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JP2003533700A - 早期産の危険性予知のためのｉｌ−６の検知 - Google Patents

早期産の危険性予知のためのｉｌ−６の検知

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JP2003533700A
JP2003533700A JP2001584889A JP2001584889A JP2003533700A JP 2003533700 A JP2003533700 A JP 2003533700A JP 2001584889 A JP2001584889 A JP 2001584889A JP 2001584889 A JP2001584889 A JP 2001584889A JP 2003533700 A JP2003533700 A JP 2003533700A
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JP
Japan
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antibody
preterm birth
birth
preterm
patients
Prior art date
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Pending
Application number
JP2001584889A
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English (en)
Inventor
バトー，フレデリック
クラレ，エマニュエル
トルブダン，エレーヌ
ヴェルモ−デスロシュ，クロード
ヴェイル，ベルナール
ヴィジュデーヌ，ジョン
Original Assignee
ユニヴェルシテ ルネ デカルト−パリ ヴェ
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
Application filed by ユニヴェルシテ ルネ デカルト−パリ ヴェ filed Critical ユニヴェルシテ ルネ デカルト−パリ ヴェ
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6863—Cytokines, i.e. immune system proteins modifying a biological response such as cell growth proliferation or differentiation, e.g. TNF, CNF, GM-CSF, lymphotoxin, MIF or their receptors
    • G01N33/6869—Interleukin

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、頸膣分泌物検体中にIL6が存在するかまたは存在しないかを検知することによって、特にPCTによるIL6 mRNAの検知または免疫-クロマトグラフィーによる直接的なIL6の検知をすることによって切迫早期産を予知する方法に関するものである。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明は、頸膣分泌物中のIL6を検知することによって、切迫早期産を診断す
る方法に関するものである。
【０００２】 本発明の記載で、「早期産」とは無月経34週目以前の出産と定義し、「早々期産(
very preterm delivery)」とは無月経32週目以前の出産と定義し、そして「切迫(i
mpending)出産」とは診断検査後14日以内、好ましくは7日以内の出産と定義する
。
【０００３】 早期産は妊娠のおおよそ10％で発生し、先天的に異常がない新生児での羅患率
および致死率の75％〜90％にあたる。産科および新生児のモニタリングがここ数
十年で進歩したにもかかわらず、早産の数は一定のままであるか、または増加し
ている。
【０００４】 特に、早期産の前兆の診断および治療療法は、臨床上未解決な問題のままであ
る。危険性がある患者を素早く同定するのは、困難である。産科の歴史、人口統
計上の要因および予兆となる症状の解析を基にした従来の予知法は、客観的でも
