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ES2330918T3 - Inhibidor del activador del factor de crecimiento de hepatocitos para usar en la modulacion de la angiogenesis y la cardiovascularizacion. - Google Patents

Inhibidor del activador del factor de crecimiento de hepatocitos para usar en la modulacion de la angiogenesis y la cardiovascularizacion. Download PDF

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ES2330918T3
ES2330918T3 ES00990950T ES00990950T ES2330918T3 ES 2330918 T3 ES2330918 T3 ES 2330918T3 ES 00990950 T ES00990950 T ES 00990950T ES 00990950 T ES00990950 T ES 00990950T ES 2330918 T3 ES2330918 T3 ES 2330918T3
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pro256
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endothelial
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Austin L. Gurney
Daniel K. Kirchhofer
William I. Wood
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Genentech Inc
Original Assignee
Genentech Inc
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Abstract

Procedimiento in vitro para identificar un agonista de un polipéptido PRO256, que comprende: (a) poner en contacto células y un compuesto de ensayo que se va a cribar en condiciones adecuadas para inducir una respuesta celular inducida normalmente por un polipéptido PRO256; y (b) determinar la inducción de dicha respuesta celular para determinar si el compuesto de ensayo es un agonista eficaz, en el que la inducción de dicha respuesta celular es indicativa de que dicho compuesto de ensayo es un agonista eficaz, y en el que un polipéptido PRO256 es un polipéptido que tiene una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos 80% con respecto a: (i) la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 2 (SEQ ID NO: 2); (ii) los restos X a 529 de la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 2 (SEQ ID NO: 2); (iii) los restos 1 a Y de la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 2 (SEQ ID NO: 2); y (iv) los restos X a Y de la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 2 (SEQ ID NO: 2), en el que dicha identidad de secuencia se determina usando el programa de ordenador ALIGN-2 y en el que X es 36±5 e Y es 465±5.

Description

Inhibidor del activador del factor de crecimiento de hepatocitos para usar en la modulación de la angiogénesis y la cardiovascularización.
Antecedentes de la invención Campo de la invención
La presente invención se refiere a composiciones y a procedimientos útiles para promover o inhibir la angiogénesis y/o cardiovascularización en mamíferos que necesiten dicho efecto biológico. Esto incluye el diagnóstico y tratamiento de enfermedades cardiovasculares, así como de trastornos oncológicos.
Descripción de los antecedentes A. Trastornos y factores cardiacos
La insuficiencia cardiaca afecta a aproximadamente 5 millones de estadounidenses y cada año hay 400.000 casos nuevos de insuficiencia cardiaca. Es la causa más frecuente de hospitalización de personas mayores de 65 años en Estados Unidos. Los avances recientes en el tratamiento de las enfermedades cardiacas agudas, incluyendo el infarto de miocardio, dan como resultado una población creciente de pacientes que con el tiempo desarrollarán insuficiencia cardiaca crónica. Desde 1979 a 1995 las hospitalizaciones por insuficiencia cardiaca congestiva (ICC) aumentaron de 377.000 a 872.000 (130 por ciento de aumento) y las muertes por ICC aumentaron 116 por ciento.
La ICC es un síndrome caracterizado por la disfunción ventricular izquierda, tolerancia al ejercicio reducida, calidad de vida deteriorada, y un notable acortamiento de la esperanza de vida. La característica fundamental de la insuficiencia cardiaca es una incapacidad del corazón para bombear sangre a una velocidad suficiente para satisfacer las necesidades metabólicas de los tejidos del cuerpo (en otras palabras, hay un rendimiento cardiaco insuficiente).
Al menos 4 mecanismos compensadores principales se activan en el contexto de la insuficiencia cardiaca para reforzar el rendimiento cardiaco, incluyendo la vasoconstricción periférica, aumento de la frecuencia cardiaca, aumento de la contractilidad cardiaca y aumento del volumen plasmático. Estos efectos son mediados principalmente por el sistema nervioso simpático y el sistema de renina-angiotensina. Véase Eichhorn, American Journal of Medecine, 104: 163-169 (1998). El rendimiento mayor del sistema nervioso simpático aumenta el tono vascular, la frecuencia cardiaca y la contractilidad. La angiotensina II eleva la presión sanguínea mediante 1) estimulación directa de la contracción del músculo liso vascular, 2) promoción de la expansión del volumen del plasma, por estimulación de la secreción de aldosterona y la hormona antidiurética, 3) estimulación del tono vascular mediado por el sistema simpático, y 4) catálisis de la degradación de la bradiquinina, que tiene una actividad vasodilatadora y natriurética. Véase, la revisión de Brown y Vaughan, Circulation. 97: 1411-1420 (1998). Como se indica más adelante, la angiotensina II puede tener también efectos perjudiciales directamente en el corazón al promover la necrosis de miocitos (deterioro de la función sistólica) y fibrosis intracardiaca (deterioro de la función diastólica y en algunos casos sistólica). Véase, Weber, Circulation, 96: 4065-4082 (1997).
Una característica constante de la insuficiencia cardiaca congestiva (ICC) es la hipertrofia cardiaca, un agrandamiento del corazón, que es activado tanto por estímulos mecánicos como hormonales y permite que el corazón se adapte a demandas de mayor rendimiento cardiaco. Morgan y Baker, Circulation, 83: 13-25 (1991). Esta respuesta hipertrófica se asocia con frecuencia a una variedad de diferentes afecciones patológicas tales como hipertensión, estenosis aórtica, infarto de miocardio, cardiomiopatía, regurgitación valvular, y derivación intracardiaca, las cuales dan todas como resultado sobrecarga hemodinámica crónica.
La hipertrofia se define, en general, como un aumento del tamaño de un órgano o estructura independiente del crecimiento natural, que no implica la formación de tumor. La hipertrofia del corazón se debe a un aumento de la masa de las células individuales (miocitos) o a un aumento del número de células que constituyen el tejido (hiperplasia), o a ambos. Aunque el agrandamiento de un corazón embrionario depende en gran medida del número de miocitos (que continua hasta poco después del nacimiento), los miocitos cardiacos post-natales pierden su capacidad proliferativa. Se produce un aumento adicional por la hipertrofia de las células individuales.
La hipertrofia de miocitos en el adulto inicialmente es beneficiosa como una respuesta a corto plazo para la función cardiaca deteriorada, permitiendo una disminución de la carga de las fibras musculares individuales. Sin embargo, con una sobrecarga grave prolongada, las células hipertrofiadas empiezan a deteriorarse y mueren. Katz, "Heart Failure", en: Katz A.M. ed., Physiology of the Heart (New York: Raven Press, 1992) pág. 638-668. La hipertrofia cardiaca es un factor de riesgo importante tanto para la mortalidad como la morbilidad en el transcurso clínico de la insuficiencia cardiaca. Katz, Trends Cardiovasc. Med., 5: 37-44 (1995). Para más detalles de las causas y la patología de la hipertrofia cardiaca, véase, por ejemplo, Heart Disease. A Textbook of Cardiovascular Medicine, Braunwald, E. ed. (W.B. Saunders Co., 1988), Capítulo 14, "Pathophysiology of Heart Failure".
A nivel celular, el corazón está compuesto de miocitos y células de soporte que los rodean, llamadas de forma genérica células no miocíticas. Aunque las células no miocíticas son principalmente fibroblastos/células mesenquimales, también incluyen células endoteliales y musculares lisas. Realmente, aunque los miocitos componen la mayor parte de la masa miocárdica del adulto, representan solo aproximadamente 30% del número de células totales presentes en el corazón. En respuesta a estímulos hormonales, fisiológicos, hemodinámicos y patológicos, las células musculares ventriculares en el adulto se pueden adaptar para mayores cargas de trabajo a través de la activación de un proceso hipertrófico. Esta respuesta se caracteriza por un aumento del tamaño de las células miocíticas y contenido de proteínas contráctiles de células musculares cardiacas individuales, sin división celular concomitante y activación de genes embrionarios, incluyendo los genes del péptido natriurético auricular (ANP). Chien y col., FASEB J., 5: 3037-3046 (1991); Chien y col., Annu. Rev. Physiol., 55: 77-95 (1993). Se ha descrito un aumento de la masa miocárdica como resultado de un aumento del tamaño de los miocitos, que está asociado con una acumulación del colágeno intersticial dentro de la matriz extracelular y alrededor de las arterias coronarias intramiocárdicas, en la hipertrofia ventricular izquierda secundaria a la sobrecarga de presión en seres humanos. Caspari y col., Cardiovasc. Res., 11: 554-558 (1977); Schwarz y col., Am. J. Cardiol., 42: 895-903 (1978); Hess y col., Circulation, 63: 360-371 (1981); Pearlman y col., Lab. Invest., 46: 158-164(1982).
También se ha sugerido que además los factores paracrinos producidos por células de soporte no miocíticas pueden estar implicados en el desarrollo de la hipertrofia cardiaca, y se han identificado diferentes factores hipertróficos derivados de células no miocíticas, tales como factor inhibidor de leucocitos (LIF) y endotelina. Metcalf, Growth Factors, 7: 169-173 (1992); Kurzrock y col., Endocrine Reviews, 12: 208-217 (1991); Inoue y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 2863-2867 (1989); Yanagisawa y Masaki, Trends Pharm. Sci., 10: 374-378 (1989); patente de EE.UU. nº 5.573.762 (presentada el 12 de noviembre, 1996). Los factores de ejemplo adicionales que se han identificado como potenciales mediadores en la hipertrofia cardiaca, incluyen cardiotrofina-1 (CT-1) (Pennica y col., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 92: 1142-1146 (1995)), catecolaminas, adrenocorticosteroides, angiotensina y prostaglandinas.
Actualmente, el tratamiento de la hipertrofia cardiaca varía dependiendo de la enfermedad cardiaca subyacente. Las catecolaminas, adrenocorticosteroides, angiotensina, prostaglandinas, LIF, endotelina (incluyendo endotelina-1, 2 y 3 y big endotelina), y CT-1 están entre los factores identificados como potenciales mediadores de la hipertrofia. Por ejemplo, los fármacos bloqueadores del receptor beta adrenérgico (beta bloqueadores, p. ej., propranolol, timolol, tertalolol, carteolol, nadolol, betaxolol, penbutolol, acetobutolol, atenolol, metoprotol, carvedilol, etc.) y verapamilo, se han usado ampliamente en el tratamiento de la cardiomiopatía hipertrófica. Los efectos beneficiosos de los beta bloqueadores en los síntomas (p. ej., dolor en el pecho) y tolerancia al ejercicio, se deben en gran medida a una disminución de la frecuencia cardiaca con la consiguiente prolongación de la diástole y aumento del llenado ventricular pasivo. Thompson y col., Br. Heart J., 44:488-98 (1980); Harrison y col., Circulation, 29:84-98 (1964). Se ha descrito que el verapamilo mejora el llenado ventricular y probablemente reduce la isquemia miocárdica Bonow y col., Circulation, 72:853-64(1985).
También se han usado ocasionalmente en el tratamiento de la cardiomiopatía hipertrófica nifedipina y diltiazem. Lorell y col., Circulation, 65: 499-507 (1982); Betocchi y col., Am. J. Cardiol., 78: 451-457 (1996). Sin embargo, debido a sus potentes propiedades vasodilatadoras, la nifedepina puede ser perjudicial en pacientes con obstrucción en el flujo de salida. Se ha usado la disopiramida para aliviar síntomas en virtud de sus propiedades inotrópicas negativas. Pollick, N. Engl. J. Med., 307: 997-999 (1982). Sin embargo, en muchos pacientes, los efectos beneficiosos iniciales disminuyen con el tiempo. Wigle y col., Circulation, 92:1680-1692(1995). Se ha descrito que la terapia con fármacos hipertensores tiene efectos beneficiosos en la hipertrofia asociada con la hipertensión. Los ejemplos de fármacos usados en la terapia hipertensora, solos o en combinación, son antagonistas del calcio, p. ej., nitrendipina; agentes bloqueadores del receptor adrenérgico, p. ej., los listados antes; inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina (ACE) tales como quinapril, captopril, enalapril, ramipril, benazepril, fosinopril, y lisinopril; diuréticos, p. ej., clorotiazida, hidroclorotiazida, hidroflumetazida, metilclotiazida, benztiazida, diclorfenamida, acetazolamida e indapamida; y bloqueadores de canales de calcio, p. ej., diltiazem, nifedipina, verapamilo y nicardipina.
Por ejemplo, el tratamiento de la hipertensión con diltiazem y captopril mostró una disminución de la masa muscular ventricular izquierda, pero los índices de Doppler de la función diastólica no se normalizaron. Szlachcic y col., Am. J. Cardiol., 63:198-201 (1989); Shahi y col., Lancet, 336: 458-461(1990). Se interpretó que estos descubrimientos indicaban que podían quedar cantidades excesivas de colágeno intersticial después del retroceso de la hipertrofia ventricular izquierda. Rossi y col., Am. Heart J., 124: 700-709 (1992). Rossi y col., véase antes, investigaron el efecto del captopril para prevenir e invertir la hipertrofia de las células miocárdicas y la fibrosis intersticial en la hipertrofia cardiaca por sobrecarga de presión, en ratas experimentales.
Inicialmente se pensó que los agentes que aumentan la contractilidad cardiaca directamente (agentes inotrópicos) eran beneficiosos en pacientes con insuficiencia cardiaca porque mejoraba el rendimiento cardiaco a corto plazo. Sin embargo, se ha encontrado que todos los agentes inotrópicos positivos excepto la digoxigenina, dan como resultado mayor mortalidad a largo plazo, en lugar de mejoras en el rendimiento cardiaco a corto plazo. Massie, Curr. Op. in Cardiology, 12: 209-217 (1997); Reddy y col., Curr. Opin. Cardiol., 12:233-241(1997). Recientemente se han recomendado los bloqueadores de receptores beta adrenérgicos para usar en la insuficiencia cardiaca. Las pruebas de los ensayos clínicos sugieren que se pueden lograr mejoras en la función cardiaca sin aumentar la mortalidad, aunque todavía no se han demostrado mejoras documentadas de supervivencia de pacientes. Véanse también, las patentes de EE.UU. nº 5.935.924, 5.624.806; 5.661.122; y 5.610.134 y WO 95/28173, en relación con el uso de cardiotropina-1 o antagonistas de la misma, o la hormona del crecimiento y/o factor de crecimiento I de tipo insulina, en el tratamiento de la ICC. Otra modalidad de tratamiento es el transplante de corazón, pero este está limitado por la disponibilidad de corazones de donantes.
La endotelina es un péptido vasoconstrictor que comprende 21 aminoácidos, aislados del líquido sobrenadante de cultivo endotelial arterial de cerdo y está determinado estructuralmente. Yanagisawa y col., Nature, 332: 411-415 (1988). Más tarde, se encontró que la endotelina presentaba diferentes acciones, y se ha demostrado que los anticuerpos de endotelina como los antagonistas de endotelina son eficaces en el tratamiento del infarto de miocardio, insuficiencia renal y otras enfermedades. Puesto que la endotelina está presente en los cuerpos vivos y presenta acción vasoconstrictora, se espera que sea un factor endógeno implicado en la regulación del sistema circulatorio, y puede estar asociada con la hipertensión, enfermedades cardiovasculares tales como el infarto de miocardio y enfermedades renales, tales como la insuficiencia renal aguda. Se describen antagonistas de la endotelina, por ejemplo, en la patente de EE.UU. 5.773.414; publicación de patente JP 3130299/1991, EP 457.195; EP 460.679; y EP 552,489. Se describe un nuevo receptor de endotelina B para identificar antagonistas del receptor de endotelina en la patente de EE.UU. nº 5.773.223.
La terapia actual para la insuficiencia cardiaca se dirige principalmente al uso de inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina (ACE), tales como captopril, y diuréticos. Estos fármacos mejoran el perfil hemodinámico y la tolerancia al ejercicio y reducen la incidencia de la morbilidad y mortalidad en pacientes con ICC. Kramer y col., Circulation, 67(4): 807-816 (1983); Captopril Multicenter Research Group, J.A.C.C., 2(4): 755-763 (1983); The CONSENSUS Trial Study Group, N. Engl. J. Med., 316(23): 1429-1435 (1987); The SOLVD Investigators, N. Engl. J. Med., 325(5): 293-302 (1991). Además, son útiles para tratar la hipertensión, disfunción ventricular izquierda, enfermedad vascular aterosclerótica y nefropatía diabética. Brown y Vaughan, véase antes. Sin embargo, a pesar de la eficacia probada, la respuesta a los inhibidores de ACE ha sido limitada. Por ejemplo, aunque prolongan la supervivencia en el marco de la insuficiencia cardiaca, parece que los inhibidores de ACE ralentizan el avance hacia la etapa final de la insuficiencia cardiaca, y un número sustancial de pacientes en tratamiento con inhibidores de ACE tienen insuficiencia cardiaca funcional de clase III.
Además, la mejora de la capacidad funcional y del tiempo de ejercicio es solo pequeña, y aunque la mortalidad se reduce, sigue siendo alta. The CONSENSUS Trial Study Group, N. Engl. J. Med., 316(23): 1429-1453 (1987); The SOLVD Investigators, N. Engl. J. Med., 325(5): 293-302 (1991); Cohn y col., N. Engl. J. Med., 325(5): 303-310 (1991); The Captopril-Digoxin Multicenter Research Group, JAMA, 259(4):539-544(1988). Por lo tanto, de forma consistente parece que los inhibidores de ACE no pueden aliviar los síntomas en más del 60% de los pacientes con insuficiencia cardiaca y reducen la mortalidad en la insuficiencia cardiaca solo aproximadamente 15-20%. Para otros efectos adversos, véase Brown y Vaughan, véase antes.
Una alternativa a los inhibidores de ACE está representada por los antagonistas del receptor AT1. Los estudios clínicos se planifican para comparar la eficacia de estas dos modalidades en el tratamiento de la enfermedad cardiovascular y renal. Sin embargo, los datos de modelos animales sugieren que la ruta de ACE/Ang II, aunque está claramente implicada en la hipertrofia cardiaca, no es la única, ni siquiera la principal ruta activa en esta función. Se han hecho modelos de ratones "genéticamente desactivados" para ensayar componentes individuales de la ruta. En uno de dichos modelos, el receptor cardiaco primario para la Ang II, AT sub 1A, se ha eliminado genéticamente; estos ratones no desarrollan hipertrofia cuando se les administra Ang II experimentalmente (confirmando el éxito básico del modelo en la eliminación de la hipertrofia secundaria a la Ang II). Sin embargo, cuando la aorta está contraída en estos animales (un modelo de estrés cardiaco hipertensor), los corazones todavía se vuelven hipertróficos. Esto sugiere que en la hipertensión se activan rutas de señalización alternativas que no dependen de este receptor (AT sub 1A). Los inhibidores de ACE probablemente no son capaces de inhibir estas rutas. Véase, Harada y col., Circulation, 97: 1952-1959 (1998). Véase también, Homcy, Circulation, 97: 1890-1892 (1998), en relación al enigma asociado con el proceso y mecanismo de la hipertrofia cardiaca.
Aproximadamente 750.000 pacientes, padecen infarto agudo de miocardio (IAM) anualmente, y aproximadamente una cuarta parte de las muertes en Estados Unidos se debe al IAM. En años recientes, los agentes trombolíticos, p. ej. estreptoquinasa, uroquinasa y en particular el activador de plasminógeno tisular (t-PA) han aumentado significativamente la supervivencia de pacientes que padecen infarto de miocardio. Cuando se administra en forma de infusión intravenosa a lo largo de 1,5 a 4 horas, el t-PA produce permeabilidad coronaria a los 90 minutos en 69% a 90% de los pacientes tratados. Topol y col., Am. J. Cardiol., 61: 723-728 (1988); Neuhaus y col., J. Am. Coll. Cardiol., 12: 581-587 (1988); Neuhaus y col., J. Am. Coll. Cardiol., 14: 1566-1569 (1989). Las mayores tasas de permeabilidad se han descrito con dosis alta o regímenes de dosificación acelerados. Topol, J. Am. Coll. Cardiol., 15: 922-924 (1990). El t-PA también se puede administrar en forma de un solo bolo, aunque debido a su semivida relativamente corta, es más adecuado para terapia por infusión. Tebbe y col., Am. J. Cardiol., 64: 448-453 (1989). Una variante del t-PA, diseñada específicamente para tener una semivida más larga y una especificidad muy alta por la fibrina, TNK t-PA (una variante de tPA T103N, N117Q, KHRR(296-299)AAAA, Keyt y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:3670-3674 (1994)) es particularmente adecuada para la administración de bolo. Sin embargo, a pesar de todos estos avances, el pronóstico a largo plazo de la supervivencia del paciente depende en gran medida del seguimiento después de infarto y del tratamiento de los pacientes, que debe incluir el seguimiento y tratamiento de la hipertrofia cardiaca.
B. Factores de crecimiento
Varios polipéptidos naturales descritos inducen la proliferación de células endoteliales. Entre estos polipéptidos están los factores de crecimiento de fibroblastos ácidos y básicos (FGF) (Burgess y Maciag, Annual Rev. Biochem., 58: 575 (1989)), factor de crecimiento de células endoteliales derivado de plaquetas (PD-ECGF) (Ishikawa y col., Nature, 338: 557 (1989)), y factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF). Leung y col., Science, 246: 1306 (1989); Ferrara y Henzel, Biochem. Biophys. Res. Commun., 161: 851 (1989); Tischer y col., Biochem. Biophys. Res. Commun., 165: 1198 (1989); EP 471.754B concedido el 31 de julio, 1996.
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Los medios condicionados por células transfectadas con el ADNc de VEGF humano (hVEGF) promovían la proliferación de células endoteliales capilares, mientras que las células de control no lo hacían. Leung y col., Science, 246: 1306 (1989). Se identificaron varios ADNc adicionales en las genotecas de ADNc que codifican las isoformas de 121, 189 y 206 aminoácidos de hVEGF (también denominadas colectivamente proteínas relacionadas con hVEGF). La proteína de 121 aminoácidos difiere de hVEGF por la deleción de los 44 aminoácidos entre los restos 116 y 159 en el hVEGF. La proteína de 189 aminoácidos difiere de hVEGF por la inserción de 24 restos de aminoácidos en el resto 116 en el hVEGF, y aparentemente es idéntica al factor de permeabilidad vascular humano (hVPF). La proteína de 206 aminoácidos difiere del hVEGF por una inserción de 41 aminoácidos en el resto 116 en hVEGF. Houck y col., Mol. Endocrin., 5: 1806(1991); Ferrara y col., J. Cell. Biochem., 47: 211 (1991); Ferrara y col., Endocrine Reviews, 13: 18 (1992); Keck y col., Science, 246: 1309 (1989); Connolly y col., J. Biol. Chem., 264: 20017 (1989); EP 370.989 publicado el 30 de mayo, 1990.
Ahora está bien establecido que la angiogénesis, que implica la formación de vasos sanguíneos nuevos a partir de endotelio preexistente, está implicada en la patogénesis de una variedad de trastornos. Estos incluyen tumores sólidos y metástasis, aterosclerosis, fibroplasia retrolental, hemangiomas, inflamación crónica, síndromes neovasculares intraoculares tales como retinopatías proliferativas, p. ej., retinopatía diabética, degeneración macular relacionada con la edad (AMD), glaucoma neovascular, rechazo inmunitario de tejido córneo transplantado y otros tejidos, artritis reumatoide, y psoriasis. Folkman y col, J. Biol. Chem., 267: 10931-10934(1992); Klagsbrun y col., Annu. Rev. Physiol., 53: 217-239 (1991); y Garner A., "Vascular diseases", en: Pathobiology of Ocular Disease, A Dynamic Approach, Garner A., Klintworth GK, eds., 2ª edición (Marcel Dekker, NY, 1994), pp 1625-1710.
En el caso de crecimiento tumoral, parece que la angiogénesis es crucial para la transición desde la hiperplasia a la neoplasia, y para proporcionar los nutrientes al tumor sólido en crecimiento. Folkman y col., Nature, 339: 58 (1989). La neovascularización permite que las células tumorales adquieran una ventaja de crecimiento y autonomía proliferativa comparadas con las células normales. Por consiguiente, se ha observado una correlación entre la densidad de los microvasos en secciones tumorales y la supervivencia de pacientes en el cáncer de mama, así como en varios otros tumores. Weidner y col, N. Engl. J. Med, 324: 1-8 (1991); Horak y col., Lancet, 340: 1120-1124(1992); Macchiarini y col., Lancet, 340: 145-146(1992).
La búsqueda de reguladores positivos de la angiogénesis ha dado muchos candidatos, que incluyen aFGF, bFGF, TGF-\alpha, TGF-\beta, factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), TNF-\alpha, angiogenina, IL-8, etc. Folkman y col., J.B.C., véase antes, y Klagsbrun y col., véase antes. Los reguladores negativos identificados hasta ahora incluyen trombospondina (Good y col., Prog. Natl. Acad. Sci. USA., 87: 6624-6628 (1990)), el fragmento N-terminal de 16 kilodalton de la prolactina (Clapp y col., Endocrinology, 133: 1292-1299 (1993)), angiostatina (O'Reilly y col., Cell, 79: 315-328 (1994)), y endostatina. O'Reilly y col., Cell, 88: 277-285 (1997).
El trabajo hecho en los últimos años, ha establecido la función del VEGF no solo en la estimulación de la proliferación de células endoteliales vasculares, sino también en la inducción de la permeabilidad vascular y angiogénesis. Ferrara y col., Endocr. Rev., 18: 4-25 (1997). El descubrimiento de que la pérdida de incluso un solo alelo de VEGF da como resultado la letalidad embrionaria, señala que este factor tiene una función irremplazable en el desarrollo y diferenciación del sistema vascular. Además, se ha mostrado que el VEGF es un mediador clave de la neovascularización asociado con tumores y trastornos intraoculares. Ferrara y col., Endocr. Rev., véase antes. El ARNm de VEGF es coexpresado por la mayoría de los tumores humanos examinados. Berkman y col., J. Clin. Invest., 91:153-159 (1993); Brown y col., Human Pathol., 26: 86-91 (1995); Brown y col., Cancer Res., 53: 4727-4735 (1993); Mattern y col., Brit. J. Cancer, 73:931-934 (1996); Dvorak y col., Am. J. Pathol., 146:1029-1039 (1995).
Además, los niveles de concentración de VEGF en los fluidos del ojo están muy correlacionados con la presencia de la proliferación activa de los vasos sanguíneos en pacientes con retinopatías diabéticas y otras retinopatías relacionadas con isquemia. Aiello y col., N. Engl. J. Med., 331: 1480-1487 (1994). Además, estudios recientes han demostrado la localización de VEGF en membranas neovasculares coroidales en pacientes afectados de AMD. Lopez y col., Invest. Ophtalmol. Vis. Sci., 37: 855-868 (1996).
Los anticuerpos neutralizantes anti-VEGF suprimen el crecimiento de una variedad de líneas celulares tumorales humanas en ratones carentes de sistema inmune (Kim y col, Nature, 362: 841-844 (1993); Warren y col, J. Clin. Invest., 95: 1789-1797 (1995); Borgström y col., Cancer Res., 56: 4032-4039 (1996); Melnyk y col., Cancer Res., 56: 921-924 (1996)), y también inhiben la angiogénesis intraocular en modelos de trastornos retinales isquémicos. Adamis y col., Arch. Ophthalmol., 114: 66-71 (1996). Por lo tanto, los anticuerpos monoclonales anti-VEGF u otros inhibidores de la acción de VEGF son candidatos prometedores para el tratamiento de tumores sólidos y diferentes enfermedades neovasculares intraoculares. Dichos anticuerpos se describen, por ejemplo, en el documento EP 817.648 publicado el 14 de enero, 1998, y en los documentos WO98/45331 y WO98/45332 ambos publicados el 15 de octubre, 1998.
Existen varios otros factores de crecimiento y mitógenos, incluyendo oncogenes transformantes, que son capaces de inducir rápidamente un conjunto complejo de genes para ser expresados por determinadas células. Lau and Nathans, Molecular Aspects of Cellular Regulation, 6: 257-293 (1991). Estos genes, que se han denominado genes de respuesta tempranos o tempranos inmediatos, son activados transcripcionalmente en los siguientes minutos después del contacto con un factor de crecimiento o mitógeno, independiente de la síntesis de proteína nueva. Un grupo de estos genes tempranos inmediatos codifica proteínas extracelulares secretadas que son necesarias para la coordinación de procesos biológicos complejos tales como diferenciación y proliferación, regeneración y curación de heridas. Ryseck y col., Cell Growth Differ., 2: 225-233 (1991).
Las proteínas muy relacionadas que pertenecen a este grupo incluyen cef 10 (Simmons y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1178-1182 (1989)), cyr 61, que es activada rápidamente por el factor de crecimiento derivado de plaquetas o suero (PDGF) (O'Brien y col., Mol. Cell Biol., 10: 3569-3577 (1990), factor de crecimiento de tejido conjuntivo humano (CTGF) (Bradham y col., J. Cell. Biol., 114: 1285-1294 (1991)), que es secretado por células endoteliales vasculares humanas con niveles altos después de la activación con el factor de crecimiento transformante beta (TGF-\beta), presenta actividades inmunológicas y biológicas de tipo PDGF, y compite con PDGP por un receptor de superficie celular particular, fisp-12 (Ryseck y col., Cell Growth Differ., 2: 225-233 (1991)), factor de crecimiento vascular humano de tipo IBP (VIGF) (documento WO 96/17931), y nov, normalmente detenida en las células de riñón adulto, que se encontró que era sobreexpresada en nefroblastomas inducidos por virus de tipo 1 asociado a mieloblastosis. Joloit y col., Mol. Cell. Biol., 12: 10-21 (1992).
La expresión de estos genes tempranos inmediatos actúa como "terceros mensajeros" en la cascada de sucesos desencadenados por factores de crecimiento. También se cree que son necesarios para integrar y coordinar procesos biológicos complejos, tales como la diferenciación y la curación de heridas en los que la proliferación celular es un suceso común.
Como mitógenos adicionales, se ha mostrado que las proteínas de unión al factor de crecimiento de tipo insulina (IGFBP) en complejo con el factor de crecimiento de tipo insulina (IGF), estimula la mayor unión de IGF a fibroblastos y receptores de la superficie de células musculares lisas. Clemmons y col., J. Clin. Invest., 77: 1548 (1986). Los efectos inhibidores de IGFBP sobre diferentes acciones del IGF in vitro incluyen la estimulación del transporte de glucosa por adipocitos, incorporación de sulfato por condroicitos e incorporación de timidina en fibroblastos. Zapf y col., J. Clin. Invest., 63: 1077 (1979). Además, se han mostrado efectos inhibidores de los IGFBP en la actividad de mitógenos mediada por factores de crecimiento en las células normales.
Se ha publicado que otro mitógeno importante, el factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), funciona como un mitógeno completo para los hepatocitos en cultivo primario y tiene una función fisiológica en la regeneración hepática, tanto en seres humanos como en roedores (para una revisión véase, Michalopoulos, G., FASEB, 4:176-187 (1990)). Más recientemente, se ha mostrado que el factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) es un mitógeno para una variedad de tipos de células incluyendo melanocitos, células tubulares renales, queratinocitos, algunas células endoteliales y células de origen epitelial (Igawa y col., Biochem. Biophys. Res. Commun., 174:831-838 (1991): Kan y col., Biochem. Biophys. Res. Commun., 174:331 -337 (1991); Matsumoto y col., Biochem. Biophys. Res. Commun., 176:45-51 (1991); Rubin y col., Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A., 88:415-419 (1991)). El factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) también puede actuar como un "factor de dispersión", una actividad que promueve la disociación de células epiteliales y endoteliales vasculares in vitro (Stroker y col., Nature, 327:239-242 (1987); Weidner y col., J. Cell. Biol., 111:2097-2108 (1990); Naldini y col., EMBO J., 10:2867-2878 (1991a)). Además, el factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) se ha descrito como un morfógeno epitelial (Montesano y col., Cell, 67:901-908 (19991)). Por lo tanto, se ha postulado que el HGF es importante en la invasión tumoral y en el desarrollo embrionario el HGF es una glicoproteína de unión a heparina derivada de células mesenquimales, que es secretado de células productoras como un precursor de una cadena inactivo, y normalmente permanece en esta forma, probablemente asociado con la matriz extracelular en los tejidos productores. En respuesta al daño tisular, tal como lesión hepática y renal, la forma de cadena sencilla inactiva se convierte en una molécula heterodímera activada exclusivamente en el tejido lesionado por la proteolisis limitada en un solo sitio. Miyazawa y col., J. Biol. Chem., 269: 8966-8970 (1994). Debido a que HGF es un potente mitógeno para una variedad de células tales como los hepatocitos y las células epiteliales tubulares renales, el HGF activado de forma proteolítica puede estar implicado en la regeneración del tejido lesionado. Gohda y col., J. Clin. Invest., 81: 414-419 (1988); Igawa y col. Biochem. Biophys. Res. Commun., 174: 831-838 (1991), y Rubin y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 88: 415-419 (1991). El potencial de activación del activador de HGF se puede neutralizar por la actividad de un inhibidor derivado de tejido conocido como HAI o inhibidor del activador del HGF. El documento EP 0759467 describe el aislamiento del inhibidor del activador del factor de crecimiento de hepatocitos. Es necesaria la caracterización de HAI en tejidos dañados para entender los mecanismos de regulación de la activación del HGF. Shimomura y col., J. Biol. Chem., 272:6370-6376 (1997). Además, los agonistas del inhibidor del activador del HGF (HAI) pueden tener una función en la inhibición de la angiogénesis y pueden ser útiles para tratar tumores sólidos mediante la supresión del crecimiento del tumor humano. Además, los antagonistas del inhibidor del activador del HGF (HAI) pueden tener una función en promover la angiogénesis o reparación tisular y por lo tanto pueden ser importantes para la revascularización terapéutica en la enfermedad vascular periférica, en el daño hepático o renal, o en indicaciones de reestenosis.
C. Necesidad de tratamientos adicionales
En vista de la función del factor celular endotelial vascular y la angiogénesis en muchas enfermedades y trastornos, es deseable tener un medio para reducir o inhibir uno o más de los efectos biológicos que producen estos procesos. También es deseable tener un medio para ensayar la presencia de polipéptidos patógenos en afecciones normales y patológicas, y en especial el cáncer. Además, en un aspecto específico, puesto que no hay una terapia aplicable en general para el tratamiento de la hipertrofia cardiaca, la identificación de factores que pueden prevenir o reducir la hipertrofia de miocitos cardiacos tiene una importancia primordial en el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas para inhibir el crecimiento cardiaco fisiopatológico. Aunque hay varias modalidades de tratamiento para diferentes trastornos cardiovasculares y oncológicos, todavía son necesarios enfoques terapéuticos adicionales.
Resumen de la invención A. Realizaciones
Por consiguiente, la presente invención se refiere a composiciones y a procedimientos para promover o inhibir la angiogénesis y/o cardiovascularización en mamíferos. La presente invención se basa en la identificación de un nuevo inhibidor polipeptídico del activador del factor de crecimiento de hepatocitos denominado en el presente documento PRO256. Por consiguiente, se cree que el inhibidor proteico y los agonistas o antagonistas del mismo, son fármacos útiles para el diagnóstico y/o tratamiento (incluyendo prevención) de trastornos en los que se desean dichos efectos, tales como la promoción o inhibición de la angiogénesis, inhibición o estimulación del crecimiento de células endoteliales vasculares, estimulación del crecimiento o proliferación de células endoteliales vasculares, inhibición de crecimiento tumoral, inhibición del crecimiento de tejido dependiente de angiogénesis, o estimulación del crecimiento de tejido dependiente de angiogénesis.
En una realización, la presente invención proporciona usos médicos de una composición que comprende un polipéptido PRO256 mezclado con un vehículo farmacéuticamente aceptable según se define en las reivindicaciones. En un aspecto, la composición comprende una cantidad terapéuticamente eficaz del polipéptido. En otro aspecto, la composición comprende un principio activo adicional, en concreto, un agente cardiovascular, endotelial o angiostático, preferiblemente un agente angiogénico o angiostático. Preferiblemente, la composición es estéril. El polipéptido PRO256 se puede administrar en forma de una formulación farmacéutica líquida, que se puede conservar para lograr una estabilidad prolongada en el almacenamiento. Las formulaciones farmacéuticas líquidas conservadas pueden contener múltiples dosis del polipéptido PRO256, y por lo tanto, pueden ser adecuadas para el uso repetido.
Un procedimiento para preparar dicha composición útil para el tratamiento de un trastorno cardiovascular, endotelial o angiogénico comprende mezclar una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido PRO256 con un vehículo farmacéuticamente aceptable como se describe en el presente documento. Preferiblemente el trastorno cardiovascular, endotelial o angiogénico es un tumor.
En otra realización, la presente invención proporciona usos médicos de una composición que comprende un agonista o antagonista de un polipéptido PRO256, mezclado con un vehículo farmacéuticamente aceptable según se define en las reivindicaciones. El agonista o antagonista de un polipéptido PRO256 es un anticuerpo anti-PRO256 o un oligonucleótido antisentido. En un aspecto, la composición comprende una cantidad terapéuticamente eficaz del agonista o antagonista. En otro aspecto, la composición comprende un principio activo adicional, en concreto un agente cardiovascular, endotelial o angiogénico o un agente angiostático, preferiblemente un agente angiogénico o angiostático. Preferiblemente, la composición es estéril. El agonista o antagonista del polipéptido PRO256 se puede administrar en forma de una formulación farmacéutica líquida, que se puede conservar para lograr una estabilidad prolongada en el almacenamiento. Las formulaciones farmacéuticas líquidas conservadas pueden contener múltiples dosis de un agonista o antagonista del polipéptido PRO256, y por lo tanto, pueden ser adecuadas para el uso repetido.
Un procedimiento para preparar dicha composición útil para el tratamiento de un trastorno cardiovascular, endotelial o angiogénico, comprende mezclar cantidades terapéuticamente eficaces de un polipéptido PRO256 o agonista o antagonista del mismo, con un vehículo farmacéuticamente aceptable como se describe en el presente documento. Preferiblemente, el trastorno cardiovascular, endotelial o angiogénico es un tumor.
En otra realización más, la presente invención se refiere a usos médicos de una composición que comprende un anticuerpo anti-PRO256 mezclado con un vehículo farmacéuticamente aceptable según se define en las reivindicaciones. En un aspecto, la composición comprende una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo. En otro aspecto, la composición comprende un principio activo adicional, en concreto un agente cardiovascular, endotelial o angiogénico o un agente angiostático, preferiblemente un agente angiogénico o angiostático. Preferiblemente, la composición es estéril. La composición se puede administrar en forma de una formulación farmacéutica líquida, que puede estar conservada para lograr una estabilidad prolongada en el almacenamiento. Las formulaciones farmacéuticas líquidas conservadas pueden contener múltiples dosis de un anticuerpo anti-PRO256, y por lo tanto, pueden ser adecuadas para el uso repetido. En realizaciones preferidas, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, un fragmento de anticuerpo, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo monocatenario.
Un procedimiento para preparar dicha composición útil para el tratamiento de un trastorno cardiovascular, endotelial o angiogénico comprende mezclar una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo anti-PRO256 con un vehículo farmacéuticamente aceptable como se describe en el presente documento. Preferiblemente, el trastorno cardiovascular, endotelial o angiogénico es un tumor.
En otra realización, la presente invención proporciona un procedimiento para identificar un agonista de un polipéptido PRO256, que comprende:
(a) poner en contacto células y un compuesto de ensayo que se va a cribar en condiciones adecuadas para inducir una respuesta celular inducida normalmente por un polipéptido PRO256; y
(b) determinar la inducción de dicha respuesta celular, para determinar si el compuesto de ensayo es un agonista eficaz, en el que la inducción de dicha respuesta celular es indicativa de que dicho compuesto de ensayo es un agonista eficaz, según se define en las reivindicaciones.
En otra realización, la presente invención proporciona un procedimiento para identificar un agonista de un polipéptido PRO256, que comprende:
(a) poner en contacto células y un compuesto de ensayo que se va a cribar en condiciones adecuadas para estimular la proliferación celular por un polipéptido PRO256; y
(b) medir la proliferación de dichas células para determinar si el compuesto de ensayo es un agonista eficaz, en el que la inhibición de la proliferación celular es indicativa de que dicho compuesto de ensayo es un agonista eficaz.
En otra realización, la invención proporciona un procedimiento para identificar un compuesto que inhibe la actividad de un polipéptido PRO256, que comprende poner en contacto un compuesto de ensayo con un polipéptido PRO256 en condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir que el compuesto de ensayo y el polipéptido interaccionen, y determinar si la actividad del polipéptido PRO256 es inhibida según se define en las reivindicaciones. En un aspecto preferido específico, el compuesto de ensayo o el polipéptido PRO256 se inmovilizan sobre un soporte sólido. En otro aspecto preferido, el componente no inmovilizado lleva un marcador detectable. En un aspecto preferido, este procedimiento comprende las etapas de:
(a) poner en contacto células y un compuesto de ensayo que se va a cribar en presencia de un polipéptido PRO256 en condiciones adecuada para inducir una respuesta celular normalmente inducida por un polipéptido PRO256; y
(b) determinar la inducción de dicha respuesta celular para determinar si el compuesto de ensayo es un antagonista eficaz.
En otro aspecto preferido, este procedimiento comprende las etapas de:
(a) poner en contacto células y un compuesto de ensayo que se va a cribar en presencia de un polipéptido PRO256 en condiciones adecuadas para estimular la proliferación celular por un polipéptido PRO256; y
(b) medir la proliferación de dichas células para determinar si el compuesto de ensayo es un agonista eficaz, en el que la estimulación de la proliferación celular es indicativa de que dicho compuesto de ensayo es un antagonista eficaz.
En otra realización, la invención proporciona un procedimiento para identificar un compuesto que inhibe la expresión de un polipéptido PRO256 en células que expresan normalmente el polipéptido, en el que el procedimiento comprende poner en contacto las células con un compuesto de ensayo y determinar si se inhibe la expresión del polipéptido PRO256. En un aspecto preferido, este procedimiento comprende las etapas de:
(a) poner en contacto células y un compuesto de ensayo que se va a cribar en condiciones adecuadas que permitan la expresión del polipéptido PRO256; y
(b) determinar la inhibición de la expresión de dicho polipéptido.
En una realización adicional más, la invención proporciona usos médicos de un compuesto que inhibe la expresión de un polipéptido PRO256, tal como un compuesto que es identificado por los procedimientos expuestos antes.
Otro aspecto de la presente invención se dirige a usos médicos de un antagonista o un antagonista de un polipéptido PRO256 que se puede identificar opcionalmente por los procedimientos descritos antes.
Un tipo de antagonista de un polipéptido PRO256 que inhibe una o más de las funciones o actividades del polipéptido PRO256 es un anticuerpo. Por lo tanto, en otro aspecto, la invención proporciona usos médicos, de un anticuerpo aislado que se une a un polipéptido PRO256. En un aspecto preferido, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, que preferiblemente tiene restos de una región determinante de la complementaridad (CDR) no humana y restos de la región de armazón (FR) humana. El anticuerpo se puede marcar y se puede inmovilizar sobre un soporte sólido. En un aspecto adicional, el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo, un anticuerpo de cadena sencilla o un anticuerpo humanizado. Preferiblemente, el anticuerpo se une específicamente al polipéptido.
En un aspecto adicional más, la presente invención proporciona un procedimiento para el diagnóstico de una enfermedad o de la susceptibilidad a una enfermedad, que está relacionada con la mutación en una secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido PRO256, que comprende determinar la presencia o ausencia de dicha mutación en la secuencia de ácido nucleico del polipéptido PRO256, en el que la presencia de dicha mutación es indicativa de la presencia de dicha enfermedad o susceptibilidad a dicha enfermedad.
En un aspecto adicional más, la invención proporciona un procedimiento de diagnóstico de un trastorno cardiovascular, endotelial o angiogénico en un mamífero, que comprende analizar el nivel de expresión de un gen que codifica un polipéptido PRO256 (a) en una muestra de ensayo de células tisulares obtenida de dicho mamífero, y (b) en una muestra de control de células tisulares normales conocidas del mismo tipo celular, en el que un nivel de expresión superior o inferior en la muestra de ensayo comparado con la muestra de control, es indicativo de la presencia de un trastorno cardiovascular, endotelial o angiogénico en dicho mamífero. La expresión de un gen que codifica un polipéptido PRO256 se puede llevar a cabo opcionalmente midiendo el nivel de ARNm del polipéptido en la muestra de ensayo com-
parado con la muestra de control. Preferiblemente el trastorno cardiovascular, endotelial o angiogénico es un tumor.
En el presente documento se describe un procedimiento para el diagnóstico de un trastorno cardiovascular, endotelial o angiogénico en un mamífero, que comprende detectar la presencia o ausencia de un polipéptido PRO256 en una muestra de ensayo de células tisulares obtenida de dicho mamífero, en la que el presencia o ausencia de dicho polipéptido PRO256 en dicha muestra de ensayo es indicativa de la presencia de un trastorno cardiovascular, endotelial o angiogénico en dicho mamífero. Preferiblemente el trastorno cardiovascular, endotelial o angiogénico es un tumor.
