ES2269440T3

ES2269440T3 - Anticuerpos contra formas especiales de propsa y su utilizacion en inmunoensayos.

Info

Publication number: ES2269440T3
Application number: ES01960241T
Authority: ES
Inventors: Wolfgang Hoesel; Jochen Nat. Inst. of Environmental Health PETER; Ole Vorm; Thomas N. Krogh
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2000-05-24
Filing date: 2001-05-23
Publication date: 2007-04-01
Anticipated expiration: 2021-05-23
Also published as: WO2001090194A3; ATE335765T1; EP1290032B1; US20040214246A1; DE50110712D1; WO2001090194A2; EP1290032A2; JP2003534001A

Abstract

Anticuerpos con especificidad para todas las formas siguientes de proPSA: [-5], [-6] y [-7]proPSA, caracterizados porque estos anticuerpos esencialmente no son reactivos con el [-4]proPSA ni con formas más cortas del proPSA.

Description

Anticuerpos contra formas especiales del proPSA y su utilización en inmunoensayos.

La invención se refiere a anticuerpos contra formas especiales de los compuestos previos, enzimáticamente no activos, del antígeno específico de la próstata (PSA), a su obtención, a su utilización en inmunoensayos para la determinación del [-5, -6, -7]-proPSA, así como al uso de los valores medidos en estos ensayos para un mejor diagnóstico en el ámbito del carcinoma de próstata.

Descripción

El carcinoma de próstata (PCa) es en Estados Unidos el cáncer diagnosticado con mayor frecuencia en los varones, Parker, S.L. y col., CA Cancer J. Clin. 46, 5-27, 1996. El antígeno específico de la próstata, también llamado PSA, se utiliza en gran manera como marcador fiable para el diagnóstico para el tratamiento de enfermos que padecen cáncer de próstata. Catalona, W.J. y col., N. Engl. J. Med. 324, 1156-1161, 1991; Osterling, J.E., 1. Urol. 145, 907-923, 1991. Como marcador tumoral tiene la gran ventaja de que no se detecta en la sangre de los varones sanos o se detecta en concentraciones muy bajas. Cuando la enfermedad se halla en un estado avanzado, por lo general se observan valores muy elevados del PSA.

Un tema de enorme importancia para el diagnóstico es la detección temprana y segura de un PCa y la diferenciación entre el PCa y la hiperplasia benigna de próstata (BPH). Uno de los mayores problemas de la actual prueba del PSA consiste en que esta diferenciación entre la BPH y el PCa no está garantizada, McCormack, R.T. y col., Urology 45, 729-744, 1995. Por ejemplo, cuando la concentración del PSA se sitúa en un intervalo de 2 a 15 ng/ml de suero, no necesariamente puede concluirse que existe una enfermedad maligna, porque tales valores de PSA los arroja también una BPH. Por consiguiente, además de la determinación del PSA, pueden ser necesarios otros análisis que en algunos casos pueden ser costosos y dolorosos (p.ej. biopsias rectales), para poder dictaminar la existencia de un PCa.

Para mejorar la exactitud del diagnóstico de la detección del PSA en el suero se han propuesto diversos procedimientos alternativos, p.ej. la densidad del PSA, la velocidad del PSA, la proporción entre el PSA libre y total o entre el PSA complejado y total, Benson, M.C. y col., J. Urol. 147, 815-816, 1992; Carter, H.B. y col., J. Am. Med. Assoc. 267, 2215-2220, 1992; Oesterling, J.E. y col., J. Am. Med. Assoc. 270, 860-864, 1993.

El PSA pertenece a un grupo de proteínas/enzimas conocidas como "calicreínas". El grupo de las calicreínas humanas consta de tres miembros, que se denominan hK1, hK2 y hK3 (PSA). Clements, J.A., Endocr. Rev. 10, 393-419, 1989; Carbini, L.A. y col., J. Hypertens. 11, 893-898, 1993.

La hK1 se produce principalmente en los riñones, en el páncreas y en las glándulas salivares submaxilares; ver Fukushima, D. y col., Biochemistry 24, 8037-8043, 1985.

La hK2, al igual que el PSA, se produce principalmente en el epitelio de la próstata (Morris, B.J., Clin. Exp. Pharm. Phys. 16, 345-351, 1989) y tiene una homología del 78% con el PSA (Schedlich, L.J. y col., DNA 6, 429-437, 1987; Lilja, H., World J. Urol. 11, 188-191, 1993). Las propiedades de la hK2 como marcador potencial se discuten en el marco de un artículo recopilatorio del cáncer de próstata, Young, C.Y.F. y col., The Prostata Supplement 7, 17-24, 1996.

El antígeno específico de la próstata (PSA) o hK3 es una glucoproteína que tiene un peso molecular aproximado de 29 kDa. Se produce en el epitelio de la próstata y es uno de los componentes del líquido seminal. El PSA tiene la actividad enzimática de una serinoproteasa neutra. Su principal función consiste en el desprendimiento de las seminogelinas I y II y de la fibronectina, que como principales componentes del material eyaculado bloquean la movilidad de los espermatozoides. Por hidrólisis de estas proteínas, el PSA produce la licuación del coágulo seminal y, de este modo, facilita la movilidad de los espermatozoides.

El PSA es una proteasa similar a la quimotripsina, mientras que la hK2 es una proteasa similar a la tripsina.

Ya es sabido que el PSA existe en el suero en diversas formas moleculares. La principal porción del PSA, con gran diferencia, está en forma de complejos inactivos, sobre todo la \alpha1-anti-quimotripsina compleja al PSA y, de este modo, inhibe también su actividad enzimática.

Otros complejos pueden formarse con inhibidores de serina-proteasa (serpinas), como son la \alpha1-anti-tripsina y el inhibidor de proteína C, que en comparación con la PSA-ACT están presentes en el suero en una cantidad muy inferior. Además, el PSA forma todavía complejo con otro tipo de inhibidor de proteasa-macroglobulina, a saber la \alpha2-macroglobulina (\alpha2-M), sobre cuyo contenido en el suero la bibliografía técnica ofrece datos dispares, sobre todo por el hecho de que el PSA dentro de este complejo no es accesible por vía inmunológica. Con la denominación PSA total se indica a continuación la suma del PSA libre y del PSA complejado con serpinas, ya que el complejo del PSA con la \alpha2-M no se detecta en todas las determinaciones inmunológicas hasta ahora conocidas (Tewari y Bluestein, J. Clin. Ligand Assay, vol. 18, pp. 186-196, 1995). Además de la denominación PSA total se emplea a menudo el término PSA global, que tiene un significado idéntico.

