JP2003534001A - プロｐｓａの特定形態に対する抗体およびそのイムノアッセイにおける使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）の酵素的に不活性な前駆体の特定形態に対する抗体、その製造、およびその［−５，−６，−７］プロＰＳＡの測定のためのイムノアッセイにおける使用、ならびに前立腺癌の分野における改良された診断法のためのこれらのアッセイから得られる測定値の適用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本発明は、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）の酵素的に不活性な前駆体の特定形態
に対する抗体、その製造、その［−５，−６，−７］プロＰＳＡの測定のための
イムノアッセイにおける適用、および前立腺癌の分野における改良された診断法
のためのこれらのアッセイから得られる測定値の使用に関する。

【０００２】 発明の詳細な説明 前立腺の癌（ＰＣａ）は、米国人男性に最も頻繁に診断される癌の形態である
。Ｐａｒｋｅｒ，Ｓ．Ｌ．ら、ＣＡ Ｃａｎｃｅｒ Ｊ．Ｃｌｉｎ．，４６：５
−２７，１９９６。ＰＳＡとも呼ばれる前立腺特異的抗原は、前立腺癌を有する
患者の治療のための信頼性のある予後マーカーとして広く用いられた。Ｃａｔａ
ｌｏｎａ，Ｗ．Ｊ．ら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３２４：１１５６−１１
６１，１９９１；Ｏｓｔｅｒｌｉｎｇ，Ｊ．Ｅ．，Ｊ．Ｕｒｏｌ．，１４５：９
０７−９２３，１９９１。腫瘍マーカーとして、これは、健常な男性の血液にお
いて検出されないか、または検出されたとしても非常に低濃度である点で、大き
な利点を有する。一般に、該疾患が進行した段階で非常に上昇したＰＳＡ値が測
定される。

【０００３】 非常に重要な臨床上の問題は、初期における一定のＰＣａの検出およびＰＣａ
と悪性前立腺過形成（ＢＰＨ）との区別である。現行のＰＳＡ試験に伴う主な問
題の１つは、このＢＰＨとＰＣａとの区別が確実でないことである。ＭｃＣｏｒ
ｍａｃｋ，Ｒ．Ｔ．ら、Ｕｒｏｌｏｇｙ，４５：７２９−７４４，１９９５。例
えば、血清中２〜１５ｎｇ／ｍｌの範囲のＰＳＡ濃度では、かかるＰＳＡ値はＢ
ＰＨによっても引き起こされるため、悪性の存在は明確に決定できない。ＰＣａ
の存在を確かめるためにはＰＳＡ測定に加え、高価で痛みを伴う試験（例えば、
直腸生検）を行わなくてはならない。

【０００４】 血清におけるＰＳＡ検出の診断精度を向上させるため、ＰＳＡ密度、ＰＳＡ割
合、総ＰＳＡに対する遊離ＰＳＡ比またはＰＳＡ複合体と総ＰＳＡとの比などの
種々の代替手順が提案された。Ｂｅｎｓｏｎ，Ｍ．Ｃ．ら、Ｊ．Ｕｒｏｌ．，１
４７：８１５−８１６，１９９２；Ｃａｒｔｅｒ，Ｈ．Ｂ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｍｅ
ｄ．Ａｓｓｏｃ．，２６７：２２１５−２２２０，１９９２；Ｏｅｓｔｅｒｌｉ
ｎｇ，Ｊ．Ｅ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．，２７０：８６０−８６４
，１９９３。

【０００５】 ＰＳＡは「カリクレイン」として知られるタンパク質／酵素の一群に属する。
ヒトカリクレインファミリーは、ｈＫ１、ｈＫ２およびｈＫ３（ＰＳＡ）と記載
される３つのメンバーから構成される。Ｃｌｅｍｅｎｔｓ，Ｊ．Ａ．，Ｅｎｄｏ
ｃｒ．Ｒｅｖ．，１０：３９３−４１９，１９８９；Ｃａｒｂｉｎｉ，Ｌ．Ａ．
ら、Ｊ．Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ．，１１：８９３−８９８，１９９３。

【０００６】 ｈＫ１は、主に腎臓、膵管および下顎骨下唾液腺で産生される。Ｆｕｋｕｓｈ
ｉｍａ，Ｄ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２４：８０３７−８０４３，１９
８５。

【０００７】 ｈＫ２はＰＳＡと同様、主に前立腺上皮で産生され（Ｍｏｒｒｉｓ，Ｂ．Ｊ．
，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈｙｓ．，１６：３４５−３５１，１９８
９）、ＰＳＡと７８％の相同性を有する（Ｓｃｈｅｄｌｉｃｈ，Ｌ．Ｊ．ら、Ｄ
ＮＡ，６：４２９−４３７，１９８７；Ｌｉｌｊａ，Ｈ．，Ｗｏｒｌｄ Ｊ．Ｕ
ｒｏｌ．，１１：１８８−１９１，１９９３）。ｈＫ２の潜在的前立腺癌マーカ
ーとしての性質は、Ｙｏｕｎｇ，Ｃ．Ｙ．Ｆ．ら、Ｔｈｅ Ｐｒｏｓｔａｔａ
Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ，７： １７−２４，１９９６の概説論文で考察された。

【０００８】 前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）すなわちｈＫ３は、分子量が約２９，０００ダル
トンの糖蛋白である。これは、前立腺上皮細胞で形成され、精液の成分である。
ＰＳＡは中性セリンプロテアーゼの酵素活性を有する。その主な機能は、射精液
の必須成分として精子の運動を阻止するセミノゲリンＩおよびＩＩならびにフィ
ブロネクチンを切断することである。これらのタンパク質を加水分解することに
より、ＰＳＡは精液凝塊の液化を引き起こし、精子を移動させる。

【０００９】 ＰＳＡはキモトリプシン様プロテアーゼであるが、ｈＫ２はトリプシン様プロ
テアーゼである。

【００１０】 ＰＳＡは、血清中に、異なる分子形態で存在することが知られている。ＰＳＡ
の大部分が不活性な複合体の形態で存在し、それにより、とりわけ、α１−抗−
キモトリプシンが、ＰＳＡと複合体を形成し、それにより酵素活性も阻害される
。