También se describe en el presente documento un procedimiento de diagnóstico de un trastorno cardiovascular, endotelial o angiogénico en un mamífero, que comprende (a) poner en contacto un anticuerpo anti-PRO256 con una muestra de ensayo de células tisulares obtenida del mamífero, y (b) detectar la formación de un complejo entre el anticuerpo y el polipéptido PRO256 en la muestra de ensayo, en el que la formación de dicho complejo es indicativa de la presencia de un trastorno cardiovascular, endotelial o angiogénico en el mamífero. La detección puede ser cualitativa o cuantitativa, y se puede realizar en comparación con el seguimiento de la formación de complejo en una muestra de control de células tisulares normales conocidas del mismo tipo de célula. Una cantidad mayor o menor de complejos formados en la muestra de ensayo, indica la presencia de una disfunción cardiovascular, endotelial o angiogénico en el mamífero del que se han obtenido las células tisulares de ensayo. El anticuerpo preferiblemente lleva un marcador detectable. El seguimiento de la formación del complejo se puede hacer, por ejemplo, por microscopía óptica, citometría de flujo, fluorimetría u otras técnicas conocidas en la materia. La muestra de ensayo normalmente se obtiene de un individuo del que se sospecha que tiene un trastorno cardiovascular, endotelial o angiogénico.
En el presente documento se describe un procedimiento para determinar la presencia de un polipéptido PRO256 en una muestra, que comprende exponer una muestra que se sospecha que contiene los polipéptidos PRO256 a un anticuerpo anti-PRO256 y determinar la unión de dicho anticuerpo a un componente de dicha muestra. En un aspecto específico, la muestra comprende una célula que se sospecha que contiene el polipéptido PRO256 y el anticuerpo se une a la célula. Preferiblemente, el anticuerpo está marcado para ser detectado y/o está unido a un soporte sólido.
En otra realización más, la presente invención proporciona usos médicos de un polipéptido PRO256 en un procedimiento para tratar un trastorno cardiovascular, endotelial o angiogénico en un mamífero, que comprende administrar al mamífero una cantidad eficaz de un polipéptido PRO256 según se define en las reivindicaciones. Preferiblemente, el trastorno es un tumor. En un aspecto adicional, el mamífero se expone además a un fármaco que trata trastornos endoteliales o angiogénicos, tales como agentes quimioterapéuticos, si el trastorno cardiovascular, endotelial o angiogénico es un tumor. Preferiblemente, el mamífero es un ser humano.
En otra realización preferida, el trastorno cardiovascular, endotelial o angiogénico es un tumor y el polipéptido PRO256 se administra combinado con un agente quimioterapéutico, un agente inhibidor del crecimiento o un agente citotóxico.
En una realización adicional, la invención se refiere a usos médicos de un anticuerpo de agonista de PRO256, en un procedimiento para tratar un trastorno cardiovascular, endotelial o angiogénico en un mamífero, que comprende administrar al mamífero una cantidad eficaz de un agonista de un polipéptido PRO256 según se define en las reivindicaciones. Preferiblemente, el trastorno cardiovascular, endotelial o angiogénico es un tumor. También se prefiere cuando el mamífero es un ser humano, y cuando se administra una cantidad eficaz de un agente angiogénico o angiostático junto con el agonista.
En una realización adicional, la invención se refiere a usos médicos de un anticuerpo de antagonista de PRO256 u oligonucleótido antisentido en un procedimiento para tratar un trastorno cardiovascular, endotelial o angiogénico en un mamífero, que comprende administrar al mamífero una cantidad eficaz de un antagonista de un polipéptido PRO256 según se define en las reivindicaciones. Preferiblemente, el trastorno cardiovascular, endotelial o angiogénico es una enfermedad vascular periférica, daño hepático o renal o indicios de reestenosis. También se prefiere cuando el mamífero es un ser humano, y cuando se administra una cantidad eficaz de un agente angiogénico o angiostático junto con el antagonista.
En una realización adicional, la invención se refiere a usos médicos de anticuerpos anti-PRO256 agonistas o antagonistas, en un procedimiento para tratar un trastorno cardiovascular, endotelial o angiogénico en un mamífero, que comprende administrar al mamífero una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-PRO256 según se define en las reivindicaciones. Preferiblemente, el trastorno cardiovascular, endotelial o angiogénico es un tumor cuando se administra un anticuerpo anti-PRO256 agonista, o una enfermedad vascular periférica, daño hepático o renal o indicios de reestenosis, cuando se administra un anticuerpo anti-PRO256 antagonista. También se prefiere cuando el mamífero es un ser humano, y cuando se administra una cantidad eficaz de un agente angiogénico o angiostático junto con el anticuerpo agonista o antagonista.
En realizaciones adicionales más, la invención proporciona usos médicos de moléculas de ácidos nucleicos en un procedimiento para tratar un trastorno cardiovascular, endotelial o angiogénico en un mamífero que padece la misma, que comprende administrar al mamífero una molécula de ácido nucleico que codifica (a) un polipéptido PRO256, (b) un agonista de un polipéptido PRO256, o (c) un antagonista de un polipéptido PRO256, en el que dicho agonista o antagonista puede ser un anticuerpo anti-PRO256 según se define en las reivindicaciones. En una realización preferida, el mamífero es un ser humano. En otra realización preferida, el gen se administra por terapia génica ex vivo. En una realización preferida adicional, el gen está comprendido dentro de un vector, más preferiblemente un vector adenovírico, vírico adenoasociado, lentivírico o retrovírico.
En otro aspecto más, la invención proporciona una partícula retrovírica recombinante que comprende un vector retrovírico que consiste esencialmente en un promotor, un ácido nucleico que codifica (a) un polipéptido PRO256, (b) un agonista polipeptídico de un polipéptido PRO256, o (c) un antagonista polipeptídico de un polipéptido PRO256, y una secuencia señal para la secreción celular del polipéptido, en el que el vector retrovírico está asociado con proteínas estructuras retrovíricas. Preferiblemente, la secuencia señal es de un mamífero, tal como un polipéptido PRO256 nativo.
En una realización adicional más, la invención proporciona una célula productora ex vivo que comprende una construcción de ácido nucleico que incluye proteínas estructurales retrovíricas y también comprende un vector retrovírico que consiste esencialmente en un promotor, un ácido nucleico que codifica (a) un polipéptido PRO256, (b) un agonista polipeptídico de un polipéptido PRO256, o (c) un antagonista polipeptídico de un polipéptido PRO256, y una secuencia señal para la secreción celular del polipéptido, en el que dicha célula productora empaqueta el vector retrovírico en asociación con proteínas estructurales para producir partículas retrovíricas recombinantes.
En el presente documento se describe un procedimiento para inhibir el crecimiento de células endoteliales en un mamífero, que comprende administrar al mamífero (a) un polipéptido PRO256, o (b) un agonista de un polipéptido PRO256, en el que se inhibe el crecimiento de células endoteliales en dicho mamífero, y en el que dicho agonista puede ser un anticuerpo anti-PRO256. Preferiblemente, el mamífero es un ser humano y el crecimiento de células endoteliales está asociado con un tumor o un trastorno retinal.
En el presente documento se describe un procedimiento para estimular el crecimiento de células endoteliales en un mamífero, que comprende administrar al mamífero un antagonista de un polipéptido PRO256, en el que se estimula el crecimiento de células endoteliales de dicho mamífero, y en el que dicho antagonista puede ser un anticuerpo anti-PRO256. Preferiblemente el mamífero es un ser humano.
En el presente documento se describe un procedimiento para inhibir la angiogénesis en un mamífero, que comprende administrar al mamífero (a) un polipéptido PRO256, o (b) un agonista de un polipéptido PRO256, en el que se inhibe la angiogénesis en dicho mamífero. Preferiblemente, el mamífero es un ser humano y más preferiblemente el mamífero tiene un tumor o un trastorno retinal.
En el presente documento se describe un procedimiento para estimular la angiogénesis en un mamífero, que comprende administrar al mamífero una cantidad terapéuticamente eficaz de un antagonista de un polipéptido PRO256, en el que se estimula la angiogénesis en dicho mamífero. Preferiblemente, el mamífero es un ser humano, y más preferiblemente la angiogénesis promocionaría la regeneración tisular, la curación de heridas o sería útil en la revascularización terapéutica en la enfermedad vascular periférica, en daño hepático o renal, o indicios de reestenosis.
En el presente documento se describe un procedimiento para inhibir la actividad de proteasa del activador del factor de crecimiento de hepatocitos en un mamífero, que comprende administrar al mamífero (a) un polipéptido PRO256, o (b) un agonista de un polipéptido PRO256, en el que se inhibe dicha actividad de proteasa, y en el que dicho agonista puede ser un anticuerpo anti-PRO256. Preferiblemente, el mamífero es un ser humano y más preferiblemente el mamífero tiene un tumor o un trastorno retinal.
En el presente documento se describe un procedimiento para estimular la actividad de proteasa del activador del factor de crecimiento de hepatocitos en un mamífero, que comprende administrar al mamífero un antagonista de un polipéptido PRO256, en el que se estimula dicha actividad de proteasa, y en el que dicho antagonista puede ser un anticuerpo anti-PRO256. Preferiblemente, el mamífero es un ser humano y más preferiblemente el mamífero tiene una enfermedad vascular periférica, daño hepático o renal o indicios de reestenosis.
B. Realizaciones adicionales
En otras realizaciones de la presente invención, la invención proporciona usos médicos de una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido PRO256.
En un aspecto, la molécula de ácido nucleico aislada comprende una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de secuencia del ácido nucleico de al menos aproximadamente 80%, alternativamente una identidad de secuencia del ácido nucleico de al menos aproximadamente 81%, alternativamente una identidad de secuencia del ácido nucleico de al menos aproximadamente 82%, alternativamente una identidad de secuencia del ácido nucleico de al menos aproximadamente 83%, alternativamente una identidad de secuencia del ácido nucleico de al menos aproximadamente 84%, alternativamente una identidad de secuencia del ácido nucleico de al menos aproximadamente 85%, alternativamente una identidad de secuencia del ácido nucleico de al menos aproximadamente 86%, alternativamente una identidad de secuencia del ácido nucleico de al menos aproximadamente 87%, alternativamente una identidad de secuencia del ácido nucleico de al menos aproximadamente 88%, alternativamente una identidad de secuencia del ácido nucleico de al menos aproximadamente 89%, alternativamente una identidad de secuencia del ácido nucleico de al menos aproximadamente 90%, alternativamente una identidad de secuencia del ácido nucleico de al menos aproximadamente 91%, alternativamente una identidad de secuencia del ácido nucleico de al menos aproximadamente 92%, alternativamente una identidad de secuencia del ácido nucleico de al menos aproximadamente 93%, alternativamente una identidad de secuencia del ácido nucleico de al menos aproximadamente 94%, alternativamente una identidad de secuencia del ácido nucleico de al menos aproximadamente 95%, alternativamente una identidad de secuencia del ácido nucleico de al menos aproximadamente 96%, alternativamente una identidad de secuencia del ácido nucleico de al menos aproximadamente 97%, alternativamente una identidad de secuencia del ácido nucleico de al menos aproximadamente 98%, y alternativamente una identidad de secuencia del ácido nucleico de al menos aproximadamente 99% con respecto a (a) una molécula de ADN que codifica un polipéptido PRO256 que tiene una secuencia de aminoácidos de longitud completa como se describe en el presente documento, una secuencia de aminoácidos que carece del péptido señal como se describe en el presente documento, un dominio extracelular de una proteína de transmembrana, con o sin el péptido señal, como se describe en el presente documento, o cualquier otro fragmento definido específicamente de la secuencia de aminoácidos de longitud completa como se describe en el presente documento, o (b) el complemento de la molécula de ADN de (a).
En otros aspectos, la molécula de ácido nucleico aislada comprende una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de secuencia del ácido nucleico de al menos aproximadamente 80%, alternativamente una identidad de secuencia del ácido nucleico de al menos aproximadamente 81%, alternativamente una identidad de secuencia del ácido nucleico de al menos aproximadamente 82%, alternativamente una identidad de secuencia del ácido nucleico de al menos aproximadamente 83%, alternativamente una identidad de secuencia del ácido nucleico de al menos aproximadamente 84%, alternativamente una identidad de secuencia del ácido nucleico de al menos aproximadamente 85%, alternativamente una identidad de secuencia del ácido nucleico de al menos aproximadamente 86%, alternativamente una identidad de secuencia del ácido nucleico de al menos aproximadamente 87%, alternativamente una identidad de secuencia del ácido nucleico de al menos aproximadamente 88%, alternativamente una identidad de secuencia del ácido nucleico de al menos aproximadamente 89%, alternativamente una identidad de secuencia del ácido nucleico de al menos aproximadamente 90%, alternativamente una identidad de secuencia del ácido nucleico de al menos aproximadamente 91%, alternativamente una identidad de secuencia del ácido nucleico de al menos aproximadamente 92%, alternativamente una identidad de secuencia del ácido nucleico de al menos aproximadamente 93%, alternativamente una identidad de secuencia del ácido nucleico de al menos aproximadamente 94%, alternativamente una identidad de secuencia del ácido nucleico de al menos aproximadamente 95%, alternativamente una identidad de secuencia del ácido nucleico de al menos aproximadamente 96%, alternativamente una identidad de secuencia del ácido nucleico de al menos aproximadamente 97%, alternativamente una identidad de secuencia del ácido nucleico de al menos aproximadamente 98%, y alternativamente una identidad de secuencia del ácido nucleico de al menos aproximadamente 99% con respecto a (a) una molécula de ADN que comprende la secuencia codificante de un ADNc del polipéptido PRO256 de longitud completa como se describe en el presente documento, la secuencia codificante de un polipéptido PRO256 que carece del péptido señal como se describe en el presente documento, una secuencia codificante de un dominio extracelular del polipéptido PRO256 transmembrana, con o sin el péptido señal, como se describe en el presente documento, o la secuencia codificante de cualquier otro fragmento definido específicamente de la secuencia de ácido nucleico de
longitud completa como se describe en el presente documento, o (b) el complemento de la molécula de ADN de (a).
En un aspecto adicional, la invención se refiere a una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de secuencia del ácido nucleico de al menos aproximadamente 80%, alternativamente una identidad de secuencia del ácido nucleico de al menos aproximadamente 81%, alternativamente una identidad de secuencia del ácido nucleico de al menos aproximadamente 82%, alternativamente una identidad de secuencia del ácido nucleico de al menos aproximadamente 83%, alternativamente una identidad de secuencia del ácido nucleico de al menos aproximadamente 84%, alternativamente una identidad de secuencia del ácido nucleico de al menos aproximadamente 85%, alternativamente una identidad de secuencia del ácido nucleico de al menos aproximadamente 86%, alternativamente una identidad de secuencia del ácido nucleico de al menos aproximadamente 87%, alternativamente una identidad de secuencia del ácido nucleico de al menos aproximadamente 88%, alternativamente una identidad de secuencia del ácido nucleico de al menos aproximadamente 89%, alternativamente una identidad de secuencia del ácido nucleico de al menos aproximadamente 90%, alternativamente una identidad de secuencia del ácido nucleico de al menos aproximadamente 91%, alternativamente una identidad de secuencia del ácido nucleico de al menos aproximadamente 92%, alternativamente una identidad de secuencia del ácido nucleico de al menos aproximadamente 93%, alternativamente una identidad de secuencia del ácido nucleico de al menos aproximadamente 94%, alternativamente una identidad de secuencia del ácido nucleico de al menos aproximadamente 95%, alternativamente una identidad de secuencia del ácido nucleico de al menos aproximadamente 96%, alternativamente una identidad de secuencia del ácido nucleico de al menos aproximadamente 97%, alternativamente una identidad de secuencia del ácido nucleico de al menos aproximadamente 98%, y alternativamente una identidad de secuencia del ácido nucleico de al menos aproximadamente 99% con respecto a (a) una molécula de ADN que codifica el mismo polipéptido maduro codificado por el ADNc de la proteína humana, depositado en la ATCC como se describe en el presente documento, o (b) el complemento de la molécula de ADN de (a).
Otro aspecto de la presente invención se refiere a una molécula de ácido nucleico aislada, que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido PRO256 que tiene suprimido el dominio transmembrana o inactivado el dominio transmembrana, o es complementario a dicha secuencia de nucleótidos codificante, en el que el o los dominios transmembrana de dicho polipéptido se describen en el presente documento. Por lo tanto, se contemplan dominios extracelulares solubles del polipéptido PRO256 descrito en el presente documento.
Otra realización se refiere a fragmentos de una secuencia que codifica el polipéptido PRO256, o el complemento de la misma, que pueden ser útiles, por ejemplo, en sondas de hibridación, para codificar fragmentos de un polipéptido PRO256 que puede codificar opcionalmente un polipéptido que comprende un sitio de unión para un anticuerpo anti-PRO256 o como sondas de oligonucleótidos antisentido: Dichos fragmentos de ácido nucleico tienen normalmente al menos aproximadamente 20 nucleótidos de longitud, alternativamente al menos aproximadamente 30 nucleótidos de longitud, alternativamente al menos aproximadamente 40 nucleótidos de longitud, alternativamente al menos aproximadamente 50 nucleótidos de longitud, alternativamente al menos aproximadamente 60 nucleótidos de longitud, alternativamente al menos aproximadamente 70 nucleótidos de longitud, alternativamente al menos aproximadamente 80 nucleótidos de longitud, alternativamente al menos aproximadamente 90 nucleótidos de longitud, alternativamente al menos aproximadamente 100 nucleótidos de longitud, alternativamente al menos aproximadamente 110 nucleótidos de longitud, alternativamente al menos aproximadamente 120 nucleótidos de longitud, alternativamente al menos aproximadamente 130 nucleótidos de longitud, alternativamente al menos aproximadamente 140 nucleótidos de longitud, alternativamente al menos aproximadamente 150 nucleótidos de longitud, alternativamente al menos aproximadamente 160 nucleótidos de longitud, alternativamente al menos aproximadamente 170 nucleótidos de longitud, alternativamente al menos aproximadamente 180 nucleótidos de longitud, alternativamente al menos aproximadamente 190 nucleótidos de longitud, alternativamente al menos aproximadamente 200 nucleótidos de longitud, alternativamente al menos aproximadamente 250 nucleótidos de longitud, alternativamente al menos aproximadamente 300 nucleótidos de longitud, alternativamente al menos aproximadamente 350 nucleótidos de longitud, alternativamente al menos aproximadamente 400 nucleótidos de longitud, alternativamente al menos aproximadamente 450 nucleótidos de longitud, alternativamente al menos aproximadamente 500 nucleótidos de longitud, alternativamente al menos aproximadamente 600 nucleótidos de longitud, alternativamente al menos aproximadamente 700 nucleótidos de longitud, alternativamente al menos aproximadamente 800 nucleótidos de longitud, alternativamente al menos aproximadamente 900 nucleótidos de longitud y alternativamente al menos aproximadamente 1000 nucleótidos de longitud, donde en este contexto el término "aproximadamente" significa la longitud de la secuencia de nucleótidos citada más o menos 10% de la longitud citada. Hay que indicar que los fragmentos nuevos de una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido PRO256 se puede determinar de una forma rutinaria por alineamiento de la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido PRO256 con otras secuencias de nucleótidos conocidas, usando cualquiera de una serie de programas de alineamiento de secuencias conocidos, y determinando que fragmento o fragmentos de secuencias de nucleótidos que codifican el polipéptido PRO256 son nuevos. Todas dichas secuencias de nucleótidos que codifican el polipéptido PRO256 están contempladas en el presente documento. También están contemplados los fragmentos de polipéptido PRO256 codificados por estos fragmentos de moléculas de nucleótidos, preferiblemente los fragmentos de polipéptidos PRO256 que comprenden un sitio de unión para un anticuerpo anti-PRO256.
En otra realización, la invención proporciona usos médicos de un polipéptido PRO256 aislado codificado por cualquiera de las secuencias de ácido nucleico aisladas identificadas en lo que antecede.
En un determinado aspecto, la invención se refiere a un polipéptido PRO256 aislado, que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente 80%, alternativamente una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente 81%, alternativamente una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente 82%, alternativamente una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente 83%, alternativamente una identidad de de aminoácidos de al menos aproximadamente 84%, alternativamente una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente 85%, alternativamente una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente 86%, alternativamente una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente 87%, alternativamente una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente 88%, alternativamente una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente 89%, alternativamente una identidad de de aminoácidos de al menos aproximadamente 90%, alternativamente una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente 91%, alternativamente una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente 92%, alternativamente una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente 93%, alternativamente una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente 94%, alternativamente una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente 95%, alternativamente una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente 96%, alternativamente una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente 97%, alternativamente una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente 98%, y alternativamente una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente 99% con respecto a un polipéptido PRO256 que tiene una secuencia de aminoácidos de longitud completa como se describe en el presente documento, una secuencia de aminoácidos que carece del péptido señal como se describe en el presente documento, un dominio extracelular de una proteína de transmembrana, con o sin el péptido señal, como se describe en el presente documento, o cualquier otro fragmento definido específicamente de la secuencia de aminoácidos de longitud completa como se describe en el presente documento.
En un aspecto adicional, la invención se refiere a un polipéptido PRO256 aislado, que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente 80%, alternativamente una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente 81%, alternativamente una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente 82%, alternativamente una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente 83%, alternativamente una identidad de de aminoácidos de al menos aproximadamente 84%, alternativamente una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente 85%, alternativamente una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente 86%, alternativamente una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente 87%, alternativamente una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente 88%, alternativamente una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente 89%, alternativamente una identidad de de aminoácidos de al menos aproximadamente 90%, alternativamente una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente 91%, alternativamente una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente 92%, alternativamente una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente 93%, alternativamente una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente 94%, alternativamente una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente 95%, alternativamente una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente 96%, alternativamente una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente 97%, alternativamente una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente 98%, y alternativamente una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente 99% con respecto a una secuencia de aminoácidos codificada por el ADNc de proteína humana depositado en la ATCC como se describe en el presente documento.
En un aspecto específico, la invención se refiere a un polipéptido PRO256 aislado sin la secuencia señal N-terminal y/o la metionina de iniciación, y es codificado por una secuencia de nucleótidos que codifica dicha secuencia de aminoácidos como se ha descrito en lo que antecede. También se describen en el presente documento procedimientos para producir la misma, en el que dichos procedimientos comprenden cultivar una célula huésped que comprende un vector que comprende la molécula de ácido nucleico codificada adecuada, en condiciones adecuadas para la expresión del polipéptido PRO256, y recuperar el polipéptido PRO256 del cultivo celular.
Otro aspecto de la invención se refiere a un polipéptido PRO256 aislado que tiene el dominio transmembrana suprimido o el dominio transmembrana inactivado. También se describen en el presente documento procedimientos para producir el mismo, en el que dichos procedimientos comprenden cultivar una célula huésped que comprende un vector que comprende la molécula de ácido nucleico codificante adecuada, en condiciones adecuadas para la expresión del polipéptido PRO256, y recuperar el polipéptido PRO256 del cultivo celular.
En otra realización más, la invención se refiere a usos médicos de agonistas y antagonistas de un polipéptido PRO256 nativo según se define en el presente documento. En una realización particular, el agonista o antagonista es un anticuerpo anti-PRO256 o un oligonucleótido antisentido.
En una realización adicional, la invención se refiere a un procedimiento para identificar agonistas o antagonistas de un polipéptido PRO256, que comprende poner en contacto el polipéptido PRO256 con una molécula candidata y hacer el seguimiento de una actividad biológica mediada por dicho polipéptido PRO256. Preferiblemente, el polipéptido PRO256 es un polipéptido PRO256 nativo.
En una realización adicional más, la invención se refiere a usos médicos de una composición objeto de la solicitud, que comprende un polipéptido PRO256 o un agonista o antagonista de un polipéptido PRO256 como se describe en el presente documento, o un anticuerpo anti-PRO256, combinado con un vehículo. Opcionalmente, el vehículo es un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Otra realización de la presente invención se dirige al uso de un polipéptido PRO256, o un agonista o antagonista del mismo como se describe en lo que antecede, o un anticuerpo anti-PRO256, para preparar un medicamento útil en el tratamiento de una afección que es sensible al polipéptido PRO256, un agonista o antagonista del mismo o un anticuerpo anti-PRO256 según se define en las reivindicaciones.
También se describen en el presente documento vectores que comprenden ADN que codifica cualquiera de los polipéptidos descritos en el presente documento. También se proporcionan células huésped que comprenden cualquiera de dichos vectores. A modo de ejemplo, las células huésped pueden ser células CHO, E. coli, levadura, o células de insecto infectadas por baculovirus. Se proporciona también un procedimiento para producir cualquiera de los polipéptidos descritos en el presente documento, y comprende cultivar células huésped en condiciones adecuadas para la expresión del polipéptido deseado y recuperar el polipéptido deseado del cultivo de células.
También se describe en el presente documento moléculas quiméricas que comprenden cualquiera de los polipéptidos descritos en el presente documento, fusionado con un polipéptido o secuencia de aminoácidos heterólogos. Los ejemplos de dichas moléculas quiméricas comprenden cualquiera de los polipéptidos descritos en el presente documento fusionado con una secuencia marcadora de epítopo o una región Fc de una inmunoglobulina.
También se describe en el presente documento un anticuerpo que se une específicamente a cualquiera de los polipéptidos descritos antes o a continuación. Opcionalmente, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, anticuerpo humanizado, fragmento de anticuerpo o anticuerpo de cadena sencilla.
También se describen en el presente documento sondas de oligonucleótidos útiles para las secuencias de nucleótidos genómicas y de ADNc o como sondas antisentido, en el que esas sondas se pueden obtener de una cualquiera de las secuencias de nucleótidos descritas antes o a continuación.
Breve descripción de las figuras
Figura 1. Muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 1) de una secuencia nativa de ADNcPRO256, en el que el SEQ ID NO: 1 es un clon denominado en el presente documento "DNA35880-1160".
Figura 2. Muestra la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 2) derivada de la secuencia codificante del SEQ ID NO: 1 mostrado en la figura 1.
Figuras 3(a) a 3(b). Muestran la conversión mediada por suero humano del factor de crecimiento de hepatocitos de cadena sencilla-^{125}I (scHGF) a su forma bicatenaria y el transcurso del tiempo de la inhibición por PRO256. La figura 3(a) muestra el transcurso de tiempo de la inhibición. Se incubó ^{125}I-scHGF con suero humano (10%) a 37ºC y se cogieron partes alícuotas en diferentes puntos de tiempo y se analizaron por SDS-PAGE en condiciones reductoras. Las bandas desde la parte superior a la inferior del gel son scHGF, cadena pesada de HGF (cadena \alpha) y cadenas ligeras de HGF (doblete, cadena \beta). Las calles de la izquierda (+) son con PRO256 (1 \muM) y las calles de la derecha (-) son sin PRO256. La figura 3(b) muestra la inhibición dependiente de la concentración de PRO256 de la activación de ^{125}I-scHGF mediada por el suero, después de 4 h de incubación; la calle C corresponde a la conversión de ^{125}I-scHGF no inhibida, la calle 0 es el punto de tiempo 0 min; las calles 1-7 muestran partes alícuotas cogidas después de 4 h de incubación en presencia de concentraciones decrecientes de PRO256 (1,27 \muM, 0,42 \muM, 0,14 \muM, 0,047 \muM, 0,016 \muM, 0,005 \muM y 0,0017.
Figuras 4(a) y 4(b). Muestran la escisión proteolítica de ^{125}I-scHGF por la calicreína humana y el factor XIIa humano. La figura 4(a) muestra la escisión de ^{125}I-scHGF (50 \mug/ml) por la calicreína humana (40 nM) y la inhibición por el inhibidor PRO256 (1 \muM). La calicreína se preincubó durante 15 min a 37ºC con inhibidor PRO256 antes de añadir ^{125}I-scHGF. Las reacciones se llevaron a cabo a 37ºC, donde (+) indica la presencia de inhibidor PRO256 y (-) la ausencia de inhibidor PRO256 (= control). La figura 4(b) muestra la conversión de ^{125}I-scHGF por el factor XIIa humano (40 nM) y la falta de inhibición por el inhibidor PRO256.
Figura 5. Muestra la inhibición de la actividad enzimática de la calicreína humana frente a un sustrato sintético pequeño (S2305) por el inhibidor PRO256. Se incubaron la calicreína (concentración final 1,25 nM) y el inhibidor PRO256 o el inhibidor del factor específico inhibidor de tripsina com (CTT) durante 20 min a temperatura ambiente. Se añadió S2305 (concentración final 1,8 mM) y se midió el cambio de absorbancia medida a 405 nM. La inhibición de la actividad enzimática se expresó en porcentaje de tasas de control (mDO_{405}/min) de dos experimentos. La CI_{50} determinada para el inhibidor PRO256 era 104 nM y la K*_{i} calculada era 37 nM.
Descripción detallada de la invención I. Definiciones
Las frases "trastorno cardiovascular, endotelial y angiogénico", "disfunción cardiovascular, endotelial y angiogénica", "trastorno cardiovascular, endotelial o angiogénico" y "disfunción cardiovascular, endotelial o angiogénica" se usan de forma intercambiable y se refieren en parte a trastornos sistémicos que afectan a los vasos, tales como diabetes mellitus, así como a enfermedades de los propios vasos, tales como de las arterias, capilares, venas y/o vasos linfáticos. Esto incluirá indicaciones que estimulan la angiogénesis y/o cardiovascularización, y las que inhiben la angiogénesis y/o cardiovascularización. Preferiblemente, el trastorno cardiovascular, endotelial o angiogénico es un tumor. Los trastornos cardiovasculares, endoteliales o angiogénicos incluirían, por ejemplo, enfermedad arterial, tal como aterosclerosis, hipertensión, vasculitis inflamatoria; enfermedad de Reynaud y fenómeno de Reynaud, aneurismas y reestenosis arterial; trastornos venosos y linfáticos tales como tromboflebitis, linfangitis y linfedema; y otros trastornos vasculares tales como enfermedad vascular periférica, un tipo de tumor tal como tumores vasculares, p. ej., hemangioma (capilar y cavernoso), tumores del glomo, telangiectasia, angiomatosis bacilar, hemangioendotelioma, angiosarcoma, hemangiopericitoma, sarcoma de kaposi, linfangioma y linfangiosarcoma, angiogénesis tumoral, traumatismo tal como heridas, quemaduras y otros tejidos lesionados, fijación de implante, cicatrización, lesión por isquemia-reperfusión, artritis reumatoide, enfermedad cerebrovascular, enfermedades renales tales como insuficiencia renal aguda y osteoporosis. Esto también incluiría angina, infartos de miocardio tales como infartos agudos de miocardio, hipertrofia cardiaca e insuficiencia cardiaca tal como ICC.
"Hipertrofia", tal como se usa en el presente documento, se define como un aumento de la masa de un órgano o estructura independiente del crecimiento natural que no implica la formación de tumor. La hipertrofia de un órgano o tejido se debe a un aumento de la masa de las células individuales (hipertrofia verdadera) o a un aumento del número de células que conforman el tejido (hiperplasia), o ambos. Algunos órganos, tales como el corazón, pierden la capacidad de dividirse poco después del nacimiento. Por consiguiente, "hipertrofia cardiaca" se define como un aumento de la masa del corazón, que en adultos se caracteriza por un aumento del tamaño de las células miocíticas y contenido de proteína contráctil sin división celular concomitante. Parece que el carácter de la tensión responsable de incitar la hipertrofia (p. ej., aumento en la carga previa, aumento en la carga posterior, pérdida de miocitos, como en el infarto de miocardio, o depresión primaria de la contractilidad), tienen una función crítica para determinar la naturaleza de la respuesta. La etapa primera de la hipertrofia cardiaca normalmente se caracteriza morfológicamente por el aumento del tamaño de miofibrillas y mitocondrias, así como por el agrandamiento de mitocondiras y núcleos. En esta etapa, aunque las células musculares son más largas de lo normal, la organización celular se conserva en gran medida. En una etapa más avanzada de la hipertrofia cardiaca, hay aumentos preferenciales en el tamaño o número de orgánulos específicos, tales como mitocondrias, y se añaden nuevos elementos contráctiles en áreas localizadas de las células, de una forma irregular. Las células sometidas a hipertrofia prolongada presentan alteraciones más obvias en la organización celular, incluyendo núcleos notablemente agrandados con membranas muy lobuladas, que desplazan las microfibrillas adyacentes y producen la rotura del registro normal de la banda Z. La expresión "hipertrofia cardiaca" se usa para incluir todas las etapas de la progresión de esta afección, caracterizada por diversos grados de daño estructural del músculo cardiaco, independientemente del trastorno cardiaco subyacente. Por lo tanto, la expresión también incluye afecciones fisiológicas que tienen un papel decisivo en el desarrollo de la hipertrofia cardiaca, tales como la hipertensión, estenosis aórtica o infarto de miocardio.
"Fallo cardiaco" se refiere a una anormalidad de la función cardiaca en la que el corazón no bombea sangre al ritmo necesario para los requisitos de los tejidos metabolizantes. El fallo cardiaco puede estar causado por varios factores, incluyendo formas isquémicas, congénitas, reumáticas o idiopáticas.
La "insuficiencia cardiaca congestiva" (ICC) es una patología progresiva en la que el corazón cada vez es más incapaz de administrar el rendimiento cardiaco adecuado (el volumen de sangre bombeado por el corazón en el tiempo) para suministrar la sangre oxigenada a los tejidos periféricos. A medida que progresa la ICC, se producen daños estructurales y hemodinámicos. Aunque estos daños tienen una diversidad de manifestaciones, un síntoma característico es la hipertrofia ventricular. La ICC es un resultado final habitual de una serie de trastornos cardiacos.
El "infarto de miocardio" generalmente es el resultado de aterosclerosis de las arterias coronarias, a menudo con trombosis coronaria superpuesta. Puede dividirse en dos tipos principales: infartos transmurales, en los que la necrosis miocárdica implica al grosor completo de la pared ventricular, e infartos subendocárdicos (no transmurales), en los que la necrosis implica el subendocardio, el miocardio intramural, o ambos, sin extenderse abriéndose paso a través de la pared ventricular del epicardio. Se sabe que el infarto de miocardio provoca tanto un cambio en los efectos hemodinámicos como una alteración en la estructura de las zonas dañadas y sanas del corazón. Así, por ejemplo, el infarto de miocardio reduce el rendimiento cardiaco máximo y el volumen sistólico del corazón. También está asociada con el infarto de miocardio una estimulación de la síntesis de ADN que sucede en el intersticio así como un aumento en la formación de colágeno en las áreas del corazón no afectadas.
Como resultado del estrés o tensión aumentada en el corazón en la hipertensión prolongada debida, por ejemplo, a la resistencia periférica total aumentada, la hipertrofia cardiaca se ha asociado durante mucho tiempo con "hipertensión". Una característica del ventrículo que se vuelve hipertrófico como resultado de sobrecarga de presión crónica es un rendimiento diastólico alterado. Fouad y col., J. Am. Coll. Cardiol. 4, 1500-6 (1984); Smith y col., J. Am. Cardiol. 5, 869-74 (1985). Se ha detectado una relajación del ventrículo izquierdo prolongada en hipertensión esencial temprana, a pesar de la función sistólica normal o supranormal. Hartford y col., Hypertension 6, 329-338 (1984). Sin embargo, no hay un paralelismo cercano entre los niveles de presión sanguínea y la hipertrofia cardiaca. Aunque se ha presentado una mejora en la función del ventrículo izquierdo en respuesta a la terapia hipertensora en seres humanos, los pacientes tratados de diversas maneras con un diurético (hidroclorotiazida), un \beta-bloqueante (propranolol), o un bloqueante de los canales de calcio (diltiazem), han mostrado una inversión de la hipertrofia ventricular izquierda, sin mejora de la función diastólica. Inouye y col., Am. J. Cardiol. 53, 1583-7 (1984).
Otra enfermedad cardiaca compleja asociada con la hipertrofia cardiaca es la "cardiomiopatía hipertrófica". Esta afección se caracteriza por una gran diversidad de características morfológicas, funcionales, y clínicas (Maron y col., N. Engl. J. Med. 316, 780-9 (1987); Spirito y col., N. Engl. J. Med. 320, 749-55 (1989); Louie y Edwards, Prog. Cardiovasc. Dis. 36, 275-308 (1994); Wigle y col., Circulation 92, 1680-92 (1995)), cuya heterogenicidad está acentuada por el hecho de que afecta a pacientes de todas las edades (Spirito y col., N. Engl. J. Med. 336, 775-785 (1997)). Los factores causantes de la cardiomiopatía hipertrófica también son diversos y poco entendidos. En general, las mutaciones en genes que codifican proteínas sarcoméricas se asocian con la cardiomiopatía hipertrófica. Los datos recientes sugieren que las mutaciones en la cadena pesada de \beta-miosina pueden representar aproximadamente de 30 a 40 por ciento de los casos de cardiomiopatía hipertrófica familiar (Watkins y col., N. Engl. J. Med. 326, 1108-14 (1992); Schwartz y col, Circulation 91, 532-40 (1995); Marian y Roberts, Circulation 92, 1336-47 (1995); Thierfelder y col., Cell 77, 701-12 (1994); Watkins y col., Nat. Gen. 11, 434-7 [1995]). Además de la cadena pesada de la \beta-miosina, otros sitios de mutaciones genéticas incluyen la troponina T cardiaca, alfa-tropomiosina, proteína C que se une a miosina cardiaca, cadena ligera esencial de miosina, y cadena ligera reguladora de miosina. Véase, Shazad y col., Curr. Opin. Cardiol., 12: 295-301 (1997).
La "estenosis aórtica" supravalvular es un trastorno vascular heredado, que se caracteriza por el estrechamiento de la aorta ascendente, pero también pueden estar afectadas otras arterias, incluyendo las arterias pulmonares. La estenosis aórtica no tratada puede conducir a presión intracardiaca aumentada que da como resultado hipertrofia miocárdica y finalmente fallo cardiaco y muerte. La patogénesis de este trastorno no se entiende completamente, pero la hipertrofia y posiblemente la hiperplasia del músculo liso medial son características prominentes de este trastorno. Se ha publicado que están implicadas variantes moleculares del gen de la elastina en la patogénesis y desarrollo de la estenosis aórtica. Patente de EE.UU. nº 5.650.282 presentada el 22 de julio de 1997.
La "regurgitación valvular" sucede como resultado de enfermedades cardiacas que producen trastornos de las válvulas cardiacas. Diversas enfermedades, como fiebre reumática, pueden causar el encogimiento o extracción del orificio de la válvula, mientras que otras enfermedades pueden provocar endocarditis, una inflamación del endocardio o membrana de revestimiento de los orificios auriculoventriculares y funcionamiento del corazón. Defectos tales como el estrechamiento de la válvula, estenosis o el cierre deficiente de la válvula provocan una acumulación de sangre en la cavidad cardiaca o la regurgitación de sangre pasada la válvula. Si no se corrige, una estenosis o insuficiencia valvular prolongada puede producir hipertrofia cardiaca y daño asociado al músculo cardiaco, que finalmente puede necesitar un reemplazo de la válvula.
La presente invención abarca el tratamiento de todos estos, y otros trastornos cardiovasculares, endoteliales y angiogénicos, que pueden estar o no acompañados por hipertrofia cardiaca.
El término "tumor" se refiere a una masa anormal de tejido que no es inflamatoria, y surge de células de tejido preexistentes. Los tumores pueden ser benignos (pero que no tienen función fisiológica), precancerosos o cancerosos.
Los términos "cáncer", "canceroso" y "maligno" se refieren o describen la afección fisiológica en mamíferos que se caracteriza por crecimiento de células no regulado. Los ejemplos de cáncer incluyen pero no se limitan a carcinoma incluyendo adenocarcinoma, linfoma, blastoma, melanoma, sarcoma y leucemia. Los ejemplos más particulares de dichos cánceres incluyen cáncer de células escamosas, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer gastrointestinal, linfoma de Hodgkin y no Hodgkin, cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer de cuello de útero, cáncer de ovario, cáncer de hígado tal como carcinoma hepático y hepatoma, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer colorrectal, carcinoma endometrial, carcinoma de glándulas salivares, cáncer de riñón tal como carcinoma de células renales, y tumores de Wilms, carcinoma de células basales, melanoma, cáncer de próstata, cáncer vulvar, cáncer de tiroides, cáncer testicular, cáncer esofágico, y diferentes tipos de cáncer de cabeza y cuello. Los cánceres preferidos para el tratamiento en el presente documento son de mama, colon, pulmón, melanoma, ovario y otros que implican tumores vasculares como se ha indicado antes.
La expresión "agente citotóxico" como se usa en el presente documento, se refiere a una sustancia que inhibe o previene la función de las células y/o causa la destrucción de las células. Se pretende que el término incluya isótopos radiactivos (p. ej., ^{131}I, ^{125}I, ^{90}Y y ^{186}Re), agentes quimioterapéuticos, y toxinas tales como toxinas enzimáticamente activas de bacterias, hongos, plantas, o de origen animal, o fragmentos de las mismas.
Un "agente quimioterapéutico" es un compuesto químico útil en el tratamiento del cáncer. Los ejemplos de agentes quimioterapéuticos incluyen agentes alquilantes, antagonistas del ácido fólico, antimetabolitos del metabolismo de ácidos nucleicos, antibióticos, análogos de pirimidina, 5-fluorouracilo, cisplatino, nucleósidos de purina, aminas, aminoácidos, nucleósidos de triazol, o corticoesteroides. Los ejemplos específicos incluyen adriamicina, doxorrubicina, 5-fluorouracilo, arabinósido de citosina ("Ara-C"), ciclofosfamida, tiotepa, busulfán, citoxina, taxol, toxotere, metotrexato, cisplatino, melfalán, vinblastina, bleomicina, etopósido, ifosfamida, mitomicina C, mitoxantrona, vincristina, vinorrelbina, carboplatino, tenipósido, daunomicina, carminomicina, aminopterina, dactinomicina, mitomicinas, esperamicinas (véase la patente de EE.UU. 4.675.187), melfalán y otras mostazas nitrogenadas relacionadas. También están incluidos en esta definición agentes hormonales que actúan para regular o inhibir la acción hormonal o tumores, tales como tamoxifeno y onapristona.
Un "agente inhibidor del crecimiento" cuando se usa en el presente documento, se refiere a un compuesto o composición que inhibe el crecimiento de una célula, tal como una célula de cáncer que sobreexpresa Wnt, in vitro o in vivo. Por lo tanto, el agente inhibidor del crecimiento es aquel que reduce significativamente el porcentaje de células malignas en fase S. Los ejemplos de agente inhibidor del crecimiento incluyen agentes que bloquean el desarrollo del ciclo celular (en un sitio distinto de la fase S), tales como agentes que inducen la detención de G1 y detención de la fase M. Los bloqueantes de la fase M clásicos incluyen las vincas (vincristina y vinblastina), taxol, e inhibidores topo II tale como doxorrubicina, daunorrubicina, etopósido y bleomicina. Aquellos agentes que detienen G1 también se extienden a la detención de la fase S, por ejemplo, los agentes alquilantes del ADN tales como tamoxifeno, prednisona, dacarbazina, mecloretamina, cisplatino, metotrexato, 5-fluorouracilo y ara-C. Se puede encontrar información adicional en "The Molecular Basis of Cancer", Mendelsohn and Israel, eds., Capítulo 1, titulado "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" de Murakami y col. (WB Saunders: Philadelphia, 1995), en especial en la pág. 13. Los ejemplos adicionales incluyen factor de necrosis tumoral (TNF), un anticuerpo capaz de inhibir o neutralizar la actividad angiogénica del FGF ácido o básico, o factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), un anticuerpo capaz de inhibir o neutralizar las actividades coagulantes del factor tisular, proteína C o proteína S (véase el documento WO 35 91/01753, publicado el 21 de febrero de 1991), o un anticuerpo capaz de unirse al receptor HER2 (documento WO 89/06692), tal como el anticuerpo 4D5 (y equivalentes funcionales del mismo) (p. ej., documento WO 92/22653).
El "tratamiento" es una intervención realizada con la intención de prevenir el desarrollo o de alterar la patología de un trastorno cardiovascular, endotelial y angiogénico. El concepto de tratamiento se usa en el sentido más amplio, e incluye específicamente la prevención (profilaxis), moderación, reducción y curado de trastornos cardiovasculares, endoteliales y angiogénicos en cualquier etapa. Por consiguiente, "tratamiento" se refiere tanto al tratamiento terapéutico y profiláctico como a medidas preventivas, en el que el objetivo es prevenir o ralentizar (reducir) un trastorno cardiovascular, endotelial y angiogénico tal como la hipertrofia. Los que necesitan el tratamiento incluyen los que ya tienen el trastorno así como los que son propensos a tener el trastorno o aquellos en los que se puede prevenir el trastorno. El trastorno puede tener cualquier causa, incluyendo causas idiopáticas, cardiotróficas o miotróficas, o isquemia o lesiones isquémicas, tales como infarto de miocardio.
