JP2004161664A - プロポリス組成物 - Google Patents
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Abstract
【課題】長期間服用しても安全で種々の優れた生物活性を有するプロポリスの有用な用途を提供すること。
【解決手段】ケルセチン、ｐ−クマール酸及びアルテピリンＣを含有し、さらにクリシン、ガランギン若しくはカフェイン酸フェネチルエステルを含有することを特徴とするプロポリスを含むアンジオテンシンＩＩ受容体拮抗用組成物、アドレナリンβ２受容体作動化用組成物、アドレナリンβ２受容体作動化組成物、女性ホルモン様組成物、エンドセリン拮抗組成物、セロトニン再吸収阻害組成物、セロトニン放出促進組成物、セロトニン容体拮抗組成物その他の用途。本発明の用途限定組成物は含有されている成分に由来するする生物活性を有し、食品、医薬、化粧料等に有用である。
【選択図】 なし
【解決手段】ケルセチン、ｐ−クマール酸及びアルテピリンＣを含有し、さらにクリシン、ガランギン若しくはカフェイン酸フェネチルエステルを含有することを特徴とするプロポリスを含むアンジオテンシンＩＩ受容体拮抗用組成物、アドレナリンβ２受容体作動化用組成物、アドレナリンβ２受容体作動化組成物、女性ホルモン様組成物、エンドセリン拮抗組成物、セロトニン再吸収阻害組成物、セロトニン放出促進組成物、セロトニン容体拮抗組成物その他の用途。本発明の用途限定組成物は含有されている成分に由来するする生物活性を有し、食品、医薬、化粧料等に有用である。
【選択図】 なし
Description
【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明は、プロポリスを含有する組成物の用途に関する。
【０００２】
【従来の技術】
プロポリスとは、働き蜂が植物の若芽などの樹液を採取し、自らの唾液と混合して生産する物質であり、樹脂成分、芳香油、ミツロウ、揮発油、花粉、ミネラル等を含有する物質である。
このプロポリスは、蜂の巣への外敵の侵入を防ぐ防御柵としての機能を有し、巣の割れ目を塞ぐ際の補強剤としての機能を有すると共に、小動物や昆虫等の死骸を覆って腐敗を防止するために用いられていることが知られている（特許文献１）。
このように多様な機能を有するプロポリスは、ヒトにおいても抗炎症作用、抗潰瘍作用、抗菌作用、抗酸化作用等の広範な生理活性を有することが認められており、感染症、潰瘍、動脈硬化等の疾病の治療及び予防に役立つと考えられていることから、健康食品として広範に利用されている。しかしながら、プロポリスの生理活性については、必ずしも十分に検討されているとはいい難く、更なる解明とそれを利用した用途の開発が望まれていた。
【０００３】
近年、多くの研究者により産地別プロポリスの成分に関する研究が進められている。例えば、ブラジル産プロポリスは主成分として、ｐ−クマル酸をはじめ、プレニル基を持つアルテピリンＣ（ａｒｔｅｐｉｌｌｉｎ Ｃ）やドルパニン（ｄｒｕｐａｎｉｎ）、（Ｅ）−プレニル−４−（２，３−ジヒドロシナモイルオキシ）桂皮酸）、（（Ｅ）−３−ｐｒｅｎｙｌ−４−（２，３−ｄｉｈｙｄｒｏｃｉｎｎａｍｏｙｌｏｘｙ）ｃｉｎｎａｍｉｃ ａｃｉｄ）、（Ｅ）−３−（２，２−ジメチル−８−プレニル−２Ｈ−ベンゾピラン−６−イル）−２−プロペノン酸、（（Ｅ）−３−（２，２−ｄｉｍｅｔｙｌ−８−ｐｒｅｎｙｌ−２ｈ−ｂｅｎｚｏｐｙｒａｎ−６−ｙｌ）−２−ｐｒｏｐｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ）などの桂皮酸誘導体が多く検出される。一方、中国産、日本産、オーストラリア産、ウルグアイ酸などのプロポリスは、地域（国）によって成分の含有量に違いがあるものの、主な成分や組成については類似したパターンを示し、主な成分としてクリシン（ｃｈｒｙｓｉｎ）やピノセンブリン（ｐｉｎｏｃｅｍｂｒｉｎ）、ガランギン（ｇａｌａｎｇｉｎ）、ピノバンクシン−３−アセテート（ｐｉｎｏｂａｎｋｓｉｎ−３−ａｃｅｔａｔｅ）、ピノバンクシン（ｐｉｎｏｂａｎｋｓｉｎ）などのフラボノイド類が多く検出される。これらの主な成分の違いから、ブラジル産プロポリスは「桂皮酸誘導体中心のタイプ」であり、中国産など他のプロポリスは「フラボノイド中心のタイプ」であることが定性的に示されている（非特許文献１）。
【０００４】
このようにブラジル産プロポリスと中国産プロポリスの成分が全く異なるという状況にも関わらず、現在上市されているプロポリス関連商品のほとんどがブラジル産プロポリスであり、中国産プロポリスはほとんど上市されていない。現在、市場においてはブラジル産プロポリスの方が品質や生物活性の面から見て優れていると考えられているが、これに関する確かな根拠は全く無い。一方、熊澤らは、産地別プロポリスのポリフェノール含有量と抗酸化活性を測定し、総ポリフェノール量と抗酸化活性とは概ね相関があることを明らかにし、ブラジル産よりも中国産などの地域（国）のプロポリスの方が抗酸化活性が高いことを示している（非特許文献２、非特許文献３）。
【０００５】
【特許文献１】
特開平９−１４９７６５
【非特許文献１】
田澤茂実ら：生薬学雑誌、５４（６），１６４−１６８，２０００
【非特許文献２】
熊澤茂則、中山勉：ミツバチ科学、２２（１），１−８，２００１
【非特許文献３】
熊澤茂則：ＦＯＯＤ Ｓｔｙｌｅ ２１、５（１０），５４−５８，２００１
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、プロポリスの成分とその生理活性の関係を明らかにし、プロポリスの新たな用途を提供することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上述した課題を解決するために鋭意検討を行い、ブラジル産プロポリスと中国産プロポリスに含まれる成分の含有量及び生物活性に着目し、本発明を完成させた。
【０００８】
すなわち、本発明は、ケルセチン、ｐ−クマール酸及びアルテピリンＣを含有し、さらにクリシン、ガランギン若しくはカフェイン酸フェネチルエステルを含有することを特徴とするプロポリスを含むアンジオテンシンＩＩ受容体拮抗用組成物、アドレナリンβ２受容体作動化用組成物、女性ホルモン様組成物、エンドセリン拮抗用組成物、セロトニン再吸収阻害用組成物、セロトニン放出促進用組成物、セロトニン容体拮抗用組成物、セロトニントランスポーター受容体結合阻害用組成物、ブラジキニン受容体拮抗用組成物、オキシトシン拮抗用組成物、ニコチン性アセチルコリン受容体作動化用組成物、ムスカリン性アセチルコリン受容体作動化用組成物、ドーパミン１受容体作動化用組成物、ベンゾジアゼピン受容体作動化用組成物、γ−アミノ酪酸受容体作動化用組成物、グルココルチコイド様作用組成物、メラトニン受容体作動化用組成物、メラトニン受容体拮抗用組成物、カルシウムチャンネル阻害用組成物、メラトニン凝集ホルモン受容体拮抗用組成物、アンジオテンシン変換酵素阻害用組成物、トロンボキサンＡ２合成酵素阻害用組成物、一酸化窒素合成酵素阻害用組成物及びヒト免疫不全ウイルスプロテアーゼ阻害用組成物である。また、本発明は、プロポリスが、ケルセチン当量が４．５８ｍｇ／ｍｌ以上で、ｐ−クマール酸を１．１６ｍｇ／ｍｌ以上、アルテピリンＣを６．７３ｍｇ／ｍｌ以上、クリシンを０．８４ｍｇ／ｍｌ以上、ガランギンを０．５３ｍｇ／ｍｌ以上及びカフェイン酸フェネチルエステルを０．８１ｍｇ／ｍｌ以上を含有するプロポリスであることを特徴とする前記いずれかの組成物、プロポリスが、産地の異なるプロポリス又はそれらの抽出物を少なくとも２種以上を含むプロポリスである前記いずれかのプロポリス組成物、前記のいずれかの組成物を含む経口用組成物又は非経口用組成物、食品である前記の経口用組成物、医薬である前記の経口用組成物又は非経口用組成物及び化粧料である前記の非経口用組成物である。
【０００９】
【発明の実施形態】
本発明におけるプロポリスは、ケルセチン、ｐ−クマール酸及びアルテピリンＣを含有し、さらにクリシン、ガランギン若しくはカフェイン酸フェネチルエステルを含有する。
【００１０】
ケルセチンは、レタス、ブロッコリー、タマネギなどの植物性食品に広く存在している典型的なフラボノール型フラボノイドであり、種々の生理作用を示すことが明らかとなっている。ケルセチンはケルセチン当量で４．５８ｍｇ／ｍｌ以上であることが好ましい。
【００１１】
ｐ−クマール酸は、３−（４−Ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−２−ｐｒｏｐｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ（３−（４−ヒドロキシフェニル）−２−プロピオン酸）のことであり、分子式 Ｃ９Ｈ８Ｏ３、分子量 １６４．１６、融点 ２１０−２１３℃、ｐＫａ値 ９．４５（２５℃）である。スモモ（Ｐｒｕｎｕｓ ｓｅｒｏｔｉｎａ）の果皮、ムラサキツメクサ（Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ ｐｒａｔｅｎｓｅ）等に多く含まれている。ｐ−クマール酸の量は１．１６ｍｇ／ｍｌ以上であることが好ましい。
【００１２】
アルテピリンＣは、４−Ｈｙｄｒｏｘｙ−３，５−ｄｉｐｒｅｎｙｌｃｉｎｎａｍｉｃ ａｃｉｄ（４−ヒドロキシ−３，５−ジプレニル桂皮酸）のことであり、分子式 Ｃ１９Ｈ２４Ｏ３、分子量 ３００．３９７、融点 ９５℃、１５０−１５２℃であり、ヨモギ属（Ａｒｔｅｍｉｓｉａ ｓｐｐ．）、バカリス属（Ｂａｃｃｈａｒｉｓ ｓｐｐ．）等に多く含まれているものである。アルテピリンＣの量は６．７３ｍｇ／ｍｌ以上であることが好ましい。
【００１３】
クリシンは、５，７−Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｆｌａｖｏｎｅ（５，７−ジヒドロキシフラボン）のことであり、分子式 Ｃ１５Ｈ１０Ｏ４、分子量 ２５４．２４２、融点 ２８５−２８６℃、２９０℃（２７５℃）、ｐＫａ値９．０５、７．４２（２０℃、５０％エタノール）である。ニレ（Ｕｌｍｕｓ ｓｉｅｂｏｌｄｉａｎａ）、ソリザヤノキ（Ｏｒｏｘｙｌｕｍ ｉｎｄｉｃｕｍ）の蕾、マツ属（Ｐｉｎｕｓ ｓｐｐ．）及びタツナミソウ属（Ｓｃｕｔｅｌｌａｒｉａ ｓｐｐ．）に多く含まれている。クリシンの量は０．８４ｍｇ／ｍｌ以上であることが好ましい。
【００１４】
ガランギンは、３，５，７−Ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙｆｌａｖｏｎｅ（３，５，７−トリヒドロキシフラボン）のことであり、分子式 Ｃ１５Ｈ１０Ｏ５、分子量 ２７０．２４１、融点 ２１４−２１５℃、２１７−２１８℃である。カレーの香辛料の一つとして使用されているガランガル（Ａｌｐｉｎｉａｏｆｆｉｃｉｎａｒｕｍ）の根茎に多く含まれている。ガランギンの量は０．５３ｍｇ／ｍｌ以上であることが好ましい。
【００１５】
カフェイン酸フェネチルエステルは、３−（３，４−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−ｃａｆｆｅａｔｅ（３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−カフェート）のことであり、分子式 Ｃ１７Ｈ１６Ｏ４、分子量 ２８４．３である。カフェイン酸フェネチルエステルの量は０．８１ｍｇ／ｍｌ以上であることが好ましい。
【００１６】
本発明におけるプロポリスは、代表的には、産地の異なるプロポリス或いはその抽出物を２種以上混合して得られる。混合するプロポリスの産地は、所望の成分が得られるものであれば特に限定されず、例えば、ブラジル産プロポリス、中国産プロポリス、オーストラリア産プロポリス、ウルグアイ産プロポリス、日本産プロポリスなどが使用できるが、含有する成分や種々の生物活性、汎用性等の面から見てブラジル産及び中国産プロポリスを混合することが好ましい。異なる産地のプロポリス又はプロポリスエキスの混合比率は特に限定されるものではないが、例えば、中国産プロポリスエキスとブラジル産プロポリスエキスの場合、重量比で、０．１：９９．９〜９９．９：０．１、好ましくは、１：２〜２：１が適当である。
【００１７】
プロポリスは、プロポリス自体を乾燥させた乾燥物、その粉砕物、超臨界抽出物、水あるいはアルコール、エーテル、アセトンなどの有機溶媒による粗抽出物、および粗抽出物を分配、カラムクロマトなどの各種クロマトグラフィーなどで段階的に精製して得られた抽出物画分など、全て使用することができる。これらは単独で用いても良く、また２種以上混合して用いても良い。例えば、ブラジル産プロポリス及び中国産プロポリスの原塊乾燥物それぞれ１Ｋｇに、９９．５％エタノール抽出液３Ｌを加え、室温で一晩浸漬することにより得た抽出液を、そのまま或いはそれらを混合して使用しても良いし、各種クロマトグラフィーを組み合わせて、精製したものを使用しても良い。
【００１８】
抽出されたプロポリスの溶液中のプロポリス抽出物濃度は特に制限はないが、通常１５〜７０質量％、好ましくは２０〜６０質量％程度である。この濃度が１５質量％未満では、乾燥時に多量のエタノールや水などの溶液を蒸発させる必要があり、７０質量％を超えると溶液の粘度が高くなり過ぎ、加工適性が悪くなる恐れがある。
【００１９】
本発明のプロポリス組成物はアンジオテンシンＩＩ受容体拮抗作用を有することから、血圧降下用とすることができる。アドレナリンβ２受容体作動化作用を有することから、平滑筋弛緩、グリコーゲン分解、グルカゴン分泌促進、血管拡張、気管支拡張、糖代謝・脂質代謝の改善、及び血圧降下、気管支喘息の改善用とすることができる。女性ホルモン様作用を有することから、抗骨粗鬆症、更年期障害の改善、前立腺癌、前立腺肥大症、乳癌・子宮癌の予防、思春期の後発症のざ瘡の改善用として用いることができる。エンドセリン拮抗作用を有することから、高血圧の治療、心疾患・脳循環疾患・腎疾患の治療、喘息、潰瘍、糖尿病の治療用として使用できる。
【００２０】
また、本発明のプロポリス組成物はセロトニン再吸収阻害、セロトニン放出促進、セロトニン受容体拮抗、セロトニントランスポーター受容体結合阻害作用を有することから、鬱病などのセロトニンが関与した疾患の治療用とすることができる。ブラジキニン受容体拮抗作用を有することから、血管拡張抑制、血管透過性増大抑制、低血圧の治療、疼痛の治療、結合組織増大の抑制、髪の喪失の予防、止瀉、平滑筋弛緩、しゅさ性ざ瘡、末梢血管拡張、鼻瘤の治療、ケロイド形成の予防、及び消炎鎮痛、喘息、アレルギー性鼻炎の予防・治療用に用いることができる。オキシトシン拮抗作用を有することから、陣痛の抑制、早産の防止、月経困難症の予防・治療用に使用できる。ニコチン性アセチルコリン受容体作動化、ムスカリン性アセチルコリン受容体作動化、ドーパミン１受容体作動化、ベンゾジアゼピン受容体作動化及びγ−アミノ酪酸受容体作動化作用を有することから、精神分裂病、ツーレット症候群、注意欠如障害、不安などの中枢神経系疾患の治療、予防及び脳機能の改善、脳代謝賦活剤としての用途を有する。グルココルチコイド様作用を有することから、糖質代謝の改善、抗ストレス剤、抗炎症剤、アポトーシス誘導剤、免疫反応抑制剤として使用できる。メラトニン受容体作動化作用及び拮抗作用を有することから、メラトニンが関与する疾患、すなわち、概日リズム睡眠障害の予防、治療、炎症性腸障害、突発性便秘、過敏腸症候群に関連する消化運動性障害の予防、治療に有効である。
【００２１】
さらに、本発明のプロポリス組成物は、カルシウムチャンネル阻害作用を有することから、脳梗塞性疾患、偏頭痛性疾患、てんかん性疾患、精神病疾患、疼痛性疾患、血圧の降下、狭心症、不整脈の治療に使用することができる。メラニン凝集ホルモン受容体拮抗作用を有することから、肥満の予防用とすることができる。アンジオテンシン変換酵素阻害作用を有することから、血圧の降下に有効である。トロンボキサンＡ２合成酵素阻害作用を有することから、アレルギー性疾患、気管支喘息、アレルギー性鼻炎、血栓、心筋梗塞、脳梗塞及び狭心症の予防、治療用として使用できる。一酸化窒素合成酵素阻害作用を有することから、敗血症、エンドトキシンショック、心不全、ショック、低血圧、リウマチ性炎症、慢性関節リウマチ、変形性関節炎、潰瘍性大腸炎、ストレス性胃潰瘍、クローン病、自己免疫疾患、臓器移植後の組織障害、拒絶反応、虚血再灌流障害、急性冠微小血管塞栓、ショック性血管塞栓（汎発性血管内血液凝固症候群（ＤＩＣ）等）、虚血性脳障害、動脈硬化、悪性貧血、ファンコニー貧血症、鎌形赤血球性貧血病、膵炎、ネフローゼ症候群、糸球体腎炎、インスリン依存性糖尿病、肝性ポルフィリン症、アルコール中毒、パーキンソン病、慢性白血病、急性白血病、腫瘍、骨髄腫、抗癌剤副作用軽減、幼児および成人性呼吸窮迫症候群、肺気腫、アルツハイマー症、多発性硬化症、ビタミンＥ欠乏症、老化、サンバーン、筋ジストロフィー、白内障、インフルエンザ感染症、マラリア、ＡＩＤＳ、放射線障害、火傷、体外受精効率化等の予防、治療に使用できる。ヒト免疫不全ウイルスプロテアーゼ阻害作用を有することから、ヒト免疫不全ウイルスの感染の予防、後天性免疫不全症候群の予防、治療として使用することができる。
【００２２】
これら本発明におけるプロポリスを、例えば、チンキタイプのプロポリスとして製造することができる。例えば、ブラジル産及び中国産プロポリス原塊から、それぞれ、７０％含水エタノールを用いて抽出を行い、ロータリーエバポレーターを用いて濃縮することにより、固形分２０％のエタノール抽出物を得る。得られたそれぞれのエタノール抽出物を、重量比で１：１と成るように混合、攪拌し、その後、慣用の手段を用いて、重曹及び大豆レシチンを添加して一晩攪拌しながら混合することにより、チンキタイプのプロポリス組成物を製造することができる。
【００２３】
本発明の各種の用途が特定されたプロポリス組成物（以下、プロポリス組成物）は、経口用の食品、経口用あるいは非経口用の医薬としても製造することができる。
医薬としての適用方法は、経口投与又は非経口投与のいずれも採用することができる。投与に際しては、有効成分を経口投与、直腸内投与、注射などの投与方法に適した固体又は液体の医薬用無毒性担体と混合して、慣用の医薬製剤の形態で投与することができる。このような製剤としては、例えば、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤などの固形剤、溶液剤、懸濁剤、乳剤などの液剤、凍結乾燥製剤などが挙げられる。これらの製剤は製剤上の常套手段により調製することができる。上記の医薬用無毒性担体としては、例えば、グルコース、乳糖、ショ糖、澱粉、マンニトール、デキストリン、脂肪酸グリセリド、ポリエチレングルコール、ヒドロキシエチルデンプン、エチレングリコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、アミノ酸、ゼラチン、アルブミン、水、生理食塩水などが挙げられる。また、必要に応じて、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、結合剤、等張化剤などの慣用の添加剤を適宜添加することもできる。
【００２４】
食品としては、本発明のプロポリス組成物をそのまま、又は種々の栄養成分を加えて、若しくは飲食品中に含有せしめて、抗炎症作用や抗酸化作用などを有する保健用食品又は食品素材として使用できる。例えば、澱粉、乳糖、麦芽糖、植物油脂粉末、カカオ脂末、ステアリン酸などの適当な助剤を添加した後、慣用の手段を用いて、食用に適した形態、例えば、顆粒状、粒状、錠剤、カプセル、ペーストなどに成形して食用に供してもよい。また種々の食品、例えば、ハム、ソーセージなどの食肉加工食品、かまぼこ、ちくわなどの水産加工食品、パン、菓子、バター、粉乳、発酵乳製品に添加して使用したり、水、果汁、牛乳、清涼飲料などの飲料に添加して使用してもよい。本発明のプロポリス組成物の配合量は、当該食用組成物の種類や状態等により適宜設定される。
【００２５】
すなわち、保健用食品等として使用する本発明のプロポリス組成物の粉末組成物を製造する場合、例えば、ブラジル産プロポリス及び中国産プロポリスのそれぞれの原塊から７０％含水エタノールを用いて抽出したエタノール抽出液を、重量比で１：１に成るように混合し、この混合液１部に、まず、でんぷん０．１部〜０．５部、好ましくは０．３部を混合機にて攪拌した後、減圧濃縮して含水エタノールの約８０％を回収する。攪拌速度は１００〜５００ｒ．ｐ．ｍ．、好ましくは１５０〜３００ｒ．ｐ．ｍ．程度である。次に、この濃縮物にさらにでんぷん０．１〜０．５部、好ましくは０．３部と必要なら粉末セルロース０．０５部〜０．５部、好ましくは０．２部を加え、高速混合機にて２〜７時間、好ましくは５時間、十分に混合する。これにより製造された粗塊状の混合物を、棚式乾燥機にて３０〜７０℃の温度にて減圧加熱乾燥した後、チョッパー型粉砕機等で粉砕し、シフターにより篩い分けすることにより、プロポリス抽出物の粉末を製造することができる。なお、プロポリス組成物の粉末の粒度は特に制限はないが、４０メッシュパス程度が適当である。
【００２６】
本発明のプロポリス組成物の有効投与量は、患者の年齢、体重、症状、患者の程度、投与経路、投与スケジュール、製剤形態、素材の阻害活性の強さなどにより、適宜選択・決定されるが、例えば、経口投与の場合、一般に乾燥重量として１日当たり１０〜５００ｍｇ／ｋｇ体重程度、好ましくは、１日当たり１５０〜３５０ｍｇ／ｋｇ体重程度とされ、１日に数回に分けて投与してもよい。
【００２７】
さらに、上述のようにして得られたプロポリスの混合エタノール抽出物を、慣用の手段を用いて、化粧料を製造することができる。
本発明のプロポリス組成物を含有せしめて、化粧料又は化粧料素材として使用する場合、例えば、本発明のプロポリス組成物を小麦胚芽油或いはオリーブ油に添加して、抗炎症作用や抗酸化作用などを有する化粧料素材として使用することができる。プロポリス組成物の添加量は、特に限定されるものではないが、一例として挙げると、小麦胚芽油或いはオリーブ油の重量に対して０．１重量％以上６０重量％以下、好ましくは、０．５重量％以上５０重量％以下が適当である。
【００２８】
また、本発明のプロポリス組成物を直接、化粧料成分として使用し、抗炎症作用や抗酸化作用などを有する化粧料を製造することができる。化粧料には、植物油のような油脂類、高級脂肪酸、高級アルコール、シリコーン、アニオン界面活性剤、カチオン界面活性剤、両性界面活性剤、非イオン界面活性剤、防腐剤、糖類、金属イオン封鎖剤、水溶性高分子のような高分子、増粘剤、液体成分、紫外線吸収剤、紫外線遮断剤、ヒアルロン酸のような保湿剤、香料、ｐＨ調整剤、乾燥剤等を含有させることができる。ビタミン類、皮膚賦活剤、血行促進剤、常在菌コントロール剤、活性酸素消去剤、抗炎症剤、美白剤、殺菌剤等の他の薬効成分、生理活性成分を含有させることもできる。
【００２９】
化粧料としては、化粧水、乳液、クリーム、パック等の皮膚化粧料、メイクアップベースローション、メイクアップクリーム、乳液状又はクリーム状或いは軟膏型のファンデーション、口紅、アイカラー、チークカラーといったメイクアップ化粧料、ハンドクリーム、レッグクリーム、ボディーローション等の身体用化粧料等、入浴剤、口腔化粧料、毛髪化粧料とすることができる。本発明の方法で得られるプロポリス組成物を含有せしめた化粧料としては、機能面からは、例えば、化粧水、乳液、フェイスクリーム、ハンドクリーム、ローション、エッセンス、シャンプー、リンス等が好ましい。
このような化粧料は、常法に従って製造することができる。化粧料における本発明のプロポリス組成物の添加量は、特に限定されるものではないが、一例として挙げると、化粧料全重量の０．０１重量％以上２０重量％以下程度が適当である。
【００３０】
本発明のプロポリス組成物の毒性は低く、例えばブラジル産プロポリス及び中国産プロポリスの抽出物の混合物を毎日１０００ｍｇ／ｋｇ、１００日間という長期間に亘ってラットに経口投与しても、死亡例は認められず、体重変化も観察されなかった。
【００３１】
【実施例】
以下に実施例を挙げて、具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
製造例１
［プロポリス抽出物の製造］
ブラジル産及び中国産プロポリスをそれぞれ凍結粉砕し、パウダー化したプロポリス粉末１ｋｇに８０％含水エタノール（和光純薬工業）３Ｌを加え、攪拌器で１０時間混合攪拌した後、１２０時間静置して抽出した。これを２回繰り返して抽出したものを吸引ろ過器でろ過して、ロータリーエバポレーターを用いて濃縮することにより、固形分２０％のプロポリス抽出物を得た。
【００３２】
実施例１
［各種成分の定量］
アルテピリンＣ、ｐ−クマール酸、クリシン、ガランギン及びカフェイン酸フェネチルエステルの定量は、検量線を作成し、それに基づいて高速液体クロマトグラフィー（以下、ＨＰＬＣと略す）により定量した。
すなわち、製造例１で得られた各プロポリス抽出物を２ｍｌとり、これにメタノールを適量加えて超音波処理し、さらにメタノールを加えて５０ｍｌにメスアップする。この溶液をそのまま又は適宜希釈した後、ミリポアを用いてろ過した後に、これをＨＰＬＣ用試料とし、以下に示す条件にてそれぞれの成分を定量した結果を表２に示す。
ただし、標準物質としてのアルテピリンＣは和光純薬工業製、ｐ−クマール酸、クリシン、ガランギン及びカフェイン酸フェネチルエステルはシグマ社製のものを使用した。
【００３３】
【００３４】
（ｐ−クマール酸）
機種：ＬＣ−２０１０Ａ（株式会社 島津製作所）
検出器：紫外可視分光光度計 ＬＣ−２０１０Ａ（株式会社 島津製作所）
