JP2003526358A - 修飾された第ｖｉｉｉ因子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ブタ第VIII因子の修飾されたB−ドメインレス形、それをコードするDNA、及び血友病の処理のためへのその使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 発明の背景： 血液凝集は、血小板が外傷部位での損傷された血管の切断壁に付着する場合に
始まる。結果的に、酵素的に調製された反応の連続段階においては、可溶性フィ
ブリノーゲン分子が酵素トロンビンにより、血栓において一緒に血小板を保持す
るフィブリンの不溶性鎖に転換される。前記連続的段階における個々の段階で、
タンパク質前駆体は、そのシリーズにおける次のタンパク質前駆体を分解するプ
ロテアーゼに転換される。補因子がそれらの段階のほとんどで必要とされる。

【０００２】 第VIII因子は、von Willebrand因子に強く且つ非共有的に結合される不活性前
駆体として血液において循環する。第VIII因子は、その因子をvon Willebrand因
子から解離し、そしてその前凝集機能を連続段階において活性化する。トロンビ
ン又は因子によりタンパク質加水分解的に活性化される。その活性形においては
、タンパク質第VIII因子は、第X因子への第IXa因子の触媒効率を数倍、高める補
因子である。

【０００３】 第VIII因子により処理されていない、第VIII因子又は第VIII因子に対する抗体
を欠いている人々は、関節の炎症反応から早期死亡までの広範囲の重大な症状を
引き起こす制御できない内部出血を伴う。アメリカ合衆国において約10,000人い
る重度の血友病患者は、十分な頻度及び濃度で投与される場合、血液の正常な凝
集能力を回復するであろうヒト第VIII因子の注入により処理され得る。実際、第
VIII因子の従来の定義は、血友病Aを有する個人に由来する血漿における凝集欠
陥を是正する、正常な血液血漿に存在する物質である。

【０００４】 第VIII因子の活性を阻害する抗体（“インヒビター”又は“阻害抗体”）の開
発は、血友病患者の管理における重大な複雑化の要因である。自己抗体は、第VI
II因子の治療的注入に応答して血友病Aの患者の約20％に発生する。インヒビタ
ーを発生する血友病Aのこれまで未処理の患者においては、インヒビターは通常
、処理の１年以内に発生する。さらに、第VIII因子を不活性化する自己抗体は時
折、これまで正常な第VIII因子レベルを有する個人においても発生する。インヒ
ビター力価が十分に低い場合、患者は第VIII因子の用量を高めることによって管
理され得る。しかしながら、しばしば、インヒビター力価は、第VIII因子により
制御され得ないほど高い。

【０００５】 他の手段は、第VIII因子複合体調製物（たとえば、KONYNE（商標）, Proplex
（商標））又は組換えヒト第VIIIa因子を用いて、正常な止血の間、第VIII因子
のための必要性を回避することである。さらに、ブタ第VIII因子は通常、ヒト第
VIII因子よりもインヒビターとの実質的に低い反応性を有するので、部分的に精
製されたブタ第VIII因子調製物（HYATE:C（商標））が使用される。ヒト第VIII
因子に対する阻害抗体を発生している多くの患者は、ブタ第VIII因子により都合
良く処理され、そしてそのような処理を長期間、耐えている。しかしながら、ブ
タ第VIII因子の投与は、いくらかの患者において、インヒビターが１又は複数回
の注入の後、ブタ第VIII因子に対して発生することができるので、完全な解決法
ではない。

【０００６】 種々の程度の純度のヒト血漿由来の第VIII因子のいくつかの調製物が、血友病
Aの処理のために市販されている。それらは、ウィルスのために熱−及び界面活
性剤−処理されるが、しかし有意なレベルの抗原性タンパク質を含む多くのドナ
ーのプールされた血液に由来する部分的に精製された第VIII因子；低レベルの抗
原性不純物及びウィルス汚染を有するモノクローナル抗体−精製された第VIII因
子；及び組換えヒト第VIII因子（この臨床実験は進行中である）を包含する。不
運なことには、ヒト第VIII因子は、生理学的濃度及びpHで不安定であり、非常に
低い濃度（0.2μg/mlの血漿）で血液に存在し、そして低い特異的な凝集活性を
有する。ウィルス又は血液−担持の汚染物の危険性に関する公衆衛生関心は、ブ
タ血液から精製されたブタ第VIII因子の有用性を制限して来た。

【０００７】 血友病患者は、出血及び得られる変形性血友病関節症を防ぐために第VIII因子
の毎日の交換を必要とする。しかしながら、供給は不適切であり、そして治療使
用における問題が、単離および精製の困難性、免疫原生、及びAIDS及び肝炎感染
の危険性の除去の必要性のために存在する。組換えヒト第VIII因子又は部分的に
精製されたブタ第VIII因子の使用は、それらのすべての問題を解決しないであろ
う。

【０００８】 通常使用される市販の血漿由来の第VIII因子に関連する問題は、良好な第VIII
因子生成物の開発に有意な興味を刺激して来た。より凝集活性の単位が分子あた
り供給され得るようなより効果的な第VIII因子；選択されたpH及び生理学的濃度
で安定する第VIII因子；阻害抗体の生成をほとんど引き起こさない第VIII因子；
及びヒト第VIII因子に対する抗体をすでに獲得している患者において免疫検出を
回避する第VIII因子に関する必要がある。

【０００９】 従って、第VIII因子を欠いているか又は第VIII因子に対するインヒビターを有
する患者において血友病を是正する第VIII因子を提供することが本発明の目的で
ある。 血友病の処理方法を提供することもまた、本発明の目的である。 選択されたpH及び生理学的濃度で安定する第VIII因子を提供することが本発明
のもう１つの目的である。 ヒト第VIII因子よりも強い凝集活性を有する第VIII因子を提供することが本発
明の目的である。 抗体がほとんど生成されない第VIII因子を提供することが本発明のさらなる目
的である。 組換えブタ第VIII因子及び特異的に修飾されたブタ第VIII因子の製造方法を提
供することが、本発明のさらなる目的である。

【００１０】 発明の要約： 本明細書に示されるブタ第VIII因子をコードする完全なDNA配列の決定は、最
初に、適切な宿主細胞においてブタ第VIII因子をコードするDNAを発現すること
によって、十分な長さのブタ第VIII因子の合成を可能にして来た。従って、生成
された組換えブタ第VIII因子は、本発明の観点である。ブタ第VIII因子の個々の
ドメイン及びそのいずれかの特定されたフラグメントをコードするDNAは、同様
にして発現され得る。さらに、欠失されたBドメインのすべて又は一部を有する
ブタ第VIII因子（Bドメインを欠くブタ第VIII因子）は、B−ドメインの１又は複
数のコドンの欠失を有するブタ第VIII因子をコードするDNAの発現により製造さ
れ、本発明の一部として利用できる。

【００１１】 また、組換えブタ第VIII因子又は修飾された組換えブタ第VIII因子、特にB−
ドメインブタ第VIII因子を含んで成る医薬組成物及び、及びその第VIII因子を投
与することを含んで成る、第VIII因子欠陥を有する患者を処理するための方法が
提供される。

【００１２】 発明の特定の記載： 特にことわらない限り、本明細書において使用される場合、“第VIII因子”と
は、いずれかの哺乳類からのいずれかの機能的第VIII因子タンパク質分子を示す
。 本明細書において使用される場合、“哺乳類第VIII因子”とは、特にことわら
ない限り、いずれかの非ヒト哺乳類に由来するアミノ酸配列を有する第VIII因子
を包含する。“動物”とは、本明細書において使用される場合、ブタ及び他の非
ヒト哺乳類を言及する。

【００１３】 “融合タンパク質”又は“融合第VIII因子又はそのフラグメント”は、本明細
書において使用される場合、１つのタンパク質についてのコード配列が、たとえ
ばその一部を、連結されたセグメントの中断されていない転写及び翻訳が融合タ
ンパク質をコードするハイブリッド遺伝子を生成するために生じ得るように、正
しい読み取り枠を整合して、他の遺伝子からの第２のタンパク質についてのコー
ド配列に連結することによって変更されるハイブリッド遺伝子の生成物である。

【００１４】 本明細書において使用される場合、“対応する”核酸又はアミノ酸、又はいず
れかの配列は、核酸又はアミノ酸数は同一ではないが、他の種の第VIII因子にお
ける部位と同じ構造及び/又は機能を有する、第VIII因子分子又はそのフラグメ
ントにおける部位で存在するものである。もう１つの第VIII因子配列に“対応す
る”DNA配列は、緊縮条件下で、企画される配列番号のそのような配列に実質的
に対応し、そしてその配列にハイブリダイズする。もう1つの第VIII因子配列に
“対応する”DNA配列はまた、第VIII因子又はそのフラグメントの発現をもたら
す配列を包含し、そして遺伝子コードの冗長性は別にして、企画される配列番号
に対してハイブリダイズする。

【００１５】 “ユニーク”アミノ酸残基又は配列とは、本明細書において使用される場合、
もう１つの種の第VIII因子分子における相同の残基又は配列とは異なる、１つの
種の第VIII因子分子におけるアミノ酸配列又は残基を言及する。 “比活性”とは、本明細書において使用される場合、ヒト第VIII因子を欠く血
漿の凝集欠陥を是正するであろう活性を言及する。比活性は、ヒト第VIII因子を
欠く血漿の凝集時間が正常なヒト血漿の凝集時間と比較される標準のアッセイに
おける合計の第VIII因子タンパク質１mg当たりの凝集活性の単位で測定される。
１単位の第VIII因子活性は、正常なヒト血漿１mlに存在する活性である。アッセ
イにおいては、凝集形成のための時間が短く成るほど、アッセイされる第VIII因
子の活性は高くなる。ブタ第VIII因子は、ヒト第VIII因子アッセイにおいて凝集
活性を有する。

【００１６】 “発現”とは、遺伝子情報が、ある生成物を生成するために使用される、発生
する工程の組みを言及する。ブタVIII因子のアミノ酸配列をコードするDNAは、
ブタ第VIII因子タンパク質を生成するために、哺乳類宿主細胞内で“発現”され
得る。発生する所定のDNA配列の発現を可能にする、材料、遺伝子構造体、宿主
細胞及び条件は、当業界において良く知られており、そして発現の時間及び量、
及び発現されるタンパク質の細胞内又は細胞外位置に影響を及ぼすよう操作され
得る。

【００１７】 例えば、ブタ第VIII因子をコードするDNAの5’末端でシグナルペプチドをコー
ドするDNAを包含することによって（前記5’末端は、慣習的には、タンパク質の
NH₂末端をコードする末端である）、発現されるタンパク質は、宿主細胞の内部
から培養培地中に輸送されるようになる。ブタ第VIII因子をコードするDNAと共
に、シグナルペプチドをコードするDNAを提供することは、好都合である。なぜ
ならば、発現される第VIII因子が、精製の工程を単純化する培養培地中に輸送さ
れるからである。好ましいシグナルペプチドは、哺乳類第VIII因子シグナルペプ
チドである。

【００１８】 ヒト第VIII因子cDNAヌクレオチド及び予測されるアミノ酸配列は、それぞれ配
列番号１及び２に示される。第VIII因子は、“ドメイン”配列NH₂−A1−A2−B−
A3−C1−C2−COOHを定義する内部配列相同性を有する、約300kDaの一本鎖タンパ
ク質として合成される。第VIII因子分子においては、“ドメイン”は、本明細書
において使用される場合、内部アミノ酸配列本体、及びトロンビンによるタンパ
ク質加水分解の部位により定義される、アミノ酸の連続配列である。特にことわ
らない限り、第VIII因子ドメインは、配列がヒトアミノ酸配列（配列番号２）と
一列配列される場合、次のアミノ酸残基を含む：A1, 残基Ala１−Arg372；A2, 残基Ser373−Arg740；B, 残基Ser741−Arg1648；A3, 残基Ser1690−Ile2032；C
1, 残基Arg2033−Asn2172；C2, 残基Ser2173−Tyr2332。A3−C1−C2−配列は、
残基Ser1690−Tyr2332を含む。

【００１９】 残る配列、すなわち残基Glu1649−Arg1689は通常、第VIII因子L鎖活性化ペプ
チドとして言及される。第VIII因子は、それをvon Willebrand 因子から解離し
、前凝集機能を有する第VIIIa因子を形成する、トロンビン又は第Xa因子により
タンパク質分解に活性化される。第VIIIa因子の生物学的機能は、第X因子活性化
への第IXa因子の触媒効率を数倍、高めることである。トロンビンにより活性化
された第VIIIa因子は、血小板又は単球の表面上で第IXa因子及び第X因子と複合
体を形成する160kDaのA1/A2/A3−C1−C2ヘテロトリマーである。“部分ドメイン
”とは、本明細書において使用される場合、ドメインのアミノ酸形成部分の連続
配列である。

【００２０】 ヒト又は動物第VIII因子の“サブユニット”は、本明細書において使用される
場合、タンパク質のH鎖及びL鎖である。第VIII因子のH鎖は、３種のドメイン、
すなわちA1, A2及びBを含む。第VIII因子のL鎖はまた、３種のドメイン、すなわ
ちA3, C1及びC2を含む。 用語“エピトープ”、“抗原性部位”、及び“抗原性決定因子”とは、本明細
書において使用される場合、類似的に使用され、そして抗体により特異的に認識
される、ヒト又は動物第VIII因子又はそのフラグメントの一部として定義される
。それはいずれかの数のアミノ酸残基から成り、そしてそれは、タンパク質の一
次、二次又は三次構成に依存し得る。

【００２１】 用語“免疫原性部位”とは、本明細書において使用される場合、通常のプロト
コール、たとえばイムノアッセイ、たとえばELISA、又はBethesdaアッセイによ
り測定される場合、ヒト又は動物において、第VIII因子、又はフラグメントに対
する抗体の生成を特異的に誘発する、ヒト又は動物第VIII因子、又はそのフラグ
メントの領域として定義される。それはいずれかの数のアミノ酸残基から成り、
そしてそれはタンパク質の一次、二次、三次構造に依存することができる。いく
つかの場合、ハイブリッド又はハイブリッド同等物第VIII因子、又はそのフラグ
メントは、動物又はヒトにおいて、非免疫原生であるか、又はヒト又はブタ第VI
II因子よりも低い免疫原性である。

【００２２】 “第VIII因子欠乏”とは、本明細書において使用される場合、欠陥第VIII因子
の生成により、不適切な第VIII因子又は第VIII因子の非生成により、又はインヒ
ビターによる第VIII因子の部分的又は、完全な阻害により引き起こされる凝集活
性の欠乏を包含する。血友病Aは、X−結合遺伝子の欠陥、及びそれがコードする
第VIII因子タンパク質の不在又は欠乏に起因する第VIII因子欠乏の型である。

【００２３】 本明細書において使用される場合、“診断アッセイ”とは、ある態様において
、医学的治療の選択を助けるために、試験サンプルに存在する特定の抗体の量を
検出し、そして/又は定義化するために抗原−抗体相互作用を用いるアッセイを
包含する。当業者に知られているおおくのそのようなアッセイが存在する。本明
細書において使用される場合、ヒト、ブタ又は修飾されたブタ第VIII因子DNA又
はそのフラグメント、及びそれらから発現されるタンパク質は、完全に又は部分
的に、他の既知のアッセイにおいてその対応する試薬により交換され得、それに
より改良されたアッセイが第VIII因子に対する抗体を検出し、そして/又は定量
化するために使用され得る。