【００１１】 しかしながら、さらに複合体は、ＰＳＡ−ＡＣＴと比べて非常に低い程度にし
か血清中に存在しないα１−抗トリプシンインヒビターおよびプロテインＣイン
ヒビターなどの他のセリンプロテアーゼインヒビター（セルピン）によっても形
成されうる。さらにまた、ＰＳＡは、別のタイプのプロテアーゼインヒビター、
すなわち、α２−マクログロブリン（α２−Ｍ）とも複合体を形成する。このプ
ロテアーゼインヒビターの血清中における含量について、文献ではさまざまな記
載がなされており、これは、この複合体ではＰＳＡが免疫学的に入手可能でない
ことが主な理由である。以下、本明細書中で使用される「総ＰＳＡ」という表現
は、α２−ＭとのＰＳＡ複合体は現在使用されているいかなる免疫学的検出方法
を用いても検出できないことから、遊離ＰＳＡおよびセルピンと複合体を形成し
たＰＳＡをあわせて言及するものである（ＴｅｗａｒｉおよびＢｌｕｅｓｔｅｉ
ｎ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌｉｇａｎｄ Ａｓｓａｙ １９９５，第１８巻，Ｓ．１８
６−１９６）。「総ＰＳＡ」に加えて、ＰＳＡトータルという表現も同じ意味で
使用する。

【００１２】 同様に、他の２つのカリクレインｈＫ１およびｈＫ２の総カリクレインに対し
ても同じ定義を適用する。しばしば、カリクレイン（トータル）またはＰＳＡ（
トータル）という。

【００１３】 複合体を形成したＰＳＡに加え、複合体を形成しえない酵素的に不活性な遊離
ＰＳＡもまた、血清中に存在する。Ｐｅｔｔｅｒｓｏｎら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ
．第４１巻，（Ｎｏ．１０），１４８０−１４８８頁，（１９９５）には、総Ｐ
ＳＡの約１５％〜２０％が遊離（複合体を形成していない）形態で血清中に存在
することが記載されている。したがって、Ｐｅｔｔｅｒｓｏｎら、および他の研
究者グループは、この遊離の酵素的に不活性なＰＳＡがプロ酵素形態でありうる
こと、またはこれが、ＰＳＡのアミノ酸１４５と１４６間のｌｙｓ−ｌｙｓ結合
の内部切断により不活性となったのではないかということについて考察している
。

【００１４】 ＰＳＡ分子は、２６１個のアミノ酸からなるプレプロフォームとして合成され
る。１７個のアミノ酸長のシグナルペプチドが小胞体において切断される。した
がって、酵素的に不活性なプロＰＳＡ（チモーゲン）は２４４個のアミノ酸長で
ある。

【００１５】 酵素的に活性な「成熟」ＰＳＡは、プロペプチド（７個のアミノ酸）が切断さ
れると生じる（例えば、Ｍｅｌｅｇｏｓ ＋ Ｄｉａｍａｎｄｉｓ，Ｃｌｉｎ．
Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２９（３），１９３−２００，１９９６））。

【００１６】 ＰＳＡプロペプチドの７個のＮ末端アミノ酸を有するプロＰＳＡ分子は、［−
７］プロＰＳＡとも呼ばれる。Ｎ末端が短い配列を有するプロＰＳＡ分子は、プ
ロペプチド部分の長さに応じて［−６］、［−５］、［−４］等のプロＰＳＡと
よばれる。

【００１７】 ヒト血清中に存在するＰＳＡの形態の正確な構造は、まだ詳細には決定も解析
もされていない。とりわけ、例えば、血清中に複合体でなく遊離で存在するＰＳ
Ａの正確な構造の概要は、まだ明らかになっていない（Ｐａｕｓら、（１９９８
） Ｊ．ｏｆ Ｕｒｏｌｏｇｙ １５９，１５９９−１６０５）。その理由は、
血清中の遊離ＰＳＡ濃度が非常に低いため、十分な材料を単離するのが大変困難
であり、研究室での試験に利用できないためである。Ｎｏｌｄｕｓら Ｊ．ｏｆ
Ｕｒｏｌｏｇｙ １５８，１６０６−１６０９ （１９９７）は、精製されて
いない形態の遊離ＰＳＡを、高力価ＰＳＡ血清の混合物（ＰＳＡトータル＞２０
００ｎｇ／ｍｌ）２３０ｍｌから約２５％の収率で単離し、Ｎ末端シークエンシ
ングを用いて解析した。正常Ｎ末端およびアミノ酸１４５と１４６間のＰＳＡ鎖
の切断の存在が示された。このことは、このＰＳＡが複合体の形態で存在しない
ことを説明しうる。プロＰＳＡ形態、すなわち、Ｎ末端にさらなるアミノ酸を有
するＰＳＡ分子は示されなかった。

【００１８】 国際公開第９８／４９３２３号パンフレットには、ＰＳＡに対する抗体を用い
て生物学的試料中に存在する遊離ＰＳＡの分子形態を同定し、分子の特性付けを
行った。それにより、遊離ＰＳＡの有意な部分が血清中に［−４］プロＰＳＡ、
すなわち、プロＰＳＡ配列あたり４個のアミノ酸が伸長されたＮ末端ＰＳＡ分子
として存在することが示された。

【００１９】 関連する従来技術には、プロペプチドの部分をなお含有する遊離ＰＳＡ分子の
特異的診断方法はない。国際公開第９８／４９３２３号パンフレットに記載の［
−４］プロＰＳＡ以外のプロＰＳＡ形態がヒト起源の試料液中に存在するか否か
は、十分に理解されていない。さらに、関連する従来技術には、異なる長さのプ
ロＰＳＡ配列部分を有する遊離ＰＳＡの診断値に関するデータも含まれていない
。

【００２０】 したがって、本発明の目的は、特定のプロＰＳＡ形態の特異的検出を行うため
の診断ツールを提供すること、およびこれらの新規な試験が前立腺癌の分野にお
ける、特にＢＰＨとＰＣａの区別における改良された診断法に貢献しうるか否か
を判定することである。

【００２１】 したがって、最初の段階で、国際公開第９８／４９３２３号パンフレットの［
−４］プロＰＳＡに相当しない他のプロＰＳＡ形態が見出されるか否かを最新の
解析方法を用いて調べた。驚いたことに、少なくとも３つのさらなるプロＰＳＡ
形態（［−２、−５、−７］プロＰＳＡ）が見出された。これらの予備試験に基
づき、これらのプロＰＳＡ形態の診断的関連性に関する疑問を検討した。

【００２２】 本発明の目的を達成するために必要な作業を行うため、［−５、−６、−７］
プロＰＳＡと反応するが、より短いプロＰＳＡ形態［−４］、［−３］などを有
意に検出しない抗体を作製し、特異的に選択した。

【００２３】 異なる長さを有するプロＰＳＡ形態のＮ末端配列に相当する合成ペプチドを作
製し、免疫化、スクリーニングおよび特性付けの目的に使用した。

【００２４】 本発明に関連する特異性を有する抗体を開発し、単離した。かかる抗体は、［
−５、−６、−７］プロＰＳＡと反応するが、［−４］プロＰＳＡペプチドまた
はそれより短いＰＳＡペプチドに対して有意な結合特性を示さない。