La administración "crónica" se refiere a la administración del o de los agentes de un modo continuo en contraposición a un modo agudo, para así mantener el efecto inicial, tal como un efecto antihipertrófico, durante un periodo de tiempo prolongado.
"Mamífero" para el propósito del tratamiento se refiere a cualquier animal clasificado como un mamífero, incluyendo seres humanos, animales domésticos y de granja, y animales de zoológico, deportes o mascotas, tales como perros, caballos, gatos, cabras, ovejas, cerdos, etc. Preferiblemente, el mamífero es un ser humano.
La administración "en combinación con" uno o más agentes terapéuticos adicionales incluye la administración simultánea (concurrente) y la consecutiva en cualquier orden.
La frase "agentes cardiovasculares, endoteliales y angiogénicos" se refiere en general a cualquier fármaco que actúe en el tratamiento de trastornos cardiovasculares, endoteliales y angiogénicos. Los ejemplos de agentes cardiovasculares son aquellos que promueven la hemostasis vascular mediante la modulación de la presión sanguínea, frecuencia cardiaca, contractilidad del corazón, y la biología endotelial y del músculo liso, teniendo todos estos factores una función en la enfermedad cardiovascular. Los ejemplos específicos de estos incluyen antagonistas del receptor de angiotensina II; antagonistas del receptor de endotelina tales como, por ejemplo, BONSENTAN^{TM} y MOXONODIN^{TM}; interferón gamma (IFN-\gamma); desaspartato-angiotensina I; agentes trombolíticos, p. ej., estreptoquinasa, uroquinasa, t-PA y una variante de t-PA específicamente diseñada para tener una semivida más larga y una especificidad de fibrina muy alta, TNK t-PA (una variante de t-PA T103N, N117Q, KHRR (296-299)AAAA, Keyt y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 3670-3674 (1994)); agentes inotrópicos o hipertensores tales como digoxigenina y agentes de bloqueo del receptor \beta-adrenérgico, p. ej., propranolol, timolol, tertalolol, carteolol, nadolol, betaxolol, penbutolol, acetobutolol, atenolol, metoprolol, y carvedilol; inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina (ACE), p. ej., quinapril, captopril, enalapril, ramipril, benazepril, fosinopril y lisinopril; diuréticos, p. ej., clorotiazida, hidroclorotiazida, hidroflumetazida, metilclotiazida, benztiazida, diclorfnamida, acetazolamida e indapamida; y bloqueantes de los canales de calcio, p. ej. diltiazem, nifedipina, verapamil, nicardipina. Una categoría preferida de este tipo, es un agente terapéutico usado para el tratamiento de la hipertrofia cardiaca o de una afección fisiológica decisiva en el desarrollo de la hipertrofia cardiaca, tal como hipertensión arterial, estenosis aórtica o infarto de miocardio.
Los "agentes angiogénicos" y "agentes endoteliales" son agentes activos que promueven la angiogénesis y/o crecimiento de células endoteliales, o si procede, la vasculogenesis. Esto incluiría factores que aceleran la curación de heridas, tales como la hormona del crecimiento, factores de crecimiento I de tipo insulina (HGF-I), VEGF, VIGF, PDGF, factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), factor de crecimiento epidérmico (EGF), CTGF y miembros de su familia, FGF, y TGF-\alpha y TGF-\beta.
El "factor de crecimiento de hepatocitos (HGF)" es un potente mitógeno, motógeno y morfógeno para las células parenquimales del hígado, epiteliales y endoteliales.
El "factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) maduro" es una proteína heterodímera que consiste en una cadena pesada (cadena \alpha) y una cadena ligera (cadena \beta) unidas entre sí mediante un enlace disulfuro. Las dos cadenas se producen a partir de un precursor de cadena sencilla (scHGF) por procesamiento proteolítico. Este procesamiento, que es mediado por una serina proteasa, es necesario para que el HGF ejerza los efectos tanto mitógenos como morfogénicos.
El "activador del factor de crecimiento de hepatocitos (HGF)" se refiere a una serina proteasa que es producida y secretada en el hígado y circula en la sangre como un zimógeno inactivo. En respuesta a la lesión tisular, el zimógeno activador del HGF se convierte en la forma activa por proteolisis limitada. El activador de HGF activado convierte el precursor de cadena sencilla del HGF (scHGF) inactivo en un heterodímero biológicamente activo en el tejido lesionado.
Los "agentes angiostáticos" son agentes activos que inhiben la angiogénesis o vasculogénesis o inhiben o previenen de otra forma el crecimiento de células de cáncer. Los ejemplos incluyen anticuerpos u otros antagonistas de agentes angiogénicos como se ha definido antes, tales como anticuerpos contra VEGF. Incluyen además agentes citoterapéuticos tales como agentes citotóxicos, agentes quimioterapéuticos, agentes inhibidores del crecimiento, agentes apoptóticos y otros agentes para tratar el cáncer, tales como anti-HER-2, anti-CD20, y otros agentes químicos orgánicos y bioactivos.
En un sentido farmacológico, en el contexto de la presente invención, una "cantidad terapéuticamente eficaz" de un agente activo tal como un polipéptido PRO256 o agonista o antagonista del mismo o un anticuerpo anti-PRO256, se refiere a una cantidad eficaz en el tratamiento de un trastorno cardiovascular, endotelial o angiogénico en un mamífero, y se puede determinar empíricamente.
Tal como se usa en el presente documento, una "cantidad eficaz" de un agente activo tal como un polipéptido PRO256 o un agonista o antagonista del mismo, se refiere a una cantidad eficaz para llevar a cabo un objetivo establecido, en el que dichas cantidades se pueden determinar empíricamente para el efecto deseado.
Las expresiones "polipéptido PRO256" y "PRO" tal como se usan en el presente documento y seguidos a continuación por una designación numérica, se refieren a diferentes polipéptidos, en el que la designación completa (es decir, PRO/número) se refiere a secuencias de polipéptido específicas como se describe en el presente documento. Las expresiones "polipéptido PRO/número" y "PRO/número" en el que el término "número" se proporciona como una designación numérica usada en el presente documento, abarcan polipéptidos de secuencia nativa y variantes de polipéptido (que se definen además en el presente documento). Los polipéptidos PRO256 descritos en el presente documento se pueden aislar de una variedad de fuentes, tales como de tipos de tejidos humanos o de otras fuentes, o se preparan por procedimientos recombinantes o sintéticos.
Un "polipéptido PRO256 de secuencia nativa" comprende un polipéptido que tiene la misma secuencia de aminoácidos que corresponde al polipéptido PRO256 obtenido de la naturaleza. Dichos polipéptidos PRO256 de secuencia nativa se pueden aislar de la naturaleza o se pueden producir por medios recombinantes o sintéticos. La expresión "polipéptido PRO256 de secuencia nativa" abarca específicamente formas secretadas o truncadas naturales del polipéptido PRO256 específico (p. ej., una secuencia de dominio extracelular), formas variantes naturales (p. ej., formas cortadas y empalmadas alternativamente) y variantes alélicas naturales del polipéptido. En diferentes realizaciones de la invención, los polipéptidos PRO256 de secuencia nativa descritos en el presente documento son polipéptidos de secuencia nativa maduros o de longitud completa que comprenden la secuencia de aminoácidos de longitud completa mostrada en las figuras que acompañan. En las figuras se muestran los codones de inicio y de parada en negrilla y subrayados. Sin embargo, aunque el polipéptido PRO256 descrito en las figuras que acompañan se muestra que empieza con restos metionina designados en el presente documento como posición 1 de aminoácidos en las figuras, se puede concebir y es posible que se puedan usar otros restos metionina situados secuencia arriba o secuencia abajo de la posición 1 de aminoácidos, como resto aminoácido inicial para los polipéptidos PRO256.
El "dominio extracelular" o "ECD" del polipéptido PRO256 se refiere a una forma del polipéptido PRO256 que está esencialmente exento de dominios transmembrana o citoplasmáticos. Normalmente, un ECD del polipéptido PRO256 tendrá menos de 1% de dichos dominios transmembrana y/o citoplasmáticos y preferiblemente, tendrá menos de 0,5% de dichos dominios. Se entenderá que cualquier dominio transmembrana identificado para los polipéptidos PRO256 de la presente invención se indetificará siguiendo los criterios usados habitualmente en la técnica para identificar este tipo de dominio hidrófobo. Los límites exactos del dominio transmembrana pueden variar, pero lo más probable es que en no más de aproximadamente 5 aminoácidos en cualquiera de los extremos del dominio como se identifica inicialmente en el presente documento. Por lo tanto, opcionalmente, un dominio extracelular de un polipéptido PRO256 puede contener desde aproximadamente 5 o menos aminoácidos en cualquiera de los extremos del límite del dominio transmembrana/dominio extracelular, como se identifica en los ejemplos o memoria descriptiva, y dichos polipéptidos, con o sin péptido señal asociado, y ácido nucleico que los codifica, están contemplados por la presente invención.
La situación aproximada de los "péptidos señal" de los diferentes polipéptidos PRO256 descritos en el presente documento, se muestra en la presente memoria descriptiva y/o las figuras que acompañan. Sin embargo, se observará que el límite C-terminal de un péptido señal puede variar, pero lo más probable es que en no más de aproximadamente 5 aminoácidos en cualquiera de los extremos del límite C-terminal del péptido señal como se identifica inicialmente en el presente documento, en el que el límite C-terminal del péptido señal se puede identificar siguiendo criterios usados habitualmente en la técnica para identificar este tipo de elemento de secuencia de aminoácidos (p. ej., Nielsen y col., Prot. Eng., 10:1-6 (1997) y von Heinje y col., Nucl. Acids Res., 14:4683-4690 (1986)). Además, también se reconoce que, en algunos casos, la escisión de una secuencia señal de un polipéptido secretado no es completamente uniforme, dando como resultado más de una especie secretada. Estos polipéptidos maduros, en los que el péptido señal se escinde en no más de aproximadamente 5 aminoácidos en cualquiera de los lados del límite C-terminal del péptido señal como se identifica en el presente documento, y los polipéptidos que los codifican, están contemplados en la presente invención.
"Variante del polipéptido PRO256" significa un polipéptido PRO256 activo como se ha definido antes o a continuación, que tiene una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente 80% con una secuencia del polipéptido PRO256 de secuencia nativa de longitud completa como se describe en el presente documento, una secuencia del polipéptido PRO256 que carece del péptido señal como se describe en el presente documento, un dominio extracelular de un polipéptido PRO256, con o sin el péptido señal, como se describe en el presente documento o cualquier otro fragmento de una secuencia del polipéptido PRO256 de longitud completa como se describe en el presente documento. Dichas variantes del polipéptido PRO256 incluyen, por ejemplo, polipéptidos PRO256 en los que se añaden o suprimen uno o más restos aminoácidos, en el extremo N o C de la secuencia de aminoácidos nativa de longitud completa. Normalmente, una variante del polipéptido PRO256 tendrá una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente 80%, alternativamente una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente 81%, alternativamente una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente 82%, alternativamente una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente 83%, alternativamente una identidad de de aminoácidos de al menos aproximadamente 84%, alternativamente una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente 85%, alternativamente una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente 86%, alternativamente una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente 87%, alternativamente una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente 88%, alternativamente una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente 89%, alternativamente una identidad de de aminoácidos de al menos aproximadamente 90%, alternativamente una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente 91%, alternativamente una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente 92%, alternativamente una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente 93%, alternativamente una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente 94%, alternativamente una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente 95%, alternativamente una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente 96%, alternativamente una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente 97%, alternativamente una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente 98%, y alternativamente una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente 99% con respecto a una secuencia del polipéptido PRO256 de secuencia nativa de longitud completa como se describe en el presente documento, una secuencia del polipéptido PRO256 que carece del péptido señal como se describe en el presente documento, un dominio extracelular de un polipéptido PRO256, con o sin el péptido señal, como se describe en el presente documento, o cualquier otro fragmento definido específicamente de la secuencia del polipéptido PRO256 de longitud completa como se describe en el presente documento. Normalmente, las variantes del polipéptido PRO256 tienen aproximadamente 10 aminoácidos de longitud, alternativamente al menos aproximadamente 20 aminoácidos de longitud, alternativamente al menos aproximadamente 30 aminoácidos de longitud, alternativamente al menos aproximadamente 40 aminoácidos de longitud, alternativamente al menos aproximadamente 50 aminoácidos de longitud, alternativamente al menos aproximadamente 60 aminoácidos de longitud, alternativamente al menos aproximadamente 70 aminoácidos de longitud, alternativamente al menos aproximadamente 80 aminoácidos de longitud, alternativamente al menos aproximadamente 90 aminoácidos de longitud, alternativamente al menos aproximadamente 100 aminoácidos de longitud, alternativamente al menos aproximadamente 150 aminoácidos de longitud, alternativamente al menos aproximadamente 200 aminoácidos de longitud, alternativamente al menos aproximadamente 300 aminoácidos de longitud, o más.
Un "porcentaje (%) de identidad de secuencia de aminoácidos" con respecto a las secuencias del polipéptido PRO256 identificadas en el presente documento, se define como el porcentaje de restos de aminoácidos en una secuencia candidato, que son idénticos a los restos de aminoácidos en una secuencia de PRO256 después de alinear las secuencias e introducir huecos, si es necesario, para lograr el porcentaje de identidad de secuencia máximo, y no considerando ninguna sustitución conservativa como parte de la identidad de secuencia. El alineamiento para el propósito de determinar el porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos, se puede lograr de varias formas que conoce el experto en la técnica, por ejemplo, usando software para ordenador públicamente disponible tal como el software BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 o Megalign (DNASTAR). Los expertos en la técnica pueden determinar los parámetros adecuados para medir el alineamiento, incluyendo cualquier algoritmo necesario para lograr el alineamiento máximo a lo largo de la longitud completa de las secuencias que se comparan. Sin embargo, para el propósito del presente documento, los valores de % de identidad de secuencia de aminoácidos se obtienen como se describe a continuación usando el programa de ordenador de comparación de secuencias ALIGN-2, en el que el código fuente completo para el programa ALIGN-2 se proporciona en la Tabla 1. El programa de ordenador de comparación de secuencias ALIGN-2 lo produce Genentech, Inc., y el código fuente mostrado en la tabla 1 se ha presentado con la documentación para el usuario en la oficina de Copyright de EE.UU., Washington D.C., 20559, donde está registrado con registro de Copyright de EE.UU. nº TXU510087. El programa ALIGN-2 está disponible para el público en Genentech, Inc., South San Francisco, California, o se puede compilar a partir del código fuente proporcionado en la tabla 1. El programa ALIGN-2 debe ser compilado por el usuario en un sistema operativo UNIX, preferiblemente UNIX digital V4.0D. Todos los parámetros de comparación de secuencias están establecidos por el programa ALIGN-2 y no varían.
Para los propósitos del presente documento, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos A dada con respecto a, con o contra una secuencia de aminoácidos B dada (que alternativamente se puede expresar como una secuencia de aminoácidos A dada que tiene o comprende un determinado % de identidad de secuencia de aminoácidos con respecto a, con o contra una secuencia de aminoácidos B dada) se calcula como sigue:
100 veces la fracción X/Y
en donde X es el número de restos de aminoácidos puntuados como coincidencias idénticas por el programa de alineamiento de secuencias ALIGN-2 en el alineamiento del programa de A y B, y donde Y es el número total de restos de aminoácidos en B. Se observará que cuando la longitud de la secuencia de aminoácidos A no es igual a la longitud de la secuencia de aminoácidos B, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de A con respecto a B no será igual al % de identidad de secuencia de aminoácidos de B con respecto a A. Como ejemplos de cálculos de % de identidad de secuencia de aminoácidos, las tablas 2-3 muestran como calcular el % de identidad de secuencia de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos denominada "Proteína de comparación" con respecto a la secuencia de aminoácidos denominada "PRO256".
Salvo que se indique lo contrario, todos lo valores de % de identidad de secuencia de aminoácidos usados en el presente documento se obtienen como se ha descrito antes usando el programa de ordenador de comparación de secuencias ALIGN-2. sin embargo, el % de identidad de secuencia de aminoácidos también se puede determinar usando el programa de comparación de secuencias NCBI-BLAST2 (Altschul y col., Nucleic Acids Res., 25:3389-3402 (1997)). El programa de comparación de secuencias NCBI-BLAST2 se puede descargar de http://www.nc-bi.nlm.nih.gov. o de lo contrario se puede obtener del Instituto Nacional de Salud de Bethesda, MD. NCBI-BLAST2 usa varios parámetros de búsqueda, en el que todos estos parámetros de búsqueda se establecen como valores por defecto incluyendo, por ejemplo, no enmascaramiento = si, cadena = todas, incidencias esperadas =10, longitud de complejidad baja mínima = 15/5, valor e multi-paso = 0,01, constante para multi-paso = 25, abandono para alineamiento con huecos final = 25 y matriz de puntuación = BLOSUM62.
En situaciones en las que se usa NCBI-BLAST2 para las comparaciones de secuencias de aminoácidos, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos A dada con respecto, con o contra una secuencia de aminoácidos B dada (que alternativamente se puede expresar como una secuencia de aminoácidos A dada que tiene o comprende un determinado % de identidad de secuencia de aminoácidos con respecto a, con o contra una secuencia de aminoácidos B dada) se calcula como sigue:
100 veces la fracción X/Y
en donde X es el número de restos de aminoácidos puntuados como coincidencias idénticas por el programa de alineamiento de secuencias NCBI-BLAST2 en el alineamiento del programa de A y B, y donde Y es el número total de restos de aminoácidos en B. Se observará que cuando la longitud de la secuencia de aminoácidos A no es igual a la longitud de la secuencia de aminoácidos B, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de A con respecto a B no será igual al % de identidad de secuencia de aminoácidos de B con respecto a A.
Además, el % de identidad de secuencia de aminoácidos también se puede determinar usando el programa de ordenador WU-BLAST-2 (Altschul y col., Methods in Enzymology, 266:460-480 (1996)). La mayoría de los parámetros de búsqueda de WU-BLAST-2 se establecen como valores por defecto. Los que no se establecen como valores por defecto, es decir, los parámetros que se pueden ajustar, se establecen con los siguientes valores: extensión de superposición = 1, fracción de superposición = 0,125, umbral de palabra (T) = 11, y matriz de puntuación = BLOSUM62. Para los propósitos del presente documento, un valor de % de identidad de secuencia de aminoácidos se determina dividiendo (a) el número de coincidencias de restos de aminoácidos idénticos entre la secuencia de aminoácidos del polipéptido PRO256 de interés que tiene una secuencia derivada del polipéptido PRO256 nativo y la secuencia de aminoácidos de comparación de interés (es decir, la secuencia frente a la cual se está comparando el polipéptido PRO256 de interés, que puede ser una variante de polipéptido PRO) determinado por WU-BLAST-2, entre (b) el número total de restos de aminoácidos del polipéptido PRO de interés. Por ejemplo, en la expresión "un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos A que tiene una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos 80% con respecto a la secuencia de aminoácidos B", la secuencia de aminoácidos A es la secuencia de aminoácidos de comparación de interés y la secuencia de aminoácidos B es la secuencia de aminoácidos del polipéptido B de interés.
Un "polipéptido variante de PRO256" o "secuencia de aminoácidos variante de PRO256" significa una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido PRO256 activo según se define a continuación y que tiene una identidad de secuencia de ácido nucleico de al menos aproximadamente 80% con una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia del polipéptido PRO256 de secuencia nativa de longitud completa como se describe en el presente documento, una secuencia del polipéptido PRO256 de la secuencia nativa de longitud completa que carece de péptido señal como se describe en el presente documento, un dominio extracelular de un polipéptido PRO256, con o sin péptido señal como se describe en el presente documento, o cualquier otro fragmento de una secuencia del polipéptido PRO256 de longitud completa como se describe en el presente documento. Normalmente, un polinucleótido variante de PRO256 tendrá una identidad de secuencia de ácido nucleico de al menos aproximadamente 80%, alternativamente una identidad de secuencia de ácido nucleico de al menos aproximadamente 81%, alternativamente una identidad de secuencia de ácido nucleico de al menos aproximadamente 82%, alternativamente una identidad de secuencia de ácido nucleico de al menos aproximadamente 83%, alternativamente una identidad de de ácido nucleico de al menos aproximadamente 84%, alternativamente una identidad de secuencia de ácido nucleico de al menos aproximadamente 85%, alternativamente una identidad de secuencia de ácido nucleico de al menos aproximadamente 86%, alternativamente una identidad de secuencia de ácido nucleico de al menos aproximadamente 87%, alternativamente una identidad de secuencia de ácido nucleico de al menos aproximadamente 88%, alternativamente una identidad de secuencia de ácido nucleico de al menos aproximadamente 89%, alternativamente una identidad de de ácido nucleico de al menos aproximadamente 90%, alternativamente una identidad de secuencia de ácido nucleico de al menos aproximadamente 91%, alternativamente una identidad de secuencia de ácido nucleico de al menos aproximadamente 92%, alternativamente una identidad de secuencia de ácido nucleico de al menos aproximadamente 93%, alternativamente una identidad de secuencia de ácido nucleico de al menos aproximadamente 94%, alternativamente una identidad de secuencia de ácido nucleico de al menos aproximadamente 95%, alternativamente una identidad de secuencia de ácido nucleico de al menos aproximadamente 96%, alternativamente una identidad de secuencia de ácido nucleico de al menos aproximadamente 97%, alternativamente una identidad de secuencia de ácido nucleico de al menos aproximadamente 98%, y alternativamente una identidad de secuencia de ácido nucleico de al menos aproximadamente 99% con una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia del polipéptido PRO256 de la secuencia nativa de longitud completa como se describe en el presente documento, una secuencia del polipéptido PRO256 de la secuencia nativa de longitud completa que carece del péptido señal como se describe en el presente documento, un dominio extracelular de un polipéptido PRO256, con o sin el péptido señal, como se describe en el presente documento, o cualquier otro fragmento de una secuencia del polipéptido PRO256 de longitud completa como se describe en el presente documento. Las variantes no abarcan la secuencia de nucleótidos nativa.
Normalmente, los polinucléotidos variantes de PRO256 tienen al menos aproximadamente 30 nucleótidos de longitud, alternativamente al menos aproximadamente 60 nucleótidos de longitud, alternativamente al menos aproximadamente 90 nucleótidos de longitud, alternativamente al menos aproximadamente 120 nucleótidos de longitud, alternativamente al menos aproximadamente 150 nucleótidos de longitud, alternativamente al menos aproximadamente 180 nucleótidos de longitud, alternativamente al menos aproximadamente 210 nucleótidos de longitud, alternativamente al menos aproximadamente 240 nucleótidos de longitud, alternativamente al menos aproximadamente 270 nucleótidos de longitud, alternativamente al menos aproximadamente 300 nucleótidos de longitud, alternativamente al menos aproximadamente 450 nucleótidos de longitud, alternativamente al menos aproximadamente 600 nucleótidos de longitud, alternativamente al menos aproximadamente 900 nucleótidos de longitud, o más. Un "porcentaje (%) de identidad de secuencia de ácido nucleico" con respecto a las secuencias de ácido nucleico que codifican el polipéptido PRO256 identificadas en el presente documento, se define como el porcentaje de nucleótidos en una secuencia candidato, que son idénticos a los nucleótidos en una secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido PRO256, después de alinear las secuencias e introducir huecos, si es necesario, para lograr el porcentaje de identidad de secuencia máximo. El alineamiento para el propósito de determinar el porcentaje de identidad de secuencia de ácido nucleico, se puede lograr de varias formas que conoce el experto en la técnica, por ejemplo, usando software para ordenador públicamente disponible tal como el software BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 o Megalign (DNASTAR). Los expertos en la técnica pueden determinar los parámetros adecuados para medir el alineamiento, incluyendo cualquier algoritmo necesario para lograr el alineamiento máximo a lo largo de la longitud completa de las secuencias que se comparan. Sin embargo, para el propósito del presente documento, los valores de % de identidad de secuencia de ácido nucleico se obtienen como se describe a continuación usando el programa de ordenador de comparación de secuencias ALIGN-2, en el que el código fuente completo para el programa ALIGN-2 se proporciona en la tabla 1. El programa de ordenador de comparación de secuencias ALIGN-2 lo produce Genentech, Inc., y el código fuente mostrado en la tabla 1 se ha presentado con la documentación para el usuario en la oficina de Copyright de EE.UU., Washington D.C., 20559, donde está registrado con registro de Copyright de EE.UU. nº TXU510087. El programa ALIGN-2 está disponible para el público en Genentech, Inc., South San Francisco, California, o se puede compilar a partir del código fuente proporcionado en la tabla 1. El programa ALIGN-2 debe ser compilado por el usuario en un sistema operativo UNIX, preferiblemente UNIX digital V4.0D. Todos los parámetros de comparación de secuencias están establecidos por el programa ALIGN-2 y no varían.
Para los propósitos del presente documento, el % de identidad de secuencia de ácido nucleico de una secuencia de ácido nucleico C dada con respecto a, con o contra una secuencia de ácido nucleico D dada (que alternativamente se puede expresar como una secuencia de ácido nucleico C dada que tiene o comprende un determinado % de identidad de secuencia de ácido nucleico con respecto a, con o contra una secuencia de ácido nucleico D dada) se calcula como sigue:
100 veces la fracción W/Z
en donde W es el número de nucleótidos puntuados como coincidencias idénticas por el programa de alineamiento de secuencias ALIGN-2 en el alineamiento del programa de C y D, y donde Z es el número total nucleótidos en D. Se observará que cuando la longitud de la secuencia de ácido nucleico C no es igual a la longitud de la secuencia de ácido nucleico D, el % de identidad de secuencia de ácido nucleico de C con respecto a D no será igual al % de identidad de secuencia de ácido nucleico de D con respecto a C. Como ejemplos de cálculos de % de identidad de secuencia de ácido nucleico, las tablas 4-5 muestran como calcular el % de identidad de secuencia de ácido nucleico de la secuencia de ácido nucleico denominada "ADN de comparación" con respecto a la secuencia de ácido nucleico denominada "PRO-ADN".
Salvo que se indique específicamente lo contrario, todos lo valores de % de identidad de secuencia de ácido nucleico usados en el presente documento se obtienen como se ha descrito antes usando el programa de ordenador de comparación de secuencias ALIGN-2. Sin embargo, el % de identidad de secuencia de ácido nucleico también se puede determinar usando el programa de comparación de secuencias NCBI-BLAST2 (Altschul y col., Nucleic Acids Res., 25:3389-3402 (1997)). El programa de comparación de secuencias NCBI-BLAST2 se puede descargar de http://www.nc-bi.nlm.nih.gov. o de lo contrario se puede obtener del Instituto Nacional de Salud de Bethesda, MD. NCBI-BLAST2 usa varios parámetros de búsqueda, en el que todos estos parámetros de búsqueda se establecen como valores por defecto incluyendo, por ejemplo, no enmascaramiento = si, cadena = todas, incidencias esperadas =10, longitud de complejidad baja mínima = 15/5, valor e multi-paso = 0,01, constante para multi-paso = 25, abandono para alineamiento con huecos final = 25 y matriz de puntuación = BLOSUM62.
En situaciones en las que se usa NCBI-BLAST2 para las comparaciones de secuencias de ácido nucleico, el % de identidad de secuencia de ácido nucleico de una secuencia de ácido nucleico C dada con respecto, con o contra una secuencia de ácido nucleico D dada (que alternativamente se puede expresar como una secuencia de ácido nucleico C dada que tiene o comprende un determinado % de identidad de secuencia de ácido nucleico con respecto a, con o contra una secuencia de ácido nucleico D dada) se calcula como sigue:
100 veces la fracción W/Z
en donde W es el número de nucleótidos puntuados como coincidencias idénticas por el programa de alineamiento de secuencias NCBI-BLAST2 en el alineamiento del programa de C y D, y donde Z es el número total de nucleótidos en D. Se observará que cuando la longitud de la secuencia de ácido nucleico C no es igual a la longitud de la secuencia de ácido nucleico D, el % de identidad de secuencia de ácido nucleico de C con respecto a D no será igual al % de identidad de secuencia de ácido nucleico de D con respecto a C.
Además, los valores de % de identidad de secuencia de ácido nucleico también se pueden generar usando el programa de ordenador WU-BLAST-2 (Altschul y col., Methods in Enzymology, 266:460-480 (1996)). La mayoría de los parámetros de búsqueda de WU-BLAST-2 se establecen como valores por defecto. Los que no se establecen como valores por defecto, es decir, los parámetros que se pueden ajustar, se establecen con los siguientes valores: extensión de superposición = 1, fracción de superposición = 0,125, umbral de palabra (T) = 11, y matriz de puntuación = BLOSUM62. Para los propósitos del presente documento, un valor de % de identidad de secuencia de ácido nucleico se determina dividiendo (a) el número de coincidencias de nucleótidos idénticos entre la secuencia de ácido nucleico de la molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido PRO256 de interés que tiene una secuencia derivada del ácido nucleico que codifica el polipéptido PRO256 de secuencia nativa y la molécula de ácido nucleico de comparación de interés (es decir, la secuencia frente a la cual se está comparando la molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido PRO de interés, que puede ser un polipéptido variante de PRO) determinado por WU-BLAST-2, entre (b) el número total de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido PRO de interés. Por ejemplo, en la expresión "una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de ácido nucleico A que tiene una identidad de secuencia de ácido nucleico de al menos 80% con respecto a la secuencia de ácido nucleico B", la secuencia de ácido nucleico A es la molécula de ácido nucleico de comparación de interés y la secuencia de ácido nucleico B es la secuencia de ácido nucleico de la molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido PRO de interés.
En otras realizaciones, los polipéptidos variantes de PRO256 son moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido PRO256 activo y que son capaces de hibridar, preferiblemente de hibridar en condiciones de hibridación y lavado restrictivas, con secuencias de nucleótidos que codifican el polipéptido PRO256 de longitud completa como se muestra en la memoria descriptiva del presente documento y las figuras que acompañan. Los polipéptidos variantes de PRO256 pueden ser aquellos que son codificados por un polinucléotido variante de PRO256.
"Aislado" cuando se usa para describir los diferentes polipéptidos descritos en el presente documento, significa un polipéptido que se ha identificado y separado y/o recuperado de un componente de su entorno natural. Preferiblemente, el polipéptido aislado está libre de asociaciones con todos los componentes con los que está asociado de forma natural. Los componentes contaminantes de su entorno natural son materiales que normalmente interferirían con los usos de diagnóstico o terapéuticos del polipétido, y pueden incluir enzimas, hormonas, y otros solutos proteicos o no proteicos. En realizaciones preferidas, el polipéptido se purificará (1) hasta un grado suficiente para obtener al menos 15 restos de la secuencia de aminoácidos N-terminal o interna, usando un secuenciador de vaso giratorio, o (2) hasta homogeneidad por SDS-PAGE en condiciones no reductoras o reductoras usando azul de Coomassie, o preferiblemente tinción con plata. El polipéptido aislado incluye el polipéptido in situ en células recombinantes, puesto que al menos un componente del entorno natural de PRO256 no estará presente. Sin embargo, normalmente el polipéptido aislado se preparará mediante al menos una etapa de purificación.
Una molécula de ácido nucleico "aislada" que codifica un polipéptido PRO256 o una molécula de ácido nucleico "aislada" que codifica un anticuerpo anti-PRO256 es una molécula de ácido nucleico que se identifica y separa de al menos una molécula de ácido nucleico contaminante, con la cual está normalmente asociada en la fuente natural del ácido nucleico que codifica PRO256 o la fuente natural del ácido nucleico que codifica anti-PRO256. Preferiblemente, el ácido nucleico aislado está exento de las asociaciones con todos los componentes con los que se asocia naturalmente. Una molécula de ácido nucleico que codifica PRO256 aislada o una molécula de ácido nucleico que codifica anti-PRO256 aislada, es distinta de la forma o marco en el que se encuentra en la naturaleza. Por lo tanto, las moléculas de ácido nucleico aisladas se distinguen de la molécula de ácido nucleico aislada que codifica un polipéptido PRO256 o la molécula de ácido nucleico que codifica anti-PRO256 como existe en células naturales. Sin embargo, una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un polipéptido PRO256 o una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un anticuerpo anti-PRO256 incluye moléculas de ácido nucleico de PRO256 o moléculas de ácido nucleico de anti-PRO256 contenidas en células que normalmente expresan polipéptidos PRO256 o anticuerpo anti-PRO256, donde, por ejemplo, la molécula de ácido nucleico está en una posición cromosómica diferente de la de las células naturales.
La expresión "secuencias de control" se refiere a secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia codificante operativamente unida a un organismo huésped particular. Las secuencias de control que son adecuadas para procariotas, por ejemplo, incluyen, por ejemplo, un promotor, opcionalmente una secuencia operadora, y un sitio de unión al ribosoma. Se sabe que las células eucariotas usan promotores, señales de poliadenilación y potenciadores.
El ácido nucleico está "operativamente unido" cuando se coloca en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN para una presecuencia o secuencia líder secretora está operativamente unida a un ADN para un polipéptido PRO256, si se expresa como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o potenciador está operativamente unido a una secuencia codificante si afecta a la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión al ribosoma está operativamente unido a una secuencia codificante si está colocado de forma que facilite la traducción. En general, "operativamente unido" significa que las secuencias de ADN que están unidas son contiguas, y en el caso de una secuencia líder secretora, contigua y en fase de lectura. Sin embargo, los potenciadores no tienen que estar contiguos. La unión se realiza mediante el ligado en sitios de restricción convenientes. Si dichos sitios no existen, se usan adaptadores o conectores oligonucleótidos sintéticos, según la práctica convencional.
La "restricción" de las reacciones de hibridación las puede determinar fácilmente el experto en la técnica, y en general es un cálculo empírico que depende de la longitud de la sonda, temperatura de lavado y concentración de sal. En general, las sondas más largas requieren temperaturas mayores para la reasociación adecuada, mientras que las sondas más cortas necesitan temperaturas menores. En general, la hibridación depende de la capacidad del ADN desnaturalizado para reasociarse cuando hay presentes cadenas complementarias en un entorno por debajo de su temperatura de fusión. Cuando mayor es el grado de homología deseado entre la sonda y la secuencia de hibridación, mayor es la temperatura relativa que se puede usar. Como resultado, se sigue que las temperaturas relativas más altas tenderán a hacer las condiciones de reacción más restrictivas, mientras que las temperaturas menores harán que sean menos restrictivas. Para detalles adicionales y explicación de la restricción de las reacciones de hibridación, véase, Ausubel y col., Current Protocols in Molecular Biology (Wiley Interscience Publishers, 1995).
Las "condiciones restrictivas" o "condiciones muy restrictivas" según se definen en el presente documento, se pueden identificar como aquellas que: (1) usan concentración iónica baja y temperatura alta para el lavado, por ejemplo, cloruro sódico 0,015 M/citrato sódico 0,0015 M/dodecilsulfato sódico al 0,1% a 50ºC; (2) usa durante la hibridación un agente desnaturalizante tal como formamida, por ejemplo, formamida al 50% (v/v) con albúmina de suero bovino al 0,1% Ficoll al 0,1%/polivinilpirrolidona al 0,1%/tampón de fosfato sódico 50 mM a pH 6,5 con cloruro sódico 750 mM, citrato sódico 75 mM a 42ºC; o (3) usa formamida al 50%, 5 x SSC (NaCl 0,75 M, citrato sódico 0,075 M), fosfato sódico 50 mM (pH 6,8), pirofosfato sódico al 0,1%, 5 x disolución de Denhardt, ADN de esperma de salmón tratado con ultrasonidos (50 mg/ml), SDS al 0,1% y sulfato de dextrano al 10% a 42ºC, con lavados a 42ºC en 0,2 x SSC (cloruro sódico/citrato sódico) y formamida al 50% a 55ºC, seguido de un lavado de alta restricción que consta de 0,1 x SSC que contiene EDTA a 55ºC.
Las "condiciones de restricción moderada" se pueden identificar como describen Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York Cold Spring Harbor Press, 1989), e incluyen el uso de disolución de lavado y condiciones de hibridación (p. ej., temperatura, concentración iónica y % de SDS) menos restrictivas que las descritas antes. Un ejemplo de condiciones de restricción moderadas es incubación durante una noche a 37ºC en una disolución que comprende: formamida al 20%, 5 x SSC (NaCl 150 mM, citrato trisódico 15 mM), fosfato sódico 50 mM (pH 7,6), 5x disolución de Denhardt, sulfato de dextrano al 10%, y ADN de esperma de salmón fraccionado y desnaturalizado 20 mg/ml, seguido de lavado de los filtros en 1 x SSC a aproximadamente 37-50ºC. El experto en la técnica reconocerá como ajustar la temperatura, concentración iónica, etc. según sea necesario para acomodar factores tales como la longitud de la sonda y similares.
El modificante "epítopo etiquetado" cuando se usa en el presente documento, se refiere a un polipéptido quimérico que comprende un polipéptido PRO256 fusionado con un "polipéptido etiqueta". El polipéptido etiqueta tiene suficientes restos para proporcionar un epítopo contra el que se puede hacer un anticuerpo, y es suficientemente corto de modo que no interfiera con la actividad del polipéptido al que está fusionado. El polipéptido etiqueta preferiblemente también es bastante único de modo que el anticuerpo no tienen sustancialmente reacciones cruzadas con otros epítopos. Los polipéptidos etiqueta adecuados, en general tienen al menos 6 restos aminoácidos y normalmente entre aproximadamente 8 y aproximadamente 50 restos aminoácidos (preferiblemente, entre aproximadamente 10 y aproximadamente 20 restos aminoácidos).
"Activo" o "actividad" en el contexto de las variantes de PRO256 se refiere a una forma o formas de proteínas PRO256 que retienen las actividades biológicas y/o inmunológicas de un polipéptido PRO256 natural o nativo.
La "actividad biológica" en el contexto de una molécula que antagoniza un polipéptido PRO256 que se puede identificar por ensayos de selección descritos en el presente documento (p. ej., una molécula pequeña orgánica o inorgánica, péptido, etc.) se usa para referirse a la capacidad de dichas moléculas para unirse o formar complejo con el polipéptido PRO256 identificado en el presente documento, o interferir de otra forma con la interacción del polipéptido PRO256 con otras proteínas celulares o inhibir de otra forma la transcripción o traducción del polipéptido PRO256. La actividad biológica particularmente preferida incluye hipertrofia cardiaca, actividad que actúa en los trastornos sistémicos que afectan a los vasos, tales como la diabetes mellitus, así como enfermedades de las arterias, capilares, venas y/o vasos linfáticos, y cáncer.
El término "antagonista" se usa en el sentido más amplio, e incluye que bloquea, inhibe o neutraliza parcial o totalmente una o más de las actividades biológicas del polipéptido PRO256 descrito en el presente documento, por ejemplo, inhibición de la activación del polipéptido activador de HGF promoviendo de esta forma la actividad mitogénica o angiogénica que resulta de la activación del HGF. Los antagonistas de un polipéptido PRO256 pueden actuar inhibiendo la unión de un polipéptido PRO256 a su proteína activadora de HGF diana que es responsable de convertir el zimógeno del factor de crecimiento de hepatocitos en su forma activa, promoviendo de esta forma la actividad mitogénica, angiogénica u otra actividad biológica del HGF activado. Los antagonistas de un polipéptido PRO256 pueden tener una función en la promoción de la angiogénesis o reparación tisular, y por lo tanto pueden ser importantes para la revascularización terapéutica en la enfermedad vascular periférica, en la lesión hepática o renal, o en indicios de reestenosis.
De una forma similar, el término "agonista" se usa en el sentido más amplio, e incluye cualquier molécula que mimetiza una actividad biológica de un polipéptido PRO256 nativo descrito en el presente documento. Dichos agonistas son útiles para el tratamiento de enfermedades o trastornos caracterizados por neovascularización excesiva indeseada, incluyendo a modo de ejemplo, tumores y específicamente tumores malignos sólidos, artritis reumatoide, psoriasis, aterosclerosis, retinopatías diabéticas y otras, fibroplasia retrolental, degeneración macular relacionada con la edad, glaucoma neovascular, hemangiomas, hiperplasias del tiroides (incluyendo enfermedad de Grave), transplante de tejido córneo y otros, e inflamación crónica. Los agonistas también son útiles para el tratamiento de enfermedades o trastornos caracterizados por la permeabilidad vascular excesiva indeseable, tal como el edema asociado con tumores cerebrales, ascitis asociada con tumores malignos, síndrome de Meig, inflamación pulmonar, síndrome nefrótico, efusión pericárdica (tal como la asociada con la pericarditis) y efusión pleural. Las moléculas agonistas o antagonistas adecuadas incluyen específicamente anticuerpos agonistas o antagonistas o fragmentos de anticuerpos, fragmentos o variantes
de la secuencia de aminoácidos, de los polipéptidos PRO256 nativos, péptidos, moléculas orgánicas pequeñas, etc.
Una "molécula pequeña" se define en el presente documento como que tiene un peso molecular inferior a aproximadamente 500 daltons.
La expresión "receptor del polipéptido PRO256" tal como se usa en el presente documento, se refiere a un receptor celular para el polipéptido PRO256, normalmente un receptor de superficie celular encontrado en células endoteliales vasculares, así como variantes del mismo que retienen la capacidad de unirse a un polipéptido PRO256.
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Los "anticuerpos" (Acs) y las "inmunoglobulinas" (Igs) son glicoproteínas que tienen las mismas características estructurales. Mientras que los anticuerpos presentan especificidad de unión a un antígeno específico, las inmunoglobulinas incluyen tanto anticuerpos como otras moléculas de tipo anticuerpo que carecen de especificidad de antígeno. Los polipéptidos de esta última clase se producen, por ejemplo, con niveles bajos, en el sistema linfático y con niveles altos en los mielomas. El término "anticuerpo" se usa en su sentido más amplio y cubre específicamente, sin limitación, anticuerpos monoclonales intactos, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (p. ej. anticuerpos biespecíficos) formados a partir de al menos dos anticuerpos intactos, y fragmentos de anticuerpo, siempre que presentan la actividad biológica deseada.
Los "anticuerpos nativos" y las "inmunoglobulinas nativas" normalmente son glicoproteínas heterodímeras de aproximadamente 150.000 daltons, compuestas de 2 cadenas ligeras (L) idénticas y 2 cadenas pesadas (H) idénticas. Cada cadena ligera está unida a una cadena pesada por un enlace disulfuro covalente, mientras que el número de enlaces disulfuro varía entre las cadenas pesadas de los diferentes isotipos de inmunoglobulinas. Cada cadena pesada y ligera también tiene enlaces disulfuro dentro de la cadena espaciados regularmente. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (V_{H}) seguido de una serie de dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable en un extremo (V_{L}) y un dominio constante en su otro extremo; el dominio constante de la cadena ligera está alineado con el primer dominio constante de la cadena pesada, y el dominio variable de la cadena ligera está alineado con el dominio variable de la cadena pesada. Se cree que los restos de aminoácidos particulares forman una interfase entre los dominios variables de la cadena ligera y pesada.
El término "variable" se refiere al hecho de que determinadas partes del dominio variable difieren ampliamente en la secuencia entre anticuerpos y se usan en la unión y la especificidad de cada anticuerpo particular para su antígeno particular. Sin embargo, la variabilidad no está uniformemente distribuida a lo largo de los dominios variables de los anticuerpos. Se concentra en 3 segmentos llamados regiones determinantes de la complementaridad (CDR) o regiones hipervariables, ambas en los dominios variables de la cadena ligera y la cadena pesada. Las partes más altamente conservadas de los dominios variables se llaman regiones armazón (FR). Los dominios variables de las cadenas pesada y ligera nativos comprenden 4 regiones FR, que adoptan en gran medida una configuración de lámina \beta, conectadas por 3 CDR, que forman bucles de conexión, y en algunos casos forman parte de la estructura de lámina \beta. Las CDR en cada cadena son mantenidas juntas muy próximas por las regiones FR, y con las CDR de otra cadena contribuyen a la formación del sitio de unión al antígeno de los anticuerpos. Véase, Kabat y col., NIH Publ. No.91-3242. Vol. I. páginas 647-669 (1991). Los dominios constantes no están directamente implicados en la unión de un anticuerpo a un antígeno, si no que presentan diferentes funciones efectoras, tales como la participación del anticuerpo en la toxicidad celular dependiente de anticuerpo.
Los "fragmentos de anticuerpos" comprenden una parte de un anticuerpo intacto, preferiblemente la región de unión al antígeno o variable del anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen los fragmentos Fab, Fab', F(ab')_{2}, y Fv; dianticuerpos; anticuerpos lineales (Zapata y col., Protein Eng., 8(10): 1057-1062 (1995)); moléculas de anticuerpo de una cadena; y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos.
La digestión por la papaína de los anticuerpos produce 2 fragmentos de unión al antígeno idénticos, llamados fragmentos "Fab", cada uno con un solo sitio de unión al antígeno, y un fragmento "Fc" residual, cuyo nombre refleja su capacidad para cristalizar fácilmente. El tratamiento con pepsina da un fragmento F(ab')_{2} que tiene 2 sitios de combinación con antígeno, y todavía es capaz de hibridazarse con el antígeno.
