JP2008523844A5

JP2008523844A5 - ワルファリンの投与範囲を予想する方法

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Filing date: 2005-12-21
Publication date: 2010-04-08
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Description

本研究において、我々はＶＫＯＲＣ１のプロモータにおける多型がワルファリン感受性と関連があることを発見した。この多型は、ワルファリン用量要求性における個体間および民族間の差異の両方を説明することができる。さらにまた、この多型はプロモータ活性と関連がある。−１６３９位（開始コドンの第一ヌクレオチドに対して番号付けされた）にＧを有するＶＫＯＲＣ１プロモータは、同じ位置にＡを有するプロモータより４４％活性が高い。−１６３９位にＡの多型を有する患者は、ワルファリンに対してより感受性である。−１６３９位のホモ接合のＡＡ患者は最も低い用量要求性を有し、ヘテロ接合のＡＧ患者は中間の用量要求性を有し、ホモ接合のＧＧ患者は最も高い用量要求性を有した。したがって、どの程度のワルファリンが被験者に対して処方されるべきかを予想するために、被験者のＶＫＯＲＣ１遺伝子のプロモータ配列または活性が使用されることができる。本方法はワルファリン用量の正確性を有意に改良する。これまでのところ、患者に初回投与量が与えられ、かれらのＩＮＲが定期的にモニタされ、患者に対して安全である維持量が獲得されることができるまで、それに応じてワルファリン投与量が調整されている。本発明を用いれば、予想投与量が維持量に極めて近づき、その結果ワルファリン投与量がより迅速に、より安全に、およびより経済的になるであろう。

具体的には、ＶＫＯＲＣ１遺伝子の−１６３９位の配列が解析されている。この位置のヌクレオチドがＡである場合、被験者はワルファリンに対してより感受性である。したがって、ＶＫＯＲＣ１遺伝子の−１６３９位にホモ接合のＡＡを有する被験者は、この位置にＡおよび他のヌクレオチド（Ｇ，ＣまたはＴ）を有するヘテロ接合を有する被験者より感受性が高い。同様に、同じヘテロ接合を有する被験者はこの位置にＡを有さない被験者よりワルファリン感受性が高い。

−１６３９位のＡまたは−１６３９位のＧ／Ｃ／Ｔアレルと等価の遺伝子マーカーに対するアッセイによって、配列が解析されることができ、等価の遺伝子マーカーの存在は対応するアレルの存在の指標である。例えば、等価の遺伝子マーカーは、ＶＫＯＲＣ１遺伝子のｒｓ９９３４４３８、ｒｓ８０５０８９４、ｒｓ２３５９６１２およびｒｓ７２９４からなる群より選択されたＳＮＰであってもよく、その多型の各々はワルファリン感受性の指標である。

本発明の幾つかの実施形態において、ＶＫＯＲＣ１遺伝子のプロモータと特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを用いることによって、配列が解析されている。オリゴヌクレオチドは、ＶＫＯＲＣ１遺伝子の−１６３９位の少なくとも６，８，１０，１２，１４，１６，１８，２０，２２または２４ヌクレオチド範囲と特異的にハイブリダイズすることが好ましい。被験者の抹消血から調製されたＤＮＡを用いることによって配列が解析されてもよい。

さらに本発明の他の態様は、ワルファリンの投与範囲を決定するためのキットを提供し、本キットは、
（ａ）ＶＫＯＲＣ１遺伝子の−１６３９位の配列Ａを検出するための手段と、
（ｂ）ＶＫＯＲＣ１遺伝子の−１６３９位の配列Ｇを検出するための手段と
からなる群より選択された少なくとも一成分を含む。

さらに、キットはそれぞれＶＫＯＲＣ１遺伝子の−１６３９位の配列ＣおよびＴを検出するための手段を含むことができる。したがって、ある実施形態において、キットはこの位置における四つの可能性のある塩基の各々を検出するための手段を含んでもよい。他の実施形態において、この位置におけるＡの存在がワルファリン感受性の最も良い指標となるので、キットはこの位置におけるＡを検出するための手段、およびＧ，ＣまたはＴを検出するための手段を含んでもよい。その手段はオリゴヌクレオチドであることが好ましい。キットは必要に応じてオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、ＰＣＲ増幅、および／または使用説明書を含んでもよい。