カラム：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＯＤＳ−Ａ 、Ａ−３１２、Φ６ｍｍ×１５ｃｍ（株式会社 ワイエムシィ）
移動相：２．５％酢酸、メタノール及びアセトニトリルの混液（５０：８：５ｖ／ｖ／ｖ）
測定波長：３２０ｎｍ
流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ．
カラム温度：４０℃
【００３５】
グラジエント条件は表１に示す。
【００３６】
【表１】
【００３７】
測定波長：３３０ｎｍ
流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ．
カラム温度：４０℃
（クリシン及びガランギン）
機種：ＬＣ−２０１０Ａ（株式会社 島津製作所）
検出器：紫外可視分光光度計 ＬＣ−２０１０Ａ（株式会社 島津製作所）
カラム：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＯＤＳ−Ａ 、Ａ−３１２、Φ６ｍｍ×１５ｃｍ（株式会社 ワイエムシィ）
移動相：５％ ギ酸、アセトニトリル及びメタノールの混液（２５：１０：１０ｖ／ｖ／ｖ）
測定波長：３６０ｎｍ
流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ．
カラム温度：４０℃
【００３８】
表２からもわかるように、ブラジル産プロポリスにはアルテピリンＣやｐ−クマール酸が多く含有されており、一方、中国産プロポリスにはカフェイン酸フェネチルエステルやクリシン、ガランギンが多く含有されており、ブラジル産及び中国産プロポリスの含有成分が大きく異なることがわかる。
【００３９】
【表２】
【００４０】
実施例２
アンジオテンシンＩＩ１型受容体結合試験
ヒトアンジオテンシンＩＩ１型受容体への結合試験評価は、Ｄｅｒｋ Ｊ．Ｂｅｒｇｓｍａらの方法（ＢＩＯＣＨＥＭＩＣＡＬ ＡＮＤ ＢＩＯＰＨＹＳＩＣＡＬ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＣＯＭＭＵＮＩＣＡＴＩＯＮＳ，１８３（３） ９８９−９９５，１９９２）を一部改変して行った。
［ＣＨＯ細胞へのヒトアンジオテンシンＩＩ１型受容体の発現］
ヒトアンジオテンシンＩＩ１型受容体プラスミド（ｐｈＡＴ１−３）を挿入した２２５０ベースペア（ｂｐ）のエンドヌクレアーゼ（Ｅｃｏ ＲＩ）を、ｐＣＪＢ３−８クローンを産生させるために、ベクターとしてｐＣＪＢ１１ｂ（ラウス肉腫ウイルスプロモーターに対してヒトシトマガロウイルスプロモーターを置換させたｐＲＪＢ誘導体）を発現したチャイニーズハムスター卵巣細胞（以下、ＣＨＯ細胞と略す）へ再クローニングした。
次に、このＣＨＯ細胞を２４時間以内に６０〜８０％にまで集密するまで、１０−ｍｍプレート上で培養した。その後、野生型Ｔ抗原をコードするＳＶ４０の起源欠損型突然変異体ＤＮＡ２５μｇを用いて形質転換させ、３７℃で一晩インキュベーションさせた後に細胞をトリプシン−ＥＤＴＡを用いてプレート上から剥離し、そして、新鮮な完全培地を用いて６ウェルプレート（３３−ｍｍ組織培養プレート）へ移した。そして、この細胞を受容体結合試験を行う２日前より、３７℃でインキュベーションした。
【００４１】
［ヒトアンジオテンシンＩＩ１型受容体への結合試験評価］
上述の細胞を３日間、形質転換させた後、本細胞を１０ｍＭの塩化マグネシウム、０．１％グルコース及び０．２％ウシ胎児血清を含むダルベコのリン酸塩緩衝液（以下、ＤＰＢＳ＋＋と略す）を用いて十分に洗浄する。その後、基質として４０〜５０ｐＭの［１２５Ｉ］標識した［ｓａｒ１，Ｉｌｅ８］アンジオテンシンＩＩ（以下、ＳＩＡと略す）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ社製、比活性：２２００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）を、製造例１で得られた５００μｇ／ｍｌの濃度のプロポリス組成物の存在化、非存在化で、ＤＰＢＳ＋＋１．０ｍｌ中で２５℃で６０分間反応させた。反応後、溶媒を除去し、迅速に細胞を氷冷しておいたＤＰＢＳ＋＋で３回洗浄し、細胞に結合した放射活性を１．０Ｎの水酸化ナトリウムを用いて溶解させた後に、γ−カウンター（８０％効力）（アロカ（株）社製）を用いて測定した。
また、ＳＩＡと１０μＭの非放射標識アンジオテンシンＩＩを用いて測定した値を、ブランク（非特異的結合）とし、データは、検量線を作成し、コンピューターソフトシステム（Ｌｕｎｄｏｎ−２ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｐｒｏｇｒａｍ；Ｌｕｎｄｏ Ｓｏｆｔｗａｒｅ社製）を用いて算出した。なお、本測定系におけるヒトアンジオテンシンＩＩ１型受容体拮抗剤であるｓａｒａｌａｓｉｎのＩＣ５０値は、１．９ｎＭ（１．７３×１０−３μｇ／ｍｌ）であった。
阻害率は、８０％であった。この結果から、強力にＳＩＡを阻害する、本発明のプロポリス組成物に強いアンジオテンシンＩＩ１型受容体拮抗作用を有することがわかる。
【００４２】
実施例３
アドレナリンβ２受容体作動化作用試験
モルモット肺由来アドレナリンβ２受容体への結合試験は、ＴＯＭＭＹ ＡＢＲＡＨＡＭＳＳＯＮらの方法（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃ．，３７（２）２０３−２０８（１９８８））を、一部改変して行った。
３５０−５００ｇ体重のモルモット（日本クレア（株））から、肺を摘出し、膜画分を調製した。膜画分の調製は、Ｖ．Ｎｅｒｍｅらの方法（Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｐｈａｒｍａｃ．，３４，２９１７（１９８５））に従って行った。
すなわち、摘出した肺をホモジナイズし、遠心分離を行い、得た沈殿部分の膜画分を、氷冷しておいたトリス緩衝液（１５４ｍＭ 塩化ナトリウム、２ｍＭ 塩化マグネシウムを含む２０ｍＭ トリス−塩酸（ｐＨ７．５）から成る）を用いて、タンパク質濃度が０．２−０．６ｍｇ／ｍｌとなるように希釈し、そして、トリチウム化した放射リガンドが実験反応系中の懸濁液中に１−４ｍｇ／ｍｌとなるように上述のトリス緩衝液を用いて希釈した。ただし、タンパク質濃度の定量は、Ｌｏｗｒｙらの方法（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９３，２６５（１９５１））に従って、タンパク質標準物として牛血清アルブミンを用いて測定した。
放射リガンド結合試験は、同様に、Ｖ．Ｎｅｒｍｅらの方法（Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｐｈａｒｍａｃ．，３４，２９１７（１９８５））に従って行った。
【００４３】
すなわち、上述にして得られた膜画分懸濁液１００μｌに１００μＭのＧＴＰ（ｇｕａｎｏｓｉｎｅ５’−ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）存在化、最終容量０．２５ｍｌ中で放射リガンドと反応させた。本実験では、放射リガンドとして０．４ｎＭの［３Ｈ］標識した（−）ＣＧＰ１２１７７（Ａｍｅｒｓｈａｍ，開発コードＮｏ．）（＋１０ｎＭ ＣＧＰ２０７１２Ａ（Ａｍｅｒｓｈａｍ，開発コードＮｏ．）を含む）を用い、反応は２２℃で２０分間行った。また、非特異的結合は５０μＭ のアロプレノロール（ａｌｐｒｅｎｏｌｏｌ）を用い、総結合の８０−９０％から成ると定義し、その非特異的結合は常に放射リガンドを加えた総量の１０％以下であった。
その後、ガラスフィルター（Ｍｏｄｅｌ ７０１、Ｓｋａｔｒｏｎ Ｉｎｃ．製）を用いて、［３Ｈ］標識した（−）ＣＧＰ１２１７７と結合した膜標品を分離するために瀘過を行ない、２回、上述のトリス緩衝液５ｍｌにて洗浄した。このガラスフィルターをバイアルに入れ、アクアゾール（液体シンチレーション用カクテル）と混合し、液体シンチレーションカウンターにて結合［３Ｈ］標識（−）ＣＧＰ１２１７７量を測定し、阻害率（％）を次式より算出した。
【００４４】
阻害率（％）＝１００−〔（Ｃ１−Ｂ）／（Ｃ０ −Ｂ）〕×１００
（式中、Ｃ１ は、既知量の供試化合物と［３Ｈ］標識（−）ＣＧＰ１２１７７が共存している状態での［３Ｈ］標識（−）ＣＧＰ１２１７７の膜に対する結合量を表わし、Ｃ０ は、供試化合物を除いた時の［３Ｈ］標識（−）ＣＧＰ１２１７７の膜に対する結合量を表わし、Ｂは、過剰（５０×１０−６Ｍ）のａｌｐｒｅｎｏｌｏｌ存在下での［３Ｈ］標識（−）ＣＧＰ１２１７７の膜に対する結合量を表わす。）
なお、本測定系におけるポジティブコントロールとしてのアドレナリンβ２受容体遮断薬であるＩＣＩ１１８５５１（レファランスコンパウンド）のＩＣ５０値は、１．９ｎＭであった。
供試化合物として、製造例１で得られたプロポリス組成物を使用した結果（濃度：５００μｇ／ｍｌ）、阻害率は４８％であった。この結果から、本発明のプロポリス組成物に強いアドレナリンβ２受容体作動化作用を有することがわかる。
【００４５】
実施例４
女性ホルモン様作用試験
ラット子宮エストロゲン受容体への結合試験評価は、Ｂ． ＫＯＦＦＭＡＮらの方法（Ｊ．Ｓｔｅｒｏｉｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｍｏｌｅｃ． Ｂｉｏｌ．，３８（２）１３５−１３９，１９９１）を一部改変して行った。
［ｃｙｔｏｓｏｌ（サイトゾル）画分の調製］
特に記述しない限り、以下に示す全ての操作は、４℃の温度で行った。
まず、粉砕した凍結子宮組織に４倍量のリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）を加え、ポリトロンＰＴ−１０プローブ（Ｂｒｉｎｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏ． Ｉｎｃ．製）を用いて、フル調節条件で、５秒間破砕し、次の破砕まで６０秒間氷中で冷却し、その後、５秒間破砕する操作を二回繰り返し行うことによりホモジナイズした。このホモジネートを１０５０００×ｇで、３０分間、遠心分離し、得られた上清をデカンテーションし、これをサイトゾル画分として使用した。サイトゾル画分のタンパク質含量は、タンパク質標準試料として牛血清アルブミンを用いて、Ｌｏｗｒｙ ｅｔ． ａｌ．の方法（Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． １９３ ２６５−２７５ １９５１）により測定した。
【００４６】
［ラット子宮エストロゲン受容体への結合試験評価］
タンパク質濃度が１．２〜７．２ｍｇ／ｍｌになるように調製したサイトゾル画分をリン酸緩衝液（ｐＨ ８．０）に溶解し、１ｎＭの［３Ｈ］で標識した１７−β−エストラジオールと製造例１で得られたプロポリス組成物５００μｇ／ｍｌとなるように加え、４０℃で２０時間反応させた。また、非特異的結合試験（ブランク）は、２００倍過剰量のジスチルベステロールの存在下で行った。
次に、遊離したステロイドや試料サンプルを、デキストラン処理した活性炭懸濁液（０．５％ノーリット Ａ、０．００５％デキストランを含むリン酸緩衝液（ｐＨ ７．４）；以下、ＤＣＣと略す）を用いて、４℃で１０分間インキュベーションすることにより除去した。その後、５０００×ｇで１０分間遠心分離することにより、ＤＣＣを沈殿させ、得られたタンパク質結合ステロイドを含む上清１００μｌに、シンチレーションカクテル溶液（Ｐａｃｋａｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏ．製、Ｄｏｗｎｅｒ Ｇｒｏｖｅ、ＩＩＩ）４ｍｌを加え、シンチレーションカウンター（Ｐａｃｋａｒｄ Ｍｏｄｅｌ ２４２５、３０−４０％ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）により測定した。抑制率は、下記式により算出した。
【００４７】
阻害率（％）＝１００−〔（Ｃ１−Ｂ）／（Ｃ０ −Ｂ）〕×１００
（式中、Ｃ１ は、既知量の供試化合物と［３Ｈ］標識１７−β−エストラジオールが共存している状態での［３Ｈ］標識１７−β−エストラジオールのラット子宮エストロゲン受容体に対する結合量を表わし、Ｃ０ は、供試化合物を除いた時の［３Ｈ］標識１７−β−エストラジオールのラット子宮エストロゲン受容体に対する結合量を表わし、Ｂは、過剰の１７−β−エストラジオール（３×１０−６Ｍ）存在下での［３Ｈ］標識１７−β−エストラジオールのラット子宮エストロゲン受容体に対する結合量を表わす。）
結果は、阻害率８７％であった。なお、本測定系におけるポジティブコントロールとしての１７−β−エストラジオールのＩＣ５０値は、０．８４ｎＭ（２．２９×１０−４ｎｇ／ｍｌ）であった。この結果からわかるように、本発明のプロポリス組成物は、１７−β−エストラジオールのエストロゲン受容体結合阻害作用を拮抗的に抑制し、強い女性ホルモン（エストロゲン）様作用を有することがわかる。
【００４８】
実施例５
エンドセリン受容体結合試験
ヒトエンドセリン受容体を発現したチャイニーズハムスター卵巣細胞（以下、ＣＨＯ細胞と略す）のエンドセリン受容体への結合試験評価は、ＢＵＣＨＡＮ，Ｋ．Ｗ．らの方法（Ｂｒ． Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１１２，１２５１−１２５７，１９９４）を一部改変し、ＣＨＯ細胞エンドセリン受容体へのエンドセリン−１の結合の阻害を測定することにより行った。
［ＣＨＯ細胞の培養］
ＣＨＯ細胞を、１０％牛胎児血清、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌのペニシリン及び１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むα−ＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ製）を用いて３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養した。細胞は、トリプシン−ＥＤＴＡを用いて１週間に２回、継代した。
【００４９】
［ＣＨＯ細胞へのヒトエンドセリン受容体の発現］
形質転換する前に、１×１０５個のＣＨＯ細胞を１０ｃｍシャーレに蒔き、接着させるために一晩３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養した。その後、ＤＮＡは、リン酸カルシウム法により形質転換させた。すなわち、０．２５Ｍ 塩酸カルシウム０．７５ｍｌにエンドセリン受容体発現プラスミド４０μｇとｐＲＳＶ−ｎｅｏ（構造的にネオマイシン耐性遺伝子を発現しているベクター）１０μｇを添加し、このＤＮＡ／塩化カルシウム混合物を等容量の２倍濃縮したＨＥＰＥＳリン酸塩緩衝液（（リン酸塩緩衝液（以下、ＰＢＳと略す）：０．２８Ｍ 塩化ナトリウム、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ及び２．２５ｍＭ リン酸水素二ナトリウム・２水和物から成る）（ｐＨ７．１２）とを、プラスティック攪拌棒を用いて滴下し、１０ｃｍシャーレ中のＣＨＯ細胞中へ沈殿物の形で加えた。その沈殿物を細胞上で一晩放置し、その後、ＰＢＳを用いて十分に洗浄した。そして、形質転換した細胞を、ネオマイシンのアナローグであるＧ４１８ １ｍｇ／ｍｌを用いてネオマイシン耐性発現細胞を選択する前に、標準成長培地中で４８時間培養した。
【００５０】
Ｇ４１８耐性細胞のコロニーを、選択した後２〜３週間観察し、クローンリングを用いて９６ウエルプレートのウエル中へ移した。耐性細胞の選択は完全に行ったけれども、その後、細胞を０．２５ｍｇ／ｍｌの濃度のＧ４１８で維持した。Ｇ４１８耐性クローンを増殖させ、結合試験によりエンドセリン受容体発現の有無を確認した。
継代回数の増加による不安定な受容体発現の問題を解決するために、ヒトエンドセリン受容体を形質転換した細胞を、リミッティングダイリューションクローニングを行った。すなわち、理論的密度として１ウエルあたり１細胞になるように９６ウエルプレートに移した。そして、約２週間後、単コロニー、すなわち、性質的に同じな純粋な細胞をサブクローンし、結合分析により受容体の発現を測定した。
【００５１】
［ＣＨＯ細胞からの膜の調製］
それぞれの培養フラスコから培地を除去し、ＣＨＯ細胞が密になった単層を、２５ｍｌのカルシウム及びマグネシウムを含まないＰＢＳで２回、十分に洗浄し、次いで、５ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳ１０ｍｌを加えた。その後、３７℃で１０分間インキュベートし、細胞懸濁液を１７０×ｇ、２０℃で５分間遠心分離し、得られた沈殿を氷冷した溶解緩衝液（０．３ｍＭ ＥＤＴＡを含む１５ｍＭ トリス−塩酸緩衝液）（ｐＨ７．４）で再溶解させた。この細胞溶解液を、氷上で１０分間、ホモジナイズし、これを１７０×ｇ、４℃で１０分間遠心分離し、得られた上清を再び４００００×ｇ、４℃で１０分間遠心分離した。それぞれに、得られた沈殿物を、分析用緩衝液（５０ｍＭ トリス、バチトラシン １００μｇ／ｍｌ、１ｍＭ 塩化カルシウム及び０．１％ 牛血清アルブミンから成る）に再懸濁し、分析に用いるまで凍結保存したか、あるいは、タンパク質濃度が３０〜１００μｇ／ｍｌとなるように分析緩衝液に溶解し、直ぐに使用した。
【００５２】
［結合試験評価］
競合阻害試験は、上述にして得られたＣＨＯ細胞膜（タンパク量として、３０−１００μｇ／ｍｌ）を、［１２５Ｉ］で放射標識したＥＴ−１（１５−２５ｐＭ）と製造例１で得られたプロポリス組成物５００μｇ／ｍｌとともに、分析用緩衝液中で２５℃で３時間、インキュベーションした。その後、３ｍｌの氷冷したＫｒｅｂｓ緩衝液で３回洗浄し、細胞を剥離し、それをガラスフィルター（Ｍｏｄｅｌ ７０１９、Ｓｋａｔｒｏｎ Ｉｎｃ．製）を用いて迅速にろ過し、フィルター上に結合した放射活性を、γ―カウンター（８０％ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）（アロカ（株）製）を用いて測定した。
また、非特異的結合（ブランク）は、飽和濃度（０．０３ｎＭ）のエンドセリン−１の存在化での膜結合放射能として定義した。非特異的結合を全結合から差し引き、そしてその差を特異的結合と定義した。全結合は常に添加した全放射能の１５％未満であった。
結果は、阻害率９６％であった。なお、本測定系におけるポジティブコントロールとしてのエンドセリン−１のＩＣ５０値は、０．２７ｎＭ（０．６７５×１０−３μｇ／ｍｌ）であった。この結果からわかるように、本発明のプロポリス組成物に強いエンドセリン拮抗作用を有することがわかる。
【００５３】
実施例６
セロトニン受容体結合阻害試験
セロトニン受容体結合阻害試験は、Ｊａｎｅｔ Ｇ．Ｍｕｌｈｅｒｏｎらの方法（Ｔｈｅ Ｊｏｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６９，１７，１９９４）を参考に行った。バキュロウィルスＳＦ９細胞にヒトセロトニン受容体を発現させ、これを実験に用いた。既存の方法に従って調製した膜は、湿重量に対して４０倍量の ５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ７．４） を加え、氷浴中にて Ｔｅｆｌｏｎ−ｇｌａｓｓ ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ を用いてホモジナイズ （３分、１ ｓｔｒｏｋｅ／ 分） し、その後遠心分離（３７，０００ × ｇ、２０分、４℃）した。得られた沈渣を氷冷緩衝液［ ５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ７．４）］で再懸濁し、ポジティブコントロールである［３Ｈ］８−ＯＨ−ＤＰＡＴ（８−ヒドロキシ−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン臭化水素酸塩）と製造例１で得られたプロポリス組成物５００μｇ／ｍｌの濃度で添加した。室温で６０分間反応させた後、ガラス繊維濾紙上に速やかに低圧吸引濾過した。それから、濾紙上に残存した受容体結合放射活性を液体シンチレーションカウンターで測定した。
結果は、阻害率９０％であった。ここで示す阻害率とは、８−ＯＨ−ＤＰＡＴの作用を抑制する割合である。なお、８−ＯＨ−ＤＰＡＴのＩＣ５０値（セロトニン受容体結合を５０％阻害する濃度）は、０．４７ ｎＭであった。このように、本発明のプロポリス組成物に、セロトニン１Ａ受容体結合阻害作用を有することがわかる。
【００５４】
実施例７
セロトニントランスポーター受容体結合阻害試験
セロトニントランスポーター受容体結合阻害試験は、Ｔａｔｓｕｍｉらの方法を参考に行った（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ３４０，２４９−２５８，１９９７）。ヒトセロトニントランスポーターｃＤＮＡをｐＲｃ／ＣＭＶベクターに発現させ、ＨＥＫ２３９細胞にトランスフェクションした。それから既存の方法に従って細胞膜を調製し、５０ ｍＭ トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、１２０ ｍＭ塩化ナトリウム、５ ｍＭ 塩化カリウム、を含む緩衝液（ｐＨ７．４）で懸濁した。これに製造例１で得られたプロポリス組成物を５００μｇ／ｍｌの濃度で添加し、セロトニントランスポーター阻害剤である［３Ｈ］イミプラミンを添加し、２２℃で３０分間インキュベートした。それから、０．２％のポリエチレンイミン浸漬のＧＦ／Ｂフィルターで濾過し、反応を停止した。フィルター上の放射活性は、液体シンチレーションカウンターによって測定した。
結果は、抑制率が９３％であった。ここで示す抑制率とは、イミプラミンのセロトニントランスポーター受容体結合阻害作用を抑制する割合である。なお、イミプラミンのＩＣ５０値（セロトニントランスポーター受容体結合を５０％阻害する濃度）は、５．８ ｎＭであった。このように、本発明のプロポリス組成物は、イミプラミンのセロトニントランスポーター受容体結合阻害作用を競合的に抑制すること、すなわち、セロトニントランスポーター受容体結合阻害作用を有することがわかる。
【００５５】
実施例８
セロトニンの再吸収阻害試験
セロトニンの再吸収阻害試験は、Ｓ．Ｐｅｒｏｖｉｃらの方法（Ａｒｚｎｅｉｍ．−Ｆｏｒｓｃｈ．／ＤｒｕｇＲｅｓ． ４５ （ＩＩ），１１，１９９５）を参考に行った。断頭により殺した２２０−２５０ ｇのラットの脳から、シナプトソームを調製した。氷浴中にて脳皮質を湿重量に対して２０倍量の０．３２ Ｍのショ糖液で、ホモジナイズし、遠心（１０００ × ｇ、１０分、４℃）を行った。得られたシナプトソーム画分をリン酸緩衝液で懸濁して、製造例１で得られたプロポリス組成物を５００μｇ／ｍｌの濃度で加え、３０℃で５分間プレインキュベートした。リン酸緩衝液の組成は、１．２ ｍＭリン酸二水素ナトリウム、２５ ｍＭ 炭酸水素ナトリウム、１１８ ｍＭ 塩化ナトリウム、５ ｍＭ 塩化カリウム、２．５ ｍＭ 硫酸マグネシウム、５０ μＭ アスコルビン酸、１０ μＭ ＥＧＴＡ［エチレングリコールビス（２−アミノエチルエーテル）四酢酸］、１１ ｍＭ グルコースである。その後、５μＭの［３Ｈ］−セロトニンを加え、全量１ ｍｌとし、３７℃で２０分間インキュベートを行った。反応は冷リン酸緩衝液を加え停止し、直ちにＧＦ／Ｂフィルターで濾過した。フィルター上の放射活性は、液体シンチレーションカウンターによって測定した。
結果は、阻害率が８１％であった。ここで示す阻害率とは、［１００−（サンプルを添加した時の［３Ｈ］−セロトニン取り込み量）／（緩衝液のみのコントロールの［３Ｈ］−セロトニン取り込み量）×１００］である。なお、本実験系でのポジティブコントロールであるイミプラミンのＩＣ５０値（セロトニン再吸収を５０％阻害する濃度）は、０．０２４ μＭであった。このように本発明のプロポリスは、セロトニン再吸収阻害作用を有することがわかる。
【００５６】
実施例９
セロトニンの放出作用試験
セロトニンの放出作用をみる実験系は、Ｇｉａｍｂａｔｔｉｓｔａらの方法を参考に行った（Ｊｏｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ６３ （３），１１６３−１１６６，１９９４）。ラット大脳皮質より、既存の方法に従って粗シナプトソーム画分を調製し、以下の緩衝液で懸濁した。緩衝液の組成は、１．２ ｍＭ 塩化カルシウム、１．２ ｍＭ 塩化マグネシウム、１ ｍＭリン酸二水素ナトリウム、２５ ｍＭ 炭酸水素ナトリウム、１２５ ｍＭ 塩化ナトリウム、３ｍＭ 塩化カリウム、２２ ｍＭ炭酸水素ナトリウム、１０ ｍＭグルコースである。得られたシナプトソームに、０．０８ μＭ［３Ｈ］―セロトニンを添加し、３７℃で１５分間インキュベートした。その後、製造例１で得られたプロポリス組成物を最終濃度が５００μｇ／ｍｌに成るように加え、３７℃で９５％Ｏ２、５％ＣＯ２条件下において潅流を行い、最後にシナプトソームの放射活性を測定した。
結果は、誘発率７４％であった。誘発率とは、［１００−（緩衝液のみのコントロールの［３Ｈ］−セロトニン放出量）／（サンプルを添加した時の［３Ｈ］−セロトニン放出量）×１００］である。なお、本実験系でのポジティブコントロールであるフェンフルラミンのＥＣ５０値（セロトニン放出を５０％促進する有効濃度）は、０．０２８ μΜであった。このように、本発明のプロポリス組成物は、セロトニン放出促進作用を有することがわかる。
