KR20090090948A - 단일염기다형을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 이를 포함하는마이크로어레이 및 진단키트, 이를 이용한 검출 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 MTHFR, AUTS2, RELN, LAMB1, WNT2, FOXP2, 및 ST7 유전자로부터 유래된 단일염기다형 (Single-Nucleotide Polymorphism; SNP)을 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드를 제공하며, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드는 자폐증의 임상적 진단의 표지 인자로서 사용될 수 있다.

자폐증, 단일염기다형, RELN

Description

단일염기다형을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 이를 포함하는 마이크로어레이 및 진단키트, 이를 이용한 검출 방법{Polynucleotides comprising single nucleotide polymorphism, microarrays and diagnostic kits comprising the same, and detection methods using the same}

본 발명은 자폐증(autism)과 관련된 단일염기다형을 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 뉴클레오티드; 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 뉴클레오티드로 이루어진 자폐증 진단을 위한 증폭용 프라이머 또는 자폐증 진단용 프로브; 상기 프로브를 포함하는 마이크로어레이; 및 자폐증 진단에 필요한 정보를 제공하는데 유용한, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 뉴클레오티드를 이용한 검출 방법에 관한 것이다.

사람의 염색체는 모두 23쌍으로 22쌍의 상동 염색체와 1쌍의 성염색체로 구성되어있다. 상기 23쌍의 염색체는 아버지로부터 23개 어머니로부터 23개씩을 받아 총 46개의 염색체를 가지고 있다. 인간 게놈프로젝트의 성공적 완료로 약 99.9%의 염기서열이 모든 사람의 개인 간에 동일한 유전적 염기서열을 자니고 있음이 밝혀졌다. 즉, 약 0.1%의 염기 서열만이 개인 간의 차이를 보이게 된다. 따라서 0.1%의 염기서열 차이가 개인간 유전적 차이의 원으로 추정되고 있다.

유전체 내에 존재하는 유전변이에는 크게 네 가지 형태가 존재한다. 첫 번째로 반복염기서열의 길이에 따라 새틀릿(satellite), 미니새틀릿(minisatellite), 마이크로새틀릿(microsatellite)(또는 STR; short tandem repeats)로 분류되는 반복 염기서열수의 차이에 따른 유전형변이형이다. 두 번째는 역트랜스포존(retrotransposons)에 의해 유전체의 여러 곳에 산발적으로 흩어져 존재하는 LINE, SINE 또는 transposable element 등의 유전형변이형 있다. 세 번째로, 특정한 유전부위 또는 염기서열이 삽입되거나 결손이 되어 나타나는 변형이 존재한다. 네 번째로 전체 인간 유전 변이형의 약 90% 이상을 차지하고 있는 가장 많이 존재하는 변이로 하나의 염기서열이 치환되어 나타나는 변이 형태로서, 최근 유전적 다양성연구에 가장 많이 이용되고 있는 SNP(single nucleotide polymorphism : 단일염기다형)가 있다. SNP는 인간집단에서 1% 이상의 빈도로 존재하는 2개의 대립 염기서열(biallele)이 발생하는 위치를 말하며, 인간이 가지고 있는 유전변이형 중에서 가장 많이 존재하는 형태로서 약 300bp마다 하나의 SNP 가 존재하는 것으로 추정하고 있다. 이러한 SNP가 나타내는 유전학적 의미는 그 위치에 따라 각 개체에 큰 차이를 가져온다. 예를 들면, 단일염기다형이 단백질을 암호화하고 있는 위치에 존재할 경우, 단백질의 구조에 영향을 미칠 수 있게 되어 단백질 기능이 달라질 수 있게 되며, 질병과도 연관될 수 있다. 다른 예로 단일염기다형이 단백질을 암호화하지 않는 다른 유전자상에서 존재할 경우, 즉 프로모터(promoter) 또는 인트론(intron)에 존재할 경우, 각각에 대하여 단백질의 발현 수준에 차이를 가져와 그 단백질의 전체적인 활성이 줄어들 수 있고, 변성적인 인트론 제거 과정(alternative splicing)을 통하여 단백질이 비정상적으로 발현될 수도 있다.

이러한 단일염기다형의 유전형(genotype) 확인을 위해서 다양한 분석법들이 사용된다. 가장 대표적인 2가지 전통적인 방법으로는 제한효소를 이용한 제한 단편화 길이 다형성(Restriction Fragment Length Polymorphism; RFLP)과 단일가닥 DNA가 자체내의 약한 분자 간 결합에 의하여 안정화되는 구조가 전기영동에 영향을 미치는 것을 이용한 SSCP방법이 있다. 최근에는 규모에 따라 그 방법이 크게 두 가지로 나뉜다. 첫 번째 방법은 작은 규모의 방법으로 단일염기다형을 조사하는데 사용되며, 대립형질 특이적 혼성화(Allele-specific hybridization)를 이용한 TaqMan^TM 프로브 방법, 용융온도(melting temperature; Tm)을 이용한 역동적 대립형질 특이적 혼성화(Dynamic Allele-Specific Hybridization; DASH)방법, 중합반응을 이용한 pyrosequencing 등이 있다. 두 번째로 대량의 단일염기 다형성의 유전형을 확인하는 방법으로 마이크로어레이 기술은 대립형질 특이적 신장(Allele-Specific Extension)이라는 원리를 이용한 프로브들을 조그만 기판위에 집적화시켜 심은 후, 목적 DNA들과의 혼성화와 신장(Extension)을 시킴으로써 단일염기다형의 유전형을 확인하고 있다.

한편, 자폐스펙트럼장애(Autism Spectrum Disorder; ASD)라고도 불리 우는 자폐증(autism)은 전반적인 발달장애(Pervasive Developmental Disorder; PDD)로서 사회적 상화작용의 장애, 의사소통의 장애, 반복적이고 상동증적인 행동을 보이는 신경발달장애이다. 자폐증은 다양한 형태로 나타나고 개인에 따라 심각한 정도가 다르며, 자폐증(autistic disorder), 레트장애(Rett’s disorder), 소아기 붕괴장애(childhood disintegrative disorder), 아스퍼거 증후군(Asperger’s syndrome), 특정불능의 전반적 발달장애(Pervasive Developmental Disorder Not Otherwise Specified; PDD-NOS)를 포함한다. 상기 PDD-NOS 란 자폐증에 가깝지만 미국정신의학회 진단기준인 정신장애 진단 및 통계편람(Diagnostic and Statistical Manual of Mental DisorderIV; DSM-IV)의 진단기준에는 적합하지 않는 장애를 말하는 것으로 자폐증이 가지는 세가지 주된 증상이 모두 나타나지 않고 일부가 나타나는 경우를 말하는 것으로 WHO가 작성한 국제질병분류(International Classification of Disease; ICD)에서는 비정형 자폐증(Atypical Autism disorder)으로 정의된다.

자폐증의 대부분은 소아기 자폐로 10,000 명당 2∼5 명의 유병률을 보이고, 아스퍼거 증후군 등 전반적 발달장애를 포함하는 경우 10,000명당 20∼50 명까지 보이며, 남녀 성비는 약 4:1 로서 여자보다 남자에서 발생 빈도가 높게 나타난다 [Gillberg C, Wing L. Autism: not an extremely rare disorder. Acta Psychiatr Scand;99:399-406 (1999); Fombonne E. The epidemiology of autism: a review. Psychol Med;29:769-786 (1999)]. 아직까지 자폐증의 정확한 원인은 보고되어 있지 않으나 많은 연구에서 유전학적 요인이 제시되었다 [Kaminsky Z, Wang SC, Petronis A. Complex disease, gender and epigenetics. Ann Med;38:530-544 (2006)]. 자폐증 환자의 형제자매들은 2∼4 % 정도로 자폐증 유병률을 보며, 이는 가족 중에 자폐증환자가 없는 경우에 비해 약 10 배 정도 그 빈도가 높은 것이다 [Folstein S,Rutter M. Genetic influences and infantile autism. Nature;265:726-728 (1977); Folstein S, Rutter M. Infantile autism: a genetic study of 21 twin pairs. J Child Psychol Psychiatry;18:297-321 (1977)]. 또한, 쌍생아 연구에서 자폐증 환자가 있는 일란성 쌍생아에서의 일치율은 36%, 이란성 쌍생아의 경우는 0%이며, 증상을 폭 넓게 본 경우 일란성 쌍생아에서는 85%, 이란성 쌍생아의 경우는 약 10%로 보고된 바 있다 [Bailey A, Le Couteur A, Gottesman I, Bolton P, Simonoff E, Yuzda E, et al. Autism as a strongly genetic disorder: evidence from a British twin study. Psychol Med;25:63-77 (1995)]. 이를 통하여 자폐증은 유전학적 요인이 그 발병에 있어 중요한 요소임을 증명하는 것으로서 최근에는 가족 및 쌍생아 연관성 연구를 통하여 자폐증이 복잡하고 다양한 상호작용 유전자자리(multiple locus)가 연루됨이 제시된 바 있다 [Pickles A, Bolton P, Macdonald H, Bailey A, Le Couteur A, Sim CH, et al. Latent-class analysis of recurrence risks for complex phenotypes with selection and measurement error: a twin and family history study of autism. Am J Hum Genet;57:717-726 (1995); Risch N, Spiker D, Lotspeich L, Nouri N, Hinds D, Hallmayer J, et al. A genomic screen of autism: evidence for a multilocus etiology. Am J Hum Genet;65:493-507 (1999); Folstein SE, Rosen-Sheidley B. Genetics of autism: complex aetiology for a heterogeneous disorder. Nat Rev Genet;2:943-955 (2001)].

자폐증의 유전학적 요인을 밝히기 위하여 다양한 연관성 분석 및 전유전체 조사(genome-wide screening)를 통한 자폐증과의 연관성 연구가 활발히 진행되고 있으며, 이들 연구에 따르면 사람이 가지고 있는 총 22개의 상동염색체 중에서 7번 염색체는 자폐증과 연관성이 많은 염색체로 보고된 바 있다 [IMGSAC. A full genome screen for autism with evidence for linkage to a region on chromosome 7q. International Molecular Genetic Study of Autism Consortium. Hum Mol Genet;7:571-578 (1998); IMGSAC. Further characterization of the autism susceptibility locus AUTS1 on chromosome 7q. Hum Mol Genet;10:973-982 (2001); Maestrini E, Paul A, Monaco AP, Bailey A. Identifying autism susceptibility genes. Neuron;28:19-24 (2000); Philippe A, Martinez M, Guilloud-Bataille M, Gillberg C, Rastam M, Sponheim E, et al. Genome-wide scan for autism susceptibility genes. ParisAutism Research International Sibpair Study. Hum Mol Genet;8:805-812 (1999)].

현재까지 많은 유전연구에도 불구하고 자폐증이 어떠한 유전양식으로 자손에게 유전되는지, 혹은 어떠한 유전자가 관여하는지에 관해서는 연구자마다 의견이 달라서 유전적으로도 이질성을 가졌거나, 여러 유전자가 관여할 가능성이 제시되기도 하였다. 또한, 아직까지 자폐증의 진단에 있어서 생리학적이나 생물학적인 진단 기준이 존재하지 않는다. 따라서 자폐증에 진단 및 예측할 수 있고 세부 질환을 판단할 수 있는 객관적인 분자생물학적 지표를 찾아내는 것이 당업계에 요구된다.

본 발명자들은 자폐증과 연관성이 많은 염색체로 보고된 7번 염색체 중, 특정 유전자 즉 MTHFR, AUTS2, RELN, LAMB1, WNT2, FOXP2, 및 ST7 유전자를 후보 유전자로 선정하여, 자폐증 진단을 위한 분자생물학적 수준에서의 진단 지표를 개발하고자 다양한 연구를 수행하였다. 그 결과, 놀랍게도 수많은 단일염기다형 중 일부의 단일염기다형만이 자폐증 환자군과 정상인군에서 통계학적으로 유의성 있는 차이를 나타낸다는 것을 발견하였으며, 상기 분석된 단일염기다형은 자폐증 진단을 위한 분자생물학적 지표로서 기능할 수 있다는 것을 발견하였다.