なく、感度も高くなく、特異的でもない。さらに、出産を遅らせることができる
子宮収縮抑制剤の大量使用に基づいた提唱されている予防処置は、比較的効果が
無いことが証明されているため、早期産の前兆を診断する場合に、早産児の生存
を確保するように新生児集中治療の全ての処置を計画するために、切迫出産を予
知することも不可欠なものである。
【０００５】 早期産の前兆と関連し、危険性のある患者をモニタリングするのに使用されえ
る、確実で素早い診断を可能にする生物学的な目印を調べるため、多くの研究が
行われてきた。
【０００６】 子宮内感染は早期産について同定された原因の1つであるが、しかし、それは
観察された事例のたった10％〜40％にしか相当しない。満期であろうと早期であ
ろうと、出産のきっかけにおける、炎症の役割および特定のサイトカイン（IL8
、IL1β、I16およびTNFα）の関与が、今日明らかに立証されている。例えば最
近の報告では、子宮頸管の細胞外マトリクスが妊娠の維持において不可欠な役割
を担っていると、Winklerら［J.Perinat.Med.,27,45-60(1999)］は報告している
。出産に先立つ頸管の素早い拡張は、局部炎症反応で誘導されるプロテアーゼに
よる、このマトリクスの素早い劣化と関連していると考えられ、それは好中球お
よび白血球の溢血、ならびに特定のサイトカイン（IL8、IL1β、I16およびTNFα
）の濃度の増加も伴うと考えられる。
【０００７】 早期および/または切迫出産の危険性を診断するために、羊水中のこれらサイ
トカイン、および炎症タンパク質（フィブロネクチン）もアッセイすることが提
唱されている。例えば、羊水中のIL6の値が高ければ、85％の感度で切迫（7日以
内の）出産を判断できると、HILLIERらは [Obsttetrics &Gynecology,6,941-948
,(1993)] 報告している。
【０００８】 しかし、羊水穿刺は危険な状態の患者の医学的なモニタリングにはあまり適し
ていない、侵襲性かつ潜在的に危険な技術であり、規則的な試験（毎週）を行う
必要がある。それゆえ、これらの目印が頸膣分泌物中にも存在するかどうか、お
よび、それらのアッセイによって早期産および/または切迫出産の危険性を評価
できるかどうかを決定するために研究が行われてきた。 報告された結果は互いに異なるものである。フィブロネクチンの事例では、IN
GLSらは[Am.J.Obst Gynecol.,171,5-10,(1994)]、膣分泌物中の総フィブロネク
チンおよび/または胎児フィブロネクチンの免疫酵素アッセイを研究した。得ら
れた結果は、総フィブロネクチンのアッセイによって、2〜3週間目（臨床医にと
って有利な、十分に長い期間）以内での出産の発生を予知できること、そしてそ
れが早期産には特異的でないことを示している。通常羊水および胎盤にのみ存在
する頸膣分泌物中でのそのアッセイは、膜が破損されたか傷害を受けた早期産の
前兆の胎児フィブロネクチンに関する事例でのみ使用することができる。
【０００９】 IL8の事例では、TANAKAらは[Am.J.Obstet.Gynecol.,179,644-649,(1998)]、頸
膣分泌物中のIL8、およびIL1の増加は早期産の危険性と関連していると考えてい
る。しかし、頸膣分泌物中でのIL-8の相当量によって、高感度（80％）で子宮内
感染を診断できることも報告されている[RIZZOら,J.Perinat.Med.,25,461-468,(
1997)；RIZZOら,Ultrasound Obstet.Gynecol.,12,86-92,(1998)]。しかし、それ
が早期産を予測するための信頼できる目印になっているとは思われない[RIZZOら
,1997,上記引用]。
【００１０】 IL6に関しては、様々な研究[LOCKWOODら,Am.J.Obst,Gyecol.,171,1097-1102,(
1994)；INGLISら,Am.J.Obst.Gynecol.,171、5-10,(1994)]が、選択された閾値に
関して互いに異なる以外は、早期産の事例では頸膣分泌物中でのIL6の量が増す
という結論と一致している。さらに、RIZZOらは[Am.J.Obstet.Gynecol.,175,812
-817,(1996)]、頸膣分泌物中のIL6の量が羊水の感染にとっての目印に当たると
考えている。頸膣分泌物中のIL6の量と切迫出産との関連は立証されていない。
あらゆる事例において、対照患者から得た検体でIL6の量が変化し、時には高く
