JP2006034209A - Ｕｇｔ１ａ３核酸配列の変異検査方法 - Google Patents

Abstract

【課題】
本発明の課題はＵＧＴ１A３の核酸配列のエキソン１領域の遺伝子変異の検査方法を提供するとともに、本検査方法を用いて薬剤代謝の判定、予測又は検査方法、黄疸、癌、冠動脈疾患又は骨粗鬆症の検査方法を提供することである。
【解決手段】
ＵＧＴ１A3の核酸配列のエキソン１領域の変異を検索したところ、UGT1A3酵素分子にアミノ酸置換を引き起こす新たな変異を見出し、それらを調べることにより、ＵＧＴ１A3活性の予測が可能であること、さらに薬剤代謝、黄疸、癌、冠動脈疾患又は骨粗鬆症に深く関与していることを見出した。

Description

本発明は臨床検査の分野で用いられ、とりわけグルクロン酸抱合に関与する酵素の核酸配列検査の方法及びそのためのキットに関する。

UDP-グルクロン酸転移酵素（UGT）により触媒されるグルクロン酸抱合はビリルビンをはじめ種々の薬剤や毒物の代謝、解毒に重要な役割をしている。ヒトUGT１遺伝子群は少なくとも１３個の異なるエキソン１と共通エキソン２〜５からなり、1つのエキソン１が共通エキソン２〜５に対してスプライシングする。UGT１AアイソフォームのうちUGT1A1はヒトの肝臓におけるビリルビンのグルクロン酸抱合を行うと共に、種々の薬剤やその代謝産物をグルクロン酸抱合する。UGT1A1の変異によるいくつかの機能上の多型が知られている（非特許文献１）。

UGT1A3は肝臓、胆嚢、胃および小腸に発現しており、エストロン、２−ヒドロキシエストロン、１級アミン、３級アミン、水酸化ベンゾピレン代謝産物、２−アセチルアミノフルオレン代謝産物、フラボノイド、７−ヒドロキシクマリン、オピオイド、アントラキノン等をグルクロン酸抱合することが知られている（非特許文献２）。そして人種により変異の型及び頻度が異なることも知られている（非特許文献３）。
Biochem. J. (1994) 303, 233-240 Drug Metab.Dispos. （1998）26、507−512 Pediatrics（１９９９）103、１２２４−１２２７

本発明の課題はＵＧＴ１A３の核酸配列のエキソン１領域の遺伝子変異の検査方法を提供するとともに、本検査方法を用いて薬剤代謝の判定、予測又は検査方法、黄疸、癌、冠動脈疾患又は骨粗鬆症の検査方法を提供することである。

本発明者らはＵＧＴ１A3の核酸配列のエキソン１領域の変異を検索したところ、UGT
1A3酵素分子にアミノ酸置換を引き起こす新たな変異を見出し、それらを調べることにより、ＵＧＴ１A3活性の予測が可能であること、さらに薬剤代謝、黄疸、癌、冠動脈疾患又は骨粗鬆症に深く関与していることを見出し、本発明を完成させた。

本発明は、以下の構成からなる。
１、ＵＤＰ−グルクロン酸転移酵素（ＵＧＴ１A3）の核酸配列の検査方法であって、配列番号１で表した配列の、17番目のaからｇ（Q6R）、31番目のｔからｃ（W11R）、133番目のｃからｔ（R45W）、及び140番目のｔからｃ（V47A）への変異のうち、いずれか１つ又は少なくとも2つを組合わせて検査することを特徴とするＵＧＴ１A3の核酸配列の検査方法。
２、前記１に記載のＵＧＴ１A3の核酸配列の検査によるUGT1A3酵素分子の機能、酵素活性を検査又は予測する方法。
３、前記２に記載の方法による薬物代謝能、黄疸、癌、冠動脈疾患又は骨粗鬆症の検査方法。
４、配列番号２、３、４、５、6及び７に記載のオリゴヌクレオチドプライマーのいずれか１または少なくとも２つを用いる前記１〜３に記載の検査方法。
５、配列番号８、９、１０及び１１に記載のオリゴヌクレオチドプライマーのいずれか１または少なくとも２つを用いる前記１〜４に記載の検査方法。
６、前記１〜５のいずれか１に記載の検査方法に用いる検査装置、試薬又はキット。
７、前記４〜６に記載のいずれか１に記載の検査方法に用いるオリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも1種を組み込んでなる検査装置、試薬又はキット。

本発明は、これまで知られていなかったUGT1A3の新しい変異を検査する方法を提供し、この検査方法を用いることにより、薬剤代謝能、癌、黄疸、冠動脈疾患、骨粗鬆症 の検査、予測が可能になるといった格段の効果をもたらす。