따라서, 본 발명은 자폐증과 관련된 단일염기다형을 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 뉴클레오티드로 이루어진 자폐증 진단을 위한 증폭용 프라이머 또는 자폐증 진단용 프로브를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 프로브를 포함하는 마이크로어레이를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 자폐증 진단에 필요한 정보를 제공하는데 유용한, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 뉴클레오티드를 이용한 검출 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 일 태양에 따라, 서열번호 2의 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서, 301번째 염기 (다형성 부위)가 C이고, 상기 301번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 (이하, "폴리뉴클레오티드 (b)"라 함); 서열번호 3의 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서, 301번째 염기 (다형성 부위)가 A이고, 상기 301번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 (이하, "폴리뉴클레오티드 (c)"라 함); 서열번호 4의 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서, 401번째 염기 (다형성 부위)가 G이고, 상기 401번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 (이하, "폴리뉴클레오티드 (d)"라 함); 서열번호 5의 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서, 201번째 염기 (다형성 부위)가 A이고, 상기 201번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 (이하, "폴리뉴클레오티드 (e)"라 함); 서열번호 8의 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서, 301번째 염기 (다형성 부위)가 A이고, 상기 301번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 (이하, "폴리뉴클레오티드 (h)"라 함); 서열번호 9의 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서, 301번째 염기 (다형성 부위)가 A이고, 상기 301번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 (이하, "폴리뉴클레오티드 (i)"라 함); 서열번호 10의 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서, 301번째 염기 (다형성 부위)가 C이고, 상기 301번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 (이하, "폴리뉴클레오티드 (j)"라 함); 서열번호 13의 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서, 201번째 염기 (다형성 부위)가 A이고, 상기 201번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 (이하, " 폴리뉴클레오티드 (m)"라 함); 서열번호 15의 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서, 301번째 염기 (다형성 부위)가 T이고, 상기 301번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 (이하, "폴리뉴클레오티드 (o)"라 함); 서열번호 16의 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서, 163번째 염기 (다형성 부위)가 G이고, 상기 163번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 (이하, "폴리뉴클레오티드 (p)"라 함); 서열번호 17의 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서, 301번째 염기 (다형성 부위)가 T이고, 상기 301번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 (이하, "폴리뉴클레오티드 (q)"라 함); 서열번호 18의 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서, 477번째 염기 (다형성 부위)가 A이고, 상기 477번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 (이하, "폴리뉴클레오티드 (r)"라 함); 서열번호 19의 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서, 301번째 염기 (다형성 부위)가 C이고, 상기 301번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 (이하, "폴리뉴클레오티드 (s)"라 함); 및 서열번호 20의 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서, 249번째 염기 (다형성 부위)가 C이고, 상기 249번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 (이하, "폴리뉴클레오티드 (t)"라 함)로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택된 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 뉴클레오티드가 제공된다.

또한, 본 발명의 다른 태양에 따라, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보 적 폴리뉴클레오티드로 이루어진, 자폐증 진단을 위한 증폭용 프라이머가 제공된다.

또한, 본 발명의 다른 태양에 따라, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드로 이루어진, 자폐증 진단용 프로브 및 이를 포함한 마이크로어레이가 제공된다..

또한, 본 발명의 다른 태양에 따라, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 자폐증 진단용 키트가 제공된다.

또한, 본 발명의 다른 태양에 따라, 자폐증 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, (i) 검체로부터 핵산 시료를 얻는 단계; 및 (ii) 상기 핵산 시료로부터, 서열번호 2 내지 5, 8 내지 10, 13, 및 15 내지 20의 폴리뉴클레오티드로부터 하나 이상 선택된 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 뉴클레오티드의 다형성 부위의 염기 서열을 분석하는 단계 (단, 상기 다형성 부위는 상기에서 정의한 바와 같다)를 포함하는, 검체 중의 단일염기다형을 검출하는 방법이 제공된다.

또한, 본 발명의 다른 태양에 따라, 자폐증 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, (i) 검체로부터 핵산 시료를 얻는 단계; 및 (ii) 상기 핵산 시료로부터 반수체형(haplotype)을 분석하는 단계를 포함하는, 검체 중의 단일염기다형을 검출하는 방법이 제공된다.

본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드 (b) 내지 (e), (h) 내지 (j), (m), (o) 내지 (t)로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택된 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보 적 뉴클레오티드는 자폐증의 진단에 유용하게 사용될 수 있다.

또한, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 뉴클레오티드로 이루어진 프라이머 또는 프로브, 및 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 뉴클레오티드 키트는 자폐증의 진단에 유용하게 사용될 수 있다.

또한 본 발명의 검출 방법은 자폐증 진단에 필요한 정보를 효과적으로 제공할 수 있다.

본 명세서에서 "자폐증(autism)" 이라 함은, 자폐 스펙트럼 장애(Autism Spectrum Disorder; ASD)라고도 칭해지며, 전반적인 발달장애(Pervasive Developmental Disorder; PDD)로서 사회적 상호작용의 장애, 의사소통의 장애, 반복적이고 상동증적인 행동을 보이는 신경발달장애를 총칭한다. 자폐증은 다양한 형태로 나타나고 개인에 따라 심각한 정도가 다르며, 자폐증(autistic disorder), 레트 장애(Rett's disorder), 소아기 붕괴장애(childhood disintegrative disorder), 아스퍼거 증후군(Asperger's syndrome), 특정불능의 전반적 발달장애(Pervasive Developmental Disorder Not Otherwise Specified; PDD-NOS)를 포함한다. 상기 PDD-NOS 란 자폐증에 가깝지만 미국정신의학회 진단기준인 정신장애 진단 및 통계편람(Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorder-IV; DSM-IV)의 진단기준에는 적합하지 않는 장애로서, 자폐증이 가지는 세가지 주된 증상이 모두 나타나지 않고 일부가 나타나는 경우를 말하는 것으로 WHO가 작성한 국제질병분류(International Classification of Disease; ICD)에서는 비정형 자폐증(Atypical Autism disorder)으로 정의된다. 본 명세서에서 "자폐증"이라 함은 상기 PDD-NOS도 포함한다.

본 발명은 자폐증과 관련되는 폴리뉴클레오티드 (b) 내지 (e), (h) 내지 (j), (m), (o) 내지 (t)로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택된 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 뉴클레오티드를 제공한다. 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 상보적 뉴클레오티드가 유래하는 서열번호 2 내지 5, 8 내지 10, 13, 및 15 내지 20의 DNA 서열은 자폐증 환자군과 정상인군에서 통계학적으로 유의성 있는 차이를 보이는 단일염기다형으로서, 이들은 각각 MTHFR(5,10-Methylenetetrahydrofolate reductase), AUTS2(autism susceptibility candidate 2), RELN(reelin), LAMB1(laminin, beta 1laminin, beta 1), WNT2(wingless-type MMTV integration site family member 2), FOXP2(forkhead box P2), 및 ST7(suppression of tumorigenicity 7) 유전자에 존재한다.

MTHFR 유전자는 5,10-메틸렌테트라히드로폴레이트(5,10-methylenetetrahydrofolate)를 5-메틸테트라히드로폴레이트(5-methyltetrahydrofolate)로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자로서, 생성되는 메틸기가 호모시스테인에 제공되어 메티오닌을 합성하는 대사과정에 관여한다. 이 유전자의 돌연변이는 효소의 활성을 저하시켜 과량의 호모시스테인이 체내에 축적되게 된다. 이러한 혈중 호모시스테인 과다증은 여러 가지 혈관성 질환 및 암의 원인으로 작용하는 것으로 알려져 있다. AUTS2 (autism susceptibility candidate 2) 유전자는 자폐증에 다감한 유전자로서 알려져 있으나, 아직 명확한 기능이 열려져 있지는 않다. RELN 유전자는 분비성 단백질분해효소를 코딩하는 유전자로서 신경세포 이동에 중요한 역할을 수행하며, 상기 효소의 농도가 낮으면 정상적인 인식에 필요한 신경회로를 약화시켜 정신분열증(schizophrenia), 자폐증(autism)의 발병 시킬 수 있는 것으로 알려져 있다. LAMB1 유전자는 기저막의 중요한 구성요소인 라미닌을 구성하는 세 개의 단백질 체인(laminin alpha, beta and gamma) 중에서 베타 체인의 세가지 아형 중 하나를 코딩하는 유전자이다. WNT2 유전자는 신호전달과정에서 단백질의 방출에 연관된 유전자이다. WNT2 유전자는 뇌 발달에 영향을 주는 16개의 WNT 유전자 패밀리 중 하나이다. FOXP2 유전자는 전사인자의 하나로서 DNA와 결합하는 단백질이며, 다른 유전자 생성물들의 생산을 조절하는 스위치로서의 역할을 하는 유전자이다. FOXP2 유전자의 돌연변이는 다른 생물체들에서 발성(vocalization) 손상을 일으키며, 발음이 부정확하고 문장이해력이 떨어지는 것으로 알려져 있다. ST7 유전자는 아직 기능이 명확히 알려져 있지 않으나, 자폐증 감수성 지역(autism-susceptibility locus)로 확인되는 7번 염색체 지구(region)에 존재하는 유전자로 알려져 있다.

본 발명자들은 자폐증과 관련된 후보 유전자군으로서 MTHFR, AUTS2, RELN, LAMB1, WNT2, FOXP2, 및 ST7을 선정하여, 자폐증 진단에 있어서 분자 수준에서의 진단 지표를 개발하고자 다양한 연구를 수행하였다. MTHFR, AUTS2, RELN, LAMB1, WNT2, FOXP2, 및 ST7은 각각 223, 3158, 2755, 306, 129, 647, 및 271 개의 수많은 단일염기다형이 존재하는 것으로 알려져 있다 (NCBI dbSNP;http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/). 본 발명자들은 한국인 자폐증 환자 180명과 정상인 147명을 대상으로 유전자형 분석 및 통계학적 분석을 수행하였으며, 놀랍게도 수많은 단일염기다형 중 극히 일부의 단일염기다형만이 자폐증 환자군과 정상인군에서 통계학적으로 유의성 있는 차이를 나타낸다는 것을 발견하였다. 특히, 서열번호 2 내지 5, 8 내지 10, 13, 및 15 내지 20의 단일염기다형은 하디-와인버그 평형 (Hardy-Weinberg Equilibrium) 및 로지스틱 회기분석 결과, 각각의 다형성 부위에 위험대립인자가 존재함을 확인하였다.

따라서, 본 발명은 자폐증과 관련되는 폴리뉴클레오티드 (b) 내지 (e), (h) 내지 (j), (m), (o) 내지 (t)로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택된 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 뉴클레오티드를 포함하며, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 뉴클레오티드의 길이는 10 내지 100 뉴클레오티드, 바람직하게는 20 내지 60 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 40 내지 60 뉴클레오티드이다.

본 발명에 따른 상기 폴리뉴클레오티드 (b) 내지 (e), (h) 내지 (j), (m), (o) 내지 (t)로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택된 폴리뉴클레오티드는 다형성 서열이다. 다형성 서열 (polymorphic sequence)이란 뉴클레오티드 서열 중에 단일염기다형을 나타내는 다형성 부위 (polymorphic site)를 포함하는 서열을 말한다. 다형성 부위 (polymorphic site)란 다형성 서열 중 단일염기다형이 일어나는 부위를 말한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA가 될 수 있다.

본 발명은 또한, 다형성 부위를 포함한 서열번호 2 내지 5, 8 내지 10, 13, 및 15 내지 20의 DNA서열로부터 유래한 10개 이상의 연속적 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 뉴클레오티드와 혼성화하는 자폐증 진단용 대립형질 특이적 폴리뉴클 레오티드를 포함한다. 상기 대립형질 특이적 (allele-specific) 폴리뉴클레오티드란 각 대립형질에 특이적으로 혼성화하는 것을 의미한다. 즉, 상기 단일염기다형이 나타내는 대립형질 중 하나에 특이적으로 혼성화 할 수 있음을 뜻한다.