本発明の他の態様はＶＫＯＲＣ１遺伝子プロモータ領域とハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、またはその相補体を提供し、その領域はプロモータの−１６３９位まで及び、少なくとも六ヌクレオチドから構成される。オリゴヌクレオチドはＶＫＯＲＣ１遺伝子の−１６３９位まで及ぶ少なくとも６，８，１０，１２，１４，１６，１８，２０または２４ヌクレオチドと特異的にハイブリダイズすることが好ましい。オリゴヌクレオチドは−１６３９位のヌクレオチドがＡ，Ｇ，ＣまたはＴ，好ましくはＡまたはＧであるこの領域とハイブリダイズすることができる。ある実施形態において、オリゴヌクレオチドは約１５ヌクレオチドまたはそれより少ないヌクレオチド、１６乃至２０ヌクレオチド、２０乃至２５ヌクレオチド、２５乃至３０ヌクレオチド、または３０乃至４０ヌクレオチドから構成されてもよい。また、本発明のオリゴヌクレオチドを構成するアレイが提供される。

我々は、ＶＫＯＲＣ１遺伝子のプロモータにおける多型がワルファリン感受性と関連があることを発見した。この多型はワルファリン用量要求性における個体間および民族間の差異の両方を説明することができる。さらに、この多型はプロモータ活性とも関連がある。−１６３９位（開始コドンの第一ヌクレオチドに対して番号付けされた）にＧを有するＶＫＯＲＣ１プロモータは、同じ位置にＡを有するプロモータより４４％活性が高い。−１６３９位にＡの多型を有する患者は、ワルファリンに対してより感受性である。−１６３９位におけるホモ接合のＡＡ患者は最も低い用量要求性を有し、ヘテロ接合のＡＧ患者は中間の用量要求性を有し、ホモ接合のＧＧ患者は最も高い用量要求性を有していた。したがって、被験者のＶＫＯＲＣ１遺伝子のプロモータ配列または活性は、その被験者に対して処方されるべきワルファリン投与量を予想するために使用されることができる。さらなる発明の詳細な説明の前に、本出願において使用される用語は特に指示がなければ以下のように定義される。

他方で、我々は、ＶＫＯＲＣ１遺伝子における変異が、中国人集団における個体間および中国人と白人との間の民族間のワルファリン用量要求性を変化させることができることを見出した。−１６３９位のプロモータの多型ＡＡ遺伝子型を有する患者がより低い用量要求性を有するのに対して、ＡＧ／ＧＧ遺伝子型を有する患者はより高い用量要求性を有していた（実施例１および２）。さらに、ホモ接合ＡＡが白人集団において稀有である一方で、この遺伝子型は多数の中国人集団を形成している（実施例３）。白人と中国人との間の遺伝子型頻度における差異、およびＡＡのワルファリン感受性との相関は、中国人集団が白人集団より低い用量を要求するといった臨床的に観察されてきたことに従っている。

具体的には、ＶＫＯＲＣ１遺伝子の−１６３９位の配列が解析された。任意の他の遺伝子型を調べる必要がなくワルファリン感受性を予想するために、このＳＮＰのみが使用されることができる。したがって、この位置におけるホモ接合のＡＡはワルファリン感受性の指標であり、ヘテロ接合のＡＧは中間の感受性を示し、ホモ接合のＧＧを有する被験者は比較的抵抗性である。感受性の被験者、中間の感受性の被験者、または比較的抵抗性の被験者に投与されるべきワルファリンの実際の投与量は、ワルファリンの剤形および被験者の指示および症状に伴って変化し、ワルファリンを処方する医師によって決定されることができる。例えば、我々の研究によって（実施例１）、ワルファリン感受性またはワルファリン抵抗性を有する選択された患者集団において、最も低い用量要求性（一日当たり平均１．１９ｍｇ、一日当たり０．７１〜１．５０ｍｇの範囲）を有する患者はＡＡ遺伝子型を有し、中間の用量要求性（一日当たり平均８．０４ｍｇ、一日当たり６．０７〜１０ｍｇの範囲）を有する患者はヘテロ接合ＡＧを有し、最も高い用量要求性（一日当たり平均９．１１ｍｇ、一日当たり８．５７〜１０ｍｇの範囲）を有する患者はホモ接合ＧＧの遺伝子型に関連していた。無作為に選択された患者において（実施例２）、ＡＡ遺伝子型はＡＧおよびＧＧ（一日当たり３．８１プラスマイナス１．２４ｍｇ）より低い維持量（一日当たり２．６１プラスマイナス１．１０ｍｇ）に関連している。これらの範囲はワルファリン投与における出発点としての機能を果たすことができる。

