ^＊ＬＲＬＧＥＬＳＬＹ；配列番号２７）、およびＤ３−２２（ＶＬＬ^＊＊＊ＷＬＬＬ；配列番号２９）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変を含む。

一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの終止リーディングフレームは、Ｄ４−４（^＊ＬＱ^＊Ｌ）、Ｄ４−１１（^＊ＬＱ^＊Ｌ）、Ｄ４−１７（^＊ＬＲ^＊Ｌ）、およびＤ４−２３（^＊ＬＲＷ^＊Ｌ）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変を含む。

一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの終止リーディングフレームは、Ｄ５−５（ＷＩＱＬＷＬ；配列番号３５）；Ｄ５−１２（ＷＩ^＊ＷＬＲＬ；配列番号３７）、Ｄ５−１８（ＷＩＱＬＷＬ；配列番号３５）、およびＤ５−２４（^＊ＲＷＬＱＬ；配列番号３９）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変を含む。

一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの終止リーディングフレームは、Ｄ６−６（Ｖ^＊ＱＬＶ）、Ｄ６−１３（Ｖ^＊ＱＱＬＶ；配列番号４１）、およびＤ６−１９（Ｖ^＊ＱＷＬＶ；配列番号４３）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変をさらに含む。

一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの終止リーディングフレームは、Ｄ７−２７（^＊ＬＧ）をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列におけるヒトＤ遺伝子セグメントの少なくとも１つの内因性コドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変をさらに含む。

一実施形態では、リーディングフレームは、ヒトＤ遺伝子セグメントの親水性フレームである。

一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの親水性フレームは、Ｄ１−１（ＹＮＷＮＤ；配列番号４５）、Ｄ１−７（ＹＮＷＮＹ；配列番号４７）、Ｄ１−２０（ＹＮＷＮＤ；配列番号４５）、およびＤ１−２６（ＹＳＧＳＹＹ；配列番号４９）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性コドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変をさらに含む。一実施形態では、親水性フレームは、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、およびこれらの組合せからなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。

一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの親水性フレームは、Ｄ２−２（ＧＹＣＳＳＴＳＣＹＴ；配列番号５１）、Ｄ２−８（ＧＹＣＴＮＧＶＣＹＴ；配列番号５３）、Ｄ２−１５（ＧＹＣＳＧＧＳＣＹＳ；配列番号５５）、およびＤ２−２１（ＡＹＣＧＧＤＣＹＳ；配列番号５７）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性コドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変をさらに含む。一実施形態では、親水性フレームは、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、およびこれらの組合せからなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。

一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの親水性フレームは、Ｄ３−３（ＹＹＤＦＷＳＧＹＹＴ；配列番号５９）、Ｄ３−９（ＹＹＤＩＬＴＧＹＹＮ；配列番号６１）、Ｄ３−１０（ＹＹＹＧＳＧＳＹＹＮ；配列番号６３）、Ｄ３−１６（ＹＹＤＹＶＷＧＳＹＲＹＴ；配列番号６５）、およびＤ３−２２（ＹＹＹＤＳＳＧＹＹＹ；配列番号６７）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性コドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変をさらに含む。一実施形態では、親水性フレームは、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、およびこれらの組合せからなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。

一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの親水性フレームは、Ｄ４−４（ＤＹＳＮＹ；配列番号６９）、Ｄ４−１１（ＤＹＳＮＹ；配列番号６９）、Ｄ４−１７（ＤＹＧＤＹ；配列番号７１）、およびＤ４−２３（ＤＹＧＧＮＳ；配列番号７３）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性コドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変を含む。一実施形態では、親水性フレームは、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、およびこれらの組合せからなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。

一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの親水性フレームは、Ｄ５−５（ＧＹＳＹＧＹ；配列番号７５）、Ｄ５−１２（ＧＹＳＧＹＤＹ；配列番号７７）、Ｄ５−１８（ＧＹＳＹＧＹ；配列番号７５）、およびＤ５−２４（ＲＤＧＹＮＹ；配列番号７９）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性コドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変をさらに含む。一実施形態では、親水性フレームは、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、およびこれらの組合せからなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。

一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの親水性フレームは、Ｄ６−６（ＥＹＳＳＳＳ；配列番号８１）、Ｄ６−１３（ＧＹＳＳＳＷＹ；配列番号８３）、およびＤ６−１９（ＧＹＳＳＧＷＹ；配列番号８５）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性コドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変をさらに含む。一実施形態では、親水性フレームは、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号７６、およびこれらの組合せからなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。

一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの親水性フレームは、Ｄ７−２７（ＮＷＧ）をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性コドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変をさらに含む。

一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの親水性フレームは、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、およびこれらの組合せからなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。

一実施形態では、反転させたヒトＤ遺伝子セグメントを含む、再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、およびＩｇＡから選択される免疫グロブリンアイソタイプをコードする、ヒトまたは非ヒトの重鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。

一実施形態では、再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、Ｃ_Ｈ１、ヒンジ、Ｃ_Ｈ２、Ｃ_Ｈ３、およびこれらの組合せから選択される、ヒトまたは非ヒトの重鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｃ_Ｈ１、ヒンジ、Ｃ_Ｈ２、およびＣ_Ｈ３（Ｃ_Ｈ１−ヒンジ−Ｃ_Ｈ２−Ｃ_Ｈ３）を含む。

一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、内因性遺伝子座に存在する（すなわち、ヌクレオチド配列が野生型の非ヒト動物にある場合）か、または異所性に存在する（例えば、そのゲノムにおける内因性免疫グロブリン鎖の遺伝子座と異なる遺伝子座に存在する、またはその内因性の遺伝子座内に、例えば、免疫グロブリン可変遺伝子座内に存在し、ここで、該内因性の遺伝子座は、ゲノムにおける異なる位置に配置されるか、またはゲノムにおける異なる位置へと移動している）。

一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｃ_Ｈ２におけるまたはＣ_Ｈ３における改変であって、酸性の環境で（例えば、ｐＨが、約５．５〜約６．０の範囲であるエンドソーム内で）重鎖定常領域アミノ酸配列のＦｃＲｎへの親和性を増大させる改変を含む。

一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、２５０位における改変（例えば、ＥまたはＱ）；２５０および４２８位における改変（例えば、ＬまたはＦ）；２５２位における改変（例えば、Ｌ／Ｙ／Ｆ／ＷまたはＴ）、２５４位における改変（例えば、ＳまたはＴ）、および２５６位における改変（例えば、Ｓ／Ｒ／Ｑ／Ｅ／ＤまたはＴ）；または４２８および／もしくは４３３位における改変（例えば、Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｐ／ＱまたはＫ）、および／もしくは４３４位における改変（例えば、Ｈ／ＦまたはＹ）；または２５０および／もしくは４２８位における改変；または３０７もしくは３０８位における改変（例えば、３０８Ｆ、Ｖ３０８Ｆ）、ならびに４３４位における改変を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。一実施形態では、改変は、４２８Ｌ（例えば、Ｍ４２８Ｌ）および４３４Ｓ（例えば、Ｎ４３４Ｓ）の改変；４２８Ｌ、２５９Ｉ（例えば、Ｖ２５９Ｉ）、および３０８Ｆ（例えば、Ｖ３０８Ｆ）の改変；４３３Ｋ（例えば、Ｈ４３３Ｋ）および４３４位（例えば、４３４Ｙ）の改変；２５２、２５４、および２５６位（例えば、２５２Ｙ、２５４Ｔ、および２５６Ｅ）における改変；２５０Ｑおよび４２８Ｌの改変（例えば、Ｔ２５０ＱおよびＭ４２８Ｌ）；ならびに３０７および／または３０８位における改変（例えば、３０８Ｆまたは３０８Ｐ）であって、酸性の環境で（例えば、ｐＨが、約５．５〜約６．０の範囲であるエンドソーム内で）重鎖定常領域アミノ酸配列のＦｃＲｎへの親和性を増大させる改変を含む。

一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、２５２位のアミノ酸残基と２５７位のアミノ酸残基との間に、少なくとも１つの改変であって、酸性の環境で（例えば、ｐＨが、約５．５〜約６．０の範囲であるエンドソーム内で）ヒトＣ_Ｈ２のアミノ酸配列のＦｃＲｎへの親和性を増大させる改変を含む、ヒトＣ_Ｈ２のアミノ酸配列をコードする。

一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、３０７位のアミノ酸残基と３１１位のアミノ酸残基との間に、少なくとも１つの改変であって、酸性の環境で（例えば、ｐＨが、約５．５〜約６．０の範囲であるエンドソーム内で）ヒトＣ_Ｈ２のアミノ酸配列のＦｃＲｎへの親和性を増大させる改変を含む、ヒトＣ_Ｈ２のアミノ酸配列をコードする。

一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、４３３位のアミノ酸残基と４３６位のアミノ酸残基との間に、少なくとも１つの改変であって、酸性の環境で（例えば、ｐＨが、約５．５〜約６．０の範囲であるエンドソーム内で）ヒトＣ_Ｈ３のアミノ酸配列のＦｃＲｎへの親和性を増大させる改変を含む、ヒトＣ_Ｈ３のアミノ酸配列をコードする。

一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｍ４２８Ｌ、Ｎ４３４Ｓ、およびこれらの組合せからなる群から選択される変異を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。

一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｍ４２８Ｌ、Ｖ２５９Ｉ、Ｖ３０８Ｆ、およびこれらの組合せからなる群から選択される変異を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。

一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｎ４３４Ａ変異を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。

一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ、およびこれらの組合せからなる群から選択される変異を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。

一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｔ２５０Ｑ、Ｍ２４８Ｌ、またはこれらの両方からなる群から選択される変異を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。

一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｈ４３３Ｋ、Ｎ４３４Ｙ、またはこれらの両方からなる群から選択される変異を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。

一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、（１）本明細書に記載されている、再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域のヌクレオチド配列が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４、およびこれらの組合せから選択されるヒトＩｇＧの第一のＣＨ_３のアミノ酸配列をコードする第一の重鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結されている、第一の対立遺伝子；ならびに（２）本明細書に記載されている、再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域のヌクレオチド配列が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４、およびこれらの組合せから選択されるヒトＩｇＧの第二のＣ_Ｈ３のアミノ酸配列をコードする第二の重鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結されており、第二のＣＨ_３のアミノ酸配列が、第二のＣＨ_３のアミノ酸配列の、プロテインＡへの結合を低減するか、または消失させる改変（例えば、ＵＳ２０１０／０３３１５２７Ａ１を参照されたい）を含む、第二の対立遺伝子を含む。

一実施形態では、第二のＣＨ_３のアミノ酸配列は、Ｈ９５Ｒの改変（ＩＭＧＴエクソン番号付けによる；ＥＵ番号付けによるＨ４３５Ｒ）を含む。一実施形態では、第二のＣＨ_３のアミノ酸配列は、Ｙ９６Ｆの改変（ＩＭＧＴエクソン番号付けによる；ＥＵによるＨ４３６Ｆ）をさらに含む。別の実施形態では、第二のＣＨ_３のアミノ酸配列は、Ｈ９５Ｒの改変（ＩＭＧＴエクソン番号付けによる；ＥＵ番号付けによるＨ４３５Ｒ）およびＹ９６Ｆの改変（ＩＭＧＴエクソン番号付けによる；ＥＵによるＨ４３６Ｆ）の両方を含む。

一実施形態では、第二のＣＨ_３のアミノ酸配列は、改変ヒトＩｇＧ１からのアミノ酸配列であり、Ｄ１６Ｅ、Ｌ１８Ｍ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴ；ＥＵによるＤ３５６Ｅ、Ｌ３８Ｍ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、およびＶ４２２Ｉ）からなる群から選択される変異をさらに含む。

一実施形態では、第二のＣＨ_３のアミノ酸配列は、改変ヒトＩｇＧ２からのアミノ酸配列であり、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴ：ＥＵによるＮ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、およびＶ４２２Ｉ）からなる群から選択される変異をさらに含む。

一実施形態では、第二のＣＨ_３のアミノ酸配列は、改変ヒトＩｇＧ４からのアミノ酸配列であり、Ｑ１５Ｒ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、Ｒ６９Ｋ、Ｅ７９Ｑ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴ：ＥＵによるＱ３５５Ｒ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、Ｒ４０９Ｋ、Ｅ４１９Ｑ、およびＶ４２２Ｉ）からなる群から選択される変異をさらに含む。

一実施形態では、重鎖定常領域アミノ酸配列は、非ヒト定常領域のアミノ酸配列であり、重鎖定常領域アミノ酸配列は、上記の種類の改変のうちのいずれかのうちの１つまたは複数を含む。

一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、ヒト重鎖定常領域アミノ酸配列であり、ヒト重鎖定常領域アミノ酸配列は、上記の種類の改変のうちのいずれかのうちの１つまたは複数を含む。

一実施形態では、全てまたは実質的に全ての内因性のＶ_Ｈ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、およびＪ_Ｈ遺伝子セグメントを、免疫グロブリン重鎖遺伝子座から欠失させるか、または非機能性にする（例えば、免疫グロブリン遺伝子座内にヌクレオチド配列（例えば、外因性ヌクレオチド配列）の挿入を介して、または内因性のＶ_Ｈセグメント、Ｄセグメント、Ｊ_Ｈセグメントの非機能性の再構成または反転を介して）。一実施形態では、例えば、全ての内因性のＶ_Ｈ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、またはＪ_Ｈ遺伝子セグメントのうちの約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、約９６％以上、約９７％以上、約９８％以上、または約９９％以上を欠失させるか、または非機能性にする。一実施形態では、例えば、内因性の機能性Ｖ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、またはＪ遺伝子セグメントのうちの少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を欠失させるか、または非機能性にする。

一実施形態では、遺伝子改変された遺伝子座は、全てまたは実質的に全ての内因性のＶ_Ｈ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、およびＪ_Ｈ遺伝子セグメントを欠失させるか、または非機能性にする改変を含み、ゲノム遺伝子座は、少なくとも１つのリーディングフレームに少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む、遺伝子改変された、再構成されていないヒト重鎖可変領域のヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、遺伝子改変された、再構成されていない免疫グロブリン重鎖可変遺伝子配列は、内因性位置に存在する（すなわち、ヌクレオチド配列が野生型の非ヒト動物にある場合）か、または異所性に存在する（例えば、そのゲノムにおける内因性免疫グロブリン鎖の遺伝子座と異なる遺伝子座に存在するか、またはその内因性の遺伝子座内に、例えば、免疫グロブリン可変遺伝子座内に存在し、ここで、該内因性の遺伝子座は、ゲノムにおける異なる位置に配置されるか、またはゲノムにおける異なる位置へと移動している）。

一実施形態では、遺伝子改変された遺伝子座は、内因性Ａｄａｍ６ａ遺伝子、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子、またはこれらの両方を含み、遺伝子改変は、内因性のＡｄａｍ６ａ遺伝子、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子、またはこれらの両方の発現および／または機能に影響を及ぼさない。

一実施形態では、遺伝子改変された遺伝子座は、異所性に存在するＡｄａｍ６ａ遺伝子、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子、またはこれらの両方を含む。一実施形態では、Ａｄａｍ６ａ遺伝子は、非ヒトＡｄａｍ６ａ遺伝子である。一実施形態では、Ａｄａｍ６ａ遺伝子は、マウスＡｄａｍ６ａ遺伝子である。一実施形態では、Ａｄａｍ６ａ遺伝子は、ヒトＡｄａｍ６ａ遺伝子である。一実施形態では、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子は、非ヒトＡｄａｍ６ｂ遺伝子である。一実施形態では、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子は、マウスＡｄａｍ６ｂ遺伝子である。一実施形態では、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子は、ヒトＡｄａｍ６ｂ遺伝子である。

一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、ヒト化された、再構成されていないλ軽鎖可変遺伝子配列および／またはκ軽鎖可変遺伝子配列をさらに含む。一実施形態では、ヒト化された、再構成されていないλ軽鎖可変遺伝子配列および／またはκ軽鎖可変遺伝子配列は、λ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列およびκ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列から選択される、免疫グロブリン軽鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。一実施形態では、ヒト化された、再構成されていないλ軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、λ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。一実施形態では、λ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列は、マウス配列、ラット配列、またはヒト配列である。一実施形態では、ヒト化された、再構成されていないκ軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、κ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。一実施形態では、κ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列は、マウス配列、ラット配列、またはヒト配列である。

一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、軽鎖可変ドメインをコードする少なくとも１つのリーディングフレームに少なくとも１つのヒスチジンコドンを導入する少なくとも１つの改変を含有する、再構成されていない軽鎖可変遺伝子配列を含む。一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、軽鎖ＣＤＲに１つ、２つ、３つ、または４つのヒスチジンコドンを含む、再構成された（例えば、再構成されたλまたはκのＶ／Ｊ配列）配列を含む。一実施形態では、ＣＤＲは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、およびこれらの組合せから選択される。一実施形態では、再構成されていないかまたは再構成された軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、再構成されていないかまたは再構成されたヒトλ軽鎖可変領域またはヒトκ軽鎖可変領域のヌクレオチド配列である。一実施形態では、再構成されていないかまたは再構成されたヒトλ軽鎖可変領域またはヒトκ軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、内因性のマウス免疫グロブリン軽鎖遺伝子座に存在する。一実施形態では、マウス免疫グロブリン軽鎖遺伝子座は、マウスκ遺伝子座である。一実施形態では、マウス免疫グロブリン軽鎖遺伝子座は、マウスλ遺伝子座である。

一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、マウスの免疫グロブリン重鎖遺伝子座に存在する。一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスにおけるヒト化免疫グロブリン重鎖遺伝子座に存在する。

一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質は、酸性の環境で（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨで）、遺伝子改変なしの、対応する野生型の重鎖可変ドメインより弱い抗原結合を示す。

一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ_１／２）は、２５℃、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、２分間未満である。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ_１／２）は、３７℃、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、２分間未満である。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ_１／２）は、２５℃、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、１分間未満である。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ_１／２）は、３７℃、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、１分間未満である。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質は、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、解離半減期（ｔ_１／２）を、中性ｐＨ（例えば、約７．０〜約７．４のｐＨ）における抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ_１／２）と比較して、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、または少なくとも約３０倍短縮する。

一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質は、遺伝子改変なしの野生型の抗原結合タンパク質と比較して、ｐＨ依存性リサイクル性の改善、血清半減期の延長、またはこれらの両方を特徴とする。

一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、目的の抗原で刺激されると、１つまたは複数のヒスチジン残基を含む重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質、例えば、抗体を産生することが可能なＢ細胞集団を含む。本明細書に記載されている抗原結合タンパク質は、被験体へと投与されると、重鎖可変ドメインをコードするが、重鎖可変ドメインにヒスチジン残基を含まない、類似するか、または十分に類似するアミノ酸配列を保有する、対応する野生型の抗原結合タンパク質を凌駕する血清半減期の延長を示す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている抗原結合タンパク質は、重鎖可変ドメインをコードするが、重鎖可変ドメインにヒスチジン残基を含まない、類似するか、または十分に類似するアミノ酸配列を保有する、対応する野生型の抗原結合タンパク質の少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍の血清半減期の延長を示す。

一実施形態では、非ヒト動物は、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座についてヘテロ接合性であり、非ヒト動物は、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座に主に由来する、少なくとも１つのヒスチジン残基を含むヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインを発現させることが可能である。

一態様では、ヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメント、ヒトＤ遺伝子セグメント、およびヒトＪ_Ｈ遺伝子セグメントを含む、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座を含む非ヒト動物であって、ヒトＤ遺伝子セグメントのうちの少なくとも１つを、５’側から３’側にかけて、対応する野生型配列に対して反転させており、反転させたヒトＤ遺伝子セグメントの少なくとも１つのリーディングフレームが、ヒスチジンコドンを含む非ヒト動物が提供される。

一実施形態では、非ヒト動物は、齧歯動物、例えば、マウス、ラット、またはハムスターを含む哺乳動物である。

一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、生殖細胞系列ゲノムに存在する。

一実施形態では、反転させたヒトＤ遺伝子セグメントのリーディングフレームは、１つまたは複数、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上、１０以上、１１以上、１２以上、１３以上、１４以上、１５以上、１６以上、１７以上、１８以上、１９以上、２０以上、２１以上、２２以上、２３以上、２４以上、２５以上、２６以上、２７以上、２８以上、２９以上、３０以上、３１以上、３２以上、３３以上、または３４以上のヒスチジンコドンを含む。

一実施形態では、機能性ヒトＤ遺伝子セグメントのうちの少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、または全てもしくは実質的に全ては、対応する野生型配列に対して逆配向である。

一実施形態では、内因性免疫グロブリンのＶ_Ｈ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、Ｊ_Ｈ遺伝子セグメントの全てまたは実質的に全てを、免疫グロブリン重鎖遺伝子座から欠失させるか、または非機能性にする（例えば、免疫グロブリン遺伝子座にヌクレオチド配列、例えば、外因性ヌクレオチド配列の挿入を介して、または内因性の免疫グロブリンＶ_Ｈセグメント、Ｄセグメント、Ｊ_Ｈセグメントの全てもしくは実質的に全ての非機能性の再構成もしくは反転を介して）が、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、ヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメント、ヒトＤ遺伝子セグメント、およびヒトＪ_Ｈ遺伝子セグメントを含み、ヒトＤ遺伝子セグメントのうちの少なくとも１つは対応する野生型配列に対して逆配向で存在し、反転させたヒトＤ遺伝子セグメントの少なくとも１つのリーディングフレームは、少なくとも１つのヒスチジンコドンを含む。

一実施形態では、反転させたヒトＤ遺伝子セグメントは、ヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントおよび／またはヒトＪ_Ｈ遺伝子セグメントに作動可能に連結されている。

一実施形態では、対応する野生型配列と比べて逆配向で存在するヒトＤ遺伝子セグメントは、Ｄ１−１、Ｄ１−７、Ｄ１−２０、Ｄ１−２６、Ｄ２−２、Ｄ２−８、Ｄ２−１５、Ｄ２−２１、Ｄ３−３、Ｄ３−９、Ｄ３−１０、Ｄ３−１６、Ｄ３−２２、Ｄ４−４、Ｄ４−１１、Ｄ４−１７、Ｄ４−２３、Ｄ５−５、Ｄ５−１２、Ｄ５−１８、Ｄ５−２４、Ｄ６−６、Ｄ６−１３、Ｄ６−１９、Ｄ７−２７、およびこれらの組合せからなる群から選択される。

一実施形態では、対応する野生型配列と比べて逆配向で存在するヒトＤ遺伝子セグメントは、Ｄ１−１、Ｄ１−７、Ｄ１−２０、Ｄ１−２６、およびこれらの組合せからなる群から選択されるＤ１遺伝子セグメントである。

一実施形態では、対応する野生型配列と比べて逆配向で存在するヒトＤ遺伝子セグメントは、Ｄ２−２、Ｄ２−８、Ｄ２−１５、Ｄ２−２１、およびこれらの組合せからなる群から選択されるＤ２遺伝子セグメントである。

一実施形態では、対応する野生型配列と比べて逆配向で存在するヒトＤ遺伝子セグメントは、Ｄ３−３、Ｄ３−９、Ｄ３−１０、Ｄ３−１６、Ｄ３−２２、およびこれらの組合せからなる群から選択されるＤ３遺伝子セグメントである。

一実施形態では、対応する野生型配列と比べて逆配向で存在するヒトＤ遺伝子セグメントは、Ｄ４−４、Ｄ４−１１、Ｄ４−１７、Ｄ４−２３、およびこれらの組合せからなる群から選択されるＤ４遺伝子セグメントである。

一実施形態では、対応する野生型配列と比べて逆配向で存在するヒトＤ遺伝子セグメントは、Ｄ５−５、Ｄ５−１２、Ｄ５−１８、Ｄ５−２４、およびこれらの組合せからなる群から選択されるＤ５遺伝子セグメントである。

一実施形態では、対応する野生型配列と比べて逆配向で存在するヒトＤ遺伝子セグメントは、Ｄ６−６、Ｄ６−１３、Ｄ６−１９、およびこれらの組合せからなる群から選択されるＤ６遺伝子セグメントである。

一実施形態では、対応する野生型配列と比べて逆配向で存在するヒトＤ遺伝子セグメントは、Ｄ７−２７である。

一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントのリーディングフレームは、終止リーディングフレーム、親水性リーディングフレーム、疎水性リーディングフレーム、およびこれらの組合せから選択され、反転させたヒトＤ遺伝子セグメントの少なくとも１つのリーディングフレームは、ヒスチジンコドンを含む。

一実施形態では、反転させたヒトＤ遺伝子セグメントを含む、再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、およびＩｇＡから選択される免疫グロブリンアイソタイプをコードする、ヒトまたは非ヒトの重鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。

一実施形態では、再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、Ｃ_Ｈ１、ヒンジ、Ｃ_Ｈ２、Ｃ_Ｈ３、およびこれらの組合せから選択される、ヒトまたは非ヒトの重鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｃ_Ｈ１、ヒンジ、Ｃ_Ｈ２、およびＣ_Ｈ３（すなわち、Ｃ_Ｈ１−ヒンジ−Ｃ_Ｈ２−Ｃ_Ｈ３）を含む。

一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、内因性遺伝子座に存在する（すなわち、ヌクレオチド配列が野生型の非ヒト動物にある場合）か、または異所性に存在する（例えば、そのゲノムにおける内因性免疫グロブリン鎖の遺伝子座と異なる遺伝子座に存在する、またはその内因性の遺伝子座内に、例えば、免疫グロブリン可変遺伝子座内に存在し、ここで、該内因性の遺伝子座は、ゲノムにおける異なる位置に配置されるか、またはゲノムにおける異なる位置へと移動している）。

一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｃ_Ｈ２におけるまたはＣ_Ｈ３における改変であって、酸性の環境で（例えば、ｐＨが、約５．５〜約６．０の範囲であるエンドソーム内で）重鎖定常領域アミノ酸配列のＦｃＲｎへの親和性を増大させる改変を含む。

一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、２５０位における改変（例えば、ＥまたはＱ）；２５０および４２８位における改変（例えば、ＬまたはＦ）；２５２位における改変（例えば、Ｌ／Ｙ／Ｆ／ＷまたはＴ）、２５４位における改変（例えば、ＳまたはＴ）、および２５６位における改変（例えば、Ｓ／Ｒ／Ｑ／Ｅ／ＤまたはＴ）；または４２８および／もしくは４３３位における改変（例えば、Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｐ／ＱまたはＫ）、および／もしくは４３４位における改変（例えば、Ｈ／ＦまたはＹ）；または２５０および／もしくは４２８位における改変；または３０７もしくは３０８位における改変（例えば、３０８Ｆ、Ｖ３０８Ｆ）、ならびに４３４位における改変を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。一実施形態では、改変は、４２８Ｌ（例えば、Ｍ４２８Ｌ）および４３４Ｓ（例えば、Ｎ４３４Ｓ）の改変；４２８Ｌ、２５９Ｉ（例えば、Ｖ２５９Ｉ）、および３０８Ｆ（例えば、Ｖ３０８Ｆ）の改変；４３３Ｋ（例えば、Ｈ４３３Ｋ）および４３４位（例えば、４３４Ｙ）の改変；２５２、２５４、および２５６位（例えば、２５２Ｙ、２５４Ｔ、および２５６Ｅ）における改変；２５０Ｑおよび４２８Ｌの改変（例えば、Ｔ２５０ＱおよびＭ４２８Ｌ）；ならびに３０７および／または３０８位における改変（例えば、３０８Ｆまたは３０８Ｐ）であって、酸性の環境で（例えば、ｐＨが、約５．５〜約６．０の範囲であるエンドソーム内で）重鎖定常領域アミノ酸配列のＦｃＲｎへの親和性を増大させる改変を含む。

一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、２５２位のアミノ酸残基と２５７位のアミノ酸残基との間に、少なくとも１つの改変であって、酸性の環境で（例えば、ｐＨが、約５．５〜約６．０の範囲であるエンドソーム内で）ヒトＣ_Ｈ２のアミノ酸配列のＦｃＲｎへの親和性を増大させる改変を含む、ヒトＣ_Ｈ２のアミノ酸配列をコードする。

一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、３０７位のアミノ酸残基と３１１位のアミノ酸残基との間に、少なくとも１つの改変であって、酸性の環境で（例えば、ｐＨが、約５．５〜約６．０の範囲であるエンドソーム内で）ヒトＣ_Ｈ２のアミノ酸配列のＦｃＲｎへの親和性を増大させる改変を含む、ヒトＣ_Ｈ２のアミノ酸配列をコードする。

一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、４３３位のアミノ酸残基と４３６位のアミノ酸残基との間に、少なくとも１つの改変であって、酸性の環境で（例えば、ｐＨが、約５．５〜約６．０の範囲であるエンドソーム内で）ヒトＣ_Ｈ３のアミノ酸配列のＦｃＲｎへの親和性を増大させる改変を含む、ヒトＣ_Ｈ３のアミノ酸配列をコードする。

一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｍ４２８Ｌ、Ｎ４３４Ｓ、およびこれらの組合せからなる群から選択される変異を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。

一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｍ４２８Ｌ、Ｖ２５９Ｉ、Ｖ３０８Ｆ、およびこれらの組合せからなる群から選択される変異を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。

一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｎ４３４Ａ変異を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。

一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ、およびこれらの組合せからなる群から選択される変異を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。

一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｔ２５０Ｑ、Ｍ２４８Ｌ、またはこれらの両方からなる群から選択される変異を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。

一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｈ４３３Ｋ、Ｎ４３４Ｙ、またはこれらの両方からなる群から選択される変異を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。

一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、（１）本明細書に記載されている、再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域のヌクレオチド配列が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４、およびこれらの組合せから選択されるヒトＩｇＧの第一のＣＨ_３のアミノ酸配列をコードする第一の重鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結されている、第一の対立遺伝子；ならびに（２）本明細書に記載されている、再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域のヌクレオチド配列が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４、およびこれらの組合せから選択されるヒトＩｇＧの第二のＣ_Ｈ３のアミノ酸配列をコードする第二の重鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結されており、第二のＣＨ_３のアミノ酸配列が、第二のＣＨ_３のアミノ酸配列の、プロテインＡへの結合を低減するか、または消失させる改変（例えば、ＵＳ２０１０／０３３１５２７Ａ１を参照されたい）を含む、第二の対立遺伝子を含む。

一実施形態では、第二のＣＨ_３のアミノ酸配列は、Ｈ９５Ｒの改変（ＩＭＧＴエクソン番号付けによる；ＥＵ番号付けによるＨ４３５Ｒ）を含む。一実施形態では、第二のＣＨ_３のアミノ酸配列は、Ｙ９６Ｆの改変（ＩＭＧＴエクソン番号付けによる；ＥＵによるＨ４３６Ｆ）をさらに含む。別の実施形態では、第二のＣＨ_３のアミノ酸配列は、Ｈ９５Ｒの改変（ＩＭＧＴエクソン番号付けによる；ＥＵ番号付けによるＨ４３５Ｒ）およびＹ９６Ｆの改変（ＩＭＧＴエクソン番号付けによる；ＥＵによるＨ４３６Ｆ）の両方を含む。

一実施形態では、第二のＣＨ_３のアミノ酸配列は、改変ヒトＩｇＧ１からのアミノ酸配列であり、Ｄ１６Ｅ、Ｌ１８Ｍ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴ；ＥＵによるＤ３５６Ｅ、Ｌ３８Ｍ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、およびＶ４２２Ｉ）からなる群から選択される変異をさらに含む。

一実施形態では、第二のＣＨ_３のアミノ酸配列は、改変ヒトＩｇＧ２からのアミノ酸配列であり、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴ：ＥＵによるＮ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、およびＶ４２２Ｉ）からなる群から選択される変異をさらに含む。

一実施形態では、第二のＣＨ_３のアミノ酸配列は、改変ヒトＩｇＧ４からのアミノ酸配列であり、Ｑ１５Ｒ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、Ｒ６９Ｋ、Ｅ７９Ｑ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴ：ＥＵによるＱ３５５Ｒ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、Ｒ４０９Ｋ、Ｅ４１９Ｑ、およびＶ４２２Ｉ）からなる群から選択される変異をさらに含む。

一実施形態では、重鎖定常領域アミノ酸配列は、非ヒト定常領域のアミノ酸配列であり、重鎖定常領域アミノ酸配列は、上記の種類の改変のうちのいずれかのうちの１つまたは複数を含む。

一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、ヒト重鎖定常領域アミノ酸配列であり、ヒト重鎖定常領域アミノ酸配列は、上記の種類の改変のうちのいずれかのうちの１つまたは複数を含む。

一実施形態では、全てまたは実質的に全ての内因性のＶ_Ｈ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、およびＪ_Ｈ遺伝子セグメントを、免疫グロブリン重鎖遺伝子座から欠失させるか、または非機能性にする（例えば、免疫グロブリン遺伝子座内にヌクレオチド配列（例えば、外因性ヌクレオチド配列）の挿入を介して、または内因性のＶ_Ｈセグメント、Ｄセグメント、Ｊ_Ｈセグメントの非機能性の再構成または反転を介して）。一実施形態では、例えば、全ての内因性のＶ_Ｈ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、またはＪ_Ｈ遺伝子セグメントのうちの約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、約９６％以上、約９７％以上、約９８％以上、または約９９％以上を欠失させるか、または非機能性にする。一実施形態では、例えば、内因性の機能性Ｖ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、またはＪ遺伝子セグメントのうちの少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を欠失させるか、または非機能性にする。

一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座は、全てまたは実質的に全ての、内因性のＶ_Ｈ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、およびＪ_Ｈ遺伝子セグメントを欠失させるか、または非機能性にする改変を含み、遺伝子改変された遺伝子座は、本明細書に記載されている、少なくとも１つの反転させたヒトＤ遺伝子セグメントを含む、再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列を含み、再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、内因性位置に存在する（すなわち、ヌクレオチド配列が野生型の非ヒト動物にある場合）か、または異所性に存在する（例えば、そのゲノムにおける内因性免疫グロブリン鎖の遺伝子座と異なる遺伝子座に存在する、またはその内因性の遺伝子座内に、例えば、免疫グロブリン可変遺伝子座内に存在し、ここで、該内因性の遺伝子座は、ゲノムにおける異なる位置に配置されるか、またはゲノムにおける異なる位置へと移動している）。

一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、内因性Ａｄａｍ６ａ遺伝子、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子、またはこれらの両方を含み、遺伝子改変は、内因性のＡｄａｍ６ａ遺伝子、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子、またはこれらの両方の発現および／または機能に影響を及ぼさない。

一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、異所性に存在するＡｄａｍ６ａ遺伝子、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子、またはこれらの両方を含む。一実施形態では、Ａｄａｍ６ａ遺伝子は、非ヒトＡｄａｍ６ａ遺伝子である。一実施形態では、Ａｄａｍ６ａ遺伝子は、マウスＡｄａｍ６ａ遺伝子である。一実施形態では、Ａｄａｍ６ａ遺伝子は、ヒトＡｄａｍ６ａ遺伝子である。一実施形態では、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子は、非ヒトＡｄａｍ６ｂ遺伝子である。一実施形態では、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子は、マウスＡｄａｍ６ｂ遺伝子である。一実施形態では、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子は、ヒトＡｄａｍ６ｂ遺伝子である。

一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、ヒト化された、再構成されていないλ軽鎖可変遺伝子配列および／またはκ軽鎖可変遺伝子配列をさらに含む。一実施形態では、ヒト化された、再構成されていないλ軽鎖可変遺伝子配列および／またはκ軽鎖可変遺伝子配列は、λ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列およびκ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列から選択される、免疫グロブリン軽鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。一実施形態では、ヒト化された、再構成されていないλ軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、λ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。一実施形態では、λ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列は、マウス配列、ラット配列、またはヒト配列である。一実施形態では、ヒト化された、再構成されていないκ軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、κ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。一実施形態では、κ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列は、マウス配列、ラット配列、またはヒト配列である。

一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、軽鎖可変ドメインをコードする少なくとも１つのリーディングフレームに少なくとも１つのヒスチジンコドンを導入する少なくとも１つの改変を含有する、再構成されていない軽鎖可変遺伝子配列を含む。一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、軽鎖ＣＤＲに１つ、２つ、３つ、または４つのヒスチジンコドンを含む、再構成された（例えば、再構成されたλまたはκのＶ／Ｊ配列）配列を含む。一実施形態では、ＣＤＲは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、およびこれらの組合せから選択される。一実施形態では、再構成されていないかまたは再構成された軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、再構成されていないかまたは再構成されたヒトλ軽鎖可変領域またはヒトκ軽鎖可変領域のヌクレオチド配列である。一実施形態では、再構成されていないかまたは再構成されたヒトλ軽鎖可変領域またはヒトκ軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、内因性のマウス免疫グロブリン軽鎖遺伝子座に存在する。一実施形態では、マウス免疫グロブリン軽鎖遺伝子座は、マウスκ遺伝子座である。一実施形態では、マウス免疫グロブリン軽鎖遺伝子座は、マウス免疫グロブリン軽鎖遺伝子座は、マウスλ遺伝子座である。

一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、マウスの免疫グロブリン重鎖遺伝子座に存在する。一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスにおけるヒト化免疫グロブリン重鎖遺伝子座に存在する。

一実施形態では、非ヒト動物は、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座についてヘテロ接合性であり、非ヒト動物は、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座に主に由来する、少なくとも１つのヒスチジン残基を含むヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインを発現させることが可能である。

一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質は、酸性の環境で（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨで）、遺伝子改変なしの、対応する野生型の重鎖可変ドメインより弱い抗原結合を示す。

一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ_１／２）は、２５℃、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、２分間未満である。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ_１／２）は、３７℃、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、２分間未満である。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ_１／２）は、２５℃、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、１分間未満である。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ_１／２）は、３７℃、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、１分間未満である。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質は、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、解離半減期（ｔ_１／２）を、中性ｐＨ（例えば、約７．０〜約７．４のｐＨ）における抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ_１／２）と比較して、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、または少なくとも約３０倍短縮する。

一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質は、遺伝子改変なしの野生型の抗原結合タンパク質と比較して、ｐＨ依存性リサイクル性の改善、血清半減期の延長、またはこれらの両方を特徴とする。

一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、目的の抗原で刺激されると、１つまたは複数のヒスチジン残基を含む重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質、例えば、抗体を産生することが可能なＢ細胞集団を含む。本明細書に記載されている抗原結合タンパク質は、被験体へと投与されると、重鎖可変ドメインをコードするが、重鎖可変ドメインにヒスチジン残基を含まない、類似するか、または十分に類似するアミノ酸配列を保有する、対応する野生型の抗原結合タンパク質を凌駕する血清半減期の延長を示す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている抗原結合タンパク質は、重鎖可変ドメインをコードするが、重鎖可変ドメインにヒスチジン残基を含まない、類似するか、または十分に類似するアミノ酸配列を保有する、対応する野生型の抗原結合タンパク質の少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍の血清半減期の延長を示す。

一態様では、ｐＨ依存性リサイクル性が増強され、かつ／または血清半減期が延長した抗原結合タンパク質を発現することが可能な非ヒト動物であって、その生殖細胞系列ゲノムに、再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域のヌクレオチド配列を含み、再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列が、本明細書に記載されている、少なくとも１つのヒスチジンコドンの付加または少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む非ヒト動物が提供される。

一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質は、酸性の環境で（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨで）、遺伝子改変なしの、対応する野生型の重鎖可変ドメインより弱い抗原結合を示す。

一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ_１／２）は、２５℃、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、２分間未満である。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ_１／２）は、３７℃、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、２分間未満である。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ_１／２）は、２５℃、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、１分間未満である。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ_１／２）は、３７℃、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、１分間未満である。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質は、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、解離半減期（ｔ_１／２）を、中性ｐＨ（例えば、約７．０〜約７．４のｐＨ）における抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ_１／２）と比較して、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、または少なくとも約３０倍短縮する。

一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質は、遺伝子改変なしの野生型の抗原結合タンパク質と比較して、ｐＨ依存性リサイクル性の改善、血清半減期の延長、またはこれらの両方を特徴とする。

一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、目的の抗原で刺激されると、１つまたは複数のヒスチジン残基を含む重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質、例えば、抗体を産生することが可能なＢ細胞集団を含む。本明細書に記載されている抗原結合タンパク質は、被験体へと投与されると、重鎖可変ドメインをコードするが、重鎖可変ドメインにヒスチジン残基を含まない、類似するか、または十分に類似するアミノ酸配列を保有する、対応する野生型の抗原結合タンパク質を凌駕する血清半減期の延長を示す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている抗原結合タンパク質は、重鎖可変ドメインをコードするが、重鎖可変ドメインにヒスチジン残基を含まない、類似するか、または十分に類似するアミノ酸配列を保有する、対応する野生型の抗原結合タンパク質の少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍の血清半減期の延長を示す。

一態様では、非ヒト動物のゲノムＤ領域またはゲノムＶ領域およびゲノムＪ領域と相同な５’側および３’側のターゲッティングアームを含むターゲッティング構築物であって、少なくとも１つのＶ_Ｈ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、またはＪ_Ｈ遺伝子セグメントが、本明細書に記載されている改変、例えば、少なくとも１つのヒスチジンコドンの付加、少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンへの置換、および／または少なくとも１つの機能性Ｄ遺伝子セグメントの、対応する野生型配列に対する反転のうちのいずれかを含むターゲッティング構築物が提供される。

一態様では、本明細書に記載されている任意の非ヒト動物の細胞に由来するハイブリドーマまたはクァドローマが提供される。一実施形態では、非ヒト動物は、齧歯動物、例えば、マウス、ラット、またはハムスターである。

一態様では、記載される本発明の様々なゲノムの改変を含む非ヒト動物に由来する多能性幹細胞、人工多能性幹細胞、または全能性幹細胞が提供される。具体的な実施形態では、多能性幹細胞、人工多能性幹細胞、または全能性幹細胞は、マウスまたはラットの胚性幹（ＥＳ）細胞である。一実施形態では、多能性幹細胞、人工多能性幹細胞、または全能性幹細胞は、ＸＸ核型またはＸＹ核型を有する。一実施形態では、多能性幹細胞または人工多能性幹細胞は、造血幹細胞である。

一態様では、本明細書に記載されている遺伝子改変、例えば、前核注射により細胞へと導入された改変を含有する核を含む細胞もまた提供される。一実施形態では、多能性幹細胞、人工多能性幹細胞、または全能性幹細胞は、遺伝子改変された免疫グロブリンのゲノム遺伝子座であって、５’側から３’側にかけて、（１）ＦＲＴ組換え部位、（２）ヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメント、（３）マウスａｄａｍ６遺伝子、（４）ｌｏｘＰ組換え部位、（５）ヒスチジンで置換したヒトＤ遺伝子セグメント、（６）ヒトＪ_Ｈ遺伝子セグメントに続いて、（７）マウスＥｉ（イントロンエンハンサー）、および（８）マウスＩｇＭ定常領域のヌクレオチド配列を含むゲノム遺伝子座を含む。

一態様では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された非ヒト動物から単離されたリンパ球が提供される。一実施形態では、リンパ球は、再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列を含む免疫グロブリンのゲノム遺伝子座を含み、再構成されていない重鎖可変遺伝子配列が、少なくとも１つのヒスチジンコドンの付加または少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含むＢ細胞である。

一態様では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された非ヒト動物から単離されたリンパ球が提供される。一実施形態では、リンパ球は、ヒトＶ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、およびＪ遺伝子セグメントを含む免疫グロブリン遺伝子座を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントのうちの少なくとも１つを、５’側から３’側にかけて、野生型配列に対して反転させており、反転させたヒトＤ遺伝子セグメントの少なくとも１つのリーディングフレームが、少なくとも１つのヒスチジン残基をコードするＢ細胞である。一実施形態では、Ｂ細胞は、本明細書に記載されている、遺伝子改変された重鎖可変ドメインを含む、抗原結合タンパク質を産生することが可能である。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された重鎖可変ドメインは、重鎖定常領域アミノ酸配列に作動可能に連結されている。

一態様では、抗原結合タンパク質を発現することが可能なＢ細胞集団が提供され、ここで、この抗原結合タンパク質は、重鎖可変ドメインに少なくとも１つのヒスチジン残基を含み、このＢ細胞集団は、本明細書に記載されている任意の遺伝子改変を含む。一実施形態では、少なくとも１つのヒスチジン残基は、重鎖ＣＤＲに存在する。一実施形態では、ＣＤＲは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、およびこれらの組合せから選択される。一実施形態では、少なくとも１つのヒスチジン残基は、ＣＤＲ３に存在する。

一態様では、血清半減期が延長し、かつ／またはｐＨ依存性リサイクル性が増強した抗原結合タンパク質を発現することが可能なＢ細胞集団であって、本明細書に記載されている任意の遺伝子改変を含むＢ細胞集団が提供される。

一態様では、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖可変遺伝子座を含む非ヒト動物を作製するための方法であって、
（ａ）非ヒト動物のゲノムを改変して、内因性免疫グロブリン重鎖のＶ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、およびＪ遺伝子セグメントを欠失させるか、または非機能性にする（例えば、免疫グロブリン遺伝子座にヌクレオチド配列、例えば、外因性ヌクレオチド配列の挿入を介して、または内因性のＶ_Ｈセグメント、Ｄセグメント、Ｊ_Ｈセグメントの非機能性の再構成もしくは反転を介して）ステップと、
（ｂ）ゲノムに、再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列を配置するステップであって、再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列が、本明細書に記載されている、少なくとも１つのヒスチジンコドンの付加または少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含むステップと
を含む方法が提供される。

一実施形態では、非ヒト動物は、齧歯動物、例えば、マウス、ラット、またはハムスターを含む哺乳動物である。

一実施形態では、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上、１０以上、１１以上、１２以上、１３以上、１４以上、１５以上、１６以上、１７以上、１８以上、１９以上、２０以上、２１以上、２２以上、２３以上、２４以上、２５以上、２６以上、２７以上、２８以上、２９以上、３０以上、３１以上、３２以上、３３以上、３４以上、３５以上、３６以上、３７以上、３８以上、３９以上、４０以上、４１以上、４２以上、４３以上、４４以上、４５以上、４６以上、４７以上、４８以上、４９以上、５０以上、５１以上、５２以上、５３以上、５４以上、５５以上、５６以上、５７以上、５８以上、５９以上、６０以上、または６１以上の内因性の非ヒスチジンコドンを、ヒスチジンコドンで置きかえる。

一実施形態では、内因性の非ヒスチジンコドンは、Ｙ、Ｎ、Ｄ、Ｑ、Ｓ、Ｗ、およびＲから選択されるアミノ酸をコードする。

一実施形態では、付加または置換されたヒスチジンコドンは、Ｎ末端領域、ループ４領域、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、これらの組合せから選択される免疫グロブリン可変ドメインをコードする、再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列に存在する。

一実施形態では、付加、置換されたヒスチジンコドンヒスチジンコドンは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、およびこれらの組合せから選択される相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードする、再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列に存在する。

一実施形態では、付加または置換されたヒスチジンコドンは、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４、およびこれらの組合せから選択されるフレーム領域（ＦＲ）をコードする、再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列に存在する。

一実施形態では、再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、ヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントの少なくとも１つのリーディングフレームにおける１つまたは複数の内因性非ヒスチジンコドンが、ヒスチジンコドンで置きかえられた、遺伝子改変されたヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントを含む。

一実施形態では、再構成されていないヒト重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、ヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントの少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変であって、ヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントが、Ｖ_Ｈ１−２、Ｖ_Ｈ１−３、Ｖ_Ｈ１−８、Ｖ_Ｈ１−１８、Ｖ_Ｈ１−２４、Ｖ_Ｈ１−４５、Ｖ_Ｈ１−４６、Ｖ_Ｈ１−５８、Ｖ_Ｈ１−６９、Ｖ_Ｈ２−５、Ｖ_Ｈ２−２６、Ｖ_Ｈ２−７０、Ｖ_Ｈ３−７、Ｖ_Ｈ３−９、Ｖ_Ｈ３−１１、Ｖ_Ｈ３−１３、Ｖ_Ｈ３−１５、Ｖ_Ｈ３−１６、Ｖ_Ｈ３−２０、Ｖ_Ｈ３−２１、Ｖ_Ｈ３−２３、Ｖ_Ｈ３−３０、Ｖ_Ｈ３−３０−３、Ｖ_Ｈ３−３０−５、Ｖ_Ｈ３−３３、Ｖ_Ｈ３−３５、Ｖ_Ｈ３−３８、Ｖ_Ｈ３−４３、Ｖ_Ｈ３−４８、Ｖ_Ｈ３−４９、Ｖ_Ｈ３−５３、Ｖ_Ｈ３−６４、Ｖ_Ｈ３−６６、Ｖ_Ｈ３−７２、Ｖ_Ｈ３−７３、Ｖ_Ｈ３−７４、Ｖ_Ｈ４−４、Ｖ_Ｈ４−２８、Ｖ_Ｈ４−３０−１、Ｖ_Ｈ４−３０−２、Ｖ_Ｈ４−３０−４、Ｖ_Ｈ４−３１、Ｖ_Ｈ４−３４、Ｖ_Ｈ４−３９、Ｖ_Ｈ４−５９、Ｖ_Ｈ４−６１、Ｖ_Ｈ５−５１、Ｖ_Ｈ６−１、Ｖ_Ｈ７−４−１、Ｖ_Ｈ７−８１、およびこれらの組合せからなる群から選択される改変を含む。

一実施形態では、再構成されていないヒト重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、遺伝子改変されたヒトＪ_Ｈ遺伝子セグメントであって、ヒトＪ_Ｈ遺伝子セグメントの少なくとも１つのリーディングフレームにおける１つまたは複数の内因性非ヒスチジンコドンが、ヒスチジンコドンで置きかえられた遺伝子改変されたヒトＪ_Ｈ遺伝子セグメントを含む。

一実施形態では、再構成されていないヒト重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、ヒトＪ_Ｈセグメントの少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変であって、ヒトＪ_Ｈ遺伝子セグメントが、Ｊ_Ｈ１、Ｊ_Ｈ２、Ｊ_Ｈ３、Ｊ_Ｈ４、Ｊ_Ｈ５、Ｊ_Ｈ６、およびこれらの組合せからなる群から選択される改変を含む。

一実施形態では、付加または置換されたヒスチジンコドンは、ＣＤＲ３の一部をコードする重鎖可変領域のヌクレオチド配列に存在する。一実施形態では、ＣＤＲ３の一部は、リーディングフレームにおける少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変を含む、遺伝子改変されたヒトＤ遺伝子セグメントのリーディングフレームに由来するアミノ酸配列を含む。

一実施形態では、ヒスチジンコドンで置換される内因性非ヒスチジンコドンは、Ｙ、Ｎ、Ｄ、Ｑ、Ｓ、Ｗ、およびＲから選択されるアミノ酸をコードする。

一実施形態では、付加または置換されるヒスチジンコドンは、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ヒト化免疫グロブリンマウス内で最も高頻度に観察されるヒトＤ遺伝子セグメントの少なくとも１つのリーディングフレームに存在する。

一実施形態では、ＣＤＲ３の一部をコードする、遺伝子改変されたヒトＤ遺伝子セグメントのリーディングフレームは、疎水性フレーム、終止フレーム、および親水性フレームから選択される。

一実施形態では、リーディングフレームは、ヒトＤ遺伝子セグメントの疎水性フレームである。

一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの疎水性フレームは、Ｄ１−１（ＧＴＴＧＴ；配列番号８８）、Ｄ１−７（ＧＩＴＧＴ；配列番号８９）、Ｄ１−２０（ＧＩＴＧＴ；配列番号８９）、およびＤ１−２６（ＧＩＶＧＡＴ；配列番号９０）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変をさらに含む。

一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの疎水性フレームは、Ｄ２−２（ＤＩＶＶＶＰＡＡＩ；配列番号９２）、Ｄ２−８（ＤＩＶＬＭＶＹＡＩ；配列番号９４）、Ｄ２−１５（ＤＩＶＶＶＶＡＡＴ；配列番号９５）、およびＤ２−２１（ＨＩＶＶＶＴＡＩ；配列番号９７）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変をさらに含む。

一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの疎水性フレームは、Ｄ３−３（ＩＴＩＦＧＶＶＩＩ；配列番号９８）、Ｄ３−９（ＩＴＩＦ^＊ＬＶＩＩ；配列番号９９、配列番号１００）、Ｄ３−１０（ＩＴＭＶＲＧＶＩＩ；配列番号１０１）、Ｄ３−１６（ＩＭＩＴＦＧＧＶＩＶＩ；配列番号１０２）、およびＤ３−２２（ＩＴＭＩＶＶＶＩＴ；配列番号１０３）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性コドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変をさらに含む。

一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの疎水性フレームは、Ｄ４−４（ＴＴＶＴ；配列番号１０５）、Ｄ４−１１（ＴＴＶＴ；配列番号１０５）、Ｄ４−１７（ＴＴＶＴ；配列番号１０５）、Ｄ４−２３（ＴＴＶＶＴ；配列番号１０６）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変をさらに含む。

一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの疎水性フレームは、Ｄ５−５（ＶＤＴＡＭＶ；配列番号１０７）、Ｄ５−１２（ＶＤＩＶＡＴＩ；配列番号１０８）、Ｄ５−１８（ＶＤＴＡＭＶ；配列番号１０７）、およびＤ５−２４（ＶＥＭＡＴＩ；配列番号１０９）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変をさらに含む。