【００５７】
実施例１０
ブラジキニンＩＩ型受容体結合試験
モルモット回腸由来ブラジキニンＩＩ型受容体への結合試験評価は、Ｙ．−Ｊ．Ｉ．ＪＯＮＧらの方法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，１０９９４−１０９９８（１９９３））を一部改変して行った。
すなわち、７５−ｃｍ２の培養フラスコにてコンフルエント（８−１２×１０６細胞）になった細胞（ＷＩ−３８繊維芽細胞；ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）を、４℃で、ダルベコのリン酸塩緩衝液（以下、ＰＢＳと略す）も用いて３回洗浄し、次ぎに、１ｍＭ トリス緩衝液（ｐＨ７．５）用いて１回洗浄し、そして、１ｍＭ トリス緩衝液（ｐＨ７．５）３ｍｌ中で１０分間、膨潤させた。その後、緩衝液Ｈ（１０ｍＭ 塩化ナトリウム、２ｍＭ ＥＧＴＡ、２ｍＭ 塩化マグネシウム及びプロテアーゼ阻害剤（１００μＭ フェニルメタンスルホニルフルオライド、１６．８μＭ ロイペプチン、４μｇ／ｍｌ キモステイン、５．８μＭ ペプステイン、６．６μＭ アンチパイン、トリプシンインヒビター ０．０８ｕｎｉｔｓ アプロチニン／ｍｌ、１０ｍＭ ベンズアミジン、０．２５ｍｇ／ｍｌ 大豆トリプシンインヒビター及び５ｍＭ ε−アミノカプロン酸）から成る）１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液）（ｐＨ７．５）９ｍｌを添加した。そして、細胞を直接に剥離し、Ｂ Ｄｏｕｎｃｅホモジナイザーを用いてホモジナイズした。このホモジネートを５０×ｇで５分間遠心分離し、得られた上清をさらに、４７０００×ｇで３０分間、遠心分離した。そして得られた膜画分を、上述の緩衝液 Ｈを用いて再懸濁させた。
【００５８】
５０μｌ中にタンパク質量が１５０−２００μｇに調整した膜画分と０．０３ｎＭのトリチウム標識したブラジキニン（ＤｕＰｏｎｔ社製；７０−１０７Ｃｉ／ｍｍｏｌ；１Ｃｉ＝３７ＧＢｑ、以下、［３Ｈ］ＢＫと略す）、製造例１で得られたプロポリス組成物５００μｇ／ｍｌと結合緩衝液１００μｌに１００μＭグアノシン ５’−［γ−チオ］トリリン酸（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社製、以下、ＧＴＰ［γ−Ｓ］と略す）の存在化で２２℃で９０分間インキュベーションさせた。その後、氷冷した５０ｍＭ トリス緩衝液（ｐＨ７．１）３ｍｌを添加して反応を停止し、０．３％ ポリエチレンイミン水溶液を用いて予め処理しておいたガラスファイバーフィルター（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ社製 Ｎｏ．３１）を用いてろ過し、同緩衝液３ｍｌを用いて洗浄した後、シンチレーションカウンター（Ｐａｃｋａｒｄ Ｍｏｄｅｌ ２４２５、３０−４０％ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）により測定し、下記式により阻害率（％）を算出した。
なお、１μＭ 非放射標識ブラジキニンの存在化での［３Ｈ］ＢＫ非特異的結合は、常に全結合の２５％以下であった。
【００５９】
阻害率（％）＝１００−〔（Ｃ１−Ｂ）／（Ｃ０ −Ｂ）〕×１００
（式中、Ｃ１ は、既知量の供試化合物と［３Ｈ］標識ブラジキニンが共存している状態での［３Ｈ］標識ブラジキニンの膜に対する結合量を表わし、Ｃ０ は、供試化合物を除いた時の［３Ｈ］標識ブラジキニンの膜に対する結合量を表わし、Ｂは、過剰のブラジキニン（１×１０−６Ｍ）存在下での［３Ｈ］標識ブラジキニンの膜に対する結合量を表わす。）
また、本反応系におけるブラジキニン受容体拮抗剤であるＤ−Ａｒｇ−［Ｈｙｐ．３，Ｄ−Ｐｈｅ７］−ブラジキニン（ＮＰＣ５６７）（シグマ社）のＩＣ５０値（結合を５０％阻害する濃度）は、５．８ｎＭであった。
結果は、阻害率８９％であった。本発明のプロポリス組成物は、ブラジキニン受容体拮抗作用を有することがわかる。
【００６０】
実施例１１
オキシトシン受容体結合試験
オキシトシン受容体への結合試験評価は、Ｄｏｕｇｌａｓ Ｊ． Ｐｅｔｔｉｂｏｎｅらの方法（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ−Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ Ｓｅｃｔｉｏｎ ，１８８ ， ２３５−２４２，１９９０）を一部改変して行った。
すなわち、屠殺する１８〜２４時間前に０．３ｍｇ／ｋｇの合成発情ホルモン剤、ジプロピオン酸ジエチルベスチルベステロールを静脈注射することにより処理したラットから摘出した子宮組織を、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５ｍＭジチオスレイトールを含む１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．４）を用いて、ホモジナイズし、４８０００×ｇ、４℃で３０分間、遠心分離し、得られた沈殿物を、５ｍＭ塩化マグネシウム、０．１％牛血清アルブミンを含む５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．４）（以下、緩衝液Ａとする）で再溶解させ、４８０００×ｇ、４℃で３０分間、遠心分離し、沈殿物を得た。この得られた沈殿物を、緩衝液Ａを用いて溶解させ、分析するまで氷冷した。
【００６１】
次に、競合試験は、１０ｎＭの［３Ｈ］標識したオキシトシン（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ製、比活性；３０−６０Ｃｉ／ｍｍｏｌ）と、製造例１で得られたプロポリス組成物５００μｇ／ｍｌを、緩衝液Ａ中で、２２℃、６０分間反応させた。
その後、ガラスフィルター（Ｍｏｄｅｌ ７０１９、Ｓｋａｔｒｏｎ Ｉｎｃ．製）を用いて、［３Ｈ］標識したオキシトシンと結合した膜標品を分離するために瀘過を行ない、２回、緩衝液Ａ ５ｍｌにて洗浄した。このガラスフィルターをバイアルに入れ、アクアゾール（液体シンチレーション用カクテル）と混合し、液体シンチレーションカウンターにて結合［３Ｈ］標識オキシトシン量を測定した。
【００６２】
阻害率（％）＝１００−〔（Ｃ１−Ｂ）／（Ｃ０ −Ｂ）〕×１００
（式中、Ｃ１ は、既知量の供試化合物と［３Ｈ］標識オキシトシンが共存している状態での［３Ｈ］標識オキシトシンの膜に対する結合量を表わし、Ｃ０ は、供試化合物を除いた時の［３Ｈ］標識オキシトシンの膜に対する結合量を表わし、Ｂは、過剰のオキシトシン（５×１０−６Ｍ）存在下での［３Ｈ］標識オキシトシンの膜に対する結合量を表わす。）
なお、本測定系におけるポジティブコントロールとしてのオキシトシンのＩＣ５０値は、３．１ｎＭ（０．３２μｇ／ｍｌ）であった。
製造例１のプロポリス組成物（最終濃度：５００μｇ／ｍｌ）を用いた結果は、阻害率１０１％であった。本発明のプロポリス組成物に強いオキシトシン拮抗作用を有することがわかる。
【００６３】
実施例１２
ニコチン性アセチルコリン受容体結合阻害試験
ニコチン性アセチルコリン受容体結合阻害試験は、Ｌａｕｒｉｅ Ａ． Ｐａｂｒｅｚａらの方法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，３９，９−１２，１９９１）を参考に行った。ラット大脳皮質を５０ ｍＭ トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、１２０ ｍＭ塩化ナトリウム、５ ｍＭ 塩化カリウム、１ ｍＭ 塩化マグネシウム、２．５ ｍＭ 塩化カルシウムを含む緩衝液（ｐＨ７．０）でホモジナイズし、懸濁した。その後、４０，０００ ×ｇで１０分間（４℃）遠心分離した後、ペレットを再度、前記緩衝液でホモジナイズした。再び同条件で遠心分離を行った後、２回分の上清を４０，０００ ×ｇで１０分間（４℃）遠心分離した。それから、沈渣を前記緩衝液で懸濁して、大脳皮質の膜標品とした。この膜標品（４００−６００μｇの蛋白質含む）に、［３Ｈ］シチシン（最終濃度１．５ ｎＭ）、製造例１で得られたプロポリス組成物（最終濃度：５００μｇ／ｍｌ）をそれぞれ加え（最終液量２５０μｌ）、４℃で７５分間インキュベーションした。反応は、すばやくブランデール社セルハーベスタを用いて、ワットマンＧＦ／Ｂフィルター（０．１％ウシ血清アルブミン含有の０．５％ポリエチレンイミン水溶液に最低３時間前処理する）上に吸引濾過し、冷却した緩衝液で３回洗浄した。フィルターをバイアル瓶に入れ、液体シンチレータを加えた後、フィルターに結合した放射能（トリチウム）を液体シンチレーションカウンターで測定を行った。また、非特異的結合は、１０μＭ（−）−ニコチンの存在下で測定した。
結果は、阻害率５３％であった。ここで示す阻害率（％）は、次式により算出した。
【００６４】
阻害率（％）＝１００−〔（Ｃ１−Ｂ０）／（Ｃ０ −Ｂ０）〕×１００
（式中、Ｃ１ は、既知量のサンプルと［３Ｈ］シチシンが共存している状態での［３Ｈ］シチシンの膜画分に対する結合量を表わし、Ｃ０ は、サンプルを除いた時の［３Ｈ］シチシンの膜画分に対する結合量を表わし、Ｂ０は、過剰のニコチン（１０μＭ）存在下での［３Ｈ］シチシンの膜画分に対する結合量を表わす。）
なお、本反応系におけるポジティブコントロールとしてのニコチン性アセチルコリン受容体の作動化剤であるニコチンのＩＣ５０値（ニコチン性アセチルコリン受容体結合を５０％阻害する濃度）は８．０ ｎＭであった。
本発明のプロポリス組成物は、ニコチン性アセチルコリン受容体に対するシチシン結合を競合的に阻害し、ニコチン性アセチルコリン受容体作動化作用を有することがわかる。
【００６５】
実施例１３
ムスカリン性アセチルコリン受容体結合試験
ムスカリン受容体に対する結合試験評価は、ＦＲＡＮＫ ＤＯＲＪＥらの方法（Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏ． Ｅｘｐ． Ｔｈｅｒ．，２５６（２），７２７−７３３，１９９０）を、一部改変して行った。
［細胞の培養］
チャイニーズハムスター卵巣細胞（以下、ＣＨＯ細胞と略す）を、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）より購入した。導入操作を行うまでは、細胞を５％ＣＯ２下で、１０％牛胎児血清、１００ ｕｎｉｔｓ／ｍｌ ペニシリンＧ、１００ ｕｎｉｔｓ／ｍｌストレプトマイシン及び４ ｍＭ グルタミン（Ｍ．Ａ． Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ社製）を含むＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ社製）中で単層培養した。
【００６６】
［導入操作］
ＣｈｅｎとＯｋａｙａｍａの方法（Ｃｈｅｎ， Ｃ． ＡＮＤ Ｏｋａｙａｍａ， Ｈ．：Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ７，２７４５−２７５２，１９８７）を参考に、選択マーカーとしてｐｃＤ ｎｅｏを用いる改良型カルシウムリン酸法を用いた。ＣＨＯ細胞は、ヒトムスカリンＭ１受容体の遺伝子配列を含むｐｃＤ発現ベクターが挿入されたプラスミドを用いて形質転換した。抗生物質の一種ネオマイシンのアナローグであるＧ−４１８（Ｇｉｂｃｏ社製）６００μｇ／ｍｌを用いた選択操作は、導入後７２時間目より開始し、２〜３週間、継続して行った。培地は、３日おきに交換した。クローナル細胞株は、リミッティングダイリューションクローニングを行うことにより得た。すなわち、理論的密度として１ウエルあたり１細胞になるように９６ウエルプレートに移し、約２週間後、単コロニー、すなわち、性質的に同じな純粋な細胞をサブクローンし、［３Ｈ］ピレンゼピン結合能を測定することにより得た。
【００６７】
［膜画分の調製］
細胞を約８０％のコンフルエントにまで培養し、洗浄後、氷冷した５ｍＭ 塩化マグネシウムを含む２５ ｍＭ リン酸ナトリウムから成る結合緩衝液（ｐＨ７．４）（以下、結合緩衝液と略す）中で剥離し、Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ Ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ（調節位置５）を用いて３０秒間、ホモジナイズした。膜を１６，０００×ｇで１５分間遠心分離して沈殿させ、この沈殿物を同条件でもう一度ホモジナイズした。タンパク質濃度は、Ｂｒａｄｆｏｒｄの方法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ， Ｍ． Ｍ．：Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ７２，２４８−２５４，１９７６）に従って、Ｂｉｏ−Ｒａｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を用いて測定した。膜画分は、使用するまで−８０℃で凍結保存した。
【００６８】
［結合阻害試験評価］
結合緩衝液を用いて、分析は総容量１ｍｌ中で行い、膜画分は、タンパク質濃度が６μｇ／ｍｌとなるように調整した。［３Ｈ］ピレンゼピンの飽和結合試験は、放射性リガンドの濃度（２〜１４００ ｐＭ）を８〜１０段階の濃度に分けて行った。結合阻害試験においては、［３Ｈ］ピレンゼピン（最終濃度２ ｎＭ）と製造例１で得られたプロポリス組成物（最終濃度：５００μｇ／ｍｌ）とを同時に加えることにより行った。非特異的結合は、１μＭのアトロピンの存在化中で結合する［３Ｈ］ピレンゼピンの差として定義した。インキュベーションは、２２℃で６０分間行い、ガラスフィルター（Ｍｏｄｅｌ ７０１９、Ｓｋａｔｒｏｎ Ｉｎｃ．製）を用いて迅速にろ過することにより反応を停止させた。フィルター上に結合した膜画分を、氷冷した結合緩衝液５ ｍｌを用いて３回洗浄し、乾燥させ、シンチレーションカクテル（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ Ａｑｕａｓｏｌ）１０ｍｌ中に移し、ＬＫＢ β−カウンターを用いて放射活性を測定した。その結果、阻害率は、６９％であった。阻害率（％）は、次式により算出した。
【００６９】
阻害率（％）＝１００−〔（Ｃ３−Ｂ１）／（Ｃ２ −Ｂ１）〕×１００
（式中、Ｃ３は、既知量のサンプルと［３Ｈ］ピレンゼピンが共存している状態での［３Ｈ］ピレンゼピンの膜画分に対する結合量を表わし、Ｃ２は、サンプルを除いた時の［３Ｈ］ピレンゼピンの膜画分に対する結合量を表わし、Ｂ１は、過剰のアトロピン（１μＭ）存在下での［３Ｈ］ピレンゼピンの膜画分に対する結合量を表わす。）
なお、本反応系におけるポジティブコントロールとしてのムスカリン１受容体の拮抗剤であるピレンゼピンのＩＣ５０値は、１３ ｎＭ（４．５７×１０−３μｇ／ｍｌ）であった。
本発明のプロポリス組成物は、ムスカリン１受容体に対するピレンゼピン結合を競合的に阻害し、強いムスカリン性受容体作動化作用を有することがわかる。
【００７０】
実施例１４
ドーパミン１受容体結合阻害試験
ドーパミン１受容体結合阻害試験は、Ｚｈｏｕらの方法を参考に行った（Ｎａｔｕｒｅ，３４７，７６−８０，１９９０）。
すなわち、３．０ ｋｂのＥｃｏＲｌ−Ｓａｃｌ断片をｐＢＣ１２ＢｌベクターのＨｉｎｄ ｌｌｌの Ｂａｍ Ｈ ｌサイト間にインサートし、カルシウムリン酸法によってＣＯＳ−７細胞に導入した。それから膜標品の調製は、既存の方法に従って行い、最終的にＴＥＭ緩衝液［２５ ｍＭ トリス緩衝液ｐＨ７．４、６ ｍＭ 塩化マグネシウム、１ ｍＭ エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）］に懸濁し、受容体膜標品とした。各試験管に、製造例１で得られた各プロポリス組成物（最終濃度：５００μｇ／ｍｌ）を加え、ドーパミン１受容体拮抗薬である［３Ｈ］ＳＣＨ ２３３９０（アマシャム社製、最終濃度０．３ ｎＭ）、受容体膜標品（２０〜３０μｇの蛋白質を含む）および上記緩衝液を加えて反応液（総量５００ μｌ）とし、反応の開始は膜標品の添加により行った。３０℃、６０分間のインキュベーションの後、受容体に結合した標識リガンドをセルハーベスター（ブランデル社製）を用いてワットマンＧＦ／Ｂグラスファイバーフィルター上に吸引濾過して反応を停止し、直ちに、氷冷５０ ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．７）５ ｍｌで３回洗浄した。次いで、フィルター上の放射能活性を液体シンチレーションカウンターにより測定し、全結合量を求めた。また、同時に測定した１ μＭ ＳＣＨ ２３３９０存在下における結合量を非特異的結合量とし、これを全結合量から差し引くことにより特異的結合量を求めた。
結果は、阻害率７０％であった。ここで示す阻害率（％）は、次式により算出した。
【００７１】
阻害率（％）＝１００−〔（Ｃ５−Ｂ２）／（Ｃ４ −Ｂ２）〕×１００
（式中、Ｃ５は、既知量のサンプルと［３Ｈ］ＳＣＨ ２３３９０が共存している状態での［３Ｈ］ＳＣＨ ２３３９０の膜画分に対する結合量を表わし、Ｃ４は、サンプルを除いた時の［３Ｈ］ＳＣＨ ２３３９０の膜画分に対する結合量を表わし、Ｂ２は、過剰のＳＣＨ ２３３９０（１μＭ）存在下での［３Ｈ］ＳＣＨ ２３３９０の膜画分に対する結合量を表わす。）
なお、本反応系におけるポジティブコントロールとしてのドーパミン１受容体の拮抗剤であるＳＣＨ ２３３９０のＩＣ５０値（ドーパミン１受容体結合を５０％阻害する濃度）は、１．２ ｎＭであった。
本発明のプロポリス組成物に、ドーパミン１受容体作動化作用を有することがわかる。
【００７２】
実施例１５
ベンゾジアゼピン受容体結合阻害試験
ベンゾジアゼピン受容体結合阻害試験は、Ｒｏｂｅｒｔ Ｃ． Ｓｐｅｔｈらの方法を参考に行った（Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２４，３５１−３５８，１９７９）。
すなわち、７〜８週令のウイスター系ラットの脳より調製した粗シナプトゾーム膜分画を１１８ ｍＭ塩化ナトリウム，４．８ ｍＭ塩化カリウム，１．２８ ｍＭ塩化カルシウムおよび１．２ ｍＭ硫酸マグネシウムを含む１５ ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）に懸濁（１ｇ脳湿重量／ ２０ｍｌ）し、受容体膜標品とした。また、標識リガンドとしては［３Ｈ］フルニトラゼパムを用いた。各試験管に製造例１で得られたプロポリス組成物（最終濃度：５００μｇ／ｍｌ）を加え、［３Ｈ］フルニトラゼパム（最終濃度０．４ ｎＭ）、受容体膜標品および上記緩衝液を加えて反応液（総量１ｍｌ）とし、反応の開始は膜標品の添加により行った。０℃、２０分間のインキュベーションの後、受容体に結合した標識リガンドをセルハーベスター（ブランデル社製）を用いてワットマンＧＦ／Ｂグラスファイバーフィルター上に吸引濾過して反応を停止し、直ちに、氷冷５０ ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．７）５ｍｌで３回洗浄した。次いで、フィルター上の放射能活性を液体シンチレーションカウンターにより測定し、全結合量を求めた。
また、同時に測定した１ μＭジアゼパム存在下における結合量を非特異的結合量とし、これを全結合量から差し引くことにより特異的結合量を求めた。
結果は、阻害率７８％であった。ここで示す阻害率（％）は、次式により算出した。
【００７３】
阻害率（％）＝１００−〔（Ｃ７−Ｂ３）／（Ｃ６ −Ｂ３）〕×１００
（式中、Ｃ７は、既知量のサンプルと［３Ｈ］フルニトラゼパムが共存している状態での［３Ｈ］フルニトラゼパムの膜画分に対する結合量を表わし、Ｃ６は、サンプルを除いた時の［３Ｈ］フルニトラゼパムの膜画分に対する結合量を表わし、Ｂ３は、過剰のジアゼパム（１μＭ）存在下での［３Ｈ］フルニトラゼパムの膜画分に対する結合量を表わす。）
なお、本反応系におけるポジティブコントロールとしてのベンゾジアゼピン受容体の作動化剤であるジアゼパムのＩＣ５０値（ベンゾジアゼピン受容体結合を５０％阻害する濃度）は、１０ ｎＭであった。
本発明のプロポリス組成物は、ベンゾジアゼピン受容体に対するフルニトラゼパム結合を競合的に阻害し、ベンゾジアゼピン受容体作動化作用を有することがわかる。
【００７４】
実施例１６
γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）受容体結合阻害試験
プロポリス組成物の［３Ｈ］ＧＡＢＡのラット由来大脳皮質ＧＡＢＡ受容体への結合阻害試験は、ＡＫＩＲＡ ＴＳＵＪＩらの方法（ＡＮＴＩＭＩＣＲＯＢ． ＡＧＥＮＴＳ ＣＨＥＭＯＴＨＥＲ．，３２（２）１９０−１９４，１９８８）を、一部改変して行った。
すなわち、２３０−２７０ｋｇ体重のＳＤ系ラット（日本クレア（株））の大脳皮質を摘出し、ポリトロンホモジナイザー（Ｂｒｉｎｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏ． Ｉｎｃ．製）を用いて、速度５にて３０秒間、５０倍容量の１ｍＭ アスコルビン酸、１ ｍＭ テトラ酢酸ジナトリウムエチレンジアミンを含む５０ ｍＭ トリス緩衝液（ｐＨ７．４）（以下、緩衝液Ａと略す）中にてホモジナイズした。すべての操作において、組織を０℃に維持した。その後、ホモジネートを４０，０００×ｇにて１５分間遠心分離し、得られた沈殿物を５０倍容量（原重量）の緩衝液Ａに再懸濁し、上述の条件と同条件で、ポリトロンにてホモジナイズした。遠心分離及び再懸濁を、３回繰り返して行った。次いで、３７℃にて１０分間、インキュベーションを行った。このホモジネートを、４０，０００×ｇで１５分間、遠心分離し、１０倍容量（原重量）の緩衝液Ａに再懸濁させ（以下、膜画分と略す）、測定まで、−２０℃以下で保存した。
【００７５】
ラット由来大脳皮質ＧＡＢＡ受容体への結合試験を行うにあたり、上述の膜画分を３７℃にまで解氷した後、１３６ ｍＭ 塩化ナトリウム、５ ｍＭ 塩化カリウム、２ ｍＭ 硫酸マグネシウム、２ ｍＭ リン酸二水素カリウム、２ ｍＭ 塩化カルシウム及び１ ｍＭ アスコルビン酸、１ ｍＭ テトラ酢酸ジナトリウムエチレンジアミンを含む２０ ｍＭ トリス緩衝液（ｐＨ７．４）から成る２０ ｍＭ トリス−クレブス緩衝液（以下、緩衝液Ｂと略す）で２０容量（原重量）にまでメスアップした。この膜画分を、ポリトロンホモジナイザーを用いて、速度５にて３０秒間ホモジナイズし、３７℃にて１５分間インキュベーションし、２０，０００×ｇで１０分間、遠心分離した。これにより得られた沈殿物に、洗浄、再懸濁を２回以上繰り返し、最終的に得られた沈殿物を、１００倍容量（原重量）の緩衝液Ｂに再懸濁し、これを以下の試験に用いた。
【００７６】
次ぎに、製造例１で得られたプロポリス組成物５０μｌ（最終濃度：５００μｇ／ｍｌ）と、［３Ｈ］ＧＡＢＡ（最終濃度１０ ｎＭ）を５０μｌ加え、これに上述の膜画分９００μｌを加えることにより反応を開始させた。２２℃で２０分間インキュベーションした後、ブランデル・セル・ハーベスター（Ｂｒａｎｄｅｌｌ Ｃｅｌｌ Ｈａｒｖｅｓｔｅｒ）を用い、減圧下、２×７．５ｍｌのろ過洗液を用い、ホワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）ＧＦ／Ｂフィルターを介するろ過により、反応を停止させた。ろ過後フィルター上に保持された放射能を、液体シンチレーションカウンター（Ｐａｃｋａｒｄ Ｍｏｄｅｌ ２４２５、３０−４０％ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）により測定した。
また、同時に測定した１００μＭ非放射標識ＧＡＢＡ存在下における結合量を非特異的結合量とし、これを全結合量から差し引くことにより特異的結合量を求めた。結果は、阻害率９０％であった。ここで示す阻害率（％）は、次式により算出した。
【００７７】
阻害率（％）＝１００−〔（Ｃ９−Ｂ４）／（Ｃ８ −Ｂ４）〕×１００
（式中、Ｃ９は、既知量のサンプルと［３Ｈ］ＧＡＢＡが共存している状態での［３Ｈ］ＧＡＢＡの膜画分に対する結合量を表わし、Ｃ８は、サンプルを除いた時の［３Ｈ］ＧＡＢＡの膜画分に対する結合量を表わし、Ｂ４は、過剰のＧＡＢＡ（１００μＭ）存在下での［３Ｈ］ＧＡＢＡの膜画分に対する結合量を表わす。）
なお、本測定系におけるポジティブコントロールとしてのＧＡＢＡのＩＣ５０値（ＧＡＢＡ受容体結合を５０％阻害する濃度）は、１１ ｎＭ（１．１３×１０−３μｇ／ｍｌ）であった。
本発明のプロポリス組成物が、強いＧＡＢＡ受容体作動化作用を有することがわかる。
【００７８】
実施例１７
ヒトコルチコイド受容体リガンド結合試験
ヒトコルチコイド受容体リガンド結合活性の測定は、Ａｂｂｏｔ Ｆ． Ｃｌａｒｋらの方法（Ｉｎｖｅｓｔ． Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ． Ｖｉｓ． Ｓｃｉ．，３５，８０５−８１３，１９９６）を一部改変して行った。
すなわち、ヒトリンパ芽球腫細胞ＩＭ９（ＡＴＣＣ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）を、可溶性グルココルチコイド受容体（以下、ＧＲと略す）として用いた。