検知されるという事実が、結果の解釈を困難にしている。
【００１１】 本発明者は、患者の細胞免疫の局所的な活性化の研究に着手し、特に頸膣分泌
物内に存在する特異的なサイトカインが、局所的に生産されるかどうかを決定す
るため、早期産の前兆を、危険性がない正常に妊娠している対照患者と比較した
。特に、膣分泌物は、剥離した上皮細胞と白血球、および頸管ムチンと細菌に分
泌される重合された糖タンパク質をも含む固体層、ならびに電解質、および漏出
または分泌されたタンパク質（免疫グロブリン、糖タンパク質（サイトカイン）
、アルブミンおよびラクトフェリン）も含む液層から構成される[BELECら,Clini
cal and Diagnostic Laboratory Immunology,2,57-61,(1995)]。
【００１２】 この目的で、本発明者は、患者の2群の頸膣分泌物から得た細胞ペレット中の
サイトカインIL6、IL8、IL10およびIL13のmRNAの存在をRT-PCRにて探索した。そ
の結果、IL8およびIL10のmRNAは、対照の患者（33.3％および16.7％）と早期産
の前兆の危険性がある患者（40.3％および48.1％）の双方で検知されるが、他方
、IL6とIL13のmRNAはそれぞれ患者の10.9及び6.2％に存在し、但し対照群の患者
では検知されなかったことが認められた。本発明者は、頸膣分泌物内でのIL6発
現が早産（妊娠34週目以前の出産p=0.02）および極端な早産（妊娠32週目以前の
出産p=0.049）と関連する目印であり、14日未満の期間内（p=0.001）または7日
未満の期間内（p=0.036）ですら、切迫早期産の診断が可能であることも認めた
。一方、IL8は母体感染および新生児感染と関連しているが、切迫出産とは関連
していない。
【００１３】 これらの結果、特に対照群の患者でIL6が存在しないことは、正常に妊娠して
いる患者の事例を含む頸膣分泌物中でIL6が存在すると報告している従来技術の
知見とは一致していないので、本発明者はこの不一致の理由を研究した。本発明
者は、従来技術ではELISA型の免疫酵素アッセイ法を使用したためであろうと推
測した。特に、膣分泌物は、複雑で比較的非均質な媒体を構成しており、特に検
体の濁度から生ずる「バックグラウンドノイズ」はELISAアッセイに干渉する可
能性がある。
【００１４】 それゆえ、本発明者はELISA技術とは異なって、バックグラウンドノイズの問
題に起因する干渉がない、固形支持体上での免疫検知法を用いた頸膣分泌物中で
のIL6の探索を選択した。得られた結果は、患者の頸膣分泌物中のIL6の不在は早
期産の前兆がないことを示し、およびIL6の存在と切迫出産とは関連しているこ
とをを立証するものである。
【００１５】 本発明者は、IL6の羊水から頸膣分泌物への通過を引き起こす胎盤膜の破損が
ない場合でさえも、IL6が頸膣分泌物内で検知されることも認めている。したが
って、驚いたことに、切迫早期産の前兆と関連して、膣の粘膜および子宮頸管の
白血球によって、IL6が局所的に生産することが認められた。これらの結果から
、早期産および特に切迫早期産の危険性を予測するための新規な方法を提供する
ことができる。
【００１６】 本発明の対象は、検査される患者から得た頸膣分泌物検体中で、IL6の発現が
存在するかまたは存在しないかを検知することからなることを特徴とする、切迫
早期産の予知方法である。従来、頸膣分泌物は外頸および後部円蓋で得られる。
【００１７】 本発明によれば、頸膣分泌物中でIL6が存在するか、またはしないかの検知は
、特に： −IL6 mRNAを検知することによって、または −IL6を直接的に検知することによって 行うことができる。
【００１８】 IL6 mRNAの検知は、IL6をエンコードする配列に特異的なオリゴヌクレオチド
、例えば頸膣分泌物の遠心分離によって得た細胞ペレットから抽出したmRNAを用
いて、従来の分子生物学的な方法で行うことができる。有利には、逆転写後、IL
6 mRNAの特異的な増幅を含む検知方法が選択されるであろう。
【００１９】 IL6の直接的な検知は、特に免疫検知によって、好ましくは頸膣分泌物の遠心
分離からの上清を用いて行うことができる。従来技術で記載されるELISA型の免
疫酵素アッセイ技術は、先に記載したバックグラウンドノイズの理由から、信頼
できる検知とは認められない。
【００２０】 免疫クロマトグラフィーによる固形支持体上での検知技術が、それゆえ選択さ