De modo similar, a las dos calicreínas restantes, la hK1 y la hK2, se les aplica la misma definición de calicreína total, que a menudo se denomina también calicreína (total) o PSA (total).

Además del PSA complejado, el suero contiene también PSA libre, enzimáticamente inactivo, que no es capaz de formar complejos, ver Petterson y col., Clin. Chem., vol. 41, (nº 10), páginas 1480-1488, 1995; que puede estar en forma libre (no complejada) en el suero, en una cantidad del 15% al 20% del PSA total. Petterson y col. y también otros grupos de trabajo han discutido que este PSA libre, enzimáticamente inactivo, constituye posiblemente una forma pro-enzima o quizá podría haberse inactivado por rotura interna de los compuestos Lys-Lys entre los aminoácidos 145-146 del PSA.

La molécula de PSA se sintetiza como pre-pro-forma compuesta por 261 aminoácidos. El péptido señal tiene una longitud de 17 aminoácidos y se desprende ya en el retículo endoplasmático. El proPSA enzimáticamente inactivo (cimógeno) tiene, pues, una longitud de 244 aminoácidos.

Por desprendimiento del pro-péptido (7 aminoácidos) se forma el PSA "maduro", enzimáticamente activo (véase p.ej. Melegos + Diamandis, Clin. Biochem. 29 (3), 193-200, 1996).

La molécula de proPSA con los 7 aminoácidos del extremo N del pro-péptido de PSA se denomina también [-7]proPSA. La molécula del proPSA con una secuencia acortada en el extremo N se denomina [-6], [-5], [-4], etc., -proPSA con arreglo a la longitud que tenga la porción del pro-péptido.

Hasta el momento no se ha determinado o analizado con detalle la estructura exacta de las formas del PSA existentes en el suero humano. No se ha elucidado por ejemplo sobre todo por qué la estructura exacta del PSA existente en el suero parece libre, es decir, no aprisionada en complejos (Paus y col., J. of Urology 159, 1599-1605, 1998). La razón estriba ante todo en que la concentración del PSA libre del suero es tan baja, que resulta muy difícil poder recoger material suficiente para someterlo al análisis. Noldus y col., J. of Urology 158, 1606-1609, 1997, a partir de 230 ml de una mezcla de sueros de alto contenido en PSA (PSA total > 2000 ng/ml) aislaron el PSA libre en forma no pura en un rendimiento del 25% y lo analizaron por secuenciación del extremo N. Encontraron indicios de la presencia de un extremo N normal y de la rotura de la cadena del PSA entre los aminoácidos 145 y 146, que podría explicar el porqué este PSA no se halla en forma complejada. No mencionan las formas proPSA, es decir, las moléculas de PSA que tienen aminoácidos adicionales en el extremo N.

En el documento WO 98/49323 se describe el uso de anticuerpos contra el PSA, con el fin de identificar las formas moleculares del PSA libre existentes en las muestras biológicas y caracterizar su estructura molecular. En él se pone de manifiesto que una porción significativa del PSA libre está presente en el suero en forma de [-4]-proPSA, es decir, en forma de una molécula de PSA cuyo extremo N se ha prolongado con 4 aminoácidos de la secuencia del proPSA.

En el estado de la técnica no se describen procedimientos específicos de diagnóstico de la molécula del PSA libre, que contengan porciones del pro-péptido. Tampoco es conocido si, aparte del [-4]-proPSA descrito en el documento WO 98/49323, han aparecido otras formas de proPSA en líquidos de muestra de origen humano.

En el estado de la técnica no se encuentran datos sobre el valor diagnóstico del PSA libre provisto de porciones de diversas longitudes de secuencias de proPSA.

Es, pues, objeto de esta invención aportar herramientas para el diagnóstico que permitan la detección específica de determinadas formas de proPSA y comprobar si estos ensayos novedosos pueden contribuir a un mejor diagnóstico en el ámbito del carcinoma de próstata, en especial la diferenciación entre la BPH y el PCa.

En un primer paso se ha estudiado, pues, si utilizando los métodos analíticos más modernos se podían encontrar indicios de otras formas de proPSA, diferentes del [-4]-proPSA descrito en el documento WO 98/149323. De modo sorprendente se encontraron por lo menos tres formas adicionales de proPSA, las [-2, -5, -7]-proPSA. En base a estos estudios previos se analizó el tema de la importancia que puedan tener estas formas de proPSA para el diagnóstico.

Para trabajar el planteamiento de la invención se prepararon anticuerpos y se eligieron con objetivos claros, para que reaccionaran con el [-5, -6, -7]-proPSA, pero que no reconozcan significativamente las formas más cortas de proPSA ([-4], [-3], etc.).

Se prepararon péptidos sintéticos, correspondientes a las secuencias del extremo N de formas proPSA de distintas longitudes, y se utilizaron con fines de inmunización, pero también de exploración (screening) y de caracterización.

Se desarrollaron y aislaron anticuerpos, que presentan especificidades relevantes en el sentido de la invención. Estos anticuerpos reaccionan con el [-5, -6, -7]-proPSA, pero no presentan características significativas de fijación sobre péptidos del tipo [-4]-proPSA ni otros péptidos proPSA más cortos.

Por lo tanto, una forma preferida de ejecución son los anticuerpos contra el proPSA, que se caracterizan porque se fijan sobre el [-5, -6, -7]-proPSA, pero básicamente no reaccionan con el [-4]-proPSA ni otras formas más cortas del proPSA.

Se someten también estos anticuerpos a los procedimientos habituales de purificación, modificación, derivatización y a inmunoensayos para la detección del [-5, -6, -7]-proPSA.

Se ha constatado de forma sorprendente que las muestras nativas tienen una porción medible del [-5, -6, -7]-proPSA. Se ha observado y constatado también de modo sorprendente que estas formas especiales de proPSA son relativamente estables y están presentes en las muestras analizadas en una concentración significativa, de modo que pueden medirse en los inmunoensayos.

