JP2006346420A - 移植材料及び骨質改善剤 - Google Patents

Abstract

【課題】本発明は、骨質を改善する用途に局所投与して使用する移植材料の提供を目的とする。
【解決手段】前記目的を達成するために、本発明の移植材料は、骨質を改善する用途に局所投与して使用する移植材料であって、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、骨芽細胞、前骨芽細胞、軟骨細胞、及び、骨形成能を有する細胞からなる群から選択される細胞を含む移植材料である。本発明の移植材料は、例えば、骨質低下に対する骨質改善剤として使用できる。本発明の移植材料は、さらに、スキャホールド、両親媒性ペプチド、多血小板血漿（ＰＲＰ）等を含むことが好ましい。本発明の移植材料は、例えば、ヒト及び非ヒト動物（好ましくはヒトである。）の骨粗しょう症を含む骨質低下疾患の予防や治療に使用できる。
【選択図】図２

Description

本発明は、移植材料及び骨質改善剤に関する。

現在、日本においては、団塊世代というエルダー世代が５０％以上を占める高齢化社会になっている。その中で、骨質低下により骨が萎縮してもろく折れ易い状態となる骨粗しょう症は、その患者数が日本国内で１０００万人以上と国民の１０分の１と推定されており、多くの高齢者にとって共通の悩みとなっている。骨粗しょう症による骨質低下に伴う大腿骨頚部骨折の患者数は、年間約１０万人といわれる（例えば、１９９７年の全国調査では、推計９２，４００人）。高齢者の骨折は、寝たきりを引き起こすなどＱＯＬの低下を招くため、大きな社会問題となっている。また、骨粗しょう症による骨質低下は、骨折という問題の他にも、例えば、歯科領域で用いられる歯科インプラントの治療方法の成功率を低下させるという問題も引き起こす。前記歯科インプラント治療方法とは、歯が失われた顎骨にチタン性の金属を埋入することで、義歯を作製する治療方法である。

前記骨折を含む骨欠損部位の修復や再生のための一般的な治療方法は、自己の組織、例えば、脂肪、筋膜、軟骨、骨片等を移植に用いる自家移植である。しかしながら、自家移植は、骨欠損部位に対して移植材料の十分な供給量が得られない場合があるという問題点や、患者に対する負担が大きいという問題点がある。また、同種移植（アロ移植）や異種移植に関しても、移植材料の供給量、免疫反応、感染等の問題が指摘されている。この問題を回避すべく、例えば、β−ＴＣＰ（β−リン酸三カルシウム）、ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）、ポリ乳酸ポリマー等の生体吸収材料からなる代用骨（例えば、特許文献１〜３参照）や、チタン等でできた人工関節を２種類のセメント等により固定する移植材料（セメント型とポーラス型）が検討されている。しかし、前記人工関節は、埋没した人工関節が時間の経過とともに緩んできて十分な効果があげられていないという問題点がある。そこで、近年、組織工学（ｔｉｓｓｕｅ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）を取り入れた再生医療骨（ｔｉｓｓｕｅ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｂｏｎｅ）による骨折の治療方法が盛んに開発されている。例えば、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）や多血小板血漿（ＰＲＰ）を含む再生医療移植材料を用いる治療方法である（例えば、特許文献４参照）。
特表２００３−５３２４５８号公報 特開２００４−１６３９８号公報 国際公開ＷＯ２００３／０６５９９６号パンフレット 特再表ＷＯ２００２／０４００７１号公報

これに対し、骨質低下それ自体に対しては、既存の治療法よりも新しい治療法が切望されている。なぜなら、例えば、運動療法、食事療法、薬物療法（例えば、特開２００５−１３９２０７号公報参照）等の現在行われている骨粗しょう症等に対する治療法では、コンプライアンスの低下や効果の有無が問題となったり、また、前記薬物療法においては、長期投与による発癌作用が問題となったりしているからである。したがって、骨質自体をより確実に改善できる新たな技術が求められている。

そこで、本発明は、骨質を改善する用途に局所投与して使用する移植材料の提供を目的とする。

前記目的を達成するために、本発明の移植材料は、骨質を改善する用途に局所投与して使用する移植材料であって、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、骨芽細胞、前骨芽細胞、軟骨細胞、及び、骨形成能を有する細胞からなる群から選択される細胞を含む移植材料である。

従来、骨再生等の再生医療は、骨欠損部へ移植材料を挿入することにより行われることが技術常識であり、すでに骨組織が存在する場合において再生医療的手法により骨質を改善するという発想は、従来技術において何ら記載も示唆もなかった。しかし、本発明者らは、例えば、骨形成能を有する細胞等を骨髄腔内に局所的に注入すれば骨密度を向上させ、低下した骨質の改善が可能であることを見出し、本発明に到達した。

本発明の移植材料は、局所投与することにより、骨密度等の骨質の改善が可能であり、例えば、骨質低下に対する骨質改善剤として使用できる。本発明の移植材料は、さらに、例えば、骨粗しょう症における骨折多発部位の予防・治療、骨折の治療・再発予防、細胞組み込み型人工関節を用いた治療、並びに、歯科インプラントを含む骨手術への術前治療等に使用できる。すなわち、本発明の移植材料は、骨粗しょう症等を含む骨質低下疾患の予防・治療に使用でき、さらに、骨粗しょう症で多発する骨折の治療時に本発明の移植材料を用いれば、再発防止効果や治癒促進効果を得ることができる。

本発明の移植材料のような再生医療移植材料を用いて、骨粗しょう症等の骨質低下疾患の骨質改善ができることや、前記再生医療材料を用いて、骨折や骨欠損をしておらず既に骨組織が存在する部位の骨質改善ができるという本発明の効果は、従来記載も示唆もない優れた効果である。

