ES2304379T3

ES2304379T3 - Factor viii modificado.

Info

Publication number: ES2304379T3
Application number: ES01910853T
Authority: ES
Inventors: John S. Lollar
Original assignee: Emory University
Current assignee: Emory University
Priority date: 2000-03-10
Filing date: 2001-02-16
Publication date: 2008-10-16
Anticipated expiration: 2021-02-16
Also published as: KR20020081426A; NL300808I2; PT1280540E; CZ298250B6; NL300808I1; SK14392002A3; HK1051004A1; BRPI0109131B1; MEP8209A; ATE391512T1; NO20024296L; CN1191360C; LU93049I2; SI1280540T1; AU2001238416B2; ZA200206810B; DE60133541D1; PL359672A1; CN1416348A; WO2001068109A1

Abstract

DNA que codifica la secuencia de aminoácidos de POL1212 como se expone en SEQ ID NO. 38.

Description

Factor VIII modificado.

Referencia cruzada a solicitudes relacionadas

Esta solicitud reivindica prioridad de la solicitud de patente de Estados Unidos Nº 09/037.601 presentada el 10 de marzo de 1998, que es una continuación en parte de la solicitud de patente de Estados Unidos Nº 08/670.707 presentada el 26 de junio de 1996, que fue concedida como la patente de EE.UU. Nº 5.859.204 y de la solicitud de patente internacional Nº PCT/US97/11155 presentada el 26 de junio de 1997.

Antecedentes de la invención

La coagulación de la sangre comienza cuando las plaquetas se adhieren a la pared cortada de un vaso sanguíneo lesionado en el sitio de la lesión. Posteriormente, en una cascada de reacciones enzimáticamente reguladas, las moléculas de fibrinógeno soluble son convertidas por la enzima trombina en cadenas insolubles de fibrina que mantienen las plaquetas conjuntamente en un trombo. En cada etapa de la cascada, un precursor de proteínas es convertido en una proteasa que escinde el siguiente precursor de proteína en la serie. Son necesarios co-factores en la mayoría de las etapas.

El factor VIII circula como un precursor inactivo en la sangre, unido estrechamente y de forma no covalente al factor de von Willebrand. El factor VIII es proteolíticamente activado por trombina o factor Xa, que lo disocia del factor de von Willebrand y activa su función pro-coagulante en la cascada. En su forma activa, el factor VIIIa de proteínas es un co-factor que aumenta la eficacia catalítica del factor IXa hacia la activación del factor X en varios órdenes de magnitud.

Las personas con deficiencias en factor VIII o anticuerpos contra el factor VIII que no son tratados con factor VIII, padecen hemorragias internas incontroladas que pueden provocar una gama de síntomas graves, desde reacciones inflamatorias en las articulaciones hasta la muerte prematura. Los hemofílicos graves, que ascienden a aproximadamente 10.000 en los Estados Unidos, pueden ser tratados con infusión de factor VIII humano, que restaura la capacidad de coagulación normal de la sangre si es administrada con una frecuencia y concentración suficientes. La definición clásica del factor VIII, de hecho, es de una sustancia presente en el plasma sanguíneo normal que corrige el defecto coagulante en el plasma derivado de individuos con hemofilia A.

El desarrollo de anticuerpos ("inhibidores" o "anticuerpos inhibidores") que inhiben la actividad del factor VIII es una complicación grave en el tratamiento de pacientes con hemofilia. Se desarrollan auto-anticuerpos en aproximadamente un 20% de los pacientes con hemofilia A en respuesta a infusiones terapéuticas de factor VIII. En pacientes sin tratar previamente con hemofilia A que desarrollan inhibidores, el inhibidor se desarrolla habitualmente dentro de un año de tratamiento. Adicionalmente, los auto-anticuerpos que inactivan el factor VIII se desarrollan ocasionalmente en individuos con niveles de factor VII previamente normales. Si el título de inhibidor es suficientemente bajo, los pacientes pueden ser tratados aumentando la dosis de factor VIII. Sin embargo, a menudo el título del inhibidor es tan elevado que no puede ser copado por el factor VIII. Una estrategia alternativa es desviar la necesidad de factor VIII durante la hemostasis, usando preparaciones complejas de factor IX (por ejemplo, KONYNE®, Proplex®) o factor VIIa humano recombinante. Adicionalmente, como el factor VIII porcino habitualmente tiene una reactividad sustancialmente menor con inhibidores que con factor VIII humano, ha sido usada una preparación parcialmente purificada de factor VIII porcino (HYATE:C®). Muchos pacientes que han desarrollado anticuerpos inhibidores para factor VIII humano han sido tratados satisfactoriamente con factor VIII porcino y han tolerado este tratamiento durante períodos de tiempo prolongados. Sin embargo, la administración de factor VIII porcino no es una solución completa porque los inhibidores pueden desarrollar factor VIII porcino después de una o más infusiones en algunos pacientes.

