JP2014097000A - Method of screening skin barrier function improving agent - Google Patents
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Abstract
【課題】紫外線及び加齢により低下した皮膚バリア機能改善剤のスクリーニング方法及びより効果の高い皮膚バリア機能改善剤を提供する。
【解決手段】若齢のヒト及び高齢のヒトのドナーから得られた培養表皮ケラチノサイトを用い、紫外線照射により培養表皮ケラチノサイトに発現するヒアルロン酸合成関連遺伝子の発現量とヒアルロン酸レセプター関連遺伝子の発現量とヒアルロン酸分解関連遺伝子の発現量を指標とし、高齢のヒトのドナーから得られた培養表皮ケラチノサイトに発現する遺伝子と若齢のヒトのドナーから得られた培養表皮ケラチノサイトに発現する遺伝子の発現量を比較することで、皮膚バリア機能改善剤をスクリーニングする方法。
【選択図】なしThe present invention provides a screening method for a skin barrier function-improving agent that has decreased due to ultraviolet rays and aging, and a skin barrier function-improving agent that is more effective.
SOLUTION: Expression levels of hyaluronic acid synthesis-related genes and hyaluronic acid receptor-related genes expressed in cultured epidermal keratinocytes by UV irradiation using cultured epidermal keratinocytes obtained from young humans and elderly human donors And the expression level of genes expressed in cultured epidermal keratinocytes obtained from an elderly human donor and the genes expressed in cultured epidermal keratinocytes obtained from a young human donor A method of screening for a skin barrier function improving agent by comparing.
[Selection figure] None
Description
本発明は、皮膚バリア機能改善剤のスクリーニング方法に関する。具体的には、ヒアルロン酸合成関連遺伝子、ヒアルロン酸レセプター関連遺伝子、ヒアルロン酸分解関連遺伝子を指標とした皮膚バリア機能改善剤のスクリーニング方法とその方法を用いて選択された皮膚バリア機能改善剤に関する。 The present invention relates to a screening method for a skin barrier function improving agent. Specifically, the present invention relates to a method for screening a skin barrier function improving agent using a hyaluronic acid synthesis-related gene, a hyaluronic acid receptor-related gene, and a hyaluronic acid degradation-related gene as indices, and a skin barrier function improving agent selected using the method.
ヒアルロン酸は皮膚の角質層や真皮に存在するムコ多糖で、皮膚の保湿や弾力性に寄与することが知られている。ヒアルロン酸の半減期は約1日と短く、皮膚内においては常に合成と分解が繰り返されて、皮膚の保湿や弾力性を維持している。 Hyaluronic acid is a mucopolysaccharide present in the stratum corneum and dermis of the skin, and is known to contribute to skin moisture retention and elasticity. Hyaluronic acid has a short half-life of about one day, and synthesis and degradation are always repeated in the skin to maintain the moisture and elasticity of the skin.
一方、加齢に伴い皮膚の弾力性やハリの低下、皮膚の乾燥や肌荒れといった変化が生じることは良く知られている。その変化の原因の一つとして皮膚におけるヒアルロン酸量の低下が考えられ、皮膚におけるヒアルロン酸については、加齢により減少することが報告されている（非特許文献１、非特許文献２）。 On the other hand, it is well known that changes such as skin elasticity and firmness, skin dryness and rough skin occur with aging. One of the causes of the change is considered to be a decrease in the amount of hyaluronic acid in the skin, and it has been reported that hyaluronic acid in the skin decreases with aging (Non-patent Documents 1 and 2).
またヒアルロン酸分子量については、紫外線の照射により低分子化すること（非特許文献３）、角層、表皮層、真皮層で比較すると角層＜表皮層＜真皮層の順で小さいことが報告されていた（非特許文献４）。 In addition, the molecular weight of hyaluronic acid is reported to be reduced by irradiation with ultraviolet rays (Non-patent Document 3), and in the order of stratum corneum <skin layer <dermis layer when compared with stratum corneum, epidermis layer and dermis layer. (Non-Patent Document 4).
そこで、これらの現象を解決するために、従来は専らヒアルロン酸量を増加あるいは維持することを目的とするヒアルロン酸生成促進剤やヒアルロン酸分解抑制剤が提案されていた。 Thus, in order to solve these phenomena, conventionally, hyaluronic acid production promoters and hyaluronic acid decomposition inhibitors have been proposed exclusively for the purpose of increasing or maintaining the amount of hyaluronic acid.
一方、ヒアルロン酸の分解促進剤に関しては、動脈硬化、心筋梗塞、骨形成異常、乾癬、悪性腫瘍の症状悪化に密接に関連すると考えられるヒアルロン酸合成の異常亢進への対処としてヒアルロン酸分解促進剤を適用する試みがわずかに報告されている（特許文献１、２）。
しかしながら、加齢に伴う皮膚の弾力性やハリの低下、皮膚の乾燥や肌荒れといった皮膚の変化を予防・改善することを目的としてヒアルロン酸の分解促進を試みる例は全く報告されていなかった。
On the other hand, as for the hyaluronic acid degradation accelerator, as a countermeasure to the abnormal increase in hyaluronic acid synthesis, which is considered to be closely related to arteriosclerosis, myocardial infarction, bone dysplasia, psoriasis, and worsening of malignant tumor symptoms, There have been a few reports of attempts to apply (Patent Documents 1 and 2).
However, there have been no reports of attempts to promote the degradation of hyaluronic acid for the purpose of preventing or improving skin changes such as skin elasticity and firmness that decrease with age, and skin dryness and rough skin.
つまり、従来は、単にヒアルロン酸の合成を促進する、或いは分解を抑制する、或いは、異常に産生されたヒアルロン酸を分解するというように、専らヒアルロン酸の量に着目し、その量を増やす、或いは減るのを抑える、増えすぎるのを抑えると言った提案に過ぎず、ヒアルロン酸の合成関連遺伝子とレセプター関連遺伝子と分解関連遺伝子に着目し、これらを指標としたスクリーニング方法は開示されていなかった。 In other words, conventionally, simply promoting the synthesis of hyaluronic acid, suppressing degradation, or decomposing abnormally produced hyaluronic acid, focusing exclusively on the amount of hyaluronic acid, increasing the amount, Alternatively, it is only a proposal to suppress the decrease or to suppress the increase, and focusing on hyaluronic acid synthesis-related genes, receptor-related genes, and degradation-related genes, and a screening method using these as indices was not disclosed. .
本発明者らは、上記背景技術に鑑み、表皮内のヒアルロン酸代謝と表皮の外部環境からの防御機能との関連について研究を進めたところ、表皮内のヒアルロン酸の量ではなく、むしろヒアルロン酸の分子量と角層水分量および水分蒸散量との間に何らかの関係があることを発見した。
そして、さらに研究を進めたところ、加齢および紫外線による表皮ケラチノサイトにおけるヒアルロン酸合成関連遺伝子（以下、単に合成関連遺伝子と言う場合がある）のみならず、ヒアルロン酸レセプター関連遺伝子（以下、単にレセプター関連遺伝子と言う場合がある）およびヒアルロン酸分解関連遺伝子（以下、単に分解関連遺伝子と言う場合がある）が、皮膚バリア機能の改善に関連していることを突き止めた。
In view of the above-mentioned background art, the present inventors have conducted research on the relationship between hyaluronic acid metabolism in the epidermis and the protective function from the external environment of the epidermis, but rather than the amount of hyaluronic acid in the epidermis, rather than hyaluronic acid in the epidermis. It has been found that there is some relationship between the molecular weight of stratum corneum and the amount of stratum corneum moisture and moisture transpiration.
As a result of further research, not only hyaluronic acid synthesis-related genes (hereinafter also referred to simply as synthesis-related genes) but also hyaluronic acid receptor-related genes (hereinafter simply referred to as receptor-related) in epidermal keratinocytes due to aging and ultraviolet rays. It has been found that hyaluronic acid degradation-related genes (hereinafter sometimes simply referred to as degradation-related genes) are related to the improvement of skin barrier function.
具体的には、ヒアルロン酸合成関連遺伝子、レセプター関連遺伝子、分解関連遺伝子の発現低下、或いは上昇度低下が、表皮内に低分子ヒアルロン酸の蓄積を招き、低分子化したヒアルロン酸が表皮細胞の分化を抑制することにより、未成熟な角層を生成し、結果として皮膚バリア機能の低下に引き続く角層水分量の低下を生じさせるという悪循環を生じさせていることが判明した。 Specifically, a decrease in the expression or elevation of hyaluronic acid synthesis-related genes, receptor-related genes, and degradation-related genes leads to the accumulation of low molecular weight hyaluronic acid in the epidermis, and the low molecular weight hyaluronic acid is expressed in epidermal cells. By suppressing differentiation, it was found that an immature stratum corneum was generated, resulting in a vicious circle in which the stratum corneum water content decreased following the skin barrier function decrease.
これらのことにより、表皮内に低分子化したヒアルロン酸の蓄積を抑制することが出来れば、皮膚バリア機能を改善させることが出来ると考えられる。 If it is possible to suppress the accumulation of hyaluronic acid having a low molecular weight in the epidermis, it is considered that the skin barrier function can be improved.
本願発明は、紫外線及び加齢により低下した皮膚バリア機能改善剤のスクリーニング方法を提供することを課題とし、加えてより効果の高い皮膚バリア機能改善剤を提供することを課題とする。 This invention makes it a subject to provide the screening method of the skin barrier function improving agent lowered | hung by ultraviolet rays and aging, and also makes it a subject to provide a skin barrier function improving agent with a higher effect.
本発明は、若齢のヒト及び高齢のヒトのドナーから得られた培養表皮ケラチノサイトを用い、紫外線照射により培養表皮ケラチノサイトに発現するヒアルロン酸合成関連遺伝子の発現量とヒアルロン酸レセプター関連遺伝子の発現量とヒアルロン酸分解関連遺伝子の発現量を指標とし、高齢のヒトのドナーから得られた培養表皮ケラチノサイトに発現する遺伝子と若齢のヒトのドナーから得られた培養表皮ケラチノサイトに発現する遺伝子の発現量を比較することで、皮膚バリア機能改善剤をスクリーニングする方法である。 The present invention uses cultured epidermal keratinocytes obtained from young humans and elderly human donors, and the expression levels of hyaluronic acid synthesis-related genes and hyaluronic acid receptor-related genes expressed in cultured epidermal keratinocytes by ultraviolet irradiation And the expression level of genes expressed in cultured epidermal keratinocytes obtained from an elderly human donor and the genes expressed in cultured epidermal keratinocytes obtained from a young human donor Is a method for screening for an agent for improving skin barrier function.