本発明において、前記骨質の改善は、骨密度の改善であることが好ましい。本発明の移植材料は、さらに、スキャホールドを含むことが好ましい。前記スキャホールドとしては、人工骨、生体骨、細胞外マトリクス、生体分解吸収性高分子材料、及び、自己組織化能を有する両親媒性ペプチドからなる群から選択されることが好ましい。前記自己組織化能を有する両親媒性ペプチドは、ペプチドハイドロゲルを形成していることが好ましい。

本発明の移植材料は、さらに、多血小板血漿（ＰＲＰ）又は成長因子を含むことが好ましい。

本発明の移植材料は、骨疾患の予防・治療に使用することが好ましい。前記骨疾患としては、骨欠損、骨ベージェット病、パーキンソン病、変形性関節症、腰背痛、慢性関節リウマチ、骨粗しょう症、閉経性骨粗しょう症、骨折、歯周疾患、骨減少症及び軟骨化症からなる群から選択されることが好ましい。

本発明の移植材料は、例えば、脈管外投与や骨髄内注入のような局所投与で用いられることが好ましい。また、本発明の移植材料は、使用時において流動性を有することが好ましい。

本発明の骨質改善剤は、本発明の移植材料を含み、骨質の改善の用途、より好ましくは、骨密度を改善する用途に局所投与して使用する骨質改善剤である。本発明の骨質改善剤は、骨欠損、骨ベージェット病、パーキンソン病、変形性関節症、腰背痛、慢性関節リウマチ、骨粗しょう症、閉経性骨粗しょう症、骨折、歯周疾患、骨減少症及び軟骨化症からなる群から選択される骨疾患の予防・治療に用いることが好ましい。また、本発明の骨質改善剤の局所投与は、例えば、脈管外投与や骨髄内注入等が好ましい。

本発明の移植材料の製造方法は、本発明の移植材料を製造する方法であって、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、又は、腸骨骨髄、顎骨骨髄、末梢血、脂肪、若しくは、さい帯血に由来する細胞を準備する工程を含み、さらに、それらを培養して、骨形成能を有する細胞に分化誘導する工程を含むことが好ましい。また、本発明の骨質改善剤の製造方法は、本発明の移植材料の製造方法により、本発明の移植材料を製造する工程を含むことが好ましい。

以下に、本発明の移植材料について説明する。

（移植材料として使用する細胞）
本発明の移植材料として使用する細胞は、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、骨芽細胞、前骨芽細胞、軟骨細胞、及び、骨形成能を有する細胞からなる群から選択される細胞又はこれらの細胞の組合せである。これらの細胞は、採取された細胞であっても培養細胞であってもよく、ヒト及び非ヒト動物の細胞であることが好ましく、より好ましくは、ヒトの細胞である。これらの細胞は、自家であってもよく、他家であってもよく、また、遺伝的に修飾されていてもよい。

これらの中でも、本発明の移植材料に使用する細胞としては、骨形成能を有する細胞が好ましい。骨形成能を有する細胞とは、骨芽細胞、前骨芽細胞、骨系細胞へ分化したＭＳＣやＥＳ細胞等を含む骨組織を形成しうる細胞をいう。本発明の移植材料に含まれる前記骨形成能を有する細胞は、前記いずれかの細胞を使用してもよく、前記細胞を任意に組合せたものを使用してもよい。これらの中でも、骨系細胞へ分化したＭＳＣを使用することが好ましい。ここで、「骨系細胞へ分化した」とは、未分化状態のＭＳＣやＥＳ細胞等が、骨系細胞へ方向付けされた状態をいう。骨系細胞へ分化したＭＳＣやＥＳ細胞は、自家細胞であることが好ましいが、同種他家細胞であってもよく、また、ヒト由来の細胞を利用できる。

骨系細胞へ分化したＭＳＣは、例えば、体内から採取した未分化ＭＳＣを、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、骨系細胞への分化を誘導する条件下で培養することで調製できる。前記骨系細胞への分化を誘導する培地としては、例えば、β−グリセロリン酸、デキサメタゾン、及び、Ｌ−アスコルビン酸を含む培地があげられる。但し、培養条件としては、これに限定されず、従来公知の骨系細胞への分化を誘導する条件を適用できる。前記骨系細胞へ分化したＭＳＣは、凍結処理をしたものであってもよい。前記未分化ＭＳＣの供給源としては、例えば、腸骨骨髄、顎骨骨髄、末梢血、脂肪、骨膜、歯髄、又は、さい帯血等があげられる。これらの従来公知の方法で採取した後、ＭＳＣをその接着性の有無に基づき選択する。すなわち、骨髄等に含まれる細胞の中で、接着性を有するものを選択することにより未分化ＭＳＣを得ることができる。なお、前記骨芽細胞、前骨芽細胞及び軟骨細胞についても、腸骨骨髄、顎骨骨髄、末梢血、脂肪、骨膜、歯髄、又は、さい帯血等から採取できる。

（投与形態）
本発明の移植材料は、局所投与の投与形態で用いられるが、前記局所投与であれば、その投与形態は特に制限されず、例えば、骨髄腔内注入等の脈管外投与でもよい。また、局所投与に使用する細胞としては、特に制限されないが、例えば、ＥＳ細胞やＭＳＣを使用してもよく、また、骨芽細胞や軟骨細胞を使用してもよい。

