JP2008500264A

JP2008500264A - 細胞外マトリックスの障害を治療するための方法及び組成物

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Publication number: JP2008500264A
Application number: JP2006517893A
Authority: JP
Inventors: チョンリン、チェイ; マーク、エマニュエル、クーパー; ツーミン、カオ
Original assignee: ダイア − ビーテックリミテッド
Priority date: 2003-07-01
Filing date: 2004-06-30
Publication date: 2008-01-10
Also published as: CA2530866A1; AU2003903363A0; EP1660114A4; ZA200600914B; WO2005002614A1; US20070185020A1; CN1863548A; EP1660114A1

Abstract

本発明は、細胞が産生する細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質のレベルを改変する方法を提供し、この方法は細胞分裂自己抗原（ＣＤＡ）の発現又は活性を調節することを含む。本出願人らは、驚くべきことに、哺乳動物の細胞が産生するＥＣＭタンパク質のレベルを制御する経路にＣＤＡが関与することを見出した。本発明は、腎繊維症及びアテローム性動脈硬化症などのＥＣＭに関係のある多くの障害に関連している。

Description

本発明は、結合組織の生物学の分野に関する。より詳しくは、本発明は、繊維症などの細胞外マトリックス（ＥＣＭ）に関連する結合組織障害、及び腎疾患、糖尿病、及びアテローム性動脈硬化症などの二次的疾患の治療に関する。

ＥＣＭは、通常結合組織内で構造上の役割を果たすゲル様物質である。ＥＣＭは、間質物質及び繊維から構成される。間質物質は間質を満たす無構造の物質であり、間質液、細胞接着タンパク質、及びプロテオグリカンから構成される。細胞接着タンパク質のために、結合組織細胞がマトリックス物質に接着することができる。プロテオグリカンは、水分を保持する働きをし、そのために半強固な水和したゲルが生じる。

多糖類の相対量及び種類は、マトリックスの特性を決定する助けとなる。例えば、多糖類が多いほど間質物質は堅くなる。間質物質は細胞を支持し、細胞を結びつけ、栄養及び他の溶解した物質がそれを通して毛細血管と細胞との間を拡散することができる媒体として働く。

マトリックスの繊維は強さを与える。結合組織のマトリックスには、コラーゲン繊維、弾性繊維、及び網状繊維の３つの型の繊維が見出されている。コラーゲン繊維（白色繊維）は、極めて強固であり高度の引っ張り強さを与えるが、この引っ張り強さは縦方向の張力に抵抗する能力である。新鮮なコラーゲン繊維の外観は白く輝いているため、「白色繊維」と呼ばれることもある。弾性繊維（黄色繊維）は、その長さの１から１．５倍に伸ばすことができるが、解放すると元の長さに戻る。弾性繊維は、肺及び血管壁などのより大きな弾性が必要なところに見出される。新鮮な弾性繊維の外観は黄色であり、黄色繊維とも呼ばれる。網状繊維は、細いコラーゲン性の繊維である。網状繊維は、肝臓及び脾臓などの柔軟な臓器を支持する繊細な枝分かれした網状組織を形成している。

ＥＣＭは明らかに体内で重要な構造上の役割を果たすが、ＥＣＭ障害はよく起こり重症である。繊維症は、動物においてＥＣＭの過剰産生の結果生じる瘢痕組織の生成に対する一般的な用語である。米国における死亡の４５パーセントは、繊維増殖性（ｆｉｂｒｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ）障害によるものと推定されている。

繊維症は、外傷、外科手術、感染、環境汚染、アルコール、及び他のタイプの毒素を含む多様な原因によって生じる可能性がある。繊維症には、心臓のポンプ能力を損なう心臓発作後の瘢痕組織の形成など、多くの例がある。糖尿病は、進行性の腎機能喪失となる腎臓の損傷及び瘢痕化を頻繁に引き起こす。外科手術後でさえ、内部臓器間に瘢痕組織が生じ、痙縮、疼痛、及び場合によっては不妊症を引き起こすことがある。

繊維障害は、急性のことも慢性のこともあり得るが、これらの障害は、コラーゲンが過剰に蓄積し、正常組織が瘢痕組織で置き換わると機能が付随的に喪失するという一般的な性質を共有する。

急性繊維症（通常は、突然、重症に始まり、持続期間は短い）は、偶発的な負傷、感染、外科手術、熱傷、放射線、及び化学療法治療を含む様々な形態の外傷に対する一般的な反応として起こる。外傷により損傷を受けた組織は全て、特に損傷が繰り返される場合に、瘢痕になり易く繊維症となる。

慢性繊維症は、組織機能の継続的な喪失を引き起こす進行性繊維症を誘発する、ウイルス感染、糖尿病、高血圧、及び他の慢性状態から生じる可能性がある。最も一般的に冒されるのは、肝臓、腎臓、及び肺である。臓器機能の喪失が進行すると、疾病、入院、透析、労作不能、及び死さえもまねくので、深部臓器の繊維症は極めて重症であることが多い。

ＥＣＭ障害は、広く起こり、衰弱を起こし、生命を脅かすことも多いが、現在効果的な治療は得られていない。ＥＣＭに関連した多くの形態の障害に臨床上の有害作用があることを考慮すると、効果的な治療は明らかに必要である。

本出願人らは、既知の細胞タンパク質がＥＣＭ障害の病態生理に関与することを発見することにより、従来技術の問題を克服又は軽減した。

一態様では、本発明は、細胞が産生する細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質のレベルを改変する方法を提供し、この方法は細胞分裂自己抗原（ＣＤＡ）の発現又は活性を調節することを含む。本出願人らは、驚くべきことに、哺乳動物細胞が産生するＥＣＭタンパク質のレベルを制御する経路にＣＤＡが関与することを見出した。本発明は、腎繊維症及びアテローム性動脈硬化症などのＥＣＭに関係のある数々の障害に関連している。