一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの疎水性フレームは、Ｄ６−６（ＳＩＡＡＲ；配列番号１１１）、Ｄ６−１３（ＧＩＡＡＡＧ；配列番号１１３）、およびＤ６−１９（ＧＩＡＶＡＧ；配列番号１１５）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変をさらに含む。

一実施形態では、疎水性フレームは、ヒトＤ７−２７（ＬＴＧ）をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変をさらに含む。

一実施形態では、リーディングフレームは、ヒトＤ遺伝子セグメントの終止リーディングフレームである。

一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの終止リーディングフレームは、Ｄ１−１（ＶＱＬＥＲ；配列番号８）、Ｄ１−７（Ｖ^＊ＬＥＬ）、Ｄ１−２０（Ｖ^＊ＬＥＲ）、Ｄ１−２６（Ｖ^＊ＷＥＬＬ；配列番号１２）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変をさらに含む。

一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの終止リーディングフレームは、Ｄ２−２（ＲＩＬ^＊＊ＹＱＬＬＹ；配列番号１４）、Ｄ２−８（ＲＩＬＹ^＊ＷＣＭＬＹ；配列番号１６および配列番号１７）、Ｄ２−１５（ＲＩＬ^＊ＷＷ^＊ＬＬＬ）、およびＤ２−２１（ＳＩＬＷＷ^＊ＬＬＦ；配列番号１９）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変をさらに含む。

一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの終止リーディングフレームは、Ｄ３−３（ＶＬＲＦＬＥＷＬＬＹ；配列番号２１）、Ｄ３−９（ＶＬＲＹＦＤＷＬＬ^＊；配列番号２３）、Ｄ３−１０（ＶＬＬＷＦＧＥＬＬ^＊；配列番号２５）、Ｄ３−１６（ＶＬ^＊ＬＲＬＧＥＬＳＬＹ；配列番号２７）、およびＤ３−２２（ＶＬＬ^＊＊＊ＷＬＬＬ；配列番号２９）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変を含む。

一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの終止リーディングフレームは、Ｄ４−４（^＊ＬＱ^＊Ｌ）、Ｄ４−１１（^＊ＬＱ^＊Ｌ）、Ｄ４−１７（^＊ＬＲ^＊Ｌ）、およびＤ４−２３（^＊ＬＲＷ^＊Ｌ）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変を含む。

一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの終止リーディングフレームは、Ｄ５−５（ＷＩＱＬＷＬ；配列番号３５）；Ｄ５−１２（ＷＩ^＊ＷＬＲＬ；配列番号３７）、Ｄ５−１８（ＷＩＱＬＷＬ；配列番号３５）、およびＤ５−２４（^＊ＲＷＬＱＬ；配列番号３９）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変を含む。

一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの終止リーディングフレームは、Ｄ６−６（Ｖ^＊ＱＬＶ）、Ｄ６−１３（Ｖ^＊ＱＱＬＶ；配列番号４１）、およびＤ６−１９（Ｖ^＊ＱＷＬＶ；配列番号４３）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変をさらに含む。

一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの終止リーディングフレームは、Ｄ７−２７（^＊ＬＧ）をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列におけるヒトＤ遺伝子セグメントの少なくとも１つの内因性コドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変をさらに含む。

一実施形態では、リーディングフレームは、ヒトＤ遺伝子セグメントの親水性フレームである。

一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの親水性フレームは、Ｄ１−１（ＹＮＷＮＤ；配列番号４５）、Ｄ１−７（ＹＮＷＮＹ；配列番号４７）、Ｄ１−２０（ＹＮＷＮＤ；配列番号４５）、およびＤ１−２６（ＹＳＧＳＹＹ；配列番号４９）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性コドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変をさらに含む。一実施形態では、親水性フレームは、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、およびこれらの組合せからなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。

一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの親水性フレームは、Ｄ２−２（ＧＹＣＳＳＴＳＣＹＴ；配列番号５１）、Ｄ２−８（ＧＹＣＴＮＧＶＣＹＴ；配列番号５３）、Ｄ２−１５（ＧＹＣＳＧＧＳＣＹＳ；配列番号５５）、およびＤ２−２１（ＡＹＣＧＧＤＣＹＳ；配列番号５７）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性コドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変をさらに含む。一実施形態では、親水性フレームは、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、およびこれらの組合せからなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。

一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの親水性フレームは、Ｄ３−３（ＹＹＤＦＷＳＧＹＹＴ；配列番号５９）、Ｄ３−９（ＹＹＤＩＬＴＧＹＹＮ；配列番号６１）、Ｄ３−１０（ＹＹＹＧＳＧＳＹＹＮ；配列番号６３）、Ｄ３−１６（ＹＹＤＹＶＷＧＳＹＲＹＴ；配列番号６５）、およびＤ３−２２（ＹＹＹＤＳＳＧＹＹＹ；配列番号６７）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性コドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変をさらに含む。一実施形態では、親水性フレームは、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、およびこれらの組合せからなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。

一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの親水性フレームは、Ｄ４−４（ＤＹＳＮＹ；配列番号６９）、Ｄ４−１１（ＤＹＳＮＹ；配列番号６９）、Ｄ４−１７（ＤＹＧＤＹ；配列番号７１）、およびＤ４−２３（ＤＹＧＧＮＳ；配列番号７３）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性コドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変を含む。一実施形態では、親水性フレームは、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、およびこれらの組合せからなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。

一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの親水性フレームは、Ｄ５−５（ＧＹＳＹＧＹ；配列番号７５）、Ｄ５−１２（ＧＹＳＧＹＤＹ；配列番号７７）、Ｄ５−１８（ＧＹＳＹＧＹ；配列番号７５）、およびＤ５−２４（ＲＤＧＹＮＹ；配列番号７９）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性コドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変をさらに含む。一実施形態では、親水性フレームは、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、およびこれらの組合せからなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。

一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの親水性フレームは、Ｄ６−６（ＥＹＳＳＳＳ；配列番号８１）、Ｄ６−１３（ＧＹＳＳＳＷＹ；配列番号８３）、およびＤ６−１９（ＧＹＳＳＧＷＹ；配列番号８５）からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性コドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変をさらに含む。一実施形態では、親水性フレームは、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号７６、およびこれらの組合せからなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。

一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの親水性フレームは、Ｄ７−２７（ＮＷＧ）をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＤ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内因性コドンをヒスチジンコドンで置きかえる改変をさらに含む。

一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントの親水性フレームは、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、およびこれらの組合せからなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。

一実施形態では、反転させたヒトＤ遺伝子セグメントを含む、再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、およびＩｇＡから選択される免疫グロブリンアイソタイプをコードする、ヒトまたは非ヒトの重鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。

一実施形態では、再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、Ｃ_Ｈ１、ヒンジ、Ｃ_Ｈ２、Ｃ_Ｈ３、およびこれらの組合せから選択される、ヒトまたは非ヒトの重鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｃ_Ｈ１、ヒンジ、Ｃ_Ｈ２、およびＣ_Ｈ３（Ｃ_Ｈ１−ヒンジ−Ｃ_Ｈ２−Ｃ_Ｈ３）を含む。

一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、内因性遺伝子座に存在する（すなわち、ヌクレオチド配列が野生型の非ヒト動物にある場合）か、または異所性に存在する（例えば、そのゲノムにおける内因性免疫グロブリン鎖の遺伝子座と異なる遺伝子座に存在する、またはその内因性の遺伝子座内に、例えば、免疫グロブリン可変遺伝子座内に存在し、ここで、該内因性の遺伝子座は、ゲノムにおける異なる位置に配置されるか、またはゲノムにおける異なる位置へと移動している）。

一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｃ_Ｈ２におけるまたはＣ_Ｈ３における改変であって、酸性の環境で（例えば、ｐＨが、約５．５〜約６．０の範囲であるエンドソーム内で）重鎖定常領域アミノ酸配列のＦｃＲｎへの親和性を増大させる改変を含む。

一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、２５０位における改変（例えば、ＥまたはＱ）；２５０および４２８位における改変（例えば、ＬまたはＦ）；２５２位における改変（例えば、Ｌ／Ｙ／Ｆ／ＷまたはＴ）、２５４位における改変（例えば、ＳまたはＴ）、および２５６位における改変（例えば、Ｓ／Ｒ／Ｑ／Ｅ／ＤまたはＴ）；または４２８および／もしくは４３３位における改変（例えば、Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｐ／ＱまたはＫ）、および／もしくは４３４位における改変（例えば、Ｈ／ＦまたはＹ）；または２５０および／もしくは４２８位における改変；または３０７もしくは３０８位における改変（例えば、３０８Ｆ、Ｖ３０８Ｆ）、ならびに４３４位における改変を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。一実施形態では、改変は、４２８Ｌ（例えば、Ｍ４２８Ｌ）および４３４Ｓ（例えば、Ｎ４３４Ｓ）の改変；４２８Ｌ、２５９Ｉ（例えば、Ｖ２５９Ｉ）、および３０８Ｆ（例えば、Ｖ３０８Ｆ）の改変；４３３Ｋ（例えば、Ｈ４３３Ｋ）および４３４位（例えば、４３４Ｙ）の改変；２５２、２５４、および２５６位（例えば、２５２Ｙ、２５４Ｔ、および２５６Ｅ）における改変；２５０Ｑおよび４２８Ｌの改変（例えば、Ｔ２５０ＱおよびＭ４２８Ｌ）；ならびに３０７および／または３０８位における改変（例えば、３０８Ｆまたは３０８Ｐ）であって、酸性の環境で（例えば、ｐＨが、約５．５〜約６．０の範囲であるエンドソーム内で）重鎖定常領域アミノ酸配列のＦｃＲｎへの親和性を増大させる改変を含む。

一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、２５２位のアミノ酸残基と２５７位のアミノ酸残基との間に、少なくとも１つの改変であって、酸性の環境で（例えば、ｐＨが、約５．５〜約６．０の範囲であるエンドソーム内で）ヒトＣ_Ｈ２のアミノ酸配列のＦｃＲｎへの親和性を増大させる改変を含む、ヒトＣ_Ｈ２のアミノ酸配列をコードする。

一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、３０７位のアミノ酸残基と３１１位のアミノ酸残基との間に、少なくとも１つの改変であって、酸性の環境で（例えば、ｐＨが、約５．５〜約６．０の範囲であるエンドソーム内で）ヒトＣ_Ｈ２のアミノ酸配列のＦｃＲｎへの親和性を増大させる改変を含む、ヒトＣ_Ｈ２のアミノ酸配列をコードする。

一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、４３３位のアミノ酸残基と４３６位のアミノ酸残基との間に、少なくとも１つの改変であって、酸性の環境で（例えば、ｐＨが、約５．５〜約６．０の範囲であるエンドソーム内で）ヒトＣ_Ｈ３のアミノ酸配列のＦｃＲｎへの親和性を増大させる改変を含む、ヒトＣ_Ｈ３のアミノ酸配列をコードする。

一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｍ４２８Ｌ、Ｎ４３４Ｓ、およびこれらの組合せからなる群から選択される変異を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。

一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｍ４２８Ｌ、Ｖ２５９Ｉ、Ｖ３０８Ｆ、およびこれらの組合せからなる群から選択される変異を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。

一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｎ４３４Ａ変異を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。

一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ、およびこれらの組合せからなる群から選択される変異を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。

一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｔ２５０Ｑ、Ｍ２４８Ｌ、またはこれらの両方からなる群から選択される変異を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。

一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｈ４３３Ｋ、Ｎ４３４Ｙ、またはこれらの両方からなる群から選択される変異を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。

一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、（１）本明細書に記載されている、再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域のヌクレオチド配列が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４、およびこれらの組合せから選択されるヒトＩｇＧの第一のＣＨ_３のアミノ酸配列をコードする第一の重鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結されている、第一の対立遺伝子；ならびに（２）本明細書に記載されている、再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域のヌクレオチド配列が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４、およびこれらの組合せから選択されるヒトＩｇＧの第二のＣ_Ｈ３のアミノ酸配列をコードする第二の重鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結されており、第二のＣＨ_３のアミノ酸配列が、第二のＣＨ_３のアミノ酸配列の、プロテインＡへの結合を低減するか、または消失させる改変（例えば、ＵＳ２０１０／０３３１５２７Ａ１を参照されたい）を含む、第二の対立遺伝子を含む。

一実施形態では、第二のＣＨ_３のアミノ酸配列は、Ｈ９５Ｒの改変（ＩＭＧＴエクソン番号付けによる；ＥＵ番号付けによるＨ４３５Ｒ）を含む。一実施形態では、第二のＣ_Ｈ３のアミノ酸配列は、Ｙ９６Ｆの改変（ＩＭＧＴエクソン番号付けによる；ＥＵによるＨ４３６Ｆ）をさらに含む。別の実施形態では、第二のＣＨ_３のアミノ酸配列は、Ｈ９５Ｒの改変（ＩＭＧＴエクソン番号付けによる；ＥＵ番号付けによるＨ４３５Ｒ）およびＹ９６Ｆの改変（ＩＭＧＴエクソン番号付けによる；ＥＵによるＨ４３６Ｆ）の両方を含む。

一実施形態では、第二のＣＨ_３のアミノ酸配列は、改変ヒトＩｇＧ１からのアミノ酸配列であり、Ｄ１６Ｅ、Ｌ１８Ｍ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴ；ＥＵによるＤ３５６Ｅ、Ｌ３８Ｍ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、およびＶ４２２Ｉ）からなる群から選択される変異をさらに含む。

一実施形態では、第二のＣＨ_３のアミノ酸配列は、改変ヒトＩｇＧ２からのアミノ酸配列であり、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴ：ＥＵによるＮ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、およびＶ４２２Ｉ）からなる群から選択される変異をさらに含む。

一実施形態では、第二のＣＨ_３のアミノ酸配列は、改変ヒトＩｇＧ４からのアミノ酸配列であり、Ｑ１５Ｒ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、Ｒ６９Ｋ、Ｅ７９Ｑ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴ：ＥＵによるＱ３５５Ｒ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、Ｒ４０９Ｋ、Ｅ４１９Ｑ、およびＶ４２２Ｉ）からなる群から選択される変異をさらに含む。

一実施形態では、重鎖定常領域アミノ酸配列は、非ヒト定常領域のアミノ酸配列であり、重鎖定常領域アミノ酸配列は、上記の種類の改変のうちのいずれかのうちの１つまたは複数を含む。

一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、ヒト重鎖定常領域アミノ酸配列であり、ヒト重鎖定常領域アミノ酸配列は、上記の種類の改変のうちのいずれかのうちの１つまたは複数を含む。

一実施形態では、全てまたは実質的に全ての内因性のＶ_Ｈ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、およびＪ_Ｈ遺伝子セグメントを、免疫グロブリン重鎖遺伝子座から欠失させるか、または非機能性にする（例えば、免疫グロブリン遺伝子座内にヌクレオチド配列（例えば、外因性ヌクレオチド配列）の挿入を介して、または内因性のＶ_Ｈセグメント、Ｄセグメント、Ｊ_Ｈセグメントの非機能性の再構成または反転を介して）。一実施形態では、例えば、全ての内因性のＶ_Ｈ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、またはＪ_Ｈ遺伝子セグメントのうちの約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、約９６％以上、約９７％以上、約９８％以上、または約９９％以上を欠失させるか、または非機能性にする。一実施形態では、例えば、内因性の機能性Ｖ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、またはＪ遺伝子セグメントのうちの少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を欠失させるか、または非機能性にする。

一実施形態では、遺伝子改変された遺伝子座は、全てまたは実質的に全ての内因性のＶ_Ｈ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、およびＪ_Ｈ遺伝子セグメントを欠失させるか、または非機能性にする改変を含み、ゲノム遺伝子座は、少なくとも１つのリーディングフレームに少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む、遺伝子改変された、再構成されていないヒト重鎖可変領域のヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、遺伝子改変された、再構成されていない免疫グロブリン重鎖可変遺伝子配列は、内因性位置に存在する（すなわち、ヌクレオチド配列が野生型の非ヒト動物にある場合）か、または異所性に存在する（例えば、そのゲノムにおける内因性免疫グロブリン鎖の遺伝子座と異なる遺伝子座に存在するか、またはその内因性の遺伝子座内に、例えば、免疫グロブリン可変遺伝子座内に存在し、ここで、該内因性の遺伝子座は、ゲノムにおける異なる位置に配置されるか、またはゲノムにおける異なる位置へと移動している）。

一実施形態では、遺伝子改変された遺伝子座は、内因性Ａｄａｍ６ａ遺伝子、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子、またはこれらの両方を含み、遺伝子改変は、内因性のＡｄａｍ６ａ遺伝子、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子、またはこれらの両方の発現および／または機能に影響を及ぼさない。

一実施形態では、遺伝子改変された遺伝子座は、異所性に存在するＡｄａｍ６ａ遺伝子、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子、またはこれらの両方を含む。一実施形態では、Ａｄａｍ６ａ遺伝子は、非ヒトＡｄａｍ６ａ遺伝子である。一実施形態では、Ａｄａｍ６ａ遺伝子は、マウスＡｄａｍ６ａ遺伝子である。一実施形態では、Ａｄａｍ６ａ遺伝子は、ヒトＡｄａｍ６ａ遺伝子である。一実施形態では、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子は、非ヒトＡｄａｍ６ｂ遺伝子である。一実施形態では、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子は、マウスＡｄａｍ６ｂ遺伝子である。一実施形態では、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子は、ヒトＡｄａｍ６ｂ遺伝子である。

一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、ヒト化された、再構成されていないλ軽鎖可変遺伝子配列および／またはκ軽鎖可変遺伝子配列をさらに含む。一実施形態では、ヒト化された、再構成されていないλ軽鎖可変遺伝子配列および／またはκ軽鎖可変遺伝子配列は、λ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列およびκ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列から選択される、免疫グロブリン軽鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。一実施形態では、ヒト化された、再構成されていないλ軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、λ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。一実施形態では、λ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列は、マウス配列、ラット配列、またはヒト配列である。一実施形態では、ヒト化された、再構成されていないκ軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、κ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。一実施形態では、κ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列は、マウス配列、ラット配列、またはヒト配列である。

一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、軽鎖可変ドメインをコードする少なくとも１つのリーディングフレームに少なくとも１つのヒスチジンコドンを導入する少なくとも１つの改変を含有する、再構成されていない軽鎖可変遺伝子配列を含む。一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、軽鎖ＣＤＲに１つ、２つ、３つ、または４つのヒスチジンコドンを含む、再構成された（例えば、再構成されたλまたはκのＶ／Ｊ配列）配列を含む。一実施形態では、ＣＤＲは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、およびこれらの組合せから選択される。一実施形態では、再構成されていないかまたは再構成された軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、再構成されていないかまたは再構成されたヒトλ軽鎖可変領域またはヒトκ軽鎖可変領域のヌクレオチド配列である。一実施形態では、再構成されていないかまたは再構成されたヒトλ軽鎖可変領域またはヒトκ軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、内因性のマウス免疫グロブリン軽鎖遺伝子座に存在する。一実施形態では、マウス免疫グロブリン軽鎖遺伝子座は、マウスκ遺伝子座である。一実施形態では、マウス免疫グロブリン軽鎖遺伝子座は、マウスλ遺伝子座である。

一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、マウスの免疫グロブリン重鎖遺伝子座に存在する。一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスにおけるヒト化免疫グロブリン重鎖遺伝子座に存在する。

一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質は、酸性の環境で（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨで）、遺伝子改変なしの、対応する野生型の重鎖可変ドメインより弱い抗原結合を示す。

一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ_１／２）は、２５℃、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、２分間未満である。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ_１／２）は、３７℃、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、２分間未満である。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ_１／２）は、２５℃、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、１分間未満である。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ_１／２）は、３７℃、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、１分間未満である。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質は、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、解離半減期（ｔ_１／２）を、中性ｐＨ（例えば、約７．０〜約７．４のｐＨ）における抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ_１／２）と比較して、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、または少なくとも約３０倍短縮する。

一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質は、遺伝子改変なしの野生型の抗原結合タンパク質と比較して、ｐＨ依存性リサイクル性の改善、血清半減期の延長、またはこれらの両方を特徴とする。

一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、目的の抗原で刺激されると、１つまたは複数のヒスチジン残基を含む重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質、例えば、抗体を産生することが可能なＢ細胞集団を含む。本明細書に記載されている抗原結合タンパク質は、被験体へと投与されると、重鎖可変ドメインをコードするが、重鎖可変ドメインにヒスチジン残基を含まない、類似するか、または十分に類似するアミノ酸配列を保有する、対応する野生型の抗原結合タンパク質を凌駕する血清半減期の延長を示す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている抗原結合タンパク質は、重鎖可変ドメインをコードするが、重鎖可変ドメインにヒスチジン残基を含まない、類似するか、または十分に類似するアミノ酸配列を保有する、対応する野生型の抗原結合タンパク質の少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍の血清半減期の延長を示す。

一態様では、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖可変遺伝子座を含む非ヒト動物を作製するための方法であって、
（ａ）非ヒト動物のゲノムを改変して、内因性免疫グロブリン重鎖のＶ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、およびＪ遺伝子セグメントを欠失させるか、または非機能性にする（例えば、免疫グロブリン遺伝子座内にヌクレオチド配列（例えば、外因性ヌクレオチド配列）の挿入を介して、または内因性のＶ_Ｈセグメント、Ｄセグメント、Ｊ_Ｈセグメントの非機能性の再構成もしくは反転を介して）ステップと、
（ｂ）ゲノムに、ヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメント、ヒトＤ遺伝子セグメント、およびヒトＪ_Ｈ遺伝子セグメントを配置するステップであって、ヒトＤ遺伝子セグメントのうちの少なくとも１つを、５’側から３’側にかけて、対応する野生型配列に対して反転させており、反転させたヒトＤ遺伝子セグメントの少なくとも１つのリーディングフレームが、ヒスチジンコドンを含むステップと
を含む方法が提供される。

一実施形態では、非ヒト動物は、齧歯動物、例えば、マウス、ラット、またはハムスターを含む哺乳動物である。

一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、生殖細胞系列ゲノムに存在する。

一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、１つまたは複数、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上、１０以上、１１以上、１２以上、１３以上、１４以上、１５以上、１６以上、１７以上、１８以上、１９以上、２０以上、２１以上、２２以上、２３以上、２４以上、２５以上、２６以上、２７以上、２８以上、２９以上、３０以上、３１以上、３２以上、３３以上、または３４以上のヒスチジン残基を含む免疫グロブリン重鎖可変ドメインをコードする。

一実施形態では、機能性ヒトＤ遺伝子セグメントのうちの少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、または全てもしくは実質的に全ては、対応する野生型配列に対して逆配向である。

一実施形態では、内因性免疫グロブリンのＶ_Ｈ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、Ｊ_Ｈ遺伝子セグメントの全てまたは実質的に全てを、免疫グロブリン重鎖遺伝子座から欠失させるか、または非機能性にする（例えば、免疫グロブリン遺伝子座にヌクレオチド配列、例えば、外因性ヌクレオチド配列の挿入を介して、または内因性の免疫グロブリンＶ_Ｈセグメント、Ｄセグメント、Ｊ_Ｈセグメントの全てもしくは実質的に全ての非機能性の再構成もしくは反転を介して）が、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、ヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメント、ヒトＤ遺伝子セグメント、およびヒトＪ_Ｈ遺伝子セグメントを含み、ヒトＤ遺伝子セグメントのうちの少なくとも１つは、対応する野生型配列に対して逆配向で存在し、反転させたヒトＤ遺伝子セグメントにおける少なくとも１つのリーディングフレームは、少なくとも１つのヒスチジンコドンを含む。

一実施形態では、反転させたヒトＤ遺伝子セグメントは、ヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントおよび／またはヒトＪ_Ｈ遺伝子セグメントに作動可能に連結されている。

一実施形態では、野生型配列と比べて逆配向で存在するヒトＤ遺伝子セグメントは、Ｄ１−１、Ｄ１−７、Ｄ１−２０、Ｄ１−２６、Ｄ２−２、Ｄ２−８、Ｄ２−１５、Ｄ２−２１、Ｄ３−３、Ｄ３−９、Ｄ３−１０、Ｄ３−１６、Ｄ３−２２、Ｄ４−４、Ｄ４−１１、Ｄ４−１７、Ｄ４−２３、Ｄ５−５、Ｄ５−１２、Ｄ５−１８、Ｄ５−２４、Ｄ６−６、Ｄ６−１３、Ｄ６−１９、Ｄ７−２７、およびこれらの組合せからなる群から選択される。

一実施形態では、対応する野生型配列と比べて逆配向で存在するヒトＤ遺伝子セグメントは、Ｄ１−１、Ｄ１−７、Ｄ１−２０、Ｄ１−２６、およびこれらの組合せからなる群から選択されるＤ１遺伝子セグメントである。

一実施形態では、対応する野生型配列と比べて逆配向で存在するヒトＤ遺伝子セグメントは、Ｄ２−２、Ｄ２−８、Ｄ２−１５、Ｄ２−２１、およびこれらの組合せからなる群から選択されるＤ２遺伝子セグメントである。

一実施形態では、対応する野生型配列と比べて逆配向で存在するヒトＤ遺伝子セグメントは、Ｄ３−３、Ｄ３−９、Ｄ３−１０、Ｄ３−１６、Ｄ３−２２、およびこれらの組合せからなる群から選択されるＤ３遺伝子セグメントである。

一実施形態では、対応する野生型配列と比べて逆配向で存在するヒトＤ遺伝子セグメントは、Ｄ４−４、Ｄ４−１１、Ｄ４−１７、Ｄ４−２３、およびこれらの組合せからなる群から選択されるＤ４遺伝子セグメントである。

一実施形態では、対応する野生型配列と比べて逆配向で存在するヒトＤ遺伝子セグメントは、Ｄ５−５、Ｄ５−１２、Ｄ５−１８、Ｄ５−２４、およびこれらの組合せからなる群から選択されるＤ５遺伝子セグメントである。

一実施形態では、対応する野生型配列と比べて逆配向で存在するヒトＤ遺伝子セグメントは、Ｄ６−６、Ｄ６−１３、Ｄ６−１９、およびこれらの組合せからなる群から選択されるＤ６遺伝子セグメントである。

一実施形態では、対応する野生型配列と比べて逆配向で存在するヒトＤ遺伝子セグメントは、Ｄ７−２７である。

一実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントのリーディングフレームは、終止リーディングフレーム、親水性リーディングフレーム、疎水性リーディングフレーム、およびこれらの組合せから選択される。

一実施形態では、反転させたヒトＤ遺伝子セグメントを含む、再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、およびＩｇＡから選択される免疫グロブリンアイソタイプをコードする、ヒトまたは非ヒトの重鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。

一実施形態では、再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、Ｃ_Ｈ１、ヒンジ、Ｃ_Ｈ２、Ｃ_Ｈ３、およびこれらの組合せから選択される、ヒトまたは非ヒトの重鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｃ_Ｈ１、ヒンジ、Ｃ_Ｈ２、およびＣ_Ｈ３（Ｃ_Ｈ１−ヒンジ−Ｃ_Ｈ２−Ｃ_Ｈ３）を含む。

一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、内因性遺伝子座に存在する（すなわち、ヌクレオチド配列が野生型の非ヒト動物にある場合）か、または異所性に存在する（例えば、そのゲノムにおける内因性免疫グロブリン鎖の遺伝子座と異なる遺伝子座に存在する、またはその内因性の遺伝子座内に、例えば、免疫グロブリン可変遺伝子座内に存在し、ここで、該内因性の遺伝子座は、ゲノムにおける異なる位置に配置されるか、またはゲノムにおける異なる位置へと移動している）。

一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｃ_Ｈ２におけるまたはＣ_Ｈ３における改変であって、酸性の環境で（例えば、ｐＨが、約５．５〜約６．０の範囲であるエンドソーム内で）重鎖定常領域アミノ酸配列のＦｃＲｎへの親和性を増大させる改変を含む。

一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、２５０位における改変（例えば、ＥまたはＱ）；２５０および４２８位における改変（例えば、ＬまたはＦ）；２５２位における改変（例えば、Ｌ／Ｙ／Ｆ／ＷまたはＴ）、２５４位における改変（例えば、ＳまたはＴ）、および２５６位における改変（例えば、Ｓ／Ｒ／Ｑ／Ｅ／ＤまたはＴ）；または４２８および／もしくは４３３位における改変（例えば、Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｐ／ＱまたはＫ）、および／もしくは４３４位における改変（例えば、Ｈ／ＦまたはＹ）；または２５０および／もしくは４２８位における改変；または３０７もしくは３０８位における改変（例えば、３０８Ｆ、Ｖ３０８Ｆ）、ならびに４３４位における改変を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。一実施形態では、改変は、４２８Ｌ（例えば、Ｍ４２８Ｌ）および４３４Ｓ（例えば、Ｎ４３４Ｓ）の改変；４２８Ｌ、２５９Ｉ（例えば、Ｖ２５９Ｉ）、および３０８Ｆ（例えば、Ｖ３０８Ｆ）の改変；４３３Ｋ（例えば、Ｈ４３３Ｋ）および４３４位（例えば、４３４Ｙ）の改変；２５２、２５４、および２５６位（例えば、２５２Ｙ、２５４Ｔ、および２５６Ｅ）における改変；２５０Ｑおよび４２８Ｌの改変（例えば、Ｔ２５０ＱおよびＭ４２８Ｌ）；ならびに３０７および／または３０８位における改変（例えば、３０８Ｆまたは３０８Ｐ）であって、酸性の環境で（例えば、ｐＨが、約５．５〜約６．０の範囲であるエンドソーム内で）重鎖定常領域アミノ酸配列のＦｃＲｎへの親和性を増大させる改変を含む。

一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、２５２位のアミノ酸残基と２５７位のアミノ酸残基との間に、少なくとも１つの改変であって、酸性の環境で（例えば、ｐＨが、約５．５〜約６．０の範囲であるエンドソーム内で）ヒトＣ_Ｈ２のアミノ酸配列のＦｃＲｎへの親和性を増大させる改変を含む、ヒトＣ_Ｈ２のアミノ酸配列をコードする。

一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、３０７位のアミノ酸残基と３１１位のアミノ酸残基との間に、少なくとも１つの改変であって、酸性の環境で（例えば、ｐＨが、約５．５〜約６．０の範囲であるエンドソーム内で）ヒトＣ_Ｈ２のアミノ酸配列のＦｃＲｎへの親和性を増大させる改変を含む、ヒトＣ_Ｈ２のアミノ酸配列をコードする。

一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、４３３位のアミノ酸残基と４３６位のアミノ酸残基との間に、少なくとも１つの改変であって、酸性の環境で（例えば、ｐＨが、約５．５〜約６．０の範囲であるエンドソーム内で）ヒトＣ_Ｈ３のアミノ酸配列のＦｃＲｎへの親和性を増大させる改変を含む、ヒトＣ_Ｈ３のアミノ酸配列をコードする。

一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｍ４２８Ｌ、Ｎ４３４Ｓ、およびこれらの組合せからなる群から選択される変異を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。

一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｍ４２８Ｌ、Ｖ２５９Ｉ、Ｖ３０８Ｆ、およびこれらの組合せからなる群から選択される変異を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。

一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｎ４３４Ａ変異を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。

一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ、およびこれらの組合せからなる群から選択される変異を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。

一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｔ２５０Ｑ、Ｍ２４８Ｌ、またはこれらの両方からなる群から選択される変異を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。

一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｈ４３３Ｋ、Ｎ４３４Ｙ、またはこれらの両方からなる群から選択される変異を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。

一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、（１）本明細書に記載されている、再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域のヌクレオチド配列が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４、およびこれらの組合せから選択されるヒトＩｇＧの第一のＣＨ_３のアミノ酸配列をコードする第一の重鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結されている、第一の対立遺伝子；ならびに（２）本明細書に記載されている、再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域のヌクレオチド配列が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４、およびこれらの組合せから選択されるヒトＩｇＧの第二のＣ_Ｈ３のアミノ酸配列をコードする第二の重鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結されており、第二のＣＨ_３のアミノ酸配列が、第二のＣＨ_３のアミノ酸配列の、プロテインＡへの結合を低減するか、または消失させる改変（例えば、ＵＳ２０１０／０３３１５２７Ａ１を参照されたい）を含む、第二の対立遺伝子を含む。

一実施形態では、第二のＣＨ_３のアミノ酸配列は、Ｈ９５Ｒの改変（ＩＭＧＴエクソン番号付けによる；ＥＵ番号付けによるＨ４３５Ｒ）を含む。一実施形態では、第二のＣＨ_３のアミノ酸配列は、Ｙ９６Ｆの改変（ＩＭＧＴエクソン番号付けによる；ＥＵによるＨ４３６Ｆ）をさらに含む。別の実施形態では、第二のＣＨ_３のアミノ酸配列は、Ｈ９５Ｒの改変（ＩＭＧＴエクソン番号付けによる；ＥＵ番号付けによるＨ４３５Ｒ）およびＹ９６Ｆの改変（ＩＭＧＴエクソン番号付けによる；ＥＵによるＨ４３６Ｆ）の両方を含む。

一実施形態では、第二のＣＨ_３のアミノ酸配列は、改変ヒトＩｇＧ１からのアミノ酸配列であり、Ｄ１６Ｅ、Ｌ１８Ｍ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴ；ＥＵによるＤ３５６Ｅ、Ｌ３８Ｍ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、およびＶ４２２Ｉ）からなる群から選択される変異をさらに含む。

一実施形態では、第二のＣＨ_３のアミノ酸配列は、改変ヒトＩｇＧ２からのアミノ酸配列であり、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴ：ＥＵによるＮ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、およびＶ４２２Ｉ）からなる群から選択される変異をさらに含む。

一実施形態では、第二のＣＨ_３のアミノ酸配列は、改変ヒトＩｇＧ４からのアミノ酸配列であり、Ｑ１５Ｒ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、Ｒ６９Ｋ、Ｅ７９Ｑ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴ：ＥＵによるＱ３５５Ｒ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、Ｒ４０９Ｋ、Ｅ４１９Ｑ、およびＶ４２２Ｉ）からなる群から選択される変異をさらに含む。

一実施形態では、重鎖定常領域アミノ酸配列は、非ヒト定常領域のアミノ酸配列であり、重鎖定常領域アミノ酸配列は、上記の種類の改変のうちのいずれかのうちの１つまたは複数を含む。

一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、ヒト重鎖定常領域アミノ酸配列であり、ヒト重鎖定常領域アミノ酸配列は、上記の種類の改変のうちのいずれかのうちの１つまたは複数を含む。

一実施形態では、全てまたは実質的に全ての内因性のＶ_Ｈ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、およびＪ_Ｈ遺伝子セグメントを、免疫グロブリン重鎖遺伝子座から欠失させるか、または非機能性にする（例えば、免疫グロブリン遺伝子座内にヌクレオチド配列（例えば、外因性ヌクレオチド配列）の挿入を介して、または内因性のＶ_Ｈセグメント、Ｄセグメント、Ｊ_Ｈセグメントの非機能性の再構成または反転を介して）。一実施形態では、例えば、全ての内因性のＶ_Ｈ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、またはＪ_Ｈ遺伝子セグメントのうちの約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、約９６％以上、約９７％以上、約９８％以上、または約９９％以上を欠失させるか、または非機能性にする。一実施形態では、例えば、内因性の機能性Ｖ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、またはＪ遺伝子セグメントのうちの少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を欠失させるか、または非機能性にする。

一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座は、全てまたは実質的に全ての、内因性のＶ_Ｈ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、およびＪ_Ｈ遺伝子セグメントを欠失させるか、または非機能性にする改変を含み、遺伝子改変された遺伝子座は、本明細書に記載されている、少なくとも１つの反転させたヒトＤ遺伝子セグメントを含む、再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列を含み、再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、内因性位置に存在する（すなわち、ヌクレオチド配列が野生型の非ヒト動物にある場合）か、または異所性に存在する（例えば、そのゲノムにおける内因性免疫グロブリン鎖の遺伝子座と異なる遺伝子座に存在する、またはその内因性の遺伝子座内に、例えば、免疫グロブリン可変遺伝子座内に存在し、ここで、該内因性の遺伝子座は、ゲノムにおける異なる位置に配置されるか、またはゲノムにおける異なる位置へと移動している）。

一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、内因性Ａｄａｍ６ａ遺伝子、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子、またはこれらの両方を含み、遺伝子改変は、内因性のＡｄａｍ６ａ遺伝子、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子、またはこれらの両方の発現および／または機能に影響を及ぼさない。

一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、異所性に存在するＡｄａｍ６ａ遺伝子、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子、またはこれらの両方を含む。一実施形態では、Ａｄａｍ６ａ遺伝子は、非ヒトＡｄａｍ６ａ遺伝子である。一実施形態では、Ａｄａｍ６ａ遺伝子は、マウスＡｄａｍ６ａ遺伝子である。一実施形態では、Ａｄａｍ６ａ遺伝子は、ヒトＡｄａｍ６ａ遺伝子である。一実施形態では、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子は、非ヒトＡｄａｍ６ｂ遺伝子である。一実施形態では、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子は、マウスＡｄａｍ６ｂ遺伝子である。一実施形態では、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子は、ヒトＡｄａｍ６ｂ遺伝子である。

一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、ヒト化された、再構成されていないλ軽鎖可変遺伝子配列および／またはκ軽鎖可変遺伝子配列をさらに含む。一実施形態では、ヒト化された、再構成されていないλ軽鎖可変遺伝子配列および／またはκ軽鎖可変遺伝子配列は、λ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列およびκ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列から選択される、免疫グロブリン軽鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。一実施形態では、ヒト化された、再構成されていないλ軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、λ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。一実施形態では、λ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列は、マウス配列、ラット配列、またはヒト配列である。一実施形態では、ヒト化された、再構成されていないκ軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、κ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。一実施形態では、κ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列は、マウス配列、ラット配列、またはヒト配列である。

一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、軽鎖可変ドメインをコードする少なくとも１つのリーディングフレームに少なくとも１つのヒスチジンコドンを導入する少なくとも１つの改変を含有する、再構成されていない軽鎖可変遺伝子配列を含む。一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、軽鎖ＣＤＲに１つ、２つ、３つ、または４つのヒスチジンコドンを含む、再構成された（例えば、再構成されたλまたはκのＶ／Ｊ配列）配列を含む。一実施形態では、ＣＤＲは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、およびこれらの組合せから選択される。一実施形態では、再構成されていないかまたは再構成された軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、再構成されていないかまたは再構成されたヒトλ軽鎖可変領域またはヒトκ軽鎖可変領域のヌクレオチド配列である。一実施形態では、再構成されていないかまたは再構成されたヒトλ軽鎖可変領域またはヒトκ軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、内因性のマウス免疫グロブリン軽鎖遺伝子座に存在する。一実施形態では、マウス免疫グロブリン軽鎖遺伝子座は、マウスκ遺伝子座である。一実施形態では、マウス免疫グロブリン軽鎖遺伝子座は、マウス免疫グロブリン軽鎖遺伝子座は、マウスλ遺伝子座である。

一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、マウスの免疫グロブリン重鎖遺伝子座に存在する。一実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスにおけるヒト化免疫グロブリン重鎖遺伝子座に存在する。

一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質は、酸性の環境で（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨで）、遺伝子改変なしの、対応する野生型の重鎖可変ドメインより弱い抗原結合を示す。

一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ_１／２）は、２５℃、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、２分間未満である。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ_１／２）は、３７℃、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、２分間未満である。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ_１／２）は、２５℃、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、１分間未満である。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ_１／２）は、３７℃、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、１分間未満である。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質は、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、解離半減期（ｔ_１／２）を、中性ｐＨ（例えば、約７．０〜約７．４のｐＨ）における抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ_１／２）と比較して、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、または少なくとも約３０倍短縮する。

一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質は、遺伝子改変なしの野生型の抗原結合タンパク質と比較して、ｐＨ依存性リサイクル性の改善、血清半減期の延長、またはこれらの両方を特徴とする。

一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、目的の抗原で刺激されると、１つまたは複数のヒスチジン残基を含む重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質、例えば、抗体を産生することが可能な、富化されたＢ細胞集団を含む。本明細書に記載されている抗原結合タンパク質は、被験体へと投与されると、重鎖可変ドメインをコードするが、重鎖可変ドメインにヒスチジン残基を含まない、類似するか、または十分に類似するアミノ酸配列を保有する、対応する野生型の抗原結合タンパク質を凌駕する血清半減期の延長を示す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている抗原結合タンパク質は、重鎖可変ドメインをコードするが、重鎖可変ドメインにヒスチジン残基を含まない、類似するか、または十分に類似するアミノ酸配列を保有する、対応する野生型の抗原結合タンパク質の少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍の血清半減期の延長を示す。

一態様では、血清半減期が延長し、かつ／またはｐＨ依存性リサイクル性が増強された免疫グロブリン重鎖可変ドメインを産生することが可能な非ヒト動物を作製するための方法であって、
（ａ）非ヒト動物のゲノムを改変して、内因性免疫グロブリン重鎖のＶ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、およびＪ遺伝子セグメントを欠失させるか、または非機能性にする（例えば、免疫グロブリン遺伝子座内にヌクレオチド配列（例えば、外因性ヌクレオチド配列）の挿入を介して、または内因性のＶ_Ｈセグメント、Ｄセグメント、Ｊ_Ｈセグメントの非機能性の再構成もしくは反転を介して）ステップと、
（ｂ）ゲノムに、再構成されていないヒト重鎖可変領域のヌクレオチド配列を配置するステップであって、再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列が、少なくとも１つのヒスチジンコドンの付加または少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含み、非ヒト動物により産生される免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質が、野生型の免疫グロブリン重鎖ドメインと比較して、血清半減期の延長および／またはｐＨ依存性リサイクル性の増強を示すステップと
を含む方法が提供される。

一実施形態では、非ヒト動物は、抗原と接触させると、血清半減期が延長し、かつ／またはｐＨ依存性リサイクル性が増強した抗原結合タンパク質を発現する、富化されたＢ細胞レパートリーの集団であって、本明細書に記載されている任意の遺伝子改変を含む、富化されたＢ細胞集団を産生しうる。

一実施形態では、遺伝子改変された非ヒト動物により産生される抗原結合タンパク質は、中性ｐＨ（例えば、約７．０〜約７．４のｐＨ）における、目的の抗原への十分な親和性、および中性ｐＨ未満のｐＨにおける（例えば、エンドソームのｐＨ、例えば、約５．５〜６．０のｐＨにおける）、抗原−抗原結合タンパク質複合体からの抗体の解離の増強を特徴とする。

一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ_１／２）は、２５℃、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、２分間未満である。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ_１／２）は、３７℃、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、２分間未満である。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ_１／２）は、２５℃、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、１分間未満である。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ_１／２）は、３７℃、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、１分間未満である。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質は、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、解離半減期（ｔ_１／２）を、中性ｐＨ（例えば、約７．０〜約７．４のｐＨ）における抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ_１／２）と比較して、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、または少なくとも約３０倍短縮する。

一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質は、遺伝子改変なしの野生型の抗原結合タンパク質と比較して、ｐＨ依存性リサイクル性の改善、血清半減期の延長、またはこれらの両方を特徴とする。

一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、目的の抗原で刺激されると、１つまたは複数のヒスチジン残基を含む重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質、例えば、抗体を産生することが可能な、富化されたＢ細胞集団を含む。本明細書に記載されている抗原結合タンパク質は、被験体へと投与されると、重鎖可変ドメインをコードするが、重鎖可変ドメインにヒスチジン残基を含まない、類似するか、または十分に類似するアミノ酸配列を保有する、対応する野生型の抗原結合タンパク質を凌駕する血清半減期の延長を示す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている抗原結合タンパク質は、重鎖可変ドメインをコードするが、重鎖可変ドメインにヒスチジン残基を含まない、類似するか、または十分に類似するアミノ酸配列を保有する、対応する野生型の抗原結合タンパク質の少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍の血清半減期の延長を示す。

一実施形態では、抗原結合タンパク質は、中性ｐＨ（約７．０〜約７．４のｐＨ）において、目的の抗原に、１０^−６未満、１０^−７未満、１０^−８未満、１０^−９未満、１０^−１０未満、１０^−１１未満、および１０^−１２未満の親和性（Ｋ_Ｄ）で、特異的に結合することが可能な免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含む。

一態様では、リサイクル性が増強され、かつ／または血清半減期が改善された抗原結合タンパク質を得るための方法であって、
（ａ）本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座を有する非ヒト動物を免疫するステップであって、非ヒト動物が、少なくとも１つのヒスチジンコドンの付加または少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む、再構成されていないヒト重鎖可変領域のヌクレオチド配列を含むステップと、
（ｂ）非ヒト動物に免疫応答を開始させるステップと、
（ｃ）リンパ球（例えば、Ｂ細胞）を、免疫した非ヒト動物から採取するステップと、
（ｄ）リンパ球を、骨髄腫細胞と融合させて、ハイブリドーマ細胞を形成するステップと、
（ｅ）ハイブリドーマ細胞により産生される抗原結合タンパク質を得るステップであって、抗原結合タンパク質が、リサイクル性の増強および／または血清中の安定性を示すステップと
を含む方法が提供される。

一態様では、本明細書に記載されている方法のうちのいずれかにより得ることができる、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座が提供される。

一態様では、本明細書に記載されている方法のうちのいずれかにより得ることができる、遺伝子改変された非ヒト動物が提供される。

様々な実施形態では、非ヒト動物は、哺乳動物である。一実施形態では、哺乳動物は、齧歯動物、例えば、マウス、ラット、またはハムスターである。

様々な実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、非ヒト動物、例えば、哺乳動物、例えば、齧歯動物、例えば、マウス、ラット、またはハムスターの生殖細胞系列ゲノムに存在する。