れるであろう。それ自体公知の一般な原理は、次のようなものである：
【００２１】 検知される分析物を含むと思われる検体を、分析物に対して割り当て、そして
（一般に着色された微粒子を用いて）ラベルした一次抗体（暴露抗体(revealing
antibody)）と接触させる。このようにして形成した混合物を、分析物に対して
も割り当てられる二次抗体（捕獲抗体(capture antibody)）が付着するクロマト
グラフィーの支持体上に沈積させる。分析物が検体中に存在すれば、分析物/ラ
ベルした暴露抗体複合体は、捕獲抗体と二次複合体を形成することにより、その
移動が停止する部分で検知される。
【００２２】 本発明を実施するためには、IL6分子の異なるエピトープを認識する2つの抗-I
L6抗体が、各々暴露抗体および捕獲抗体として選択されるであろう。特に最も適
した抗体は、BesanconのCENTER NATIONAL DE TRANSFUSION SANGUINE[France輸血
センター]およびBIOTEST PHARMA GMBHの名前で、ヨーロッパ出願0 043 193号に
記載されているモノクローナル抗体BE-4（C.N.C.M I-911）、BF-6（C.N.C.M I-9
12）およびBE-8（C.N.C.M I-913）から選択される。有利には、BE-8抗体が捕獲
抗体として選択され、BE-4抗体が暴露抗体として選択されるであろう。
【００２３】 暴露抗体のラベル化およびクロマトグラフィー支持体への捕獲抗体の付着は、
当業者にそれ自体公知の方法に従って行われる。
【００２４】 例えば、暴露抗体は、着色したゼラチンの微粒子、リポソーム、金属の微粒子
、特にコロイド状の金などでラベルされてもよい。
【００２５】 本発明に関連して、免疫クロマトグラフィーによる先に記載の検知における、
様々な変形および様々な改良型が使用されてもよい。例えば免疫クロマトグラフ
ィーでの検知では、市販されており、所定の分析物を検知するために選択される
抗体と組合せできる、用時調整型装置を使用することができる。一般に、これら
の装置は、捕獲抗体が付着できるクロマトグラフィー支持体（例えばニトロセル
ロース膜）および解析される検体を受ける沈着領域；捕獲抗体が付着する領域と
沈着領域の間にあって、後着に隣接している、ラベルされた暴露抗体を受ける領
域からなる小さなスリップの形態である。捕獲抗体をクロマトグラフィー支持体
へ付着させ、そして、それを受ける領域を暴露抗体で飽和した後、装置は解析に
使われるように準備される。このことは、この目的のために提供される領域上で
、解析される検体を沈積させることで容易に行われる。分析物/暴露抗体複合体
の形成は、検体がこの暴露抗体で飽和した領域を通過して移動する時に起こりえ
る；そしてこの複合体は、クロマトグラフィー支持体を洗浄した後、捕獲抗体が
付着した着色したバンドの形態で目視で検知される。検知は、このようにして数
分で行うことができる。
【００２６】 上記の方法に従った、免疫クロマトグラフィーによるIL6の検知は、特に危険
な状態の患者のモニタリングに適した本発明を具体化したものに相当し、かさ高
く高価な装置を必要としないため、患者の枕もとで、医師または治療関係者によ
って簡単に行うことができ、そして素早く応答を得ることが可能であり、そのた
め切迫出産が予知される場合には必要な処置をすることができる。
【００２７】 上の組合せ以外に、本発明は本発明の対象である方法の実施例を言及する次に
挙げる説明から明らかになるであろう他の組み合せも含む。しかし、これらの実
施例が本発明の対象の例示としてのみ示されるものであり、決して本発明に制限
を加えるものではないことは明確に理解されるべきである。
【００２８】 実施例1：早期産の前兆がある患者の頸膣分泌物中の炎症性サイトカインmRNA
の発現A-材料と方法 1-調査される個体群の説明 調査される個体群は、Maternite Port Royal[Port Royal Maternity Hospital
](Paris)に入院している無月経13〜35週目(WA)の早期産の前兆が認められる307
人の患者から成る。対照群は、早期産の前兆がない30人の妊婦(3ヶ月を超える)
で構成される。 封入規準 (inclusion criteria)は、臨床および超音波試験に従って定義され
る。 これらの患者のうち、258人(84％)が無傷な膜を有している。