更に具体的には、下記ステップにより測定した遺伝子の発現量を指標とする、皮膚バリア機能改善剤のスクリーニング方法である。
（１）紫外線を照射した若齢のヒトをドナーとする培養表皮ケラチノサイトのヒアルロン酸合成関連遺伝子の発現量（Ｃｙｓ）およびヒアルロン酸レセプター関連遺伝子の発現量（Ｃｙｒ）およびヒアルロン酸分解関連遺伝子の発現量（Ｃｙｄ）を測定するステップ
（２）紫外線を照射しない若齢のヒトをドナーとする培養表皮ケラチノサイトのヒアルロン酸合成関連遺伝子の発現量（Ｂｙｓ）およびヒアルロン酸レセプター関連遺伝子の発現量（Ｂｙｒ）およびヒアルロン酸分解関連遺伝子の発現量（Ｂｙｄ）を測定するステップ
（３）紫外線を照射した高齢のヒトをドナーとする培養表皮ケラチノサイトのヒアルロン酸合成関連遺伝子の発現量（Ｃａｓ）およびヒアルロン酸レセプター関連遺伝子の発現量（Ｃａｒ）およびヒアルロン酸分解関連遺伝子の発現量（Ｃａｄ）を測定するステップ
（４）紫外線を照射しない高齢のヒトをドナーとする培養表皮ケラチノサイトのヒアルロン酸合成関連遺伝子の発現量（Ｂａｓ）およびヒアルロン酸レセプター関連遺伝子の発現量（Ｂａｒ）およびヒアルロン酸分解関連遺伝子の発現量（Ｂａｄ）を測定するステップ
（５）紫外線照射前又は、紫外線照射後又は、紫外線照射の前後に被験物質を加えた状態の高齢のヒトをドナーとする培養表皮ケラチノサイトのヒアルロン酸合成関連遺伝子の発現量（Ｔａｓ）およびヒアルロン酸レセプター関連遺伝子の発現量（Ｔａｒ）およびヒアルロン酸分解関連遺伝子の発現量（Ｔａｄ）を測定するステップ
（６）前記（１）〜（５）の各ステップで得られた遺伝子の発現量において、Ｃｙｓ／Ｂｙｓ≧Ｔａｓ／Ｂａｓ≧Ｃａｓ／ＢａｓかつＣｙｒ／Ｂｙｒ≧Ｔａｒ/Ｂａｒ≧Ｃａｒ／ＢａｒかつＣｙｄ／Ｂｙｄ≧Ｔａｄ／Ｂａｄ＞Ｃａｄ／Ｂａｄとなる被験物質を有効成分として選択するステップ
More specifically, it is a screening method for a skin barrier function improving agent using the gene expression level measured in the following steps as an index.
(1) Expression level of hyaluronic acid synthesis-related gene (Cys), expression level of hyaluronic acid receptor-related gene (Cyr) and expression of hyaluronic acid degradation-related gene in cultured epidermal keratinocytes from young humans irradiated with ultraviolet rays (2) Expression level (Bys) of hyaluronic acid synthesis-related gene and expression level (Byr) of hyaluronic acid receptor-related gene in cultured epidermal keratinocytes from young human donors who are not irradiated with ultraviolet rays And (3) measuring the expression level (Byd) of a gene related to the degradation of hyaluronic acid and hyaluronic acid (3) Expression level of the hyaluronic acid synthesis-related gene (Cas) and hyaluronic acid receptor-related in cultured epidermal keratinocytes from donors who are irradiated with ultraviolet rays Gene expression level (Car) and hyaluronic acid Step of measuring the expression level (Cad) of the solution-related gene (4) Expression level of the hyaluronic acid synthesis-related gene (Bas) and expression of the hyaluronic acid receptor-related gene in cultured epidermal keratinocytes from donors who are not irradiated with ultraviolet rays Step (5) for measuring the amount (Bar) and the expression level (Bad) of a gene related to the degradation of hyaluronic acid (5) Donating an elderly human to whom a test substance has been added before, after, or before and after UV irradiation Measuring the expression level (Tas) of the hyaluronic acid synthesis-related gene and the expression level (Tad) of the hyaluronic acid receptor-related gene and the expression level (Tad) of the hyaluronic acid receptor-related gene in the cultured epidermal keratinocytes (6) In the expression level of the gene obtained in each step of 1) to (5), Cys / Selecting the test substance as an active ingredient a ys ≧ Tas / Bas ≧ Cas / Bas and Cyr / Byr ≧ Tar / Bar ≧ Car / Bar and Cyd / Byd ≧ Tad / Bad> Cad / Bad
更には、
Ｃｙｓ／Ｂｙｓ≧Ｔａｓ／Ｂａｓ≧Ｃａｓ／Ｂａｓかつ、Ｃｙｒ／Ｂｙｒ≧Ｔａｒ/Ｂａｒ≧Ｃａｒ／Ｂａｒかつ、Ｃｙｄ／Ｂｙｄ≧Ｔａｄ／Ｂａｄ≧（Ｃｙｄ／Ｂｙｄ＋Ｃａｄ／Ｂａｄ）／２となる被験物質を有効成分として選択することを特徴とする請求項１の皮膚バリア機能改善剤のスクリーニング方法である。
Furthermore,
Test substance with Cys / Bys ≧ Tas / Bas ≧ Cas / Bas and Cyr / Byr ≧ Tar / Bar ≧ Car / Bar and Cyd / Byd ≧ Tad / Bad ≧ (Cyd / Byd + Cad / Bad) / 2 The screening method for a skin barrier function improving agent according to claim 1, wherein:
また、上記スクリーニング方法により選別された皮膚バリア機能改善剤及びそれを配合した皮膚外用剤を提供する。 Moreover, the skin barrier function improving agent selected by the said screening method and the skin external preparation which mix | blended it are provided.
本発明によれば、ヒアルロン酸合成関連遺伝子、レセプター関連遺伝子、分解関連遺伝子を指標にし、各遺伝子発現が特定の関係を示す被験物質を選別することにより、動物実験や人での試験を行わずとも、簡易的に皮膚バリア機能を高める被験物質を選別することが可能になる。
また、これまでにない新たな着想に基づく皮膚バリア機能改善剤及び皮膚外用剤が提供される。
According to the present invention, animal experiments and human tests are not performed by selecting test substances having a specific relationship between gene expression, using hyaluronic acid synthesis-related genes, receptor-related genes, and degradation-related genes as indices. In both cases, it is possible to easily select a test substance that enhances the skin barrier function.
Moreover, the skin barrier function improving agent and external preparation for skin based on the new idea which has not existed before are provided.
本願発明のスクリーニング方法は、低分子化したヒアルロン酸の蓄積を防止するために、単にヒアルロン酸の分解を促進して、ヒアルロン酸の合成を促進させる被験物質を選択するものではない。 単にヒアルロン酸量を増加させることは、かえって病的な状態になる場合があるからである。
本願発明のスクリーニング方法においては、加齢及び紫外線によりダメージを受けた皮膚を想定し、ヒアルロン酸の合成関連遺伝子、レセプター関連遺伝子、分解関連遺伝子の発現量を、若齢のヒトの皮膚における各遺伝子発現の状態に近づけさせる被験物質を選択する方法である。
The screening method of the present invention does not select a test substance that promotes the synthesis of hyaluronic acid by merely promoting the degradation of hyaluronic acid in order to prevent the accumulation of hyaluronic acid having a reduced molecular weight. This is because simply increasing the amount of hyaluronic acid may result in a pathological condition.
In the screening method of the present invention, assuming the skin damaged by aging and ultraviolet rays, the expression level of the synthesis-related gene, receptor-related gene, and degradation-related gene of hyaluronic acid is determined based on each gene in young human skin. This is a method for selecting a test substance to be brought close to the expression state.
具体的には、以下の方法による。
（１）紫外線を照射した若齢のヒトをドナーとする培養表皮ケラチノサイトのヒアルロン酸合成関連遺伝子の発現量（Ｃｙｓ）およびヒアルロン酸レセプター関連遺伝子の発現量（Ｃｙｒ）およびヒアルロン酸分解関連遺伝子の発現量（Ｃｙｄ）を測定する。
（２）紫外線を照射しない若齢のヒトをドナーとする培養表皮ケラチノサイトのヒアルロン酸合成関連遺伝子の発現量（Ｂｙｓ）およびヒアルロン酸レセプター関連遺伝子の発現量（Ｂｙｒ）およびヒアルロン酸分解関連遺伝子の発現量（Ｂｙｄ）を測定する。
（３）紫外線を照射した高齢のヒトをドナーとする培養表皮ケラチノサイトのヒアルロン酸合成関連遺伝子の発現量（Ｃａｓ）およびヒアルロン酸レセプター関連遺伝子の発現量（Ｃａｒ）およびヒアルロン酸分解関連遺伝子の発現量（Ｃａｄ）を測定する。
（４）紫外線を照射しない高齢のヒトをドナーとする培養表皮ケラチノサイトのヒアルロン酸合成関連遺伝子の発現量（Ｂａｓ）およびヒアルロン酸レセプター関連遺伝子の発現量（Ｂａｒ）およびヒアルロン酸分解関連遺伝子の発現量（Ｂａｄ）を測定する。
（５）紫外線照射前又は、紫外線照射後又は、紫外線照射の前後に被験物質を加えた状態の高齢のヒトをドナーとする培養表皮ケラチノサイトのヒアルロン酸合成関連遺伝子の発現量（Ｔａｓ）およびヒアルロン酸レセプター関連遺伝子の発現量（Ｔａｒ）およびヒアルロン酸分解関連遺伝子の発現量（Ｔａｄ）を測定する。
（６）前記（１）〜（５）で得られた遺伝子の発現量において、Ｃｙｓ／Ｂｙｓ≧Ｔａｓ／Ｂａｓ≧Ｃａｓ／ＢａｓかつＣｙｒ／Ｂｙｒ≧Ｔａｒ/Ｂａｒ≧Ｃａｒ／ＢａｒかつＣｙｄ／Ｂｙｄ≧Ｔａｄ／Ｂａｄ＞Ｃａｄ／Ｂａｄとなる被験物質を有効成分として選択する。
Specifically, the following method is used.