図１Ａおよび１Ｂは、ヒトＤ遺伝子セグメント（Ｄ）の３つのリーディングフレーム（すなわち、終止リーディングフレーム、親水性リーディングフレーム、および疎水性リーディングフレーム）によりコードされるアミノ酸配列、およびヒスチジンで置換したヒトＤ遺伝子セグメント（ＨＤ）の３つのリーディングフレームによりコードされるアミノ酸配列を例示する。親水性リーディングフレームにおけるヒスチジンコドンの導入（太字で印字される）はまた、終止リーディングフレームにおいても、多くの終止コドンをＳｅｒコドン（太字で印字される）に変えたが、疎水性リーディングフレームには変化がほとんど導入されなかった。「^＊」の記号は、終止コドンを表し、２つの配列番号の間のカンマは、２つのアミノ酸配列が、終止コドンにより隔てられていることを示す。 図１Ａおよび１Ｂは、ヒトＤ遺伝子セグメント（Ｄ）の３つのリーディングフレーム（すなわち、終止リーディングフレーム、親水性リーディングフレーム、および疎水性リーディングフレーム）によりコードされるアミノ酸配列、およびヒスチジンで置換したヒトＤ遺伝子セグメント（ＨＤ）の３つのリーディングフレームによりコードされるアミノ酸配列を例示する。親水性リーディングフレームにおけるヒスチジンコドンの導入（太字で印字される）はまた、終止リーディングフレームにおいても、多くの終止コドンをＳｅｒコドン（太字で印字される）に変えたが、疎水性リーディングフレームには変化がほとんど導入されなかった。「^＊」の記号は、終止コドンを表し、２つの配列番号の間のカンマは、２つのアミノ酸配列が、終止コドンにより隔てられていることを示す。 図２は、スペクチノマイシン選択カセットを含有するｐＬＭａ０１７４を、ＭＡＩＤ １１１６の５’端へとターゲッティングするためのスキームを例示する（ステップ１：ＢＨＲ（Ｓｐｅｃ））。ステップ１では、それらの全てがｈＶ_Ｈ６−１の上流に位置する、クロラムフェニコール選択カセット、ネオマイシン選択カセット、ｌｏｘＰ部位、２つのＶ_Ｈ遺伝子セグメント（ｈＶ_Ｈ１−３およびｈＶ_Ｈ１−２）、ヒトＡｄａｍ６遺伝子を、クローンから欠失させ、スペクチノマイシンカセットで置きかえて、ＶＩ４３３クローンを作製した。ステップ２（ＢＨＲ（Ｈｙｇ＋Ｓｐｅｃ））では、ＦＲＴ部位に挟まれるハイグロマイシンカセットを含有するｐＮＴｕ０００２を、ヒト免疫グロブリンＤ遺伝子セグメントを含む領域へとターゲッティングした。ステップ２を介して、全てのヒトＤ遺伝子セグメントを、ＶＩ４３３から欠失させ、ハイグロマイシンカセットで置きかえて、ＭＡＩＤ６０１１ ＶＩ４３４（クローン１）を作製した。 図３は、逐次的ライゲーションを介して、ヒスチジンで置換したヒトＤ遺伝子セグメントをアセンブルするためのスキームを例示する。 図４は、あらかじめアセンブルされた、ネオマイシンカセットを含有する、ヒスチジンで置換したヒトＤ遺伝子セグメントの、Ｄ遺伝子セグメントに最も近位のＶ_Ｈ遺伝子セグメント（Ｖ_Ｈ６−１）とＤ遺伝子セグメントに最も近位のＪ_Ｈ遺伝子セグメント（Ｊ_Ｈ１）との間の領域への、酵素介在性消化（ＰＩ−ＳｃｅＩおよびＩ−ＣｅｕＩ）およびライゲーションを介する導入を例示する。このプロセスは、ハイグロマイシンカセットを、ＭＡＩＤ ６０１１ ＶＩ４３４から除去し、あらかじめアセンブルされた、ヒスチジンで置換したヒトＤ遺伝子セグメントをクローンへと導入する。ターゲッティングが成功したクローンを含む細菌細胞を、ネオマイシン耐性およびスペクチノマイシン耐性の両方に基づき選択する。結果として生じるクローン（ＭＡＩＤ６０１２ ＶＩ４６９）は、５’側から３’側にかけて、（１）スペクチノマイシン選択カセット、（２）ヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメント（Ｖ_Ｈ６−１）を含む５０ｋｂのアーム、（３）ｌｏｘＰ部位に挟まれるネオマイシンカセット、（４）ヒスチジン置換を含有するヒトＤ遺伝子セグメント（ＨＤ１．１−６．６（９５８６ｂｐ；配列番号１）、ＨＤ１．７−６．１３（９２６８ｂｐ；配列番号２）、ＨＤ１．１４−６．１９（９４４１ｂｐ；配列番号３）、およびＨＤ１．２０−６．２５、１．２６（１１５９２ｂｐ；配列番号４））、（５）約２５ｋｂのヒトＪ_Ｈ遺伝子セグメントを含有するゲノム領域、（６）マウスＥ_ｉ配列（配列番号５；発達しつつあるＢ細胞内でＶ_ＨからＤＪ_Ｈへの再構成を促進するイントロンエンハンサー）、および（７）マウスＩｇＭ定常領域のヌクレオチド配列（ｍＩｇＭエクソン１；配列番号７）を含む。 図５は、ＭＡＩＤ １４６０ ｈｅｔの１２９系統に由来する染色体を、ＭＡＩＤ ６０１１ ＶＩ４３４内のハイグロマイシン選択カセットでターゲッティングすることにより、ヒト免疫グロブリン重鎖のＤ遺伝子領域を、ＭＡＩＤ １４６０ヘテロ接合性ＥＳ細胞から欠失させるためのスキームを例示する。 図６は、ＭＡＩＤ ６０１１を同定するためのスクリーニングアッセイにおいて、対立遺伝子の喪失（ＬＯＡ）、対立遺伝子の獲得（ＧＯＡ）、または親対立遺伝子（親）を確認するために用いられるプライマーおよびプローブのリストを示す。 図７は、ＭＡＩＤ ６０１１ヘテロ接合性ＥＳ細胞を、ＭＡＩＤ ６０１２ ＶＩ４６９でターゲッティングすることにより、ＭＡＩＤ ６０１２ ｈｅｔを構築するためのスキームを例示する。ＭＡＩＤ ６０１２ ＶＩ４６９構築物の、ＭＡＩＤ ６０１１ヘテロ接合性ＥＳ細胞へのエレクトロポレーションにより、１２９系統に由来する染色体を、５’側から３’ 側の方向において、ＦＲＴ部位、ヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメント、ａｄａｍ６遺伝子を含むマウスゲノム領域、ｌｏｘＰに挟まれた（ｆｌｏｘｅｄ）ネオマイシン選択カセット、ヒスチジン置換を含むヒトＤ遺伝子セグメント（ＨＤ１．１−６．６（９５８６ｂｐ；配列番号１）、ＨＤ１．７−６．１３（９２６８ｂｐ；配列番号２）、ＨＤ１．１４−６．１９（９４４１ｂｐ；配列番号３）、およびＨＤ１．２０−６．２５、１．２６（１１５９２ｂｐ；配列番号４））、ヒトＪ_Ｈ遺伝子セグメント、マウスＥ_ｉ配列（配列番号５；発達しつつあるＢ細胞内でＶ_ＨからＤＪ_Ｈへの再構成を促進するイントロンエンハンサー）、およびマウスＩｇＭ定常領域のヌクレオチド配列（ｍＩｇＭエクソン１；配列番号７）を含有するように改変した、ＭＡＩＤ ６０１２ヘテロ接合性ＥＳ細胞が作製された。 図８は、ＭＡＩＤ ６０１２を同定するためのスクリーニングアッセイにおいて、対立遺伝子の喪失（ＬＯＡ）、対立遺伝子の獲得（ＧＯＡ）、または親対立遺伝子（親）を確認するために用いられるプライマーおよびプローブのリストを示す。 図９は、ネオマイシンカセットを、ＭＡＩＤ ６０１２ヘテロ接合性ＥＳ細胞から除去するためのスキームを例示する。Ｃｒｅ発現プラスミドの、ＭＡＩＤ ６０１２ ＥＳ細胞へのエレクトロポレーションにより、ｌｏｘＰに挟まれたネオマイシンカセットの組換えおよび欠失がもたらされ、ＭＡＩＤ ６０１３ヘテロ接合性ＥＳ細胞が作製される。 図１０Ａ〜１０Ｅは、６つのリーディングフレーム、すなわち、５’から３’方向の配向の３つのリーディングフレームおよび逆配向（３’〜５’配向）の３つのリーディングフレームの各々について、翻訳を有するヒトＤ遺伝子セグメントのヌクレオチド配列を例示する。「^＊」の記号は、終止コドンを表し、２つの配列番号の間のカンマは、２つのアミノ酸配列が、終止コドンにより隔てられていることを示す。 図１０Ａ〜１０Ｅは、６つのリーディングフレーム、すなわち、５’から３’方向の配向の３つのリーディングフレームおよび逆配向（３’〜５’配向）の３つのリーディングフレームの各々について、翻訳を有するヒトＤ遺伝子セグメントのヌクレオチド配列を例示する。「^＊」の記号は、終止コドンを表し、２つの配列番号の間のカンマは、２つのアミノ酸配列が、終止コドンにより隔てられていることを示す。 図１０Ａ〜１０Ｅは、６つのリーディングフレーム、すなわち、５’から３’方向の配向の３つのリーディングフレームおよび逆配向（３’〜５’配向）の３つのリーディングフレームの各々について、翻訳を有するヒトＤ遺伝子セグメントのヌクレオチド配列を例示する。「^＊」の記号は、終止コドンを表し、２つの配列番号の間のカンマは、２つのアミノ酸配列が、終止コドンにより隔てられていることを示す。 図１０Ａ〜１０Ｅは、６つのリーディングフレーム、すなわち、５’から３’方向の配向の３つのリーディングフレームおよび逆配向（３’〜５’配向）の３つのリーディングフレームの各々について、翻訳を有するヒトＤ遺伝子セグメントのヌクレオチド配列を例示する。「^＊」の記号は、終止コドンを表し、２つの配列番号の間のカンマは、２つのアミノ酸配列が、終止コドンにより隔てられていることを示す。 図１０Ａ〜１０Ｅは、６つのリーディングフレーム、すなわち、５’から３’方向の配向の３つのリーディングフレームおよび逆配向（３’〜５’配向）の３つのリーディングフレームの各々について、翻訳を有するヒトＤ遺伝子セグメントのヌクレオチド配列を例示する。「^＊」の記号は、終止コドンを表し、２つの配列番号の間のカンマは、２つのアミノ酸配列が、終止コドンにより隔てられていることを示す。 図１１〜１３は、６０１３ Ｆ０ヘテロ接合性マウスが発現したｍＲＮＡ配列およびそれらにコードされるタンパク質配列を例示し、これらは、それらの１２９系統に由来する染色体における免疫グロブリン重鎖遺伝子座に、ヒスチジンで置換したヒトＤ遺伝子セグメント（ＨＤ１．１−６．６（９５８６ｂｐ；配列番号１）、ＨＤ１．７−６．１３（９２６８ｂｐ；配列番号２）、ＨＤ１．１４−６．１９（９４４１ｂｐ；配列番号３）、およびＨＤ１．２０−６．２５、１．２６（１１５９２ｂｐ；配列番号４））を含む。各図内の枠囲いされた配列は、ヒスチジンで置換したヒトＤ遺伝子セグメントを含む、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座に由来する、ＣＤＲ３配列におけるヒスチジンコドンの存在を示す。ＦＷＲは、フレーム領域を表し、ＣＤＲは、相補性決定領域を表す。アラインメントでは、ドット「.」は、クエリー配列と同一な配列を示し、ダッシュ「−」は、配列におけるギャップを示す。 図１１〜１３は、６０１３ Ｆ０ヘテロ接合性マウスが発現したｍＲＮＡ配列およびそれらにコードされるタンパク質配列を例示し、これらは、それらの１２９系統に由来する染色体における免疫グロブリン重鎖遺伝子座に、ヒスチジンで置換したヒトＤ遺伝子セグメント（ＨＤ１．１−６．６（９５８６ｂｐ；配列番号１）、ＨＤ１．７−６．１３（９２６８ｂｐ；配列番号２）、ＨＤ１．１４−６．１９（９４４１ｂｐ；配列番号３）、およびＨＤ１．２０−６．２５、１．２６（１１５９２ｂｐ；配列番号４））を含む。各図内の枠囲いされた配列は、ヒスチジンで置換したヒトＤ遺伝子セグメントを含む、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座に由来する、ＣＤＲ３配列におけるヒスチジンコドンの存在を示す。ＦＷＲは、フレーム領域を表し、ＣＤＲは、相補性決定領域を表す。アラインメントでは、ドット「.」は、クエリー配列と同一な配列を示し、ダッシュ「−」は、配列におけるギャップを示す。 図１１〜１３は、６０１３ Ｆ０ヘテロ接合性マウスが発現したｍＲＮＡ配列およびそれらにコードされるタンパク質配列を例示し、これらは、それらの１２９系統に由来する染色体における免疫グロブリン重鎖遺伝子座に、ヒスチジンで置換したヒトＤ遺伝子セグメント（ＨＤ１．１−６．６（９５８６ｂｐ；配列番号１）、ＨＤ１．７−６．１３（９２６８ｂｐ；配列番号２）、ＨＤ１．１４−６．１９（９４４１ｂｐ；配列番号３）、およびＨＤ１．２０−６．２５、１．２６（１１５９２ｂｐ；配列番号４））を含む。各図内の枠囲いされた配列は、ヒスチジンで置換したヒトＤ遺伝子セグメントを含む、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座に由来する、ＣＤＲ３配列におけるヒスチジンコドンの存在を示す。ＦＷＲは、フレーム領域を表し、ＣＤＲは、相補性決定領域を表す。アラインメントでは、ドット「.」は、クエリー配列と同一な配列を示し、ダッシュ「−」は、配列におけるギャップを示す。 図１４は、免疫グロブリン重鎖ＣＤＲ３配列におけるヒスチジン組込み頻度を例示する。Ｘ軸は、各ＣＤＲ３配列に現れるヒスチジンコドンの数を表し、Ｙ軸は、対応する読取りの比率を表す。「６０１３ Ｆ０ ｈｅｔ」は、ヒスチジンで置換したＤ遺伝子セグメントを含む６０１３ヘテロ接合性マウスが発現したＣＤＲ３配列を示す。「ＶＩ３−Ａｄａｍ６」は、本明細書に記載されているヒスチジン改変なしのヒトＶＨ遺伝子セグメント、ヒトＤ遺伝子セグメント、およびヒトＪＨ遺伝子セグメントを含む対照マウスから得られたＣＤＲ３配列を示す。「ＡＳＡＰ」は、別の対照として用いられたＲｅｇｅｎｅｒｏｎ抗体データベースから得られるＣＤＲ３配列を示す。 図１５は、様々な抗原特異的抗体（Ａ〜Ｋ抗体）からのヒトＶκ１−３９に由来する軽鎖のアミノ酸アラインメントを例示する。各軽鎖配列内に位置するヒスチジン（Ｈ）残基は、太字とする。様々な軽鎖領域（フレームワークおよびＣＤＲ）を、アラインメントの上方に表示する。 図１６は、ヒトＶκ１−３９に由来する軽鎖のＣＤＲ３領域内で、変異生成により操作された（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）ヒスチジン残基の組合せおよび位置を例示する。対応する核酸配列を含める。変異生成を介して導入されたヒスチジン残基および対応する核酸残基を太字で示す。アミノ酸位置（１０５、１０６位など）は、Lefrancら（２００３年）、Dev. Comp. Immunol.、２７巻：５５〜７７頁において記載されており、また、www.imgt.org上でも調べることができる、固有の番号付けに基づく。 図１７は、５つの（１〜５の）異なる重鎖およびＣＤＲ３内の表示される位置（Ｙ軸を参照されたい）に操作したヒスチジン残基を有するＶκ１−３９に由来する軽鎖をコードする核酸をトランスフェクトされたＣＨＯ細胞の上清中で検出される、ｎｇ／ｍＬ単位の抗体発現レベルを例示する。 図１８は、ＣＨＯ細胞上清中の、ヒスチジン操作した軽鎖を含有する選択された抗原特異的ヒト抗体の発現を示すウェスタンブロットである。 図１９Ａ〜１９Ｊは、様々なヒスチジン操作した軽鎖と対合させた、抗原特異的抗体から選択された重鎖についての、中性（７．４）および酸性（５．５）ｐＨにおける結合キネティクスを示す。 図１９Ａ〜１９Ｊは、様々なヒスチジン操作した軽鎖と対合させた、抗原特異的抗体から選択された重鎖についての、中性（７．４）および酸性（５．５）ｐＨにおける結合キネティクスを示す。 図１９Ａ〜１９Ｊは、様々なヒスチジン操作した軽鎖と対合させた、抗原特異的抗体から選択された重鎖についての、中性（７．４）および酸性（５．５）ｐＨにおける結合キネティクスを示す。 図１９Ａ〜１９Ｊは、様々なヒスチジン操作した軽鎖と対合させた、抗原特異的抗体から選択された重鎖についての、中性（７．４）および酸性（５．５）ｐＨにおける結合キネティクスを示す。 図１９Ａ〜１９Ｊは、様々なヒスチジン操作した軽鎖と対合させた、抗原特異的抗体から選択された重鎖についての、中性（７．４）および酸性（５．５）ｐＨにおける結合キネティクスを示す。 図１９Ａ〜１９Ｊは、様々なヒスチジン操作した軽鎖と対合させた、抗原特異的抗体から選択された重鎖についての、中性（７．４）および酸性（５．５）ｐＨにおける結合キネティクスを示す。 図１９Ａ〜１９Ｊは、様々なヒスチジン操作した軽鎖と対合させた、抗原特異的抗体から選択された重鎖についての、中性（７．４）および酸性（５．５）ｐＨにおける結合キネティクスを示す。 図１９Ａ〜１９Ｊは、様々なヒスチジン操作した軽鎖と対合させた、抗原特異的抗体から選択された重鎖についての、中性（７．４）および酸性（５．５）ｐＨにおける結合キネティクスを示す。 図１９Ａ〜１９Ｊは、様々なヒスチジン操作した軽鎖と対合させた、抗原特異的抗体から選択された重鎖についての、中性（７．４）および酸性（５．５）ｐＨにおける結合キネティクスを示す。 図１９Ａ〜１９Ｊは、様々なヒスチジン操作した軽鎖と対合させた、抗原特異的抗体から選択された重鎖についての、中性（７．４）および酸性（５．５）ｐＨにおける結合キネティクスを示す。 図２０Ａ〜２０Ｅは、様々なヒスチジン操作した軽鎖と対合させた、抗原特異的抗体から選択された重鎖（１〜５）についての、中性（７．４）および酸性（５．７５）ｐＨにおける結合キネティクスを示す。ｋ_ａ、ｋ_ｄ、Ｋ_Ｄ、およびｔ_１／２を含む様々な動力学的パラメータが示される。ＮＢ＝結合がみられない。 図２０Ａ〜２０Ｅは、様々なヒスチジン操作した軽鎖と対合させた、抗原特異的抗体から選択された重鎖（１〜５）についての、中性（７．４）および酸性（５．７５）ｐＨにおける結合キネティクスを示す。ｋ_ａ、ｋ_ｄ、Ｋ_Ｄ、およびｔ_１／２を含む様々な動力学的パラメータが示される。ＮＢ＝結合がみられない。 図２０Ａ〜２０Ｅは、様々なヒスチジン操作した軽鎖と対合させた、抗原特異的抗体から選択された重鎖（１〜５）についての、中性（７．４）および酸性（５．７５）ｐＨにおける結合キネティクスを示す。ｋ_ａ、ｋ_ｄ、Ｋ_Ｄ、およびｔ_１／２を含む様々な動力学的パラメータが示される。ＮＢ＝結合がみられない。 図２０Ａ〜２０Ｅは、様々なヒスチジン操作した軽鎖と対合させた、抗原特異的抗体から選択された重鎖（１〜５）についての、中性（７．４）および酸性（５．７５）ｐＨにおける結合キネティクスを示す。ｋ_ａ、ｋ_ｄ、Ｋ_Ｄ、およびｔ_１／２を含む様々な動力学的パラメータが示される。ＮＢ＝結合がみられない。 図２０Ａ〜２０Ｅは、様々なヒスチジン操作した軽鎖と対合させた、抗原特異的抗体から選択された重鎖（１〜５）についての、中性（７．４）および酸性（５．７５）ｐＨにおける結合キネティクスを示す。ｋ_ａ、ｋ_ｄ、Ｋ_Ｄ、およびｔ_１／２を含む様々な動力学的パラメータが示される。ＮＢ＝結合がみられない。 図２１は、表示される重鎖（２、３、および６）と対合させた、親のユニバーサル軽鎖またはヒスチジン改変ユニバーサル軽鎖を含む抗体についての動力学的パラメータ（Ｋ_Ｄおよびｔ_１／２）を示す。ヒスチジン置換は、複数の抗体において強力なｐＨ依存性をもたらす。ＣＤＲ３内でヒスチジン置換を施して、配列_１０５ＱＱＳＹＳＴＰ_１１１（配列番号３）を_１０５ＨＨＳＹＳＴＨ_１１１（配列番号３２９）へと転換した。ＮＢ＝結合が検出されない（Ｋ_Ｄ＞１０マイクロモル濃度）ことに注意されたい。 図２２は、ヒスチジン残基を、再構成されたヒトＶκ１−３９／Ｊκ５軽鎖配列のＣＤＲ３へと操作するのに用いられる、選択された変異生成プライマーの配列および特性（ＧＣ含量％、Ｎ、ミスマッチ％、Ｔｍ）を示す。下記の表には、配列表において用いられるこれらのプライマーの配列番号が含まれる。Ｆ＝フォワードプライマー、Ｒ＝リバースプライマー。 図２３Ａ〜２３Ｂは、改変されたヒト軽鎖を含有する抗体を発現する遺伝子改変マウスを作製するために、ヒスチジン残基を、Ｖκ１−３９／Ｊκ５可変領域に由来する、再構成されたヒト軽鎖可変領域配列へと操作するためのターゲッティングベクターを構築するための一般的戦略を示す。図２３Ｃ〜２３Ｄが、ＵＬＣ−Ｈ１０５／１０６／１０８／１１１置換のためのターゲッティングベクターのＥＳ細胞への導入、およびＥＳ細胞からのヘテロ接合性マウスの生成を示すのに対し、図２３Ｅ〜２３Ｆは、ＵＬＣ−Ｈ１０６／１０８／１１１置換のためのターゲッティングベクターのＥＳ細胞への導入、およびＥＳ細胞からのヘテロ接合性マウスの生成を示す。略図は、縮尺通りに提示するわけではない。特に示されない限り、塗りつぶされた描形および実線は、マウス配列を表し、白抜きの描形および二重線は、ヒト配列を表す。 図２３Ａ〜２３Ｂは、改変されたヒト軽鎖を含有する抗体を発現する遺伝子改変マウスを作製するために、ヒスチジン残基を、Ｖκ１−３９／Ｊκ５可変領域に由来する、再構成されたヒト軽鎖可変領域配列へと操作するためのターゲッティングベクターを構築するための一般的戦略を示す。図２３Ｃ〜２３Ｄが、ＵＬＣ−Ｈ１０５／１０６／１０８／１１１置換のためのターゲッティングベクターのＥＳ細胞への導入、およびＥＳ細胞からのヘテロ接合性マウスの生成を示すのに対し、図２３Ｅ〜２３Ｆは、ＵＬＣ−Ｈ１０６／１０８／１１１置換のためのターゲッティングベクターのＥＳ細胞への導入、およびＥＳ細胞からのヘテロ接合性マウスの生成を示す。略図は、縮尺通りに提示するわけではない。特に示されない限り、塗りつぶされた描形および実線は、マウス配列を表し、白抜きの描形および二重線は、ヒト配列を表す。 図２３Ａ〜２３Ｂは、改変されたヒト軽鎖を含有する抗体を発現する遺伝子改変マウスを作製するために、ヒスチジン残基を、Ｖκ１−３９／Ｊκ５可変領域に由来する、再構成されたヒト軽鎖可変領域配列へと操作するためのターゲッティングベクターを構築するための一般的戦略を示す。図２３Ｃ〜２３Ｄが、ＵＬＣ−Ｈ１０５／１０６／１０８／１１１置換のためのターゲッティングベクターのＥＳ細胞への導入、およびＥＳ細胞からのヘテロ接合性マウスの生成を示すのに対し、図２３Ｅ〜２３Ｆは、ＵＬＣ−Ｈ１０６／１０８／１１１置換のためのターゲッティングベクターのＥＳ細胞への導入、およびＥＳ細胞からのヘテロ接合性マウスの生成を示す。略図は、縮尺通りに提示するわけではない。特に示されない限り、塗りつぶされた描形および実線は、マウス配列を表し、白抜きの描形および二重線は、ヒト配列を表す。 図２３Ａ〜２３Ｂは、改変されたヒト軽鎖を含有する抗体を発現する遺伝子改変マウスを作製するために、ヒスチジン残基を、Ｖκ１−３９／Ｊκ５可変領域に由来する、再構成されたヒト軽鎖可変領域配列へと操作するためのターゲッティングベクターを構築するための一般的戦略を示す。図２３Ｃ〜２３Ｄが、ＵＬＣ−Ｈ１０５／１０６／１０８／１１１置換のためのターゲッティングベクターのＥＳ細胞への導入、およびＥＳ細胞からのヘテロ接合性マウスの生成を示すのに対し、図２３Ｅ〜２３Ｆは、ＵＬＣ−Ｈ１０６／１０８／１１１置換のためのターゲッティングベクターのＥＳ細胞への導入、およびＥＳ細胞からのヘテロ接合性マウスの生成を示す。略図は、縮尺通りに提示するわけではない。特に示されない限り、塗りつぶされた描形および実線は、マウス配列を表し、白抜きの描形および二重線は、ヒト配列を表す。 図２３Ａ〜２３Ｂは、改変されたヒト軽鎖を含有する抗体を発現する遺伝子改変マウスを作製するために、ヒスチジン残基を、Ｖκ１−３９／Ｊκ５可変領域に由来する、再構成されたヒト軽鎖可変領域配列へと操作するためのターゲッティングベクターを構築するための一般的戦略を示す。図２３Ｃ〜２３Ｄが、ＵＬＣ−Ｈ１０５／１０６／１０８／１１１置換のためのターゲッティングベクターのＥＳ細胞への導入、およびＥＳ細胞からのヘテロ接合性マウスの生成を示すのに対し、図２３Ｅ〜２３Ｆは、ＵＬＣ−Ｈ１０６／１０８／１１１置換のためのターゲッティングベクターのＥＳ細胞への導入、およびＥＳ細胞からのヘテロ接合性マウスの生成を示す。略図は、縮尺通りに提示するわけではない。特に示されない限り、塗りつぶされた描形および実線は、マウス配列を表し、白抜きの描形および二重線は、ヒト配列を表す。 図２３Ａ〜２３Ｂは、改変されたヒト軽鎖を含有する抗体を発現する遺伝子改変マウスを作製するために、ヒスチジン残基を、Ｖκ１−３９／Ｊκ５可変領域に由来する、再構成されたヒト軽鎖可変領域配列へと操作するためのターゲッティングベクターを構築するための一般的戦略を示す。図２３Ｃ〜２３Ｄが、ＵＬＣ−Ｈ１０５／１０６／１０８／１１１置換のためのターゲッティングベクターのＥＳ細胞への導入、およびＥＳ細胞からのヘテロ接合性マウスの生成を示すのに対し、図２３Ｅ〜２３Ｆは、ＵＬＣ−Ｈ１０６／１０８／１１１置換のためのターゲッティングベクターのＥＳ細胞への導入、およびＥＳ細胞からのヘテロ接合性マウスの生成を示す。略図は、縮尺通りに提示するわけではない。特に示されない限り、塗りつぶされた描形および実線は、マウス配列を表し、白抜きの描形および二重線は、ヒト配列を表す。 図２４は、二回目の採血における、ヒスチジンユニバーサル軽鎖（ＨＵＬＣ）についてヘテロ接合性のマウス（４カ所のＨｉｓ置換を有するマウス（ＨＵＬＣ １９２７マウス）；３カ所のＨｉｓ置換を有するマウス（ＨＵＬＣ １９３０マウス））および野生型動物からの、免疫原に対する抗血清力価を示す。 図２５は、ＨＵＬＣ（１９２７対１９３０）マウスおよびＷＴマウスからのハイブリドーマ融合体から得られる、全抗原陽性クローンの数と、ｐＨ感受性抗原結合を提示する抗原陽性クローンの数との比較である。図は、各マウス種類（「マウス１」および「マウス２」）につき２匹ずつのマウスについてのデータを含む。 図２６Ａ〜２６Ｃは、中性ｐＨ（ｐＨ７．４）において、ヘテロ接合性ＨＵＬＣマウスまたはＷＴマウスからのモノクローナル抗体（ＡＡ、ＢＢ、ＣＣ、ＤＤ、ＨＨ、ＧＧ、ＮＮ、およびＯＯ）を、免疫原と会合させるのに続いて、解離相のためのｐＨを７．４または６．０とする緩衝液へとシフトさせる、表面プラズモン共鳴結合実験からのセンサーグラムを示す。各グラフ内の個々の直線は、それぞれの抗体の異なる濃度における結合応答を表す。全ての実験は、２５℃で実行した。解離半減期の値（ｔ_１／２）を、それぞれのセンサーグラムの上方に注記し、ｔ_１／２の倍数変化を、各センサーグラムの右側に含める。抗体ＡＡ、ＢＢ、ＣＣ、ＤＤ、ＨＨ、およびＧＧは、Ｈｉｓ置換された軽鎖を用いるＨＵＬＣ １９２７マウスからの抗体であり、ＮＮは、ＷＴ軽鎖を用いるＨＵＬＣ １９２７マウスからの抗体であり、ＯＯは、ＷＴマウスからの抗体である（明確化のために表５を参照されたい）。 図２６Ａ〜２６Ｃは、中性ｐＨ（ｐＨ７．４）において、ヘテロ接合性ＨＵＬＣマウスまたはＷＴマウスからのモノクローナル抗体（ＡＡ、ＢＢ、ＣＣ、ＤＤ、ＨＨ、ＧＧ、ＮＮ、およびＯＯ）を、免疫原と会合させるのに続いて、解離相のためのｐＨを７．４または６．０とする緩衝液へとシフトさせる、表面プラズモン共鳴結合実験からのセンサーグラムを示す。各グラフ内の個々の直線は、それぞれの抗体の異なる濃度における結合応答を表す。全ての実験は、２５℃で実行した。解離半減期の値（ｔ_１／２）を、それぞれのセンサーグラムの上方に注記し、ｔ_１／２の倍数変化を、各センサーグラムの右側に含める。抗体ＡＡ、ＢＢ、ＣＣ、ＤＤ、ＨＨ、およびＧＧは、Ｈｉｓ置換された軽鎖を用いるＨＵＬＣ １９２７マウスからの抗体であり、ＮＮは、ＷＴ軽鎖を用いるＨＵＬＣ １９２７マウスからの抗体であり、ＯＯは、ＷＴマウスからの抗体である（明確化のために表５を参照されたい）。 図２６Ａ〜２６Ｃは、中性ｐＨ（ｐＨ７．４）において、ヘテロ接合性ＨＵＬＣマウスまたはＷＴマウスからのモノクローナル抗体（ＡＡ、ＢＢ、ＣＣ、ＤＤ、ＨＨ、ＧＧ、ＮＮ、およびＯＯ）を、免疫原と会合させるのに続いて、解離相のためのｐＨを７．４または６．０とする緩衝液へとシフトさせる、表面プラズモン共鳴結合実験からのセンサーグラムを示す。各グラフ内の個々の直線は、それぞれの抗体の異なる濃度における結合応答を表す。全ての実験は、２５℃で実行した。解離半減期の値（ｔ_１／２）を、それぞれのセンサーグラムの上方に注記し、ｔ_１／２の倍数変化を、各センサーグラムの右側に含める。抗体ＡＡ、ＢＢ、ＣＣ、ＤＤ、ＨＨ、およびＧＧは、Ｈｉｓ置換された軽鎖を用いるＨＵＬＣ １９２７マウスからの抗体であり、ＮＮは、ＷＴ軽鎖を用いるＨＵＬＣ １９２７マウスからの抗体であり、ＯＯは、ＷＴマウスからの抗体である（明確化のために表５を参照されたい）。 図２７は、ヒトＶκ３−２０に由来する軽鎖のＣＤＲ３領域内で、変異生成により操作したヒスチジン残基の位置を示す。変異生成を介して導入されたヒスチジン残基および対応する核酸残基を太字で示す。アミノ酸位置（１０５、１０６位など）は、Lefrancら（２００３年）、Dev. Comp. Immunol.、２７巻：５５〜７７頁において記載されている固有の番号付けに基づいており、また、www.imgt.org上でも調べることができる。 図２８は、ヒスチジン残基を、再構成されたヒトＶκ３−２０／Ｊκ１軽鎖配列のＣＤＲ３へと操作するのに用いられる、選択された変異生成プライマーの配列および特性（ＧＣ含量％、Ｎ、ミスマッチ％、Ｔｍ）を示す。下記の表には、配列表において用いられるこれらのプライマーの配列番号が含まれる。Ｆ＝フォワードプライマー、Ｒ＝リバースプライマー。 図２９Ａ〜２９Ｂは、改変されたヒト軽鎖を含有する抗体を発現する遺伝子改変マウスを作製するために、ヒスチジン残基を、Ｖκ３−２０／Ｊκ１軽鎖可変領域に由来する、再構成されたヒト軽鎖可変領域配列へと操作するためのターゲッティングベクターを構築するための一般的戦略を示す。図２９Ｃが、ＵＬＣ−Ｑ１０５Ｈ／Ｑ１０６Ｈ／Ｙ１０７Ｈ／Ｓ１０９Ｈ置換のためのターゲッティングベクターのＥＳ細胞への導入、およびＥＳ細胞からのヘテロ接合性マウスの生成を示すのに対し、図２９Ｄは、ＵＬＣ−Ｑ１０５Ｈ／Ｑ１０６Ｈ／Ｓ１０９Ｈ置換のためのターゲッティングベクターのＥＳ細胞への導入、およびＥＳ細胞からのヘテロ接合性マウスの生成を示す。略図は、縮尺通りに提示するわけではない。特に示されない限り、塗りつぶされた描形および実線は、マウス配列を表し、白抜きの描形および二重線は、ヒト配列を表す。 図２９Ａ〜２９Ｂは、改変されたヒト軽鎖を含有する抗体を発現する遺伝子改変マウスを作製するために、ヒスチジン残基を、Ｖκ３−２０／Ｊκ１軽鎖可変領域に由来する、再構成されたヒト軽鎖可変領域配列へと操作するためのターゲッティングベクターを構築するための一般的戦略を示す。図２９Ｃが、ＵＬＣ−Ｑ１０５Ｈ／Ｑ１０６Ｈ／Ｙ１０７Ｈ／Ｓ１０９Ｈ置換のためのターゲッティングベクターのＥＳ細胞への導入、およびＥＳ細胞からのヘテロ接合性マウスの生成を示すのに対し、図２９Ｄは、ＵＬＣ−Ｑ１０５Ｈ／Ｑ１０６Ｈ／Ｓ１０９Ｈ置換のためのターゲッティングベクターのＥＳ細胞への導入、およびＥＳ細胞からのヘテロ接合性マウスの生成を示す。略図は、縮尺通りに提示するわけではない。特に示されない限り、塗りつぶされた描形および実線は、マウス配列を表し、白抜きの描形および二重線は、ヒト配列を表す。 図２９Ａ〜２９Ｂは、改変されたヒト軽鎖を含有する抗体を発現する遺伝子改変マウスを作製するために、ヒスチジン残基を、Ｖκ３−２０／Ｊκ１軽鎖可変領域に由来する、再構成されたヒト軽鎖可変領域配列へと操作するためのターゲッティングベクターを構築するための一般的戦略を示す。図２９Ｃが、ＵＬＣ−Ｑ１０５Ｈ／Ｑ１０６Ｈ／Ｙ１０７Ｈ／Ｓ１０９Ｈ置換のためのターゲッティングベクターのＥＳ細胞への導入、およびＥＳ細胞からのヘテロ接合性マウスの生成を示すのに対し、図２９Ｄは、ＵＬＣ−Ｑ１０５Ｈ／Ｑ１０６Ｈ／Ｓ１０９Ｈ置換のためのターゲッティングベクターのＥＳ細胞への導入、およびＥＳ細胞からのヘテロ接合性マウスの生成を示す。略図は、縮尺通りに提示するわけではない。特に示されない限り、塗りつぶされた描形および実線は、マウス配列を表し、白抜きの描形および二重線は、ヒト配列を表す。 図２９Ａ〜２９Ｂは、改変されたヒト軽鎖を含有する抗体を発現する遺伝子改変マウスを作製するために、ヒスチジン残基を、Ｖκ３−２０／Ｊκ１軽鎖可変領域に由来する、再構成されたヒト軽鎖可変領域配列へと操作するためのターゲッティングベクターを構築するための一般的戦略を示す。図２９Ｃが、ＵＬＣ−Ｑ１０５Ｈ／Ｑ１０６Ｈ／Ｙ１０７Ｈ／Ｓ１０９Ｈ置換のためのターゲッティングベクターのＥＳ細胞への導入、およびＥＳ細胞からのヘテロ接合性マウスの生成を示すのに対し、図２９Ｄは、ＵＬＣ−Ｑ１０５Ｈ／Ｑ１０６Ｈ／Ｓ１０９Ｈ置換のためのターゲッティングベクターのＥＳ細胞への導入、およびＥＳ細胞からのヘテロ接合性マウスの生成を示す。略図は、縮尺通りに提示するわけではない。特に示されない限り、塗りつぶされた描形および実線は、マウス配列を表し、白抜きの描形および二重線は、ヒト配列を表す。

詳細な説明
このような方法および条件は変化しうるので、本発明は、記載される特定の方法および実験条件に限定されるものではない。本発明の範囲は、特許請求の範囲により規定されるので、本明細書で用いられる用語法は、特定の実施形態だけを説明することを目的とするものであり、限定的であることを意図するものではないこともまた理解されたい。

別に定義されない限り、本明細書で用いられる全ての用語および語句は、反対のことが明らかに示されない限り、またはその用語または語句が用いられる文脈から明らかに明白でない限り、その用語および語句が当技術分野で獲得した意味を含む。本発明の実施または試験では、本明細書に記載されている方法および材料と類似するかまたは同等な任意の方法および材料を用いることができるが、ここでは、特定の方法および材料を記載する。

定義
本明細書で用いる用語「抗体」は、ジスルフィド結合によって相互接続する４つのポリペプチド鎖、２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含む免疫グロブリン分子を含む。各重鎖は、重鎖可変ドメインおよび重鎖定常領域（Ｃ_Ｈ）を含む。重鎖定常領域は、３つのドメイン、Ｃ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２およびＣ_Ｈ３を含む。各軽鎖は、軽鎖可変ドメインおよび軽鎖定常領域（Ｃ_Ｌ）を含む。重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインは、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる保存されている領域の間に散在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域にさらに細分化することができる。各重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインは、アミノ末端からカルボキシ末端まで以下の順序で配置される３つのＣＤＲおよび４つのＦＲを含む：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４（重鎖ＣＤＲは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３と略すことができ；軽鎖ＣＤＲは、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３と略すことができる）。用語「高親和性」抗体は、その標的エピトープに関して約１０^−９Ｍ以下のＫ_Ｄ（例えば、約１×１０^−９Ｍ、１×１０^−１０Ｍ、１×１０^−１１Ｍまたは約１×１０^−１２Ｍ）を有する抗体を指す。一実施形態では、Ｋ_Ｄは表面プラズモン共鳴、例えばＢＩＡＣＯＲＥ^ＴＭによって測定され、別の実施形態では、Ｋ_ＤはＥＬＩＳＡによって測定される。

語句「二重特異性抗体」は、２つ以上のエピトープに選択的に結合することが可能な抗体を含む。二重特異性抗体は、２つの同一ではない重鎖を一般に含み、各重鎖は、２つの異なる分子上（例えば、２つの異なる免疫原上の異なるエピトープ）または同じ分子上（例えば、同じ免疫原上の異なるエピトープ）の異なるエピトープに特異的に結合する。二重特異性抗体が２つの異なるエピトープ（第一のエピトープおよび第二のエピトープ）に選択的に結合することが可能な場合、第一のエピトープに対する第一の重鎖の親和性は、第二のエピトープに対する第一の重鎖の親和性より少なくとも１桁から２桁、または３桁または４桁またはそれ超、一般に低く、逆もまた同じである。二重特異性抗体が特異的に結合するエピトープは、同じか異なる標的の上（例えば、同じか異なるタンパク質の上）にあってよい。例示的な二重特異性抗体は、腫瘍抗原に対して特異的な第一の重鎖、および細胞傷害性マーカー、例えば、Ｆｃ受容体（例えば、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩなど）またはＴ細胞のマーカー（例えば、ＣＤ３、ＣＤ２８など）に対して特異的な第二の重鎖を有する二重特異性抗体を含む。さらに、第二の重鎖可変ドメインは、異なる所望の特異性を有する重鎖可変ドメインで置換することができる。例えば、毒素（例えば、サポリン、ビンカアルカロイドなど）を腫瘍細胞へと送達するように、腫瘍抗原に対して特異的な第一の重鎖および毒素に対して特異的な第二の重鎖を有する二重特異性抗体を対合させることができる。他の例示的な二重特異性抗体は、活性化受容体（例えば、Ｂ細胞受容体、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＩＡ、ＦｃαＲＩ、Ｔ細胞受容体など）に対して特異的な第一の重鎖および抑制性受容体（例えば、ＦｃγＲＩＩＢ、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７２、ＣＤ３００ａなど）に対して特異的な第二の重鎖を有する二重特異性抗体を含む。細胞の活性化（例えば、アレルギーおよび喘息）と関連する治療条件のためには、このような二重特異性抗体を構築することができる。二重特異性抗体は、例えば、同じ免疫原の異なるエピトープを認識する重鎖を組み合わせることによって作ることができる。例えば、同じ免疫原の異なるエピトープを認識する重鎖可変配列をコードする核酸配列は、同じか異なる重鎖定常領域をコードする核酸配列に融合させることができ、そのような配列は免疫グロブリン軽鎖を発現する細胞で発現させることができる。一般的な二重特異性抗体は、各々３つの重鎖ＣＤＲと、続く（Ｎ末端からＣ末端にかけて）Ｃ_Ｈ１ドメイン、ヒンジ、Ｃ_Ｈ２ドメインおよびＣ_Ｈ３ドメインを有する２つの重鎖、ならびに、エピトープ結合特異性を付与しないが各重鎖と会合することができるか、または各重鎖と会合することができ、かつ重鎖エピトープ結合領域が結合するエピトープの１つもしくは複数に結合することができるか、または各重鎖と会合することができ、かつ一方もしくは両方のエピトープへの重鎖の一方もしくは両方の結合を可能にすることができる免疫グロブリン軽鎖を有する。

用語「細胞」には、組換え核酸配列を発現させるのに適する任意の細胞が含まれる。細胞には、原核生物および真核生物（単細胞または多細胞）のもの、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉの株、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．など）、マイコバクテリア細胞、真菌細胞、酵母細胞（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓ．ｐｏｍｂｅ、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａなど）、植物細胞、昆虫細胞（例えば、ＳＦ−９、ＳＦ−２１、バキュロウイルス感染昆虫細胞、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉなど）、ヒト以外の動物細胞、ヒト細胞、または細胞融合体、例えばハイブリドーマもしくはクアドローマが含まれる。一部の実施形態では、細胞はヒト、サル、類人猿、ハムスター、ラットまたはマウスの細胞である。一部の実施形態では、細胞は真核細胞であり、以下の細胞から選択される：ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯ Ｋ１、ＤＸＢ−１１ ＣＨＯ、Ｖｅｇｇｉｅ−ＣＨＯ）、ＣＯＳ（例えば、ＣＯＳ−７）、網膜細胞、Ｖｅｒｏ、ＣＶ１、腎臓（例えば、ＨＥＫ２９３、２９３ ＥＢＮＡ、ＭＳＲ ２９３、ＭＤＣＫ、ＨａＫ、ＢＨＫ）、ＨｅＬａ、ＨｅｐＧ２、ＷＩ３８、ＭＲＣ ５、Ｃｏｌｏ２０５、ＨＢ ８０６５、ＨＬ−６０（例えば、ＢＨＫ２１）、Ｊｕｒｋａｔ、Ｄａｕｄｉ、Ａ４３１（表皮性）、ＣＶ−１、Ｕ９３７、３Ｔ３、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、ＳＰ２／０、ＮＳ−０、ＭＭＴ ０６０５６２、Ｓｅｒｔｏｌｉ細胞、ＢＲＬ ３Ａ細胞、ＨＴ１０８０細胞、骨髄腫細胞、腫瘍細胞および前記細胞に由来する細胞系。一部の実施形態では、細胞は、１つまたは複数のウイルス遺伝子を含む（例えばウイルス遺伝子を発現する網膜細胞（例えば、ＰＥＲ．Ｃ６^ＴＭ細胞））。

本明細書で用いられる用語「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」には、通常は（すなわち、野生型動物では）免疫グロブリン分子（例えば、抗体またはＴ細胞受容体）の軽鎖可変領域内または重鎖可変領域における２つのフレームワーク領域の間に現れる生物体の免疫グロブリン遺伝子の核酸配列によりコードされるアミノ酸配列が含まれる。ＣＤＲは、例えば、生殖細胞系列配列によりコードされてもよく、再構成された配列によりコードされてもよく、例えば、ナイーブＢ細胞またはナイーブＴ細胞によりコードされてもよく、成熟Ｂ細胞または成熟Ｔ細胞によりコードされてもよい。ＣＤＲは、体細胞変異させる（例えば、動物の生殖細胞系列内でコードされる配列から変化する）こともでき、ヒト化させることもでき、かつ／またはアミノ酸置換、アミノ酸付加、もしくはアミノ酸欠失により改変することもできる。状況によって（例えば、ＣＤＲ３では）、ＣＤＲは、例えば、配列のスプライシングまたは接続（例えば、重鎖ＣＤＲ３を形成するＶ−Ｄ−Ｊ組換え）の結果として、連続的でない（例えば、再構成されていない核酸配列内では）が、Ｂ細胞の核酸配列内では連続的な２つ以上の配列（例えば、生殖細胞系列配列）によりコードされてもよい。

保存的なアミノ酸置換を記載するために用いられる場合、用語「保存的」には、類似した化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を有する側鎖Ｒ基を有する別のアミノ酸残基によるアミノ酸残基の置換が含まれる。一般に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の目的の機能特性、例えば標的エピトープに所望の親和性で特異的に結合する可変領域の能力を実質的に変えない。類似した化学特性を有する側鎖を有するアミノ酸の群の例には、グリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシンなどの脂肪族側鎖；セリンおよびトレオニンなどの脂肪族ヒドロキシル側鎖；アスパラギンおよびグルタミンなどのアミドを含む側鎖；フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンなどの芳香族の側鎖；リシン、アルギニンおよびヒスチジンなどの塩基性側鎖；アスパラギン酸およびグルタミン酸などの酸性側鎖；ならびにシステインおよびメチオニンなどの硫黄を含む側鎖が含まれる。保存的アミノ酸置換基には、例えば、バリン／ロイシン／イソロイシン、フェニルアラニン／チロシン、リシン／アルギニン、アラニン／バリン、グルタミン酸／アスパラギン酸、およびアスパラギン／グルタミンが含まれる。一部の実施形態では、例えばアラニンスキャニング変異生成で用いられるように、保存的アミノ酸置換は、アラニンによるタンパク質の任意の天然の残基の置換であってよい。一部の実施形態では、Ｇｏｎｎｅｔら（１９９２年）Ｅｘｈａｕｓｔｉｖｅ Ｍａｔｃｈｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｎｔｉｒｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａｂａｓｅ、Ｓｃｉｅｎｃｅ２５６巻：１４４３〜４５頁に開示されるＰＡＭ２５０対数尤度マトリックスで正の値を有する保存的置換がもたらされる。一部の実施形態では、置換は、ＰＡＭ２５０対数尤度マトリックスで置換が負ではない値を有するような適度に保存的な置換である。

一部の実施形態では、免疫グロブリン軽鎖または重鎖での残基位置は、１つまたは複数の保存的アミノ酸置換によって異なる。一部の実施形態では、免疫グロブリン軽鎖またはその機能的断片（例えば、Ｂ細胞などからの発現および分泌を可能にする断片）における残基位置は、アミノ酸配列が本明細書に記載されている軽鎖と同一ではなく、１つまたは複数の保存的アミノ酸置換によって異なる。

本明細書で用いられる用語「解離半減期」または「ｔ_１／２」は、以下の式：ｔ_１／２（分）＝（ｌｎ２／ｋ_ｄ）／６０［式中、ｋ_ｄは、解離速度定数を表す］により計算される値を指す。

語句「エピトープ結合タンパク質」には、少なくとも１つのＣＤＲを有し、エピトープを選択的に認識することが可能な、例えばエピトープに約１マイクロモル以下のＫ_Ｄ（例えば、約１×１０^−６Ｍ、１×１０^−７Ｍ、１×１０^−９Ｍ、１×１０^−９Ｍ、１×１０^−１０Ｍ、１×１０^−１１Ｍまたは約１×１０^−１２ＭのＫ_Ｄ）で結合することが可能であるタンパク質が含まれる。治療的なエピトープ結合タンパク質（例えば、治療的な抗体）は、ナノモルまたはピコモルの範囲のＫ_Ｄをしばしば必要とする。

例えば、機能性ポリペプチドを参照して本明細書で使用される用語「機能性」は、天然のタンパク質と通常関連する少なくとも１つの生物学的活性を保持するポリペプチドを含む。別の場合には、機能性免疫グロブリン遺伝子セグメントは、再構成された免疫グロブリン遺伝子配列を生成するための産生性の再構成が可能な可変遺伝子セグメントを含み得る。

語句「機能的断片」には、発現、分泌させることができ、マイクロモル、ナノモルまたはピコモルの範囲のＫ_Ｄでエピトープに特異的に結合するエピトープ結合タンパク質の断片が含まれる。特異的な認識には、少なくともマイクロモルの範囲、ナノモルの範囲またはピコモルの範囲のＫ_Ｄを有することが含まれる。

本明細書中で使用される場合、免疫グロブリン核酸配列を参照した用語「生殖細胞系列」には、子孫に渡されることができる核酸配列への参照が含まれる。

語句「重鎖」または「免疫グロブリン重鎖」には、任意の生物体からの免疫グロブリン重鎖配列（免疫グロブリン重鎖定常領域配列を含む）が含まれる。特に明記しない限り、重鎖可変ドメインには３つの重鎖ＣＤＲおよび４つのＦＲ領域が含まれる。重鎖の断片には、ＣＤＲ、ＣＤＲおよびＦＲ、ならびにこれらの組合せが含まれる。一般的な重鎖は、可変ドメインに続いて、（Ｎ末端からＣ末端に向かって）Ｃ_Ｈ１ドメイン、ヒンジ、Ｃ_Ｈ２ドメイン、およびＣ_Ｈ３ドメインを有する。重鎖の機能性断片には、エピトープを特異的に認識する（例えば、マイクロモル濃度、ナノモル濃度、またはピコモル濃度範囲のＫ_Ｄでエピトープを認識する）ことが可能で、細胞から発現および分泌させることが可能で、少なくとも１つのＣＤＲを含む断片が含まれる。重鎖可変ドメインは、生殖細胞系列に存在するＶ_Ｈセグメント、Ｄ_Ｈセグメント、およびＪ_Ｈセグメントのレパートリーに由来する、Ｖ_Ｈセグメント、Ｄ_Ｈセグメント、およびＪ_Ｈセグメントを一般に含む可変領域のヌクレオチド配列によりコードされる。様々な生物体のＶ重鎖セグメント、Ｄ重鎖セグメント、およびＪ重鎖セグメントについての配列、位置、および命名法は、インターネットを介してＵＲＬ「ｉｍｇｔ．ｏｒｇ．」のワールドワイドウェブ（ｗｗｗ）上でアクセス可能な、ＩＭＧＴデータベース内で見出すことができる。

配列に関連して用いられる場合、用語「同一性」には、ヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列の同一性を測定するために用いることができる当技術分野で公知であるいくつかの異なるアルゴリズムで決定される同一性が含まれる。本明細書に記載される一部の実施形態では、同一性は、１０．０のオープンギャップペナルティ、０．１のエクステンドギャップペナルティを使用するＣｌｕｓｔａｌＷ ｖ．１．８３（スロー）アラインメントを用い、およびＧｏｎｎｅｔの類似度マトリックス（ＭＡＣＶＥＣＴＯＲ^ＴＭ１０．０．２、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ Ｉｎｃ．、２００８）を用いて決定される。配列の同一性に関して比較される配列の全長は特定の配列に依存するが、軽鎖定常ドメインの場合、全長は、自己会合して正規の軽鎖定常ドメインを形成することが可能な、例えばベータストランドを含む２つのβシートを形成することが可能であり、およびヒトまたはマウスの少なくとも１つのＣ_Ｈ１ドメインと相互作用することが可能な軽鎖定常ドメインに折り畳まれるのに十分な長さの配列を含むべきである。Ｃ_Ｈ１ドメインの場合、配列の全長は、ベータストランドを含む２つのβシートを形成することが可能であり、およびマウスまたはヒトの少なくとも１つの軽鎖定常ドメインと相互作用することが可能なＣ_Ｈ１ドメインに折り畳まれるのに十分な長さの配列を含むべきである。

語句「免疫グロブリン分子」には、２つの免疫グロブリン重鎖および２つの免疫グロブリン軽鎖が含まれる。重鎖は同一であっても異なってもよく、軽鎖は同一であっても異なってもよい。

語句「軽鎖」には、任意の生物体からの免疫グロブリン軽鎖配列が含まれ、特に明記しない限りヒトカッパ（κ）およびラムダ（λ）軽鎖およびＶｐｒｅＢ、ならびに代わりの軽鎖が含まれる。特に明記しない限り、軽鎖可変ドメインには３つの軽鎖ＣＤＲおよび４つのフレームワーク（ＦＲ）領域が一般に含まれる。一般に、完全長軽鎖には、アミノ末端からカルボキシル末端にかけて、ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４を含む可変ドメインおよび軽鎖定常領域アミノ酸配列が含まれる。軽鎖可変ドメインは、生殖細胞系列に存在する軽鎖Ｖ遺伝子セグメントおよび軽鎖Ｊ遺伝子セグメントのレパートリーに由来する、軽鎖Ｖ_Ｌ遺伝子セグメントおよび軽鎖Ｊ_Ｌ遺伝子セグメントを一般に含む軽鎖可変領域のヌクレオチド配列によりコードされる。様々な生物体の軽鎖Ｖ遺伝子セグメントおよび軽鎖Ｊ遺伝子セグメントについての配列、位置、および命名法は、インターネットを介してＵＲＬ「ｉｍｇｔ．ｏｒｇ．」のワールドワイドウェブ（ｗｗｗ）上でアクセス可能な、ＩＭＧＴデータベース内で見出すことができる。軽鎖には、例えば、軽鎖が現れるエピトープ結合タンパク質が選択的に結合する第一または第二のエピトープのいずれにも選択的に結合しないものが含まれる。軽鎖には、エピトープ結合タンパク質（その中に軽鎖が現れる）が選択的に結合する１つまたは複数のエピトープに結合し認識するものか、重鎖による結合および認識を助けるものがさらに含まれる。軽鎖には、軽鎖が現れるエピトープ結合タンパク質が選択的に結合する１つまたは複数のエピトープに結合し認識するものか、重鎖による結合および認識を助けるものがさらに含まれる。共通軽鎖またはユニバーサル軽鎖はヒトＶκ１−３９Ｊκ５遺伝子またはヒトＶκ３−２０Ｊκ１遺伝子に由来するものを包含し、それの体細胞変異（例えば、親和性成熟）バージョンを包含する。

語句「マイクロモルの範囲」は、１〜９９９マイクロモルを意味するものとする。語句「ナノモルの範囲」は、１〜９９９ナノモルを意味するものとする。語句「ピコモルの範囲」は、１〜９９９ピコモルを意味するものとする。

「中性ｐＨ」は、ｐＨ約７．０〜約８．０の間、例えば、ｐＨ約７．０〜約７．４の間、例えば、約７．２〜約７．４の間のｐＨ、例えば、マウスまたはヒトにおける、例えば、生理学的ｐＨを含む。「酸性ｐＨ」は、６．０以下のｐＨ、例えば、ｐＨ約５．０〜約６．０の間、ｐＨ約５．７５〜約６．０の間のｐＨ、例えば、エンドソームコンパートメントまたはリソソームコンパートメントのｐＨを含む。

用語「作動可能に連結した」は、作動可能に連結した成分が、それらの意図される様式で機能する関係を指す。１つの場合には、適正な転写調節を保持するように、タンパク質をコードする核酸配列を、調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー配列など）に作動可能に連結することができる。１つの場合には、免疫グロブリン可変領域（またはＶ（Ｄ）Ｊセグメント）の核酸配列を免疫グロブリン定常領域の核酸配列に作動可能に連結することにより、該配列の間の免疫グロブリン重鎖配列または免疫グロブリン軽鎖配列への適正な組換えを可能にすることができる。

本明細書で使用される語句「体細胞変異」には、クラススイッチングを経たＢ細胞からの核酸配列への言及が含まれ、ここで、クラススイッチングされたＢ細胞における免疫グロブリン可変領域、例えば重鎖可変領域（例えば、重鎖可変ドメインまたは重鎖ＣＤＲもしくはＦＲ配列を含む領域）の核酸配列は、クラススイッチングの前のＢ細胞の核酸配列と同一ではなく、例えば、例えば、クラススイッチングを経ていないＢ細胞とクラススイッチングを経たＢ細胞との間のＣＤＲまたはフレームワーク核酸配列において差がある。語句「体細胞変異した」には、親和性成熟していないＢ細胞での対応する免疫グロブリン可変領域ヌクレオチド配列（すなわち、生殖細胞系列細胞のゲノム中の配列）と同一ではない親和性成熟Ｂ細胞からの核酸配列への言及が含まれる。語句「体細胞変異した」には、目的のエピトープへのＢ細胞の曝露の後のＢ細胞からの免疫グロブリン可変領域核酸配列への言及も含まれ、ここで、核酸配列は、目的のエピトープへのＢ細胞の曝露の前の対応する核酸配列と異なる。語句「体細胞変異した」は、免疫原チャレンジに応じて動物で、例えばヒト免疫グロブリン可変領域核酸配列を有するマウスで生成される、かつそのような動物で生得的に作動する選択プロセスから生じる抗体からの配列も指す。

核酸配列を参照した用語「再構成されていない」は、動物細胞の生殖細胞系列に存在する核酸配列を含む。

語句「可変ドメイン」は、Ｎ末端からＣ末端にかけて（特に示されない限り）、配列において以下のアミノ酸領域：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４を含む免疫グロブリン軽鎖または免疫グロブリン重鎖のアミノ酸配列（所望に応じて改変された）を含む。

語句「作動可能に連結した」は、そのように記載された成分が、それらの意図される様式で機能することを可能とする関係にある並置を指す。１つの場合には、適正な転写調節を保持するように、タンパク質をコードする核酸配列を調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー配列など）に作動可能に連結することができる。１つの場合には、免疫グロブリン可変領域（またはＶ（Ｄ）Ｊセグメント）の核酸配列を免疫グロブリン定常領域の核酸配列に作動可能に連結することにより、該配列の間の免疫グロブリン重鎖配列または免疫グロブリン軽鎖配列への適正な組換えを可能にすることができる。

遺伝子置きかえに関連する用語「置きかえ」は、外因性遺伝物質を内因性遺伝子座に配置し、これにより、内因性遺伝子の全部または一部分を、オーソロガスな核酸配列または相同な核酸配列で置きかえることを指す。

本明細書で使用される、例えば、機能性ポリペプチドを参照した用語「機能性」は、天然のタンパク質と通常関連する少なくとも１つの生物学的活性を保持するポリペプチドを含む。別の場合には、機能性免疫グロブリン遺伝子セグメントは、再構成された免疫グロブリン遺伝子配列を生成するための産生性の再構成が可能な可変遺伝子セグメントを含み得る。