【００２５】 したがって、好ましい具体的な態様は、［−５、−６、−７］プロＰＳＡに結
合するが、［−４］プロＰＳＡまたはそれより短いプロＰＳＡ形態と本質的に反
応しないことを特徴とする、プロＰＳＡに対する抗体である。

【００２６】 これらの抗体を、通常の方法により精製し、修飾し、誘導し、［−５、−６、
−７］プロＰＳＡを検出するためのイムノアッセイに使用した。

【００２７】 驚いたことに、天然の試料は、［−５、−６、−７］プロＰＳＡの測定可能な
部分を含むことが観察された。さらにまた、驚いたことに、これらの特定のプロ
ＰＳＡ形態は、比較的安定であり、イムノアッセイを用いて測定しうる有意な濃
度で被検試料中に存在することが観察された。

【００２８】 本発明の方法を用いて測定される［−５、−６、−７］プロＰＳＡ値を、臨床
的および診断的関連性に関して従来技術で公知のＰＳＡアッセイと比較した。

【００２９】 最初に述べたように、臨床的診断法におけるＰＳＡ測定値の使用に伴う主な問
題の１つは、低いがわずかに上昇したＰＳＡ値の範囲である。ＢＰＨとＰＣａと
の区別は総ＰＳＡ値では行うことができない。本発明によるプロＰＳＡの特定形
態に関する試験は、この臨床的に特に重要な測定範囲、すなわち総ＰＳＡ濃度が
２０ｎｇ／ｍｌ以下において重要で診断的関連性のあるさらなる情報を提供し（
例えば、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社の総ＰＳＡ用Ｅｌｅｃｓｙｓ（
登録商標）試験で測定）、したがって、ＰＣａとＢＰＨとの区別の改良に重要な
貢献を果たす。

【００３０】 本発明のさらに好ましい態様は、したがって、前立腺癌の分野における診断に
関連する臨床的課題のための［−５、−６、−７］プロＰＳＡ値の使用である。

【００３１】 本発明の抗体およびこれらを用いて確立された免疫学的方法により、初めて遊
離ＰＳＡと［−５、−６、−７］プロＰＳＡの総量との比率を算出することが可
能になる。この比率が臨床上／診断上の所見を実質的に向上させることが驚くほ
ど判定されるため、遊離ＰＳＡの［−５、−６、−７］プロＰＳＡに対する比率
の使用は、本発明の特に好ましい態様を示す。

【００３２】 以下、本発明を詳細に記載する。

【００３３】 ＰＳＡ分子の前駆体は、「プレ−プロＰＳＡ」であり、２６１個のアミノ酸か
ら構成される。シグナルペプチドは、１７個のアミノ酸長であり、プレ−プロＰ
ＳＡが分泌管に進入するとすぐ、小胞体で切断される。生じた酵素的に不活性な
プロＰＳＡ（このＰＳＡの不活性前駆体は、チモーゲンとも呼ばれる）は、該プ
ロペプチドの７個のＮ末端アミノ酸の放出（切断）により、酵素的に活性な「成
熟」ＰＳＡに変換される。この酵素的に活性な成熟形態は２３７個のアミノ酸を
有し、分子量は約２９ｋＤである。

【００３４】 ＰＳＡならびに２つの他のカリクレインｈＫ１およびｈＫ２は、不活性な複合
体の形態で、すなわち種々のプロテアーゼインヒビターに結合した形態で循環系
に多く存在することが知られている。ほとんど大部分がα１−抗−キモトリプシ
ンと複合体を形成したものである。

【００３５】 ［−７］プロＰＳＡのプロペプチドは、前述のような７個のアミノ酸長である
。これは、アミノ酸配列アラニン−プロリン−ロイシン−イソロイシン−ロイシ
ン−セリン−アルギニン（ＡＰＬＩＬＳＲ）を有する。ｈＫ２のプロペプチド配
列は、バリン−プロリン−ロイシン−イソロイシン−グルタミン−セリン−アル
ギニン（ＶＰＬＩＱＳＲ）である。ＰＳＡの最初のＮ末端アミノ酸はイソロイシ
ンである。驚いたことに、［６］プロＰＳＡに相当する合成ペプチドを免疫化に
用いると、本発明の反応スペクトル、すなわち、プロＰＳＡ形態［−５］、［−
６］および［−７］に対する良好な結合性を有する抗体を得ることができること
がわかった。また、実際に使用したペプチドは、成熟ＰＳＡ由来の第１アミノ酸
を含有する。したがって、その配列はＰＬＩＬＳＲＩである。

【００３６】 短いペプチドは、それ自体、ほんのわずかに免疫原性であるか、または免疫原
性でないことが知られている。したがって、免疫化の目的のためには、ペプチド
を適当な担体構造、例えばウシ血清アルブミンまたはスカシガイのヘモシアニン
に結合させることが通常必要である。また、必要であれば、「アジュバント試薬
」を添加することにより免疫応答を増強させる。本発明の好ましい態様は、した
がって、ＰＳＡの［−５、−６、−７］プロペプチドを含む免疫原である。配列
番号：２のペプチドを用いて得られうる免疫原は特に好ましい。

【００３７】 本発明の抗体はまた、［−７］プロＰＳＡペプチドまたはミメトープ、例えば
、［−６］プロＰＳＡのミメトープなどの他の免疫原との適切な組み合せを用い
、以下に記載のスクリーニング基準により得ることができる。

【００３８】 したがって、本発明の目的は、［−５、−６、−７］プロＰＳＡに対する特異
性を有し、［−４］プロＰＳＡおよびそれより短いＰＳＡ形態と本質的に非反応
性である抗体である。異なるプロＰＳＡ形態［−７］、［−６］および［−５］
プロＰＳＡは、かかる抗体により効果的に結合されるが、［−４］プロＰＳＡは
本質的に非反応性である。

【００３９】 ＰＬＩＬＳＲＩペプチドは、標準法（Ｐｅｐｔｉｄｅ，Ｈａｎｓ−Ｄｉｅｔｅ
ｒ Ｊａｋｕｂｋｅ，Ｓｐｅｋｔｒｕｍ Ｖｅｒｌａｇ，ハイデルベルク，１９
９６）を用いて合成により作製した。実験により、短いペプチドそれ自体は、あ
まり免疫原性でないことが示されている。したがって、免疫化の目的のため、合
成ＰＬＩＬＳＲＩペプチドをスカシガイのヘモシアニン、ウシ血清アルブミンま
たはエデスチンなどの適当な輸送タンパク質に結合させる。

【００４０】 この目的のために典型的に使用される研究用動物、すなわちマウス、ラット、
ウサギまたはヒツジにおいて免疫化を行う。典型的なアジュバント物質（例えば
、フロイントアジュバント）を用いて免疫応答を刺激する。