【００２４】 それは、ヒト又は動物第VIII因子に対する抗体の検出についての既知アッセイ
の改良を可能にする、それらの試薬、第VIII因子DNA、又はそのフラグメント又
はそれから発現されるタンパク質の使用である。そのようなアッセイは、ELISA
免疫拡散アッセイ及びイムノブロットを包含するが、但しそれらだけには限定さ
れない。それらのアッセイのいずれかを実施するための適切なアッセイは、当業
者に知られている。本明細書において使用される場合、タンパク質の少なくとも
１つのエピトープを包含する、第VIII因子、又はそのフラグメントは、診断用試
薬として使用され得る。ヒト、ブタ又は修飾されたブタ第VIII因子、又はそのフ
ラグメントが使用され得る他のアッセイの例は、Bethesdaアッセイ及び抗凝集ア
ッセイを包含する。

【００２５】 用語“タンパク質、例えばブタ第VIII因子をコードするDNA”とは、そのヌク
レオチド配列が、遺伝子コードの既知関係に従って、タンパク質、例えばブタ第
VIII因子のアミノ酸配列について宿主細胞に対するコード情報を具体化するポリ
デオキシ核酸を意味する。

【００２６】 ヒト又は動物第VIII因子又は修飾された第VIII因子をコードするDNAの“発現
生成物”とは、参照されるDNAによりコードされるタンパク質の前−又は後−翻
訳修飾、例えばグリコシル化、タンパク質加水分解性切断及び同様のもの（但し
、それらだけには限定されない）のそのような特徴を包含する、適切な宿主細胞
における参照されるDNAの発現から得られる生成物である。そのような修飾が、
生じ得、そして宿主細胞型及び他の因子に依存して、幾分異なることができ、そ
して前凝集活性を有する生成物の分子イソフォームをもたらすことができること
は、当業界において知られている。例えば、Lind, P. など., Eur. J. Biochem. 232: 1927 (1995) (引用により本明細書に組み込まれる) を参照のこと。

【００２７】 “発現ベクター”とは、所望する宿主細胞において自律的に複製する能力、又
は宿主細胞ゲノム中に組み込む能力を有し、そしてまた、適切な部位で及び正し
い配向でベクター配列中に挿入されるコードDNAの発現を可能にする良く知られ
た特徴も有する、しばしば環状構造のDNA要素である。そのような特徴は、コー
ドDNA及び他のDNA要素、例えばエンハンサー、ポリアデニル化部位及び同様のも
の（すべては、当業界において良く知られている）の転写開始を方向づけるため
の１又は複数のプロモーター配列を包含するが、但しそれらだけには限定されな
い。

【００２８】 用語“発現ベクター”は、その配列内に挿入される、発現されるべきDNAコー
ド配列を有するベクター、及び挿入部位中に挿入されるいずれかのコードDNAを
発現するよう作用することができるよう、挿入部位に対して配置される必要な発
現制御要素を有するベクターを示すために使用される。従って、例えばプロモー
ターを欠いているベクターは、コードDNAと共に組合されるプロモーターの挿入
により発現ベクターになることができる。

【００２９】 方法の一般的記載： アメリカ特許第5,364,771号は、凝集活性を有するハイブリッドヒト/ブタ第VI
II因子の発現を記載しており、ここでヒト又はブタの第VIII因子分子の要素が他
の種の第VIII因子の対応する要素により置換されている。アメリカ特許第5,663,
060号は、前凝集ハイブリッドヒト/動物及びハイブリッド同等物第VIII因子分子
を記載し、ここで１つの種の第VIII因子分子の要素が他の種の第VIII因子分子の
対応する要素により置換されている。

【００３０】 現在の情報は、Bドメインが阻害エピトープを有さず、そして第VIII因子機能
に対する既知の効果を有さないことを示しているので、いくつかの態様において
、Bドメインは、本明細書に記載されるいずれかの方法により調製される、活性
ハイブリッド又はハイブリッド同等物第VIII因子分子又はそのフラグメントにお
いて、完全に又は一部欠失されている（“B（−）第VIII因子”）。

【００３１】 ヒト第VIII因子遺伝子は、Toule, J. J. など. (1984) Nature 312: 342-347
(Genetics Institute) ; Gitschier, J. など. (1984) Nature 312: 326-330 (G
enentech); Wood, W. I. など. (1984) Nature 312: 330-337 (Genentech); Veh
ar, G. A. など. (1984) Nature 312: 337-342 (Genentech); WO87/04187号；WO
88/08035号；WO88/03558号；アメリカ特許第4,757,006号により報告されるよう
に、単離され、そして哺乳類細胞において発現され、そしてアミノ酸配列はcDNA
から推定される。アメリカ特許第4,965,199号（Caponなど）は、哺乳類宿主細胞
において第VIII因子を生成するための組換えDNA方法、及びヒト第VIII因子の精
製を開示する。

【００３２】 CHO（チャイニーズハムスター卵巣）細胞及びBHKC（子供のハムスターの腎細
胞）上でのヒト第VIII因子発現が報告されている。ヒト第VIII因子はBドメイン
の一部又はすべてを欠失するよう修飾されており（アメリカ特許第4,868,112号
）、そしてヒト第V因子Bドメインによるヒト第VIII因子Bドメインの置換が試み
られている（アメリカ特許第5,004,803号）。ヒト第VIII因子をコードするcDNA
配列及び予測されるアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号１及び２に示される。
配列番号１においては、コード領域は、ヌクレオチド位置208、すなわち配列番
号２に与えられるような成熟タンパク質のアミノ酸１（Ala）のためのコドンで
あるトリプレットGCCで開始する。

【００３３】 ブタ第VIII因子は、血漿から単離され、そして精製されて来た（Fass, D. N.
など. (1982) Blood 59: 594）。セルロプラスミン及び凝集第V因子に対しての
相同性を有し、そして非常に不適切に位置するN−末端L鎖配列の部分に対応する
ブタ第VIII因子の部分アミノ酸配列が、Churchなど. (1984) Pro. Natl. Acad.
Sci. USA 81: 6934により記載されている。Toole, J. J. など. (1984) Nature
312: 342-347は、ブタ第VIII因子の４種のアミノ酸フラグメントのN−末端の部
分配列決定を記載しているが、しかし第VIII因子分子におけるそれらの位置に関
するフラグメントを特徴づけていない。

【００３４】 ブタ第VIII因子のBドメインのアミノ酸配列、及びA2ドメインの一部のアミノ
酸配列が、Toole, J. J. など. (1986) Proc. Natl. Acad. Sa. USA 83: 5939-5
942により報告されている。ブタ第VIII因子の完全なA2ドメインをコードするcDN
A配列、及び予測されるアミノ酸配列、並びにすべてのドメイン、すべてのサブ
ユニット及び特定のアミノ酸配列の置換を有するハイブリッドヒト/ブタ第VIII
因子が、1994年11月15日に発行された、“Hybrid Human/Porcine factor VIII”
の表題のアメリカ特許第5,364,771号、及びWO93/20093号に開示されている。配
列番号１に示されるような、成熟ヒト第VIII因子における残基373-740に対応す
るブタ第VIII因子のA2ドメインをコードするcDNA, 及び予測されるアミノ酸配列
がそれぞれ、配列番号３及び４に示される。

【００３５】 より最近においては、最初の198のアミノ酸を欠いているA1ドメイン及びブタ
第VIII因子のA2ドメインの一部のヌクレオチド及び対応するアミノ酸配列が、WO
94/11503号に報告されている。完全なA１ドメイン、活性化ペプチド、A3, C1及
びC2ドメイン、及びコードされるアミノ酸配列を包含する、ブタ第VIII因子をコ
ードする完全なヌクレオチド配列が、1999年１月12日に発行されたアメリカ特許
第5,859,204号及び1997年12月31日に公開されたWO97/49725号に開示されるよう
に、Lollarにより最終的に得られた。

【００３６】 ブタ及びヒト第VIII因子は、２種のサブユニットタンパク質として血漿から単
離される。H鎖及びL鎖として知られているサブユニットは、カルシウムイオン又
は他のニ価の金属イオンを必要とする非共有結合により一緒に維持される。第VI
II因子のL鎖はまた、３種のドメイン、すなわちA3, C1,及びC2を含む。Bドメイ
ンは既知の生物学的機能を有さず、そして分子から、タンパク質分解により、又
は第VIII因子のいずれか測定できるパラメーターにおける有意な変更を伴わない
での組換えDNA技法により除去されるか又は部分的に除去され得る。ヒト組換え
第VIII因子は、それは、哺乳類細胞において発現されるまで、グリコシル化され
ないが、血漿由来の第VIII因子に類似する構造及び機能を有する。

【００３７】 ヒト及びブタ活性化された第VIII因子（“第VIIIa因子”）は、A1とA2ドメイ
ンとの間のH鎖の分解により３種のサブユニットを有する。この構造体は、A1/A2
/A3−C1−C2と命名される。ヒト第VIIIa因子は、たぶんヒト第VIIIa因子のA2サ
ブユニットの弱い会合のために、ブタ第VIIIa因子を安定化する条件下で安定で
きない。ヒト及びブタ第VIIIa因子のA2サブユニットの解離は、第VIIIa因子分子
における活性の損失に関連している。Yakhyav, Aなど. (1997) Blood 90: Suppl
. 1, Abstract #126は、低密度リポタンパク質受容体関連のタンパク質によるA2
ドメインの結合を報告しており、このことは、そのような結合により介在される
A2の細胞摂取が第VIII因子活性をダウンレギュレートするよう使用することを示
唆する。

【００３８】 “B−ドメインを有さない第VIII因子”の発現は、B−ドメインの一部を含むこ
とによって増強される。“SQ”[Lind, P. など. (1995) 前記]と称するBドメイ
ンのそれらの部分の包含は、好ましい発現をもたらすことが報告されている。“
SQ”構造体は、ヒトBドメインのすべてを欠いているが、但し、BドメインN末端
の５個のアミノ酸及びBドメインC末端の９個のアミン酸を除く。 精製されたハイブリッド第VIII因子又はそのフラグメントは、標準のアッセイ
、たとえば血漿フリーの第VIII因子アッセイ、1段階凝集アッセイ、及び標準と
して精製された組換えヒト第VIII因子を用いての酵素−結合されたイムノソルベ
ントアッセイにより、免疫反応性及び凝集活性についてアッセイされ得る。

【００３９】 プラスミド及び真核ウィルスベクターを包含するほかのベクターが、当業者の
参照及び判断に依存して、真核細胞において組換え遺伝子構造体を発現するため
に使用され得る（たとえば、Sambrook など., Chapter 16を参照のこと）。他の
ベクター及び発現システム、たとえば細菌、酵母及び昆虫細胞システムが使用さ
れ得るが、しかしグリコシル化の差異、又はその欠乏のために好ましくない。 組換えハイブリッド第VIII因子タンパク質は、培養及び組換え哺乳類タンパク
質発現のために通常使用される種々の細胞において発現され得る。特に、多くの
囓歯動物細胞系は、大きなタンパク質の発現のために特に有用な宿主であること
が見出されている。American Type Collection, Rockville, MDから入手できる
好ましい細胞系は、子供ハムスター腎細胞、及び通常の方法及び培地を用いて培
養されるチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞を包含する。

【００４０】 ブタ第VIII因子におけるより高い凝集活性のための根本原理は、ブタ第VIIIa
因子からのブタA2サブユニットよりもヒト第VIIIa因子からのヒトA2サブユニッ
トのより早い自発的解離であることが明らかである。A2サブユニットの解離は、
活性損失を導く[Lollar, P. など. (1990) J. Biol. Chem. 265: 1688-1692; Lo
llar, P. など. (1992) J. Biol. Chem. 267: 23652-23657; Fag, P. J. など.
(1992) J. Biol. Chem. 267: 13246-13250]。

【００４１】低められた免疫反応性を有する第VIII因子分子 ： 第VIII因子の凝集活性を阻害する抗体（“インヒビター”又は“阻害抗体”）
と免疫反応性であるエピトープは、第VIII因子における既知の構造−機能の関係
に基づいて特徴づけられて来た。たぶん、インヒビターは、第VIII因子のドメイ
ン構造に関連する高分子相互作用、又はvon Willebrand因子、トロンビン、第Xa
因子、又は第X因子とのその会合のいずれかを破壊することによって作用するこ
とができる。

【００４２】 しかしながら、ヒト第VIII因子に対する阻害抗体の90％以上が、Fulcherなど.
(1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 7728-7732; 及びScandellaなど. (19
88) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 6152-6156により記載されるように、第VI
II因子の40kDaのA2ドメイン又は20kDaのC2ドメインに位置するエピトープに結合
することによって作用し、それらのドメインに関連する特定の機能を破壊する。
A2及びC2エピトープの他に、Scandellaなど. (1993) Blood 82: 1767-1775によ
れば、第VIII因子のL鎖のA3又はC1ドメインに第３のエピトープが存在し得る。
この推定上の第３のエピトープの有意性は未知であるが、しかし第VIII因子にお
けるエピトープ反応性のマイナーな機能を説明するよう思われる。

【００４３】 抗−A2抗体は、Lollaなど. (1994) J. Clin. Invest. 93: 2497-2504により示
されるように、第X因子活性化を阻止する。Wareなど. (1992) Blood Coagul. Fi
brinolysis 3: 703-716により記載される欠失突然変異によるこれまでのマッピ
ング研究は、40kDaのA2ドメインののNH2−末端の20kDa領域内にA2エピトープが
位置することを示した。競争イムノラジオメトリックアッセイは、A2インヒビタ
ーが、Scandella など. (1992) Throm. Haemostas 67: 665-671及びアメリカ特
許第5,859,204号に記載されるように、通常のエピトープ又は狭くクラスター化
されたエピトープのいずれかを認識することを示した。

【００４４】 動物又は修飾された動物第VIII因子分子は、臨床学的試験において、それらの
低められた抗原性及び/又は免疫原性について、ヒトにおいて試験され得る。前
記第VIII因子が阻害抗体と免疫反応性であるかどうかを決定することが企画され
た１つのタイプの試験においては、第VIII因子が、好ましくは静脈注入により、
治療用ヒト第VIII因子の凝集活性を阻害する抗体を有する、第VIII因子欠乏の約
25人の患者に投与される。動物又は修飾された動物第VIII因子分子の投与量は、
５〜50単位/kg体重、好ましくは10〜50単位/kg、及び最も好ましくは40単位/kg
の範囲である。

【００４５】 個々の投与の約１時間後、血液サンプルからの第VIII因子の回復性が一段階凝
集アッセイにおいて測定される。再びサンプルが、注入の約５時間後に採取され
、そして回復性が測定された。サンプルからの第VIII因子の合計の回復性及び消
出速度は、抗体力価及び阻害活性を示す。抗体力価が高い場合、第VIII因子の回
復性は通常測定され得ない。この回復性の結果が、血漿由来のヒト第VIII因子、
組換えヒト第VIII因子、血漿由来のブタ第VIII因子、及び他の通常使用される治
療形の第VIII因子又は第VIII因子置換体により処理された患者における回復性結
果と比較される。

【００４６】 臨床学的に有意なエピトープの同定の後、インヒビター血漿の広い調査に対し
てインビトロで試験される場合、血漿由来のブタ第VIII因子に比較して、低いか
又は等しい交差反応性を有する組換え第VIII因子分子が発現されるであろう。エ
ピトープ領域におけるさらなる突然変異誘発は、交差反応性を低めるために行わ
れ得る。低められた交差反応性は、所望ではないが、汚染性ブタタンパク質又は
汚染性感染剤、例えばウィルス又はプリオンのために副作用を生成することがで
きる、存在する血漿由来のブタ第VIII因子濃縮物に対して利点を有することがで
きる生成物を生成する必要がない。組換えブタ又は修飾されたブタ第VIII因子分
子は、外来性ブタタンパク質を含まないであろう。