"Fv" es el fragmento de anticuerpo mínimo que contiene un sitio completo de reconocimiento y unión del antígeno. Esta región consiste en un dímero de un dominio variable de una cadena pesada y una ligera en asociación estrecha y no covalente. Es en esta configuración en la que las 3 CDR de cada dominio variable interaccionan para definir un sitio de unión al antígeno en la superficie del dímero V_{H}-V_{L}. Colectivamente, las 6 CDR confieren especificidad de unión del antígeno al anticuerpo. Sin embargo, incluso un solo dominio variable (o la mitad de un Fv que comprende sólo 3 CDR específicas para un antígeno) tiene capacidad para reconocer y unirse al antígeno, pero con una afinidad menor que el sitio de unión entero.
El fragmento Fab también contiene el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH 1) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab' difieren de los fragmentos Fab por adición de unos pocos restos en el extremo carboxi del dominio CH1 de la cadena pesada que incluye una o más cisteínas de la región bisagra del anticuerpo. Fab'-SH es la designación en el presente documento para Fab' en el que el o los restos de cisteína de los dominios constantes llevan un grupo tiol libre. Los fragmentos de anticuerpo F(ab')_{2} se producían originalmente como parejas de los fragmentos Fab' que tienen cisteínas bisagra entre ellos. También se conocen otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpos.
Las "cadenas ligeras" de los anticuerpos (inmunoglobulinas) de cualquier especie de vertebrado se pueden asignar a 1 ó 2 tipos claramente distintos, llamados kappa (\kappa) y lambda (\lambda), basados en las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes.
Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas, las inmunoglobulinas se pueden asignar a diferentes clases. Hay 5 clases principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM; y varias de estas se pueden dividir además en subclases (isotipos)), p. ej., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA e IgA2. Los dominios constantes de la cadena pesada que corresponden a diferentes clases de inmunoglobulinas se llaman \alpha, \delta, \varepsilon, \gamma y \mu, respectivamente. Las estructuras de las subunidades y configuraciones tridimensionales de las diferentes clases de inmunoglobulinas son bien conocidas.
La expresión "anticuerpo monoclonal" tal como se usa en el presente documento, se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos salvo por las posibles mutaciones naturales que pueda haber presentes en pequeñas cantidades. Los anticuerpos monoclonales son muy específicos, están dirigidos contra un solo sitio antigénico. Además, en contraste con las preparaciones de anticuerpos convencionales (policlonales), cada anticuerpo monoclonal está dirigido contra un solo determinante en el antígeno. Además de su especificidad, los anticuerpos monoclonales son ventajosos en cuanto que son sintetizados por el cultivo de hibridoma, sin contaminación por otras inmunoglobulinas. El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo que se ha obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea, y no debe considerarse que requiere la producción del anticuerpo por cualquier procedimiento particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que se usan según la presente invención se pueden hacer por el procedimiento del hibridoma, descrito por primera vez por Kohler y col., Nature, 256: 495 (1975), o se pueden hacer por procedimientos de ADN recombinante, p. ej., patente de EE.UU. nº 4.816.567). Los "anticuerpos monoclonales" también se pueden aislar de bibliotecas de anticuerpos de fagos usando las técnicas descritas por Clackson y col., Nature, 352: 624-628 (1991) y Marks y col., J. Mop. Biol., 222: 581 -597 (1991), por ejemplo.
Los anticuerpos monoclonales del presente documento incluyen específicamente anticuerpos "quiméricos" (inmunoglobulinas) en los que una parte de la cadena pesada y/o ligera es idéntica u homóloga a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenecen a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras que las demás cadenas son idénticas u homólogas a otra clase o subclase de anticuerpo, así como fragmentos de dichos anticuerpos, siempre que presenten la actividad biológica deseada. Patente de EE.UU. 4.816.567; Morrison y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984).
Las formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (o. ej., murinos) son inmunoglobulinas quiméricas, cadenas de inmunoglobulinas o fragmentos de las mismas (tales como Fv, Fab, Fab', F(ab')_{2}, u otras subsecuencias de anticuerpos de unión al antígeno) que contienen la secuencia mínima derivada de la inmunoglobulina no humana. Para la mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que los restos de una CDR del receptor se sustituyen por restos de una CDR de una especie no humana (anticuerpo donador) tal como ratón, rata o conejo, que tienen la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los restos FR de Fv de la inmunoglobulina humana se sustituyen por los correspondientes restos no humanos. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender restos que no se encuentran ni en el anticuerpo receptor ni en la CDR importada o secuencias armazón. Estas modificaciones se hacen para refinar más y maximizar el rendimiento del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todo de al menos uno y normalmente dos, dominios variables, en los que todas o sustancialmente todas las regiones FR son las de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado preferiblemente también comprenderá al menos una parte de una región constante de inmunoglobulina (Fc), normalmente la de una inmunoglobulina humana. Para más detalles, véase Jones y col., Nature, 321: 522-525 (1986); Reichmann y col., Nature, 332: 323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596 (1992). El anticuerpo humanizado incluye un anticuerpo PRIMA-TIZED^{TM} en el que la región de unión al antígeno del anticuerpo deriva de un anticuerpo producido por inmunización de monos macacos con el antígeno de
interés.
Los fragmentos de anticuerpo "Fv de una cadena" o "sFv" comprenden los dominios V_{H} y V_{L} de un anticuerpo, en el que estos dominios están presentes en una sola cadena de polipéptido. Preferiblemente, el polipéptido Fv además comprende un conector de polipéptido entre los dominios V_{H} y V_{L} que permite que sFv forme la estructura deseada para la unión del antígeno. Para una revisión de sFv, véase Pluckthun en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg and Moore, eds. (Springer-Verlag: New York, 1994), pág. 269-315.
El término "dianticuerpos" se refiere a fragmentos de anticuerpos pequeños con 2 sitios de unión al antígeno, cuyos fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (V_{H}) conectado a un dominio variable de cadena ligera (V_{L}) en la misma cadena de polipéptido (V_{H}-V_{L}). Mediante el uso de un conector que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena, los dominios están forzados a emparejarse con dominios complementarios de otra cadena y crear 2 sitios de unión al antígeno. Se describen dianticuerpos con más detalle, por ejemplo en los documentos EP 404,097; WO 93/11161; y Hollinger y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993).
Un anticuerpo "aislado" es uno que se ha identificado y separado y/o recuperado de un componente de su entorno natural. Los componentes contaminantes de su entorno natural son materiales que normalmente interferirían con los usos de diagnóstico o terapéuticos del anticuerpo, y pueden incluir enzimas, hormonas, y otros solutos proteicos o no proteicos. En realizaciones preferidas, el anticuerpo se purificará (1) a más de 95% en peso del anticuerpo, determinado por el procedimiento de Lowry y más preferiblemente a más de 99% en peso, (2) hasta un grado suficiente para obtener al menos 15 restos de secuencia de aminoácidos N-terminal o interna usando un secuenciador de vaso giratorio, o (3) hasta homogeneidad por SDS-PAGE en condiciones no reductoras o reductoras usando azul de Coomassie, o preferiblemente tinción con plata. El anticuerpo aislado incluye el anticuerpo in situ en células recombinantes, puesto que al menos un componente del entorno natural del anticuerpo no estará presente. Sin embargo, normalmente el anticuerpo aislado se preparará mediante al menos una etapa de purificación.
Un anticuerpo que "se une específicamente a" o es "específico para" un polipéptido particular o un epítopo en un polipéptido particular, es uno que se une a ese polipéptido o epítopo particular en un polipéptido particular sin unirse sustancialmente a cualquier otro polipéptido o epítopo del polipéptido.
La palabra "marcador" cuando se usa en el presente documento, se refiere a un compuesto detectable u otra composición que está conjugada directa o indirectamente con el anticuerpo de modo que genera un anticuerpo "marcado". El marcador puede ser detectable por si mismo (p. ej., marcadores radioisótopos o marcadores fluorescentes), o en el caso de un marcador enzimático, puede catalizar la alteración química de un compuesto sustrato o composición que es detectable. Los radionucleidos que pueden servir como marcadores detectables incluyen, por ejemplo, I-131, I-123, I-125, Y-90, Re-188, At-211, Cu-67, Bi-212, y Pd-109. El marcador también pueden ser una entidad no detectable tal como una toxina.
Por "fase sólida" se entiende una matriz no acuosa a la que se puede adherir un anticuerpo de la presente invención. Los ejemplos de fases sólidas abarcadas en el presente documento, incluyen las formadas parcial o enteramente de vidrio (p. ej., vidrio de poros controlados), polisacáridos (p. ej., agarosa), poliacrilamidas, poliestireno, poli(alcohol vinílico) y siliconas. En algunas realizaciones, dependiendo del contexto, la fase sólida puede comprender el pocillo de una placa de ensayo; en otras es una columna de purificación (p. ej., una columna de cromatografía por afinidad). Este término también incluye una fase sólida discontinua de partículas discretas, tal como se describe en la patente de EE.UU. nº 4.275.149.
Un "liposoma" es una vesícula pequeña compuesta de diferentes tipos de lípidos, fosfolípidos y/o tensioactivos, que es útil para el suministro de un fármaco (tal como el polipéptido PRO256 o anticuerpos contra el mismo, descritos en el presente documento) a un mamífero. Los componentes del liposoma normalmente se disponen en una formación de bicapa, similar a la disposición de lípidos de las membranas biológicas.
Tal como se usa en el presente documento, el término "inmunoadhesina" designa una molécula de tipo anticuerpo que combina la especificidad de unión de una proteína heteróloga (una "adhesina") con las funciones efectoras de los dominios constantes de inmunoglobulina. Estructuralmente, las inmunoadhesinas comprenden una fusión de una secuencia de aminoácidos con la especificidad de unión deseada que distinta del sitio de reconocimiento del antígeno y sitio de unión de un anticuerpo (es decir, es "heterólogo") y una secuencia del dominio constante de inmunoglobulina. La parte de adhesina de una molécula de inmunoadhesina normalmente es una secuencia de aminoácidos contigua que comprende al menos el sitio de unión de un receptor o un ligando. La secuencia del dominio constante de inmunoglobilina en la inmunoadhesina se puede obtener de cualquier inmunoglobulina, tal como los subtipos IgG-1, IgG-2, IgG-3 o IgG-4, IgA (incluyendo IgA-1 e IgA-2), IgE, IgD o IgM.
Como se muestra a continuación, la tabla 1 proporciona el código fuente completo para el programa de ordenador de comparación de secuencias ALIGN-2. Este código fuente lo puede compilar rutinariamente el usuario en un sistema operativo UNIX para proporcionar el programa de ordenador de comparación de secuencias ALIGN-2.
Además, las tablas 2-5 presentan ejemplos hipotéticos para usar el procedimiento descrito a continuación para determinar el % de identidad de secuencia de aminoácidos (tablas 2-3) y el % de identidad de secuencia de ácido nucleico (tablas 4-5) usando el programa de ordenador de comparación de secuencias ALIGN-2, en el que "PRO" representa la secuencia de aminoácidos de un polipéptido PRO hipotético de interés, "Proteína de comparación" representa la secuencia de aminoácidos de un polipéptido frente al que se está comparando el polipéptido "PRO", "PRO-ADN" representa una secuencia de ácido nucleico que codifica PRO de interés, "ADN de comparación" representa la secuencia de ácido nucleico de una molécula de ácido nucleico frente a la que se está comparando la molécula de ácido nucleico "PRO-ADN" de interés, "X", "Y" y "Z" representa cada uno restos de aminoácidos hipotéticos, y "N", "L" y "V" representa cada uno diferentes nucleótidos hipotéticos.
TABLA 1
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TABLA 2
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TABLA 3
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TABLA 4
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TABLA 5
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II. Composiciones y procedimientos de la invención A. Variantes de PRO254
Además de los polipéptidos PRO256 de secuencia nativa de longitud completa descritos en el presente documento, se contempla que se pueden preparar variantes de PRO256. Las variantes de PRO256 se pueden preparar introduciendo cambios de nucleótidos adecuados en el ADN de PRO256, y/o por síntesis del polipéptido PRO256 deseado. Los expertos en la materia apreciarán que los cambios de aminoácidos pueden alterar los procesos postraduccionales del polipéptido PRO256, tal como cambiar el número o posición de sitios de glicosilación o alterar las características de anclaje de la membrana.
Las variaciones en el polipéptido PRO256 de secuencia nativa de longitud completa o en diferentes dominios del polipéptido PRO256 descrito en el presente documento, se pueden hacer, por ejemplo, usando cualquiera de las técnicas y guías de mutaciones conservativas y no conservativas expuestas, por ejemplo, en la patente de EE.UU. nº 5.364.934. Las variaciones pueden ser una sustitución, deleción o inserción de uno o más codones que codifican el polipéptido PRO256, que dan como resultado un cambio en la secuencia de aminoácidos del polipéptido PRO256 comparado con el polipéptido PRO256 de secuencia nativa. Opcionalmente, la variación es por sustitución de al menos un aminoácido por cualquier otro aminoácido en uno o más de los dominios del polipéptido PRO256. La guía para determinar que resto de aminoácido se puede insertar, sustituir o eliminar sin afectar de forma adversa a la actividad deseada, se puede encontrar comparando la secuencia del polipéptido PRO256 con la de moléculas de proteína homólogas conocidas y minimizando el número de cambios en la secuencia de aminoácidos hechos en regiones con homología alta. Las sustituciones de aminoácidos pueden dar como resultado la sustitución de un aminoácido por otro aminoácido que tiene propiedades estructurales y/o químicas similares, tal como la sustitución de una leucina por una serina, es decir, sustituciones de aminoácidos conservativas. Las inserciones o deleciones se pueden hacer opcionalmente en el intervalo de aproximadamente 1 a 5 aminoácidos. La variación permitida se puede determinar haciendo sistemáticamente inserciones, deleciones o sustituciones de aminoácidos en la secuencia y ensayando la actividad de las variantes que resultan respecto a la presentada por la secuencia nativa madura o de longitud
completa.
En realizaciones particulares, las sustituciones conservativas de interés se muestran en la tabla 6 bajo el encabezamiento de sustituciones preferidas. Si dichas sustituciones dan como resultado un cambio en la actividad biológica, entonces se introducen más cambios sustanciales, denominados sustituciones de ejemplo en la tabla 6 o descritas con más detalle a continuación en referencia a las clases de aminoácidos, y se seleccionan los productos.
TABLA 6
34 
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Las modificaciones sustanciales en la función o identidad inmunológica del polipéptido PRO256 se llevan a cabo seleccionando sustituciones que difieran significativamente en su efecto en mantener (a) la estructura de la cadena principal del polipéptido en la zona de la sustitución, por ejemplo, en una conformación en lámina o hélice, (b) la carga o la hidrofobicidad de la molécula en el sitio diana, o (c) el volumen de la cadena lateral. Los restos naturales se dividen en grupos basándose en las propiedades comunes de las cadenas laterales:
(1) hidrófobos: norleucina, met, ala, val, leu, ile;
(2) hidrófilos neutros: cys, ser, thr;
(3) ácidos: asp, glu;
(4) básicos: asn, gln, his, lys, arg;
(5) restos que influyen en la orientación de la cadena: gly, pro; y
(6) aromáticos: trp, tyr, phe.
Las sustituciones no conservativas implicarán cambiar un miembro de una de estas clases por otra clase. Dichos restos sustituidos también se pueden introducir en los sitios de sustituciones conservativas, o más preferiblemente, en los sitios restantes (no conservados).
Las variaciones se pueden hacer usando procedimientos conocidos en la técnica tales como mutagénesis (dirigida) mediada por oligonucleótido, barrido de alanina y mutagénesis por PCR. La mutagénesis dirigida [Carter y col., Nucl. Acids Res., 13: 4331 (1986); Zoller y col., Nucl. Acids Res., 10:6487 (1987)], mutagénesis de casete [Wells y col., Gene, 34:315 (1985)], mutagénesis de selección por restricción [Wells y col., Philos. Trans. R. Soc. London Sera. 317:415 (1986)] u otras técnicas conocidas, se pueden realizar en el ADN clonado para producir el ADN variante de PRO256.
El análisis por barrido de aminoácido también se puede usar para identificar uno o más aminoácidos a lo largo de una secuencia contigua. Entre los aminoácidos de barrido preferidos están los aminoácidos neutros, relativamente pequeños. Dichos aminoácidos incluyen alanina, glicina, serina y cisteína. Normalmente, la alanina es un aminoácido de barrido preferido en este grupo, porque elimina la cadena lateral más allá del carbono beta y es menos probable que se altere la conformación de la cadena principal de la variante [Cunningham y Wells, Science, 244:1081-1085 (1989)]. También se prefiere normalmente la alanina porque es el aminoácido más común. Además, se encuentra con frecuencia tanto en posiciones escondidas como expuestas [Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman y Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150:1 (1976)]. Si la sustitución de alanina no da cantidades adecuadas de variante, se puede usar un aminoácido isostérico.
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B. Modificaciones de los polipéptidos PRO256
Las modificaciones covalentes de los polipéptidos PRO256 están incluidas dentro del alcance de esta invención. Un tipo de modificación covalente incluye hacer reaccionar restos de aminoácidos diana de un polipéptido PRO256 con un agente orgánico derivatizante que es capaz de reaccionar con cadenas laterales seleccionadas o los restos N o C terminales del polipéptido PRO256. La derivatización con agentes bifuncionales es útil, por ejemplo, para la reticulación del polipéptido PRO256 a una matriz o superficie de soporte insoluble en agua para usar en el procedimiento de purificación de anticuerpos anti-PRO256, y viceversa. Los agentes de reticulación usados habitualmente incluyen, p. ej., 1,1-bis(diazoacetil)-2-feniletano, glutaraldehído, ésteres de N-hidroxisuccinimida, por ejemplo, ésteres con ácido 4-azidosalicílico, imidoésteres homobifuncionales, incluyendo ésteres de disuccinimidilo tales como 3,3'-ditiobis(propionato de succinimidilo), maleimidas bifuncionales tales como bis-N-maleimido-1,8-octano y agentes tales como 3-[(p-azidofenil)-ditio]propioimidato de metilo.
Otras modificaciones incluyen la desamidación de restos glutaminilo y asparaginilo a los correspondientes restos glutamilo y aspartilo, respectivamente, hidroxilación de prolina y lisina, fosforilación de grupos hidroxilo de restos serilo o treonilo, metilación de los grupos \alpha-amino de las cadenas laterales de lisina, arginina e histidina [T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman y Co., San Francisco, pág. 79-86 (1983)], acetilación de la amina N-terminal, y amidación del cualquier grupo carboxilo C-terminal.
Otro tipo de modificación covalente del polipéptido PRO256 incluida en el alcance de esta invención, comprende alterar el patrón de glicosilación nativo del polipéptido. "Alterar el patrón de glicosilación nativo" para los propósitos del presente documento significa eliminar uno o más restos carbohidrato encontrados en el polipéptido PRO256 de secuencia nativa (eliminando el sitio de glicosilación subyacente o eliminando la glicosilación por medios químicos y/o enzimáticos), y/o añadir uno o más sitios de glicosilación que no estaban presentes en el polipéptido PRO256 de secuencia nativa. Además, la frase incluye cambios en la glicosilación de las proteínas nativas que implican un cambio en la naturaleza y proporciones de los diferentes restos de carbohidratos presentes.
La adición de sitios de glicosilación en el polipéptido PRO256 se puede llevar a cabo alterando la secuencia de aminoácidos. La alteración se puede hacer, por ejemplo, mediante la adición o sustitución de uno o más restos serina o treonina del polipéptido PRO256 de secuencia nativa (para los sitios de glicosilación unidos a O). La secuencia de aminoácidos de PRO256 se puede alterar opcionalmente mediante cambios a nivel del ADN, en particular mediante mutación del ADN que codifica el polipéptido PRO256 en bases preseleccionadas, de modo que se generen codones que se traducirán en los aminoácidos deseados.
Otro medio de aumentar el número de restos de carbohidratos en el polipéptido PRO256 es por acoplamiento químico o enzimático de glicósidos al polipéptido. Dichos procedimientos están descritos en la materia, p. ej., en el documento WO 87/05330 publicado el 11 de septiembre de 1987, y en Aplin y Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pág. 259-306 (1981).
La eliminación de restos de carbohidratos presentes en el polipéptido PRO256 se puede llevar a cabo química o enzimáticamente o por sustitución por mutación de codones que codifican los restos de aminoácido que sirven de dianas para la glicosilación. Las técnicas de desglicosilación química son conocidas en la materia y las describen, por ejemplo, Hakimuddin, y col., Arch. Biochem. Biophys., 259:52 (1987) y Edge y col., Anal. Biochem., 118:131 (1981). La escisión enzimática de restos de carbohidratos en los polipéptidos se puede lograr usando una variedad de endo y exoglicosidasas como describen Thotakura y col., Meth. Enzymol., 138:350 (1987).
Otro tipo de modificación covalente del polipéptido PRO256 comprende la unión del polipéptido PRO256 a una variedad de polímeros no proteicos, p. ej., polietilenglicol (PEG), propilenglicol o polioxialquilenos, de la forma expuesta en las patentes de EE.UU. nº 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192 ó 4.179.337.
El polipéptido PRO256 también se puede modificar de una manera que forme una molécula quimérica que comprende el polipéptido PRO256 fusionado a otra secuencia de aminoácido o polipéptido heteróloga.
Dicha molécula quimérica puede comprender una fusión del polipéptido PRO256 con un polipéptido etiqueta que proporciona un epítopo al que se puede unir selectivamente un anticuerpo anti-etiqueta. El epítopo etiqueta en general se pone en el extremo amino o carboxilo del polipéptido PRO256. La presencia de dichas formas de epítopo etiquetado en el polipéptido PRO256 se pueden detectar usando un anticuerpo contra el polipéptido etiqueta. Además, el proporcionar el epítopo etiqueta permite que el polipéptido PRO256 sea purificado fácilmente por purificación por afinidad usando un anticuerpo anti-etiqueta u otro tipo de matriz de afinidad que se una al epítopo etiqueta. Se conocen bien en la técnica diferentes polipéptidos etiqueta y sus respectivos anticuerpos. Los ejemplos incluyen etiquetas de poli-histidina (poli-His) o poli-histidina-glicina (poli-His-gly); el polipéptido etiqueta HA de la gripe y su anticuerpo 12CA5 [Field y col., Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988)]; la etiqueta c-myc y los anticuerpos 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 y 9E10 para la misma [Evan y col., Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985)]; y la etiqueta glicoproteína D (gD) del virus Herpes Simplex y su anticuerpo [Paborsky y col., Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990)]. Otros polipéptidos etiqueta incluyen el péptido Flag [Hopp y col., BioTechnology, 6:1204-1210 (1988)]; el péptido epítopo KT3 [Martin y col., Science, 255:192-194 (1992)]; un péptido epítopo de \alpha-tubulina [Skinner y col., J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991)]: y la etiqueta péptido proteína 10 del gen T7 [Lutz-Freyermuth y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393-6397 (1990)].
Alternativamente, la molécula quimérica puede comprender una fusión del polipéptido PRO256 con una inmunoglobulina o una región particular de una inmunoglobulina. Para una forma bivalente de la molécula quimérica (también denominada una "inmunoadhesina") dicha fusión podría ser con la región Fc de una molécula de IgG. Las fusiones de Ig preferiblemente incluyen la sustitución de una forma soluble (dominio transmembrana eliminado o inactivado) de un polipéptido PRO256 en el lugar de al menos una región variable en una molécula de Ig. En una realización particularmente preferida, la fusión de inmunoglobulina incluye las regiones bisagra, CH2 y CH3, o las regiones bisagra, CH1, CH2 y CH3 de una molécula de IgG1. Para la producción de fusiones de inmunoglobulinas véase también la patente de EE.UU. nº 5.428.130 presentada el 27 de junio, 1995.
C. Preparación del polipéptido PRO256
La presente invención proporciona secuencias de nucleótidos recién identificadas y aisladas que codifican polipéptidos denominados en la presente solicitud polipéptidos PRO256, para usos médicos como se describe en el presente documento. En particular se han identificado y aislado ADNc que codifican polipéptidos PRO256, como se describe con más detalle en los siguientes ejemplos. Hay que indicar que las proteínas producidas en ciclos de expresión separados pueden dar diferentes números de PRO, pero el número UNQ es único para cualquier ADN dado y la proteína codificada, y no se cambiará. Sin embargo, para mayor simplicidad, en la presente memoria descriptiva la proteína codificada por el ADN PRO así como todos los homólogos nativos y variantes adicionales incluidos en la definición anterior de polipéptidos PRO256, se denominarán "PRO256" independientemente de su origen o modo de preparación.
La siguiente descripción se refiere principalmente a la producción de polipéptidos PRO256 mediante el cultivo de células transformadas o transfectadas con un vector que contiene el ácido nucleico que codifica polipéptidos PRO256. Se contempla, por supuesto, que se pueden usar procedimientos alternativos que son conocidos en la técnica, para preparar el polipéptido PRO256. Por ejemplo, la secuencia del polipéptido PRO256, o partes de la misma, se pueden producir por síntesis de péptido directa usando técnicas de fase sólida. Véase p. ej., Stewart y col., Solid-Phase Peptide Synthesis (W.H. Freeman Co.: San Francisco. CA, 1969); Merrifield, J. Am Chem Soc., 85:2149-2154 (1963). La síntesis de proteínas in vitro se puede llevar a cabo usando técnicas manuales o mediante síntesis automática, por ejemplo con un sintetizador Applied Biosystems Peptide Synthesizer (Foster City, CA) usando las instrucciones del fabricante. Se pueden sintetizar químicamente por separado diferentes partes del polipéptido PRO256 y combinarlas usando procedimientos químicos o enzimáticos para producir el polipéptido PRO256 de longitud completa.
i. Aislamiento del ADN que codifica polipéptidos PRO256
El ADN que codifica el polipéptido PRO256 se puede obtener a partir de una biblioteca de ADNc preparada a partir de tejido que se cree que tiene el ARNm que codifica el polipéptido PRO256 y que lo expresa en un nivel detectable. Por consiguiente, los ADN que codifican el polipéptido PRO256 humano se pueden obtener de forma conveniente a partir de bibliotecas de ADNc preparadas a partir de tejidos humanos, como se describe en los ejemplos. El gen que codifica el polipéptido PRO256 también se puede obtener a partir de una genoteca o por síntesis de oligonucleótidos.
Las bibliotecas se pueden cribar con sondas (tales como anticuerpos contra el polipéptido PRO256 u oligonucleótidos de al menos aproximadamente 20-80 bases) diseñadas para identificar el gen de interés o la proteína codificada por el mismo. El cribado de bibliotecas de ADNc o de genes con la sonda seleccionada se puede llevar a cabo usando procedimientos estándar, como describen Sambrook y col., véase antes. Un medio alternativo para aislar el gen que codifica el polipéptido PRO256 es usar la metodología de la PCR. Sambrook y col, véase antes; Dieffenbach y col., PCR Primer: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995).
Los siguientes ejemplos describen técnicas para el cribado de bibliotecas de ADNc. Las secuencias de oligonucleótidos seleccionadas como sondas deben tener una longitud suficiente y deben ser suficientemente no ambiguas para que se minimicen los falsos positivos. El oligonucleótido preferiblemente se marca de modo que se pueda detectar tras la hibridación con el ADN en la biblioteca que se está cribando. Los procedimientos de marcaje son conocidos en la materia, e incluyen el uso de radiomarcadores tales como ATP macado con ^{32}P, biotinilación o marcado enzimático. Las condiciones de hibridación, incluyendo la restricción moderada y la restricción alta, se proporcionan en Sambrook y col., véase antes.
Las secuencias identificadas en dichos procedimientos de cribado de bibliotecas se pueden comparar y alinear con otras secuencias conocidas depositadas y disponibles en bases de datos públicas tales como GenBank y otras bases de datos de secuencias privadas. La identidad de secuencia (a nivel de aminoácidos o nucleótidos) dentro de regiones definidas de la molécula o a lo largo de la secuencia de longitud completa, se puede determinar mediante el alineamiento de secuencias usando programas de software de alineamiento de secuencias tales como ALIGN, DNAstar y INHERIT, que usan diferentes algoritmos para medir la homología.
El ácido nucleico que tiene secuencia codificante de proteína se puede obtener mediante cribado de bibliotecas de ADNc o genómicas seleccionadas, usando la secuencia de aminoácidos deducida descrita en el presente documento por primera vez, y, si es necesario, usando procedimientos de extensión de cebador convencionales como describen Sambrook y col., véase antes, para detectar precursores y procesar intermedios de ARNm que pueden no dar la transcripción inversa a ADNc.
ii. Selección y transformación de células huésped
Las células huésped se transfectan o transforman con vectores de expresión o clonación descritos en el presente documento para producir el polipéptido PRO256, y se cultivan en medios nutrientes convencionales modificados según convenga para inducir promotores, seleccionar transformantes, o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas. Las condiciones de cultivo, tales como el medio, temperatura, pH y similares, las puede seleccionar el experto en la materia sin excesiva experimentación. En general, se pueden encontrar principios, protocolos y técnicas prácticas para maximizar la productividad de cultivos celulares en Mammalian Cell Biotechnology: A Practical Approach, M. Butler, ed. (IRL Press, 1991) y Sambrook y col., véase antes.
Los procedimientos de transfección son conocidos para los expertos en la materia, por ejemplo, el tratamiento con CAPO_{4} y electroporación. Dependiendo de la célula huésped usada, la transformación se realiza usando técnicas estándar adecuadas para dichas células. El tratamiento con calcio usa cloruro de calcio como se describe en Sambrook y col., véase antes, o se usa en general electroporación para procariotas u otras células que contienen sustanciales barreras de pared celular. Se usa la infección con Agrobacterium tumefaciensis para la transformación de determinadas células vegetales, como describen Shaw y col., Gene, 23: 315 (1983) y el documento WO 89/05859 publicado el 29 de junio de 1989. Para las células de mamíferos sin dichas paredes celulares, se puede usar el procedimiento de precipitación con fosfato de calcio de Graham y van der Eb, Virology 52:456-457 (1978). Se han descrito aspectos generales de las transformaciones con sistemas huésped de células de mamífero en la patente de EE.UU. nº 4.399.216. Las transformaciones en levaduras normalmente se llevan a cabo por el procedimiento de Van Solingen y col., J. Bact., 130: 946 (1977) y Hsiao y col., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 76: 3829 (1979). Sin embargo, también se pueden usar otros procedimientos para introducir el ADN en células, tales como la microinyección nuclear, electroporación, fusión de protoplastos bacterianos con células intactas, o policationes, p. ej., polibreno o poliornitina. Para diferentes técnicas de transformación de células de mamífero, véase Keown y col., Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990) y Mansour y col., Nature, 336: 348-352 (1988).
Las células huésped adecuadas para clonar o expresar el ADN en los vectores del presente documento, incluyen procariotas, levaduras, o células eucariotas superiores. Las procariotas adecuadas incluyen, pero no se limitan a eubacterias, tales como organismos Gram positivos o Gram negativos, por ejemplo enterobacteriáceas tales como E. coli. Están disponibles al público diferentes cepas de E. coli, tales como la cepa de E. coli K12 MM294 (ATCC 31.446); E. coli X1776 (ATCC 31.537); cepa de E. coli W3110 (ATCC 27.325); y K5 772 (ATCC 53.635). Otras células huésped procariotas adecuadas incluyen enterobacteriáceas tales como Escherichia, p. ej., E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, p. ej., Salmonella typhimurium, Serratia, p. ej., Serratia marcescans y Shigella, así como Bacilli tales como B. subtilis y B. licheniformis (p. ej., B. licheniformis 41P descrito en el documento DD 266.710 publicado el 12 de abril de 1989), Pseudomonas tales como P. aeruginosa, y Streptomyces. Estos ejemplos son ilustrativos más que limitantes. La cepa W3110 es un huésped particularmente preferido o el huésped original, porque es una cepa huésped común para las fermentaciones de productos de ADN recombinantes. Preferiblemente, la célula huésped secreta cantidades mínimas de enzimas proteolíticas. Por ejemplo, la cepa W3110 se puede modificar para realizar una mutación genética en los genes que codifican proteínas endógenas del huésped, incluyendo los ejemplos de dicho huésped la cepa de E. coli W3110 1A2, que tiene el genotipo completo de tonA; cepa de E. coli W3110 9E4, que tiene el genotipo completo de tonAptr3; cepa de E. coli W3110 27C7 (ATCC 55.244), que tiene el genotipo completo de tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac)169 degP ompT kan^{r}; cepa de E. coli W3110 37D6, que tiene el genotipo completo de tonA ptr3 phoA E15 (argF lac) 169 degP ompT rbs7 ilvG kan^{r}; cepa de E. coli W3110 4084, que es la cepa 37D6 con una mutación por deleción de degP de resistencia a la kanamicina; y una cepa de E. coli que tiene proteasa periplásmica mutante descrita en la patente de EE.UU. nº 4.946.783 presentada el 7 de agosto de 1990. Alternativamente, son adecuados procedimientos de clonación in vitro, p. ej., PCR u otras reacciones de polimerasa de ácidos nucleicos.
Además de procariotas, los microbios procariotas tales como hongos filamentosos o levaduras son huéspedes de expresión o clonación adecuados para vectores que codifican el polipéptido PRO256. Saccharomyces cerevisiae es un microorganismo huésped eucariota usado habitualmente. Otros incluyen Schizosaccharomyces pombe (Beach y Nurse, Nature, 290: 140 [1981]; documento EP 139.383 publicado el 2 de mayo de 1985); huéspedes Kluyveromyces (patente de EE.UU. nº 4.943.529; Fleer y col., Bio/Technology, 9:968-975 (1991)) tales como, p. ej., K. lactis (MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt y col., J. Bacteriol., 737 [1983]), K. fragilis (ATCC 12.424), K. bulgaricus (ATCC 16.045), K. wickeramii (ATCC 24.178), K. waltii (ATCC 56.500), K. drosophilarum (ATCC 36.906; Van den Berg y col., Bio/Technology, 8:135(1990)), K. thermotolerans, y K. marxianus; yarrowia (documento EP 402.226); Pichia pastoris (documento EP 183.070; Sreekrishna y col., J. Basic Microbiol., 28: 265-278 [1988]); Candida; Trichoderma reesia (documento EP 244.234); Neurospora crassa (Case y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 5259-5263 [1979]); Schwanniomyces tales como Schwanniomyces occidentalis (documento EP 394.538 publicado el 31 de octubre de 1990); y hongos filamentosos tales como, p. ej., Neurospora, Penicillium, Tolypocladium (documento WO 91/00357 publicado el 10 de enero de 1991), y huéspedes Aspergillus tales como A. nidulans (Ballance y col., Biochem. Biophys. Res. Commun., 112: 284-289 [1983]; Tilburn y col., Gene, 26: 205-221 [19831; Yelton y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 1470-1474 [1984]) y A. niger (Kelly y Hynes, EMBO J., 4:475-479 [1985]). Las levaduras metilotrópicas son adecuadas en el presente documento e incluyen, pero no se limitan a levaduras capaces de crecer en metanol, seleccionadas de los géneros que consiste en Hansenula, Candida, Kloeckera, Pichia, Saccharomyces, Torulopsis, y Rhodotorula. Se puede encontrar una lista de especies específicas que son ejemplo de esta clase de levaduras en C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982).
Las células huésped adecuadas para la expresión del ácido nucleico que codifica polipéptidos PRO256 glicosilados, se obtienen de organismos multicelulares. Los ejemplos de células de invertebrados incluyen células de insecto tales como Drosophila S2 y Spodoptera Sf9, así como células vegetales. Los ejemplos de líneas de células huésped de mamíferos útiles, incluyen células de ovario de hámster chino (CHO) y COS. Los ejemplos más específicos incluyen la línea CV1 de riñón de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); línea de riñón embrionario humano (293 o 293 células subclonadas para el crecimiento en cultivo en suspensión, Graham y col., J. Gen. Virol., 36: 59 (1977)); células de ovario de hámster chino/-DHFR (CHO, Urlaub y Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)); células de Sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)); células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75); células de hígado humano (Hep G2, HB 8065); y células de tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51). Se considera que la selección de la célula huésped adecuada depende del experto en la técnica.
iii. Selección y uso de un vector replicable
El ácido nucleico (p. ej., ADNc o ADN genómico) que codifica el polipéptido PRO256 se puede insertar en un vector replicable para la clonación (amplificación del ADN) o para la expresión. Están disponibles al público diferentes vectores. El vector puede ser, por ejemplo, en forma de plásmido, cósmido, partícula vírica o fago. La secuencia de ácido nucleico adecuada se puede insertar en el vector mediante una variedad de procedimientos. En general, el ADN se inserta en un sitio o sitios de endonucleasas de restricción adecuadas, usando técnicas conocidas en la materia. Los componentes del vector en general incluyen, pero no se limita a una o más de una secuencia señal si la secuencia va a ser secretada, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento potenciador, un promotor y una secuencia de terminación de la transcripción. La construcción de vectores adecuados que contienen uno o más de estos componentes usa técnicas de ligado estándar que son conocidas para el experto en la materia.
El polipéptido PRO256 se puede producir de forma recombinante no solo directamente, si no también como un polipéptido de fusión con un polipéptido heterólogo, que puede ser una secuencia señal y otro polipéptido que tenga un sitio de escisión específico en el extremo N de la proteína madura o polipéptido. En general, la secuencia señal puede ser un componente del vector, o puede ser parte del ADN que codifica el polipéptido PRO256 que se inserta en el vector. La secuencia señal puede ser una secuencia señal procariota seleccionada, por ejemplo, del grupo de la fosfatasa alcalina, penicilinasa, lpp, o secuencias líder de enterotoxina II estable al calor. Para la secreción de levaduras, la secuencia señal puede ser, p. ej., la secuencia líder invertasa de levadura, secuencia líder de factor alfa (incluyendo secuencia líder de factor \alpha de Saccharomyces y Kluyveromyces, la última descrita en la patente de EE.UU. nº 5.010.182), o secuencia líder de la fosfatasa ácida, la secuencia líder de glucoamilasa de C. albicans (documento EP 362.179 publicado el 4 de abril de 1990), o la secuencia señal descrita en el documento WO 90/13646 publicado el 15 de noviembre de 1990. En la expresión de células de mamíferos, se pueden usar secuencias señal de mamíferos para dirigir la secreción de la proteína, tales como secuencias señal de polipéptidos secretados de la misma especie o especies relacionadas, así como secuencias líder secretoras víricas.
Tanto los vectores de expresión como los de clonación contienen una secuencia de ácido nucleico que permite que el vector se replique en una o más células huésped seleccionadas. Dichas secuencias son conocidas para una variedad de bacterias, levaduras y virus. El origen de replicación del plásmido pBR322 es adecuado para la mayoría de las bacterias Gram negativas, el origen del plásmido 2 \mu es adecuado para levaduras y diferentes orígenes víricos (SV40, polioma, adenovirus, VSV, o BPV) son útiles para vectores de clonación en células de mamífero.
Los vectores de expresión y clonación normalmente contendrán un gen de selección, denominado también un marcador seleccionable. Los genes de selección típicos codifican proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos y otras toxinas, p. ej., ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina, (b) complementan deficiencias auxotróficas, o (c) suministran nutrientes críticos no disponibles en el medio complejo, p. ej., el gen que codifica la D-alanina racemasa para Bacilli.
Un ejemplo de marcadores seleccionables adecuados para células de mamífero son aquellos que permiten la identificación de células competentes para absorber el ácido nucleico que codifica el polipéptido PRO256 tal como DHFR o timidina quinasa. Una célula huésped adecuada cuando se usa DHFR de tipo salvaje es la línea de células CHO deficiente en actividad de DHFR, preparada y propagada como describen Urlaub y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216 (1980). Un gen de selección adecuado para usar en levaduras es el gen trp1 presente en el plásmido de levadura YRp7. Stinchcomb y col., Nature, 282: 39 (1979); Kingsman y col., Gene, 7: 141 (1979); Tschemper y col., Gene, 10:157 (1980). El gen trp1 proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de levadura que carece de la capacidad de crecer en triptófano, por ejemplo, ATCC nº 44076 o PEP4-1. Jones, Genetics, 85:12(1977).
Los vectores de expresión y clonación normalmente contienen un promotor operativamente unido a la secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido PRO256 para dirigir la síntesis del ARNm. Los promotores reconocidos por una variedad de potenciales células huésped son conocidos. Los promotores adecuados para usar en huéspedes procariotas incluyen los sistemas promotores de \beta-lactamasa y lactosa (Chang y col., Nature, 275: 615 (1978); Goeddel y col., Nature, 281: 544 (1979)), fosfatasa alcalina, un sistema promotor de triptófano (trp) (Goeddel, Nucleic Acids Res., 8: 4057 (1980); documento EP 36.776), y promotores híbridos tales como el promotor tac (deBoer y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 21-25 (1983)). Los promotores para usar en sistemas bacterianos también contendrán una secuencia de Shine-Dalgarno (S.D.) operativamente unida al ADN que codifica el polipéptido PRO256.
Los ejemplos de secuencias promotoras adecuadas para usar en huéspedes de tipo levaduras incluyen los promotores de 3-fosfoglicerato quinasa (Hitzeman y col., J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)) u otras enzimas glicolíticas (Hess y col., J. Adv. Enzyme Reg., 7: 149 (1968); Holland, Biochemistry, 17: 4900 (1978)), tales como enolasa, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, hexoquinasa, piruvato descarboxilasa, fosfofrutoquinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, 3-fosfoglicerato mutasa, piruvato quinasa, trifosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa y glucoquinasa.
Otros promotores de levaduras que son promotores inducibles que tienen la ventaja adicional de la transcripción controlada por las condiciones de crecimiento, son las regiones promotoras para la alcohol deshidrogenasa 2, isocitocromo C, fosafatasa ácida, enzimas degradadoras asociadas con el metabolismo del nitrógeno, metalotioneína, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, y enzimas responsables del uso de maltosa y galactosa. Los vectores y promotores adecuados para usar en la expresión en levaduras se describen con más detalle en el documento EP
73.657.
La transcripción del ácido nucleico de PRO256 a partir de vectores en células huésped de mamíferos se controla, por ejemplo, mediante promotores obtenidos de genomas de virus tales como poliomavirus, virus de la viruela de aves de corral (documento UK 2.211.504 publicado el 5 de julio de 1989), adenovirus (tal como Adenovirus 2), papilomavirus bovino, virus de sarcoma aviar, citomegalovirus, un retrovirus, virus de la hepatitis-B, y Virus de simio 40 (SV40); mediante promotores de mamífero heterólogos, p. ej., el promotor de actina o un promotor de inmunoglobulina; y mediante promotores de choque térmico, con la condición de que dichos promotores sean compatibles con los sistemas de células huésped.
La transcripción de un ADN que codifica el polipéptido PRO256 por eucariotas superiores se puede aumentar insertando una secuencia potenciadora en el vector. Los potenciadores son elementos de actuación en cis del ADN, normalmente de aproximadamente 10 a 300 pb, que actúan como un promotor para aumentar la transcripción. Se conocen muchas secuencias potenciadoras de genes de mamíferos (globina, elastasa, albúmina, \alpha-fetoproteína e insulina). Sin embargo, normalmente se usará un potenciador de un virus de célula eucariota. Los ejemplos incluyen el potenciador SV40 en el lado final del origen de replicación (pb 100-270), el potenciador de promotor temprano de citomegalovirus, el potenciador de polioma en el lado final del origen de replicación, y potenciadores adenovíricos. El potenciador se puede empalmar en el vector en una posición 5' o 3' de la secuencia que codifica polipéptidos PRO256, pero preferiblemente se sitúa en un sitio 5' del promotor.
Los vectores de expresión usados en células huésped eucariotas (levaduras, hongos, insectos, vegetales, animales, humanas, o células nucleadas de otros organismos multicelulares) también contendrán secuencias necesarias para la terminación de la transcripción y para la estabilización del ARNm. Dichas secuencias están disponibles habitualmente de las regiones no traducidas 5', y ocasionalmente 3', de ADN o ADNc eucariotas o víricos. Estas regiones contienen segmentos nucleótidos transcritos como fragmentos de poliadenilación en la parte no traducida del ARNm que codifica el polipéptido PRO256.
Se describen otros procedimientos más, vectores y células huésped adecuados para adaptar a la síntesis del polipéptido PRO256 en cultivos de células de vertebrados recombinantes, en Gething y col., Nature, 293: 620-625 (1981); Mantei y col., Nature, 281: 40-46(1979); documentos EP 117.060; y EP 117.058.
iv. Detección de amplificación/expresión de genes
La amplificación y/o expresión de genes se puede medir en una muestra directamente, por ejemplo, por transferencia Southern convencional, transferencia Northern para cuantificar la transcripción de ARNm (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 5201-5205 (1980)), transferencia en mancha (análisis de ADN) o hibridación in situ, usando una sonda marcada de forma adecuada, basándose en las secuencias proporcionadas en el presente documento. Alternativamente, se pueden usar anticuerpos que pueden reconocer dúplex específicos, incluyendo dúplex de ADN, dúplex de ARN y dúplex híbridos de ADN-ARN o dúplex de ADN-proteína. Los anticuerpos a su vez se pueden marcar y el ensayo se puede llevar a cabo con el dúplex unido a una superficie, de forma que tras la formación del dúplex en la superficie, se puede detectar la presencia del anticuerpo unido al dúplex.