【００４１】 モノクローナル抗体を作製するため、脾臓細胞、好ましくはマウス由来の脾臓
細胞（動物はしかるべく免疫化した）を、当業者に公知の方法を用いて不死化す
る。ハイブリドーマ技術（ＫｏｅｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒ
ｅ ２５６（１９７５），４９５−４９７）に基づく方法またはエプスタイン−
バーウイルスを用いる形質転換（ＥＢＶ形質転換［モノクローナル抗体作製技術
および応用、Ｌａｗｒｅｎｃｅ Ｂ．Ｓｃｈｏｏｋ編、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋ
ｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，１９８７］）が特に好ましい。

【００４２】 免疫応答の質は、動物間で、および種間で大きく変動する。この理由のため、
得られる抗体もまた必要な性質を有することを確実にする適切なスクリーニング
方法を使用することが必要である。

【００４３】 本発明のさらなる目的は、したがって、適切なスクリーニングシステムを含む
抗体作製方法である。このスクリーニングシステムでは、得られる抗体が、前述
の免疫化により、［−５、−６、−７］プロＰＳＡに対する適切な結合特性を有
し、かつ［−４］プロＰＳＡおよびそれより短いＰＳＡ形態と本質的に非反応性
であることが確実である。

【００４４】 特に好適なスクリーニングシステムは、ビオチン化形態のストレプトアビジン
固相上にコートされた、７個のアミノ酸長のＰＬＩＬＳＲＩペプチドを含む。代
替例として、ＰＳＡプロペプチドを、タンパク質に結合させ、該タンパク質によ
り固相上に吸着させることもできる。これらのスクリーニングシステムのすべて
において、輸送タンパク質および結合性化学物質が、免疫原を作製するために使
用される成分とは異なることを確実にするバリアントが特に好ましく使用される
、すなわち、代替的な輸送タンパク質および他のタイプのリンカー構造を使用す
ることは特に好ましい。

【００４５】 さらに特に好適なスクリーニングシステムは、ビオチン化ＰＳＡ−［−６〜＋
１］プロペプチド［ＰＬＩＬＳＲＩ−Ｂｉ］を抗原として使用する競合的イムノ
アッセイである。この試験システムでは、ビオチン化ペプチドがストレプトアビ
ジンを介して固相上にコートされる。次いで、この試験において、ＰＳＡのプロ
ペプチド領域由来の他の／短縮ペプチドが本発明の抗体と置換されうる程度を調
べるために調査を行う。［−５、−６、−７］プロＰＳＡと反応するが、［−４
］プロＰＳＡを本質的に検出しない抗体を選択する。

【００４６】 プロＰＳＡを検出するための改変形態（本明細書の以下の記載を参照）におい
て使用しうる代替スクリーニングシステムは、サンドイッチ試験である。この試
験では、ＰＳＡ（例えば、精子由来）およびプロＰＳＡおよびＰＣａ血漿由来Ｐ
ＳＡを抗原として試験する。

【００４７】 （プロ）ＰＳＡのストレプトアビジンコート固相への結合は、遊離ＰＳＡに対
する抗体によりＦ（ａｂ）断片を介して起こる。試験対象であるプロＰＳＡに対
する新しい抗体を検出に用いる。最初のスクリーニングにおいて、ＰＣａ血清由
来プロＰＳＡと反応性であるが、精子由来ＰＳＡとは反応しない抗体を選択する
。

【００４８】 前述のシステムは、さらに、適切な置換反応により本発明の抗体を選出するた
めに使用しうる。この目的のため、ＰＣａ血清由来プロＰＳＡを前述のような固
相に結合させる。次いで、抗原としてビオチン化したプロＰＳＡペプチドを用い
る試験に関して先に記載のようにして、さらなる特異性試験を行なう。

【００４９】 本発明のさらなる目的は、したがって、前述の競合試験において、［−７］Ｐ
ＳＡプロペプチド、および［−６］ＰＳＡプロペプチド、および［−５］ＰＳＡ
プロペプチドとの良好な競合を示すが、［−４］ＰＳＡプロペプチドとは本質的
に競合しない抗体である。本文脈における競合とは、［−５、−６、−７］プロ
ＰＳＡペプチドが、固相上のＰＬＩＬＳＲＩペプチドと結合することを調べてい
る抗体と効果的に競合することを意味する。［−４］プロＰＳＡおよびそれより
短いプロＰＳＡ配列に対して本質的に非反応性の抗体は、競合試験において、［
−５］プロＰＳＡペプチドと比べて１０％未満の置換効果、 特に好ましくは５％
未満、最も好ましくは３％未満の置換効果を示す抗体である。

【００５０】 本発明の文脈における「抗体」という用語は、そのままの免疫グロブリンおよ
びすべての抗体断片をいう。これらには、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはＦ（
ａｂ）’₂ 断片が含まれる。「モノクローナル」または「ポリクローナル」とい
う記載のない抗体という用語は、常に両方のタイプの抗体ならびに任意のキメラ
構築物および上記のすべての断片を含む。

【００５１】 同じ結合特性を本質的に示す抗体は、ＢｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇのＤｅｕｔｓ
ｃｈｅｎ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｆｕｅｒ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｕｓ ｕ
ｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ（ＤＳＭＺ）にＡＣＣ ２４５６として２００
０年５月１６日に寄託されたクローンと免疫学的に競合し、［−５，−６，−７
］プロＰＳＡと結合する抗体であると理解される。

【００５２】 本発明の特に好ましい態様は、ＤＳＭＺのＡＣＣ２４５６として寄託されたク
ローンと同じ結合特性を本質的に有する抗体である。

【００５３】 本発明の抗体は、［−５，−６，−７］プロＰＳＡを特異的に検出するために
使用しうる。競合原理またはサンドイッチ原理に基づく免疫学的方法が特に好ま
しい。イムノアッセイの種々の態様が当業者に知られているため、本明細書には
詳細に記載しない。

【００５４】 本発明のさらなる目的は、したがって、試料中の［−５，−６，−７］プロＰ
ＳＡの定量／検出に適した免疫学的試験手順である。

【００５５】 当業者に広く知られたすべての生体液を試料として使用しうる。全血、血清、
血漿または尿などの体液が試料として好ましい。

【００５６】 ［−５，−６，−７］プロＰＳＡは、サンドイッチ試験において特に好ましく
検出される。［−５，−６，−７］プロＰＳＡに対する特異的抗体を特異的捕捉
抗体として使用することが特に有利であることが証明されている。本文脈におい
て、「特異的」という用語は、捕捉抗体がスクリーニングのセクションで記載し
た特異性要件を満たすことを意味するものと理解される。