(1) Expression level of hyaluronic acid synthesis-related gene (Cys), expression level of hyaluronic acid receptor-related gene (Cyr) and expression of hyaluronic acid degradation-related gene in cultured epidermal keratinocytes from young humans irradiated with ultraviolet rays The quantity (Cyd) is measured.
(2) Hyaluronic acid synthesis-related gene expression level (Bys), hyaluronic acid receptor-related gene expression level (Byr) and hyaluronic acid degradation-related gene expression in cultured epidermal keratinocytes from young humans who do not irradiate ultraviolet rays The amount (Byd) is measured.
(3) Expression level of hyaluronic acid synthesis-related gene (Cas), expression level of hyaluronic acid receptor-related gene (Car), and expression level of hyaluronic acid degradation-related gene in cultured epidermal keratinocytes from donors who are irradiated with ultraviolet rays (Cad) is measured.
(4) Expression level of genes related to hyaluronic acid synthesis (Bas), expression level of hyaluronic acid receptor-related genes (Bar), and expression level of genes related to degradation of hyaluronic acid in cultured epidermis keratinocytes whose donors are elderly people who do not irradiate ultraviolet rays (Bad) is measured.
(5) Expression level (Tas) of hyaluronic acid synthesis-related gene in cultured epidermis keratinocytes with a test substance added before or after ultraviolet irradiation or before and after ultraviolet irradiation as a donor The expression level of the receptor-related gene (Tar) and the expression level of the hyaluronic acid degradation-related gene (Tad) are measured.
(6) In the expression levels of the genes obtained in the above (1) to (5), Cys / Bys ≧ Tas / Bas ≧ Cas / Bas and Cyr / Byr ≧ Tar / Bar ≧ Car / Bar and Cyd / Byd ≧ Tad A test substance satisfying / Bad> Cad / Bad is selected as an active ingredient.
本発明で用いるヒアルロン酸合成関連遺伝子はＨＡＳ１、ＨＡＳ２、ＨＡＳ３である。ＨＡＳ１、ＨＡＳ２、ＨＡＳ３それぞれの発現量を測定し、これらの内、少なくとも１種以上の遺伝子の発現量がＣｙｓ／Ｂｙｓ≧Ｔａｓ／Ｂａｓ≧Ｃａｓ／Ｂａｓとなっていればよい。
具体的には、例えばヒアルロン酸合成関連遺伝子中、指標をＨＡＳ１とした際に、Ｃｙｓ／Ｂｙｓ≧Ｔａｓ／Ｂａｓ≧Ｃａｓ／Ｂａｓとなっていれば良いという意味である。この関係が、ＨＡＳ２を指標とした場合、ＨＡＳ３を指標にした際にも、それぞれ同様の関係であれば更に良い。 つまり、本関係を確認する場合には、遺伝子の種類は固定した上で判断する。
尚、ＨＡＳ１、ＨＡＳ２、ＨＡＳ３それぞれの発現量の内、少なくとも１種以上の遺伝子の発現量が前記関係を満たしていれば良く、ＨＡＳ１、ＨＡＳ２、ＨＡＳ３のいずれかの指標において、遺伝子の発現量がＣｙｓ／Ｂｙｓ≧Ｔａｓ／Ｂａｓ≧Ｃａｓ／Ｂａｓとなっていないものがあっても差し支えない。
The genes related to hyaluronic acid synthesis used in the present invention are HAS1, HAS2, and HAS3. The expression level of each of HAS1, HAS2, and HAS3 is measured, and the expression level of at least one of these genes may be Cys / Bys ≧ Tas / Bas ≧ Cas / Bas.
Specifically, for example, when the index is HAS1 in a gene related to hyaluronic acid synthesis, it means that Cys / Bys ≧ Tas / Bas ≧ Cas / Bas. In the case where HAS2 is used as an index, this relationship is even better if HAS3 is used as an index as long as the relationship is the same. In other words, when confirming this relationship, the type of gene is fixed and determined.
Of the expression levels of HAS1, HAS2, and HAS3, it is only necessary that the expression level of at least one gene satisfies the above relationship. In any of the indicators HAS1, HAS2, and HAS3, the expression level of the gene is There may be a case where Cys / Bys ≧ Tas / Bas ≧ Cas / Bas is not satisfied.
ＨＡＳはヒアルロン酸合成酵素（Ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ Ｓｙｎｔｈａｓｅ）をコードする遺伝子で、脊椎動物のＨＡＳファミリーにはＨＡＳ１、ＨＡＳ２、ＨＡＳ３の３種類がある。表皮細胞のヒアルロン酸合成では ＨＡＳ３ が主に働いていることが報告されているが（Sayo T et al.
Journal of Investigative Dermatology 118: 43-48, 2002. ）、ノックアウトマウスを用いた研究からＨＡＳ１とＨＡＳ３のノックアウトマウスでは目立った表現型が見られず、ＨＡＳは互いに機能を補完し合っている可能性も示唆されている。
HAS is a gene encoding hyaluronan synthase, and there are three types of HAS family of vertebrates: HAS1, HAS2, and HAS3. It has been reported that HAS3 mainly works in the synthesis of hyaluronan in epidermal cells (Sayo T et al.
Journal of Investigative Dermatology 118: 43-48, 2002.) From a study using knockout mice, no remarkable phenotype was found in HAS1 and HAS3 knockout mice, and HAS may complement each other's functions. Has been suggested.
本発明で用いるヒアルロン酸レセプター関連遺伝子はＣＤ４４である。 The hyaluronic acid receptor-related gene used in the present invention is CD44.
ＣＤ４４は、細胞凝集、細胞周囲のマトリックスの保持、マトリックス−細胞間のシグナリング、レセプターを介するヒアルロン酸の取り込み／分解や細胞遊走などを含む様々な細胞機能に関与するＣＤ４４
Ａｎｔｉｇｅｎをコードする遺伝子である。
CD44 is involved in various cellular functions including cell aggregation, retention of the matrix surrounding the cell, matrix-cell signaling, hyaluronan uptake / degradation via the receptor, cell migration, and the like.
It is a gene encoding Antigen.
本発明で用いるヒアルロン酸分解関連遺伝子は、ＨＹＡL１、ＨＹＡＬ２である。ＨＹＡL１、ＨＹＡＬ２それぞれの発現量を測定し、これらの内、少なくとも一方の遺伝子の発現量がＣｙｄ／Ｂｙｄ≧Ｔａｄ／Ｂａｄ＞Ｃａｄ／Ｂａｄとなっていればよい。具体的には、例えばヒアルロン酸分解関連遺伝子中、指標をＨＹＡL１とした際に、Ｃｙｄ／Ｂｙｄ≧Ｔａｄ／Ｂａｄ＞Ｃａｄ／Ｂａｄとなっていれば良いという意味である。この関係が、ＨＹＡＬ２を指標とした場合にも、同様の関係であれば更に良い。
つまり、本関係を確認する場合には、遺伝子の種類は固定した上で判断する。
尚、ＨＹＡL１、ＨＹＡＬ２それぞれの発現量の内、少なくとも一方の遺伝子の発現量が前記関係を満たしていれば良く、ＨＹＡL１、ＨＹＡＬ２のいずれか一方の指標において、遺伝子の発現量がＣｙｄ／Ｂｙｄ≧Ｔａｄ／Ｂａｄ＞Ｃａｄ／Ｂａｄなっていないものがあっても差し支えない。
The hyaluronic acid degradation-related genes used in the present invention are HYAL1 and HYAL2. The expression level of each of HYAL1 and HYAL2 is measured, and the expression level of at least one of these genes may be Cyd / Byd ≧ Tad / Bad> Cad / Bad. Specifically, for example, when the index is set to HYAL1 in a hyaluronic acid degradation-related gene, it means that Cyd / Byd ≧ Tad / Bad> Cad / Bad. This relationship is even better if HYAL2 is used as an index as long as the relationship is similar.
In other words, when confirming this relationship, the type of gene is fixed and determined.
Of the expression levels of HYAL1 and HYAL2, it is only necessary that the expression level of at least one of the genes satisfies the above relationship. In either index of HYAL1 or HYAL2, the expression level of the gene is Cyd / Byd ≧ Tad. / Bad> Cad / Bad may not be present.
ＨＹＡＬはヒアルロン酸分解酵素（Ｈｙａｌｕｒｏｎｏｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ）をコードする遺伝子で、ＨＹＡＬファミリーにはＨＹＡＬ１、ＨＹＡＬ２、ＨＹＡＬ３、ＨＹＡＬ４の４つの遺伝子が知られている（http://omim.org/entry/607071）が、現在のところ、ヒト体細胞で発現し、ＨＹＡＬとして主に機能しているのはＨＹＡＬ１およびＨＹＡＬ２の２種類と考えられており（井上ら. 生化学 77: 1152-1164, 2005.）、ＨＹＡＬ２が細胞膜上で高分子ヒアルロン酸を約２０ｋＤａの分子量にまで限定分解した後、ＨＹＡＬ１がリソソームにおいてＨＡを４糖にまで分解する。ＨＹＡＬ２が細胞膜上で高分子ヒアルロン酸を分解する際には、ヒアルロン酸、ＣＤ４４と複合体（ＨＡ−ＣＤ４４−ＨＹＡＬ２複合体）を形成して反応が進行する。ＨＡ−ＣＤ４４−ＨＹＡＬ２複合体は脂質ラフトの１種でカベオレ（Ｃａｖｅｏｌａｅ）と呼ばれる形質膜が陥入した所に豊富に存在し、ヒアルロン酸はここで約５０個の二糖単位に相当する２０ｋＤａの大きさの限定生成物に分解される（Stern R. ほ乳類ヒアルロニダーゼ-Update-. グライコフォーラム/今日のヒアルロン酸科学-15, 2004.）。 HYAL is a gene encoding hyaluronan degrading enzyme (Hyaluronoglucosaminedase), and four genes of HYAL1, HYAL2, HYAL3, and HYAL4 are known in the HYAL family (http://omim.org/entry/607071), At present, two types of HYAL1 and HYAL2 are considered to be expressed in human somatic cells and mainly function as HYAL (Inoue et al. Biochemistry 77: 1152-1164, 2005.) After limited degradation of macromolecular hyaluronic acid to a molecular weight of about 20 kDa on the cell membrane, HYAL1 degrades HA to tetrasaccharides in lysosomes. When HYAL2 degrades polymeric hyaluronic acid on the cell membrane, the reaction proceeds by forming a complex with hyaluronic acid and CD44 (HA-CD44-HYAL2 complex). The HA-CD44-HYAL2 complex is a kind of lipid raft and is abundant in the invaded place of the plasma membrane called Caveolae, where hyaluronic acid is 20 kDa corresponding to about 50 disaccharide units. It breaks down into limited size products (Stern R. Mammalian hyaluronidase-Update-. Glyco Forum / Today's hyaluronic acid science-15, 2004.).