Están disponibles en el comercio diversas preparaciones de factor VIII derivado de plasma humano con grados variables de pureza para el tratamiento de hemofilia A. éstas incluyen un factor VIII parcialmente purificado derivado de la sangre reunida de muchos donantes, es decir, tratada con calor y detergentes para virus, pero que contienen un nivel significativo de proteínas antígenas; un factor VIII purificado con anticuerpos monoclonales que tiene niveles inferiores de impurezas antígenas y contaminación viral; y factor VIII humano recombinante, para las que están en curso ensayos clínicos. Desgraciadamente, el factor VIII humano es inestable a concentraciones y pH fisiológicos si está presente en la sangre a una concentración extremadamente baja (0,2 \mug/ml de plasma) y tiene una baja actividad de coagulación específica. Las preocupaciones de la sanidad pública relativas al riesgo de virus u otros contaminantes portados por la sangre han limitado la utilidad del factor VIII porcino purificado a partir de sangre porcina.

Los hemofílicos requieren la reposición diaria de factor VIII para evitar hemorragias y la arteroterapia hemofílica deformante que resulta. Sin embargo, los suministros han sido inadecuados y se pueden producir problemas en el uso terapéutico debido a la dificultad de aislamiento y purificación, inmunogenicidad y la necesidad de suprimir el riesgo de infección por SIDA y hepatitis. El uso de factor VIII humano recombinante o factor VIII porcino parcialmente purificado no resolverá todos los problemas.

Los problemas asociados con el factor VIII derivado de plasma comúnmente usado y disponible en el comercio han estimulado un interés significativo por el desarrollo de un mejor producto de factor VIII. Hay una necesidad de una molécula de factor VIII más potente, de forma que puedan ser suministradas más unidades de actividad coagulante por molécula; una molécula de factor VIII que sea estable a un pH seleccionado y concentración fisiológica; una molécula de factor VIII que sea menos propensa a provocar la producción de anticuerpos inhibidores; y una molécula de factor VIII que evite la detección inmune en pacientes que tengan anticuerpos ya adquiridos para factor VIII humano.

Es un objeto de la invención proporcionar un procedimiento para preparar factor VIII porcino recombinante y, específicamente, factor VIII porcino modificado.

Sumario de la invención

La determinación de la secuencia completa de DNA que codifica factor VIII porcino expuesta en la memoria descriptiva ha hecho posible, por primera vez, la síntesis de factor VIII porcino de longitud completa expresando el DNA que codifica factor VIII porcino en una célula hospedante adecuada. Por lo tanto, se describe factor VIII porcino recombinante purificado. El DNA que codifica cada dominio del factor VIII porcino, así como cualquier fragmento especificado del mismo, puede ser análogamente expresado. Además, el fVIII porcino que tiene la totalidad o parte del domino B suprimido (fVIII porcino sin domino B) ha resultado disponible como parte de la presente invención, mediante la expresión de DNA que codifica fVIII porcino que tiene una deleción de uno o más codones del dominio B.

También se proporcionan composiciones y procedimientos farmacéuticos para tratar pacientes que tiene deficiencia de factor VIII, que comprenden administrar factor VIII porcino recombinante o un factor VIII porcino recombinante modificado, en particular un factor VIII porcino sin dominio B.

Breve descripción de los dibujos

Las Figs. 1A-1H tomadas conjuntamente proporcionan una comparación de secuencias alineadas de las secuencias ácidas de factor VIII humano, de cerdo y de ratón.

Descripción detallada de la invención

Salvo que se especifique o se indique otra cosa, como se usa en la presente memoria descriptiva, "factor VIII" indica cualquier molécula proteica de factor VIII funcional de cualquier mamífero.

Como se usa en la presente memoria descriptiva, "factor VIII de mamífero" incluye factor VIII con una secuencia de aminoácidos derivada de cualquier mamífero no humano, salvo que se especifique otra cosa. "Animal", como se usa en la presente memoria descriptiva, se refiere al cerdo y otros animales no humanos.