（検査対象）
本発明により検査対象は薬物代謝能、黄疸、癌、冠動脈疾患又は骨粗鬆症があげられる。
薬物代謝はチトクロームP450による代謝経路に加えて、ＵＧＴ１によるグルクロン酸抱合による代謝経路も重要であり、本発明の検査方法を用いることによりグルクロン酸抱合されて代謝される薬物の薬効と副作用の予測が可能になる。本発明の方法によって検査されうる対象となる薬剤の例として、エストロン、２−ヒドロキシエストロン、１級アミン、３級アミン、水酸化ベンゾピレン代謝産物、２−アセチルアミノフルオレン代謝産物、フラボノイド、７−ヒドロキシクマリン、オピオイド、アントラキノン等が挙げられる。

ビリルビンの肝臓からの排出には、ＵＧＴ１が必須であり、黄疸の原因を検査するために本発明は有効である。本発明は、さらに乳がん、大腸がんをはじめとする種々の癌との関連を検査する方法としても有用であり、冠動脈疾患や骨粗鬆症の発症を理解、予測する上においても有用な検査方法である。

（検査試料）
検査しようとするＵＧＴ１A3核酸配列のゲノムDNAは肝臓、腎臓、白血球、毛髪等の臓器、組織等特に限定されることなく得ること可能である。白血球からゲノムDNAを得る方法の一つに市販のキット、例えばキアゲン社のQuiagen Blood DNAキットを用いることができる。得られたゲノムDNAを用いて、配列番号１に記載の領域を含むゲノムDNAを、例えば、５´−CACGTTGATTTGCTAAGTGG−３´と
５´−TGGATGAAGGCACCATATACA−３´のプライマー対を用いてポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により増幅させる。ゲノムDNAを増幅する手段はPCRに限られたものではなく、ＬＡＭＰ、ＬＣＲ、ＮＡＳＢＡ等の公知の増幅工程により増幅させることも可能である。

（変異検出）
得られた増幅産物の変異を検出する方法は直接シーケンス法を初め、種々の公知の方法が適用され特に限定されるものではない。直接シーケンス法のためのプライマーの例として、配列番号２、３、４,５,６及び７のプライマーが挙げられる。さらに、変異を導入したプライマーの例として、配列番号８、９、１０及び１１のプライマーが挙げられる。制限酵素による断片化試料の電気泳動分析やＤＮＡ試料を溶液内ハイブリザイズさせるＦＩＳＨ法等により、検査することも可能である。その他サザンハイブリダイゼーション法、ドットハイブリダイゼーション法（J. Mol. Biol., 98: 503-517, 1975等参照）、ジデオキシ塩基配列決定法、ＤＮＡの増幅手法を組合せた各種の検出法［例えばＰＣＲ−制限酵素断片長多型分析法（RFLP: Restriction fragment length polymorphism），ＰＣＲ−単鎖高次構造多型分析法（Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 86:
2766-2770, 1989等参照），ＰＣＲ−特異的配列オリゴヌクレオチド法（SSO: Specific sequence oligonucleotide），ＰＣＲ−ＳＳＯとドットハイブリダイゼーション法を用いる対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド法（Nature, 324: 163-166, 1986等参照）］等を例示することができる。さらにオリゴヌクレオチドプローブを用いる核酸チップ又は核酸アレイによって簡便に検出することも可能である。

（プローブ）
本発明を実施するための一つのツールとして変異を検出するためのオリゴヌクレオチドプローブを調製することが可能である。その例として配列番号８、９、１０、及び１１の配列中のNを含むオリゴヌクレオチドにストリンジェントな条件でハイブリダイズする相補的配列を有するプローブを合成して用いることができる。これらの配列中Ｎで表した塩基は全て、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔのいずれかに置換されたものである。これらのプローブ用オリゴヌクレオチドのヌクレオチド数は、少なくとも８個、通常１０〜５０個、好ましくは１５〜３５個の範囲にあるのがよい。プローブのヌクレオチド数が上記よりあまりに多くなりすぎると、１本鎖ＤＮＡにハイブリダイズしにくくなり、逆にあまりに小さすぎると、ハイブリダイゼーションの特異性が低下する。

上記本発明で用いるプローブのオリゴヌクレオチドは、常法に従い、自動合成機、例えばＤＮＡシンセサイザー（パーキンエルマー社）等を用いて容易に合成することができ、得られるオリゴヌクレオチドは更に必要に応じて、市販の精製用カートリッジ等を用いて精製することもできる。合成オリゴヌクレオチドはスライドグラス表面に固定化した核酸アレイやマイクロタイタープレート固相へ応用する場合には５´末端または３´末端をアミノ標識或いはビオチン標識しておくことも好適である。
以下、本発明を更に詳しく説明するため実施例を挙げる。