【００２９】2-調査される個体群の分娩特徴 −検体採取日から出産日までの期間、 −早産(無月経32週目未満(極端な早産)または無月経34週目未満(早産)) を決定するため、これらの患者は出産に至るまでモニタリングした。 調査した個体群において、患者の30.9％が入院後早々に出産し(34WA以下)、10
.7％が7日以内に出産した。18.9％が、入院から14日以内に出産した。
【００３０】3-頸膣検体採取 頸膣分泌物は、フォームチップのついた滅菌したプラスチック採取ピペットを
使って、外頸および後部円蓋を吸引することにより収集した。肉眼で見て出血し
ている検体は、この段階で除外した。細胞を1500rpm/5分で遠心分離し、PBSバッ
ファーにて2回洗浄した。上皮細胞および白血球を、マラセジア細胞上で数えた
。そして細胞ペレットを、総RNAを抽出する目的で、500μlのTRI-REAGENTに(EUR
OMEDEX、Souffelmeyerheim、France)に再懸濁した。
【００３１】4-総RNAの抽出および逆転写 膣分泌物細胞の総RNAを、グアニジンイソチオシアナート-フェノール手法によ
って抽出し、そして、ゲノムDNAの全残渣を取り除くためにDNAseI(BOEHRINGER M
ANHEIN、Meylan、France)で処理した。最終量40μl中、6IUの逆転写酵素(PROMEG
A、Charbonnieres、France)存在下で、3μgのRNAを42℃、2時間でcDNAに転写し
た。
【００３２】5-PCR 次に、100ngのcDNAを2IUのTag DNAポリメラーゼ(ATGC、Noisy le Grand)およ
びヒトアクチンに、IL6に、IL8に、IL10にまたはIL13に特異的なオリゴヌクレオ
チドの存在下で、PCRにて増幅した。94℃で5分の初期変性および57℃で3分のハ
イブリダイゼーションの後、35回の増幅サイクルを次の条件下(伸長：72℃で30
秒、変性：94℃で30秒およびハイブリダイゼーション：57℃で30秒)で行い、次
いで72℃で7分伸長させ、そして生産物を4℃で維持した。 ポジティブな検体については、既知コピー数の競合血漿(IL6に対してはPQA1ま
たはアクチンに対してはPQB2)を用いて、メッセンジャーRNAを競合PCRにて定量
する。エチジウムブロマイドの存在下で2％アガロースゲル電気泳動にて生産物
を分画した後、ゲルを写真に撮り、バンドの強度を濃度計(Vilbert-Loumat、Mar
ne la Vallee、France)を使って測定する。
【００３３】6-母親および子供の感染調査 母親の感染は、温度、尿、血清CRP、完全血液計数(complete blood count) (
白血球増加)および膣検体の細胞細菌学的な試験を基にして評価する。新生児の
感染は、発熱、血清CRP、完全血液計数および細菌学的な調査のためのオリフィ
スで得られる検体を基にして評価する。
【００３４】7-炎症パラメータ (CRPおよび総フィブロネクチン)のアッセイ 血清CRPはを比濁計にて評価し、胎児のフィブロネクチンを、従来の免疫酵素
手法(ELISA)を使い、市販のキットにて頸膣内で定量する。
【００３５】8-統計解析 頸膣分泌物サイトカインの早産と、検体採取日から出産日までの期間との関連
性は、多重回帰によって行った。群間の違いは、χ2検定およびフィッシャー正
確(Fischer's exact)検定を使って決定した。
【００３６】B-結果 1-早期産の前兆に特異的な目印の実証 サイトカインIL6、IL8、IL10およびIL13の生産物は、早期産の前兆の危険性が
ある129人の患者、および早期産の前兆の危険性がない30人の対照患者の膣分泌
物中で、RT-PCRにて解析した。これら2群の検体中で、これらサイトカインが存
在するか存在しないかを決定し、得られた結果を百分率として、下の表1に示す
。
【表１】 これらの結果は、IL6およびIL13が早期産の前兆に特異的なサイトカインであ
り、それらは診断に使用されえることを示している。 IL13を用いてRT-PCRによって認められたシグナルがIL6で認められたシグナル
よりはるかに弱かったため、それゆえIL6を、より感度が高く、そのため、診断
での利用上、潜在的により有利な目印として選択した。IL6のメッセンジャーの
数は定量PCRにて決定した。ポジティブ検体当り平均230000のコピー数が観察さ
れた。それは、アクチンと比べて100〜1000倍のコピーに相当する。
【００３７】2-種々のサイトカインの早期産との関連 結果を、下の表2に示す；著しい関連性は、それらの有意閾値とともに太字で