【００４７】診断アッセイ ： 第VIII因子cDNA、及び/又はそれらから、完全に又は部分的に発現されるタン
パク質が、第VIII因子を欠いているヒト患者の血清及び体液のサンプルを包含す
る、基質におけるヒト又は動物第VIII因子又は修飾された動物第VIII因子に対す
る阻害抗体の検出のための診断試薬としてアッセイにおいて使用され得る。それ
らの抗体アッセイは、アッセイ、たとえばELISAアッセイ、イムノブロット、放
射性イムノアッセイ、免疫拡散アッセイ及び第VIII因子生物学的活性のアッセイ
（例えば、凝集アッセイによる）を包含する。

【００４８】 それらの試薬を調製するための技法及びその使用方法は、当業者に知られてい
る。たとえば、患者血清サンプルにおける阻害抗体の検出のためのイムノアッセ
イは、試験サンプルと、サンプルにおける阻害抗体により形成され得る検出でき
る複合体が実際、抗原性である、十分な量の試験されるべき第VIII因子との反応
を包含する。

【００４９】 核酸及びアミノ酸プローブは、ハイブリッド第VIII因子cDNA又はそのタンパク
質分子又はフラグメントの配列に基づいて調製され得る。いくつかの態様におい
ては、それらは、市販されている色素又は酵素、蛍光、化学ルミネセンス又は放
射性ラベルを用いてラベルされ得る。たとえば、アミノ酸プローブは、ヒト、動
物又はハイブリッドヒト/動物第VIII因子に対するインヒビターの存在が予測さ
れる血清又は他の体液をスクリーンするために使用され得る。インヒビターのレ
ベルは、患者において定量化され得、そして健康な対照に比較され、そしてたと
えば、第VIII因子を欠いている患者が動物又は修飾された動物第VIII因子により
処理され得るかどうかを決定するために使用され得る。cDNAプローブは、たとえ
ばDNAライブラリーのスクリーニングにおける研究目的のために使用され得る。

【００５０】医薬組成物 ： 組換えブタ又は修飾されたブタ第VIII因子を、単独で、又は適切の医薬安定化
化合物、供給ビークル、及び/又はキャリヤービークルと共に含む医薬組成物は
、Remington’s Pharmaceutical Sciences by E. W. Martin に記載されるよう
な既知の方法に従って調製される。 １つの態様においては、静脈内注入のための好ましいキャリヤー又は供給ビー
クルは、生理食塩水又はリン酸緩衝溶液である。 もう１つの好ましい態様においては、適切な安定化化合物、供給ビークル、及
びキャリヤービークルは、他のヒト又は動物タンパク質、たとえばアルブミンを
包含するが、但しそれらだけには限定されない。

【００５１】 リン脂質ビークル又はリポソーム懸濁液はまた、医薬的に許容できるキャリヤ
ー又は供給ビークルとしても好ましい。それらは、当業者に知られている方法に
従って調製され得、そしてたとえば、第VIII因子は負に荷電されたリン脂質膜に
結合するので、表面の負の電荷を一緒に付与するホスファチジルセリン/ホスフ
ァチジルコリン、又はリン脂質又は界面活性剤の他の組成物を含むことができる
。

【００５２】 リポソームは、続いて蒸発され、容器の表面上に乾燥された脂質の薄フィルム
を残す無機溶媒に、適切な脂質（たとえば、ステアロイルホスファチジルエタノ
ールアミン、ステアロイルホスファチジルコリン、アラカドイルホスファチジル
コリン及びコレステロール）を溶解することによって調製され得る。次に、ハイ
ブリッド第VIII因子の水溶液が容器中に導入される。次に、容器が手動的に渦巻
きされ、容器の側面から脂質材料が離され、そして脂質凝集物が分散され、それ
により、リポソーム懸濁液が形成される。

【００５３】 組換えブタ又は修飾されたブタ第VIII因子が他の適切な安定化化合物、供給ビ
ークル、及び/又はキャリヤービークル、たとえばビタミンK依存性凝集因子、組
織因子、及びvon Willebrand因子（vWf）又は第VIII因子結合部位を含むvWfのフ
ラグメント、及び多糖類、たとえばスクロースと共に組み合わされ得る。

【００５４】 組換えブタ又は修飾されたブタ第VIII因子はまた、ヒト第VIII因子が、供給手
段、たとえばレトロウィルスベクターを用いて供給され得るのと同じ手段で遺伝
子療法により供給さえ得る。この方法は、第VIII因子を欠く患者中に直接的に移
植されるか、又は第VIII因子分子に対して透過性であるが、しかし細胞に対して
は不透過性であり、次に移植される移植可能装置に配置されるヒト細胞中への所
望する第VIII因子構造体cDNAの組み込みから成る。好ましい方法は、レトロウィ
ルス−介在性遺伝子トランスファーであろう。

【００５５】 この方法においては、外来性遺伝子（たとえば、第VIII因子cDNA）が、修飾さ
れたレトロウィルスのゲノム中にクローン化される。前記遺伝子が宿主細胞のゲ
ノム中に、それが細胞により発現されるであろうウィルス装置により挿入される
。レトロウィルスベクターは、それがウィルスを生成せず、すなわち宿主のウィ
ルス感染を防ぐであろうよう修飾される。このタイプの治療のための一般的原理
は、当業者に知られており、そして文献において再考されて来た（たとえば、Ko
hn, D. B. など. (1989) Transfusion 29: 812-820）。

【００５６】 ブタ又は修飾されたブタ第VIII因子は、ハイブリッド分子の半減期及び保存寿
命を高めるためにvWfに結合されて貯蔵され得る。さらに、第VIII因子の凍結乾
燥は、vWfの存在下で活性分子の収率を改良することができる。商業的供給者に
より使用されるヒト及び動物第VIII因子の貯蔵のための現在の方法が、組換え第
VIII因子の貯蔵のために使用され得る。それらの方法は、（１）部分的に精製さ
れた状態での第VIII因子の凍結乾燥（さらなる精製を伴わないで注入される第VI
II因子“濃縮物”として）；（２）Zimmerman方法による第VIII因子の免疫親和
性−精製、及び第VIII因子を安定化するアルブミンの存在下での凍結乾燥；（３
）アルブミンの存在下での組換え第VIII因子の凍結乾燥を包含する。

【００５７】 さらに、ブタ又は修飾されたブタ第VIII因子は、0.6MのNaCl, 20mMのMES, 及
び5mMのCaCl₂溶液（pH6.0）において４℃で無期限に安定し、そしてまた、それ
らの緩衝液において凍結貯蔵され、そして活性の最少の損失を伴って、融解され
得る。

【００５８】処理方法 ： 組換えブタ又は修飾されたブタ第VIII因子は、阻害抗体による及びそれによら
ない血友病患者において、及び阻害抗体の発生による、獲得された第VIII因子欠
乏の患者において、第VIII因子欠乏による抑制できない出血（たとえば、関節間
、頭蓋内又は胃腸出血）を処理するために使用される。活性材料は好ましくは、
静脈内投与される。

【００５９】 さらに、組換えブタ又は修飾されたブタ第VIII因子は、前記ハイブリッドを生
成するために遺伝子的に構築された細胞の移植により、又は上記のように、その
ような細胞を含む装置の移植により投与され得る。 好ましい態様においては、組換えブタ又は修飾されたブタ第VIII因子を単独で
、又は安定剤、供給ビークル及び/又はキャリヤーと組合して含む医薬組成物は
、ヒト又は動物第VIII因子の注入のために使用される同じ方法に従って、患者に
静脈内注入される。

【００６０】 そのような処理の必要な患者に投与されるべき組換えブタ又は修飾されたブタ
第VIII因子組成物の処理用量は、第VIII因子不足の重症度に非常に依存するであ
ろう。一般的に、用量レベルは、重症度を維持する頻度、期間及び単位、及び個
々の患者の出血の症状の発現の期間により調節される。従って、第VIII因子は、
医薬的に許容できるキャリヤー、供給ビークル又は安定剤に、標準の凝集アッセ
イにより測定される場合、出血を止めるのに治療的に有効な量のタンパク質を患
者に供給するために十分な量で含まれる。

【００６１】 第VIII因子は、血友病Aを有する個人に由来する血漿における凝集欠陥を是正
する、正常な血漿に存在する物質として分類的には定義される。第VIII因子の精
製された及び部分精製された形のインビトロ凝集活性が、ヒト患者への注入のた
めの第VIII因子の用量を計算するために使用され、そして患者の血漿から回収さ
れた活性の信頼できるインジケーター及びインビボ出血欠陥の是正のインジケー
ターである。Lusher, J. M. など. 328 New Engl. J. Med. 328: 453-459; Pitt
man, D. D. など. (1992) Blood 79: 389-397; 及びBrinkhous など. (1985) Pr
oc. Natl. Acad. Sci. 82: 8752-8755によれば、新規第VIII因子分子のインビト
ロ標準アッセイと、イヌ注入モデル又はヒト患者におけるそれらの挙動性との間
に矛盾は報告されていない。

【００６２】 通常、組換えブタ又は修飾されたブタ第VIII因子の投与を通して患者において
達成される所望する血漿第VIII因子レベルは、正常値の30〜100％の範囲である
。治療用第VIII因子の投与の好ましい態様においては、組成物は、約５〜50単位
/kg体重、より好ましくは10〜50単位/kg体重、及び最も好ましくは20〜40単位/k
g体重の範囲の好ましい投与量で静脈内投与され；その頻度は約８〜24時間の範
囲であり（強く影響される血友病の場合）；そして処理の持続期間（日）は、１
〜10日の範囲であり、又は出血エピソードが解決されるまでである。

【００６３】 たとえば、Roberts, H. R., and M. R. Jones, “Hemophilia and Rolated Co
nditions-Congenital Deficiencies of Prothrombin (Factor II, Factor V 及
びFactors VII to XII)”, Ch. 153, 1453-1474, 1460, Hematolog, Williams,
W. J., など., ed. (1990) を参照のこと。インヒビターを有する患者は、異な
った量の組換えブタ又は修飾されたブタ第VIII因子を、それらの前の形の第VIII
因子よりも必要とすることができる。例えば、患者は、ヒト第VIII因子よりも高
い比活性及び低められた抗体反応性のために、少ない組換えブタ又は修飾された
ブタ第VIII因子を必要とする。

【００６４】 ヒト又は血漿由来のブタ第VIII因子による処理に関しては、注入される治療用
第VIII因子の量は、一段階第VIII因子凝集アッセイにより定義され、そして選択
された場合においては、インビボ回復性が、注入の後、患者の血漿における第VI
II因子を測定することによって決定される。いずれか特定の患者に関しては、特
定の投与量レジメが個人の必要性及び投与する個人又は組成物の投与を管理する
個人の専門的判断に従って、時間にわたって調節され、そして本明細書に示され
る濃度範囲は単なる例示であり、そして本発明の範囲を限定するものではないこ
とが理解されるべきである。

【００６５】 処理は、必要により、組成物の一回の静脈内投与、又は延長された時間にわた
っての定期的な又は連続した投与の形を取ることができる。他方では、治療用第
VIII因子は、種々の期間、一又は数回の用量でリポソームと共に皮下又は経口投
与され得る。

【００６６】 組換えブタ又は修飾されたブタ第VIII因子はまた、ヒト第VIII因子に対する抗
体を発生せしめている血友病患者における第VIII因子不足による制御できない出
血を処理するために使用され得る。この場合、ヒト又は動物第VIII因子のみの凝
集活性によりも卓越する凝集活性は必要とされない。ヒト第VIII因子の凝集活性
よりも劣っている凝集活性（すなわち、3,000単位/mg以下）が、その活性が患者
の血漿における抗体により中和されない場合、有用であろう。

【００６７】 組換えブタ及び修飾されたブタ第III因子がヒト第VIII因子とは、比活性にお
いて異なることは、本明細書において示されている。ヒト第VIII因子からの高い
前凝集活性を有する第VIII因子タンパク質は、より低い用量が患者の第VIII因子
欠失を是正するために必要とされるので、血友病の処理において有用である。ヒ
ト第VIII因子よりも低い前凝集活性を有する第VIII因子はまた、それらが正常な
ヒト第VIII因子に比較して、少なくとも１％の比活性を有する場合、治療用途の
ために適切である。従って、前凝集活性を有する本発明の第VIII因子は、ヒト第
VIII因子の比活性の少なくとも１％を有するものとして定義される。 組換えブタ又は修飾されたブタ第VIII因子分子及びそれの単離、特徴化、製造
及び使用方法が、さらに次の非制限的な例に理解されるであろう。

【００６８】実施例 例１ ．ブタ第VIII因子及びハイブリッドヒト/ブタ第VIII因子のアッセイ ブタ第VIII因子は、分子の比活性に基づけば、ヒト第VIII因子よりも高い凝集
活性を有する。この結論は、ヒト/ブタ第VIII因子の明確な比較を可能にする適
切な標準曲線の使用に基づかれている。凝集アッセイは、血友病Aを有する患者
に由来する血漿の凝集時間を短くする第VIII因子の能力に基づかれている。次の
２種のタイプのアッセイを使用した：一段階及び二段階アッセイ。

【００６９】 一段階アッセイにおいては、0.1mlの血友病A血漿（George king Biomedical,
Inc.）を、0.1mlの活性化された部分トロンボプラスチン試薬（APTT）（Organon
Teknika）、及び0.01mlのサンプル又は標準（希釈され、クエン酸化された正常
なヒト血漿から成る）と共に、水浴において、37℃で５分間インキュベートした
。インキュベーションに続いて、0.1mMのCaCl₂を添加し、そしてフィブリンクロ
ットの進行のための時間を眼での観察により決定した。

【００７０】 第VIII因子の単位は、１mlのクエン酸化された正常なヒト血漿に存在する量と
して定義される。標準としてのヒト血漿と、ブタ及びヒト第VIII因子活性とを直
接的に比較した。血漿標準又は精製されたタンパク質の希釈を、0.15MのNaCl、0
.02MのHEPES溶液（pH7.4）により行った。標準曲線を、血漿の３又は４個の希釈
度に基づいて（再高の希釈度は1/50である）、及び直線のプロットをもたらす、
log₁₀血漿濃度に対してプロットされたlog₁₀凝集時間に基づいて構成した。未知
のサンプルにおける第VIII因子の単位を、その標準曲線から、内挿法により決定
した。

【００７１】 一段階アッセイは、血友病A血漿に形成される活性化因子による第VIII因子の
内因性活性化に依存し、そして二段階アッセイは、予備活性化された第VIII因子
の前凝集活性を測定する。二段階アッセイにおいては、トロンビンと反応された
第VIII因子を含むサンプルを、活性化された部分トロンボプラスチン及び37℃で
５分間プレインキュベートされたヒト血友病A血漿の混合物に添加した。次に、
得られる凝集時間を、上記の同じ標準曲線に基づいて、単位/mlに転換した。二
段階アッセイにおける相対的活性は、第VIII因子が予備活性化されているので、
一段階アッセイにおけるよりも高い。

【００７２】例２ ．ヒト及びブタ第VIII因子間の機能的差異の特徴化 ブタ及びヒト血漿由来の第VIII因子及びヒト組換え第VIII因子の単離は、Fulc
her, C. A. など. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 1648-1652; Toule
など. (1984) Nature 312: 342-347 (Genetics Institute); Gitschier など. (
1984) Nature 312: 326-330 (Genentech); Wood など. (1984) Nature 312: 330
-337 (Genentech); Vehar など. Nature 312: 337-342 (Genentech); Fass など
. (1982) Blood 59: 594; Toole など. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83
: 5939-5942 における文献に記載されている。これは、いくつかの手段で達成さ
れ得る。すべてのそれらの調製物はサブユニット組成においては類似するが、但
しヒト及びブタ第VIII因子間での安定性の機能的差異が存在する。