Se comparó la relevancia clínica y diagnóstica de los valores del [-5, -6, -7]-proPSA hallados en los métodos de la invención con los obtenidos en otros ensayos de PSA ya conocidos del estado de la técnica.

Tal como se ha mencionado en la introducción, uno de los principales problemas del uso de las mediciones del PSA en el diagnóstico clínico es el intervalo bajo, muy poco elevado, de valores del PSA. No es posible diferenciar entre la PBH y el PCa en base a los valores de PSA total. El ensayo de la invención dirigido a las formas especiales del proPSA proporciona en este ámbito de decisiones especialmente crítico desde el punto de vista clínico, es decir, en una concentración de PSA total inferior a 20 ng/ml (determinada p. ej. con el ensayo Elecsys® de la empresa Roche Diagnostics), informaciones adicionales valiosas y relevantes para el diagnóstico y, de este modo, contribuye a una mejor diferenciación entre el PCa y la BPH.

Otra forma preferida de ejecución de la invención es, pues, el uso de los valores del [-5, -6, -7]-proPSA para los planteamientos de diagnóstico en el ámbito del carcinoma de próstata.

Con los anticuerpos de la invención y los procedimientos inmunológicos basados en ellos ha sido posible por primera vez hallar el cociente de la cantidad total del PSA libre y el [-5, -6, -7]-proPSA. Se ha constatado de modo sorprendente que este cociente mejora sustancialmente la predicción clínica-diagnóstica, por lo cual el uso del cociente entre el PSA libre y el [-5, -6, -7]-proPSA constituye otra forma especialmente preferida de ejecución de la
invención.

Leyendas de las figuras

Figura 1

Péptidos (pro-)PSA del análisis MALDI-TOF

Se aísla el PSA libre de un plasma de PCa por inmunosorción, se separa a través de un gel SDS y se digiere la banda de PSA libre con Endo Lys C. Se mezclan 0,5 \mul de esta muestra en un plato de muestras MALDI con 0,5 ml de material matriz (10 mg/ml de ácido sinápico al 1% en TFA/acetonitrilo = 7/3, v/v) y se registra su espectro de masas. Las denominaciones de los péptidos que figuran por encima de los números de masa (p.ej. 114-145) indican el segmento de aminoácidos de la secuencia del PSA. El péptido correspondiente al pico iónico [M+H]^{+} de 1939.10 es un péptido descompuesto de forma incompleta que tiene el segmento de aminoácidos 222 - 237 del PSA. Esta pro-secuencia de PSA abarca desde la posición -7 de aminoácidos hasta la -1.

Figura 2

Ensayo de competición con los péptidos de proPSA libre

Se fija el proPSA de un plasma de PCa sobre una fase sólida recubierta con estreptavidina mediante un anticuerpo biotinilado, en competición con el PSA libre. Se determina la fijación o la expulsión del anticuerpo monoclonal (mab) 1.023.6 por acción de péptidos proPSA de diferentes longitudes y se representa en esta figura.

Figura 3

Análisis ROC del poder predictivo de diversos parámetros de PSA

En la figura se representan los valores AUC (AUC = area under the curve) calculados con el análisis ROC. Cuanto mayor es el valor AUC, tanto mejor es un parámetro (o la relación de parámetros) en lo que respecta a la exactitud clínica y poder predictivo a nivel de sensibilidad y especificidad.

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A continuación se describe la invención con mayor detalle

La precursora de la molécula de PSA es el llamado pre-pro-PSA, que consta de un total de 261 aminoácidos. El péptido señal tiene una longitud de 17 aminoácidos y se desprende del retículo endoplasmático desde el momento, en el que el pre-pro-PSA rebosa de las glándulas secretoras. El proPSA enzimáticamente inactivo que se forma (esta forma previa inactiva del PSA se denomina también cimógeno) se convierte por liberación (desprendimiento) de los siete aminoácidos del extremo N en el PSA "maduro", enzimáticamente activo. Esta forma madura, enzimáticamente activa, tiene un total de 237 aminoácidos y un peso molecular de unos 29 kD.

Ya es sabido que este PSA, pero también las dos calicreínas restantes, la hK1 y la hK2, están presentes en circulación en su mayor parte en forma de complejos inactivos, es decir, fijados sobre diversos inhibidores de proteasa. La mayor parte, con gran diferencia, está complejada con la \alpha1-anti-quimotripsina.

El propéptido del [-7]-proPSA tiene una longitud de 7 aminoácidos, tal como se ha mencionado antes. Tiene la secuencia de aminoácidos alanina-prolina-leucina-isoleucina-leucina-serina-arginina (APLILSR). La secuencia de propéptido de la hK2 es la siguiente: valina-prolina-leucina-isoleucina-glutamina-serina-arginina (VPLIQSR). El primer aminoácidos del extremo N del PSA es la isoleucina. Se ha constatado de modo sorprendente que los anticuerpos del espectro de reacción según la invención, es decir, buena fijación sobre las formas de proPSA [-5], [-6] y [-7], se pueden obtener cuando se utilizan para la inmunización de un péptido sintético, que corresponda al [-6]-proPSA. El péptido concreto que se utiliza contiene además el primer aminoácido del PSA maduro. Su secuencia es, pues: PLILSRI.

Como es sabido, los péptidos cortos son de por sí poco o nada inmunógenos. Por ello, con fines de inmunización es necesario por lo general anclar los péptidos sobre estructuras sustrato apropiadas, p.ej. albúmina de suero bovino o hemocianina lapa de cerradura (keyhole limpet hemocyanine). Eventualmente, la respuesta inmune puede potenciarse con la adición de los llamados reactivos adyuvantes. Una forma preferida de ejecución de la invención son, pues, los inmunógenos que contiene los propéptidos [-5, -6, -7] del PSA. Son preferidos en especial los inmunógenos que pueden obtenerse con el uso del péptido de la SEQ ID NO: 2.

Los anticuerpos de la invención se pueden obtener también mediante una combinación idónea de otros inmunógenos, p.ej. un péptido [-7]-proPSA o de mimetopos, p.ej. del [-6]-proPSA, con los criterios de exploración que se describen seguidamente.