ヒスチジン置換を有する可変ドメイン
ヒト免疫グロブリンベースの治療剤のデザインは、十分に研究された現象であるが、ある種の未解決の問題が、最適の特徴を有するこのような治療剤の作製すること、例えば、このような治療剤の血清半減期の延長、または治療用分子１つ当たりでより多くの標的に結合するそれらの能力の他の方法での改善することにおいて依然として存続している。ここ数十年にわたる、血清免疫グロブリンの代謝回転を解明することを目的とする多くの研究は、抗体の構造を改変することにより、治療的に重要な抗体、または免疫グロブリンベースの治療剤の血清半減期を延長する方途に焦点を当ててきた。大半の場合、この改変研究は、抗体の定常ドメインの胎児性Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）との相互作用に焦点を当ててきた。細胞外表面上の胎児性Ｆｃ受容体は、それらのＦｃ領域を介して循環抗体に結合して、抗体−ＦｃＲｎ複合体を形成し、これは、細胞へと組み込まれるかまたはエンドサイトーシスを受け（ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｅｄ）、ここで、リガンドと抗体とは離別し、抗体−ＦｃＲｎ複合体は、サイクリングプロセスを経、これにより、抗体およびＦｃＲｎが細胞の表面へと戻り、ここで、抗体は、放出され、新たな標的分子に再結合し得る。抗体−ＦｃＲｎ複合体のサイクリングは、受容体サイクリングの一般的機構の発見に続き、強い関心の領域となった。

受容体のサイクリングは様々な機構により進行し得る。受容体を媒介するエンドサイトーシスは、細胞表面受容体（場合によっては、例えば、ＦｃＲｎ）およびそれらのリガンドのリサイクリングを調節するためのエンドソーム経路をもたらす。（他の方法で、ピノサイトーシスを受けた（ｐｉｎｏｃｙｔｏｓｅｄ）分子は典型的に、分解に終わるエンドソーム経路を介してシャトリングされる）。受容体を媒介するエンドサイトーシス機構の発見および膜受容体のリサイクリングに関する一連の研究は、受容体−リガンド代謝回転一般についての詳細な理解のための枠組みをもたらした（総説については、例えば、Brown, M.S.、Anderson, R.G.W.、およびGoldstein, J.L.（１９８３年）、「Recycling Receptors: The Round-Trip Itinerary of Migrant Membrane Proteins」、Cell ３２巻：６６３〜６６７頁を参照されたい; Goldstein, J.L.およびBrown, M.S.（２００９年）、「The LDL Receptor」、Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol.、２９巻：４３１〜４３８頁; Basu, S.K.（１９８４年）、「Receptor-mediated endocytosis: An overview of a dynamic process」、J. Biosci.、６巻（４号）：５３５〜５４２頁もまた参照されたい）。エンドソームソーティングについての他の研究も、循環免疫グロブリンの運命および免疫グロブリン受容体リサイクリングの現象ならびに抗体薬物の薬物動態の問題に適正な枠組みを与える一助となった。この研究は、血清中のＩｇＧ分子の比較的長い半減期の主な一因となっているようである、複雑な抗体−ＦｃＲｎ複合体のサイクリングプロセスを明らかにした。実際、この領域におけるやや早期の研究も、エンドソームが、ｉｎ ｖｉｖｏにおける最も豊富なＦｃＲｎの供給源であることを確立した（Roberts, D.M.ら（１９９０年）、「Isolation and Characterization of the Fc Receptor from the Fetal Yolk Sac of the Rat」、J. Cell. Biol.、１１１巻：１８６７〜１８７６頁を参照されたい）。そして、受容体陽性のエンドソーム画分は、凝集（例えば、Dunn, K.W.ら（１９８９年）、「Iterative Fractionation of Recycling Receptors from Lysosomally Destined Ligands in an Early Sorting Endosome」、J. Cell. Biol.、１０９巻（６号）：３３０３〜３３１４頁を参照されたい）の非存在下では、大部分、リソソーム分解に向かわないことが以前から観察されている（例えば、Brown, M.S.ら（１９８３年）、「Recycling Receptors: The Round-Trip Itinerary of Migrant Membrane Proteins」、Cell ３２巻：６６３〜６６７頁を参照されたい; von Figuraら（１９８４年）、「Antibody to mannos 6-phosphate specific receptor induces receptor deficiency in human fibroblasts」、EMBO J.、３巻（６号）：１２８１〜１２８６頁もまた参照されたい）。ＦｃＲｎによく結合する抗体（例えば、ヒトＩｇＧ１抗体）が、酸性の条件下では、長時間にわたり血清中に依然として存在することを確実にするサイクリングプロセスに関与するのは、このエンドソーム系である。

いくつかの報告によれば、ＦｃＲｎを含有するエンドソームのリサイクリング機構は新規であり、独特である。それは、ユビキチン依存性の完全な細胞小器官融合（ｍｅｒｇｉｎｇ）を伴わず、キスアンドリンガーモデル（ｋｉｓｓ−ａｎｄ−ｌｉｎｇｅｒ ｍｏｄｅｌ）（Gan, Z.ら（２００９年）、「Analyses of the recycling receptor, FcRn, in live cells reveal novel pathways for lysosomal delivery」、Traffic、１０巻（５号）：６００頁；Tzaban, S.ら（２００９年）、「The recycling and transcytotic pathways for IgG transport by FcRn are distinct and display an inherent polarity」、J. Cell Biol.、１８５巻（４号）：６７３〜６８４頁もまた参照されたい）にいっそう類似する小管の伸展（ｔｕｂｕｌａｒ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）により媒介される不完全な融合に酷似する。したがって、抗体−ＦｃＲｎサイクリングモデルは、他のエンドソーム経路とは異なるようである。

抗体−ＦｃＲｎエンドソームサイクリング機構は、ＦｃＲｎによく結合する抗体が、多かれ少なかれ持続的なＦｃＲｎ保護プロセスであって、結合した抗体をエンドソームコンパートメントに封鎖し、そこで、抗体のＦｃＲｎへの結合を維持し、ＦｃＲｎへと結合した抗体のリソソーム分解を阻止することを伴う、ＦｃＲｎ保護プロセスを介して、血清中の存続の延長を維持することが可能であることを確保する。典型的に、循環抗体分子は、細胞表面上でＦｃＲｎに結合する。抗体−ＦｃＲｎ複合体は、エンドソームに、持続的なエンドサイトーシスプロセスの結果として現れる。ＦｃＲｎに結合した分子（例えば、抗体、またはＦｃ融合タンパク質）は、酸安定性のＦｃ−ＦｃＲｎ間相互作用を介して、酸性のエンドソームコンパートメントにおいてＦｃＲｎとの会合を維持する。エンドソーム表面に結合（例えば、ＦｃＲｎまたは別の受容体を介して）しない分子が、リソソーム経路へとシャトリングされ、分解されるのに対し、受容体に結合した分子は、エンドソームが形質膜と融合すると、形質膜へとリサイクルされる。形質膜と融合すると、酸安定性のＦｃ−ＦｃＲｎ間相互作用は、中性に近い細胞外ｐＨへと曝露され、そこで、Ｆｃは、ＦｃＲｎから容易に解離する。ＦｃＲｎへの結合を介して血清濃度を維持するある種のＦｃの能力の主な一因となると考えられるのは、プロトン化状態と共に変化するＦｃＲｎの示差的な熱安定性と組み合わさった、ＦｃのｐＨ結合性の差である。エンドソームサイクリング機構への鍵は、酸性のエンドソームコンパートメントにおける受容体によるリガンドの放出である（例えば、Brown, M.S.ら（１９８３年）において総説されている）。

ＩｇＧ１Ｆｃ部分は、ｐＨ６．０〜約６．５では、ＦｃＲｎに、高い親和性で結合するが、ｐＨ７．０〜約７．５では、結合は、ＦｃＲｎに結合するＦｃの領域の近くのヒスチジン残基である残基３１０〜４３３の滴定（ｔｉｔｒａｔｉｏｎ）、およびプロトン化状態により媒介されるＦｃＲｎの分子間の熱安定性の差におそらく起因して約２桁弱くなり（Raghaven, M.ら（１９９５年）、「Analysis of the pH dependence of the neonatal Fc receptor/immunoglobulin G interaction using antibody and receptor variants」、Biochemistry、３４巻：１４６４９〜１４６５７頁; Vaughn, D.E.およびBjorkman, P.J. （１９９８年）、「Structural basis of pH-dependent antibody binding by the neonatal Fc receptor」、Structure、６巻：６３〜７３頁）、ラットＦｃＲｎも、ｐＨ６．０で、ｐＨ８．０における場合より良好な熱安定性プロファイルを示すことが実証されている（Raghavan, M.ら（１９９３年）、「The class I MHC-related Fc receptor shows pH dependent stability differences correlating with immunoglobulin binding and release」、Biochemistry、３２巻：８６５４〜８６６０頁）。

自然は、ＦｃＲｎに示差的に結合するＦｃ構造物をもたらしたが、ＦｃＲｎへのより緊密な結合および（おそらく）より長い血清半減期を結果としてもたらすＦｃ構造物をデザインするためのＦｃ操作（Ｆｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）の科学が生じた。本明細書で総説するには多数に過ぎる、多くのこのような構造物がデザインされ、試験されたが、成功の度合いは様々であった。免疫グロブリン定常領域配列を変異させて、ＦｃＲｎへの結合特徴を改変することにより、抗体のリサイクリングを促進することには、長く、変化にとんだ歴史がある。今日まで、変異を同定しようとする、全てではないにせよ大半の試みは、ＦｃＲｎへの結合またはＦｃＲｎとの相互作用において極めて重要であると考えられる残基、すなわち、その改変がＦｃのＦｃＲｎに対する親和性に影響を及ぼす残基に焦点を当てている。

しかし、ＦｃのＦｃＲｎへの結合は、それ自体複雑なことがらである。異なる種類の治療抗体（ヒト化、キメラ、およびマウス）、そして、種類内の治療抗体（例えば、異なるヒト化抗体を互いと比較する場合、ＩｇＧ１アイソタイプ抗体を互いと比較する場合など）でもなお、ＦｃＲｎに対して、約２倍ほど変動する解離定数を示す（例えば、Suzuki, T.ら（２０１０年）、「Importance of Neonatal FcR in Regulating the Serum Half-Life of Therapeutic Proteins Containing the Fc Domain of Human IgG1: A Comparative Study of the Affinity of Monoclonal Antibodies and Fc-Fusion Proteins to Human Neonatal FcR」、J. Immunol.、１８４巻：１９６８〜１９７６頁を参照されたい）。この観察は、定常領域の一次構造で全ての薬物動態挙動を説明することはできないという推論を可能とする。他の研究者らは、抗体の全等電点（ｐＩ）が、定常領域の一次構造を一定に保ちながら、血清半減期の重要な決定因子である（おそらく性状不明のＦｃＲｎに依存しない機構を介して）ことを仮定している（Igawa, T.ら（２０１０年）、「Reduced elimination of IgG antibodies by engineering the variable region」、Protein Engineering, Design & Selection、２３巻（５号）：３８５〜３９２頁）。この視点によれば、抗体のｐＩが低下するほど、ＦｃＲｎへの結合はより緊密となる（同上文献）。少なくとも１つのＩｇＧ４アイソタイプ抗体について、ｐＩの９．２から７．２への変化は、半減期の２．４倍の延長およびクリアランスの４．４倍の低減と相関し（同上文献）、これは、重鎖可変領域および軽鎖可変領域の両方における残基も一緒に改変することによる、ｐＩの非特異的な低下も、薬物動態挙動に有意に影響を及ぼし得るという推論と符合する。この報告では、残基の改変は、いかなる特定のパターンにも従わず、いかなる残基もヒスチジンへと置換しなかったが、軽鎖ＣＤＲ２における少なくとも１つの残基は、ヒスチジン残基からグルタミン酸残基に変化させた（同上文献、図５、３９０頁）。さらに、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＦｃＲｎへの結合とｉｎ ｖｉｖｏにおける薬物動態とを比較すると、奇妙な逆説が生じる。Ｆｃ領域に複数の置換を有する、少なくとも１つの臨床的に重要なＩｇＧ１抗体であって、ＦｃＲｎと相互作用するＩｇＧ１抗体では、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＦｃＲｎへの結合は、ｉｎ ｖｉｖｏにおける薬物動態挙動と相関しなかった（Petkova, S.B.ら（２００６年）、「Enahanced half-life of genetically engineered human IgG1 antibodies in a humanized FcRn mouse model: potential application in humorally mediated autoimmune disease」、Int’l Immunol.、１８巻（１２号）：１７５９〜１７６９頁を参照されたい）。最後に、形質膜と融合したときの、ＦｃリガンドのＦｃＲｎからの放出は、未知の機構による２相（短時間相および長時間相）で生じるようである（Ober, R.J.ら（２００４年）、「Exocytosis of IgG as mediated by the receptor FcRn: an analysis at the single-molecule level」、Proc. Natl Acad. Sci. USA、１０１巻：１１０７６〜１１０８１頁を参照されたい）。

最後に、血清中の抗体半減期の延長は、抗体療法の有効性を増強する１つの方途である。２つまたは３つまたはそれより多くの標的分子に結合し、これらを消失させる同じ抗体または可変ドメインの有効性の改善、またはアベイラビリティーの改善は、標的抗原に影響を及ぼすＦｃＲｎへの結合および代謝回転の改善により必ずしも対処するわけではない。ＦｃのＦｃＲｎへの親和性を増大させる改変は、代謝回転を増大させ、したがって、治療抗体の薬物動態を改善することが期待される。抗原−抗体複合体がＦｃＲｎに緊密に結合する結果として、抗原−抗体複合体は、リソソーム経路により分解されるのではなく、細胞外腔へとサイクリングにより戻される。しかし、この情況では、抗原または標的は大部分、抗体との複合体化を維持し、抗体と一緒に細胞外腔へとリサイクルされる。治療抗体にとって、この現象は、全く望ましくないものであり得る。

しかし、抗原とのそれらの相互作用がｐＨ依存性である抗体、すなわち、エンドソームのｐＨでは、抗原に低い親和性で結合するように工学的に作製された抗体であれば、エンドソームコンパートメントにおいて抗原−抗体複合体の不安定性に起因して、ＦｃＲｎ依存的な様式で抗原をリサイクルすることもないことになる。これは、エンドソームの酸性環境では、抗原は抗体−ＦｃＲｎ複合体から離脱し、抗体に結合したＦｃＲｎが細胞の表面へとリサイクルされる一方で、脱離した遊離抗原はリソソーム分解経路へとシャトリングされるためである。このようにして、ｐＨ依存性の抗原結合は、ＦｃＲｎを媒介するサイクリングの状況では、サイクリングした抗体を遊離させて抗原に結合させ、ＦｃＲｎに結合させ、エンドソームを介してサイクルさせ、細胞外腔に戻し、より多くの抗原に結合させ、より多くの抗原をリソソーム分解経路へとシャトリングさせることにより、有効性および／または薬物動態の増強をもたらし得る（しかし、Ｆｃ−ＦｃＲｎ間相互作用には直接依存しない）。

エンドソームのｐＨでは、リガンドは、それらの受容体から高頻度で解離するという観察を活用することにより、毒素を細胞へと移入させ、エンドソームにおいて毒素を放出するする目的で、特定の細胞を標的とする、ある種の特異的な多機能性分子を作製するために、エンドソームのｐＨでは、抗原を効果的に放出する抗体を探索することが示唆された（例えば、米国特許第５，５９９，９０８号および米国特許第５，６０３，９３１号を参照されたい）。しかし、これは、抗原−抗体サイクリング、特に、ヒト治療剤のための抗原−抗体サイクリングに対処するものではない。

抗原−ＦｃＲｎ複合体のＦｃＲｎ依存性サイクリングを維持しながら、エンドソームで脱離させた抗原を、リソソーム経路を介してシャトリングするために抗体の構造を活用する目的で、ｐＨ依存性の抗原結合へのある種の手法が探索されている。このような手法は、残基をヒスチジンで置換し、ヒスチジン置きかえの一般化された手法が、所望されるｐＨ依存性の抗原結合を有する抗体をもたらすのかどうかを確かめるために試験するための、可変領域にわたる一般化されたヒスチジンスキャニング（例えば、Igawa, T.ら（２０１０年）、「Antibody recycling by engineered pH-dependent antigen binding improves the duration of antigen neutralization」、Nature Biotech.、２８巻（１１号）：１２０３〜１２０８頁を参照されたい；米国特許出願公開第２０１１／０１１１４０６Ａ１号もまた参照されたい）を含む。この手法の可能性のある欠点は、抗原結合に重要な残基の改変が、酸性ｐＨでも中性ｐＨでも、結合を破壊し、これにより、エンドソームコンパートメントと細胞外腔との間のｐＨ差に起因するいかなる効力も消失させ得る可能性があることである。

様々な態様では、抗体可変領域（重鎖可変ドメインおよび／または軽鎖可変ドメイン）におけるいくつかの熟慮により選択された領域において１カ所または複数カ所のヒスチジン置換を施すための組成物および方法が提供され、標的抗原にｐＨ依存的な様式で結合する抗体可変ドメイン、例えば、中性ｐＨもしくは塩基性ｐＨまたは細胞外ｐＨでは、目的の抗原に、第一の親和性で結合するが、酸性ｐＨでは、同じ目的の抗原に、第二の親和性で結合し、ここで、第一の親和性は高く、第二の親和性は低い可変ドメインを作製するための方法も提供される。

様々な態様では、１カ所または複数カ所のヒスチジン置換は、ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列、ＣＤＲ３配列、Ｎ末端配列、および／またはループ４配列においてである。

いくつかの態様では、１カ所または複数カ所のヒスチジン置換は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３においてである。

いくつかの態様では、１カ所または複数カ所のヒスチジン置換は、ＣＤＲ３配列およびループ４配列においてである。さらなる実施形態では、置換はまた、Ｎ末端配列においてである。

いくつかの態様では、１カ所または複数カ所のヒスチジン置換は、ＣＤＲ３配列およびＮ末端配列においてである。さらなる実施形態では、置換はまた、ループ４配列においてである。

いくつかの態様では、１カ所または複数カ所のヒスチジン置換は、ＣＤＲ２配列およびループ４配列においてである。さらなる実施形態では、置換はまた、Ｎ末端配列においてである。

いくつかの態様では、ループ４配列は、λ軽鎖可変ドメインでは、残基８３〜８８であり、κ軽鎖可変ドメインでは、残基８３〜８８であり、重鎖可変領域では８２〜８８（ＩＭＧＴ番号付け）である。

いくつかの態様では、軽鎖可変ドメインまたは重鎖可変ドメインのＮ末端配列は、残基１〜２６（ＩＭＧＴ番号付け）である。一実施形態では、１カ所または複数カ所の（例えば、クラスター化された）ヒスチジン置換を含むＮ末端配列は、残基１〜５であり、一実施形態では、残基１〜１０であり、一実施形態では、１〜１５であり、一実施形態では、１〜２０であり、一実施形態では、１〜２５であり、一実施形態では、５〜１０であり、一実施形態では、１０〜１５であり、一実施形態では、１５〜２０であり、一実施形態では、２０〜２５であり、一実施形態では、５〜１５であり、一実施形態では、１０〜２０であり、一実施形態では、５〜２０である。一実施形態では、ヒスチジン置換は、２カ所以上（例えば、３カ所、４カ所、５カ所、または６カ所以上）であり、ヒスチジン置換のうちの少なくとも２カ所以上は、約３残基、４残基、５残基、または６残基以上のＮ末端配列のストレッチ内で施す。一実施形態では、複数カ所のヒスチジン置換をＮ末端において施し、ヒスチジン置換は、少なくとも２カ所、少なくとも３カ所、または少なくとも４カ所のヒスチジン置換のクラスターを含む。一実施形態では、ヒスチジン置換の少なくとも１つのクラスターは、１つまたは複数の非ヒスチジン置換で隔てられたヒスチジン置換を含む。

いくつかの態様では、ＣＤＲにおける１カ所または複数カ所のヒスチジン置換は、ＣＤＲにおける２カ所、３カ所、４カ所、５カ所、または６カ所の置換である。一実施形態では、中性ｐＨにおける結合にそれほど重要でないＣＤＲにおける全ての残基をヒスチジンで置換する。一実施形態では、２カ所、３カ所、４カ所、５カ所、または６カ所の置換は連続的であり；一実施形態では、２カ所、３カ所、４カ所、５カ所、または６カ所の置換のうちの１カ所または複数カ所はクラスターで存在し、クラスターは少なくとも１つの非ヒスチジン残基を含み；一実施形態では、クラスターは２つの非ヒスチジン残基を含み；一実施形態では、クラスターは３つの非ヒスチジン残基を含み；一実施形態では、クラスターは４つの非ヒスチジン残基を含む。

いくつかの態様では、Ｎ末端における１カ所または複数カ所のヒスチジン置換は、１カ所、２カ所、３カ所、４カ所、５カ所、または６カ所の置換である。一実施形態では、中性ｐＨにおける抗原結合を低減しない（例えば、１％超、２％超、３％超、４％超、または５％超）Ｎ末端における全ての残基をヒスチジンで置換する。一実施形態では、２カ所、３カ所、４カ所、５カ所、または６カ所の置換は連続的であり；一実施形態では、２カ所、３カ所、４カ所、５カ所、または６カ所の置換のうちの１カ所または複数カ所はクラスターで存在し、クラスターは少なくとも１つの非ヒスチジン残基を含み；一実施形態では、クラスターは２つの非ヒスチジン残基を含み；一実施形態では、クラスターは３つの非ヒスチジン残基を含み；一実施形態では、クラスターは４つの非ヒスチジン残基を含む。

いくつかの態様では、方法は、可変ドメインを、ヒスチジン置換のクラスター（例えば、本明細書で記載される通り、連続的であるか、または１つまたは複数の非ヒスチジン残基で中断された）を、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、Ｎ末端、ループ４、およびこれらの組合せから選択される領域に含むように改変するステップを含む。いくつかの態様では、クラスターとは、上流で第一のヒスチジン残基が結合し、下流で第二のヒスチジン残基が結合した配列であり、第一のヒスチジン残基と第二のヒスチジン残基との間に１つまたは複数の残基を含む。一実施形態では、第一のヒスチジン残基と第二のヒスチジン残基との間の１つまたは複数の残基は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つ以上の非ヒスチジン残基である。一実施形態では、第一のヒスチジン残基と第二のヒスチジン残基との間の１つまたは複数の残基は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのヒスチジン残基である。一実施形態では、クラスターは、３つの残基であり、一実施形態では、４つの残基であり、一実施形態では、５つの残基であり、一実施形態では、６つの残基であり、一実施形態では、７つの残基であり、一実施形態では、８つ以上の残基である。

様々な態様では、方法は、抗原への結合（例えば、中性ｐＨ、例えば、ｐＨ７〜７．４、例えば、ｐＨ７．２、例えば、細胞外ｐＨにおける）に極めて重要な抗体可変ドメイン（重鎖および／または軽鎖）における配列を同定するステップと、配列内の１つまたは複数の残基をヒスチジンへと置換するステップとを含み、ここで、ヒスチジンへの置換は、中性ｐＨにおける可変ドメインの標的抗原への結合を消失させない。様々な態様では、中性ｐＨにおける結合にそれほど重要でない２つ以上、３つ以上、４つ以上、または５つ以上の残基のクラスターを、ヒスチジン残基で置換する。様々な態様では、ヒスチジン残基のクラスターは、ＣＤＲ内、ループ４内、Ｎ末端内、またはこれらの組合せ内にある。

様々な態様では、結合に極めて重要な残基を、ほぼ中性の（または細胞外）ｐＨで、代わりのアミノ酸で置換すると、可変ドメインの結合を、一実施形態では、少なくとも５％、一実施形態では、少なくとも１０％、一実施形態では、少なくとも２０％、一実施形態では、少なくとも３０％、一実施形態では、少なくとも４０％、一実施形態では、少なくとも５０％、一実施形態では、少なくとも６０％、一実施形態では、少なくとも７０％、一実施形態では、少なくとも８０％、一実施形態では、少なくとも９０％低減し、一実施形態では、検出可能な結合を結果としてもたらさない残基として同定する。一実施形態では、代わりのアミノ酸はヒスチジンである。一実施形態では、代わりのアミノ酸はアラニンである。

一態様では、酸性ｐＨでは、抗原に、中性ｐＨまたは塩基性ｐＨにおいて同じ抗原に結合するより弱く結合する抗体可変ドメインを作製するための方法であって、可変領域の１つまたは複数のアミノ酸残基を、１つまたは複数のヒスチジン残基で置換するステップを含む方法が提供される。一実施形態では、酸性ｐＨにおける結合は、無視できる程度であるかまたはゼロである。

一実施形態では、置換される１つまたは複数のアミノ酸残基は軽鎖にある。具体的な実施形態では、１つまたは複数の残基は軽鎖のＮ末端領域にある。具体的な実施形態では、Ｎ末端残基は、１〜２６、１〜２０、１〜１５、１〜１０、１〜６、または１〜５（ＩＭＧＴ番号付け）から選択される。一実施形態では、１つまたは複数の残基はループ３にある。具体的な実施形態では、ループ４残基は、Ｖκ内またはＶλの８３〜８８であり、Ｖ_Ｈの８２〜８８（ＩＭＧＴ番号付け）である。

一実施形態では、１つまたは複数の残基は重鎖にある。具体的な実施形態では、１つまたは複数の残基は重鎖のＮ末端領域にある。具体的な実施形態では、Ｎ末端残基は、１〜２６、１〜２０、１〜１５、１〜１０、１〜６、または１〜５（ＩＭＧＴ番号付け）から選択される。一実施形態では、１つまたは複数の残基はループ４にある。具体的な実施形態では、ループ３残基は、（Ｖκおよび／またはＶλでは）８３、８４、８５、８６、８７、８８、およびこれらの組合せ（ＩＭＧＴ番号付け）；または（Ｖ_Ｈでは）８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、およびこれらの組合せ（ＩＭＧＴ番号付け）；ならびにこれらの組合せから選択される。

一実施形態では、１つまたは複数の残基は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３から選択されるＣＤＲにあり、１つまたは複数の残基は、置換されて（例えば、アラニンまたはヒスチジンで）も、中性ｐＨまたは塩基性ｐＨにおける標的抗原の結合の減少を結果としてもたらさない。具体的な実施形態では、（例えば、アラニン置換またはヒスチジン置換による）置換の結果としての、中性ｐＨまたは塩基性ｐＨにおける標的抗原の結合の減少は、置換されていない可変ドメインと比較して５％以下、１０％以下、１５％以下、または２０％以下、２５％以下、または３０％以下である。

いくつかの態様では、標的抗原と複合体化した、ｈｉｓで改変した可変ドメインは、高ｐＨ（例えば、細胞外ｐＨ、またはｐＨ７〜７．４、例えば、ｐＨ７．２）では、少なくとも約２０分間の半減期を示し、エンドソームのｐＨ、または例えば、ｐＨ５〜６、例えば、ｐＨ５．７５のｐＨでは、５分間未満、４分間未満、３分間未満、２分間未満、または１分間未満の半減期を示す。一実施形態では、標的抗原と複合体化した、ｈｉｓで改変した可変ドメインは、高ｐＨでは、少なくとも約２０分間の半減期を示し、エンドソームのｐＨでは、６０秒間未満、３０秒間未満、１０秒間未満、５秒間未満、４秒間未満、３秒間未満、または２秒間未満の半減期を示す。一実施形態では、標的抗原と複合体化した、ｈｉｓで改変した可変ドメインは、高ｐＨ（例えば、ｐＨ７〜７．４、例えば、ｐＨ７．２）では、少なくとも約２０分間の半減期を示し、エンドソームのｐＨでは、約１秒間未満、０．５秒間未満、０．１秒間未満、または０．０５秒間未満の半減期を示す。一実施形態では、標的抗原と複合体化した、ｈｉｓで改変した可変ドメインを、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）チップの表面上において、中性ｐＨまたは高ｐＨで平衡化し、エンドソームのｐＨ（または、例えば、ｐＨ５〜６、例えば、ｐＨ５．７５）の緩衝液を複合体上に流す、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）アッセイを使用して、エンドソームのｐＨにおける半減期を測定する。

様々な態様では、細胞外ｐＨでは第一の親和性で標的抗原に結合し、エンドソームのｐＨでは標的抗原に結合しないかまたは標的抗原に第二の親和性で結合する抗体可変ドメインを作製するための方法であって、第一の親和性が、第二の親和性の約１０、１０^２、１０^３、１０^４、１０^５、１０^６、１０^７、１０^８、１０^９、１０^１０、１０^１１、または１０^１２倍である（またはこれらを超える）方法。いくつかの態様では、第一の親和性はピコモル濃度〜ナノモル濃度の範囲にあり（例えば、Ｋ_Ｄは、１０^−１２〜１０^−９であり）、第二の親和性はマイクロモル濃度以上の範囲（例えば、Ｋ_Ｄ＝１０^−６以上、例えば、１０^−５、１０^−４、１０^−３、１０^−２、１０^−１、１以上）である。いくつかの態様では、第一の親和性は約Ｋ_Ｄ１０^−９〜約Ｋ_Ｄ１０^−１２の範囲にあり、第二の親和性は約Ｋ_Ｄ１０^−３〜約１以上の範囲にある。一実施形態では、第一の親和性は約Ｋ_Ｄ１０^−９〜約Ｋ_Ｄ１０^−１２の範囲にあり、第二の親和性はＫ_Ｄ＞１を特徴とし；具体的な実施形態では、第二の親和性はＫ_Ｄ＞＞１（例えば、１０、１０^２、１０^３以上）を特徴とする。具体的な実施形態では、第一の親和性は約１０^−９〜約１０^−１２のＫ_Ｄを特徴とし、第二の親和性は、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）結合アッセイにおいて、バックグラウンドを超えて結合を検出することが不可能なことを特徴とする。

様々な態様を特定の事例で例示するが、そこでは、ヒト軽鎖可変配列を、軽鎖ＣＤＲ３において、クラスターを含め、１つまたは複数のヒスチジンを含有するように改変し、軽鎖を、同種のヒト重鎖を有するＣＨＯ細胞内で発現させる。軽鎖可変ドメインの特定の配列は重要でないので、ヒスチジン改変された抗体が結合する抗原の同定（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）は重要ではない。実施例で例示される原理は、ＣＤＲ３、ＣＤＲ２、ＣＤＲ１、Ｎ末端領域、またはループ４に適用可能である。例えば、列挙される領域における残基は、単独または例えば、２つ、３つ、４つ、または５つのクラスターのヒスチジンで置換し、結果として得られる抗体をｐＨ依存性の抗原結合について試験することができる。

抗原にｐＨ依存的な様式で結合することが可能な抗体を工学的に作製するための方法は、記載される軽鎖の配列（例えば、ＣＤＲ３、ＣＤＲ２、ＣＤＲ１、ループ４、Ｎ末端における配列）に沿った１つまたは複数の位置において、免疫グロブリン軽鎖可変領域の改変を施すことにより作製することができる。ヒスチジンは、ＣＤＲ領域で忍容され、軽鎖は、可変領域配列に沿って体細胞超変異を典型的に示し、場合によって、このような変異は、ＣＤＲにおけるヒスチジン残基による置換を結果としてもたらし得る（図１５）。

実施例では、中性ｐＨにおける標的抗原の結合にそれほど重要でない残基である、軽鎖ＣＤＲ３領域の１つ〜４つの位置において、ヒスチジン置換を同定し、これにより、１５の変異体構築物を作製した。示される特定の軽鎖（様々な異なるが同種の重鎖を有する）は、単一のＶκセグメントおよび単一のＪκセグメント（Ｖκ１−３９／Ｊκ５）に由来する。このような変異体は、発現させると、抗体（同種の重鎖とともに）に、ｐＨ依存性の抗原結合の特性を付与する。抗原特異的な抗体可変ドメインを使用して変異体構築物を作製し、ほぼ中性のｐＨにおける発現および抗原結合ならびに低ｐＨにおける放出について試験した（「キャッチアンドリリース」）。示されるある種の例では、４つの同定される残基の位置（ヒスチジンへの変異が中性ｐＨにおける結合にそれほど重要でない位置）は、Ｑ１０５Ｈ、Ｑ１０６Ｈ、Ｙ１０８Ｈ、およびＰ１１１Ｈである。異なる標的抗原に結合する抗体、または異なる再構成されたＶ−Ｊ配列を含む抗体では、ｐＨ依存性可変ドメインを作製するためのｈｉｓ変異可能な残基は、どの残基が中性ｐＨにおける結合にそれほど重要でないのかを同定し、次いで、これらの残基（例えば、クラスターにおける）のうちの１つまたは複数を改変し、変異を含む抗体を発現させ、中性ｐＨ（例えば、細胞外ｐＨ）および酸性ｐＨ（例えば、エンドソームのｐＨ）における結合（および／または放出時間、例えば、ｔ_１／２）について試験することにより見出される。本実施例で示されるデータは、Ｖκ１−３９／Ｊκ５軽鎖についてのデータであるが、Ｖκ３−２０／Ｊκ１再構成に由来する軽鎖を含む他の軽鎖も、重鎖と同様、本明細書で記載される手法に適する。

本実験で作製された、ヒスチジンを工学的に作製した（ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）軽鎖構築物の全ては、重鎖と共に良好に発現した。さらに、ｐＨ依存的な様式での抗体の抗原への結合も、同じ細胞表面抗原を特異的に認識する５つの異なる重鎖を有する１５の変異体について、ほぼ中性のｐＨおよび酸性ｐＨにおける抗原の結合を示す、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）アッセイのデータから実証された（図１９Ａ〜Ｊ）。

記載された方法、および本明細書の例および図のうちのあるものにおいて例示を目的として使用された特定の方法は、例えば、ヒスチジンをＣＤＲ３に含むヒト免疫グロブリン可変ドメインによりそれらの標的に結合する、ヒト治療用結合タンパク質を作製するのに使用され得る、抗体の可変領域を生成するのに有用である。治療剤は、細胞表面で標的に結合し、エンドソームへと内部移行し、治療剤がリサイクルされて、さらに別の標的の分子（例えば、別の細胞にまたは同じ細胞に）に結合し得るように、エンドソームにおいて標的からより容易にまたはより迅速に解離するため、低ｐＨにおける結合が変化すれば、状況によっては、より迅速な代謝回転が可能となる。様々な実施形態では、これは、治療剤を低用量で投与するか、または治療剤をそれほど高頻度でなく投与する可能性を結果としてもたらす。これは、安全性または毒性の理由で、高頻度で投与するかまたはある投与量を上回って投与することが所望でない場合には特に有用である。例えば、結果として、被験体の血清中における抗体治療剤の半減期が延長される。

したがって、様々な実施形態では、再構成されたヒト軽鎖をコードする遺伝子におけるコドンを、１０５、１０６、１０８、１１１位、またはこれらの組合せにおいて施すことができる。例えば、１０６、１０８、および１１１位のうちの１つまたは複数とともに１０５位；１０５、１０８、および１１１位のうちの１つまたは複数とともに１０６位；１０５、１０６、および１１１位のうちの１つまたは複数とともに１０８位；１０５、１０６、および１０８位のうちの１つまたは複数とともに１１１位。様々な実施形態には、他の軽鎖（すなわち、他のＶ−Ｊ再構成に由来する）における対応する位置も含める。

ヒスチジン残基を含む免疫グロブリン重鎖可変ドメインを発現する非ヒト動物
記載される本発明は、ｐＨ依存性の抗原結合性特徴を有する抗原結合タンパク質を産生しうる、遺伝子改変された非ヒト動物を提供する。様々な実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された非ヒト動物により産生される抗原結合タンパク質は、ｐＨ依存性のリサイクリング効率の増大および／または血清半減期の延長を示す。特に、記載される本発明は、免疫グロブリン重鎖遺伝子座における遺伝子改変を使用して、ヒスチジンコドンをヒト重鎖可変領域のヌクレオチド配列へと導入し、必要に応じて、Ｃ_Ｈ２ドメインおよび／またはＣ_Ｈ３ドメインをコードする定常領域のヌクレオチド配列に、抗体定常領域のＦｃＲｎ受容体への結合を増大させる変異（複数可）を導入し、これにより、抗原結合タンパク質のリサイクリングを容易とする。酸性の細胞内コンパートメント内で（例えば、ｐＨが、約５．５〜約６．０の範囲であるエンドソーム内で）は、抗原結合部位にあるプロトン化されたヒスチジン残基に起因して、改変を含む抗原結合タンパク質は、その標的への結合が、細胞外環境または細胞表面における（すなわち、生理学的ｐＨ、例えば、約７．０〜約７．４の範囲のｐＨにおける）場合より緩くなり得る。したがって、本明細書に記載されている遺伝子改変を含む抗原結合タンパク質であれば、標的介在性エンドサイトーシスに続き、このような遺伝子改変を含まない野生型の抗原結合タンパク質より、迅速または効率的にリサイクルすることが可能である。さらに、改変されたヒスチジン残基は、酸性環境だけにおいてプロトン化され、中性ｐＨではプロトン化されないので、このような改変であれば、生理学的ｐＨにおける抗原結合タンパク質の目的の抗原に対する結合親和性および／または特異性に影響を及ぼさないと予測される。

様々な態様では、再構成されていないヒト重鎖可変領域のヌクレオチド配列を含む免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含む非ヒト動物であって、再構成されていないヒト重鎖可変領域のヌクレオチド配列が、少なくとも１つのヒスチジンコドンの付加または少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む非ヒト動物が提供される。

様々な態様では、非ヒト動物を作製し、用いる方法もまた、提供される。目的の抗原で免疫すると、遺伝子改変された非ヒト動物は、ヒスチジン残基を有する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質を産生するＢ細胞集団であって、抗原結合タンパク質が、ｐＨ依存性リサイクリングの増強および／または血清半減期の延長を示すＢ細胞集団を生成することが可能である。様々な実施形態では、非ヒト動物は、ヒト重鎖可変ドメインを同系のヒト軽鎖可変ドメインと共よって発現するＢ細胞集団を生成する。様々な実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座は、非ヒト動物の生殖細胞系列ゲノムに存在する。

様々な実施形態では、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座は、全てまたは実質的に全ての、内因性のＶ_Ｈ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、およびＪ_Ｈ遺伝子セグメントを、欠失させるかまたは非機能性にする改変を含み、遺伝子改変された遺伝子座は、１つまたは複数のヒスチジンコドンを有する、１つまたは複数のヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメント、ヒトＤ遺伝子セグメント、および／またはヒトＪ_Ｈ遺伝子セグメントを含む、再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列を含み、ここで、再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、内因性位置に存在する（すなわち、ヌクレオチド配列が野生型の非ヒト動物にある場合）か、または異所性に存在する（例えば、そのゲノムにおける内因性免疫グロブリン鎖の遺伝子座と異なる遺伝子座に存在する、またはその内因性の遺伝子座内に、例えば、免疫グロブリン可変遺伝子座内に存在し、ここで、該内因性の遺伝子座は、ゲノムにおける異なる位置に配置されるか、またはゲノムにおける異なる位置へと移動している）。一実施形態では、全ての内因性重鎖のＶ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、またはＪ遺伝子セグメントのうちの、例えば、約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、約９６％以上、約９７％以上、約９８％以上、または約９９％以上を、欠失させるか、または非機能性にする。一実施形態では、内因性機能的重鎖のＶ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、またはＪ遺伝子セグメントのうちの、例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を、欠失させるか、または非機能性にする。

一実施形態では、非ヒト動物は、哺乳動物である。本明細書では、ヒスチジンコドンをマウスにおける再構成されていないヒト重鎖可変遺伝子配列へと導入することを対象とする実施形態について広範に論じるが、少なくとも１つのヒスチジンコドンの付加または少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む、再構成されていないヒト重鎖可変領域のヌクレオチド配列を含有する遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座を含む他の非ヒト動物もまた提供される。このような非ヒト動物は、本明細書で開示される、ヒスチジンを含有する重鎖可変ドメインを発現するように遺伝子改変されうる、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ウシ（例えば、雌牛、雄牛、野牛）、シカ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、ネコ、イヌ、フェレット、霊長動物（例えば、マーモセット、アカゲザル）などを含む、非ヒト動物のうちのいずれかを含む。例えば、好適な遺伝子改変可能なＥＳ細胞が容易に利用可能でない非ヒト動物には、他の方法を用いて、遺伝子改変を含む非ヒト動物を作製する。このような方法は、例えば、非ＥＳ細胞ゲノム（例えば、線維芽細胞または人工多能性細胞）を改変すること、体細胞核移植（ＳＣＮＴ）を用いて、遺伝子改変されたゲノムを、好適な細胞、例えば、除核卵母細胞へと移植すること、改変された細胞（例えば、改変卵母細胞）を、胚を形成するのに好適な条件下で、非ヒト動物に懐胎させることを含む。非ヒト動物ゲノム（例えば、ブタ、雌牛、齧歯動物、ニワトリなどのゲノム）を改変するための方法は、例えば、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）または転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）を用いて、コードするヌクレオチド配列を含むようにゲノムを改変することを含む。

一実施形態では、非ヒト動物は、小型の哺乳動物、例えば、Ｄｉｐｏｄｏｉｄｅａ上科またはＭｕｒｏｉｄｅａ上科の動物である。一実施形態では、遺伝子改変された動物は、齧歯動物である。一実施形態では、齧歯動物は、マウス、ラット、およびハムスターから選択される。一実施形態では、齧歯動物は、Ｍｕｒｏｉｄｅａ上科から選択される。一実施形態では、遺伝子改変された動物は、Ｃａｌｏｍｙｓｃｉｄａｅ科（例えば、マウス様ハムスター）、Ｃｒｉｃｅｔｉｄａｅ科（例えば、ハムスター、新世界ラット、およびマウス、ハタネズミ）、Ｍｕｒｉｄａｅ科（真性（ｔｒｕｅ）マウスおよびラット、アレチネズミ、トゲネズミ、タテガミネズミ）、Ｎｅｓｏｍｙｉｄａｅ科（キノボリネズミ、イワネズミ、オジロキヌゲネズミ（ｗｉｔｈ−ｔａｉｌｅｄ ｒａｔ）、マダカスカルラットおよびマダカスカルマウス）、Ｐｌａｔａｃａｎｔｈｏｍｙｉｄａｅ科（例えば、トゲヤマネ）、およびＳｐａｌａｃｉｄａｅ科（例えば、デバネズミ（ｍｏｌｅ ｒａｔｅｓ）、タケネズミ、およびモグラネズミ）から選択される科由来の動物である。具体的な実施形態では、遺伝子改変された齧歯動物は、真性マウスまたはラット（Ｍｕｒｉｄａｅ科）、アレチネズミ、トゲネズミ、およびタテガミネズミから選択される。一実施形態では、遺伝子改変されたマウスは、Ｍｕｒｉｄａｅ科のメンバー由来のマウスである。一実施形態では、動物は、齧歯動物である。具体的な実施形態では、齧歯動物は、マウスおよびラットから選択される。一実施形態では、非ヒト動物は、マウスである。

一実施形態では、非ヒト動物は、Ｃ５７ＢＬ／Ａ、Ｃ５７ＢＬ／Ａｎ、Ｃ５７ＢＬ／ＧｒＦａ、Ｃ５７ＢＬ／ＫａＬｗＮ、Ｃ５７ＢＬ／６、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、Ｃ５７ＢＬ／６ＢｙＪ、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ、Ｃ５７ＢＬ／６ＮＪ、Ｃ５７ＢＬ／１０、Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｃＳｎ、Ｃ５７ＢＬ／１０Ｃｒ、およびＣ５７ＢＬ／Ｏｌａから選択されるＣ５７ＢＬ系統のマウスである齧歯動物である。別の実施形態では、マウスは、１２９系統である。一実施形態では、１２９系統は、１２９Ｐ１、１２９Ｐ２、１２９Ｐ３、１２９Ｘ１、１２９Ｓ１（例えば、１２９Ｓ１／ＳＶ、１２９Ｓ１／ＳｖＩｍ）、１２９Ｓ２、１２９Ｓ４、１２９Ｓ５、１２９Ｓ９／ＳｖＥｖＨ、１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）、１２９Ｓ７、１２９Ｓ８、１２９Ｔ１、１２９Ｔ２からなる群から選択される（例えば、Festingら（１９９９年）、「Revised nomenclature for strain 129 mice, Mammalian Genome」、１０巻：８３６頁を参照されたい; Auerbachら（２０００年）、「Establishment and Chimera Analysis of 129/SvEv- and C57BL/6-Derived Mouse Embryonic Stem Cell Lines」もまた参照されたい）。一実施形態では、遺伝子改変されたマウスは、前述の１２９系統と前述のＣ５７ＢＬ系統（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６系統）とのミックスである。別の実施形態では、マウスは、前述の１２９系統のミックスまたは前述のＣ５７ＢＬ／６系統のミックスである。一実施形態では、ミックスの１２９系統は、１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）系統である。別の実施形態では、マウスは、１２９／ＳｖＥｖに由来する系統とＣ５７ＢＬ／６に由来する系統とのミックスである。具体的な実施形態では、マウスは、Auerbachら、２０００年、BioTechniques、２９巻：１０２４〜１０３２頁において記載されている、１２９／ＳｖＥｖに由来する系統とＣ５７ＢＬ／６に由来する系統とのミックスである。別の実施形態では、マウスは、ＢＡＬＢ系統、例えば、ＢＡＬＢ／ｃ系統である。別の実施形態では、マウスは、ＢＡＬＢ系統（例えば、ＢＡＬＢ／ｃ系統）と別の前述の系統とのミックスである。

一実施形態では、非ヒト動物は、ラットである。一実施形態では、ラットは、Ｗｉｓｔａｒラット、ＬＥＡ系統、Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ系統、Ｆｉｓｃｈｅｒ系統、Ｆ３４４、Ｆ６、およびＤａｒｋ Ａｇｏｕｔｉから選択される。一実施形態では、ラット系統は、Ｗｉｓｔａｒ、ＬＥＡ、Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ、Ｆｉｓｃｈｅｒ、Ｆ３４４、Ｆ６、およびＤａｒｋ Ａｇｏｕｔｉからなる群から選択される系統のうちの２つ以上のミックスである。

一実施形態では、非ヒト動物は、マウスである。一実施形態では、マウスは、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ヒト化マウスである。

内因性のマウス遺伝子座における、マウス免疫グロブリン可変領域の、ヒト免疫グロブリン可変領域による正確な置きかえを含有するＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ヒト化マウス（例えば、ＵＳ６，５９６，５４１、ＵＳ７，１０５，３４８、およびＵＳ２０１２０３２２１０８Ａ１を参照されたい）は、Ｂ細胞の発生に関して、野生型マウスとの驚くべき顕著な類似性を提示する。ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ヒト化マウスは、１つの重要な点だけで野生型マウスと異なり（免疫に応答して生成される可変領域は、完全にヒト可変領域である）、免疫に対する本質的に正常な野生型応答を提示する。

ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ヒト化マウスは、内因性の遺伝子座における、マウス免疫グロブリン重鎖（ＩｇＨ）およびマウス免疫グロブリン軽鎖（例えば、κ軽鎖、Ｉｇκ）の生殖細胞系列可変領域のヌクレオチド配列の、対応するヒト免疫グロブリン可変領域のヌクレオチド配列による正確で大スケールの置きかえを含有する（例えば、ＵＳ６，５９６，５４１、ＵＳ７，１０５，３４８、およびＵＳ２０１２０３２２１０８Ａ１を参照されたい）。合計で、約６メガ塩基（ｍｅｇａｂａｓｅ）のマウス遺伝子座を、約１．５メガ塩基のヒトゲノム配列で置きかえる。この正確な置きかえにより、ヒト可変領域およびマウス定常領域を有する重鎖および軽鎖を作製するハイブリッド免疫グロブリン遺伝子座を有するマウスが結果としてもたらされる。マウスＶ_Ｈ−Ｄ−Ｊ_ＨセグメントおよびＶκ−Ｊκセグメントの正確な置きかえは、ハイブリッド免疫グロブリン遺伝子座におけるフランキングマウス配列を無傷かつ機能的のままとする。マウスの体液性免疫系は、野生型マウスの体液性免疫系と同様に機能する。いかなる重要な点でも、Ｂ細胞発生は妨げられず、抗原チャレンジされると、マウスにおいて、ヒト可変領域の豊かな多様性が生成される。

重鎖およびκ軽鎖の免疫グロブリン遺伝子セグメントは、ヒトおよびマウスにおいて同様に再構成されるために、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ヒト化マウスが可能であるが、これは、それらの遺伝子座が同じということでも、ほぼ同じということでさえない（明らかに同じではない）。しかし、遺伝子座は、重鎖可変遺伝子の遺伝子座のヒト化を、全てのＶ_Ｈ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、およびＪ_Ｈ遺伝子セグメントを含有する、約３百万塩基対の連続的なマウス配列を、ヒト免疫グロブリン遺伝子座からの基本的に同等な配列を網羅する約百万塩基の連続的なヒトゲノム配列で置きかえることにより達成するのに十分な程度類似する。

いくつかの実施形態では、ある特定のマウス定常領域のヌクレオチド配列の、ヒト定常領域のヌクレオチド配列によるさらなる置きかえ（例えば、マウス重鎖Ｃ_Ｈ１ヌクレオチド配列のヒト重鎖Ｃ_Ｈ１ヌクレオチド配列による置きかえ、およびマウス軽鎖定常領域のヌクレオチド配列の、ヒト軽鎖定常領域のヌクレオチド配列による置きかえ）により、例えば、完全ヒト抗体断片、例えば、完全ヒトＦａｂ’を作製するのに好適な、ヒト可変領域および部分ヒト定常領域を有する抗体を作製する、ハイブリッド免疫グロブリン遺伝子座を有するマウスが結果としてもたらされる。ハイブリッド免疫グロブリン遺伝子座を有するマウスは、正常な可変遺伝子セグメントの再構成、正常な体細胞超変異頻度、および正常なクラススイッチングを示す。これらのマウスは、野生型マウスと識別不可能な体液性免疫系を示し、Ｂ細胞発生の全ての段階で正常な細胞集団および正常なリンパ器官構造を提示する（マウスがヒト可変領域ヌクレオチドセグメントの完全なレパートリーを欠く場合であっても）。これらのマウスを免疫することにより、多種多様な可変遺伝子セグメントの使用を提示する頑健な体液性応答が結果としてもたらされる。

マウス生殖細胞系列可変領域のヌクレオチド配列の正確な置きかえは、部分ヒト免疫グロブリン遺伝子座を有するマウスを作製することを可能とする。部分ヒト免疫グロブリン遺伝子座は、再構成し、超変異し、および正常にクラススイッチするため、部分ヒト免疫グロブリン遺伝子座は、マウスにおいて、ヒト可変領域を含む抗体を生成する。可変領域をコードするヌクレオチド配列は、同定およびクローニングし、次いで、任意の選り抜きの配列、例えば、特定の使用に好適な任意の免疫グロブリンアイソタイプと融合させる（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ系において）ことから、ヒト配列に完全に由来する抗体または抗原結合タンパク質を結果としてもたらすことができる。

様々な実施形態では、少なくとも１つのヒスチジンコドンは、Ｎ末端領域、ループ４領域、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、またはこれらの組合せをコードする、再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列に存在する。

様々な実施形態では、少なくとも１つのヒスチジンコドンは、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４からなる群から選択されるフレームワーク領域（ＦＲ）をコードする、再構成されていない重鎖可変領域のヌクレオチド配列に存在する。

様々な態様では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、少なくとも１つのコドンが、ヒスチジンコドンで置きかえられたヌクレオチド配列を含む。

様々な態様では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、少なくとも１つの内因性非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む、再構成されていないヒト重鎖可変領域のヌクレオチド配列を含む。

一実施形態では、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上、１０以上、１１以上、１２以上、１３以上、１４以上、１５以上、１６以上、１７以上、１８以上、１９以上、２０以上、２１以上、２２以上、２３以上、２４以上、２５以上、２６以上、２７以上、２８以上、２９以上、３０以上、３１以上、３２以上、３３以上、３４以上、３５以上、３６以上、３７以上、３８以上、３９以上、４０以上、４１以上、４２以上、４３以上、４４以上、４５以上、４６以上、４７以上、４８以上、４９以上、５０以上、５１以上、５２以上、５３以上、５４以上、５５以上、５６以上、５７以上、５８以上、５９以上、６０以上、または６１以上の内因性の非ヒスチジンコドンを、ヒスチジンコドンで置きかえる。

ヒト免疫グロブリンＤ遺伝子セグメントのリーディングフレーム使用についての先行研究は、３つのリーディングフレーム（すなわち、終止リーディングフレーム、疎水性リーディングフレーム、および親水性リーディングフレーム）のうち、終止フレームの用いられる頻度が極めて低いことを示している。明白に、一部の終止フレームは、繰り返し用いられ（ｃｈｅｗｅｄ ｂａｃｋ）、結果として発現する。しかし、終止リーディングフレームは、用いられる頻度が余りに低いので、ヒスチジンコドンを操作する目的では、終止リーディングフレームを用いない方が効率的である。親水性リーディングフレームと疎水性リーディングフレームとのどちらかとなれば、親水性リーディングフレームが好ましいようである。したがって、一実施形態では、１つまたは複数のヒスチジンコドンを含有する（終止フレームまたは疎水性フレームと比較して）ように、ヒトＤ遺伝子セグメントの親水性リーディングフレームを操作する。