【００７３】 ヒト組換え及びブタ第VIII因子の比較のために、高度に精製されたヒト組換え
第VIII因子（Cutter Laboratories, Berkeley, CA）及びブタ第VIII因子（Fass
など. (1982) Blood 59: 594に記載のようにして免疫精製された）の調製物を、
NonoQ^TM (Pharmacia-LKB, Piscataway, NJ) アニオン交換カラム（Pharmacia, I
nc.）上での高圧液体クロマトグラフィー（HPLC）にゆだねた。MonoQ^TM HPLC段
階の目的は、比較目的のために通常の緩衝液中へのヒト及びブタ第VIII因子の交
換のマイナーな不純物の排除であった。1000〜2000単位の第VIII因子を含むバイ
アルを水５mlにより再構成した。次に、Hepes (pH7.4で2M) を添加し、0.02Mの
最終濃度にした。第VIII因子を、pH7.4での0.15MのNaCl、0.02MのHepes, 5mMのC
aCl₂溶液（緩衝液A＋0.15MのNaCl）により平衡化されたMonoQ^TM HR5/5カラムに
適用し；10mlの緩衝液A＋0.15MのNaClにより洗浄し；そして緩衝液中、0.15M〜0
.90MのNaClの線状グラジエント20mlにより、1ml/分の流速で溶出した。

【００７４】 ヒト血漿由来の第VIII因子（MonoQ^TM HPLC により精製された）及びブタ第VII
I因子の比較のために、免疫親和性−精製された血漿由来のブタ第VIII因子を0.0
4MのHepes, 5mMのCaCl₂、0.01％のTween−80溶液（pH7.4）により1:4に希釈し、
そしてヒト第VIII因子についての前記文節に記載されるのと同じ条件下で、Mono
Q^TM HPLC にゆだねた。ヒト及びブタ第VIII因子の単離のためのそれらの方法は
当業者のためには標準である。

【００７５】 カラム画分を、一段階凝集アッセイにより第VIII因子活性についてアッセイし
た。単位活性/材料のA₂₈₀で表されるアッセイの平均結果が、表IIに表され、そ
してブタ第VIII因子は、一段階アッセイが使用される場合、ヒト第VIII因子より
も少なくとも６倍高い活性を有することを示す。

【００７６】

【表１】

【００７７】例３ ．ヒト及びブタ第VIII因子の安定性の比較 第VIII因子についての一段階アッセイの結果は、サンプルにおける第VIII因子
の第VIIIa因子への活性化、及び形成される第VIIIa活性の可能な損失に影響を及
ぼす。ヒト及びブタ第VIII因子の直接的な比較が行われた。MonoQ^TM HPLC (Phar
macia, Inc., Piscataway, N. J.) からのサンプルを、同じ濃度及び緩衝液組成
に希釈し、そしてトロンビンと反応せしめた。種々の時間で、サンプルを二段階
凝集アッセイのために採取した。典型的にはピーク活性（２分での）は、ヒト第
VIIIa因子よりもブタ第VIIIa因子において10倍高く、そしてブタ及びヒト第VIII
a因子の活性は、結果的に、低下し、そしてヒト第VIIIa因子活性はより急速に低
下した。

【００７８】 一般的に、安定したヒト第VIIIa因子を単離するための試みは、安定したブタ
第VIIIa因子を生成する条件が使用される場合でさえ好結果を生まない。これを
示すために、MonoQ^TM HPLC−精製されたヒト第VIII因子をトロンビンにより活性
化し、そしてLollarなど. (1989) Biochemistry 28: 666により記載されるよう
に、安定したブタ第VIIIa因子を生成する条件下で、MonoS^TM カチオン−交換（P
harmacia, Inc.）HPLCにゆだねた。

【００７９】 0.2MのNaCl、0.01MのHepes, 2.5mMのCaCl₂の溶液（pH7.4）中、43μg/ml（0.2
μM）のヒト第VIII因子（10mlの合計体積）を、トロンビン（0.036μM）と10分
間、反応せしめ、この時点で、FPR−CH₂Cl D−フェニル−プロリル−アルギニル
−クロロメチルケトンを添加し、トロビンの不可逆的不活性化のために0.2μMの
濃度にした。次に、この混合物を、40mMの２−（N−モルホリノ）エタンスルホ
ン酸（MES）、５mMのCaCl₂溶液（pH6.0）により1：1に希釈し、そして５mMのMES
、５mMのCaCl₂溶液（pH6.0）(緩衝液B)＋0.1MのNaClにより平衡化されたMonoS^TM Hr5/5 HPLC カラム（Pharmacia, Inc.）上に2ml/分で負荷した。第VIIIa因子を
、緩衝液B中、0.1M〜0.9MのNaClグラジエント20mlにより1ml/分で、カラム洗浄
を伴わないで溶出した。

【００８０】 二段階アッセイにおいて凝集活性を有する画分は、それらの条件下で単一ピー
クとして溶離した。そのピーク画分の比活性は、約7,500U/A₂₈₀であった。MonoS ^TM 第VIIIa因子ピークのドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動（SDS−PAGE）、続くタンパク質の染色は、第VIII因子のヘテロダイマー（A
3−C1−C2/A1）誘導体に対応する２つのバンドを示した。A2フラグメントは、そ
の低い濃度のために、それらの条件下で銀染色により同定されないが、それは^{12 5} I−ラべリングにより微量構成成分として同定された。

【００８１】 ヒト第VIII因子の結果と比較すれば、同じ条件下でMonoS^TM HPLCにより単離さ
れたブタ第VIIIa因子は、1.6×10⁶U/A₂₈₀の比活性を有した。SDS−PAGEによるブ
タ第VIIIa因子の分析は、A1, A2及びA3−C1−C2サブユニットに対応する３種の
フラグメントを示し、これはブタ第VIIIa因子が３種のサブユニットを有するこ
とを示す。

【００８２】 ヒトトロンビン−活性化された第VIII因子調製物（pH6.0）のMonoS^TM HPLCの
結果は、ヒト第VIIIa因子が安定したブタ第VIIIa因子を生成する条件下で不安定
性であることを示す。しかしながら、微量のA2フラグメントがピーク画分に同定
されたけれども、凝集活性が少量のヘテロトリマー第VIIIa因子に起因するか又
は低い比活性を有するヘテロダイマー第VIIIa因子に起因するかどうかの決定は
、この方法のみからは不可能であった。

【００８３】 ヒト第VIII因子を、それがそのA2サブユニットを失う前に単離するための手段
は、この問題を解決するために所望される。そのために、単離は、MonoS^TM 緩衝
液のpHを、５に低めることを包含する方法において達成された。MonoQ^TM−精製
されたヒト第VIII因子（0.5mg）を、水により希釈し、0.25MのNaCl、0.01MのHep
es, 2.5mMのCaCl₂, 0.005%のTween−80溶液（pH7.4；合計体積7.0ml）中、0.2mg
/ml (1μm)の最終濃度の第VIII因子を付与した。トロンビンを添加し、0.072μM
の最終濃度にし、そして３分間、反応せしめた。

【００８４】 次に、トロンビンを、FPR−CH₂Cl (0.2μM) により不活性化した。次に、その
混合物を、40mMの酢酸ナトリウム、５mMのCaCl₂、0.01％Tween−80の溶液（pH5.
0）により1：1に希釈し、そして0.01Mの酢酸ナトリウム、５mMのCaCl₂、0.01％
のTween−80の溶液（pH5.0）＋0.1MのNaClにより平衡化されたMonoS^TM HR5/5HPL
Cカラム上に2ml/分で負荷した。第VIIIa因子を、1ml/分で、同じ緩衝液中、0.1M
〜1.0MのNaClのグラジエント20mlにより、カラム洗浄を伴わないで溶出した。

【００８５】 これは、SDS−PAGE及び銀染色により示されるように、検出できる量のA2フラ
グメントを含むピークにおける凝集活性の回復をもたらした。ピーク画分の比活
性は、pH6.0で回復された比活性よりも10倍高かった（75,000U/A₂₈₀対7,500U/A_{2 80} ）。しかしながら、４℃で無期限に安定する、PH6.0で単離されたブタ第VIIIa
因子比較して、ヒト第VIIIa因子活性は、MonoS^TM からの溶出の後、数時間にわ
たって一定して低下した。さらに、pH5.0で精製され、そしてすぐにアッセイさ
れた第VIIIa因子の比活性はブタ第VIIIa因子の比活性のわずか５％であり、これ
は、実質的に解離がアッセイの前に生じたことを示す。

【００８６】 それらの結果は、ヒト及びブタ第VIIIa因子が３種のサブユニット（A1, A2及
びA3−C１−C2）から構成されることを示す。A2サブユニットの解離が、一定の
条件、たとえば生理学的イオン強度、pH及び濃度下で、ヒト及びブタ第VIIIa因
子の両活性の損失を担当している。一定条件下でのブタ第VIIIa因子の相対的安
定性は、A2サブユニットのより強い解離のためである。

【００８７】例４ ．ブタ第VIII因子のA2ドメインをコードするDNAの単離及び配列決定 ブタ第VIII因子のBドメイン及び一部のA2ドメインをコードするヌクレオチド
配列のみが、これまで配列決定されている（Tooleなど. (1986) Proc. Natl. Ac
ad. Sci. USA 83: 5939-5942）。完全なブタ第VIII因子A2ドメインのためのcDNA
及び予測されるアミノ酸配列（それぞれ、配列番号３及び４）が、本明細書に開
示される。

【００８８】 ブタ第VIII因子A2ドメインを、ブタ脾臓の全RNAの逆転写及びPCR増幅によりク
ローン化し；既知ヒト第VIII因子cDNA配列に基づく変性プライマー及びブタ第VI
II因子配列の一部に基づく正確なブタプライマーを使用した。1kbのPCR生成物を
単離し、そしてBluescript^TM (Stratagene) ファゲミドベクター中への挿入によ
り増幅した。 ブタA2ドメインを、ジデオキシ配列決定により完全に配列決定した。cDNA及び
予測されるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号３及び４に記載される。

【００８９】例５ ．ブタ第VIII因子をコードするDNAの完全な配列 クレノウフラグメント、リン酸化されたClaIリンカー, NotIリンカー、T4リガ
ーゼ及びTag DNA ポリメラーゼは、Promega（Madison, Wisconsin）から入手さ
れた。ポリヌクレオチドキナーゼは、Life Technologies, Inc., Gaithersburg,
Maryland から購入された。γ³²P−ATP（Redivue, ＞5000Ci/mモル）は、Amers
hamから購入された。pBluescript II KS^-及びE.コリEpicurean Xl1−Blue細胞は
、Stratagene (La Jolla, Cakifornia) から購入された。

【００９０】 合成オリゴヌクレオチドは、Life Technologies, Inc. 又はCruachem, Inc.
から購入された。5’−リン酸化されたプライマーが、PCR生成物がクローニング
目的のために生成される場合に使用された。ブタ第VIII因子cDNA又はゲノムDNA
のポリメラーゼ鎖反応（PCR）増幅のためのプライマーとして使用されるオリゴ
ヌクレオチドのヌクレオチド（nt）番号付けは、対照としてヒト第VIII因子cDNA
を使用する（Woodなど. (1984) 前記）。

【００９１】 ブタ脾臓の全RNAを、酸性グアニジュウムチオシアネート−フェノール−クロ
ロホルム抽出により単離した。[Chomczynskiなど. (1987) Anal. Biochem. 162:
156-159]。ブタcDNAを、特にことわらない限りMoloneyネズミ白血病ウィルス逆
転写酵素（RT）及び反応を感作するためのランダムヘキサマーを用いて、全脾臓
RNAから調製した（First−Strand cDNA Synthesis Kit, Pharmacia Biotech）。

【００９２】 RT反応は、45mMのトリス−HCl、pH8.3, 68mMのKC1, 15mMのDTT, 9mMのMgCl₂,
0.08mg/mlのウシ血清アルブミン及び1.8mMのデオキシヌクレオチドミリン酸（dN
tP）を含んだ。ブタゲノムDNAを、標準の方法を用いて、脾臓から単離した（Str
auss, W. M. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel
など., editors, John Wiley & Sons, pp. 2.2.1-2.2.3）。アガロースゲルか
らのDNA単離は、Geneclean II (Bio 101) 又はQuiex II Gel Extraction kit (Q
iagen) を用いて行われた。

【００９３】 PCR反応は、Hybaid OmniGeneサーモサイクラーを用いて行われた。Taq DNAポ
リメラーゼを用いてのPCR反応に関しては、反応は、0.6mMのMgcl2, 0.2mMのdNTP
、0.5μMオリゴヌクレオチドプライマー、50U/mlのポリメラーゼ、及び0.1体積
の第１鎖cDNA反応混合物を含んだ。特にことわらない限り、PCR生成物は、ゲル
精製され、クレノウフラグメントによりブラント末端化され、エタノールにより
沈殿せしめられ、そして脱リン酸化されたpBluescript II KS^-のEcoRV部位に連
結され、又はT4リガーゼを用いて、燐酸化されたClaIリンカーにより連結され、
ClaIにより消化され、Sephacryl S400クロマトグラフィーにより精製され、そし
てClaI切断された、脱リン酸化されたpBluescript II KS−に連結された。連結
は、特にことわらない限り、T4 DNAリガーゼ（Rapid DNA連結キット、Boehringe
r Mannheim）を用いて行われた。挿入物−含有pBluescript II KS^-プラスミドを
用いて、E.コリEpicurean XL１−Blue細胞を形質転換した。

【００９４】 プラスミドDNAの配列決定を、Applied Biosystems 373a 自動DNA配列決定装置
及びPRISM色素ターミネーターキットを用いて、又は手動的には、Sequenase v.
2.0配列決定装置（Amersham Corporation）を用いて行った。オリゴヌクレオチ
ドの³²P−末端ラベリングを包含する、PCR生成物の直接的な配列決定は、サイク
ル配列決定プロトコール（dsDNA Cycle Sequencing System, Life Technologies
）を用いて行われた。

【００９５】5’UTR配列、シグナルペプチド及びA1ドメインコドンを含むブタ第VIII因子cDNA クローンの単離 ： 5’側のブタ第VIII因子cDNA〜A2ドメインを、cDNA末端の5’急速増幅（5’−R
ACE）プロトコール（Marathon cDNA Amplification, Clontech, Version PR5545
3）を用いて、雌ブタ脾臓全RNAのネスティドRT−PCRにより増幅した。これは、
鍵−合体オリゴ（ｄT）プライマーを用いての第１鎖cDNA合成[Borson, N. D. な
ど. (1992) PCR Mechods Appl. 2: 144-148], E.コリDNAポリメラーゼIを用いて
の第２鎖cDNA合成、及び次の5’延長された二本鎖アダプター（配列番号５）に
よる連結を包含した：

【００９６】 5’−CTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG CTC GAG CGG CCG CCC GGG CAG GT−3’ 3’−H₂N−CCCGTCCA−PO₄−5’ ここで、短い方の鎖は非特異的PCRプライミングを減じるためにアミノ基により3
’末端でブロックされ、そして3’末端で８個のヌクレオチドに対して相補的で
あった（Siebert, P. D., など. (1995) Nucleic. Acids. Res. 23: 1087-1088
）。第１回目のPCRを、プライマーとして、次のアダプター−特異的オリゴヌク
レオチド（配列番号６）：5’−CCA TCC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC−3’（A
P1と命名された）、及びアンチセンスプライマーとして、次のブタ第VIII因子A2
ドメイン特異的オリゴヌクレオチド（配列番号７）：5’−CCA TTG ACA TGA AGA
CCG TTT CTC−3’（nt2081-2104）を用いて行った。