ＣＤＡは、細胞分裂自己抗原１（ＣＤＡ１）、又はその機能的等価物又は誘導体であることができる。

別の態様では、本発明は、ＥＣＭタンパク質の合成に関係のある状態を治療又は予防する方法を提供し、この方法はＣＤＡの発現及び／又は活性を調節することを含む。

本発明は、ＣＤＡ１を改変されたレベルで発現することができる細胞を有するＥＣＭ障害の研究に使用するためのヒト以外の動物も提供する。

本発明の別の態様は、ＥＣＭの合成を調節することができる物質をスクリーニングする方法を提供し、この方法は、
ＣＤＡ１を発現することができる動物又は細胞を用意するステップと
その動物又は細胞をその物質に曝露するステップと、
その物質がＣＤＡ１の発現及び／又は活性に及ぼす影響を決定するステップと
を含む。

本発明は、本明細書に記載されたスクリーニング方法により同定される物質、及びその物質を含む薬剤組成物をさらに含む。

本発明は、ＥＣＭに関係のある状態を治療又は予防する方法をさらに含み、この方法は、本明細書に記載された薬剤組成物の有効量をそれを必要とする動物に投与することを含む。

また、本発明は、細胞におけるＣＤＡ１の発現及び／又は活性を調節する方法を提供し、この方法は、アンギオテンシンＩＩ、ＴＧＦβ、及び結合組織成長因子を含む群から選択される因子の活性を調節することができる物質に細胞を曝露することを含む。

本発明は、またさらにＥＣＭタンパク質の合成に関係のある状態を診断する方法を提供し、この方法は、
動物から生物学的サンプルを得ること、
サンプル中のＣＤＡ１のレベルを決定すること、及び
サンプル中のＣＤＡ１のレベルを基準値と比較すること
を含み、サンプル中のＣＤＡ１のレベルが基準値より統計学的に有意に高い又は低い場合に陽性と診断される。

一態様では、本発明は、細胞が産生する細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質のレベルを改変する方法を提供し、この方法は細胞分裂自己抗原（ＣＤＡ）の発現又は活性を調節することを含む。本出願人らは、驚くべきことに、哺乳動物細胞が産生するＥＣＭタンパク質のレベルを制御する経路にＣＤＡが関与することを見出した。

ＥＣＭは、哺乳動物の組織内に見られる細胞を取り囲み、支持する複雑な構造的実体である。ＥＣＭは結合組織と呼ばれることが多い。ＥＣＭは、３つの主要なクラスの生体分子、即ち構造タンパク質（コラーゲン及びエラスチン）、特殊化タンパク質（フィブリリン、フィブロネクチン、及びラミニン）、並びにプロテオグリカンから構成される。

したがって、本発明の好ましい形態では、ＥＣＭタンパク質は、コラーゲン、エラスチン、フィブリリン、フィブロネクチン、ラミニン、及びプロテオグリカンを含む群から選択される。より好ましくは、ＥＣＭタンパク質は、フィブロネクチン又はコラーゲンＩＶである。

本明細書で用いられる「ＣＤＡの発現又は活性を調節すること」とは、ＣＤＡの発現及び／又は活性を、非調節のレベルに比べて修正又は改変することを意味する。発現を調節することは、発現及び／又は活性を誘発し又は増加させること、或いは発現及び／又は活性を減少させることを含むことができる。

細胞におけるＣＤＡの発現及び／又は活性の調節は、ＣＤＡの拮抗薬、阻害薬、擬似物質、又は誘導体を使用して実現することができる。本発明で用いられる「拮抗薬」又は「阻害薬」は、ＣＤＡの生物学的活性を阻害し又は調節する物質のことである。拮抗薬及び阻害薬には、タンパク質、核酸、炭水化物、抗体、又はあらゆる他の分子若しくはリガンドが含まれる。タンパク質には、ＣＤＡを分解することができ、それによって細胞内又は細胞周囲のＣＤＡレベルに影響を及ぼす酵素が含まれることがある。ＣＤＡの活性及び／又は発現を調節する他の物質には、ある範囲の合理的に設計された合成阻害薬が含まれる。

ＣＤＡの発現及び／又は活性の調節は、直接的又は間接的方法によって実現することができる。ＣＤＡの発現及び／又は活性の調節は、当業者には周知の直接的方法を用いて実現され、ノックアウト技術、アンチセンス技術、三重鎖技術、標的突然変異、遺伝子治療、転写に作用する物質による制御を含むがそれらだけには限定されない。ＣＤＡの発現及び／又は活性を調節する間接的方法には、サイトカインなどによる上流又は下流の制御因子のターゲティングを含むがそれらだけには限定されない。

「活性」とは、細胞におけるＣＤＡの機能に関し、ＣＤＡがシャペロン分子、又は上流若しくは下流のエフェクター分子と結合し、それによりＥＣＭタンパク質の生成に影響を及ぼす上流又は下流の経路を活性化又は抑制する能力を含む。

細胞が腎組織又は血管組織に由来するものであることが好ましい。腎臓でＣＤＡ１が発現されることについては、以前に報告がない。本出願人らは、遠位尿細管及び集合管を含む腎臓でＣＤＡ１が発現されることを示している（図４）。正常ラットの遠位尿細管及び集合管におけるＣＤＡ１の発現は、細胞質におけるパターンも核におけるパターンも実証した。ＣＤＡ１は、正常ラットの腎臓の糸球体で発現されることはまれであった。