Son, pues objeto de la invención los anticuerpos que tienen especificidad para el [-5, -6, -7]-proPSA, y que sustancialmente no reaccionan con el [-4]-proPSA y formas más cortas de proPSA. Las distintas formas de proPSA, el [-7], el [-6] y el [-5]proPSA, se fijan eficazmente sobre dichos anticuerpos, mientras que el [-4]proPSA sustancialmente no reacciona con ellos.

El péptido PLILSRI se obtienen por síntesis aplicando métodos estándar (véase Peptide, Hans-Dieter Jakubke, editorial Spektrum, Heidelberg, 1996). Por experiencia se sabe que los péptidos cortos son, como tales, poco inmunógenos. Por ello, para la inmunización se fija el péptido sintético PLILSRI sobre una proteína sustrato idónea, p.ej. la hemocianina lapa de cerradura, la albúmina de suero bovino o la edestina.

La inmunización se realiza en los animales de laboratorio empleados normalmente para ello, se inmunizan con preferencia ratones, ratas, conejos u ovejas. Para potenciar la respuesta inmune pueden emplearse las sustancias adyuvantes habituales (p.ej. el adyuvante de Freund).

Para obtener los anticuerpos monoclonales se inmortalizan con preferencia esplenocitos, sobre todo de ratones, de los animales inmunizados correspondientes por procedimientos, con los que los expertos están ya familiarizados. Los procedimientos especialmente preferidos son en este caso la técnica del hibridoma (Köhler y Milstein, Nature 256, 495 - 497, 1975) o la transformación con el virus de Eppstein-Barr (EBV-Transformation [Monoclonal Antibody Production Techiques and Application, Lawrence B. Schook, coordinador, editorial Marcel Dekker, 1987]).

La calidad de la respuesta inmune varía en gran manera de un animal a otro y de una especie a otra. Por este motivo es necesario utilizar procedimientos idóneos de exploración (screening), que aseguren que los anticuerpos obtenidos poseen además las propiedades requeridas.

Otro objeto de la invención es, pues, un procedimiento de obtención de anticuerpos, que comprende un sistema de exploración idóneo. Este sistema de exploración tiene la seguridad de que los anticuerpos obtenidos mediante la inmunización mencionada poseen propiedades de fijación apropiadas sobre el [-5, -6, -7]-proPSA y sustancialmente no son reactivos con el [-4]-proPSA ni con formas más cortas de proPSA.

Un sistema de exploración especialmente adecuado contiene el péptido PLILSRI, que tiene una longitud de 7 aminoácidos y que con preferencia especial está recubriendo fases sólidas de estreptavidina en forma biotinilada. Como alternativa, el PSA-pro-péptido puede fijarse también sobre proteínas y mediante ellas adsorberse sobre una fase sólida. En todos estos sistemas de exploración se utilizan con preferencia especial aquellas variantes que aseguran que tanto la proteína sustrato como la química de fijación se diferencian de las sustancias empleadas para la obtención de los inmunógenos, es decir, se utilizan con preferencia especial proteínas sustrato alternativas y estructuras de engarce de otra índole.

Otro sistema de exploración especialmente indicado es un inmunoensayo competitivo empleando como antígeno un PSA-[de -6 a +1]pro-péptido biotinilado [el PLILSRI-Bi]. En este sistema de ensayo se recubre una fase sólida con el péptido biotinilado mediante la estreptavidina. Después se comprueba en qué medida otros péptidos más cortos del ámbito pro-péptido del PSA pueden expulsar o desplazar a los anticuerpos de la invención en el ensayo en cuestión. Se eligen los anticuerpos que reaccionan con el [-5, -6, -7]-proPSA, pero que sustancialmente no reconocen al [-4]-proPSA.

Un sistema alternativo de exploración, que puede utilizarse también para la detección de proPSA en forma modificada (ver más abajo), es un sistema llamado sandwich. En este ensayo se analizan como antígenos los PSA (p.ej. de esperma) y también el proPSA y el PSA de plasma de enfermos de PCa.

La fijación del (pro)-PSA sobre la fase sólida recubierta con estreptavidina se realiza mediante los fragmentos
F(ab) de un anticuerpo frente al PSA libre. Para la detección se emplean los nuevos anticuerpos a ensayar frente al proPSA. En una primera exploración se eligen anticuerpos que son reactivos con el proPSA de suero de PCa y no reaccionan con el PSA del esperma.

El sistema anterior puede utilizarse también para seleccionar los anticuerpos de la invención mediante reacciones de expulsión o desplazamiento idóneas. Para este fin se fija el proPSA del suero de PCa sobre una fase sólida, tal como se ha indicado antes. La posterior verificación de la especificidad puede realizarse del modo ya descrito antes para los ensayos en los que se emplea como antígeno un proPSA-péptido biotinilado.

Otro objeto de la invención son, pues, los anticuerpos que en el anterior ensayo de competición presentan una buena competencia con el [-7]-PSA-pro-péptido, con el [-6]-PSA-pro-péptido y con el [-5]-PSA-pro-péptido, pero fundamentalmente ninguna competencia con el [-4]-PSA-pro-péptido. Se entiende por competencia que el péptido [-5, -6, -7]-proPSA compite con eficacia con el anticuerpo estudiado por lograr la fijación sobre el péptido PLILSRI. Los anticuerpos sustancialmente no reactivos con el [-4]-proPSA y secuencias más cortas de proPSA son aquellos anticuerpos que, en ensayos de competencia, presentan una acción de expulsión inferior al 10%, con preferencia especial inferior al 5% y con preferencia muy especial inferior al 3% del poder de expulsión que tiene un péptido [-5]-proPSA.

En el sentido de la invención, además de las inmunoglobulinas intactas se entienden también por el término "anticuerpo" todos los fragmentos de anticuerpo. Entre ellos se cuentan los fragmentos Fab, Fab' y F(ab)'_{2}. El término "anticuerpo" sin el añadido "monoclonal" ni "policlonal" abarca a ambos tipos de anticuerpos así como a las eventuales construcciones quiméricas y todos los fragmentos ya mencionados.