【００９７】 第２回目のPCRを、センスプライマーとして、次のネスティドアダプター特異
的オリゴヌクレオチド（配列番号８）：5’−ACT CAC TAT AGG GCT CGA GCG GC
−3’（AP2と命名された）、及びアンチセンスプライマーとして、次のネスティ
ドブタA2ドメイン特異的オリゴヌクレオチド（配列番号９）：5’−GGG TGC AAA
GCG CTG ACA TCA GTG−3’（nt1497-1520）を用いて行った。PCRを、抗体−介
在性ホットスタートプロトコール[Kellogg, D. E. など. (1994) Biotechniques
16: 1134-1137]を用いる市販のキット（Advantage cDNA PCR コアキット）を用
いて行った。

【００９８】 PCR条件は、94℃で60秒間の変性、続いて、30サイクル（第１PCR）又は25サイ
クル（第２PCR）の94℃で30秒間の変性、60℃で30秒間のアニーリング、および
管温度調節を用いての68℃で４分間の延長を包含した。この方法は、5’UTR中に
約150bpを延長するフラグメントの増幅と矛盾しない卓越した1.6kbの生成物を生
成した。PCR生成物を、ClaIリンカーを用いて、pBluescript中にクローン化した
。４種のクローンの挿入体を両方に配列決定した。

【００９９】 それらのクローンの配列は、5’UTR、シグナルペプチド、A1ドメイン及びA2ド
メインの一部の137bpに対応する領域を含んだ。コンセンサスは、４種の部位の
少なくとも３種の部位で達成された。しかしながら、クローンは、たぶん、クロ
ーン化できる生成物を生成するために必要とされる複数回のPCRのために、平均
４個の見掛けのPCR−生成された突然変異を含んだ。従って、本発明者は、配列
を確かめるためにもう1つのPCR生成物の合成のために、及び発現ベクター中にク
ローン化するために、RENEOPIGSPと命名されたセンス鎖リン酸化されたPCRプラ
イマー（配列番号10）：5’−CCT CTC GAG CCA CCA TGT CGA GCC ACC“ATG”CAG
CTA GAG CTC TCC ACC TG−3’ を企画するために、シグナルペプチド領域から
得られた配列を使用した。 “ ”で示す配列は、開始コドンを表す。この5’側の配列は、第VIII因子の
発現のために使用される哺乳類発現ベクターReNeo中への挿入部位のその5’側と
同一の配列を表す（Lubinなど. (1994) 前記）。この部位は、Xho１切断部位（
下線）を含む。RENEOPIGSP及びnt1497-1520オリゴヌクレオチドは、鋳型として
脾臓cDNAを用いて、Taq DNAポリメラーゼ−介在性PCR反応を感作するために使用
された。いくつかのほかの製造業者からのDNAポリメラーゼは、検出できる生成
物を生成することには失敗している。

【０１００】 PCR条件は、94℃で４分間の変性、続く35サイクルの94℃で1分間の変性、55℃
で２分間のアニーリング、及び72℃で２分間の延長、続く72℃で５分間の最終延
長段階を包含した。PCR生成物を、ClaIリンカーを用いて、pBluescript中にクロ
ーン化した。それらのクローンのうち２種のクローンの挿入体を両方向に配列決
定し、そしてコンセンサス配列と適合した。

【０１０１】A3, C1及びC2ドメインコドンの5’半分を含むブタ第VIII因子cDNAクローンの単
離 ： 最初に、B−A3ドメインフラグメント（nt4519-5571）及びC1-C2ドメインフラ
グメント（nt6405-6990）に対応する２種のブタ脾臓RT−PCR生成物をクローン化
した。得られるC2ドメインの3’末端は、第VIII因子における末端エキソンであ
る、エキソン26領域中に延長した。B−A3生成物を、次のブタ−特異的Bドメイン
プライマー（配列番号11）：5’−CGC GCG GCC GCG CAT CTG GCA AAG CTG AGT T −3’を用いて製造し、ここで下線領域は、ヒト第VIII因子におけるnt 4519-453
0と整列するブタ第VIII因子における領域に対応する。オリゴヌクレオチドの5’
領域は、本来、クローニング目的のために意図されたNotI部位を包含する。

【０１０２】 B−A3生成物の生成に使用される次のアンチセンスプライマー（配列番号12）
：5’−GAA ATA AGC CCA GGC TTT GCA GTC RAA−3’は、nt5545-5571でのヒト第
VIII因子cDNA配列の逆補体に基づかれた。PCR反応は、50mMのKCl, 10mMのトリス
−Cl, pH9.0, 0.1%のTriton X-100, 1.5mMのMgCl₂, 2.5mMのdNTP, 20μMのプラ
イマー、25単位/mlのTaq DNAポリメラーゼ及び1/20体積のRT反応混合物を含んだ
。PCR条件は、94℃で３分間の変性、続く30サイクルの94℃で１分間の変性、50
℃で２分間のアニーリング、及び72℃で２分間の延長であった。PCR生成物をT4
DNAキナーゼを用いてリン酸化し、そしてNotIリンカーを付加した。NotIにより
切断した後、PCRフラグメントを、BlueScript II KS^-のNotI部位中にクローン化
し、そしてXL１−Blue細胞を形質転換した。

【０１０３】 C1−C2生成物を、それぞれ、次のセンス及びアンチセンスプライマー：（配列
番号13）5’−AGG AAA TTC CAC TGG AAC CTT N−3’（nt 6405-6426）及び（配
列番号14）5’−CTG GGG GTG AAT TCG AAG GTA GCG N−3’（nt 6966-6990の逆
補体）を合成するために、既知のヒトcDNA配列を用いて製造した。PCR条件は、B
−A2生成物を生成するために使用されるそれらの条件と同一であった。得られる
フラグメントを、Prime PCR Cloner Cloning System (5 Prime-3 Prime, Inc.,
Boulder, Colorado) を用いて、pNOT クローニングベクターに連結し、そしてJM
109細胞において増殖せしめた。

【０１０４】 B−A3及びC1-C2プラスミドを、それぞれブタ−特異的センス及びアンチセンス
オリゴヌクレオチド：（配列番号15）5’−GAG TTC ATC GGG AAG ACC TGT TG−3
’（nt 4551-4573）及び（配列番号16）5’−ACA GCC CAT CAA CTC CAT GCG AAG
−3’（nt6541-6564）を製造するために部分的に配列決定した。それらのオリゴ
ヌクレオチドを、Clontech Advantage cDNA PCRキットを用いて、2013bpのRT−P
CR生成物を生成するために、プライマーとして使用した。ヒトnt4551-6564に対
応するこの生成物は、L鎖活性化ペプチド（nt5002-5124）に対応する領域、A3ド
メイン（nt5125-6114）及びC1ドメイン（nt6115-6573）のほとんどを含む。C1−
C2クローンの配列は、nt6565〜C1ドメインの3’末端までのヒト及びブタcDNAが
同一であったことを確立した。PCR生成物を、pBluescript II KS−のEcoRV部位
中にクローン化した。４種のクローンを、両方向に完全に配列決定した。コンセ
ンサスが、４種の部位中の少なくとも３種の部位において達した。

【０１０５】C2ドメインコドンの3’半分を含むブタ第VIII因子cDNAクローンの単離 ： ヒト第VIII因子のC2ドメイン（ヌクレオチド6574-7053）は、エキソン24−26
内に含まれる[Gitschier J. など. (1984) Nature 312: 326-330]。ヒトエキソ
ン26は、1958bp、すなわちその対応するヌクレオチド6901-8858を含む。それは
、3’翻訳配列の1478bpを含む。C2ドメインの3’UTRに対応するエキソン26 cDNA
を、3’ RACE [Sciebert など. (1995) 前記]、逆PCR [Ochman, H. など. (1990
) Biotechnology (N. Y.). 8: 759-760]、制限部位PCR [Sarkar, G. など. (199
3) PCR Meth. Appl. 2: 318-322]、“予測できない感作された”PCR [Dominguez
, O. など. (1994) Nucleic. Acids Res. 22: 3247-3248]、及びブタ肝臓cDNAラ
イブラリーのスクリーニングによりクローン化する試みは、失敗した。3’ RACE
を、ブタ第VIII因子cDNAの5’末端をクローン化するために都合良く使用される
同じアダプター連結された二本鎖cDNAライブラリーを用いて、試みた。従って、
この方法の失敗は、エキソン26に対応するcDNAの不在に依存しなかった。

【０１０６】 標的化された遺伝子ウォーキングPCR方法[Parker, J. D. など. (1991) Nacle
ic Acids Res. 19: 3055-3060]を用いて、C2ドメインの3’半分をクローン化し
た。ブタ−特異的センスプライマー（配列番号17）5’−TCAGGGCAATCAGGACTCC−
3’（nt6904-6924）を、初期C2ドメイン配列に基づいて合成し、そして実験に利
用できるオリゴヌクレオチドから選択された非特異的“ウォーキング”プライマ
ーによるPCR反応に使用した。次に、PCR生成物を、³²P−末端ラベルされたブタ
−特異的内部プライマー（配列番号18）5’−CCGTGGTGAACGCTCTGGACC−3’（nt6
932-6952）を用いて、プライマー延長分析[Parker など. (1991) BioTechniques
10: 94-101]により標的化した。

【０１０７】 興味あることには、試験された40個の非特異的プライマーのうち、わずか２つ
のプライマーが、プライマー延長分析に基づいて、陽性生成物を生成し、そして
それらの2つのプライマーは、C2ドメインの3’末端での正確な及び変性ヒト配列
に対応した：（配列番号19）5’−GTAGAGGTCCTGTGCCTCGCAGCC−3’（nt7030-705
3）及び（配列番号20）5’−GRAGAGSTSCTGKGCCTCRCAKCCYAG−3’（nt7027-7053
）。それらのプライマーは最初に、従来のRT−PCRにより生成物を生成するよう
企画されたが、しかし臭化エチジウム色素結合により可視化され得る十分な生成
物を生成するのには失敗した。しかしながら、PCR生成物は、より感受性のプラ
イマー延長方法により同定され得た。この生成物をゲル精製し、そして直接的に
配列決定した。これは、3’側のブタ第VIII因子の配列をnt7026まで延長した。

【０１０８】 追加の配列を、前記5’−RACEプロトコールに使用されるアダプター連結され
た二本鎖cDNAライブラリーを用いて生成されたネスティド生成物のプライマー延
長分析により得た。第１回目の反応は、正確なブタプライマー（配列番号21）5
’−CTTCGCATGGAGTTGATGGGCTGT−3’（nt6541-6564）及びAP１プライマーを使用
した。第２回目の反応は、（配列番号22）5’−AATCAGGACTCCTCCACCCCCG−3’（
nt6913-6934）及びAP2プライマーを使用した。直接的なPCR配列決定は、3’配列
をC2ドメイン（nt7053）の末端まで延長した。C2ドメイン配列は、C2ドメインの
3’末端近くのnt7045でを除いてユニークであった。反復されたPCR反応の分析は
、この部位で、A, G又はA/Gの二重読み取りのいずれかを生成した。

【０１０９】 配列決定を、次の２つの追加のプライマーを用いて、3’UTR中に延長した：（
配列番号23）5’−GGA TCC ACC CCA CGA GCT GG−3’（nt6977-6996）及び（配
列番号24）5’−CGC CCT GAG GCT CGA GGT TCT AGG−3’（nt7008-7031）。3’U
TR配列の約15bpを得たが、但しその配列はいくつかの部位で不明であった。次に
、いくつかのアンチセンスプライマーを、3’未翻訳配列の最良の評価に基づい
て合成した。それらのプライマーは、それらの3’末端でTGA停止コドンの逆補体
を含んだ。

【０１１０】 PCR生成物を、アガロースゲル電気泳動、及び次の特異的センスプライマー（
配列番号25）5’−AAT CAG GAC TCC TCC ACC CCC G−3’（nt6913-6934）及び3
’UTRアンチセンスプライヤー（配列番号26）5’−CCTTGCVAGGAATTCGATTCA−3’
を用いての臭化エチジウム染色により可視化されたブタ脾臓ゲノムDNA及びブタ
脾臓cDNAの両者から得た。クローニング目的のための十分な量の材料を得るため
に、第２回目のPCRを、ネスティドセンスプライマー（配列番号27）5’−CCGTGG
TGAACGCTCTGGACC−3’（nt6932-6952）及び同じアンチセンスプライマーを用い
て行った。141bpのPCR生成物を、EcoRV切断されたpBluescript II KS^-中にクロ
ーン化した。ゲノムDNAに由来する３種のクローン及びcDNAに由来する３種のク
ローンの配列を、両方向に得た。その配列はnt7045 でを除いて明白であり、こ
こでゲノムDNAは常にAであり、そしてcDNAは常にGであった。

【０１１１】ヒト、ブタ及びマウス第VIII因子の複数のDNA配列の整列（図１A−１H） ： シグナルペプチドA1, A2, A3, C1,及びC2領域の整列を、CLUSTALNプログラム[
Thompson, J. D. など. (1994) Nucleic Acid Res. 22: 4673-4680] を用いて行
った。ギャップ開放及びギャップ延長ペナルティーは、それぞれ10及び0.05であ
った。ヒト、マウス及びBドメインの整列はこれまで記載さえている[Elder など
. (1993) 前記]。ヒトA2配列は、配列番号２におけるアミノ酸373-740に対応す
る。ブタA2アミノ酸配列は、配列番号４に与えられ、そしてマウスA2ドメインア
ミノ酸配列は、配列番号28、アミノ酸392-759に与えられる。

【０１１２】例６ ．活性、組換えB−ドメインレスブタ第VIII因子（PB^-）の発現 材料： クエン酸塩添加された血友病A及び正常なプールされたヒト血漿は、George Ki
ng Biomedical, Inc.から購入した。ウシ胎児血清、ゲネチシン、ペニシリン、
ストレプトマイシン、DMEM/F12培地及びAIM−V培地は、Life Technologies, Inc
.から購入された。Taq DNAポリメラーゼはPromegaから購入された。Vent DNAポ
リメラーゼはNew England Biolabsから購入された。pfu DNAポリメラーゼ及びフ
ェゲミドpBlueScript II KS^-はStratageneから購入された。合成オリゴヌクレオ
ヂドはLife Technologies又はCruachem, Inc.から購入された。

【０１１３】 制限酵素は、New England Biolabs 又はPromegaから購入された。5’−リン酸
化されたプライマーは、PCR生成物がクローニングの目的のために生成される場
合に使用された。ブタ第VIII因子cDNA又はゲノムDNAのポリメラーゼ鎖反応（PCR
）増幅のためのプライマーとして使用されるオリゴヌクレオチドのヌクレオチド
（nt）番号付けは、対照として、ヒト第VIII因子cDNAを使用する[Woodなど. (19
84) Nature 312: 330-337]。

【０１１４】 HB^-/ReNeoとして命名された第VIII因子発現ベクターを、Biogen, Inc.から得
た。HB^-/ReNeoは、アンピシリン及びゲネチシン耐性遺伝子、及びトロンビンに
より生成されるSer741−Arg1648分解フラグメントとして定義される、完全なBド
メインを欠いているヒト第VIII因子cDNAを含む。ReNeoにおける第VIII因子挿入
体の3’末端で存在する、第VIII因子C2ドメインcDNAの突然変異誘発を単純化す
るために、NotI部位を、スプライシング×オーバーラップ延長（SOE）突然変異
誘発によりHB^-/ReNeoの、3’側から停止コドンに向かって２つの塩基側に導入し
た[Horton, R. M. など. (1993) Methods Enzymol. 217: 270-279]。この構造体
をHB^-ReNeo/NotIと命名する。