細胞が、腎有足細胞、腎近位尿細管細胞、腎集合管細胞、泡沫細胞、又はマクロファージを含む群から選択されることがより好ましい。

腎部分切除（ＳＴＮｘ）後の残遺腎組織において、ＣＤＡ１の発現が繊維症と共に局在化することも観察された（図３）。腎重量が減少した後、糸球体の有足細胞でＣＤＡ１の発現が見られた（図６Ａ）が、これは正常の腎臓では見られなかった。細胞質及び核の染色パターンは、特に硬化した糸球体、及び尿細管管質性繊維症の部位でははっきりとしている。我々の予備データは、ＡＴ１受容体拮抗薬のバルサルタンなどアンギオテンシンＩＩの作用を遮断する治療的取組みは、細胞の損傷が少なくＣＤＡ１の発現が減弱することに関連することも示している（図３Ｂ）。

以前に記載されたのと同じＣＤＡ１トランスフェクション技術を用いて（Ｃｈａｉら、（２００１年）「細胞の増殖を停止させるＳＥＴ関連細胞分裂自己抗原１（ＣＤＡ１）（ＳＥＴ−ｒｅｌａｔｅｄＣｅｌｌＤｉｖｉｓｉｏｎＡｕｔｏａｎｔｉｇｅｎ−１（ＣＤＡ１）ＡｒｒｅｓｔｓＣｅｌｌＧｒｏｗｔｈ）」、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６巻、３３６６５〜３３６７４頁、今後「Ｃｈａｉら、２００１年」と呼ぶ）、本出願人らはＣＤＡ１を近位尿細管細胞系のＮＲＫ−５２Ｅにトランスフェクトした。我々の予備実験では、ＣＤＡ１をトランスフェクトした細胞では、ビヒクルのみをトランスフェクトした細胞に比べて、コラーゲンＩＶ（図４Ｂ）及びフィブロネクチン（図４Ｄ）を含むマトリックスタンパク質の産生が上昇したことが示されている（図４Ａ及び４Ｃ）。この結果は、ＣＤＡ１が細胞外マトリックスの産生、及びそれに続く腎繊維症の発症に直接関連する可能性があることを示唆している。

本発明の好ましい形態では、ＣＤＡは、細胞分裂自己抗原１（ＣＤＡ１）、又はそのフラグメント、機能的等価物、類似体、突然変異体、若しくは変異体である。

ＣＤＡ１は、円板状紅斑性狼瘡患者の血清を用いて最近同定された新規の核タンパク質である。本出願人らは、以前にＣＤＡ１の分子クローニング及び構造について詳細に記載している（ＷＯ０２／３６７６８として刊行されたＰＣＴ／ＡＵ０１／０１４８を参照されたい）。簡潔に述べると、ＣＤＡ１のｃＤＮＡは、２８０８塩基対であり、２０７９塩基対のオープンリーディングフレームは、ＣＤＡ１と名付けられた６９３個のアミノ酸の予測ポリペプチドをコードしている。ＣＤＡ１の予測分子量は７９，４３０ダルトンであり、ｐＩは４．２６である。

ＣＤＡ１は、Ｎ末端のプロリンリッチドメイン、中央の塩基性ドメイン、及びＣ末端の二連（ｂｉｐａｒｔｉｔｅ）酸性ドメインを含む。本出願人らの当初の研究により、ＣＤＡ１には４つの推定上の核局在シグナル、並びにｃＡＭＰ及びｃＧＭＰ依存キナーゼ、タンパク質キナーゼＣ、チミジンキナーゼ、カゼインキナーゼＩＩ、及びサイクリン依存キナーゼ（ＣＤＫｓ）によりリン酸化を受ける潜在的部位があることが実証されている。ＣＤＡ１は、ＨｅＬａ細胞中で、ｉｎｖｉｔｒｏでサイクリンＤ１／ＣＤＫ４、サイクリンＡ／ＣＤＫ２、及びサイクリンＢ／ＣＤＫ１によりリン酸化される。ＣＤＡ１の塩基性及び酸性ドメインは、殆どのヒト白血病関連ＳＥＴタンパク質全体と相同のドメインを含む。

ＣＤＡ１の発現は細胞周期中では絶えず変化し、そのレベルは様々な細胞周期の期及び培養条件と直接関係がある。血清の飢餓細胞（Ｇ_０期）では、ＣＤＡ１は非常に低いレベルで発現された。血清を培養液に添加して細胞周期を刺激すると（Ｇ１期）、それに関連してＣＤＡ１の発現が増加した。培養液にチミジンを２ｍＭ添加して細胞をＧ１／Ｓで阻止すると、ＣＤＡ１の発現は最高に達した。コルセミド０．１５μｇ／ｍｌの添加により細胞をＭ期で停止させると、ＣＤＡ１の発現は減少したが、それでもＧ_０期で検出されたものよりは高かった。

他の研究者もその後ＣＤＡ１を同定し、それがＴＧＦβ１標的遺伝子であることを実証し、差次的に発現された核小体ＴＧＦ−β１標的（ＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙＥｘｐｒｅｓｓｅｄＮｕｃｌｅｏｌａｒＴＧＦ−β１Ｔａｒｇｅｔ：ＤＥＮＴＴ）と名付けた。ＣＤＡ１の発現は、ｉｎｖｉｔｒｏでＴＧＦβ１によって増加することが実証された。ＣＤＡ１（ＤＥＮＴＴとしても知られる）は、下垂体で高度に発現され、副腎、脳、膵島、精巣、及び卵巣で中程度に発現され、内分泌器官でこのタンパク質が優位であることが示唆される。

より好ましくは、ＣＤＡ１は、図７によるヌクレオチド配列、又はＣＤＡ１の機能的等価物若しくは誘導体をコードする配列でコードされる。ＣＤＡ１は、図８によるアミノ酸配列又はその機能的等価物若しくは誘導体を有することができる。