本願発明の皮膚バリア機能改善剤は、前記スクリーニング方法により選択される。 The skin barrier function improving agent of the present invention is selected by the screening method.
本発明におけるヒアルロン酸合成関連遺伝子、レセプター関連遺伝子、分解関連遺伝子（以下、総称して代謝関連遺伝子と言う場合がある。）の発現量は、回収した細胞からまずＴｏｔａｌ
ＲＮＡを抽出し、このＴｏｔａｌ ＲＮＡ中におけるヒアルロン酸代謝関連遺伝子（ｍＲＮＡ）の発現量を測定する。
The expression levels of hyaluronic acid synthesis-related genes, receptor-related genes, and degradation-related genes (hereinafter sometimes collectively referred to as metabolism-related genes) in the present invention are first determined from the collected cells.
RNA is extracted, and the expression level of the hyaluronic acid metabolism-related gene (mRNA) in the total RNA is measured.
Ｔｏｔａｌ ＲＮＡの抽出方法は特に限定されず、たとえば、チオシアン酸グアニジン・塩化セシウム超遠心法、チオシアン酸グアニジン・ホットフェノール法、グアニジン塩酸法、酸性チオシアン酸グアニジン・フェノール・クロロホルム法（Chomczynski P et
al. Anal. Biochem, 162, 156-159, 1987.）等を採用することができる。例えば、市販品であるＲＮｅａｓｙ
ＭＩＮＩ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）などが使用でき、抽出された全RNAは、必要に応じてさらにｍＲＮＡのみに精製して用いてもよい。
The extraction method of the total RNA is not particularly limited. For example, guanidine thiocyanate / cesium chloride ultracentrifugation method, guanidine thiocyanate / hot phenol method, guanidine hydrochloride method, guanidine thiocyanate / phenol / chloroform method (Chomczynski Pet et al.).
al. Anal. Biochem, 162, 156-159, 1987) and the like can be employed. For example, RNeasy, which is a commercial product
MINI Kit (QIAGEN) or the like can be used, and the extracted total RNA may be further purified to mRNA alone if necessary.
各遺伝子の発現量は、遺伝子チップ、アレイ等の固相化試料を用いた核酸ハイブリダイゼーション法、RT-PCR法、リアルタイムＰＣＲ法、サブトラクション法、ディファレンシャル・ディスプレイ法、ディファレンシャル・ハイブリダイゼーション法、ならびにクロスハイブリダイゼーション法など公知の方法を用いて測定することができる。 The expression level of each gene is determined by nucleic acid hybridization method, RT-PCR method, real-time PCR method, subtraction method, differential display method, differential hybridization method using cross-linked samples such as gene chips and arrays, and cross-linking. It can be measured using a known method such as a hybridization method.
本発明に用いる高齢のヒトをドナーとする培養表皮ケラチノサイトは、健常な５０歳以上のヒトをドナーとするものが望ましく、継代数が５以下のものが望ましい。３０〜４０歳代のヒトをドナーとする培養表皮ケラチノサイトではヒアルロン酸代謝関連遺伝子の紫外線による明確な低下が認められず、また、継代数が６以上では被験物質による紫外線によるヒアルロン酸代謝関連遺伝子の発現量低下あるいは上昇度低下の抑制が明確でなくなる。例えば、市販品であるＥｐｉｄｅｒｃｅｌｌ
Ｈｕｍａｎ Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ（クラボウ社）やＨＥＫ（東洋紡社）を使用することができ、培養に用いる好適な培地も各社がそれぞれの細胞種に対して推奨している培地を使用して差し支えない。
The cultured epidermal keratinocytes used in the present invention with elderly human donors are preferably those from healthy humans 50 years of age or older, and those with a passage number of 5 or less are preferred. In cultured epidermal keratinocytes from humans in their 30s to 40s, there is no clear decrease in hyaluronic acid metabolism-related genes due to ultraviolet light. The suppression of the decrease in the expression level or the decrease in the degree of increase becomes unclear. For example, Epidercell, a commercial product
Human Epidermal Keratinocyte (Kurabo) or HEK (Toyobo) can be used, and a suitable medium used for the culture may be a medium recommended by each company for each cell type.
本発明に用いる若齢のヒトをドナーとする培養表皮ケラチノサイトは、健常な１０〜２０歳代のヒトをドナーとするものが望ましく、継代数が５以下のものが望ましい。９歳以下のヒトをドナーとする培養表皮ケラチノサイトではヒアルロン酸代謝関連遺伝子の紫外線による変動に被験者間のバラツキがあり、また、継代数が６以上では被験物質による紫外線によるヒアルロン酸代謝関連遺伝子の発現量低下あるいは上昇度低下の抑制が明確でなくなる。例えば、市販品であるＥｐｉｄｅｒｃｅｌｌ
Ｈｕｍａｎ Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ（クラボウ社）やＨＥＫ（東洋紡社）を使用することができ、培養に用いる好適な培地も各社がそれぞれの細胞種に対して推奨している培地を使用して差し支えない。
The cultured epidermal keratinocytes using young humans as donors for use in the present invention are preferably those from healthy humans in their 10s to 20s, and those having a passage number of 5 or less. In cultured epidermal keratinocytes from humans under 9 years of age, variation in hyaluronic acid metabolism-related genes due to ultraviolet light varies among subjects, and when the number of passages is 6 or higher, expression of hyaluronic acid metabolism-related genes due to ultraviolet light by test substances The suppression of the decrease in the amount or the decrease in the degree of increase is not clear. For example, Epidercell, a commercial product
Human Epidermal Keratinocyte (Kurabo) or HEK (Toyobo) can be used, and a suitable medium used for the culture may be a medium recommended by each company for each cell type.
本発明に用いる紫外線を照射した培養表皮ケラチノサイトは、上記の培養表皮ケラチノサイトに紫外線を照射することにより得られる。この際に使用する光源としては、例えば、ＴＯＲＥＸ
ＦＬ２０Ｓ・Ｅ−３０／ＤＭＲ（ＴＯＳＨＩＢＡ社）が好適に使用でき、紫外線照射量は１５〜２５ｍＪ／ｃｍ２が望ましい。１５ｍＪ／ｃｍ２より少ないと紫外線による影響が明確に観察できず、２５ｍＪ／ｃｍ２より多いと培養表皮ケラチノサイトの生存率が著しく低下し、遺伝子発現量の変化が正しく観察できない。
The cultured epidermal keratinocytes irradiated with ultraviolet rays used in the present invention can be obtained by irradiating the cultured epidermal keratinocytes with ultraviolet rays. As a light source used at this time, for example, TOREX
FL20S · E-30 / DMR (TOSHIBA) can be preferably used, and the ultraviolet irradiation amount is preferably 15 to 25 mJ / cm 2 . 15 mJ / cm 2 less and can not be clearly observed effects of ultraviolet than, 25 mJ / cm greater than 2 and survival of cultured epidermal keratinocytes was significantly reduced, the change in gene expression can not be observed correctly.
本願発明のスクリーニング方法より選別された皮膚バリア機能改善効果が期待できる成分は、サルビア抽出物及びザクロ抽出物である。 The components that can be expected to improve the skin barrier function selected by the screening method of the present invention are salvia extract and pomegranate extract.
前記サルビアは、シソ科サルビア属のサルビア（Ｓａｌｖｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）で、部位は特に限定されないが、例えば、葉が好適に使用できる。 The salvia is Salvia officinalis belonging to the family Lamiaceae, and the site is not particularly limited. For example, leaves can be used preferably.
前記ザクロは、ミソハギ科ザクロ属のザクロ（Ｐｕｎｉｃａ ｇｒａｎａｔｕｍ）で、部位は特に限定されないが、例えば、果皮および／または花が好適に使用できる。 The pomegranate is a pomegranate belonging to the genus Pomegranate (Punica granatum), and the site is not particularly limited. For example, pericarps and / or flowers can be preferably used.
これらの植物抽出物の調製は特に限定されないが、例えば種々の適当な有機溶媒を用いて、低温下から加温下で抽出される。抽出溶媒としては、例えば、水；メチルアルコール、エチルアルコール等の低級１価アルコール；グリセリン、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール等の液状多価アルコール；アセトン、メチルエチルケトン等のケトン；酢酸エチルなどのアルキルエステル；ベンゼン、ヘキサン等の炭化水素；ジエチルエーテル等のエーテル類；ジクロルメタン、クロロホルム等のハロゲン化アルカン等の１種または２種以上を用いることが出来る。就中、水、エチルアルコール、１，３−ブチレングリコールの１種または２種以上の混合溶媒が特に好適である。 The preparation of these plant extracts is not particularly limited. For example, the plant extracts are extracted from a low temperature to a warm temperature using various appropriate organic solvents. Examples of the extraction solvent include water; lower monohydric alcohols such as methyl alcohol and ethyl alcohol; liquid polyhydric alcohols such as glycerin, propylene glycol, and 1,3-butylene glycol; ketones such as acetone and methyl ethyl ketone; and ethyl acetate. One or more of alkyl esters; hydrocarbons such as benzene and hexane; ethers such as diethyl ether; and halogenated alkanes such as dichloromethane and chloroform can be used. Among them, water, ethyl alcohol, and a mixed solvent of one or more of 1,3-butylene glycol are particularly suitable.