Alternativamente, la expresión de genes se puede medir por procedimientos inmunológicos, tales como tinción inmunohistoquímica de células o secciones de tejidos, y hacer el ensayo del cultivo de células o fluidos corporales, para cuantificar directamente la expresión del producto génico. Los anticuerpos útiles para la tinción inmunohistoquímica y/o ensayo de muestra de fluidos, pueden ser monoclonales o policlonales, y se pueden preparar en cualquier mamífero. De forma conveniente, los anticuerpos se pueden preparar contra un polipéptido PRO256 de secuencia nativa o contra un péptido sintético basado en las secuencias de ADN proporcionadas en el presente documento o contra la secuencia exógena fusionada al ADN que codifica el polipéptido PRO256 y que codifica un epítopo específico de anticuerpo.
v. Purificación de polipéptidos PRO256
Las formas de los polipéptidos PRO256 se pueden recuperar del medio de cultivo o de los lisatos de las células huésped. Si están unidas a membrana, se pueden liberar de la membrana usando una disolución de detergente adecuada (p. ej., TRITON-X^{TM} 100) o por escisión enzimática. Las células usadas en la expresión del ácido nucleico que codifica el polipéptido PRO256 se pueden alterar por diferentes medios físicos o químicos, tales como en ciclos de congelación-descongelación, ultrasonidos, disrupción mecánica, o agentes de lisis celulares. Puede ser conveniente purificar el polipéptido PRO256 de las proteínas celulares o polipéptidos recombinantes. Los siguientes procedimientos son ejemplos de procedimientos de purificación adecuados: por fraccionamiento en una columna de intercambio iónico; precipitación con etanol; HPLC de fase inversa; cromatografía en sílice o en una resina de intercambio catiónico tal como DEAE; enfoque cromatográfico; SDS-PAGE; precipitación con sulfato amónico; filtración en gel usando, por ejemplo, Sephadex G-75; columnas de Proteína A-Sepharosa para separar los contaminantes tales como IgG; y columnas quelantes de metales para unir las formas de epítopo etiquetado del polipéptido PRO256. Se pueden usar diferentes procedimientos de purificación de proteínas y dichos procedimientos son conocidos en la técnica, y se describen, por ejemplo, en Deutscher, Methods in Enzymology, 182(1990); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice (Springer-Verlag: New York. 1982). La etapa o etapas de purificación seleccionadas dependerán, por ejemplo, de la naturaleza del procedimiento de producción usado y del polipéptido PRO256 particular producido.
D. Usos de los polipéptidos PRO256 i. Ensayos de la actividad cardiovascular, endotelial y angiogénica
Se pueden usar diferentes ensayos para probar la actividad cardiovascular endotelial y angiogénica del polipéptido del presente documento. Dichos ensayos incluyen los proporcionados en los siguientes ejemplos.
Los ensayos para probar la actividad antagonista de la endotelina, como se describe en la patente de EE.UU. nº 5.773.414, incluyen un ensayo de unión a ventrículo de corazón de rata, en el que se ensaya la capacidad del polipéptido para inhibir la unión de la endotelina-1 yodada en un ensayo de receptor, un ensayo de unión a receptor de endotelina para ensayar la unión a células intactas de la endotelina-1 radiomarcada usando células musculares lisas vasculares arteriales renales de conejo, un ensayo de acumulación de fosfato de inositol en el que se determina la actividad funcional en células Rat-1 midiendo los niveles intracelulares de segundos mensajeros, un ensayo de liberación de ácido araquidónico en músculos lisos vasculares cultivados, estudios in vitro (recipiente aislado) usando endotelio de conejos macho de Nueva Zelanda, y estudios in vivo usando ratas macho Sprague-Dawley.
Los ensayos de la actividad de generación de tejido incluyen, pero sin limitación, los descritos en el documento WO 95/16035 (hueso, cartílago, tendón); documento WO 95/05846 (nervio, neuronal), y documento WO 91/07491 (piel, endotelio).
Los ensayos de la actividad de curación de heridas incluyen, por ejemplo, los descritos en Winter, Epidermal Wound Healing, Maibach, HI and Rovee, DT, eds. (1972) (Year Book Medical Publishers, Inc., Chicago), pág. 71-112, según la modificación del artículo de Eaglstein y Mertz, J. Invest. Dermatol., 71: 382-384 (1978).
Un ensayo para seleccionar una molécula de ensayo relacionada con un polipéptido PRO256 que se une al polipéptido receptor de la endotelina B_{1} (ETB_{1}) y modula la actividad de transducción, implica proporcionar una célula huésped transformada con un ADN que codifica el polipéptido receptor de la endotelina B_{1}, exponer las células al candidato de ensayo, y medir la actividad de transducción de señal del receptor de la endotelina B_{1}, como se describe, p. ej., en la patente de EE.UU. nº 5.773.223.
Hay varios ensayos de hipertrofia cardiaca. Los ensayos in vitro incluyen la inducción de la expansión de miocitos cardiacos de rata adulta. En este ensayo, se aíslan miocitos ventriculares de una sola rata (macho Sprague-Dawley), siguiendo esencialmente una modificación del procedimiento descrito en detalle por Piper y col., "Adult ventricular rat heart muscle cells" en Cell Culture Techniques in Heart and Vessel Research, H.M. Piper, ed. (Berlin: Springer-Verlag, 1990), pág. 36-60. Este procedimiento permite aislar miocitos ventriculares adultos y el cultivo prolongado de estas células en el fenotipo de forma de varilla. Se ha mostrado que la fenilefrina y la prostaglandina F_{2 \alpha} (PGF_{2 \alpha}) inducen una expansión de la respuesta en estas células de adulto. Después se ensaya la inhibición de la expansión de miocitos inducida por PGF_{2 \alpha} o análogos de PGF_{2 \alpha} (p. ej., fluprostenol) y fenilefrina por diferentes inhibidores potenciales de la hipertrofia cardiaca.
Un ejemplo de un ensayo in vivo es un ensayo para inhibir la hipertrofia cardiaca inducida por fluprostenol in vivo. Este modelo farmacológico ensaya la capacidad del polipéptido PRO256 para inhibir la hipertrofia cardiaca inducida en ratas (p. ej., macho Sprague-Dawley o Wistar) por inyección subcutánea de fluprostenol (un agonista análogo de PGF_{2 \alpha}). Se sabe que las ratas con hipertrofia cardiaca patológica inducida por infarto de miocardio, tienen niveles crónicos elevados de PGF_{2 \alpha} excretable en su miocardio. Lai y col., Am. J. Physiol. (Heart Circ. Physiol.), 271: H2197-H2208 (1996). Por consiguiente, los factores que pueden inhibir los efectos del fluprostenol en el crecimiento miocárdico in vivo, son potencialmente útiles para tratar la hipertrofia cardiaca. Los efectos del polipéptido PRO256 en la hipertrofia cardiaca se determinan midiendo el peso del corazón, ventrículos y ventrículo izquierdo (normalizado respecto al peso corporal) con respecto a las ratas tratadas con fluprostenol que no reciben el polipéptido
PRO256.
Otro ejemplo de un ensayo in vivo es el ensayo de hipertrofia cardiaca por sobrecarga de presión. Para el ensayo in vivo es habitual inducir la hipertrofia cardiaca por sobrecarga de presión mediante constricción de la aorta abdominal de los animales de ensayo. En un protocolo típico, se tratan ratas (p. ej., macho Sprague-Dawley o Wistar) con anestesia y se estrecha la aorta abdominal de cada rata justo debajo del diafragma Beznak M., Can. J. Biochem. Physiol., 33: 985-94 (1955). La aorta se expone mediante incisión quirúrgica, y se pone una aguja despuntada cerca del vaso. La aorta se constriñe con una ligadura de seda atada alrededor de la aguja, que se saca inmediatamente y que reduce el lumen de la aorta al diámetro de la aguja. Este procedimiento lo describen, por ejemplo, Rossi y col., Am. Heart J., 124: 700-709 (1992) y O'Rourke y Reibel, P.S.E.M.B., 200: 95-100 (1992).
En otro ensayo más in vivo, se mide el efecto en la hipertrofia cardiaca después de infarto de miocardio (IM) inducido experimentalmente. Se induce IM agudo en ratas mediante ligadura de la arteria coronaria izquierda y se confirma por examen electrocardiográfico. También se prepara un grupo de operación simulada como animales de control. Los primeros datos han mostrado que la hipertrofia cardiaca está presente en el grupo de animales con IM, puesto de manifiesto por un aumento de 18% de la relación peso del corazón-peso corporal. Lai y col., véase antes. El tratamiento de estos animales con candidatos de bloqueantes de la hipertrofia cardiaca, p. ej., el polipéptido PRO256, proporciona información valiosa sobre el potencial terapéutico de los candidatos ensayados. Se describe otro ensayo más para la inducción de la hipertrofia cardiaca en la patente de EE.UU. nº 5.773.415, usando ratas Sprague-
Dawley.
Para el cáncer, se puede usar una variedad de modelos animales conocidos para entender mejor la función de los genes identificados en el presente documento, en el desarrollo y patogénesis de tumores, y para ensayar la eficacia de los agentes terapéuticos candidatos, incluyendo anticuerpos y otros agonistas de polipéptidos PRO256 nativos. La naturaleza in vivo de dichos modelos hace que sean particularmente predictivos de las respuestas en pacientes humanos. Los modelos animales de tumores y cánceres (p. ej., cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer de próstata, cáncer de pulmón, etc.) incluyen animales tanto no recombinantes como recombinantes (transgénicos). Los modelos animales no recombinantes incluyen, por ejemplo, modelos de roedores, p. ej., murinos. Dichos modelos se pueden generar introduciendo células tumorales en ratones singénicos usando técnicas estándar, p. ej., la inyección subcutánea, inyección en la vena de la cola, implante en bazo, implante intraperitoneal, implante bajo la cápsula renal o implante de orthopin, p. ej., células de cáncer de colon implantadas en tejido colónico. Véase, la publicación PCT nº WO 97/33551, publicada el 18 de septiembre de 1997. Probablemente la especie animal usada con más frecuencia en estudios oncológicos son los ratones inmunodeficientes, y en particular, los ratones sin sistema inmune. La observación de que el ratón sin sistema inmune con hipoplasia tímica podría actuar satisfactoriamente como un huésped para lo xenoinjertos de tumores humanos, ha conducido a su uso extendido para este propósito. El gen nu recesivo autosómico se ha introducido en un gran número de cepas congénicas distintas de ratones sin sistema inmune, incluyendo por ejemplo, ASW, A/He, AKR, BALB/c, B 10.LP, C17, C3H, C57BL, C57, CBA, DBA, DDD, I/st, NC, NFR, NFS, NFS/N, NZB, NZC, NZW, P, RIII, y SJL. Además, se han reproducido una gran variedad de otros animales con defectos inmunológicos heredados distintos de los ratones sin sistema inmune, y se han usado como receptores de xenoinjertos de tumores. Para más detalles véase, p. ej., The Nude Mouse in Oncology Research, E. Boven and B. Winograd, eds. (CRC Press, Inc., 1991).
Las células introducidas en dichos animales se pueden obtener de líneas de células de tumor/cáncer conocidas, tales como cualquiera de las líneas de células tumorales listadas antes, y por ejemplo, la línea celular B 104-1 -1 (línea celular estable NIH-3T3 transfectada con el protooncogén neu); células NIH-3T3 transfectadas con ras; Caco-2 (ATCC HTB-37); o una línea celular de adenocarcinoma de colon humano de grado II bien diferenciada, HT-29 (ATCC HTB-38); o de tumores y cánceres. Las muestras de células de tumor o cáncer se pueden obtener de pacientes que experimentan cirugía, usando condiciones estándar que implican la congelación y almacenamiento en nitrógeno líquido. Karmali y col., Br. J. Cancer, 48: 689-696 (1983).
Las células de tumores se pueden introducir en animales tales como ratones sin sistema inmune mediante una variedad de procedimientos. El espacio subcutáneo (s.c.) en los ratones es muy adecuado para el implante de tumor. Los tumores se pueden transplantar por vía s.c. en forma de bloques sólidos, como aguja de biopsia o un trócar, o como suspensiones de células. Para el implante de bloque sólido o trócar, se introducen fragmentos de tejido del tumor de tamaño adecuado en el espacio s.c. Las suspensiones de células están recién preparadas a partir de tumores primarios o líneas celulares de tumores estables, y se inyectan por vía subcutánea. Las células tumorales también se pueden inyectar como implantes subdérmicos. En este sitio, el inóculo se deposita entre la parte inferior del tejido conjuntivo dérmico y el tejido sc.
Los modelos animales de cáncer de mama se pueden generar, por ejemplo, implantando células de neuroblastoma de rata (de la que se ha aislado inicialmente el oncogén neu), o células NIH-3T3 transformadas con neu en ratones sin sistema inmune, esencialmente como describen Drebin y col. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 83: 9129-9133 (1986).
Igualmente, se pueden generar modelos animales de cáncer pasando células de cáncer de colon en animales, p. ej., ratones sin sistema inmune, lo que conduce a la aparición de tumores en estos animales. Han descrito un modelo de transplante ortotópico de cáncer de colon humano en ratones sin sistema inmune, por ejemplo, Wang y col., Cancer Research, 54: 4726-4728 (1994) y Togo y col., Cancer Research, 55: 681-684(1995). Este modelo se basa en el llamado "METAMOUSE^{TM}" vendido por AntiCancer, Inc., (San Diego, California).
Los tumores que surgen en los animales se pueden sacar y cultivar in vitro. Las células de los cultivos in vitro se pueden pasar después a animales. Dichos tumores pueden servir como dianas para más ensayos o cribado de fármacos. Alternativamente, los tumores que resultan de este paso, se pueden aislar y se puede analizar la expresión diferencial del ARN de genes de interés de las células antes del paso y de las células aisladas después de uno o más ciclos de pasos. Dichas técnicas de paso se pueden realizar con cualquier línea celular de tumor o cáncer conocida.
Por ejemplo, Meth A, CMS4, CMS5, CMS21, y WEHI-164 son fibrosarcomas químicamente inducidos de ratones hembra BALB/c (DeLeo y col., J. Exp. Med., 146:720 (1977)), que proporcionan un sistema de modelo muy controlable para estudiar las actividades antitumorales de diferentes agentes. Palladino y col., J. Immunol., 138: 4023-4032 (1987). Brevemente, las células tumorales se propagan in vitro en cultivo celular. Antes de la inyección a los animales, las líneas se lavan y se suspenden en tampón con una densidad celular de aproximadamente 10x10^{6} a 10x10^{7} células/ml. Después los animales se infectan por vía subcutánea con 10 a 100 \mul de suspensión celular, dejando de 1 a 3 semanas para que aparezca el tumor.
Además, se puede usar el carcinoma de pulmón de Lewis (3LL) de ratones, que es uno de los tumores experimentales mejor estudiados en el tratamiento de pacientes humanos a los que se ha diagnosticado carcinoma de pulmón de células pequeñas (SCCL). Este tumor se puede introducir en ratones normales por inyección de fragmentos de tumor de un ratón afectado o de células mantenidas en cultivo Quivey y col., Br. J. Cancer, 41: suppl. 4, 30 (1980). Las pruebas indican que los tumores pueden iniciarse por inyección simplemente de una sola célula y sobrevive una proporción muy alta de células tumorales. Para más información sobre este modelo de tumor véase, Zacharski, Haemostasis, 16: 300-320 (1986).
Una forma de evaluar la eficacia de un compuesto de ensayo en un modelo animal con un tumor implantado es medir el tamaño del tumor antes y después del tratamiento. Tradicionalmente, el tamaño de los tumores implantados se ha medido con un pié de rey en 2 o 3 dimensiones. La medición limitada a 2 dimensiones no refleja con precisión el tamaño del tumor, por lo tanto, normalmente se convierte en el correspondiente volumen usando una fórmula matemática. Sin embargo, la medición del tamaño del tumor es muy imprecisa. Los efectos terapéuticos de un candidato a fármaco se pueden describir mejor como retraso del crecimiento inducido por el tratamiento y retraso del crecimiento específico. Otra variable importante en la descripción del crecimiento del tumor es el tiempo de duplicación del volumen del tumor. También hay disponibles programas de ordenador para el cálculo y la descripción del crecimiento del tumor, tales como el programa publicado por Rygaard y Spang-Thomsen, Proc. 6th Int Workshop on Immune-Deficient Animals. Wu y Sheng eds. (Basel, 1989), p. 301. Sin embargo, hay que indicar que la necrosis y respuesta inflamatoria después del tratamiento pueden dar como resultado un aumento del tamaño del tumor, al menos inicialmente. Por lo tanto, es necesario controlar con cuidado estos cambios, mediante una combinación de un procedimiento morfométrico y análisis por citometría de flujo.
Además, se pueden diseñar modelos animales recombinantes (transgénicos) introduciendo la parte codificante del gen de PRO256 identificada en el presente documento en el genoma de animales de interés, usando técnicas estándar para producir animales transgénicos no humanos. Los animales no humanos que pueden servir como una diana para la manipulación transgénica incluyen, sin limitación, ratones, ratas, conejos, cobayos, cerdos, ovejas y primates no humanos, por ejemplo bonobos, chimpancés y monos. Las técnicas conocidas en la materia para introducir una muestra en dichos animales, incluyen microinyección pronuclear (patente de EE.UU. nº 4.873.191); transferencia de gen mediada por retovirus en líneas germinales (p. ej., Van der Putten y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 6148-6182 (1985)); reconocimiento génico en células madre embrionarias (Thompson y col., Cell, 56: 313-321 (1989)); electroporación de embriones (Lo, Mol. Cell. Biol., 3:1803-1814 (1983)); y transferencia de genes mediada por esperma. Lavitrano y col., Cell, 57: 717-723 (1989). Para una revisión, véase por ejemplo, la patente de EE.UU. nº
4.736.866.
Para el propósito de la presente invención, los animales transgénicos no humanos incluyen los que llevan el transgén solo en parte de sus células ("animales mosaico"). El transgén se puede integrar como un solo transgén, o en concatámeros, p. ej., tándems cabeza-cabeza o cabeza-cola). La introducción selectiva de un transgén en un tipo de célula particular también es posible, siguiendo por ejemplo, la técnica de Lasko y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89: 6232-6236 (1992). La expresión del transgén en animales transgénicos no humanos se puede seguir por técnicas estándar. Por ejemplo, se puede usar análisis de transferencia Southern o amplificación por PCR, para verificar la integración de un transgén. Después, se puede analizar el nivel de expresión de ARNm usando técnicas tales como la hibridación in situ, análisis por transferencia Northern, PCR o inmunocitoquímica. Se examina además en los animales signos de desarrollo de tumor o cáncer.
Alternativamente, se pueden construir animales no humanos "con genes inactivados" que tienen un gen defectuoso o alterado que codifica un polipéptido PRO256 identificado en el presente documento, como resultado de la recombinación homóloga entre el gen endógeno que codifica el polipéptido PRO256 y el ADN genómico alterado que codifica el mismo polipéptido introducido en una célula embrionaria de animal. Por ejemplo, se puede usar el ADNc que codifica un polipéptido PRO256 particular para clonar ADN genómico que codifica este polipéptido según las técnicas establecidas. Una parte del ADN genómico que codifica un polipéptido PRO256 particular se puede eliminar o sustituir por otro gen, tal como un gen que codifica un marcador seleccionable que se puede usar para seguir la integración. Normalmente, se incluyen en el vector varias kilobases de ADN flanqueante inalterado (tanto en el extremo 5' como en el 3'). Véase, p. ej., Thomas y Capecchi, Cell, 51: 503 (1987) para una descripción de vectores de recombinación homólogos. El vector se introduce un una línea de células madre embrionarias (p. ej., por electroporación) y se seleccionan las células en las que el ADN introducido se ha recombinado homólogamente con el ADN endógeno. Véase, p. ej., Li y col., Cell, 69: 915 (1992). Después, las células seleccionadas se inyectan en un blastocito de un animal no humano (p. ej., un ratón o una rata) para formar quimeras de agregación. Véase, p. ej., Bradley, en Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E. J. Robertson, ed. (IRL: Oxford, 1987), pág. 113-152. Después se puede implantar un embrión quimérico en un animal receptor hembra pseudopreñado y llevar el embrión a término para crear un animal con genes inactivados no humanos. La progenie que alberga el ADN recombinado homólogamente en sus células germinales, se puede identificar mediante técnicas estándar y se pueden usar para reproducir animales en los que todas las células del animal no humano contienen el ADN recombinado homólogamente. Los animales no humanos con genes inactivados se pueden caracterizar, por ejemplo, por su capacidad para defenderse frente a algunas afecciones patológicas y por su desarrollo de afecciones patológicas debidas a la ausencia del polipéptido PRO256.
La eficacia de los anticuerpos que se unen específicamente a los polipéptidos PRO256 identificados en el presente documento, y otros candidatos a fármaco, se puede ensayar también en el tratamiento de tumores espontáneos en animales. Una diana adecuada para dichos estudios es el carcinoma de células escamosas oral felino (SCC). El SCC oral felino es un tumor maligno muy invasivo que es el tumor maligno oral más común en gatos, representando alrededor de 60% de los tumores orales descritos en esta especie. Se metastatiza raramente a sitios distantes, aunque esta baja incidencia de metástasis puede ser un simple reflejo de los tiempos de supervivencia cortos para gatos con este tumor. Normalmente estos tumores no pueden tratarse por cirugía, principalmente debido a la anatomía de la cavidad oral felina. Actualmente no hay un tratamiento eficaz para este tumor. Antes de entrar en el estudio, se hace a cada gato un examen clínico completo y biopsia, y se hace un barrido por tomografía computerizada (CT). Los gatos a los que se diagnostica tumores de células escamosas orales sublinguales se excluyen del estudio. La lengua puede paralizarse como resultado de dicho tumor, y si bien el tratamiento mata el tumor, los animales no pueden alimentarse por si mismos. Cada gato se trata repetidamente a lo largo de un periodo de tiempo largo. Se tomarán fotografías de los tumores diariamente durante el periodo de tratamiento y en cada examen posterior. Después del tratamiento, se hace a cada gato otro barrido de CT. Después, los barridos de CT y los radiogramas torácicos se evalúan cada 8 semanas. Se evalúan los datos de diferencias de supervivencia, respuesta y toxicidades comparado con los grupos de control. La respuesta positiva puede requerir pruebas de regresión del tumor, preferiblemente con mejora de la calidad de vida y/o aumento de la vida útil.
Además, también se pueden ensayar otros tumores espontáneos en animales, tales como fibrosarcoma, adenocarcinoma, linfoma, condroma o leiomiosarcoma de perros, gatos y bonobos. De estos, el adenocarcinoma mamario en perros es un modelo preferido, ya que su aparición y comportamiento son muy similares a los de los seres humanos. Sin embargo, el uso de este modelo está limitado por la rara aparición de este tipo de tumor en animales.
Otros ensayos cardiovasculares, endoteliales y angiogénicos in vitro e in vivo en la materia, también son adecuados en el presente documento.
ii. Distribución tisular
Los resultados de los ensayos cardiovasculares, endoteliales y angiogénicos del presente documento, se pueden verificar con estudios adicionales, tales como por la determinación de la expresión de ARNm en diferentes tejidos humanos.
Como se ha indicado antes, la amplificación de genes y/o la expresión de genes en diferentes tejidos se puede medir por transferencia Southern convencional, transferencia Northern para cuantificar la transcripción de ARNm (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 5201-5205 (1980)), transferencia en mancha (análisis de ADN) o hibridación in situ, usando una sonda marcada de forma adecuada, basándose en las secuencias proporcionadas en el presente documento. Alternativamente, se pueden usar anticuerpos que pueden reconocer dúplex específicos, incluyendo dúplex de ARN, dúplex de ADN y dúplex híbridos de ADN-ARN o dúplex de ADN-proteína. Los anticuerpos a su vez se pueden marcar y el ensayo se lleva a cabo por con el dúplex unido a una superficie, de forma que tras la formación del dúplex en la superficie, se puede detectar la presencia del anticuerpo unido al dúplex.
Alternativamente, la expresión de genes en diferentes tejidos se puede medir por procedimientos inmunológicos, tales como tinción inmunohistoquímica de secciones de tejidos, y hacer el ensayo del cultivo de células o fluidos corporales, para cuantificar directamente la expresión del producto génico. Los anticuerpos útiles para la tinción inmunohistoquímica y/o ensayo de muestra de fluidos, pueden ser monoclonales o policlonales, y se pueden preparar en cualquier mamífero. De forma conveniente, los anticuerpos se pueden preparar contra un polipéptido PRO256 de secuencia nativa o contra un péptido sintético basado en las secuencias de ADN proporcionadas en el presente documento o contra la secuencia exógena fusionada al ADN de PRO256 y que codifica un epítopo específico de anticuerpo. En lo sucesivo se proporcionan técnicas generales para generar anticuerpos y protocolos especiales para la hibridación in situ.
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iii. Estudios de unión de anticuerpos
Los resultados del estudio cardiovascular, endotelial y angiogénico se pueden verificar adicionalmente mediante estudios de unión de anticuerpos, en los que se ensaya la capacidad de los anticuerpos anti-PRO265 para inhibir el efecto del polipéptido PRO256 en células endoteliales y otras células usadas en los ensayos cardiovasculares, endoteliales y angiogénicos. Los anticuerpos de ejemplos incluyen anticuerpos policlonales, monoclonales, humanizados, biespecíficos y heteroconjugados, cuya preparación se describe en lo sucesivo.
Los estudios de unión de anticuerpos se pueden llevar a cabo en cualquier procedimiento de ensayo conocido, tal como ensayos de unión competitivos, ensayos de tipo sándwich directos e indirectos, y ensayos de inmunoprecipitación. Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques (CRC Press, Inc., 1987), pág. 147-158.
Los ensayos de unión competitivos se basan en la capacidad de un compuesto de referencia marcado para competir en la unión con el analito de la muestra de ensayo con una cantidad limitada de anticuerpo. La cantidad de proteína diana en la muestra de ensayo es inversamente proporcional a la cantidad de compuesto de referencia que se une a los anticuerpos. Para facilitar la determinación de la cantidad de compuesto de referencia que se une, los anticuerpos preferiblemente se insolubilizan antes o después de la competición, de modo que el compuesto de referencia y el analito que se unen a los anticuerpos pueden separarse de forma conveniente del compuesto de referencia y analito que permanecen sin unir.
Los ensayos de tipo sándwich implican el uso de 2 anticuerpos, cada uno capaz de unirse a una parte inmunogénica o epítopo diferente de la proteína que se va a detectar. En un ensayo de tipo sándwich, el analito de la muestra de ensayo se une a un primer anticuerpo que está inmovilizado sobre un soporte sólido, y después un segundo anticuerpo se une al analito, formando así un complejo de tres partes insoluble. Véase, p. ej., la patente de EE.UU. nº 4.376.110. El segundo anticuerpo puede estar marcado con un resto detectable (ensayos de tipo sándwich directos) o se puede medir usando un anticuerpo anti-inmunoglobulina que está marcado con un resto detectable (ensayo de tipo sándwich indirecto). Por ejemplo, un tipo de ensayo de tipo sándwich es un ensayo ELISA, en cuyo caso el resto detectable es una enzima.
Para la inmunohistoquímica, la muestra de tejido puede estar fresca o congelada o puede insertarse en parafina y fijarse con un conservante tal como formalina, por ejemplo.
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iv. Ensayos de tumores basados en célula
Se pueden usar ensayos basados en células y modelos animales para los trastornos cardiovasculares, endoteliales y angiogénicos, tales como tumores, para verificar los descubrimientos de un ensayo cardiovascular endotelial y angiogénico del presente documento, y para entender mejor la relación entre los genes identificados en el presente documento y el desarrollo y patogénesis del crecimiento celular cardiovascular endotelial y angiogénico indeseable. La función de los productos génicos identificados en el presente documento en el desarrollo y patología del crecimiento celular cardiovascular endotelial y angiogénico indeseable, p. ej., células tumorales, se puede ensayar usando células o líneas celulares que se ha identificado que son estimuladas o inhibidas por el polipéptido PRO256 del presente documento. Dichas células incluyen, por ejemplo, las expuestas en los ejemplos, a continuación.
En un procedimiento diferente, las células de un tipo celular que se sabe que está implicado en un trastorno cardiovascular endotelial y angiogénico particular, son transfectadas con los ADNc del presente documento, y se analiza la capacidad de estos ADNc para inducir el crecimiento excesivo o inhibir el crecimiento. Si el trastorno cardiovascular endotelial y angiogénico es cáncer, las células tumorales adecuadas incluyen, por ejemplo, líneas celulares tumorales estables tales como la línea celular B104-1-1 (línea celular estable NIH-3T3 transfectada con el protooncogen neu) y células NIH-3T3 transfectadas con ras, que pueden transfectarse con el gen deseado y seguir el crecimiento tumorigénico. Dichas líneas celulares transfectadas después se pueden usar para ensayar la capacidad de anticuerpos poli o monoclonales o composiciones de anticuerpos, para inhibir el crecimiento de células tumorigénicas ejerciendo actividad citostática o citotóxica en el crecimiento de las células transformadas, o por mediación de la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC). Las células transfectadas con las secuencias codificantes de los genes identificados en el presente documento se pueden usar además para identificar candidatos a fármacos para el tratamiento de trastornos cardiovasculares, endoteliales y angiogénicos, tales como el cáncer.
Además, se pueden usar cultivos primarios derivados de tumores en animales transgénicos (como se ha descrito antes), en los ensayos basados en células del presente documento, aunque se prefieren las líneas celulares estables. Las técnicas para derivar líneas celulares continuas de animales transgénicos son conocidas en la materia. Véase, p. ej., Small y col., Mol. Cell. Biol., 5: 642-648 (1985).
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v. Terapia génica
Los polipéptidos PRO256 del presente documento y agonistas y antagonistas polipeptidilos, se pueden usar según la presente invención mediante la expresión de dichos polipéptidos in vivo, lo que a menudo se denomina terapia génica.
Hay 2 procedimientos principales para introducir el ácido nucleico (opcionalmente contenido en un vector) en las células del paciente: in vivo y ex vivo. Para el suministro in vivo, el ácido nucleico se inyecta directamente en el paciente, normalmente en los sitios en los que se requiere el polipéptido PRO256, es decir, el sitio de la síntesis del polipéptido PRO256, si se conoce, y el sitio (p. ej., tumor sólido) en el que se necesita la actividad biológica del polipéptido PRO256. Para el tratamiento ex vivo, se sacan células del paciente, se introduce el ácido nucleico en esas células aisladas, y las células modificadas se administran al paciente, sea directamente, o por ejemplo, encapsuladas dentro de membranas porosas que son implantadas en el paciente (véase, p. ej., las patentes de EE.UU. nº 4.892.538 y 5.283.187). Hay una variedad de técnicas disponibles para introducir ácidos nucleicos en células viables. Las técnicas varían dependiendo de si el ácido nucleico se transfiere a células cultivadas in vitro, o se transfiere in vivo a las células en el huésped destinatario. Las técnicas adecuadas para la transferencia de ácido nucleico a células de mamífero in vitro incluyen el uso de liposomas, electroporación, microinyección, transducción, fusión de células, DEAE-dextrano, el procedimiento de precipitación con fosfato cálcico, etc. La transducción implica la asociación de una partícula vírica (preferiblemente retrovírica) recombinante, de replicación defectuosa con un receptor celular, seguido de la introducción de los ácidos nucleicos contenidos en la partícula en la célula. Un vector usado habitualmente para el suministro ex vivo del gen es un retrovirus.
Las técnicas de transferencia de ácido nucleico in vivo actualmente preferidas incluyen la transfección con vectores víricos o no víricos (tales como adenovirus, lentivirus, virus Herpes simplex I o virus adenoasociados (AAV)) y sistemas basados en lípidos (son lípidos útiles para la transferencia mediada por lípidos de un gen, por ejemplo DOTMA, DOPE, y DC-Chol; véase, p. ej., Tonkinson y col., Cancer Investigation, 14(1): 54-65 (1996)). Los vectores más preferidos para usar en terapia génica son virus, lo más preferiblemente adenovirus, AAV, lentivirus o retrovirus. Un vector vírico tal como un vector retrovírico incluye al menos un promotor/potenciador de la transcripción o elemento(s) que definen el locus, u otros elementos que controlan la expresión de genes por otros medios tales como corte y empalme alternado, exportación de ARN nuclear o modificación postraduccional de un mensajero. Además, un vector vírico como un vector retrovírico incluye una molécula de ácido nucleico que cuando se transcribe en presencia de un gen que codifica el polipéptido PRO256, se une operativamente al mismo y actúa como una secuencia de inicio de la traducción. Dichas construcciones de vectores también incluyen una señal de empaquetamiento, repeticiones terminales largas (LTR) o partes de las mismas, y sitios de unión del cebador de cadena negativa adecuados para el virus usado (si estos no están ya presentes en el vector vírico). Además, dicho vector normalmente incluye una secuencia señal para la secreción del polipéptido PRO256 de una célula huésped en la que está puesto. Preferiblemente, la secuencia señal para este propósito es una secuencia señal de mamífero, lo más preferiblemente la secuencia señal nativa para el polipéptido PRO256. Opcionalmente, la construcción del vector puede incluir una señal que dirige la poliadenilación, así como uno o más sitios de restricción y una secuencia de terminación de la traducción. A modo de ejemplo, dichos vectores incluirán una LTR 5', un sitio de unión de ARNt, una señal de empaquetamiento, un origen de síntesis de la segunda cadena de ADN, y una LTR 3' o una parte de la misma. Se pueden usar otros vectores que no son víricos, tales como cationes lipídicos, polilisina y dendrímeros.
En algunas situaciones, es conveniente proporcionar la fuente de ácido nucleico con un agente que dirige las células diana, tal como un anticuerpo específico para una proteína de membrana de la superficie celular o la célula diana, un ligando para un receptor en la célula diana, etc. Cuando se usan liposomas, se pueden usar proteínas que se unen a una proteína de membrana de la superficie celular asociada con la endocitosis, para dirigir y/o facilitar la absorción, p. ej., proteínas de cápsida o fragmentos de las mismas, trópicos para un tipo de célula particular, anticuerpos para proteínas que sufren internalización en ciclo, y proteínas que dirigen la localización intracelular y potencian la semivida intracelular. La técnica de endocitos mediada por receptor la describen, por ejemplo, Wu y col., J. Biol. Chem., 262: 4429-4432 (1987); y Wagner y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 3410-3414 (1990). Para una revisión del marcaje de genes y los protocolos de terapia génica actualmente conocidos, véase, Anderson y col., Science, 256: 808-813 (1992). Véase también el documento WO 93/25673 y las referencias citadas en el mismo.
Se pueden encontrar terapias génicas y procedimientos para hacer partículas retrovíricas y proteínas estructurales en la patente de EE.UU. nº 5.681.746.
vi. Uso de genes como diagnóstico
Esta invención también se refiere al uso del gen que codifica el polipéptido PRO256 como diagnóstico. La detección de una forma mutada del polipéptido PRO256 permitirá un diagnóstico de una enfermedad cardiovascular endotelial y angiogénica o la susceptibilidad a una enfermedad cardiovascular endotelial y angiogénica, tal como un tumor, puesto que las mutaciones en el polipéptido PRO256 pueden causar tumores.
Los individuos que llevan mutaciones en los genes que codifican un polipéptido PRO256 humano, se pueden detectar a nivel del ADN con una variedad de técnicas. Los ácidos nucleicos para el diagnóstico se pueden obtener de células de un paciente, tal como de sangre, orina, saliva tejido de biopsia y material de autopsia. El ADN genómico se puede usar directamente para la detección o se puede amplificar enzimáticamente usando PCR (Saiki y col., Nature, 324: 163-166 (1986)) antes del análisis. El ARN o ADNc también se pueden usar para los mismos propósitos. Como ejemplo, los cebadores de la PCR complementarios del ácido nucleico que codifica el polipéptido PRO256 se pueden usar para identificar y analizar mutaciones del polipéptido PRO256. Por ejemplo, se pueden detectar deleciones e inserciones mediante un cambio de tamaño del producto amplificado en comparación con el genotipo normal. Las mutaciones puntuales se pueden identificar por hibridación de ADN amplificado con ARN radiomarcado que codifica el polipéptido PRO256, o alternativamente, secuencias de ADN antisentido radiomarcadas que codifican el polipéptido PRO256. Las secuencias perfectamente coincidentes se pueden distinguir de los dúplex no coincidentes por digestión con RNasa A o por diferencias en las temperaturas de fusión.
El ensayo genético basado en las diferencias de secuencia de ADN se puede lograr por detección de alteración en la movilidad electroforética de fragmentos de ADN en geles con o sin agentes desnaturalizantes. Las deleciones e inserciones de secuencia pequeñas se pueden visualizar por electroforesis en gel de alta resolución. Los fragmentos de ADN de diferentes secuencias se pueden distinguir en geles de gradiente de formamidina desnaturalizantes en los que las movilidades de los diferentes fragmentos de ADN se retrasan en el gel en diferentes posiciones según las temperaturas de fusión específica o de fusión parcial. Véase, p. ej., Myers y col., Science, 230: 1242 (1985).
Los cambios de secuencia en sitios específicos también se pueden poner de manifiesto por ensayos de protección de nucleasa, tales como protección de RNasa y S1 o el procedimiento de escisión química, por ejemplo, [Cotton y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:4397-4401 (1985).
Por lo tanto, la detección de una secuencia de ADN específica se puede lograr por procedimientos tales como la hibridación, protección de RNasa, escisión química, secuenciación de ADN directa, o el uso de enzimas de restricción, p. ej., polimorfismos de la longitud del fragmento de restricción (RFLP) y transferencia Southern de ADN genómico.
vii. Uso para detectar niveles del polipéptido PRO256
Además de la electroforesis en gel y secuenciación de ADN más convencionales, las mutaciones también se pueden detectar mediante análisis in situ.
La expresión del ácido nucleico que codifica el polipéptido PRO256 se puede ligar a la enfermedad vascular periférica, lesión hepática o renal o indicios de reestenosis. Si el polipéptido PRO256 tiene una secuencia señal y el ARNm se expresa mucho en células endoteliales y en menor extensión en células musculares lisas, esto indica que el polipéptido PRO256 está presente en el suero. Por consiguiente, se podría usar un anticuerpo anti-PRO256 para diagnosticar la enfermedad vascular periférica, trastornos hepáticos o reestenosis, puesto que el nivel alterado de este polipéptido PRO256 podría ser indicio de dichos trastornos.
Se puede usar un ensayo de competición en el que los anticuerpos específicos para el polipéptido PRO256 se unen a un soporte sólido y el polipéptido PRO256 marcado y una muestra obtenida del huésped, se pasan por el soporte sólido, y la cantidad de marcador detectada unido al soporte sólido se puede correlacionar con una cantidad de polipéptido PRO256 en la muestra.
viii. Cartografía de cromosomas
Las secuencias de la presente invención también son valiosas en la identificación de cromosomas. La secuencia se reconoce específicamente y puede hibridar con un lugar particular en un cromosoma humano individual. Además, actualmente es necesario identificar sitios particulares en el cromosoma. Actualmente hay disponibles pocos reactivos de marcado de cromosomas basados en los datos de secuencia actuales (polimorfismos de repetición) para marcar sitios cromosómicos. La cartografía de los ADN de los cromosomas según la presente invención es una primera etapa importante en la correlación de estas secuencias con genes asociados con la enfermedad.
Brevemente, las secuencias se pueden cartografiar en los cromosomas preparando cebadores de PCR (preferiblemente 15-25 pb) a partir de ADNc. Se usa el análisis por ordenador de la región 3' no traducida para seleccionar cebadores rápidamente que no se extiendan más de un exón en el ADN genómico, complicando así el procedimiento de amplificación. Estos cebadores después se usaron para el cribado por PCR de híbridos celulares somáticos que contienen los cromosomas humanos individuales. Solo los híbridos que contienen el gen humano correspondiente al cebador darán un fragmento amplificado.
La cartografía por PCR de híbridos de células somáticas es un procedimiento rápido para asignar un ADN particular a un cromosoma particular. Usando la presente invención con los mismos cebadores oligonucleótidos, la sublocalización se puede lograr con paneles de fragmentos de cromosomas específicos o grupos de clones genómicos grandes de una forma análoga. Otras estrategias de cartografía que se pueden usar de forma similar para cartografiar el cromosoma incluyen la hibridación in situ, cribado previo con cromosomas marcados separados por flujo, y preselección por hibridación para construir bibliotecas de ADNc específicas del cromosoma.
La hibridación in situ fluorescente (FISH) de un clon de ADNc con una propagación de cromosoma en metafase, se puede usar para proporcionar un lugar cromosómico preciso en una etapa. Esta técnica se puede usar con ADNc tan corto como 500 ó 600 bases; sin embargo, los clones mayores de 2.000 pb tienen una probabilidad mayor de unirse a un lugar cromosómico único con suficiente intensidad de señal para la detección sencilla. La FISH requiere usar los clones de los cuales se ha obtenido el gen que codifica el polipéptido PRO256, y cuanto más largo mejor. Por ejemplo, 2.000 pb es bueno, 4.000 pb es mejor y probablemente no es necesario más de 4.000 para obtener resultados buenos un porcentaje razonable de las veces. Para una revisión de esta técnica, véase, Verma y col., Human Chromosomes: a Manual of Basic Techniques (Pergamon Press, New York, 1988).
Una vez que se ha cartografiado una secuencia en un lugar cromosómico preciso, la posición física de la secuencia en el cromosoma se puede correlacionar con los datos del mapa genético. Dichos datos se encuentran, por ejemplo, en V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man (disponible en línea en Johns Hopkins University Welch Medical Library). Después, la relación entre genes y enfermedades que se han cartografiado en la misma región cromosómica se identifica por el análisis de ligado (herencia conjunta de genes físicamente adyacentes).
Después, es necesario determinar las diferencias en el ADNc o secuencia genómica entre los individuos afectados y los no afectados. Si se observa una mutación en alguno o en todos los individuos afectados, pero no en ninguno de los individuos normales, entonces es probable que la mutación sea el agente causante de la enfermedad.
Con la resolución actual de las técnicas de cartografía física y de cartografía genética, un ADNc localizado con precisión en una región cromosómica asociada con la enfermedad podría ser uno entre 50 y 500 potenciales genes causantes (Esto supone una resolución de mapa de 1 megabase y 1 gen por 20 kb).
ix. Ensayos de cribado para candidatos a fármacos
Esta invención abarca procedimientos de cribado de compuestos para identificar los que imitan el polipéptido PRO256 (agonistas) o previenen el efecto del polipéptido PRO256 (antagonistas). Los ensayos de cribado para los candidatos a fármacos antagonistas se diseñan para identificar compuestos que se unen o forman complejo con el polipéptido PRO256 codificado por los genes identificados en el presente documento, o que interfieren de otra forma con la interacción de los polipéptidos codificados con otras proteínas celulares. Dichos ensayos de cribado incluyen ensayos que se pueden trasladar al cribado de alto rendimiento de bibliotecas químicas, haciendo que sean particularmente adecuados para identificar candidatos a fármacos de tipo moléculas pequeñas.
El ensayo se puede llevar a cabo en una variedad de formatos, incluyendo ensayos de unión proteína-proteína, ensayos de cribado bioquímico, inmunoensayos u ensayos basados en células, que están bien caracterizados en la materia.
Todos los ensayos para antagonistas son comunes en cuanto que implican el contacto del candidato a fármaco con un polipéptido PRO256 codificado por un ácido nucleico identificado en el presente documento, en condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir que estos dos componentes interaccionen.
En los ensayos de unión, la interacción es la unión y el complejo formado se puede aislar o detectar en la mezcla de reacción. En una realización particular, el polipéptido PRO256 codificado por el gen identificado en el presente documento o candidato a fármaco, se inmoviliza en una fase sólida, p. ej., una placa de microvaloración, mediante enlaces covalentes y no covalentes. El enlace covalente generalmente se lleva a cabo mediante el recubrimiento de la superficie sólida con una disolución del polipéptido PRO256 y secado. Alternativamente, se puede usar un anticuerpo inmovilizado, p. ej., un anticuerpo monoclonal, específico para el polipéptido PRO256 que se va a inmovilizar, para anclarlo a su superficie sólida. El ensayo se lleva a cabo añadiendo el componente no inmovilizado, que puede estar marcado con un marcador detectable, al componente inmovilizado, p. ej., la superficie recubierta que contiene el componente anclado. Cuando la reacción se ha completado, se separan los componentes que no han reaccionado, p. ej., mediante lavado, y se detectan los complejos anclados en la superficie sólida. Cuando el componente no inmovilizado originalmente lleva un marcador detectable, la detección del marcador inmovilizado en la superficie indica la formación de complejo que ha tenido lugar. Cuando el componente no inmovilizado originalmente no lleva el marcador, la formación de complejo se puede detectar, por ejemplo, usando un anticuerpo marcado que se une específicamente al complejo inmovilizado.