本明細書で用いられる「機能的等価物又は誘導体」はフラグメントを含むがそれだけには限定されず、フラグメントはＣＤＡ１又はその相同体、類似体、突然変異体、変異体、若しくは誘導体の機能上の活性を有する。これには、融合タンパク質を含めて、天然、リコンビナント、又は合成の供給源に由来する相同体、類似体、突然変異体、変異体、又は誘導体が含まれる。「相同体」と言及した場合、治療される種以外の種に由来するＣＤＡ１核酸分子又はタンパク質と理解されたい。

誘導体には、融合タンパク質を含めた、天然、合成、又はリコンビナントの供給源由来のフラグメント、部分、一部、突然変異体、変異体、及び擬似物質が含まれる。部分又はフラグメントには、例えば、ＣＤＡ１の活性領域が含まれる。誘導体は、アミノ酸の挿入、欠失、又は置換によって得られたものでよい。アミノ酸の挿入による誘導体には、アミノ末端及び／又はカルボキシル末端の融合物、並びに１個又は多数のアミノ酸の配列内挿入が含まれる。アミノ酸配列の挿入による変異体は、１個又は複数のアミノ酸残基がタンパク質の所定の部位に導入されたものであるが、得られた産物のスクリーニングが適切であればランダムな挿入も可能である。欠失による変異体は、配列から１個又は複数のアミノ酸が取り除かれることを特徴とする。置換によるアミノ酸の変異体は、配列内の少なくとも１個の残基が取り除かれその場所に異なる残基が挿入されたものである。置換によるアミノ酸の変異体の例として、保存的なアミノ酸の置換がある。保存的アミノ酸の置換には、通常以下：グリシンとアラニン、バリンとイソロイシンとロイシン、アスパラギン酸とグルタミン酸、アスパラギンとグルタミン、セリンとスレオニン、リジンとアルギニン、フェニルアラニンとチロシン、のグループ内での置換が含まれる。アミノ酸配列に対する添加には、他のペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質との融合が含まれる。

ＣＤＡ１の核酸又はタンパク質分子の化学的及び機能的等価物は、これらの分子の任意の１つ又は複数の機能上の活性を示す分子を含むということを理解すべきであり、化学的に合成されたもの、又は天然産物のスクリーニングなどのスクリーニングプロセスで同定されたものなどのあらゆる供給源に由来するものでもよい。

誘導体には、ペプチド、ポリペプチド、又は他のタンパク質若しくは非タンパク質の分子に融合したタンパク質全体の特別なエピトープ又は部分を有するフラグメントが含まれる。

本明細書で企図される類似体には、側鎖の修飾、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質の合成中の非天然アミノ酸及び／又はその誘導体の取込み、並びにタンパク質分子又はその類似体に対して立体配座の束縛を強制する架橋剤及び他の方法の使用が含まれるが、それらだけには限定されない。

核酸配列の誘導体は、同様に、他の核酸分子との融合を含めた、１個又は多数のヌクレオチドの置換、欠失、及び／又は付加に由来するものでもよい。本発明の核酸分子の誘導体には、オリゴヌクレオチド、ＰＣＲプライマー、アンチセンス分子、核酸分子の共抑制（ｃｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ）及び融合に使用するのに適する分子が含まれる。核酸配列の誘導体には、縮重変異体も含まれる。

本発明で企図される側鎖の修飾の例には、アルデヒドとの反応による還元的アルキル化及びそれに続くＮａＢＨ_４による還元、メチルアセトイミデートによるアミジノ化などによるアミノ基の修飾；無水酢酸によるアシル化、シアナートによるアミノ基のカルバモイル化、２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）によるアミノ基のトリニトロベンジル化、無水コハク酸及び無水テトラヒドロフタル酸によるアミノ基のアシル化、ピリドキサル−５−リン酸によるリジンのピリドキシル化及びそれに続くＮａＢＨ_４による還元が含まれる。

アルギニン残基のグアニジン基は、２，３−ブタンジオンフェニルグリオキサール及びグリオキサールなどの試薬で複素環縮合産物を形成して修飾することができる。

カルボキシル基は、Ｏ−アシルイソウレアの形成によるカルボジイミドの活性化、及びそれに続き対応するアミドなどに誘導して修飾することができる。

スルフヒドリル基は、ヨード酢酸又はヨードアセトアミドによるカルボキシメチル化、システイン酸への過ギ酸酸化、他のチオール化合物によるジスルフィド混合物の形成、マレイミド、無水マレイン酸、又は他の置換されたマレイミドとの反応、４−クロロメルクリ安息香酸、４−クロロマーキュリフェニルスルホン酸、塩化フェニル水銀、２−クロロメルクリ−４−ニトロフェノール、及び他の水銀剤を用いた水銀誘導体の形成、アルカリ側のｐＨにおけるシアネートによるカルバモイル化などの方法により修飾することができる。

トリプトファン残基は、例えば、Ｎ−ブロモスクシンイミドによる酸化、又は２−ヒドロキシ−５−ニトロベンジルブロミド若しくはハロゲン化スルフェニルによるインドール環のアルキル化により修飾することができる。一方、チロシン残基は、テトラニトロメタンでニトロ化して３−ニトロチロシン誘導体を形成することにより改変することができる。

ヒスチジン残基のイミダゾール環の修飾は、ヨード酢酸誘導体によるアルキル化、又はジエチルピロカーボネートによるＮ−カーボエトキシ化により行うことができる。

タンパク質合成中に非天然アミノ酸及び誘導体を取込むことの例には、ノルロイシン、４−アミノ酪酸、４−アミノ−３−ヒドロキシ−５−フェニルペンタン酸、６−アミノヘキサン酸、ｔ−ブチルグリシン、ノルバリン、フェニルグリシン、オルニチン、サルコシン、４−アミノ−３−ヒドロキシ−６−メチルヘプタン酸、２−チエニルアラニン、及び／又はアミノ酸のＤ異性体の使用が含まれるが、それらだけには限定されない。