投与においては、本発明の移植材料により骨形成が促進される限りどのような媒体を使用してもよい。好ましくは、本発明の移植材料に使用する細胞の生理活性を維持するのに好ましい媒体を用いて投与する。前記媒体としては、例えば、生理食塩水や、さらに後述するＰＲＰや各種の成長因子を加えたもの等があげられる。本発明の移植材料に使用する前記細胞の細胞数としては、例えば、投与する移植材料１ｍＬあたり１×１０⁵細胞以上であって、好ましくは、１×１０⁶〜１×１０⁸細胞である。また、本発明の移植材料を局所投与する場合、後述するとおり、スキャホールドとともに投与してもよい。例えば、本発明の移植材料を骨髄腔内へ注入する場合、生理食塩水を用いた場合には、本発明の移植材料を骨髄全体へ到達させることが可能である。一方、スキャホールドを用いた場合には、本発明の移植材料を骨の一定領域にとどめておき、必要な部分のみを骨質改善することが可能となる。

（スキャホールド）
前述のとおり、本発明の移植材料を投与する場合、骨形成のスキャホールド（足場）と組合せて投与してもよい。スキャホールドは、骨の再生において、通常、細胞の移植に先立ってあるいは移植とともに、骨形成又は骨形成を促進しようとする部位（骨疾患部位、整形外科における治療又は予防部位、美容形成における治療又は予防部位、形成外科における治療又は予防部位、歯科における治療又は予防部位、口腔外科における治療又は予防部位）に供給される。こうすることで、移植した細胞の骨疾患部位等における生着や骨疾患部位での細胞増殖等を促進して骨疾患部位での骨形成（再生）を促進することが可能となる。こうしたスキャホールドとしては、各種の人工骨や生体骨（自家骨等を含む）のほか、生体内で分解吸収される高分子材料があげられる。こうした高分子材料としては、例えば、自己組織化能を有する両親媒性ペプチド、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸とグルコール酸との共重合体、ポリ−ε−カプロラクトン、ε−カプロラクトンと乳酸あるいはグリコール酸との共重合体、ポリクエン酸、ポリリンゴ酸、ポリ−α−シアノアクリレート、ポリ−β−ヒドロキシ酪酸、ポリトリメチレンオキサレート、ポリテトラメチレンオキサレート、ポリプロピレンカーボネート、ポリ−γ−ベンジル−Ｌ−グルタメート、ポリ−γ−メチル−Ｌ−グルタメート、ポリ−Ｌ−アラニン等の合成高分子、デンプン、アルギン酸、ヒアルロン酸、キチン、ペクチン酸及びその誘導体等の多糖あるいはゼラチン、コラーゲン（コラーゲンのタイプ及びその抽出法はいずれでもよい）等があげられる。

これらの中でも、本発明の移植材料に使用するスキャホールドとしては、生体吸収性、非感染源性、非免疫原性等の優れた生体適合性を示し、かつ、優れた流動性、付形性及び操作性を示すスキャホールドが好ましい。このようなスキャホールドとしては、後述する自己組織化能を有する両親媒性ペプチドがあげられる。このようなスキャホールドを用いれば、本発明の移植材料を一定領域にとどめておくことが可能になり、必要な部分のみ骨質を改善でき、例えば、歯科インプラント治療に有用となる。低浸襲であることや欠損の形態に影響されないことから、骨折の治癒遅延症例や、骨粗しょう症における骨質改善にも有用である。

（自己組織化能を有する両親媒性ペプチド）
本発明の移植材料のスキャホールドとして使用可能な前述の組織化能を有する両親媒性ペプチド（Ｓｅｌｆ−Ａｓｓｅｍｂｌｉｎｇ Ａｍｐｈｉｐｈａｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅ）は、疎水性アミノ酸残基と親水性アミノ酸残基とが一定周期で交互に配置されて疎水性側鎖の非極性の面と親水性側鎖の極性の面とを備える。そして、前記両親媒性ペプチドは、適当な電解質存在下において、自己組織化的にナノファイバーを形成し、その結果、ペプチドナノファイバーからなるペプチドハイドロゲルを形成する。

前記両親媒性ペプチドにおいて、前記親水性アミノ酸残基は、その側鎖のチャージが正のものと負のものとが一定周期で交互に配置され、前記極性の面が、イオン的に相補的であることが好ましい。前記両親媒性ペプチドの自己組織化能に関与するペプチド間の相互作用の一例を図５に示す。図５は、ＫＬＤＬＫＬＤＬＫＬＤＬ（配列番号１）というアミノ酸配列からなる３本の両親媒性ペプチドの相互作用を示す模式図である。前記両親媒性ペプチドは、電解質が存在する水溶液中で、多数の相互作用によって自己組織化する。前記相互作用には、例えば、隣接しているペプチドにおける正チャージのアミノ酸（リジン：Ｋ）側鎖と負チャージのアミノ酸（アスパラギン酸：Ｄ）側鎖とが形成する相補的なイオン対が含まれる。また、図示していないが、例えば、アスパラギンやグルタミン等の親水性アミノ酸残基の非チャージ側鎖であれば、水素結合総合作用に関与する。隣接しているペプチドにおける疎水性側鎖は、ファンデルワールス相互作用に関与する。ペプチド骨格上のアミノ基及びカルボニル基もまた分子間水素結合相互作用に関与しうる。前記正チャージ側鎖のアミノ酸残基としては、アルギニン：Ｒ、リジン：Ｋ、ヒスチジン：Ｈがあげられ、前記負チャージ側鎖のアミノ酸残基としては、アスパラギン酸：Ｄ、グルタミン酸：Ｅがあげられ、非チャージ親水性側鎖のアミノ酸残基としては、アスパラギン：Ｎ、グルタミン：Ｑ、セリン：Ｓ、トレオニン：Ｔ、チロシン：Ｙがあげられ、疎水性側鎖のアミノ酸残基としては、アラニン：Ａ、グリシン：Ｇ、バリン：Ｖ、ロイシン：Ｌ、イソロイシン：Ｉ、プロリン：Ｐ、フェニルアラニン：Ｆ、メチオニン：Ｍ、トリプトファン：Ｗ、システイン：Ｃがあげられる。