上述の細胞を１０％牛胎児血清（ＨｙＣｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ）、１００Ｕ／ｍｌ ペミシリン、１００μｇ／ｍｌ ストレプトマイシン及び２ｍＭ Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）を含むＲＰＭＩ １６４０培地（Ｇｉｂｃｏ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）を用いて、３７℃、７％ ＣＯ２ の条件下で１０×１０５細胞／ｍｌになるまで培養した。その後、この細胞を、１５００ｇで１０分間遠心分離することにより、培地から剥離した。剥離した細胞を１２倍量のダルベコのリン酸塩緩衝液（以下、ＰＢＳと略す：Ｇｉｂｃｏ）を用いて洗浄した後、再び１５００ｇで１０分間遠心分離して沈殿を得、これをＰＢＳにて洗浄した。
【００７９】
洗浄した細胞に、１０ｍＭ ＴＥＳ、１０ｍＭ モリブデン酸ナトリウム、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２０ｍＭ ２−メルカプトエタノール及び１０％ グリセロールから成るホモジネーション緩衝液（ｐＨ ７．４）（以下、ＨＢと略す）を５〜６倍量加え懸濁させ、細胞をＮ２キャビテーター（Ｐａｒｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ、Ｍｏｌｉｎｅ、ＩＬ）を用いて、０℃で、１５分間、６００〜７５０ｐｓｉの窒素圧で２回、キャビテーションすることにより破砕し、この細胞破砕物を、ニコンダイアフォトを用いたＨｏｆｆｍａｎ対比型顕微鏡（Ｇａｒｄｅｎ Ｃｉｔｙ、ＮＹ）を用いて明確化した。
その後、細胞破砕調製物を、２７０００ｇで１５分間遠心分離し、結果得られた上清を、１０３０００ｇ、４℃で６０分間遠心分離した。この得られた上清画分中のタンパク質量は、ＢＣＡ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を用い、標準物質として牛血清アルブミンを用いて定量し、上清画分の標品は、ドライアイス−アセトンバス中で急冷し、−７０℃で凍結保存した。
【００８０】
競合結合試験は、ＩＭ９細胞サイトゾル１ｍｇ、１．５ｎＭの［３Ｈ］標識したトリアムシノロン（０．０２５μＣｉ：Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ、Ｈｅｉｇｈｔｓ、ＩＬ）と製造例１で得たプロポリス組成物を最終濃度が５００μｇ／ｍｌに成るように調製したものを、ＨＢ（総容量２００μｌ）中に加え、０℃で１８時間、インキュベーションさせた。木炭−デキストラン混合物（２％ 活性炭、０．５％ デキストラン、１％ ＥＤＴＡを含む１０ｍＭ トリス緩衝液（ｐＨ ７．４））１００μｌを添加することにより反応を停止させ、この混合物をさらに０℃で１０分間、インキュベーションし、８２００ｇで５分間、遠心分離した。結果として得られた上清１００μｌを、液体シンチレーションスペクトロメトリーを用いて以下の式にて放射活性を測定した。
結果は、阻害率８８％であった。なお、１０μＭ 非放射標識デキサメタソンの存在化での［３Ｈ］トリアムシノロンの非特異的結合は、常に全結合の１５％以下であった。
【００８１】
阻害率（％）＝１００−〔（Ｃ１−Ｂ）／（Ｃ０ −Ｂ）〕×１００
（式中、Ｃ１は、既知量の供試化合物と［３Ｈ］標識トリアムシノロンが共存している状態での［３Ｈ］標識トリアムシノロンの膜に対する結合量を表わし、Ｃ０は、供試化合物を除いた時の［３Ｈ］標識トリアムシノロンの膜に対する結合量を表わし、Ｂは、過剰のデキサメタソン（１０×１０−６Ｍ）存在下での［３Ｈ］標識トリアムシノロンの膜に対する結合量を表わす。）
なお、本測定系におけるポジティブコントロールとしてのデキサメタソンのＩＣ５０値（結合を５０％阻害する濃度）は、２．７ｎＭであった。本発明のプロポリス組成物が強いＧＣ様作用を有することがわかる。
【００８２】
実施例１８
メラトニン受容体結合阻害
メラトニン受容体結合阻害試験は、Ｄａｒｒｙｌ Ｓ．らの方法（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，１７５，７１−７７，１９９０）を参考に行った。
すなわち、シリアンハムスター（２〜４ヶ月齢、雄）を１６時間明期、８時間暗期という条件下で飼育し、既存の方法に従って脳からラジオレセプターアッセイ用の粗膜画分を調製した。なお懸濁には、氷冷緩衝液［５０ ｍＭ トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ｐＨ７．４）］を用いた。この膜標品（５０−１００μｇの蛋白質含む）に、［１２５Ｉ］ヨードメラトニン（最終濃度０．１ ｎＭ）、製造例１で得られたプロポリス組成物（最終濃度：１００μｇ／ｍｌ）を加え（最終液量２００μｌ）、４℃で３０分間インキュベーションさせた後、ガラス繊維濾紙上に速やかに低圧吸引濾過した。それから、濾紙上に残存した受容体結合放射活性を液体シンチレーションカウンターで測定した。また、非特異的結合は、３０μＭメラトニンの存在下で測定した。
結果は、阻害率８９％であった。ここで示す阻害率（％）は、次式により算出した。
【００８３】
阻害率（％）＝１００−〔（Ｃ１−Ｂ０）／（Ｃ０ −Ｂ０）〕×１００
（式中、Ｃ１ は、既知量のサンプルと［１２５Ｉ］ヨードメラトニンが共存している状態での［１２５Ｉ］ヨードメラトニンの膜画分に対する結合量を表わし、Ｃ０ は、サンプルを除いた時の［１２５Ｉ］ヨードメラトニンの膜画分に対する結合量を表わし、Ｂ０は、過剰のメラトニン（３０μＭ）存在下での［１２５Ｉ］ヨードメラトニンの膜画分に対する結合量を表わす。）
なお、本反応系におけるポジティブコントロールとしてのメラトニン受容体の作動化剤であるヨードメラトニンのＩＣ５０値（メラトニン受容体結合を５０％阻害する濃度）は１８８ ｎＭであった。
本発明のプロポリス組成物は、メラトニン受容体に対するヨードメラトニン結合を競合的に阻害し、メラトニン受容体と高い親和性を有することが分かる。
【００８４】
実施例１９
カルシウムチャンネル阻害試験
カルシウムチャンネル阻害試験は、Ｈｏｗａｒｄ Ｒ． Ｌｅｅらの方法（Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，３５（７），７２１−７３２，１９８４）を一部改変して行った。
すなわち、体重２５０−３５０ｇの雄性ＳＤラットを断頭して殺した後、脳を速やかに取り出した。そして、大脳皮質を氷冷したベトリ皿上で脳の残屑から解剖した。その後、得た大脳皮質を１９倍容量のＫｒｅｂｓのリン酸緩衝液（１２０ｍＭ ＮａＣｌ、４．８ｍＭＫＣｌ、２．１ｍＭ ＭｇＳＯ４、１．３ｍＭ ＣａＣｌ２、２０．３ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、３．２ｍＭ ＨＣｌ、１０ｍＭ Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｅ、ｐＨ ７．４）を遠心管に加え、ポリトロン（Ｂｒｉｎｋｍａｎ社製）を用いて１０秒間、３回（調節速度；４０％）、ホモジナイズした。その後、このホモジナイズした大脳皮質を２回、４８０００×ｇで１０分間、遠心分離することにより洗浄し、上述のＫｒｅｂｓのリン酸緩衝液にて再懸濁させた。
【００８５】
このようにして得られた新鮮な大脳皮質ホモジネートを湿重量で１−５ｍｇ／組織になるように調整し、その後、Ｋｒｅｂｓのリン酸緩衝液を含むチューブ中に総容量が２ｍｌとなるように０．０４ｎＭ［３Ｈ］標識したイソプロピル ４−（２，１，３−ベンゾキサジアゾル−４−イル）−１，４−ジヒドロ−２，６−ジメチル−ピリジン−３，５−ジカルボキシル酸メチル １−メチルエチルエステル（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ ４−（２，１，３−ｂｅｎｚｏｘａｄｉａｚｏｌ−４−ｙｌ）−１，４−ｄｉｈｙｄｒｏ−２，６−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−ｐｙｒｉｄｉｎｅ−３，５−ｄｉｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ ｍｅｔｈｙｌ １−ｍｅｔｈｙｌｅｔｈｙｌｅｓｔｅｒ、以下［３Ｈ］（＋）ＰＮ ２００−１００と略す）（８９Ｃｉ／ｍｍｏｌ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，Ｍａｓｓ．社製）及び製造例１で得られた最終濃度が５００μｇ／ｍｌの濃度になるように調整したプロポリス組成物を加え、ナトリウムランプを用いた暗室で、２２℃、９０分間、インキュベーションした。
【００８６】
その後、膜に結合した放射活性をグラスファイバーフィルター（Ｗｈａｔｍａｎ社製、ＧＦ／Ｂ）を用いて吸引濾過してトラップし、次いで、０．９％食塩水５ｍｌを用いて３回洗浄した。そして、フィルターを乾燥させ、シンチレーション溶液中で一晩浸漬することにより、フィルター中の放射活性を溶出させた後、この溶出物中の放射活性を液体シンチレーションスペクトロメトリー（４３％ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）を用いて測定し、以下に示す式を用いてカルシウムチャンネル阻害活性を算出した。
また、特異的結合は、１μＭのニフェジピン（ｎｉｆｅｄｉｐｉｎｅ）と置換される結合と定義し、タンパク質量は、Ｌｏｗｒｙらの方法（Ｏ．Ｈ．Ｌｏｗｒｙ， Ｎ．Ｊ．Ｒｏｓｅｎｂｒｏｕｇｈ， Ａ．Ｌ．Ｆａｒｒ ａｎｄ Ｒ．Ｊ．Ｒａｎｄａｌｌ；Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． １９３， ２６５−２７５ （１９５１））により測定した。
【００８７】
阻害率（％）＝１００−〔（Ｃ１−Ｂ）／（Ｃ０ −Ｂ）〕×１００
（式中、Ｃ１ は、既知量の供試化合物と［３Ｈ］（＋）ＰＮ ２００−１００が共存している状態での［３Ｈ］（＋）ＰＮ ２００−１００の膜画分に対する結合量を表わし、Ｃ０ は、供試化合物を除いた時の［３Ｈ］（＋）ＰＮ ２００−１００の膜画分に対する結合量を表わし、Ｂは、過剰のｎｉｆｅｄｉｐｉｎｅ（１×１０−６Ｍ）存在下での［３Ｈ］（＋）ＰＮ ２００−１００の膜画分に対する結合量を表わす。）
なお、本反応系におけるポジティブコントロールとしてのカルシウムチャンネル阻害剤であるニトレンジピン（ｎｉｔｒｅｎｄｉｐｉｎｅ、ファイザー製薬社製）のＩＣ５０値は、１．７ｎＭであった。
用いたプロポリス組成物では、阻害率が７４％であった。本発明のプロポリス組成物は、カルシウムチャンネルに対するニトレンジピンの結合を競合的に阻害し、強いカルシウムチャンネル阻害作用を有することがわかる。
【００８８】
実施例２０
メラトニン凝集ホルモン（ＭＣＨ）受容体結合阻害試験
ＭＣＨ受容体結合阻害試験は、Ｊｏｎ Ｃｈａｍｂｅｒｓらの方法（Ｎａｔｕｒｅ， ４００， ２６１−２６５， １９９９）を参考にして行った。
すなわち、ヒトＭＣＨ受容体であるＳＬＣ１を発現させたチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）（２〜４μｇ／タンパク質となるように調整）、０．１ｎＭの［１２５Ｉ］標識した［Ｐｈｅ１３，Ｔｙｒ１９］−ＭＣＨ（比活性；２２００Ｃｉ／ｍｍｏｌ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ製）及び最終濃度が５００μｌ／ｍｌになるように調整した製造例１で得られたプロポリス組成物とを、２２℃で６０分間、インキュベートした。その後、グラスファイバーフィルター（Ｗｈａｔｍａｎ社製、ＧＦ／Ｃ）を用いて吸引濾過して放射活性をトラップし、次いで、０．３％脱脂粉乳５ｍｌを用いて３回洗浄した。そして、フィルターを乾燥させ、シンチレーション溶液中で一晩浸漬することにより、フィルター中の放射活性を溶出させた後、この溶出物中の放射活性を液体シンチレーションスペクトロメトリー（４３％ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）を用いて測定し、以下に示す式を用いてＭＣＨ受容体阻害活性を算出した。
結果は、阻害率が５６％であった。また、特異的結合は、０．１μＭのＭＣＨと置換される結合と定義し、タンパク質量は、Ｌｏｗｒｙらの方法（Ｏ．Ｈ．Ｌｏｗｒｙ， Ｎ．Ｊ．Ｒｏｓｅｎｂｒｏｕｇｈ， Ａ．Ｌ．Ｆａｒｒ ａｎｄ Ｒ．Ｊ．Ｒａｎｄａｌｌ；Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． １９３， ２６５−２７５ （１９５１））により測定した。
【００８９】
阻害率（％）＝１００−〔（Ｃ１−Ｂ）／（Ｃ０ −Ｂ）〕×１００
（式中、Ｃ１ は、既知量の供試化合物と［１２５Ｉ］標識した［Ｐｈｅ１３，Ｔｙｒ１９］−ＭＣＨが共存している状態での［１２５Ｉ］標識した［Ｐｈｅ１３，Ｔｙｒ１９］−ＭＣＨの膜画分に対する結合量を表わし、Ｃ０ は、供試化合物を除いた時の［１２５Ｉ］標識した［Ｐｈｅ１３，Ｔｙｒ１９］−ＭＣＨの膜画分に対する結合量を表わし、Ｂは、過剰のＭＣＨ（１×１０−５Ｍ）存在下での［１２５Ｉ］標識した［Ｐｈｅ１３，Ｔｙｒ１９］−ＭＣＨの膜画分に対する結合量を表わす。）
なお、本反応系におけるポジティブコントロールとしてのＭＣＨ受容体作動化薬であるＭＣＨのＩＣ５０値は、０．２５ｎＭであった。
本発明のプロポリスは、ＭＣＨ受容体に対するＭＣＨの結合を競合的に阻害し、ＭＣＨ受容体と高い親和性を有することが分かる。
【００９０】
実施例２１
アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害活性試験
ＡＣＥ阻害活性試験は、Ｈｏｏｒｎ，Ｃ．Ｍ．とＲｏｔｈ，Ｒ．Ａ．の方法（Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１１０，５９７−６０２，１９９３）を一部改変して行った。
すなわち、ガラス試験管中に、製造例１で得られたプロポリス組成物を最終濃度が５００μｇ／ｍｌとなるように１０％ジメチルスルホキシド（以下、ＤＭＳＯと略す）に溶解したものを０．０６ｍｌ加え、次いで、１００ｍＵ／ｍｌのＡＣＥ（シグマ社製）０．０３ｍｌを添加し、３７℃で５分間、プレインキュベーションした後、１００ｍＭ ホウ酸緩衝液 ｐＨ ８．３、５００ｍＭ ＮａＣｌ、６．５ｍＭ ［３Ｈ］標識したヒプリルグリシルグリシン（ｈｙｐｐｕｒｙｌｇｌｙｃｙｌｇｌｙｃｉｎｅ、以下、［３Ｈ］ＨＧＧと略す）０．３ｍｌを加え、３７℃で５時間、インキュベーションし、１Ｎ 塩酸０．５ｍｌを加えて反応を停止させた。その後、酢酸エチル１．５ｍｌを加えて１分間攪拌し、ＡＣＥにより遊離した［３Ｈ］したヒプリル酸（ｈｉｐｐｕｒｉｃ ａｃｉｄ）を抽出し、この酢酸エチル層１．０ｍｌを分取して乾固させた後、液体シンチレーションを加え、放射活性を測定し、次式にて阻害率（％）を算出した。
【００９１】
阻害率（％）＝（Ａ−Ｂ）／Ａ×１００
（ここで、Ａは阻害剤を含まない場合の放射活性値を表わし、Ｂは阻害剤を添加した場合の放射活性値を表わす。）
結果は、阻害率６０％であった。なお、本反応系におけるポジティブコントロールとしてのＡＣＥ阻害剤であるカプトプリル（ｃａｐｔｏｐｒｉｌ、和光純薬製）のＩＣ５０値は、０．００１１μＭであった。 本発明のプロポリス組成物は強いＡＣＥ阻害作用を有することがわかる。
【００９２】
実施例２２
トロンボキサンＡ２（ＴＸＡ２）合成酵素阻害活性試験
ＴＸＡ２合成酵素阻害活性試験は、ＷＡＤＥ， Ｍ． Ｌ．とＦＩＴＺＰＡＴＲＩＣＫ， Ｆ． Ａ．の方法（Ａｒｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ．， ３４７， １７４−１８０， １９９７）を一部改変して、ヒト血小板ミクロソームのトロンボキサン合成酵素阻害活性を調べた。
すなわち、１０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ ７．４）中に、血小板ミクロソーム（０．５ｍｇ タンパク質）、１０μＭ プロスタグランジンＨ２（以下、ＰＧＨ２と略す）、５ｍＭ エピネフリン、２μＭ ヘミン、及び前記製造例１で調製したプロポリス組成物（最終濃度：５００μｇ／ｍｌ）を含む反応液（全量 ０．２ｍｌ）を用いた。プロポリス組成物と血小板ミクロソームを２２℃で３分間プレインキュベーションした後、基質として１０μＭ ＰＧＨ２を添加して２２℃で２分間反応させた。その後、塩化スズ溶液を添加して反応を停止し、生成したトロンボキサンＢ２（以下、ＴＸＢ２と略す）の量を、ＴＸＢ２ ＥＩＡ（Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏ Ａｓｓａｙ）キット（アマシャム ファルマシア バイオテク社製）を用いて測定した。
結果は、阻害率９３％であった。なお、本反応系におけるポジティブコントロールとしてのＴＸＡ２合成酵素阻害剤であるｆｕｒｅｇｒｅｌａｔｅのＩＣ５０値（酵素活性を５０％阻害する濃度）は０．２１μＭであった。本発明のプロポリス組成物は、強力なＴＸＡ２合成酵素阻害活性を有することが分かる。
【００９３】
実施例２３
一酸化窒素合成酵素阻害活性試験
プロポリス抽出物のＮＯＳ阻害活性試験は、Ｅｓｔｒａｄａらの方法（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１８６，４７５−４８２（１９９２））を、一部改変して行った。
マウス由来のマクロファージ様細胞ＲＡＷ２６４−７を５×１０５／ｗｅｌｌで培養プレートに播種し、３７℃で２４時間インキュベーションした。この培養プレートに、ＬＰＳ（リポポリサッカライド；１０ｎｇ／ｍｌ）および製造例１で得られたプロポリス組成物を５００μｇ／ｍｌの濃度になるように調整して添加し、３７℃で１８時間インキュベーションした。得られた培養液（１００μｌ）とＧｒｉｅｓｓ試薬（１００μｌ）を反応させ、５４０ｎｍの吸光度を測定した。そして、プロポリス抽出物の非存在下での吸光度を１００％とし、プロポリス抽出物存在下での百分率（％）を求め、阻害率を算出した。
その結果は、阻害率９２％であった。なお、本反応系におけるポジティブコントロールとしてのＮＯＳ阻害剤であるＬ−ＮＭＭＡのＩＣ５０値（酵素活性を５０％阻害する濃度）は、６９μＭであった。本発明のプロポリス組成物に、強いＮＯＳ阻害作用を有することがわかる。
【００９４】
実施例２４
ヒト免疫不全ウイルス−１プロテアーゼ阻害活性試験
ＨＩＶ−１プロテアーゼ阻害活性の測定は、ＴＯＴＨ， Ｍ． Ｖ．とＭＡＲＳＨＡＬＬ， Ｇ． Ｒ．の方法（Ｉｎｔ． Ｊ． Ｐｅｐｔｉｄｅ． Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．，３６，５４４−５５０，１９９０）を一部改変して行った。
すなわち、ＨＩＶ−１プロテアーゼ（遺伝子組み換えにより大腸菌に発現させたもの、バケム社製）を、２００ｍＭ 塩化ナトリウム、５ｍＭ ジチオトレイトール、１０％（ｖ／ｖ）グリセロールを含む１００ｍＭ 酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．９）（以下、緩衝液Ａとする）し、０．０２ｍｇ／ｍｌの酵素溶液とした。また、１ｍｇ／ｍｌのＨｉｓ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−ｐ−ｎｉｔｒｏ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｎｌｅ−Ｓｅｒ−ＮＨ２（バケム社製）を蒸留水に溶解し、基質溶液とした。
０．５ｍｌ容量のプラスチックチューブに、緩衝液Ａ１００μｌ、基質溶液１０μｌ及び製造例１で得られたプロポリス組成物１０μｌ（最終濃度：５００μｇ／ｍｌ）を加え、３７℃で５分間、プレインキュベートした後、上記酵素溶液２５μｌを加え十分に攪拌した後、３７℃で４０分間、反応を行った。その後、１０％トリフルオロ酢酸１５μｌを添加して反応を停止させた。
反応停止後、酵素反応により遊離してくるｐ−ｎｉｔｒｏ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｎｌｅ−Ｓｅｒ−ＮＨ２量を、下記条件下でＨＰＬＣにより定量した。
【００９５】
＜ＨＰＬＣ条件＞
カラム：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ Ｃ８（Ａ−２０２、１５０×４．６ｍｍＩ．Ｄ．、（株）ワイエムシィ製）
溶出溶媒：０．１％トリフルオロ酢酸を含む０〜６３％のアセトニトリルの直線濃度勾配（２０分）
流速：１ｍｌ／ｍｉｎ．
検出波長：３００ｎｍ
また、阻害率（％）は、次式により算出した。
阻害率（％）＝（Ｂ−Ｃ）／Ｂ×１００
〔式中、Ｂ：阻害剤を含まない場合のｐ−ｎｉｔｒｏ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｎｌｅ−Ｓｅｒ−ＮＨ２のピーク面積、Ｃ：阻害剤を添加した場合のｐ−ｎｉｔｒｏ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｎｌｅ−Ｓｅｒ−ＮＨ２のピーク面積を表す。〕
上述して得た結果、阻害率は、９４％であった。なお、本測定系におけるポジティブコントロールとしてのペプステイン（ｐｅｐｓｔａｉｎ）ＡのＩＣ５０値は、５．２μＭ（３．５７μｇ／ｍｌ）であった。本発明のプロポリス組成物に強いＨＩＶ−１プロテアーゼ阻害作用を有することがわかる。
【００９６】
以下に処方例を示す。
処方例１
［錠剤の製造］
製造例１で得られたブラジル産プロポリス及び中国産プロポリスのエタノール抽出物を重量比で１：１に混合したブレンドプロポリスエキスを用いて、常法に従って、下記の組成の錠剤を製造した。
（組 成） （配合：質量％）
ブレンドプロポリスエキス ２４
乳糖 ６３
コーンスターチ １２
グァーガム １
【００９７】
処方例２
［ジュースの製造］
製造例１で得られたブラジル産プロポリス及び中国産プロポリスのエタノール抽出物を重量比で１：１に混合したブレンドプロポリスエキスを用いて、常法に従って、下記の組成のジュースを製造した。
（組 成） （配合：質量％）
冷凍濃縮温州みかん果汁 ５．０
果糖ブドウ糖液糖 １１．０
クエン酸 ０．２
Ｌ−アスコルビン酸 ０．０２
香料 ０．２
色素 ０．１
ブレンドプロポリスエキス ０．２
水 ８３．２８
【００９８】
処方例３
［フェイスクリームの製造］
製造例１で得られたブラジル産プロポリス及び中国産プロポリスのエタノール抽出物を重量比で１：１に混合したブレンドプロポリスエキスを用いて、常法に従って、下記の組成のフェイスクリームを製造した。
（組 成） （配合：重量％）
イソステアリン酸イソプロピル ８．０
ホホバ油 ６．０
セタノール ８．０
ステアリルアルコール ２．０
ポリオキシエチレンラウリルエーテル １．５
プロピレングリコール ６．０
ソルビトール １．０
パラベン ０．４
ブレンドプロポリスエキス ０．５
ビタミンＥ ０．５
香料 ０．１
精製水 ６６．０
【００９９】
【発明の効果】
本発明で特定する成分を有するプロポリス組成物は、上記各実施例で示すような生物活性を有し、前記用途に有用である。これらの生物活性は含有されている成分に由来すると考えられる。また、このような組成物は、長期間服用しても安全である。
【発明が属する技術分野】
本発明は、プロポリスを含有する組成物の用途に関する。
【０００２】
【従来の技術】
プロポリスとは、働き蜂が植物の若芽などの樹液を採取し、自らの唾液と混合して生産する物質であり、樹脂成分、芳香油、ミツロウ、揮発油、花粉、ミネラル等を含有する物質である。
このプロポリスは、蜂の巣への外敵の侵入を防ぐ防御柵としての機能を有し、巣の割れ目を塞ぐ際の補強剤としての機能を有すると共に、小動物や昆虫等の死骸を覆って腐敗を防止するために用いられていることが知られている（特許文献１）。
このように多様な機能を有するプロポリスは、ヒトにおいても抗炎症作用、抗潰瘍作用、抗菌作用、抗酸化作用等の広範な生理活性を有することが認められており、感染症、潰瘍、動脈硬化等の疾病の治療及び予防に役立つと考えられていることから、健康食品として広範に利用されている。しかしながら、プロポリスの生理活性については、必ずしも十分に検討されているとはいい難く、更なる解明とそれを利用した用途の開発が望まれていた。
【０００３】
近年、多くの研究者により産地別プロポリスの成分に関する研究が進められている。例えば、ブラジル産プロポリスは主成分として、ｐ−クマル酸をはじめ、プレニル基を持つアルテピリンＣ（ａｒｔｅｐｉｌｌｉｎ Ｃ）やドルパニン（ｄｒｕｐａｎｉｎ）、（Ｅ）−プレニル−４−（２，３−ジヒドロシナモイルオキシ）桂皮酸）、（（Ｅ）−３−ｐｒｅｎｙｌ−４−（２，３−ｄｉｈｙｄｒｏｃｉｎｎａｍｏｙｌｏｘｙ）ｃｉｎｎａｍｉｃ ａｃｉｄ）、（Ｅ）−３−（２，２−ジメチル−８−プレニル−２Ｈ−ベンゾピラン−６−イル）−２−プロペノン酸、（（Ｅ）−３−（２，２−ｄｉｍｅｔｙｌ−８−ｐｒｅｎｙｌ−２ｈ−ｂｅｎｚｏｐｙｒａｎ−６−ｙｌ）−２−ｐｒｏｐｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ）などの桂皮酸誘導体が多く検出される。一方、中国産、日本産、オーストラリア産、ウルグアイ酸などのプロポリスは、地域（国）によって成分の含有量に違いがあるものの、主な成分や組成については類似したパターンを示し、主な成分としてクリシン（ｃｈｒｙｓｉｎ）やピノセンブリン（ｐｉｎｏｃｅｍｂｒｉｎ）、ガランギン（ｇａｌａｎｇｉｎ）、ピノバンクシン−３−アセテート（ｐｉｎｏｂａｎｋｓｉｎ−３−ａｃｅｔａｔｅ）、ピノバンクシン（ｐｉｎｏｂａｎｋｓｉｎ）などのフラボノイド類が多く検出される。これらの主な成分の違いから、ブラジル産プロポリスは「桂皮酸誘導体中心のタイプ」であり、中国産など他のプロポリスは「フラボノイド中心のタイプ」であることが定性的に示されている（非特許文献１）。