別の態様においては、本発明は、ＥＣＭタンパク質の合成に関係のある状態を治療又は予防する方法を提供し、この方法はＣＤＡの発現及び／又は活性を調節することを含む

ＥＣＭタンパク質の合成に関係のある状態には、外傷の結果としての繊維症、並びに特に脊椎及び中枢神経系の損傷が含まれる。熱傷及び他の肥厚性瘢痕、心臓発作後の心臓の瘢痕化、血液療法薬物が誘発する繊維症、放射線が誘発する繊維症、肺繊維症（急性呼吸器不全症候群）及び外科手術の瘢痕化もまた含まれる。

この状態は、腎疾患（例えば、糖尿病又は高血圧症によるもの）、肝繊維症（例えば、ウイルス性肝炎又はアルコール乱用によるもの）、肺繊維症、心臓繊維症、黄斑変性、網膜及び硝子体網膜症などを含めた主要な臓器の繊維症でもよい。

この状態には、全身性及び局所性の強皮症、ケロイド及び肥厚性瘢痕、アテローム性動脈硬化症又は再狭窄などの障害も含まれることがある。

本発明のより好ましい形態では、この状態は、糖尿病の結果としての腎繊維症である。出願人らは、８週齢の糖尿病ラットにおいてＣＤＡ１の発現が増加することを発見した（図６）。その上、糖尿病誘発３２週後に腎臓のＣＤＡ１の発現がさらに増加した。尿細管及び間質において、ＣＤＡ１の発現が増加することが見出されている。

特に興味深いのは、正常ラットからの腎臓では見られなかったＣＤＡ１の新たな発現が、糖尿病ラットからの有足細胞にあったことである（図２）。本出願人らは、糖尿病性腎症では有足細胞の損傷が起こること、及びネフリンのようなスリット膜タンパク質の不十分な発現が糖尿病で見られるアルブミン尿の一因である可能性があることを実証している。ＣＤＡ１及び糖尿病性腎症の周知の病態生理学的側面に関するこれらのデータに基づき、この新規のタンパク質は糖尿病性腎症の機能上の発現と構造上の発現との間の重要なリンクであると、本出願人らは提唱する。

理論によって限定されることを望まないが、アンギオテンシンＩＩ、ＴＧＦβ、及びＣＴＧＦを介して糖尿病で活性化される血行力学的経路及び代謝経路は、ＣＤＡ１の発現を増加させ、それによってフィブロネクチン及びコラーゲンＩＶなどのＥＣＭタンパク質の産生を増加させることが提唱されている。

本発明のさらに好ましい実施形態では、この状態はアテローム性動脈硬化症である。本出願人らは、糖尿病のＡｐｏＥノックアウトマウスの大動脈におけるアテローム硬化プラークでＣＤＡ１染色が増加することを示しているが（図６）、これはＣＤＡ１がアテローム性動脈硬化症の発症においてある役割を果たしている可能性があることを示唆している。アテローム性動脈硬化症は、動脈によく起こる疾患である。脂肪、コレステロール、及び他の物質が動脈壁に蓄積し、「粥腫（ａｔｈｅｒｏｍａｓ）」即ちプラークを形成する。最終的に、脂肪組織が動脈壁を侵食し、動脈の弾力性を減少させ、血流を妨害することがある。

プラーク堆積物の周囲に凝血塊が生じ、さらに血流を妨害することがある。心筋へ向かう動脈の血流が大きく制限されるようになると、心筋に対する損傷は避けられない。

危険因子には、喫煙、糖尿病、肥満、高血圧、血中高コレステロール、脂肪の多い食事、及び心臓疾患の個人的病歴又は家族歴を有することが含まれる。脳血管疾患、末梢血管疾患、及び透析を必要とする腎臓疾患もまた、アテローム性動脈硬化症と関連することのある障害である。本発明は、アテローム性動脈硬化症の治療又は予防を企図するものである。

本方法は、ＥＣＭタンパク質の増加が望ましい状態、例えば動脈瘤、より詳しくは腹部大動脈瘤の治療のためにも使用される。

本発明は、改変されたレベルでＣＤＡ１を発現することのできる細胞を有する、ＥＣＭ障害を研究に使用するヒト以外の動物も提供する。この動物は、「ノックアウト」動物であって、ＣＤＡ１を全く発現しないものでもよい。この動物は、低減した活性でＣＤＡ１を発現するものでもよい。このような動物はＥＣＭに関係のある状態を研究するための、又はＥＣＭに関係のあるあらゆる状態の治療又は予防に有用な物質をスクリーニングするためのモデルとして有用であることが企図される。

本発明の別の態様では、ＥＣＭ合成を調節することのできる物質をスクリーニングする方法を提供し、この方法は、
ＣＤＡ１を発現することができる動物又は細胞を用意するステップと、
この動物又は細胞をこの物質に曝露するステップと、
この物質がＣＤＡ１の発現及び／又は活性に及ぼす影響を決定するステップと
を含む。

本発明はさらに、本明細書に記載されるスクリーニング方法によって同定される物質、及びＥＣＭに関係のある状態を治療するのに有用な物質を含む薬剤組成物を含む。薬剤組成物及び化粧用の組成物を調製するための方法及び担体は、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎの薬剤科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ）」、１８版、米国ペンシルバニア州、Ｅａｓｔｏｎ、ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏｍｐａｎｙ刊などの教科書で述べられている通り当業者にはよく知られており、この本の内容は本明細書に組み込まれる。