Si el compuesto candidato interacciona pero no se une a un polipéptido PRO256 particular codificado por un gen identificado en el presente documento, su interacción con este polipéptido se puede ensayar por procedimientos conocidos para detectar interacciones proteína-proteína. Dichos ensayos incluyen procedimientos tradicionales, tales como, p. ej., reticulación, coinmunoprecipitación, y copurificación por gradientes o columnas cromatográficas. Además, las interacciones proteína-proteína se pueden seguir usando un sistema genético basado en levaduras descrito por Fields y colaboradores (Fields y Song, Nature (London), 340: 245-246 (1989); Chien y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 9578-9582 (1991)) como describen Chevray y Nathans, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5789-5793 (1991). Muchos activadores transcripcionales, tales como la levadura GAL4, consisten en 2 dominios modulares físicamente discretos, en el que uno actúa como el dominio de unión al ADN y el otro funciona como el dominio de transcripción-activación. El sistema de expresión de levaduras descrito en las publicaciones anteriores (en general denominado como "sistema de dos híbridos") aprovecha esta propiedad y usa 2 proteínas híbridas, una en la que la proteína diana está fusionada con el dominio de unión al ADN de GAL4, y la otra, en la que las proteínas activantes candidatas se fusionan con el dominio de activación. La expresión de un gen indicador GAL1-lacZ bajo el control de un promotor activado de GAL4 depende de la reconstitución de la actividad de GAL4 por la interacción proteína-proteína. Las colonias que contienen polipéptidos que interaccionan se detectan con un sustrato cromogénico para la \beta-galactosidasa. Está disponible en el comercio en Clontech un kit completo (MATCHMAKER^{TM}) para identificar interacciones proteína-proteína entre dos proteínas específicas que usa la técnica de los dos híbridos. Este sistema también se puede extender a la cartografía de dominios de proteína implicados en las interacciones de proteínas específicas así como a determinar la posición de restos de aminoácido que son cruciales para estas interacciones.
Los compuestos que interfieren con la interacción de un gen que codifica un polipéptido PRO256 identificado en el presente documento, y otros componentes intra o extracelulares, se pueden ensayar como sigue: normalmente se prepara una mezcla de reacción que contiene el producto del gen y el componente intra o extracelular en condiciones y durante un tiempo que permitan la interacción y unión entre los dos productos. Para ensayar la capacidad de un compuesto candidato para inhibir la unión, la reacción se lleva a cabo en ausencia y en presencia del compuesto de ensayo. Además, se puede añadir un placebo a una tercera mezcla de reacción para que sirva como control positivo. La unión (formación de complejo) entre el compuesto de ensayo y el componente intra o extracelular presente en la mezcla se sigue como se ha descrito en lo que antecede. La formación de un complejo en la o las reacciones de control, pero no en la mezcla de reacción que contiene el compuesto de ensayo, indica que el compuesto de ensayo interfiere con la interacción del compuesto de ensayo y su pareja de reacción.
Las composiciones útiles en el tratamiento de trastornos cardiovasculares, endoteliales y angiogénicos incluyen, sin limitación, anticuerpos, moléculas orgánicas e inorgánicas pequeñas, péptidos, fosfopéptidos, moléculas antisentido y ribozimas, moléculas triple hélice, etc. que inhiben la expresión y/o actividad del producto génico diana.
Los ejemplos más específicos de potenciales antagonistas incluyen un oligonucleótido que se une a las fusiones de inmunoglobulina con un polipéptido PRO256, y en particular, anticuerpos que incluyen, sin limitación, anticuerpos poli y monoclonales y fragmentos de anticuerpos, anticuerpos de una cadena, anticuerpos antiidiotípicos, y versiones quiméricas o humanizadas de dichos anticuerpos o fragmentos, así como anticuerpos humanos y fragmentos de anticuerpos. Alternativamente, un potencial antagonista puede ser una proteína estrechamente relacionada, por ejemplo, una forma mutada del polipéptido PRO256 que reconoce el receptor pero no imparte efecto, inhibiendo así de forma competitiva la acción del polipéptido PRO256.
Otro potencial antagonista del polipéptido PRO256 es una construcción de ARN o ADN antisentido preparada usando tecnología antisentido, en la que, p. ej., una molécula de ARN o ADN antisentido actúa para bloquear directamente la traducción del ARNm mediante hibridación con el ARNm dirigido y prevenir la traducción de la proteína. Se puede usar tecnología antisentido para controlar la expresión del gen mediante la formación de una triple hélice o ADN o ARN antisentido, estando ambos procedimientos basados en la unión de un polinucleótido a ADN o ARN. Por ejemplo, la parte codificante 5' de la secuencia polinucleótida, que codifica el polipéptido PRO256 maduro del presente documento, se usa para diseñar un oligonucleótido de ARN antisentido de aproximadamente 10 a 40 pares de bases de longitud. Se diseña un oligonucleótido de ADN para que sea complementario de una región del gen implicada en la transcripción (triple hélice, véase, Lee y col., Nucl. Acids Res., 6:3073 (1979); Cooney y col., Science, 241: 456 (1988); Dervan y col., Science, 251:1360 (1991)), previniendo así la transcripción y la producción del polipéptido PRO256. El oligonucleótido de ARN antisentido hibrida con el ARNm in vivo y bloquea la traducción de la molécula de ARNm al polipéptido PRO256 (antisentido - Okano, Neurochem., 56:560 (1991) Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression (CRC Press: Boca Raton, FL, 1988). Los oligonucleótidos descritos antes también se pueden suministrar a las células de modo que el ARN o ADN antisentido puedan expresarse in vivo para inhibir la producción del polipéptido PRO256. Cuando se usa el ADN antisentido, se prefieren los oligodesoxirribonucleótidos derivados del sitio de inicio de la traducción, p. ej., entre las posiciones aproximadamente -10 a +10 de la secuencia de nucleótidos del gen diana.
Las moléculas de ARN o ADN antisentido en general tienen al menos aproximadamente 5 bases de longitud, aproximadamente 10 bases de longitud, aproximadamente 15 bases de longitud, aproximadamente 20 bases de longitud, aproximadamente 25 bases de longitud, aproximadamente 30 bases de longitud, aproximadamente 35 bases de longitud, aproximadamente 40 bases de longitud, aproximadamente 45 bases de longitud, aproximadamente 50 bases de longitud, aproximadamente 55 bases de longitud, aproximadamente 60 bases de longitud, aproximadamente 65 bases de longitud, aproximadamente 70 bases de longitud, aproximadamente 75 bases de longitud, aproximadamente 80 bases de longitud, aproximadamente 85 bases de longitud, aproximadamente 90 bases de longitud, aproximadamente 95 bases de longitud, aproximadamente 100 bases de longitud, o más.
Los potenciales antagonistas incluyen moléculas pequeñas que se unen al sitio activo, al sitio de unión al receptor o al factor de crecimiento u otros sitios de unión relevantes del polipéptido PRO256, bloqueando así la actividad biológica normal del polipéptido PRO256. Los ejemplos de moléculas pequeñas incluyen, pero no se limitan a moléculas pequeñas peptídicas o de tipo péptido, preferiblemente péptidos solubles, y compuestos orgánicos o inorgánicos no peptidilos sintéticos.
Los ribozimas son moléculas de ARN enzimáticas capaces de catalizar la escisión específica del ARN. Los ribozimas actúan por hibridación específica de secuencia con el ARN diana complementario, seguido de escisión endonucleolítica. Los sitios de escisión específicos del ribozima en una potencial diana de ARN se pueden identificar por técnicas conocidas. Para más detalles, véase, p. ej., Rossi, Current Biology, 4: 469-471 (1994), y publicación PCT WO 97/33551 (publicada el 18 de septiembre, 1997).
Las moléculas de ácido nucleico en formación de triple hélice usadas para inhibir la transcripción deben ser monocatenarias y estar compuestas de desoxinucleótidos. La composición de bases de estos oligonucleótidos se diseña de modo que promueva la formación de la triple hélice por las reglas de emparejamiento de bases de Hoogsteen, que en general requiere tramos de tamaño considerable de purinas o pirimidinas en una cadena de un dúplex. Para más detalles véase, p. ej., la publicación PCT nº WO 97/33551, véase antes.
Estas moléculas pequeñas se pueden identificar mediante uno cualquiera o más de los ensayos de cribado discutidos en lo que antecede y/o por cualquier técnica de cribado conocida para los expertos en la materia.
x. Tipos de trastornos cardiovasculares, endoteliales y angiogénicos a tratar
Los polipéptidos PRO256, o agonistas o antagonistas de los mismos, que tienen actividad en ensayos cardiovasculares, endoteliales y angiogénicos, y/o cuyo producto génico se ha encontrado que está localizado en el sistema cardiovascular, es probable que tengan usos terapéuticos en una variedad de trastornos cardiovasculares, endoteliales y angiogénicos, incluyendo trastornos sistémicos que afectan a vasos, tales como diabetes mellitus. Su utilidad terapéutica podría incluir enfermedades de las arterias, capilares, venas y/o vasos linfáticos. Los ejemplos de tratamiento que se dan a continuación incluyen tratar enfermedades de desgaste muscular, tratar la osteoporosis, ayudar a la fijación de implante para estimular el crecimiento de células alrededor del implante y por lo tanto facilitar su unión al sitio pretendido, aumentar la estabilidad de IGF en tejidos o en el suero, si se aplica, y aumentar la unión al receptor de IGF (puesto que se ha mostrado que IGF in vitro potencia el crecimiento de células progenitoras granulocíticas o eritroides de la médula).
Los polipéptidos PRO256 o agonistas o antagonistas de los mismos, también se pueden usar para estimular la eritropoyesis o granulopoyesis, para estimular la curación de heridas o la regeneración de tejido, y en terapias asociadas relativas al recrecimiento de tejido, tal como tejido conjuntivo, piel, hueso, cartílago, músculo, pulmón o riñón, para promover la angiogénesis, para estimular o inhibir la migración de células endoteliales y proliferar el crecimiento del músculo liso vascular y producción de células endoteliales. El aumento de la angiogénesis mediada por un antagonista del polipéptido PRO256 sería beneficioso para tejidos isquémicos y para el desarrollo coronario colateral en el corazón después de estenosis coronaria. Los polipéptidos PRO256 o agonistas de los mismos se usan para inhibir la angiogénesis, por ejemplo, para limitar la producción de exceso de tejido conjuntivo durante la curación de heridas o fibrosis pulmonar.
La decisión de usar la propia molécula o un agonista de la misma para cualquier indicación, en oposición a un antagonista de la molécula, dependerá principalmente de si la molécula del presente documento promueve la cardiovascularización, génesis de células endoteliales o angiogénesis, o inhibe estas afecciones. Por ejemplo los polipéptidos PRO256 o un agonista de los mismos, pueden presentar inhibición de la activación del factor de crecimiento de hepatocitos y por lo tanto inhibirían la promoción de la angiogénesis. Por lo tanto, sería de esperar que fueran útiles para el tratamiento de trastornos en los que es conveniente limitar o prevenir la angiogénesis. Los polipéptidos PRO256 o agonistas de los mismos, se podrían usar directamente para el tratamiento de trastornos asociados con tumores vasculares tales como hemangioma, angiogénesis de tumor, neovascularización en la retina, coroide o córnea, asociado con retinopatía diabética o retinopatía infantil prematura, o degeneración macular, y vitrorretinopatía proliferativa, artritis reumatoide, enfermedad de Crohn, aterosclerosis, hiperestimulación ovárica, psoriasis, endometriosis asociada con neovascularización, reestenosis después de angioplastia con balón, sobreproducción de tejido de cicatrización, por ejemplo, el observado en un queloide que se forma después de cirugía, fibrosis después de infarto de miocardio, o lesiones fibróticas asociadas con fibrosis pulmonar.
Por otra parte, se esperaría que los antagonistas de los polipéptidos PRO256 fueran útiles para afecciones en las que se desea la promoción de la angiogénesis, tales como enfermedad vascular periférica, hipertensión, vasculitis inflamatoria, enfermedad de Reynaud y fenómeno de Reynaud, aneurismas, reestenosis arterial, tromboflebitis, linfangitis, linfedema, curación de heridas y reparación tisular (en especial tejido hepático y renal), lesión por isquemia-reperfusión, angina, infartos de miocardio tales como infartos de miocardio agudos, afecciones crónicas del corazón, insuficiencia cardiaca tales como insuficiencia cardiaca congestiva, y osteoporosis.
A continuación se describen tipos específicos de enfermedades, en los que el polipéptido PRO256 del presente documento o agonistas o antagonistas del mismo, pueden servir al ser útiles para dirigir fármacos relacionados con el sistema vascular o como dianas terapéuticas para el tratamiento o prevención de los trastornos. La aterosclerosis es una enfermedad caracterizada por la acumulación de placas de engrosamiento de la íntima de las arterias, debido a la acumulación de lípidos, proliferación de células musculares lisas y formación de tejido fibroso en la pared arterial. La enfermedad puede afectar a arterias grandes, medias y pequeñas en cualquier órgano. Se sabe que los cambios en la función de la células endoteliales y musculares lisas vasculares tienen una función importante en la modulación de la acumulación y regresión de estas placas.
La hipertensión se caracteriza por la presión vascular elevada en los sistemas arterial sistémico, arterial pulmonar o venoso portal. La presión elevada puede ser resultado o dar como resultado la función endotelial deteriorada y/o enfermedad vascular.
La vasculitis inflamatoria incluye arteritis de células gigantes, arteritis de Takayasu, poliartritis nodosa (incluyendo la forma microangiopática), enfermedad de Kawasaki, poliangitis microscópica, granulomatosis de Wegner y una variedad de trastornos vasculares relacionados con infección (incluyendo púrpura de Henoch-Schonlein). Se ha mostrado que la función celular endotelial alterada es importante en estas enfermedades.
La enfermedad de Reynaud y fenómeno de Reynaud se caracterizan por el deterioro anormal de la circulación por las extremidades por la exposición al frío. Se ha mostrado que la función celular endotelial alterada es importante en esta enfermedad.
Los aneurismas son dilataciones saculares o fusiformes del árbol arterial o venoso, asociadas con células endoteliales y/o células musculares lisas vasculares alteradas.
La reestenosis arterial (reestenosis de la pared arterial) se puede producir después de angioplastia como resultado de la alteración de la función y proliferación de las células endoteliales y células musculares lisas vasculares.
La tromboflebitis y linfangitis son trastornos inflamatorios de las venas y vasos linfáticos, respectivamente que pueden ser resultado de y/o dar como resultado la función de células endoteliales alterada. Igualmente el linfedema es una afección que implica vasos linfáticos deteriorados que resultan de la función de células endoteliales.
La familia de los tumores vasculares benignos y malignos se caracteriza por la proliferación anómala y el crecimiento de elementos celulares del sistema vascular. Por ejemplo, los linfoangiomas son tumores benignos del sistema linfático, que son congénitos, a menudo quísticos, malformaciones de los vasos linfáticos que normalmente se producen en los recién nacidos. Los tumores quísticos tienden a crecer en el tejido adyacente. Los tumores quísticos a menudo se producen en la región cervical y axilar. También pueden producirse en el tejido blando de las extremidades. Los síntomas principales son vasos linfáticos dilatados, a veces reticulares, estructurados y quistes linfáticos rodeados de tejido conjuntivo. El resultado es el drenaje linfático local 
\hbox{deteriorado, Griener y col.,  Lymphology , 4:
140-144 (1971).}
Como se ha indicado antes, los polipéptidos PRO256 o agonistas de los mismos, serían útiles en la prevención de la angiogénesis tumoral, un proceso que implica la vascularización de un tumor que le permite el crecimiento y/o metástasis. Este proceso depende del crecimiento de nuevos vasos sanguíneos. Los ejemplos de neoplasmas y afecciones relacionadas que implican la angiogénesis tumoral incluyen carcinomas de mama, carcinomas de hígado, carcinomas de ovario, teocomas, arrenoblastomas, carcinomas cervicales, carcinomas endometriales, hiperplasia endometrial, endometriosis, fibrosarcomas, coriocarcinoma, cáncer de cabeza y cuello, carcinoma nasofaríngeo, carcinomas laríngeos, hepatoblastoma, sarcoma de Kaposi, melanoma, carcinomas de piel, hemangioma, hemangioma cavernoso, hemangioblastoma, carcinomas de páncreas, retinoblastoma, astrocitoma, glioblastoma, Schwanoma, oligodendroglioma, meduloblastoma, neuroblastomas, radbomiosarcoma, sarcoma osteogénico, leiomiosarcomas, carcinomas del tracto urinario, carcinomas de tiroides, tumor de Wim, carcinoma de células renales, carcinoma de próstata, proliferación vascular anormal asociada con facomatosis, edema (tal como el asociado con tumores cerebrales) y síndrome de Meigs.
La degeneración macular relacionada con la edad (AMD) es una causa que conduce a la pérdida visual grave en la población anciana. La forma exudativa de la AMD se caracteriza por la neovascularización coroidal y el desprendimiento de células del epitelio pigmentario de la retina. Debido a que la neovascularización coroidal está asociada con un notable empeoramiento en el pronóstico, se espera que el polipéptido PRO256 o agonista del mismo, sea útil para reducir la gravedad de la AMD.
La curación de traumatismos tales como la curación de heridas y la reparación de tejidos también es un uso pretendido para los antagonistas de los polipéptidos PRO256. La formación y regresión de nuevos vasos sanguíneos es esencial para la curación y reparación de tejido. Esta categoría incluye crecimiento o regeneración de hueso, cartílago, tendón, ligamento y/o tejido nervioso, así como la curación de heridas y la reparación y sustitución de tejido, y el tratamiento de quemaduras, incisiones y úlceras. El antagonista del polipéptido PRO256 que induce el crecimiento de cartílago y/o hueso en circunstancias en las que el hueso no se forma normalmente, tiene aplicación en la curación de fracturas óseas y daño o defectos de cartílago en seres humanos y otros animales. Dicha preparación que usa un antagonista del polipéptido PRO256 puede tener un uso profiláctico en la reducción de fractura cerrada así como abierta y también en la mejor fijación de articulaciones artificiales. La formación nueva de hueso por un agente osteogénico contribuye a la reparación de defectos congénitos, inducidos por traumatismo u oncológicos, defectos craneofaciales inducidos por resección, y también es útil en cirugía plástica cosmética.
Los antagonistas del polipéptido PRO256 también pueden ser útiles para promover el cierre mejor y más rápido de heridas que no están curando, incluyendo sin limitación ulceras por presión, úlceras asociadas con insuficiencia vascular, heridas quirúrgicas y traumáticas y similares.
Se espera que un antagonista del polipéptido PRO256 presenta también actividad para la generación y regeneración de otros tejidos, tales como órganos (incluyendo, por ejemplo, páncreas, hígado, intestino, riñón, piel o endotelio), músculo (liso, esquelético o cardiaco), y tejido vascular (incluyendo endotelio vascular), o para promover el crecimiento de células que comprenden dichos tejidos. Parte de los efectos deseados pueden ser por inhibición o modulación de cicatrización fibrótica para permitir que se regenere el tejido normal.
Un antagonista de PR0256 también puede ser útil para la protección o regeneración del intestino y el tratamiento de fibrosis de pulmón o hígado, lesión por reperfusión en varios tejidos, y afecciones que resultan en daño en citoquinas sistémicas. Además, el polipéptido PRO256 o agonista o antagonista del mismo, puede ser útil para promover o inhibir la diferencicación de tejidos descrita antes a partir de tejidos o células precursoras, o para inhibir el crecimiento de tejidos descrito antes.
Un antagonista del polipéptido PRO256 también se puede usar en el tratamiento de enfermedades periodontales y en otros procesos de reparación dental. Dichos agentes pueden proporcionar un entorno para atraer las células formadoras hueso, estimular el crecimiento de células formadoras de hueso o inducir la diferenciación de progenitores de células formadoras de hueso. Un antagonista del polipéptido PRO256 también puede ser útil en el tratamiento de la osteoporosis u osteoartritis, tal como por estimulación de la reparación de hueso y/o cartílago o por bloqueo de la inflamación o procesos de destrucción de tejido (actividad de colagenasa, actividad de osteoclastos, etc.) mediados por procesos inflamatorios, ya que los vasos sanguíneos tienen una función importante en la regulación de la renovación y crecimiento óseos.
Otra categoría de actividad de regeneración de tejidos que se puede atribuir al antagonista del polipéptido PRO256 es la formación de tendón/ligamento. Una proteína que induce la formación del tejido de tipo tendón/ligamento u otro tejido en circunstancias en las que normalmente no se forma dicho tejido, tiene aplicación en la curación de rotura de ligamento o tendón, deformidades y otros defectos de tendones o ligamentos en seres humanos y otros animales. Dicha preparación puede tener uso profiláctico para prevenir el daño a los tejidos de tendones o ligamentos, así como uso para mejorar la fijación del tendón o ligamento al hueso u otros tejidos, y en la reparación de defectos de tejidos de tendones o ligamentos. La formación nueva de tejido de tipo tendón/ligamento inducida por una composición del antagonista del polipéptido PRO256 contribuye a la reparación de defectos congénitos inducidos por traumatismo o de otro tipo de tendones y ligamentos. Las composiciones del presente documento pueden proporcionar un entorno para atraer las células formadoras de tendones o ligamentos, estimular el crecimiento de células formadoras de tendones o ligamentos, inducir la diferenciación de progenitores de células formadoras de tendones o ligamentos, o inducir el crecimiento de células de tendones/ligamentos o progenitores ex vivo para devolverlas in vivo para realizar la reparación. Las composiciones del presente documento también pueden incluir una matriz y/o agente secuestrante como vehículo como se conoce en la materia.
El antagonista del polipéptido PRO256 pueden ser útil para la proliferación de células neurales para la regeneración de nervio y tejido cerebral, es decir, para el tratamiento de enfermedades del sistema nervioso central y periférico y neuropatías, así como para trastornos mecánicos y traumáticos, que implican la degeneración, muerte o traumatismo de células neurales o tejido nervioso. Más específicamente, un antagonista del polipéptido PRO256 se puede usar en el tratamiento de enfermedades del sistema nervioso central, tales como la enfermedad de Alzheimer, de Parkinson, enfermedad de Huntington, esclerosis lateral amiotrófica, y síndrome de Shy-Drager. Otras afecciones que se pueden tratar según la presente invención incluyen trastornos traumáticos y mecánicos, tales como trastornos de la médula espinal, traumatismo de la cabeza y enfermedades cerebrovasculares tales como accidente cerebrovascular. Las neuropatías periféricas que resultan de quimioterapias y otras terapias médicas, también se pueden tratar usando un antagonista del polipéptido PRO256.
La lesión por isquemia-reperfusión es otra indicación. La disfunción de células endoteliales puede ser importante tanto en el inicio como en la regulación de las secuelas de los sucesos que ocurren después de la lesión por isquemia-reperfusión.
La artritis reumatoide es otra indicación. El crecimiento de vasos sanguíneos y reconocimiento de células inflamatorias a lo largo de la vasculatura es un componente importante en la patogénesis de las formas reumatoide y sero-negativa de la artritis.
Un antagonista del polipéptido PRO256 puede ser útil también en el tratamiento de la fibrilación auricular, que se desarrolla en una parte sustancial de los pacientes a los que se ha diagnosticado cardiomiopatía hipertrófica.
Indicaciones adicionales incluyen angina, infartos de miocardio tales como infartos agudos de miocardio e insuficiencia cardiaca tal como insuficiencia cardiaca congestiva. Afecciones adicionales no neoplásicas incluyen psoriasis, retinopatías proliferativas diabéticas y otras, incluyendo retinopatía del prematuro, fibroplasia retrolental, glaucoma neovascular, hiperplasias del tiroides (incluyendo enfermedad de Grave), transplante de tejido córneo y otros tejidos, inflamación crónica, inflamación de pulmón, síndrome nefrótico, preclampia, ascitis, efusión pericárdica (tal como la asociada con la pericarditis) y efusión pleural.
En vista de lo anterior, los polipéptidos PRO256 o agonistas o antagonistas de los mismos descritos en el presente documento, que se ha mostrado que alteran o afectan a la función, proliferación y/o forma de las células endoteliales, es probable que tengan una función importante en la etiología y patogénesis de muchas o todos los trastornos indicados antes, y como tales pueden servir como dianas terapéuticas para aumentar o inhibir estos procesos o para dirigir fármacos relacionados con el sistema vascular en estos trastornos.
xi. Protocolos, esquemas, dosis y formulaciones de administración
Las moléculas del presente documento y los agonistas y antagonistas de las mismas son farmacéuticamente útiles como un agente profiláctico y terapéutico para diferentes trastornos y enfermedades como se ha expuesto antes.
Las composiciones terapéuticas de los polipéptidos PRO256 o agonistas o antagonistas de los mismos se preparan para almacenar, por mezcla de la molécula deseada que tiene el grado de pureza adecuado con vehículos, excipientes o estabilizantes farmacéuticamente aceptables (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16ª edición, Osol, A. ed. (1980)), en forma de formulaciones liofilizadas o disoluciones acuosas. Los vehículos excipientes o estabilizantes aceptables no son tóxicos para el receptor en las dosis y concentraciones usadas, e incluyen tampones tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes que incluyen ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencilamonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquil-parabenes tales como metil- o propilparabén; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 20 restos); proteínas, tales como albúmina del suero, gelatina, o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos que incluyen glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; azúcares tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sales tales como sodio; complejos metálicos (p. ej., complejos de Zn-proteína); y/o tensioactivos no iónicos tales como TWEEN^{TM}, PLURONICS^{TM} o polietilenglicol (PEG).
Los ejemplos adicionales de dichos vehículos incluyen intercambiadores de iones, alúmina, estearato de aluminio, lecitina, proteínas del suero, tales como albúmia de suero humano, sustancias tamponantes tales como fosfatos, glicina, ácido sórbico, sorbato potásico, mezclas parciales de glicéridos y ácidos grasos saturados vegetales, agua, sales o electrolitos tales como sulfato de protamina, hidrogenofosfato de disodio, hidrogenofosfato de potasio, cloruro sódico, sales de cinc, sílice coloidal, trisilicato de magnesio, polivinilpirrolidona, sustancias basadas en celulosa y polietilenglicol. Los vehículos para las formas tópicas o basadas en gel de los agonistas o antagonistas, incluyen polisacáridos tales como carboximetilcelulosa sólida o metilcelulosa, polivinilpirrolidona, poliacrilatos, polímeros de bloques de polioxietileno-polioxipropileno, polietilenglicol y alcoholes de cera de madera. Para todas las administraciones, se usan de forma adecuada las formas de depósito convencionales. Dichas formas incluyen, por ejemplo, microcápsulas, nanocápsulas, liposomas, escayolas, formas de inhalación, pulverizadores nasales, comprimidos sublinguales y preparaciones de liberación sostenida. Los polipéptidos PRO256 o agonistas o antagonistas de los mismos, normalmente se formularán en dichos vehículos en una concentración de aproximadamente 0,1 mg/ml a 100 mg/ml.
Otra formulación comprende incorporar un polipéptido PRO256 o agonista o antagonista del mismo en artículos formados. Dichos artículos se pueden usar para modular el crecimiento de células endoteliales y la angiogénesis. Además, la invasión de tumor y metástasis se puede modular con estos artículos.
Los polipéptidos PRO256 o agonistas o antagonistas para usar para la administración in vivo, deben ser estériles. Esto se logra fácilmente por filtración a través de membranas de filtración estéril, antes o después de la liofilización y reconstitución. Los polipéptidos PRO256 normalmente se conservarán en forma liofilizada o en disolución si se administran de forma sistémica. Si están en forma liofilizada, el polipéptido PRO256 o agonista o antagonista del mismo, normalmente se formula en combinación con otros ingredientes para la reconstitución con un diluyente adecuado en el momento de su uso. Un ejemplo de una formulación líquida de un polipéptido PRO256 o agonista o antagonista, es una disolución incolora, límpida y estéril no conservada cargada en un vial de una sola dosis para la inyección subcutánea. Las composiciones farmacéuticas conservadas adecuadas para el uso repetido pueden contener, por ejemplo, dependiendo principalmente de la indicación y del tipo de polipéptido:
a) polipéptido PRO256 o agonista o antagonista del mismo;
b) un tampón capaz de mantener el pH en un intervalo de estabilidad máxima del polipéptido u otra molécula en la disolución, preferiblemente aproximadamente 4-8;
c) un detergente/tensioactivos principalmente para estabilizar el polipéptido o molécula frente a la agregación inducida por agitación;
d) un agente de isotonicidad;
e) un conservante seleccionado del grupo de fenol, alcohol bencílico y haluro de bencetonio, p. ej., cloruro; y
f) agua.
Si el detergente usado es no iónico, puede ser, por ejemplo, polisorbatos (p. ej., POLYSORBATE^{TM} (TWEEN^{TM}) 20, 80, etc.) o poloxámeros (p. ej., POLOXAMER^{TM} 188). El uso de tensioactivos no iónicos permite que la formulación sea expuesta a tensión superficial de cizalladura sin causar la desnaturalización del polipéptido. Además, dichas formulaciones que contienen tensioactivos se pueden usar en dispositivos de aerosoles tales como los usados en una dosificación por vía pulmonar, y pistolas de inyector de chorro sin agujas (véase, p. ej., EP 257,956).
Puede estar presente un agente de la isotonicidad para asegurar la isotonicidad de una composición líquida del polipéptido PRO256 o agonista o antagonista del mismo, e incluye alcoholes de azúcares polihídricos, preferiblemente trihídricos o alcoholes de azúcares superiores, tales como glicerina, eritritol, arabitol, xilitol, sorbitol y manitol. Estos alcoholes de azúcares se pueden usar solos o en combinación. Alternativamente, se puede usar cloruro sódico y otras sales inorgánicas adecuadas para hacer las disoluciones isotónicas.
El tampón puede ser, por ejemplo un tampón de acetato, citrato, succinato o fosfato, dependiendo del pH deseado. El pH de un tipo de formulación líquida de esta invención se tampona en el intervalo de aproximadamente 4 a 8, preferiblemente aproximadamente pH fisiológico.
Los conservantes fenol, alcohol bencílico y haluros de bencetonio, p. ej., cloruro, son agentes antimicrobianos conocidos que se pueden usar.
Las composiciones terapéuticas del polipéptido PRO256 en general se ponen en un envase que tienen un puerto de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa o vial de disolución intravenosa que tiene un tapón perforable con una aguja de inyección hipodérmica. Las formulaciones se administran preferiblemente como inyecciones repetidas intravenosas (i.v.), subcutáneas (s.c.) o intramusculares (i.m.), o en forma de formulaciones en aerosoles adecuadas para el suministro intranasal o intrapulmonar (para el suministro intrapulmonar véase, p. ej., el documento EP
257,956).
Los polipéptidos PRO256 también se pueden administrar en forma de preparaciones de liberación sostenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen la proteína, cuyas matrices están en forma de artículos confirmados, p. ej., películas o microcápsulas. Los ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (p. ej., poli(metacrilato de 2-hidroxietilo) como describen Langer y col., J. Biomed. Mater. Res., 15:167-277(1981) y Langer, Chem. Tech., 12:98-105 (1982) o poli(alcohol vinílico)), polilactidas (patente de EE.UU. nº 3.773.919, EP 58,481), copolímeros de ácido L-glutámico y gamma-L-glutamato de etilo (Sidman y col., Biopolymers, 22: 547-556 (1983)), acetato de etileno-vinilo no degradable (Langer y col., véase antes), copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradables tales como Lupron Depot^{TM} (microesferas inyectables compuestas de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprolida), y poli-(ácido D-(-)-3-hidroxibutírico) (documento EP 133.988).
Aunque los polímeros tales como de etileno-acetato de vinilo y de ácido láctico-ácido glicólico permiten la liberación de moléculas a lo largo de 100 días, algunos hidrogeles liberan proteínas durante periodos de tiempo más cortos. Cuando las proteínas encapsuladas permanecen en el cuerpo durante un tiempo largo, se pueden desnaturalizar o agregar como resultado de la exposición a la humedad a 37ºC, dando como resultado la pérdida de actividad biológica y posibles cambios en la inmunogenicidad. Se pueden planificar estrategias racionales para la estabilización de proteínas dependiendo del mecanismo implicado. Por ejemplo, si se descubre que el mecanismo de agregación es la formación de enlace S-S intermolecular a través del intercambio de tiodisulfuro, la estabilización se puede lograr modificando los restos sulfhidrilo, liofilizando las disoluciones ácidas, controlando el contenido de humedad, usando aditivos adecuados, y desarrollando composiciones de matrices poliméricas específicas.
Las composiciones del polipéptido PRO256 también incluyen los polipéptidos PRO256 atrapados en liposomas. Los liposomas que contienen el polipéptido PRO256 se preparan por procedimientos conocidos en la materia: documentos DE 3.218.121; Epstein y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688-3692 (1985); Hwang y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4030-4034 (1980); EP 52.322; EP 36.676; EP 88.046; EP 143.949; EP 142.641; solicitud de patente japonesa 83-118008; patentes de EE.UU. nº 4.485.045 y 4.544.545; y EP 102.324. Normalmente los liposomas son de tipo unilamelar pequeño (aproximadamente 200-800 angstroms) en el que el contenido de lípido es mayor de aproximadamente 30% en moles de colesterl, ajustándose la proporción seleccionada para la terapia
óptima.
La dosis terapéuticamente eficaz de un polipéptido PRO256 o agonista o antagonista del mismo, variará, por supuesto, dependiendo de factores tales como la afección patológica que se va a tratar (incluyendo prevención), el procedimiento de administración, el tipo de compuesto que se va a usar para el tratamiento, cualquier coterapia implicada, la edad, peso, estado médico general del paciente, los antecedentes médicos personales, etc., y su determinación está al alcance de un médico en ejercicio. Por consiguiente, será necesario que el terapeuta valore la dosificación y modifique la ruta de administración según se requiera, para obtener el máximo efecto terapéutico. Si el polipéptido PRO256 tienen una ventana estrecha de huéspedes, para el tratamiento de pacientes humanos se prefieren las formulaciones que comprenden el polipéptido PRO256 humano, más preferiblemente el polipéptido PRO256 humano de secuencia nativa. El especialista clínico administrará el polipéptido PRO256 hasta que se alcance una dosificación que consiga el efecto deseado para el tratamiento de la afección en cuestión. Por ejemplo, si el objetivo es el tratamiento de CHF, la cantidad será una que inhiba la hipertrofia cardiaca progresiva asociada con esta afección. El desarrollo de esta terapia se sigue fácilmente por ecocardiografía. Igualmente, en pacientes con cardiomiopatía hipertrófica, el polipéptido PRO256 se puede administrar en una base empírica.
Con las directrices anteriores, la dosis efectiva en general está en el intervalo de aproximadamente 0,001 a aproximadametne 1,0 mg/kg, más preferiblemente aproximadamente 0,01-1,0 mg/kg, lo más preferiblemente aproximadamente 0,01-0,1 mg/kg.
Para uso no oral en el tratamiento de la hipertensión del adulto humano, es ventajoso administrar el polipéptido PRO256 en forma de una inyección de aproximadamente 0,01 a 50 mg, preferiblemente aproximadamente de 0,05 a 20 mg, lo más preferiblemente de 1 a 20 mg, por kg de peso corporal, de 1 a 3 veces al día por inyección intravenosa. Para la administración oral, se administra preferiblemente una molécula basada en el polipéptido PRO256 de aproximadamente 5 mg a 1 mg, preferiblemente aproximadamente de 10 a 100 mg, por kg de peso corporal, de 1 a 3 veces al día. Debe apreciarse que la contaminación por endotoxinas deben mantenerse al mínimo en un nivel de seguridad, por ejemplo, menos de 0,5 ng/mg de proteína. Además, para la administración humana, las formulaciones preferiblemente cumplen la esterilidad, pirogenicidad, seguridad general y pureza requeridas por los estándares biológicos y la oficina de la FDA.
El régimen de dosificación de una composición farmacéutica que contiene el polipéptido PRO256 para usar en la regeneración de tejido, lo determinará el médico que atiende considerando diferentes factores que modifican la acción de los polipéptidos, p. ej., la cantidad de peso de tejido que se desea que se forme, el sitio del daño, la afección del tejido dañado, el tamaño de una herida, el tipo de tejido dañado (p. ej., hueso), la edad, sexo y dieta del paciente, la gravedad de cualquier infección, el tiempo de administración y otros factores clínicos. La dosificación puede variar con el tipo de matriz usada en la reconstitución y con la inclusión de otras proteínas en la composición farmacéutica. Por ejemplo, la adición de otros factores de crecimiento conocidos, tales como IGF-I, a la composición final, también puede afectar a la dosificación. El progreso se puede seguir mediante la evaluación periódica de crecimiento y/o reparación del tejido/hueso, por ejemplo, por rayos X, determinaciones histomorfométricas y marcajes con tetraciclina.
La vía de administración del polipéptido PRO256 o agonista o antagonista es según los procedimientos conocidos, p. ej., por inyección o infusión por vías intravenosa, intramuscular, intracerebral, intraperitoneal, intracerobroespinal, subcutánea, intraocular, intraarticular, intrasinovial, intratecal, oral, tópica o inhalación, o por sistemas de liberación sostenida como se ha indicado antes. El polipéptido PRO256 o agonistas o antagonistas del mismo también se pueden administrar de forma adecuada por vías intratumoral, peritumoral, intralesional o perilesional, para ejercer efectos terapéuticos locales así como sistémicos. Se espera que la vía intraperitoneal sea particularmente útil, por ejemplo, en el tratamiento de los tumores de ovario.
Si se usa un péptido o molécula pequeña como un antagonista o agonista, preferiblemente se administra por vía oral o no oral en forma de un líquido o sólido, a mamíferos.
Los ejemplos de sales de moléculas farmacológicamente aceptables que forman sales que son útiles en el presente documento, incluyen sales de metales alcalinos (p. ej., sal de sodio, sal de potasio), sales de metales alcalinotérreos (p. ej., sal de calcio, sal de magnesio, sales de amonio, sales de base orgánicas (p. ej., sal de piridina, sal de trietilamina), sales de ácido inorgánico (p. ej., hidrocloruro, sulfato, nitrato) y sales de ácido orgánico (p. ej., acetato, oxalato, p-toluenosulfonato).
Para las composiciones del presente documento que son útiles para la regeneración de hueso, cartílago, tendón o ligamento, el procedimiento terapéutico incluye la administración de la composición por vía tópica, sistémica o local en forma de un implante o dispositivo: cuando se administra, la composición terapéutica para usar, está en una forma fisiológicamente aceptable exenta de pirógenos. Además, la composición puede encaspularse de forma conveniente o inyectarse en una forma viscosa para liberar en el sitio del hueso, cartílago o tejido dañado. La administración tópica puede ser adecuada para curar heridas y reparar tejidos. Preferiblemente, para la formación de hueso y/o cartílago, la composición incluirá una matriz capaz de liberar la composición que contiene proteína en el sitio de daño del hueso y/o cartílago, proporcionando una estructura para el desarrollo del hueso y cartílago, y preferiblemente capaz de ser reabsorbida en el cuerpo. Dichas matrices pueden estar formadas de materiales que se usan actualmente para aplicaciones médicas de implantes.
La elección del material de la matriz se basa en la biocompatibilidad, biodegradabilidad, propiedades mecánicas, aspecto cosmético y propiedades de interfase. La aplicación particular de las composiciones definirá la formulación adecuada. Las potenciales matrices para las composiciones pueden ser biodegradables y químicamente definidas, por sulfato cálcico, fosfato de tricalcio, hidroxiapatito, poli(ácido láctico), poli(ácido glicólico), y polianhídridos. Otros potenciales materiales son biodegradables y biológicamente bien definidos, tal como colágeno óseo o dérmico. Otras matrices están compuestas de proteínas puras o componentes de la matriz extracelular. Otras potenciales matrices son no biodegradables y químicamente definidas, tales como hidroxiapatito sinterizado, biovidrio, aluminatos y otros materiales cerámicos. Las matrices pueden estar compuestas de combinaciones de cualquiera de los tipos de materiales mencionados antes, tales como poli(ácido láctico) e hidroxiapatito o colágeno y fosfato tricálcico. Los materiales biocerámicos pueden alterarse en la composición, tal como en aluminato-fosfato de calcio y procesarse para alterar el tamaño de poros, tamaño de partículas, forma de partículas y biodegradabilidad.
Una realización específica es un copolímero 50:50 (moles en peso) de ácido láctico y ácido glicólico en forma de partículas porosas que tienen diámetros en el intervalo de 150 a 800 micrómetros. En algunas aplicaciones, será útil usar un agente secuestrante, tal como carboximetilcelulosa o coágulo de sangre autólogo, para prevenir que las composiciones del polipéptidos se disocien de la matriz.
Una familia adecuada de agentes secuestrantes son los materiales celulósicos tales como alquilcelulosas (incluyendo hidroxialquilcelulosas), inclyendo metilcelulosa, etilcelulosa, hidroxietilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa y carboximetilcelulosa, siendo uno preferido las sales catiónicas de la carboximetilcelulosa (CMC). Otros agentes secuestrantes preferidos incluyen ácido hialurónico, alginato sódico, polietilenglicol, poli(óxido de oxietileno), polímero de carboxivinilo y poli(alcohol vinílico). La cantidad de agente secuestrante útil en el presente documento es 0,5-20% en peso, preferiblemente 1-10% en peso, basado en el peso total de la formulación, que representa la cantidad necesaria para prevenir la desorción del polipéptido (o su antagonista) de la matriz de polímero y proporcionar la manipulación adecuada de la composición, pero no tanto como para que se prevenga que las células progenitoras se infiltren en la matriz, proporcionando así al polipéptido (o su antagonista) la oportunidad de ayudar a la actividad osteogénica de las células progenitoras.
xii Terapias de combinación
La eficacia del polipéptido PRO256 o un agonista o antagonista del mismo para prevenir o tratar el trastorno en cuestión, se puede mejorar administrando el agente activo de forma seriada o en combinación con otro agente que es eficaz para esos propósitos, en la misma composición o en composiciones separadas.
Por ejemplo, para el tratamiento de la hipertrofia cardiaca, la terapia con el polipéptido PRO256 se puede combinar con la administración de inhibidores de factores de hipertrofia miocítica cardiaca conocidos, p. ej., inhibidores de agonistas \alpha-adrenérgicos tales como fenilefrina; inhibidores de endotelina-1 tales como BOSENTAN^{TM} y MOXONODIN^{TM}; inhibidores de CT-1 (patente de EE.UU. nº 5.679.545); inhibidores de LIF; inhibidores de ACE; inhibidores de des-aspartato-angiotensina I (patente de EE.UU. nº 5.773.415), e inhibidores de angiotensina II.
Para el tratamiento de la hipertrofia cardiaca asociada con hipertensión, el polipéptido PRO256 se puede administrar en combinación con agente bloqueantes del receptor \beta-adrenérgico, p. ej., propranolol, timolol, tertalolol, carteolol, nadolol, betaxolol, penbutolol, acetobutolol, atenolol, metoprolol, o carvedilol; inhibidores de ACE, p. ej., quinapril, captopril, enalapril, ramipril, benazepril, fosinopril o lisinopril; diuréticos, p. ej., clorotiazida, hidroclorotiazida, hiroflumetazida, metilclotiazida, benzotiazida, diclorfenamida, acetazolamida o indapamida; y/o bloqueantes de canales de calcios, p. ej., diltiazem, nifedipina, verapamilo, o nicardipina. Las composiciones farmacéuticas que comprenden los agentes terapéuticos identificados en el presente documento por sus nombres genéricos, están disponibles en el comercio, y deben administrarse siguiendo las instrucciones del fabricante para la dosificación, administración, efectos adversos, contraindicaciones, etc. Véase, p. ej., Physicians' Desk Reference (Medical Economics Data Production Co.: Montvale, N.J., 1997), 51ª edición.
Los candidatos preferidos para la terapia de combinación en el tratamiento de la cardiomiopatía hipertrófica son los fármacos bloqueantes \beta-adrenérgicos (p. ej., propranolol, timolol, tertalolol, carteolol, nadolol, betaxolol, penbutolol, acetobutolol, atenolol, metoprolol, o carvedilol), verapamilo, difedipina, o diltiazem. El tratamiento de la hipertrofia asociada con la hipertensión puede requerir el uso de terapia con fámracos antihipertensores, usando bloqueantes de los canales de calcio, p. ej., diltiazem, nifedipina, verapamilo o nicardipina; agentes bloqueantes \beta-adrenérgicos; diuréticos, p. ej., clorotiazida, hidroclorotiazida, hidroflumetazida, metilclotiazida, benzotiazida, diclorfenamida, acetazolamida, o indapamida; y/o inhibidores de ACE, p. ej., quinapril, captopril, enalapril, ramipril, benazepril, fosinopril o lisinopril.
Para otras indicaciones, los polipéptidos PRO256 o sus agonistas o antagonistas se pueden combinar con otros agentes beneficiosos para el tratamiento del defecto óseo y/o de cartílago, herida o tejido en cuestión. Estos agentes incluyen diferentes factores de crecimientos tales como EGF, PDGF, TGF-\alpha o TGF-\beta, IGF, FGF y CTGF.