当技術分野では、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて変異を導入する方法、例えば、部位指向変異生成の方法が周知である。記載される本発明のいくつかの実施形態では、一緒にライゲーションし戻すための（固有の）制限酵素部位を伴って合成（例えば、化学合成）される、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏで、ヒスチジンで置換したヒトＤ遺伝子セグメントをデザインすることにより（例えば、Ｙコドン、Ｄコドン、およびＮコドンのＨコドンへの変異、例えば、ＣＡＴ、ＣＡＣ）、ヒスチジンコドンを富化する。合成されるＤ遺伝子セグメントは、上流および下流の適切な組換えシグナル配列（ＲＳＳ）を伴って作製される。一実施形態では、互いとライゲーションされると、合成されたヒスチジンで置換したＤ遺伝子セグメントは、ヒトの各Ｄ遺伝子セグメント間で観察される遺伝子間配列を含む。

１つまたは複数のヒスチジンをコードするコドンは、再構成し、かつ／または体細胞超変異すると、ヒスチジンのうちの１つまたは複数が、別のアミノ酸へと変わるように変化しうることが理解される。しかし、これは、非ヒト動物におけるありとあらゆる再構成において、ヒスチジンをコードするありとあらゆるコドンについて生じうるわけではない。このような変化が生じる場合、変化は、一部のＢ細胞で生じうるが、全てのＢ細胞で生じうるわけではなく、一部の重鎖可変配列で生じうるが、全ての重鎖可変配列で生じうるわけではない。

様々な態様では、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座は、ヒト重鎖のＶ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、およびＪ遺伝子セグメントを含み、ヒトＤ遺伝子セグメントのうちの少なくとも１つを、５’側から３’側にかけて、対応する野生型配列に対して反転させており、反転させたヒトＤ遺伝子セグメントの少なくとも１つのリーディングフレームは、ヒスチジンコドンを含む。

様々な実施形態では、ヌクレオチド配列は、１つまたは複数、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上、１０以上、１１以上、１２以上、１３以上、１４以上、１５以上、１６以上、１７以上、１８以上、１９以上、２０以上、２１以上、２２以上、２３以上、２４以上、または２５以上のヒスチジンコドンを含む。

各々３つ〜５つずつのメンバーによる６つのファミリー（１つのファミリー（Ｄ７ファミリー）は、単一のメンバーを有する）に２５の機能性ヒトＤ遺伝子セグメントがある。逆方向リーディングフレーム（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ）の方がより多くのヒスチジンコドンを示すが、ヒトＤ遺伝子セグメントの定方向組み換え（ｄｉｒｅｃｔ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）の方が、反転よりはるかに高頻度である。いくつかのＤ遺伝子セグメントおよびリーディングフレームは、他のＤ遺伝子セグメントおよびリーディングフレームより高頻度で用いられる。全ての機能性Ｄ遺伝子セグメントのための、３つの定方向リーディングフレーム（ｄｉｒｅｃｔ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ）の全ておよび３つの逆配向リーディングフレームの全てを、図１０Ａ〜１０Ｅに提示する。図１０Ａ〜１０Ｅに示される通り、逆方向リーディングフレームには、定方向リーディングフレーム内より多くのヒスチジンコドンがある。より具体的には、逆方向リーディングフレームには、３４のヒスチジンがあるが、定方向リーディングフレームにおけるヒスチジンは４つだけである。加えて、定方向リーディングフレームにおける４つのうち、３つのヒスチジンは、偽遺伝子によりコードされるか、または代替対立遺伝子に存在する。したがって、ヒスチジンコドンを含有するヒト生殖細胞系列のＤ遺伝子セグメントの定方向リーディングフレームは、ただ１つだけであり、さらなるヒスチジンコドンには、おそらく、代替対立遺伝子（おそらく、ヒト集団のサブセットにおける）内で遭遇する。

逆方向Ｄ再構成は、極めてまれである。Ｔｕａｉｌｌｏｎら（J. Immunol.、１５４巻（１２号）：５４５３〜６４６５頁）は、逆方向リーディングフレームの使用（限界希釈ＰＣＴにより測定される場合の）が、極めてまれである、すなわち、定方向再構成の間接再構成（ｉｎｄｉｒｅｃｔ ａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）に対する比は、大半の場合において、１００〜１０００であることを示した。定方向再構成の間接再構成に対する比が低い程度に応じて、それは、極めて低度の使用を示すＤセグメントだけにおいて観察された。Ｊ１に隣接して（他のＤファミリーメンバーよりはるかに下流に）位置するＤ遺伝子セグメントのファミリー７が、大半は胎児で用いられ、成人では低度の使用を呈示することもまた示された（Schroederら、Immunology、３０巻、２００６年、１１９〜１３５頁）。したがって、一実施形態では、Ｄファミリー７の配列は、５’側から３’側にかけて逆方向ではない。

一実施形態では、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、または全てもしくは実質的に全てのヒト機能性Ｄ遺伝子セグメントは、５’側から３’側にかけて、対応する野生型配列に対して逆方向である。

一実施形態では、少なくとも１つの天然に存在しないヒスチジン残基を含むヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインは、ｐＨ依存性の抗原結合性特徴を示す。例えば、改変された免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含む抗体は、ほぼ中性ｐＨ（例えば、約７．０〜約７．４のｐＨ）では、標的に十分な親和性で結合するが、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）では、同じ標的に結合しないかまたは弱く結合する。一実施形態では、酸性ｐＨは、約５．５、約５．６、約５．７、約５．８、約５．９、および約６．０から選択される。一実施形態では、中性ｐＨは、約７．０、約７．１、約７．２、約７．３、および約７．４から選択される。

一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ_１／２）は、２５℃、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、２分間未満である。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ_１／２）は、３７℃、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、２分間未満である。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ_１／２）は、２５℃、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、１分間未満である。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ_１／２）は、３７℃、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、１分間未満である。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座によって発現する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質は、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）で、解離半減期（ｔ_１／２）を、中性ｐＨ（例えば、約７．０〜約７．４のｐＨ）における抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ_１／２）と比較して、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、または少なくとも約３０倍短縮する。

一実施形態では、遺伝子改変されたヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質は、中性ｐＨまたは生理学的ｐＨ（約７．０〜約７．４のｐＨ）において、目的の抗原に、１０^−６未満、１０^−７未満、１０^−８未満、１０^−９未満、または１０^−１０未満、１０^−１１未満、１０^−１２未満の親和性（Ｋ_Ｄ）で、特異的に結合することが可能である。

治療抗体は、細胞表面で標的に結合し、エンドソームへと内部移行し、治療剤がリサイクルされて、別の細胞に存在するさらに別の標的の分子に結合しうるように、エンドソーム内で標的からより容易にまたはより迅速に解離するため、酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ）において免疫グロブリン重鎖可変ドメインの変化させた結合特性は、状況によっては、抗体の代謝回転の増大を可能とする。これは、治療抗体を低用量で投与するか、または治療抗体をそれほど高頻度でなく投与することを可能とする。これは、安全性または毒性の理由で、治療抗体を高頻度で投与するかまたはある特定の投与量を上回るレベルで投与することが望ましくない状況では特に有用である。

様々な実施形態では、本明細書に記載されているヒト免疫グロブリン重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、ヒトまたは非ヒトの重鎖定常領域のヌクレオチド配列（例えば、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、およびＩｇＡから選択される免疫グロブリンアイソタイプをコードする重鎖定常領域のヌクレオチド配列）に作動可能に連結されている。様々な実施形態では、ヒトまたは非ヒトの重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｃ_Ｈ１、ヒンジ、Ｃ_Ｈ２、Ｃ_Ｈ３、およびこれらの組合せからなる群から選択される。一実施形態では、定常領域のヌクレオチド配列は、Ｃ_Ｈ１、ヒンジ、Ｃ_Ｈ２、およびＣ_Ｈ３（例えば、Ｃ_Ｈ１−ヒンジ−Ｃ_Ｈ２−Ｃ_Ｈ３）を含む。

様々な実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、内因性遺伝子座に存在する（すなわち、ヌクレオチド配列が野生型の非ヒト動物にある場合）か、または異所性に存在する（例えば、そのゲノムにおける内因性免疫グロブリン鎖の遺伝子座と異なる遺伝子座に存在する、またはその内因性の遺伝子座内に、例えば、免疫グロブリン可変遺伝子座内に存在し、ここで、該内因性の遺伝子座は、ゲノムにおける異なる位置に配置されるか、またはゲノムにおける異なる位置へと移動している）。

一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、Ｃ_Ｈ２におけるまたはＣ_Ｈ３における改変であって、酸性の環境で（例えば、ｐＨが、約５．５〜約６．０の範囲であるエンドソーム内で）重鎖定常領域アミノ酸配列のＦｃＲｎへの親和性を増大させる改変を含む。

ＩｇＧに対する胎児性Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）は、母体からその胎児への、胎盤および近位小腸を介する受動体液性免疫の移入において、十分に特徴づけられている（Roopenian, D.およびAkilesh, S.、Nat. Rev. Immun.、２００７年、７巻：７１５〜７２５頁）。ＦｃＲｎは、ＩｇＧのＦｃ部分に、古典的なＦｃγＲまたは補体活性化の古典的な経路を開始する補体のＣ１ｑ成分の結合部位とは異なる部位で結合する。より具体的には、ＦｃＲｎは、ＩｇＧ抗体のＣ_Ｈ２−Ｃ_Ｈ３間のヒンジ領域（ブドウ球菌プロテインＡ、連鎖球菌プロテインＧ、およびリウマチ因子にも結合するＦｃの多目的領域）に結合することが示された。しかし、他のＦｃ結合タンパク質とは異なり、ＦｃＲｎは、ＩｇＧのＦｃ領域に、厳密にｐＨ依存的な様式で結合する。生理学的なｐＨ７．４では、ＦｃＲｎは、ＩｇＧに結合しないのに対し、エンドソーム（例えば、ｐＨが、約５．５〜約６．０の範囲である）の酸性ｐＨでは、ＦｃＲｎは、ＩｇＧのＦｃ領域に対して、低マイクロモル濃度〜ナノモル濃度の親和性を示す。このｐＨ依存性相互作用は、ＩｇＧのＣ_Ｈ２−Ｃ_Ｈ３間領域におけるヒスチジン残基の滴定（ｔｉｔｒａｔｉｏｎ）、およびＦｃＲｎの表面上の酸性残基とのそれらの後続の相互作用により媒介されることが示されている（Roopenian, D.およびAkilesh, S.、Nat. Rev. Immun.、２００７年、７巻：７１５〜７２５頁）。

当技術分野では、酸性ｐＨにおけるＦｃ領域のＦｃＲｎへの親和性を増大させうる、ＩｇＧのＣ_Ｈ２−Ｃ_Ｈ３間領域における様々な変異が公知である。これらは、２５０位における改変（例えば、ＥまたはＱ）；２５０および４２８位における改変（例えば、ＬまたはＦ）；２５２位における改変（例えば、Ｌ／Ｙ／Ｆ／ＷまたはＴ）、２５４位における改変（例えば、ＳまたはＴ）、および２５６位における改変（例えば、Ｓ／Ｒ／Ｑ／Ｅ／ＤまたはＴ）；または４２８および／もしくは４３３位における改変（例えば、Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｐ／ＱまたはＫ）、および／もしくは４３４位における改変（例えば、Ｈ／ＦまたはＹ）；または２５０および／もしくは４２８位における改変；または３０７もしくは３０８位における改変（例えば、３０８Ｆ、Ｖ３０８Ｆ）、ならびに４３４位における改変を含むが、これらに限定されない。別の例では、改変は、４２８Ｌ（例えば、Ｍ４２８Ｌ）および４３４Ｓ（例えば、Ｎ４３４Ｓ）の改変；４２８Ｌ、２５９Ｉ（例えば、Ｖ２５９Ｉ）、および３０８Ｆ（例えば、Ｖ３０８Ｆ）の改変；４３３Ｋ（例えば、Ｈ４３３Ｋ）および４３４位（例えば、４３４Ｙ）における改変；２５２、２５４、および２５６位（例えば、５２Ｙ、２５４Ｔ、および２５６Ｅ）における改変；２５０Ｑおよび４２８Ｌの改変、またはこれらの組合せを含みうる。

一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、２５２位のアミノ酸残基と２５７位のアミノ酸残基との間に、少なくとも１つの改変であって、酸性の環境で（例えば、ｐＨが、約５．５〜約６．０の範囲であるエンドソーム内で）ヒトＣ_Ｈ２のアミノ酸配列のＦｃＲｎへの親和性を増大させる改変を含む、ヒトＣ_Ｈ２のアミノ酸配列をコードする。

一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、３０７位のアミノ酸残基と３１１位のアミノ酸残基との間に、少なくとも１つの改変であって、酸性の環境で（例えば、ｐＨが、約５．５〜約６．０の範囲であるエンドソーム内で）ヒトＣ_Ｈ２のアミノ酸配列のＦｃＲｎへの親和性を増大させる改変を含む、ヒトＣ_Ｈ２のアミノ酸配列をコードする。

一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、４３３位のアミノ酸残基と４３６位のアミノ酸残基との間に、少なくとも１つの改変であって、酸性の環境で（例えば、ｐＨが、約５．５〜約６．０の範囲であるエンドソーム内で）ヒトＣ_Ｈ３のアミノ酸配列のＦｃＲｎへの親和性を増大させる改変を含む、ヒトＣ_Ｈ３のアミノ酸配列をコードする。

一実施形態では、本明細書に記載されている重鎖定常領域のヌクレオチド配列によりコードされるヒト定常領域のアミノ酸配列は、Ｍ４２８Ｌ、Ｎ４３４Ｓ、およびこれらの組合せからなる群から選択される変異を含む。一実施形態では、ヒト定常領域のアミノ酸配列は、Ｍ４２８Ｌ、Ｖ２５９Ｉ、Ｖ３０８Ｆ、およびこれらの組合せからなる群から選択される変異を含む。一実施形態では、ヒト定常領域のアミノ酸配列は、Ｎ４３４Ａ変異を含む。一実施形態では、ヒト定常領域のアミノ酸配列は、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ、およびこれらの組合せからなる群から選択される変異を含む。一実施形態では、ヒト定常領域のアミノ酸配列は、Ｔ２５０Ｑ、Ｍ２４８Ｌ、またはこれらの両方からなる群から選択される変異を含む。一実施形態では、ヒト定常領域のアミノ酸配列は、Ｈ４３３Ｋ、Ｎ４３４Ｙ、またはこれらの両方からなる群から選択される変異を含む。

一実施形態では、重鎖定常領域アミノ酸配列は、非ヒト定常領域のアミノ酸配列であり、重鎖定常領域アミノ酸配列は、上記の種類の改変のうちのいずれかのうちの１つまたは複数を含む。

一実施形態では、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、ヒト重鎖定常領域アミノ酸配列であり、ヒト重鎖定常領域アミノ酸配列は、上記の種類の改変のうちのいずれかのうちの１つまたは複数を含む。

免疫グロブリン軽鎖遺伝子における工学的に作製したヒスチジン残基
様々な実施形態では、ｐＨ依存性の抗原結合を示すヒト抗体分子をコードするヌクレオチド配列（複数可）、例えば、ｐＨ依存性の抗原結合を示す抗体をコードする、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列を含む、免疫グロブリン軽鎖のヌクレオチド配列をそれらのゲノムに、例えば、それらの生殖細胞系列に含む、遺伝子改変された非ヒト動物（例えば、例えば、マウス、ラット、ウサギなどの哺乳動物）；これと同じ免疫グロブリン軽鎖のヌクレオチド配列を含む胚、細胞、および組織；これらを作製する方法；ならびにこれらを使用する方法が提供される。

本発明者らは、ｐＨ依存的な様式で抗原への結合が可能な抗体を発現する非ヒト動物を、軽鎖の配列に沿った１つまたは複数の位置において免疫グロブリン軽鎖可変領域の改変を施すことにより作製し得ることを発見した。動物が、抗体のＣＤＲ内でヒスチジンを発現するように、非ヒト動物の生殖細胞系列内に改変を施す方法が記載される。特に、マウスの生殖細胞系列内の免疫グロブリン軽鎖可変配列内に改変を施すための方法が記載される。例えば、軽鎖の可変領域配列は典型的に、可変領域配列に沿った体細胞超変異を示す。場合によって、このような変異は、ヒスチジン残基による置換（例えば、図１５を参照されたい）を結果としてもたらし得る。このような変異は、抗原結合の一因となる可変ドメインの領域である相補性決定領域（ＣＤＲ）内でもなお生じ得る。場合によって、このような変異は、ｐＨ依存性の抗原結合を示す、例えば、酸性ｐＨにおける抗原結合の、中性ｐＨにおける抗原結合と比較した低減を示す抗体を結果としてもたらし得る。このようなｐＨ依存性の抗原結合が所望される。なぜなら、抗体が、細胞の外部の抗原に結合し、エンドソームへと内部移行すると、抗原を放出し、表面へと再度リサイクルされて、別の抗原に結合し、標的介在性クリアランスを回避することを可能とし得るからである。ランダムｈｉｓスキャニング変異生成を用いて、抗ＩＬ−６Ｒ抗体におけるｐＨ依存性の結合特性を操作することにより、ヒスチジン残基を導入して、この効果を達成するための手法が報告されている（ＵＳ２０１１／０１１１４０６Ａ１）。しかし、抗体残基のランダム変異生成は、抗体の抗原への親和性の低下を結果としてもたらし得る。抗体配列内のヒスチジン置換を発現させるために遺伝子改変された非ヒト動物は、目的の抗原に応答する高親和性抗体であって、ヒスチジン改変（複数可）に起因して、ｐＨ依存性の抗原結合もまた提示する高親和性抗体の生成を可能とする。

したがって、様々な実施形態では、抗原にｐＨ依存的な様式で結合することが可能な抗体を発現する動物を結果としてもたらす改変を含む、ヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列をそのゲノム内に、例えば、その生殖細胞系列に含む、遺伝子改変された非ヒト動物（例えば、齧歯動物、例えば、マウスまたはラット）が本明細書において提供される。一実施形態では、非ヒト動物は、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換（場合によってまた、「ヒスチジン置換」、「ヒスチジンコドン置換」などとも称し得る）を含む、ヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列（例えば、Ｖ_Ｌセグメント配列および／またはＪ_Ｌセグメント配列）内の改変を含む。一実施形態では、動物は、ヒト免疫グロブリン軽鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ；例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３）のヌクレオチド配列内に、少なくとも１カ所の、非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む。一実施形態では、置換は、ＣＤＲ３コドンにおいてである。一実施形態では、軽鎖は、κ軽鎖である。一実施形態では、動物は、少なくとも１つのアミノ酸のヒスチジンによる置換を含む免疫グロブリン軽鎖、例えば、軽鎖ＣＤＲ、例えば、軽鎖ＣＤＲ３を発現する。別の実施形態では、軽鎖は、λ軽鎖である。さらに別の実施形態では、マウスは、κ軽鎖内およびλ軽鎖内のいずれにおいても、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む。

ヒスチジン残基は、２つの異なるコドン、ＣＡＴおよびＣＡＣ（デオキシリボ核酸残基）によりコードされる。したがって、非ヒスチジンコドンは、ＣＡＴまたはＣＡＣで置換することができる。置換は、その生殖細胞系列内の立体配置（すなわち、非体細胞変異状態）では、ヒスチジン残基をコードしないコドンにおいて操作する。

一実施形態では、軽鎖は、ユニバーサル軽鎖（また、共通軽鎖とも称する）である。米国特許出願第１３／０２２，７５９号、同第１３／０９３，１５６号、同第１３／４１２，９３６号、および同第１３／４８８，６２８号（米国出願公開第２０１１／０１９５４５４号、同第２０１２／００２１４０９号、同第２０１２／０１９２３００号、および同第２０１３／００４５４９２号）において記載されている通り、複数の重鎖のために共通軽鎖を選択する非ヒト動物（例えば、マウス）は、実際的な有用性を有する。様々な実施形態では、共通の軽鎖だけを含む、非ヒト動物で発現される抗体は、同一であるか実質的に同一の軽鎖と会合して発現することができる重鎖を有する。これは、二重特異性抗体の作製で特に有益である。例えば、そのような動物は第一の免疫原で免疫して、第一のエピトープに特異的に結合する抗体を発現するＢ細胞を生成することができる。動物（または、遺伝的に同じ動物）は、第二の免疫原で免疫して、第二のエピトープに特異的に結合する抗体を発現するＢ細胞を生成することができる。重鎖可変領域はＢ細胞からクローニングすることができ、細胞中で同じ重鎖定常領域および同じ軽鎖（例えば、共通軽鎖）と共に発現されて二重特異性抗体を作製することができ、ここで、二重特異性抗体の重鎖成分は、同じ軽鎖成分と会合して発現するように動物によって選択される。記載される様々な実施形態では、遺伝子操作マウスの可変領域は、ヒト可変領域である。

したがって、ヒト可変領域が生殖細胞系列配列から逸脱する重鎖、例えば親和性成熟または体細胞変異可変領域を含む、重鎖のかなり多様なファミリーと好適に対合する免疫グロブリン軽鎖を生成することができるマウスが操作された。様々な実施形態では、マウスは、ヒト軽鎖可変ドメインが、体細胞変異を含むヒト重鎖可変ドメインと対合するように工夫され、このようにして、ヒト治療法として使用するのに適する高親和性結合タンパク質への経路を可能にする。

生物体における抗体選択の長く複雑なプロセスを介して、遺伝子操作マウスは、ヒト重鎖可変ドメインの多様なコレクションを限定された数のヒト軽鎖選択肢と対合させることにおいて、生物学的に適当な選択をする。これを達成するために、多様なヒト重鎖可変ドメイン選択肢と一緒に限定された数のヒト軽鎖可変ドメイン選択肢を提示するようにマウスは操作される。免疫原チャレンジに際して、マウスは免疫原に対する抗体を発生させるためにそのレパートリーにおける解法の数を最大にし、これは、そのレパートリーでの軽鎖選択肢の数によって大きく、またはそれ単独で制限される。様々な実施形態では、これは、軽鎖可変ドメインの好適で適合性の体細胞変異をマウスに達成させることを含み、該変異は、それにもかかわらず、特に体細胞変異ヒト重鎖可変ドメインを含む、比較的多様なヒト重鎖可変ドメインに適合する。

米国出願公開第２０１１／０１９５４５４号、同第２０１２／００２１４０９号、同第２０１２／０１９２３００号、および同第２０１３／００４５４９２号において記載されている、操作された共通軽鎖マウスは、軽鎖選択肢の限定されたレパートリー、例えば、２つ以下のＶ_Ｌセグメントまたは単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列を含む、共通軽鎖またはユニバーサル軽鎖「ＵＬＣ」をコードする核酸配列を含んだ。このような限られたレパートリーを達成するために、天然のマウス軽鎖可変ドメインを作製または再構成する能力を、非機能的または実質的に非機能的にするようにマウスを操作する。１つの態様において、これは、例えば、マウスの軽鎖可変領域遺伝子セグメントを欠失させることによって達成された。以前に記載されたとおり、内因性マウス遺伝子座は、次に、外来性のヒト可変領域遺伝子セグメントが内因性マウス軽鎖定常領域遺伝子と組み合わさることができ、再構成されたリバースキメラ軽鎖遺伝子（ヒト可変、マウス定常）を形成することができる方法で、選択された外来性の好適なヒト軽鎖可変領域遺伝子セグメント（これは、内因性のマウス軽鎖定常ドメインに作動可能に連結される）によって改変され得る。様々な実施形態では、軽鎖可変領域は、体細胞変異させることが可能である。様々な実施形態では、体細胞変異を得る軽鎖可変領域の能力を最大にするために、適切なエンハンサー（複数可）がマウスで保持される。１つの態様において、ヒトκ軽鎖遺伝子セグメントで内因性マウスκ軽鎖遺伝子セグメントを置換するためにマウスκ軽鎖遺伝子座を改変することにおいて、マウスのκイントロンエンハンサーおよびマウスκ３’エンハンサーは機能的に維持されるか、破壊されない。

したがって、多様なリバースキメラ（ヒト可変、マウス定常）重鎖と会合する限られたレパートリーのリバースキメラ（ヒト可変、マウス定常）軽鎖を発現する遺伝子操作マウスが提供された。様々な実施形態では、内因性マウスκ軽鎖領域遺伝子セグメントが欠失し、内因性マウスＣκ遺伝子に作動可能に連結された単一の（または２つの）再構成されたヒト軽鎖領域で置換される。再構成されたヒト軽鎖領域の体細胞超変異を最大にするための実施形態では、マウスκイントロンエンハンサーおよびマウスκ３’エンハンサーが維持される。様々な実施形態では、マウスは非機能的なλ軽鎖遺伝子座、またはその欠失、またはその遺伝子座がλ軽鎖を作製できないようにする欠失をさらに含む。

ユニバーサル軽鎖マウスは、多様なＶ_Ｈセグメント、Ｄ_Ｈセグメント、およびＪ_Ｈセグメントのレパートリーを含む、重鎖可変領域配列の多様なレパートリーを使用することが可能な、様々な抗原に応答する抗体を生成した。このような遺伝子操作ＵＬＣマウスにおいて生成される抗体は、二重特異性治療抗体をデザインするのに有用であるが、他の任意の抗体と同様に、各二重特異性抗体も、血漿中のその寿命の間に１つの標的だけに結合することが可能であり、その抗体は、エンドソームへと内部移行して、リソソーム分解の標的とされる。研究は、ＭＨＣクラスＩ様Ｆｃγ受容体であるＦｃＲｎが、免疫グロブリンを、ソーティングエンドソームから細胞表面へとリサイクリングして戻すことにより、リソソーム分解からレスキューすることが可能であることを示している（SimisterおよびMostov （１９８９年）、An Fc receptor structurally related to MHC class I antigens、Nature、３３７巻：１８４〜８７頁）。上記で説明した通り、抗体リサイクリングの効率を改善するには、抗体配列へのさらなる改変、例えば、酸性ｐＨ（例えば、エンドソームのｐＨ）では、抗原結合の低下を結果としてもたらすが、中性ｐＨ（例えば、血液などの体液のｐＨ）では、抗体−抗原の親和性および特異性を保持する改変が有益である。ユニバーサル軽鎖配列内の非ヒスチジン残基をヒスチジン残基で置換した、本明細書に記載されている非ヒト動物は、ｐＨ依存性結合もまた提示する、例えば、酸性ｐＨにおける抗原への結合の、中性ｐＨにおける抗原への結合と対比した低減もまた提示する、ユニバーサル軽鎖フォーマットに基づく高親和性抗体を産生することが可能であるために有益である。

したがって、一実施形態では、ヒト軽鎖可変領域の限定されたレパートリー、またはヒト軽鎖可変遺伝子セグメントの限定されたレパートリーからの単一のヒト軽鎖可変領域をそのゲノム内に、例えば、その生殖細胞系列内に含む非ヒト動物（例えば、齧歯動物、例えば、マウスまたはラット）であって、ヒト軽鎖可変領域（複数可）が、少なくとも１カ所の、非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む非ヒト動物が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、提供される非ヒト動物を、単一の軽鎖を発現する（または２つの軽鎖の一方もしくは両方を発現する）、再構成されたヒト軽鎖可変領域遺伝子（または２つの再構成された軽鎖可変領域遺伝子）を形成するように再構成する、単一の再構成されていないヒト軽鎖可変領域遺伝子セグメント（または２つのヒト軽鎖可変領域遺伝子セグメント）を含むように遺伝子操作し、ここで、軽鎖可変領域遺伝子（複数可）は、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む。これらのヒスチジン置換した軽鎖可変領域遺伝子（複数可）によりコードされる、再構成されたヒト軽鎖可変ドメインは、動物により選択される、複数の親和性成熟させたヒト重鎖であって、重鎖可変領域が異なるエピトープに特異的に結合するヒト重鎖と対合することが可能である。様々な実施形態では、少なくとも１カ所の、非ヒスチジン残基のヒスチジン残基による置換は、同種の（ｃｏｇｎａｔｅ）重鎖と共に発現すると、その抗原にｐＨ依存的な様式で結合する、再構成されたヒト軽鎖を結果としてもたらす。

ヒト軽鎖可変ドメインの限定されたレパートリー、またはヒト軽鎖可変領域遺伝子配列の限定されたレパートリーからの単一のヒト軽鎖可変ドメインを発現する遺伝子操作動物であって、可変領域遺伝子配列が、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む遺伝子操作動物が提供される。いくつかの実施形態では、提供される動物を、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含み、単一の軽鎖の可変領域を発現する（または２つの可変領域の一方もしくは両方を発現する）、単一のＶ／Ｊヒト軽鎖配列（または２つのＶ／Ｊ配列）を含むように遺伝子操作する。一態様では、可変配列を含む軽鎖は、動物によりクローン選択される、複数の親和性成熟させたヒト重鎖であって、重鎖可変領域が異なるエピトープに特異的に結合するヒト重鎖と対合させることが可能である。一実施形態では、抗体は、その抗原（複数可）にｐＨ依存的な様式で結合する。一実施形態では、単一のＶ／Ｊヒト軽鎖配列は、Ｖκ１−３９Ｊκ５およびＶκ３−２０Ｊκ１から選択される。一実施形態では、２つのＶ／Ｊ配列は、Ｖκ１−３９Ｊκ５およびＶκ３−２０Ｊκ１である。一実施形態では、Ｖκ１−３９Ｊκ５配列およびＶκ３−２０Ｊκ１配列は、再構成されたＶ／Ｊ配列である。

一態様では、ヒトＪ_Ｌ遺伝子セグメント（１つまたは複数のＪ_Ｌセグメントから選択される）と共に再構成することが可能であり、免疫グロブリン軽鎖のヒト可変ドメインをコードすることが可能な、単一のヒト免疫グロブリン軽鎖Ｖ_Ｌ遺伝子セグメントを含む、遺伝子改変された非ヒト動物であって、単一のヒト免疫グロブリン軽鎖Ｖ_Ｌ遺伝子セグメントおよび／またはヒトＪ_Ｌ遺伝子セグメントが、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む、遺伝子改変された非ヒト動物が提供される。別の態様では、それらの各々が、ヒトＪ_Ｌ遺伝子セグメント（１つまたは複数のＪ_Ｌセグメントから選択される）と共に再構成することが可能であり、免疫グロブリン軽鎖のヒト可変ドメインをコードすることが可能な、２つ以下のヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントを含む遺伝子改変マウスであって、２つ以下のＶ_Ｌ遺伝子セグメントおよび／またはＪ_Ｌ遺伝子セグメントの各々が、少なくとも１つの非ヒスチジン残基のヒスチジン残基による置換を含む遺伝子改変マウスが提供される。

本明細書では、ヒトＶ_Ｌ配列およびヒトＪ_Ｌ配列を含む、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列をそのゲノム内に、例えば、その生殖細胞系列内に含む、遺伝子改変された非ヒト動物であって、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域が、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む、遺伝子改変された非ヒト動物もまた提供される。一態様では、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列は、ヒスチジン置換（複数可）を除けば、ヒト生殖細胞系列のＶ_Ｌ遺伝子配列およびＪ_Ｌ遺伝子配列に由来する。一実施形態では、ヒト免疫グロブリン軽鎖は、ヒト免疫グロブリンκ鎖である。したがって、一実施形態では、ヒトＶ_Ｌ遺伝子配列は、Ｖκ１−３９およびＶκ３−２０から選択される。一実施形態では、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列は、再構成されたＶκ１−３９／Ｊ配列またはＶκ３−２０／Ｊ配列を含む。一実施形態では、ヒトＪ_Ｌ遺伝子配列は、Ｊκ１、Ｊκ２、Ｊκ３、Ｊκ４、およびＪκ５から選択される。一実施形態では、ヒトＪ_Ｌ配列は、Ｊκ１およびＪκ５から選択される。一実施形態では、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列は、Ｖκ１−３９Ｊκ５およびＶκ３−２０Ｊκ１から選択される（例えば、ヒスチジン置換（複数可）を除けば）。代替的な実施形態では、ヒト免疫グロブリン軽鎖は、ヒトλ鎖である。

一実施形態では、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換は、軽鎖可変ドメインの相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするヌクレオチド配列内にある。一実施形態では、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換は、軽鎖可変ドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３をコードするヌクレオチド配列内にある。具体的な一実施形態では、置換は、ＣＤＲ３をコードするヌクレオチド配列内にある。

一態様では、置換は、ヒト軽鎖可変領域遺伝子配列のＣＤＲ３コドンにおける、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換である。一実施形態では、置換は、１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ超のＣＤＲ３コドンの置換である。単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域が、Ｖκ１−３９Ｊκ５可変領域である実施形態では、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置きかえは、１０５、１０６、１０８、１１１位、およびこれらの組合せから選択される位置においてヒスチジンを発現するようにデザインされた、ＣＤＲ３をコードする免疫グロブリン軽鎖遺伝子配列内の位置における置きかえを含む。一実施形態では、置きかえは、１０５および１０６位においてヒスチジンを発現するようにデザインする。一実施形態では、置きかえは、１０５および１１１位においてヒスチジンを発現するようにデザインする。一実施形態では、置きかえは、１０５および１０８位においてヒスチジンを発現するようにデザインする。一実施形態では、置きかえは、１０５、１０８、および１１１位においてヒスチジンを発現するようにデザインする。一実施形態では、置きかえは、１０５、１０６、および１０８位においてヒスチジンを発現するようにデザインする。一実施形態では、置きかえは、１０６および１０８位においてヒスチジンを発現するようにデザインする。一実施形態では、置きかえは、１０６および１１１位においてヒスチジンを発現するようにデザインする。一実施形態では、置きかえは、１０８および１１１位においてヒスチジンを発現するようにデザインする。一実施形態では、置きかえは、１０６、１０８、および１１１位においてヒスチジンを発現するようにデザインする。さらに別の実施形態では、置きかえは、１０６、１０８、および１１１位においてヒスチジンを発現するようにデザインする。一実施形態では、置きかえは、１０５、１０６、および１１１位においてヒスチジンを発現するようにデザインする。一実施形態では、置きかえは、１０５、１０６、１０８、および１１１位においてヒスチジンを発現するようにデザインする。ヒスチジン置換した領域の核酸配列およびアミノ酸配列を、図１６の配列アラインメントに示し、配列番号３２７〜３５７にも示す。

単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域が、Ｖκ３−２０Ｊκ１可変領域である実施形態では、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置きかえは、１０５、１０６、１０７、１０９位、およびこれらの組合せから選択される位置においてヒスチジンを発現するようにデザインされた、ＣＤＲ３領域をコードする免疫グロブリン軽鎖遺伝子配列内の位置における置きかえを含む。一実施形態では、置きかえは、１０５および１０６位においてヒスチジンを発現するようにデザインする。一実施形態では、置きかえは、１０５および１０７位においてヒスチジンを発現するようにデザインする。一実施形態では、置きかえは、１０５および１０９位においてヒスチジンを発現するようにデザインする。一実施形態では、置きかえは、１０６および１０７位においてヒスチジンを発現するようにデザインする。一実施形態では、置きかえは、１０６および１０９位においてヒスチジンを発現するようにデザインする。一実施形態では、置きかえは、１０７および１０９位においてヒスチジンを発現するようにデザインする。一実施形態では、置きかえは、１０５、１０６、および１０７位においてヒスチジンを発現するようにデザインする。一実施形態では、置きかえは、１０５、１０７、および１０９位においてヒスチジンを発現するようにデザインする。一実施形態では、置きかえは、１０６、１０８、および１１１位においてヒスチジンを発現するようにデザインする。一実施形態では、置きかえは、１０５、１０６、および１０９位においてヒスチジンを発現するようにデザインする。別の実施形態では、置きかえは、１０５、１０６、１０７、および１０９位においてヒスチジンを発現するようにデザインする。例示的な、ヒスチジン置換した領域の核酸配列およびアミノ酸配列を、図２７の配列アラインメントに示し、配列番号３９８〜４０３に示す。

アミノ酸位置（１０５、１０６位など）は、Lefrancら（２００３年）、Dev. Comp. Immunol.、２７巻：５５〜７７頁において記載されている固有の番号付けに基づいており、また、www.imgt.org上でも調べることができる。

一実施形態では、ヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントを、ヒトリーダー配列または非ヒトリーダー配列に作動可能に連結する。一実施形態では、リーダー配列は、非ヒトリーダー配列である。具体的な実施形態では、非ヒトリーダー配列は、マウスＶκ３−７リーダー配列である。具体的な実施形態では、リーダー配列を、再構成されていないヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントに作動可能に連結する。具体的な実施形態では、リーダー配列を、再構成されたヒトＶ_Ｌ／Ｊ_Ｌ配列に作動可能に連結する。したがって、具体的な一実施形態では、少なくとも１つのヒスチジン置換を含む、単一の、再構成されたＶκ１−３９／Ｊκ５可変領域遺伝子配列またはＶκ３−２０／Ｊκ１可変領域遺伝子配列を、マウスＶκ３−７リーダー配列に作動可能に連結する。

一実施形態では、Ｖ_Ｌ遺伝子セグメントを、免疫グロブリンプロモーター配列に作動可能に連結する。一実施形態では、プロモーター配列は、ヒトプロモーター配列である。具体的な実施形態では、ヒト免疫グロブリンプロモーターは、ヒトＶκ３−１５プロモーターである。具体的な実施形態では、プロモーターを、再構成されていないヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントに作動可能に連結する。具体的な実施形態では、プロモーターを、再構成されたヒトＶ_Ｌ／Ｊ_Ｌ配列に作動可能に連結する。したがって、具体的な一実施形態では、少なくとも１つのヒスチジン置換を含む、単一の、再構成されたＶκ１−３９／Ｊκ５可変領域遺伝子配列またはＶκ３−２０／Ｊκ１可変領域遺伝子配列を、ヒトＶκ３−１５プロモーターに作動可能に連結する。

一実施形態では、軽鎖遺伝子座は、５’側（Ｖ_Ｌ遺伝子セグメントの転写方向に対して）でヒト免疫グロブリンプロモーターと隣接し、３’側でヒトＪ_Ｌセグメントと共に再構成するヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントと隣接した、リーダー配列を含み、内因性非ヒト軽鎖定常領域（Ｃ_Ｌ）を含むリバースキメラ軽鎖の可変ドメインをコードする。具体的な実施形態では、Ｖ_Ｌ遺伝子セグメントおよびＪ_Ｌ遺伝子セグメントは、非ヒトＶκ遺伝子座にあり、非ヒトＣ_Ｌは、非ヒトＣκ（例えば、マウスＣκ）である。具体的な一実施形態では、可変領域配列を、非ヒト定常領域配列、例えば、非ヒトＣκ遺伝子配列に作動可能に連結する。

一実施形態では、軽鎖遺伝子座は、５’側（Ｖ_Ｌ遺伝子セグメントの転写方向に対して）でヒト免疫グロブリンプロモーターと隣接し、３’側で再構成されたヒト可変領域配列（Ｖ_Ｌ／Ｊ_Ｌ配列）と隣接した、リーダー配列を含み、内因性非ヒト軽鎖定常領域（Ｃ_Ｌ）を含むリバースキメラ軽鎖の可変ドメインをコードする。具体的な実施形態では、再構成されたヒトＶ_Ｌ／Ｊ_Ｌ配列は、非ヒトカッパ（κ）遺伝子座にあり、非ヒトＣ_Ｌは、非ヒトＣκである。具体的な一実施形態では、再構成されたヒト可変領域配列を、非ヒト免疫グロブリン軽鎖定常領域配列、例えば、非ヒトＣκ遺伝子配列に作動可能に連結する。一実施形態では、非ヒト免疫グロブリン軽鎖定常領域配列は、内因性非ヒト配列である。一実施形態では、非ヒト動物は、マウスであり、Ｃκ遺伝子配列は、マウスＣκ遺伝子配列である。一実施形態では、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列は、内因性非ヒト（例えば、マウス）免疫グロブリン軽鎖遺伝子座（κ遺伝子座）にある。遺伝子座の例示的な実施形態を、図２３Ｃ、２３Ｅ、２９Ｃ、および２９Ｄに提示する。

一実施形態では、遺伝子改変された非ヒト動物は、マウスであり、マウスの可変領域遺伝子座は、κ軽鎖遺伝子座であり、κ軽鎖遺伝子座は、マウスκイントロンエンハンサー、マウスκ３’側エンハンサー、またはイントロンエンハンサーおよび３’側エンハンサーの両方を含む。

一実施形態では、非ヒト動物（例えば、齧歯動物、例えば、ラットまたはマウス）は、非機能的な免疫グロブリンラムダ（λ）軽鎖遺伝子座を含む。具体的な実施形態では、λ軽鎖遺伝子座は、遺伝子座の１つまたは複数の配列の欠失であって、λ軽鎖遺伝子座を再構成して、軽鎖遺伝子を形成することを不可能とする１つまたは複数の欠失を含む。別の実施形態では、λ軽鎖遺伝子座のＶ_Ｌ遺伝子セグメントの全てまたは実質的に全てを欠失させる。一実施形態では、非ヒト動物（例えば、齧歯動物、例えば、マウスまたはラット）は、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列を含み、機能的な、再構成されていない免疫グロブリン軽鎖可変領域、例えば、内因性の、再構成されていない軽鎖可変領域を欠く。一実施形態では、再構成された、ヒスチジン置換したヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列により、内因性の、再構成されていない免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列を置きかえる。

一実施形態では、動物により、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含むヒト可変領域配列に由来する体細胞変異可変ドメインを含む軽鎖を作製する。一実施形態では、軽鎖は、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む、ヒト可変領域配列に由来する体細胞変異可変ドメイン、および非ヒトＣκ領域を含む。一実施形態では、非ヒト動物は、λ軽鎖を発現しない。

当業者ならば、少なくとも１つの非ヒスチジン残基のヒスチジン残基による置換（複数可）を、ヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域へと遺伝子操作しても、体細胞超変異に起因して、遺伝子改変された非ヒト動物において生成される全ての抗体が、このヒスチジン残基（複数可）を、操作された位置（複数可）において保有するわけではないことを十分に理解する。しかし、非ヒト動物における広範な抗体レパートリーの生成は、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて生成される抗原特異的抗体であって、目的の抗原に対する高親和性を提示する一方で、生殖細胞系列へと導入され、したがって、ｐＨ依存性の抗原結合を示すヒスチジン改変を保持する抗原特異的抗体について選択することを可能とする。

したがって、一実施形態では、動物は、非ヒスチジンアミノ酸のヒスチジンコドンによる少なくとも１つの置換を保持する。一実施形態では、動物は、その可変領域遺伝子へと導入された、その体細胞変異軽鎖可変ドメイン内の全てまたは実質的に全てのヒスチジン置換を保持する。

一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された非ヒト動物はまた、Ｖ_Ｈ遺伝子セグメント配列、Ｄ_Ｈ遺伝子セグメント配列、およびＪ_Ｈ遺伝子セグメント配列を含む、再構成されていない免疫グロブリン重鎖可変領域もそのゲノム内に、例えば、その生殖細胞系列に含む。一実施形態では、Ｖ_Ｈ遺伝子セグメント配列、Ｄ_Ｈ遺伝子セグメント配列、およびＪ_Ｈ遺伝子セグメント配列は、ヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメント配列、ヒトＤ_Ｈ遺伝子セグメント配列、およびヒトＪ_Ｈ遺伝子セグメント配列であり、再構成されていない免疫グロブリン重鎖可変領域は、ヒト重鎖可変領域である。一実施形態では、ヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメント配列、ヒトＤ_Ｈ遺伝子セグメント配列、およびヒトＪ_Ｈ遺伝子セグメント配列は、非ヒト重鎖定常領域配列に作動可能に連結されている。一実施形態では、非ヒト重鎖定常領域配列は、内因性非ヒト重鎖定常領域配列である。一実施形態では、ヒト重鎖遺伝子セグメント配列は、内因性非ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座にある。一実施形態では、非ヒト動物に含まれるヒト免疫グロブリン重鎖可変領域配列はまた、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換も含む。

一実施形態では、本明細書に記載されている非ヒト動物は、非ヒト軽鎖定常領域配列を含む免疫グロブリン軽鎖を発現する。一実施形態では、非ヒト動物は、ヒト軽鎖定常領域配列を含む免疫グロブリン軽鎖を発現する。

一実施形態では、本明細書に記載されている非ヒト動物は、Ｃ_Ｈ１配列、ヒンジ配列、Ｃ_Ｈ２配列、Ｃ_Ｈ３配列、およびこれらの組合せから選択される非ヒト配列を含む免疫グロブリン重鎖を発現する。

一実施形態では、非ヒト動物は、Ｃ_Ｈ１配列、ヒンジ配列、Ｃ_Ｈ２配列、Ｃ_Ｈ３配列、およびこれらの組合せから選択されるヒト配列を含む免疫グロブリン重鎖を発現する。

動物が、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む、単一の、再構成された免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む実施形態では、動物の生殖細胞系列内の、再構成された免疫グロブリン軽鎖配列は、内因性非ヒト免疫グロブリン軽鎖遺伝子座にある。具体的な実施形態では、動物の生殖細胞系列内の、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む、再構成された免疫グロブリン軽鎖配列は、内因性非ヒト免疫グロブリン軽鎖遺伝子座における、全てまたは実質的に全ての内因性非ヒト軽鎖Ｖセグメント配列および内因性非ヒト軽鎖Ｊセグメント配列を置きかえる。

一実施形態では、非ヒト動物は、内因性Ｖ_Ｈ遺伝子セグメントの１つまたは複数のヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントによる置きかえを含み、ここで、非ヒト動物がヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントを再構成し、ヒトＶ_Ｈドメインおよび非ヒトＣ_Ｈを含むリバースキメラ免疫グロブリン重鎖を発現するように、ヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントは、非ヒトＣ_Ｈ領域遺伝子に作動可能に連結されている。一実施形態では、再構成されていない非ヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントのうちの９０〜１００％を、少なくとも１つの、再構成されていないヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントで置きかえる。具体的な実施形態では、内因性非ヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントの全てまたは実質的に全て（例えば、９０〜１００％）を、少なくとも１つの、再構成されていないヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントで置きかえる。一実施形態では、置きかえは、少なくとも１９、少なくとも３９、または少なくとも８０もしくは８１の再構成されていないヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントによる置きかえである。一実施形態では、置きかえは、少なくとも１２の機能的な、再構成されていないヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメント、少なくとも２５の機能的な、再構成されていないヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメント、または少なくとも４３の機能的な、再構成されていないヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントによる置きかえである。一実施形態では、非ヒト動物は、全ての非ヒトＤ_Ｈセグメントおよび非ヒトＪ_Ｈセグメントの、少なくとも１つの、再構成されていないヒトＤ_Ｈセグメント、および少なくとも１つの、再構成されていないヒトＪ_Ｈセグメントによる置きかえを含む。一実施形態では、非ヒト動物は、全ての非ヒトＤ_Ｈセグメントおよび非ヒトＪ_Ｈセグメントの、全ての、再構成されていないヒトＤ_Ｈセグメント、および全ての、再構成されていないヒトＪ_Ｈセグメントによる置きかえを含む。

ヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域の限定されたレパートリー、例えば、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を有する、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域（例えば、Ｖκ１−３９／Ｊκ５またはＶκ３−２０／Ｊκ１）、ならびに再構成されていないヒトＶ_Ｈセグメント、ヒトＤ_Ｈセグメント、およびヒトＪ_Ｈセグメントの多様なレパートリーをそのゲノム内に、例えば、その生殖細胞系列内に含む非ヒト動物、例えば、マウスは、再構成されていないヒトＶ_Ｈセグメント、ヒトＤ_Ｈセグメント、およびヒトＪ_Ｈセグメントの様々な順列に由来する、重鎖可変領域配列によりコードされる、抗原結合タンパク質を生成することが可能であり、ここで、重鎖可変配列内に存在するＶ_Ｈセグメント、Ｄ_Ｈセグメント、およびＪ_Ｈセグメントは、動物のゲノム内に存在する、全てまたは実質的に全ての機能的なヒトＶ_Ｈセグメント、ヒトＤ_Ｈセグメント、およびヒトＪ_Ｈセグメントに由来する。本明細書に記載されている遺伝子改変動物の細胞、例えば、Ｂ細胞内で発現させた重鎖可変ドメイン配列（すなわち、様々な、機能的なヒトＶセグメント、ヒトＤセグメント、およびヒトＪセグメントの組合せに由来する）の様々な利用可能性は、米国出願公開第２０１１／０１９５４５４号、同第２０１２／００２１４０９号、同第２０１２／０１９２３００号、および同第２０１３／００４５４９２号において記載されている。様々な実施形態では、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換（複数可）を含む、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列、および再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域配列は、非ヒト動物の生殖細胞系列内に含まれる。

一実施形態では、非ヒト動物は、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換（複数可）を含む、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列、および再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域配列の一方または両方の１つのコピーを含む。別の実施形態では、非ヒト動物は、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換（複数可）を含む、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列、および再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域配列の一方または両方の２つのコピーを含む。したがって、非ヒト動物は、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換（複数可）を含む、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列、および再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域配列の一方または両方について、ホモ接合性であってもよく、ヘテロ接合性であってもよい。

少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換（例えば、軽鎖のＣＤＲ３内の）を含む、免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列（例えば、単一の、再構成された免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列）をそれらのゲノム内に含む、遺伝子改変された非ヒト動物に加えて、本明細書では、発現した可変ドメインが、体細胞超変異にかけられない場合は、ヒスチジンである、さらなるアミノ酸（複数可）を含むように、ヒスチジンコドン（複数可）の１つまたは複数の付加を有する、免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列を含む、遺伝子改変された非ヒト動物もまた提供される。

本明細書に記載されている、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を有する、ヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列を含む遺伝子改変された非ヒト動物は、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ウシ（例えば、雌牛、雄牛、野牛）、シカ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、ネコ、イヌ、フェレット、霊長動物（例えば、マーモセット、アカゲザル）からなる群から選択することができる。好適な遺伝子改変可能なＥＳ細胞が容易に利用可能でない非ヒト動物には、本明細書に記載されている方法とは異なる方法を用いて、遺伝子改変を含む非ヒト動物を作製する。このような方法は、例えば、非ＥＳ細胞ゲノム（例えば、線維芽細胞または人工多能性細胞）を改変するステップと、核移植を用いて、改変されたゲノムを、好適な細胞、例えば、卵母細胞へと導入するステップと、改変された細胞（例えば、改変卵母細胞）を、胚を形成するのに好適な条件下で、非ヒト動物に懐胎させるステップとを含む。

一態様では、非ヒト動物は、哺乳動物である。一態様では、非ヒト動物は、小型の哺乳動物、例えば、Ｄｉｐｏｄｏｉｄｅａ上科またはＭｕｒｏｉｄｅａ上科の小型の哺乳動物である。一実施形態では、遺伝子改変された動物は、齧歯動物である。一実施形態では、齧歯動物は、マウス、ラット、およびハムスターから選択される。一実施形態では、齧歯動物は、Ｍｕｒｏｉｄｅａ上科から選択される。一実施形態では、遺伝子改変された動物は、Ｃａｌｏｍｙｓｃｉｄａｅ科（例えば、マウス様ハムスター）、Ｃｒｉｃｅｔｉｄａｅ科（例えば、ハムスター、新世界ラット、およびマウス、ハタネズミ）、Ｍｕｒｉｄａｅ科（真性（ｔｒｕｅ）マウスおよびラット、アレチネズミ、トゲネズミ、タテガミネズミ）、Ｎｅｓｏｍｙｉｄａｅ科（キノボリネズミ、イワネズミ、オジロキヌゲネズミ（ｗｉｔｈ−ｔａｉｌｅｄ ｒａｔ）、マダカスカルラットおよびマダカスカルマウス）、Ｐｌａｔａｃａｎｔｈｏｍｙｉｄａｅ科（例えば、トゲヤマネ）、およびＳｐａｌａｃｉｄａｅ科（例えば、デバネズミ（mole rates）、タケネズミ、およびモグラネズミ）から選択される科由来の動物である。具体的な実施形態では、遺伝子改変された齧歯動物は、真性マウスまたはラット（Ｍｕｒｉｄａｅ科）、アレチネズミ、トゲネズミ、およびタテガミネズミから選択される。一実施形態では、遺伝子改変されたマウスは、Ｍｕｒｉｄａｅ科由来のメンバーのマウスである。一実施形態では、動物は、齧歯動物である。具体的な実施形態では、齧歯動物は、マウスおよびラットから選択される。一実施形態では、非ヒト動物は、マウスである。

具体的な実施形態では、非ヒト動物は、Ｃ５７ＢＬ／Ａ、Ｃ５７ＢＬ／Ａｎ、Ｃ５７ＢＬ／ＧｒＦａ、Ｃ５７ＢＬ／ＫａＬｗＮ、Ｃ５７ＢＬ／６、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、Ｃ５７ＢＬ／６ＢｙＪ、Ｃ５７ＢＬ／６ＮＪ、Ｃ５７ＢＬ／１０、Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｃＳｎ、Ｃ５７ＢＬ／１０Ｃｒ、およびＣ５７ＢＬ／Ｏｌａから選択されるＣ５７ＢＬ系統のマウスである齧歯動物である。別の実施形態では、マウスは、１２９Ｐ１、１２９Ｐ２、１２９Ｐ３、１２９Ｘ１、１２９Ｓ１（例えば、１２９Ｓ１／ＳＶ、１２９Ｓ１／ＳｖＩｍ）、１２９Ｓ２、１２９Ｓ４、１２９Ｓ５、１２９Ｓ９／ＳｖＥｖＨ、１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）、１２９Ｓ７、１２９Ｓ８、１２９Ｔ１、１２９Ｔ２である系統からなる群から選択される、１２９系統である（例えば、Festingら（１９９９年）、Revised nomenclature for strain 129 mice、Mammalian Genome、１０巻：８３６頁を参照されたい; Auerbachら（２０００年）、Establishment and Chimera Analysis of 129/SvEv- and C57BL/6-Derived Mouse Embryonic Stem Cell Linesもまた参照されたい）。具体的な実施形態では、遺伝子改変されたマウスは、前述の１２９系統と前述のＣ５７ＢＬ／６系統とのミックスである。別の具体的な実施形態では、マウスは、前述の１２９系統のミックスまたは前述のＢＬ／６系統のミックスである。具体的な実施形態では、ミックスの１２９系統は、１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）系統である。別の実施形態では、マウスは、ＢＡＬＢ系統、例えば、ＢＡＬＢ／ｃ系統である。さらに別の実施形態では、マウスは、ＢＡＬＢ系統と別の前述の系統とのミックスである。