薬剤組成物は、ＥＣＭに関係のある状態を治療又は予防するために、治療又は予防有効量で投与することができる。本明細書で用いられる「治療又は予防有効量」とは、望まれる効果を少なくとも部分的に達成するために、或いはＥＣＭに関係のある状態の始まりを遅らせるために、進行を阻止するために、又は始まり若しくは進行を完全に止めるために必要な量を意味する。このような量は、勿論、治療する特定の状態、状態の重症度、並びに、年齢、身体の状態、大きさ、体重、及び他の併用療法を含む個々のパラメータに依存することがある。これらの因子は、当業者にはよく知られており、ルーチンの実験だけで対処することができる。最小有効量が、確実な医療上の又は治療上の判断により決定されることが概ね好ましい。しかし、医療上の又は他の理由でより高用量を投与することがあることを、当業者は理解されたい。当業者であれば、また、本発明の状況に有用な投与経路及び投与計画の範囲に精通している。所与の臨床上の適用に対する最適の製剤、投与経路、又は投与計画を確実にするには、ルーチンの実験だけが必要である。

本発明は、ＥＣＭに関係のある状態を治療又は予防する方法をさらに含み、この方法は、本明細書に記載されている薬剤組成物の有効量をそれを必要とする動物に投与することを含む。ＥＣＭに関係のある状態は、本明細書にすでに記載されている状態のあらゆるものでよい。

本発明は、細胞におけるＣＤＡ１の発現及び／又は活性を調節する方法も提供し、この方法は、アンギオテンシンＩＩ、ＴＧＦβ、及び結合組織成長因子を含む群から選択される因子の活性を調節することができる物質に細胞を曝露することを含む。

出願人らは、アンギオテンシンＩＩ注入後にＣＤＡ１の発現が増加することを示している（図５Ｂ）。ＣＤＡ１を免疫組織化学的に染色すると、近位尿細管では細胞質染色も核染色もレベルが増加することが示される。アンギオテンシンＩＩ注入後のＣＤＡ１の発現の増加は、ＡＴ１受容体拮抗薬であるバルサルタンで治療することにより防止される（データは示さず）。

アンギオテンシンＩＩ注入後に尿細管でＣＤＡ１の発現が増加するパターン（図５Ｂ）は、ＴＧＦβ（図２Ｃ）及びＴＧＦβ２（図２Ｄ）のものと類似している。さらに、２つの重要なプロアポトーシスタンパク質であるｐ５３及びｂａｘの発現が増加したのと同じ部位で、近位尿細管のＣＤＡ１の発現の増加が観察された（データは示さず）。ｐ５３及びｂａｘの共発現は、ＣＤＡ１が細胞増殖の阻害に関与することと一致している。

本発明は、ＥＣＭタンパク質の合成に関係のある状態を診断する方法をさらにまた提供し、この方法は、
動物から生物学的サンプルを得ること、
サンプル中のＣＤＡ１のレベルを決定すること、及び
サンプル中のＣＤＡの１レベルを基準値と比較すること
を含み、サンプル中のＣＤＡ１のレベルが基準値より統計学的に有意に高い又は低い場合に陽性と診断される。

この方法は、本明細書に記載したようにＥＣＦの異常に関係のあるあらゆる疾患を診断する際に有用であることが企図される。

（実施例１）
ＣＤＡ１の発現及びＡｎｇＩＩ：時間と投与量の関係
８週齢のオスＳｐｒａｇｕｅＤａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラットに、皮下に埋植したミニポンプにより３日間又は１４日間、昇圧作用のある投与量（６０ｎｇ／分）及び昇圧作用のない投与量（６ｎｇ／分）のＡｎｇＩＩを継続的に注入した（ＣａｏらＺ、「成年ラットの腎臓においてアンギオテンシン２型受容体が発現し、細胞増殖及びアポトーシスを促進する（Ｔｈｅａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎｔｙｐｅ２ｒｅｃｅｐｔｏｒｉｓｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎａｄｕｌｔｒａｔｋｉｄｎｅｙａｎｄｐｒｏｍｏｔｅｓｃｅｌｌｕｌａｒｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎａｎｄａｐｏｐｔｏｓｉｓ．）」、ＫｉｄｎｅｙＩｎｔ．、２０００年、５８巻、２４３７〜２４５１頁）。結果を図２に示す。

（実施例２）
残遺腎臓におけるＣＤＡ１の発現及び繊維症
右腎切除により腎部分切除（ＳＴＮｘ）を行い、その後、左腎の約３分の２に梗塞が形成され、１匹以外の選択的結紮を行ったもの全ての左腎動脈に腎臓外分枝が見られた（ＣＩＡ４０）。ペントバルビトンナトリウム（ｐｅｎｔｏｂａｒｂｉｔｏｎｅｓｏｄｉｕｍ）（６０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射し、麻酔を行った。対照に偽手術を行ったラットを用いた。手術後１、２、４、８、及び１２週目に動物を屠殺し、組織を収集して、ＣＤＡ１の発現、繊維成長因子、及びマトリックスタンパク質の評価を行った。結果を図３に示す。

（実施例３）
ＡｎｇＩＩ、ＴＧＦβ、及びＣＴＧＦ刺激の存在下又は存在なしで、ＣＤＡ１の過剰発現がコラーゲン、オステオポンチン、フィブロネクチンの発現に及ぼす影響
培養した正常ラット腎上皮細胞系にＣＤＡ１をトランスフェクションすることにより、ＣＤＡ１の過剰発現を実現した。培養した正常ラット腎上皮細胞系にＣＤＡ１をトランスフェクションすることにより、ＣＤＡ１の過剰発現を実現した（ＮＲＫ５２Ｅ）。Ｍｙｃでタグ付けしたＣＤＡ１を発現する構成物、即ちＣＤＮＡ３−２Ｍ−ＣＤＡ１及びｐＣＤＮＡ３−２ＭベクターコントロールＤＮＡを用いて、以前にＨｅＬａ細胞のトランスフェクションで記載された電気穿孔法により、ＮＲＫ５２Ｅ細胞をトランスフェクトした（Ｃｈａｉら、２００１年）。