【０００４】
このようにブラジル産プロポリスと中国産プロポリスの成分が全く異なるという状況にも関わらず、現在上市されているプロポリス関連商品のほとんどがブラジル産プロポリスであり、中国産プロポリスはほとんど上市されていない。現在、市場においてはブラジル産プロポリスの方が品質や生物活性の面から見て優れていると考えられているが、これに関する確かな根拠は全く無い。一方、熊澤らは、産地別プロポリスのポリフェノール含有量と抗酸化活性を測定し、総ポリフェノール量と抗酸化活性とは概ね相関があることを明らかにし、ブラジル産よりも中国産などの地域（国）のプロポリスの方が抗酸化活性が高いことを示している（非特許文献２、非特許文献３）。
【０００５】
【特許文献１】
特開平９−１４９７６５
【非特許文献１】
田澤茂実ら：生薬学雑誌、５４（６），１６４−１６８，２０００
【非特許文献２】
熊澤茂則、中山勉：ミツバチ科学、２２（１），１−８，２００１
【非特許文献３】
熊澤茂則：ＦＯＯＤ Ｓｔｙｌｅ ２１、５（１０），５４−５８，２００１
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、プロポリスの成分とその生理活性の関係を明らかにし、プロポリスの新たな用途を提供することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上述した課題を解決するために鋭意検討を行い、ブラジル産プロポリスと中国産プロポリスに含まれる成分の含有量及び生物活性に着目し、本発明を完成させた。
【０００８】
すなわち、本発明は、ケルセチン、ｐ−クマール酸及びアルテピリンＣを含有し、さらにクリシン、ガランギン若しくはカフェイン酸フェネチルエステルを含有することを特徴とするプロポリスを含むアンジオテンシンＩＩ受容体拮抗用組成物、アドレナリンβ２受容体作動化用組成物、女性ホルモン様組成物、エンドセリン拮抗用組成物、セロトニン再吸収阻害用組成物、セロトニン放出促進用組成物、セロトニン容体拮抗用組成物、セロトニントランスポーター受容体結合阻害用組成物、ブラジキニン受容体拮抗用組成物、オキシトシン拮抗用組成物、ニコチン性アセチルコリン受容体作動化用組成物、ムスカリン性アセチルコリン受容体作動化用組成物、ドーパミン１受容体作動化用組成物、ベンゾジアゼピン受容体作動化用組成物、γ−アミノ酪酸受容体作動化用組成物、グルココルチコイド様作用組成物、メラトニン受容体作動化用組成物、メラトニン受容体拮抗用組成物、カルシウムチャンネル阻害用組成物、メラトニン凝集ホルモン受容体拮抗用組成物、アンジオテンシン変換酵素阻害用組成物、トロンボキサンＡ２合成酵素阻害用組成物、一酸化窒素合成酵素阻害用組成物及びヒト免疫不全ウイルスプロテアーゼ阻害用組成物である。また、本発明は、プロポリスが、ケルセチン当量が４．５８ｍｇ／ｍｌ以上で、ｐ−クマール酸を１．１６ｍｇ／ｍｌ以上、アルテピリンＣを６．７３ｍｇ／ｍｌ以上、クリシンを０．８４ｍｇ／ｍｌ以上、ガランギンを０．５３ｍｇ／ｍｌ以上及びカフェイン酸フェネチルエステルを０．８１ｍｇ／ｍｌ以上を含有するプロポリスであることを特徴とする前記いずれかの組成物、プロポリスが、産地の異なるプロポリス又はそれらの抽出物を少なくとも２種以上を含むプロポリスである前記いずれかのプロポリス組成物、前記のいずれかの組成物を含む経口用組成物又は非経口用組成物、食品である前記の経口用組成物、医薬である前記の経口用組成物又は非経口用組成物及び化粧料である前記の非経口用組成物である。
【０００９】
【発明の実施形態】
本発明におけるプロポリスは、ケルセチン、ｐ−クマール酸及びアルテピリンＣを含有し、さらにクリシン、ガランギン若しくはカフェイン酸フェネチルエステルを含有する。
【００１０】
ケルセチンは、レタス、ブロッコリー、タマネギなどの植物性食品に広く存在している典型的なフラボノール型フラボノイドであり、種々の生理作用を示すことが明らかとなっている。ケルセチンはケルセチン当量で４．５８ｍｇ／ｍｌ以上であることが好ましい。
【００１１】
ｐ−クマール酸は、３−（４−Ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−２−ｐｒｏｐｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ（３−（４−ヒドロキシフェニル）−２−プロピオン酸）のことであり、分子式 Ｃ９Ｈ８Ｏ３、分子量 １６４．１６、融点 ２１０−２１３℃、ｐＫａ値 ９．４５（２５℃）である。スモモ（Ｐｒｕｎｕｓ ｓｅｒｏｔｉｎａ）の果皮、ムラサキツメクサ（Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ ｐｒａｔｅｎｓｅ）等に多く含まれている。ｐ−クマール酸の量は１．１６ｍｇ／ｍｌ以上であることが好ましい。
【００１２】
アルテピリンＣは、４−Ｈｙｄｒｏｘｙ−３，５−ｄｉｐｒｅｎｙｌｃｉｎｎａｍｉｃ ａｃｉｄ（４−ヒドロキシ−３，５−ジプレニル桂皮酸）のことであり、分子式 Ｃ１９Ｈ２４Ｏ３、分子量 ３００．３９７、融点 ９５℃、１５０−１５２℃であり、ヨモギ属（Ａｒｔｅｍｉｓｉａ ｓｐｐ．）、バカリス属（Ｂａｃｃｈａｒｉｓ ｓｐｐ．）等に多く含まれているものである。アルテピリンＣの量は６．７３ｍｇ／ｍｌ以上であることが好ましい。
【００１３】
クリシンは、５，７−Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｆｌａｖｏｎｅ（５，７−ジヒドロキシフラボン）のことであり、分子式 Ｃ１５Ｈ１０Ｏ４、分子量 ２５４．２４２、融点 ２８５−２８６℃、２９０℃（２７５℃）、ｐＫａ値９．０５、７．４２（２０℃、５０％エタノール）である。ニレ（Ｕｌｍｕｓ ｓｉｅｂｏｌｄｉａｎａ）、ソリザヤノキ（Ｏｒｏｘｙｌｕｍ ｉｎｄｉｃｕｍ）の蕾、マツ属（Ｐｉｎｕｓ ｓｐｐ．）及びタツナミソウ属（Ｓｃｕｔｅｌｌａｒｉａ ｓｐｐ．）に多く含まれている。クリシンの量は０．８４ｍｇ／ｍｌ以上であることが好ましい。
【００１４】
ガランギンは、３，５，７−Ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙｆｌａｖｏｎｅ（３，５，７−トリヒドロキシフラボン）のことであり、分子式 Ｃ１５Ｈ１０Ｏ５、分子量 ２７０．２４１、融点 ２１４−２１５℃、２１７−２１８℃である。カレーの香辛料の一つとして使用されているガランガル（Ａｌｐｉｎｉａｏｆｆｉｃｉｎａｒｕｍ）の根茎に多く含まれている。ガランギンの量は０．５３ｍｇ／ｍｌ以上であることが好ましい。
【００１５】
カフェイン酸フェネチルエステルは、３−（３，４−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−ｃａｆｆｅａｔｅ（３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−カフェート）のことであり、分子式 Ｃ１７Ｈ１６Ｏ４、分子量 ２８４．３である。カフェイン酸フェネチルエステルの量は０．８１ｍｇ／ｍｌ以上であることが好ましい。
【００１６】
本発明におけるプロポリスは、代表的には、産地の異なるプロポリス或いはその抽出物を２種以上混合して得られる。混合するプロポリスの産地は、所望の成分が得られるものであれば特に限定されず、例えば、ブラジル産プロポリス、中国産プロポリス、オーストラリア産プロポリス、ウルグアイ産プロポリス、日本産プロポリスなどが使用できるが、含有する成分や種々の生物活性、汎用性等の面から見てブラジル産及び中国産プロポリスを混合することが好ましい。異なる産地のプロポリス又はプロポリスエキスの混合比率は特に限定されるものではないが、例えば、中国産プロポリスエキスとブラジル産プロポリスエキスの場合、重量比で、０．１：９９．９〜９９．９：０．１、好ましくは、１：２〜２：１が適当である。
【００１７】
プロポリスは、プロポリス自体を乾燥させた乾燥物、その粉砕物、超臨界抽出物、水あるいはアルコール、エーテル、アセトンなどの有機溶媒による粗抽出物、および粗抽出物を分配、カラムクロマトなどの各種クロマトグラフィーなどで段階的に精製して得られた抽出物画分など、全て使用することができる。これらは単独で用いても良く、また２種以上混合して用いても良い。例えば、ブラジル産プロポリス及び中国産プロポリスの原塊乾燥物それぞれ１Ｋｇに、９９．５％エタノール抽出液３Ｌを加え、室温で一晩浸漬することにより得た抽出液を、そのまま或いはそれらを混合して使用しても良いし、各種クロマトグラフィーを組み合わせて、精製したものを使用しても良い。
【００１８】
抽出されたプロポリスの溶液中のプロポリス抽出物濃度は特に制限はないが、通常１５〜７０質量％、好ましくは２０〜６０質量％程度である。この濃度が１５質量％未満では、乾燥時に多量のエタノールや水などの溶液を蒸発させる必要があり、７０質量％を超えると溶液の粘度が高くなり過ぎ、加工適性が悪くなる恐れがある。
【００１９】
本発明のプロポリス組成物はアンジオテンシンＩＩ受容体拮抗作用を有することから、血圧降下用とすることができる。アドレナリンβ２受容体作動化作用を有することから、平滑筋弛緩、グリコーゲン分解、グルカゴン分泌促進、血管拡張、気管支拡張、糖代謝・脂質代謝の改善、及び血圧降下、気管支喘息の改善用とすることができる。女性ホルモン様作用を有することから、抗骨粗鬆症、更年期障害の改善、前立腺癌、前立腺肥大症、乳癌・子宮癌の予防、思春期の後発症のざ瘡の改善用として用いることができる。エンドセリン拮抗作用を有することから、高血圧の治療、心疾患・脳循環疾患・腎疾患の治療、喘息、潰瘍、糖尿病の治療用として使用できる。
【００２０】
また、本発明のプロポリス組成物はセロトニン再吸収阻害、セロトニン放出促進、セロトニン受容体拮抗、セロトニントランスポーター受容体結合阻害作用を有することから、鬱病などのセロトニンが関与した疾患の治療用とすることができる。ブラジキニン受容体拮抗作用を有することから、血管拡張抑制、血管透過性増大抑制、低血圧の治療、疼痛の治療、結合組織増大の抑制、髪の喪失の予防、止瀉、平滑筋弛緩、しゅさ性ざ瘡、末梢血管拡張、鼻瘤の治療、ケロイド形成の予防、及び消炎鎮痛、喘息、アレルギー性鼻炎の予防・治療用に用いることができる。オキシトシン拮抗作用を有することから、陣痛の抑制、早産の防止、月経困難症の予防・治療用に使用できる。ニコチン性アセチルコリン受容体作動化、ムスカリン性アセチルコリン受容体作動化、ドーパミン１受容体作動化、ベンゾジアゼピン受容体作動化及びγ−アミノ酪酸受容体作動化作用を有することから、精神分裂病、ツーレット症候群、注意欠如障害、不安などの中枢神経系疾患の治療、予防及び脳機能の改善、脳代謝賦活剤としての用途を有する。グルココルチコイド様作用を有することから、糖質代謝の改善、抗ストレス剤、抗炎症剤、アポトーシス誘導剤、免疫反応抑制剤として使用できる。メラトニン受容体作動化作用及び拮抗作用を有することから、メラトニンが関与する疾患、すなわち、概日リズム睡眠障害の予防、治療、炎症性腸障害、突発性便秘、過敏腸症候群に関連する消化運動性障害の予防、治療に有効である。
【００２１】
さらに、本発明のプロポリス組成物は、カルシウムチャンネル阻害作用を有することから、脳梗塞性疾患、偏頭痛性疾患、てんかん性疾患、精神病疾患、疼痛性疾患、血圧の降下、狭心症、不整脈の治療に使用することができる。メラニン凝集ホルモン受容体拮抗作用を有することから、肥満の予防用とすることができる。アンジオテンシン変換酵素阻害作用を有することから、血圧の降下に有効である。トロンボキサンＡ２合成酵素阻害作用を有することから、アレルギー性疾患、気管支喘息、アレルギー性鼻炎、血栓、心筋梗塞、脳梗塞及び狭心症の予防、治療用として使用できる。一酸化窒素合成酵素阻害作用を有することから、敗血症、エンドトキシンショック、心不全、ショック、低血圧、リウマチ性炎症、慢性関節リウマチ、変形性関節炎、潰瘍性大腸炎、ストレス性胃潰瘍、クローン病、自己免疫疾患、臓器移植後の組織障害、拒絶反応、虚血再灌流障害、急性冠微小血管塞栓、ショック性血管塞栓（汎発性血管内血液凝固症候群（ＤＩＣ）等）、虚血性脳障害、動脈硬化、悪性貧血、ファンコニー貧血症、鎌形赤血球性貧血病、膵炎、ネフローゼ症候群、糸球体腎炎、インスリン依存性糖尿病、肝性ポルフィリン症、アルコール中毒、パーキンソン病、慢性白血病、急性白血病、腫瘍、骨髄腫、抗癌剤副作用軽減、幼児および成人性呼吸窮迫症候群、肺気腫、アルツハイマー症、多発性硬化症、ビタミンＥ欠乏症、老化、サンバーン、筋ジストロフィー、白内障、インフルエンザ感染症、マラリア、ＡＩＤＳ、放射線障害、火傷、体外受精効率化等の予防、治療に使用できる。ヒト免疫不全ウイルスプロテアーゼ阻害作用を有することから、ヒト免疫不全ウイルスの感染の予防、後天性免疫不全症候群の予防、治療として使用することができる。
【００２２】
これら本発明におけるプロポリスを、例えば、チンキタイプのプロポリスとして製造することができる。例えば、ブラジル産及び中国産プロポリス原塊から、それぞれ、７０％含水エタノールを用いて抽出を行い、ロータリーエバポレーターを用いて濃縮することにより、固形分２０％のエタノール抽出物を得る。得られたそれぞれのエタノール抽出物を、重量比で１：１と成るように混合、攪拌し、その後、慣用の手段を用いて、重曹及び大豆レシチンを添加して一晩攪拌しながら混合することにより、チンキタイプのプロポリス組成物を製造することができる。
【００２３】
本発明の各種の用途が特定されたプロポリス組成物（以下、プロポリス組成物）は、経口用の食品、経口用あるいは非経口用の医薬としても製造することができる。
医薬としての適用方法は、経口投与又は非経口投与のいずれも採用することができる。投与に際しては、有効成分を経口投与、直腸内投与、注射などの投与方法に適した固体又は液体の医薬用無毒性担体と混合して、慣用の医薬製剤の形態で投与することができる。このような製剤としては、例えば、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤などの固形剤、溶液剤、懸濁剤、乳剤などの液剤、凍結乾燥製剤などが挙げられる。これらの製剤は製剤上の常套手段により調製することができる。上記の医薬用無毒性担体としては、例えば、グルコース、乳糖、ショ糖、澱粉、マンニトール、デキストリン、脂肪酸グリセリド、ポリエチレングルコール、ヒドロキシエチルデンプン、エチレングリコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、アミノ酸、ゼラチン、アルブミン、水、生理食塩水などが挙げられる。また、必要に応じて、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、結合剤、等張化剤などの慣用の添加剤を適宜添加することもできる。
【００２４】
食品としては、本発明のプロポリス組成物をそのまま、又は種々の栄養成分を加えて、若しくは飲食品中に含有せしめて、抗炎症作用や抗酸化作用などを有する保健用食品又は食品素材として使用できる。例えば、澱粉、乳糖、麦芽糖、植物油脂粉末、カカオ脂末、ステアリン酸などの適当な助剤を添加した後、慣用の手段を用いて、食用に適した形態、例えば、顆粒状、粒状、錠剤、カプセル、ペーストなどに成形して食用に供してもよい。また種々の食品、例えば、ハム、ソーセージなどの食肉加工食品、かまぼこ、ちくわなどの水産加工食品、パン、菓子、バター、粉乳、発酵乳製品に添加して使用したり、水、果汁、牛乳、清涼飲料などの飲料に添加して使用してもよい。本発明のプロポリス組成物の配合量は、当該食用組成物の種類や状態等により適宜設定される。
【００２５】
すなわち、保健用食品等として使用する本発明のプロポリス組成物の粉末組成物を製造する場合、例えば、ブラジル産プロポリス及び中国産プロポリスのそれぞれの原塊から７０％含水エタノールを用いて抽出したエタノール抽出液を、重量比で１：１に成るように混合し、この混合液１部に、まず、でんぷん０．１部〜０．５部、好ましくは０．３部を混合機にて攪拌した後、減圧濃縮して含水エタノールの約８０％を回収する。攪拌速度は１００〜５００ｒ．ｐ．ｍ．、好ましくは１５０〜３００ｒ．ｐ．ｍ．程度である。次に、この濃縮物にさらにでんぷん０．１〜０．５部、好ましくは０．３部と必要なら粉末セルロース０．０５部〜０．５部、好ましくは０．２部を加え、高速混合機にて２〜７時間、好ましくは５時間、十分に混合する。これにより製造された粗塊状の混合物を、棚式乾燥機にて３０〜７０℃の温度にて減圧加熱乾燥した後、チョッパー型粉砕機等で粉砕し、シフターにより篩い分けすることにより、プロポリス抽出物の粉末を製造することができる。なお、プロポリス組成物の粉末の粒度は特に制限はないが、４０メッシュパス程度が適当である。
【００２６】
本発明のプロポリス組成物の有効投与量は、患者の年齢、体重、症状、患者の程度、投与経路、投与スケジュール、製剤形態、素材の阻害活性の強さなどにより、適宜選択・決定されるが、例えば、経口投与の場合、一般に乾燥重量として１日当たり１０〜５００ｍｇ／ｋｇ体重程度、好ましくは、１日当たり１５０〜３５０ｍｇ／ｋｇ体重程度とされ、１日に数回に分けて投与してもよい。
【００２７】
さらに、上述のようにして得られたプロポリスの混合エタノール抽出物を、慣用の手段を用いて、化粧料を製造することができる。
本発明のプロポリス組成物を含有せしめて、化粧料又は化粧料素材として使用する場合、例えば、本発明のプロポリス組成物を小麦胚芽油或いはオリーブ油に添加して、抗炎症作用や抗酸化作用などを有する化粧料素材として使用することができる。プロポリス組成物の添加量は、特に限定されるものではないが、一例として挙げると、小麦胚芽油或いはオリーブ油の重量に対して０．１重量％以上６０重量％以下、好ましくは、０．５重量％以上５０重量％以下が適当である。
【００２８】
また、本発明のプロポリス組成物を直接、化粧料成分として使用し、抗炎症作用や抗酸化作用などを有する化粧料を製造することができる。化粧料には、植物油のような油脂類、高級脂肪酸、高級アルコール、シリコーン、アニオン界面活性剤、カチオン界面活性剤、両性界面活性剤、非イオン界面活性剤、防腐剤、糖類、金属イオン封鎖剤、水溶性高分子のような高分子、増粘剤、液体成分、紫外線吸収剤、紫外線遮断剤、ヒアルロン酸のような保湿剤、香料、ｐＨ調整剤、乾燥剤等を含有させることができる。ビタミン類、皮膚賦活剤、血行促進剤、常在菌コントロール剤、活性酸素消去剤、抗炎症剤、美白剤、殺菌剤等の他の薬効成分、生理活性成分を含有させることもできる。
【００２９】
化粧料としては、化粧水、乳液、クリーム、パック等の皮膚化粧料、メイクアップベースローション、メイクアップクリーム、乳液状又はクリーム状或いは軟膏型のファンデーション、口紅、アイカラー、チークカラーといったメイクアップ化粧料、ハンドクリーム、レッグクリーム、ボディーローション等の身体用化粧料等、入浴剤、口腔化粧料、毛髪化粧料とすることができる。本発明の方法で得られるプロポリス組成物を含有せしめた化粧料としては、機能面からは、例えば、化粧水、乳液、フェイスクリーム、ハンドクリーム、ローション、エッセンス、シャンプー、リンス等が好ましい。
このような化粧料は、常法に従って製造することができる。化粧料における本発明のプロポリス組成物の添加量は、特に限定されるものではないが、一例として挙げると、化粧料全重量の０．０１重量％以上２０重量％以下程度が適当である。
【００３０】
本発明のプロポリス組成物の毒性は低く、例えばブラジル産プロポリス及び中国産プロポリスの抽出物の混合物を毎日１０００ｍｇ／ｋｇ、１００日間という長期間に亘ってラットに経口投与しても、死亡例は認められず、体重変化も観察されなかった。
【００３１】
【実施例】
以下に実施例を挙げて、具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
製造例１
［プロポリス抽出物の製造］
ブラジル産及び中国産プロポリスをそれぞれ凍結粉砕し、パウダー化したプロポリス粉末１ｋｇに８０％含水エタノール（和光純薬工業）３Ｌを加え、攪拌器で１０時間混合攪拌した後、１２０時間静置して抽出した。これを２回繰り返して抽出したものを吸引ろ過器でろ過して、ロータリーエバポレーターを用いて濃縮することにより、固形分２０％のプロポリス抽出物を得た。
【００３２】
実施例１
［各種成分の定量］
アルテピリンＣ、ｐ−クマール酸、クリシン、ガランギン及びカフェイン酸フェネチルエステルの定量は、検量線を作成し、それに基づいて高速液体クロマトグラフィー（以下、ＨＰＬＣと略す）により定量した。
すなわち、製造例１で得られた各プロポリス抽出物を２ｍｌとり、これにメタノールを適量加えて超音波処理し、さらにメタノールを加えて５０ｍｌにメスアップする。この溶液をそのまま又は適宜希釈した後、ミリポアを用いてろ過した後に、これをＨＰＬＣ用試料とし、以下に示す条件にてそれぞれの成分を定量した結果を表２に示す。
ただし、標準物質としてのアルテピリンＣは和光純薬工業製、ｐ−クマール酸、クリシン、ガランギン及びカフェイン酸フェネチルエステルはシグマ社製のものを使用した。
【００３３】
（ｐ−クマール酸）
機種：ＬＣ−２０１０Ａ（株式会社 島津製作所）
検出器：紫外可視分光光度計 ＬＣ−２０１０Ａ（株式会社 島津製作所）
カラム：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＯＤＳ−Ａ 、Ａ−３１２、Φ６ｍｍ×１５ｃｍ（株式会社 ワイエムシィ）
移動相：２．５％酢酸、メタノール及びアセトニトリルの混液（５０：８：５ｖ／ｖ／ｖ）
測定波長：３２０ｎｍ
流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ．
カラム温度：４０℃
【００３５】
【００３６】
【表１】
測定波長：３３０ｎｍ
流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ．
カラム温度：４０℃
（クリシン及びガランギン）
機種：ＬＣ−２０１０Ａ（株式会社 島津製作所）
検出器：紫外可視分光光度計 ＬＣ−２０１０Ａ（株式会社 島津製作所）
カラム：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＯＤＳ−Ａ 、Ａ−３１２、Φ６ｍｍ×１５ｃｍ（株式会社 ワイエムシィ）
移動相：５％ ギ酸、アセトニトリル及びメタノールの混液（２５：１０：１０ｖ／ｖ／ｖ）
測定波長：３６０ｎｍ
流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ．
カラム温度：４０℃
【００３８】
表２からもわかるように、ブラジル産プロポリスにはアルテピリンＣやｐ−クマール酸が多く含有されており、一方、中国産プロポリスにはカフェイン酸フェネチルエステルやクリシン、ガランギンが多く含有されており、ブラジル産及び中国産プロポリスの含有成分が大きく異なることがわかる。
【００３９】
【表２】
実施例２
アンジオテンシンＩＩ１型受容体結合試験
ヒトアンジオテンシンＩＩ１型受容体への結合試験評価は、Ｄｅｒｋ Ｊ．Ｂｅｒｇｓｍａらの方法（ＢＩＯＣＨＥＭＩＣＡＬ ＡＮＤ ＢＩＯＰＨＹＳＩＣＡＬ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＣＯＭＭＵＮＩＣＡＴＩＯＮＳ，１８３（３） ９８９−９９５，１９９２）を一部改変して行った。
［ＣＨＯ細胞へのヒトアンジオテンシンＩＩ１型受容体の発現］
ヒトアンジオテンシンＩＩ１型受容体プラスミド（ｐｈＡＴ１−３）を挿入した２２５０ベースペア（ｂｐ）のエンドヌクレアーゼ（Ｅｃｏ ＲＩ）を、ｐＣＪＢ３−８クローンを産生させるために、ベクターとしてｐＣＪＢ１１ｂ（ラウス肉腫ウイルスプロモーターに対してヒトシトマガロウイルスプロモーターを置換させたｐＲＪＢ誘導体）を発現したチャイニーズハムスター卵巣細胞（以下、ＣＨＯ細胞と略す）へ再クローニングした。
次に、このＣＨＯ細胞を２４時間以内に６０〜８０％にまで集密するまで、１０−ｍｍプレート上で培養した。その後、野生型Ｔ抗原をコードするＳＶ４０の起源欠損型突然変異体ＤＮＡ２５μｇを用いて形質転換させ、３７℃で一晩インキュベーションさせた後に細胞をトリプシン−ＥＤＴＡを用いてプレート上から剥離し、そして、新鮮な完全培地を用いて６ウェルプレート（３３−ｍｍ組織培養プレート）へ移した。そして、この細胞を受容体結合試験を行う２日前より、３７℃でインキュベーションした。
【００４１】
［ヒトアンジオテンシンＩＩ１型受容体への結合試験評価］
上述の細胞を３日間、形質転換させた後、本細胞を１０ｍＭの塩化マグネシウム、０．１％グルコース及び０．２％ウシ胎児血清を含むダルベコのリン酸塩緩衝液（以下、ＤＰＢＳ＋＋と略す）を用いて十分に洗浄する。その後、基質として４０〜５０ｐＭの［１２５Ｉ］標識した［ｓａｒ１，Ｉｌｅ８］アンジオテンシンＩＩ（以下、ＳＩＡと略す）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ社製、比活性：２２００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）を、製造例１で得られた５００μｇ／ｍｌの濃度のプロポリス組成物の存在化、非存在化で、ＤＰＢＳ＋＋１．０ｍｌ中で２５℃で６０分間反応させた。反応後、溶媒を除去し、迅速に細胞を氷冷しておいたＤＰＢＳ＋＋で３回洗浄し、細胞に結合した放射活性を１．０Ｎの水酸化ナトリウムを用いて溶解させた後に、γ−カウンター（８０％効力）（アロカ（株）社製）を用いて測定した。