본 발명은 또한, 상기 폴리뉴클레오티드 (b) 내지 (e), (h) 내지 (j), (m), (o) 내지 (t)로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택된 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드로 이루어진, 자폐증 진단을 위한 증폭용 대립형질 특이적 프라이머를 포함한다. 여기서 "프라이머 (primer)"란 적절한 버퍼 중의 적절한 조건 (예를 들면, 4개의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 (ATP,GTP,CTP,TTP) 및 DNA 폴리머라제) 및 적당한 온도 하에서 주형-지시 DNA 합성의 시작점으로서 작용할 수 있는 단일가닥 올리고뉴클레오티드를 말한다. 상기 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있으나, 통상 10 내지 100, 바람직하게는 10 내지 80 뉴클레오티드이다. 짧은 프라이머 분자는 일반적으로 주형과 안정한 혼성체를 형성하기 위해서는 더 낮은 온도를 필요로 한다. 프라이머 서열은 주형과 완전하게 상보적일 필요는 없으나, 주형과 혼성화 할 정도로 충분히 상보적이어야 한다. 상기 프라이머는 3'-말단이 서열번호 2 내지 5, 8 내지 10, 13, 및 15 내지 20의 단일염기다형과 정렬하는 것이 바람직하다. 상기 프라이머는 다형성 부위를 포함하는 표적 DNA에 혼성화하고, 상기 프라이머가 완전한 상동성을 보이는 대립형질 형태의 DNA에서 증폭을 개시한다. 이 프라이머는 반대편에 혼성화하는 제2 프라이머와 쌍을 이루어 사용된다. 증폭에 의하여 두 개의 프라이머로부터 산물이 증폭되고, 증폭된 산물만을 특이적으로 염색하여 시각화한다. 이는 특정 대립형질 형태가 존재한다는 것을 의미한다. 여기서 사용되는 대립형질 특이적 폴리뉴클레오티드들이 다른 변성화 과정을 거치게 되면, GoldenGate^TM Assay 뿐만 아니라 다른 방법들에 의해서도 사용될 수 있다.

본 발명은 폴리뉴클레오티드 (b) 내지 (e), (h) 내지 (j), (m), (o) 내지 (t)로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택된 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드로 이루어진, 자폐증 진단용 프로브 및 이를 포함하는 자폐증 진단용 마이크로어레이를 포함한다. 또한, 본 발명은 폴리뉴클레오티드 (b) 내지 (e), (h) 내지 (j), (m), (o) 내지 (t)로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택된 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 자폐증 진단용 키트를 포함한다.

본 발명은 자폐증 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, (i) 검체로부터 핵산 시료를 얻는 단계; 및 (ii) 상기 핵산 시료로부터, 서열번호 2 내지 5, 8 내지 10, 13, 및 15 내지 20의 폴리뉴클레오티드로부터 하나 이상 선택된 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 뉴클레오티드의 다형성 부위의 염기 서열을 분석하는 단계 (단, 상기 다형성 부위는 상기에서 정의한 바와 같다)를 포함하는, 검체 중의 단일염기다형을 검출하는 방법을 포함한다.

상기 검체는 혈액, 조직, 세포 등을 포함하며, 핵산 시료는 통상의 방법에 따라 얻을 수 있다. 예를 들어 혈액에 경우 다음과 같이 핵산 시료를 얻을 수 있다. 혈액을 원심분리 시험관으로 옮기고 낮은 농도의 염 성분 완충용액(low-salt buffer solution(10mM Tris-HCl [pH 7.6], 10mM KCl, 10mM MgCl2, 및 2mM EDTA))을 첨가한다. 그리고 Nonidet P-40을 첨가한 다음, 얻어진 용액을 잘 섞어준 후, 상온에서 10분간 약 2,200 rpm으로 원심분리한다. 이때 얻어진 덩어리는 고농도의 염 성분 완충용액(high-salt buffer solution(10mM Tris-HCl [pH 7.6], 10mM KCl, 10mM MgCl2, 0.4M NaCl, 및 2mM EDTA))으로 재현탁한다. 게놈 DNA는 50ul의 10% SDS와 섞은 후, 약 55℃에서 밤새 반응시킨다. 반응 후에, 각 게놈 DNA들은 1.5ml 용량의 원심분리 시험관으로 옮겨, 6M NaCl을 0.3ml 첨가한다. 게놈 DNA들을 잘 섞어준 후, 약 12,000rpm에서 10분간 원심분리한다. 원심분리 후, 게놈 DNA가 들어있는 상층을 모아서 새로운 시험관으로 옮기고, 상온에서 동량의 100% 에탄올을 첨가한다. 게놈 DNA들이 침전될 때까지 잘 섞어 주고, 침전이 되면 70% 에탄올로 게놈 DNA들을 세척한다. 이 과정이 끝나면 시험관 뚜껑을 열어, 용액성분이 마르도록 놓아둔다. 그리고 TE 완충용액(pH 8.0)을 넣어 게놈 DNA를 재현탁함으로써, 핵산 시료를 얻을 수 있다.

여기에서, 상기 다형성 부위의 뉴클레오티드 서열을 결정하는 단계는 서열번호 2 내지 5, 8 내지 10, 13, 및 15 내지 20의 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드 서열로서 다형성 부위를 포함하는 서열(단, 상기 다형성 부위는 상기에서 정의한 바와 같다)을 주형으로 하는 프라이머 또는 프로브를 이용하여 수행될 수 있다. 상기 프라이머 또는 프로브는 상기에서 설명한 바와 같다.

또한, 상기 다형성 부위의 뉴클레오티드 서열을 분석하는 단계는 폴리뉴클레 오티드 (b) 내지 (e), (h) 내지 (j), (m), (o) 내지 (t)로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 뉴클레오티드가 고정된 마이크로어레이에 상기 핵산 시료를 혼성화시키는 단계; 및 얻어진 혼성화 결과를 분석하는 단계를 포함하여 수행될 수 있으며, 상기 마이크로어레이에 고정되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 뉴클레오티드의 DNA 서열의 길이는 각각 10 내지 100 뉴클레오티드일 수 있다.

본 발명의 검체 중의 단일염기다형을 검출하는 방법에 따라 얻어진 결과는 자폐증 진단에 필요한 정보를 제공할 수 있으며, 예를 들어, 서열번호 2 내지 5, 8 내지 10, 13, 및 15 내지 20의 다형성 부위의 뉴클레오티드 서열이 각각 C, A, G, A, A, A, C, A, T, G, T, A, C, 및 C(위험 대립인자)인 것이 하나 이상 존재하는 경우, 자폐증 환자군에 속하는 것으로 판단할 수 있다. 상기 위험 대립 인자를 갖는 핵산 서열이 하나의 검체에서 많이 검출되면 될수록 자폐증 환자군에서 속하는 확률은 더 높은 것으로 판단할 수 있다.

또한, 상기 다형성 부위의 염기 서열을 분석하는 단계는 서열번호 2 내지 5, 8 내지 10, 13, 및 15 내지 20의 다형성 부위의 유전자형(genotype) 분석을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 다형성 부위의 염기 서열을 분석하는 단계는 서열번호 2, 8, 10 및 16의 다형성부위의 공우성 유전자형(co-dominant genotype) 및 열성 유전자형(resessive genotype) 분석을 포함하거나, 서열번호 3, 5 및 18의 다형성 부위의 우성 유전자형(dominant genotype) 분석을 포함하거나, 서열번호 4, 17 및 19의 다형성 부위의 공우성 유전자형(co-dominant genotype) 및 우성 유전자 형(dominant genotype) 분석을 포함하거나, 서열번호 9, 13 및 15의 다형성 부위의 열성 유전자형(resessive genotype) 분석을 포함하거나, 서열번호 20의 다형성 부위의 공우성 유전자형(co-dominant genotype) 분석을 포함할 수 있다.

즉, 서열번호 2, 8, 10 및 16의 다형성 부위가 각각 유전자형이 C/C, A/A, C/C, 및 G/G 가 하나 이상 존재하는 경우 자폐증에 걸릴 위험도가 높은 것으로 판단할 수 있으며, 공우성 모형에서도 유의하므로 위험대립인자인 C, A, C 및 G를 가지고 있을 경우 자폐증에 걸릴 위험도가 높은 것으로 판단할 수 있다. 또한 서열번호 3, 5 및 18의 다형성 부위가 각각 유전자형이 A/A, A/A, 및 A/A 가 하나 이상 존재하는 경우 자폐증에 걸릴 위험도가 높은 것으로 판단할 수 있다. 또한 서열번호 4, 17 및 19의 다형성 부위의 유전자형이 각각 G/G와 A/G, T/T와 C/T, 및 C/C와 T/C 가 하나 이상 존재하는 경우 자폐증에 걸릴 위험도가 높은 것으로 판단할 수 있으며, 공우성 모형에서도 유의하므로 위험대립인자인 G, T, 및 C를 가지고 있을 경우 자폐증에 걸릴 위험도가 높은 것으로 판단할 수 있다. 또한 서열번호 9, 13 및 15의 다형성 부위가 각각 유전자형이 A/A, A/A, 및 T/T 가 하나 이상 존재하는 경우 자폐증에 걸릴 위험도가 높은 것으로 판단할 수 있다. 또한 서열번호 20은 위험대립인자인 G를 가지고 있을 경우 자폐증에 걸릴 위험도가 올라가는 것으로 판단할 수 있다. 상기 위험 대립 인자를 갖는 핵산 서열이 하나의 검체에서 많이 검출되면 될수록 위험군에서 속하는 확률은 더 높은 것으로 판단할 수 있다.

본 발명은 또한, 자폐증 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, (i) 검체로부터 핵산 시료를 얻는 단계; 및 (ii) 상기 핵산 시료로부터 반수체형(haplotype) 을 분석하는 단계를 포함하는, 검체 중의 단일염기다형을 검출하는 방법을 포함한다. 구체적으로, 상기 반수체형 분석은 상기 핵산 시료로부터, 서열번호 1 및 2의 DNA 서열의 다형성 부위로부터 결정되는 반수체형, 서열번호 6 및 7의 DNA 서열의 다형성 부위로부터 결정되는 반수체형, 또는 서열번호 8, 9, 11, 12, 13 및 14의 DNA 서열의 다형성 부위로부터 결정되는 반수체형을 분석함으로써 수행될 수 있다. 상기 서열번호 1 및 2의 DNA 서열의 다형성 부위는 각각 서열번호 1의 401번째 염기 및 서열번호 2의 301번째 염기를 말하며, 상기 서열번호 6 및 7의 DNA 서열의 다형성 부위는 각각 서열번호 6의 499번째 염기 및 서열번호 7의 301번째 염기를 말하고, 상기 서열번호 8, 9, 11, 12, 13 및 14의 DNA 서열의 다형성 부위는 각각 서열번호 8의 301번째 염기, 서열번호 9의 301번째 염기, 서열번호 11의 301번째 염기, 서열번호 12의 301번째 염기, 서열번호 13의 201번째 염기, 및 서열번호 14의 567번째 염기를 말한다.

즉, 서열번호 1 및 2의 DNA 서열의 다형성 부위로부터 결정된 반수체형 분석결과, GA 반수체형을 가지지 않는 경우 또는 GC 반수체형을 가지는 경우, 그렇지 않은 사람보다 자폐증에 걸릴 위험이 높은 것으로 판정할 수 있다. 또한, 서열번호 6 및 7의 DNA 서열의 다형성 부위로부터 결정된 반수체형 분석 결과, TC 반수체형을 가지고 있지 않은 사람이 이를 가지고 있는 사람보다 자폐증에 걸릴 위험이 높은 것으로 판정할 수 있다. 또한, 서열번호 8, 9, 11, 12, 13 및 14의 DNA 서열의 다형성 부위로부터 결정된 반수체형 분석 결과, AAGAAG 반수체형을 가지고 있는 사람이 이를 가지지 않는 사람보다 자폐증에 걸릴 위험이 높은 것으로 판정할 수 있 다 (표 6, 도 1-2 참조).