一実施形態では、非ヒト動物は、ラットである。一実施形態では、ラットは、Ｗｉｓｔａｒラット、ＬＥＡ系統、Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ系統、Ｆｉｓｃｈｅｒ系統、Ｆ３４４、Ｆ６、およびＤａｒｋ Ａｇｏｕｔｉから選択される。一実施形態では、ラット系統は、Ｗｉｓｔａｒ、ＬＥＡ、Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ、Ｆｉｓｃｈｅｒ、Ｆ３４４、Ｆ６、およびＤａｒｋ Ａｇｏｕｔｉからなる群から選択される２つ以上の系統のミックスである。

したがって、一実施形態では、遺伝子改変された非ヒト動物は、齧歯動物である。一実施形態では、遺伝子改変された非ヒト動物は、ラットまたはマウスである。一実施形態では、動物は、マウスである。したがって、本発明の一実施形態では、ヒトＶ_Ｌ遺伝子配列およびヒトＪ_Ｌ遺伝子配列を含む、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域をそのゲノム内に、例えば、その生殖細胞系列に含む遺伝子改変マウスであって、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域が、少なくとも非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む遺伝子改変マウスが本明細書において提供される。一実施形態では、マウスは、機能的な、再構成されていない免疫グロブリン軽鎖可変領域を欠く（例えば、機能的な、再構成されていないＶ遺伝子セグメント配列およびＪ遺伝子セグメント配列を欠く）。一実施形態では、ヒスチジンコドンの置換（複数可）を有する、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域は、Ｖκ１−３９／Ｊκ可変領域またはＶκ３−２０／Ｊκ可変領域である。一実施形態では、Ｊセグメント配列は、Ｊκ１、Ｊκ２、Ｊκ３、Ｊκ４、およびＪκ５から選択される。一実施形態では、Ｊセグメント配列は、Ｊκ１またはＪκ５である。一実施形態では、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換は、ＣＤＲ３領域をコードするヌクレオチド配列内にある。再構成された可変領域配列が、Ｖκ１−３９／Ｊκ５配列である一実施形態では、ヒスチジン置換（複数可）を、１０５、１０６、１０８、１１１位、およびこれらの組合せから選択される位置において発現するようにデザインする。再構成された可変領域配列が、Ｖκ３−２０／Ｊκ１配列である別の実施形態では、ヒスチジン置換（複数可）を、１０５、１０６、１０７、１０９位、およびこれらの組合せから選択される位置において発現するようにデザインする。一実施形態では、置換されたヒスチジンコドン（複数可）を有する、再構成された免疫グロブリン軽鎖可変領域を、内因性のマウス免疫グロブリン定常領域遺伝子配列（例えば、Ｃκ遺伝子配列）に作動可能に連結する。一実施形態では、マウスは、そのゲノム内に、例えば、その生殖細胞系列に、ヒトＶ_Ｈセグメント、ヒトＤ_Ｈセグメント、およびヒトＪ_Ｈセグメントを含む、再構成されていない免疫グロブリン重鎖可変領域をさらに含む。一実施形態では、ヒトＶ_Ｈセグメント、ヒトＤ_Ｈセグメント、およびヒトＪ_Ｈセグメントは、内因性のマウス免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結されている。様々な実施形態では、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換（複数可）を含む、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列、および再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域配列は、マウスの生殖細胞系列内に含まれる。

本明細書では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された非ヒト動物、例えば、マウスを生成するためのターゲッティングベクターもまた提供される。一態様では、ベクターの５’側マウス相同性アームおよび３’側マウス相同性アームの配列に関する転写方向の５’側から３’側にかけて、５’側マウス相同性アーム、ヒト免疫グロブリンプロモーターまたはマウス免疫グロブリンプロモーター、ヒトリーダー配列またはマウスリーダー配列、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む再構成されたヒトＶκ１−３９Ｊκ５または再構成されたヒトＶκ３−２０Ｊκ１から選択されるヒト可変領域、および３’側マウス相同性アームを含む、ターゲッティングベクターが提供される。一実施形態では、５’側相同性アームおよび３’側相同性アームは、ベクターを、５’側に存在し、マウスＣκ遺伝子に対して近位である、エンハンサー配列に対して５’側の配列へとターゲッティングする。別の実施形態では、ターゲッティングベクターは、５’側マウス相同性アームに続いて、組換え部位により挟まれた選択カセット、ヒト免疫グロブリンプロモーターまたはマウス免疫グロブリンプロモーター、ヒトリーダー配列またはマウスリーダー配列、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む再構成されたヒトＶκ１−３９Ｊκ５または再構成されたヒトＶκ３−２０Ｊκ１から選択されるヒト可変領域に続いて、マウスエンハンサーおよび定常領域（Ｃκ）配列を含む、３’側マウス相同性アームを含む。

選択カセットとは、目的の構築物を組み込んだ細胞（例えば、ＥＳ細胞）の選択を容易にするために、ターゲッティング構築物へと挿入されるヌクレオチド配列である。当技術分野では、いくつかの好適な選択カセットが公知である。一般に、選択カセットは、特定の抗生剤（例えば、Ｎｅｏ、Ｈｙｇ、Ｐｕｒ、ＣＭ、Ｓｐｅｃなど）の存在下で、陽性選択を可能とする。加えて、選択カセットは、レコンビナーゼ酵素で処理したときに、選択カセットの欠失を可能とする、組換え部位で挟むことができる。一般に用いられる組換え部位は、Ｃｒｅ酵素およびＦｌｐ酵素のそれぞれにより認識されるｌｏｘＰおよびＦｒｔであるが、当技術分野では、他の組換え部位も公知である。

一実施形態では、プロモーターは、ヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメントプロモーターである。具体的な実施形態では、プロモーターは、ヒトＶκ３−１５プロモーターである。一実施形態では、リーダー配列は、マウスリーダー配列である。具体的な実施形態では、マウスリーダー配列は、マウスＶκ３−７リーダー配列である。ターゲッティングベクターの例示的な実施形態を、図２３Ｂおよび２９Ｂに提示する。

一態様では、ターゲッティングベクターを、上記で記載した通りに提供するが、５’側マウス相同性アームの代わりに、ヒトプロモーターまたはマウスプロモーターに、５’側で、部位特異的レコンビナーゼ認識部位（ＳＲＲＳ）を隣接させ、３’側マウス相同性アームの代わりに、ヒトＶ_Ｌ領域に、３’側で、ＳＲＲＳを隣接させる。

本明細書では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された非ヒト動物（例えば、齧歯動物、例えば、マウスまたはラット）を作製する方法もまた提供される。一態様では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された非ヒト動物を作製するための方法は、実施例において記載されている通り、ＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）技術を用いて作製されるターゲッティングベクターを使用し、構築物をＥＳ細胞へと導入し（ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ）、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）技術を用いて、ターゲッティングされたＥＳ細胞クローンをマウス胚へと導入する。ヒスチジン改変は、様々な分子生物学技法、例えば、部位指向変異生成またはデノボのＤＮＡ合成を用いて、ターゲッティングベクターへと導入することができる。遺伝子ターゲッティングが完了したら、遺伝子改変された非ヒト動物のＥＳ細胞をスクリーニングして、目的の外因性ヌクレオチド配列の組込みまたは外因性ポリペプチドの発現の成功を確認する。当業者には、数多くの技法が公知であり、サザンブロット法、長鎖ＰＣＲ、定量的ＰＣＴ（例えば、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）を用いるリアルタイムＰＣＲ）、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ノーザンブロット法、フローサイトメトリー、ウェスタン分析、免疫細胞化学検査、免疫組織化学検査などが挙げられる（が、これらに限定されない）。一例では、目的の遺伝子改変を保有する非ヒト動物（例えば、マウス）は、Valenzuelaら（２００３年）、High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis、Nature Biotech.、２１巻（６号）：６５２〜６５９頁において記載されている、対立遺伝子アッセイの改変型を用いて、マウス対立遺伝子の喪失および／またはヒト対立遺伝子の獲得についてスクリーニングすることにより同定することができる。当業者には、遺伝子改変動物における具体的なヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を同定する他のアッセイも公知である。

したがって、一実施形態では、遺伝子改変された非ヒト動物を生成する方法は、動物における免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列を、ヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列（ヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントおよびヒトＪ_Ｌ遺伝子セグメントを含む）で置きかえるステップを含み、ここで、ヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子配列は、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む。一実施形態では、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換は、ＣＤＲ領域、例えば、ＣＤＲ３領域をコードするヌクレオチド配列内にある。

一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された非ヒト動物を生成する方法は、動物における免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列を、ヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメント配列およびヒトＪ_Ｌ遺伝子セグメント配列を含む、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列で置きかえるステップを含み、ここで、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子配列は、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む。一実施形態では、置換は、ＣＤＲコドンにおいてである。一実施形態では、置換は、１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ超のＣＤＲ３コドンの置換である。一実施形態では、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列は、Ｖκ１−３９Ｊκ５およびＶκ３−２０Ｊκ１から選択される、ヒト生殖細胞系列の、再構成された軽鎖可変領域配列に基づく。したがって、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列が、Ｖκ１−３９Ｊκ５に由来する一実施形態では、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置きかえを、１０５、１０６、１０８、１１１位、およびこれらの組合せから選択される位置において、ヒスチジンを発現するようにデザインする。単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列が、Ｖκ３−２０κ１に由来する一実施形態では、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置きかえを、１０５、１０６、１０７、１０９位、およびこれらの組合せから選択される位置において、ヒスチジンを発現するようにデザインする。

別の実施形態では、本明細書に記載されている非ヒト動物（すなわち、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン軽鎖遺伝子座を含む）を生成する方法は、非ヒト動物のゲノムを改変して、免疫グロブリン軽鎖遺伝子座内の、内因性免疫グロブリンの軽鎖Ｖセグメントおよび軽鎖Ｊセグメントを欠失させるか、または非機能的にするステップと、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む、単一の、再構成されたヒト軽鎖可変領域遺伝子配列をゲノムに配置するステップとを含む。一実施形態では、方法は、目的の抗原へのｐＨ依存性結合を示す抗体が富化されたＢ細胞集団を含む、遺伝子改変された非ヒト動物を結果としてもたらす。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された非ヒト動物を生成する方法は、内因性非ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子配列の、上記で記載したヒトＶ_Ｈ配列、ヒトＤ_Ｈ配列、およびヒトＪ_Ｈ配列の各々またはレパートリーのうちの少なくとも１つを含むヒト免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子配列による置きかえもまた含む動物において、免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列を、ヒト配列で置きかえるステップを含む。一実施形態では、内因性免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列の、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む、ヒト軽鎖可変領域遺伝子配列による置きかえと、内因性非ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子配列の、ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子配列による置きかえとを含む、非ヒト動物を生成するために、軽鎖可変領域遺伝子配列の置きかえを有する動物を、重鎖可変領域遺伝子配列の置きかえを有する動物と交配させる。

発明者らは、本明細書において、１つまたは複数のヒスチジン改変を含むユニバーサル軽鎖、例えば、ヒトユニバーサル軽鎖（例えば、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域に由来する軽鎖）を含む抗原結合タンパク質、例えば、抗体を発現する、遺伝子操作非ヒト動物（例えば、齧歯動物、例えば、ラットまたはマウス）であって、抗原結合タンパク質が、標的抗原のｐＨ依存性の抗原結合を示す、遺伝子操作非ヒト動物を提供する。動物は、１つまたは複数のヒスチジン改変を含む軽鎖ＣＤＲ３を含むように遺伝子操作する。様々な実施形態では、軽鎖ＣＤＲ３は、クラスター内に、２つ、３つ、または４つ以上のヒスチジン残基を含む。

一実施形態では、軽鎖可変領域遺伝子配列内のコドン改変の結果として、ヒスチジン残基（複数可）を発現して、標的抗原のｐＨ依存性結合を提示する、抗原特異的抗体の集団を含む、遺伝子操作非ヒト動物が本明細書において提供される。一実施形態では、これらの動物は、本明細書に記載されている免疫グロブリン軽鎖可変領域内に、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含まない動物において生成される抗原特異的抗体の集団と比較して、ｐＨ依存性の結合特性（例えば、酸性ｐＨにおける解離半減期（ｔ_１／２）の、中性ｐＨにおけるｔ_１／２と対比した短縮）を提示する抗体、例えば、抗原特異的抗体が富化されたＢ細胞集団を含む。一実施形態では、本明細書に記載されている遺伝子操作動物において生成されるｐＨ依存性の抗原結合特性を提示する抗原特異的抗体の富化は、軽鎖可変領域内にヒスチジン置換を含む同様の動物と比較して、約２倍を超える、例えば、約５倍を超え、例えば、約１０倍を超える。したがって、本発明の遺伝子改変動物は、標的介在性クリアランスを低減し、ならびに、このような、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて生成される抗体フォーマットに基づいて開発される治療用抗原結合タンパク質の用量および／または投与頻度を低減するのに所望される、抗体リサイクリング特性の改善を有する抗体が富化されている。

したがって、本明細書では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された非ヒト動物において生成される抗原結合タンパク質であって、ｐＨ依存性の抗原結合を提示する抗原結合タンパク質が提供される。一実施形態では、抗原結合タンパク質は、抗体、例えば、抗原特異的抗体である。一実施形態では、抗体は、ヒト免疫グロブリン軽鎖可変遺伝子セグメントの再構成に由来する、ヒト軽鎖可変ドメインを含む軽鎖を含み、この場合、生殖細胞系列遺伝子配列内の、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンは、ヒスチジンコドンで置換され、抗体は、その発現したヒト軽鎖可変ドメイン内に、少なくとも１つのヒスチジン置換を保持する。一実施形態では、抗体は、単一の、再構成されたヒト軽鎖可変領域遺伝子配列に由来する、ヒト軽鎖可変ドメインを含む軽鎖を含み、単一の、再構成された軽鎖可変領域遺伝子配列は、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含み、抗体は、その発現した軽鎖可変ドメイン内に、少なくとも１つのヒスチジン置換を保持する。一実施形態では、抗体は、ヒトＶκ１−３９Ｊκ５の再構成またはヒトＶκ３−２０Ｊκ１の再構成に由来する軽鎖を含み、ヒトＶκ１−３９Ｊκ５遺伝子配列またはヒトＶκ３−２０Ｊκ１遺伝子配列は、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含み、抗体は、その発現した軽鎖可変ドメイン内に、少なくとも１つのヒスチジン置換を保持する。いくつかの実施形態では、抗体は、その発現した軽鎖可変ドメイン内に、全てまたは実質的に全てのヒスチジン置換を保持する。一実施形態では、置換は、軽鎖可変領域遺伝子配列のＣＤＲ３をコードするヌクレオチド配列内の、３つの非ヒスチジンコドンの３つのヒスチジンコドンによる置換であり、抗体は、その発現した軽鎖可変ドメイン内に、３つのヒスチジン置換全てを保持する。一実施形態では、置換は、軽鎖可変領域遺伝子配列のＣＤＲ３をコードするヌクレオチド配列内の、４つの非ヒスチジンコドンの４つのヒスチジンコドンによる置換であり、抗体は、その発現した軽鎖可変ドメイン内に、３または４つのヒスチジン置換を保持する。

一実施形態では、抗体の軽鎖は、非ヒト軽鎖定常領域のアミノ酸配列、例えば、内因性軽鎖定常領域のアミノ酸配列をさらに含む。加えて、本明細書に記載されている、遺伝子改変された非ヒト動物において生成される抗体、例えば、抗原特異的抗体はまた、ヒト重鎖Ｖセグメント、ヒト重鎖Ｄセグメント、およびヒト重鎖Ｊセグメントの再構成に由来する、ヒト重鎖可変ドメインを含む重鎖も含む。ヒト重鎖Ｖセグメント、ヒト重鎖Ｄセグメント、およびヒト重鎖Ｊセグメントは、内因性非ヒト重鎖遺伝子座、例えば、少なくとも１つの機能的なＶセグメント、少なくとも１つの機能的なＤセグメント、および少なくとも１つの機能的なＪセグメントに存在するヒト重鎖セグメントのレパートリー、例えば、最大で、機能的なヒトＶセグメント、ヒトＤセグメント、およびヒトＪセグメントの完全なレパートリーから選択することができる。ヒト重鎖可変セグメントの例示的な、可能な再構成は、ＩＭＧＴデータベース内の機能的なヒトＶセグメント、ヒトＤセグメント、およびヒトＪセグメントの列挙、ならびに米国出願公開第２０１１／０１９５４５４号、同第２０１２／００２１４０９号、同第２０１２／０１９２３０９号、および同第２０１３／００４５４９２号から収集することができる。さらに、一実施形態では、抗体の重鎖は、非ヒト重鎖定常領域のアミノ酸配列、例えば、内因性非ヒト重鎖定常領域のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、非ヒト重鎖定常領域は、Ｃ_Ｈ１ドメイン、ヒンジドメイン、Ｃ_Ｈ２ドメイン、およびＣ_Ｈ３ドメインを含む。一実施形態では、抗体は、ＩｇＧアイソタイプ、ＩｇＥアイソタイプ、ＩｇＤアイソタイプ、ＩｇＭアイソタイプ、またはＩｇＡアイソタイプである。

したがって、一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された非ヒト動物において生成される結合タンパク質であって、（ａ）少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む、ヒトＶκ１−３９Ｊκ５の再構成に由来する軽鎖可変ドメインであり、軽鎖が、その発現した軽鎖可変ドメイン内に、少なくとも１つのヒスチジン置換を保持する軽鎖可変ドメインと、（ｂ）非ヒト軽鎖定常領域のアミノ酸配列、例えば、マウス軽鎖定常領域のアミノ酸配列とを含む、リバースキメラ軽鎖を含み、ここで、軽鎖が、（ａ）ヒトＶセグメント、ヒトＤセグメント、およびヒトＪセグメントの再構成に由来する重鎖可変ドメインであり、Ｖセグメント、Ｄセグメント、およびＪセグメントが、動物において存在するヒトＶセグメント、ヒトＤセグメント、およびヒトＪセグメントのレパートリーから選択される重鎖可変ドメインと、（ｂ）非ヒト重鎖定常領域のアミノ酸配列、例えば、マウス重鎖定常領域のアミノ酸配列とを含む、リバースキメラ重鎖と関連する、結合タンパク質が本明細書において提供される。一実施形態では、ヒトＶセグメント、ヒトＤセグメント、およびヒトＪセグメントのレパートリーは、少なくとも１つの機能的なＶセグメント、少なくとも１つの機能的なＤセグメント、および少なくとも１つの機能的なＪセグメント、例えば、最大で、機能的なヒトＶセグメント、ヒトＤセグメント、およびヒトＪセグメントの完全なレパートリーを含む。一実施形態では、重鎖定常ドメインおよび軽鎖定常ドメインは、内因性の重鎖定常領域および軽鎖定常領域である。一実施形態では、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインは、体細胞変異ドメインである。一実施形態では、体細胞変異軽鎖ドメインは、生殖細胞系列配列へと導入された少なくとも１つのヒスチジン置換を保持する。いくつかの実施形態では、体細胞変異軽鎖ドメインは、生殖細胞系列配列へと導入された、全てまたは実質的に全てのヒスチジン置換を保持する。一実施形態では、抗原結合タンパク質は、ｐＨ依存性の抗原結合特性を提示する。

別の実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された非ヒト動物において生成される結合タンパク質であって、（ａ）少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む、ヒトＶκ３−２０Ｊκ１の再構成に由来する軽鎖可変ドメインであり、軽鎖が、その発現した軽鎖可変ドメイン内に、少なくとも１つのヒスチジン置換を保持する軽鎖可変ドメインと、（ｂ）非ヒト軽鎖定常領域のアミノ酸配列、例えば、マウス軽鎖定常領域のアミノ酸配列とを含む、リバースキメラ軽鎖を含み、ここで、軽鎖が、（ａ）ヒトＶセグメント、ヒトＤセグメント、およびヒトＪセグメントの再構成に由来する重鎖可変ドメインであり、Ｖセグメント、Ｄセグメント、およびＪセグメントが、動物において存在するヒトＶセグメント、ヒトＤセグメント、およびヒトＪセグメントのレパートリーから選択される重鎖可変ドメインと、（ｂ）非ヒト重鎖定常領域のアミノ酸配列、例えば、マウス重鎖定常領域のアミノ酸配列とを含む、リバースキメラ重鎖と関連する、結合タンパク質が本明細書において提供される。一実施形態では、ヒトＶセグメント、ヒトＤセグメント、およびヒトＪセグメントのレパートリーは、少なくとも１つの機能的なＶセグメント、少なくとも１つの機能的なＤセグメント、および少なくとも１つの機能的なＪセグメント、例えば、最大で、機能的なヒトＶセグメント、ヒトＤセグメント、およびヒトＪセグメントの完全なレパートリーを含む。一実施形態では、重鎖定常領域および軽鎖定常領域は、内因性の重鎖定常領域および軽鎖定常領域である。一実施形態では、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインは、体細胞変異ドメインである。一実施形態では、体細胞変異軽鎖ドメインは、生殖細胞系列配列へと導入された少なくとも１つのヒスチジン置換を保持する。いくつかの実施形態では、体細胞変異軽鎖ドメインは、生殖細胞系列配列へと導入された、全てまたは実質的に全てのヒスチジン置換を保持する。一実施形態では、抗原結合タンパク質は、ｐＨ依存性の抗原結合特性を提示する。

一実施形態では、本明細書に記載されている遺伝子改変動物のＢ細胞であって、ヒスチジン改変ヒト軽鎖可変領域配列、例えば、本明細書に記載されている、ヒスチジン改変、単一の、再構成されたヒト軽鎖可変領域配列をその生殖細胞系列内に含み、本明細書に記載されている抗原結合タンパク質を発現するＢ細胞もまた本明細書において提供される。一実施形態では、Ｂ細胞内で発現させた抗原結合タンパク質、例えば、抗体は、生殖細胞系列へと導入された、少なくとも１つのヒスチジン残基を保持し、ｐＨ依存性の抗原結合特性を提示する。いくつかの実施形態では、Ｂ細胞内で発現させた抗原結合タンパク質、例えば、抗体は、生殖細胞系列へと導入された、全てまたは実質的に全てのヒスチジン残基を保持し、ｐＨ依存性の抗原結合特性を提示する。

様々な実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された非ヒト動物は、ヒト軽鎖可変領域遺伝子配列、例えば、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換（またはヒスチジンコドンの生殖細胞系列配列への付加）を含む、単一の、再構成されたヒト軽鎖可変領域遺伝子配列（例えば、Ｖκ１−３９Ｊκ５またはＶκ３−２０Ｊκ１配列）を含む。これらの付加または置換は、それらの抗原に対するｐＨ依存性の結合特性を有する、抗原結合タンパク質が富化されたＢ細胞集団を含む、非ヒト動物を結果としてもたらす。一実施形態では、本明細書に記載されている非ヒト動物において、抗原刺激に応答して生成される抗原結合タンパク質、例えば、抗体は、中性ｐＨ、例えば、約７．０〜約８．０の間のｐＨ、例えば、約７．０〜約７．４の間のｐＨ、例えば、約７．２〜約７．４の間、例えば、血液のような体液のｐＨでは、抗原に対する高親和性を示して、ｐＨ依存性の抗原結合を提示する。一実施形態では、中性ｐＨにおける解離定数（Ｋ_Ｄ）として表される、抗原結合タンパク質のその抗原に対する親和性は、１０^−６Ｍ未満、例えば、１０^−８Ｍ未満、例えば、１０^−９Ｍ未満、例えば、１０^−１０Ｍ未満、例えば、１０^−１１Ｍ未満、例えば、１０^−１２Ｍ未満である。

一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された非ヒト動物において生成される、抗原結合タンパク質、例えば、抗体は、中性ｐＨと比較して、酸性ｐＨ（例えば、６．０以下のｐＨ、例えば、約５．０〜約６．０の間のｐＨ、約５．７５〜約６．０の間のｐＨ、例えば、エンドソームコンパートメントまたはリソソームコンパートメントのｐＨ）で、その抗原に対する結合の低減を示す。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された非ヒト動物において生成される、抗原結合タンパク質、例えば、抗体は、中性ｐＨでは、抗原への結合を保持するが、酸性ｐＨでは、抗原への結合を示さない。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された非ヒト動物により生成される抗原結合タンパク質は、中性ｐＨにおける抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ_１／２）と比較して、酸性ｐＨで、解離半減期（ｔ_１／２）の少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、または少なくとも約３０倍への短縮を有する。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された非ヒト動物が発現する抗原結合タンパク質のｔ_１／２は、酸性ｐＨおよび３７℃で、約２分間以下である。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された非ヒト動物が発現する抗原結合タンパク質のｔ_１／２は、酸性ｐＨおよび３７℃で、約１分間未満である。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された非ヒト動物が発現する抗原結合タンパク質のｔ_１／２は、酸性ｐＨおよび２５℃で、約２分間以下である。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された非ヒト動物が発現する抗原結合タンパク質のｔ_１／２は、酸性ｐＨおよび２５℃で、約１分間未満である。

平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）および解離半減期（ｔ_１／２）などの動力学的パラメータは、Ｋ_Ｄ（Ｍ）＝ｋ_ｄ／ｋ_ａ；およびｔ_１／２（分）＝ｌｎ２／（６０×ｋ_ｄ）として、動力学的速度定数から計算することができる。

一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された非ヒト動物において生成される、抗原結合タンパク質、例えば、抗体は、ＦｃＲｎ分子への結合の増大を示す。上記で記載したＦｃＲｎとは、エンドソームコンパートメントの内部に存在する受容体であって、酸性ｐＨにおいて、免疫グロブリンに結合し、それらを表面へとリサイクリングして戻すことが可能な受容体である。本明細書に記載されている、遺伝子改変された非ヒト動物における抗体分子をスクリーニングすることにより、３つの有益なパラメータ：抗原に対する高親和性、ｐＨ依存性の抗原結合（酸性ｐＨでは抗原結合が弱い）、およびＦｃＲｎへの結合の増大を有する抗体について選択する固有の機会が提供される。

一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された非ヒト動物は、抗原結合タンパク質、例えば、抗体を産生し、これらが富化された、抗原に応答するＢ細胞集団であって、治療剤へと再フォーマットされる場合に、治療用量を被験体へと投与されると、それらのヒト軽鎖可変領域遺伝子配列内にヒスチジン改変（複数可）を含まない非ヒト動物において同じ抗原に応答して産生される、同等なＢ細胞集団を凌駕する、血清半減期の延長を示すＢ細胞集団を含む。したがって、一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された非ヒト動物において、目的の抗原に応答して産生される抗原結合タンパク質、例えば、抗体は、治療剤へと再フォーマットされる場合に、治療用量を被験体へと投与されると（治療剤へと再フォーマットされ、同じ治療用量で投与されるる場合）、そのヒト軽鎖可変領域遺伝子配列内にヒスチジン改変（複数可）を含まない非ヒト動物において同じ抗原に応答して産生された抗原結合タンパク質の血清半減期を凌駕する、血清半減期の延長を示す。いくつかの実施形態では、血清半減期の延長は、約２倍、例えば、約５倍、例えば、約１０倍、例えば、約１５倍、例えば、約２０倍、またはそれ超である。

一態様では、本明細書に記載されている非ヒトに由来する多能性細胞、人工多能性細胞、または全能性細胞が提供される。具体的な実施形態では、細胞は、胚性幹（ＥＳ）細胞である。

一態様では、本明細書に記載されている非ヒト動物に由来する組織が提供される。一実施形態では、組織は、本明細書に記載されている、非ヒト動物の脾臓、リンパ節、または骨髄に由来する。

一態様では、本明細書に記載されている非ヒト動物に由来する核が提供される。一実施形態では、核は、Ｂ細胞ではない二倍体細胞からの核である。

一態様では、本明細書に記載されている非ヒト動物（例えば、齧歯動物、例えば、マウスまたはラット）から単離された非ヒト細胞が提供される。一実施形態では、細胞は、ＥＳ細胞である。一実施形態では、細胞は、リンパ球である。一実施形態では、リンパ球は、Ｂ細胞である。一実施形態では、Ｂ細胞は、ヒト遺伝子セグメントに由来する可変ドメインを含むキメラ重鎖と；少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を有する、再構成されたヒトＶκ１−３９／Ｊ配列、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を有する、再構成されたヒトＶκ３−２０／Ｊ配列、またはこれらの組合せに由来し、生殖細胞系列内でコードされる少なくとも１つのアミノ酸のヒスチジンによる置換をさらに含む軽鎖とを発現し、重鎖可変ドメインは非ヒト定常領域に融合し、軽鎖可変ドメインは非ヒト定常領域またはヒト定常領域に融合している。

一態様では、本明細書に記載されている、非ヒト動物のＢ細胞により作製されるハイブリドーマが提供される。具体的な実施形態では、Ｂ細胞は、目的のエピトープを含む免疫原で免疫された、本明細書に記載されているマウスからのＢ細胞であり、Ｂ細胞は、目的のエピトープに結合する結合タンパク質を発現し、結合タンパク質は、体細胞変異ヒト可変重鎖ドメインおよびマウスＣ_Ｈを有し、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を有する、再構成されたヒトＶκ１−３９Ｊκ５、または少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を有する、再構成されたヒトＶκ３−２０Ｊκ１に由来するヒト可変軽鎖ドメイン、およびマウスＣ_Ｌを有し、ヒト軽鎖ドメインは、生殖細胞系列内でコードされる少なくとも１つのアミノ酸のヒスチジンによる置換を含む。

本明細書に記載されている非ヒト動物において生成される抗原結合タンパク質を発現する細胞もまた提供される。一実施形態では、細胞は、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、およびウイルス核酸配列を発現する網膜細胞（例えば、ＰＥＲＣ．６^ＴＭ細胞）から選択される。

一態様では、本明細書に記載されている非ヒト動物に由来するドナーＥＳ細胞を含む非ヒト胚が提供される。

本明細書に記載されている非ヒト動物は、ヒスチジンをＣＤＲ３内に有する抗体を発現するＢ細胞を生成するのに有用である。ヒスチジンをＣＤＲ３に配置する動物は、抗体を作製するのに一般に有用であり、中性ｐＨまたはその近くでは、標的に十分な親和性で結合するが、酸性ｐＨでは、同じ標的に結合しないかまたは弱く結合する抗体を開発するのに特に有用である。

非ヒト動物は、例えば、ヒスチジンをＣＤＲ３内に含むヒト免疫グロブリン可変ドメインによりそれらの標的に結合する、ヒト治療用結合タンパク質を作製するのに用いられ得る、抗体の可変領域を生成するのに有用である。治療剤は、細胞表面で標的に結合し、エンドソームへと内部移行し、治療剤がリサイクルされて、さらに別の標的の分子（例えば、別の細胞上または同じ細胞上の）に結合し得るように、エンドソーム内で標的からより容易にまたはより迅速に解離するため、より低いｐＨにおける結合が変化すれば、状況によっては、より迅速な代謝回転が可能となる。状況によっては、これにより、結果として、治療剤を低用量で投与するか、または治療剤を低頻度で投与することができる。これは、安全性または毒性の理由で、頻繁に投与することやある特定の投与量を上回って投与することが望ましくない場合に特に有用である。結果として、被験体へと投与される場合の抗体治療剤の血清半減期が延長される。

非ヒト動物、例えば、齧歯動物、例えば、マウスまたはラットは、１つまたは複数のヒスチジンをその中に有するＣＤＲ３を有する抗体可変領域を示す動物におけるＢ細胞の数を増大させるための方法において有用である。非ヒト動物は、ｐＨ依存性の抗原結合を示す抗体配列を生成するのに有用である。非ヒト動物は、単回の免疫から、抗体がｐＨ依存性の抗原結合を示す、より多数の抗体配列を生成するのに有用である。

抗原結合タンパク質およびこれを生成する方法
一態様では、当技術分野で用いられる標準的な方法により、本明細書に記載されている、遺伝子改変された非ヒト動物から、ｐＨ依存性の抗原結合を示すヒト抗原結合タンパク質、例えば、抗体を生成するための方法もまた本明細書において提供される。

抗体を生成するための複数の技法が記載されている。例えば、様々な実施形態では、本明細書に記載されているマウスにおいてキメラ抗体が産生される。抗体は、免疫したマウスのＢ細胞から直接単離することができ（例えば、Ｕ．Ｓ．２００７／０２８０９４５Ａ１を参照されたい）、かつ／または免疫したマウスのＢ細胞を用いて、ハイブリドーマを作製することができる（KohlerおよびMilstein、１９７５年、Nature、２５６巻：４９５〜４９７頁）。本明細書に記載されている非ヒト動物からの抗体（ヒト重鎖および／またはヒト軽鎖）をコードするＤＮＡは、従来の技法を用いて、容易に単離および配列決定される。本明細書に記載されている非ヒト動物に由来するハイブリドーマおよび／またはＢ細胞は、このようなＤＮＡの好ましい供給源として役立つ。単離されると、ＤＮＡは、発現ベクターに入れることができ、次いで、これを、他の形では免疫グロブリンタンパク質を産生しない宿主細胞へとトランスフェクトして、組換え宿主細胞内でモノクローナル抗体の合成を得る。ＤＮＡはまた、例えば、ヒト重鎖定常ドメインおよび軽鎖定常ドメインのコード配列を、非ヒト配列の代わりに置換することにより改変することもできる。したがって、所望の特徴、例えば、親和性、エピトープ、ｐＨ依存性の抗原結合などを有する抗体の核酸配列が決定されたら、非ヒト定常領域遺伝子配列を、所望のヒト定常領域配列で置きかえて、非ＩｇＭアイソタイプ、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４を含有する完全ヒト抗体を生成する。

したがって、一実施形態では、ｐＨ依存性の抗原結合特性を示す抗体を生成する方法であって、本明細書に記載されている非ヒト動物（例えば、マウス）を生成するステップと、マウスを目的の抗原で免疫するステップと、非ヒト動物に抗原への免疫応答を開始させるステップと、非ヒト動物において、ｐＨ依存性の抗原結合特性を示す、例えば、酸性ｐＨでは、中性ｐＨにおける場合より抗原への結合が弱い抗原特異的抗体を選択するステップとを含む方法が本明細書において提供される。

本明細書では、多重特異性抗原結合タンパク質、例えば、二重特異性抗原結合タンパク質を作製する方法もまた提供される。これらは、複数のエピトープに高親和性で結合することが可能な分子である。本発明の利点には、その各々が単一の軽鎖と会合する好適に高い結合性の（例えば、親和性成熟した）重鎖免疫グロブリン鎖を選択できることが挙げられる。加えて、本発明の利点には、ｐＨ依存性の抗原結合を示す、多重特異性、例えば、二重特異性の抗原結合タンパク質を生成できることが挙げられる。

二重特異性抗体の二重の性質（すなわち、１つのポリペプチドの異なるエピトープに特異的な場合もあり、複数の標的ポリペプチドに特異的な抗原結合ドメインを含有する場合もある；例えば、Tuttら、１９９１年、J. Immunol.、１４７巻：６０〜６９頁; Kuferら、２００４年、Trends Biotechnol.、２２巻：２３８〜２４４頁を参照されたい）のため、それらは、治療適用に有用な多くの利点をもたらす。例えば、二重特異性抗体は、方向転換された細胞傷害作用（例えば、腫瘍細胞を死滅させる）のために用いることもでき、ワクチンアジュバントとして用いることもでき、血栓溶解剤をクロットへと送達するために用いることもでき、標的部位（例えば、腫瘍）において酵素活性化型プロドラッグを転換するために用いることもでき、感染性疾患を処置するために用いることもでき、免疫複合体を細胞表面受容体へとターゲッティングするために用いることもでき、免疫毒素を腫瘍細胞へと送達するために用いることもできる。

本明細書に記載されている二重特異性抗体はまた、酵素イムノアッセイ、二部位イムノアッセイ、様々な疾患（例えば、がん）に対するｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏにおける免疫診断法、競合結合アッセイ、直接サンドイッチアッセイおよび間接サンドイッチアッセイ、ならびに免疫沈降アッセイなど、複数の治療的アッセイ法ならびに非治療的アッセイ法および／または診断的アッセイ法においても用いることができる。当業者には、二重特異性抗体の他の使用が明らかである。

二重特異性抗体断片を、組換え細胞培養物から作製するための複数の技法が報告されている。しかし、二重特異性結合タンパク質の合成および発現は、２つの異なる重鎖と会合して発現し得る好適な軽鎖の同定と関連する問題に部分的に起因し、単離の問題にも部分的に起因して、問題含みであった。様々な実施形態では、本明細書に記載されている組成物および方法は、成分の安定性／相互作用を増大させることにより、従来の免疫グロブリン構造を維持するのに特殊な改変（複数可）を必要としない完全長の二重特異性抗体の利点を提供する。様々な実施形態では、このような改変（複数可）は、煩瑣であることがわかっており、二重特異性抗体技術の開発およびヒト疾患のための処置におけるそれらの潜在的な使用に対する障害として作用した。したがって、様々な実施形態では、複数の特異性という特性を付加した、天然の免疫グロブリン構造（すなわち、完全長）を提供することを介して、完全長の二重特異性抗体は、かつての二重特異性断片が欠いた、それらの極めて重要なエフェクター機能を維持し、半減期の延長という重要な薬物動態パラメータを明らかに示す治療剤をさらに提供する。

本明細書に記載される方法および組成物は、遺伝子改変マウスが、他の点では天然であるプロセスを介して、体細胞変異された（例えば、親和性成熟した）重鎖を含む複数の重鎖と会合して発現することができる好適な軽鎖を選択することを可能にし、ここで、この軽鎖は、抗原結合タンパク質にそのｐＨ依存性抗原結合特性をさらに付与する。リバースキメラ重鎖（すなわち、ヒト可変およびマウス定常）を有する親和性成熟抗体を発現する、本明細書に記載される免疫マウスの適するＢ細胞からのヒト重鎖および軽鎖の可変領域配列を同定して、適するヒト定常領域遺伝子配列（例えば、ヒトＩｇＧ１）を有する発現ベクターにインフレームでクローニングすることができる。２つのそのような構築物を調製することができ、ここで、各構築物は異なるエピトープに結合するヒト重鎖可変ドメインをコードする。少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含むヒト軽鎖可変領域の１つ（例えば、ヒトＶκ１−３９Ｊκ５またはヒトＶκ３−２０Ｊκ１）は、適するヒト軽鎖定常領域遺伝子（例えば、ヒトκ定常遺伝子）にインフレームで融合させることができる。これら３つの完全なヒトの重鎖および軽鎖構築物は、発現のために適する細胞に入れることができる。細胞は、２つの主要な種を発現する：同一の軽鎖を有するホモダイマー重鎖、および同一の軽鎖を有するヘテロダイマー重鎖。これらの主要な種の容易な分離を可能にするために、重鎖の１つはプロテインＡ結合決定基が削除されるように改変され、これにより、ヘテロダイマー結合タンパク質とは異なるホモダイマー結合タンパク質の親和性がもたらされる。この問題に対処する組成物および方法は、ＵＳ２０１０／０３３１５２７Ａ１として公開された、２０１０年６月２５日に出願された「Ｒｅａｄｉｌｙ Ｉｓｏｌａｔｅｄ Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｗｉｔｈ Ｎａｔｉｖｅ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｆｏｒｍａｔ」という名称のＵＳＳＮ１２／８３２，８３８に記載される。同一な軽鎖を有するヘテロ二量体重鎖を含む上記種が選択されたら、この二重特異性抗原結合タンパク質をスクリーニングして、そのｐＨ依存性の抗原結合特性の保持を確認することができる。

一態様では、本明細書に記載されるエピトープ結合タンパク質が提供され、ここで、ヒト軽鎖および重鎖の可変領域配列は、目的のエピトープを含む抗原で免疫されている本明細書に記載される動物に由来する。

一実施形態では、第一および第二のポリペプチドを含むエピトープ結合タンパク質が提供され、第一のポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端にかけて、第一のエピトープに選択的に結合する第一のエピトープ結合領域、続いてＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４およびその組合せから選択されるヒトＩｇＧの第一のＣ_Ｈ３領域を含む定常領域を含み；第二のポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端にかけて、第二のエピトープに選択的に結合する第二のエピトープ結合領域、続いてＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４およびその組合せから選択されるヒトＩｇＧの第二のＣ_Ｈ３領域を含む定常領域を含み、第二のＣ_Ｈ３領域は、プロテインＡへの第二のＣ_Ｈ３ドメインの結合を低減または除去する改変を含む。様々なこのような改変は、例えば、米国出願公開第２０１０／０３３１５２７号、および同第２０１１／０１９５４５４号において記載されている。

複数のエピトープに結合し、ｐＨ依存性のエピトープ結合特性を示すエピトープ結合タンパク質を作製するための１つの方法は、本発明に従い第一のマウスを、第一の目的のエピトープを含む抗原で免疫することであり、ここで、マウスは、（１）軽鎖を再構成して形成することが可能な内因性マウス軽鎖可変領域遺伝子配列を含有しない、内因性免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子座であって、内因性マウス免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子座には、マウス内因性軽鎖定常領域遺伝子に作動可能に連結された、単一の、再構成されたヒト軽鎖可変領域があり、再構成されたヒト軽鎖可変領域が、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む、ヒトＶκ１−３９Ｊκ５およびヒトＶκ３−２０Ｊκ１から選択される、内因性免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子座と、（２）マウスにより作製される免疫グロブリン重鎖が、単独でまたは実質的にヒト可変ドメインおよびマウス定常ドメインを含む重鎖であるように、ヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントで全体的または部分的に置きかえられた内因性マウスＶ_Ｈ遺伝子セグメントとを含む。免疫すると、このようなマウスにより、２つのヒト軽鎖可変ドメインのうちの１つ（例えば、例えば、少なくとも１つのアミノ酸のヒスチジンによる置換を含む、ヒトＶκ１−３９Ｊκ５またはヒトＶκ３−２０Ｊκ１のうちの１つ）だけを含むリバースキメラ抗体が作製される。一般に、生殖細胞系列配列へと導入された、置換されたヒスチジン残基の少なくとも一部は、リバースキメラ抗体内で保持される。目的のエピトープに結合する重鎖可変ドメインをコードするＢ細胞を同定し、ｐＨ依存性の抗原結合特性を示す抗体を発現させたら、重鎖可変領域（そして、必要に応じて、軽鎖可変領域）のヌクレオチド配列を取り出し（例えば、ＰＣＲにより）、好適なヒト免疫グロブリン重鎖定常領域配列に対してインフレームで、発現構築物へとクローニングすることができる。このプロセスを繰り返して、第二のエピトープに結合する第二の重鎖可変ドメインを同定し、第二の重鎖可変領域遺伝子配列を取り出し、第二の好適なヒト免疫グロブリン重鎖定常領域配列とインフレームで、発現ベクターへとクローニングすることができる。定常領域遺伝子配列によりコードされる第一の免疫グロブリン定常ドメインと、第二の免疫グロブリン定常ドメインとは、同じアイソタイプであってもよく、異なるアイソタイプであってもよく、免疫グロブリン定常ドメインのうちの一方を、本明細書またはＵＳ２０１０／０３３１５２７Ａ１に記載されている通りに改変することができ（しかし、他方は改変しない）、エピトープ結合タンパク質を、好適な細胞内で発現させ、そのプロテインＡに対する、例えば、ＵＳ２０１０／０３３１５２７Ａ１において記載されているホモ二量体のエピトープ結合タンパク質と比較した、示差的な親和性に基づき単離することができる。

したがって、様々な実施形態では、ＤＮＡの単離、ならびに所望の特異性／親和性を有する第一のヒト重鎖可変ドメインおよび第二のヒト重鎖可変ドメインをコードする第一の核酸配列および第二の核酸配列、ならびにヒト軽鎖ドメインをコードし、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む第三の核酸配列（本明細書に記載されている非ヒト動物から単離された、生殖細胞系列の再構成された配列または軽鎖配列）の選択に続き、当技術分野で広範に利用可能な組換え技法を用いて、分子をコードする３つの核酸配列を発現させて、二重特異性抗体を形成する。しばしば、二重特異性抗体が、適切にグリコシル化される（例えば、グリコシル化された抗体ドメインを含む二重特異性抗体の場合）ように、選り抜きの発現系は、哺乳動物細胞の発現ベクターおよび宿主を包含する。しかし、分子はまた、原核生物発現系において産生させることもできる。通常、宿主細胞は、第一のヒト重鎖可変ドメイン、第二のヒト重鎖可変ドメイン、ヒト軽鎖ドメインの全てを、単一のベクター上または独立のベクター上でコードするＤＮＡにより形質転換される。しかし、第一のヒト重鎖可変ドメイン、第二のヒト重鎖可変ドメイン、およびヒト軽鎖ドメイン（二重特異性抗体の成分）を、独立の発現系において発現させ、発現させたポリペプチドをｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてカップリングさせることも可能である。様々な実施形態では、ヒト軽鎖ドメインは、例えば、ＣＤＲコドンにおける、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を除けば、生殖細胞系列配列に由来する。様々な実施形態では、ヒト軽鎖ドメインは、軽鎖ドメインの軽鎖可変配列内に、１カ所以下、２カ所以下、３カ所以下、４カ所以下、または５カ所以下の体細胞超変異を含む。いくつかの実施形態では、体細胞超変異は、軽鎖可変領域の生殖細胞系列配列へと導入された、少なくとも１つのヒスチジン残基の存在を変化させない。

様々な実施形態では、少なくとも１つの非ヒスチジンのヒスチジンによる置換を有する２つの重鎖および単一のヒト軽鎖をコードする核酸（複数可）（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）を、さらなるクローニング（ＤＮＡの増幅）および／または発現のために、複製可能なベクターへと挿入する。多くのベクターが利用可能であり、以下：シグナル配列、複製起点、１つまたは複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、および転写終結配列のうちの１つまたは複数を一般に含むが、これらに限定されない。各成分は、個別に選択することもでき、宿主細胞の選択に基づき選択することもでき、実験により決定される他の基準に基づき選択することもできる。当技術分野では、各成分の複数の例が公知である。

発現ベクターおよびクローニングベクターは通常、宿主生物体により認識されるプロモーターを含有し、二重特異性抗体の各成分または全ての成分をコードする核酸配列に作動可能に連結される。様々な潜在的な宿主細胞により認識される多数のプロモーターが周知である。これらのプロモーターは、制限酵素消化により供給源のＤＮＡからプロモーターを除去し、単離されたプロモーター配列をベクターへと挿入することにより、二重特異性抗体をコードするＤＮＡに作動可能に連結する。

真核生物の宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、または他の多細胞生物体からの有核細胞）において用いられる発現ベクターはまた、転写の終結およびｍＲＮＡの安定化に必要な配列も含有し得る。このような配列は、真核生物またはウイルスのＤＮＡまたはｃＤＮＡの５’側非翻訳領域から一般に入手可能であり、必要に応じて、真核生物またはウイルスのＤＮＡまたはｃＤＮＡの３’側非翻訳領域からも入手可能である。これらの領域は、二重特異性抗体成分をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分内のポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含有する。様々な実施形態に好適な発現ベクターは、二重特異性抗体をコードするＤＮＡの、哺乳動物細胞における一過性発現をもたらす発現ベクターを含む。宿主細胞が、発現ベクターの多くのコピーを蓄積し、発現ベクターによりコードされる高レベルの、所望のポリペプチドを合成するように、一般に、一過性発現は、宿主細胞内で効率的に複製することが可能な発現ベクターの使用を包含する。好適な発現ベクターおよび宿主細胞を含む一過性発現系は、第一のヒト重鎖可変ドメインまたは第二のヒト重鎖可変ドメインのホモ二量体を有する親抗体と比べて、クローニングされるＤＮＡによりコードされるポリペプチドの簡便な陽性同定、ならびに所望の結合特異性／親和性または所望のゲル移動特徴を有する二重特異性抗体の迅速なスクリーニングを可能とする。

様々な実施形態では、二重特異性抗体の成分をコードするＤＮＡが、上記で記載した所望のベクター（複数可）へとアセンブルされたら、それらを、発現および回収に好適な宿主細胞へと導入する。宿主細胞をトランスフェクトすることにより、選択された宿主細胞に適切な、当技術分野で公知の標準的な技法（例えば、エレクトロポレーション、核内マイクロインジェクション、インタクトの細胞との細菌プロトプラスト融合、またはポリカチオン、例えば、ポリブレン、ポリオルニチンなど）を用いて達成することができる。

様々な実施形態では、成分を含有し、二重特異性抗体種の最も効率的で好適な産生を可能とする発現ベクターに最適な宿主細胞を選択する。発現のための例示的な宿主細胞には、原核生物および真核生物（単細胞または多細胞）のもの、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉの株、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．など）、マイコバクテリア細胞、真菌細胞、酵母細胞（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓ．ｐｏｍｂｅ、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａなど）、植物細胞、昆虫細胞（例えば、ＳＦ−９、ＳＦ−２１、バキュロウイルス感染昆虫細胞、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉなど）、ヒト以外の動物細胞、ヒト細胞、または例えばハイブリドーマもしくはクアドローマなどの細胞融合体が挙げられる。種々の実施形態では、細胞はヒト、サル、類人猿、ハムスター、ラットまたはマウスの細胞である。種々の実施形態では、細胞は、以下から選択される真核細胞である：ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯ Ｋ１、ＤＸＢ−１１ ＣＨＯ、Ｖｅｇｇｉｅ−ＣＨＯ）、ＣＯＳ（例えば、ＣＯＳ−７）、網膜細胞、Ｖｅｒｏ、ＣＶ１、腎臓（例えば、ＨＥＫ２９３、２９３ ＥＢＮＡ、ＭＳＲ ２９３、ＭＤＣＫ、ＨａＫ、ＢＨＫ）、ＨｅＬａ、ＨｅｐＧ２、ＷＩ３８、ＭＲＣ ５、Ｃｏｌｏ２０５、ＨＢ ８０６５、ＨＬ−６０（例えば、ＢＨＫ２１）、Ｊｕｒｋａｔ、Ｄａｕｄｉ、Ａ４３１（表皮性）、ＣＶ−１、Ｕ９３７、３Ｔ３、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、ＳＰ２／０、ＮＳ−０、ＭＭＴ ０６０５６２、Ｓｅｒｔｏｌｉ細胞、ＢＲＬ ３Ａ細胞、ＨＴ１０８０細胞、骨髄腫細胞、腫瘍細胞および前記細胞に由来する細胞系。種々の実施形態では、細胞は、１つまたは複数のウイルス遺伝子を含む（例えばウイルス遺伝子を発現する網膜細胞（例えば、ＰＥＲ．Ｃ６^ＴＭ細胞））。

二重特異性抗体を産生するのに用いられる哺乳動物の宿主細胞は、様々な培地中で培養することができる。ハムＦ１０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（（ＭＥＭ）；Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）、およびダルベッコ改変イーグル培地（（ＤＭＥＭ）；Ｓｉｇｍａ）などの市販される培地は、宿主細胞を培養するのに好適である。培地には、必要に応じて、ホルモンおよび／もしくは他の成長因子（インスリン、トランスフェリン、または上皮成長因子など）、塩（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、およびリン酸塩など）、バッファ（ＨＥＰＥＳなど）、ヌクレオシド（アデノシンおよびチミジンなど）、抗生剤（ＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮ^ＴＭなど）、微量元素（通常マイクロモル濃度範囲の最終濃度で存在する無機化合物として定義される）、ならびにブドウ糖、または同等なエネルギー供給源を補充することができる。他の任意の補充物質もまた、当業者に公知の適切な濃度で含めることができる。様々な実施形態では、温度、ｐＨなどの培養条件は、発現について選択された宿主細胞で既に用いられた培養条件であり、当業者には明らかである。

二重特異性抗体は、分泌されるポリペプチドとして、培養培地から回収することができるが、分泌シグナルを伴わずに直接産生される場合は、宿主細胞溶解物からも回収することができる。二重特異性抗体が、膜結合型である場合は、好適な洗浄剤溶液（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ １００）を用いて、膜から放出させることができる。

単離に続き、２つのヒト重鎖と、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む、Ｖκ１−３９Ｊκ５配列およびＶκ３−２０／κ１配列から選択される、再構成されたヒト軽鎖可変領域遺伝子配列に由来する、単一のヒト軽鎖とを含む二重特異性抗体を、その抗原の一方、好ましくは両方の、ｐＨ依存性結合を示すその能力についてスクリーニングする。その抗原に対し、中性ｐＨと酸性ｐＨとで結合が異なる二重特異性抗体の能力（例えば、酸性ｐＨにおいて、中性ｐＨにおける場合と比較してｔ_１／２の短縮を明らかに示すそれらの能力）は、当技術分野で利用可能な様々な技法により決定することができ、下記の実施例、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ^ＴＭアッセイにおいて記載されている。