本発明に用いることのできる植物抽出物の抽出方法は特に限定されないが、例えば乾燥したものであれば重量比で１〜１０００倍量、特に１０〜１００倍量の溶媒を用い、常温抽出の場合には、０℃以上、特に２０℃〜４０℃で１時間以上、特に３〜７日間行うのが好ましい。また、６０〜１００℃で１時間、加熱抽出しても良い。 The extraction method of the plant extract that can be used in the present invention is not particularly limited. For example, if it is dried, the solvent is used in an amount of 1 to 1000 times, particularly 10 to 100 times in weight ratio, and in the case of room temperature extraction. Is preferably performed at 0 ° C. or higher, particularly 20 ° C. to 40 ° C. for 1 hour or longer, particularly 3 to 7 days. Moreover, you may heat-extract at 60-100 degreeC for 1 hour.
以上のような条件で得られる上記各抽出物は、抽出された溶液のまま用いても良いが、さらに必要により、濾過等の処理をして、濃縮、粉末化したものを適宜使い分けて用いることが出来る。 Each of the above-mentioned extracts obtained under the above conditions may be used as an extracted solution, but if necessary, use a product that has been subjected to a treatment such as filtration, concentrated and powdered as appropriate. I can do it.
本発明の皮膚外用剤における植物抽出物の配合量は、蒸発乾燥分に換算して０．００００１〜２０．０重量％が好ましく、特に０．０１〜１０．０重量％の範囲が最適である。 The blending amount of the plant extract in the external preparation for skin of the present invention is preferably 0.00001 to 20.0% by weight, particularly in the range of 0.01 to 10.0% by weight in terms of evaporated and dried content. .
また、本発明のスクリーニング方法で選別される被験物質は、植物抽出物に限定されない。本願発明のスクリーニング方法で選別されたものであればよく、植物抽出物以外に、菌類、動物等の抽出物は勿論、化合物であっても差し支えない。 Moreover, the test substance selected by the screening method of the present invention is not limited to a plant extract. As long as it is selected by the screening method of the present invention, it may be a compound as well as an extract of fungi, animals, etc. in addition to a plant extract.
本発明の皮膚外用剤は皮膚に適用される組成物を意味する。例えば、化粧水、乳液、クリーム、オイル、化粧下地、ファンデーション等の化粧品や医薬部外品、分散液、軟膏、クリーム、外用液等の外用医薬品等の皮膚外用剤として適用可能な組成物のことを言う。液体、クリーム状、粉末状、固体状等の皮膚外用剤の形態も問わない。 The topical skin preparation of the present invention means a composition applied to the skin. For example, it is a composition applicable as a skin external preparation such as cosmetics such as lotion, milky lotion, cream, oil, makeup base, foundation, quasi-drugs, external medicines such as dispersions, ointments, creams, and external liquids. Say. The form of the external preparation for skin such as liquid, cream, powder, solid and the like is not limited.
皮膚外用剤は、公知である従来の皮膚外用剤と同様な基剤成分が用いられ、常法により製造される。本発明の皮膚外用剤は、本発明の効果を阻害しない範囲内で、皮膚外用剤に通常用いられている他の成分を配合することができる。例えば、油脂、ロウ類、炭化水素油、エステル油、高級アルコール、シリコーン油、紫外線吸収剤、紫外線散乱剤、保湿剤、界面活性剤、水溶性高分子、増粘剤、粉体、皮膚保護剤、美白剤、シワ改善剤、老化防止剤、植物抽出物、防腐剤、消炎剤、pH調整剤、金属イオン封鎖剤、酸化防止剤などが挙げられる。 The external preparation for skin uses the same base components as the known external preparation for skin, and is produced by a conventional method. The skin external preparation of this invention can mix | blend the other component normally used for the skin external preparation within the range which does not inhibit the effect of this invention. For example, fats and oils, waxes, hydrocarbon oils, ester oils, higher alcohols, silicone oils, UV absorbers, UV scattering agents, moisturizers, surfactants, water-soluble polymers, thickeners, powders, skin protection agents , Whitening agents, wrinkle improving agents, anti-aging agents, plant extracts, antiseptics, anti-inflammatory agents, pH adjusters, sequestering agents, antioxidants, and the like.
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples. However, the present invention is not limited to these examples.
＜実験例１＞角層状態および角層ヒアルロン酸状態の評価
試験に同意を得た２０歳代の男性５名および５０歳代の男性５名にて下記項目について評価した。露光部皮膚としては顔面、非露光部皮膚としては上腕内側部を測定部位とし、測定部位を洗顔料で洗浄後、２０±１℃、湿度５０±２％の環境下で１０分間順化した後測定を行った。
<Experimental Example 1> The following items were evaluated by 5 males in their 20s and 5 males in their 50s who had consented to the evaluation test of the horny layer state and the horny layer hyaluronic acid state. The exposed part skin is the face, and the non-exposed part skin is the inner part of the upper arm as the measurement site, and the measurement site is washed with face wash and then acclimated for 10 minutes in an environment of 20 ± 1 ° C and humidity of 50 ± 2% Measurements were made.
１．角層状態の評価
１−１．角層水分量の測定
露光部皮膚および非露光部皮膚の角層水分量を角層水分量測定装置（Corneometer CM825,
Courage+Khazaka）にて測定した。各部位５点を測定し、平均値を各被験者の当該部位における角層水分量値とした。
1. Evaluation of stratum corneum 1-1. Measurement of stratum corneum moisture The stratum corneum moisture measurement device (Corneometer CM825,
Courage + Khazaka). Five points were measured at each site, and the average value was defined as the stratum corneum moisture content value at that site for each subject.
１−２．経表皮水分蒸散量の測定
露光部皮膚および非露光部皮膚の経表皮水分蒸散量を経表皮水分蒸散量測定装置（Tewameter TM210, Courage+Khazaka）にて測定した。各部位１点を測定し、１分間を超えて測定値が安定した時間帯の測定値を平均した値を各被験者の当該部位における経表皮水分蒸散量値とした。
1-2. Measurement of transepidermal water transpiration The transepidermal water transpiration of exposed and unexposed skin was measured with a transepidermal water transpiration measuring device (Tewameter TM210, Courage + Khazaka). One point was measured for each part, and the value obtained by averaging the measured values in the time period in which the measured values were stable for more than 1 minute was taken as the transepidermal water transpiration value for each part of each subject.
２．角層ヒアルロン酸状態の評価
２−１．角層ヒアルロン酸の採取
露光部皮膚および非露光部皮膚の３．６×４ｃｍの範囲の角層を５回のテープストリッピングにより採取し、テープを１５ｍＬチューブに入れて０．５Ｎ
ＮａＯＨ水溶液 ３ｍＬを添加し、一晩室温下で静置した。その後１Ｎ ＨＣｌ水溶液１．５ｍＬを添加して中和し、緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，５．０ｍＭ ＣａＣｌ２，ｐＨ７．８）４．５ｍＬを加えて１０分間煮沸した。次いでプロテアーゼ
６ｍｇを添加して５０℃にて２４時間インキュベートし、その後再度プロテアーゼ ６ｍｇを添加した。さらに５０℃にて２４時間インキュベートした後、トリクロロ酢酸１ｍＬを加え、４℃で１時間静置後、遠心分離（３５００ｒｐｍ，１５分）してタンパクを沈殿させた。次に上清を採取して蒸留水に対して透析し、凍結乾燥した。得られた乾燥物に蒸留水
１ｍＬを添加して溶解し、５００μＬずつ分注して再度凍結乾燥した。
2. 2. Evaluation of stratum corneum hyaluronic acid state 2-1. Collection of stratum corneum Hyaluronic acid The stratum corneum in the area of 3.6 × 4 cm of exposed and non-exposed skin was sampled by tape stripping 5 times, and the tape was placed in a 15 mL tube to give 0.5N.
3 mL of NaOH aqueous solution was added, and it left still at room temperature overnight. Thereafter, 1.5 mL of 1N HCl aqueous solution was added for neutralization, and 4.5 mL of a buffer solution (100 mM Tris-HCl, 5.0 mM CaCl 2 , pH 7.8) was added and boiled for 10 minutes. Next, 6 mg of protease was added and incubated at 50 ° C. for 24 hours, after which 6 mg of protease was added again. After further incubation at 50 ° C. for 24 hours, 1 mL of trichloroacetic acid was added, the mixture was allowed to stand at 4 ° C. for 1 hour, and centrifuged (3500 rpm, 15 minutes) to precipitate the protein. The supernatant was then collected, dialyzed against distilled water and lyophilized. Distilled water (1 mL) was added to the obtained dried product to dissolve it, and 500 μL was dispensed and freeze-dried again.
２−２．角層ヒアルロン酸量の測定
２−１で調製された凍結乾燥物中に含まれるヒアルロン酸量を市販のＥＬＩＳＡ
Ｋｉｔ（QnE
Hyaluronic Acid(HA)ELISA Assay, Biotech Trading Partners)を使用し、Ｋｉｔの指示通りに測定した。
2-2. Measurement of stratum corneum hyaluronic acid amount The amount of hyaluronic acid contained in the lyophilizate prepared in 2-1 was measured using a commercially available ELISA.
Kit (QnE
Hyaluronic Acid (HA) ELISA Assay, Biotech Trading Partners) and measured as per Kit instructions.
２−３．角層ヒアルロン酸分子量の測定
２−１で調製された凍結乾燥物に蒸留水 １０μＬとＬｏａｄｉｎｇ
Ｂｕｆｆｅｒ（２Ｍスクロース，１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ｂｏｒａｔｅ，１ｍＭ ＥＤＴＡ， ｐＨ８．３） １０μＬを添加した。これを試料として４％ＴＢＥポリアクリルアミドゲルを作製し、ＴＢＥバッファー中４００Ｖで１２分間電気泳動を行い、ゲルを０．００５％
Ｓｔａｉｎｓ−Ａｌｌ ５０％エタノール溶液（Sigma社）を用いて一晩染色後、１０％エタノール水溶液中で脱色し、電気泳動像をスキャナーで取り込んだ。各試料のゲル上での移動距離を基に分子量を５段階に分類し（分子量の小さい方から１，２，３，４，５）、分子量スコアとした。具体的には、ヒアルロン酸の電気泳動は、タンパク質とは異なりテーリングをするので、陽極方向のテーリング最先端部（到達点側）の位置をスコアリングしている。つまり、本分子量スコアが上がるということは、低分子化したヒアルロン酸の蓄積がなくなり、正常分子量のヒアルロン酸が合成されていることが示される。
2-3. Measurement of stratum corneum hyaluronic acid molecular weight 10 μL of distilled water and loading with the lyophilized product prepared in 2-1.