また、ＳＩＡと１０μＭの非放射標識アンジオテンシンＩＩを用いて測定した値を、ブランク（非特異的結合）とし、データは、検量線を作成し、コンピューターソフトシステム（Ｌｕｎｄｏｎ−２ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｐｒｏｇｒａｍ；Ｌｕｎｄｏ Ｓｏｆｔｗａｒｅ社製）を用いて算出した。なお、本測定系におけるヒトアンジオテンシンＩＩ１型受容体拮抗剤であるｓａｒａｌａｓｉｎのＩＣ５０値は、１．９ｎＭ（１．７３×１０−３μｇ／ｍｌ）であった。
阻害率は、８０％であった。この結果から、強力にＳＩＡを阻害する、本発明のプロポリス組成物に強いアンジオテンシンＩＩ１型受容体拮抗作用を有することがわかる。
【００４２】
実施例３
アドレナリンβ２受容体作動化作用試験
モルモット肺由来アドレナリンβ２受容体への結合試験は、ＴＯＭＭＹ ＡＢＲＡＨＡＭＳＳＯＮらの方法（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃ．，３７（２）２０３−２０８（１９８８））を、一部改変して行った。
３５０−５００ｇ体重のモルモット（日本クレア（株））から、肺を摘出し、膜画分を調製した。膜画分の調製は、Ｖ．Ｎｅｒｍｅらの方法（Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｐｈａｒｍａｃ．，３４，２９１７（１９８５））に従って行った。
すなわち、摘出した肺をホモジナイズし、遠心分離を行い、得た沈殿部分の膜画分を、氷冷しておいたトリス緩衝液（１５４ｍＭ 塩化ナトリウム、２ｍＭ 塩化マグネシウムを含む２０ｍＭ トリス−塩酸（ｐＨ７．５）から成る）を用いて、タンパク質濃度が０．２−０．６ｍｇ／ｍｌとなるように希釈し、そして、トリチウム化した放射リガンドが実験反応系中の懸濁液中に１−４ｍｇ／ｍｌとなるように上述のトリス緩衝液を用いて希釈した。ただし、タンパク質濃度の定量は、Ｌｏｗｒｙらの方法（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９３，２６５（１９５１））に従って、タンパク質標準物として牛血清アルブミンを用いて測定した。
放射リガンド結合試験は、同様に、Ｖ．Ｎｅｒｍｅらの方法（Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｐｈａｒｍａｃ．，３４，２９１７（１９８５））に従って行った。
【００４３】
すなわち、上述にして得られた膜画分懸濁液１００μｌに１００μＭのＧＴＰ（ｇｕａｎｏｓｉｎｅ５’−ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）存在化、最終容量０．２５ｍｌ中で放射リガンドと反応させた。本実験では、放射リガンドとして０．４ｎＭの［３Ｈ］標識した（−）ＣＧＰ１２１７７（Ａｍｅｒｓｈａｍ，開発コードＮｏ．）（＋１０ｎＭ ＣＧＰ２０７１２Ａ（Ａｍｅｒｓｈａｍ，開発コードＮｏ．）を含む）を用い、反応は２２℃で２０分間行った。また、非特異的結合は５０μＭ のアロプレノロール（ａｌｐｒｅｎｏｌｏｌ）を用い、総結合の８０−９０％から成ると定義し、その非特異的結合は常に放射リガンドを加えた総量の１０％以下であった。
その後、ガラスフィルター（Ｍｏｄｅｌ ７０１、Ｓｋａｔｒｏｎ Ｉｎｃ．製）を用いて、［３Ｈ］標識した（−）ＣＧＰ１２１７７と結合した膜標品を分離するために瀘過を行ない、２回、上述のトリス緩衝液５ｍｌにて洗浄した。このガラスフィルターをバイアルに入れ、アクアゾール（液体シンチレーション用カクテル）と混合し、液体シンチレーションカウンターにて結合［３Ｈ］標識（−）ＣＧＰ１２１７７量を測定し、阻害率（％）を次式より算出した。
【００４４】
阻害率（％）＝１００−〔（Ｃ１−Ｂ）／（Ｃ０ −Ｂ）〕×１００
（式中、Ｃ１ は、既知量の供試化合物と［３Ｈ］標識（−）ＣＧＰ１２１７７が共存している状態での［３Ｈ］標識（−）ＣＧＰ１２１７７の膜に対する結合量を表わし、Ｃ０ は、供試化合物を除いた時の［３Ｈ］標識（−）ＣＧＰ１２１７７の膜に対する結合量を表わし、Ｂは、過剰（５０×１０−６Ｍ）のａｌｐｒｅｎｏｌｏｌ存在下での［３Ｈ］標識（−）ＣＧＰ１２１７７の膜に対する結合量を表わす。）
なお、本測定系におけるポジティブコントロールとしてのアドレナリンβ２受容体遮断薬であるＩＣＩ１１８５５１（レファランスコンパウンド）のＩＣ５０値は、１．９ｎＭであった。
供試化合物として、製造例１で得られたプロポリス組成物を使用した結果（濃度：５００μｇ／ｍｌ）、阻害率は４８％であった。この結果から、本発明のプロポリス組成物に強いアドレナリンβ２受容体作動化作用を有することがわかる。
【００４５】
実施例４
女性ホルモン様作用試験
ラット子宮エストロゲン受容体への結合試験評価は、Ｂ． ＫＯＦＦＭＡＮらの方法（Ｊ．Ｓｔｅｒｏｉｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｍｏｌｅｃ． Ｂｉｏｌ．，３８（２）１３５−１３９，１９９１）を一部改変して行った。
［ｃｙｔｏｓｏｌ（サイトゾル）画分の調製］
特に記述しない限り、以下に示す全ての操作は、４℃の温度で行った。
まず、粉砕した凍結子宮組織に４倍量のリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）を加え、ポリトロンＰＴ−１０プローブ（Ｂｒｉｎｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏ． Ｉｎｃ．製）を用いて、フル調節条件で、５秒間破砕し、次の破砕まで６０秒間氷中で冷却し、その後、５秒間破砕する操作を二回繰り返し行うことによりホモジナイズした。このホモジネートを１０５０００×ｇで、３０分間、遠心分離し、得られた上清をデカンテーションし、これをサイトゾル画分として使用した。サイトゾル画分のタンパク質含量は、タンパク質標準試料として牛血清アルブミンを用いて、Ｌｏｗｒｙ ｅｔ． ａｌ．の方法（Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． １９３ ２６５−２７５ １９５１）により測定した。
【００４６】
［ラット子宮エストロゲン受容体への結合試験評価］
タンパク質濃度が１．２〜７．２ｍｇ／ｍｌになるように調製したサイトゾル画分をリン酸緩衝液（ｐＨ ８．０）に溶解し、１ｎＭの［３Ｈ］で標識した１７−β−エストラジオールと製造例１で得られたプロポリス組成物５００μｇ／ｍｌとなるように加え、４０℃で２０時間反応させた。また、非特異的結合試験（ブランク）は、２００倍過剰量のジスチルベステロールの存在下で行った。
次に、遊離したステロイドや試料サンプルを、デキストラン処理した活性炭懸濁液（０．５％ノーリット Ａ、０．００５％デキストランを含むリン酸緩衝液（ｐＨ ７．４）；以下、ＤＣＣと略す）を用いて、４℃で１０分間インキュベーションすることにより除去した。その後、５０００×ｇで１０分間遠心分離することにより、ＤＣＣを沈殿させ、得られたタンパク質結合ステロイドを含む上清１００μｌに、シンチレーションカクテル溶液（Ｐａｃｋａｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏ．製、Ｄｏｗｎｅｒ Ｇｒｏｖｅ、ＩＩＩ）４ｍｌを加え、シンチレーションカウンター（Ｐａｃｋａｒｄ Ｍｏｄｅｌ ２４２５、３０−４０％ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）により測定した。抑制率は、下記式により算出した。
【００４７】
阻害率（％）＝１００−〔（Ｃ１−Ｂ）／（Ｃ０ −Ｂ）〕×１００
（式中、Ｃ１ は、既知量の供試化合物と［３Ｈ］標識１７−β−エストラジオールが共存している状態での［３Ｈ］標識１７−β−エストラジオールのラット子宮エストロゲン受容体に対する結合量を表わし、Ｃ０ は、供試化合物を除いた時の［３Ｈ］標識１７−β−エストラジオールのラット子宮エストロゲン受容体に対する結合量を表わし、Ｂは、過剰の１７−β−エストラジオール（３×１０−６Ｍ）存在下での［３Ｈ］標識１７−β−エストラジオールのラット子宮エストロゲン受容体に対する結合量を表わす。）
結果は、阻害率８７％であった。なお、本測定系におけるポジティブコントロールとしての１７−β−エストラジオールのＩＣ５０値は、０．８４ｎＭ（２．２９×１０−４ｎｇ／ｍｌ）であった。この結果からわかるように、本発明のプロポリス組成物は、１７−β−エストラジオールのエストロゲン受容体結合阻害作用を拮抗的に抑制し、強い女性ホルモン（エストロゲン）様作用を有することがわかる。
【００４８】
実施例５
エンドセリン受容体結合試験
ヒトエンドセリン受容体を発現したチャイニーズハムスター卵巣細胞（以下、ＣＨＯ細胞と略す）のエンドセリン受容体への結合試験評価は、ＢＵＣＨＡＮ，Ｋ．Ｗ．らの方法（Ｂｒ． Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１１２，１２５１−１２５７，１９９４）を一部改変し、ＣＨＯ細胞エンドセリン受容体へのエンドセリン−１の結合の阻害を測定することにより行った。
［ＣＨＯ細胞の培養］
ＣＨＯ細胞を、１０％牛胎児血清、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌのペニシリン及び１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むα−ＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ製）を用いて３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養した。細胞は、トリプシン−ＥＤＴＡを用いて１週間に２回、継代した。
【００４９】
［ＣＨＯ細胞へのヒトエンドセリン受容体の発現］
形質転換する前に、１×１０５個のＣＨＯ細胞を１０ｃｍシャーレに蒔き、接着させるために一晩３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養した。その後、ＤＮＡは、リン酸カルシウム法により形質転換させた。すなわち、０．２５Ｍ 塩酸カルシウム０．７５ｍｌにエンドセリン受容体発現プラスミド４０μｇとｐＲＳＶ−ｎｅｏ（構造的にネオマイシン耐性遺伝子を発現しているベクター）１０μｇを添加し、このＤＮＡ／塩化カルシウム混合物を等容量の２倍濃縮したＨＥＰＥＳリン酸塩緩衝液（（リン酸塩緩衝液（以下、ＰＢＳと略す）：０．２８Ｍ 塩化ナトリウム、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ及び２．２５ｍＭ リン酸水素二ナトリウム・２水和物から成る）（ｐＨ７．１２）とを、プラスティック攪拌棒を用いて滴下し、１０ｃｍシャーレ中のＣＨＯ細胞中へ沈殿物の形で加えた。その沈殿物を細胞上で一晩放置し、その後、ＰＢＳを用いて十分に洗浄した。そして、形質転換した細胞を、ネオマイシンのアナローグであるＧ４１８ １ｍｇ／ｍｌを用いてネオマイシン耐性発現細胞を選択する前に、標準成長培地中で４８時間培養した。
【００５０】
Ｇ４１８耐性細胞のコロニーを、選択した後２〜３週間観察し、クローンリングを用いて９６ウエルプレートのウエル中へ移した。耐性細胞の選択は完全に行ったけれども、その後、細胞を０．２５ｍｇ／ｍｌの濃度のＧ４１８で維持した。Ｇ４１８耐性クローンを増殖させ、結合試験によりエンドセリン受容体発現の有無を確認した。
継代回数の増加による不安定な受容体発現の問題を解決するために、ヒトエンドセリン受容体を形質転換した細胞を、リミッティングダイリューションクローニングを行った。すなわち、理論的密度として１ウエルあたり１細胞になるように９６ウエルプレートに移した。そして、約２週間後、単コロニー、すなわち、性質的に同じな純粋な細胞をサブクローンし、結合分析により受容体の発現を測定した。
【００５１】
［ＣＨＯ細胞からの膜の調製］
それぞれの培養フラスコから培地を除去し、ＣＨＯ細胞が密になった単層を、２５ｍｌのカルシウム及びマグネシウムを含まないＰＢＳで２回、十分に洗浄し、次いで、５ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳ１０ｍｌを加えた。その後、３７℃で１０分間インキュベートし、細胞懸濁液を１７０×ｇ、２０℃で５分間遠心分離し、得られた沈殿を氷冷した溶解緩衝液（０．３ｍＭ ＥＤＴＡを含む１５ｍＭ トリス−塩酸緩衝液）（ｐＨ７．４）で再溶解させた。この細胞溶解液を、氷上で１０分間、ホモジナイズし、これを１７０×ｇ、４℃で１０分間遠心分離し、得られた上清を再び４００００×ｇ、４℃で１０分間遠心分離した。それぞれに、得られた沈殿物を、分析用緩衝液（５０ｍＭ トリス、バチトラシン １００μｇ／ｍｌ、１ｍＭ 塩化カルシウム及び０．１％ 牛血清アルブミンから成る）に再懸濁し、分析に用いるまで凍結保存したか、あるいは、タンパク質濃度が３０〜１００μｇ／ｍｌとなるように分析緩衝液に溶解し、直ぐに使用した。
【００５２】
［結合試験評価］
競合阻害試験は、上述にして得られたＣＨＯ細胞膜（タンパク量として、３０−１００μｇ／ｍｌ）を、［１２５Ｉ］で放射標識したＥＴ−１（１５−２５ｐＭ）と製造例１で得られたプロポリス組成物５００μｇ／ｍｌとともに、分析用緩衝液中で２５℃で３時間、インキュベーションした。その後、３ｍｌの氷冷したＫｒｅｂｓ緩衝液で３回洗浄し、細胞を剥離し、それをガラスフィルター（Ｍｏｄｅｌ ７０１９、Ｓｋａｔｒｏｎ Ｉｎｃ．製）を用いて迅速にろ過し、フィルター上に結合した放射活性を、γ―カウンター（８０％ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）（アロカ（株）製）を用いて測定した。
また、非特異的結合（ブランク）は、飽和濃度（０．０３ｎＭ）のエンドセリン−１の存在化での膜結合放射能として定義した。非特異的結合を全結合から差し引き、そしてその差を特異的結合と定義した。全結合は常に添加した全放射能の１５％未満であった。
結果は、阻害率９６％であった。なお、本測定系におけるポジティブコントロールとしてのエンドセリン−１のＩＣ５０値は、０．２７ｎＭ（０．６７５×１０−３μｇ／ｍｌ）であった。この結果からわかるように、本発明のプロポリス組成物に強いエンドセリン拮抗作用を有することがわかる。
【００５３】
実施例６
セロトニン受容体結合阻害試験
セロトニン受容体結合阻害試験は、Ｊａｎｅｔ Ｇ．Ｍｕｌｈｅｒｏｎらの方法（Ｔｈｅ Ｊｏｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６９，１７，１９９４）を参考に行った。バキュロウィルスＳＦ９細胞にヒトセロトニン受容体を発現させ、これを実験に用いた。既存の方法に従って調製した膜は、湿重量に対して４０倍量の ５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ７．４） を加え、氷浴中にて Ｔｅｆｌｏｎ−ｇｌａｓｓ ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ を用いてホモジナイズ （３分、１ ｓｔｒｏｋｅ／ 分） し、その後遠心分離（３７，０００ × ｇ、２０分、４℃）した。得られた沈渣を氷冷緩衝液［ ５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ７．４）］で再懸濁し、ポジティブコントロールである［３Ｈ］８−ＯＨ−ＤＰＡＴ（８−ヒドロキシ−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン臭化水素酸塩）と製造例１で得られたプロポリス組成物５００μｇ／ｍｌの濃度で添加した。室温で６０分間反応させた後、ガラス繊維濾紙上に速やかに低圧吸引濾過した。それから、濾紙上に残存した受容体結合放射活性を液体シンチレーションカウンターで測定した。
結果は、阻害率９０％であった。ここで示す阻害率とは、８−ＯＨ−ＤＰＡＴの作用を抑制する割合である。なお、８−ＯＨ−ＤＰＡＴのＩＣ５０値（セロトニン受容体結合を５０％阻害する濃度）は、０．４７ ｎＭであった。このように、本発明のプロポリス組成物に、セロトニン１Ａ受容体結合阻害作用を有することがわかる。
【００５４】
実施例７
セロトニントランスポーター受容体結合阻害試験
セロトニントランスポーター受容体結合阻害試験は、Ｔａｔｓｕｍｉらの方法を参考に行った（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ３４０，２４９−２５８，１９９７）。ヒトセロトニントランスポーターｃＤＮＡをｐＲｃ／ＣＭＶベクターに発現させ、ＨＥＫ２３９細胞にトランスフェクションした。それから既存の方法に従って細胞膜を調製し、５０ ｍＭ トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、１２０ ｍＭ塩化ナトリウム、５ ｍＭ 塩化カリウム、を含む緩衝液（ｐＨ７．４）で懸濁した。これに製造例１で得られたプロポリス組成物を５００μｇ／ｍｌの濃度で添加し、セロトニントランスポーター阻害剤である［３Ｈ］イミプラミンを添加し、２２℃で３０分間インキュベートした。それから、０．２％のポリエチレンイミン浸漬のＧＦ／Ｂフィルターで濾過し、反応を停止した。フィルター上の放射活性は、液体シンチレーションカウンターによって測定した。
結果は、抑制率が９３％であった。ここで示す抑制率とは、イミプラミンのセロトニントランスポーター受容体結合阻害作用を抑制する割合である。なお、イミプラミンのＩＣ５０値（セロトニントランスポーター受容体結合を５０％阻害する濃度）は、５．８ ｎＭであった。このように、本発明のプロポリス組成物は、イミプラミンのセロトニントランスポーター受容体結合阻害作用を競合的に抑制すること、すなわち、セロトニントランスポーター受容体結合阻害作用を有することがわかる。
【００５５】
実施例８
セロトニンの再吸収阻害試験
セロトニンの再吸収阻害試験は、Ｓ．Ｐｅｒｏｖｉｃらの方法（Ａｒｚｎｅｉｍ．−Ｆｏｒｓｃｈ．／ＤｒｕｇＲｅｓ． ４５ （ＩＩ），１１，１９９５）を参考に行った。断頭により殺した２２０−２５０ ｇのラットの脳から、シナプトソームを調製した。氷浴中にて脳皮質を湿重量に対して２０倍量の０．３２ Ｍのショ糖液で、ホモジナイズし、遠心（１０００ × ｇ、１０分、４℃）を行った。得られたシナプトソーム画分をリン酸緩衝液で懸濁して、製造例１で得られたプロポリス組成物を５００μｇ／ｍｌの濃度で加え、３０℃で５分間プレインキュベートした。リン酸緩衝液の組成は、１．２ ｍＭリン酸二水素ナトリウム、２５ ｍＭ 炭酸水素ナトリウム、１１８ ｍＭ 塩化ナトリウム、５ ｍＭ 塩化カリウム、２．５ ｍＭ 硫酸マグネシウム、５０ μＭ アスコルビン酸、１０ μＭ ＥＧＴＡ［エチレングリコールビス（２−アミノエチルエーテル）四酢酸］、１１ ｍＭ グルコースである。その後、５μＭの［３Ｈ］−セロトニンを加え、全量１ ｍｌとし、３７℃で２０分間インキュベートを行った。反応は冷リン酸緩衝液を加え停止し、直ちにＧＦ／Ｂフィルターで濾過した。フィルター上の放射活性は、液体シンチレーションカウンターによって測定した。
結果は、阻害率が８１％であった。ここで示す阻害率とは、［１００−（サンプルを添加した時の［３Ｈ］−セロトニン取り込み量）／（緩衝液のみのコントロールの［３Ｈ］−セロトニン取り込み量）×１００］である。なお、本実験系でのポジティブコントロールであるイミプラミンのＩＣ５０値（セロトニン再吸収を５０％阻害する濃度）は、０．０２４ μＭであった。このように本発明のプロポリスは、セロトニン再吸収阻害作用を有することがわかる。
【００５６】
実施例９
セロトニンの放出作用試験
セロトニンの放出作用をみる実験系は、Ｇｉａｍｂａｔｔｉｓｔａらの方法を参考に行った（Ｊｏｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ６３ （３），１１６３−１１６６，１９９４）。ラット大脳皮質より、既存の方法に従って粗シナプトソーム画分を調製し、以下の緩衝液で懸濁した。緩衝液の組成は、１．２ ｍＭ 塩化カルシウム、１．２ ｍＭ 塩化マグネシウム、１ ｍＭリン酸二水素ナトリウム、２５ ｍＭ 炭酸水素ナトリウム、１２５ ｍＭ 塩化ナトリウム、３ｍＭ 塩化カリウム、２２ ｍＭ炭酸水素ナトリウム、１０ ｍＭグルコースである。得られたシナプトソームに、０．０８ μＭ［３Ｈ］―セロトニンを添加し、３７℃で１５分間インキュベートした。その後、製造例１で得られたプロポリス組成物を最終濃度が５００μｇ／ｍｌに成るように加え、３７℃で９５％Ｏ２、５％ＣＯ２条件下において潅流を行い、最後にシナプトソームの放射活性を測定した。
結果は、誘発率７４％であった。誘発率とは、［１００−（緩衝液のみのコントロールの［３Ｈ］−セロトニン放出量）／（サンプルを添加した時の［３Ｈ］−セロトニン放出量）×１００］である。なお、本実験系でのポジティブコントロールであるフェンフルラミンのＥＣ５０値（セロトニン放出を５０％促進する有効濃度）は、０．０２８ μΜであった。このように、本発明のプロポリス組成物は、セロトニン放出促進作用を有することがわかる。
【００５７】
実施例１０
ブラジキニンＩＩ型受容体結合試験
モルモット回腸由来ブラジキニンＩＩ型受容体への結合試験評価は、Ｙ．−Ｊ．Ｉ．ＪＯＮＧらの方法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，１０９９４−１０９９８（１９９３））を一部改変して行った。
すなわち、７５−ｃｍ２の培養フラスコにてコンフルエント（８−１２×１０６細胞）になった細胞（ＷＩ−３８繊維芽細胞；ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）を、４℃で、ダルベコのリン酸塩緩衝液（以下、ＰＢＳと略す）も用いて３回洗浄し、次ぎに、１ｍＭ トリス緩衝液（ｐＨ７．５）用いて１回洗浄し、そして、１ｍＭ トリス緩衝液（ｐＨ７．５）３ｍｌ中で１０分間、膨潤させた。その後、緩衝液Ｈ（１０ｍＭ 塩化ナトリウム、２ｍＭ ＥＧＴＡ、２ｍＭ 塩化マグネシウム及びプロテアーゼ阻害剤（１００μＭ フェニルメタンスルホニルフルオライド、１６．８μＭ ロイペプチン、４μｇ／ｍｌ キモステイン、５．８μＭ ペプステイン、６．６μＭ アンチパイン、トリプシンインヒビター ０．０８ｕｎｉｔｓ アプロチニン／ｍｌ、１０ｍＭ ベンズアミジン、０．２５ｍｇ／ｍｌ 大豆トリプシンインヒビター及び５ｍＭ ε−アミノカプロン酸）から成る）１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液）（ｐＨ７．５）９ｍｌを添加した。そして、細胞を直接に剥離し、Ｂ Ｄｏｕｎｃｅホモジナイザーを用いてホモジナイズした。このホモジネートを５０×ｇで５分間遠心分離し、得られた上清をさらに、４７０００×ｇで３０分間、遠心分離した。そして得られた膜画分を、上述の緩衝液 Ｈを用いて再懸濁させた。
【００５８】
５０μｌ中にタンパク質量が１５０−２００μｇに調整した膜画分と０．０３ｎＭのトリチウム標識したブラジキニン（ＤｕＰｏｎｔ社製；７０−１０７Ｃｉ／ｍｍｏｌ；１Ｃｉ＝３７ＧＢｑ、以下、［３Ｈ］ＢＫと略す）、製造例１で得られたプロポリス組成物５００μｇ／ｍｌと結合緩衝液１００μｌに１００μＭグアノシン ５’−［γ−チオ］トリリン酸（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社製、以下、ＧＴＰ［γ−Ｓ］と略す）の存在化で２２℃で９０分間インキュベーションさせた。その後、氷冷した５０ｍＭ トリス緩衝液（ｐＨ７．１）３ｍｌを添加して反応を停止し、０．３％ ポリエチレンイミン水溶液を用いて予め処理しておいたガラスファイバーフィルター（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ社製 Ｎｏ．３１）を用いてろ過し、同緩衝液３ｍｌを用いて洗浄した後、シンチレーションカウンター（Ｐａｃｋａｒｄ Ｍｏｄｅｌ ２４２５、３０−４０％ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）により測定し、下記式により阻害率（％）を算出した。
なお、１μＭ 非放射標識ブラジキニンの存在化での［３Ｈ］ＢＫ非特異的結合は、常に全結合の２５％以下であった。
【００５９】
阻害率（％）＝１００−〔（Ｃ１−Ｂ）／（Ｃ０ −Ｂ）〕×１００
（式中、Ｃ１ は、既知量の供試化合物と［３Ｈ］標識ブラジキニンが共存している状態での［３Ｈ］標識ブラジキニンの膜に対する結合量を表わし、Ｃ０ は、供試化合物を除いた時の［３Ｈ］標識ブラジキニンの膜に対する結合量を表わし、Ｂは、過剰のブラジキニン（１×１０−６Ｍ）存在下での［３Ｈ］標識ブラジキニンの膜に対する結合量を表わす。）
また、本反応系におけるブラジキニン受容体拮抗剤であるＤ−Ａｒｇ−［Ｈｙｐ．３，Ｄ−Ｐｈｅ７］−ブラジキニン（ＮＰＣ５６７）（シグマ社）のＩＣ５０値（結合を５０％阻害する濃度）は、５．８ｎＭであった。
結果は、阻害率８９％であった。本発明のプロポリス組成物は、ブラジキニン受容体拮抗作用を有することがわかる。
【００６０】
実施例１１
オキシトシン受容体結合試験