前記両親媒性ペプチドにおいて、疎水性アミノ酸残基と親水性アミノ酸残基との配置の一定周期は、例えば、１残基、２残基、３残基、４残基の交互配置であってよく、好ましくは、１個のアミノ酸残基の交互配置である。

前記両親媒性ペプチドにおいて、親水性アミノ酸残基の側鎖が、イオン的に相補的である場合、その正負のチャージの配列に応じてモジュールＩ〜ＩＶ等にクラス分けできる。すなわち、正チャージアミノ酸残基と負チャージアミノ酸残基の交互配置の一定周期が、１残基（−＋−＋−＋−＋）、２残基（−−＋＋−−＋＋）、３残基（−−−＋＋＋）及び４残基（−−−−＋＋＋＋）である場合を、それぞれ、モジュールＩ、モジュールＩＩ、モジュールＩＩＩ及びモジュールＩＶという。なお、各モジュールにおいて、正負チャージの順番は逆でもよい。

両親媒性ペプチドの長さは、例えば、８〜２００アミノ酸残基であって、好ましくは、８〜３６アミノ酸残基であり、より好ましくは、８〜１６アミノ酸残基である。また、前記両親媒性ペプチドのＮ末端側は、アセチル化されていてもよい。前記両親媒性ペプチドの製造方法は、特に制限されず、例えば、従来公知の化学合成方法により合成する方法があげられる。

本発明の移植材料に使用される前記両親媒性ペプチドは、一種類でもよく、複数種類でもよい。複数種類の場合、β−シート状の構造に自己組織化する両親媒性ペプチドを少なくとも一種類含むことが好ましい。そのようなβ−シート状の構造に自己組織化する両親媒性ペプチドは、例えば、米国特許ＵＳ５，９５５，３４３、米国特許ＵＳ５，６７０，４８３、特表２００５−５１５７９６号公報（国際公開ＷＯ２００２／０６２９６１号パンフレット）に開示されており、その一例を下記表１に示す。

（ペプチドハイドロゲル）
本発明において、ペプチドハイドロゲルは、前記両親媒性ペプチドが自己組織化によりナノファイバーを形成した結果として得らるものである。このペプチドハイドロゲルは、ｉｎ ｖｉｖｏで、骨形成のスキャホールド（足場）として機能しうる。前記ナノファイバーとは、前記両親媒性ペプチドが、例えば、らせん状のβ−シート構造をとったものである。前記ナノファイバーの直径は、例えば、５００ｎｍ以下、１００ｎｍ未満、５０ｎｍ未満、２０ｎｍ未満、１０ｎｍ〜２０ｎｍ、５ｎｍ〜１０ｎｍ、５ｎｍ未満である。

前記ペプチドハイドロゲルを形成する方法としては、例えば、水溶液中の前記両親媒性ペプチドの最終濃度を、０．５ｗｔ％〜５．０ｗｔ％、好ましくは、０．５ｗｔ％〜３．０％、より好ましくは、０．５ｗｔ％〜１．０ｗｔ％とし、前記水溶液の塩濃度（例えば、ＮａＣｌ）を、５ｍＭ〜５Ｍとする方法があげられる。前記水溶液の好ましいバッファーとしては、例えば、生理食塩水、ＰＢＳ等があげられる。

前記ペプチドハイドロゲルを形成するための前記水溶液は、さらに、等浸透圧性溶質を含むことが好ましい。前記等浸透圧性溶質とは、前記水溶液中に溶解された非イオン性化合物をいう。前記等浸透圧性溶質としては、例えば、単糖類や二糖類等の糖類があげられ、そのなかでも、スクロース、グルコース、ガラクトース、フルクトース、リボース、マンノース、アラビノース、キシロース等が好ましい。前記等浸透圧性溶質の濃度は、例えば、５０ｍＭ、１５０ｍＭ、３００ｍＭ、２００〜２５０ｍＭ、２５０〜２７０ｍＭ、２７０〜３００ｍＭ、３００〜４００ｍＭ、４００〜５００ｍＭ、５００〜６００ｍＭ、６００〜７００ｍＭ、７００〜８００ｍＭ、８００〜９００ｍＭである。その他の等浸透圧性溶質としては、例えば、５〜２０％（ｖ／ｖ）のグリセロールがあげられる。前記水溶液のｐＨは、例えば、７．０である。

前記ペプチドハイドロゲルは、注射器やカテーテルで注入可能な程度の流動性を備えることが好ましい。

前記ペプチドハイドロゲルの水分含有量は、例えば、９９％を超え、好ましくは、９９．５％〜９９．９％である。また、前記ペプチドハイドロゲルは、優れた生体適合性を示すことが好ましい。すなわち、哺乳類動物においては、検出可能な免疫応答や炎症応答を誘発せず、また、生理食塩水条件下では、検出可能な膨張性を示さないことが好ましい。前記ペプチドハイドロゲルの孔サイズは、例えば、５０ｎｍ〜４００ｎｍである。前記ペプチドハイドロゲルは、生体内分解性があり、骨形成とともに吸収される。その分解期間は、例えば、２〜８週間である。前記分解期間は、前記両親媒性ペプチドに、例えば、プロテアーゼによる切断部位を導入するなどして調整可能である。また、完全人工合成が可能であるから、他の動物由来材料と異なり病原菌、ウイルス及びプリオン等の感染のおそれを排除できる。