10 μL of Buffer (2M sucrose, 100 mM Tris-borate, 1 mM EDTA, pH 8.3) was added. Using this as a sample, a 4% TBE polyacrylamide gel was prepared, and electrophoresed at 400 V in TBE buffer for 12 minutes.
Stains-All 50% ethanol solution (Sigma) was stained overnight, then decolorized in 10% ethanol aqueous solution, and the electrophoretic image was captured with a scanner. The molecular weight was classified into five levels based on the distance of movement of each sample on the gel (1, 2, 3, 4, 5 from the smallest molecular weight), and the molecular weight score was obtained. Specifically, since electrophoresis of hyaluronic acid tails unlike protein, the position of the tailing most distal portion (arrival point side) in the anode direction is scored. In other words, an increase in the molecular weight score indicates that the accumulation of hyaluronic acid having a reduced molecular weight is eliminated and normal molecular weight hyaluronic acid is synthesized.
図１〜４に示した実験の結果より、加齢したヒトの露光部皮膚の角層より抽出されたヒアルロン酸は非露光部皮膚のものよりも分子量が小さく、また、若齢ヒトの同部位ものと比較しても分子量が小さかった。一方、ヒアルロン酸量も若齢ヒトの同部位との比較では少ないが、年代に関わらず露光部皮膚のヒアルロン酸量の方が多いということ、この際加齢したヒトの露光部皮膚では非露光部皮膚と比較して角層水分量が低く、経表皮水分蒸散量が高いという結果が得られた。すなわち、露光部皮膚と非露光部皮膚では露光部皮膚の角層ヒアルロン酸量が多いにも関わらず、角層水分量が低く、経表皮水分蒸散量が高い。この結果から、角層水分量と皮膚バリア機能の向上には、ヒアルロン酸の量よりもむしろ分子量が重要であることが示された。また、露光部皮膚と非露光部皮膚の経表皮水分蒸散量は年代に関わらず露光部皮膚の経表皮水分蒸散量が高いが、角層水分量については若齢のヒトでは部位による差が小さいのに対して、加齢したヒトの露光部皮膚では非露光部皮膚に比較して著しく小さく、加齢したヒト皮膚における低分子ヒアルロン酸の蓄積が継続的な皮膚バリア機能の低下を招き、角層水分量を低下させている可能性が示唆された。 1-4, the hyaluronic acid extracted from the horny layer of the exposed human exposed skin has a smaller molecular weight than that of the non-exposed exposed skin, and the same part of the young human The molecular weight was small even when compared with the product. On the other hand, the amount of hyaluronic acid is small compared with the same part of young humans, but the amount of hyaluronic acid in the exposed skin is higher regardless of age, and in this case, the exposed skin of an aged human is not exposed. The results showed that the stratum corneum moisture content was low and the transepidermal moisture transpiration was high compared to the part skin. That is, in the exposed part skin and the non-exposed part skin, although the amount of horny layer hyaluronic acid in the exposed part skin is large, the amount of horny layer moisture is low and the amount of transepidermal water transpiration is high. From these results, it was shown that molecular weight rather than hyaluronic acid was important for improving stratum corneum water content and skin barrier function. In addition, the transepidermal water transpiration of exposed and non-exposed skin is high regardless of age, but the amount of stratum corneum is small in young humans. In contrast, aged human exposed skin is significantly smaller than non-exposed skin, and the accumulation of low-molecular hyaluronic acid in aged human skin leads to a continuous decline in skin barrier function. It was suggested that the water content in the layer was reduced.
＜実験例２＞培養表皮ケラチノサイトのヒアルロン酸代謝関連遺伝子発現量に対する紫外線の影響
１９歳および５７歳健常ヒト由来ケラチノサイト（ＨＥＫ， 東洋紡社）をそれぞれ７．５×１０４Ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるようにＫｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍ Ｋｉｔ（Cell Applications）に分散し、２４ウェル細胞培養プレートの各ウェルに５００μＬずつ播種した。３７℃、５％ＣＯ２下で２４時間インキュベートした後、Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍ Ｋｉｔを除いてＰＢＳに置換し、ＵＶＢ ２０ｍＪ／ｃｍ２を照射した。その後ＰＢＳを取り除いて新しいＫｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍ Ｋｉｔに置換し、さらに３７℃、５％ＣＯ２下で６時間インキュベートした。次に、市販のＴｏｔａｌ ＲＮＡ抽出Ｋｉｔ（RNeasy Mini Kit,QIAGEN)を使用し、Ｋｉｔの指示通りにＴｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。得られたＴｏｔａｌ ＲＮＡは、市販の逆転写Ｋｉｔ（PrimeScript RT
Reagent Kit (Perfect Real Time), TaKaRa)を用い、GeneAmp PCR System
2700 (Applied Biosystems)にてＫｉｔの指示通りに逆転写した。ヒアルロン酸代謝関連遺伝子の発現量は、市販のＲｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ試薬（Power SYBR Green PCR Master Mix, Applied Biosystems)を用い、7500 Real Time PCR System (Applied Biosystems)にてＫｉｔの指示通りに測定した。この際に使用したプライマー配列は下記の通りである。
<Experimental example 2> Effect of ultraviolet rays on the expression level of hyaluronic acid metabolism-related genes in cultured epidermal keratinocytes 19-year-old and 57-year-old healthy human keratinocytes (HEK, Toyobo Co., Ltd.) were adjusted to 7.5 × 10 4 Cells / mL, respectively. Dispersed in Keratinocyte Growth Medium Kit (Cell Applications), 500 μL was seeded in each well of a 24-well cell culture plate. After incubating at 37 ° C. under 5% CO 2 for 24 hours, the keratinocyte growth medium kit was removed and replaced with PBS, and UVB 20 mJ / cm 2 was irradiated. Then, PBS was removed and replaced with fresh Keratinocyte Growth Medium Kit, and further incubated at 37 ° C. under 5% CO 2 for 6 hours. Next, using a commercially available total RNA extraction kit (RNeasy Mini Kit, QIAGEN), total RNA was extracted as instructed by the kit. The obtained total RNA was a commercially available reverse transcription Kit (PrimeScript RT
GeneAgent PCR System using Reagent Kit (Perfect Real Time), TaKaRa)
Reverse transcription was performed with 2700 (Applied Biosystems) as directed by Kit. The expression level of the gene related to hyaluronic acid metabolism was measured using a commercially available Real-time PCR reagent (Power SYBR Green PCR Master Mix, Applied Biosystems) according to the instructions of Kit by 7500 Real Time PCR System (Applied Biosystems). The primer sequences used at this time are as follows.
（１）ＧＡＰＤＨ
ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ： ５‘−ＣＣＡＣＡＴＣＧＣＴＣＡＧＡＣＡＣＣＡＴ−３’
ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ： ５‘−ＴＧＡＣＣＡＧＧＣＧＣＣＣＡＡＴＡ−３’
（２）ＨＡＳ１
ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ：５‘−ＡＴＡＴＡＧＧＡＡＴＡＡＣＣＴＣＴＴＧＣＡＧＣＡＧＴＴ−３’
ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ：５‘−ＴＧＧＡＧＧＴＧＴＡＣＴＴＧＧＴＡＧＣＡＴＡＡＣＣ−３’
（３）ＨＡＳ２
ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ：５‘−ＴＧＧＡＴＧＡＣＣＴＡＣＧＡＡＧＣＧＡＴＡＡ−３’
ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ：５‘−ＧＣＴＧＧＡＴＴＡＣＴＧＴＧＧＣＡＡＴＧＡＧ−３’
（４）ＨＡＳ３
ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ： ５‘−ＣＣＴＧＣＡＣＣＡＴＣＧＡＧＡＴＧＣＴＴ−３’
ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ： ５‘−ＣＧＴＡＣＴＴＧＴＴＧＡＧＧＡＴＣＴＧＧＡＣＡＴ−３’
（５）ＣＤ４４
ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ： ５‘−ＣＣＴＧＧＣＧＣＡＧＡＴＣＧＡＴＴＴ−３’
ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ： ５‘−ＴＧＣＴＧＴＡＧＣＧＡＣＣＡＴＴＴＴＴＣＴＣ−３’
（６）ＨＹＡＬ１
ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ： ５‘−ＴＣＴＧＧＧＴＧＡＧＣＴＧＧＧＡＡＡＡＴＡ−３’
ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ： ５‘−ＧＣＣＣＣＡＧＴＧＴＡＧＴＧＴＣＣＡＴＡＴＡＣＴＣ−３’
（７）ＨＹＡＬ２
ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ： ５‘−ＧＣＡＣＴＣＣＣＡＧＴＣＴＡＣＧＴＣＴＴＣＡ−３’
ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ： ５‘−ＣＧＣＡＣＴＣＴＣＧＣＣＡＡＴＧＧＴＡ−３’
(1) GAPDH
forward primer: 5′-CCACATCGCTCAGACACCAT-3 ′
reverse primer: 5'-TGACCAGGCGCCACA-3 '
(2) HAS1
forward primer: 5'-ATATAGGAATAACCCTCTGCAGCAGTT-3 '
reverse primer: 5′-TGGAGGGTTACACTGGTAGCATAACC-3 ′
(3) HAS2
forward primer: 5'-TGGATGACCCTACGAAGCGATAA-3 '
reverse primer: 5′-GCTGGATTACTGTGGCAATGAG-3 ′
(4) HAS3
forward primer: 5'-CCTGCACATCATGAGAGCTT-3 '
reverse primer: 5'-CGTACTTGTTGAGGATCTGACAT-3 '
(5) CD44
forward primer: 5'-CCTGGGCGCAGATCGATTTT-3 '
reverse primer: 5′-TGCTGTAGGCGACATTTTTCTC-3 ′
(6) HYAL1
forward primer: 5'-TCTGGGTGAGCTGGGAAAATA-3 '
reverse primer: 5′-GCCCCAGGTGTAGGTCCCATACTACT-3 ′
(7) HYAL2
forward primer: 5'-GCACTCCCCAGTCTACGTTCTTCA-3 '
reverse primer: 5'-CGCACTCTCGCCAATGGGTA-3 '
図５〜１０に示すように、紫外線を照射した高齢ヒトをドナーとする培養表皮ケラチノサイトにおいて、ヒアルロン酸代謝関連遺伝子のうち、ヒアルロン酸合成関連遺伝子であるＨＡＳ１、ＨＡＳ２、ＨＡＳ３、ヒアルロン酸レセプター関連遺伝子であるＣＤ４４、ヒアルロン酸分解関連遺伝子であるＨＹＡＬ１、ＨＹＡＬ２のそれぞれの発現量が低下あるいは若齢のヒトをドナーとする培養表皮ケラチノサイトと比較して発現量の上昇度が低下していることが示された。この結果から、加齢および紫外線による表皮ケラチノサイトにおけるヒアルロン酸合成関連遺伝子のみならず、ヒアルロン酸レセプター関連遺伝子およびヒアルロン酸分解関連遺伝子を含むヒアルロン酸代謝関連遺伝子の発現量低下あるいは上昇度低下が低分子ヒアルロン酸の蓄積を招いている可能性が示唆された。 As shown in FIGS. 5 to 10, in cultured epidermal keratinocytes whose donors are elderly humans irradiated with ultraviolet rays, among hyaluronic acid metabolism-related genes, hyaluronic acid synthesis-related genes HAS1, HAS2, HAS3, hyaluronic acid receptor-related genes It is shown that the expression level of CD44, a hyaluronic acid degradation-related gene, HYAL1, and HYAL2 are decreased, or the level of expression is decreased compared to cultured epidermal keratinocytes using young human donors. It was done. From this result, the expression level or decrease in the level of hyaluronic acid metabolism-related genes including hyaluronic acid receptor-related genes and hyaluronic acid degradation-related genes in epidermal keratinocytes due to aging and ultraviolet rays is low. This suggests the possibility of accumulating hyaluronic acid.