ＶＫＯＲＣ１遺伝子のゲノム配列はＧｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＹ５８７０２０（配列番号１；図３）として入手可能である。ＶＫＯＲＣ１アイソフォーム１のｍＲＮＡの配列は登録番号ＮＭ_０２４００６．４．として入手可能である。これらの配列の両方において、転写開始位置は＋１として指定されており、したがって本明細書中に記載されたワルファリン感受性のプロモータ多型の指標は１４１３位に位置されるだろう。しかしながら、配列変異の記載に対するヒトゲノム変異学会（ＨｕｍａｎＧｅｎｏｍｅＶａｒｉａｔｉｏｎＳｏｃｉｅｔｙ（ＨＧＶＳ）による最近の推奨に従って（ｈｔｔｐ:／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｉｃ．ｕｎｉｍｅｌｂ．ｅｄｕ．ａｕ／ｍｄｉ／ｍｕｔｎｏｍｅｎ／）、プロモータＳＮＰはＡＴＧ転写開始コドンのＡに関して記載することを推奨されている。この命名法に基づいて、ＮＭ_０２４００６．４またはＡＹ５８７０２０のＡＴＧ転写開始
コドン（Ｍｅｔ）のＡは、＋１に位置付けられ、本明細書中に記載されたプロモータＳＮＰは−１６３９位であり、この位置におけるＧ＞Ａ多型は「ＮＭ_０２４００６．４：Ｃ．−１６３９Ｇ＞Ａ」として参照されるだろう。本開示の−１６３９位のＧ＞Ａ多型（すなわちより正確には「ＮＭ_０２４００６．４：Ｃ．−１６３９Ｇ＞Ａ」）は、従来のプロモータ配列番号付けに従って１４１３位のＧ＞Ａ多型と同じであることが明らかにされるべきである。

特異的多型（例えば、−１６３９位のＡＡ，ＡＧまたはＧＧ）に加えて、特異的ＳＮＰｓの各々に結合される遺伝子マーカーは、同様に対応するワルファリン感受性を予想するために使用されることができる。これは対象のＳＮＰ近傍の遺伝子マーカーが対象のＳＮＰと共分離する傾向にあるか、あるいは対象のＳＮＰと連鎖不均衡を示すためである。その結果、これらのマーカー（同等の遺伝子マーカー）の存在は、対象のＳＮＰの存在の指標であり、換言すると、ワルファリン感受性レベルの指標となる。

ＶＫＯＲＣ１の−１６３９位のＡ＞Ｇプロモータ多型は、Ｄ‘Ａｎｄｒｅａらによって最近報告されたＶＫＯＲＣ１の１１７３位のＣ＞Ｔイントロン多型（２７）と連鎖不均衡状態にあり、この結果によって、１１７３位のＴＴ遺伝子型を有するイタリア人患者がＣＴまたはＣＣ遺伝子型を有する患者より低い平均一日服用量を有していたことが説明されるかもしれない。また、我々の研究によって、３７３０位（すなわちｒｓ７２９４）のＧ＞Ａ多型は、３’非翻訳領域に位置されるが、中国人集団における−１６３９位のＡ＞Ｇおよび１１７３位のＣ＞Ｔと連鎖不均衡状態にあることが示された。具体的には、３７３０位のＧアレルは−１６３９位のＡアレルおよび１１７３位のＴアレルと関連がある。−１６３９位のＳＮＰの他の等価の遺伝子マーカーは、ｒｓ９９３４４３８（イントロン１）、ｒｓ８０５０８９４（イントロン２）およびｒｓ２３５９６１２（イントロン２）を含む。したがって、−１６３９位のＡがｒｓ９９３４４３８におけるＴ，ｒｓ８０５０８９４におけるＣ，ｒｓ２３５９６１２におけるＴおよびｒｓ７２９４におけるＧと関連している一方で、−１６３９位のＧは、ｒｓ９９３４４３８におけるＣ，ｒｓ８０５０８９４におけるＧ、ｒｓ２３５９６１２におけるＣおよびｒｓ７２９４におけるＡと関連している。

等価の遺伝子マーカーは、マイクロサテライトマーカーおよび一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）マーカーを含めて任意のマーカーであることが可能である。有用な遺伝子マーカーはＶＫＯＲＣ１の−１６３９位から約２００キロベースまたはそれより小さい距離であることが好ましい。遺伝子マーカーはＶＫＯＲＣ１の−１６３９位から約１００キロベース、８０キロベース、６０キロベース、４０キロベース、２０キロベース、１５キロベース、１０キロベース、または５キロベースあるいはそれより小さい距離であることがより好ましい。