【００５７】 本発明のさらなる目的は、したがって、これらの分子を検出するためにイムノ
アッセイにおいて［−５，−６，−７］プロＰＳＡに対する抗体の使用すること
である。

【００５８】 さらにまた、遊離ＰＳＡと特異的に反応する抗体を［−５，−６，−７］プロ
ＰＳＡの検出において使用することが特に有利であることが証明されている。遊
離ＰＳＡに対する特異性を有する抗体とは、かかる抗体が、α１−抗−キモトリ
プシン（ＡＣＴ）と複合体を形成するＰＳＡ分子を検出しないことを意味すると
理解される。

【００５９】 ［−５，−６，−７］プロＰＳＡのレベルは、測定しやすいことが証明されて
いる。したがって、前述の試験システムを用い、臨界ヒト血清、すなわち約４〜
約１０ｎｇ／ｍｌの総ＰＳＡを有するヒト血清を調べた。測定した値の解析によ
り、［−５，−６，−７］プロＰＳＡ値が臨床的に関連する有益なさらなる情報
、および判定棄却域を提供することが示された。［−５，−６，−７］プロＰＳ
Ａ値は、前立腺癌の存在を診断またはその可能性を排除するために使用しうる。

【００６０】 最初に記載したように、＞２０ｎｇ／ｍｌの顕著に上昇したＰＳＡ値は、非常
に大きな臨床的／診断的関連性を有する。かかる値は、比較的確かなＰＣａの存
在の診断的表示である。値が２０ｎｇ／ｍｌ未満の場合は、診断的関連性がかな
り低下する。１０ｎｇ／ｍｌ未満の値は、ＢＰＨによるものでありうるが、ＰＣ
ａによりものでありうる可能性も同程度である。特にこの範囲では、初期段階で
悪性前立腺過形成をＰＣａと区別するために特に重要でありうる。

【００６１】 選択された血清の包括的基準は、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社の適
切なＥｌｅｃｓｙｓ（登録商標）試験で調べると、４〜１０ｎｇ／ｍｌのＰＳＡ
（トータル）値であった。ＰＳＡ（トータル）に加え、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎ
ｏｓｔｉｃｓ社の適切なＥｌｅｃｓｙｓ（登録商標）試験を用いて遊離ＰＳＡも
調べた。

【００６２】 試験したＰＳＡマーカーの臨床的関連性を個々に調査し、ＲＯＣ解析を用い、
臨床的に特に関連性のある範囲（４〜１０ｎｇ／ｍｌ）において互いに関連づけ
て調査した。

【００６３】 ＲＯＣ解析（ＲＯＣ＝レシーバー・オペレーター・カーブ(receiver operator
curve) ）とは、感度−特異性ダイアグラムの計算および編集をいう。良好な診
断的分類効率を伴う試験は、可能な限り大きなＡＵＣ値を有する（ＡＵＣ＝曲線
下面積(area under the curve)）。この値が高いほど、特異性および感度に関し
て評価した試験の成績特性がより良好である。

【００６４】 ［−５，−６，−７］プロＰＳＡの遊離ＰＳＡに対する比を初めて示し、新た
に開発されたイムノアッセイの結果として評価した。驚いたことに、この比は、
実施されたＲＯＣ解析において、特定の臨床的関連性を有すること、すなわち［
−５，−６，−７］プロＰＳＡの遊離ＰＳＡに対する比を用いると関連技術で公
知のパラメータを用いるよりもＰＨＢとＰＣａの区別がより良好に行われうるこ
とが証明された。この利点は、図３において明らかとなる。

【００６５】 本発明のさらに好ましい態様は、したがって、臨界ＰＳＡ血清、すなわち約２
０ｎｇ／ｍｌ未満の総ＰＳＡ、特に好ましくはＰＳＡが２〜１５ｎｇ／ｍｌ、特
に４〜１０ｎｇ／ｍｌを有する血清の［−５，−６，−７］プロＰＳＡの遊離Ｐ
ＳＡに対する比率またはその逆比率を評価することによる、さらに詳細な解析で
ある。

【００６６】 本発明の抗体はまた、３つの異なるプロＰＳＡ形態［−５］プロＰＳＡ、［６
］プロＰＳＡおよび／または［−７］プロＰＳＡのそれぞれを調べるために使用
しうる。この目的のため、試料から［−５］、［−６］および［−７］プロＰＳ
Ａ分子を富化し、さらなる解析に利用しやすくするために本発明の抗体を使用す
る。特に好ましくは、富化は、イムノアフィニティークロマトグラフィーまたは
選択的免疫吸着を用いて行われ、上記の３つのプロＰＳＡ形態の個々の検出は、
質量分析法（ＭＳ）に基づく方法を用いて行う。

【００６７】 本発明の免疫学的方法では、プロＰＳＡ形態［−５，−６，−７］がまとめて
検出されるが、３つのプロＰＳＡ形態はＭＳを用いて個々に定量しうる。

【００６８】 本発明のさらなる目的は、したがって、［−５］、［−６］および［−７］プ
ロＰＳＡの個別の定量ならびに、これらの個々の値を前立腺癌の診断またはその
可能性の排除に使用することである。

【００６９】 本発明の抗体は、アミノ酸配列プロリン−ロイシン−イソロイシン−グルタミ
ン−セリン−アルギニン（ＰＬＩＱＳＲ）を有する［−６］プロｈＫ２とも反応
する。前述の検出方法および解析と同様に、プロｈＫ２もまた測定することがで
き、本発明の抗体を用いる診断目的に使用することができる。

【００７０】 ３つのプロＰＳＡ形態［−５］、［−６］および［−７］の量はまた、攻撃的
な疾患過程を該疾患の緩慢な過程と区別するために、本質的な疾患および過程と
比較しうる。

【００７１】 以下の実施例により、本発明をさらに説明する。

【００７２】 実施例１ 質量分析法を用いる異なるプロＰＳＡ形態の個々の検出 ａ） 免疫吸着を用いたＰＣａ血清からの遊離ＰＳＡの単離 抗体ＭＡＢ＜ＰＳＡ＞−Ｍ−３０−ＩｇＧ−ビオチン（ｃ＝２５μｇ／ｍｌ）
を含むＰＢＳ ｐＨ７＋１％ＢＳＡ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ２０の溶液４ｍｌを、
１０ｍｌバイアル中の磁気ストレプトアビジンビース２８．７ｍｇに添加し、１
時間インキュベートした。次いで、ビーズを磁石を用いて沈殿させ、上清みをピ
ペットで除去し、ビーズを３回、それぞれ３ｍｌの洗浄用溶液（ＰＢＳ ｐＨ７
＋２０ｍＭオクチルグルコシド）で洗浄した。８ｍｌの血漿（遊離ＰＳＡ含量：
１８０ｎｇ／ｍｌ）を添加した後、溶液をさらに６０分間室温でインキュベート
した。次いで、血漿をピペットで除去し、ビーズをそれぞれ１ｍｌの洗浄用溶液
で４回洗浄した。次いで、５００μｌの１Ｍプロピオン酸をビーズに加え、懸濁
液を再度１時間シェイクした。ビーズが沈殿した後の上清みを除去し、凍結乾燥
した後、１０μｌの蒸留水に加えた。精子由来のＰＳＡをＳｃｒｉｐｐｓ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、サンディエゴから入手した。