オキシトシン受容体への結合試験評価は、Ｄｏｕｇｌａｓ Ｊ． Ｐｅｔｔｉｂｏｎｅらの方法（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ−Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ Ｓｅｃｔｉｏｎ ，１８８ ， ２３５−２４２，１９９０）を一部改変して行った。
すなわち、屠殺する１８〜２４時間前に０．３ｍｇ／ｋｇの合成発情ホルモン剤、ジプロピオン酸ジエチルベスチルベステロールを静脈注射することにより処理したラットから摘出した子宮組織を、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５ｍＭジチオスレイトールを含む１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．４）を用いて、ホモジナイズし、４８０００×ｇ、４℃で３０分間、遠心分離し、得られた沈殿物を、５ｍＭ塩化マグネシウム、０．１％牛血清アルブミンを含む５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．４）（以下、緩衝液Ａとする）で再溶解させ、４８０００×ｇ、４℃で３０分間、遠心分離し、沈殿物を得た。この得られた沈殿物を、緩衝液Ａを用いて溶解させ、分析するまで氷冷した。
【００６１】
次に、競合試験は、１０ｎＭの［３Ｈ］標識したオキシトシン（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ製、比活性；３０−６０Ｃｉ／ｍｍｏｌ）と、製造例１で得られたプロポリス組成物５００μｇ／ｍｌを、緩衝液Ａ中で、２２℃、６０分間反応させた。
その後、ガラスフィルター（Ｍｏｄｅｌ ７０１９、Ｓｋａｔｒｏｎ Ｉｎｃ．製）を用いて、［３Ｈ］標識したオキシトシンと結合した膜標品を分離するために瀘過を行ない、２回、緩衝液Ａ ５ｍｌにて洗浄した。このガラスフィルターをバイアルに入れ、アクアゾール（液体シンチレーション用カクテル）と混合し、液体シンチレーションカウンターにて結合［３Ｈ］標識オキシトシン量を測定した。
【００６２】
阻害率（％）＝１００−〔（Ｃ１−Ｂ）／（Ｃ０ −Ｂ）〕×１００
（式中、Ｃ１ は、既知量の供試化合物と［３Ｈ］標識オキシトシンが共存している状態での［３Ｈ］標識オキシトシンの膜に対する結合量を表わし、Ｃ０ は、供試化合物を除いた時の［３Ｈ］標識オキシトシンの膜に対する結合量を表わし、Ｂは、過剰のオキシトシン（５×１０−６Ｍ）存在下での［３Ｈ］標識オキシトシンの膜に対する結合量を表わす。）
なお、本測定系におけるポジティブコントロールとしてのオキシトシンのＩＣ５０値は、３．１ｎＭ（０．３２μｇ／ｍｌ）であった。
製造例１のプロポリス組成物（最終濃度：５００μｇ／ｍｌ）を用いた結果は、阻害率１０１％であった。本発明のプロポリス組成物に強いオキシトシン拮抗作用を有することがわかる。
【００６３】
実施例１２
ニコチン性アセチルコリン受容体結合阻害試験
ニコチン性アセチルコリン受容体結合阻害試験は、Ｌａｕｒｉｅ Ａ． Ｐａｂｒｅｚａらの方法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，３９，９−１２，１９９１）を参考に行った。ラット大脳皮質を５０ ｍＭ トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、１２０ ｍＭ塩化ナトリウム、５ ｍＭ 塩化カリウム、１ ｍＭ 塩化マグネシウム、２．５ ｍＭ 塩化カルシウムを含む緩衝液（ｐＨ７．０）でホモジナイズし、懸濁した。その後、４０，０００ ×ｇで１０分間（４℃）遠心分離した後、ペレットを再度、前記緩衝液でホモジナイズした。再び同条件で遠心分離を行った後、２回分の上清を４０，０００ ×ｇで１０分間（４℃）遠心分離した。それから、沈渣を前記緩衝液で懸濁して、大脳皮質の膜標品とした。この膜標品（４００−６００μｇの蛋白質含む）に、［３Ｈ］シチシン（最終濃度１．５ ｎＭ）、製造例１で得られたプロポリス組成物（最終濃度：５００μｇ／ｍｌ）をそれぞれ加え（最終液量２５０μｌ）、４℃で７５分間インキュベーションした。反応は、すばやくブランデール社セルハーベスタを用いて、ワットマンＧＦ／Ｂフィルター（０．１％ウシ血清アルブミン含有の０．５％ポリエチレンイミン水溶液に最低３時間前処理する）上に吸引濾過し、冷却した緩衝液で３回洗浄した。フィルターをバイアル瓶に入れ、液体シンチレータを加えた後、フィルターに結合した放射能（トリチウム）を液体シンチレーションカウンターで測定を行った。また、非特異的結合は、１０μＭ（−）−ニコチンの存在下で測定した。
結果は、阻害率５３％であった。ここで示す阻害率（％）は、次式により算出した。
【００６４】
阻害率（％）＝１００−〔（Ｃ１−Ｂ０）／（Ｃ０ −Ｂ０）〕×１００
（式中、Ｃ１ は、既知量のサンプルと［３Ｈ］シチシンが共存している状態での［３Ｈ］シチシンの膜画分に対する結合量を表わし、Ｃ０ は、サンプルを除いた時の［３Ｈ］シチシンの膜画分に対する結合量を表わし、Ｂ０は、過剰のニコチン（１０μＭ）存在下での［３Ｈ］シチシンの膜画分に対する結合量を表わす。）
なお、本反応系におけるポジティブコントロールとしてのニコチン性アセチルコリン受容体の作動化剤であるニコチンのＩＣ５０値（ニコチン性アセチルコリン受容体結合を５０％阻害する濃度）は８．０ ｎＭであった。
本発明のプロポリス組成物は、ニコチン性アセチルコリン受容体に対するシチシン結合を競合的に阻害し、ニコチン性アセチルコリン受容体作動化作用を有することがわかる。
【００６５】
実施例１３
ムスカリン性アセチルコリン受容体結合試験
ムスカリン受容体に対する結合試験評価は、ＦＲＡＮＫ ＤＯＲＪＥらの方法（Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏ． Ｅｘｐ． Ｔｈｅｒ．，２５６（２），７２７−７３３，１９９０）を、一部改変して行った。
［細胞の培養］
チャイニーズハムスター卵巣細胞（以下、ＣＨＯ細胞と略す）を、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）より購入した。導入操作を行うまでは、細胞を５％ＣＯ２下で、１０％牛胎児血清、１００ ｕｎｉｔｓ／ｍｌ ペニシリンＧ、１００ ｕｎｉｔｓ／ｍｌストレプトマイシン及び４ ｍＭ グルタミン（Ｍ．Ａ． Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ社製）を含むＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ社製）中で単層培養した。
【００６６】
［導入操作］
ＣｈｅｎとＯｋａｙａｍａの方法（Ｃｈｅｎ， Ｃ． ＡＮＤ Ｏｋａｙａｍａ， Ｈ．：Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ７，２７４５−２７５２，１９８７）を参考に、選択マーカーとしてｐｃＤ ｎｅｏを用いる改良型カルシウムリン酸法を用いた。ＣＨＯ細胞は、ヒトムスカリンＭ１受容体の遺伝子配列を含むｐｃＤ発現ベクターが挿入されたプラスミドを用いて形質転換した。抗生物質の一種ネオマイシンのアナローグであるＧ−４１８（Ｇｉｂｃｏ社製）６００μｇ／ｍｌを用いた選択操作は、導入後７２時間目より開始し、２〜３週間、継続して行った。培地は、３日おきに交換した。クローナル細胞株は、リミッティングダイリューションクローニングを行うことにより得た。すなわち、理論的密度として１ウエルあたり１細胞になるように９６ウエルプレートに移し、約２週間後、単コロニー、すなわち、性質的に同じな純粋な細胞をサブクローンし、［３Ｈ］ピレンゼピン結合能を測定することにより得た。
【００６７】
［膜画分の調製］
細胞を約８０％のコンフルエントにまで培養し、洗浄後、氷冷した５ｍＭ 塩化マグネシウムを含む２５ ｍＭ リン酸ナトリウムから成る結合緩衝液（ｐＨ７．４）（以下、結合緩衝液と略す）中で剥離し、Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ Ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ（調節位置５）を用いて３０秒間、ホモジナイズした。膜を１６，０００×ｇで１５分間遠心分離して沈殿させ、この沈殿物を同条件でもう一度ホモジナイズした。タンパク質濃度は、Ｂｒａｄｆｏｒｄの方法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ， Ｍ． Ｍ．：Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ７２，２４８−２５４，１９７６）に従って、Ｂｉｏ−Ｒａｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を用いて測定した。膜画分は、使用するまで−８０℃で凍結保存した。
【００６８】
［結合阻害試験評価］
結合緩衝液を用いて、分析は総容量１ｍｌ中で行い、膜画分は、タンパク質濃度が６μｇ／ｍｌとなるように調整した。［３Ｈ］ピレンゼピンの飽和結合試験は、放射性リガンドの濃度（２〜１４００ ｐＭ）を８〜１０段階の濃度に分けて行った。結合阻害試験においては、［３Ｈ］ピレンゼピン（最終濃度２ ｎＭ）と製造例１で得られたプロポリス組成物（最終濃度：５００μｇ／ｍｌ）とを同時に加えることにより行った。非特異的結合は、１μＭのアトロピンの存在化中で結合する［３Ｈ］ピレンゼピンの差として定義した。インキュベーションは、２２℃で６０分間行い、ガラスフィルター（Ｍｏｄｅｌ ７０１９、Ｓｋａｔｒｏｎ Ｉｎｃ．製）を用いて迅速にろ過することにより反応を停止させた。フィルター上に結合した膜画分を、氷冷した結合緩衝液５ ｍｌを用いて３回洗浄し、乾燥させ、シンチレーションカクテル（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ Ａｑｕａｓｏｌ）１０ｍｌ中に移し、ＬＫＢ β−カウンターを用いて放射活性を測定した。その結果、阻害率は、６９％であった。阻害率（％）は、次式により算出した。
【００６９】
阻害率（％）＝１００−〔（Ｃ３−Ｂ１）／（Ｃ２ −Ｂ１）〕×１００
（式中、Ｃ３は、既知量のサンプルと［３Ｈ］ピレンゼピンが共存している状態での［３Ｈ］ピレンゼピンの膜画分に対する結合量を表わし、Ｃ２は、サンプルを除いた時の［３Ｈ］ピレンゼピンの膜画分に対する結合量を表わし、Ｂ１は、過剰のアトロピン（１μＭ）存在下での［３Ｈ］ピレンゼピンの膜画分に対する結合量を表わす。）
なお、本反応系におけるポジティブコントロールとしてのムスカリン１受容体の拮抗剤であるピレンゼピンのＩＣ５０値は、１３ ｎＭ（４．５７×１０−３μｇ／ｍｌ）であった。
本発明のプロポリス組成物は、ムスカリン１受容体に対するピレンゼピン結合を競合的に阻害し、強いムスカリン性受容体作動化作用を有することがわかる。
【００７０】
実施例１４
ドーパミン１受容体結合阻害試験
ドーパミン１受容体結合阻害試験は、Ｚｈｏｕらの方法を参考に行った（Ｎａｔｕｒｅ，３４７，７６−８０，１９９０）。
すなわち、３．０ ｋｂのＥｃｏＲｌ−Ｓａｃｌ断片をｐＢＣ１２ＢｌベクターのＨｉｎｄ ｌｌｌの Ｂａｍ Ｈ ｌサイト間にインサートし、カルシウムリン酸法によってＣＯＳ−７細胞に導入した。それから膜標品の調製は、既存の方法に従って行い、最終的にＴＥＭ緩衝液［２５ ｍＭ トリス緩衝液ｐＨ７．４、６ ｍＭ 塩化マグネシウム、１ ｍＭ エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）］に懸濁し、受容体膜標品とした。各試験管に、製造例１で得られた各プロポリス組成物（最終濃度：５００μｇ／ｍｌ）を加え、ドーパミン１受容体拮抗薬である［３Ｈ］ＳＣＨ ２３３９０（アマシャム社製、最終濃度０．３ ｎＭ）、受容体膜標品（２０〜３０μｇの蛋白質を含む）および上記緩衝液を加えて反応液（総量５００ μｌ）とし、反応の開始は膜標品の添加により行った。３０℃、６０分間のインキュベーションの後、受容体に結合した標識リガンドをセルハーベスター（ブランデル社製）を用いてワットマンＧＦ／Ｂグラスファイバーフィルター上に吸引濾過して反応を停止し、直ちに、氷冷５０ ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．７）５ ｍｌで３回洗浄した。次いで、フィルター上の放射能活性を液体シンチレーションカウンターにより測定し、全結合量を求めた。また、同時に測定した１ μＭ ＳＣＨ ２３３９０存在下における結合量を非特異的結合量とし、これを全結合量から差し引くことにより特異的結合量を求めた。
結果は、阻害率７０％であった。ここで示す阻害率（％）は、次式により算出した。
【００７１】
阻害率（％）＝１００−〔（Ｃ５−Ｂ２）／（Ｃ４ −Ｂ２）〕×１００
（式中、Ｃ５は、既知量のサンプルと［３Ｈ］ＳＣＨ ２３３９０が共存している状態での［３Ｈ］ＳＣＨ ２３３９０の膜画分に対する結合量を表わし、Ｃ４は、サンプルを除いた時の［３Ｈ］ＳＣＨ ２３３９０の膜画分に対する結合量を表わし、Ｂ２は、過剰のＳＣＨ ２３３９０（１μＭ）存在下での［３Ｈ］ＳＣＨ ２３３９０の膜画分に対する結合量を表わす。）
なお、本反応系におけるポジティブコントロールとしてのドーパミン１受容体の拮抗剤であるＳＣＨ ２３３９０のＩＣ５０値（ドーパミン１受容体結合を５０％阻害する濃度）は、１．２ ｎＭであった。
本発明のプロポリス組成物に、ドーパミン１受容体作動化作用を有することがわかる。
【００７２】
実施例１５
ベンゾジアゼピン受容体結合阻害試験
ベンゾジアゼピン受容体結合阻害試験は、Ｒｏｂｅｒｔ Ｃ． Ｓｐｅｔｈらの方法を参考に行った（Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２４，３５１−３５８，１９７９）。
すなわち、７〜８週令のウイスター系ラットの脳より調製した粗シナプトゾーム膜分画を１１８ ｍＭ塩化ナトリウム，４．８ ｍＭ塩化カリウム，１．２８ ｍＭ塩化カルシウムおよび１．２ ｍＭ硫酸マグネシウムを含む１５ ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）に懸濁（１ｇ脳湿重量／ ２０ｍｌ）し、受容体膜標品とした。また、標識リガンドとしては［３Ｈ］フルニトラゼパムを用いた。各試験管に製造例１で得られたプロポリス組成物（最終濃度：５００μｇ／ｍｌ）を加え、［３Ｈ］フルニトラゼパム（最終濃度０．４ ｎＭ）、受容体膜標品および上記緩衝液を加えて反応液（総量１ｍｌ）とし、反応の開始は膜標品の添加により行った。０℃、２０分間のインキュベーションの後、受容体に結合した標識リガンドをセルハーベスター（ブランデル社製）を用いてワットマンＧＦ／Ｂグラスファイバーフィルター上に吸引濾過して反応を停止し、直ちに、氷冷５０ ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．７）５ｍｌで３回洗浄した。次いで、フィルター上の放射能活性を液体シンチレーションカウンターにより測定し、全結合量を求めた。
また、同時に測定した１ μＭジアゼパム存在下における結合量を非特異的結合量とし、これを全結合量から差し引くことにより特異的結合量を求めた。
結果は、阻害率７８％であった。ここで示す阻害率（％）は、次式により算出した。
【００７３】
阻害率（％）＝１００−〔（Ｃ７−Ｂ３）／（Ｃ６ −Ｂ３）〕×１００
（式中、Ｃ７は、既知量のサンプルと［３Ｈ］フルニトラゼパムが共存している状態での［３Ｈ］フルニトラゼパムの膜画分に対する結合量を表わし、Ｃ６は、サンプルを除いた時の［３Ｈ］フルニトラゼパムの膜画分に対する結合量を表わし、Ｂ３は、過剰のジアゼパム（１μＭ）存在下での［３Ｈ］フルニトラゼパムの膜画分に対する結合量を表わす。）
なお、本反応系におけるポジティブコントロールとしてのベンゾジアゼピン受容体の作動化剤であるジアゼパムのＩＣ５０値（ベンゾジアゼピン受容体結合を５０％阻害する濃度）は、１０ ｎＭであった。
本発明のプロポリス組成物は、ベンゾジアゼピン受容体に対するフルニトラゼパム結合を競合的に阻害し、ベンゾジアゼピン受容体作動化作用を有することがわかる。
【００７４】
実施例１６
γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）受容体結合阻害試験
プロポリス組成物の［３Ｈ］ＧＡＢＡのラット由来大脳皮質ＧＡＢＡ受容体への結合阻害試験は、ＡＫＩＲＡ ＴＳＵＪＩらの方法（ＡＮＴＩＭＩＣＲＯＢ． ＡＧＥＮＴＳ ＣＨＥＭＯＴＨＥＲ．，３２（２）１９０−１９４，１９８８）を、一部改変して行った。
すなわち、２３０−２７０ｋｇ体重のＳＤ系ラット（日本クレア（株））の大脳皮質を摘出し、ポリトロンホモジナイザー（Ｂｒｉｎｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏ． Ｉｎｃ．製）を用いて、速度５にて３０秒間、５０倍容量の１ｍＭ アスコルビン酸、１ ｍＭ テトラ酢酸ジナトリウムエチレンジアミンを含む５０ ｍＭ トリス緩衝液（ｐＨ７．４）（以下、緩衝液Ａと略す）中にてホモジナイズした。すべての操作において、組織を０℃に維持した。その後、ホモジネートを４０，０００×ｇにて１５分間遠心分離し、得られた沈殿物を５０倍容量（原重量）の緩衝液Ａに再懸濁し、上述の条件と同条件で、ポリトロンにてホモジナイズした。遠心分離及び再懸濁を、３回繰り返して行った。次いで、３７℃にて１０分間、インキュベーションを行った。このホモジネートを、４０，０００×ｇで１５分間、遠心分離し、１０倍容量（原重量）の緩衝液Ａに再懸濁させ（以下、膜画分と略す）、測定まで、−２０℃以下で保存した。
【００７５】
ラット由来大脳皮質ＧＡＢＡ受容体への結合試験を行うにあたり、上述の膜画分を３７℃にまで解氷した後、１３６ ｍＭ 塩化ナトリウム、５ ｍＭ 塩化カリウム、２ ｍＭ 硫酸マグネシウム、２ ｍＭ リン酸二水素カリウム、２ ｍＭ 塩化カルシウム及び１ ｍＭ アスコルビン酸、１ ｍＭ テトラ酢酸ジナトリウムエチレンジアミンを含む２０ ｍＭ トリス緩衝液（ｐＨ７．４）から成る２０ ｍＭ トリス−クレブス緩衝液（以下、緩衝液Ｂと略す）で２０容量（原重量）にまでメスアップした。この膜画分を、ポリトロンホモジナイザーを用いて、速度５にて３０秒間ホモジナイズし、３７℃にて１５分間インキュベーションし、２０，０００×ｇで１０分間、遠心分離した。これにより得られた沈殿物に、洗浄、再懸濁を２回以上繰り返し、最終的に得られた沈殿物を、１００倍容量（原重量）の緩衝液Ｂに再懸濁し、これを以下の試験に用いた。
【００７６】
次ぎに、製造例１で得られたプロポリス組成物５０μｌ（最終濃度：５００μｇ／ｍｌ）と、［３Ｈ］ＧＡＢＡ（最終濃度１０ ｎＭ）を５０μｌ加え、これに上述の膜画分９００μｌを加えることにより反応を開始させた。２２℃で２０分間インキュベーションした後、ブランデル・セル・ハーベスター（Ｂｒａｎｄｅｌｌ Ｃｅｌｌ Ｈａｒｖｅｓｔｅｒ）を用い、減圧下、２×７．５ｍｌのろ過洗液を用い、ホワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）ＧＦ／Ｂフィルターを介するろ過により、反応を停止させた。ろ過後フィルター上に保持された放射能を、液体シンチレーションカウンター（Ｐａｃｋａｒｄ Ｍｏｄｅｌ ２４２５、３０−４０％ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）により測定した。
また、同時に測定した１００μＭ非放射標識ＧＡＢＡ存在下における結合量を非特異的結合量とし、これを全結合量から差し引くことにより特異的結合量を求めた。結果は、阻害率９０％であった。ここで示す阻害率（％）は、次式により算出した。
【００７７】
阻害率（％）＝１００−〔（Ｃ９−Ｂ４）／（Ｃ８ −Ｂ４）〕×１００
（式中、Ｃ９は、既知量のサンプルと［３Ｈ］ＧＡＢＡが共存している状態での［３Ｈ］ＧＡＢＡの膜画分に対する結合量を表わし、Ｃ８は、サンプルを除いた時の［３Ｈ］ＧＡＢＡの膜画分に対する結合量を表わし、Ｂ４は、過剰のＧＡＢＡ（１００μＭ）存在下での［３Ｈ］ＧＡＢＡの膜画分に対する結合量を表わす。）
なお、本測定系におけるポジティブコントロールとしてのＧＡＢＡのＩＣ５０値（ＧＡＢＡ受容体結合を５０％阻害する濃度）は、１１ ｎＭ（１．１３×１０−３μｇ／ｍｌ）であった。
本発明のプロポリス組成物が、強いＧＡＢＡ受容体作動化作用を有することがわかる。
【００７８】
実施例１７
ヒトコルチコイド受容体リガンド結合試験
ヒトコルチコイド受容体リガンド結合活性の測定は、Ａｂｂｏｔ Ｆ． Ｃｌａｒｋらの方法（Ｉｎｖｅｓｔ． Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ． Ｖｉｓ． Ｓｃｉ．，３５，８０５−８１３，１９９６）を一部改変して行った。
すなわち、ヒトリンパ芽球腫細胞ＩＭ９（ＡＴＣＣ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）を、可溶性グルココルチコイド受容体（以下、ＧＲと略す）として用いた。
上述の細胞を１０％牛胎児血清（ＨｙＣｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ）、１００Ｕ／ｍｌ ペミシリン、１００μｇ／ｍｌ ストレプトマイシン及び２ｍＭ Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）を含むＲＰＭＩ １６４０培地（Ｇｉｂｃｏ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）を用いて、３７℃、７％ ＣＯ２ の条件下で１０×１０５細胞／ｍｌになるまで培養した。その後、この細胞を、１５００ｇで１０分間遠心分離することにより、培地から剥離した。剥離した細胞を１２倍量のダルベコのリン酸塩緩衝液（以下、ＰＢＳと略す：Ｇｉｂｃｏ）を用いて洗浄した後、再び１５００ｇで１０分間遠心分離して沈殿を得、これをＰＢＳにて洗浄した。
【００７９】
洗浄した細胞に、１０ｍＭ ＴＥＳ、１０ｍＭ モリブデン酸ナトリウム、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２０ｍＭ ２−メルカプトエタノール及び１０％ グリセロールから成るホモジネーション緩衝液（ｐＨ ７．４）（以下、ＨＢと略す）を５〜６倍量加え懸濁させ、細胞をＮ２キャビテーター（Ｐａｒｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ、Ｍｏｌｉｎｅ、ＩＬ）を用いて、０℃で、１５分間、６００〜７５０ｐｓｉの窒素圧で２回、キャビテーションすることにより破砕し、この細胞破砕物を、ニコンダイアフォトを用いたＨｏｆｆｍａｎ対比型顕微鏡（Ｇａｒｄｅｎ Ｃｉｔｙ、ＮＹ）を用いて明確化した。
その後、細胞破砕調製物を、２７０００ｇで１５分間遠心分離し、結果得られた上清を、１０３０００ｇ、４℃で６０分間遠心分離した。この得られた上清画分中のタンパク質量は、ＢＣＡ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を用い、標準物質として牛血清アルブミンを用いて定量し、上清画分の標品は、ドライアイス−アセトンバス中で急冷し、−７０℃で凍結保存した。
【００８０】
競合結合試験は、ＩＭ９細胞サイトゾル１ｍｇ、１．５ｎＭの［３Ｈ］標識したトリアムシノロン（０．０２５μＣｉ：Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ、Ｈｅｉｇｈｔｓ、ＩＬ）と製造例１で得たプロポリス組成物を最終濃度が５００μｇ／ｍｌに成るように調製したものを、ＨＢ（総容量２００μｌ）中に加え、０℃で１８時間、インキュベーションさせた。木炭−デキストラン混合物（２％ 活性炭、０．５％ デキストラン、１％ ＥＤＴＡを含む１０ｍＭ トリス緩衝液（ｐＨ ７．４））１００μｌを添加することにより反応を停止させ、この混合物をさらに０℃で１０分間、インキュベーションし、８２００ｇで５分間、遠心分離した。結果として得られた上清１００μｌを、液体シンチレーションスペクトロメトリーを用いて以下の式にて放射活性を測定した。
結果は、阻害率８８％であった。なお、１０μＭ 非放射標識デキサメタソンの存在化での［３Ｈ］トリアムシノロンの非特異的結合は、常に全結合の１５％以下であった。
【００８１】
阻害率（％）＝１００−〔（Ｃ１−Ｂ）／（Ｃ０ −Ｂ）〕×１００
（式中、Ｃ１は、既知量の供試化合物と［３Ｈ］標識トリアムシノロンが共存している状態での［３Ｈ］標識トリアムシノロンの膜に対する結合量を表わし、Ｃ０は、供試化合物を除いた時の［３Ｈ］標識トリアムシノロンの膜に対する結合量を表わし、Ｂは、過剰のデキサメタソン（１０×１０−６Ｍ）存在下での［３Ｈ］標識トリアムシノロンの膜に対する結合量を表わす。）
なお、本測定系におけるポジティブコントロールとしてのデキサメタソンのＩＣ５０値（結合を５０％阻害する濃度）は、２．７ｎＭであった。本発明のプロポリス組成物が強いＧＣ様作用を有することがわかる。
【００８２】
実施例１８
メラトニン受容体結合阻害
メラトニン受容体結合阻害試験は、Ｄａｒｒｙｌ Ｓ．らの方法（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，１７５，７１−７７，１９９０）を参考に行った。