Se entiende por anticuerpos, que sustancialmente presentan las mismas propiedades de fijación, aquellos anticuerpos que compiten inmunológicamente por fijarse sobre el [5, -6, -7]-proPSA con el clon depositado con fecha 16 de mayo de 2000 en la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares de Branschweig (DSMZ) con el número de registro ACC 2456.

Una forma especialmente preferida de ejecución de la invención son los anticuerpos que sustancialmente presentan las mismas propiedades de fijación que el clon depositado en la DSMZ con el número de registro ACC
2456.

Los anticuerpos de la invención pueden utilizarse para detectar específicamente el [-5, -6, -7]-proPSA. Para ello se aplican con preferencia especial los procesos inmunológicos que se basan en el principio de competición y en el llamado principio "sandwich". Las múltiples posibilidades de diseño de los inmunoensayos ya son conocidas por los expertos, de modo que se aquí se puede omitir la descripción detallada de las mismas.

Otro objeto de la invención son, pues, los procedimientos de ensayo inmunológico que son idóneos para cuantificar/detectar el [-5, -6, -7]-proPSA en una muestra.

Como muestras pueden utilizarse según la invención todos los líquidos biológicos con los que los expertos trabajan habitualmente. Como muestras son preferidos los líquidos corporales, como son la sangre total, el suero sanguíneo, el plasma sanguíneo o la orina.

El [-5, -6, -7]-proPSA se detecta con preferencia especial en un ensayo sandwich. Para ello ha resultado ser ventajoso en especial el uso de anticuerpos específicos contra el [-5, -6, -7]-proPSA como anticuerpos capturadores específicos. Se entiende por específico que el anticuerpo capturador cumple los requisitos de especificidad descritos en la parte de la exploración.

Otro objeto de la invención es, pues, el uso de anticuerpos contra el [-5, -6, -7]-proPSA en inmunoensayos para detectar estas moléculas.

Además ha resultado ser especialmente ventajoso para la detección del [-5, -6, -7]-proPSA el uso de un anticuerpo que por su lado reaccione específicamente con el así llamado PSA libre. En este caso se entiende por anticuerpo con especificidad para el PSA libre que dicho anticuerpo no reconozca a las moléculas de PSA que están complejadas con la \alpha1-quimotripsina (ACT).

El nivel del [-5, -6, -7]-proPSA puede medirse con facilidad. Mediante el anterior sistema de ensayo se analizan sueros humanos críticos, es decir, sueros humanos que contienen un PSA total de 4 a 10 ng/ml. El estudio de los valores obtenidos indica que dichos valores de [-5, -6, -7]-proPSA proporcionan informaciones adicionales valiosas para la toma de decisiones clínicamente relevantes y críticas. Se puede recurrir a los valores del [-5, -6, -7]-proPSA para diagnosticar o para descartar la existencia de un carcinoma de próstata.

Tal como se ha mencionado en la introducción, un valor de PSA netamente superior a 20 ng/ml tiene un poder predictivo clínico/diagnóstico muy alto. Un valor de este tipo es un indicio diagnóstico relativamente seguro de la existencia de un PCa. En valores inferiores a 20 ng/ml, el poder predictivo es mucho menor. Un valor inferior a 10 ng/ml puede ser debido tanto a una BPH, como a un PCa. Precisamente en este ámbito sería especialmente importante poder distinguir entre una hiperplasia benigna de próstata y un PCa en estado incipiente.

Los criterios de inclusión para los sueros elegidos sería un valor de PSA (total) de 4 a 10 ng/ml, que se haya determinado con el correspondiente ensayo Elecsys® de la empresa Roche Diagnostics. Además del PSA (total), con el correspondiente ensayo Elecsys® (de Roche Diagnostics) se determina también el PSA libre.

En el intervalo clínicamente más importante (4-10 ng/ml) se estudia el poder predictivo de los marcadores de PSA ensayados a título individual y comparativamente entre sí mediante los llamados análisis ROC.

Se entiende por análisis ROC (ROC = receiver operator curve) el cálculo y el trazado de un diagrama llamado de sensibilidad-especificidad. Un ensayo de buena resolución diagnóstica se caracteriza por un valor AUC (AUC = area under the curve) lo más grande posible. Cuanto mayor es este valor, tanto, mejores serán las prestaciones del ensayo evaluado en lo tocante a su especificidad y sensibilidad.

Con los inmunoensayos recién desarrollados se ha conseguido por primera vez representar y evaluar la relación entre el [-5, -6, -7]-proPSA y el PSA libre. De modo sorprendente, esta relación ha demostrado tener un valor predictivo especialmente grande en los análisis ROC realizados, es decir, con la relación entre el [-5, -6, -7]-proPSA y el PSA libre es posible una diferenciación entre la PHB y el PCa mejor que con los parámetros ya conocidos del estado de la técnica. Esta ventaja resulta evidente cuando se observa la figura 3.

Otra forma de ejecución preferida de la invención es, pues, un análisis más profundo de los sueros críticos de PSA, es decir, de sueros que tienen un PSA total inferior a 20 ng/ml, con preferencia especial un PSA de 2 a 15 ng/ml y en particular de 4 a 10 ng/ml mediante la evaluación del cociente de la división del [-5, -6, -7]-proPSA por el PSA libre o bien del cociente inverso.

Los anticuerpos de la invención pueden utilizarse además para determinar individualmente las tres formas diferentes del proPSA, el [-5]-proPSA, el [-6]-proPSA y/o el [-7]-proPSA. A tal fin se utiliza un anticuerpo de la invención para enriquecer el [-5, -6, -7]-proPSA de una muestra y hacerlo accesible para el análisis posterior. El enriquecimiento se lleva a cabo de modo especialmente preferido por cromatografía de inmunoafinidad o por inmunosorción selectiva y mediante la detección individual de las tres formas de proPSA mediante espectrometría de masas (EM).

El procedimiento inmunológico de la invención abarca a las tres formas de proPSA [-5, -6, -7] como suma, mientras que con la EM es posible cuantificar individualmente cada una de las tres formas de proPSA.

Otro objeto de la invención es, pues, la cuantificación separada del [-5], [-6] y [-7]-proPSA y el uso de estos valores individuales para el diagnóstico o para la exclusión de un carcinoma de próstata.