【００７３】 ｂ） レーザーイオン化飛行時間型質量分析装置（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ）
を用いる遊離プロＰＳＡ形態の同定 免疫吸着により精製した血漿由来遊離ＰＳＡが、精子から得られたものと大き
さの点で異なるという最初の示唆を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳを用いて実証し
た。２９１００ＤａのＰＣａ血漿由来の遊離ＰＳＡが精子由来の遊離ＰＳＡより
も約６００ｄａ（２８５００Ｄａ）だけ大きい分子量を有することが示された。

【００７４】 ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、バンドの還元性アルキル化、およびエンドプロテアーゼＬ
ｙｓ−Ｃを用いた消化によりＰＣａ血漿と精子から遊離ＰＳＡを分離した後、図
１に示すペプチドパターンが示された。さらに解明するため、それぞれのＰＳＡ
形態において検出されたペプチドを表１にまとめる。

【００７５】

【表１】

【００７６】 図１および表１に示すように、ＰＣａ血漿由来の遊離ＰＳＡは、精子由来のＰ
ＳＡには存在しない４つのペプチドを含む。それらは、ＰＳＡのＮ末端から２，
４，５または７個のアミノ酸が伸長されたペプチドであり、したがって、プロＰ
ＳＡ形態である。

【００７７】 実施例２ プロＰＳＡに対するモノクローナル抗体（ＭＡＢ）の産生 ａ） マウスの免疫 １２週齢の雌Ｂａｌｂ／Ｃマウスを、まず、ＫＬＨ（スカシガイのヘモシアニ
ン）にスペーサーによりシステインと結合したペプチドＰ−Ｌ−Ｉ−Ｌ−Ｓ−Ｒ
−Ｉ−Ｃ（以下、プロＰＳＡペプチドという）１００μｇをアジュバント（完全
フロイントアジュバント）とともに腹腔内にて刺激した。６週間後およびその後
は１ヶ月間隔で、さらに３回の腹腔内免疫を行なった。各マウスに上述の免疫原
１００μｇをＩＦＡ（不完全フロイントアジュバント）とともに投与した。次い
で、融合の３日前、２日前および当日に、１００μｇの各免疫原を含むＰＢＳバ
ッファーを用いて静脈内にて最後の免疫を行った。

【００７８】 ｂ） 融合およびクローニング ａ）により免疫したマウス由来の脾臓細胞と骨髄腫細胞との融合を、Ｇａｌｆ
ｒｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ７３，１９８１、３に記
載のようにして実施した。この手順において、免疫したマウス由来の約１×１０⁸ 脾臓細胞を、２×１０⁷ 骨髄腫細胞（Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８−６５３，ＡＴＣＣ
ＣＲＬ１５８０）と混合し、遠心分離（３００ｇ、４℃で１０分）する。次い
で、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含まないＲＰＭＩ−１６４０培地で細胞を１回洗
浄し、５０ｍｌ容コーンバイアルにてもう一度４００ｇで遠心分離した。１ｍｌ
のＰＥＧ（ポリエチレングリコール）（分子量４０００、Ｍｅｒｃｋ、ダルムシ
ュタット）を添加し、ピペッティングにより混合した。３７℃の水浴中で１分間
の後、ＦＣＳを含まない５ｍｌのＲＰＭＩ １６４０を滴下し、混合し、培地（
ＲＰＭＩ １６４０＋１０％ＦＣＳ）で５０ｍｌとした後、遠心分離した。沈降
した細胞を、１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ １６４０培地に添加し、ヒポキサン
チン−アザセリン選択培地（１００ｍｍｏｌ／ｌヒポキサンチン、１μｇ／ｍｌ
アザセリンを含むＲＰＭＩ １６４０＋１０％ＦＣＳ）中に播種した。インター
ロイキン６（１００Ｕ／ｍｌ）を成長因子として培地に添加した。１０日後、一
次培養物を特異的抗体の合成に関して試験した。

【００７９】 ｃ） 抗プロＰＳＡペプチド抗体のスクリーニング試験 マウス血清のスクリーニングのため、一次培養物およびクローン化したＭＡＢ
、組換えストレプトアビジン（ＭｉｃｒｏＣｏａｔ，Ｐｅｎｚｂｅｒｇ，カタロ
グ番号１２−Ｋ ９６ Ｎ，ロットＭＣ ２８９）でコートしたＭＴＰを、１μ
ｇ／ｍｌのビオチン化プロＰＳＡペプチドを含むＰＢＳ＋０．５％クロテイン(C
rotein) Ｃ（ウェルあたり１００μｌ、振とうしながら室温で１０分インキュベ
ーション）でコートした後、０．９％ＮａＣｌ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で３
回洗浄した。このコンジュゲートでは、スペーサー特異的抗体を妨げるため、マ
ウスを免疫するために使用した前述の免疫原とは別のスペーサーによりビオチン
をプロＰＳＡペプチド（ＰＬＩＬＳＲＩＣ−Ｂｉ）に結合した。次いで、調査対
象の抗体溶液１００μｌを、コートされたウェルに添加し、振とうしながら室温
で１時間インキュベートした。０．９％塩化ナトリウム／０．０５％Ｔｗｅｅｎ
２０で３回洗浄した後、試料中の結合抗体を検出するため、マウスＦｃγに対す
るヒツジ由来のポリクローナル抗体のＰＯＤ標識Ｆａｂ断片（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉ
ａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ，Ｉ．Ｄ．Ｎｏ．１４３１３２３、２５ｍＵ／ｍ
ｌに相当）１００μｌを各場合において添加し、室温で１時間インキュベートし
た後、０．９％塩化ナトリウム／０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０で３回
洗浄した。

【００８０】 最後に、１００μｌのＡＢＴＳ（登録商標）（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔ
ｉｃｓ ＧｍｂＨ，カタログ番号１２０４５２１および１２０４５３０）を各ウ
ェルに添加した。室温で３０分間の後、Ｄｙｎａｔｅｃｈ社製ＭＲ７００マイク
ロプレートリーダーで４０５／４９２ｎｍにおける吸光度を測定した。