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예

1. 피검자 선정

자폐증 환자는 7 ∼ 22.5세로 2004년에서 2006년까지 3개의 특수학교의 외래환자 및 학생을 대상으로 180명을 선정하였으며, 이들 모두 DSM-IV(American Psychiatric Association, 1994), 임상 면접시험, 증후 등급(symptom rating)을 시행하였으며, Childhood Autism Rating Scale (CARS) 점수 30 이상의 환자를 선정하였다. 모든 진단은 독립된 2명의 경험 있는 정신과 의사 및 심리학자에 의해 수행 되었다. 대조군은 유전학적, 신경학적 병인이 없는 건강한 147명을 대상으로 선정 하였다. 모든 대상은 연구의 목적과 방법에 대한 설명을 한 후 서면 동의서를 통해 동의를 얻었으며, 자체 기관윤리위원회(Institutional Review Board, IRB)를 통과하였다. 선정된 총 327명으로부터 혈액을 채취하여, 혈액 내의 게놈 DNA(Genomic DNA)를 분리하여 실험에 사용하였다. 사용된 군집의 크기는 다음 표 1과 같다.

그룹	정상인	환자군	총합계
조사인원	147	180	327

2. 게놈 DNA 의 준비

게놈 DNA(genomic DNA; gDNA)를 준비하기 위하여 327명으로부터 혈액을 채취하였다. 혈액은 300 ul씩을 제공받았으며 게놈 DNA를 추출하기 위하여 Gentra사의 blood genomic DNA preparation kit를 사용하였다. 준비된 게놈 DNA는 GoldenGate Assay를 위해 Quant-iT^TM Picogreen dsDNA assay kit (Molecular Probes, Invitrogen)을 사용하여 250 ng/5 ul의 농도로 조정하였다.

3. 게놈 DNA 의 증폭 및 분석

Goldengate assay 방법에 따라, Sentrix array matrix chip을 사용하여 유전자형을 분석하였다. 일루미나사(Illumina Inc.)로부터 GoldenGate assay를 위한 모든 시약과 Sentrix array matrix chip을 구입하여 사용하였다. 모든 과정은 일루미나사의 GoldenGate assay 방법에 따라 시행하였다.

게놈 DNA 시료(250 ng/5 ㎕)는 96웰 플레이트에서 5 ul의 GS#-MS1 시약과 혼합하였다. 플레이트를 밀봉하고 250×g에서 1 분 동안 원심분리하고, 95 ℃ heat block에서 30 분간 반응시켰다. 여기에 5 ul GS#-SUD를 넣고 혼합한 후 5 ul 2-프로판올(2-propanol)을 넣고, 다시 혼합한 후에 3,000×g에서 20분 동안 원심분리한 후 상등액을 제거하고 펠렛을 건조시켰다. 건조된 DNA는 10 ul의 GS#-RS1 시약을 넣고 잘 풀어주었다. 여기에 10 ul의 GS#-OPA와 30 ul의 GS#-OB1를 넣고, 잘 혼합한 후 70℃ heat block에 넣고 30℃가 될 때까지 천천히 식혔다. GS#-ASE 플레이트를 마그네틱 플레이트 위에 올리고 2분간 방치하였다. 상등액을 제거하고, 50 ul GS#-AM1을 넣어주고 잘 혼합하였다. 마그네틱 플레이트 위에 올리고 2분간 방치한 후 상등액을 제거하고, 50 ul GS#-AM1을 넣어주고 잘 혼합하였다. 위와 동일한 방법으로 50 ul GS#-UB1로 세척 후, 상등액을 제거하고, 37 ul GS#-MEL을 넣어주고 잘 혼합한 후에 45℃에서 15분간 배양(incubation)하였다. 위 플레이트를 다시 마그네틱 플레이트 위에 올리고 2분간 방치한 후 상등액을 제거하고, 50 ul GS#-UB1을 넣어주었다. 다시 위 과정을 반복하고, 35 ul GS#-IP1을 넣어주고 잘 혼합한 후 95℃ heat block에서 1분간 배양(incubation)하였다. 플레이트를 마그네틱 플레이트 위에 올리고 2분간 방치하였다. 상등액 30 ul를 GS#-PCR 플레이트에 옮긴 후 64 ul의 illumina-recommended DNA polymerase와 100 ul UDG를 GS#-MMP tube에 넣어준후 잘 섞어주고, 표 2에 나타낸 조건으로 증폭시켰다.

	온도	각 온도에서의 시간
	37℃	10 min
	95℃	3 min
34 사이클	95℃	35 sec
	56℃	35 sec
	72℃	2 min
	72℃	10 min
	4℃	5 min

반응 후에 20 ul의 GS#MPB를 넣고 잘 혼합한 후, 96웰 필터 플레이트에 옮기고, 암실에서 60분 동안 방치하였다. 필터 플레이트 어댑터를 96웰 V-bottom에 놓고, 원심분리하여 상등액을 제거하였다. 다시 필터 플레이트에 50 ul GS#-UB2를 넣고 1000 x g에서 5 분간 원심분리하였다. 30 ul의 GS#_MH1가 들어있는 GS#-INT 플레이트를 필터 플레이트 위에 놓고, 30 ul의 0.1N NaOH를 필터 플레이트에 넣었다. 1000 xg에서 5 분간 원심분리하여 PCR 생산물을 수거하였다.

칩을 GS#-UB2와 NaOH에서 전 처리하고, 수거한 PCR 산물을 384웰에 옮기고 여기에 전처리한 칩을 올렸다. 60 ℃에서 30 분 동한 혼성화시키고 다시 온도를 45℃로 바꾸고 14시간 이상 혼성화시켰다. GS#UB2, GS#IS1에서 세척한 후에 상온에서 건조시킨 후, 분석을 위해서 이미지 스캐닝(image scanning)을 실시하였다.

유전자형 분석 이미지 파일로부터의 유전자형의 분석은 Illumina사의 Beadstudio (version 2.3.41.16318)를 사용하여 각 다형성에 대한 유전자형를 확인하였다. Beadstudio는 두 개의 대립인자를 인식하는 프로브들 사이의 발색의 세기에 대한 비율을 가지고 전형적인 유전자형의 패턴을 나타낸다.

4. 통계학적 분석

각각의 단일염기다형들에 대한 유전자형은 Haploview software (version 53.32) 와 SAS statistical software (SAS Institute, Cary, NC)를 이용하여 결과를 분석하였다. 유의성의 검정을 위한 유의수준은 5%로 하여 P 값이 0.05 이하인 경우에만 유의성을 두었다.

각각의 단일염기다형 결과로부터 소수 대립인자 빈도 (Minor Allele Frequency; MAF)가 5% 이상인 것으로 기준을 두었으며, 하아디-와인버그 평형 (Hardy-Weinberg Equilibrium ; HWE) 검정을 카이제곱 분석을 통해 시행하여 유의수준 (p value) >0.05 이상을 나타내는 단일염기다형들을 선택하였다. 여기서 선택된 결과로부터 대립형질 (alleles)과 유전형질 (genotypes)에 대하여 질병에 대한 연관성을 오즈 비 (Odds Ratio; OR)를 통해 구하였고 두 집단 간의 유의성 있는 차이를 나타내는지를 검정하였다. 오즈 비(Odds Ratio)는 로지스틱 회귀모형을 통하여 산출하였으며 우성 (Dominant), 열성 (Recessive) 및 공우성(Co-Dominant) 모형을 적용하였다. 각 모형에 따른 질병과의 유의성을 분석함에 있어 다수 대립인자를 A1이라 하고 소수 대립인자를 A2라 하면 우성 (Dominant) 모형은 A1A1의 빈도와 A1A2와 A2A2의 빈도에 대한 합을 비교하는 것이고, 열성 (Recessive) 형질 모형은 A1A1과 A1A2의 합과 A2A2의 빈도를 비교하는 것이고, 공우성 (Co-Dominant) 형질 모형은 A1A1, A1A2 및 A2A2에 대한 각각의 빈도를 비교하는 것이다.

두 개 이상의 단일염기다형성이 연관 비평형을 이루며, 하나의 그룹을 형성하는데, 이를 연관 비평형 블록(Linkage Disequilibrium Block)이라 한다. 연관 비평형 블록은 Gabriel이 제안한 방법을 통하여 확인하였다 (Gabriel SB, Schaffner SF, Nguyen H, Moore JM, Roy J, Blumenstiel B, et al. The structure of haplotype blocks in the human genome. Science;296:2225-2229 (2002)). 연관 비평형 블록들로부터 형성되는 유전적 단위체는 각 단일염기다형의 유전자형 분석으로부터 그 유형이 결정되는데, 이를 반수체형(Haplotype)이라고 한다. Haploview를 사용하여 유전자 단위에서 밀접한 연관성을 나타내는 단일염기다형들간의 연관비평형 검정 (Linkage disequilibrium; LD)을 시행하였으며, 이로부터 얻어지는 반수체형 (Haplotype)이 질병에 어떠한 연관성을 오즈비를 통해 검정하였다. 또한 연관비평형 검정에 의한 각 단일염기다형들의 연관성에 대해서는 르완톤의 (Lewontin's) ｜D'｜ 및 r ² 측정을 사용하였다.

5. 결과

(1) MTHFR , AUTS2 , RELN , LAMB1 , WNT2 , FOXP2 , 및 ST7 유전자에 존재하는 유의성을 나타내는 단일염기다형

자폐증과 관련된 후보 유전자군으로서 MTHFR, AUTS2, RELN, LAMB1, WNT2, FOXP2, 및 ST7을 선정하여, 상기 유전자형 분석을 통하여 얻어진 결과를 분석한 결과, 놀랍게도 수많은 단일염기다형 중, MTHFR, AUTS2, 및 WNT2 유전자는 각각 2개의 단일염기다형, RELN 유전자는 3개의 단일염기다형, LAMB1 유전자는 9개의 단일염기다형, FOXP2 및 ST7 유전자는 각각 1개의 단일염기다형이 통계학적으로 유의성이 있는 것으로 나타났다. 이들 단일염기다형의 다형성 부위의 특성은 다음 표 3과 같다.

서열번호	Reference SNP ID	대립인자	염색체 지역	위치	유전자	SNP역할	아미노산 변화
1	rs2274976	G>A	1p36.3	11785193	MTHFR	exon11	Gln->Arg
2	rs1801131	A>C	1p36.3	11788742	MTHFR	exon7	Ala->Glu
3	rs736477	A>G	7q11.22	69570924	AUTS2	intron	변화없음
4	rs2293503	A>G	7q11.22	69694776	AUTS2	intron	변화없음
5	rs13232021	A>G	7q22	102735098	RELN	intron	변화없음
6	rs362646	T>C	7q22	102869754	RELN	intron	변화없음
7	rs2072402	C>A	7q22	102885872	RELN	intron	변화없음
8	rs7561	C>A	7q22	107158317	LAMB1	3'UTR	변화없음
9	rs7797759	C>A	7q22	107158958	LAMB1	intron	변화없음
10	rs13646	T>C	7q22	107159089	LAMB1	intron	변화없음
11	rs2237685	G>A	7q22	107168735	LAMB1	intron	변화없음
12	rs10271464	G>A	7q22	107173554	LAMB1	intron	변화없음
13	rs2158836	G>A	7q22	107174790	LAMB1	intron	변화없음
14	rs740287	T>G	7q22	107178731	LAMB1	intron	변화없음
15	rs4730283	C>T	7q22	107187940	LAMB1	exon22	Arg->Gln
16	rs1548638	G>T	7q23	107198769	LAMB1	intron	변화없음
17	rs936145	C>T	7q31	113891131	FOXP2	intron	변화없음
18	rs12706126	A>G	7q31.1-q31.3	116185759	ST7	5'-flanking UTR	변화없음
19	rs6948009	T>C	7q31	116510364	WNT2	3'-flanking UTR	변화없음
20	rs3779548	A>G	7q31	116524846	WNT2	intron	변화없음

ㆍ서열번호는 각 단일염기다형을 나타내는 서열번호이다.

