JP2003527866A5 - - Google Patents

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【特許請求の範囲】
【請求項１】 下記のステップを有する方法であって、
ａ）ポリヌクレオチド・キナーゼ、ヌクレオチド-トリホスフェートおよび5'-OH基を持ち且つ配列S2を含むオリゴヌクレオチドを反応させ、5'-OH基においてオリゴヌクレオチドS2をリン酸化し；
ｂ）下記を含む反応混合物を供給し、
ｉ）オリゴヌクレオチド5'-ホスフェートS2、
ｉｉ）連続的な配列領域C1-Cnを含む単一ストランドの核酸鋳型、ここでnは２より大きな整数であり、
ｉｉｉ）前記鋳型の領域C1へハイブリッド化される配列S1を有する第１のオリゴヌクレオチド、
ｉｖ）配列S3-Snを有する複数のオリゴヌクレオチド5'-ホスフェート、ここで、オリゴヌクレオチド5'-ホスフェートの各々は、前記鋳型C3-Cnの一つの領域に対して相補的であり、そして
ｖ）リガーゼおよびリガーゼの補助因子；
ｃ）前記リパーゼを用いてオリゴヌクレオチドS1およびオリゴヌクレオチド5'-ホスフェートS2をリゲートし、次いで複数のオリゴヌクレオチド5'-ホスフェートS3-Snの少なくとも一つを連続的にオリゴヌクレオチドS2にリゲートして前記オリゴヌクレオチドS2-Snの安定なハイブリッド形成をさせないような条件下で一つの連続的なプロセスにおいて連結生成物を形成し、ここで、オリゴヌクレオチド5'-モノホスフェートS2-Snの連結がオリゴヌクレオチドS2がポリヌクレオチド・キナーゼによりリン酸化される場合のみに起きることが含まれる方法。
【請求項２】 請求項１の方法において、オリゴヌクレオチド5'-ホスフェートS2-Snの各々が同じ数の塩基からなり、そして塩基の数が２〜20である前記方法。
【請求項３】 請求項２の方法において、オリゴヌクレオチド5'-ホスフェートS2-Snの各々が同じ数の塩基からなり、そして塩基の数が４〜12個である前記方法。
【請求項４】 請求項１の方法において、用いたATPがγ³²P-ATPである前記方法。
【請求項５】 請求項１の方法において、前記オリゴヌクレオチド5'-ホスフェートの少なくとも一部に検出可能な標識が含まれている前記方法。
【請求項６】 請求項５の方法において、前記検出可能な標識を放射性同位元素、化学発光性標識、蛍光標識、比色分析標識、酵素、結合性タンパク質、抗原、抗体およびハプテンから選択する前記方法。
【請求項７】 請求項１の方法において、リゲートされた前記生成物は標識がつけられておらず、したがって、その生成物の長さまたは塩基数を決定する手段により検出される前記方法。
【請求項８】 請求項７の方法において、前記標識が酵素であり、さらに、リゲートした生成物に存在する酵素標識を酵素の基質と反応させ、且つ酵素と基質の間の反応生成物を検出するステップが含まれる前記方法。
【請求項９】 請求項８の方法において、前記標識酵素を、アルカリ性ホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、β-グルクロニダーゼ、グルコース・オキシダーゼおよびセイヨウワサビ・バーオキシダーゼから選択する前記方法。
【請求項１０】 請求項８の方法において、前記基質を着色した生成物、蛍光生成物、化学発光物質または生物発光物質をつくる基質から選択する前記方法。
【請求項１１】 請求項１の方法において、S4-Snから選択した前記オリゴヌクレオチドの一つが連結反応に関与できない3'-末端基を有する非拡張性のオリゴヌクレオチドである前記方法。
【請求項１２】 請求項11の方法において、前記非拡張性のオリゴマーを3'-端部にジデオキシ塩基を有するオリゴマーおよび3'-端部にブロックされた3'-OH基を有するオリゴマーから選択する前記方法。
【請求項１３】 請求項１の方法において、オリゴヌクレオチドS1に、オリゴヌクレオチドS2-Snの各々より多い、少なくとも約５個の塩基が含まれている前記方法。
【請求項１４】 請求項１の方法において、前記鋳型が固体支持体上に固定されている前記方法。
【請求項１５】 請求項14の方法において、前記固体支持体に磁性粒子が含まれている前記方法。
【請求項１６】 請求項15の方法において、リゲートされたオリゴヌクレオチドのハイブリッド化生成物と前記鋳型を含む前記固体支持体が、ハイブリッド化されていないオリゴヌクレオチドから分離される前記方法。