【００８１】 ｄ） ＰＣａ血清中のプロＰＳＡの検出のためのマウス血清および培養上清みの
試験 マウス血清のスクリーニングのため、一次培養物、およびＰＣａ血清における
プロＰＳＡ形態との反応のためのクローン化したＭＡＢ、組換えストレプトアビ
ジン（ＭｉｃｒｏＣｏａｔ，Ｐｅｎｚｂｅｒｇ，カタログ番号１２−Ｋ ９６
Ｎ，ロットＭＣ ２８９）でコートされたＭＴＰを、遊離ＰＳＡしか検出しない
モノクローナル抗体Ｍ−３０由来ビオチン化Ｆａｂ断片を１μｇ／ｍｌで含むＰ
ＢＳ＋０．５％クロテインＣ（ウェルあたり１００μｌ、振とうしながら室温で
１０分間インキュベーション）でコートした後、０．９％ＮａＣｌ／０．０５％
Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄した。次いで、室温で振とうしながら、希釈していな
い、またはＰＢＳで１：１０に希釈したＰＣａ血清１００μｌを用いて１時間イ
ンキュベーションを行った。次の工程では、調査対象の抗体溶液１００μｌを、
コートしたウェルに添加し、振とうしながら室温で１時間インキュベートした。
０．９％塩化ナトリウム／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄した後、試料中
の結合抗体を検出するため、マウスＦｃγに対するヒツジ由来のポリクローナル
抗体のＰＯＤ標識Ｆａｂ断片（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ
，Ｉ．Ｄ．Ｎｏ．１４３１３２３、２５ｍＵ／ｍｌに相当）１００μｌを各場合
において添加し、振とうしながら室温で１時間インキュベートした後、０．９％
塩化ナトリウム／０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０で３回洗浄した。

【００８２】 最後に、１００μｌのＡＢＴＳ（登録商標）（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔ
ｉｃｓ ＧｍｂＨ，カタログ番号１２０４５２１および１２０４５３０）を各ウ
ェルに添加した。室温で２０分間の後、Ｄｙｎａｔｅｃｈ社製ＭＲ７００マイク
ロプレートリーダーで４０５／４９２ｎｍにおける吸光度を測定した。雌ドナー
由来のＰＳＡ無含有血清を対照として用いた。

【００８３】 産生された抗体が精子由来の遊離ＰＳＡとの反応性を示さないことを確認する
ため、Ｓｃｒｉｐｐｓ，サンディエゴ、カタログ番号Ｐ ０７１４、ロット９８
４３ ６４９の遊離ＰＳＡを１μｇ／ｍｌでＰＢＳ＋０．５％クロテインＣに
溶解し、ＰＣａ血清の代わりに抗原として用いた。結果を表２にまとめる。

【００８４】

【表２】

【００８５】 結果は、一方では、１ａにより免疫したマウス由来の調査した血清のほとんど
が、ＰＳＡを含有するＰＣａ血清と特異的に反応することを示す。他方、これら
は、成熟ＰＳＡの正常Ｎ末端を有する精子由来遊離ＰＳＡとは反応しないため、
これらの結果はまた、プロＰＳＡ形態がこのＰＣａ血清に存在するはずであるこ
とも実証する。

【００８６】 プロＰＳＡペプチドおよびプロＰＳＡを含有する血清と陽性反応を示すが、（
精子）ＰＳＡとの反応は示さなかった一次培養物を同様にして試験し、クローニ
ングを９６穴細胞培養プレートにおいて蛍光活性化細胞分取器を用いて行った。
インターロイキン−６（１００Ｕ／ｌ）を成長添加剤として培地に添加した。表
３に示すクローンをこのようにして得た。

【００８７】

【表３】

【００８８】 ｅ） マウス腹水からの免疫グロブリンの採取 得られたハイブリドーマ細胞を標準的手順において使用し、マウスに腹水を形
成させることによりＩｇＧを産生させた。これらの抗体を、一般的なタンパク質
化学法により（例えば、Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １２１（１９８６），５８７−
６９５の「方法」に従って）腹水から精製した。

【００８９】 実施例３ ［−５，−６，−７］プロＰＳＡに対する特異性の試験 実施例１のｄ）に記載のように、ＰＣａ血清由来のプロＰＳＡをストレプトア
ビジンでプレコートしたマイクロタイタープレートのウェル内に結合させた。次
いで、抗プロＰＳＡ抗体を、異なる長さのプロＰＳＡペプチドとともに１時間イ
ンキュベートした。添加した遊離ペプチドは、この工程で、該抗体に結合するた
めに、固相上のＰＣａ血清由来プロＰＳＡと競合しうる。特異的抗体が少ないほ
ど、結合する検出抗体が少ないため、良好に検出されたペプチドは、置換反応、
したがってシグナルの低下をもたらす。図２に示すように、［−６］プロＰＳＡ
および［−５］プロＰＳＡペプチドのみが強い置換反応をもたらす。［−７］プ
ロＰＳＡはこの実験で調べなかった。他の実験において、［−７］プロＰＳＡペ
プチドは、［−５］または［−６］プロＰＳＡペプチドと同等に良好な競合を示
した。

【００９０】 実施例４ ＥＬＩＳＡにおける［−５，−６，−７］プロＰＳＡの検出 ［−５，−６，−７］プロＰＳＡの検出を、サンドイッチＥＬＩＳＡにおいて
捕捉抗体としてプロＰＳＡ ＭＡＢおよび検出試薬として遊離ＰＳＡに対するＰ
ＯＤ標識ＭＡＢを用いて実施した。ＭＡＢ１．０２３．６は、標準法を用いてビ
オチン化し、２．５μｇ／ｍｌの濃度で使用した。この試験を、遊離ＰＳＡでの
Ｅｎｚｙｍｕｎ（登録商標）試験と同様にして実施したが、ここで、大きな違い
は、本発明の（ビオチン化）ＭＡＢ１．０２３．６を捕捉試薬として用いたこと
であった。

【００９１】 実施例５ 異なるＰＳＡ断片を用いたＲＯＣ解析 ４〜１０ｎｇ／ｍｌの間の総ＰＳＡ値を有するが、ＢＰＨとＰＣａに関して診
断が確かな全部で４１個の試料において、ＥＬＥＣＳＹＳ（登録商標）（Ｒｏｃ
ｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）自動免疫分析装置および実施例４に記載のよう
なプロＰＳＡを用いて遊離ＰＳＡおよび総ＰＳＡのパラメータを測定した。遊離
ＰＳＡの総ＰＳＡに対する比率、プロＰＳＡの総ＰＳＡに対する比率および遊離
ＰＳＡのプロＰＳＡに対する比率を算出し、個々のパラメータと同様にＲＯＣ解
析に供した。図３に明白に示されるように、遊離ＰＳＡのプロＰＳＡに対する比
率でのＡＵＶ値が最大という結果になっている。したがって、この「パラメータ
」は、他の２つの相対値または個々の値のそれぞれよりも、ＢＰＨとＰＣａとの
区別に対してはるかに良好に貢献する。