ｐＨ依存性の抗原結合を有する抗原結合タンパク質を生成するためのさらなる方法
本明細書に記載されている、遺伝子改変された非ヒト動物において、ｐＨ依存性の抗原結合特性を有する抗原結合タンパク質を生成する様々な方法が提供される。ｐＨ依存性の抗原結合特性を有する抗原結合タンパク質をｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて生成する方法もまた提供される。このような方法は、抗原結合タンパク質の様々な成分を、遺伝子改変された非ヒト動物において、ｉｎ ｖｉｖｏで生成するステップと、次いで、それらを改変するステップと、生物体の外部において、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、哺乳動物細胞培養物中で発現させるタンパク質複合体としてそれらを再アセンブルするステップとを包含し得る。

一実施形態では、ｐＨ依存性の抗原結合特性を有する抗原結合タンパク質を生成する方法は、米国出願公開第２０１１／０１９５４５４号、同第２０１２／００２１４０９号、同第２０１２／０１９２３００号、および同第２０１３／００４５４９２号において記載されているマウスなどの「ユニバーサル軽鎖」マウスまたは「共通軽鎖」マウス（「ＵＬＣ」マウス）である、軽鎖可変領域のＶセグメントおよびＪセグメント、例えば、ヒト軽鎖可変領域のＶセグメントおよびＪセグメントの限定されたレパートリーを含むマウスにおいて生成される抗原結合タンパク質配列、例えば、抗体配列を使用する。一実施形態では、ｐＨ依存性の抗原結合特性を有する抗原結合タンパク質を生成する方法は、単一の、再構成されたヒト軽鎖可変領域遺伝子配列を含むマウスにおいて生成される抗原結合タンパク質配列を使用する。一実施形態では、方法は、ヒトＶκ１−３９Ｊκ５およびヒトＶκ３−２０Ｊκ１から選択される、単一の、再構成されたヒト軽鎖可変領域遺伝子配列を含むマウスにおいて生成される抗原結合タンパク質を使用する。

一実施形態では、ｐＨ依存性の抗原結合特性を有する抗原結合タンパク質、例えば、抗体を生成するための方法は、目的の抗原に結合する（例えば、目的の抗原に所望の親和性で結合する）第一の抗体を選択するステップと、第一の抗体の免疫グロブリン軽鎖ヌクレオチド配列を、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含むように改変するステップと、第一の抗体の免疫グロブリン重鎖および改変された免疫グロブリン軽鎖を細胞内で発現させるステップと、細胞内で発現させた第二の抗体であって、中性ｐＨでは、目的の抗原への結合を保持し（例えば、目的の抗原に対する所望の親和性を保持し）、酸性ｐＨでは、目的の抗原への結合の低減を提示する第二の抗体を選択するステップとを含む。

一実施形態では、ｐＨ依存性の抗原結合特性を有する抗原結合タンパク質、例えば、抗体を生成するための方法は、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列を有する免疫グロブリン軽鎖を含む抗体（例えば、非ヒト動物、例えば、マウス、例えば、ＵＬＣマウスから得られる）からの免疫グロブリン重鎖であって、抗体が目的の抗原に結合する（例えば、目的の抗原に所望の親和性で結合する）免疫グロブリン重鎖を選択するステップと；免疫グロブリン軽鎖の核酸配列を、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列が、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含むように改変するステップと；選択された免疫グロブリン重鎖および少なくとも１つのアミノ酸のヒスチジンによる置換をその可変ドメイン内に含む免疫グロブリン軽鎖を発現させるステップと；中性ｐＨでは、目的の抗原への結合を保持する（例えば、目的の抗原への所望の親和性を保持する）が、酸性ｐＨでは、目的の抗原への結合の低減を提示する抗体を選択するステップとを含む。様々な実施形態では、免疫グロブリン重鎖は、ヒト重鎖可変遺伝子セグメント（ヒトＶセグメント、ヒトＤセグメントおよびヒトＪセグメント）の再構成に由来する。

一実施形態では、ｐＨ依存性の抗原結合特性を有する抗原結合タンパク質、例えば、抗体を生成するための方法は、（１）単一の、再構成されたヒト軽鎖可変領域遺伝子配列および再構成されていないヒト重鎖可変遺伝子セグメント（Ｖセグメント、Ｄセグメント、およびＪセグメント）のレパートリーを含む非ヒト動物、例えば、マウスを、目的の抗原で免疫し、マウスに前記抗原に対する免疫応答を開始させるステップと、（２）非ヒト動物において、例えば、マウスにおいて、目的の抗原に所望の親和性で結合する抗体を選択するステップと、（３）非ヒト動物から、例えば、マウスから、目的の抗原に所望の親和性で結合する抗体の免疫グロブリン重鎖のヌクレオチド配列を単離するステップと、（４）前記重鎖のヌクレオチド配列を決定するステップと、（５）単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域を含有する免疫グロブリン軽鎖のヌクレオチド配列を、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含むように改変するステップと、（６）目的の抗原に所望の親和性で結合する抗体の免疫グロブリン重鎖およびヒスチジン改変を含む免疫グロブリン軽鎖を細胞内で発現させるステップと、（７）細胞内で発現した抗体が、中性ｐＨでは、抗原への結合を保持するが、酸性ｐＨでは、結合の低減を提示するのかどうかを決定するステップとを含む。一実施形態では、細胞内で発現した抗体は、中性ｐＨにおいて、抗原への所望の親和性を示す。様々な実施形態では、免疫グロブリン重鎖は、ヒト重鎖可変遺伝子セグメント（ヒトＶセグメント、ヒトＤセグメント、およびヒトＪセグメント）の再構成に由来する。

一実施形態では、単一の、再構成されたヒト軽鎖可変領域遺伝子配列を含むマウスは、例えば、米国出願公開第２０１１／０１９５４５４号、同第２０１２／００２１４０９号、同第２０１２／０１９２３００号、および同第２０１３／００４５４９２号において記載されている、ユニバーサル軽鎖マウスまたは共通軽鎖マウスまたは「ＵＬＣ」マウスである。一実施形態では、単一の、再構成されたヒト軽鎖可変領域遺伝子配列は、ヒトＶκ１−３９Ｊκ５およびヒトＶκ３−２０Ｊκ１配列から選択される。

一実施形態では、目的の抗原は、可溶性抗原、細胞表面抗原（例えば、腫瘍抗原）、および細胞表面受容体から選択される。具体的な実施形態では、細胞表面受容体は、免疫グロブリン受容体である。具体的な実施形態では、免疫グロブリン受容体は、Ｆｃ受容体である。

一実施形態では、中性ｐＨにおける解離定数（Ｋ_Ｄ）として表される、抗原に対する抗体の所望の親和性は、１０^−６Ｍ未満、例えば、１０^−８Ｍ未満、例えば、１０^−９Ｍ未満、例えば、１０^−１０Ｍ未満、例えば、１０^−１１Ｍ未満、例えば、１０^−１２Ｍ未満である。

上記で説明した通り、一実施形態では、ＵＬＣマウスは、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変遺伝子配列を含み、抗原に応答して抗体を発現するが、この場合、抗体の抗原への親和性は、主にそれらの抗体の重鎖によって媒介される。これらのマウスは、単一の、再構成されたヒト軽鎖可変配列に由来する軽鎖もまた含む抗体のヒト重鎖可変ドメインをコードするように再構成する、ヒト重鎖可変（Ｖ、Ｄ、およびＪ）セグメントのレパートリーを含む。一実施形態では、抗原曝露により、これらのマウスは、多様なヒト重鎖可変（Ｖ、Ｄ、およびＪ）セグメントのレパートリーを使用して、抗原に対する親和性および特異性を有する抗体を生成する。したがって、抗原へと曝露したら、ＵＬＣマウスにおいて生成される抗体の免疫グロブリン重鎖のヌクレオチド配列を単離し、これを使用して、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列（例えば、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を有する、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列）に由来する免疫グロブリン軽鎖もまた含む、所望の結合タンパク質を生成することができる。

ＵＬＣマウスの一実施形態では、再構成されていない非ヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントのうちの９０〜１００％を、少なくとも１つの、再構成されていないヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントで置きかえる。具体的な実施形態では、内因性非ヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントの全てまたは実質的に全て（例えば、９０〜１００％）を、少なくとも１つの、再構成されていないヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントで置きかえる。一実施形態では、置きかえは、少なくとも１９、少なくとも３９、または少なくとも８０もしくは８１の再構成されていないヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントによる置きかえである。一実施形態では、置きかえは、少なくとも１２の機能的な、再構成されていないヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメント、少なくとも２５の機能的な、再構成されていないヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメント、または少なくとも４３の機能的な、再構成されていないヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントによる置きかえである。一実施形態では、非ヒト動物は、全ての非ヒトＤ_Ｈセグメントおよび非ヒトＪ_Ｈセグメントの、少なくとも１つの、再構成されていないヒトＤ_Ｈセグメント、および少なくとも１つの、再構成されていないヒトＪ_Ｈセグメントによる置きかえを含む。一実施形態では、非ヒト動物は、全ての非ヒトＤ_Ｈセグメントおよび非ヒトＪ_Ｈセグメントの、全ての、再構成されていないヒトＤ_Ｈセグメント、および全ての、再構成されていないヒトＪ_Ｈセグメントによる置きかえを含む。したがって、ＵＬＣマウスは、ヒト可変領域遺伝子セグメント（Ｖセグメント、Ｄセグメント、およびＪセグメント）の多様なレパートリーを使用して、目的の抗原に応答する抗体を生成する。

目的の抗原に所望の親和性で結合する抗体の重鎖を決定したら、重鎖のヌクレオチド配列を単離および配列決定する。配列は、好適な宿主細胞、例えば、真核生物細胞、例えば、ＣＨＯ細胞における発現のためのベクターへとクローニングする。一実施形態では、ヒト重鎖定常領域の配列を、マウス（例えば、ＵＬＣマウス）から単離されたヒト重鎖可変領域配列の下流にクローニングする。

一実施形態では、ｐＨ依存性の抗原結合特性を有する抗原結合タンパク質の生成は、免疫グロブリン軽鎖のヌクレオチド配列、特に、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域の配列を、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含むように改変するステップを含む。当技術分野では、ヌクレオチド配列を改変するための様々な技法、例えば、部位指向変異生成が公知である。加えて、所望のヒスチジン置換を含むヌクレオチド配列は、デノボ合成することもできる。

一実施形態では、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換は、１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ超のヒスチジン残基の発現を結果としてもたらす置換を含む。一実施形態では、置換（複数可）は、３つまたは４つのヒスチジン残基の発現を結果としてもたらす。一実施形態では、置換（複数可）は、免疫グロブリン軽鎖可変領域においてである。一実施形態では、置換（複数可）は、ＣＤＲコドン、例えば、ＣＤＲ１コドン、ＣＤＲ３コドン、および／またはＣＤＲ３においてである。一実施形態では、置換（複数可）は、ＣＤＲ３コドンにおいてである。

免疫グロブリン軽鎖核酸配列がＶκ１−３９Ｊκ５遺伝子配列を含み、置換（複数可）がＣＤＲ３コドンにおいてである一実施形態では、置換は、１０５、１０６、１０８、１１１位、およびこれらの組合せから選択される位置におけるヒスチジンの発現を結果としてもたらす。一実施形態では、置換は、１０５、１０６、１０８、および１１１位におけるヒスチジンの発現を結果としてもたらす。一実施形態では、置換は、１０５および１０６位におけるヒスチジンの発現を結果としてもたらす。一実施形態では、置換は、１０５および１０８位におけるヒスチジンの発現を結果としてもたらす。一実施形態では、置換は、１０５および１１１位におけるヒスチジンの発現を結果としてもたらす。一実施形態では、置換は、１０６および１０８位におけるヒスチジンの発現を結果としてもたらす。一実施形態では、置換は、１０６および１１１位におけるヒスチジンの発現を結果としてもたらす。一実施形態では、置換は、１０８および１１１位におけるヒスチジンの発現を結果としてもたらす。一実施形態では、置換は、１０５、１０６、および１０８位におけるヒスチジンの発現を結果としてもたらす。一実施形態では、置換は、１０５、１０６、および１１１位におけるヒスチジンの発現を結果としてもたらす。一実施形態では、置換は、１０５、１０８、および１１１位におけるヒスチジンの発現を結果としてもたらす。一実施形態では、置換は、１０６、１０８、および１１１位におけるヒスチジンの発現を結果としてもたらす。様々なヒスチジン置換を含むＶκ１−３９Ｊκ５のＣＤＲ３領域のアミノ酸配列および核酸配列を、図２に示し、配列表にも含める。

免疫グロブリン軽鎖核酸配列がＶκ３−２０Ｊκ１遺伝子配列を含み、置換（複数可）がＣＤＲ３コドンにおいてである一実施形態では、置換は、１０５、１０６、１０７、１０９位、およびこれらの組合せから選択される位置におけるヒスチジンの発現を結果としてもたらす。一実施形態では、置換は、１０５、１０６、１０７、および１０９位におけるヒスチジンの発現を結果としてもたらす。一実施形態では、置換は、１０５および１０６位におけるヒスチジンの発現を結果としてもたらす。一実施形態では、置換は、１０５および１０７位におけるヒスチジンの発現を結果としてもたらす。一実施形態では、置換は、１０５および１０９位におけるヒスチジンの発現を結果としてもたらす。一実施形態では、置換は、１０６および１０７位におけるヒスチジンの発現を結果としてもたらす。一実施形態では、置換は、１０６および１０９位におけるヒスチジンの発現を結果としてもたらす。一実施形態では、置換は、１０７および１０９位におけるヒスチジンの発現を結果としてもたらす。一実施形態では、置換は、１０５、１０６、および１０７位におけるヒスチジンの発現を結果としてもたらす。一実施形態では、置換は、１０５、１０６、および１０９位におけるヒスチジンの発現を結果としてもたらす。一実施形態では、置換は、１０５、１０７、および１０９位におけるヒスチジンの発現を結果としてもたらす。一実施形態では、置換は、１０６、１０７、および１０９位におけるヒスチジンの発現を結果としてもたらす。様々なヒスチジン置換を含むＶκ３−２０Ｊκ１のＣＤＲ３領域の選択されたアミノ酸配列および核酸配列を、図２７に示し、配列表にも含める。

免疫グロブリン軽鎖、例えば、ヒト免疫グロブリン軽鎖可変ドメインの配列を、ヒスチジン残基を所望の位置に含むように改変したら、軽鎖のヌクレオチド配列を、好適な宿主細胞、例えば、真核生物細胞、例えば、ＣＨＯ細胞における発現のためのベクターへとクローニングする。一実施形態では、ヒト軽鎖定常領域の配列を、ヒト可変領域の改変されたヌクレオチド配列の下流にクローニングする。

一実施形態では、改変されたヒト免疫グロブリン軽鎖および選択されたヒト免疫グロブリン重鎖をコードするヌクレオチド配列を含むベクターを、好適な宿主細胞、例えば、真核生物の宿主細胞、例えば、ＣＨＯ細胞内で共発現させて、抗原結合タンパク質を生成する。当技術分野では、発現のために用い得る様々な宿主細胞が公知であり、本明細書を通して言及される。

宿主細胞において生成される抗原結合タンパク質、例えば、抗体は、細胞上清へと分泌させることができ、これを、中性ｐＨにおける適正な発現および元の抗原に対する親和性についてスクリーニングする。抗原結合タンパク質はまた、細胞溶解物からも回収することができ、膜結合型である場合は、好適な洗浄剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ）を用いて、膜から放出させることもできる。所望の特徴を有する抗原結合タンパク質は、精製することができる。

一実施形態では、ヒスチジン改変（複数可）を含む抗原結合タンパク質は、ヒスチジン改変（複数可）を含まない同じ（元の）抗原結合タンパク質の抗原に対する親和性と同等な、抗原に対する親和性を保持する。一実施形態では、中性ｐＨにおける解離定数（Ｋ_Ｄ）として表される、ヒスチジン改変抗原結合タンパク質の目的の抗原に対する親和性は、１０^−６Ｍ未満、例えば、１０^−８Ｍ未満、例えば、１０^−９Ｍ未満、例えば、１０^−１０Ｍ未満、例えば、１０^−１１Ｍ未満、例えば、１０^−１２Ｍ未満である。

一実施形態では、本明細書に記載されているヒスチジン改変を含む抗原結合タンパク質、例えば、抗体は、ｐＨ依存性の抗原結合特性を示す。一実施形態では、ヒスチジン改変を含む抗原結合タンパク質は、ヒスチジン改変を有さない同等な抗原結合タンパク質（ヒスチジン改変を除けば、同じアミノ酸配列の抗原結合タンパク質）を凌駕する、増強したｐＨ依存特性を保有する。一実施形態では、本明細書に記載されている抗原結合タンパク質は、中性ｐＨでは、抗原への結合を保持する（例えば、中性ｐＨでは、抗原に対する所望の親和性を保持する）が、酸性ｐＨでは、結合の低減を提示する。一実施形態では、本明細書に記載されている、抗原結合タンパク質、例えば、抗体は、中性ｐＨでは、抗原への結合を保持するが、酸性ｐＨでは、抗原への結合を示さない。一実施形態では、本明細書に記載されている抗原結合タンパク質は、中性ｐＨにおける抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ_１／２）と比較して、酸性ｐＨで、解離半減期（ｔ_１／２）の少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、または少なくとも約３０倍の短縮を有する。一実施形態では、本明細書に記載されている抗原結合タンパク質のｔ_１／２は、酸性ｐＨおよび３７℃で、約２分間以下である。一実施形態では、本明細書に記載されている抗原結合タンパク質のｔ_１／２は、酸性ｐＨおよび３７℃で、約１分間未満である。一実施形態では、本明細書に記載されている抗原結合タンパク質のｔ_１／２は、酸性ｐＨおよび２５℃で、約２分間以下である。一実施形態では、本明細書に記載されている抗原結合タンパク質のｔ_１／２は、酸性ｐＨおよび２５℃で、約１分間未満である。

一実施形態では、本明細書に記載されているヒスチジン改変を含む抗原結合タンパク質、例えば、抗体は、治療用量を被験体へと投与すると、同等な治療用量の、ヒスチジン改変を含まない抗原結合タンパク質（例えば、ヒスチジン改変を含まない、元の抗原結合タンパク質）を投与したときの血清半減期と比較して、血清半減期の延長を示す。いくつかの実施形態では、ある用量の、本明細書に記載されているヒスチジン改変を含む抗原結合タンパク質を投与したときの血清半減期の、同じ用量の、ヒスチジン改変を含まない抗原結合タンパク質を投与したときの血清半減期に対する延長は、約２倍、例えば、約５倍、例えば、約１０倍、例えば、約１５倍、例えば、約２０倍、またはそれ超である。一実施形態では、血清半減期は、少なくとも約１日間、例えば、少なくとも約２日間、例えば、少なくとも約７日間、例えば、少なくとも約１４日間、例えば、少なくとも約３０日間、例えば、少なくとも約６０日間である。

上記で記載した、ｐＨ依存性の抗原結合特性を有する抗原結合タンパク質をｉｎ ｖｉｔｒｏで生成するための方法に加えて、本明細書では、前記方法により生成される抗原結合タンパク質、例えば、抗体もまた提供される。加えて、前記方法は、マウスにおける共通（ユニバーサル）軽鎖に結合する、２つの異なるヒト免疫グロブリン重鎖を選択し、重鎖のヌクレオチド配列を決定し、ユニバーサル軽鎖を、上記で記載したヒスチジン置換を含むように改変し、単一の、ヒスチジン改変ユニバーサル軽鎖を有する２つのヒト重鎖を宿主細胞内で共発現させることにより、多重特異性、例えば、二重特異性の抗原結合タンパク質を生成するのにも使用することができる。上記で記載した抗原結合タンパク質を生成するための様々なステップは、二重特異性抗原結合タンパク質を生成する方法へも適用することができる。抗原（複数可）に対する所望の親和性およびｐＨ依存性の抗原結合特性を保有することが確認された二重特異性抗原結合タンパク質は、精製することができる。したがって、２つのヒト重鎖および、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含むヒト可変領域遺伝子、例えば、Ｖκ１−３９Ｊκ５可変領域遺伝子またはＶκ３−２０Ｊκ１可変領域遺伝子によりコードされるヒト軽鎖可変ドメイン配列を含む単一のヒト軽鎖を含む二重特異性抗体が提供される。

ヒト免疫グロブリン重鎖と、ヒスチジン置換を含むヒト免疫グロブリン軽鎖とを含む抗原結合タンパク質の作製において使用される構築物もまた提供される。本明細書に記載されている抗原結合タンパク質、例えば、抗体を発現する宿主細胞もまた提供される。

以下の実施例は、本発明を作製および使用する方法についての完全な開示および記載を当業者に提示するように示されるものであり、本発明者らが自身の発明とみなすものの範囲を限定することを意図するものでも、下記の実験が、実施される全てまたは唯一の実験であることを表すことを意図するものでもない。用いる数（例えば、量、温度など）に関して正確性を保証するように努めたが、多少の実験誤差および偏差があることが考慮されるべきである。特に明記しない限り、部分は重量部分であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏度で示され、気圧は大気圧またはその近くである。

（実施例１）
ヒスチジンで置換したＤ遺伝子セグメントを含むヒト化免疫グロブリン重鎖遺伝子座の構築
細菌人工染色体（ＢＡＣ）のＤＮＡを用いる、細菌細胞における一連の相同組換え反応（ＢＨＲ）により、ヒスチジンで置換したヒトＤ遺伝子セグメントを含む免疫グロブリン重鎖遺伝子座の構築を実行した。ＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）遺伝子操作技術（例えば、米国特許第６，５８６，２５１号およびValenzuela, D. M.ら（２００３年）、「High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis」、Nature Biotechnology、２１巻（６号）：６５２〜６５９頁を参照されたい）を用いて、１つまたは複数のヒスチジン残基を含む重鎖可変ドメインを発現する遺伝子操作マウスを作製するためのいくつかのターゲッティング構築物を生成した。

まず、ヒトＤ遺伝子セグメントを、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏで、親水性フレームにおけるチロシン（Ｙ）、アスパラギン（Ｎ）、セリン（Ｓ）、グリシン（Ｇ）、およびアスパラギン酸（Ｄ）をコードするコドンをヒスチジンコドンで置換した４つの部分（４つの反復配列）（以下では、「ヒスチジンで置換したヒトＤ遺伝子セグメント」、すなわち、ＨＤ１．１−６．６（９５８６ｂｐ；配列番号１）、ＨＤ１．７−６．１３（９２６８ｂｐ；配列番号２）、ＨＤ１．１４−６．１９（９４４１ｂｐ；配列番号３）、およびＨＤ１．２０−６．２５、１．２６（１１５９２ｂｐ；配列番号４）；図３）として合成した。４つの反復配列はまた、末端に、それらを一緒にライゲーションし戻すための固有の制限酵素部位も含有した。各ヒトＤ遺伝子セグメントにおけるヒスチジン置換の具体的な位置（太字の字体で表示された）を、図１Ａおよび１Ｂの「親水性」と表示された列に示す。図１に示す通り、改変は、ヒスチジンコドンを親水性リーディングフレームに導入する一方で、「終止」リーディングフレームにおける一部の終止コドンをセリンコドンに変えもした。しかし、改変は、「疎水性」リーディングフレームにおける変化をほとんどもたらさなかった。４つの合成されたＤセグメントの反復配列をライゲーションするための詳細な手順を、図３に例示する（逐次的ライゲーション）。結果として得られるクローンは、５’側から３’側にかけて、５’側マウス相同性アーム、ｌｏｘＰに挟まれたネオマイシンカセット、ヒスチジン置換を含むヒトＤ遺伝子セグメント（すなわち、ＨＤ１．１−６．６（９５８６ｂｐ；配列番号１）、ＨＤ１．７−６．１３（９２６８ｂｐ；配列番号２）、ＨＤ１．１４−６．１９（９４４１ｂｐ；配列番号３）、およびＨＤ１．２０−６．２５、１．２６（１１５９２ｂｐ；配列番号４））、クロラムフェニコール選択カセット、および３’側相同性アームを含有した。

ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ヒト化マウスにおける内因性のヒトＤ遺伝子セグメントを、上記のヒスチジンで置換したヒトＤ遺伝子セグメントで置きかえるために、以下の６つの遺伝子改変を実行した。

第一に、スペクチノマイシン選択カセットおよびＡｓｉＳＩ制限部位を含有するｐＬＭａ０１７４を、ＭＡＩＤ １１１６クローンの５’端へとターゲッティングした（ステップ１： ＢＨＲ（Ｓｐｅｃ）；図２）。ステップ１の間、それらの全てがｈＶ_Ｈ６−１の５’側上流に位置する、クロラムフェニコール選択カセット、ネオマイシン選択カセット、ｌｏｘＰ部位、２つのＶ_Ｈ遺伝子セグメント（ｈＶ_Ｈ１−３およびｈＶ_Ｈ１−２）、およびヒトＡｄａｍ６ｐ遺伝子を、ＭＡＩＤ １１１６クローンから欠失させ、スペクチノマイシンカセットで置きかえて、ＶＩ４３３クローンを作製した。

第二に、ステップ２（ＢＨＲ（Ｈｙｇ＋Ｓｐｅｃ）；図２）では、ＦＲＴ部位に挟まれるハイグロマイシンカセットを含有するｐＮＴｕ０００２を、ヒト免疫グロブリンＤ_Ｈ遺伝子セグメントを含む領域へとターゲッティングした。ステップ２の間、全てのヒト重鎖Ｄ遺伝子セグメントを、ＶＩ４３３から欠失させ、ハイグロマイシンカセットで置きかえて、ＭＡＩＤ６０１１ ＶＩ４３４（クローン１）を作製した。改変はまた、ハイグロマイシンカセットの５’端および３’端に、ＰＩ−ＳｃｅＩ制限部位およびＩ−ＣｅｕＩ制限部位も導入した。

第三に、制限消化およびライゲーションを介して、ヒスチジンで置換したヒトＤ遺伝子セグメント（ＨＤ１．１−６．６（９５８６ｂｐ；配列番号１）、ＨＤ１．７−６．１３（９２６８ｂｐ；配列番号２）、ＨＤ１．１４−６．１９（９４４１ｂｐ；配列番号３）、およびＨＤ１．２０−６．２５、１．２６（１１５９２ｂｐ；配列番号４））を含むゲノム領域を、ＭＡＩＤ ６０１１ ＶＩ４３４のＰＩ−ＳｃｅＩ部位とＩ−ＣｅｕＩ部位との間の領域へと導入した（ＰＩ−ＳｃｅＩ／Ｉ−ＣｅｕＩ間のライゲーションにより、１１１６を改変した（Ｋａｎ＋Ｓｐｅｃ）；図４）。これは、５’側から３’側にかけて、スペクチノマイシンカセット、Ｖ_Ｈ６−１を含む約５０ｋｂのゲノム領域、ｌｏｘＰに挟まれたネオマイシンカセット、約４０ｋｂのヒスチジンで置換したヒトＤ遺伝子セグメント（ＨＤ１．１−６．６（９５８６ｂｐ；配列番号１）、ＨＤ１．７−６．１３（９２６８ｂｐ；配列番号２）、ＨＤ１．１４−６．１９（９４４１ｂｐ；配列番号３）、およびＨＤ１．２０−６．２５、１．２６（１１５９２ｂｐ；配列番号４））、およびヒトＪ_Ｈ遺伝子セグメントを含有する約２５ｋｂのゲノム領域に続いて、マウスＥｉ（ｍＩｇＨイントロンエンハンサー；配列番号５）、マウススイッチ領域（配列番号６）、ならびにマウスＩｇＭ定常領域のヌクレオチド配列（ｍＩｇＭエクソン１；配列番号７）を含有するＭＡＩＤ６０１２ ＶＩ４６９を作製した。改変を含有する細菌細胞を、カナマイシン選択およびスペクチノマイシン選択に基づき選択した。

第四に、図５に例示される通り、全ての内因性のヒトＤ遺伝子セグメントを、ＭＡＩＤ １４６０クローンから除去するために、ＭＡＩＤ １４６０ヘテロ接合性マウスＥＳ細胞を、エレクトロポレーションを介して、ＭＡＩＤ ６０１１ ＶＩ４３４でターゲッティングした。これにより、その免疫グロブリン重鎖遺伝子座に（１２９系統に由来する染色体に）、５’側から３’側にかけて、ＦＲＴ部位、ヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメント、ａｄａｍ６ａ／ｂ遺伝子を包含するマウスゲノム領域、ＦＲＴ部位に挟まれるハイグロマイシンカセット、およびヒトＪ_Ｈセグメントに続いて、マウスＥｉ配列およびＩｇＭ定常領域のヌクレオチド配列を含むＭＡＩＤ ６０１１ヘテロ接合性マウスＥＳ細胞が作製された。ＭＡＩＤ ６０１１の遺伝子改変（対立遺伝子の喪失、対立遺伝子の獲得、および親対立遺伝子の存在）は、図６に示されるプローブおよびプライマーを用いることにより確認した。

第五に、ヒスチジンで置換したヒトＤ遺伝子セグメント（すなわち、ＨＤ１．１−６．６（９５８６ｂｐ；配列番号１）、ＨＤ１．７−６．１３（９２６８ｂｐ；配列番号２）、ＨＤ１．１４−６．１９（９４４１ｂｐ；配列番号３）、およびＨＤ１．２０−６．２５、１．２６（１１５９２ｂｐ；配列番号４））を、ＭＡＩＤ ６０１１へと導入するために、ＭＡＩＤ ６０１１ヘテロ接合性マウスＥＳ細胞に、ＭＡＩＤ ６０１２ ＶＩ４６９でエレクトロポレーションした。ターゲッティングステップにより、ｌｏｘＰに挟まれたハイグロマイシン選択カセットを、ＭＡＩＤ ６０１１から除去し、配列を、ヒスチジンで置換したヒトＤ遺伝子セグメントで置きかえた。これにより、野生型のヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントおよびＪ_Ｈ遺伝子セグメントならびに本明細書に記載されているヒスチジンで置換したヒトＤ遺伝子セグメントを含む、野生型のＣ５７ＢＬ／６系統に由来する染色体および遺伝子改変された１２９系統に由来する染色体を含む、ＭＡＩＤ ６０１２ヘテロ接合性ＥＳ細胞がもたらされた。加えて、ＥＳ細胞は、Ｖ_ＨセグメントとＤセグメントとの間に、ａｄａｍ６ａ／ｂ遺伝子を包含するマウスゲノム領域およびｌｏｘＰに挟まれたネオマイシンカセットを含有した（図７）。ＭＡＩＤ６０１２の遺伝子改変（対立遺伝子の喪失、対立遺伝子の獲得、および親対立遺伝子の存在）は、図８に示されるプローブおよびプライマーを用いることにより確認した。

最後に、ネオマイシン選択カセットを、ＭＡＩＤ ６０１２ ＥＳ細胞から除去するために、ＭＡＩＤ ６０１２ ＥＳ細胞に、Ｃｒｅレコンビナーゼを発現するプラスミドでエレクトロポレーションし、その結果として、ＭＡＩＤ ６０１３ヘテロ接合性ＥＳ細胞が得られた（図９）。最終のＭＡＩＤ ６０１３ヘテロ接合性（「ＭＡＩＤ ６０１３ ｈｅｔ」）ＥＳ細胞は、その免疫グロブリン重鎖遺伝子座に、図９に例示される通り、５’側から３’側にかけて、（１）ＦＲＴ部位；（２）ヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメント；（３）ａｄａｍ６ａ／ｂ遺伝子を包含するマウスゲノム領域；（４）ｌｏｘＰに挟まれたネオマイシン選択カセット；（５）ヒスチジンで置換したヒトＤ遺伝子セグメント（ＨＤ１．１−６．６（９５８６ｂｐ；配列番号１）、ＨＤ１．７−６．１３（９２６８ｂｐ；配列番号２）、ＨＤ１．１４−６．１９（９４４１ｂｐ；配列番号３）、およびＨＤ１．２０−６．２５、１．２６（１１５９２ｂｐ；配列番号４））；（６）ヒトＪ_Ｈ遺伝子セグメントに続いて；（７）マウスＥ_ｉ配列（ｍＩｇＨイントロンエンハンサー；配列番号５）；（８）スイッチ領域（配列番号６）；および（９）マウスＩｇＭ定常領域のヌクレオチド配列（ｍＩｇＭエクソン１；配列番号７）を含む野生型のＣ５７ＢＬ／６系統に由来する染色体および遺伝子改変された１２９系統に由来する染色体を含有する。

ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）法により、上記のターゲッティングＥＳ細胞（ＭＡＩＤ ６０１３）をドナーＥＳ細胞として用い、８細胞期マウス胚へと導入した（例えば、ＵＳ７，５７６，２５９、ＵＳ７，６５９，４４２、ＵＳ７，２９４，７５４、ＵＳ２００８−００７８０００Ａ１を参照されたい）。図８に示されるプライマーおよびプローブを用いる遺伝子型決定により、本明細書に記載されているヒスチジンで置換したヒト重鎖Ｄ遺伝子セグメントを含む、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座を保有するマウスを同定した。結果として得られる遺伝子改変されたＦ０マウスを、野生型マウスへと交配させて、Ｆ１子孫を得た。Ｆ１仔マウスを遺伝子型決定し、ヒスチジンで置換したヒト重鎖Ｄ遺伝子セグメントを含む、遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座についてヘテロ接合性のＦ１仔マウスを、さらなる特徴づけのために選択した。

（実施例２）
再構成された重鎖可変領域ヌクレオチド配列の解析
次に、本明細書に記載されている、ヒスチジンで置換したヒトＤ遺伝子セグメントを含む、遺伝子改変されたマウス、例えば、その生殖細胞系列に、ヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメント、ヒトＪ_Ｈ遺伝子セグメント、およびヒスチジンで置換したヒトＤ遺伝子セグメント（ＨＤ１．１−６．６（９５８６ｂｐ；配列番号１）、ＨＤ１．７−６．１３（９２６８ｂｐ；配列番号２）、ＨＤ１．１４−６．１９（９４４１ｂｐ；配列番号３）、およびＨＤ１．２０−６．２５、１．２６（１１５９２ｂｐ；配列番号４）を含む、１２９系統に由来する染色体を含む、６０１３Ｆ０ヘテロ接合性マウスが、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座に由来する１つまたは複数のヒスチジンコドンを含む、再構成された重鎖Ｖ（Ｄ）Ｊ配列を発現することができるかどうかを調査した。

この目的で、６０１３ Ｆ０ヘテロ接合性マウスの脾臓Ｂ細胞から単離したｍＲＮＡ配列を、ヒスチジンで置換したヒトＤ遺伝子セグメントに由来するＩｇＭ ＣＤＲ３配列の存在について、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって解析した。

手短には、脾臓を摘出し、スライドガラスを用いて、１倍濃度のＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）中でホモジナイズした。遠心分離器内で細胞をペレット化し（５００×ｇで５分間にわたり）、ＡＣＫ Ｌｙｓｉｓ緩衝液（Ｇｉｂｃｏ）中で、３分間にわたり赤血球を溶解させた。細胞は、１倍濃度のＰＢＳで洗浄し、０．７μｍの細胞ストレーナーを用いて濾過した。ＣＤ１９についてのＭＡＣＳ磁気陽性選択（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて、Ｂ細胞を脾臓細胞から単離した。ＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、全ＲＮＡを、ペレット化されたＢ細胞から単離した。Ｏｌｉｇｏｔｅｘ（登録商標）Ｄｉｒｅｃｔ ｍＲＮＡミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、ポリＡ＋ｍＲＮＡを、全ＲＮＡから単離した。

ＳＭＡＲＴｅｒ（商標）Ｐｉｃｏ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いる５’ＲＡＣＥにより、二本鎖ｃＤＮＡを、脾性Ｂ細胞ｍＲＮＡから調製した。Ｃｌｏｎｔｅｃｈによる逆転写酵素およびｄＮＴＰを、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製のＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩおよびｄＮＴＰで代用した。ＩｇＭ定常領域に特異的なプライマーおよびＳＭＡＲＴｅｒ（商標）５’ＲＡＣＥプライマーを用いて、重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）抗体レパートリーを、ｃＤＮＡから増幅した（表１）。ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、ＰＣＲ産物を清浄化した。同じ５’ＲＡＣＥプライマーおよびＩｇＭ定常領域に特異的なネステッド３’プライマーを用いて、第二ラウンドのＰＣＲを行った（表２）。ＳｉｚｅＳｅｌｅｃｔ（商標）Ｅ−ｇｅｌ（登録商標）システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、第二ラウンドのＰＣＲ産物を精製した。４５４のアダプターおよびバーコードを付加したプライマーを用いて、三回目のＰＣＲを実施した。Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ（登録商標）ＡＭＰｕｒｅ（登録商標）ＸＰ Ｂｅａｄｓを用いて、第三ラウンドのＰＣＲ産物を精製した。精製されたＰＣＲ産物は、ＫＡＰＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＫＡＰＡ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いるＳＹＢＲ（登録商標）−ｑＰＣＲにより定量化した。４５４ ＧＳ Ｊｕｎｉｏｒ Ｔｉｔａｎｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ Ｌｉｂ−Ａ ｅｍＰＣＲ Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いて、プールされたライブラリーを、エマルジョンＰＣＲ（ｅｍＰＣＲ）にかけ、製造元のプロトコールに従い、Ｒｏｃｈｅ ４５４ ＧＳ Ｊｕｎｉｏｒ装置を用いて、二方向配列決定を行った。

バイオインフォマティックス解析

試料バーコードの完全なマッチに基づき、４５４の配列を分取し、品質について調整した。ｉｇｂｌａｓｔ（ＮＣＢＩ、ｖ２．２．２５＋）のローカルインストールを用いて、再構成されたＩｇ配列の、ヒト生殖細胞系列のＶセグメント、ＤセグメントおよびＪセグメントのデータベースに照らしたアラインメントに基づき、配列に注記した。スコアが同一な複数のベストヒットが検出された場合は、配列を不明確（ａｍｂｉｇｕｏｕｓ）とマークし、解析から除外した。ｐｅｒｌスクリプトのセットを開発して、結果を解析し、データを、ｍｙｓｑｌデータベースに保存した。ＣＤＲ３領域は、軽鎖については、保存的ＣコドンとＦＧＸＧモチーフ（配列番号３２０）との間と定義し、重鎖については、保存的ＣコドンとＷＧＸＧモチーフ（配列番号３２１）との間と定義した。ＣＤＲ３の長さは、産生性抗体だけを用いて決定した。

図１１〜１３に示す通り、６０１３Ｆ０ヘテロ接合性マウスは、ＣＤＲ３における１つまたは複数のヒスチジンコドンをコードする、再構成された重鎖可変領域ｍＲＮＡ配列（再構成されたＶ−Ｄ−Ｊ配列）の多様なレパートリーを発現した。配列決定データは、ＣＤＲ３に現れるヒスチジンコドンは、本明細書に記載されている６０１３マウスの、遺伝子改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座に存在する、様々なヒスチジンで置換したヒトＤ遺伝子セグメントに由来することを示唆した。

（実施例３）
抗原特異的なヒト軽鎖におけるヒスチジンの使用
抗原特異的なヒト抗体から選択された軽鎖のアミノ酸配列をアライメントした。選択された数の抗原特異的なヒト抗体について、ヒトＶκ１−３９に由来する軽鎖のＣＤＲにおけるヒスチジン変異を同定した（図１５）。ヒトＶκ１−３９に由来する軽鎖を、単一の、再構成されたヒトＶκ１−３９軽鎖を含有し（ＵＳ２０１１／０１９５４５４Ａ１を参照されたい）、マウスの抗体レパートリーにおいて生成されたとおりの体細胞超変異を保有するように操作した（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）免疫マウスから単離した。

当技術分野で公知の分子変異誘発法を使用して、再構成されたヒトＶκ１−３９軽鎖内にヒスチジン残基を工学的に作製した。工学的に作製された残基の位置を、図１６に示す。

工学的に作製されたヒスチジン残基を含有するヒトＶκ１−３９に由来する軽鎖可変領域を構築し、ヒト細胞表面受容体に特異的な抗体フォーマットにおける様々なヒト重鎖可変領域と対合させて、ＣＨＯ細胞における発現を解析した。

表示されるｈｉｓ改変（例えば、１０５、１０６、１０８、１１１）を有する特定の重鎖および軽鎖を有するＣＨＯ細胞を、４８ウェルプレートのウェルへと播種した。翌日、等重量（４００ｎｇ）の、重鎖および軽鎖に対応するＤＮＡを、トランスフェクション試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ ２０００）と混合し、インキュベーションにより複合体を形成させ、複合体を、プレート培養した細胞へと添加した。４日間後、培地を回収した。培地は、発現した抗体を含有した。

ＣＤＲ３に１つまたは複数のｈｉｓ置換を有する同じ軽鎖と対合させた異なる重鎖を有するＣＨＯ細胞は、発現が良好である。軽鎖のＣＤＲ３の選択された位置において工学的に作製されたヒスチジン残基を有する抗体遺伝子をトランスフェクトしたＣＨＯ細胞の上清中で検出される、ｎｇ／ｍＬ単位の抗体発現レベル（ｎｇ／ｍＬ）を決定した。

選択した重鎖を使用して、ヒスチジンを工学的に作製した軽鎖と対合させた抗原特異的重鎖の、タンパク質ブロットにより測定した、ＣＨＯ細胞上清中の発現を図１８に示す。ＵＬＣとは、再構成されたヒトＶκ１−３９に由来する軽鎖を指す。

培地のアリコートを、抗体の標的抗原（細胞表面受容体の配列）を使用するＢＩＡＣＯＲＥ（商標）装置での解析にかけた。抗体はチップ上で捕捉した。抗体の捕捉レベルを、図１９Ａ〜１９Ｊに、ＲＵとして示す。ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）チップ上で捕捉された抗体を、標的抗原の配列を含有する流動に供した。標的抗原の抗体による捕捉ならびに会合速度および示される他のパラメータを測定した。抗原の流動を停止させ、抗原が結合した抗体から脱離するときの解離速度を決定した。

選択された抗体上清についての平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）（見かけの）を、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）Ｔ１００装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用するＳＰＲ（表面プラズモン共鳴）により決定した。 キネティクスは、ｐＨ７．４およびｐＨ５．７５において測定した。結果を、図１９Ａ〜１９Ｊに示す。

図１９Ａ〜１９Ｊに示される通り、ＣＤＲの特異的な位置においてヒスチジン残基をコードするように軽鎖を改変した場合の、表示される重鎖と対合させたＶκ１−３０／Ｊκ５軽鎖についての、細胞表面受容体への抗体の結合についてのデータは、ヒスチジン改変が、ｐＨ７．４およびｐＨ５．７５において、異なる親和性を有して抗原（例えば、細胞表面受容体）の結合に直接影響を及ぼすことを実証する。ｐＨ７．４では、結合を保持するが、ｐＨ５．７５では、弱い結合を示すか、または検出可能な結合を示さないヒスチジン改変が所望される。

（実施例４）
抗原特異的なヒト軽鎖におけるヒスチジン残基の同定
共通軽鎖マウス（例えば、Ｖκ１−３９共通軽鎖マウスまたはＶκ３−２０共通軽鎖マウス）の生成、およびこれらのマウスにおける抗原特異的抗体の生成は、米国特許出願第１３／０２２，７５９号、同第１３／０９３，１５６号、および同第１３／４１２，９３６号（それぞれ、特許公開第２０１１／０１９５４５４号、同第２０１２／００２１４０９号、および同第２０１２／０１９２３００号）において記載されている。手短には、マウスゲノム細菌人工染色体（ＢＡＣ）クローンを改変するために、ＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）技術（例えば、米国特許第６，５８６，２５１号およびＶａｌｅｎｚｕｅｌａら（２００３年）Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｇｅｎｏｍｅ ｃｏｕｐｌｅｄ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２１巻（６号）：６５２〜６５９頁を参照）を用いて、再構成されたヒト生殖細胞系列軽鎖ターゲッティングベクターが作製され、そして、ゲノム構築物を単一の再構成されたヒト生殖細胞系列軽鎖領域を含むように操作し、内因性κ可変および連結遺伝子セグメントを欠失させるために事前に改変しておいた内因性κ軽鎖遺伝子座に挿入した。再構成されたヒト生殖細胞系列Ｖκ１−３９Ｊκ５またはＶκ３−２０Ｊκ１領域を発現するキメラマウスを生成するための改変ＥＳ細胞を形成するために、マウスＥＳ細胞をエレクトロポレーションするために、次にターゲッティングＢＡＣ ＤＮＡを用いた。標的ＥＳ細胞をドナーＥＳ細胞として用い、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）法によって８細胞期マウス胚に導入した（例えば、米国特許第７，２９４，７５４号およびＰｏｕｅｙｍｉｒｏｕら（２００７年）Ｆ０ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｍｉｃｅ ｔｈａｔ ａｒｅ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｆｕｌｌｙ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｄｏｎｏｒ ｇｅｎｅ−ｔａｒｇｅｔｅｄ ＥＳ ｃｅｌｌｓ ａｌｌｏｗｉｎｇ ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ａｎａｌｙｓｅｓ Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２５巻（１号）：９１〜９９頁を参照）。特有な再構成されたヒト生殖細胞系列軽鎖領域の存在を検出する対立遺伝子アッセイ（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａら、上記）の改変型を用いる遺伝子タイピングによって、操作されたヒト生殖細胞系列Ｖκ１−３９Ｊκ５またはＶκ３−２０Ｊκ１軽鎖領域を独立して有するＶＥＬＯＣＩＭＩＣＥ（登録商標）を同定した。

操作されたヒト生殖細胞系列の軽鎖遺伝子座を保有するマウス（ＵＬＣマウス）を、内因性マウス重鎖可変遺伝子座のヒト重鎖可変遺伝子座による置きかえを含有するマウス（ＵＳ６，５９６，５４１を参照されたい；ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウス、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）と交配させた。

単一の、再構成されたヒト生殖細胞系列の軽鎖領域を含有するＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスを、目的の抗原でチャレンジし、ユニバーサル軽鎖（例えば、Ｖκ１−３９Ｊκ５）を含む抗体を単離および配列決定する。共通Ｖκ１−３９Ｊκ５軽鎖マウスにおいて生成される抗原特異的ヒト抗体から選択された軽鎖（Ａ〜Ｋ）のアミノ酸配列をアラインメントした。選択された数の抗原特異的ヒト抗体について、ヒトＶκ１−３９に由来する軽鎖のＣＤＲ内のヒスチジン変異を同定した（図１５）。生殖細胞系列のＶκ１−３９Ｊκ５可変ドメインの部分的なアミノ酸配列をアラインメントの上方に示し、配列番号３２５にも示し、完全な可変ドメインのアミノ酸配列を配列番号４０４に示す。

（実施例５）
ヒスチジン置換したヒトユニバーサル軽鎖抗体の操作および特徴付け
（実施例５．１）
ヒスチジン残基の生殖細胞系列ヒト再構成軽鎖への操作
操作したヒスチジン残基を、ヒトＶκ１−３９Ｊκ５軽鎖のＱ１０５、Ｑ１０６、Ｙ１０８、およびＰ１１１位に導入するように特別にデザインされた部位指向変異生成プライマーを用いて、ヒスチジン残基を、再構成されたヒトＶκ１−３９Ｊκ５軽鎖へと操作した。当技術分野で公知の分子技法（例えば、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ ＩＩ ＸＬ Ｓｉｔｅ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、部位指向変異生成を実施した。ＣＤＲ３内の操作された残基の位置を図２に示し、図１６に示された、ヒスチジン置換したＣＤＲ３の核酸配列を、配列番号３２８、３３０、３３２、３３４、３３６、３３８、３４０、３４２、３４４、３４６、３４８、３５０、３５２、３５４、および３５６に示す（対応するアミノ酸配列を、配列番号３２９、３３１、３３３、３３５、３３７、３３９、３４１、３４３、３４５、３４７、３４９、３５１、３５３、３５５、および３５７に示す）。生殖細胞系列の、再構成されたＶκ１−３９Ｊκ５ ＣＤＲ３の核酸配列およびアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号３２６および３２７に示す。

（実施例５．２）
ヒスチジン操作した軽鎖の構築および発現
実施例２に従い作製された、生殖細胞系列の、操作したヒスチジン残基を含有するヒトＶκ１−３９に由来する軽鎖を構築し、ヒト細胞表面受容体に特異的である、様々なヒト重鎖（１〜５と表示される）と対合させて、ＣＨＯ細胞における発現を解析した。ヒスチジン置換したＶκ１−３９に由来する軽鎖と対合させた、ヒト細胞表面受容体に特異的な５つのヒト重鎖は、単一の、再構成されたヒト軽鎖（ヒトＶκ１−３９／Ｊκ５の再構成された軽鎖；ＵＳ２０１１／０１９５４５４Ａ１を参照されたい）を有するマウスから得た。

酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）：ＣＨＯ細胞からの抗体の分泌は、Ｆｃ ＥＬＩＳＡを用いて、５つの異なる重鎖を有する、表示されるヒスチジン改変を有する軽鎖について検出した。軽鎖配列および重鎖配列（改変を除く）は、単一の、再構成されたヒト軽鎖（例えば、ヒトＶκ１−３９／Ｊκ５の再構成された軽鎖；ＵＳ２０１１／０１９５４５４Ａ１を参照されたい）を有するマウスにおいて生成された。捕捉抗体は、ヤギ抗ヒトＩｇＧであり、検出抗体は、ヤギ抗ヒト（Ｆｃガンマ特異的）−ＨＲＰであった。結果を図１７に示す。ＵＬＣ＋重鎖：特異的重鎖および改変されていないヒトＶκ１−３９に由来する軽鎖。図１７に示される通り、発現は、ほぼ全ての変異体において検出された。

タンパク質イムノブロット：ＣＨＯ細胞の上清中の、ヒスチジン操作した軽鎖と対合させた抗原特異的重鎖の発現を、ウェスタンブロットによりさらに解析した。試料を、４〜１２％のトリス−グリシンゲル上で泳動させた。選択された重鎖（重鎖３）を用いた結果を、図１８に示す。ＵＬＣとは、再構成されたヒトＶκ１−３９に由来する軽鎖（上記で記載した）を指す。

（実施例５．３）
ヒスチジン操作した軽鎖の結合親和性の決定
選択された抗体上清についての平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）、解離半減期（ｔ_１／２）、および他の動力学的パラメータは、ＢＩＡＣＯＲＥ^ＴＭＴ２００装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いるＳＰＲ（表面プラズモン共鳴）により決定した。キネティクスは、ｐＨ７．４およびｐＨ５．７５で測定した。結果を図２０Ａ〜２０Ｅに示す。

中性ｐＨ（ｐＨ７．４）および酸性ｐＨ（ｐＨ５．７５）における、抗体の免疫原への結合についての動力学的結合特性（ｋｉｎｅｔｉｃ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｐｅｒｔｙ）（例えば、ｋ_ａ、ｋ_ｄ、Ｋ_Ｄ、ｔ_１／２など）の数値は、リアルタイム表面プラズモン共鳴バイオセンサー（Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００）を用いて得た。Ｂｉａｃｏｒｅ ＣＭ５センサーチップを、マウス抗ヒトＦｃ抗体で誘導体化して、上清からの抗体を捕捉した。次いで、単一濃度（５０ｎＭ）の免疫原を、抗体捕捉表面上に、３０μｌ／分の流量で注入した。抗体−抗原間の会合を、２．５分間にわたりモニタリングし、次いで、抗原の、捕捉抗体からの解離を、８分間にわたりモニタリングした。会合動力学速度定数（ｋａ）および解離動力学速度定数（ｋｄ）は、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアｖｅｒｓｉｏｎ １．０を用い、データを処理して物質移動モデルによる１：１の結合へとフィッティングすることにより、決定した。平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）および解離半減期（ｔ_１／２）は、Ｋ_Ｄ（Ｍ）＝ｋ_ｄ／ｋ_ａ；およびｔ_１／２（分）＝（ｌｎ２／（６０×ｋ_ｄ）として、動力学速度定数から計算した。

図２０に示される通り、抗体の細胞表面受容体への結合アッセイでは、抗原特異的ヒト重鎖と対合させた、ヒスチジン改変共通軽鎖（Ｖκ１−３９／Ｊκ５軽鎖のヒスチジン改変ＣＤＲ３）を有する５つの抗体のうちの２つが、ｐＨ７．４およびｐＨ５．７５において、異なる親和性で、抗原へ（例えば、細胞表面受容体への）の結合を示した。ｐＨ７．４では、結合を保持するが、ｐＨ５．７５では、低度の結合を示すか、または検出可能な結合を示さない、ヒスチジン改変を有する抗体が望ましい。ｐＨ５．７５におけるｔ_１／２のｐＨ７．４におけるｔ_１／２と比較した短縮を示す、ヒスチジン改変を有する抗体が望ましい。

ヒスチジン改変共通軽鎖および３つの抗原特異的重鎖を含む３つの抗体（２、３、および６と表示される）についての、異なるｐＨにおける抗原結合データを、図２１にさらにまとめる。例えば、ｐＨ５．７５におけるｔ_１／２の短縮または結合が検出されないことにより裏付けられる通り、これらの抗体は、ｐＨ５．７５において、ｐＨ７．４における抗原結合と比較した、抗原結合の有意な低下を示した。