ㆍReference SNP ID는 표준단일염기다형의 명칭 (Reference SNP ID; rs)을 의미하며, 이는 인간게놈프로젝트 후, 미국 국립보건원 산하 생물공학정보연구소 (NCBI)의 데이터베이스에서 각 단일염기다형을 구분하기 위하여 붙인 이름이다.

ㆍ염색체 지역은 염색체를 특정 기법으로 염색했을 때 색깔에 따라 나누어지는 단위를 나타내고 있다. 이는 일명 G-band라고 불리고 있다.

ㆍ위치는 염색체상에서 표준염기서열의 위치를 의미한다(NCBI Genome build 36.2).

ㆍ유전자는 상기 단일염기다형들이 위치하고 있는 유전자를 나타낸다.

ㆍSNP 역할은 상기 단일염기다형들이 유전자상에서 어디에 위치하고 있는지를 나타내주고 있다. 따라서 각각의 단일염기다형들이 유전자의 발현과 기능에 있어서 어떻게 작용하는지를 알 수 있다.

ㆍ아미노산의 변화는 상기 단일염기다형들이 유전자가 발현되어 단백질을 생성할 때, 그 단백질을 이루는 아미노산에 변화를 주고 있는지에 대한 설명이다.

(2) 유전자형( genotype ) 및 위험대립인자 분석

표 4는 서열번호 1 내지 20의 소수대립인자 빈도와 각 유전형의 수와 그 빈도를 나타내며, 표 5a 및 5b는 표 4의 각 유전형 빈도에 대하여 각 단일염기다형이 우성 (Dominant) 모형, 열성 (Recessive) 모형, 그리고 공우성 (Co-dominant, 불완전우성) 모형을 따라 자폐증과 연관성이 있는지를 검정한 결과와 위험 대립인자를 나타낸다. 위험대립인자는 이 대립인자를 가지고 있을 경우 자폐증에 걸릴 위험도가 높은 대립인자를 말한다.

서열번호	대립 인자	소수 대립인자 빈도		A1A1		A1A2		A2A2
		대조군	자폐증	대조군	자폐증	대조군	자폐증	대조군	자폐증
1	G>A	0.09	0.10	123(83.67)	145(80.56)	23(15.65)	35(19.45)	1(0.68)	-
2	A>C	0.20	0.28	94(63.95)	96(54.24)	48(32.65)	64(36.16)	5(3.40)	17(9.60)
3	A>G	0.09	0.05	122(82.99)	163(90.56)	24(16.33)	16(8.89)	1(0.68)	1(0.56)
4	A>G	0.38	0.49	54(36.73)	42(23.33)	73(49.66)	99(55.00)	20(13.61)	39(21.67)
5	A>G	0.27	0.23	76(51.70)	113(62.78)	63(42.86)	52(28.89)	8(5.44)	15(8.33)
6	T>C	0.42	0.49	48(32.65)	43(23.89)	75(51.02)	97(53.89)	24(16.33)	40(22.22)
7	C>A	0.14	0.14	109(74.15)	133(73.89)	34(23.13)	45(25.00)	4(2.72)	2(1.11)
8	C>A	0.13	0.19	110(74.83)	122(67.78)	36(24.49)	48(26.67)	1(0.68)	10(5.56)
9	C>A	0.13	0.19	97(74.05)	121(68.75)	33(25.19)	44(25.00)	1(0.76)	11(6.25)
10	T>C	0.13	0.20	110(74.83)	123(68.33)	36(24.49)	42(23.33)	1(0.68)	15(8.33)
11	G>A	0.30	0.30	73(49.66)	88(48.89)	61(41.50)	76(42.22)	13(8.84)	16(8.89)
12	G>A	0.14	0.18	108(73.47)	127(70.56)	37(25.17)	43(23.89)	2(1.36)	10(5.56)
13	G>A	0.13	0.18	109(74.15)	126(70.00)	37(25.17)	44(24.44)	1(0.68)	10(5.56)
14	T>G	0.15	0.20	105(71.43)	119(66.11)	39(26.53)	51(28.33)	3(2.04)	10(5.56)
15	C>T	0.14	0.20	107(72.79)	117(65.36)	38(25.85)	51(28.49)	2(1.36)	11(6.15)
16	G>T	0.32	0.24	71(48.30)	101(56.11)	59(40.14)	70(38.89)	17(11.56)	9(5.00)
17	C>T	0.07	0.12	127(86.39)	137(76.11)	18(12.24)	42(23.33)	2(1.36)	1(0.56)
18	A>G	0.20	0.14	93(63.27)	134(74.44)	50(34.01)	41(22.78)	4(2.72)	5(2.78)
19	T>C	0.15	0.23	106(72.11)	105(58.33)	39(26.53)	68(37.78)	2(1.36)	7(3.89)
20	A>G	0.34	0.41	60(40.82)	56(31.11)	74(50.34)	100(55.56)	13(8.84)	24(13.33)

자폐증환자와 정상인에 대한 각 단일염기다형의 HWE와 로지스틱 회귀분석

서열번호	HWE		모형	OR (95% CI)	p-value	위험대립인자
1	대조군	0.09	공우성	-	-	-
	자폐증	0.15	우성	-	-
			열성	-	-
2	대조군	0.71	공우성	1.53 (1.06∼2.20)	0.023	C
	자폐증	0.20	우성	1.50 (0.96∼2.34)	0.078
			열성	3.02 (1.09∼8.39)	0.034
3	대조군	0.88	공우성	0.55 (0.30∼1.02)	0.058	A
	자폐증	0.39	우성	0.51 (0.26∼0.98)	0.045
			열성	0.81 (0.05∼13.13)	0.885
4	대조군	0.55	공우성	1.61 (1.16∼2.24)	0.005	G
	자폐증	0.18	우성	1.91 (1.18∼3.09)	0.009
			열성	1.76 (0.97∼3.17)	0.061
5	대조군	0.27	공우성	0.81 (0.57∼1.15)	0.240	A
	자폐증	0.02	우성	0.63 (0.41∼0.99)	0.044
			열성	1.58 (0.65∼3.84)	0.313
6	대조군	0.56	공우성	1.37 (0.99∼1.90)	0.055	-
	자폐증	0.29	우성	1.54 (0.95∼2.51)	0.079
			열성	1.46 (0.84∼2.57)	0.183
7	대조군	0.50	공우성	0.94 (0.60∼1.48)	0.803	-
	자폐증	0.40	우성	1.01 (0.62∼1.67)	0.957
			열성	0.40 (0.07∼2.22)	0.296
8	대조군	0.29	공우성	1.54 (1.01∼2.35)	0.047	A
	자폐증	0.08	우성	1.41 (0.87∼2.30)	0.163
			열성	8.59 (1.09∼67.89)	0.041
9	대조군	0.31	공우성	1.45 (0.94∼2.24)	0.090	A
	자폐증	0.02	우성	1.30 (0.78∼2.15)	0.312
			열성	8.67 (1.10∼67.99)	0.040
10	대조군	0.29	공우성	1.58 (1.06∼2.37)	0.026	C
	자폐증	0.00	우성	1.38 (0.85∼2.24)	0.197
			열성	13.27 (1.73∼101.64)	0.013

자폐증환자와 정상인에 대한 각 단일염기다형의 HWE와 로지스틱 회귀분석

서열번호	HWE		모형	OR (95% CI)	p-value	위험대립인자
11	대조군	0.96	공우성	1.02 (0.73∼1.43)	0.910	-
	자폐증	0.94	우성	1.03 (0.67∼1.59)	0.890
			열성	1.01 (0.47∼2.16)	0.989
12	대조군	0.56	공우성	1.28 (0.85∼1.94)	0.237	-
	자폐증	0.02	우성	1.16 (0.71∼1.88)	0.560
			열성	4.26 (0.92∼19.78)	0.064
13	대조군	0.26	공우성	1.39 (0.91∼2.11)	0.129	A
	자폐증	0.03	우성	1.23 (0.75∼2.00)	0.407
			열성	8.59 (1.09∼67.89)	0.041
14	대조군	0.78	공우성	1.34 (0.90∼2.00)	0.154	-
	자폐증	0.16	우성	1.28 (0.80∼2.06)	0.304
			열성	2.82 (0.76∼10.46)	0.120
15	대조군	0.50	공우성	1.50 (1.00∼2.26)	0.050	T
	자폐증	0.10	우성	1.42 (0.88∼2.28)	0.151
			열성	4.75 (1.04∼21.76)	0.045
16	대조군	0.38	공우성	0.70 (0.50∼0.99)	0.044	G
	자폐증	0.48	우성	0.73 (0.47∼1.13)	0.160
			열성	0.40 (0.17∼0.93)	0.034
17	대조군	0.16	공우성	1.74 (1.01∼2.99)	0.047	T
	자폐증	0.24	우성	1.99 (1.11∼3.57)	0.020
			열성	0.41 (0.04∼4.51)	0.462
18	대조군	0.37	공우성	0.67 (0.44∼1.02)	0.059	A
	자폐증	0.40	우성	0.59 (0.37∼0.95)	0.030
			열성	1.02 (0.27∼3.87)	0.975
19	대조군	0.45	공우성	1.79 (1.17∼2.73)	0.007	C
	자폐증	0.32	우성	1.85 (1.16∼2.94)	0.010
			열성	2.93 (0.60∼14.34)	0.184
20	대조군	0.14	공우성	1.42 (1.00∼2.01)	0.047	G
	자폐증	0.05	우성	1.53 (0.97∼2.41)	0.069
			열성	1.59 (0.78∼3.24)	0.205

ㆍHWE 상태는 하아디-와인버그 평형 (Hardy-Weinberg Equilibrium)의 상태를 나타내는 것이다. 카이제곱 (df=1) 검정에서 chi-value = 3.84(p-value=0.05, df=1)을 기준으로, 3.84보다 큰 경우에는 하아디-와인버크 평형 HWE (Hardy-Weinberg Equilibrium)으로 판단하고, 3.84보다 작은 경우에는 하아디-와인버그 비평형 (Hardy-Weinberg Disequilibrium)으로 판단하였다.

ㆍ오즈 비율 (odds ratio, OR)은 환자군 중에서 위험 대립인자를 가질 오즈에 대한 정상군 중에서 위험 대립인자를 가질 오즈의 비율을 나타낸다. 95% CI는 오즈 비율의 95% 신뢰구간을 나타내는 것으로, (하한 신뢰구간, 상한 신뢰구간)을 나타낸다. 신뢰구간은 1을 포함하는 경우에는 질병과의 연관성을 유의하다고 판단할 수 없다. 오즈비율이 1보다 크고 95%신뢰구간에 1이 포함되어 있지 않은 경우 소수 대립인자가 질환군에서 더 높은 빈도를 가지며, 오즈비율이 1보다 작은 경우에는 다수 대립인자가 질환군에서 더 높은 빈도를 가진다.

ㆍ위험 대립 인자 (risk allele)는 p-value에 유의성이 있는 경우 오즈비가 1 보가 크면 소수 대립인자, 오즈비가 1 보다 작으면 다수 대립인자로 하였다.