【０１１５】 全RNAを、酸性グアニジウムチオシアネート−フェノール−クロロホルム抽出[
Chomczynski, P. など.(1987) Anal. Biochem. 162: 156-159]により単離した。
cDNAを、製造業者により提出される説明書に従って（First−Strand cDNA Synth
esis Kit, Pharmacia Biotech）、Moloneyネズミ白血病ウィルス逆転写酵素（RT
）及びランダムへキサマーを用いて、mRNAから合成した。プラスミドDNAを、Qia
gen Plasmid Maxi Kit (Qiagen, Inc.) を用いて精製した。PCR反応を、Taq, ve
nt, 又はpfu DNAポリメラーゼを用いて、Hybaid QmniGeneサーモサイクラーによ
り行った。

【０１１６】 PCR生成物を、ゲル精製し、エタノールにより沈殿せしめ、そしてT4 DNAリガ
ーゼを用いてプラスミドDNA中に連結した（Rapid DNA連結キット、Boehringer M
annheim）。挿入体含有プラスミドを用いて、E.コリEpicurean XL１−Blue細胞
を形質転換した。PCRにより精製されるすべての新規第VIII因子DNA配列を、Appl
ied Biosystems 373a 自動DNA配列配列決定装置及びPRISM色素ターミネーターキ
ットを用いて、ジオキソ配列決定により確かめた。

【０１１７】ブタC2ドメインを含むハイブリッド第VIII因子発現ベクター、HP20の構成 ： C1ドメインの3’末端及びC2ドメインのすべてに対応するブタ第VIII因子cDNA
を、既知ブタ第VIII因子cDNA配列に基づくプライマーを用いて、脾臓全RNAから
のRT−PCRにより、pBluescript中にクローン化した[Healy, J. F. など. (1996) Blood 88: 4209-4214]。この構造体及びHB^-/ReNeoを、SOE突然変異誘発によりp
BlueScriptにおいてヒトC1−ブタC2融合生成物を構成するために鋳型として使用
した。このプラスミドにおけるC1−C2フラグメントを、ApaI及びNotIにより除去
し、そしてApaI/NotI−切断されたHB^-/ReNeo/NotI中に連絡し、HP20/ReNeo/NotI
を生成した。

【０１１８】ブタL鎖を含む、B−ドメイン欠失されたハイブリッドヒト/ブタ第VIII因子（HP1 8）の構成： ヒト第VIII因子L鎖は、アミノ酸残基Asp1649-Tyr2332から成る。ブタ第VIII因
子cDNAにおけるその対応する残基を、H13^-のこの領域により置換し、HP18として
命名されたハイブリッドヒト/ブタ第VIII因子分子を生成した。これは、ブタA2
領域に対応するPCR生成物、A3ドメイン、C1ドメイン、及びC2ドメインの一部を
、HP20におけるその対応する領域により置換することによって行われた。構成を
促進するために、類似するAvrII部位を、SOE突然変異誘発により、HP20のA2及び
A3ドメインの連結部でnt2273中に挿入した。

【０１１９】ブタシグナルペプチド、A1ドメイン及びA2ドメインを含むB−ドメインを欠失さ
れたハイブリッドヒト/ブタ第VIII因子（HP22）の構成： ヒト第VIII因子シグナルペプチド、A1ドメイン及びA2ドメインは、アミノ酸残
基Met(-19)−Arg740から成る。ブタ第VIII因子cDNAにおけるその対応する残基を
、HP22と命名される分子を生成するために、HB^-のこの領域により置換した。さ
らに、類似するAvr II部位を、SOE突然変異誘発により、HP22のA2及びA3ドメイ
ンの連結部でnt2273中に導入した。HP22を、HP1として命名される、ブタA2ドメ
インを含むB−ドメインレスハイブリッドヒト/ブタ第VIII因子[Lubin など. (19
94) 前記]と、pBlueScriptにおけるブタシグナルペプチド−A1−部分A2フラグメ
ント[Healyなど. (1996) 前記]との融合により構成した。

【０１２０】ブタBドメインレス第VIII因子（PB^-）の構成 ： HP18/BS（＋AvrII）のSpeI/NotIフラグメントを、AvrII/NotIにより消化し、
そしてAvrII/NotI−消化されたHP22/BS（＋AvrII）中に連結し、全Bドメインを
欠いているブタ第VIII因子から成る構造体PB^-/BS（＋AvrII）を生成した。HP22/
ReNeo/NotI（＋AvrII）中にPB^-/BS（＋AvrII）のXba/NotIフラグメントを連結す
ることによって、PB^-を、ReNeo中にクローン化した。

【０１２１】組換え第VIII因子分子の発現 ： PB^-/ReNeo/NotI（＋AvrII）及びHP22/ReNeo/NotI（＋AvrII）を、前記のよう
にして[Lubin, I. M. など. (1994) J. Biol. Chem. 269: 8639-8641]、SOS細胞
中に一時的にトランスフェクトし、そして発現した。HB^-/ReNeo/NotI及びDNA（
類似）を対照としてトランスフェクトした。

【０１２２】 PB^-、HP22及びHB^-の第VIII因子活性を、次の通りにして、クロモゲンアッセイ
により測定した。COS細胞培養物上清液における第VIII因子サンプルを、10nMの
第IXa因子、425nMの第X因子、及び50μMの単層ホスファチジルセリン−ホスファ
チジルコリン（25/75 w/w）小胞の存在下で、0.15MのNaCl, 20mMのHEPES, 5mMの
CaCl₂, 0.01%のTween−80（pH7.4）中、40nMのトロンビンにより活性化した。５
分後、反応を、0.05MのEDTA及び100nMの組換えデスルファトヒルジンの添加によ
り停止し、そして得られる第Xa因子を、クロモゲン基質アッセイにより測定した
。クロモゲン基質アッセイにおいては、0.4nMのSpectrozyme Xaを添加し、そし
てパラ−ニトロアニリドの開放速度を、405nmでその溶液の吸光度を測定するこ
とによって、測定した。

【０１２３】 独立してトランスフェクトされた二重反復細胞培養物上清液の結果（405nmで
の吸光度/分）は次の通りである： HB^-：13.9 PB^-：139 HP22：100 擬似：＜0.2 それらの結果は、ブタB−ドメインレス第VIII因子、及びブタA1及びA2サブユ
ニットから成るブタB−ドメインレス第VIII因子が活性的であることを示し、そ
してそれらがヒトB−ドメインレス第VIII因子よりも卓越した活性を有すること
を示唆する。

【０１２４】 PB^-を部分精製し、そしてヘパリン−Sepharoseクロマトグラフィーにより増幅
培地から濃縮した。ヘパリン−Sepharose（10ml）を、0.075MのNaCl, 10mMのHEP
ES, 2.5mMのCaCl₂, 0.005%のTween−80, 0.02％のアジ化ナトリウム（pH7.40）
により平均化した。発現細胞からの培地を、ヘパリン−Sepharoseに適用し、次
にこれを、アジ化ナトリウムを有さない平衡化緩衝液30mlにより洗浄した。PB^-
を、0.65MのNaCl, 20mMのHEPES, 5mMのCaCl₂, 0.01%のTween−80（pH7.40）によ
り溶出し、そして−80℃で貯蔵した。第VIII因子凝集活性の収率は、典型的には
、50〜75％であった。

【０１２５】ブタB−ドメインレス第VIII因子（PB^-）の安定した発現 ： トランスフェクトさえた細胞系を、10％ウシ胎児血清、50U/mlのペニシリン、
50μg/mlのストレプトマイシンを含むダルベッコ変性イーグル培地−F12に維持
した。ウシ胎児血清を、使用の１時間前、50℃で不活性化した。HB^-/ReNeo及びP
B^-ReNeo/NotI（＋AvrII）を安定して、BHK細胞中にトランスフェクトし、そして
前に記載された一般的なプロトコール[Lubin など. (1994) Biol. Chem. 269: 8
639-8641]を用いて、ゲネチシン耐性に対して選択し、但し、発現細胞は、600μ
g/mlのゲネチシンを含む増殖培地において維持された。

【０１２６】 集密性まで増殖された、Corning T−75フラスコからの細胞を、３本のNuncフ
ラスコに移し、600μg/mlのゲネチシンを含む培地において、集密性まで増殖し
た。培地を除去し、そしてゲネチシンを含まない、血清フリーのAIM−V培地（Li
fe Technologies, Inc.）により置換した。第VIII因子発現を、一段階第VIII因
子凝集活性によりモニターし（前記を参照のこと）、そして100〜150mlの培地を
、４〜５日間、1日１度、集めた。HB^-及びPB^-についての培地における最大の発
現レベルは、それぞれ、１〜２単位/ml及び10〜12単位/mlの第VIII因子凝集活性
であった。

【０１２７】PB^-の精製 ： PB^-を、60％飽和硫酸アンモニウムを用いて、培養物上清液から沈殿せしめ、
そして血漿由来のブタ第VIII因子の精製について前に記載されるようにして、W3
−３免疫親和性クロマトグラフィー及びnonoQ高圧液体クロマトグラフィーによ
り精製した[Lollarなど. (1993) Factor VIII/Fuctor VIIIa. Methods Enzymol.
222: 128-143]。PB^-の凝集比活性を、一段階凝集アッセイにより測定し[Lollar
など. (1993) 前記]、そしてそれは、血漿由来のブタ第VIII因子に類似した。

【０１２８】 SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析される場合、PB^-調製物は、
見掛けの分子質量160kDa, 82kDa及び76kDaの３種のバンドを含んだ。82kDa及び7
6kDaのバンドは、A1−A2及びap−A3−C1−C2ドメイン（ここで、apは活性ペプチ
ドを言及する）を含むヘテロダイマーとしてこれまで記載されている[Tooleなど
. (1984) Nature 312: 342-347]。160kDaのバンドを、ポリビニリデンフルオリ
ド膜に移し、そしてNH₂−末端配列決定にゆだね、これは、一本鎖第VIII因子のN
H₂−末端配列であるArg−Ile−Xx−Xx−Tyrを生成した[Tooleなど.(1984) 前記]
。従って、PB^-は、２種の形、すなわち一本鎖A1−A2−ap−A3−C1−C2タンパク
質及びA1−A2/ap−A3−C1−C2ヘテロダイマーから成るよう、A2及びA3ドメイン
の間を切断することによって、部分的にプロセッシングされる。組換えHB^-の類
似するプロセッシングは報告されている[Lindなど. (1995) Eur. J. Biochem. 2
32: 19-27]。

【０１２９】ブタ第VIII因子の特徴化 ： 本発明者は、137bpの5’UTR,シグナルペプチドコード領域（57bp）、及びA1 (
1119bp), A3 (990bp), C1 (456bp) 及びC2 (483bp) ドメインに対応するブタ第V
III因子のcDNA配列を決定した。Bドメイン及びL鎖活性化ペプチド領域[Tooleな
ど. (1986) 前記]及びA2ドメイン[Lubinなど. (1994) 前記]のこれまで公開され
た配列に加えて、本明細書に報告される配列は、翻訳された生成物に対応するブ
タ第VIII因子cDNAの決定を完結する。

【０１３０】 5’UTR領域、シグナルペプチド、及びA1ドメインcDNAを含むフラグメントを、
5’−RACE RT−PCRプロトコールを用いてクローン化した。ヒトC2配列に基づく
プライマーは、A3, C1, 及びC2ドメインの5’半分のクローニングを導くRT−PCR
生成物の生成において好都合であった。C2の3’半分に対応するcDNA及び3’UTR
cDNAは、クローン化するのには困難である。C2ドメインの残りは、究極的には、
標的化された遺伝子ウォーキングPCR方法[Parkerなど. (1991) 前記]によりクロ
ーン化された。

【０１３１】 本明細書に報告される配列、すなわち配列番号29は、上記のようにA又はGであ
る、C2ドメインの3’末端のnt7045でを除いて、明白であった。その対応するコ
ドンは、GAC（Asp）又はAAC（Asn）である。ヒト及びマウスコドンは、それぞれ
、GAC及びCAG（Gln）である。これが多形現象又は再生可能PCR人工物を表すかは
、未知である。GAC及びAACコドンの両者に対応するブタC2ドメイン置換を含む組
換えハイブリッドヒト/ブタB−ドメインレス第VIII因子cDNAは、前凝集活性の検
出できる差異を伴わないで安定して発現された。これは、２つのC2ドメイン変異
体間に機能的差異が存在しないことを示唆する。

【０１３２】 公開されたヒト[Woodなど. (1984) 前記]及びネズミ[Elserなど. (1993) 前記
]配列と、十分な長さのブタ第VIII因子配列番号30の予測されるアミノ酸配列と
の整列が、後翻訳修飾、タンパク質分解切断及び他の高分子による認識のための
部位と共に、図１A−１Hに示される。整列された配列の同一性の程度が表VIIに
示されている。前記に示されるように、それらの種のBドメインは、A又はCドメ
インよりも規準からはずれている。これは、その大きなサイズにもかかわらず、
Bドメインが既知の機能を有さない観察と一致する[Elderなど. (1993) 前記；To
oleなど. (1986) 前記]。本発明の結果は、Bドメイン又はブタ第VIII因子が活性
のために必要ではないことを確証する。

【０１３３】 本明細書に提供される配列データに基づけば、欠失されたB−ドメインのすべ
て又は一部を有するブタ第VIII因子が、ブタBドメインのすべて又は一部のコド
ンを、それらから欠失している、ブタ第VIII因子コードのDNAを発現することに
よって合成され得る。A1ドメインAPC/第IXa分解ペプチド（残基337−372）及びL
鎖活性化ペプチドに対応する配列の一層の逸脱性がまた存在する（表VII）。337
-372ペプチドを生成するために336でのトロンビン分解部位は、この残基がアル
ギニンの代わりにグルタミンであるので、マウスにおいては明らかに失われてい
る[Elderなど. (1993) 前記]。

【０１３４】 トロンビン分解ペプチド（又はマウス第VIII因子においては、たぶん退化した
337-372活性化ペプチド）の比較的急速な逸脱性が、フィブリノペプチドに関し
てこれまでに示されている[Creighton, T. E. (1993) Proteins, Structures an
d Molecular Properties, W. H. Freeman, New York, pp. 105-138]。分解され
たそれらのペプチドの生物学的機能の欠乏が、急速な逸脱性に関する可能性ある
理由として引用されている。ヒト第VIII因子因子におけるArg562は、第VIII因子
及び第VIII因子の不活性化の間、活性化されたタンパク質Cのためのより重要な
分解部位であることが提案さえている[Fag, P. J. など. (1991) J. Biol. Chem
. 226: 20139-20145]。

【０１３５】 可能性あるN−結合されたグリコシル化部位がまた、図１A−１Hにおいて、太
字で示されている。次の８種の保存されたN−結合されたグリコシル化部位が存
在する：A1ドメインに１つ、A2ドメインに１つ、Bドメインに４個、A3ドメイン
に１つ、及びC1ドメインに１つ。19A及びCドメインシステインが保存し、そして
Bドメインシステインの逸脱性が存在する。第VIII因子における８個のジスルフ
ィド結合のうち６個の結合が第V因子及びセルクプラスミンにおける相同部位で
見出され、そして両Cドメインジスルフィド結合が第V因子に見出される[McMulle
n, B. A. など. (1995) Protein Sci. 4: 740-746]。