本発明の一態様は、本発明のＳＮＰｓとハイブリダイズすることが可能なオリゴヌクレオチドを提供する。例えば、オリゴヌクレオチドはＶＫＯＲＣ１遺伝子のプロモータ配列の検出のためのハイブリダイゼーションプローブまたはプライマとして有用であろう。オリゴヌクレオチドは、配列ＴＧＧＣＣＧＧＧＴＧＣ（配列番号１の３６６８位から３６７８位）、またはその相補体から構成されることが好ましい。ハイブリダイゼーションの目的のために、−１６３９位に対応する配列がオリゴヌクレオチドの中心近傍であることが好ましい。−１６３９位に対応する配列の両側上に少なくとも４ヌクレオチドあることが好ましい。−１６３９位に対応する位置は両側上の少なくとも５，６，７，８または９ヌクレオチドによって側面を守られていることがより好ましい。

−１６３９位のプロモータＳＮＰはＥ−ＢＯＸ（Ｅ−ＢＯＸのコンセンサス配列はＣＡＮＮＴＧである）内に位置され、短距離（２００塩基対）以内にさらに三つのＥ−ＢＯＸが存在する。Ｅ−ＢＯＸが筋肉、神経細胞、肝臓および膵臓等の細胞／組織型特異的転写を媒介するための重要な要素であることが示されてきた（２８，２９）。−１６３９位において観察されたＡからＧへの第二塩基の置換はＥ−ＢＯＸコンセンサスを無効にしてプロモータ活性を変えるだろう。コンセンサス配列が無効にされる場合、ＨｅｐＧ２細胞においてプロモータ活性が４４％増加されることがプロモータアッセイによって、明確に例証された（図２）。理論によって限定したい訳ではなく、このことはＥ−ＢＯＸがＨｅｐＧ２におけるリプレッサ結合部位として機能することを示唆する。ＨｅｐＧ２が肝臓癌由来であるため、−１６３９位のＥ−ＢＯＸは肝臓において転写を抑制しそうである。

−１６３９位にＧＧ遺伝子型を有する人々がより高いワルファリン投与量を要求することは、以下のように説明されることができる。ＶＫＯＲＣ１遺伝子はビタミンＫエポキシド還元酵素複合体のサブユニット１をコードし、ビタミンＫの還元型を再生することに関与している。ビタミンＫの還元型はガンマカルボキシラーゼによって要求され、ビタミンＫ依存性凝固因子（因子ＩＩ，ＶＩＩ，ＩＸおよびＸ）のガンマカルボキシル化が血液凝固にとって必須である。ＶＫＯＲＣ１プロモータ活性が増加される場合、ＶＫＯＲＣ１ｍＲＮＡの増加レベルがより高いＶＫＯＲ活性に通じることができ、その結果還元型ビタミンＫの再生効率を増長する。それ故に、ビタミンＫ依存性凝固因子のガンマカルボキシル化は、より高レベルの還元型ビタミンＫによって増長される。ワルファリンは凝固因子の合成を阻害することによって作用し、より活性的な凝固因子を有することによってその抗凝固効果のためにより多くのワルファリンが要求されるだろう。肝臓がビタミンＫ依存性凝固因子の合成のための主要な器官であり、ＶＫＯＲＣ１の発現が肝臓で最も高いために、肝臓におけるＶＫＯＲＣ１のレベルの４４％の変化は血液凝固過程に関して重要な影響を与える可能性がある。したがって、ワルファリンの用量要求性はＶＫＯＲＣ１遺伝子多型およびそのプロモータ活性に関連がある。

ＶＫＯＲＣ１プロモータの−１６３９位におけるＡ以外の任意の配列が、Ｅ−ＢＯＸを破壊してプロモータ活性を増加させることを、我々は予想している。換言すれば、プロモータ活性における増加がワルファリンの用量要求性を増加させる。したがって、プロモータ配列、具体的に−１６３９位の配列は、ワルファリン投与量の指標となる。さらに、本発明の他の実施形態は、ＶＫＯＲＣ１遺伝子のプロモータ活性を検出することによって、ワルファリンの投与方法、あるいはワルファリン感受性の決定方法を提供する。同様に、ＶＫＯＲＣ１遺伝子の遺伝子産物（ｍＲＮＡまたはタンパク質）あるいはＶＫＯＲ活性のレベルもワルファリンの用量要求性を反映することができる。ＶＫＯＲＣ１プロモータ活性、ｍＲＮＡレベル、タンパク質レベル、またはＡＡ遺伝子型を有する被験者のＶＫＯＲ活性より少なくとも１０％，１５％，２０％，２５％，３０％，３５％または４０％高いＶＫＯＲ活性が、ＡＡの遺伝子型を有する被験者より高いワルファリンの用量要求性の指標となる。