＜実験例３＞加齢および紫外線によるヒアルロン酸代謝関連遺伝子の発現量低下あるいは上昇度低下を抑制する物質のスクリーニング
１．被験物質の調製
オトギリソウ地上部、サルビア葉、ザクロ果皮、ザクロ花、アルテア葉、クレマティス葉、トウキンセンカ花を用いて、次の製造方法に従い、各植物抽出物（粉末）を得た。
<Experimental example 3> Screening of substances that suppress the decrease in the expression level or increase in the level of hyaluronic acid metabolism-related gene due to aging and ultraviolet rays. Preparation of Test Substance Each plant extract (powder) was obtained according to the following production method using above-ground hypericum, salvia leaf, pomegranate peel, pomegranate flower, altea leaf, clematis leaf, and red flowers.
乾燥したオトギリソウ地上部、サルビア葉、ザクロ果皮、ザクロ花、アルテア葉、クレマティス葉トウキンセンカ花に、１０倍の重量の５０％エタノール水溶液を加えて室温で1週間静置し、各植物の５０％エタノール抽出液を得た。次に、得られた抽出液をフィルター(ADVANTEC
Cellulose acetate, 0.45μm, 47mm)を用いて吸引ろ過後、エバポレーターにてエタノールを留去し、凍結乾燥することによって各植物抽出物（粉末）を得た。
50% ethanol solution of 10% weight of 50% ethanol solution was added to the above-ground dried hypericum above ground, salvia leaf, pomegranate peel, pomegranate flower, altea leaf, clematis leaf eucalyptus flower, and allowed to stand at room temperature for 1 week, 50% of each plant An ethanol extract was obtained. Next, the obtained extract is filtered (ADVANTEC
After suction filtration using Cellulose acetate (0.45 μm, 47 mm), ethanol was distilled off with an evaporator and freeze-dried to obtain each plant extract (powder).
２．培養表皮ケラチノサイトに対する被験物質の適用
５７歳健常ヒト由来ケラチノサイト（ＨＥＫ， 東洋紡社）を７．５×１０４Ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるようにＫｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍ Ｋｉｔに分散し、２４ウェル細胞培養プレートの各ウェルに５００μＬずつ播種した。３７℃、５％ＣＯ２下で２４時間インキュベートした後、被験物質を添加し、さらに３７℃、５％ＣＯ２下で２４時間インキュベートした。その後Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍ Ｋｉｔを除いてＰＢＳに置換し、ＵＶＢ ２０ｍＪ／ｃｍ２を照射した後、ＰＢＳを取り除いて新しいＫｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍ Ｋｉｔに置換し、再度被験物質を添加して３７℃、５％ＣＯ２下で６時間インキュベートした。その後Ｔｏｔａｌ
ＲＮＡを調製して＜実験例２＞と同様の方法でヒアルロン酸代謝関連遺伝子の発現量を測定した。
尚、本実験では、紫外線照射の前後に被験物質の添加を行ったが、紫外線照射前のみ被験物質の添加を行っても良いし、紫外線照射後にのみ被験物質を添加して実験を行っても、遺伝子の発現量と皮膚バリア機能改善作用との関係は同様の傾向を示すので、被験物質に合わせて、適宜調整することが可能である。
2. Application of test substance to cultured epidermal keratinocytes 57-year-old healthy human-derived keratinocytes (HEK, Toyobo Co., Ltd.) were dispersed in Keratinocyte Growth Medium Kit to 7.5 × 10 4 Cells / mL, and each well of a 24-well cell culture plate 500 μL each was seeded. After incubating at 37 ° C. under 5% CO 2 for 24 hours, a test substance was added, and further incubated at 37 ° C. under 5% CO 2 for 24 hours. Subsequently, the keratinocyte growth medium kit was removed and replaced with PBS, irradiated with UVB 20 mJ / cm 2 , the PBS was removed and replaced with a new keratinocyte growth medium kit, and the test substance was added again at 37 ° C., 5% CO 2. Incubated under 6 hours. Then Total
RNA was prepared and the expression level of the hyaluronic acid metabolism-related gene was measured in the same manner as in <Experimental example 2>.
In this experiment, the test substance was added before and after the ultraviolet irradiation, but the test substance may be added only before the ultraviolet irradiation, or the test substance may be added only after the ultraviolet irradiation. Since the relationship between the gene expression level and the skin barrier function improving action shows the same tendency, it can be appropriately adjusted according to the test substance.
表１に示したように、サルビア葉から得られた抽出物でヒアルロン酸合成関連遺伝子であるＨＡＳ１およびＨＡＳ３、ヒアルロン酸レセプター関連遺伝子であるＣＤ４４、ヒアルロン酸分解関連遺伝子であるＨＹＡＬ１およびＨＹＡＬ２、ザクロ果皮および花から得られた各抽出物でヒアルロン酸合成関連遺伝子であるＨＡＳ１およびＨＡＳ２およびＨＡＳ３、ヒアルロン酸レセプター関連遺伝子であるＣＤ４４、ヒアルロン酸分解関連遺伝子であるＨＹＡＬ１およびＨＹＡＬ２についてＣｙｓ／Ｂｙｓ≧Ｔａｓ／Ｂａｓ≧Ｃａｓ／ＢａｓかつＣｙｒ／Ｂｙｒ≧Ｔａｒ/Ｂａｒ≧Ｃａｒ／ＢａｒかつＣｙｄ／Ｂｙｄ≧Ｔａｄ／Ｂａｄ＞Ｃａｄ／Ｂａｄとなり、本発明の皮膚バリア機能改善剤の有効成分として選択された。さらに、サルビア葉から得られた抽出物ではヒアルロン酸分解関連遺伝子であるＨＹＡＬ２についてＣｙｄ／Ｂｙｄ≧Ｔａｄ／Ｂａｄ≧（Ｃｙｄ／Ｂｙｄ＋Ｃａｄ／Ｂａｄ）／２になっており、特に有効な有効成分として選択された。一方、オトギリソウ地上部、アルテア葉、クレマティス葉、トウキンセンカ花から得られた抽出物では、Ｃｙｓ／Ｂｙｓ≧Ｔａｓ／Ｂａｓ≧Ｃａｓ／ＢａｓかつＣｙｒ／Ｂｙｒ≧Ｔａｒ/Ｂａｒ≧Ｃａｒ／ＢａｒかつＣｙｄ／Ｂｙｄ≧Ｔａｄ／Ｂａｄ＞Ｃａｄ／Ｂａｄが満たされておらず、本発明の皮膚バリア機能改善剤の有効成分として選択されなかった。 As shown in Table 1, hyaluronic acid synthesis-related genes HAS1 and HAS3, hyaluronic acid receptor-related gene CD44, hyaluronic acid degradation-related genes HYAL1 and HYAL2, pomegranate skin Cys / Bys ≧ Tas / Bas for hyaluronic acid synthesis-related genes HAS1 and HAS2 and HAS3, hyaluronic acid receptor-related gene CD44, and hyaluronic acid degradation-related genes HYAL1 and HYAL2 in each extract obtained from flowers ≧ Cas / Bas and Cyr / Byr ≧ Tar / Bar ≧ Car / Bar and Cyd / Byd ≧ Tad / Bad> Cad / Bad were selected as the active ingredients of the skin barrier function improving agent of the present invention. Furthermore, in the extract obtained from the salvia leaf, Hydron2, which is a gene related to hyaluronic acid degradation, has Cyd / Byd ≧ Tad / Bad ≧ (Cyd / Byd + Cad / Bad) / 2 and is selected as a particularly effective active ingredient. It was. On the other hand, in the extract obtained from above-ground hypericum, Altea leaves, clematis leaves, and red flowers, Cys / Bys ≧ Tas / Bas ≧ Cas / Bas and Cyr / Byr ≧ Tar / Bar ≧ Car / Bar and Cyd / Byd ≧ Tad / Bad> Cad / Bad was not satisfied, and it was not selected as an active ingredient of the skin barrier function improving agent of the present invention.