Los anticuerpos de la invención reaccionan también con la [-6]-prohK2, que tiene la secuencia de aminoácidos prolina-leucina-isoleucina-glutamina-serina-arginina (PLIQSR). De modo similar al sistema de detección y análisis descrito anteriormente, con los anticuerpos de la invención se puede determinar también la prohK2 y aportarse al diagnóstico.

La cantidad de las tres formas de proPSA [-5], [-6] y [-7] puede compararse por tanto con las enfermedades y procesos patológicos que las generan, para poder distinguir entre un curso agresivo de la enfermedad y un curso de índole más lenta.

Los siguientes ejemplos ilustran la invención.

Ejemplo 1 Detección individualizada de las diversas formas de proPSA mediante espectroscopía de masas a) Aislamiento del PSA libre de un suero de PCa mediante inmunosorción

En un tubo de 10 ml, a 28,7 mg de esferillas magnéticas de estreptavidina se les añaden 4 ml de una solución del anticuerpo mab<PSA>-MIgG-biotina (c = 25 \mug/ml) en PBS, pH 7, + 1% de RSA + 0,1% de Tween 20 y se incuban durante una hora. A continuación, con un imán se precipitan las esferillas, se saca el líquido sobrenadante pipeteando y se lavan las esferillas tres veces con 3 ml de solución de lavado cada vez (PBS, pH 7 + 20 mM octilglucósido). Se añaden 8 ml de plasma (contenido de PSA libre: 180 ng/ml) se incuba de nuevo a temperatura ambiente durante 60 min. Se saca el plasma pipeteando y se lavan las esferillas 4 x con 1 ml de solución de lavado cada vez. Después se tratan las esferillas con 500 \mul de ácido propiónico 1 M y se agita de nuevo la suspensión durante una hora. Después de la precipitación de las esferillas se retira el líquido sobrenadante, se liofiliza y después se recoge en 10 \mul de agua destilada. Se adquiere el PSA de espermatozoides a la empresa Scripps Laboratories, San Diego.

b) Identificación de formas de proPSA libre por espectrometría de masas del tipo desorción láser asistida por matriz - tiempo de vuelo (EM MALDI-TOF)

En una primera detección, con la EM MALDI-TOF se pone de manifiesto que el PSA libre del plasma, purificado por inmunosorción, se diferencia por su tamaño del obtenido a partir del esperma. Se observa que el PSA libre del plasma de PCa tiene un peso molecular de 29100 Da, es decir 600 Da mayor que el peso molecular del PSA libre obtenido a partir del esperma (28500 Da).

Después de la separación del PSA libre del plasma de PCa y del esperma por SDS-PAGE, la alquilación reductora de las bandas y la digestión con endoproteasa Lys-C permiten obtener el modelo de péptido representado en la figura 1. Para ilustración, los péptidos detectados a partir de las formas de PSA correspondientes se recogen en la
tabla 1.

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TABLA 1 Péptidos de (proPSA) de un análisis MALDI-TOF

1

Tal como se desprende de la figura 1 y de la tabla 1, el PSA libre del plasma de PCa contiene cuatro péptidos, que no están presentes en el PSA del esperma. Se trata de péptidos, cuyo extremo N se ha alargado en 2, 4, 5 y 7 aminoácidos, y constituyen por tanto formas del proPSA.

Ejemplo 2 Obtención de anticuerpos monoclonales (mab) contra el proPSA a) Inmunización de ratones

Ratones Balb/C hembras, de 12 semanas de edad, se estimulan en primer lugar por vía intraperitoneal con 100 \mug del péptido P-L-I-L-S-R-I-C (denominado a continuación péptido proPSA), cuya cisteína está unida mediante un espaciador a una KLH (hemocianina de lapa de cerradura), junto el adyuvante CFA (adyuvante completo de Freund). Después de 6 semanas y después a intervalos mensuales se les administran otras tres inmunizaciones por vía intraperitoneal. A continuación se administran las últimas inmunizaciones por vía intravenosa, cada una con 100 \mug del inmunógeno en un tampón PBS en los días 3, 2 y último antes de la fusión.

b) Fusión y clonación

Las fusión de los esplenocitos de los ratones inmunizados con arreglo al apartado a) con células de mieloma se realiza con según el método de Galfre, Methods in Enzymology 3, 73, 1981. Para ello se mezclan 1 x 10^{8} esplenocitos del ratón inmunizado con 2 x 10^{7} células de mieloma (P3X63-Ag8-653, ATCC CRL 1580) y se centrifugan (10 min a 300 rpm y 4°C). Después se lavan las células con medio RPMI-1640 sin suero fetal bovino (FBS) y se centrifugan de nuevo a 400 rpm en un tubo puntiagudo de 50 ml; se añade 1 ml de PEG (polietilenglicol) (peso molecular 4000; de Merck, Darmstadt) y se mezclan por pipeteo. Después de 1 min en un baño de agua a 37ºC se añaden por goteo 5 ml de RPMI 1640 sin el FBS, se mezclan bien, se llena hasta 50 ml con medio (RPMI 1640 + 10% de FBS) y después se centrifuga. Se recogen las células sedimentadas con RPMI 1640 y 10% de FBS y se siembran en un medio de selección de hipoxantina-azaserina (100 mmoles/l de hipoxantina, 1 \mug/ml de azaserina en RPMI 1640 + 10% de FICS). Como factor de cultivo se añade al medio la interleucina 6 (100 U/ml). Después de 10 días se comprueba la síntesis de anticuerpos específicos que ha tenido lugar en los cultivos
primarios.

c) Ensayo de exploración de anticuerpos anti-péptido proPSA

Para la exploración de los sueros de ratón, de los cultivos primarios y de los mab clonados, la MPT recubierta con estreptavidina recombinante (empresa MicroCoat, Penzberg, nº de catálogo 12-K96 N, lote MC 289) se recubre con 1 \mug/ml de péptido proPSA biotinilado en PBS más un 0,5% de croteína C (100 \mul por hoyo, 10 min de incubación a temperatura ambiente con agitación) y después se lava 3 veces con 0,9% de NaCl/0,05% de Tween 20. En este conjugado, el péptido proPSA (PLILSRIC-Bi) está unido a la biotina mediante otro espaciador, diferente del utilizado anteriormente para el inmunógeno descrito para la inmunización de los ratones, con el fin de evitar los anticuerpos específicos del espaciador. Después se añaden 100 \mul de la solución del anticuerpo a analizar a un hoyo recubierto y se incuba a temperatura ambiente con agitación durante 1 hora. Después de lavar 3 veces con un 0,9% de cloruro sódico/0,05% de Tween 20 y para detectar el anticuerpo fijado procedente de la muestra se añaden en cada caso 100 \mul de un fragmento Fab marcado con POD de un anticuerpo policlonal de oveja contra Fcy de ratón (Roche Diagnostics GmbH, nº de ident. 1431323, equivalentes a 25 mU/ml), se incuba a temperatura ambiente con agitación durante 1 hora y después se lava 3 veces con 0,9% de cloruro sódico/0,05% de
Tween® 20.