すなわち、シリアンハムスター（２〜４ヶ月齢、雄）を１６時間明期、８時間暗期という条件下で飼育し、既存の方法に従って脳からラジオレセプターアッセイ用の粗膜画分を調製した。なお懸濁には、氷冷緩衝液［５０ ｍＭ トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ｐＨ７．４）］を用いた。この膜標品（５０−１００μｇの蛋白質含む）に、［１２５Ｉ］ヨードメラトニン（最終濃度０．１ ｎＭ）、製造例１で得られたプロポリス組成物（最終濃度：１００μｇ／ｍｌ）を加え（最終液量２００μｌ）、４℃で３０分間インキュベーションさせた後、ガラス繊維濾紙上に速やかに低圧吸引濾過した。それから、濾紙上に残存した受容体結合放射活性を液体シンチレーションカウンターで測定した。また、非特異的結合は、３０μＭメラトニンの存在下で測定した。
結果は、阻害率８９％であった。ここで示す阻害率（％）は、次式により算出した。
【００８３】
阻害率（％）＝１００−〔（Ｃ１−Ｂ０）／（Ｃ０ −Ｂ０）〕×１００
（式中、Ｃ１ は、既知量のサンプルと［１２５Ｉ］ヨードメラトニンが共存している状態での［１２５Ｉ］ヨードメラトニンの膜画分に対する結合量を表わし、Ｃ０ は、サンプルを除いた時の［１２５Ｉ］ヨードメラトニンの膜画分に対する結合量を表わし、Ｂ０は、過剰のメラトニン（３０μＭ）存在下での［１２５Ｉ］ヨードメラトニンの膜画分に対する結合量を表わす。）
なお、本反応系におけるポジティブコントロールとしてのメラトニン受容体の作動化剤であるヨードメラトニンのＩＣ５０値（メラトニン受容体結合を５０％阻害する濃度）は１８８ ｎＭであった。
本発明のプロポリス組成物は、メラトニン受容体に対するヨードメラトニン結合を競合的に阻害し、メラトニン受容体と高い親和性を有することが分かる。
【００８４】
実施例１９
カルシウムチャンネル阻害試験
カルシウムチャンネル阻害試験は、Ｈｏｗａｒｄ Ｒ． Ｌｅｅらの方法（Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，３５（７），７２１−７３２，１９８４）を一部改変して行った。
すなわち、体重２５０−３５０ｇの雄性ＳＤラットを断頭して殺した後、脳を速やかに取り出した。そして、大脳皮質を氷冷したベトリ皿上で脳の残屑から解剖した。その後、得た大脳皮質を１９倍容量のＫｒｅｂｓのリン酸緩衝液（１２０ｍＭ ＮａＣｌ、４．８ｍＭＫＣｌ、２．１ｍＭ ＭｇＳＯ４、１．３ｍＭ ＣａＣｌ２、２０．３ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、３．２ｍＭ ＨＣｌ、１０ｍＭ Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｅ、ｐＨ ７．４）を遠心管に加え、ポリトロン（Ｂｒｉｎｋｍａｎ社製）を用いて１０秒間、３回（調節速度；４０％）、ホモジナイズした。その後、このホモジナイズした大脳皮質を２回、４８０００×ｇで１０分間、遠心分離することにより洗浄し、上述のＫｒｅｂｓのリン酸緩衝液にて再懸濁させた。
【００８５】
このようにして得られた新鮮な大脳皮質ホモジネートを湿重量で１−５ｍｇ／組織になるように調整し、その後、Ｋｒｅｂｓのリン酸緩衝液を含むチューブ中に総容量が２ｍｌとなるように０．０４ｎＭ［３Ｈ］標識したイソプロピル ４−（２，１，３−ベンゾキサジアゾル−４−イル）−１，４−ジヒドロ−２，６−ジメチル−ピリジン−３，５−ジカルボキシル酸メチル １−メチルエチルエステル（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ ４−（２，１，３−ｂｅｎｚｏｘａｄｉａｚｏｌ−４−ｙｌ）−１，４−ｄｉｈｙｄｒｏ−２，６−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−ｐｙｒｉｄｉｎｅ−３，５−ｄｉｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ ｍｅｔｈｙｌ １−ｍｅｔｈｙｌｅｔｈｙｌｅｓｔｅｒ、以下［３Ｈ］（＋）ＰＮ ２００−１００と略す）（８９Ｃｉ／ｍｍｏｌ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，Ｍａｓｓ．社製）及び製造例１で得られた最終濃度が５００μｇ／ｍｌの濃度になるように調整したプロポリス組成物を加え、ナトリウムランプを用いた暗室で、２２℃、９０分間、インキュベーションした。
【００８６】
その後、膜に結合した放射活性をグラスファイバーフィルター（Ｗｈａｔｍａｎ社製、ＧＦ／Ｂ）を用いて吸引濾過してトラップし、次いで、０．９％食塩水５ｍｌを用いて３回洗浄した。そして、フィルターを乾燥させ、シンチレーション溶液中で一晩浸漬することにより、フィルター中の放射活性を溶出させた後、この溶出物中の放射活性を液体シンチレーションスペクトロメトリー（４３％ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）を用いて測定し、以下に示す式を用いてカルシウムチャンネル阻害活性を算出した。
また、特異的結合は、１μＭのニフェジピン（ｎｉｆｅｄｉｐｉｎｅ）と置換される結合と定義し、タンパク質量は、Ｌｏｗｒｙらの方法（Ｏ．Ｈ．Ｌｏｗｒｙ， Ｎ．Ｊ．Ｒｏｓｅｎｂｒｏｕｇｈ， Ａ．Ｌ．Ｆａｒｒ ａｎｄ Ｒ．Ｊ．Ｒａｎｄａｌｌ；Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． １９３， ２６５−２７５ （１９５１））により測定した。
【００８７】
阻害率（％）＝１００−〔（Ｃ１−Ｂ）／（Ｃ０ −Ｂ）〕×１００
（式中、Ｃ１ は、既知量の供試化合物と［３Ｈ］（＋）ＰＮ ２００−１００が共存している状態での［３Ｈ］（＋）ＰＮ ２００−１００の膜画分に対する結合量を表わし、Ｃ０ は、供試化合物を除いた時の［３Ｈ］（＋）ＰＮ ２００−１００の膜画分に対する結合量を表わし、Ｂは、過剰のｎｉｆｅｄｉｐｉｎｅ（１×１０−６Ｍ）存在下での［３Ｈ］（＋）ＰＮ ２００−１００の膜画分に対する結合量を表わす。）
なお、本反応系におけるポジティブコントロールとしてのカルシウムチャンネル阻害剤であるニトレンジピン（ｎｉｔｒｅｎｄｉｐｉｎｅ、ファイザー製薬社製）のＩＣ５０値は、１．７ｎＭであった。
用いたプロポリス組成物では、阻害率が７４％であった。本発明のプロポリス組成物は、カルシウムチャンネルに対するニトレンジピンの結合を競合的に阻害し、強いカルシウムチャンネル阻害作用を有することがわかる。
【００８８】
実施例２０
メラトニン凝集ホルモン（ＭＣＨ）受容体結合阻害試験
ＭＣＨ受容体結合阻害試験は、Ｊｏｎ Ｃｈａｍｂｅｒｓらの方法（Ｎａｔｕｒｅ， ４００， ２６１−２６５， １９９９）を参考にして行った。
すなわち、ヒトＭＣＨ受容体であるＳＬＣ１を発現させたチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）（２〜４μｇ／タンパク質となるように調整）、０．１ｎＭの［１２５Ｉ］標識した［Ｐｈｅ１３，Ｔｙｒ１９］−ＭＣＨ（比活性；２２００Ｃｉ／ｍｍｏｌ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ製）及び最終濃度が５００μｌ／ｍｌになるように調整した製造例１で得られたプロポリス組成物とを、２２℃で６０分間、インキュベートした。その後、グラスファイバーフィルター（Ｗｈａｔｍａｎ社製、ＧＦ／Ｃ）を用いて吸引濾過して放射活性をトラップし、次いで、０．３％脱脂粉乳５ｍｌを用いて３回洗浄した。そして、フィルターを乾燥させ、シンチレーション溶液中で一晩浸漬することにより、フィルター中の放射活性を溶出させた後、この溶出物中の放射活性を液体シンチレーションスペクトロメトリー（４３％ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）を用いて測定し、以下に示す式を用いてＭＣＨ受容体阻害活性を算出した。
結果は、阻害率が５６％であった。また、特異的結合は、０．１μＭのＭＣＨと置換される結合と定義し、タンパク質量は、Ｌｏｗｒｙらの方法（Ｏ．Ｈ．Ｌｏｗｒｙ， Ｎ．Ｊ．Ｒｏｓｅｎｂｒｏｕｇｈ， Ａ．Ｌ．Ｆａｒｒ ａｎｄ Ｒ．Ｊ．Ｒａｎｄａｌｌ；Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． １９３， ２６５−２７５ （１９５１））により測定した。
【００８９】
阻害率（％）＝１００−〔（Ｃ１−Ｂ）／（Ｃ０ −Ｂ）〕×１００
（式中、Ｃ１ は、既知量の供試化合物と［１２５Ｉ］標識した［Ｐｈｅ１３，Ｔｙｒ１９］−ＭＣＨが共存している状態での［１２５Ｉ］標識した［Ｐｈｅ１３，Ｔｙｒ１９］−ＭＣＨの膜画分に対する結合量を表わし、Ｃ０ は、供試化合物を除いた時の［１２５Ｉ］標識した［Ｐｈｅ１３，Ｔｙｒ１９］−ＭＣＨの膜画分に対する結合量を表わし、Ｂは、過剰のＭＣＨ（１×１０−５Ｍ）存在下での［１２５Ｉ］標識した［Ｐｈｅ１３，Ｔｙｒ１９］−ＭＣＨの膜画分に対する結合量を表わす。）
なお、本反応系におけるポジティブコントロールとしてのＭＣＨ受容体作動化薬であるＭＣＨのＩＣ５０値は、０．２５ｎＭであった。
本発明のプロポリスは、ＭＣＨ受容体に対するＭＣＨの結合を競合的に阻害し、ＭＣＨ受容体と高い親和性を有することが分かる。
【００９０】
実施例２１
アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害活性試験
ＡＣＥ阻害活性試験は、Ｈｏｏｒｎ，Ｃ．Ｍ．とＲｏｔｈ，Ｒ．Ａ．の方法（Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１１０，５９７−６０２，１９９３）を一部改変して行った。
すなわち、ガラス試験管中に、製造例１で得られたプロポリス組成物を最終濃度が５００μｇ／ｍｌとなるように１０％ジメチルスルホキシド（以下、ＤＭＳＯと略す）に溶解したものを０．０６ｍｌ加え、次いで、１００ｍＵ／ｍｌのＡＣＥ（シグマ社製）０．０３ｍｌを添加し、３７℃で５分間、プレインキュベーションした後、１００ｍＭ ホウ酸緩衝液 ｐＨ ８．３、５００ｍＭ ＮａＣｌ、６．５ｍＭ ［３Ｈ］標識したヒプリルグリシルグリシン（ｈｙｐｐｕｒｙｌｇｌｙｃｙｌｇｌｙｃｉｎｅ、以下、［３Ｈ］ＨＧＧと略す）０．３ｍｌを加え、３７℃で５時間、インキュベーションし、１Ｎ 塩酸０．５ｍｌを加えて反応を停止させた。その後、酢酸エチル１．５ｍｌを加えて１分間攪拌し、ＡＣＥにより遊離した［３Ｈ］したヒプリル酸（ｈｉｐｐｕｒｉｃ ａｃｉｄ）を抽出し、この酢酸エチル層１．０ｍｌを分取して乾固させた後、液体シンチレーションを加え、放射活性を測定し、次式にて阻害率（％）を算出した。
【００９１】
阻害率（％）＝（Ａ−Ｂ）／Ａ×１００
（ここで、Ａは阻害剤を含まない場合の放射活性値を表わし、Ｂは阻害剤を添加した場合の放射活性値を表わす。）
結果は、阻害率６０％であった。なお、本反応系におけるポジティブコントロールとしてのＡＣＥ阻害剤であるカプトプリル（ｃａｐｔｏｐｒｉｌ、和光純薬製）のＩＣ５０値は、０．００１１μＭであった。 本発明のプロポリス組成物は強いＡＣＥ阻害作用を有することがわかる。
【００９２】
実施例２２
トロンボキサンＡ２（ＴＸＡ２）合成酵素阻害活性試験
ＴＸＡ２合成酵素阻害活性試験は、ＷＡＤＥ， Ｍ． Ｌ．とＦＩＴＺＰＡＴＲＩＣＫ， Ｆ． Ａ．の方法（Ａｒｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ．， ３４７， １７４−１８０， １９９７）を一部改変して、ヒト血小板ミクロソームのトロンボキサン合成酵素阻害活性を調べた。
すなわち、１０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ ７．４）中に、血小板ミクロソーム（０．５ｍｇ タンパク質）、１０μＭ プロスタグランジンＨ２（以下、ＰＧＨ２と略す）、５ｍＭ エピネフリン、２μＭ ヘミン、及び前記製造例１で調製したプロポリス組成物（最終濃度：５００μｇ／ｍｌ）を含む反応液（全量 ０．２ｍｌ）を用いた。プロポリス組成物と血小板ミクロソームを２２℃で３分間プレインキュベーションした後、基質として１０μＭ ＰＧＨ２を添加して２２℃で２分間反応させた。その後、塩化スズ溶液を添加して反応を停止し、生成したトロンボキサンＢ２（以下、ＴＸＢ２と略す）の量を、ＴＸＢ２ ＥＩＡ（Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏ Ａｓｓａｙ）キット（アマシャム ファルマシア バイオテク社製）を用いて測定した。
結果は、阻害率９３％であった。なお、本反応系におけるポジティブコントロールとしてのＴＸＡ２合成酵素阻害剤であるｆｕｒｅｇｒｅｌａｔｅのＩＣ５０値（酵素活性を５０％阻害する濃度）は０．２１μＭであった。本発明のプロポリス組成物は、強力なＴＸＡ２合成酵素阻害活性を有することが分かる。
【００９３】
実施例２３
一酸化窒素合成酵素阻害活性試験
プロポリス抽出物のＮＯＳ阻害活性試験は、Ｅｓｔｒａｄａらの方法（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１８６，４７５−４８２（１９９２））を、一部改変して行った。
マウス由来のマクロファージ様細胞ＲＡＷ２６４−７を５×１０５／ｗｅｌｌで培養プレートに播種し、３７℃で２４時間インキュベーションした。この培養プレートに、ＬＰＳ（リポポリサッカライド；１０ｎｇ／ｍｌ）および製造例１で得られたプロポリス組成物を５００μｇ／ｍｌの濃度になるように調整して添加し、３７℃で１８時間インキュベーションした。得られた培養液（１００μｌ）とＧｒｉｅｓｓ試薬（１００μｌ）を反応させ、５４０ｎｍの吸光度を測定した。そして、プロポリス抽出物の非存在下での吸光度を１００％とし、プロポリス抽出物存在下での百分率（％）を求め、阻害率を算出した。
その結果は、阻害率９２％であった。なお、本反応系におけるポジティブコントロールとしてのＮＯＳ阻害剤であるＬ−ＮＭＭＡのＩＣ５０値（酵素活性を５０％阻害する濃度）は、６９μＭであった。本発明のプロポリス組成物に、強いＮＯＳ阻害作用を有することがわかる。
【００９４】
実施例２４
ヒト免疫不全ウイルス−１プロテアーゼ阻害活性試験
ＨＩＶ−１プロテアーゼ阻害活性の測定は、ＴＯＴＨ， Ｍ． Ｖ．とＭＡＲＳＨＡＬＬ， Ｇ． Ｒ．の方法（Ｉｎｔ． Ｊ． Ｐｅｐｔｉｄｅ． Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．，３６，５４４−５５０，１９９０）を一部改変して行った。
すなわち、ＨＩＶ−１プロテアーゼ（遺伝子組み換えにより大腸菌に発現させたもの、バケム社製）を、２００ｍＭ 塩化ナトリウム、５ｍＭ ジチオトレイトール、１０％（ｖ／ｖ）グリセロールを含む１００ｍＭ 酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．９）（以下、緩衝液Ａとする）し、０．０２ｍｇ／ｍｌの酵素溶液とした。また、１ｍｇ／ｍｌのＨｉｓ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−ｐ−ｎｉｔｒｏ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｎｌｅ−Ｓｅｒ−ＮＨ２（バケム社製）を蒸留水に溶解し、基質溶液とした。
０．５ｍｌ容量のプラスチックチューブに、緩衝液Ａ１００μｌ、基質溶液１０μｌ及び製造例１で得られたプロポリス組成物１０μｌ（最終濃度：５００μｇ／ｍｌ）を加え、３７℃で５分間、プレインキュベートした後、上記酵素溶液２５μｌを加え十分に攪拌した後、３７℃で４０分間、反応を行った。その後、１０％トリフルオロ酢酸１５μｌを添加して反応を停止させた。
反応停止後、酵素反応により遊離してくるｐ−ｎｉｔｒｏ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｎｌｅ−Ｓｅｒ−ＮＨ２量を、下記条件下でＨＰＬＣにより定量した。
【００９５】
＜ＨＰＬＣ条件＞
カラム：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ Ｃ８（Ａ−２０２、１５０×４．６ｍｍＩ．Ｄ．、（株）ワイエムシィ製）
溶出溶媒：０．１％トリフルオロ酢酸を含む０〜６３％のアセトニトリルの直線濃度勾配（２０分）
流速：１ｍｌ／ｍｉｎ．
検出波長：３００ｎｍ
また、阻害率（％）は、次式により算出した。
阻害率（％）＝（Ｂ−Ｃ）／Ｂ×１００
〔式中、Ｂ：阻害剤を含まない場合のｐ−ｎｉｔｒｏ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｎｌｅ−Ｓｅｒ−ＮＨ２のピーク面積、Ｃ：阻害剤を添加した場合のｐ−ｎｉｔｒｏ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｎｌｅ−Ｓｅｒ−ＮＨ２のピーク面積を表す。〕
上述して得た結果、阻害率は、９４％であった。なお、本測定系におけるポジティブコントロールとしてのペプステイン（ｐｅｐｓｔａｉｎ）ＡのＩＣ５０値は、５．２μＭ（３．５７μｇ／ｍｌ）であった。本発明のプロポリス組成物に強いＨＩＶ−１プロテアーゼ阻害作用を有することがわかる。
【００９６】
以下に処方例を示す。
処方例１
［錠剤の製造］
製造例１で得られたブラジル産プロポリス及び中国産プロポリスのエタノール抽出物を重量比で１：１に混合したブレンドプロポリスエキスを用いて、常法に従って、下記の組成の錠剤を製造した。
（組 成） （配合：質量％）
ブレンドプロポリスエキス ２４
乳糖 ６３
コーンスターチ １２
グァーガム １
【００９７】
処方例２
［ジュースの製造］
製造例１で得られたブラジル産プロポリス及び中国産プロポリスのエタノール抽出物を重量比で１：１に混合したブレンドプロポリスエキスを用いて、常法に従って、下記の組成のジュースを製造した。
（組 成） （配合：質量％）
冷凍濃縮温州みかん果汁 ５．０
果糖ブドウ糖液糖 １１．０
クエン酸 ０．２
Ｌ−アスコルビン酸 ０．０２
香料 ０．２
色素 ０．１
ブレンドプロポリスエキス ０．２
水 ８３．２８
【００９８】
処方例３
［フェイスクリームの製造］
製造例１で得られたブラジル産プロポリス及び中国産プロポリスのエタノール抽出物を重量比で１：１に混合したブレンドプロポリスエキスを用いて、常法に従って、下記の組成のフェイスクリームを製造した。
（組 成） （配合：重量％）
イソステアリン酸イソプロピル ８．０
ホホバ油 ６．０
セタノール ８．０
ステアリルアルコール ２．０
ポリオキシエチレンラウリルエーテル １．５
プロピレングリコール ６．０
ソルビトール １．０
パラベン ０．４
ブレンドプロポリスエキス ０．５
ビタミンＥ ０．５
香料 ０．１
精製水 ６６．０
【００９９】
【発明の効果】
本発明で特定する成分を有するプロポリス組成物は、上記各実施例で示すような生物活性を有し、前記用途に有用である。これらの生物活性は含有されている成分に由来すると考えられる。また、このような組成物は、長期間服用しても安全である。
Claims (30)
- ケルセチン、ｐ−クマール酸及びアルテピリンＣを含有し、さらにクリシン、ガランギン若しくはカフェイン酸フェネチルエステルを含有することを特徴とするプロポリスを含むアンジオテンシンＩＩ受容体拮抗用組成物。
- ケルセチン、ｐ−クマール酸及びアルテピリンＣを含有し、さらにクリシン、ガランギン若しくはカフェイン酸フェネチルエステルを含有することを特徴とするプロポリスを含むアドレナリンβ２受容体作動化用組成物。
- ケルセチン、ｐ−クマール酸及びアルテピリンＣを含有し、さらにクリシン、ガランギン若しくはカフェイン酸フェネチルエステルを含有することを特徴とするプロポリスを含む女性ホルモン様組成物。
- ケルセチン、ｐ−クマール酸及びアルテピリンＣを含有し、さらにクリシン、ガランギン若しくはカフェイン酸フェネチルエステルを含有することを特徴とするプロポリスを含むエンドセリン拮抗用組成物。
- ケルセチン、ｐ−クマール酸及びアルテピリンＣを含有し、さらにクリシン、ガランギン若しくはカフェイン酸フェネチルエステルを含有することを特徴とするプロポリスを含むセロトニン再吸収阻害用組成物。
- ケルセチン、ｐ−クマール酸及びアルテピリンＣを含有し、さらにクリシン、ガランギン若しくはカフェイン酸フェネチルエステルを含有することを特徴とするプロポリスを含むセロトニン放出促進用組成物。
- ケルセチン、ｐ−クマール酸及びアルテピリンＣを含有し、さらにクリシン、ガランギン若しくはカフェイン酸フェネチルエステルを含有することを特徴とするプロポリスを含むセロトニン容体拮抗用組成物。
- ケルセチン、ｐ−クマール酸及びアルテピリンＣを含有し、さらにクリシン、ガランギン若しくはカフェイン酸フェネチルエステルを含有することを特徴とするプロポリスを含むセロトニントランスポーター受容体結合阻害用組成物。
- ケルセチン、ｐ−クマール酸及びアルテピリンＣを含有し、さらにクリシン、ガランギン若しくはカフェイン酸フェネチルエステルを含有することを特徴とするプロポリスを含むブラジキニン受容体拮抗用組成物。
- ケルセチン、ｐ−クマール酸及びアルテピリンＣを含有し、さらにクリシン、ガランギン若しくはカフェイン酸フェネチルエステルを含有することを特徴とするプロポリスを含むオキシトシン拮抗用組成物。
- ケルセチン、ｐ−クマール酸及びアルテピリンＣを含有し、さらにクリシン、ガランギン若しくはカフェイン酸フェネチルエステルを含有することを特徴とするプロポリスを含むニコチン性アセチルコリン受容体作動化用組成物。
- ケルセチン、ｐ−クマール酸及びアルテピリンＣを含有し、さらにクリシン、ガランギン若しくはカフェイン酸フェネチルエステルを含有することを特徴とするプロポリスを含むムスカリン性アセチルコリン受容体作動化用組成物。
- ケルセチン、ｐ−クマール酸及びアルテピリンＣを含有し、さらにクリシン、ガランギン若しくはカフェイン酸フェネチルエステルを含有することを特徴とするプロポリスを含むドーパミン１受容体作動化用組成物。
- ケルセチン、ｐ−クマール酸及びアルテピリンＣを含有し、さらにクリシン、ガランギン若しくはカフェイン酸フェネチルエステルを含有することを特徴とするプロポリスを含むベンゾジアゼピン受容体作動化用組成物。
- ケルセチン、ｐ−クマール酸及びアルテピリンＣを含有し、さらにクリシン、ガランギン若しくはカフェイン酸フェネチルエステルを含有することを特徴とするプロポリスを含むγ−アミノ酪酸受容体作動化用組成物。
- ケルセチン、ｐ−クマール酸及びアルテピリンＣを含有し、さらにクリシン、ガランギン若しくはカフェイン酸フェネチルエステルを含有することを特徴とするプロポリスを含むグルココルチコイド様作用組成物。
- ケルセチン、ｐ−クマール酸及びアルテピリンＣを含有し、さらにクリシン、ガランギン若しくはカフェイン酸フェネチルエステルを含有することを特徴とするプロポリスを含むメラトニン受容体作動化用組成物。
- ケルセチン、ｐ−クマール酸及びアルテピリンＣを含有し、さらにクリシン、ガランギン若しくはカフェイン酸フェネチルエステルを含有することを特徴とするプロポリスを含むメラトニン受容体拮抗用組成物。
- ケルセチン、ｐ−クマール酸及びアルテピリンＣを含有し、さらにクリシン、ガランギン若しくはカフェイン酸フェネチルエステルを含有することを特徴とするプロポリスを含むカルシウムチャンネル阻害用組成物。
- ケルセチン、ｐ−クマール酸及びアルテピリンＣを含有し、さらにクリシン、ガランギン若しくはカフェイン酸フェネチルエステルを含有することを特徴とするプロポリスを含むメラトニン凝集ホルモン受容体拮抗用組成物。
- ケルセチン、ｐ−クマール酸及びアルテピリンＣを含有し、さらにクリシン、ガランギン若しくはカフェイン酸フェネチルエステルを含有することを特徴とするプロポリスを含むアンジオテンシン変換酵素阻害用組成物。
- ケルセチン、ｐ−クマール酸及びアルテピリンＣを含有し、さらにクリシン、ガランギン若しくはカフェイン酸フェネチルエステルを含有することを特徴とするプロポリスを含むトロンボキサンＡ２合成酵素阻害用組成物。
- ケルセチン、ｐ−クマール酸及びアルテピリンＣを含有し、さらにクリシン、ガランギン若しくはカフェイン酸フェネチルエステルを含有することを特徴とするプロポリスを含む一酸化窒素合成酵素阻害用組成物。
- ケルセチン、ｐ−クマール酸及びアルテピリンＣを含有し、さらにクリシン、ガランギン若しくはカフェイン酸フェネチルエステルを含有することを特徴とするプロポリスを含むヒト免疫不全ウイルスプロテアーゼ阻害用組成物。
- プロポリスが、ケルセチン当量が４．５８ｍｇ／ｍｌ以上で、ｐ−クマール酸を１．１６ｍｇ／ｍｌ以上、アルテピリンＣを６．７３ｍｇ／ｍｌ以上、クリシンを０．８４ｍｇ／ｍｌ以上、ガランギンを０．５３ｍｇ／ｍｌ以上及びカフェイン酸フェネチルエステルを０．８１ｍｇ／ｍｌ以上を含有するプロポリスであることを特徴とする請求項１〜２４のいずれか１項記載の組成物。
- プロポリスが、産地の異なるプロポリス又はそれらの抽出物を少なくとも２種以上を含むプロポリスであることを特徴とする請求項１〜２５のいずれか１項記載のプロポリス組成物。
- 請求項１〜２６のいずれか１項記載の組成物を含む経口用組成物又は非経口用組成物。
- 食品である請求項２７記載の経口用組成物。
- 医薬である請求項２７記載の経口用組成物又は非経口用組成物。
- 化粧料である請求項２７記載の非経口用組成物。
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