【請求項１７】 請求項１の方法において、前記ポリヌクレオチド・キナーゼがT4ポリヌクレオチド・キナーゼである前記方法。
【請求項１８】 請求項１の方法において、前記リガーゼ酵素をT4リガーゼ、T7リガーゼ、Tthリガーゼ、Tagリガーゼおよび大腸菌DNAリガーゼから選択する前記方法。
【請求項１９】 請求項18の方法において、前記リガーゼ酵素がT4 DNAリガーゼである前記方法。
【請求項２０】 ポリヌクレオチド・キナーゼの活性を検出または測定するために用いられる請求項１の方法。
【請求項２１】 請求項１の方法において、単一ストランドの前記核酸鋳型を、二重ストランドの核酸を分離してつくる前記方法。
【請求項２２】 下記のステップを含む方法であって、
ａ）ポリヌクレオチド・キナーゼ、ヌクレオチド-トリホスフェート、配列S2-Snを有する複数の5'-OH基を有するオリゴヌクレオチド、連続的な配列領域C1-Cnを含む単一ストランドの核酸鋳型、ここでnは２より大きな整数であり、そして各ｍは２−ｎの整数であり、SmはCmの補体である、前記鋳型の領域C1へハイブリッド化される配列S1を有する第１オリゴヌクレオチド、リガーゼおよびリガーゼの補助因子を含む反応混合物を供給し；そして
ｂ）一つのプロセスにおいてオリゴヌクレオチドS2-Snをリン酸化し、オリゴヌクレオチド5'-ホスフェートS2-Snを形成し、前記リガーゼを用いてオリゴヌクレオチドS1およびオリゴヌクレオチド5'-ホスフェートS2をリゲートし、複数のオリゴヌクレオチド5'-ホスフェートS3-Snの少なくとも一つを連続的にオリゴヌクレオチドS2にリゲートして前記オリゴヌクレオチドS2-Snの安定なハイブリッド形成をさせないような条件下で一つの連続的なプロセスにおいて連結生成物を形成し、ここで、オリゴヌクレオチド5'-モノホスフェートS2-Snの連結がオリゴヌクレオチドS2がポリヌクレオチド・キナーゼによりリン酸化される場合のみに起きることが含まれる前記方法。
【請求項２３】 被検体を検出する方法であって、
ａ）前記被検体を検出する特異的結合ペア反応を行い、ここで、ポリヌクレオチド・キナーゼは特異的結合ペアメンバーにおいて標識として存在し；
ｂ）ポリヌクレオチド・キナーゼと、ヌクレオチドートリホスフェートと、5'-OH基および配列S2を含むオリゴヌクレオチドとを反応させ、5'-OH基においてオリゴヌクレオチドS2をリン酸化し；
ｃ）下記を含む反応混合物を供給し、
ｉ）オリゴヌクレオチドS2、
ｉｉ）連続的な配列領域C1とC2を含む単一ストランドの核酸鋳型、
ｉｉｉ）前記鋳型の領域C1へハイブリッド化される配列S1を有する第１オリゴヌクレオチド、および
ｉｖ）リガーゼおよびリガーゼの補助因子；
ｄ）リガーゼを用いてオリゴヌクレオチドS1とオリゴヌクレオチド5'-ホスフェートS2をリゲートして連結生成物を形成し、ここで、連結は、オリゴヌクレオチドS2がポリヌクレオチド・キナーゼによりリン酸化される場合にのみ起こり；
ｅ）ポリヌクレオチド・キナーゼの存在または活性を示すものとして、ステップｄのリゲートされたオリゴヌクレオチド生成物を検出し；そして
ｆ）ポリヌクレオチド・キナーゼの活性を被検体の量に関係づける工程が含まれる前記方法。
【請求項２４】 請求項23の方法において、ここでステップｃ）に、さらに、前記鋳型の領域に対して相補的な配列を有する追加のオリゴヌクレオチド5'-ホスフェートを少なくとも一つ加えることが含まれ、ここで、追加のオリゴヌクレオチド5'-ホスフェートを前記鋳型C3-Cnの連続的な領域に対して相補的であるように選択し、且つ追加のオリゴヌクレオチド5'-ホスフェートの少なくとも一つがリゲートされる前記方法。
【請求項２５】 請求項23の方法において、ここでステップｃ）に、さらに、配列S3-Snを有する複数のオリゴヌクレオチド5'-ホスフェートを加えることが含まれ、ここで、各オリゴヌクレオチド5'-ホスフェートは前記C3-Cn鋳型の一つの領域に対して相補的であり、そしてすべてのオリゴヌクレオチド5'-ホスフェートはリゲートされる前記方法。
【請求項２６】 請求項23の方法において、オリゴヌクレオチド5'-ホスフェートの各々が同数の塩基からなり、そして塩基の数が２〜20個である前記方法。