대립유전자 (Allele)는 대립형질들이 환자군가 정상인군 사이에서 출현되는 빈도수의 비율을 통하여 위험 대립인자가 질병에 어느 정도의 연관성 (위험도)를 가지고 있는지 확인할 수 있다. 95% 신뢰구간에 1을 포함하고 있을 경우 유의성이 없기 때문에, 상기 표 5로부터 확인할 수 있는 바와 같이, 서열번호 1, 6, 7, 11, 12, 및 14의 경우 유의성을 가지고 있지 않다. 따라서, 서열번호 2 내지 5, 8 내지 10, 13, 및 15 내지 20의 다형성 부위의 뉴클레오티드 서열이 각각 C, A, G, A, A, A, C, A, T, G, T, A, C, 및 C(위험 대립인자)인 것이 하나 이상 존재하는 경우, 자폐증 걸릴 가능성이 높은 것으로 판단할 수 있다

또한, 서열번호 2, 8, 10, 및 16은 공우성과 열성 모형에서 유의성을 보이며, 서열번호 2, 8, 및 10은 오즈비가 > 1로 유전자형(genotype)이 소수대립인자(Minor Allele)을 가지고 있는 사람이 다수대립인자(Major Allele)를 가지고 있는 사람보다 자폐증에 걸릴 위험이 더 높은 것으로 나타났다. 서열번호 16은 오즈비가 < 1로 유전자형(genotype)이 다수 대립인자를 가지고 있는 사람이 소수 대립인자를 가지고 있는 사람보다 자폐증에 걸릴 위험이 더 높은 것으로 나타났다.

서열번호 3, 5 및 18은 우성 모형에서 유의성을 보이며 오즈비가 < 1로서 유전자형이 다수 대립인자를 가지고 있는 사람이 소수대립인자 둘로 구성된 사람보다 자폐증에 걸릴 위험이 높은 것으로 나타났다.

서열번호 4, 17 및 19은 공우성과 우성 모형에서 유의성을 보이며 오즈비가 > 1로서 유전자형이 소수 대립인자를 가지고 있는 사람이 다수 대립인자 둘로 구성된 사람보다 자폐증에 걸릴 위험이 높은 것으로 나타났다.

서열번호 9, 13 및 15은 열성 모형에서 유의성을 보이며 오즈비가 > 1로서 두개의 소수 대립인자를 가지고 있는 사람의 경우 다수 대립인자를 하나 이상 가지고 있는 사람에 비해 자폐증에 걸릴 위험이 더 높은 것으로 나타났다. 서열번호 20은 공우성 모형에서 유의성을 보이며 오즈비가 > 1로서 소수 대립인자를 가지고 있을수록 자폐증에 걸릴 위험이 더 높은 것으로 나타났다.

상기 결과로부터, 서열번호 2, 8, 10 및 16의 다형성 부위가 각각 유전자형이 C/C, A/A, C/C, 및 G/G 가 하나 이상 존재하는 경우 자폐증에 걸릴 위험도가 높은 것으로 판단할 수 있으며, 공우성 모형에서도 유의하므로 위험대립인자인 C, A, C 및 G를 가지고 있을 경우 자폐증에 걸릴 위험도가 높은 것으로 판단할 수 있다. 또한 서열번호 3, 5 및 18의 다형성 부위가 각각 유전자형이 A/A, A/A, 및 A/A 가 하나 이상 존재하는 경우 자폐증에 걸릴 위험도가 높은 것으로 판단할 수 있다. 또한 서열번호 4, 17 및 19의 다형성 부위의 유전자형이 각각 G/G와 A/G, T/T와 C/T, 및 C/C와 T/C 가 하나 이상 존재하는 경우 자폐증에 걸릴 위험도가 높은 것으로 판단할 수 있으며, 공우성 모형에서도 유의하므로 위험대립인자인 G, T, 및 C를 가지고 있을 경우 자폐증에 걸릴 위험도가 높은 것으로 판단할 수 있다. 또한 서열번호 9, 13 및 15의 다형성 부위가 각각 유전자형이 A/A, A/A, 및 T/T 가 하나 이상 존재하는 경우 자폐증에 걸릴 위험도가 높은 것으로 판단할 수 있다. 또한 서열번호 20은 위험대립인자인 G를 가지고 있을 경우 자폐증에 걸릴 위험도가 올라가는 것으로 판단할 수 있다. 상기 위험 대립 인자를 갖는 핵산 서열이 하나의 검체에서 많이 검출되면 될수록 위험군에서 속하는 확률은 더 높은 것으로 판단할 수 있다.

서열번호 1은 자폐증 환자군에서 소수 대립인자 둘로 구성된 유전형이 발견되지 않아 분석이 이루어 지지 않으며, 서열번호 6, 7, 11, 12, 및 14는 연관성이 없는 것으로 나왔으나 서열번호 3을 포함하는 위 단일염기 다형성들은 연관불균형으로부터 반수체형을 확인하여 연관성을 분석한 결과 유의한 반수체형을 얻었다 (도 1 및 2 참조).

(3) 반수체형 분석

표 6 및 도 1은 서열번호 1 내지 20에 대한 다형성 부위간의 연관성을 나타내며 도 2는 이를 토대로, 도 1로부터 형성된 연관 비평형 블록(Linkage Disequilibrium Block)으로부터 유전자형의 분석결과와 대비하여 형성된 반수체형(Haplotype)을 나타낸다. 표 7은 각 블록의 반수체형에 대한 자폐증과의 연관성 검정 결과이다.

	｜D'｜
		block	block1
	block	서열 번호	1	2
r 2	block1	1		0.973
		2	0.294

	｜D'｜
		block	block2		block3
	block	서열 번호	6	7	8	9	11	12	13	14
r 2	block2	6		1	-	-	-	-	-	-
		7	0.137		-	-	-	-	-	-
	block3	8	-	-		0.976	1	0.965	0.988	0.965
		9	-	-	0.941		0.936	0.951	0.975	0.963
		11	-	-	0.082	0.075		1	1	0.88
		12	-	-	0.911	0.883	0.08		0.988	1
		13	-	-	0.944	0.918	0.079	0.966		1
		14	-	-	0.835	0.827	0.071	0.877	0.867

연관불균형 블록	반수체형		대조군(%)	자폐증(%)	모델	OR (95% CI)	p-value
Block1	ht1	ht/ht	94(63.95)	95 (53.67)	공우성	1.55(1.08∼2.24)	0.018
	G-A	-/ht	48(32.65)	65 (36.72)	우성	1.53(0.98∼2.40)	0.062
		-/-	5(3.40)	17 (9.60)	열성	3.02(1.09∼8.39)	0.034
	ht2	ht/ht	1(0.68)	6 (3.39)	공우성	0.54(0.34∼0.86)	0.009
	G-C	-/ht	31(21.09)	54 (30.51)	우성	0.20(0.02∼1.64)	0.133
		-/-	115(78.23)	117 (66.10)	열성	0.54(0.33∼0.89)	0.017
	ht3	ht/ht	1(0.68)	-	공우성	0.93(0.53∼1.64)	0.805
	A-C	-/ht	23(15.65)	32 (18.08)	우성	-	-
		-/-	123(83.67)	145 (81.92)	열성	0.88(0.49∼1.58)	0.678
Block2	ht4	ht/ht	24 (16.33)	40 (22.22)	공우성	0.73(0.53∼1.01)	0.055
	C-C	-/ht	75 (51.02)	97 (53.89)	우성	0.68(0.39∼1.20)	0.183
		-/-	48 (32.65)	43 (23.89)	열성	0.65(0.40∼1.05)	0.079
	ht5	ht/ht	30 (20.41)	21 (11.67)	공우성	1.33(0.96∼1.83)	0.082
	T-C	-/ht	69 (46.94)	92 (51.11)	우성	1.94(1.06∼3.56)	0.032
		-/-	48 (32.65)	67 (37.22)	열성	1.22(0.77∼1.93)	0.390
	ht6	ht/ht	4 (2.72)	2 (1.11)	공우성	1.06(0.68∼1.65)	0.803
	T-A	-/ht	34 (23.13)	45 (25.00)	우성	2.49(0.45∼13.79)	0.296
		-/-	109 (74.15)	133 (73.89)	열성	0.99(0.60∼1.62)	0.957
Block3	ht7	ht/ht	45 (30.61)	47 (26.11)	공우성	1.27(0.92∼1.74)	0.142
	C-C-G-G-G-T	-/ht	77 (52.38)	90 (50.00)	우성	1.25(0.77∼2.02)	0.368
		-/-	25 (17.01)	43 (23.89)	열성	1.53(0.88∼2.65)	0.129
	ht8	ht/ht	12 (8.16)	16 (8.89)	공우성	1.01(0.72∼1.41)	0.975
	C-C-A-G-G-T	-/ht	58 (39.46)	68 (37.78)	우성	0.91(0.42∼1.99)	0.816
		-/-	77 (52.38)	96 (53.33)	열성	1.04(0.67∼1.61)	0.864
	ht9	ht/ht	1 (0.68)	10 (5.56)	공우성	0.74(0.49∼1.14)	0.172
	A-A-G-A-A-G	-/ht	36 (24.49)	41 (22.78)	우성	0.12(0.01∼0.92)	0.041
		-/-	110 (74.83)	129 (71.67)	열성	0.85(0.52∼1.39)	0.521

도 1에서 알 수 있는 바와 같이, 서열번호 1과 2가 연관 비평형 블록(block1)을 형성하였으며, 서열번호 6과 7이 연관 비평형 블록(block2)을 형성하였다. 또한, 서열번호 8, 9, 11, 12, 13 및 14에서 연관 비평형 블록(block3)이 형성되었다. 도 2로부터 첫 번째 블록인 서열번호 1과 2로 구성된 블록(block1)은 GA(ht1), GC(ht2) 및 AC(ht3) 형태의 반수체형이 나타냈으며, 두 번째 블록인 서열번호 6과 7로 구성된 블록(block2)은 CC(ht4), TC(ht5) 및 TA(ht6) 형태의 반수체형이 나타냈으며, 서열번호 8, 9, 11, 12, 13 및 14로 구성된 세 번째 블록(block3)에서는 CCGGGT(ht7), CCAGGT(ht8), 및 AAGAAG(ht9) 형태의 반수체형을 보였다. 도2를 보면 각 블록 내에서 상위에 있는 반수체형이 나타나는 빈도가 높다. 표 6은 도 1에 나타난 각 단일염기다형 간의 연관비평형 블록의 조밀함을 수치화하여 나타낸 것으로 ｜D'｜과 r² 값을 나타내고 있다. 표 7은 우성 모형, 열성 모형, 그리고 공우성(불완전우성) 모형을 따라 자폐증과 연관성이 있는지를 검정한 결과이다. block1에서 ht1(GA)와 ht2(GC) 반수체형이 공우성과 열성 모형에서 유의성을 보여, 각각 반수체형 ht1과 ht2를 가지고 있는 않은 사람이 가지고 있는 사람보다 자폐증에 걸릴 위험이 높은 것으로 나타났다. block2에서 ht5(TC)와 block3에서 ht9(AAGAAG) 반수체형이 우성모형에서 유의성을 보여, 각각 반수체형으로 ht5와 ht9를 가지고 있는 사람이 그렇지 않은 사람보다 자폐증에 걸릴 위험이 높은 것으로 나타났다.

상기 결과로부터, 서열번호 1 및 2의 DNA 서열의 다형성 부위로부터 결정된 반수체형 분석결과, GA 반수체형을 가지지 않는 경우 또는 GC 반수체형을 가지는 경우, 그렇지 않은 사람보다 자폐증에 걸릴 위험이 높은 것으로 판정할 수 있다. 또한, 서열번호 6 및 7의 DNA 서열의 다형성 부위로부터 결정된 반수체형 분석 결과, TC 반수체형을 가지고 있지 않은 사람이 이를 가지고 있는 사람보다 자폐증에 걸릴 위험이 높은 것으로 판정할 수 있다. 또한, 서열번호 8, 9, 11, 12, 13 및 14의 DNA 서열의 다형성 부위로부터 결정된 반수체형 분석 결과, AAGAAG 반수체형을 가지고 있는 사람이 이를 가지지 않는 사람보다 자폐증에 걸릴 위험이 높은 것으로 판정할 수 있다.

도 1a MTHFR 유전자의 연관비평형 블록을 나타낸다.

도 1b RELN 및 LAMB1 유전자의 연관비평형 블록을 나타낸다.