トランスフェクトした細胞をカバーガラス上に塗抹し、ウシ胎児血清を含まないＤＭＥＭ中で３日間培養した。フィブロネクチン及び他のマトリックスタンパク質を、免疫組織化学的方法により評価した。ＴＧＦβ、コラーゲンＩ、及びフィブロネクチンの遺伝子発現は、以下の引用文献に記載されているように、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ又は免疫化学的方法により評価することができる：Ｃａｏら、「進行性腎損傷におけるレニンアンギオテンシン系及びエンドセリン系の阻害（Ｂｌｏｃｋａｄｅｏｆｔｈｅｒｅｎｉｎａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎａｎｄｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎｓｙｓｔｅｍｓｏｎｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅｒｅｎａｌｉｎｊｕｒｙ）」、Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ２０００年、３６巻、５６１〜５６８頁；Ｔｗｉｇｇら、「実験的糖尿病における腎結合組織成長因子の誘導はアミノグアニジンにより妨害される（Ｒｅｎａｌｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅｔｉｓｓｕｅｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｉｎｄｕｃｔｉｏｎｉｎｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｄｉａｂｅｔｅｓｉｓｐｒｅｖｅｎｔｅｄｂｙａｍｉｎｏｇｕａｎｉｄｉｎｅ）」Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、２００２年、１４３巻、４９０９〜４９１３頁。

細胞外マトリックスタンパク質は、免疫組織化学的方法によりＣＤＡ１、又はビヒクルをトランスフェクトした細胞の存在下で又は存在なしに評価した。結果を図４に示す。

８週齢のＳｐｒａｇｕｅＤａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラットにストレプトゾトシン（ＳＴＺ）を静脈注射することにより、糖尿病を誘発した（Ａｌｌｅｎら、「実験的糖尿病性腎症におけるアンギオテンシンＩＩ及びブラジキニンの役割−機能上及び構造上の研究（ＲｏｌｅｏｆａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎＩＩａｎｄｂｒａｄｙｋｉｎｉｎｉｎｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｄｉａｂｅｔｉｃｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ−ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌａｎｄｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｓｔｕｄｉｅｓ）」Ｄｉａｂｅｔｅｓ、１９９７年、４６巻、１６１２〜１６１８頁）。糖尿病誘発８及び３２週後に動物を屠殺し、その後のＣＤＡ１の免疫組織化学検査用に腎臓を摘出した。結果を図５に示す。

ａｐｏＥノックアウトマウスにＳＴＺ糖尿病を誘発し（ＳＴＺを６日間毎日注射）、糖尿病誘発２０週後に、免疫組織化学検査用に大動脈を摘出した。結果を図６に示す。

（実施例４）
ＣＤＡ１免疫組織化学検査の方法
パラフィンで固定した切片に、ウサギ抗ヒトＣＤＡ１血清を用いてＣＤＡ１染色を行った（Ｃｈａｉら、２００１年）。簡潔に述べると、脱ロウ後、パラフィンで固定した切片を、１０ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）中、電子レンジの低出力で１０分間処理した。３％過酸化水素（Ｈ_２Ｏ_２）のメタノール溶液を用い、２０分間内因性のパーオキシダーゼを不活性化した。切片を、タンパク質ブロック剤で２０分間ブロックした。切片を、ウサギ抗ヒトＣＤＡ１血清と室温で２時間インキュベートした。ビオチン化したヤギ抗ウサギ免疫グロブリン（ＤＡＫＯＡ／Ｓ）を、第２抗体として使用し、その後アビジンビオチン西洋ワサビペルオキシダーゼ混合物（ＡＢＣＥｌｉｔｅｋｉｔ、カリフォルニア州、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＶｉｃｔｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）を用いた。３，３’−ジアミノベンチジンテトラヒドロクロリドと反応させて検出を行った（ＤＡＢ、ミズーリ州、ＳｔＬｏｕｉｓ、ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌ社製）（Ｃａｏら、「成年マウスの腎臓においてアンギオテンシン２型受容体が発現し、細胞増殖及びアポトーシスを促進する（Ｔｈｅａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎｔｙｐｅ２ｒｅｃｅｐｔｏｒｉｓｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎａｄｕｌｔｒａｔｋｉｄｎｅｙａｎｄｐｒｏｍｏｔｅｓｃｅｌｌｕｌａｒｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎａｎｄａｐｏｐｔｏｓｉｓ．）」、ＫｉｄｎｅｙＩｎｔ．、２０００年、５８巻、２４３７〜２４５１頁）。