さらに本発明の他の態様は、ワルファリンの投与範囲を決定するためのキットを提供し、本キットは、
（ａ）ＶＫＯＲＣ１遺伝子の−１６３９位における配列Ａを検出するための手段と、
（ｂ）ＶＫＯＲＣ１遺伝子の−１６３９位における配列Ｇを検出するための手段と
からなる群より選択された少なくとも一成分を含む。

さらに、そのキットは、それぞれＶＫＯＲＣ１遺伝子の−１６３９位における配列ＣおよびＴを検出するための手段を含むことができる。したがって、ある実施形態において、そのキットはこの位置における四つの可能性のある塩基の各々を検出するための手段を含んでもよい。他の実施形態において、この位置におけるＡの存在がワルファリン感受性の最も良い指標であるため、キットはこの位置におけるＡを検出するための手段、およびＧ，ＣまたはＴを検出するための手段を含んでもよい。その手段はオリゴヌクレオチドであることが好ましい。キットは必要に応じてオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、ＰＣＲ増幅法のための試薬、および／または使用説明書を含んでいてもよい。

本発明の他の態様は、ＶＫＯＲＣ１遺伝子のプロモータ領域とハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、またはその相補体を提供し、その領域はプロモータの−１６３９位まで及び、少なくとも６ヌクレオチドから構成される。オリゴヌクレオチドはＶＫＯＲＣ１遺伝子の−１６３９位まで及ぶ少なくとも６，８，１０，１２，１４，１６，１８，２０，２２，または２４ヌクレオチドと特異的にハイブリダイズすることが好ましい。オリゴヌクレオチドは、−１６３９位におけるヌクレオチドがＡ，Ｇ，ＣまたはＴ、好ましくはＡまたはＧであるこの領域とハイブリダイズすることができる。ある実施形態において、オリゴヌクレオチドは約１５ヌクレオチドまたはそれより小さいヌクレオチド、１６〜２０ヌクレオチド、２０〜２５ヌクレオチド、２５〜３０ヌクレオチド、または３０〜４０ヌクレオチドから構成されてもよい。また、本発明のオリゴヌクレオチドを構成するアレイも提供される。

ルシフェラーゼレポータ分析
プラスミドの構築
ＶＫＯＲＣ１プロモータ活性に対して分析するために、順方向プライマ：５’−ｃｃｇｃｔｃｇａｇｔａｇａｔｇｔｇａｇａａａｃａｇｃａｔｃｔｇｇ（配列番号４；ＸｈｏＩの制限酵素部位を含む）および逆方向プライマ：５‘−ｃｃｃａａｇｃｔｔａａａｃｃａｇｃｃａｃｇｇａｇｃａｇ（配列番号５；ＨｉｎｄＩＩの制限酵素部位を含む）を用いて、−１６３９位のＡＡおよび−１６３９位のＧＧ遺伝子型を有する患者から得た−１６３９位の多型（１７９８位から３５位）を網羅するＶＫＯＲＣ１プロモータを、ｐＧＥＭ−ＴＥａｓｙベクター（アメリカ、ウィスコンシン州、マディソン、Ｐｒｏｍｅｇａ社）中にまずクローニングした。ＸｈｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素部位を用いてベクターを切断することによって、ＶＫＯＲＣ１プロモータを含む断片をｐＧＥＭ−ＴＥＡＳＹベクターから切り離し、ｐＧＬ３−標準ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社）の多重クローニング部位（ＸｈｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ）中にサブクローニングした。ｐＧＬ−３ベクターは、蛍ルシフェラーゼに対してコードされたｃＤＮＡを含み、プロモータとともに融合された場合、哺乳類細胞中へのトランフェクション上に挿入されたプロモータ活性を解析するために使用されることができる。−１６３９位のＧ／Ｇ遺伝子型を含むベクターをｐＧＬ３−Ｇに設定し、−１６３９位のＡ／Ａ遺伝子型を含むベクターをｐＧＬ３−Ａに設定した。両ベクター中のＶＫＯＲＣ１プロモータ配列を直接配列決定解析によって確認した。