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ解析由来（プロ−）ＰＳＡペプチドである。免疫
吸着を用いてＰＣａ血漿から遊離ＰＳＡを単離し、ＳＤＳゲル上で分離し、遊離
ＰＳＡバンドをＥｎｄｏ Ｌｙｓ Ｃで消化した。この試料０．５μＬを、０．
５ｍＬマトリックス（１０ｍｇ／ｍｌシナピン酸を含む０．１％ＴＦＡ：アセト
ニトリル、７：３、ｖ：ｖ）を含むＭＡＬＤＩ試料トレイ上で混合し、質量スペ
クトルを測定した。質量数の上側のペプチドの記載（例えば、１１４〜１４５）
は、ＰＳＡのアミノ酸配列の範囲を示す。［Ｍ＋Ｈ］⁺ イオンピーク１９３９．
１０に相当するペプチドは、ＰＳＡのアミノ酸範囲２２２〜２３７を有する不完
全な切断ペプチドである。ＰＳＡのプロ配列は、アミノ酸位置−７から−１に及
ぶ。

【図２】 図２は、遊離プロＰＳＡペプチドを用いる競合試験である。ＰＣａ血漿由来の
プロＰＳＡを、遊離ＰＳＡに対するビオチン化抗体により、ストレプトアビジン
でコートした固相に結合させた。異なる長さのプロＰＳＡペプチドによるＭＡＢ
１．０２３．６の結合または置換を調べ、図に示している。

【図３】 図３は、種々のＰＳＡパラメータの臨床的関連性のＲＯＣ解析である。この図
は、ＲＯＣ解析により算出されたＡＵＣ（「曲線下面積」）値を示す。ＡＵＣ値
が大きいほど、感度および特異性に関する臨床的精度および臨床的関連性の点で
、パラメータ（またはパラメータの比）が良好である。

【配列表】

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１４年７月１０日（２００２．７．１０）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項１５】 前立腺癌を検出またはその可能性を排除するための試験に
おける請求項１〜３いずれか記載の抗体の使用。

【手続補正書】

【提出日】平成１４年１２月９日（２００２．１２．９）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＪＰ，Ｕ Ｓ (72)発明者 ペーター，ヨッヘン アメリカ合衆国 ノースカロライナ 27709 リサーチ トライアングル パー ク，ビルディング 101 ルーム エフ 011，ナショナル インスティテュート オブ エンバイロンメンタル ヘルス（番 地なし) (72)発明者 ヴォーム，オーレ デンマーク国 オーデンセ ディーケイ− 5230 フォースカーパーケン 10 (72)発明者 クロッグ，トーマス，エヌ． デンマーク国 オーデンセ エス ディー ケイ−5260 ラグマーケン 32 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 BA54 GA03 GA09 GA18 GA27 HA15 4B064 AG27 CA10 CA20 CC01 CC24 CD30 DA13 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 BA13 BA14 BA42 CA40 DA75 DA76 DA86 DA89 EA50 EA51 FA20 FA52 FA71 FA72

Claims (18)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ［−４］プロＰＳＡおよびそれより短いプロＰＳＡと本質的
   に非反応性である、［−５，−６，−７］プロＰＳＡに対する特異性を有する抗
   体。
2. 【請求項２】 モノクローナル抗体である請求項１記載の抗体。
3. 【請求項３】 ＤＳＭＺにＡＣＣ２４５６として寄託されたクローンにより
   分泌されるモノクローナル抗体と同じ結合特性を本質的に有する抗体である請求
   項１または２記載の抗体。
4. 【請求項４】 ［−５］、［−６］および／または［−７］プロＰＳＡのプ
   ロペプチド配列に相当する、担体に結合した合成ペプチドを用いて［−５，−６
   ，−７］プロＰＳＡに対する抗体を製造する方法であって、［−４］プロＰＳＡ
   またはそれより短いプロＰＳＡと本質的に非反応性である抗体をスクリーニング
   する方法により得る、製造方法。
5. 【請求項５】 試料中の［−５，−６，−７］プロＰＳＡを検出する方法で
   あって、検出のために請求項１〜３いずれか記載の特異的抗体を用いる方法。
6. 【請求項６】 請求項１〜３いずれか記載の抗体を特異的捕捉抗体として用
   いる請求項５記載の方法。
7. 【請求項７】 ［−５，−６，−７］プロＰＳＡに対する特異性を有する捕
   捉抗体、および遊離ＰＳＡに対する特異性を有する検出抗体を用いる請求項５ま
   たは６記載の方法。
8. 【請求項８】 特異的捕捉抗体がビオチン化されている請求項５、６または
   ７いずれか記載の方法。
9. 【請求項９】 より短いプロＰＳＡ形態と本質的に非反応性である、［−５
   ，−６，−７］プロＰＳＡに対する特異性を有する抗体を含有する、［−５，−
   ６，−７］プロＰＳＡを検出するための診断用試験組成物。
10. 【請求項１０】 ［−５，−６，−７］プロＰＳＡを測定する、試料におけ
    る前立腺癌を検出またはその可能性を排除する方法。
11. 【請求項１１】 ［−５，−６，−７］プロＰＳＡを測定し、他のカリクレ
    イン画分と、または１種以上のカリクレインの総量との比率を求める、試料にお
    ける前立腺癌を検出またはその可能性を排除する方法。
12. 【請求項１２】 カリクレインがＰＳＡである請求項１１記載の方法。
13. 【請求項１３】 プロＰＳＡと遊離ＰＳＡの比率を作成する、試料における
    前立腺癌を検出またはその可能性を排除する方法。
14. 【請求項１４】 ［−５，−６，−７］プロＰＳＡをプロＰＳＡとして測定
    する、請求項１２記載の試料における前立腺癌を検出またはその可能性を排除す
    る方法。
15. 【請求項１５】 ［−５，−６，−７］プロＰＳＡを請求項１〜３いずれか
    記載の抗体を用いて精製し、これらの３つのプロＰＳＡ形態のそれぞれを個々に
    定量する、試料における前立腺癌を検出またはその可能性を排除する方法。
16. 【請求項１６】 前立腺癌を検出またはその可能性を排除するための試験に
    おける請求項１〜３いずれか記載の抗体の使用。
17. 【請求項１７】 ［−５，−６，−７］プロＰＳＡに対する抗体の製造のた
    めのペプチドを含有してなる免疫原であって、配列番号：１、２および／または
    ３を有する合成ペプチドが使用されてなる、免疫原。
18. 【請求項１８】 請求項１７記載のペプチドを含有してなる免疫原であって
    、配列番号：２を有するペプチドが使用されてなる、免疫原。