（検査対象及び試料の調製）
健常日本人１００人を検査対象とした。キアゲン社のQuiagen
Blood DNAキットを用いてゲノムDNAを分離し精製した。それぞれについてUGT1A3のエキソン１の領域を配列番号２及び３に記載のオリゴヌクレオチドプライマー対を用いてポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により増幅させた。PCRの条件は９４℃で２分間の変性、９４℃で１分間の放置、６２℃で１分間、７２℃で２分間のサイクルを３２サイクル行った。増幅した試料をジクロロローダミン使用ダイターミネーター法シーケンシングキット（dRhodamine
Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit）を用いて直接シーケンス法にて配列を確認した。配列解析用プライマーとして、配列番号２、３、４,５,６及び７のプライマーを用いた。

（対立遺伝子解析）
実施例１に記載の検査対象について、対立遺伝子の解析を行った。その結果を表１に示した。全２００対立遺伝子のうち正常型は１２２対立遺伝子（６１％）で、７８対立遺伝子（３９％）で、Q6R,W11R, R45W及びV47Aのうちいずれかの変異を見出した。Q6Rのみの変異は検出されず、W11Rとの複合変異を検出したものが１１対立遺伝子（５．５％）であった。W11Rは単独で変異が認められたものは、２０対立遺伝子（１０％）、V47Aとの複合変異が２５対立遺伝子（１２．５％）、そして前述のQ6Rとの複合変異の１１対立遺伝子（５．５％）を含めて、５６対立遺伝子（２８％）であった。R４５Wの変異は全て単独の変異で２２対立遺伝子（１１％）であった。V４７Aの変異は全てW11Rとの複合変異であり、前述のごとく２５対立遺伝子（１２．５％）であった。

ヒトｃDNAライブラリーよりUGT1A3のｃDNAを配列番号1２及び１３に示したプライマー対を用いてPCRにより増幅し、有核細胞TAクローニングキット（Invitrogen）を用いてｐCR３．１発現ベクターに組み込んだ。変異導入操作はMutan Km キット（Takara）を用いて行った。すなわち、ｐCR３．１発現ベクターに組み込んだｃDNAをHind IIIとXba Iの２つの制限酵素で切断し、ｐｋF18ベクター（Takara）に組み込んだ。配列番号８，９，１０及び１１に示したプライマーを用いて変異を導入した。変異を導入したｐKF18ベクターを切断し、再度ｐCR３．１発現ベクターに繋いだ。W11RとR45Wの単独変異、Q6RとW11RおよびW11RとV47Aの複合変異のベクターをそれぞれ調製した。
各３μｇのプラスミドDNAをCOS-7細胞にGene PORTERトランスフェクション試薬（Gene Therapy System）を用いてトランスフェクションした。トランスフェクションした細胞を48時間培養した後、細胞を集めて超音波処理にて破壊し、細胞ホモジネートを調製した。エストロン及びUDP-グルクロン酸を基質として細胞ホモジネートのUDP-グルクロン酸転移酵素活性を測定した。１４CでラベルしたUDP−グルクロン酸を用い、３７℃で１０分間反応後の生成物をTLCプラスチックシート５７４８（メルク）で分析することにより酵素活性を求めた。その結果を表２に示した。

以上の結果、UGT1A3の酵素活性が７０−３７０％もの間で変動することから、本発明により、酵素活性が予測できることが判った。

本発明は、新薬開発における、薬効や副作用の予測に利用されるほか、診断・治療のために必要な臨床検査の分野で用いられる診断薬キットとして製造される。

Claims (7)

1. ＵＤＰ−グルクロン酸転移酵素（ＵＧＴ１A3）の核酸配列の検査方法であって、配列番号１で表した配列の、17番目のaからｇ（Q6R）、31番目のｔからｃ（W11R）、133番目のｃからｔ（R45W）、及び140番目のｔからｃ（V4７A）への変異のうち、いずれか１つ又は少なくとも2つを組合わせて検査することを特徴とするＵＧＴ１A3の核酸配列の検査方法。
2. 請求項１に記載のＵＧＴ１A3の核酸配列の検査によるUGT1A3酵素分子の機能、酵素活性を検査又は予測する方法。
3. 請求項２に記載の方法による薬物代謝能、黄疸、癌、冠動脈疾患又は骨粗鬆症の検査方法。
4. 配列番号２、３、４、５、6、及び７に記載のオリゴヌクレオチドプライマーのいずれか１または少なくとも２つを用いる請求項１〜３に記載の検査方法。
5. 配列番号８、９、１０及び１１に記載のオリゴヌクレオチドプライマーのいずれか１または少なくとも２つを用いる請求項１〜４に記載の検査方法。
6. 請求項１〜５のいずれか１に記載の検査方法に用いる検査装置、試薬又はキット。
7. 請求項４〜６に記載のいずれか１に記載の検査方法に用いるオリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも1種を組み込んでなる検査装置、試薬又はキット。