前記両親媒性ペプチドとしては、市販製品である商品商標「ＰｕｒａＭａｔｒｉｘ^TM」（３−Ｄ Ｍａｔｒｉｘ Ｊａｐａｎ社製）を使用でき、前記ペプチドハイドロゲルとしては、市販製品である商品商標「ＰｕｒａＭａｔｒｉｘ^TM Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｈｙｄｒｏｇｅｌ」（同社製）を使用できる。

（ＰＲＰ：多血小板血漿）
本発明の移植材料は、その他の態様として、さらに、ＰＲＰ（多血小板血漿）を含んでもよい。ＰＲＰは、血小板を豊富に含む血漿であり、換言すれば、血小板が濃縮された血漿をいう。ＰＲＰは、例えば、商品名：濃厚血小板「日赤」（日本赤十字社製）に準じるものであり、採取した血液を遠心分離処理するなどして調製できる。具体的には、例えば、まず、採取した血液にクエン酸ナトリウム等の凝固防止剤を添加し、室温で所定時間放置する。その後、血球及びバフィーコートが分離する条件（例えば、約１，１００ｒｐｍ）で遠心処理する。これにより、２層（上層を、Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｐｏｏｒ Ｐｌａｓｍａ：ＰＰＰともいう。下層には、血球及びバフィーコートが含まれる）に分離される。前記上層のＰＰＰを取り除いた後、更に、赤血球が分離される条件（例えば、約２，５００ｒｐｍ）で遠心処理する。これにより、２層（上層を、Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｐｏｏｒ Ｐｌａｓｍａ：ＰＰＰともいう。下層には、血球及び軟膜が含まれる）に分離される。その結果得られた赤血球を実質的に含まない画分（Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｒｉｃｈ Ｐｌａｓｍａ：ＰＲＰ）を採取する。ＰＲＰの調製方法は、この方法に限定されず、必要に応じて修正を加えた方法により調製することができる。ＰＲＰに含まれる血小板の量についての一般的な定義はないが、採取した血液に比較して約２倍〜約２０倍の血小板を含有することが好ましい。なお、その調製が可能であり、かつ調製に際して非現実的な負担のない限りにおいて、血小板の含有量は、できるだけ豊富なものを用いることが好ましい。ＰＲＰは、自己由来のＰＲＰであることが好ましい。毒性ないし免疫拒絶反応を回避できるからである。

ＰＲＰに豊富に含まれる血小板及びフィブリノーゲンをトロンビン等を用いてゲル化させたＰＲＰゲルは、前記ペプチドハイドロゲルと共役して骨形成のスキャホールドとして機能しうる。ＰＲＰは、また、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）等の成長因子を豊富に含み、これらの成長因子もまた、骨形成に寄与すると考えられる。本発明の移植材料は、さらにその他の態様として、ＰＲＰに代えて、ＰＤＧＦやＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、骨誘導因子（ＢＭＰ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）−Ｉ、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）等の成長因子と組合せたものでもよい。これらのＰＲＰ又は１種若しくは２種以上の成長因子との併用によれば、骨形成又は骨形成を促進すべき部位において効果的に骨密度を増進させることができる。

（用途）
本発明の移植材料は、ヒト及び非ヒト動物（好ましくはヒトである。）の各種骨疾患の治療・予防又は改善に使用できる。ここで、予防・治療とは、予防及び治療、又は、予防若しくは治療をいう。前記骨疾患としては、骨欠損、骨ベージェット病、パーキンソン病、変形性関節症、腰背痛、慢性関節リューマチ、骨粗しょう症、閉経性骨粗しょう症、骨折、歯周疾患、骨減少症、軟骨化症等があげられる。さらに、その他の態様として、本発明に移植材料は、整形外科、美容外科、形成外科、歯科及び口腔外科の領域にも適用することができる。例えば、インプラント（人工歯根）の植立のための顎骨の骨質強化や再建、歯槽骨の増強・再生、外科手術後の顎骨再建、唇顎口蓋裂の顎裂部の再建等に適用できる。

これらの中でも、本発明の移植材料は、ヒト及び非ヒト動物（好ましくはヒトである。）の骨質低下疾患における骨質改善に適用することが好ましい。前記骨質改善とは、特に制限されないが、例えば、骨密度の改善を含む。前記骨質低下疾患とは、骨密度の低下、骨組織の劣化等の症状を伴う骨量の低下が起こる疾患をいう。前記骨質低下疾患としては、例えば、（１）原発性骨粗しょう症（例えば、加齢に伴う原発性骨粗しょう症、閉経に伴う原発性骨粗しょう症、卵巣摘出術に伴う原発性骨粗しょう症等）、（２）二次性骨粗しょう症（例えば、グルココルチコイド誘発性骨粗しょう症、甲状腺機能亢進性骨粗しょう症、固定誘発性骨粗しょう症、ヘパリン誘発性骨粗しょう症、免疫抑制誘発性骨粗しょう症、腎不全による骨粗しょう症、炎症性骨粗しょう症、クッシング症候群に伴う骨粗しょう症、リューマチ性骨粗しょう症等）、（３）癌骨転移、高カルシウム血症、ページェット病、骨欠損（歯槽骨欠損、下顎骨欠損、小児期突発性骨欠損等）、骨壊死等のような骨質低下を伴う疾患があげられる。