Finalmente se añaden en cada caso 100 \mul/hoyo de ABTS® (Roche Diagnostics GmbH, nº de catálogo: 1204521 y 1204530) y después de 30 min a temperatura ambiente se mide la extinción a 405/492 nm en un aparato MR700 Microplate Reader de la empresa Dynatech.

d) Ensayo de los sueros de ratón y líquidos sosbrenadantes de cultivos para el reconocimiento del proPSA en sueros de PCa

Para explorar la reacción de los sueros de ratón, de los cultivos primarios y de los mab clonados con las formas de proPSA en el suero de PCa, la MTP recubierta con estreptavidina recombinante (empresa MicroCoat, Penzberg, nº de catálogo 12-K96 N, lote MC 289) se recubre con 1 \mug/ml de fragmento Fab biotinilado del anticuerpo monoclonal M-30, que solamente reconoce al PSA libre, en PBS más un 0,5% de croteína C (100 \mul por hoyo, 10 min de incubación a temperatura ambiente con agitación) y después se lava 3 veces con 0,9% de NaCl/0,05% de Tween 20. Después se incuba a temperatura ambiente con agitación durante 1 h junto con 100 \mul del suero de PCa sin diluir o diluido 1:10 con PBS. En el paso siguiente se introducen en un hoyo recubierto 100 \mul de la solución de anticuerpo a analizar y se incuba a temperatura ambiente y con agitación durante 1 hora. Después de lavar 3 veces con 0,9% de NaCl/0,05% de Tween 20 y para detectar el anticuerpo fijado procedente de la muestra se añaden en cada caso 100 \mul de un fragmento Fab marcado con POD de un anticuerpo policlonal de oveja contra Fcy de ratón (Roche Diagnostics GmbH, nº de ident. 1431323, equivalentes a 25 mU/ml), se incuba a temperatura ambiente con agitación durante 1 hora y después se lava 3 veces con 0,9% de cloruro sódico/0,05% de Tween® 20.

Finalmente se añaden en cada caso 100 \mul/hoyo de ABTS® (Roche Diagnostics GmbH, nº de catálogo: 1204521 y 1204530) y después de 20 min a temperatura ambiente se mide la extinción a 405/492 nm en un aparato MR700 Microplate Reader de la empresa Dynatech. Como control se emplea un suero de mujer, libre de PSA.

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Para comprobar que los anticuerpos generados no reaccionan con el PSA libre procedente del esperma, en lugar de suero de PCa se emplea como antígeno el PSA libre de la empresa Scripps, San Diego, nº de catálogo: P 0714, lote: 98 43 649, 1 \mug/ml, disuelto en PBS más un 0,5% de croteína C. Los resultados se recogen en la tabla 2.

TABLA 2 Reacción de un suero de PCa que contiene una concentración elevada de PSA con sueros de ratones, que se han inmunizado con un inmunógeno péptido proPSA, por comparación con un suero nulo

2

El resultado indicado por un lado que la mayor parte de los sueros analizados de los ratones inmunizados con arreglo al apartado a) reaccionan específicamente con el suero de PCa que contiene PSA. Por otro lado, como no reaccionan con el PSA libre del esperma, que posee el extremo N normal del PSA maduro, estos resultados demuestran además que en este suero de PCa tienen que existir formas de proPSA.

Se analizan de modo similar los cultivos primarios y se clonan los cultivos, que presentan una reacción positiva con el péptido proPSa y con el suero que contiene el proPSA pero que no reaccionan con el PSA (del esperma), con el clasificador celular activado por fluorescencia en placas de cultivo celular de 96 hoyos. Como aditivo de cultivo se añade al medio la interleucina 6 (100 U/l). De este modo se obtienen los clones de la tabla 3.

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TABLA 3 Clones con reactividad frente al proPSA

clon	subgrupo de IgG	extinción/ensayo 1c)
1.001.7	IgG1	1,60
2.003.6	IgG1	1,59
2.005.11	IgG1	2,49
1.023.6	IgG1	2,09
2.002.4	IgG1	1,42

e) Se utilizan las células de hibridoma obtenidas para un procedimiento estándar de producción de IgG por formación de ascites en ratones. La purificación de estos anticuerpos de ascites se realiza por los métodos habituales de la química de las proteínas (p.ej. con arreglo a los métodos descritos en Enzymology 121, 587-695, 1986).

Ejemplo 3 Ensayo de la especificidad con respecto al [-5, -6, -7]-proPSA

Tal como se ha descrito en el ejemplo 1 d), el proPSa del suero de PCa se fija sobre hoyos recubiertos previamente con estreptavidina de placas de microvaloración. A continuación se incuban juntos durante 1 hora los anticuerpos anti-proPSa y los péptidos proPSA de distintas longitudes. Los péptidos libres añadidos pueden competir en esta etapa con el proPSA del suero de PCa de la fase sólida para lograr fijarse sobre los anticuerpos. Los péptidos que se reconocen bien provocan la expulsión o desplazamiento y, a fin de cuentas, la disminución de señales, porque se habrán fijado menos anticuerpos específicos y, por tanto, menos anticuerpos detectados. Tal como se desprende de la figura 2, los péptidos [-6]proPSA y [-5]proPSA conducen a una intensa reacción de expulsión. El [-7]proPSA no se empleó en esta misma reacción. En otros ensayos, el péptido [-7]proPSA presenta una competencia igualmente buena, similar a la del péptido [-5] o [-6]proPSA.