【請求項２７】 請求項26の方法において、オリゴヌクレオチド5'-ホスフェートの各々が同じ数の塩基からなり、そして塩基の数が４〜12個である前記方法。
【請求項２８】 請求項23の方法において、用いたATPがγ-³²P-ATPである前記方法。
【請求項２９】 請求項23の方法において、前記オリゴヌクレオチド5'-ホスフェートの少なくとも一部に検出可能な標識が含まれている前記方法。
【請求項３０】 請求項29の方法において、前記検出可能な標識を放射性同位元素、化学発光性標識、蛍光標識、比色分析標識、酵素、結合性タンパク質、抗原、抗体およびハプテンから選択する前記方法。
【請求項３１】 請求項23の方法において、前記リゲートされた生成物は標識が付けられておらず、したがって、その生成物の長さまたは塩基数を決定する手段により検出される前記方法。
【請求項３２】 請求項30の方法において、前記標識が酵素であり、さらに、リゲートした生成物に存在する酵素標識を酵素の基質と反応させ、且つ酵素と基質の間の反応生成物を検出するステップが含まれる前記方法。
【請求項３３】 請求項32の方法において、前記標識酵素を、アルカリ性ホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、β-グルクロニダーゼ、グルコース・オキシダーゼおよびセイヨウワサビ・バーオキシダーゼから選択する前記方法。
【請求項３４】 請求項32の方法において、前記基質を着色した生成物、蛍光生成物、化学発光物質または生物発光物質をつくる基質から選択する前記方法。
【請求項３５】 請求項23の方法において、S4-Snから選択した前記オリゴヌクレオチドの一つが連結反応に関与できない3'-末端基を有する非拡張性のオリゴヌクレオチドである前記方法。
【請求項３６】 請求項35の方法において、前記非拡張性オリゴマーを3'-端部にジデオキシ塩基を有するオリゴマーおよび3'-端部にブロックされた3'-OH基を有するオリゴマーから選択する前記方法。
【請求項３７】 請求項23の方法において、オリゴヌクレオチドS1に、オリゴヌクレオチドS2-Snの各々より多い、少なくとも約５個の塩基が含まれている前記方法。
【請求項３８】 請求項23の方法において、前記鋳型が固体支持体上に固定されている前記方法。
【請求項３９】 請求項38の方法において、前記固体支持体に磁性粒子が含まれている前記方法。
【請求項４０】 請求項38の方法において、前記鋳型とリゲートされたオリゴヌクレオチドのハイブリッド化生成物を含む前記固体支持体が、ハイブリッド化されていないオリゴヌクレオチドから分離される前記方法。
【請求項４１】 請求項23の方法において、前記ポリヌクレオチド・キナーゼがT4ポリヌクレオチド・キナーゼである前記方法。
【請求項４２】 請求項23の方法において、前記リガーゼ酵素をT4リガーゼ、T7リガーゼ、Tthリガーゼ、Tagリガーゼおよび大腸菌DNAリガーゼから選択する前記方法。
【請求項４３】 請求項42の方法において、前記リガーゼ酵素がT4 DNAリガーゼである前記方法。
【請求項４４】 ポリヌクレオチド・キナーゼの活性を検出または測定するのに用いる請求項23の方法。
【請求項４５】 請求項23の方法において、単一ストランドの前記核酸鋳型を、二重ストランドの核酸を分離してつくる前記方法。
【請求項４６】 請求項１の方法において、前記連結がオリゴヌクレオチドS1の3'-端部から進行する前記方法。
【請求項４７】 請求項１の方法において、オリゴヌクレオチドS1に5'-ホスフェート基が含まれ、且つ前記連結がオリゴヌクレオチドS1の5'-端部から進行する前記方法。
【請求項４８】 請求項22の方法において、前記連結がオリゴヌクレオチドS1の3'-端部から進行する前記方法。
【請求項４９】 請求項22の方法において、オリゴヌクレオチドS1に5'-ホスフェート基が含まれ、且つ前記連結がオリゴヌクレオチドS1の5'-端部から進行する前記方法。
【請求項５０】 請求項23の方法において、前記連結がオリゴヌクレオチドS1の3'-端部から進行する前記方法。
【請求項５１】 請求項23の方法において、オリゴヌクレオチドS1に5'-ホスフェート基が含まれ、且つ前記連結がオリゴヌクレオチドS1の5'-端部から進行する前記方法。
【請求項５２】 請求項１の方法において、ステップａ）−ｃ）が一つのプロセスにおいて単一反応混合物において行われる前記方法。