本発明の移植材料は、少なくとも使用時において流動性を有しておればよく、使用前においては粉状ないし固形状であっても良い。したがって、凍結した状態をもって本発明の移植材料とすることができる。また、凍結乾燥した状態をもって本発明の移植材料とすることもできる。使用前において凍結状態又は凍結乾燥状態とすることにより長期の保存が可能となり、また、使用前の取扱いも容易となる。さらには、凍結処理又は凍結乾燥処理により抗原性の低下が期待できるため、自家のＰＲＰではなく同種の他家のＰＲＰを用いた場合の安全性向上される。前記流動性は、例えば、本発明の移植材料を、注射器やカテーテルにて注入可能な程度であることが好ましい。

本発明の移植材料は、その他の態様として、細胞外マトリクス（ＥＣＭ）タンパク質を含んでもよい。前記ＥＣＭは、自家であることが好ましいが、同種他家であってよい。また、本発明の移植材料は、ゲル化材料、例えば、トロンビンや塩化カルシウムを含んでもよい。これらを含むことにより、トロンビンがＰＲＰ中のフィブリノーゲンに作用し、フィブリンが生ずる。そして、フィブリンの凝集作用により粘性が増加する。前記ゲル化剤の種類は特に限定されず、上記のようにＰＲＰ中の成分に作用して粘性を増加させるもの、又はそれ自身により増粘効果を奏するものを適宜選択して用いることができる。また、前記ゲル化材料に加えて、適用後（移植後）に作用して本発明の移植材料の流動性（粘度）を変化させる第２のゲル化材料を併用することもできる。使用時には適度な流動性を有するために移植が容易であり、かつ、適用後にはより粘度が増すことにより適用部位における定着性が向上し、骨形成が効果的となる。前記ゲル化材料としては、その他に、コラーゲンやフィブリン糊等があげられる。さらに、本発明の再生医療骨組成物は、アルギン酸ナトリウム等の増粘多糖類、グリセリン、ワセリン等の増粘剤を含んでもよい。

（製造方法）
本発明の移植材料を製造する方法は、特に制限されないが、例えば、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、又は、腸骨骨髄、顎骨骨髄、末梢血、脂肪、若しくは、さい帯血等に由来する細胞を準備する工程を含み、さらに、それらを培養して、骨形成能を有する細胞に分化誘導する工程を含むことが好ましい。分化誘導されていない細胞であっても一定の効果を示すことが有り、その場合には、そのまま使用することができ、必要に応じて分化誘導の工程を行う。骨形成能を有する細胞に分化誘導する方法は、特に制限されず、従来公知の方法を適用でき、未分化ＭＳＣの分化誘導方法については、前述のとおりである。

（骨質改善剤）
本発明の骨質改善剤は、本発明の移植材料を含み、骨質を改善する用途に局所投与して使用する骨質改善剤である。本発明の骨質改善剤は、本発明の移植材料と同様の用途に使用できるが、とりわけ、前述の骨質低下疾患における骨質改善の用途に用いることが好ましい。前記骨質改善としては、特に制限されないが、骨質が低下した骨の骨密度の改善があげられる。また、局所投与の投与形態も、特に制限されず、例えば、骨髄腔内注入等の脈管外投与が可能である。

本発明の骨質改善剤は、エストロゲン、ビタミンＫ、ビスフォスフォネート等の従来公知の骨質改善剤と併用してもよい。また、本発明の骨質改善剤を製造する方法は、特に制限されず、例えば、前述の本発明の移植材料を製造する方法により、本発明の移植材料を製造する工程を含むことが好ましい。

（医薬組成物）
本発明は、その他の態様として、ヒト及び非ヒト動物（好ましくはヒトである。）の骨疾患及び骨質低下疾患の予防・治療に用いる医薬組成物であって、本発明の移植材料又は本発明の骨質改善剤を含む医薬組成物である。前記骨疾患及び骨質低下疾患は特に制限されず、例えば、前述のとおりである。また、投与形態や投与量も、特に制限されず、例えば、本発明の移植材料の投与形態や投与量と同定度である。

（予防・治療方法）
本発明は、その他の態様として、ヒト及び非ヒト動物（好ましくはヒトである。）の骨形成又は骨形成促進方法であって、本発明の移植材料を局所投与により移植する工程を備える。この方法により、ヒト又は非ヒト動物の骨部における骨密度増加を促進できる。移植方法は、特に制限されず、前述の本発明の移植材料の投与方法を参照できる。また、本発明は、その他の態様として、ヒト及び非ヒト動物（好ましくはヒトである。）の骨疾患及び骨質低下疾患の予防・治療方法であって、本発明の移植材料又は本発明の骨質改善剤を使用する方法である。前記骨疾患及び骨質低下疾患は特に制限されず、例えば、前述のとおりである。

前述の本発明の骨疾患及び骨質低下疾患の予防・治療方法の一実施態様としては、例えば、ＭＳＣ、骨芽細胞又は軟骨細胞を培養する工程と、培養したＭＳＣ、骨芽細胞又は軟骨細胞を局所投与により移植する工程とを備える予防・治療方法があげられ、また、その他の実施態様として、例えば、採取等により取得したＥＳ細胞、ＭＳＣ、骨芽細胞又は軟骨細胞を保存する工程と、保存したＭＳＣ、骨芽細胞又は軟骨細胞を局所投与により移植する工程とを備える予防・治療方法があげられる。

さらに、本発明は、その他の態様として、骨疾患及び骨質低下疾患の予防・治療、又は骨質改善のためのキットであって、本発明の移植材料を含むキットである。前記キットは、必要に応じて、試薬等を含んでもよい。