また、我々はＶＫＯＲＣ１遺伝子のプロモータ、コード領域、およびエクソン−イントロン接合部の配列を解析した。ＶＫＯＲＣ１の３‘非翻訳領域（ＵＴＲ）に位置する一変異（３７３０位のＧ＞Ａ）が検出された。さらに、プロモータ多型である−１６３９位のＧ＞Ａ（すなわち＋１として転写開始位置を用いる１４１３位）が、ＶＫＯＲＣ１の上流領域において検出された。この多型は、全てのワルファリン感受性患者が−１６３９位においてホモ接合のＡＡであるという点で、ワルファリン感受性と相関を示した。その一方で、ワルファリン抵抗性患者は、へテロ接合のＡＧまたはホモ接合のＧＧのいずれかであった（表１）。ワルファリン用量が−１６３９位の遺伝子型に対してプロットされた場合、ＡＡ遺伝子型を有する患者が最も低い用量要求性（平均一日当たり１．１９ｍｇ、一日当たり０．７１〜１．５０ｍｇの範囲）を有し、ヘテロ接合のＡＧを有する患者は中間の用量要求性（平均一日当たり８．０４ｍｇ、一日当たり６．０７〜１０ｍｇの範囲）を有し、およびホモ接合のＧＧを有する患者は最も高い用量要求性（平均一日当たり９．１１ｍｇ、一日当たり８．５７〜１０ｍｇの範囲）を有していた（表１）。

−１６３９位のＧ＞Ａに加えて、イントロン１の多型である１１７３位のＣ＞Ｔは、Ｄ‘Ａｎｄｒｅａらによって記載されてきたが、我々の患者においても同定された。これら二つの多型は強力な連鎖不均衡（ＬＤ）の関係にあるように思われる（表１）。−１６３９位のＡＡ遺伝子型を有するワルファリン感受性患者が一患者（被験者６）を除いて１１７３位のホモ接合のＴＴと相関することが見出された。ワルファリン抵抗性患者において、−１６３９位のヘテロ接合のＡＧを有する患者は１１７３位のヘテロ接合のＣＴと相関することが見出され、ホモ接合の−１６３９位のＧＧは１１７３位のホモ接合のＴＴと相関があることが見出された（表１）。

実施例２
ワルファリンを受けている無作為中国人患者におけるＶＫＯＲＣ１の−１６３９位のＧ＞Ａ多型
−１６３９位のＧ＞Ａ多型がワルファリン用量における個体間の差異と相関があるかどうかさらに解析するために、我々は用量に関係なくワルファリンを受けている１０４人の患者に、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法を用いて遺伝子解析を行った。ＡＡおよびＡＧ／ＧＧ集団は年齢、性別、およびＩＮＲに関して差異がなかった（表２）。二患者においてのみＧＧに対してホモ接合であることが見出され、彼らは統計解析のためにＡＧを有する患者と一緒に集団化された。我々は食事または他の投薬等の他の混乱させる変数の有無に関係なくデータを解析した。表２に示されるように、ＡＡ集団は、ＡＧ／ＧＧ集団（一日当たり３．８１ｍｇ）より有意に低い用量要求性（一日当たり２．６１ｍｇ）を有していた。Ｔ検定（ｐ＜０．０００１）またはＷｉｌｃｏｘｏｎＭａｎｎＷｈｉｔｎｅｙ検定（ｐ＝０．０００２）によって、ＡＡ集団とＡＧ／ＧＧ集団との間の差異は優位なものとなった。