示している。
【表２】 結果は、頸膣分泌物内のIL6、IL8およびIL10の存在と極端な早産(32WA未満)と
の著しい関連性を示している。一方、IL6のみの存在は極端な早期産(32WA未満)
および早期産(34WA未満)の両方と関連している。
【００３８】3-サイトカインと、入院7日目または14日目以内の出産との関連 結果を下の表3に示す；著しい関連性は、それらの有意閾値とともに太字で示
している。
【表３】 結果は、頸膣分泌物中のIL6の存在と、入院後7日目または14日目以内の出産と
の著しい関連性を示している。 加えて、無傷な膜を有する258人の患者の個体群では、頸膣分泌物中のIL6の存
在は14日未満(p=0.003)の出産期間と著しく関連している。 それゆえ、これら全ての結果は、早期産の前兆の危険性がある患者の頸膣分泌
物中でのRT-PCTによるIL6 mRNAの検知は、切迫早期産[7日未満 (p=0.001)；14日
未満(p=0.001)]を予知するための確実な方法となることを実証している。
【００３９】 実施例2：早期産の診断のための、免疫クロマトグラフィーによるIL6の検知A-材料と方法 1-免疫クロマトグラフィー装置の調製 GELMAN SCIENCESが販売している免疫クロマトグラフィー装置を使った。クロ
マトグラフィー支持体は、ポリエーテルスルフォンで作られた膜から成り、従来
使われているニトロセルロースよりも耐性が高く、より優れた検知感度を示す。 試薬リスト −膜(PREDATOR、PALL Gelman Sciences) −グラスウール(PALL Gelman Sciences) −吸収紙(PALL Gelman Sciences) −暴露抗体(BE-4、C.N.C.M.I-911) −捕獲抗体(BE-8、C.N.C.N.I-913) −ヤギ抗-マウスIgG抗体(対照) −クエン酸ナトリウム −ホウ砂バッファー(20mMまたは2ｍM Na2B4O7・2H2O、pH9.3) −BSA −Tween 20
【００４０】2-暴露抗体(コロイド状金に結合した抗体)の調製 a-コロイド状金の調製 溶液を、500mlのエルレンマイヤーフラスコに調製する。4mlの1％金コロイド
溶液を200mlの沸騰している蒸留水に加える。そして、12mlの1％クエン酸ナトリ
ウム溶液を強く攪拌しながら加える。得られた溶液を、ワインと似た色が得られ
るまで(約3分)、再び加熱して沸騰させる。そして、溶液を暗所で環境温度に保
管する。 b-コロイド状金に結合した抗体(暴露抗体)の調製 BE-4抗体を一晩蒸留水に透析し、そして、そのタンパク質含量を評価し、-80
℃で保管する。 c-コロイド状金に対する抗体の結合 そして、BE-4抗体25μgおよび20mM BORAXバッファー100μlを1mlのコロイド状
金に加える。得られた溶液を環境温度下で1時間保温する。1％BSAを含む20mM BO
RAXバッファー100μlを加え、溶液を1500rpmで15分間遠心分離する。上清を取り
除いた後、ペレットを0.1％BSAを含む2mM BORAXバッファー1mlに懸濁し、溶液を
1500rpmで50分間遠心分離する。上清を取り除いた後、0.1% BSAを含む2mM BORAX
バッファー250μl中にペレットを採取する。コロイド状金に結合した抗体を4℃
で暗所で保管する。
【００４１】3-免疫クロマトグラフィー装置の組み立て a-暴露抗体を含むグラスウールの調製 コロイド状金に結合したBE-4抗体250μlを、1mlの100mMトリス塩酸バッファー
、pH8.0；0.5％ BSA；0.1％ Tween20および5％サッカロースに加える。 長方形のグラスウール (L：20mm×W：5mm)をコロイド状金に結合した抗体の溶
液に浸し、そして58℃のオーブンで30分間乾燥させ、環境温度下、乾燥空気、減
圧下で保管する。 b-装置の組み立て 2枚の長方形の吸収紙を切り抜く(L：16mm×W：4mmおよびL：18mm×W：4mm)。 膜の小さなスリップを切り抜き(L：59mm×W：25mm)、捕獲抗体(BE-8) 8μlお
よび対照抗体(抗-マウス IgG) 8μlを1mg/mlで膜に対して垂直に線上に沈積し、
そして膜を乾燥器で乾燥させる。幅4mmの小さなスリップを切り取り、免疫クロ
マトグラフィー装置の様々な部品を製造取扱説明書に従って組み立てる。
【００４２】4-免疫クロマトグラフィーによる頸膣分泌物中のIL6の検知 調査された個体群、解析された臨床パラメータおよび頸膣分泌物検体を得る方