【０１３６】 ヒト第VIII因子は、位置346, 718, 719, 723, 1664及び1680で、硫酸化された
チロシンを含む[Pittman, D. D. など. (1992) Biochemistry 31: 3315-3325; M
ichnick, D. A. など. (1994) J. Biol. Chem. 269: 20095-20102]。それらの残
基は、マウス第VIII因子及びブタ第VIII因子に保存されるが（図１）、但し、CL
USTALWプログラムは、ヒト第VIII因子におけるTyr346に対応するマウスチロシン
を整列することには失敗した。

【０１３７】 マウス及びブタ血漿は、それらの種のA及びCドメインにおける残基の保存のレ
ベルと一致する、ヒト血友病A血漿における凝集欠陥を是正することができる。
ブタ第VIII因子の前凝集活性は、ヒト第VIII因子のその活性よりも卓越している
[Lollar, P. など. (1992) J. Biol. Chem. 267: 23652-23657]。本明細書に記
載されるような発現され、そして精製された組換えブタ第VIII因子（Bドメイン
欠失された）はまた、ヒト第VIII因子よりも高い凝集比活性を示し、これは血漿
由来のブタ第VIII因子に比較できる。

【０１３８】 これは、活性A1/A2/A3−C1−C2第VIIIa因子ヘテトトリマーからのA2サブユニ
ットの低められた自発的解離速度のためであり得る。前凝集活性におけるこの差
異が種適合性の例としての機能の前進性変化に影響を及ぼす[Peruts, M. F. (19
96) Adv. Protin Chem. 36: 213-244]かどうかは未知である。翻訳された生成物
に対応するブタ第VIII因子cDNAが完全であるので、相同走査突然変異誘発[Cunni
ngham, B. C., など. (1989) Science 243: 1330-1336]は、ヒト及びブタ第VIII
因子間の、後者の卓越した活性を担当する構造的差異を同定するための手段を提
供することができる。

【０１３９】 ブタ第VIII因子は典型的には、第VIII因子を輸血された血友病患者において発
生し、そして一般集団において自己抗体として発生する阻害抗体とほとんど反応
しない。これは、阻害抗体を有する患者の管理にブタ第VIII因子濃縮物を用いる
ための基本原理である[Hay and Lozier (1995) 前記]。ほとんどのインヒビター
は、A2ドメイン又はC2ドメインに位置するエピトープに対して向けられる[Fulch
er, C. A. など. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 7728-7732; Scandel
la, D. など. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 6152-6156; Scandella, D. など. (1989) Blood 74: 1618-1626]。

【０１４０】 さらに、A3又はC1ドメインのいずれかに存在する未知のエピトープが同定され
た[Scandella など. (1989) 前記；Scandella, D. など. (1993) Blood 82: 176
7-1775; Nakai, H. など. (1994) Blood 84: 224a]。A2エピトープを、相同走査
突然変異誘導 [Healey など. (1995) 前記]により残基485-508に対してマッピン
グした。この25個の残基セグメントにおいては、比較的低い割合の同一の配列が
存在する（16/25又は64%）。この領域に対する抗体が阻害性である事実に基づい
て、機能的に重要であると思われる前記領域が明らかに、相補的に、より急速な
遺伝子的浮動にゆだねられたことは興味あることである。ブタA2ドメイン及びA3
ドメインの整列は、A2エピトープが、A3ドメインにおけるその対応する領域と検
出できる相同性を共有しないことを示唆する。

【０１４１】 ヒト第VIII因子のC2インヒビターエピトープは、欠失マッピングにより残基22
48−2312内に位置することが提案されている[Scandella, D. など. (1995) Bloo
d 86: 1811-1819]。ヒト及びブタ第VIII因子は、この65個の残基セグメントにお
いて83％同一である。しかしながら、C2エピトープを特徴づけるためのこの領域
の相同走査突然変異誘発は、意外には、C2エピトープの主要決定基がヒトアミノ
酸2181-2243（配列番号２及び図１H）に対応する領域に位置することを示した。

【０１４２】 ヒト−ブタハイブリッド第VIII因子タンパク質が製造され、ここでヒト第VIII
因子のC2ドメインの種々の部分が、本明細書に記載される手段を用いて、ブタ第
VIII因子のその対応する部分により置換されている（例５）。種々のC2−ハイブ
リッド第VIII因子の合成は、配列番号30に与えられるブタC2領域をコードするヌ
クレオチド配列を用いて、ハイブリッドコードDNAを構成することによって達成
された。個々のハイブリッドDNAは、ハイブリッド第VIII因子が増殖培地から部
分的に精製されるよう、トランスフェクトされた細胞において発現された。いず
れかのインヒビターの不在下で、活性を、一段階凝集アッセイにより測定した。

【０１４３】 一連の５種のヒトインヒビターを用いて、個々のハイブリッド第VIII因子を試
験した。抗第VIII因子抗体を含むインヒビター血漿は、阻害を中和する組換えヒ
トC2ドメインの能力に基づいて、ヒトC2ドメインに対して向けられることがこれ
までに示されている。すべての試験血漿においては、インヒビター力価は、C2ド
メイン又はL鎖により79%以上中和されるが、しかし組換えヒトA2ドメインによっ
ては、10%以下であった。さらに、C2−ハイブリッド第VIII因子が、C2ドメイン
を結合するネズミモノクローナル抗体に対して試験され、そしてヒトC2インヒビ
ター抗体のように、それは、リン脂質及びvon Willebrand因子への第VIII因子の
結合を阻害した。

【０１４４】 C2−ハイブリッド第VIII因子に対する抗体インヒビター力価を比較することに
よって、ヒトC2インヒビターエピトープの主要決定基は、残基2181−2243（配列
番号２；また図１Hを参照のこと）の領域であることが示された。領域COOH−末
端〜残基2253に対して向けられた抗−C2抗体は、５人のうち４人の患者の血清に
おいて同定されなかった。ヒトアミノ酸残基番号2181−2199及び2207−2243に対
応するブタ配列を有するハイブリッドの比較においては、両領域が抗体結合に寄
与していると思われた。ヒト残基2181−2243に対応するブタアミノ酸は、配列番
号30において、1982から2044まで番号付けされる。ブタアミノ酸1982−2044をコ
ードするブタDNAの配列は、配列番号29におけるヌクレオチド番号5944−6132で
ある。

【０１４５】 図１Hを参照すると、領域2181−2243において、ヒト及びブタ配列間に16個の
アミノ酸差異が存在することが見出され得る。それらの差異は、残基2181, 2182
, 2188, 2195-2197, 2199, 2207, 2216, 2222, 2224-2227, 2234, 2238及び2243
で見出される。１又は複数のそれらの番号付けされた残基でのアミノ酸置換が、
ヒト抗−C2インヒビター抗体に対して非反応性の修飾されたヒト第VIII因子を製
造するために実施され得る。アラニン走査突然変異誘発は、上記のように、天然
に存在する残基によるアラニン置換を生成するための従来の方法を提供する。ア
ラニン以外のアミノ酸もまた、本明細書に記載のようにして、置換され得る。個
々のアミノ酸、特に、ヒト/ブタ又はヒト/マウス間で同一ではなく、又は抗体結
合にたぶん最も寄与するそれらのアミノ酸によるアラニン置換は、阻害抗体に対
する低められた反応性を有する修飾された第VIII因子を生成することができる。

【０１４６】 一緒に取られる図１A−１Hは、ヒト、ブタ及びマウス第VIII因子アミノ酸配列
の整列された配列比較を提供する。図１Aは、シグナルペプチド領域（ヒト、配
列番号31；ブタ、配列番号30、アミノ酸１−19；ネズミ、配列番号28、アミノ酸
１−19）を比較する。図１A−１Hにおけるアミノ酸は、番号１として成熟タンパ
ク質の第１アラニンで番号付けされ、そしてシグナルペプチドのアミノ酸は負の
番号を付与された。

【０１４７】 配列番号２におけるヒト第VIII因子配列は、アミノ酸番号１として、成熟タン
パク質の第１アラニンから開始する。マウス第VIII因子（配列番号28）及びブタ
第VIII因子（配列番号30）のアミノ酸配列においては、成熟配列の最初のアミノ
酸（アラニン）は、アミノ酸配列番号20である。図１A−１Hは、最大のアミノ酸
同一性の領域が並置されるように、ヒト、マウス及びブタ第VIII因子のそれらの
対応する配列の整列を示す。図１A−１Hにおけるアミノ酸番号は、ヒト第VIII因
子のみに適用される。

【０１４８】 図１Bは、ヒト（配列番号２、アミノ酸１−372）、ブタ（配列番号30、アミノ
酸20−391）、及びネズミ（配列番号28、アミノ酸20−391）のA1ドメインのため
のアミノ酸配列を提供する。図1Cは、ヒト（配列番号2、 アミノ酸373-740）、
ブタ（配列番号30、アミノ酸392−759）及びマウス（配列番号28、アミノ酸392
−759）からの第VIII因子A2ドメインのためのアミノ酸配列を提供する。図１Dは
、ヒト（配列番号２、アミノ酸741−1648）、ブタ（配列番号30、アミノ酸760−
1449）及びマウス（配列番号28、アミノ酸760−1640）のBドメインのアミノ酸配
列を提供する。

【０１４９】 図１Eは、ヒト、ブタ及びマウスの第VIII因子L鎖活性化ペプチドのアミノ酸配
列（それぞれ、配列番号２、アミノ酸1649−1689；配列番号30、アミノ酸1450−
1490；及び配列番号28、アミノ酸1641−1678）を比較する。図１Fは、ヒト、ブ
タ及びマウス第VIII因子A3ドメインのための配列比較を提供する（それぞれ、配
列番号２、アミノ酸1690−2019；配列番号30、アミノ酸1491−1820；及び配列番
号28、アミノ酸1679−2006）。

【０１５０】 図１Gは、ヒト、ブタ及びマウスの第VIII因子C1ドメインのアミノ酸配列を提
供する（それぞれ、配列番号２、アミノ酸2020−2172；配列番号30、アミノ酸18
21−1973；及び配列番号28、アミノ酸2007−2159）。図１Hは、ヒト、ブタ及び
マウスの第VIII因子C2ドメインのC２ドメインについての配列データを提供する
（それぞれ、配列番号２、アミノ酸2173−2332；配列番号30、アミノ酸1974−21
33；及び配列番号28、アミノ酸2160−2319）。

【０１５１】 菱形は、チロシン硫酸化部位を表し、第IXa因子、リン脂質及びタンパク質Cの
ための提案された結合部位は二重下線が引かれ、そして結合抗−A2及び抗−C2阻
害抗体に関与する領域はイタリック形で書かれている。星印は、保存されるアミ
ノ酸配列を強調する。また、配列番号29（ブタ第VIII因子cDNA）及び配列番号30
（ブタ第VIII因子の推定されるアミノ酸配列）も参照のこと。ヒト番号付けシス
テムは、対照として使用される[Woodなど. (1984) 前記]。A1, A2及びBドメイン
は、位置372及び740でのトロンビン分解部位、及び位置1648での未知のプロテア
ーゼ分解部位により、それぞれ残基1−372, 373−740及び741−1648として定義
される[Eaton, D. L. など. (1986) Biochemistry 25: 8343-8347]。

【０１５２】 A3, C1及びC2ドメインは、それぞれ残基1690−2019, 2020−2172及び2173−23
32として定義される[Veharなど. (1984) 前記]。トロンビン（第VIII因子）、第
IXa因子、第Xa因子及びAPCのための分解部位[Fay など. (1991) 前記；Eaton, D
. など. (1986) Biochemistry 25: 505-512; Lamphear, B. J. など. (1992) Bl
ood 80: 3120-3128]は、反応性アルギニン上に酵素名称を配置することによって
示される。酸性ペプチドは、位置1689でトロンビン又は第Xa因子により第VIII因
子L鎖から切断される。

【０１５３】 第IXa因子[Fay, P. J. など. (1994) J. Biol. Chem. 269; 20522-20527; Len
ting, P. J. など. (1994) J. Biol. Chem. 269: 7150-7155]、リン酸質[Foster
, P. A. など. (1990) Blood 75; 1999-2004] 及びタンパク質C[Walker, F. J.
など. (1990) J. Biol. Chem. 265: 1484-1489]のための提案された結合部位は
二重下線が引かれている。結合抗−A2に関与する領域[Labinなど. (1994) 前記
；Healeyなど. (1995) 前記]；及び抗−C2阻害抗体について前に提案された領域
はイタリック形で示される。本明細書に記載のようにして同定されたC2インヒビ
ターエピトープ（ヒトアミノ酸2181−2243）は、図１Hにおいて一本線により示
される。チロシン硫酸化部位[Pittmanなど. (1992) 前記；Michnickなど. (1994
) 前記]は◆により示される。

【０１５４】例７ ．POL1212の構成及び子供ハムスター腎臓細胞における発現 POL1212は、B−ドメインのNH₂末端の12個のアミノ酸及び−COOH末端の12個の
アミノ酸が保持されているのを除いて、欠失されているB−ドメインを有する部
分的B−ドメインレスブタ第VIII因子である。 ブタ第VIII因子ドメインA1, A2, ap-A3-C1及びC2についての配列をコードする
cDNAを、例５に記載のようにして得た。ブタ第VIII因子のDNAヌクレオチド配列
及び由来のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号29及び30として表されている。増
幅されたフラグメントを、プラスミドpBluescript II KS−(pBS) 中に別々にク
ローン化した。

【０１５５】 POL1212とは、Bドメインのほとんどを欠いているが、しかしA2及びapドメイン
間の24個のアミノ酸リンカーをコードするDNA配列を含むブタ第VIII因子をコー
ドするcDNAを言及する。POL1212を、Biogenから得られた哺乳類発現ベクターReN
eoにおいて構成した。ReNeoは、細菌において複製し、第VIII因子の過渡的発現
のためにCOS細胞おいてエピソームとして複製し、又は種々の哺乳類細胞中に安
定して組み込まれ得る。

【０１５６】 それは、１）複製の起点及びアンピシリン耐性遺伝子を包含する、プラスミド
pBR322由来の配列、２）その発現がSV40プロモーター/エンハンサー、SV40小tイ
ントロン及びSV40ポリアデニル化シグナル調節要素の制御下にあるネオマイシン
耐性遺伝子、３）第VIII因子及びそのシグナルペプチドの挿入のための部位から
成り、その発現は、SV40エンハンサー、アデノウィルス２型主要後期プロモータ
ー及びアデノウィルス２型３部分リーダー配列下にある。類似する機能的成分を
有するいずれかのベクターが、ReNeoベクターの代わりに使用され得る。

【０１５７】 POL1212/ReNeoを、いくつかの段階で調製した。第１に、ブタ第VIII因子H鎖（
A1−A2）をコードするcDNA及びブタ第VIII因子L鎖（ap-A3-C1-C2）をコードする
cDNAを、pBSにおいて別々にアンセンブルした。それらの構造体から、ブタB−ド
メインレス第VIII因子をコードするDNAを、pBS（PB−/pBS）においてアセンブル
した。この形のブタ第VIII因子は、ヒト第VIII因子における残基741−1648（ヒ
トヌクレオチド2278−5001）に対応するアミノ酸として定義される完全なBドメ
インを欠いている。次に、ブタA2をコードするDNAを、ヒトB−ドメインレス第VI
II因子発現ベクターReNeo（HB-/ReNeo）におけるヒトA2ドメインにより置換した
。ブタH鎖の残りをコードするDNA及びブタL鎖をコードするDNAを、前に製造され
たブタH鎖/pBS及びPB−/pBS構造体を用いて、追加の二段階で、ドメインにより
置換した。