＜実験例４＞実使用試験
サルビア葉抽出物、ザクロ花抽出物、あるいはクレマティス葉抽出物を用いて「表２」の処方により皮膚外用剤を調製し、試験に同意を得た５０代男性５名を１群とし、第１群に実施例１と比較例２、第２群に実施例２と比較例２、第３群に比較例１と比較例２のテストサンプルを半顔に１日２回塗布してもらい、使用開始前、使用開始４週間後に＜実験例１＞と同様の方法で角層水分量、経表皮水分蒸散量、ヒアルロン酸分子量の測定を行った。試験結果は各測定日の比較例２使用部位の測定により得られた値を１００％として表した。試験結果を図１１〜１４に示す。
<Experimental Example 4> 50-year-old male who prepared an external preparation for skin according to the formulation of “Table 2” using salvia leaf extract, pomegranate flower extract, or clematis leaf extract, and obtained consent from the test. Name 1 group, Example 1 and Comparative Example 2 for the first group, Example 2 and Comparative Example 2 for the second group, and Test Samples of Comparative Example 1 and Comparative Example 2 for the third group for half a day After having been applied twice, the stratum corneum water content, transepidermal water transpiration amount, and hyaluronic acid molecular weight were measured in the same manner as in <Experimental Example 1> before the start of use and 4 weeks after the start of use. The test results were expressed with the value obtained by measuring the site of Comparative Example 2 used on each measurement day as 100%. The test results are shown in FIGS.
図１１〜１４に示したように、本発明のスクリーニング法により選択された加齢および紫外線によるヒアルロン酸代謝関連遺伝子の発現量低下あるいは上昇度低下を抑制する成分を含有する皮膚バリア機能改善剤であるサルビア葉抽出物を配合した実施例１あるいはザクロ花抽出物を配合した実施例２では角層ヒアルロン酸量には大きな変化が認められなかったが、角層ヒアルロン酸分子量スコアの上昇と経表皮水分蒸散量の低下、角層水分量の向上が認められた。一方、本発明のスクリーニング法において良好な成績を与えなかったクレマティス葉抽出物では、各測定項目において明確な変化は見られなかった。 As shown in FIGS. 11-14, the skin barrier function improving agent containing the component which suppresses the fall of the expression level of hyaluronic acid metabolism related gene by the aging and ultraviolet rays selected by the screening method of this invention, or a fall of a raise degree. In Example 1 containing a certain salvia leaf extract or Example 2 containing a pomegranate flower extract, no significant change was observed in the amount of stratum corneum hyaluronic acid. A decrease in moisture transpiration and an improvement in stratum corneum moisture were observed. On the other hand, in the clematis leaf extract that did not give good results in the screening method of the present invention, no clear change was observed in each measurement item.
以下、本発明に係る紫外線防御用皮膚外用剤の処方例を示す。なお、含有量は重量％である。尚、製法は常法による。 Hereinafter, the formulation example of the skin external preparation for ultraviolet protection which concerns on this invention is shown. The content is% by weight. In addition, a manufacturing method is a conventional method.
処方例１：クリーム
サルビア葉抽出物 ０．０２
ステアリルアルコール ６．００
ステアリン酸 ２．００
ワセリン ４．００
スクワラン ９．００
オクチルドデカノール １０．００
１，３−ブチレングリコール ６．００
グリセリン ４．００
ＰＯＥ（２０）セチルアルコールエーテル ３．００
モノステアリン酸グリセリン ２．００
酸化防止剤 適量
防腐剤 適量
精製水 残部
合計 １００．０
Formulation Example 1: Cream salvia leaf extract 0.02
Stearyl alcohol 6.00
Stearic acid 2.00
Vaseline 4.00
Squalane 9.00
Octyldodecanol 10.00
1,3-butylene glycol 6.00
Glycerin 4.00
POE (20) cetyl alcohol ether 3.00
Glycerol monostearate 2.00
Antioxidant Appropriate amount Preservative Appropriate amount of purified water Remaining total 100.0
処方例２：ファンデーション
ザクロ葉抽出物 ０．０１
サルビア葉抽出物 ０．０１
タルク ５.００
セリサイト ８.００
酸化チタン ５.００
色顔料 適量
モノイソステアリン酸ポリグリセリル ３.００
ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油 １.５０
イソノナン酸イソトリデシル １０.００
１，３−ブチレングリコール ５.００
酸化防止剤 適量
防腐剤 適量
精製水 残部
合計 １００．０
Formulation Example 2: Foundation pomegranate leaf extract 0.01
Salvia leaf extract 0.01
Talc 5.00
Sericite 8.00
Titanium oxide 5.00
Color pigment Appropriate amount Polyglyceryl monoisostearate 3.00
Polyoxyethylene hydrogenated castor oil 1.50
Isotridecyl isononanoate 10.00
1,3-butylene glycol 5.00
Antioxidant Appropriate amount Preservative Appropriate amount of purified water Remaining total 100.0
処方例３：サンスクリーン
ザクロ花抽出物 ０．０１
サルビア葉抽出物 ０．０１
酸化チタン １０.００
酸化亜鉛 １０.００
PEG-９ポリジメチルシロキシエチルジメチコン １.５０
ラウリルPEG-９ポリジメチルシロキシエチルジメチコン １.５０
シクロペンタシロキサン ２０.００
ジメチコン １０.００
（ジメチコン／ビニルジメチコン）クロスポリマー
０.５０
セチルジメチコン ０.２５
グリチルレチン酸エステル ０.０５
メチルグルセス−２０ １.００
１，３−ブチレングリコール １０.００
塩化ナトリウム 適量
酸化防止剤 適量
防腐剤 適量
精製水 残部
合計 １００．０
Formulation Example 3: Sunscreen pomegranate flower extract 0.01
Salvia leaf extract 0.01
Titanium oxide 10.0
Zinc oxide 10.0
PEG-9 polydimethylsiloxyethyl dimethicone 1.50
Lauryl PEG-9 polydimethylsiloxyethyl dimethicone 1.50
Cyclopentasiloxane 20.00
Dimethicone 10.0
(Dimethicone / Vinyl Dimethicone) Crosspolymer 0.50
Cetyl dimethicone 0.25
Glycyrrhetinic acid ester 0.05
Methyl Gurces-20 1.00
1,3-butylene glycol 10.0
Sodium chloride Appropriate amount Antioxidant Appropriate amount Preservative Appropriate amount Purified water Total remaining 100.0
Claims (6)
（２）紫外線を照射しない若齢のヒトをドナーとする培養表皮ケラチノサイトのヒアルロン酸合成関連遺伝子の発現量（Ｂｙｓ）およびヒアルロン酸レセプター関連遺伝子の発現量（Ｂｙｒ）およびヒアルロン酸分解関連遺伝子の発現量（Ｂｙｄ）を測定するステップ
（３）紫外線を照射した高齢のヒトをドナーとする培養表皮ケラチノサイトのヒアルロン酸合成関連遺伝子の発現量（Ｃａｓ）およびヒアルロン酸レセプター関連遺伝子の発現量（Ｃａｒ）およびヒアルロン酸分解関連遺伝子の発現量（Ｃａｄ）を測定するステップ
（４）紫外線を照射しない高齢のヒトをドナーとする培養表皮ケラチノサイトのヒアルロン酸合成関連遺伝子の発現量（Ｂａｓ）およびヒアルロン酸レセプター関連遺伝子の発現量（Ｂａｒ）およびヒアルロン酸分解関連遺伝子の発現量（Ｂａｄ）を測定するステップ
（５）紫外線照射前又は、紫外線照射後又は、紫外線照射の前後に被験物質を加えた状態の高齢のヒトをドナーとする培養表皮ケラチノサイトのヒアルロン酸合成関連遺伝子の発現量（Ｔａｓ）およびヒアルロン酸レセプター関連遺伝子の発現量（Ｔａｒ）およびヒアルロン酸分解関連遺伝子の発現量（Ｔａｄ）を測定するステップ
（６）前記（１）〜（５）の各ステップで得られた遺伝子の発現量において、Ｃｙｓ／Ｂｙｓ≧Ｔａｓ／Ｂａｓ≧Ｃａｓ／ＢａｓかつＣｙｒ／Ｂｙｒ≧Ｔａｒ/Ｂａｒ≧Ｃａｒ／ＢａｒかつＣｙｄ／Ｂｙｄ≧Ｔａｄ／Ｂａｄ＞Ｃａｄ／Ｂａｄとなる被験物質を有効成分として選択することを特徴とする皮膚バリア機能改善剤のスクリーニング方法。 (1) Expression level of hyaluronic acid synthesis-related gene (Cys), expression level of hyaluronic acid receptor-related gene (Cyr) and expression of hyaluronic acid degradation-related gene in cultured epidermal keratinocytes from young humans irradiated with ultraviolet rays (2) Expression level (Bys) of hyaluronic acid synthesis-related gene and expression level (Byr) of hyaluronic acid receptor-related gene in cultured epidermal keratinocytes from young human donors who are not irradiated with ultraviolet rays And (3) measuring the expression level (Byd) of a gene related to the degradation of hyaluronic acid and hyaluronic acid (3) Expression level of the hyaluronic acid synthesis-related gene (Cas) and hyaluronic acid receptor-related in cultured epidermal keratinocytes from donors who are irradiated with ultraviolet rays Gene expression level (Car) and hyaluronic acid Step of measuring the expression level (Cad) of the solution-related gene (4) Expression level of the hyaluronic acid synthesis-related gene (Bas) and expression of the hyaluronic acid receptor-related gene in cultured epidermal keratinocytes from donors who are not irradiated with ultraviolet rays Step (5) for measuring the amount (Bar) and the expression level (Bad) of a gene related to the degradation of hyaluronic acid (5) Donating an elderly human to whom a test substance has been added before, after, or before and after UV irradiation Measuring the expression level (Tas) of the hyaluronic acid synthesis-related gene and the expression level (Tad) of the hyaluronic acid receptor-related gene and the expression level (Tad) of the hyaluronic acid receptor-related gene in the cultured epidermal keratinocytes (6) In the expression level of the gene obtained in each step of 1) to (5), Cys / A skin barrier characterized by selecting a test substance as ys ≧ Tas / Bas ≧ Cas / Bas and Cyr / Byr ≧ Tar / Bar ≧ Car / Bar and Cyd / Byd ≧ Tad / Bad> Cad / Bad as an active ingredient Screening method for function improvers.
A skin external preparation containing the skin barrier function-improving agent according to claim 4 or 5.
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