Además, los polipéptidos PRO256 o sus agonistas usados para tratar el cáncer se pueden combinar con agentes citotóxicos, quimioterapéuticos o inhibidores del crecimiento como se han definido antes. También para el tratamiento del cáncer el polipéptido PRO256 o su agonista se administran de forma adecuada en serie o en combinación con tratamientos radiológicos, que implican irradiación o administración de sustancias radiactivas.
Las cantidades eficaces de los agentes terapéuticos administrados en combinación con el polipéptido PRO256 o agonista o antagonista del mismo, estará a discreción del médico o veterinario. La administración y ajuste de la dosificación se hace para lograr el tratamiento máximo de la afección a tratar. Por ejemplo, para tratar la hipertensión, estas cantidades idealmente tienen en cuenta el uso de diuréticos o digitalis, y las afecciones tales como la hiper o hipotensión, insuficiencia renal, etc. La dosis dependerá además de factores tales como el tipo de agente terapéutico que se va a usar y el paciente específico que se va a tratar. Normalmente, la cantidad usada será la misma dosis que la usada si el agente terapéutico dado se administra sin el polipéptido PRO256.
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xii. Artículos de fabricación
Un artículo de fabricación tal como un kit que contiene el polipéptido PRO256 o agonistas o antagonistas del mismo útil para el diagnóstico o tratamiento de trastornos descritos antes, comprende al menos un envase y una etiqueta. Los envases adecuados incluyen, por ejemplo, botellas, viales, jeringuillas y tubos de ensayo. Los envases pueden estar formados de una variedad de materiales tales como vidrio o plástico. El envase contiene una composición que es eficaz para el diagnóstico o tratamiento de la afección y puede tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo, el envase puede ser una bolsa o un vial de disolución intravenosa con un tapón perforable con una aguja de inyección hipodérmica). El agente activo en la composición es el polipéptido PRO256 o un agonista o antagonista del mismo. La etiqueta en el envase o asociada con el envase, indica que la composición se usa para el diagnóstico o tratamiento de la afección elegida. El artículo de fabricación puede comprender además un segundo envase que comprende un tampón farmacéuticamente aceptable, tal como disolución salina tamponada con fosfato, disolución de Ringer y disolución de dextrosa. Puede incluir además otros materiales convenientes desde un punto de vista comercial y de uso, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, agujas, jeringuillas y prospectos con instrucciones de uso. El artículo de fabricación también puede comprender un segundo o tercer envase con otro agente activo como se ha descrito
antes.
E. Anticuerpos
Algunos de los candidatos a fármacos más prometedores según la presente invención son anticuerpos y fragmentos de anticuerpos que pueden inhibir la producción o el producto génico de los genes identificados en el presente documento y/o reducir la actividad de los productos génicos.
i. Anticuerpos policlonales
Los procedimientos para preparar anticuerpos policlonales son conocidos para los expertos en la materia. Los anticuerpos policlonales se pueden producir en un mamífero, por ejemplo, mediante una o más inyecciones de un agente inmunizante y, si se desea, un adyuvante. Normalmente, el agente inmunizante y/o adyuvante se inyectarán en el mamífero por múltiples inyecciones subcutáneas o intraperitoneales. El agente inmunizante puede incluir el polipéptido PRO256 o una proteína de fusión del mismo. Puede ser útil conjugar el agente inmunizante con una proteína que se sepa que es inmunogénica en el mamífero que se va a inmunizar. Los ejemplos de dichas proteínas inmunogénicas incluyen, pero no se limitan a hemocianina de lapa californiana, albúmina de suero, tiroglobulina bovina e inhibidor de tripsina de soja. Los ejemplos de adyuvantes que se pueden usar incluyen adyuvante completo de Freund y adyuvante MPL-TDM (monofosforil-lípido A o dicorinomicolato de trehalosa sintético). El protocolo de inmunización lo puede seleccionar el experto en la técnica sin excesiva experimentación.
ii. Anticuerpos monoclonales
Los anticuerpos anti-PRO256 pueden ser alternativamente anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos monoclonales se pueden preparar usando procedimientos de hibridoma, tales como los descritos por Kohler y col., Nature, 256: 495 (1975). En un procedimiento de hibridoma, normalmente se inmuniza un ratón, hámster u otro animal huésped adecuado, con un agente de inmunización para provocar linfocitos que producen o son capaces de producir anticuerpos que se unirán específicamente al agente de inmunización. Alternativamente, los linfocitos se pueden inmunizar in vitro.
El agente de inmunización normalmente incluirá el polipéptido PRO256 o una proteína de fusión del mismo. En general, se usan linfocitos de sangre periférica ("PBL") si se desean células de origen humano, o se usan células de bazo o células de nódulo linfático si se desean fuentes de mamíferos no humanas. Después, los linfocitos se fusionan con una línea celular inmortalizada usando un agente de fusión adecuado, tal como polietilenglicol, para formar una célula hibridoma. Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pág. 59-103. Las líneas celulares inmortalizadas normalmente son células de mamífero transformadas, en particular células de mieloma de origen de roedor, bovino y humano. Normalmente, se usan líneas celulares de mieloma de rata o ratón. Las células hibridomas se pueden cultivar en un medio de cultivo adecuado que contiene preferiblemente una o más sustancias que inhiben el crecimiento o la supervivencia de las células inmortalizadas, no fusionadas. Por ejemplo, si las células parentales carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforribosil-transferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para los hibridomas normalmente incluirá hipoxantina, aminopterina y timidina ("medio HAT"), cuyas sustancias previenen el crecimiento de células deficientes en HGPRT.
Las líneas celulares inmortalizadas preferidas son aquellas que se fusionan eficazmente, soportan un nivel de expresión alto estable del anticuerpo de las células productoras de anticuerpo seleccionadas, y son sensibles a un medio tal como el medio HAT. Las líneas celulares inmortalizadas más preferidas son líneas de mieloma murino, que se pueden obtener, por ejemplo, del Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California y la American Type Culture Collection, Manassas, Virginia. También se han descrito líneas celulares de mieloma humano y heteromieloma de ratón-humano para la producción de anticuerpos monoclonales humanos. Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur y col., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pág. 51-63.
Después, se puede ensayar en el medio de cultivo en el que se cultivan las células hibridomas la presencia de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el polipéptido PRO256. Preferiblemente, la especificidad de la unión de anticuerpos monoclonales producidos por las células hibridomas se determina por inmunoprecipitación o por un ensayo de unión in vitro, tal como radioinmunoensayo (RIA) o ensayo de inmunoabsorción con enzimas ligadas (ELISA). Dichas técnicas y ensayos son conocidos en la materia. La afinidad de unión del anticuerpo monoclonal se puede determinar, por ejemplo, por el análisis de Scatchard de Munson y Pollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980).
Después de identificar las células hibridomas deseadas, los clones se pueden subclonar por procedimientos de dilución límite y hacer crecer por procedimientos estándar. Goding, véase antes. Los medios de cultivo adecuados para este propósito incluyen, por ejemplo, medio Eagle modificado por Dulbecco y medio RPMI-1640. Alternativamente, las células de hibridoma se pueden hacer crecer in vivo como ascitis en un mamífero.
Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones se pueden aislar o purificar del medio de cultivo o fluido ascítico por procedimientos de purificación de inmunoglobulina convencionales tales como, por ejemplo, proteína A-Sepharosa, hidroxilapatito, electroforesis en gel, diálisis, o cromatografía de afinidad.
Los anticuerpos monoclonales también se pueden hacer por procedimientos de ADN recombinante, tales como los descritos en la patente de EE.UU. nº 4.816.567. El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales de la invención se puede aislar fácilmente y secuenciar usando procedimientos convencionales (p. ej., usando sondas de oligonucleótidos que son capaces de unirse específicamente a los genes que codifican las cadenas pesadas y ligeras de los anticuerpos murinos). Las células hibridomas de la invención sirven como fuente preferida para dicho ADN. Una vez aislado, el ADN se puede poner en vectores de expresión, que después se transfectan a células huésped, tales como células COS de simio, células de ovario de hámster chino (CHO) o células de mieloma que de lo contrario no producen proteína de inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células huésped recombinantes. El ADN también se puede modificar, por ejemplo, sustituyendo los dominios constantes de la cadena pesada y ligera humanas por secuencia codificante, en lugar de las secuencias murinas homólogas (Patente de EE.UU. nº 4.816.567; Morrison y col., véase antes), o por unión covalente a la secuencia codificante de la inmunoglobulina de toda o parte de la secuencia codificante de un polipéptido que no es de inmunoglobulina. Dicho polipéptido que no es de inmunoglobulina se puede sustituir por los dominios constantes de un anticuerpo de la invención o se puede sustituir por los dominios variables de un sitio de combinación de antígeno de un anticuerpo de la invención, para crear un anticuerpo quimérico bivalente.
Los anticuerpos pueden ser anticuerpos monovalentes. Los procedimientos para preparar anticuerpos monovalentes son bien conocidos en la materia. Por ejemplo, un procedimiento implica la expresión recombinante de la cadena ligera de la inmunoglobulina y la cadena pesada modificada. La cadena pesada se trunca generalmente en cualquier punto en la región Fc de modo que se prevenga el entrecruzamiento de la cadena pesada. Alternativamente, los restos de cisteína relevantes se sustituyen por otros restos de aminoácidos o se eliminan de modo que se prevenga el entrecruzamiento.
Los procedimientos in vitro también son adecuados para preparar anticuerpos monovalentes. La digestión de anticuerpos para producir sus fragmentos, en particular fragmentos Fab, se puede llevar a cabo usando técnicas rutinarias conocidas en la técnica.
iii. Anticuerpos humanos y humanizados
Los anticuerpos anti-PRO256 pueden comprender además anticuerpos humanizados o anticuerpos humanos. Las formas humanizadas de los anticuerpos no humanos (p. ej., murinos) son inmunoglobulinas quiméricas, cadenas de inmunoglobulinas o fragmentos de las mismas (tales como Fv, Fab, Fab', F(ab')_{2} u otras subsecuencias de anticuerpos que se unen al antígeno) que contienen la secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. Los anticuerpos humanizados incluyen inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que los restos de una región determinante de la complementaridad (CDR) del receptor se sustituyen por los restos de una CDR de una especie no humana (anticuerpo donador) tal como ratón, rata o conejo que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los restos de la Fv de la región armazón de la inmunoglobulina humana son sustituidos por los correspondientes restos no humanos. Los anticuerpos humanizados también pueden comprender restos que no se encuentran ni en el anticuerpo receptor ni en la CDR importada o secuencias de la región armazón. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todo de al menos uno, y normalmente dos, dominios variables, en el que todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a aquellas de una inmunoglobulina no humana, y todas o sustancialmente todas las regiones FR son aquellas de una secuencia consenso de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado también comprenderá, de forma óptima, al menos una parte de una región constante (Fc) de una inmunoglobulina, normalmente la de una inmunoglobulina humana. Jones y col., Nature, 321:522-525 (1986); y Reichmann y col., Nature, 332:323-329 (1988)].
Los procedimientos para humanizar anticuerpos no humanizados son bien conocidos en la técnica. En general, un anticuerpo humanizado tiene uno o más restos de aminoácidos introducidos en el mismo, de una fuente que no es humana. Estos restos de aminoácidos no humanos a menudo se denominan restos "importados", que normalmente se toman de un dominio variable "importado". La humanización se puede llevar a cabo esencialmente siguiendo el procedimiento de Winter y colaboradores (Jones y col., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann y col., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen y col., Science, 239:1534-1536 (1988)), sustituyendo las correspondientes secuencias de un anticuerpo humano por las secuencias de la CDR o las CDR de roedores. Por consiguiente, dichos anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (patente de EE.UU. nº 4.816.567), en los que sustancialmente menos de un dominio variable humano intacto se ha sustituido por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son normalmente anticuerpos humanos en los que algunos restos de la CDR y posiblemente algunos restos de la FR se sustituyen por restos de sitios análogos de anticuerpos de roedores.
Los anticuerpos humanos también se pueden producir usando diferentes técnicas conocidas en la materia, incluyendo bibliotecas de presentación de fagos. Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks y col., J. Mol. Biol., 222:581 (1991)]. También están disponibles las técnicas de Cole y col. y Boerner y col. para preparar anticuerpos monoclonales humanos. Cole y col., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985) y Boerner y col., J. Immunol., 147 (1):86-95 (1991). Igualmente, se pueden hacer anticuerpos humanos introduciendo locus de inmunoglobulina humana en animales transgénicos, p. ej., ratones en los que se han inactivado parcial o completamente los genes de las inmunoglobulinas endógenas. Tras la estimulación, se observa la producción de anticuerpos humanos, que se parecen mucho a los observados en los seres humanos en todos los aspectos, incluyendo la reorganización de genes, montaje y repertorio de anticuerpos. Este procedimiento se describe, por ejemplo, en las patentes de EE.UU. nº 5.545.807; 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.661.016, y en las siguientes publicaciones científicas: Marks y col., Bio/Technology 10,779-783 (1992); Lonberg y col., Nature 368 856-859 (1994); Morrison, Nature 368, 812-13 (1994); Fishwild y col., Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996); Lonberg y Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13 65-93 (1995).
iv. Anticuerpos biespecíficos
Los anticuerpos biespecíficos son anticuerpos monoclonales, preferiblemente humanos o humanizados, que tienen especificidades de unión para al menos dos antígenos diferentes. En el presente caso, una de las especificidades de unión es para el polipéptido PRO256, y la otra es para cualquier otro antígeno, y preferiblemente para una proteína de superficie celular o receptor o subunidad de receptor.
Los procedimientos para hacer anticuerpos biespecíficos se conocen en la técnica. Tradicionalmente, la producción recombinante de anticuerpos biespecíficos se basa en la coexpresión de dos parejas de cadena pesada/cadena ligera de inmunoglobulinas, donde las dos cadenas pesadas tienen diferentes especificidades. Milstein y Cuello, Nature, 305: 537-539 (1983). Debido a la variedad aleatoria de cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulinas, estos hibridomas (cuadromas) producen una potencial mezcla de 10 moléculas de anticuerpo diferentes, de las cuales solo una tiene la estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula correcta normalmente se logra por etapas de cromatografía de afinidad. Se describen procedimientos similares en el documento WO 93/08829, publicado el 13 de mayo de 1993, y en Traunecker y col., EMBO J., 10: 3655-3659 (1991).
Los dominios variables del anticuerpo con las especificidades de unión deseadas (sitios de combinación anticuerpo-antígeno) se pueden fusionar con las secuencias de dominio constante de la inmunoglobulina. La fusión preferiblemente es con un dominio constante de la cadena pesada de la inmunoglobulina, que comprende al menos parte de las regiones bisagra, CH2 y CH3. Se prefiere tener la primera región constante de la cadena pesada (CH1) que contenga el sitio necesario para la unión de la cadena ligera presente en al menos una de las fusiones. Los ADN que codifican las fusiones de cadena pesada de inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión separados, y se cotransfectan a un organismo huésped adecuado. Para más detalles de generación de anticuerpos biespecíficos, véase, por ejemplo, Suresh y col., Methods in Enzymology, 121: 210 (1986).
v. Anticuerpos heteroconjugados
Los anticuerpos heteroconjugados están compuestos de 2 anticuerpos covalentemente unidos. Dichos anticuerpos se han propuesto, por ejemplo, para dirigir células del sistema inmunitario a células no deseadas (patente de EE.UU. nº 4.676.980), y para el tratamiento de la infección por el VIH. Documentos WO 91/00360; WO 92/200373; EP 03089. Está contemplado que los anticuerpos heteroconjugados se pueden preparar in vitro usando procedimientos conocidos en la química sintética de proteínas, incluyendo los que implican agentes de entrecruzamiento. Por ejemplo, las inmunotoxinas se pueden construir usando una reacción de intercambio de disulfuro o por formación de un enlace tioéter. Los ejemplos de reactivos adecuados para este propósito incluyen iminotiolato y 4-mercaptobutirimidato de metilo y los descritos, por ejemplo, en la patente de EE.UU. nº 4.676.980.
vi. Diseño de la función efectora
Puede ser conveniente modificar el anticuerpo de la invención con respecto a la función efectora, para así potenciar, p. ej., la eficacia del anticuerpo en el tratamiento del cáncer. Por ejemplo, se pueden introducir resto(s) de cisteína en la región Fc, permitiendo así la formación de enlaces disulfuro entre cadenas en esta región. El anticuerpo homodímero así generado puede tener mejor capacidad de internalización y/o muerte de células mediada por complemento y citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) incrementadas. Véase, Caron y col., J. Exp. Med., 176: 1191-1195 (1992) y Shopes, J. Immunol., 148: 2918-2922 (1992). Los anticuerpos homodímeros con actividad antitumoral potenciada también se pueden preparar usando conectores de cruzamiento heterobifuncionales como describen Wolff y col., Cancer Research, 53: 2560-2565 (1993). Alternativamente, se puede diseñar un anticuerpo que tenga doble región Fc y por lo tanto puede tener potenciada la lisis de complemento y las capacidades de ADCC. Véase, Stevenson y col., Anti-Cancer Drug Design, 3: 219-230 (1989).
vii. Inmunoconjugados
La invención también se refiere a inmunoconjugados que comprenden un anticuerpo conjugado con un agente citotóxico tal como un agente quimioterapéutico, toxina (p. ej., una toxina enzimáticamente activa de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, o fragmentos de la misma) o un isótopo radiactivo (es decir, un radioconjugado).
Los agentes quimioterapéuticos útiles para generar dichos inmunoconjugados se han descrito antes. Las toxinas enzimáticamente activas y fragmentos de las mismas que se pueden usar incluyen la cadena A de difteria, fragmentos activos que no son de unión de la toxina de la difteria, cadena A de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), cadena A de ricina, cadena A de abrina, cadena A de modeccina, alfa-sarcina, Aleurites fordiiproteins, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII y PAP-S), inhibidor de momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina, y los tricotecenos. Están disponibles una variedad de radionucleidos para la para la producción de anticuerpos radioconjugados. Los ejemplos incluyen ^{212}Bi, ^{131}I, ^{131}In, ^{90}Y y ^{186}Re.
Los conjugados del anticuerpo y el agente citotóxico se hacen usando una variedad de agentes de acoplamiento de proteínas bifuncionales, tales como propionato de N-succinimidil-3-(2-piridilditiol) (SPDP), iminotiolani (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como adipimidato de dimetilo HCl), ésteres activos (tales como suberato de disuccinimidilo), aldehídos (tales como glutaraldehído), compuestos de bis-azido (tales como bis(p-azidobenzoil)hexanodiamina), derivados de bis-diazonio (tales como bis-(p-diazo-niobencil)-etilendiamina), diisocianatos (tales como 2,6-diisocianato de tolieno), y compuestos de bis-flúor activos (tales como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). Por ejemplo, una inmunotoxina de ricina se puede preparar como describen Vitetta y col., Science, 238:1098 (1987). El ácido 1-isotiocianatobencil-3-metildietilentriamino-pentaacético (MIX-DTPA) es un ejemplo de agente quelante para la conjugación del radionucleótido al anticuerpo. Véase, WO94/11026.
En otra realización, el anticuerpo se puede conjugar a un "receptor" (tal como estreptavidina) para usar en el reconocimiento previo del tumor, en el que el conjugado de anticuerpo-receptor se administra al paciente después de eliminar el conjugado no unido de la circulación, usando un agente de depuración y después administración de un "ligando" (p. ej., avidina) que está conjugado con un agente citotóxico. (p. ej., radionucleótido).
viii. Inmunoliposomas
Los anticuerpos descritos en el presente documento también se pueden formular como inmunoliposomas. Los liposomas que contienen el anticuerpo se preparan por procedimientos conocidos en la técnica, tales como los descritos por Epstein y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985); Hwang y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980); y patentes de EE.UU. nº 4.485.045 y 4.544.545. Los liposomas con tiempo en la circulación potenciado se describen en la patente de EE.UU. nº 5.013.556.
Los liposomas particularmente útiles se pueden generar por el procedimiento de evaporación en fase inversa con una composición de lípidos que comprende fafatidilcolina, colesterol y fosfatidiletanolamida derivatizada con PEG (PEG-PE). Los liposomas se extruyen a través de filtros de tamaño de poros definido para dar liposomas con el diámetro deseado. Los fragmentos Fab' del anticuerpo de la presente invención se pueden conjugar con los liposomas como describen Martin y col., J. Biol. Chem., 257: 286-288 (1982) mediante una reacción de intercambio de disulfuro. Opcionalmente, se introduce un agente quimioterapéutico (tal como la doxorrubicina) en el liposoma. Véase, Gabizon y col., J. National Cancer Inst., 81(19): 1484 (1989).
ix. Composiciones farmacéuticas de anticuerpos
Los anticuerpos que se unen específicamente a un polipéptido PRO256 identificado en el presente documento, así como otras moléculas identificadas por ensayos de cribado descritos en lo que antecede, se pueden administrar para el tratamiento de diferentes trastornos como se indica antes y a continuación en forma de composiciones farmacéuticas.
Si el polipéptido PRO256 es intracelular y se usan anticuerpos enteros como inhibidores, se prefiere la internalización de los anticuerpos. Sin embargo, las lipofecciones o liposomas solo se pueden usar para suministrar el anticuerpo o un fragmento de anticuerpo en las células. Cuando se usan fragmentos de anticuerpos, se prefiere el fragmento inhibidor más pequeño que se une específicamente al dominio de unión de la proteína diana. Por ejemplo, basándose en las secuencias de la región variable de un anticuerpo, se pueden diseñar moléculas de péptidos que retienen la capacidad para unirse a la secuencia de la proteína diana. Dichos péptidos se pueden sintetizar químicamente y/o producir por tecnología de ADN recombinante. Véase, p. ej., Marasco y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7889-7893(1993).
La formulación del presente documento también puede contener más de un compuesto activo según sea necesario para la indicación particular que se va a tratar, preferiblemente con actividades complementarias que no se afectan adversamente entre sí. Alternativamente, o además, la composición puede comprender un agente que potencia su función, tal como por ejemplo, un agente citotóxico, citoquina, agente quimioterapéutico, o agente inhibidor del crecimiento. Dichas moléculas están presentes de forma adecuada en combinación y en cantidades que son eficaces para el propósito pretendido.
Los principios activos también pueden atraparse en microcápsulas preparadas, por ejemplo, por técnicas de coacervación o por polimerización interfacial, por ejemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulosa o gelatina y microcápsulas de poli(metacrilato de metilo), respectivamente, en sistemas de suministro de fármaco coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en microemulsiones. Dichas técnicas se describen en Pharmaceutical Sciences de Remington, véase antes.
Las formulaciones que se van a usar para la administración in vivo deben ser estériles. Esto se lleva a cabo fácilmente por filtración a través de membranas de filtración estériles.
Se pueden preparar preparaciones de liberación sostenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el anticuerpo, cuyas matrices están en forma de artículos conformados, p. ej., películas o microcápsulas. Los ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli(metacrilato de 2-hidroxietilo), o poli(alcohol vinílico)), polilactidas (patente de EE.UU. nº 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutámico y L-glutamato de etilo, etileno-acetato de vinilo no degradable, copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradables tales como LUPRON DEPOT^{TM} (microesferas inyectables compuestas de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprolida) y poli(ácido D-(-)-3-hidroxibutírico). Mientras que polímeros tales como el etileno-acetato de vinilo y el ácido láctico-ácido glicólico permiten la liberación de moléculas a lo largo de 100 días, algunos hidrogeles liberan proteínas durante periodos de tiempo más cortos. Cuando los anticuerpos encapsulados permanecen en el cuerpo durante un periodo de tiempo largo, se pueden desnaturalizar o agregar como resultado a la exposición a la humedad a 37ºC, dando como resultado una pérdida de actividad biológica y a posibles cambios en la inmunogenicidad. Se pueden planificar estrategias racionales para la estabilización dependiendo del mecanismo implicado. Por ejemplo, si se descubre que el mecanismo de agregación es la formación de enlace S-S intermolecular a través del intercambio de tiodisulfuro, la estabilización se puede lograr modificando los restos sulfhidrilo, liofilizando las disoluciones ácidas, controlando el contenido de humedad, usando aditivos adecuados, y desarrollando composiciones de matrices poliméricas específicas.
x. Procedimientos de tratamiento usando el anticuerpo
Se contempla que los anticuerpos contra un polipéptido PRO256 se pueden usar para tratar diferentes afecciones cardiovasculares, endoteliales y angiogénicas, como se ha indicado antes.
Los anticuerpos se administran a un mamífero, preferiblemente un ser humano, según procedimientos conocidos, tales como la administración intravenosa en forma de un bolo o por infusión continua a lo largo de un periodo de tiempo, por vía intravenosa, intramuscular, intracerebral, intraperitoneal, intracerobroespinal, subcutánea, intraocular, intraarticular, intrasinovial, intratecal, oral, tópica o inhalación. Se prefiere la administración intravenosa del anticuerpo.
Se pueden combinar otros regímenes terapéuticos con la administración de los anticuerpos de la presente invención, como se ha indicado antes. Por ejemplo, si los anticuerpos son para tratar el cáncer, el paciente que se va a tratar con dichos anticuerpos puede recibir también terapia por radiación. Alternativamente, o además, se puede administrar al paciente un agente quimioterapéutico. El esquema de preparación y dosificación para los agentes quimioterapéuticos se puede usar según las instrucciones del fabricante o lo puede determinar empíricamente el médico experto. Los esquemas de preparación y dosificación para dicha quimioterapia también está descrita en Chemotherapy Service, Ed., M.C. Perry (Williams & Wilkins: Baltimore, MD, 1992). El agente quimioterapéutico puede preceder o seguir a la administración del anticuerpo, o se puede dar simultáneamente con el mismo. El anticuerpo se puede combinar con un compuesto antiestrógeno tal como tamoxifeno o EVISTA^{TM} o una anti-progesterona tal como onapristona (véase, el documento EP 616812) en las dosificaciones conocidas para dichas moléculas.
Si los anticuerpos se usan para tratar el cáncer, puede ser conveniente también administrar los anticuerpos contra otros antígenos asociados al tumor, tales como anticuerpos que se unen a uno o más de los receptores ErbB2, EGFR, ErbB3, ErbB4 o VEGF. Estos también incluyen los agentes expuestos antes. Además, el anticuerpo se administra de forma adecuada en serie o en combinación con tratamientos radiológicos, que implican irradiación o administración de sustancias radiactivas. Alternativamente, o además, se pueden coadministrar al paciente dos o más anticuerpos que se unen al mismo o a dos o más antígenos diferentes descritos en el presente documento. A veces, puede ser beneficioso también administrar una o más citoquinas al paciente. En una realización preferida, los anticuerpos del presente documento se coadministran con un agente inhibidor del crecimiento. Por ejemplo, el agente inhibidor del crecimiento se puede administrar primero, seguido de un anticuerpo de la presente invención. Sin embargo, también se contempla la administración simultánea o primero la administración del anticuerpo de la presente invención. Las dosificaciones adecuadas para el agente inhibidor del crecimiento son las usadas actualmente y se pueden reducir debido a la acción combinada (sinergia) del agente inhibidor del crecimiento y el anticuerpo del presente documento.
En una realización, la vascularización de los tumores se ataca con terapia de combinación. El anticuerpo anti-polipéptido PRO256 y otro anticuerpo (p. ej., anti-VEGF) se administran al paciente que tiene el tumor en dosis terapéuticamente eficaces, determinadas por ejemplo, observando la necrosis del tumor o su foco metastático, si lo hay. Esta terapia se continúa hasta que no se observe más efecto beneficioso o el examen clínico no muestre rastro del tumor o cualquier foco metastático. Después, se administra TNF, solo o en combinación con un agente auxiliar tal como interferón alfa, beta o gamma, anticuerpo anti-HER2, heregulina, anticuerpo anti-heregulina, factor D, interleuquina-1 (IL-1), interleuquina-2 (IL-2), factor estimulador de la colonia de granulocitos-macrófagos (GM-CSF), o agentes que promueven la coagulación microvascular en tumores, tales como anticuerpo anti-proteína C, anticuerpo anti-proteína S, o proteína de unión C4b (véase, documento WO 91/01753, publicado el 21 de febrero de 1991), o calor o radiación.
Puesto que variará la eficacia de los agentes auxiliares, es conveniente comparar su impacto en el tumor mediante barrido de la matriz de una forma convencional. La administración del anticuerpo anti-polipéptido PRO256 y TNF se repite hasta que se logre el efecto clínico deseado. Alternativamente, el anticuerpo anti-polipéptido PRO256 se administra junto con el TNF y opcionalmente agente(s) auxiliar(es). En casos en los que se encuentran tumores sólidos en las extremidades o en otros lugares susceptibles de aislamiento de la circulación general, los agentes terapéuticos descritos en el presente documento se administran al tumor u órgano aislado. En otras realizaciones, se administra un antagonista de FGF o PDGF, tal como anticuerpo neutralizante anti-FGF o anti-PDGF, al paciente junto con el anticuerpo anti-polipéptido PRO256. El tratamiento con los anticuerpos anti-polipéptido PRO256 se puede suspender preferiblemente durante periodos de curación de la herida o neovascularización deseable.
Para prevenir o tratar el trastorno cardiovascular, endotelial y angiogénico, la dosificación adecuada del anticuerpo del presente documento, dependerá del tipo de trastorno que se va a tratar, como se ha definido antes, la gravedad y curso de la enfermedad, si el anticuerpo se administra con propósito preventivo o terapéutico, terapia previa, antecedentes clínicos del paciente y respuesta al anticuerpo, y a discreción del médico que atiende. El anticuerpo se administra adecuadamente al paciente una vez o a lo largo de una serie de tratamientos.
Por ejemplo, dependiendo del tipo y gravedad del trastorno, aproximadamente 1 \mug/kg a 50 mg/kg (p. ej., 0,1-20 mg/kg) de anticuerpo es una dosificación inicial candidata para administrar al paciente, sea, por ejemplo, por una o más administraciones separadas, o por infusión continua. Una dosificación diaria o semanal típica puede estar en el intervalo de aproximadamente 1 \mug/kg a 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados antes. Para las administraciones repetidas a lo largo de varios días o periodo más largo, dependiendo de la afección, el tratamiento se repite o se mantiene hasta que se produzca la supresión deseada de los síntomas del trastorno. Sin embargo, pueden ser útiles otros regímenes de dosificación. El progreso de esta terapia se sigue fácilmente mediante técnicas convencionales y ensayos, incluyendo por ejemplo, la formación de imagen radiográfica del tumor.
xi. Artículos de fabricación con anticuerpos
También se proporciona un artículo de fabricación que contiene un envase con el anticuerpo y una etiqueta. Dichos artículos se han descrito antes, en los que el agente activo es un anticuerpo anti-PRO256.
xii. Diagnóstico y pronóstico de tumores usando anticuerpos
Si la indicación para la que se usan los anticuerpos es el cáncer, aunque las proteínas de superficie celular, tales como los receptores de crecimiento sobreexpresados en determinados tumores, son dianas excelentes para los candidatos a fármacos o tratamiento de tumores (p. ej., cáncer), las mismas proteínas junto con polipéptidos PRO256 tienen uso adicional en el diagnóstico y pronóstico de tumores. Por ejemplo, se pueden usar anticuerpos dirigidos contra polipéptidos PRO256 como agentes de diagnóstico o pronóstico de tumores.
Por ejemplo, los anticuerpos, incluyendo fragmentos de anticuerpos, se pueden usar cualitativa y cuantitativamente para detectar la expresión de genes, incluyendo el gen que codifica el polipéptido PRO256. El anticuerpo preferiblemente está equipado con un marcador detectable, p. ej., fluorescente, y la unión se puede seguir mediante microscopia óptica, citometría de flujo, fluorometría u otras técnicas conocidas en la materia. Dichos ensayos de unión se llevan a cabo esencialmente como se ha descrito antes.
La detección in situ de la unión del anticuerpo a los productos génicos con marcadores, se puede realizar, por ejemplo, por microscopía inmunofluorescente o inmunoelectrónica. Para este propósito, se obtiene una muestra histológica del paciente, y se le aplica un anticuerpo marcado, preferiblemente cubriendo con el anticuerpo una muestra biológica. Este procedimiento también permite determinar la distribución del producto génico con marcador en el tejido examinado. Será evidente para el experto en la técnica que están disponibles una amplia variedad de procedimientos histológicos para la detección in situ.
Los siguientes ejemplos se ofrecen solo con propósitos ilustrativos, y no se pretende que limiten el alcance de la presente invención de ninguna forma.
Ejemplos
Los reactivos disponibles en el comercio a los que se hace referencia en los ejemplos, se usaron según las instrucciones del fabricante, salvo que se indique lo contrario. La fuente de las células identificadas en los siguientes ejemplos, y a lo largo de toda la memoria descriptiva, por los números de acceso a ATCC, es la American Type Culture Collection, Manassas, VA. Salvo que se indique lo contrario, la presente invención usa procedimientos estándar de tecnología de ADN recombinante, tales como los descritos en lo que antecede y en los siguientes libros de texto: Sambrook y col., véase antes; Ausubel y col., Current Protocols in Molecular Biology (Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y., 1989); Innis y col., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, Inc.: N.Y., 1990); Harlow y col., Antibodies; A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press: Cold Spring Harbor, 1988); Gait, Oligonucleotide Synthesis (IRL Press: Oxford, 1984); Freshney, Animal Cell Culture, 1987; Coligan y col., Current Protocols in Immunology, 1991.
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Ejemplo 1
Ailamiento de clones de ADNc que codifican PRO256 humano
Se usaron las secuencias del dominio extracelular (BCD) (incluyendo la secuencia señal de secreción, si hay) de aproximadamente 950 proteínas secretadas conocidas de la base de datos pública Swis-Prot para buscar en la base de datos EST. La base de datos EST incluye bases de datos públicas (p. ej., Dayhoff, GenBank), y bases de datos privadas (p. ej. LIFESEQ®, Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA). La búsqueda se hizo usando el programa de ordenador BLAST o BLAST-2 (Altschul y col., Methods in Enzymology, 266:460-480 (1996)) como comparación de las secuencias de proteínas ECD con una traducción de 6 marcos de las secuencias de EST. Aquellas comparaciones con una puntuación en BLAST de 70 (o en algunos casos, 90) o mayores no codifican proteínas conocidas y se agruparon y unieron en secuencias de ADN consenso con el programa "phrap" (Phil Green, University of Washington, Seattle, WA).
Usando este cribado de homología de dominio extracelular, las secuencias consenso de ADN se agruparon con respecto a las otras secuencias de EST identificadas usando phrap. Además, las secuencias consenso de ADN obtenidas a menudo (pero no siempre) se extendieron usando ciclos repetidos de BLAST o BLAST-2 y phrap para extender la secuencia consenso tan lejos como fuera posible usando la fuente de secuencias de EST descrita antes.
Una secuencia consenso de ADN se reunió con respecto a otras secuencias de EST usando phrap como se ha descrito antes. Esta secuencia consenso agrupada se identifica como DNA28725. Basándose en la secuencia consenso DNA28725, se sintetizaron oligonucleótidos: 1) para identificar por PCR una biblioteca de ADNc que contenía la secuencia de interés, 2) para usar sondas para aislar un clon de la secuencia codificante de longitud completa de PRO256.
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Se sintetizó una pareja de cebadores de la PCR (directo e inverso):
cebador directo de la PCR:
5'-TGTCCACCAAGCAGACAGAAG-3'
(SEQ ID NO:3)
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cebador inverso de la PCR:
5'-ACTGGATGGCGCCTTTCCATG-3'
(SEQ ID NO:4)
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Adicionalmente, se construyeron dos oligonucleótidos sintéticos a partir de la secuencia consenso DNA28725 que tenía las siguientes secuencias de nucleótidos:
sondas de hibridación:
5'-CTGACAGTGACTAGCTCAGACCACCCAGAGGACACGGCCAACGTCACAGT-3' (SEQ ID NO:5)
5'-GGGCTCTTTCCCACGCTGGTACTATGACCCCACGGAGCAGATCTG-3' (SEQ ID NO:6) 
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Con el fin de cribar varias bibliotecas para una fuente de un clon de longitud completa, se cribó el ADN de las bibliotecas por amplificación por PCR con la pareja de cebadores de la PCR identificados antes. Después se usó una biblioteca positiva para aislar clones que codificaran el gen de PRO256 usando uno de los oligonucleótidos sonda y uno de los cebadores de la PCR.
Se aisló ARN para construir las bibliotecas de ADNc de tejido de placenta humana. Las bibliotecas de ADNc usadas para aislar los clones de ADNc se construyeron por procedimientos estándar usando reactivos disponibles en el comercio tales como los de Invitrogen, San Diego, CA. El ADNc se cebó con oligo dT que contenía un sitio NotI, unido con extremo romo a los adaptadores de hemiquinidasa SalI, se escindió con NotI, se separó por tamaños aproximadamente por electroforesis en gel, y se clonó en una orientación definida en un vector de clonación adecuado (tal como pRKB o pRKD; pRK5B es un precursor de pRK5D que no contiene el sitio SfiI; véase, Holmes y col., Science, 253:1278-1280 (1991)) en los sitios únicos XhoI y NotI.
La secuenciación del ADN de los clones aislados como se ha descrito antes, dio la secuencia del ADN de longitud completa de PRO256, denominado en el presente documento DNA35880-1160 [Figura 1; SEQ ID NO:1] y la secuencia de proteína derivada para PRO256.
La secuencia de nucleótidos entera de DNA35880-1160 se muestra en la Figura 1 (SEQ ID NO: 1). El clon DNA35880-1160 contiene un solo marco de lectura abierto con un sitio de inicio de la traducción aparente en las posiciones de nucleótidos 188-190 y termina en el codón de parada de las posiciones de nucleótidos 1775-1777. El precursor polipeptídico predicho tiene 529 aminoácidos de longitud (Figura 2). El análisis de la secuencia de PRO256 de longitud completa mostrada en la Figura 2 (SEQ ID NO:2) pone de manifiesto la presencia de una variedad de dominios del polipéptido importantes, en la que las posiciones dadas para estos dominios importantes del polipéptido son aproximadas como se ha descrito antes. El análisis del polipéptido PRO256 de longitud completa mostrado en la Figura 2 pone de manifiesto la presencia de los siguiente: un péptido señal desde aproximadamente el aminoácido 1 a aproximadamente el aminoácido 35; un dominio transmembrana desde aproximadamente el aminoácido 466 a aproximadamente el aminoácido 483; sitios de N-glicosilación desde aproximadamente el aminoácido 66 a aproximadamente el aminoácido 70, desde aproximadamente el aminoácido 235 a aproximadamente el aminoácido 239, y desde aproximadamente el aminoácido 523 a aproximadamente el aminoácido 527; sitios de N-miristoilación desde aproximadamente el aminoácido 29 a aproximadamente el aminoácido 35, desde aproximadamente el aminoácido 43 a aproximadamente el aminoácido 49, desde aproximadamente el aminoácido 161 a aproximadamente el aminoácido 167, desde aproximadamente el aminoácido 212 a aproximadamente el aminoácido 218, desde aproximadamente el aminoácido 281 a aproximadamente el aminoácido 287, desde aproximadamente el aminoácido 282 a aproximadamente el aminoácido 288, desde aproximadamente el aminoácido 285 a aproximadamente el aminoácido 291, desde aproximadamente el aminoácido 310 a aproximadamente el aminoácido 316, desde aproximadamente el aminoácido 313 a aproximadamente el aminoácido 319, desde aproximadamente el aminoácido 422 a aproximadamente el aminoácido 428, desde aproximadamente el aminoácido 423 a aproximadamente el aminoácido 429, y desde aproximadamente el aminoácido 426 a aproximadamente el aminoácido 432; una secuencia de unión a la célula desde aproximadamente el aminoácido 193 a aproximadamente el aminoácido 199; y distintivos de la familia del inhibidor de tripsina pancreática (Kunitz) desde aproximadamente el aminoácido 278 a aproximadamente el aminoácido 298 y desde aproximadamente el aminoácido 419 a aproximadamente el aminoácido 438. El clon DNA35880-1160 se ha depositado en ATCC el 16 de octubre, 1997 y se ha depsitado con el número de acceso a ATCC
209379.
El análisis de la secuencia de aminoácidos del polipéptido PRO256 de longitud completa sugiere que partes del mismo tienen una homología significativa con la proteína bicunina humana, indicando por lo tanto, que PRO256 puede ser un nuevo inhibidor de proteinasa.
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Ejemplo 2
Inhibición de la activación del factor de crecimiento de hepatocitos por PRO256
Se llevó a cabo un estudio en el tiempo de la inhibición de la conversión del factor de crecimiento de hepatocitos de una cadena-^{125}I (scHGF) en su forma de HGF madura de dos cadenas por el PRO256. Además, se estudió la escisión proteolítica del factor de crecimiento de hepatocitos de una cadena (scHGF) por la calicreína y la inhibición por PRO256.
El dominio catalítico del activador del factor de crecimiento de hepatocitos comparte una similitud de secuencia de aminoácidos considerable con otras serina proteasas, incluyendo el factor de coagulación XIIa (47%) y la calicreína del plasma (37%) (Miyazawa y col., J. Biol. Chem., 268:10024-10028(1993)). El factor XIIa puede activar el HGF de una cadena in vitro, aunque la actividad específica del factor XIIa es menor que la del activador de HGF (Shimomura y col., Eur. J. Biochem., 229:257-261 (1995)). Además, se ha mostrado que el factor XII es activado por escisión de la calicreína en el plasma (Dunn y col., J. Biol. Chem., 257:1779-1784(1982)).
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Expresión y purificación del factor de crecimiento de hepatocitos de una cadena (scHGF)
El sistema de expresión y protocolo de purificación se llevaron a cabo en medio exento de suero para evitar la activación del HGF de una cadena por el activador de HGF del suero. Parece que el suero es la fuente principal de la enzima activadora del factor de crecimiento de hepatocitos (Naka y col., J. Biol. Chem., 267:20114-20119 (1992).
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Marcaje con ^{125}I del factor de crecimiento de hepatocitos de una cadena (scHGF)
Se pusieron 250 \mul de una disolución de IOOO-GEN® (1,3,4,6-tetracloro-3\alpha,6\alpha-difenil-glicolurilo) (Pierce Chemical Co., Rock-ford, IL) en cloroformo (0,5 mg/ml) en tubos de vidrio de borosilicato de 5 ml. Se evaporó el disolvente a temperatura ambiente bajo una corriente constante de nitrógeno gaseoso, y el material seco se almacenó en un desecador hasta su uso. Se añadió HGF (700 mg) en Hepes 20 mM, pH 7,2, NaCl 150 mM, CaCl_{2} 5 mM (tampón HBS) al material IOOO-GEN® seco. Se añadió disolución de ^{125}I-sodio (NEN Life Sciences Inc., Boston, MA) (5 \muCi/\mug de proteína) y la mezcla de reacción se incubó sobre hielo durante 5 min con agitación suave. Después, el material se aplicó a una columna PD-10 (Pharmacia, Upsala, Suecia) que se había equilibrado con 20 volúmenes de columna de tampón HBS. Las fracciones que contenían scHGF marcado con ^{125}I se recogieron y se reunieron. La actividad específica era 0,4 \muCi/\mug de scHGF. El análisis por SDS-PAGE en condiciones reductoras y no reductoras indicó que menos de 10% de la forma de HGF de una cadena se había convertido en su forma de dos cadenas.
El scHGF yodado se comparó con el scHGF sin marcar en un ensayo de activación usando factor XIIa (20 nM; Haematologic Technologies) como un activador. Se analizó en el tiempo la conversión de scHGF en su forma de dos cadenas por SDS-PAGE seguido de autorradiografía (^{125}I-HGF) o después de tinción con Coomassie (HGF sin marcar). Tanto el HGF marcado como el no marcado se convirtieron de forma idéntica, sugiriendo que la yodación de scHGF no impedía el procesamiento por sus activadores, tales como el factor XIIa.
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Activación de HGF de cadena sencilla marcado con ^{125}I por suero humano
Se incubó suero humano (ICN Pharmaceuticals) con diferentes concentraciones de PRO256 durante 15 min a 37ºC. Se añadió ^{125}I-scHGF en tampón HBS para iniciar la reacción. Las concentraciones de ^{125}I-scHGF y suero en esta mezcla de reacción eran 50 mg/ml y 10% de suero, respectivamente. En diferentes puntos de tiempo se separaron partes alícuotas y se añadieron al tampón de muestra (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) que contenía el agente reductor ditiotreitol (BIO-Rad). Después de un breve calentamiento, las muestras (aprox. 10^{5} cpm/calle) se cargaron sobre un gel de poliacrilamida de gradiente 4-20% (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA). Después de electroforesis, los geles secados se expusieron a películas de rayos X (X-OMAT AR, Eastman Kodak Company, Rochester, NY) durante 12-24 h. Las películas se revelaron (Kodak M35AX-OMAT Processor), se hizo un barrido (Umax S-12, Umax Data Systems, Inc., Fremont, CA) y se procesaron más con el software Adobe V.5.5 Photoshop (Adobe Systems Inc., San Jose, Ca).