実施例３
中国人および白人におけるＶＫＯＲＣ１の−１６３９位のＧ＞Ａ多型およびＣＹＰ２Ｃ９変異の遺伝子型頻度
中国人集団は白人集団より極めて低いワルファリン維持量を要求することが知られていた。ＶＫＯＲＣ１の−１６３９位の遺伝子型における差異がワルファリン用量における民族間の差異を説明することが可能かどうか調べるために、９５人の正常漢民族被験者および９２人の正常白人被験者が遺伝子解析された。白人集団において、ホモ接合のＡＡは最も低い頻度を有したのに対して、ＡＧおよびＧＧ遺伝子型が多数の集団を構成した（表３、それぞれ１４．２％、４６．７％および３９．１％）。逆に、中国人集団において、ホモ接合のＡＡが多数派集団を構成し（８２．１％）、集団の残りは、ヘテロ接合のＡＧ（１７．９％）であった。無作為に選択されたこの集団においては、ホモ接合のＧＧは検出されなかった。また、この割合は７９．８％がホモ接合のＡＡであり、１８．３％がヘテロ接合のＡＧであり、残りの１．８％がホモ接合のＧＧであることが見出された１０４人のワルファリン患者における割合と同じであった。白人集団と二つの中国人集団との間の遺伝子型頻度における差異は、０．０００１未満のｐ値を有して優位であった。二つの民族集団（白人および中国人）の間のこれらの差異、およびＡＡのワルファリン感受性との相関は、中国人集団が白人集団より低い用量を要求するという臨床的所見に従う。

−１６３９位のＧ＞Ａに加えて、我々は中国人集団において、三つのイントロンの多型（ｒｓ９９３４４３８、イントロン１の１１７３位のＣ＞Ｔ，ｒｓ８０５０８９４、イントロン２ｇ．５０９＋１２４Ｃ、およびｒｓ２３５９６１２、イントロン２ｇ．５０９＋８３７Ｃ）、および一つの３‘非翻訳領域の多型（ｒｓ７２９４，３７３０位のＧ＞Ａ）のためにスクリーニングを行った。四つの多型の全てが−１６３９位のプロモータ多型と連鎖不均衡（ＬＤ）の関係にあった（内部マーカーＤ’およびｒ^２値が１．０）
また、ＣＹＰ２Ｃ９の変異が中国人集団において遺伝子解析された。ＣＹＰ２Ｃ９^＊１／^＊３の頻度は、中国人の正常集団において７．３％であり、ワルファリンを受けている無作為に選択された中国人患者において５．４％であった、ＣＹＰ２Ｃ９^＊２の変異は中国人患者および対照において検出されなかった。白人におけるＣＹＰ２Ｃ９変異の頻度に関する刊行物のデータに比べて、白人集団は中国人よりはるかに高いＣＹＰ２Ｃ９変異の頻度を有し（３０％未満対７％未満）、さらに白人がワルファリンに対してより抵抗性であった。ワルファリン感受性患者において検出された他のミスセンス変異である８９５位のＡ＞Ｇ（Ｔ２９９Ａ）および１１４５位のＣ＞Ｔ（Ｐ３８２Ｌ）（表１）は無作為に選択された患者および対照のいずれにおいても見出されず、このことはこれらの変異が稀な変異であることを示唆している。

実施例４
ＶＫＯＲＣ１プロモータ活性
ＡＡ遺伝子型の患者とＧＧ遺伝子型の患者との間のワルファリン感受性における差異は、ＶＫＯＲＣ１プロモータ活性における変化によって説明されることができよう。−１６３９位のプロモータＳＮＰがＥ−ＢＯＸ（ＣＡＮＮＴＧ）の第二ヌクレオチドにおいて位置され、その結果、この多型はＥ−ＢＯＸコンセンサス配列を変化させ、ＶＫＯＲＣ１プロモータ活性における変化に通じるであろう。この仮説を調べるために、−１６３９位を網羅するＶＫＯＲＣ１プロモータを、−１６３９位のＡＡ遺伝子型またはＧＧ遺伝子型を有する患者からＰＣＲ増幅し、ｐＧＬ−３ベクター中にクローニングした。ＶＫＯＲＣ１が肝臓において最も高いレベルで発現されるので、ＨｅｐＧ２細胞（ヒト肝臓癌細胞株）をプロモータ解析のために選択した。合計九回の実験を行い、全ての実験が（図２に示されるように）一貫した結果を示した。ＶＫＯＲＣ１プロモータの−１６３９位のＧは、プロモータの−１６３９位のＡと比べてより高いルシフェラーゼ活性（約４４％高い）を示した。ｐＧＬ−３標準ベクターは多重クローニング部位内に挿入されたプロモータを全く有さず、ごく少量のルシフェラーゼ活性を有していた。したがって、−１６３９位の配列はプロモータ活性にとって重要であり、より高いプロモータ活性（例えば、−１６３９位のＧ）がより高いワルファリン用量要求性と相関する。