最後に、本明細書に概説した本発明の精神から逸脱することなく、他の様々な修正及び／又は改変を行うことができることを理解されたい。

遠位尿細管及び集合管におけるＣＤＡ１の発現を示す。切片は、ＨＥで対比染色してある（核が青色に染まっている）。パネルＡ、ヒト組織。パネルＢ、ラット腎組織。ｉｎｖｉｖｏにおけるＡｎｇＩＩ刺激に反応して腎臓内でＣＤＡ１の発現が増加することを示す。パネルＡ、ＣＤＡ１発現対照。パネルＢ、アンギオテンシンＩＩに曝露後のＣＤＡ１の発現。パネルＣ、アンギオテンシンＩＩに曝露後のＴＧＦ−β１発現。パネルＤ、アンギオテンシンＩＩに曝露後のＴＧＦ−β２発現。腎臓重量減少後のＣＤＡ１の発現の増加及び繊維症を示す。切片は、ＨＥで対比染色してある（核が青色に染まっている）。パネルＡ、腎部分摘出におけるＣＤＡ１の発現。パネルＢ、バルサルタンに曝露後の腎部分摘出におけるＣＤＡ１の発現。近位尿細管細胞における、ＣＤＡ１の過剰発現及び細胞外マトリックスタンパク質の産生を示す。パネルＡ、ビヒクルをトランスフェクトしたＮＲＫ細胞のコラーゲンＩＶ染色。パネルＢ、ＣＤＡ１をトランスフェクトしたＮＲＫ細胞のコラーゲンＩＶ染色。パネルＣ、ビヒクルをトランスフェクトしたＮＲＫ細胞のフィブロネクチン染色。パネルＤ、ＣＤＡ１をトランスフェクトしたＮＲＫ細胞のフィブロネクチン染色。糖尿病ラットの腎臓におけるＣＤＡ１の発現を示す。切片は、ＨＥで対比染色してある（核が青色に染まっている）。パネルＡ、対照の腎臓におけるＣＤＡ１の発現。パネルＢ、８週間後のＣＤＡ１の発現。パネルＣ、３２週間後のＣＤＡ１の発現。アテローム硬化プラークにおけるＣＤＡ１の発現を示す。ＣＤＡ１は茶色に染色し、核は青色に染色している。パネルＡ、糖尿病ではないマウスの大動脈。パネルＢ、糖尿病（ａｐｏＥ）マウスの大動脈。ヒトＣＤＡ１をコードするＤＮＡ配列を示す。ヒトＣＤＡ１に対するタンパク質配列を示す。

Claims

細胞が産生する細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質のレベルを改変する方法であって、細胞分裂自己抗原（ＣＤＡ）の発現又は活性を調節することを含む方法。
前記ＥＣＭタンパク質が、コラーゲン、エラスチン、フィブリリン、フィブロネクチン、ラミニン及びプロテオグリカンからなる群から選択される、請求項１記載の方法。
前記ＥＣＭタンパク質がフィブロネクチン又はコラーゲンＩＶである、請求項１記載の方法。
前記細胞が腎組織又は血管組織に由来する、請求項１記載の方法。
前記細胞が、腎有足細胞、腎近位尿細管細胞、腎集合管細胞、泡沫細胞及びマクロファージ細胞からなる群から選択される、請求項１記載の方法。
前記ＣＤＡが、Ｎ末端のプロリンリッチドメイン、中央の塩基性ドメイン、及びＣ末端の二連酸性ドメインを含む、請求項１記載の方法。
前記ＣＤＡが、細胞分裂自己抗原１（ＣＤＡ１）、又はそのフラグメント、機能的等価物、類似体、突然変異体若しくは変異体である、請求項１記載の方法。
前記ＣＤＡ１が、図７によるヌクレオチド配列でコードされる、請求項７記載の方法。
前記ＣＤＡ１が、図８によるアミノ酸配列、又はその機能的等価物若しくは誘導体を有する、請求項７記載の方法。
ＥＣＭタンパク質の合成に関係のある状態を治療又は予防する方法であって、ＣＤＡの発現及び／又は活性を調節することを含む方法。
前記状態が繊維症である、請求項１０記載の方法。
前記繊維症が、熱傷、心臓発作、化学療法薬による治療、放射線への曝露、又は外科手術によるものである、請求項１１記載の方法。
前記繊維症が主要臓器の繊維症である、請求項１１記載の方法。
前記主要臓器が、腎臓、肝臓、心臓及び眼からなる群から選択される、請求項１３記載の方法。
前記主要臓器の繊維症が、糖尿病、高血圧症、ウイルス性肝炎、アルコール乱用、黄斑変性症、網膜の網膜症及び硝子体網膜症からなる群から選択される状態によるものである、請求項１３記載の方法。
前記状態が、糖尿病の結果としての腎繊維症である、請求項１１記載の方法。
前記状態が、全身性及び局所性強皮症、ケロイド、肥厚性瘢痕、アテローム性動脈硬化症並びに再狭窄を含む群から選択される、請求項１０記載の方法。
前記状態が、アテローム性動脈硬化症である、請求項１７記載の方法。
前記状態が動脈瘤である、請求項１０記載の方法。
前記動脈瘤が腹部大動脈瘤である、請求項１９記載の方法。
前記ＣＤＡがＣＤＡ１である、請求項１０記載の方法。
ＥＣＭ障害を研究に使用するためのヒト以外の動物であって、改変されたレベルのＣＤＡを発現することのできる細胞を有する動物。
前記ＣＤＡがＣＤＡ１である、請求項２２記載のヒト以外の動物。
ＥＣＭ合成を調節することができる物質をスクリーニングする方法であって、
ＣＤＡを発現することができる動物又は細胞を用意するステップ、
前記動物又は細胞を前記物質に曝露するステップ、及び
前記物質がＣＤＡ発現及び／又は活性に及ぼす影響を決定するステップ、
を含む方法。
前記ＣＤＡがＣＤＡ１である、請求項２４記載の方法。
請求項２４記載の方法により同定される物質。
請求項２６記載の物質を含む薬剤組成物。
ＥＣＭタンパク質に関係のある状態を治療又は予防する方法であって、請求項２７記載の薬剤組成物の有効量をそれを必要とする動物に投与することを含む方法。
細胞におけるＣＤＡの発現及び／又は活性を調節する方法であって、アンギオテンシンＩＩ、ＴＧＦβ、及び結合組織成長因子からなる群から選択される因子の発現及び／又は活性を調節することができる物質に前記細胞を曝露することを含む方法。
前記ＣＤＡがＣＤＡ１である、請求項２９記載の方法。
動物におけるＥＣＭタンパク質の合成に関係のある状態を診断する方法であって、
前記動物から生物学的サンプルを得ること、
前記サンプル中のＣＤＡのレベルを決定すること、及び
前記サンプル中のＣＤＡのレベルを基準値と比較すること、
を含み、前記サンプル中のＣＤＡのレベルが基準値より統計学的に有意に高い又は低い場合に陽性と診断される、方法。
前記ＣＤＡがＣＤＡ１である、請求項３１記載の方法。