Las Figuras 3a - 3b muestran la conversión mediada por suero humano de ^{125}I-scHGF y la inhibición de esta conversión por PRO256.
La figura 3a muestra el estudio en el tiempo de la inhibición por PRO256 de la conversión mediada por el suero de ^{125}I-scHGF en su forma de dos cadenas. Se incubó ^{125}I-scHGF con suero humano (10%) a 37ºC y se cogieron partes alícuotas en diferentes puntos de tiempo y se analizaron por SDS-PAGE en condiciones reductoras. Las bandas desde la parte superior a la inferior del gel son scHGF, cadena pesada de HGF (cadena \alpha) y cadenas ligeras de HGF (doblete, cadena \beta). Las calles de la izquierda (+) son con PRO256 (1 \muM) y las calles de la derecha (-) son sin PRO256. En presencia del inhibidor PRO256 (a intervalos de tiempo de 0, 0,5 h, 1 h, 2 h y 4 h), el ^{125}I-scHGF no se convirtió en su forma de dos cadenas como indica la fuerte banda en la parte superior en el gel. En contraste, en ausencia del inhibidor PRO256, la conversión mediada por el suero de ^{125}I-scHGF en su forma de dos cadena ocurrió en las siguientes 4 h del periodo de incubación.
La figura 3b representa la inhibición dependiente de la concentración de PRO256 de la activación de ^{125}I-scHGF mediada por el suero, después de 4 h de incubación. La calle C corresponde a la conversión de ^{125}I-scHGF no inhibida, la calle 0 es el punto de tiempo 0 min; las calles 1-7 muestran partes alícuotas cogidas después de 4 h de incubación en presencia de concentraciones decrecientes de PRO256 (1,27 \muM, 0,42 \muM, 0,14 \muM, 0,047 \muM, 0,016 \muM, 0,005 \muM y 0,0017.
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Escisión proteolítica de scHGF por la calicreína e inhibición por PRO256
Se llevaron a cabo ensayos como se describe para la activación de ^{125}I-scHGF por el suero humano, excepto que se usó calicreína (Haematologic Technologies, Essex Junction, VT) en lugar de suero. Rl inhibidor. PR0256 en tampón HBS se incubó con calicreína durante 15 min a 37ºC antes de añadir ^{125}I-scHGF. Las concentraciones finales de calicreína, ^{125}I-scHGF e inhibidor PRO256 en tampón HBS buffer eran 40 nM, 50 mg/ml y 1 mM, respectivamente. La actividad proteolítica del factor XII humano no parecía ser inhibida por el inhibidor del activador de HGF. Por lo tanto, como control para la especificidad de PRO256, se usó el factor XIIa humano (F.XIIa; Haematologic Technologies) Los experimentos se llevaron a cabo de forma idéntica que para la calicreína.
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Inhibición de la actividad enzimática de la calicreína por PRO256
La calicreína humana se incubó con PRO256 en tampón HBS que contenía BSA 0,5 mg/ml durante 20 min a temperatura ambiente. Se añadió el sustrato cromogénico S2305 (Diapharma Group Inc., Columbus, OH) y se midió el cambio de absorbancia a 405 nm en un lector de microplaca cinética (Molecular Devices, Menlo Park, CA). Las concentraciones finales de calicreína y S2305 en esta mezcla de reacción eran 1,25 nM y 1,8 mM, respectivamente.
En un experimento separado, se determinó que el valor de K_{M} de S2305 en este sistema de ensayo era 168 \muM. Suponiendo un modo de inhibición competitivo de PRO256 con respecto al sustrato cromogénico S2305, la Ki aparente (Ki*) se calculó según la ecuación K_{i}*=CI_{50}/(1 + (S/K_{M})) (Cheng y col., Biochem. Pharmacol., 22:3099-3109, (1973)), en la que S es la concentración usada de S2305. (Véase la Figura 5).
Las figuras 4(a) a 4(b) muestran los estudios de inhibición de PRO256 en la escisión proteolítica de ^{125}I-scHGF por la calicreína humana y el factor XIIa humano.
La figura 4a representa la escisión proteolítica de ^{125}I-scHGF (50 mg/ml) por la calicreína humana (40 nM) y la inhibición por el inhibidor PRO256 (1 mM). La calicreína se preincubó durante 15 min a 37ºC con inhibidor PRO256 antes de añadir ^{125}I-scHGF. Las reacciones se llevaron a cabo a 37ºC. Las calles designadas (+) indican la presencia de PRO256 y (-) indican la ausencia de PRO256 (= control). En presencia de PRO256, la conversión por la calicreína de ^{125}I-scHGF en su forma de dos cadenas se inhibe a lo largo del periodo de incubación de 4 h comparado con el control.
La figura 4b muestra la conversión de ^{125}I-scHGF por el factor XIIa humano (40 nM) y su falta de inhibición por el inhibidor PRO256. El factor XIIa se preincubó durante 15 min a 37ºC con PRO256 antes de añadir ^{125}I-scHGF. Las reacciones se llevaron a cabo a 37ºC. Las calles designadas (+) indican la presencia de PRO256 y (-) la ausencia de PRO256 (= control). En presencia o ausencia de PRO256, el factor XIIA convierte el ^{125}I-scHGF en su forma de dos cadenas, indicando así la falta de inhibición por PRO256.
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Ejemplo 3
Uso de PRO256 como una sonda de hibridación
El siguiente procedimiento describe el uso de una secuencia de nucleótidos que codifica PRO256 como sonda de hibridación.
El ADN que comprende la secuencia que codifica el PRO256 de longitud completa o maduro (como se muestra en las figuras que acompañan) o un fragmento de la misma, se usa como sonda para cribar ADN homólogos (tales como los que codifican variantes de PRO256 naturales) en bibliotecas de ADNc de tejido humano o genotecas de tejido humano.
La hibridación y lavado de los filtros que contiene cualquiera de los ADN de la biblioteca se lleva a cabo en condiciones de restricción alta. La hibridación de la sonda radiomarcada obtenida del gen que codifica el polipéptido PRO256 con los filtros se lleva a cabo en una disolución de formamida al 50%, 5 x SSC, SDS al 0,1%, pirofosfato sódico al 0,1%, fosfato sódico 50 mM, pH 6,8, 2x disolución de Denhardt, y sulfato de dextrano al 10% a 42ºC durante 20 horas. El lavado de los filtros se lleva a cabo en una disolución acuosa de 0,1x SSC y SDS al 0,1% a 42ºC.
Los ADN que tienen una identidad de secuencia deseada con el ADN que codifica la secuencia nativa de longitud completa se pueden identificar después usando técnicas estándar conocidas en la técnica.
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Ejemplo 4
Expresión de PRO256 en E. coli
Este ejemplo ilustra la preparación de una forma no glicosilada de PRO256 por expresión recombinante en E. coli.
La secuencia de ADN que codifica PRO256 se amplifica inicialmente usando cebadores de PCR seleccionados. Los cebadores deben contener sitios de enzimas de restricción que se correspondan con los sitios de enzimas de restricción en el vector de expresión seleccionado. Se pueden usar una variedad de vectores de expresión. Un ejemplo de un vector adecuado es pBR322 (derivado de E. coli; véase, Bolivar y col., Gene, 2:95 (1977)) que contiene los genes de resistencia a la ampicilina y la tetraciclina. Este vector se hace digerir con enzimas de restricción y se desfosforila. Las secuencias amplificadas por la PCR después se ligan al vector. El vector preferiblemente incluye secuencias que codifican un gen de resistencia a antibiótico, un promotor trp, una secuencia líder poli-His (incluyendo los primeros 6 codones STII, secuencia de poli-His, y sitio de escisión de enteroquinasa), la región que codifica PR0256, terminador de la transcripción lambda y un gen argU.
Después, la mezcla de ligación se usa para transformar una cepa de E. coli seleccionada usando procedimientos descritos en Sambrook y col., véase antes. Los transformantes se identifican por su capacidad para crecer en placas LB y después se seleccionan las colonias resistentes a antibiótico. El ADN plasmídico se pueden aislar y confirmar por análisis de restricción y secuenciación de ADN.
Los clones seleccionados se pueden hacer crecer durante la noche en medio de cultivo líquido tal como caldo LB complementado con antibióticos. Posteriormente el cultivo de la noche se puede usar para inocular un cultivo a gran escala. Después, las células se hacen crecer hasta una densidad óptica deseada, durante cuyo tiempo el promotor de la expresión se activa.
Después de cultivar las células durante varias horas más, las células se pueden recoger por centrifugación. El sedimento celular obtenido por centrifugación se puede solubilizar usando diferentes agentes conocidos en la materia, y la proteína PRO256 solubilizada después se puede purificar usando una columna de quelación de metal en condiciones que permitan la unión fuerte de la proteína.
PRO256 se puede expresar en E. coli en una forma etiquetada de poli-His, usando el siguiente procedimiento. El ADN que codifica PRO256 se amplifica inicialmente usando cebadores de PCR seleccionados. Los cebadores contendrán sitios de enzimas de restricción que se corresponden con los sitios de enzimas de restricción en el vector de expresión seleccionado, y otras secuencias útiles que proporcionan un inicio de la traducción eficaz y fiable, purificación rápida en una columna de quelación de metales y la separación proteolítica con enteroquinasa. Las secuencias amplificadas por PCR, etiquetadas con poli-His después se ligan a un vector de expresión, que se usa para transformar un huésped E. coli basado en la cepa 52 (W3110 fuhA(tonA) lon galE rpoHts(htpRts) clpP(laclq). Los transformantes se hacen crecer primero en LB que contiene carbenicilina 50 mg/ml a 30ºC con agitación hasta que se alcanza una DO_{600} de 3-5. Después, los cultivos se diluyen 50-100 veces en medio CRAP media (preparado mezclando 3,57 g de (NH_{4})_{2}SO_{4}, 0,71 g de citrato sódico-2H_{2}O, 1,07 g de KCl, 5,36 g de extracto de levadura Difco, 5,36 g de Sheffield hycase SF en 500 ml de agua, así como MPOS 110 mM, pH 7,3, glucosa al 0,55% (p/v) y MgSO_{4} 7 mM) y se hacen crecer durante aproximadamente 20-30 horas a 30ºC con agitación. Las muestras se sacan para verificar la expresión por análisis de SDS-PAGE, y el cultivo bruto se centrifuga para sedimentar las células. Los sedimentos celulares se congelan hasta purificación y replegado.
Se vuelve a suspender la pasta de E. coli de fermentaciones de 0,5 a 1 litro (6-10 g de sedimentos) en 10 volúmenes (p/v) de guanidina 7 M, tampón Tris 20 mM, pH 8. Se añaden sulfito sódico sólido y tetrationato sódico para llegar a concentraciones finales de 0,1 M y 0,02 M, respectivamente, y la disolución se agita durante la noche a 4ºC. Esta etapa da como resultado una proteína desnaturalizada con todos los restos cisteína bloqueados por sulfitolización. La disolución se centrifuga a 40.000 rpm en una ultracentrífuga Beckman durante 30 min. El líquido sobrenadante se diluye con 3-5 volúmenes de tampón de columna de quelato metálico (guanidina 6 M, Tris 20 mM, pH 7,4) y se filtra a través de filtros de 0,22 micrómetros para clarificar. El extracto clarificado se carga en una columna de quelato de metales Qiagen Ni^{2+}-NTA de 5 ml equilibrada con el tampón de columna de quelato de metales. La columna se lava con tampón adicional que contiene imidazol 50 mM (Calbiochem, Utrol grade), pH 7,4. La proteína se eluye con tampón que contiene imidazol 250 mM. Las fracciones que contienen la proteína deseada se reúnen y se almacenan a 4ºC. La concentración de proteína se calcula por su absorbancia a 280 nm usando el coeficiente de extinción calculado basado en su secuencia de aminoácidos.
Se lleva a cabo el replegado de las proteínas diluyendo la muestra lentamente en tampón de replegado recién preparado que consiste en: Tris 20 mM, pH 8,6, NaCl 0,3 M, urea 2,5 M, cisteína 5 mM, glicina 20 mM y EDTA 1 mM. Los volúmenes de replegado se eligen de modo que la concentración final de proteína sea entre 50 y 100 microgramos/ml. La disolución de replegado se agita suavemente a 4ºC durante 12-36 horas. La reacción de replegado se inactiva por adición de TFA hasta una concentración final de 0,4% (pH de aproximadamente 3). Antes de purificar más la proteína, la disolución se filtra a través de un filtro de 0,22 micrómetros y se añade acetonitrilo hasta una concentración final de 2-10%. La proteína replegada se cromatografía en una columna de fase inversa Poros R1/H usando un tampón de fase móvil de TFA al 0,1% con elución con gradiente de acetonitrilo de 10 a 80%. Se analizan las partes alícuotas de fracciones con absorbancia de A_{280} en geles de poliacrilamida-SDS y las fracciones que contienen la proteína replegada homogénea se reúnen. En general, las especies replegadas adecuadamente de la mayoría de las proteínas eluyen con las concentraciones más bajas de acetonitrilo, puesto que estas especies son las más compactas con sus interiores hidrófobos protegidos de la interacción con la resina de fase inversa. Normalmente eluyen especies agregadas con las concentraciones de acetonitrilo más altas. Además de resolver las formas de las proteínas mal plegadas de la forma deseada, la etapa de fase inversa también elimina la endotoxina de las muestras.
Las fracciones que contienen el polipéptido PRO256 plegado se reúnen y se separa el acetonitrilo usando una corriente suave de nitrógeno dirigida a la disolución. Las proteínas se formulan en Hepes 20 mM, pH 6,8 con cloruro sódico 0,14 M y manitol al 4% por diálisis o por filtración en gel usando resinas G25 Superfine (Pharmacia) equilibradas en el tampón de formulación, y se esterilizan por filtración.
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Ejemplo 5
Expresión de PRO256 en células de mamífero
Este ejemplo ilustra la preparación de una forma potencialmente glicosilada de PRO256 por expresión recombinante en células de mamífero.
Se usa el vector pRK5 (véase el documento EP 307.247, publicado el 15 de marzo, 1989), como vector de expresión. Opcionalmente, el ADN de PRO256 se liga en pRK5 con enzimas de restricción seleccionadas que permiten la inserción del ADN de PRO256 usando procedimientos de ligados como se describen en Sambrook y col., véase antes. El vector resultante se llama pRK5-PRO256.
En una realización, las células huésped seleccionadas pueden ser células 293. Las células 293 humanas (ATCC CCL 1573) se hacen crecer hasta confluencia en placas de cultivo tisular en medio tal como DMEM complementado con suero de ternero fetal, y opcionalmente componentes nutrientes y/o antibióticos. Aproximadamente 10 mg de ADN pRK5-PRO256 DNA se mezcla con aproximadamente 1 mg de ADN que codifica el gen de VA RNA [Thimmappaya y col., Cell, 31:543 (1982)] y se disuelven en 500 ml de Tris-HCl 1 mM, EDTA 0,1 mM, CaCl_{2} 0,227 M. A esta mezcla se añaden, gota a gota, 200 \mul de HEPES 50 mM (pH 7,35), NaCl 280 mM, NaPO_{4} 1,5 mM, y se deja que se forme un precipitado durante 10 minutos a 25ºC. El precipitado se suspende y se añade a las células 293 y se deja que sedimenten durante aproximadamente 4 horas a 37ºC. El medio de cultivo se separa por aspiración y se añaden 2 ml de glicerol al 20% en PBS durante 30 segundos. Después, las células 293 se lavan con medio exento de suero, se añade medio reciente y las células se incuban durante aproximadamente 5 días.
Aproximadamente 24 horas después de las transfecciones, se separa el medio de cultivo y se sustituye por medio de cultivo (solo) o medio de cultivo que contiene ^{35}S-cisteína 200 \muCi/ml y ^{35}S-metionina 200 \muCi/ml. Después de una incubación de 12 horas, se recoge el medio condicionado, se concentra en un filtro giratorio y se carga en un gel de SDS al 15%. El gel procesado se puede secar y exponer a película durante un periodo de tiempo seleccionado para revelar la presencia del polipéptido PRO256. Los cultivos que contienen las células transfectadas pueden sufrir incubación adicional (en medio exento de suero) y el medio se ensaya en bioensayos seleccionados.
En una técnica alternativa, el PRO256 se puede introducir en células 293 transitoriamente usando el procedimiento del sulfato de dextrano descrito por Somparyrac y col., Proc. Natl. Acad. Sci., 12:7575 (1981). Se hacen crecer 293 células hasta densidad máxima en un matraz giratorio y se añaden 700 mg de ADN pRK5-PRO256. Las células primero se concentran en el matraz giratorio por centrifugación y se lavan con PBS. El precipitado de ADN-dextrano se incuba en el sedimento celular durante 4 horas. Las células se tratan con glicerol al 20% durante 90 segundos, se lavan con medio de cultivo tisular, y se vuelven a introducir en el matraz giratorio que contiene medio de cultivo tisular, insulina bovina 5 \mug/ml, transferrina bovina 0,1 \mug/ml. Después de aproximadamente 4 días, el medio condicionado se centrifuga y se filtra para separar las células y los residuos. La muestra que contiene el PRO256 expresado después se puede concentrar y purificar por cualquier procedimiento seleccionado, tal como diálisis y/o cromatografía en columna.
En otra realización, el PRO256 se puede expresar en células CHO. El pRK5-PRO256 se puede transfectar en células CHO usando reactivos conocidos tales como CaPO_{4} o DEAE-dextrano. Como se ha descrito antes, los cultivos celulares se pueden incubar y el medio se sustituye por medio de cultivo (solo) o medio que contiene un radiomarcador tal como ^{35}S-metionina. Después de determinar la presencia de un polipéptido PRO256, el medio de cultivo se puede sustituir por medio exento de suero. Preferiblemente, los cultivos se incuban durante aproximadamente 6 días, y después se recoge el medio condicionado. El medio que contiene el polipéptido PRO256 expresado, después se puede concentrar y purificar por cualquier procedimiento seleccionado.
El PRO256-epítopo etiquetado también se puede expresar en células huésped CHO. El PRO256 se puede sublconar fuera del vector pRK5. El inserto del subclón se puede someter a PCR para fusionar en el marco con un epítopo etiqueta seleccionado, tal como una etiqueta poli-His, en un vector de expresión de baculovirus. El inserto de PRO256 etiquetado con poli-His después se puede subclonar en un vector dirigido por SV40 que contiene un marcador de selección tal como DHFR para seleccionar los clones estables. Finalmente, las células CHO se pueden transfectar (como se ha descrito antes) con el vector dirigido por SV40. Se puede llevar el marcaje a cabo como se ha descrito antes, para verificar la expresión. El medio de cultivo que contiene el PRO256 etiquetado con poli-His después se puede concentrar y purificar por cualquier procedimiento seleccionado, tal como cromatografía de afinidad de quelato de Ni^{2+}.
PRO256 también puede expresarse en células CHO y/o COS por un procedimiento de expresión transitoria o en células CHO por otro procedimiento de expresión estable.
La expresión estable en las células CHO se lleva a cabo usando el siguiente procedimiento. Las proteínas se expresan como una construcción de IgG (inmunoadhesina), en la que las secuencias codificantes para las formas solubles (p. ej., dominios extracelulares) de las respectivas proteínas están fusionadas con una secuencia de la región constante de la IgG1 que contiene los dominios bisagra, CH2 y CH2 y/o como una forma etiquetada con poli-His.
Después de la amplificación por PCR, los respectivos ADN se subclonan en un vector de expresión CHO usando técnicas estándar como describen Ausubel y col., Current Protocols of Molecular Biology, Unit 3.16, John Wiley and Sons (1997). Los vectores de expresión CHO se construyen para que tengan sitios de restricción compatibles 5' y 3' del ADN de interés para permitir el lanzado conveniente de los ADN. El vector usado en la expresión en células CHO es como describen Lucas y col., Nucl. Acids Res., 24:9 (1774-1779) (1996), y usa el promotor temprano de SV40/potenciador para dirigir la expresión del ADNc de interés y la dihidrofolato reductasa (DHFR). La expresión de la DHFR permite la selección del mantenimiento estable del plásmido después de transfección.
Se introducen 12 microgramos del ADN plasmídico deseado en aproximadamente 10 millones de células CHO usando reactivos de transfección disponibles en el comercio Superfect® (Qiagen), Dosper® o Fugene® (Boehringer Mannheim). Las células se hacen crecer como describen Lucas y col., véase antes. Se congelan aproximadamente 3x10^{7} en una ampolla para el crecimiento y producción adicionales como se describe a continuación.
Las ampollas que contienen el ADN plasmídico se descongelan poniéndolas en un baño de agua y con mezclamiento vortical. Los contenidos se introducen con pipeta en un tubo de centrífuga que contiene 10 ml de medio y se centrifugan a 1000 rpm durante 5 minutos. Los líquidos sobrenadantes se aspiran y las células se vuelven a suspender en 10 ml de medio selectivo (PS20 filtrado por 0,2 \mum con suero bovino fetal diafiltrado por 0,2 \mum). Después se introducen partes alícuotas de las células en un centrifugador de 100 ml que contiene 90 ml de medio selectivo. Después de 1-2 días, las células se transfieren a un centrifugador de 250 ml cargado con 150 ml de medio de crecimiento selectivo y se incuban a 37ºC. Después de otros 2-3 días, los centrifugadores de 230 ml, 500 ml y 2000 ml se siembran con 3x10^{5} células/ml. El medio celular se intercambia con medio rediente por centrifugación y se vuelve a suspender en medio de producción. Aunque se puede usar cualquier medio CHO adecuado, se puede usar un medio de producción descrito en la patente de EE.UU. nº 5.122.469, presentada el 16 de junio, 1992. Se siembra un centrifugador de producción de 3 litros con 1,2 x 10^{6} células/ml. El día 0, se determinan el número de células y el pH. El día 1, se toma muestra del centrifugador y se comienza el chorro de aire filtrado. El día 2, se toma muestra del centrifugador, la temperatura se cambia a 33ºC y se añaden 30 ml de glucosa 500 g/l y 0,6 ml de antiespumante al 10% (p. ej., emulsión de poldimetilsiloxano, Dow Corning 365 Medical Grade Emulsion). A lo largo de toda la producción el pH se ajusta según sea necesario para mantenerlo a aproximadamente 7,2. Después de 10 días, o hasta que la viabilidad disminuya a menos de 70%, el cultivo celular se recoge por centrifugación y se filtra a través de un filtro de 0,22 \mum. El filtrado se almacena a 4ºC o se carga inmediatamente en columnas para la purificación.
Para las construcciones etiquetadas con poli-His, las proteínas se purifican usando una columna de Ni^{2+}-NTA (Qiagen). Antes de la purificación, se añade imidazol al medio condicionado hasta una concentración de 5 mM. El medio condicionado se bombea en una columna de 6 ml de Ni ^{2+}-NTA equilibrada en Hepes 20 mM, pH 7,4, tampón que contiene NaCl 0,3 M e imidazol 5 mM, con un caudal de 4-5 ml/min, a 4ºC. Después de la carga, la columna se lava con tampón de equilibrado adicional y la proteína se eluye con tampón de equilibrado que contiene imidazol 0,25 M. La proteína altamente purificada posteriormente se desaliniza en un tampón de almacenamiento que contiene Hepes 10 mM, NaCl 0,14 M y manitol al 4%, pH 6,8, con una columna de 25 ml G25 Superfine (Pharmacia) y se almacena a -80ºC.
Las construcciones de inmunoadhesina (que contienen Fc) se purifican del medio condicionado como sigue. El medio condicionado se bombea en una columna de 5 ml de Proteína A (Pharmacia) que se ha equilibrado en tampón de fosfato de Na 20 mM, pH 6,8. Después de la carga, la columna se lava extensamente con tampón de equilibrado antes de la elución con ácido cítrico 100 mM, pH 3,5. La proteína eluida se neutraliza inmediatamente por recolección de fracciones de 1 ml en tubos que contienen 275 \mul de tampón Tris 1 M, pH 9. La proteína altamente purificada posteriormente se desaliniza en tampón de almacenamiento como se ha descrito antes para las proteínas etiquetadas con poli-His. La homogeneidad se evalúa por geles de poliacrilamida-SDS y secuenciación del aminoácido N-terminal por degradación de Edman.
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Ejemplo 6
Expresión de PRO256 en levaduras
El siguiente procedimiento describe la expresión recombinante de PRO256 en levaduras.
Primero se construyen los vectores de expresión de levaduras para la producción intracelular o secreción de PRO256 a partir del promotor ADH2/GAPDH. El ADN que codifica PRO256 y el promotor se insertan en sitios de enzimas de restricción adecuados en el plásmido seleccionado para dirigir la expresión intracelular de PRO256. Para la secreción, el ADN que codifica PRO256 se puede clonar en el plásmido seleccionado, junto con el ADN que codifica el promotor ADH2/GAPDH, un péptido señal de PRO256 nativo o péptido señal de otro mamífero, o por ejemplo, un factor alfa de levaduras o señal de secreción de invertasa/secuencia líder y secuencias conectoras (si son necesarias) para la expresión de PRO256.
Las células de levaduras, tales como la cepa de levadura AB110, después se pueden transformar con los plásmidos de expresión descritos antes y cultivar en medio de fermentación seleccionado. Los líquidos sobrenadantes de las levaduras transformadas se pueden analizar por precipitación con ácido tricloroacético al 10% y separación por SDS-PAGE, seguido de tinción de los geles con tinción azul de Coomassie.
El PRO256 recombinante posteriormente se pueden aislar y purificar para separar las células de levaduras del medio de fermentación por centrifugación y después concentrar el medio usando filtros de cartucho seleccionados. El concentrado que contiene PRO256 se puede purificar más usando resinas de cromatografía en columna seleccionadas.
Muchos de los polipéptidos PRO256 descritos en el presente documento se expresaron satisfactoriamente como se ha descrito antes.
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Ejemplo 7
Expresión de PRO256 en células de insecto infectadas con baculovirus
El siguiente procedimiento describe la expresión recombinante en células de insecto infectadas con baculovirus.
La secuencia que codifica PRO256 se fusiona secuencia arriba con un epítopo etiqueta contenido en un vector de expresión de baculovirus. Dichos epítopos etiquetas incluyen etiquetas de poli-His y etiquetas de inmunoglobulinas (regiones tipo Fc de IgG). Se puede usar una variedad de plásmidos, incluyendo los plásmidos derivados de plásmidos disponibles en el comercio como pVL1393 (Novagen). Brevemente, la secuencia que codifica PRO256 o la parte deseada de la secuencia que codifica PRO256 (tal como la secuencia que codifica el dominio extracelular de una proteína transmembrana o la secuencia que codifica la proteína madura si la proteína es extracelular) se amplifica por PCR con cebadores complementarios a las regiones 5' y 3'. El cebador de 5' puede incorporar sitios de enzimas de restricción flanqueantes (seleccionados). Después el producto se hace digerir con aquellas enzimas de restricción seleccionadas y se subclona en el vector de expresión.
El baculovirus recombinante se genera por cotransfección del plásmido anterior y ADN vírico BaculoGold^{TM} (Pharmingen) en células de Spodoptera frugiperda ("Sf9") (ATCC CRL 1711) usando lipofectina (disponible en el comercio en GIBCO-BRL). Después de 4-5 días de incubación a 28ºC, los virus liberados se recogen y se usan para amplificaciones adicionales. La infección vírica y la expresión de proteína se llevan a cabo como describen O'Reilley y col., Baculovirus expression vectors: A Laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press (1994).
El PRO256 etiquetado con poli-His expresado después se puede purificar, por ejemplo, por cromatografía de afinidad de quelato de Ni^{2+} como sigue. Los extractos se preparan a partir de las células Sf9 infectadas por virus recombinantes como describen Rupert y col., Nature, 362: 175-179 (1993). Brevemente, las células Sf9 se lavan, se vuelven a suspender en tampón de ultrasonidos (Hepes 25 ml, pH 7,9; MgCl_{2} 12,5 mM; EDTA 0,1 mM; glicerol al 10%; NP-40 al 0,1%; KCl 0,4 M), y se trataron con ultrasonidos 2 veces durante 20 segundos sobre hielo. El resultado de los ultrasonidos se aclara por centrifugación, y el líquido sobrenadante se diluye 50 veces en tampón de carga (fosfato 50 mM, NaCl 300 mM, glicerol al 10%, pH 7,8) y se filtra a través de un filtro de 0,45 \mum. Se prepara una columna de agarosa Ni^{2+}-NTA (disponible en el comercio en Qiagen) con un volumen de lecho de 5 ml, se lava con 25 ml de agua y se equilibra con 25 ml de tampón de carga. El extracto de células filtrado se carga en la columna a 0,5 ml/min. La columna se lava hasta el valor inicial de A_{280} con tampón de carga, en cuyo punto se inicia la recolección de fracciones. Después, la columna se lava con un tampón de lavado secundario (fosfato 50 mM, NaCl 300 mM, glicerol al 10%, pH 6,0), que eluye la proteína unida de forma no específica. Después de volver a alcanzar el valor inicial de A_{280}, la columna se desarrolla con un gradiente de imidazol de 0 a 500 mM en el tampón de lavado secundario. Se recogen fracciones de 1 ml y se analizan por SDS-PAGE y se tiñen con plata o transferencia Western con Ni^{2+}-NTA conjugado con fosfatsa alcalina (Qiagen). Las fracciones que contienen PRO256 etiquetado con His_{10} se reúnen y se dializan contra tampón de carga.
Alternativamente, la purificación de PRO256 etiquetado con IgG (o etiquetado con Fc) se puede realizar usando técnicas cromatográficas conocidas, incluyendo, por ejemplo, cromatografía en columna de proteína A o proteína G.
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Ejemplo 8
Preparación de anticuerpos que se unen a PRO256
Este ejemplo ilustra la preparación de anticuerpos monoclonales que se unen específicamente al polipéptido PRO256 o un epítopo del polipéptido PRO256 sin unirse sustancialmente a ningún otro polipéptido o epítopo de polipéptido.
Las técnicas para producir anticuerpos monoclonales son conocidas en la materia, y se describen, por ejemplo, en Goding, véase antes. Los inmunógenos que se pueden usar incluyen PRO256 purificado, proteínas de fusión que contienen PRO256 y células que expresan PRO256 recombinante en la superficie celular. La selección de inmunógenos la puede hacer el experto en la materia sin excesiva experimentación.
Ratones, tales como Balb/c, se inmunizan con el inmunógeno PRO256 emulsionado en adyuvante completo de Freund y se inyecta por vía subcutánea o intraperitoneal una cantidad de 1-100 microgramos. Alternativamente, el inmunógeno se emulsiona en adyuvante MPL-TDM (Ribi Immunochemical Research, Hamilton, MT) y se inyecta en las almohadillas de las patas traseras de los animales. Después se administra un refuerzo a los ratones inmunizados de 10 a 12 días más tarde con inmunógeno adicional emulsionado en el adyuvante seleccionado. Después, durante varias semanas, también se puede reforzar a los ratones con inyecciones de inmunización adicionales. Se pueden obtener periódicamente muestras de suero de lo ratones por sangrado retroorbital para ensayo en ELISA para detectar los anticuerpos anti-PRO256.
Después de detectar un título de anticuerpos adecuado, a los animales "positivos" para los anticuerpos se les puede inyectar una inyección intravenosa final de PRO256. De 3 a 4 días más tarde, los ratones se sacrifican y se recogen las células del bazo. Después, las células del bazo se fusionan (usando polietilenglicol al 35%) con una línea celular de mieloma murino seleccionado, tal como P3X63AgU.1, disponible en ATCC nº CRL 1597. Las fusiones generan células de hibridoma que después se pueden cultivar en placa en placas de cultivo tisular de 96 pocillos que contienen medio HAT (hipoxantina, aminopterina y timidina) para inhibir la proliferación de células no fusionadas, híbridos de mieloma e híbridos de células de bazo.
Las células hibridoma se cribarán en un EISA para determinar la reactividad contra PRO256. La determinación de células hibridoma "positivas" que segregan los anticuerpos monoclonales deseados contra PRO256 está al alcance del experto en la materia.
Las células hibridoma positivas se pueden inyectar por vía intraperitoneal en ratones Balb/c para producir ascitis que contienen los anticuerpos monoclonales anti-PRO256. Alternativamente, las células hibridoma se pueden hacer crecer en matraces de cultivo celular o botellas giratorias. La purificación de los anticuerpos monoclonales producidos en los ascitis se puede llevar a cabo usando precipitación con sulfato amónico, seguido de cromatografía en gel de exclusión. Alternativamente, se puede usar cromatografía de afinidad tras la unión del anticuerpo a la proteína A o proteína G.
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Depósito de material
Los siguientes materiales se han depositado en la American Type Culture Collection, 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209, USA (ATCC):
\underline{Material \hskip2.2cm N^{o} \ de \ dep \ en \ ATCC \hskip1.2cm Fecha \ de \ depósito}
DNA35880-1160 209379 16 de octubre, 1997 
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Este depósito se hizo según el Tratado de Budapest y el reconocimiento internacional del Depósito de microorganismos para el propósito de procedimiento de patente y las regulaciones del mismo (Tratado de Budapest). Esto asegura el mantenimiento de un cultivo viable del depósito durante 30 años desde la fecha de depósito. La ATCC hará disponible el depósito bajo los términos del Tratado de Budapest, y sujeto a un acuerdo entre Genentech, Inc., y ATCC, que asegura la disponibilidad permanente y no restringida de la progenie del cultivo del depósito al público tras concesión de la patente de EE.UU. o tras apertura al público de cualquier solicitud de patente de EE.UU. o extranjera, cualquiera que sea antes, y asegura la disponibilidad de la progenie a aquel determinado por el Comisionado de patentes y marcas de EE.UU. (que incluye 37 CFR \NAK1.14 con particular referencia a 886 OG 638).
El cesionario de la presente solicitud ha acordado que si el cultivo del o de los materiales en depósito muriera o se perdiera o destruyera cuando se cultivase en condiciones adecuadas, el o los materiales serían sustituidos inmediatamente tras notificación, con otros iguales. La disponibilidad del o de los materiales no está considerado como una licencia para la práctica de la invención en contravención con los derechos garantizados por las autoridades de cualquier gobierno según sus leyes sobre patentes.
La memoria descriptiva anteriormente escrita se considera que es suficiente para permitir a un experto en la materia la práctica de la invención. La presente invención no está limitada en alcance por la o las construcciones depositadas, puesto que se pretende que la o las realizaciones depositadas sean solo ilustraciones de determinados aspectos de la invención y cualquier construcción que sea funcionalmente equivalente está dentro del alcance de esta invención. El depósito de material o materiales del presente documento no constituye la admisión de que la descripción escrita contenida en el presente documento es inadecuada para permitir la práctica de cualquier aspecto de la invención, incluyendo el mejor modo de la misma, ni deben considerarse como limitantes del alcance de las reivindicaciones las ilustraciones específicas que se representan. Realmente, diferentes modificaciones de la invención además de las mostradas y descritas en el presente documento serán evidentes para los expertos en la materia a partir de la descripción anterior y entran dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.
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Referencias citadas en la descripción
Esta lista de referencias citadas por el solicitante está prevista únicamente para ayudar al lector y no forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha puesto el máximo cuidado en su realización, no se pueden excluir errores u omisiones y la OEP declina cualquier responsabilidad en este respecto.
Documentos de patente citados en la descripción
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\bullet US 5935924 A [0013]
\bullet US 5624806 A [0013]
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\bullet US 5773223 A [0014] [0215]
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Claims (31)

1. Procedimiento in vitro para identificar un agonista de un polipéptido PRO256, que comprende:
(a) poner en contacto células y un compuesto de ensayo que se va a cribar en condiciones adecuadas para inducir una respuesta celular inducida normalmente por un polipéptido PRO256; y
(b) determinar la inducción de dicha respuesta celular para determinar si el compuesto de ensayo es un agonista eficaz, en el que la inducción de dicha respuesta celular es indicativa de que dicho compuesto de ensayo es un agonista eficaz, y
en el que un polipéptido PRO256 es un polipéptido que tiene una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos 80% con respecto a:
(i) la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 2 (SEQ ID NO: 2);
(ii) los restos X a 529 de la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 2 (SEQ ID NO: 2);
(iii) los restos 1 a Y de la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 2 (SEQ ID NO: 2); y
(iv) los restos X a Y de la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 2 (SEQ ID NO: 2),
en el que dicha identidad de secuencia se determina usando el programa de ordenador ALIGN-2 y en el que X es 36\pm5 e Y es 465\pm5.
2. Procedimiento in vitro para identificar un antagonista de un polipéptido PRO256, que comprende:
(a) poner en contacto células y un compuesto de ensayo que se va a cribar en presencia de dicho polipéptido en condiciones adecuadas para inducir una respuesta celular inducida normalmente por un polipéptido PRO256; y
(b) determinar la inducción de dicha respuesta celular para determinar si el compuesto de ensayo es un antagonista eficaz, en el que una reducción de la inducción de dicha respuesta celular es indicativa de que dicho compuesto de ensayo es un antagonista eficaz, y
en el que un polipéptido PRO256 es según se define en la reivindicación 1.
3. Procedimiento de la reivindicación 2 o reivindicación 3, en el que la respuesta celular inducida normalmente por dicho polipéptido es la inhibición de la proliferación celular.
4. Procedimiento de diagnóstico de una enfermedad cardiovascular, endotelial o angiogénica o de la susceptibilidad a dicha enfermedad, que está relacionada con una mutación en una secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido PRO256, que comprende determinar la presencia o ausencia de dicha mutación en dicha secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido PRO256, en el que la presencia de dicha mutación es indicativa de la presencia de dicha enfermedad o susceptibilidad a dicha enfermedad, en el que un polipéptido PRO256 es según se define en la reivindicación 1.
5. Procedimiento de diagnóstico de un trastorno cardiovascular, endotelial o angiogénico en un mamífero, que comprende analizar el nivel de expresión de un gen que codifica un polipéptido PRO256 (a) en una muestra de ensayo de células de tejido obtenidas de dicho mamífero, y (b) en una muestra de control de células de tejido normal conocidas del mismo tipo celular, en el que un nivel de expresión mayor o menor en la muestra de ensayo comparado con la muestra de control, es indicativo de la presencia de un trastorno cardiovascular, endotelial o angiogénico en dicho mamífero, en el que un polipéptido PRO256 es según se define en la reivindicación 1.
6. Anticuerpo antagonista u oligonucleótido antisentido de un polipéptido PRO256, en el que un polipéptido PRO256 es según se define en la reivindicación 1, para usar en el tratamiento de un trastorno cardiovascular, endotelial o angiogénico en un mamífero.
7. Uso de un anticuerpo antagonista u oligonucleótido antisentido de un polipéptido PRO256, en la fabricación de un medicamento para usar en el tratamiento de un trastorno cardiovascular, endotelial o angiogénico en un mamífero, en el que un polipéptido PRO256 es según se define en la reivindicación 1.
8. Anticuerpo antagonista u oligonucleótido antisentido para usar según la reivindicación 6 o para usar según la reivindicación 7, en el que el mamífero es un ser humano.
9. Anticuerpo antagonista u oligonucleótido antisentido para usar o el uso según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, en el que dicho trastorno cardiovascular, endotelial o angiogénico es un traumatismo, enfermedad vascular periférica, lesión hepática o renal o un trastorno de reestenosis.
10. Anticuerpo antagonista u oligonucleótido antisentido para usar según la reivindicación 6, en el que el anticuerpo antagonista u oligonucleótido antisentido se administra junto con un agente cardiovascular, endotelial o angiogénico.
11. Uso según la reivindicación 7, en el que el medicamento es para administrar junto con un agente cardiovascular, endotelial o angiogénico.
12. Anticuerpo antagonista u oligonucleótido antisentido para usar o el uso según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 11, en el que el anticuerpo antagonista u oligonucleótido antisentido de un polipéptido PRO256 estimula el crecimiento de células endoteliales o angiogénesis.
13. Polipéptido PRO256 o anticuerpo agonista para este, en el que un polipéptido PRO256 es según se define en la reivindicación 1, para usar para inhibir el crecimiento de células endoteliales o la angiogénesis en el tratamiento de un trastorno cardiovascular, endotelial o angiogénico en un mamífero.
14. Uso de un polipéptido PRO256 o anticuerpo agonista para este, en la fabricación de un medicamento para inhibir el crecimiento de células endoteliales o la angiogénesis en el tratamiento de un trastorno cardiovascular, endotelial o angiogénico en un mamífero, en el que un polipéptido PRO256 es según se define en la reivindicación 1.
15. Polipéptido PRO256 o anticuerpo agonista para este, para usar según la reivindicación 13 o el uso según la reivindicación 14, en el que el mamífero es un ser humano.
16. Polipéptido PRO256 o anticuerpo agonista para este, para usar o el uso según la reivindicación 15, en el que el ser humano tiene hipertrofia cardiaca, un tipo de tumor o degeneración macular relacionada con la edad.
17. Polipéptido PRO256 o anticuerpo agonista para este, para usar según la reivindicación 13, en el que el polipéptido PRO256 o anticuerpo agonista para este se administra junto con un agente cardiovascular, endotelial o angiogénico.
18. Uso según la reivindicación 14, en el que el medicamento es para la administración junto con un agente cardiovascular, endotelial o angiogénico.
19. Polipéptido PRO256 o anticuerpo agonista para este, para usar según la reivindicación 13, en el que el polipéptido PRO256 o anticuerpo agonista para este se administra en combinación con un agente quimioterapéutico, un agente inhibidor del crecimiento o un agente citotóxico.
20. Uso según la reivindicación 14, en el que el medicamento es para la administración en combinación con un agente quimioterapéutico, un agente inhibidor del crecimiento o un agente citotóxico.
21. Polipéptido PRO256 o anticuerpo agonista para este, en el que un polipéptido PRO256 es según se define en la reivindicación 1, para usar en el tratamiento de un trastorno cardiovascular, endotelial o angiogénico en un mamífero, en el que el trastorno cardiovascular, endotelial o angiogénico es hipertrofia cardiaca, angiogénesis tumoral, o degeneración macular relacionada con la edad.
22. Uso de un polipéptido PRO256 o anticuerpo agonista para este, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno cardiovascular, endotelial o angiogénico en un mamífero, en el que un polipéptido PRO256 es según se define en la reivindicación 1, y en el que el trastorno cardiovascular, endotelial o angiogénico es hipertrofia cardiaca, angiogénesis tumoral, o degeneración macular relacionada con la edad.
23. Polipéptido PRO256 o anticuerpo agonista para este para usar según la reivindicación 21 o el uso según la reivindicación 22, en el que el polipéptido PRO256 o anticuerpo agonista para este inhibe el crecimiento de células endoteliales o la angiogénesis.
24. Polipéptido PRO256 o anticuerpo agonista para este, para usar o el uso según una cualquiera de las reivindicaciones 21 a 23, en el que el trastorno cardiovascular, endotelial o angiogénico es hipertrofia cardiaca, angiogénesis tumoral, o degeneración macular relacionada con la edad.
25. Molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido PRO256 o anticuerpo agonista, anticuerpo antagonista u oligonucleótido antisentido para este, en el que un polipéptido PRO256 es según se define en la reivindicación 1, para usar en el tratamiento de un trastorno cardiovascular, endotelial o angiogénico en un mamífero.
26. Uso de una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido PRO256 o anticuerpo agonista, anticuerpo antagonista u oligonucleótido antisentido para este, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno cardiovascular, endotelial o angiogénico en un mamífero, en el que un polipéptido PRO256 es según se define en la reivindicación 1.
27. Molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido PRO256 o anticuerpo agonista, anticuerpo antagonista u oligonucleótido antisentido para este, para usar según la reivindicación 25 o el uso según la reivindicación 26, en el que el mamífero es un ser humano.
28. Molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido PRO256 o anticuerpo agonista, anticuerpo antagonista u oligonucleótido antisentido para este, para usar según la reivindicación 25, en el que dicha molécula de ácido nucleico se administra por terapia génica ex vivo.
29. Uso según la reivindicación 26, en el que el medicamento es para administrar por terapia génica ex vivo.
30. Partícula retrovírica recombinante que comprende un vector retrovírico que comprende (1) un promotor, (2) ácido nucleico que codifica un polipéptido PRO256 o anticuerpo agonista, anticuerpo antagonista u oligonucleótido antisentido para este, y (3) una secuencia señal para la secreción celular del polipéptido, en el que el vector retrovírico está asociado con proteínas estructurales, en el que un polipéptido PRO256 es según se define en la reivindicación 1.
31. Célula productora ex vivo que comprende una construcción de ácido nucleico que expresa proteínas estructurales retrovíricas y también comprende un vector retrovírico que comprende un (1) promotor, (2) ácido nucleico que codifica un polipéptido PRO256 o anticuerpo agonista, anticuerpo antagonista u oligonucleótido antisentido para este, y (3) una secuencia señal para la secreción celular del polipéptido, en el que dicha célula productora empaqueta el vector retrovírico asociado con proteínas estructurales para producir partículas retrovíricas recombinantes, en el que un polipéptido PRO256 es según se define en la reivindicación 1.
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