【０１５８】 ５個のC−末端及び９個のN−末端アミノ酸をコードするヒトBドメインのフラ
グメントを、A2とA3ドメインとの間に挿入し、PSQ/ReNeoと呼ばれる構造体を生
成した[Healeyなど. (1998) 92: 3701-3709]。残基Glu2181−Val2243は、ヒト第
VIII因子のC2ドメインにおいて阻害エピトープの主要決定因子を含む。この構造
体を、12個のC−末端及び12個のN−末端アミノ酸をコードするブタBドメインの
フラグメントを製造するための鋳型として使用した。このフラグメントを、A2と
A3ドメインとの間に挿入し、最終構造体POL1212/ReNeoをもたらした。 POL1212の24個のアミノ酸リンカーは、ブタ第VIII因子Bドメインの最初の12個
及び最後の12個の残基から成る。POL1212リンカーは次の配列を有する： SFAQNSRPPSASAPKPPVLRRHQR (配列番号32)。

【０１５９】 1212リンカー及び周囲のアミノ酸に対応するヌクレオチド配列は次の通りであ
る：

【表２】

【０１６０】 POL1212リンカーを、次の通りにスプライシング−バイ−オーバーラップ（spl
icing-by-overlap）延長（SOE）突然変異誘発により合成した： SOE生成物を製造するために使用されるPCR反応は次の通りであった： 反応１： 外部プライマー：ブタA2プライマー、すなわちヌクレオチド1742−1761（配列
番号29）であるRev4。この配列は、5’−GAGGAAAACCAGATGATGTCA−3’（配列番
号34）である。

【０１６１】 内部プライマー：OL1212の最初の（5’）15個のアミノ酸及びブタA2の最後の
（3’）５個のアミノ酸を包含するブタ逆プライマーであるOL12。その配列は次
の通りである： 5’−CTTTGGAGCGCTCGCACTAGGGGGTCTTGAATTCTGGGCAAAGCTCCTAGGTTCAATGAC−3’（
配列番号35）。 鋳型：PSQ/ReNeo。 生成物：A2ドメインにおけるヌクレオチド1742からOL1212におけるA2ドメイン
までの580bpのブタDNA。

【０１６２】 反応２： 外部プライマー：P2949は、ブタ逆A3プライマー、すなわち配列番号29のヌク
レオチド2998−3021である。この配列は、次の通りである： 5’−GGTCACTTGTCTACCGTGAGCAGC−3’（配列番号29）。 内部プライマー：OL12＋、すなわちOL1212の最後の（3’）16個のアミノ酸及
び活性化ペプチドの最初の（5’）６個のアミノ酸を包含するブタプライマー（
配列番号29のヌクレオチド2302−2367）。これは次の通りである： 5’−CCTAGTGCGAGCGCTCCAAAGCCTCCGGTCCTGCGACGGCATCAGAGGGACATAAGCCTTCCTACT
−3’（配列番号36）。

【０１６３】 鋳型：PSQ/ReNeo。 生成物：OL1212におけるヌクレオチド2302からA3ドメインにおけるヌクレオチ
ド3021までの719bpのブタDNA。 SOE反応： プライマー：Rev4, P2949−。 鋳型：rxn＃1（bp）からのフラグメント及びrxn＃2（bp）からの低溶融性フラ
グメント。 生成物：A2ドメインにおけるヌクレオチド1742から、OL1212を包含するA3ドメ
イン（配列番号29）におけるヌクレオチド3021までの1279bpのブタDNA。反応生
成物は、エタノール沈殿された。

【０１６４】 SOE生成物（挿入体）及びPSQ/ReNeo（ベクター）を、BsaB Iにより切断するこ
とによって、1212リンカーをPSQ/ReNeo中に挿入した。ベクター及び挿入体をT4
リンガーゼを用いて連結し、そして生成物を用いて、E.コリXL1−Blue細胞を形
質転換した。プラスミドDNAをいくつかのコロニーから調製し、そして1212リン
カーの配列及び他のPCR−生成された配列をDNA配列分析により確かめた。

【０１６５】 子供ハムスター腎臓（BHK）CRL−1632細胞の培養： BHK細胞系を、ATCC受託番号CRL−1632から得、そしてさらなる使用まで−20℃
で凍結貯蔵した。細胞を37℃で融解し、そして50U/mlのペニシリン、50μg/mlの
ストレプトマイシン及び10％ウシ胎児血清（FBS）を含む、DMEM/F12として定義
される完全培地10ml中に導入した。FBSは、Hyclone, Logan Utahから購入した。
細胞を300RPMで２分間、遠心分離した。培地を吸引し、そして細胞を、20mlの完
全培地を含むT−75フラスコにおいて2mlの完全培地に再懸濁した。

【０１６６】 POL1212は、子供ハムスター腎臓（BHK）及びチャイニーズハムスター卵巣（CH
O）の両細胞のおいて発現されている。次の２種のBHK系を使用した：ATCCからの
CRL−1632系及びR. Mcgillivray, University of British Columbia, [Funkなど
., (1990) Biochemistry 29: 1654-1660]から得られたもう１つのBHK系。後者を
、本発明者の実験室において、選択しないで継代培養し、そしてBHK1632（Emory
）と命名した。CHO細胞系は、CHO−K1、すなわちATCC受託番号CCL−61であった
。Emory細胞系及びCHO−K１細胞からの平均的クローンの発現は、発色性アッセ
イ活性により判断される場合、CRL−1632細胞からの発現よりもいくぶん、高か
った。

【０１６７】 T−75フラスコにおいて増殖した細胞は、集密性単層を形成した。POL1212/ReN
eoプラスミドを担持するLB/アンピシリン（50mg/ml）におけるE.コリXL１−Blue
細胞の培養物60mlを調製した。

【０１６８】 POL1212/ReNeoによるCRL−1632BHK細胞のトランスフェクション： POL1212/ReNoe XL1-Blue細胞の一晩の培養からのDNAを、Qiagen, Valencia, C
A Spin Miniprepキットを用いて調製した。合計2mlのCRL−1632細胞の１つのフ
ラスコを、貯蔵フラスコ及びトランスフェクションのためのフラスコにそれぞれ
0.2ml及び0.3mlづつ分けた。他のフラスコは、新鮮な培地を提供された。培地は
DMEM/F12＋10％Hyclone FBS＋50U/mlのペニシリン、50μg/mlのストレプトマイ
シンであった。CRL−1632細胞を、新鮮なDMEM/F12＋10％Hyclone FBS＋50U/mlの
ペニシリン、50μg/mlストレプトマイシンを用いて、（個々のウェルにおいて2m
lの１：5000Versen [Life Technologies, Gaithersburg, MD]中、T−75フラスコ
からの細胞0.3ml）。

【０１６９】 次の溶液を、無菌の１〜２mlの試験管において調製した： A)48μl（10μg）のMiniprep POL1212/ReNeo DNA＋血清を有さない培地（DMEM/F
12）＋10μlのLipofectin^TM (Life Technologies, Gaithersburg, MD)。 B)10μlのLipofectin＋190μlの培地（擬似トランスフェクション）を軽く混合
し、そしてDNA及びLipofectinを室温で15分間、反応せしめた。この時間の間、
細胞を２mlのDMEM/F12により２度、洗浄した。次に、1.8mlのDMEM/F12を細胞に
添加した。DNA/Lipofectiｎ複合体を細胞に滴下し、そして軽くかきまぜた。

【０１７０】 細胞はインキュベーターにおいて一晩、存続した。DNA/Lipofectinを除去し、
そして細胞に、血清と共に培地３mlを添加した。細胞を30〜48時間インキュベー
トした。Geneticinは、Life Technologies, Gaithersburg, MDから購入した。細
胞培養物を、10cmの皿上で535μg/mlのGeneticin及び血清を含む培地10mlにおい
て、1:20, 1:50, 1:100, 1:250及び1:500に分けた。次の数日にわたって、POL12
12/ReNeoプラスミドを摂取しなかった細胞は、Geneticinの存在のために殺され
た。残る細胞は、Geneticin下で複製し続け、皿上に眼に見える単離コロニーを
形成した。

【０１７１】 BHK CRL-1632細胞からのPOL1212の発現及びアッセイ： 小さなプラスチック製円柱状環をコロニーの周囲に配置した。コロニーを、完
全培地を用いて別々に吸引し、そして試験管に移した。それらのコロニーを、環
状のクローン化されたコロニーとして言及する。環状のクローン化されたコロニ
ーを、24ウェルプレート上に別々にプレートし、そして完全培地において増殖し
た。

【０１７２】 トランスフェクトされたCRL−1632細胞による第VIII因子発現のための発色性基
質アッセイ： 細胞培養物上清液からのPOL1212のサンプルを、0.15MのNaCl, 20mMのHEPES, 5
mMのCaCl₂, 0.01％のTween80（pH7.4）中、50nMの精製されたブタ第IXa因子及び
0.05Mのホスファチジルコリン/ホスファチジルセリン（PCPS）と共に混合した。
対照として、擬似トランスフェクトされた細胞からの細胞培養培地を使用した。
トロンビン及び第X因子を同時に添加し、それぞれ40及び425nMの最終濃度にした
。トロンビンは第VIII因子を活性化し、次に、PCPSと共に、第X因子の活性化の
間、第IXa因子のための補因子として作用する。

【０１７３】 ５分後、第IXa因子/第VIIIa因子/PCPSによる第X因子の活性化を、EDTAを添加
し、50mMの最終濃度にすることにより停止した。同時に、トロンビンによる第VI
II因子の活性化を、トロンビンインヒビター、すなわち組換えデスルファトヒル
ジンを添加し、100nMの最終濃度にすることにより停止した。反応混合物のサン
プル25μlをマイクロタイターウェルに移し、これに、第Xa因子のための発色性
基質であるSpoctrozyme Xa (America Diagnostica, Greenwich, CT) 74μlを添
加した。Spectrozyme Xa の最終濃度は0.6mMであった。第Xa因子によるSpectroz
yme Xaの分解による405nmでの吸光度を、Vmax Kinetic Plate Reader (Molecula
r Devices, Inc., Mento Park, CA) により５分間、連続してモニターした。そ
の結果は、A₄₀₅/分として表される。

【０１７４】

【表３】

【０１７５】 それらの結果は、選択されたすべての10個のコロニーが、バックグラウンドよ
りも少なくとも10倍高い第VIII因子活性を表すことを示す。 最高の活性を表すコロニーであるコロニー８の培地からの活性をさらに、１−
状態第VIII因子凝集アッセイにより試験した。このアッセイにおいては、50mlの
第VIII因子欠失血漿（George King Biomedical Overlannd Park, KA）、5mlのサ
ンプル又は対照、及び50mlの活性化された粒状トロンボプラスチン時間試薬（Or
ganon Teknika, Durham, NC）を、37℃で３分間インキュベートした。

【０１７６】 サンプルは、0.15MのNaCl、Hepes（pH7.4）（HBS）又は対照としての完全培地
に希釈されたコロニー８の培地を含む。凝集は、50mlの20mMのCaCl₂の添加によ
り開始された。凝集時間を、ST4 BIO Coagulation Instrument (Diagnostica St
ago, Parsippany, NJ) を用いて測定した。標準曲線を、プールされ、クエン酸
塩化された正常ヒト血漿ロット0641（George King Biomedical, Overland Park,
KA）の希釈溶液を製造することによって得た。標準の第VIII因子濃度は、0.9U/
mlであった。

【０１７７】

【表４】

【０１７８】 凝集時間−対−標準の濃度の対数の線状回帰は、0.997の相関係数を生成した
。 試験物質は、次の凝集時間を付与し、これを、標準曲線を用いて単位/mlに転
換した。

【０１７９】

【表５】

【０１８０】 それらの結果は、コロニー８の活性が対照サンプルの活性よりも約200倍高い
ことを示す。 POL1212をコードするDNA配列を、配列番号37として示す。POL1212のコードさ
れたアミノ酸配列を、配列番号38として示す。POL1212のさらなる精製を、種々
の既知の方法、例えば免疫親和性クロマトグラフィー及びHPLCクロマトグラフィ
ーを用いて行うことができる（例２及び３を参照のこと）。

【０１８１】 一般的な結論の注目： アミノ酸配列のマイナーな変動又はPOL1212に関連するそのような配列をコー
ドするDNAは、機能の必須特性に影響を及ぼさないで導入され得ることが理解さ
れるであろう。例えば、A2ドメインと活性化ペプチドとの間にリンカーとして保
持されるB−ドメイン配列の長さは、当業界において知られている範囲内で高め
られ得るか又は低められ得る。配列変異体は、本明細書に教授されるようなPOL1
212、及び本明細書に教授され、そして当業界において知られているブタB−ドメ
インレス第VIII因子の同等の機能的特性を保持しながら、リンカー領域に導入さ
れ得る。

【０１８２】 ヒト血液において凝集活性を有する既知の第VIII因子アミノ酸配列の比較に基
づけば、配列変異体、例えば個々のアミノ酸置換、又は既知の機能的変異体によ
るペプチドセグメントの置換は、それらの同等の機能的特性を保持しながら、基
本的POL1212アミノ酸配列において行なわれ得る。前記型の変動は、制限的では
なく、タンパク質の機能的特性を実質的に変性しないで、当業者により行なわれ
得る配列修飾の単なる例示である。すべてのそのような変異体及び修飾は、本発
明の範囲内であると思われる。 配列の列挙：

【０１８３】

【表６】

【図面の簡単な説明】

図１A−１Hは、一緒に取られる場合、ヒト、ブタ及びマウス第VIII因子アミノ
酸配列の整列された配列比較を提供する。

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA80 CA04 DA02 DA06 HA17 4B064 AG01 CA19 CC24 DA01 4B065 AA90X AA90Y AA91X AB01 CA24 CA44 4C084 AA02 AA07 BA01 BA08 BA22 BA23 CA21 CA53 DC15 NA14 ZA531 ZA532 4H045 AA10 AA20 BA10 CA40 DA66 EA24 FA74

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号38で示されるPOL1212のアミノ酸配列をコードするD
   NA。
2. 【請求項２】 請求項１記載のDNAを含んで成る発現ベクター。
3. 【請求項３】 配列番号37のヌクレオチド配列を有する請求項１記載のDNA
   。
4. 【請求項４】 請求項３記載のDNAを含んで成る発現ベクター。
5. 【請求項５】 配列番号38のアミノ酸配列を有する修飾されたブタ第VIII因
   子。
6. 【請求項６】 請求項５記載の修飾されたブタ第VIII因子及び生理学的に許
   容できるキャリヤーを含んで成る治療組成物。
7. 【請求項７】 配列番号38のアミノ酸配列を有する修飾された第VIII因子タ
   ンパク質の生成方法であって、 配列番号38のアミノ酸配列をコードするDNAを、哺乳類宿主細胞において発現
   せしめることを含んで成る方法。
8. 【請求項８】 配列番号38のアミノ酸配列をコードする前記DNAがさらに、
   シグナルペプチドもコードし、それにより、前記修飾されたブタ第VIII因子タン
   パク質が哺乳類宿主細胞から運び出される請求項７記載の方法。
9. 【請求項９】 前記シグナルペプチドが、配列番号30のアミノ酸１−19の配
   列を有する請求項８記載の方法。
10. 【請求項１０】 配列番号38で示されるPOL1212のアミノ酸配列をコードす
    るDNAを含んで成る発現ベクターを含み、そしてそれを複製する哺乳類細胞。
11. 【請求項１１】 前記DNAを含んで成るベクターが、配列番号37のヌクレオ
    チド配列を有する請求項10記載の哺乳類細胞。
12. 【請求項１２】 前記宿主細胞がBHK CRL-1632である請求項11記載の哺乳類
    細胞。