Ejemplo 4 Detección del [-5, -6, -7]-proPSA con ELISA

La detección del [-5, -6, -7]-proPSA se realiza en un ensayo ELISA sandwich con el mab anti-proPSA como anticuerpo capturador y un mab marcado con POD contra el PSA libre como reactivo de detección. Se biotinila el anticuerpo mab 1.023.6 por procedimientos estándar y se utiliza en una concentración de 2,5 \mug/ml. Este ensayo se efectúa de modo similar al ensayo Enzymun® con el PSA libre, con una diferencia importante, que consiste en que se emplea como reactivo capturador el mab 1.023.6 (biotinilado) de la presente invención.

Ejemplo 5 Análisis ROC con distintas fracciones de PSA

Con el inmunoanalizador automático ELECSYS® (Roche Diagnostics) se analizan los parámetros de PSA libre y PSA total de un total de 41 muestras que tienen un valor de PSA total comprendido entre 4 y 10 ng/ml pero que tienen al mismo tiempo un diagnóstico seguro en cuanto a la BPH o al PCa; así como el proPSA con arreglo al ejemplo 4. Se calculan los cocientes del PSA libre y el PSA total, del proPSA y el PSA total, del PSA libre y el proPSA y al igual que los parámetros individuales se someten a un análisis ROC. Tal como se desprende claramente de la figura 3, la relación entre el PSA libre y el proPSA arroja el valor máximo de AUC. Por lo tanto, este parámetro contribuye mucho mejor a la diferenciación entre la BPH y el PCa que los dos valores relativos restantes o los valores individuales correspondientes.

<110> Roche Diagnostics GmbH

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<120> Anticuerpos contra formas especiales del proPSA y su utilización en inmunoensayos

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<130> 523500DE

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<140>

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<141>

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<160> 9

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<170> PatentIn Ver. 2.1

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<210> 1

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<211> 7

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 1

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\sa{Ala Pro Leu Ile Leu Ser Arg}

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<210> 2

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<211> 7

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 2

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\sa{Pro Leu Ile Leu Ser Arg Ile}

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<210> 3

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<211> 6

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 3

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\sa{Pro Leu Ile Leu Ser Arg}

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<210> 4

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<211> 5

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 4

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\sa{Leu Ile Leu Ser Arg}

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<210> 5

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<211> 4

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 5

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\sa{Ile Leu Ser Arg}

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<210> 6

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<211> 7

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 6

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\sa{Val Pro Leu Ile Gln Ser Arg}

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<210> 7

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<211> 6

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 7

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\sa{Leu Ile Leu Ser Arg Ile}

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<210> 8

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<211> 5

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 8

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\sa{Ile Leu Ser Arg Ile}

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<210> 9

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<211> 4

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 9

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\sa{Leu Ser Arg Ile}

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Claims

1. Anticuerpos con especificidad para todas las formas siguientes de proPSA: [-5], [-6] y [-7]proPSA, caracterizados porque estos anticuerpos esencialmente no son reactivos con el [-4]proPSA ni con formas más cortas del proPSA.

2. Anticuerpos según la reivindicación 1, caracterizados porque estos anticuerpos son anticuerpos monoclonales.

3. Anticuerpos según la reivindicación 1 ó 2, caracterizados porque son anticuerpos que presentan propiedades de fijación esencialmente iguales que las de los anticuerpos monoclonales que se ha segregado del clon depositado en la DSMZ con el número de registro ACC 2456.

4. Procedimiento para la obtención de anticuerpos contra todas las formas siguientes de proPSA: [-5], [-6] y [-7]proPSA, empleando péptidos sintéticos fijados sobre un sustrato, que corresponden a la secuencia del propéptido [-5], [-6] y/o [-7]proPSA, caracterizado porque mediante un procedimiento de exploración se obtienen anticuerpos que esencialmente no son reactivos con el [-4]proPSA ni con formas más cortas del proPSA.

5. Método para la detección de todas las formas siguientes de proPSA: [-5], [-6] y [-7]proPSA en una muestra, caracterizado porque para la detección se emplea un anticuerpo específico según una de las reivindicaciones 1 - 3.

6. Método según la reivindicación 5, caracterizado porque como anticuerpo capturador específico se emplea un anticuerpo según una de las reivindicaciones 1 - 3.

7. Método según una de las reivindicaciones 5 ó 6, caracterizado porque se utiliza un anticuerpo capturador con especificidad para todas las formas siguientes de proPSA: [-5], [-6] y [-7]proPSA así como un anticuerpo de detección con especificidad para el PSA libre.

8. Método según una de las reivindicaciones 5, 6 ó 7, caracterizado porque el anticuerpo capturador está presente en forma biotinilada.

9. Composición de ensayo de diagnóstico para la detección de todas las formas siguientes de proPSA: [-5],[-6] y [-7]proPSA, que contiene anticuerpos con especificidad para todas las formas siguientes de proPSA: [-5], [-6] y [-7]proPSA, que esencialmente no son reactivos con las formas más cortas de proPSA.

10. Procedimiento para la detección o exclusión de un carcinoma de próstata, caracterizado porque se realiza determinando todas las formas siguientes de proPSA: [-5], [-6] y [-7]proPSA de una muestra.

11. Procedimiento para la detección o exclusión de un carcinoma de próstata, caracterizado porque se determinan todas las formas siguientes de proPSA: [-5], [-6] y [-7]proPSA de una muestra y se halla su relación con otras fracciones de calicreína o con la cantidad total de una o de varias calicreínas.

12. Procedimiento según la reivindicación 11, caracterizado porque la calicreína es el PSA.

13. Procedimiento para la detección o exclusión del carcinoma de próstata, caracterizado porque se determinan todas las formas siguientes de proPSA: [-5], [-6] y [-7]proPSA y el PSA libre de una muestra y se calcula el cociente de todas las formas siguientes de proPSA: [-5], [-6] y [-7]proPSA y el PSA libre.

14. Procedimiento para la detección o exclusión del carcinoma de próstata, caracterizado porque se purifican todas las formas siguientes de proPSA: [-5], [-6] y [-7]proPSA empleando los anticuerpos según las reivindicaciones 1 - 3 y se cuantifica por separado cada una de estas tres formas de proPSA.