（実施例６）
ヒスチジン置換したＶκ１−３９Ｊκ５ユニバーサル軽鎖を含む遺伝子改変マウスの操作および特徴付け
（実施例６．１）
再構成されたヒト軽鎖可変領域内のヒスチジン残基を操作するためのターゲッティングベクターの構築
当技術分野で公知の標準的な分子クローニング技法により作製されるターゲッティングベクターを用いて、ヒト軽鎖のＣＤＲ領域へと操作したヒスチジン残基を有する、再構成されたヒト軽鎖遺伝子を含有する遺伝子改変マウスを作製する。

手短には、マウスゲノムの細菌人工染色体（ＢＡＣ）ＤＮＡを、単一の、再構成されたヒト生殖細胞系列の軽鎖領域を含有するように改変するために、ＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）技術（例えば、米国特許第６，５８６，２５１号およびValenzuelaら（２００３年）、High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis、Nature Biotech.、２１巻（６号）：６５２〜６５９頁を参照されたい）を用いて、様々な、再構成されたヒト生殖細胞系列の軽鎖ターゲッティングベクターを作製し、内因性κ可変遺伝子セグメントおよび内因性κ接合遺伝子セグメントを欠失させるように既に改変された内因性κ軽鎖遺伝子座へと挿入する。再構成されたヒト生殖細胞系列の軽鎖領域を、軽鎖の配列内の１つまたは複数のヌクレオチド位置において、生殖細胞系列配列のそれぞれの位置には通常存在しないヒスチジン残基をコードするように改変する。ターゲッティングベクターを、マウス胚性幹（ＥＳ）細胞へとエレクトロポレーションして作製し、定量的ＰＣＲアッセイ（例えば、ＴＡＱＭＡＮ^ＴＭ）を用いて確認する。

具体的には、これらのターゲッティングベクターを構築するための戦略を、図２３Ａ〜２３Ｆに示す。共通（ユニバーサル）軽鎖マウス（例えば、ＵＳ２０１１／０１９５４５４Ａ１において記載されている「ＵＬＣマウス」）のターゲッティングベクターを生成するために用いられるプラスミドであって、ｐＢＳ＋ＦＲＴ−Ｕｂ−Ｈｙｇ−ＦＲＴ＋マウスＶκ３−７リーダー＋ヒトＶκ１−３９Ｊκ５を含有するプラスミドを、部位指向変異生成（ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ ＩＩ ＸＬ Ｋｉｔ）により、図２２に示される部位指向変異生成プライマーを用いて、ＣＤＲ３領域内のＱ１０５、Ｑ１０６、Ｙ１０８、およびＰ１１１、またはＱ１０６、Ｙ１０８、およびＰ１１１を、ヒスチジン残基で置きかえるように改変した（この操作ステップについては、図２３Ａを参照されたい）。結果として得られるベクター（Ｈ１０５／１０６／１０８／１１１およびＨ１０６／１０８／１１１）をさらに改変し、マウスＩｇκ定常領域、マウスエンハンサー、マウス３’側相同性アーム、およびＳＰＥＣカセットを含むベクターへとライゲーションした（図２３Ｂ）。さらなる改変は、５’側マウスアームを保有し、Ｆｒｔ−Ｕｂ−ＮＥＯ−Ｆｒｔカセットを含むベクターへのライゲーションを包含した（図２３Ｂ）。結果として得られるターゲッティングベクターを、マウスＩｇκ可変遺伝子座（κ可変遺伝子セグメントおよびκ接合遺伝子セグメントを含む）の欠失を含むＥＳ細胞へとエレクトロポレーションした（図２３Ｃ〜２３Ｆ）。

陽性のＥＳ細胞クローンは、内因性κ軽鎖遺伝子座へと挿入される、操作されたＶκ１−３９Ｊκ５軽鎖領域に対して特異的なプローブを用いる、対立遺伝子アッセイ（Valenzuelaら）の改変型を用いることにより確認した。アッセイにおいて用いられるプライマーおよびプローブを、下記の表３に示し、配列表にも示し、プローブの位置を、図２３Ｃ〜２３Ｆに示す。

ターゲッティング構築物により導入されるＮＥＯ選択カセットは、ＥＳ細胞に、ＦＬＰを発現するプラスミドをトランスフェクトすることにより欠失させた（図２３Ｃおよび２３Ｅ）。必要に応じて、ネオマイシンカセットは、ＦＬＰレコンビナーゼを発現するマウス（例えば、ＵＳ６，７７４，２７９）と交配させることにより除去することもできる。必要に応じて、ネオマイシンカセットを、マウスに保持させる。

上記で記載した標的ＥＳ細胞をドナーＥＳ細胞として用い、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）法により、８細胞期マウス胚へと導入した（例えば、米国特許第７，２９４，７５４号；およびPoueymirouら（２００７年）、F0 generation mice that are essentially fully derived from the donor gene-targeted ES cells allowing immediate phenotypic analyses、Nature Biotech.、２５巻（１号）：９１〜９９頁を参照されたい）。配列に沿った１つまたは複数の位置において変異させたヒスチジン残基を含有する、操作されたヒト軽鎖遺伝子を独立に保有するＶＥＬＯＣＩＭＩＣＥ（登録商標）を、上記で記載した標的ＥＳ細胞から作製した。

仔マウスを遺伝子型決定し、操作された、ヒスチジン改変ヒト軽鎖についてヘテロ接合性の仔マウスを、軽鎖の発現および発現させた抗体の結合能を特徴づけるために選択した。３カ所の（Ｈ１０６／１０８／１１１；「１９３０」）ヒスチジン改変または４カ所の（Ｈ１０５／１０５／１０８／１１１；「１９２７」）ヒスチジン改変を有するユニバーサル軽鎖遺伝子を特異的に含むマウスを遺伝子型決定するためのプライマーおよびプローブを、下記の表４に列挙し、配列表にも示す。本明細書では、ヒスチジン改変をそれらのユニバーサル軽鎖内に含有するマウスを、「ＨＵＬＣ」マウス（ヒスチジンユニバーサル軽鎖マウス）と称する。

（実施例６．２）
ヒスチジン置換したユニバーサル軽鎖を有するマウスにおける抗原への免疫応答の解析
細胞表面受容体（「抗原Ａ」）を、ＣＤＲ３内に４カ所のヒスチジン置換を有するＶκ１−３９およびＪκ５を使用して既定の（ｐｒｅ−ａｒｒａｎｇｅｄ）ヒトカッパ軽鎖の発現についてヘテロ接合性であるマウス（以下では、「ＨＵＬＣ １９２７」とする）、もしくはＣＤＲ３内に３カ所のヒスチジン置換を有するＶκ１−３９およびＪκ５を使用して既定のヒトカッパ軽鎖の発現についてヘテロ接合性であるマウス（以下では、「ＨＵＬＣ１９３０」とする）のいずれか、またはホモ接合性のＷＴマウスを免疫する免疫原として用いた。免疫を開始する前に、免疫前血清を、マウスから収集した。免疫原は、足蹠（ｆ．ｐ．）を介して、容量２５μｌ中に、アジュバントとしてのＣｐＧオリゴヌクレオチド（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）１０μｇと混合した、初回抗原刺激による免疫のためのタンパク質２．３５μｇを投与した。その後、３、６、１１、１３、１７、２０日目において、合計６回の追加免疫のために、マウスに、同じ経路を介して、２．３５μｇの抗原Ａを、アジュバントとしての１０μｇのＣｐＧおよび２５μｇのＡｄｊｕ−Ｐｈｏｓ（Ｂｒｅｎｎｔａｇ）と共に追加免疫した。それぞれ、４および６回目の追加免疫の後の１５および２２日目において、マウスから採血した。それらの抗血清を、抗原Ａに対する抗体力価についてアッセイした。

免疫原に対する抗体血清力価は、標準的なＥＬＩＳＡにより決定した。ＥＬＩＳＡを実施するために、９６ウェルマイクロ滴定プレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、リン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ；Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中の２μｇ／ｍｌの抗原Ａにより、４℃で一晩にわたりコーティングした。翌日、プレートを、プレート洗浄機（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて、０．０５％のＴｗｅｅｎ ２０を含有するリン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ−Ｔ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で、４回にわたり洗浄した。次いで、プレートを、ＰＢＳ中の０．５％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）２５０μｌでブロッキングし、室温で１時間にわたりインキュベートした。次いで、プレートを、ＰＢＳ−Ｔで４回にわたり洗浄した。免疫したマウスからの血清および免疫前血清を、０．５％のＢＳＡ−ＰＢＳ中に、１：３００または１：１０００で始めて３倍の系列希釈を行い、ブロッキングしたプレートへと二連で添加し、次いで、室温で１時間にわたりインキュベートした。最後の２つのウェルは、ブランクのまま放置して、二次抗体対照（バックグラウンド対照）として用いた。プレート洗浄機により、プレートを、ＰＢＳ−Ｔで、４回にわたり再度洗浄した。次いで、ヤギ抗マウスＩｇＧ−Ｆｃ−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）を、１：５０００／１：１０，０００の希釈率でプレートへと添加し、室温で１時間にわたりインキュベートした。次いで、プレートを、ＰＢＳ−Ｔで８回にわたり洗浄し、ＴＭＢ／Ｈ_２Ｏ_２を基質として用いて発色させた。基質を２０分間にわたりインキュベートし、２Ｎの硫酸（Ｈ_２ＳＯ_４；ＶＷＲ、カタログ番号ＢＤＨ３５００−１）または１Ｎのリン酸（ＪＴ Ｂａｋｅｒ、カタログ番号７６６４−３８−２）で反応を停止させた。プレートは、分光光度計（Ｖｉｃｔｏｒ；Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）において４５０ｎｍで読み取った。抗体力価は、Ｇｒａｐｈｐａｄ ＰＲＩＳＭソフトウェアを用いて計算した。

マウスにおいて、注入された免疫原に対して誘導された免疫応答は、抗原結合の吸光度がバックグラウンドの２倍となる最大の血清希釈率の逆数として定義される、抗体力価として表される。したがって、抗体力価数が大きいほど、免疫原に対する体液性免疫応答が大きくなる。免疫原に対して誘導された抗体力価は、ＨＵＬＣマウスの両方の系統でも、ＷＴマウスでも、極めて大きく、系統の間で有意差は観察されなかった（図２４）。

（実施例６．３）
ｐＨ感受性モノクローナル抗体の生成
ＨＵＬＣマウス両方の系統でも、ＷＴマウスでも、免疫原に対する所望の免疫応答が達成されたら、各マウス系統からの脾細胞を採取し、マウス骨髄腫細胞と融合させて、ハイブリドーマ細胞を生成し、９６ウェルプレート内で成長させた。１０日間成長後、各ハイブリドーマ細胞含有ウェルからの上清を、免疫原特異的ＥＬＩＳＡを介してスクリーニングして、陽性の抗原結合試料を同定した。ＥＬＩＳＡのために、９６ウェルマイクロ滴定プレートを、１ｕｇ／ｍＬの抗ｍｙｃポリクローナル抗体（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、番号ＮＢ６００−３４）により、４℃で一晩にわたりコーティングして、ｍｙｃタグ付けされた抗原を固定し、これに続いて、ＰＢＳ中の０．５％（ｗ／ｖ）のＢＳＡ溶液でブロッキングした。プレートを洗浄し、抗原溶液を、１μｇ／ｍＬの濃度でプレートへと添加し、室温で１時間にわたり、コーティングしたプレートに結合させた。その後、ハイブリドーマ細胞からの上清を、１：５０の希釈率でウェルへと添加し、室温で１時間にわたり結合させた。プレートに結合した抗体は、ＨＲＰとコンジュゲートさせた抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、番号１１５−０３５−１６４）を用いて検出した。ＴＭＢ基質を、プレート（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、番号５１−２６０６ＫＣ／５１−２６０７ＫＣ）へと添加し、製造元により推奨されるプロトコールに従い、比色シグナルを生じさせた。吸光度は、Ｖｉｃｔｏｒ Ｗａｌｌａｃプレートリーダーにおいて４５０ｎｍで記録した。ＯＤが０．５以上（ベースラインのＯＤは約０．１）を有するとして定義される抗原陽性試料は、リアルタイム表面プラズモン共鳴バイオセンサー（Ｂｉａｃｏｒｅ ４０００）を用いて、親和性スクリーニングにかけた。

中性ｐＨ（ｐＨ７．４）および酸性ｐＨ（ｐＨ６．０）における、抗体の免疫原への結合についての動力学的結合パラメータ（例えば、ｋ_ａ、ｋ_ｄ、Ｋ_Ｄ、ｔ_１／２など）を記録した。Ｂｉａｃｏｒｅ ＣＭ４センサーチップを、ポリクローナルヤギ抗マウスＦｃ抗体で誘導体化して、上清からの抗体を捕捉した。次いで、単一濃度（１００ｎＭ）の免疫原を、抗体捕捉表面上に、３０μｌ／分の流量で注入した。抗体−抗原間の会合を、１．５分間にわたりモニタリングし、次いで、抗原の、捕捉抗体からの解離を、２．５分間にわたりモニタリングした。会合動力学速度定数（ｋ_ａ）および解離動力学速度定数（ｋ_ｄ）は、Ｂｉａｃｏｒｅ ４０００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアｖｅｒｓｉｏｎ １．０を用い、データを処理して物質移動モデルによる１：１の結合へとフィッティングすることにより、決定した。平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）および解離半減期（ｔ_１／２）は、Ｋ_Ｄ（Ｍ）＝ｋ_ｄ／ｋ_ａ；およびｔ_１／２（分）＝ｌｎ２／（６０×ｋ_ｄ）として、動力学速度定数から計算した。ｐＨ６．０において、ｐＨ７．４における結合と比較して結合の低下を提示する試料のセット（ｐＨ感受性）、ならびにｐＨ７．４とｐＨ６．０との間で有意な速度の変化を提示しない対照試料のセット（ｐＨ非感受性の対照）を、クローン作製するために選択した。図２５は、全抗原陽性クローンの数と、ＨＵＬＣマウスおよびＷＴマウスからのｐＨ感受性抗原結合を提示する抗原陽性クローンの数との比較を示す。

抗原陽性クローンのうち、２匹のヘテロ接合性ＨＵＬＣ１９２７マウスおよび２匹のＨＵＬＣ１９３０のそれぞれから単離された１８のクローンおよび７つのクローン、ならびにＷＴマウスからの１つのクローンは、モノクローナルとなった。モノクローナルハイブリドーマの上清を、中性ｐＨおよび低ｐＨにおける抗原解離速度（オフ速度）解析にかけ、細胞ペレットを軽鎖可変ドメインＤＮＡの配列決定に用いた。

（実施例６．４）
Ｖκ１−３９Ｊκ５に基づくヒスチジンユニバーサル軽鎖マウスのＣＤＲ３領域における配列決定および体細胞超変異
ＨＵＬＣマウスおよびＷＴマウスによるモノクローナルハイブリドーマからの細胞ペレットを、軽鎖可変ドメインＤＮＡの配列決定に用いた。２６のクローンがモノクローナルとなり（上記の実施例３．３を参照されたい）、これらを配列決定にかけ、１５のクローンを、ＨＵＬＣマウス軽鎖またはＷＴマウス軽鎖（ＭＭおよびＮＮ；表４を参照されたい）を用いて確認した。１４のクローンは、ＨＵＬＣヘテロ接合性マウス（１９２７マウスまたは１９３０マウス）に由来し、１つのクローンは、ＷＴマウスに由来した。

ＨＵＬＣヘテロ接合性マウスに由来する１４の抗原陽性試料のうち、１２のモノクローナル抗体が、それらの対応するＨＵＬＣ軽鎖を使用したのに対し、２つのモノクローナル抗体は、ＷＴマウスの軽鎖を使用した。表３に示される通り、ＨＵＬＣを使用する抗体のうちの１つ（斜字体の抗体）を除く全ては、導入されたヒスチジン変異の全てを保持した。クローンＡＡを配列決定したところ、２つの異なるＨＵＬＣ配列がもたらされたが、表５では、これらを２つの項目で表す。

（実施例６．５）
Ｖκ１−３９Ｊκ５に基づくヒスチジンユニバーサル軽鎖マウスにおいて生成されるモノクローナル抗体のｐＨ依存性結合
ＨＵＬＣマウスおよびＷＴマウスから単離されたモノクローナル抗体のｐＨ依存性結合特徴をさらに評価するために、中性ｐＨにおいて抗体／抗原間の会合相を観察し、中性または酸性ｐＨにおいて抗体／抗原間の解離相を観察する、結合実験を実行した。

Ｂｉａｃｏｒｅ ＣＭ４センサーチップを、ポリクローナルウサギ抗マウスＦｃ抗体で誘導体化した。モノクローナル抗体上清を抗マウスＦｃセンサー表面上に捕捉した。次いで、５０ｎＭ（二連で）および１６．７ｎＭという２つの濃度の免疫原を、モノクローナル抗体捕捉表面上に、３０μｌ／分の流量で注入した。抗体−抗原間の会合を、ｐＨ７．４で４分間にわたりモニタリングし、次いで、捕捉モノクローナル抗体からの抗原の解離を、ｐＨ７．４またはｐＨ６．０で１５分間にわたりモニタリングした。解離速度定数（ｋ_ｄ）は、Ｓｃｒｕｂｂｅｒ ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０曲線フィッティングソフトウェアを用い、データを処理してフィッティングすることにより決定し、これを、表６に示す。解離半減期（ｔ_１／２）は、ｔ_１／２（分）＝（ｌｎ２／ｋ_ｄ）／６０として、解離速度定数から計算し、これを、表６に示す。表４に列挙される複数の抗体の、様々なｐＨ条件下における会合／解離特徴を示すセンサーグラムを、図２６にグラフで示す。各グラフ内の個々の線は、それぞれの抗体の異なる濃度における結合応答を表す。全ての実験は、２５℃で実行した。解離半減期の値（ｔ_１／２）を、それぞれのセンサーグラムの上方に注記する。応答は、ＲＵ単位で測定する。

（実施例７）
ヒスチジン置換したＶκ３−２０Ｊκ１ユニバーサル軽鎖を含む遺伝子改変マウスの操作
例えば、米国特許出願第１３／０２２，７５９号、同第１３／０９３，１５６号、同第１３／４１２，９３６号、および同第１３／４８８，６２８号（それぞれ、特許公開第２０１１／０１９５４５４号、同第２０１２／００２１４０９号、同第２０１２／０１９２３００号、および同第２０１３／００４５４９２号）、ならびに上記の実施例１において記載されている通りに、共通Ｖκ３−２０Ｊκ１軽鎖を含むマウスを生成した。生殖細胞系列のユニバーサルＶκ３−２０Ｊκ１軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を、配列番号３８３に示す。

Ｖκ１−３９Ｊκ５ヒスチジン改変ユニバーサル軽鎖マウス（ＨＵＬＣ １９２７およびＨＵＬＣ １９３０）について、上記の実施例３で記載した戦略と同様の戦略を用いて、ヒスチジン置換を、Ｖκ３−２０Ｊκ１ユニバーサル軽鎖のターゲッティングベクターへと導入し、このベクターからマウスを生成した。

手短には、ヒスチジン改変Ｖκ３−２０Ｊκ１ユニバーサル軽鎖ターゲッティングベクターを生成するための戦略を、図２９Ａ〜２９Ｄにまとめる。共通（ユニバーサル）軽鎖マウス（例えば、ＵＳ２０１１／０１９５４５４Ａ１において記載されている「ＵＬＣマウス」）のためのターゲッティングベクターを生成するために用いられるプラスミドであって、ｐＢＳ＋ＦＲＴ−Ｕｂ−Ｈｙｇ−ＦＲＴ＋マウスＶκ３−７リーダー＋ヒトＶκ３−２０Ｊκ１を含有するプラスミドを、部位指向変異生成（ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ Ｋｉｔ）により、図２８に示される部位指向変異生成プライマーを用いて、ＣＤＲ３領域内のＱ１０５、Ｑ１０６、Ｙ１０７、およびＳ１０９、またはＱ１０５、Ｑ１０６、およびＳ１０９（図２７のアラインメントを参照されたい）を、ヒスチジン残基で置きかえるように改変した（この操作ステップについては、図２９Ａを参照されたい）。結果として得られるベクター（Ｈ１０５／１０６／１０７／１０９およびＨ１０５／１０６／１０９）をさらに改変し、マウスＩｇκ定常領域、マウスエンハンサー、マウス３’側相同性アーム、およびＳＰＥＣカセットを含むベクターへとライゲーションした（図２９Ｂ）。さらなる改変は、５’側マウスアームを保有し、Ｆｒｔ−ＵＢ−ＮＥＯ−Ｆｒｔカセットを含むベクターへのライゲーションを包含した（図２９Ｂ）。結果として得られるターゲッティングベクターを、マウスＩｇκ可変遺伝子座（κ可変遺伝子セグメントおよびκ接合遺伝子セグメントを含む）の欠失を含むＥＳ細胞へとエレクトロポレーションした（図２９Ｃ〜２９Ｄ）。

陽性のＥＳ細胞クローンは、内因性κ軽鎖遺伝子座へと挿入される、操作されたＶκ３−２０κＪ１軽鎖領域に対して特異的なプローブを用いる、対立遺伝子アッセイ（Valenzuelaら）の改変型を用いることにより確認した。アッセイにおいて用いられるプライマーおよびプローブを、下記の表７に示し、配列表にも示し、プローブの位置を、図２９Ｃ〜２９Ｄに示す。

ターゲッティング構築物により導入されるＮＥＯ選択カセットは、ＥＳ細胞を、ＦＬＰを発現するプラスミドでトランスフェクトすることにより欠失させる（図２９Ｃおよび２９Ｄ）。必要に応じて、ネオマイシンカセットは、ＦＬＰレコンビナーゼを発現するマウス（例えば、ＵＳ６，７７４，２７９）と交配させることにより除去することもできる。必要に応じて、ネオマイシンカセットを、マウスに保持させる。

上記で記載した標的ＥＳ細胞をドナーＥＳ細胞として用い、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）法により、８細胞期マウス胚へと導入する（例えば、米国特許第７，２９４，７５４号；およびPoueymirouら（２００７年）、F0 generation mice that are essentially fully derived from the donor gene-targeted ES cells allowing immediate phenotypic analyses、Nature Biotech.、２５巻（１号）：９１〜９９頁を参照されたい）。配列に沿った１つまたは複数の位置において変異させたヒスチジン残基を含有する、操作されたヒト軽鎖遺伝子を独立に保有するＶＥＬＯＣＩＭＩＣＥ（登録商標）を、上記で記載した標的ＥＳ細胞から作製する。

仔マウスを遺伝子型決定し、操作された、ヒスチジン改変ヒト軽鎖についてヘテロ接合性の仔マウスを、軽鎖の発現および発現させた抗体の結合能を特徴づけるために選択する。３カ所の（Ｈ１０５／１０６／１０９；「６１８３」）ヒスチジン改変または４カ所の（Ｈ１０５／１０５／１０８／１１１；「６１８１」）ヒスチジン改変を有するユニバーサル軽鎖遺伝子を特異的に含むマウスを遺伝子型決定するためのプライマーおよびプローブを、下記の表６に列挙し、配列表にも示す。本明細書では、ヒスチジン改変をそれらのユニバーサル軽鎖内に含有するマウスを、「ＨＵＬＣ」マウス（ヒスチジンユニバーサル軽鎖マウス）と称する。

マウスを目的の抗原で免疫し、ｐＨ依存性結合を有する抗体を生成する能力について調べる。

（実施例８）
ヒスチジン置換した単一の、再構成されたヒトユニバーサル軽鎖マウス（ＨＵＬＣ）を含むマウスの交配
本実施例は、本明細書に記載されているＨＵＬＣマウスのうちのいずれか１つと交配させて、多重の遺伝子改変免疫グロブリン遺伝子座を保有する、多重の遺伝子改変マウス系統を作製し得る、複数の他の遺伝子改変マウス系統について記載する。

内因性Ｉｇλノックアウト（ＫＯ）
操作された軽鎖遺伝子座の使用頻度を最適化するために、上記のＨＵＬＣ動物（例えば、Ｖκ１−３９Ｊκ５またはＶκ３−２０Ｊκ１ヒスチジン置換したユニバーサル軽鎖を含む）のうちの任意の１つを、内因性λ軽鎖遺伝子座に欠失を含む別のマウスと交配させ得る。この様式において、得られる子孫は、それらの唯一の軽鎖として、上記の実施例３および４に記載されるとおりの再構成されたヒスチジン置換したヒト生殖細胞系列軽鎖領域を発現する。交配は、当技術分野で認められる標準技術によって、あるいは商業的な繁殖家（例えば、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）によって実施される。操作されたヒスチジン置換した軽鎖遺伝子座、および内因性λ軽鎖遺伝子座の欠失を有するマウス系統は、特有な軽鎖領域の存在および内因性マウスλ軽鎖の非存在についてスクリーニングされる。

ヒト化内因性重鎖遺伝子座
操作されたヒト生殖細胞系列軽鎖遺伝子座を有するマウス（ＨＵＬＣマウス）は、ヒト重鎖可変遺伝子の遺伝子座による内因性マウス重鎖可変遺伝子の遺伝子座の置換を含むマウスと交配させられる（ＵＳ６，５９６，５４１を参照；ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウス、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）。ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスは、マウスが抗原刺激に応じてヒト重鎖可変ドメインおよびマウス重鎖定常領域を含む抗体を生成するように、内因性マウス定常領域遺伝子座に作動可能に連結されたヒト重鎖可変領域を含むゲノムを含む。

内因性マウス重鎖可変領域遺伝子座のヒト重鎖可変領域遺伝子座による置きかえ、および内因性κ軽鎖遺伝子座内に、ヒスチジン置換した、単一の、再構成されたヒト軽鎖可変領域を保有するマウスを得る。目的の抗原で免疫すると、ヒスチジン置換した単一のヒト軽鎖（ＨＵＬＣ；ヒト軽鎖可変ドメインおよびマウスＣ_Ｌ）を有する体細胞変異重鎖（ヒト重鎖可変ドメインおよびマウスＣ_Ｈ）を含有するリバースキメラ抗体が得られる。このようなマウスにおいて生成されるｐＨ依存性ヒト抗体は、当技術分野で公知であるかまたは上記で記載した抗体の単離およびスクリーニング法を用いて同定する。抗体、例えば、ｐＨ感受性抗体を発現するＢ細胞の可変軽鎖領域および可変重鎖領域のヌクレオチド配列を同定し、好適な発現系で、可変重鎖領域および可変軽鎖領域のヌクレオチド配列を、ヒトＣ_Ｈヌクレオチド配列およびヒトＣ_Ｌヌクレオチド配列のそれぞれへと融合させることにより、完全ヒト抗体を作製する。

（実施例９）
遺伝子改変マウスの子孫
再構成されたヒト軽鎖可変領域配列の限定的なレパートリー、または本明細書で記載される、単一の、再構成されたヒト軽鎖可変領域配列を含む操作されたヒト生殖細胞系列の軽鎖遺伝子座を保有するマウス（ＨＵＬＣマウス）を、本明細書で記載されるヒスチジン改変されたヒト重鎖可変遺伝子遺伝子座を含有するマウスと交配させる。マウスを得、ヒスチジン改変されたヒト軽鎖可変領域を含有する軽鎖配列およびヒスチジン改変されたヒト重鎖可変領域を含有する重鎖配列の存在を遺伝子型解析により確認する。

目的の抗原により免疫すると、ヒスチジン改変された重鎖（ヒスチジン改変されたヒト重鎖可変ドメインおよびマウスＣ_Ｈ）およびヒスチジン改変された単一ヒト軽鎖（ＨＵＬＣ；ヒスチジン改変されたヒト軽鎖可変ドメインおよびマウスＣ_Ｌ）を含有するリバースキメラ抗体が得られる。このようなマウスにおいて生成されるｐＨ依存性ヒト抗体は、当技術分野で公知であるかまたは上記で記載した抗体の単離およびスクリーニング法を使用して同定する。抗体、例えば、ｐＨ感受性抗体を発現するＢ細胞の可変軽鎖領域および可変重鎖領域のヌクレオチド配列を同定し、好適な発現系において、可変重鎖領域および可変軽鎖領域のヌクレオチド配列を、ヒトＣ_Ｈヌクレオチド配列およびヒトＣ_Ｌヌクレオチド配列のそれぞれへと融合させることにより、完全ヒト抗体を作製する。

均等物
当業者は、日常的な程度の実験を用いて、本明細書に記載されている本発明の具体的な実施形態の多くの均等物を認識するか、または確認することが可能である。このような均等物は、以下の特許請求の範囲に包含されることを意図する。記載される本発明を、その具体的な実施形態を参照しながら記載してきたが、当業者は、本発明の真の精神および範囲から逸脱することなく、様々な変更を行うことができ、同等物を代用しうることを理解されたい。加えて、多くの改変も行って、特定の状況、材料、物質組成、プロセス、１つまたは複数のプロセスステップを、記載される本発明の目的および精神および範囲に照らして採用することができる。全てのこのような改変は、本明細書に付属の特許請求の範囲内にあることを意図する。

（項目１）
少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換または挿入を免疫グロブリン可変遺伝子座に含む、免疫グロブリン遺伝子座をその生殖細胞系列に含む、遺伝子改変された非ヒト動物。
（項目２）
第一の可変遺伝子座および第二の可変遺伝子座を含み、少なくとも該第一の可変遺伝子座または該第二の可変遺伝子座は、少なくとも１つのヒスチジンコドンの挿入または少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む、項目１に記載の非ヒト動物。
（項目３）
前記第一の可変遺伝子座および前記第二の可変遺伝子座の両方が各々、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換または挿入を含む、項目２に記載の非ヒト動物。
（項目４）
前記第一の可変遺伝子座が、再構成されていない重鎖可変遺伝子座（再構成されていないＶセグメント、Ｄセグメント、Ｊセグメント）の少なくとも１つの機能性部分を含む、項目３に記載の非ヒト動物。
（項目５）
前記再構成されていない重鎖可変遺伝子座が、ヒト遺伝子座（再構成されていないＶセグメント、Ｄセグメント、Ｊセグメント）の少なくとも一部分を含む、項目４に記載の非ヒト動物。
（項目６）
前記再構成されていない重鎖遺伝子座が、再構成されていないＶセグメント、リンカーを含む合成Ｄセグメント、およびヒトＪセグメントを含むヒト遺伝子座である、項目４に記載の非ヒト動物。
（項目７）
前記合成Ｄセグメントが、少なくとも１つのヒスチジンコドンを含む、項目６に記載の非ヒト動物。
（項目８）
前記第二の可変遺伝子座が、再構成されていない軽鎖遺伝子座（再構成されていないＶセグメント、Ｊセグメント）の少なくとも１つの機能性部分を含む、項目３に記載の非ヒト動物。
（項目９）
前記第二の可変遺伝子座が、再構成された免疫グロブリン軽鎖可変遺伝子配列（再構成されたＶＪ配列）を含む、項目４に記載の非ヒト動物。
（項目１０）
非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる前記置換および／またはヒスチジンコドンの前記挿入が、可変ドメインをコードする核酸配列においてであり、ヒスチジンが、免疫グロブリン鎖のＮ末端領域、免疫グロブリン鎖のループ４領域、重鎖のＣＤＲ１、重鎖のＣＤＲ２、重鎖のＣＤＲ３、軽鎖のＣＤＲ１、軽鎖のＣＤＲ２、軽鎖のＣＤＲ３、およびこれらの組合せから選択される領域にある、項目１に記載の非ヒト動物。
（項目１１）
前記第一の可変遺伝子座または前記第二の可変遺伝子座のうちの少なくとも１つが、内因性非ヒト免疫グロブリン遺伝子座において、内因性非ヒト定常領域の核酸配列に作動可能に連結された、項目２に記載の非ヒト動物。
（項目１２）
前記第一の可変遺伝子座（再構成されていないヒトＶセグメント、ヒトＤセグメント、ヒトＪセグメント）が、内因性非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域の核酸配列に作動可能に連結された、項目５に記載の非ヒト動物。
（項目１３）
前記第一の可変遺伝子座（再構成されていないヒトＶセグメント、ヒトＤセグメント、ヒトＪセグメント）が、内因性非ヒト免疫グロブリン遺伝子座において、前記内因性非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域の核酸配列に作動可能に連結された、項目１２に記載の非ヒト動物。
（項目１４）
前記第二の可変遺伝子座（再構成されていないＶセグメント、Ｊセグメント）が、内因性非ヒト免疫グロブリン軽鎖定常領域配列に作動可能に連結された、項目６に記載の非ヒト動物。
（項目１５）
前記内因性非ヒト免疫グロブリン軽鎖定常領域配列が、内因性非ヒト免疫グロブリン遺伝子座にある、項目１４に記載の非ヒト動物。
（項目１６）
定常領域遺伝子配列に作動可能に連結された再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域の核酸配列（再構成されていないＶセグメント、Ｄセグメント、Ｊセグメント）の少なくとも一部分であって、該Ｖ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、およびＪ遺伝子セグメントのうちの１つまたは複数が、少なくとも１カ所の非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換、または少なくとも１カ所のヒスチジンコドンの挿入を含む、再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域の核酸配列の少なくとも一部分と；
定常領域遺伝子配列に作動可能に連結された再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域の核酸配列（再構成されていないＶセグメント、Ｊセグメント）の少なくとも一部分であって、該Ｖ遺伝子セグメントおよびＪ遺伝子セグメントのうちの１つまたは複数が、少なくとも１カ所の非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換、または少なくとも１カ所のヒスチジンコドンの挿入を含む、再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域の核酸配列の少なくとも一部分と
を含み、
マウスの生殖細胞系列におけるヒスチジン置換またはヒスチジン挿入に由来するヒスチジンを含む、免疫グロブリン重鎖可変ドメインおよび／または免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを発現する、遺伝子改変された非ヒト動物。
（項目１７）
哺乳動物である、項目１６に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
（項目１８）
齧歯動物である、項目１７に記載の遺伝子改変された哺乳動物。
（項目１９）
マウス、ラット、およびハムスターからなる群から選択される、項目１８に記載の齧歯動物。
（項目２０）
前記再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域の核酸配列が、非ヒト定常領域配列に作動可能に連結された、項目１６に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
（項目２１）
前記再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域の核酸配列に作動可能に連結された前記非ヒト定常領域核酸配列が、前記非ヒト動物の生殖細胞系列における内因性非ヒト免疫グロブリン遺伝子座にある、項目２０に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
（項目２３）
前記再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域の核酸配列に作動可能に連結された前記非ヒト定常領域核酸配列が、前記非ヒト動物の生殖細胞系列における内因性非ヒト免疫グロブリン遺伝子座にある、項目１６に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
（項目２４）
定常領域遺伝子配列に作動可能に連結された再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域の核酸配列（再構成されていないＶセグメント、Ｄセグメント、Ｊセグメント）の少なくとも一部分であって、該再構成されていないＶ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、およびＪ遺伝子セグメントのうちの１つまたは複数が、少なくとも１カ所の非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換、または少なくとも１カ所のヒスチジンコドンの挿入を含む、再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域の核酸配列の少なくとも一部分と；
軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結された再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域の核酸配列（再構成されたＶＪ配列）であって、該再構成されたＶＪ配列が、少なくとも１カ所の非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換、または少なくとも１カ所のヒスチジンコドンの挿入を含む、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域の核酸配列と
を含み、
マウスの生殖細胞系列におけるヒスチジン置換またはヒスチジン挿入に由来するヒスチジンを含む、免疫グロブリン重鎖可変ドメインおよび／または免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを発現する、遺伝子改変された非ヒト動物。
（項目２５）
哺乳動物である、項目２４に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
（項目２６）
齧歯動物である、項目２５に記載の遺伝子改変された哺乳動物。
（項目２７）
マウス、ラット、およびハムスターからなる群から選択される、項目２６に記載の齧歯動物。
（項目２８）
前記再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域の核酸配列が、非ヒト定常領域配列に作動可能に連結された、項目２４に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
（項目２９）
前記再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域の核酸配列に作動可能に連結された前記非ヒト定常領域配列が、前記非ヒト動物の生殖細胞系列における内因性非ヒト免疫グロブリン遺伝子座にある、項目２８に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
（項目３０）
前記再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域の核酸配列に作動可能に連結された前記非ヒト定常領域配列が、前記非ヒト動物の生殖細胞系列における内因性非ヒト免疫グロブリン遺伝子座にある、項目２９に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
（項目３１）
野生型の非ヒト動物と比較した、Ｂ細胞集団の免疫グロブリン重鎖におけるおよび免疫グロブリン軽鎖におけるヒスチジン残基の存在の増強を特徴とするＢ細胞集団を含む、遺伝子改変された非ヒト動物。
（項目３２）
前記増強が、約２〜４倍である、項目３１に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
（項目３３）
前記増強が、約２〜１０倍である、項目３１に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
（項目３４）
非ヒト動物の生殖細胞系列の免疫グロブリン配列における置換および／または挿入によりコードされるヒスチジンを含む、免疫グロブリン軽鎖および免疫グロブリン重鎖を発現する、遺伝子改変された非ヒト動物。
（項目３５）
前記可変領域配列が、ヒスチジンコドンによる非ヒスチジンコドンの置換および／またはヒスチジンコドンの挿入である、２つ、３つ、４つ、または５つのヒスチジンによるクラスターを含む、項目１に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
（項目３６）
前記再構成されていない重鎖遺伝子座が、前記重鎖遺伝子座の配向の方向に対して反転されたＤ遺伝子セグメントを含む、項目５に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
（項目３７）
生殖細胞系列のヒスチジンコドンによりコードされるヒスチジンを有する抗体可変ドメインを作製する非ヒト動物を作製するための方法であって、
該非ヒト動物を、その生殖細胞系列において、少なくとも１カ所のヒスチジンコドンによる非ヒスチジンコドンの置換またはヒスチジンコドンの挿入を、再構成されていない免疫グロブリン重鎖可変（再構成されていないＶセグメント、Ｄセグメント、Ｊセグメント）遺伝子座に含むように改変するステップと、
該非ヒト動物を、その生殖細胞系列において、少なくとも１カ所のヒスチジンコドンによる非ヒスチジンコドンの置換またはヒスチジンコドンの挿入を、再構成されていない免疫グロブリン軽鎖可変（再構成されていないＶセグメント、Ｊセグメント）遺伝子座に含むように改変するステップと
を含む方法。
（項目３８）
マウスの生殖細胞系列を、再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変（Ｖセグメント、Ｄセグメント、Ｊセグメント）遺伝子座の少なくとも一部分を含むように遺伝子改変するステップと、ヒスチジン置換またはヒスチジン挿入を、該再構成されていない免疫グロブリン重鎖可変（再構成されていないＶセグメント、Ｄセグメント、Ｊセグメント）ヒト遺伝子座に施すステップとを含む、項目３７に記載の方法。
（項目３９）
マウスの生殖細胞系列を、再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖（再構成されていないＶセグメント、Ｊセグメント）遺伝子座の少なくとも一部分を含むように遺伝子改変するステップと、ヒスチジン置換またはヒスチジン挿入を、該再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖遺伝子座に施すステップとを含む、項目３７に記載の方法。
（項目４０）
前記非ヒト動物が、齧歯動物である、項目３７に記載の方法。
（項目４１）
前記齧歯動物が、マウス、ラット、およびハムスターから選択される、項目４０に記載の方法。
（項目４２）
生殖細胞系列のヒスチジンコドンによりコードされるヒスチジンを有する抗体可変ドメインを作製する非ヒト動物を作製するための方法であって、
該非ヒト動物を、少なくとも１カ所のヒスチジンコドンによる非ヒスチジンコドンの置換またはヒスチジンコドンの挿入を、再構成されていない免疫グロブリン重鎖可変（再構成されていないＶセグメント、Ｄセグメント、Ｊセグメント）遺伝子座に含むように改変するステップと、
該非ヒト動物を、少なくとも１カ所のヒスチジンコドンによる非ヒスチジンコドンの置換またはヒスチジンコドンの挿入を、該生殖細胞系列における再構成された免疫グロブリン軽鎖可変配列（再構成されたＶＪ配列）に含むように改変するステップと
を含む方法。
（項目４３）
前記非ヒト動物が、齧歯動物である、項目４２に記載の方法。
（項目４４）
前記齧歯動物が、マウス、ラット、およびハムスターから選択される、項目４３に記載の方法。

Claims (43)

1. 少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換または挿入を免疫グロブリン可変遺伝子座に含む、免疫グロブリン遺伝子座をその生殖細胞系列に含む、遺伝子改変された非ヒト動物であって、該ヒスチジンコドンは、対応する野生型生殖系列遺伝子セグメントによってコードされない。非ヒト動物。
2. 第一の可変遺伝子座および第二の可変遺伝子座を含み、少なくとも該第一の可変遺伝子座または該第二の可変遺伝子座は、少なくとも１つのヒスチジンコドンの挿入または少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む、請求項１に記載の非ヒト動物。
3. 前記第一の可変遺伝子座および前記第二の可変遺伝子座の両方が各々、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換または挿入を含む、請求項２に記載の非ヒト動物。
4. 前記第一の可変遺伝子座が、再構成されていない重鎖可変遺伝子座（再構成されていないＶセグメント、Ｄセグメント、Ｊセグメント）の少なくとも１つの機能性部分を含む、請求項３に記載の非ヒト動物。
5. 前記再構成されていない重鎖可変遺伝子座が、ヒト遺伝子座（再構成されていないＶセグメント、Ｄセグメント、Ｊセグメント）の少なくとも一部分を含む、請求項４に記載の非ヒト動物。
6. 前記再構成されていない重鎖遺伝子座が、再構成されていないＶセグメント、リンカーを含む合成Ｄセグメント、およびヒトＪセグメントを含むヒト遺伝子座である、請求項４に記載の非ヒト動物。
7. 前記合成Ｄセグメントが、少なくとも１つのヒスチジンコドンを含む、請求項６に記載の非ヒト動物。
8. 前記第二の可変遺伝子座が、再構成されていない軽鎖遺伝子座（再構成されていないＶセグメント、Ｊセグメント）の少なくとも１つの機能性部分を含む、請求項３に記載の非ヒト動物。
9. 前記第二の可変遺伝子座が、再構成された免疫グロブリン軽鎖可変遺伝子配列（再構成されたＶＪ配列）を含む、請求項４に記載の非ヒト動物。
10. 非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる前記置換および／またはヒスチジンコドンの前記挿入が、可変ドメインをコードする核酸配列においてであり、ヒスチジンが、免疫グロブリン鎖のＮ末端領域、免疫グロブリン鎖のループ４領域、重鎖のＣＤＲ１、重鎖のＣＤＲ２、重鎖のＣＤＲ３、軽鎖のＣＤＲ１、軽鎖のＣＤＲ２、軽鎖のＣＤＲ３、およびこれらの組合せから選択される領域にある、請求項１に記載の非ヒト動物。
11. 前記第一の可変遺伝子座または前記第二の可変遺伝子座のうちの少なくとも１つが、内因性非ヒト免疫グロブリン遺伝子座において、内因性非ヒト定常領域の核酸配列に作動可能に連結された、請求項２に記載の非ヒト動物。
12. 前記第一の可変遺伝子座（再構成されていないヒトＶセグメント、ヒトＤセグメント、ヒトＪセグメント）が、内因性非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域の核酸配列に作動可能に連結された、請求項５に記載の非ヒト動物。
13. 前記第一の可変遺伝子座（再構成されていないヒトＶセグメント、ヒトＤセグメント、ヒトＪセグメント）が、内因性非ヒト免疫グロブリン遺伝子座において、前記内因性非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域の核酸配列に作動可能に連結された、請求項１２に記載の非ヒト動物。
14. 前記第二の可変遺伝子座（再構成されていないＶセグメント、Ｊセグメント）が、内因性非ヒト免疫グロブリン軽鎖定常領域配列に作動可能に連結された、請求項６に記載の非ヒト動物。
15. 前記内因性非ヒト免疫グロブリン軽鎖定常領域配列が、内因性非ヒト免疫グロブリン遺伝子座にある、請求項１４に記載の非ヒト動物。
16. 定常領域遺伝子配列に作動可能に連結された再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域の核酸配列（再構成されていないＶセグメント、Ｄセグメント、Ｊセグメント）の少なくとも一部分であって、該Ｖ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、およびＪ遺伝子セグメントのうちの１つまたは複数が、少なくとも１カ所の非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換、または少なくとも１カ所のヒスチジンコドンの挿入を含み、該再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域の核酸配列の該ヒスチジンコドンは、対応するヒト生殖系列遺伝子セグメントによってコードされない、再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域の核酸配列の少なくとも一部分と；
    定常領域遺伝子配列に作動可能に連結された再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域の核酸配列（再構成されていないＶセグメント、Ｊセグメント）の少なくとも一部分であって、該Ｖ遺伝子セグメントおよびＪ遺伝子セグメントのうちの１つまたは複数が、少なくとも１カ所の非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換、または少なくとも１カ所のヒスチジンコドンの挿入を含み、該再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域の核酸配列の該ヒスチジンコドンは、対応するヒト生殖系列遺伝子セグメントによってコードされない、再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域の核酸配列の少なくとも一部分と
    を含み、
    マウスの生殖細胞系列におけるヒスチジン置換またはヒスチジン挿入に由来するヒスチジンを含む、免疫グロブリン重鎖可変ドメインおよび／または免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを発現する、遺伝子改変された非ヒト動物。
17. 哺乳動物である、請求項１６に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
18. 齧歯動物である、請求項１７に記載の遺伝子改変された哺乳動物。
19. マウス、ラット、およびハムスターからなる群から選択される、請求項１８に記載の齧歯動物。
20. 前記再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域の核酸配列が、非ヒト定常領域配列に作動可能に連結された、請求項１６に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
21. 前記再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域の核酸配列に作動可能に連結された前記非ヒト定常領域核酸配列が、前記非ヒト動物の生殖細胞系列における内因性非ヒト免疫グロブリン遺伝子座にある、請求項２０に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
22. 前記再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域の核酸配列に作動可能に連結された前記非ヒト定常領域核酸配列が、前記非ヒト動物の生殖細胞系列における内因性非ヒト免疫グロブリン遺伝子座にある、請求項１６に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
23. 定常領域遺伝子配列に作動可能に連結された再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域の核酸配列（再構成されていないＶセグメント、Ｄセグメント、Ｊセグメント）の少なくとも一部分であって、該再構成されていないＶ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、およびＪ遺伝子セグメントのうちの１つまたは複数が、少なくとも１カ所の非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換、または少なくとも１カ所のヒスチジンコドンの挿入を含み、該再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域の核酸配列の該ヒスチジンコドンは、対応するヒト生殖系列遺伝子セグメントによってコードされない、再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域の核酸配列の少なくとも一部分と；
    軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結された再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域の核酸配列（再構成されたＶＪ配列）であって、該再構成されたＶＪ配列が、少なくとも１カ所の非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換、または少なくとも１カ所のヒスチジンコドンの挿入を含み、該再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域の核酸配列の該ヒスチジンコドンは、対応するヒト生殖系列遺伝子セグメントによってコードされない、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域の核酸配列と
    を含み、
    マウスの生殖細胞系列におけるヒスチジン置換またはヒスチジン挿入に由来するヒスチジンを含む、免疫グロブリン重鎖可変ドメインおよび／または免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを発現する、遺伝子改変された非ヒト動物。
24. 哺乳動物である、請求項２４に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
25. 齧歯動物である、請求項２５に記載の遺伝子改変された哺乳動物。
26. マウス、ラット、およびハムスターからなる群から選択される、請求項２６に記載の齧歯動物。
27. 前記再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域の核酸配列が、非ヒト定常領域配列に作動可能に連結された、請求項２４に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
28. 前記再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域の核酸配列に作動可能に連結された前記非ヒト定常領域配列が、前記非ヒト動物の生殖細胞系列における内因性非ヒト免疫グロブリン遺伝子座にある、請求項２８に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
29. 前記再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域の核酸配列に作動可能に連結された前記非ヒト定常領域配列が、前記非ヒト動物の生殖細胞系列における内因性非ヒト免疫グロブリン遺伝子座にある、請求項２９に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
30. 遺伝子改変された非ヒト動物であって、
    その生殖細胞系列に、
    免疫グロブリン重鎖遺伝子での非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる少なくとも１カ所の挿入または少なくとも１カ所の置換であって、該免疫グロブリン重鎖遺伝子座の該ヒスチジンコドンが、対応する生殖細胞系列遺伝子セグメントによってコードされない、挿入または置換、および
    免疫グロブリン軽鎖遺伝子での非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる少なくとも１カ所の挿入または少なくとも１カ所の置換であって、該免疫グロブリン軽鎖遺伝子座の該ヒスチジンコドンが、対応する生殖細胞系列遺伝子セグメントによってコードされない、挿入または置換、および
    野生型の非ヒト動物と比較した、Ｂ細胞集団の免疫グロブリン重鎖におけるおよび免疫グロブリン軽鎖におけるヒスチジン残基の存在の増強を特徴とするＢ細胞集団
    を含む、遺伝子改変された非ヒト動物。
31. 前記増強が、約２〜４倍である、請求項３１に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
32. 前記増強が、約２〜１０倍である、請求項３１に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
33. 非ヒト動物の生殖細胞系列の免疫グロブリン配列における置換および／または挿入によりコードされるヒスチジンを含む、免疫グロブリン軽鎖および免疫グロブリン重鎖を発現する、遺伝子改変された非ヒト動物。
34. 前記可変領域配列が、ヒスチジンコドンによる非ヒスチジンコドンの置換および／またはヒスチジンコドンの挿入である、２つ、３つ、４つ、または５つのヒスチジンによるクラスターを含む、請求項１に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
35. 前記再構成されていない重鎖遺伝子座が、前記重鎖遺伝子座の配向の方向に対して反転されたＤ遺伝子セグメントを含む、請求項５に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
36. 生殖細胞系列のヒスチジンコドンによりコードされるヒスチジンを有する抗体可変ドメインを作製する非ヒト動物を作製するための方法であって、
    該非ヒト動物を、その生殖細胞系列において、少なくとも１カ所のヒスチジンコドンによる非ヒスチジンコドンの置換またはヒスチジンコドンの挿入を、再構成されていない免疫グロブリン重鎖可変（再構成されていないＶセグメント、Ｄセグメント、Ｊセグメント）遺伝子座に含むように改変するステップであって、該再構成されていない免疫グロブリン重鎖可変遺伝子座の該ヒスチジンコドンが、対応する野生型生殖細胞系列遺伝子セグメントによってコードされない、ステップと、
    該非ヒト動物を、その生殖細胞系列において、少なくとも１カ所のヒスチジンコドンによる非ヒスチジンコドンの置換またはヒスチジンコドンの挿入を、再構成されていない免疫グロブリン軽鎖可変（再構成されていないＶセグメント、Ｊセグメント）遺伝子座に含むように改変するステップであって、該再構成されていない免疫グロブリン軽鎖可変遺伝子座の該ヒスチジンコドンが、対応する野生型生殖細胞系列遺伝子セグメントによってコードされない、ステップと
    を含む方法。
37. マウスの生殖細胞系列を、再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変（Ｖセグメント、Ｄセグメント、Ｊセグメント）遺伝子座の少なくとも一部分を含むように遺伝子改変するステップと、ヒスチジン置換またはヒスチジン挿入を、該再構成されていない免疫グロブリン重鎖可変（再構成されていないＶセグメント、Ｄセグメント、Ｊセグメント）ヒト遺伝子座に施すステップとを含む、請求項３７に記載の方法。
38. マウスの生殖細胞系列を、再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖（再構成されていないＶセグメント、Ｊセグメント）遺伝子座の少なくとも一部分を含むように遺伝子改変するステップと、ヒスチジン置換またはヒスチジン挿入を、該再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖遺伝子座に施すステップとを含む、請求項３７に記載の方法。
39. 前記非ヒト動物が、齧歯動物である、請求項３７に記載の方法。
40. 前記齧歯動物が、マウス、ラット、およびハムスターから選択される、請求項４０に記載の方法。
41. 生殖細胞系列のヒスチジンコドンによりコードされるヒスチジンを有する抗体可変ドメインを作製する非ヒト動物を作製するための方法であって、
    該非ヒト動物を、少なくとも１カ所のヒスチジンコドンによる非ヒスチジンコドンの置換またはヒスチジンコドンの挿入を、再構成されていない免疫グロブリン重鎖可変（再構成されていないＶセグメント、Ｄセグメント、Ｊセグメント）遺伝子座に含むように改変するステップであって、該再構成されていない免疫グロブリン重鎖可変遺伝子座の該ヒスチジンコドンが、対応する野生型生殖細胞系列遺伝子セグメントによってコードされない、ステップと、
    該非ヒト動物を、少なくとも１カ所のヒスチジンコドンによる非ヒスチジンコドンの置換またはヒスチジンコドンの挿入を、該生殖細胞系列における再構成された免疫グロブリン軽鎖可変配列（再構成されたＶＪ配列）に含むように改変するステップであって、該再構成された免疫グロブリン軽鎖可変配列に含まれる該ヒスチジンコドンが、対応する野生型生殖細胞系列遺伝子セグメントによってコードされない、ステップと
    を含む方法。
42. 前記非ヒト動物が、齧歯動物である、請求項４２に記載の方法。
43. 前記齧歯動物が、マウス、ラット、およびハムスターから選択される、請求項４３に記載の方法。