実施例５
ワルファリン用量におけるＶＫＯＲＣ１の−１６３９位のＳＮＰとＣＹＰ２Ｃ９との組合せ
ワルファリン感受性を予想するためにＶＫＯＲＣ１の−１６３９位のＳＮＰ単独で使用されることが可能であるが、このＳＮＰは必要に応じて他の遺伝子マーカーと組み合わせられことが可能である。例えば、ＶＫＯＲＣ１遺伝子およびＣＹＰ２Ｃ９遺伝子の両方の配列がワルファリン用量において解析されることが可能である。以下の表にこれら二つの遺伝子がともに考慮される場合に各ハプロタイプに対するクマディンの推奨用量を示す。

本発明の多数の実施形態が記載されてきた。それにもかかわらず、本発明の精神および範囲から逸脱することなく種々の変更がなされてもよいことが理解されよう。

ＶＫＯＲＣ１の−１６３９位の遺伝子型に対するワルファリン投与の散布図である。ＶＫＯＲＣ１プロモータの−１６３９位の異なる遺伝子型に対して、ワルファリン感受性またはワルファリン抵抗性を有する選択された患者におけるワルファリン用量（詳細な説明における表１を参照のこと）を座標で示した。＊は、ＣＹＰ２ｃ９^＊３、Ｔ２９９Ａ（すなわちＴからＡに置換されたアミノ酸残基２９９）およびＰ３８２Ｌ（すなわちＰからＬに置換されたアミノ酸残基３８２）を含めたＣＹＰ２Ｃ９変異を有する患者を示す。ＨｅｐＧ２細胞中のルシフェラーゼ活性レベルの相対測定。プロモータ−１６３９位におけるＡアレル（ｐＧＬ３−Ａ）またはＧアレル（ｐＧＬ３−Ｇ）を含むｐＧＬ３ルシフェラーゼレポーター。九回の実験から得たデータの平均値を表示し、エラーバーは標準偏差を表している。任意のプロモータ配列が挿入されていないコントロールとして、ｐＧＬ３−標準を使用した。ＶＫＯＲＣ１遺伝子のゲノム配列（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＹ５８７０２０）。転写開始位置は、この図におけるヌクレオチド番号５０８６（太字かつ囲み線）であり、従来の命名法において遺伝子の＋１として表されている。ＡＴＧ転写開始コドン（太字）のＡが、この図におけるヌクレオチド番号５３１２であり、ヒトゲノム変異学会（ＨｕｍａｎＧｅｎｏｍｅＶａｒｉａｔｉｏｎＳｏｃｉｅｔｙ）によって新規命名システムにおいて＋１として表されるように推奨されている。本発明において記載されたプロモータの多型は下線および太字で表記されており（この配列中ヌクレオチド番号３６７３）、従来システムにおける１４１３位および新規推奨システムにおいて−１６３９位である。

Claims

ヒト患者に対するワルファリンの投与範囲を予想する方法において、
前記患者のＶＫＯＲＣ１遺伝子の−１６３９位のヌクレオチドを解析する工程であって、前記ヌクレオチドは前記ＶＫＯＲＣ１遺伝子のプロモータと特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを用いることによって解析される工程と、
前記−１６３９位のヌクレオチドに基づいて前記患者がワルファリン感受性か、またはワルファリン抵抗性かを決定する工程であって、前記−１６３９位におけるホモ接合のＡＡ、ヘテロ接合のＡＧ、およびホモ接合のＧＧは、それぞれ前記患者がワルファリン感受性、中間の感受性、およびワルファリン抵抗性であることを示す工程と、
前記患者のワルファリン感受性またはワルファリン抵抗性に基づいてワルファリンの投与範囲を予想する工程と
からなる方法。
前記オリゴヌクレオチドは前記ＶＫＯＲＣ１遺伝子の前記−１６３９位まで及ぶ少なくとも６ヌクレオチドと特異的にハイブリダイズする請求項１に記載の方法。
前記ヌクレオチドは前記患者の抹消血から調製されたＤＮＡを用いることによって解析される請求項１または請求項２に記載の方法。
前記患者はアジア人である請求項１乃至請求項３のいずれか一項に記載の方法。
前記患者は白人である請求項１乃至請求項３のいずれか一項に記載の方法。
前記患者はアフリカ人、アフリカ系アメリカ人、またはヒスパニックである請求項１乃至請求項３のいずれか一項に記載の方法。
ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子の配列を解析する工程と、前記ＶＫＯＲＣ１遺伝子の−１６３９位のヌクレオチドおよび前記ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子の配列に基づいてワルファリンの投与範囲を予想する工程とをさらに含む請求項１乃至請求項６のいずれか一項に記載の方法。