法は、上記実施例1に記載されている。 分泌物を300μlのpH7.4のPBSバッファーで希釈し、混合物を攪拌し、そして25
00rpmで5分間遠心分離する。200μlの上清を、本目的に供される免疫クロマトグ
ラフィー装置の領域に沈積する。 60分間移動させる；膜を洗浄した後、捕獲抗体が付着した部位で茶色のバンド
が出現するのは、検体中にIL6が存在することを示している。
【００４３】B-結果 IL6の存在は、実施例1の調査に含まれた早期産の前兆がある患者からの41検体
で解析された。これらの患者のうち、37人は無傷の膜を有しており、4人は膜の
破損を呈している。 膜の破損を呈している患者から得た4検体は、RT-PCRではネガティブな結果を
、免疫クロマトグラフィーではポジティブな結果を示す。 これらの結果は、免疫クロマトグラフィーとRT-PCRとの間で95％の相関を示し
ている。 膜が破損していない場合には、頸膣分泌物中でのIL6の検知において、免疫ク
ロマトグラフィーは、RT-PCRと同程度の感度である。 この結果、本発明の免疫クロマトグラフィーによる頸膣分泌物中のIL6の検知
方法は、RT-PCRによるIL6 mRNAの検知方法と同程度の感度である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＯ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ， ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，Ｉ Ｓ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ， ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，Ｐ Ｔ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ， ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 クラレ，エマニュエル フランス、エフ−25000 ブザンソン、シ ュマン ド ラ セル、37 (72)発明者 トルブダン，エレーヌ フランス、エフ−92130 イシ−レ−ムリ ノー、リュ デュ ジェネラル エブエ、 28 (72)発明者 ヴェルモ−デスロシュ，クロード フランス、エフ−25000 ブザンソン、リ ュ メルモ、４シー (72)発明者 ヴェイル，ベルナール フランス、エフ−95600 オボンヌ、アレ モシャン、７ (72)発明者 ヴィジュデーヌ，ジョン フランス、エフ−25720 ラルノール、シ ュマン ド ラ グラット（番地なし) Ｆターム(参考） 4B063 QA01 QA19 QQ03 QQ53 QR08 QR48 QR62 QS16 QS25 QX01

Claims (8)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 検査される患者から得た頸膣分泌物検体中にIL6が存在する
    かしないかを検知することからなることを特徴とする、切迫早期産を予知する方
    法。
  2. 【請求項２】 IL6 ｍRNAが、検知されることを特徴とする請求項1に記載の
    方法。
  3. 【請求項３】 IL6が、直接検知されることを特徴とする請求項1に記載の方
    法。
  4. 【請求項４】 IL6が、免疫クロマトグラフィーにて検知されることを特徴
    とする請求項3に記載の方法。
  5. 【請求項５】 BE-4（C.N.C.M I-911）、BF-6（C.N.C.M I-912）およびBE-8
    （C.N.C.M I-913）から選択される、少なくとも2つの抗-IL6モノクローナル抗体
    を使うことを特徴とする請求項4に記載の方法。
  6. 【請求項６】 捕獲抗体が、BE-8抗体であることを特徴とする請求項5に記
    載の方法。
  7. 【請求項７】 暴露抗体が、BE-4抗体であることを特徴とする請求項5に記
    載の方法。
  8. 【請求項８】 切迫早期産を予知することを目的とした、頸膣分泌物中のIL
    6を検知するための免疫クロマトグラフィーによる検知装置の使用。
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