도 2a MTHFR 유전자의 연관비평형 블록으로부터 유전자형의 분석결과와 대비하여 형성된 반수체형을 나타낸다.

도 2b RELN 및 LAMB1 유전자의 연관비평형 블록으로부터 유전자형의 분석결과와 대비하여 형성된 반수체형을 나타낸다.

<110> College of Medicine Pochon CHA University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Polynucleotides comprising single nucleotide polymorphism, microarrays and diagnostic kits comprising the same, and detection methods using the same <160> 20 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 801 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 cttccctggg cgagagatca tccagcccac cgtagtggat cccgtcagct tcatgttctg 60 gaaggtaaag gagccggggg caagcttgcc ccgcccacct ggaaaaccgt ggggagggat 120 tgggaccaag tcccaagcgt gtgctgaagg ccacactgga cccagccttc agggcacacc 180 cagctctgac tcacccatgt cactgctgat gcagggtgtt tatttctggg caggggtggg 240 aagtgatact ggcagtgggc cttgttctat tccgggaaat gtcctgttga gcagagccct 300 tggagagccc tgttaatctt gcctctgtgt gtgtgtgcat gtgtgcgtgt gtgcgggggt 360 atgtgtgtgt aggacgaggc ctttgccctg tggattgagc rgtggggaaa gctgtatgag 420 gaggagtccc cgtcccgcac catcatccag tacatccacg acaactactt cctggtcaac 480 ctggtggaca atgacttccc actggacaac tgcctctggc aggtggtgga agacacattg 540 gagcttctca acaggcccac ccagaatgcg agagaaacgg aggctccatg accctgcgtc 600 ctgacgccct gcgttggagc cactcctgtc ccgccttcct cctccacagt gctgcttctc 660 ttgggaactc cactctcctt cgtgtctctc ccaccccggc ctccactccc ccacctgaca 720 atggcagcta gactggagtg aggcttccag gctcttcctg gacctgagtc ggccccacat 780 gggaacctag tactctctgc t 801 <210> 2 <211> 601 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 tgcagacctt ccttgcaaat atatctttgt tcttgggagc gggagggcag aagaagtttg 60 catgcttgtg gttgacctgg gaggagtcag gggcagaatt tacaggaatg gcctcctggg 120 catgtggtgg cactgccctc tgtcaggagt gtgccctgac ctctgggcac ccctctgcca 180 ggggcaattc ctcttcccct gcctttgggg agctgaagga ctactacctc ttctacctga 240 agagcaagtc ccccaaggag gagctgctga agatgtgggg ggaggagctg accagtgaag 300 maagtgtctt tgaagtcttt gttctttacc tctcgggaga accaaaccgg aatggtcaca 360 aagtgagtga tgctggagtg gggaccctgg ttcatcccct gcccctggcc tgaccccagc 420 tgcaggccag gctgcggggc tgtgacttcc ccatcctgtg ccctcccctc catgctgtgg 480 acatggcaaa gggagaaggg taagttggga gacctccacc tggaagggct tagggaggca 540 aagacaggct gggtctttgt tgggggccgt gagagggact cagggtgcca aacctgatgg 600 t 601 <210> 3 <211> 601 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 agacactatt attcccattt cacagataaa gctaaggaag ttgcccaagg tcacagactg 60 atcaggtagc ggagctacaa cagcaagatc tgagtccaaa gcgtgtgtgt ttcaggatgt 120 cctcacactg ccaccctcct cccaccctgg tcacctgcca cagggagcga ctattcactc 180 aacagtcctc ctgaattttc ctgcctgcat ctcaaccctc attttcacat tttccagggg 240 actaccttcc cctcattcct gcaacctaat tctacctgtg aagcccccta cgctttgaag 300 ygcatccaag aaacaccttc ctgaagaaga tggcctcaga cgccgccagg gagagtttgt 360 gtttcttctg aaacaaccta tgttctgcct ggaatttcag ctgcttctgt cctggtcttc 420 tttctcctgt caggtaatta ggcggcatct agaatgccag ctaatctcca ttcaaatgcc 480 ggctctggag tgaatgataa cagtccactg tctgtgctga tgttctagta ggggagaaag 540 acaaataaaa gtcaacaaat gaataaagaa ggtaattgca gggtgtgaca tgtgtcatga 600 g 601 <210> 4 <211> 801 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 aatgcctgaa tctgcctgta cacttgcaga tgggatcgaa tacacaaagg ccacacaaag 60 catgcacctt tattaggaag agactcattt atcggggcag tgagatgtag aataactcct 120 ctccataacg tcagcttgtg tttctttccg cttcctagag gtgacctttg ctatggggca 180 agagctcacc atcttcttcc aatgggcagg aacaggctgt tgtaaactcg gattccctga 240 gataccaagg aatggctctc acccactgca ccatgggaag ttcaggcaga accactgccg 300 agcacagctc tactaccgaa agaatgcggt gtaagagatg aaatctggaa gctggacggg 360 atgtactgaa actcctaaga gagcaccatc tcctgcctaa rtggtaagca gggtatctgg 420 gactcccacc agcttgcccg gaggtgcagc gggagcatgg taaacacagc agggttgcct 480 gaagcacaca tctcagttcc cattattttg ggcgactcac ctaggtgggc agcagggttg 540 aggaagttgc tgtgatgagg aggtggccca aaaggggtcc cagttgggtg tgcagcacct 600 gttaagtcaa acataacgaa accagagttt acaaaaagcc aacttcgaag atgcaaccgg 660 cttctacttg cttaagggcc ccgtgagaaa atatgttcaa gggaggtcat ggctgaagtc 720 cacccaggcc cctgcaggca agacacaggg taaaagaaaa tgtgtgtttt tttttttttt 780 tttttttttt tttttttagg a 801 <210> 5 <211> 401 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 agtatttatc atttgtaatc catatagtct ggctcatttt atgaactgga taaactgtac 60 tagaacttga tcctaatatt cttgtactta ggaaacataa gacattttta aagtttctat 120 tcaaaggatt ttctttcctg ggggacccaa aggacattgt tatagattat gtctcataca 180 taagttggtt cctaggcatg rcccatgatg tgagtaatgc gtcttgtcca gggctttacc 240 cttaccttca gagtgtgggt caagtagcag tttggccctg agtatcccgg atcacagatg 300 cactgttccc ttaagcaatc tccatggccc ctgcagttgt ccaagcatcc agggcccagg 360 tagaaattat cgattgccca ctgcatgtct gagtacttct g 401 <210> 6 <211> 699 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 tacttttctc tctttttttt ttgagacagt ctcgctctgt cgccaggttg gagtacaatg 60 gtgcaatctc ggctcactgc aatctctgcc tgccgggttc aagcaattct cctgcctcag 120 cctcctgagt agctgggact acaggtgcgc accaccacac ccagcttttt ttttcgtatt 180 tttagtagag acagggtttc accatgttga ccaggatggt ctcaatctcc tgacctcgtg 240 atctgcctgc ctcggcctcc caaactgctg ggattacagg catgagccac tgcgcccagc 300 ctacttttct cttgatgctt ataagcatca aaatatttcc cttagatcca tatttaaaac 360 tatgacaata aattccttca aatgatcaga agtcagtggg acaaatggat gggttggctt 420 ggtagttttt cactgcaaga cacatcaatc tttgtgcgct ccatctgtca atggaaaaat 480 atctagaatt ttataccayt tgaattatga tttccccagg agaagatttc actctacaac 540 catttttcca aatgctttcc aacatacctg ggctcatgat agctgagata tgaataatgc 600 tccaggagtt tccaagttat cccattatca taagaataat gcaacaaaac tccttcacca 660 ggctgatcag gggctctgca cgtgctcaga acagatttg 699 <210> 7 <211> 601 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 cttattctgt aatgtggcaa gtattttata taatcatctt taattctcct aatagccccc 60 aatgaggtat attaaatctt taattataca gaaaaaagtg gaaagtcagg gagagtaaat 120 atgattacac agaatggaat ccaggtccaa tttcaaaatt taactttctt ccattttttc 180 tatgctgcat ttctctataa gtagcgtggc aataaccaca gaactgccat atagaattta 240 agttcatgca gtccaaaata taagtcaagt acataaagaa tgaatggcct tacaaatgtt 300 mattgtaatc ttgcatccag tttaccaaag atactatctt tctttctttc ttttttacaa 360 gaccactttt aaagaggtta ggtttcttac ctattatgac aaaaatgcta atttcaggat 420 aactcattga tttttattct gcaacatgga ttcaagtatt tcaatatctc agagagaatg 480 tactcaccca ctgtagtttt cagaggagta gacagtgctg tgggggaggt ggggtccagc 540 acagatctca ggtaagcatt cagtgtgaag gagggaccag gagcgcccat ggttggtaga 600 a 601 <210> 8 <211> 601 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 8 tttcacacag gcttattttt taaattactt taaggcatcc atagtttatt taaaagtgaa 60 aaatatattc actttgtctt gagatcatca tagtataaat tgctcagact ttatatatat 120 atatatctcc acagatttag aaagaaaata tgaagacaat caaagatact tagaagataa 180 agctcaagaa ttagcaagac tggaaggaga agtccgttca ctcctaaagg atataagcca 240 gaaagttgct gtgtatagca catgcttgta acagaggaga ataaaaaatg gctgaggtga 300 mcaaggtaaa acaactacat tttaaaaact gacttaatgc tcttcaaaat aaaacatcac 360 ctatttaatg tttttaatca cattttgtat ggagttaaat aaagtacagt gcttttgtat 420 atattttggt gtacttgtta ctttcactga ttgttgatga atcccttttt tcactgtaaa 480 cgtggattta taaacaagtt tactgcgtcc atgaagaccc taatttatgt tgtctataaa 540 caagctatta tatttatttg acaggtaaac atcctccaaa actccacacc cttgactccc 600 c 601 <210> 9 <211> 601 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9 gctaaaagag tttttgcttc attttgtagc atttcggctt tccttctggc atcagctgac 60 tcttcagttt ttttggcaat taaattttct acttttttat acttttcatc aagttcacca 120 tctaaagtct atagttccac atttagacag aaagaagtgg taatgttagt gtcagtaatt 180 acatttaaga gcaatagtgt aatcatggca tgcattctgg attaagggcc accaaggata 240 ttcactggta agtaatttaa aattttatct tcaaacagtg gaattgaatg caaaattgac 300 mtgattttaa agaacatttc aaaaaattct ggagttgcag caaatcctta gggctaagtc 360 ctcattctcc tgattattac ttttctatag aaaagttgta gcataattgt attgcaaatt 420 acatagagaa gcgcagattt ttcaaaagta gattagacat tagagaagcc catattgaag 480 aagtggaggc tctttggatc ttgactaaat taggatttgt gaagacttgc ttataaggaa 540 atcagaggaa aaagattaaa caaaagatac aggaaggaaa ggtgagattg tagcatatgc 600 a 601 <210> 10 <211> 601 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 10 tagttccaca tttagacaga aagaagtggt aatgttagtg tcagtaatta catttaagag 60 caatagtgta atcatggcat gcattctgga ttaagggcca ccaaggatat tcactggtaa 120 gtaatttaaa attttatctt caaacagtgg aattgaatgc aaaattgacc tgattttaaa 180 gaacatttca aaaaattctg gagttgcagc aaatccttag ggctaagtcc tcattctcct 240 gattattact tttctataga aaagttgtag cataattgta ttgcaaatta catagagaag 300 ygcagatttt tcaaaagtag attagacatt agagaagccc atattgaaga agtggaggct 360 ctttggatct tgactaaatt aggatttgtg aagacttgct tataaggaaa tcagaggaaa 420 aagattaaac aaaagataca ggaaggaaag gtgagattgt agcatatgca agaagtgagt 480 gaggagaaga gaaatggggt gtggggttgg aatgcaaatg attcttttta gaaactgttc 540 aaatagccat ttatggaaat ttcatttcaa gagattttgt tcctttctct tgtgataaaa 600 t 601 <210> 11 <211> 601 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 11 gatggagaga attggcattt catgcttcat aactttgtct cctgttagct gcaatttaca 60 cattgctcta agccttcatt tttctttttt cttcatcttt tatttttcca tttaataaat 120 gacagattat ttgctcccta tttgctataa agtttcagaa gataatgagt atgaaaccta 180 gcaggcatca ataaacactg tcttatattg tgaccaattt tgtctatttc agagaaagtg 240 atgagaggag ggaggaagca tcactaagac aaagctgtaa tgaagtttga actcttctgc 300 rcctatgtac cttccatctt taactttctc tgtgtctctg ggctaagaga acacaaacct 360 tagtctataa aaaataccct ccaaattatt tcacataggt atccttcctt gaaaacacag 420 gaaggaagag gaagaaacag gctcagttag gcttttttgg ggccttctgc ctgattttca 480 ttaaactcac aacccaattt catttggctc cagagttcct ttttaaaagc ttctgggaaa 540 tgaatctact ttctaggctg gtttcagggt taatcttcac caggtaaagt tactggaaca 600 a 601 <210> 12 <211> 601 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 12 tgacatcaag gtccagttac tttaaatcta ggtctaggaa ggacctcctt caagtcgctt 60 gagctaatgt cagctgtcct ctgctactca tgcctggtat gagatgaaaa gtccctctgg 120 cttcttaaag gtgctgatta aagtctcatc acacacaaaa aatgttactg tcatttcgtc 180 atataaacac ctcagtgtgc aggatttaac tgtgaagcag tcccctcagg cctagatggt 240 gagtctgcag tgaaaaaacc atagcatcta gggaagcaca gatgcctcat acccttttct 300 rtttttgtcc tttagcactt aggtcttatt gtgctgtttt gggggttcct ttttggcaaa 360 aggagttggg atgtttaggg gcaagagagg ggaggtagga gaaagggtag ataaatgatc 420 cttgagaagg tcaattctct aggcttccac taacaaacac tgtccaatca gagggaagat 480 tacctagaga aggggtggga tgaggacttt tcagcataga gcagctgtta taactagatg 540 aatgaagcac tggtctggtg gactaatggc ggagaagcag aaaaaacttg aagtaagcag 600 t 601 <210> 13 <211> 617 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 13 agagagcaaa gcactggtgg cagggtgtgc agtcagggaa gacccccgag taccctcgcg 60 tgcacttgtc acagcgtgga ccctcaacac cctcaacgca gacacactgg cccgtggact 120 ggtcacactg tggcgtctca atgcccctgg ggtcacagtc acaggctaga agggaataag 180 caatgctagc tgatctactt ratcatgaac ctcagtgaca agatgtggca tttagaatac 240 tcacttcact gtgaaaatgg gaaggtgtca accatcgaca acaattgacc aatggctcag 300 gtagagactg tagcagcttc ctctagcaca tgcgtgactt cagtggttgc taaccccttc 360 ttagcagtaa taatacttta aacagaaatg ttttatatga atgatcccat ttaactctca 420 caataaccct atgggatacg tgttataata atcactattt cacagatgtg ggaactcaga 480 gatcagagag attatgtaac atgccccaag tctcactgca aggaaaaggc cacgccagaa 540 ttctgattca gttctttgca actccggagt ctatactctt cacctccgtc ctgcctttgc 600 ctccccctta cttagga 617 <210> 14 <211> 809 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 14 tgtttctgcc cgccttctgt atattagaga aaaaaagaga gcatgtgcgt gtgtgtgtat 60 ctgtgtgtct gtgtgagaga tggagaaaga gatacccttc aaaaggtgga gctggagcag 120 aatcacgact tcggaagttc agcaatgtag gctgatgcac aaatctcagg acttacgtaa 180 cagaggaaga agtgatgcca tttgtaataa aacttacctt gtctaccagc cagtggtcag 240 ggtgaggcag ccctctgggg cctactcacc catctccctt agacttgaca caactgaggc 300 agagttgcat atgcttatag tttgcttaga caattatttc tttcccatag atgatgcaaa 360 ggtatacctt tgttcagtcc taaacattag gtttttgctg gattcatgct tggggcaagg 420 gatgcatgca tacgttgatt tatttttaat ttctgtgatc atttttcatt tatttcgttg 480 ccaaagacat gtcttgctcc cattctgtca taggcatctt taaggggaaa acagcccaac 540 cctgaaagac ttaaaaggca gataagkctt ccctctttat ctggccgagg gaaattagcc 600 tgggtaagag ttccaatgag ctagcagagc ttcggctctc tccagaagtc aacaaccagt 660 tcagccaaac tgaccaacat tcctttctcc cacctgaaaa gtaaaccatc aaatctcaca 720 gatgaccgga ttgcagtgtc attattgaaa aagttgggcc tgactctccg ggaaggcacc 780 aataactagt ttaaatgtac caaggtttt 809 <210> 15 <211> 601 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 15 ctactcggga ggctgaggca tgagaatcac ttgaactctg gaggcagagg ttatagtgag 60 ctgagatcat gccactgcac tccagcctgg gtgatagagt gagactctgt ctcattaaaa 120 aaaaaaaaaa aattggtctc atctttcctt agttgaaagt gaaattttac ctctctgaac 180 aagtgttttc ccaagtgaaa taaatacagg aagaataaaa tctgctgata atgaaaaaaa 240 ggtggaagtc attctaagaa gtgggcagaa taaatgtgca tcttacttcg acagtcctgc 300 yggagggcat caccatagta tccaaaccgg cagaactgac agtgttcccc ttccgtgtgg 360 tacaggcact tgagacacct cccagtctcc ttgtcacagg cttctgggtc tgtcgtgtca 420 atgttgttgt gacactggca aggctgacac gaccccccaa cttctgatgg attgccaaag 480 tatcctgagg cacagtcgtc acatctggaa cctgtcaccc gataaaacca aacacaagat 540 gtttagctta ttgactgaaa gctcaccagt gcaccgacac tcatgcctag agagagctga 600 t 601 <210> 16 <211> 1280 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 16 ttggggatga atagatgaaa aaatatcctt gcctcagtat ttaccatgct aggttgataa 60 ctttggagca taagtagaga gaagaaaagt ttcttgtaaa gacacatttc ttaaaccaac 120 caaaagcctt atcagtgaat gctccaaagc caatttgtga gtkatagaat tacttagctt 180 taaatatgac tcttctcagg aaggcatggt cctgatcctt attttgtgct cactgacaaa 240 gctataaaaa tgcttctgaa atggggtctt tacaaagcat gtatgttcca ctacacccca 300 aaacactgct ttaccgacct gccacacact cccctactca caggccccaa gttggcttcc 360 tccgcttcat agaggtagtg atccagggtg gcaaagtagt aaccaggttc cacttcgttg 420 cactgacgtc caatcatgtg aggccggcat gagcactggc ctgactccgc aaagcaactg 480 gaagggagga ggagccacat cagctgagtt catggtcacg cgagtcaacc cgccagaagc 540 agctctacag ctgccattac tcagtacaca ggaccaaata catagcatgt tcttgttttc 600 ttcagaaaat acatatgtgg aaaaaagtag tgcctatgga ttaatcccaa actccagaag 660 cgtggctgag aacctggtct tctcggtttt acctcccttg ccctctcttg actaacacgc 720 cgtccgcatc acatgaaggt tttccacatc ccaaaccttc ttgctttggc atgttacatc 780 ttttgcttat ttcctgagat ttaggctcaa atatccagct ccctgaagaa catctccagc 840 ttggctgtcc cagagcatcc caaaccaacg gatctaagac agaagccctc aatccctcgg 900 atggtctcta tcagggtgaa ggcactacca cctgctgagt caaccaagtc agaaatttag 960 tccccgttct tctccagatt ctttcttcac actccatcag gaaccaaatt ctgtgatttt 1020 tacttctgca tcttgtgtct ctcttccccc tttccattgg ctatgctatg ctaaatataa 1080 gaaatgcggc tgggcacggt ggctcacgcc tgtaatctca gcactttggg aggccgagac 1140 aggcggatca cctgaggttg ggagttcgag accagcctca ccaacatgga gaaaccccat 1200 ctctactaaa aatacaaaat tagctgggcg tggtggcgca ggcctgtaat cccagatact 1260 tgggaggctg aggcacgaga 1280 <210> 17 <211> 601 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 17 aacaatcatt tgtggcatgt gttaacaaat ataatgaaat 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caggattgag gaaaacagac tcagtcctta 300 tcctcgtggt gtcatcgact tcatggtcct tgaagcagta gccaggcact gggacacagt 360 ctaggtgctg gagaaccctc acactggggc aggaaagtgg tggtgtttag gtttcagtcc 420 ttgttgcatt gctctgttat aaggtcttat cttatatatg tcattttgac aaggtaaaga 480 ataagttatt catctccttc tgctttgac 509