以下に、本発明を実施例により説明する。

骨粗しょう症モデルラットを使用した実験系をデザインして、本発明の移植材料が、骨質低下した骨の骨密度を改善できることを確認した。

（骨粗しょう症モデルラットの作製）
骨粗しょう症モデルラットを、卵巣を摘出することにより確立した。この方法は、文献［Ｊ Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ Ｒｅｓ １９９７：１２；１８４４−１８５０、Ｈｉｔｏｓｈｉ Ｓａｉｎｏら］に準じて行った。前記骨粗しょう症モデルラットは、ＤＸＡ（２重エネルギーＸ線吸収計）というＣＴ機を用いて骨密度を測定し、骨粗しょう症モデルを確認した。

（骨系細胞へ分化したＭＳＣの調製）
本発明の移植材料とするため、ＧＦＰラットの大腿骨から未分化ＭＳＣを採取し、分化誘導して骨系細胞へ分化したＭＳＣを調製した。前記ＧＦＰラットは、大阪大学の岡部らが開発したもので、日本ＳＬＣ社から購入した。このラットの全ての組織には、ＧＦＰ遺伝子が組み込まれているため、移植した細胞の動向を追うことができる。このラットは、文献［Ｊ．Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｏｌ １２：２６５７−２６３５、２００１、Ｔａｋａｈｉｔｏ Ｉｔｏ ｅｔ ａｌ.］に記載されている。

前記ＭＳＣの分化誘導の培養方法は、文献［Ｂｏｏ，Ｊ.Ｓ．， Ｙａｍａｄａ，Ｙ．， Ｈｉｂｉｎｏ，Ｙ．， Ｏｋａｚａｋｉ，Ｙ．， Ｏｋａｄａ,Ｋ., Ｈａｔａ，Ｋ．， Ｙｏｈｉｋａｗａ，Ｔ．， Ｓｕｇｉｕｒａ，Ｙ．，ａｎｄ Ｕｅｄａ，Ｍ． Ｔｉｓｓｕｅ−Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｂｏｎｅ Ｕｓｉｎｇ Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ａ Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ ｓｃａｆｆｏｌｄ. Ｊ．Ｃｒａｎｉｏｆａｃ．ｓｕｒｇ. １３、２３１−２３９、２００２］、［Ｙａｍａｄａ、Ｙ., Ｂｏｏ，Ｊ．Ｓ．， Ｏｚａｗａ，Ｒ．， Ｎａｇａｓａｋａ，Ｔ．， Ｏｋａｚａｋｉ，Ｙ．， Ｈａｔａ,Ｋ．， ａｎｄ Ｕｅｄａ，Ｍ． Ｂｏｎｅ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｆｉｂｒｉｎ ｇｌｕｅ ｗｉｔｈ ａ ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ ｓｃａｆｆｏｌｄ. Ｊ.Ｃｒａｎｉｏ−ｍａｘｉｌｌｏｆａｃ.ｓｕｒｇ. ３１,２７−３３,２００３］及び［Ｙａｍａｄａ，Ｙ．， Ｕｅｄａ，Ｍ．， Ｎａｉｋｉ，Ｔ．， Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｍ．， Ｈａｔａ，Ｋ．， ａｎｄ Ｎａｇａｓａｋａ，Ｔ． Ａｕｔｏｇｅｎｏｕｓ ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ Ｂｏｎｅ ｆｏｒ Ｒｅｎｅｇｅｒａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ（ＭＳＣｓ） ａｎｄ Ｐｌａｔｅｌｅｔ−Ｒｉｃｈ Ｐｌａｓｍａ（ＰＲＰ）−Ｔｉｓｓｕｅ-ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｂｏｎｅ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ−． Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇ． １０（５/６），９５５−９６４，２００４］等に準じた。すなわち、前記ＧＦＰラットの大腿骨の骨髄穿刺により未分化ＭＳＣを含む骨髄を採取し、骨髄細胞を、基本培地、低グルコースＤＭＥＭ、増殖サプリメント（Ｃａｍｂｒｅｘ社製）で培養し、３つのサプリメント（デキサメタゾン、β−グリセロリン酸ナトリウム、及びＬ−アスコルビン酸２リン酸）によって、ＭＳＣの骨系細胞への分化を誘導した。骨系細胞へ分化したＭＳＣは、ｐ−ニトロフェニルホスファターゼを基質として使用したアルカリホスファターゼ活性を検出することで確認した。ＭＳＣは、移植に使用する前にトリプシン処理を施した。

（局所投与）
前述のとおりに調製したＭＳＣを、生理食塩水又はＰＲＰとともに、図１に示すとおり、ラット（ヌードラット）の大腿骨に骨髄穿刺針を用いて注入した。移植した細胞数は、５×１０⁶個／ｍｌと、１×１０⁷個／ｍｌの２群とした。

（ＰＲＰの調製）
前記ＰＲＰは、ラット末梢血から、全血を採取し、５分間、１１００ｒｐｍの遠心分離の後、イエロープラズマ（血小板及び白血球とともにバフィーコートを含む）を長いカニューレで中性のモノベットに回収し、１０分間、２５００ｒｐｍの遠心分離で血小板を単一ペレットとして調製した。前記ＰＲＰは、残存血漿にリサスペンドし、ＰＲＰのゲル化に使用した。ＰＲＰのゲル化は、前記ＰＲＰに、トロンビン／塩化カルシウム溶液を添加し、気泡を含ませながら混合することで行った。前記トロンビン／塩化カルシウム溶液は、１０ｍＬの１０％塩化カルシウム溶液に、１０，０００Ｕのウシトロンビンを溶解して調製した。

（評価）
前記局所投与群の評価は、大腿骨のＤＸＡ法による骨密度測定及びμＣＴにより行った。なお、骨粗しょう症のモデル成立のための骨密度測定は、卵巣摘出後、２週、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月程度とした。骨粗しょう症モデルラットに所定の方法で細胞を移植し、移植直後、移植後１ヶ月、２ヶ月、及び３ヶ月後に同様にして骨密度を測定し、骨密度に基づいて細胞移植の状態を確認した。

（結果）
図２に、移植前、移植時、移植後１ヶ月の骨密度測定結果を示す。また、図３に、骨密度の改善が得られた状態で屠殺し、μＣＴを撮影した結果を示す。前記μＣＴでは、当該局所である大腿骨を撮影した。さらに、図４に、大腿骨への局所投与について、注入移植後に経時的に骨密度を測定し、非注入のコントロールとの骨密度比をグラフ化した結果の一例を示す。

骨粗しょう症モデルラットについては、図２に示すとおり、コントロール群では骨密度に変化が見られなかったのに対し、卵巣摘出群では骨密度の低下が観察されたことから、骨粗しょう症モデルが成立したことが確認された。局所投与群は、図２に示すとおり、細胞移植時には骨密度値の低下傾向がみられたが、細胞移植の１ヶ月後には、骨密度の上昇が確認され、図３に示すとおり、μＣＴにおいても骨密度の改善が確認された。なお、図示してないが、移植した細胞数は、１×１０⁷個の方が、５×１０⁶個よりも骨密度改善の効果が高かった。なお、図４に示すとおり、細胞移植による骨密度の増加は、コントロールと比較して約１０％を示した。薬物療法による骨密度の増加が、通常約４％程度であることを考慮すると、本発明の移植材料による骨質改善効果が優れていることが確認された。

以上のことから、本発明の移植材料は、骨密度を改善する骨質改善剤として機能しうることが確認された。

なお、上記記述内において引用された文献は、引用によってその内容のすべてが編入される。

以上説明したとおり、本発明の移植材料は、例えば、整形外科、美容整形、歯科、口腔外科、及び、耳鼻咽喉科等における骨の再生医療分野、及び、骨質低下疾患における骨質改善の分野で有用であり、低浸襲による幹細胞を用いた再生医学的治療法による骨組織の再生を含むアンチエイジング治療の分野で有用である。

図１は、実施例における実験系を説明する写真である。 図２は、実施例における骨密度測定の結果の一例を示すグラフである。 図３は、実施例におけるμＣＴ撮影の一例を示す写真である。 図４は、実施例における骨密度比変化の一例を示すグラフである。 図５は、自己組織化能を有する両親媒性ペプチド間の相互作用を説明する模式図である。

配列番号１〜１８ 自己組織化能を有する両親媒性ペプチド

Claims (15)

1. 骨質を改善する用途に局所投与して使用する移植材料であって、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、骨芽細胞、前骨芽細胞、軟骨細胞、及び、骨形成能を有する細胞からなる群から選択される細胞を含むことを特徴とする移植材料。
2. 前記骨質の改善が、骨密度の改善である請求項１記載の移植材料。
3. さらに、スキャホールドを含み、前記スキャホールドが、人工骨、生体骨、生体分解吸収性高分子材料、及び、自己組織化能を有する両親媒性ペプチドからなる群から選択されるスキャホールドである請求項１又は２記載の移植材料。
4. 前記両親媒性ペプチドが、ペプチドハイドロゲルを形成している請求項３記載の移植材料。
5. さらに、多血小板血漿（ＰＲＰ）又は成長因子を含む請求項１から４のいずれか一項に記載の移植材料。
6. 骨疾患の予防・治療に使用する請求項１から５のいずれか一項に記載の移植材料。
7. 前記骨疾患が、骨欠損、骨ベージェット病、パーキンソン病、変形性関節症、腰背痛、慢性関節リウマチ、骨粗しょう症、閉経性骨粗しょう症、骨折、歯周疾患、骨減少症及び軟骨化症からなる群から選択される骨疾患である請求項６記載の移植材料。
8. 前記局所投与が、脈管外投与又は骨髄内注入である請求項１から７のいずれか一項に記載の移植材料。
9. 使用時において流動性を有する請求項１から８のいずれか一項に記載の移植材料。
10. 骨質改善剤であって、請求項１から９のいずれか一項に記載の移植材料を含み、骨質を改善する用途に局所投与して使用する骨質改善剤。
11. 前記骨質の改善が、骨密度の改善である請求項１０に記載の骨質改善剤。
12. 骨欠損、骨ベージェット病、パーキンソン病、変形性関節症、腰背痛、慢性関節リウマチ、骨粗しょう症、閉経性骨粗しょう症、骨折、歯周疾患、骨減少症及び軟骨化症からなる群から選択される骨疾患の予防・治療に使用する請求項１０又は１１記載の骨質改善剤。
13. 前記局所投与が、脈管外投与又は骨髄内注入である請求項１０から１２のいずれか一項に記載の骨質改善剤。
14. 請求項１から９のいずれか一項に記載の移植材料の製造方法であって、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、又は、腸骨骨髄、顎骨骨髄、末梢血、脂肪、若しくは、さい帯血に由来する細胞を準備する工程を含む移植材料の製造方法。
15. 請求項１０から１３のいずれか一項に記載の骨質改善剤の製造方法であって、請求項１４記載の製造方法により請求項１から９のいずれか一項に記載の移植材料を製造する工程を含む骨質改善剤の製造方法。

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