Claims (12)

1. 서열번호 5의 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서, 201번째 염기 (다형성 부위)가 A이고, 상기 201번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 (이하, "폴리뉴클레오티드 (e)"라 함) 또는 그의 상보적 뉴클레오티드.
2. 제1항에 있어서, 길이가 10 내지 100 뉴클레오티드인 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드.
3. 제1항 또는 제2항에 따른 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드로 이루어진, 자폐증 진단을 위한 증폭용 프라이머.
4. 제1항 또는 제2항에 따른 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드로 이루어진, 자폐증 진단용 프로브.
5. 제4항에 따른 자폐증 진단용 프로브를 포함하는 마이크로어레이.
6. 제1항 또는 제2항에 따른 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 자폐증 진단용 키트.
7. 자폐증 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, (i) 검체로부터 핵산 시료를 얻는 단계; 및 (ii) 상기 핵산 시료로부터, 서열번호 5의 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 뉴클레오티드의 다형성 부위의 염기 서열을 분석하는 단계((단, 상기 다형성 부위는 서열번호 5의 DNA 서열 중 201번째 염기를 말한다)를 포함하는, 검체 중의 단일염기다형을 검출하는 방법.
8. 제7항에 있어서, 상기 다형성 부위의 염기 서열을 분석하는 단계가 서열번호 5의 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드 서열로서 다형성 부위를 포함하는 서열(단, 상기 다형성 부위는 201번째 염기를 말한다)을 주형으로 하는 프라이머 또는 프로브를 이용하여 수행되는 것을 특징으로 하는, 검체 중의 단일염기다형을 검출하는 방법.
9. 제7항에 있어서, 상기 다형성 부위의 뉴클레오티드 서열을 분석하는 단계가 서열번호 5의 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서 201번째 염기가 A이고, 상기 201번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 뉴클레오티드가 고정된 마이크로어레이에 상기 핵산 시료를 혼성화시키는 단계; 및 얻어진 혼성화 결과를 분석하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 검체 중의 단일염기다형을 검출하는 방법.
10. 제9항에 있어서, 상기 마이크로어레이에 고정되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 뉴클레오티드의 DNA 서열의 길이가 각각 10 내지 100 뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는, 검체 중의 단일염기다형을 검출하는 방법.
11. 제7항에 있어서, 상기 다형성 부위의 염기 서열을 분석하는 단계가 서열번호 5의 다형성 부위의 우성 유전자형(dominant genotype) 분석을 포함하는 것을 특징으로 하는, 검체 중의 단일염기다형을 검출하는 방법.
12. 자폐증 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, (i) 검체로부터 핵산 시료를 얻는 단계; 및 (ii) 상기 핵산 시료로부터, 서열번호 6 및 7의 DNA 서열의 다형성 부위로부터 결정되는 반수체형을 분석하는 단계 (단, 상기 서열번호 6 및 7의 DNA 서열의 다형성 부위는 각각 서열번호 6의 499번째 염기 및 서열번호 7의 301번째 염기를 말한다)를 포함하는, 검체 중의 단일염기다형을 검출하는 방법.

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