Una "proteína de fusión" o "factor VIII de fusión o fragmento del mismo", como se usan en la presente memoria descriptiva, es el producto de un gen híbrido en el que es alterada la secuencia codificadora de una proteína, por ejemplo, uniendo parte del mismo a la secuencia codificadora para una segunda proteína de un gen diferente en un registro de marco de lectura apropiado de forma que se pueda producir la trascripción y traducción ininterrumpidas de los segmentos unidos, para producir un gen híbrido que codifique la proteína de fusión.

Un ácido nucleico o aminoácido "correspondiente" o secuencia de cualquiera de ellos, como se usa en la presente memoria descriptiva, es uno que está presente en un sitio en una molécula de factor VIII o fragmento de la misma que tiene la misma estructura y/o función que el sitio en la molécula de factor VIII de otras especies, aunque el número de ácidos nucleicos o aminoácidos puede no ser igual. Una secuencia de DNA "correspondiente" a otra secuencia de factor VIII corresponde sustancialmente a esa secuencia, y se hibrida a la secuencia de la denominada SEQ ID NO. bajo condiciones restrictivas. Una secuencia de DNA "correspondiente a" otra secuencia de factor VIII incluye también una secuencia que da lugar a la expresión de un factor VIII o fragmento del mismo y se hibridaría a la denominada SEQ ID NO. excepto en cuanto a la redundancia del código genético.

Un residuo o secuencia "único" de aminoácidos, como se usa en la presente memoria descriptiva, se refiere a una secuencia o residuo de aminoácidos en la molécula de factor VIII de una especie que es diferente del residuo o secuencia homólogo en la molécula de factor VIII de otras especies.

"Actividad específica", como se usa en la presente memoria descriptiva, se refiere a la actividad que corregirá el defecto de coagulación de plasma humano deficiente en factor VIII. La actividad específica se mide en unidades de actividad coagulante por miligramo de proteína de factor VIII total en un ensayo estándar, en el que el tiempo de coagulación de plasma deficiente en factor VIII humano se compara con el de plasma humano normal. Una unidad de actividad de factor VIII es la actividad presente en un mililitro de plasma humano normal. En el ensayo, cuanto más corto es el tiempo para la formación del coagulo, mayor es la actividad del factor VIII que está siendo ensayado. El factor VIII porcino tiene actividad de coagulación en un ensayo de factor VIII humano.

"Expresión" se refiere al conjunto de procedimientos que se producen mediante los cuales se utiliza la información genética para proporcionar un producto. Un DNA que codifica la secuencia de aminoácidos de factor VIII porcino puede ser "expresado" en una célula hospedante de mamífero para producir proteína de factor VIII porcino. Los materiales, estructuras genéticas, células hospedantes y condiciones que permiten la expresión de una secuencia dada de DNA que se produce son bien conocidos en la técnica y pueden ser manipulados para afectar al tiempo y la cantidad de expresión, así como la ubicación intra- o extra-celular de la proteína expresada. Por ejemplo, mediante la inclusión de DNA que codifica un péptido de señal en el extremo 5' del DNA que codifica factor VIII porcino (siendo el extremo 5', como norma, el extremo que codifica la terminación de NH_{2} de la proteína), la proteína expresada resulta exportada desde el interior de la célula hospedante al medio de cultivo. Es ventajoso proporcionar un DNA que codifique péptido de señal en combinación con el DNA que codifica factor VIII porcino, porque el factor VIII expresado es exportado al medio de cultivo, lo que simplifica el procedimiento de purificación. Un péptido de señal preferido es un péptido de señal de factor VIII de mamífero.

Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos previstos de cDNA de factor VIII humano se muestran en las SEQ ID NO. 1 y 2, respectivamente. El factor VIII es sintetizado como una proteína de cadena única de aproximadamente 300 kDA con una homología de secuencias internas que define la secuencia de "dominio" NH_{2}-A1-A2-B-A3-C1-C2-COOH. En una molécula de factor VIII, un "dominio", como se usa en la presenta memoria descriptiva, es una secuencia continua de aminoácidos que está definida por la identidad de las secuencias internas de aminoácidos y los sitios de escisión proteolítica por trombina. Salvo que se especifique otra cosa, los dominios de factor VIII incluyen los siguientes residuos de aminoácidos, cuando las secuencias están alineadas con la secuencia humana de aminoácidos (SEQ ID NO. 2): A 1, residuos Alal-Arg372; A2, residuos Ser373-Arg740; B, residuos Ser741-Argl648; A3, residuos Serl690-Ile2032; C1, residuos Arg2033-Asn2172; C2, residuos Ser2173-Tyr2332. La secuencia A3-C1-C2 incluye los residuos Ser1690-Tyr2332. El segmento restante, residuos Glu 1649-Arg1689 se denomina habitualmente el péptido de activación de cadena ligera de factor VIII. El factor VIII es proteolíticamente activado por trombina o factor Xa, que se disocia del factor de von Willebrand, formando factor VIIIa, que tiene una función pro-coagulante. La función biológica del factor VIIIa es aumentar la eficacia catalítica del factor IXa hacia la activación de factor X en varios órdenes de magnitud. El factor VIIIa activado por trombina es un heterotrímero A1/A2/A3-C1-C2 de 160 kDa que forma un complejo con factor IXa y factor X en la superficie de las plaquetas o monocitos. Un "dominio parcial", como se
usa en la presente memoria descriptiva, es una secuencia continua de aminoácidos que forman parte de un dominio.

"Subunidades" de factor VIII humano o de animal, como se usa en la presente memoria descriptiva, son las cadenas pesadas y ligeras de la proteína. La cadena pesada de factor VIII contiene tres dominios A1, A2 y B. La cadena ligera de factor VIII contiene también tres dominios, A3, C1 y C2.

Los términos "epitopo" "sitio antígeno" y "determinante antígeno", como se usan en la presente memoria descriptiva, se usan de forma sinónima y están definidos como una parte del factor VIII humano o de animal o fragmento del mismo que es específicamente reconocido por un anticuerpo. Puede consistir en cualquier número de residuos de aminoácidos y puede depender de la estructura primaria, secundaria o terciaria de la proteína.

La expresión "sitio inmunógeno", como se usa en la presente memoria descriptiva, se define como una región del factor VIII humano o de animal, o fragmento del mismo, que provoca específicamente la producción de anticuerpos para el factor VIII, o fragmento, en un ser humano o animal, al ser medida mediante protocolos rutinarios como un inmunoensayo, por ejemplo, ELISA o el ensayo de Bethesda descrito en la presente memoria descriptiva. Puede consistir en cualquier número de residuos de aminoácidos y puede depender de la estructura primaria, secundaria o terciaria de la proteína. En algunas realizaciones, el factor VIII híbrido o equivalente de híbrido o fragmento del mismo es no inmunógeno o menos inmunógeno en un animal o ser humano que el factor VIII humano o porcino.

"Deficiencia de factor VIII", como se usa en la presente memoria descriptiva, incluye deficiencia en la actividad coagulante provocada por la producción de factor VIII defectuoso, por la producción inadecuada o nula de factor VIII o por la inhibición parcial o total de factor VIII por inhibidores. La hemofilia A es un tipo de deficiencia de factor VIII que resulta de un defecto en un gen conectado a X y la ausencia o deficiencia de la proteína de factor VIII que codifica.

Como se usa en la presente memoria descriptiva "ensayos de diagnóstico", incluyen ensayos que de alguna manera utilizan la interacción de antígeno-anticuerpo para detectar y/o cuantificar la cantidad de un anticuerpo particular que está presente en una muestra de ensayo para ayudar a la selección de terapias médicas. Hay muchos de estos ensayos conocidos por los expertos en la técnica. Como se usa en la presente memoria descriptiva, el DNA de factor VIII humano, porcino o porcino modificado o fragmento del mismo y la proteína expresada a partir del mismo, en la totalidad o en parte, pueden sustituir a los correspondientes reactivos en los ensayos conocidos de alguna otra manera, con lo que los ensayos modificados pueden ser usados para detectar y/o cuantificar anticuerpos para factor VIII. El uso de estos reactivos, el DNA de factor VIII o fragmento del mismo o proteína expresada a partir del mismo, es lo que permite la modificación de ensayos conocidos para la detección de anticuerpos para factor VIII humano o de animal. Estos ensayos incluyen, pero sin limitación, ELISA, ensayos de inmunodifusión e inmunotransferencias. Los procedimientos adecuados para poner en práctica cualquiera de estos ensayos son conocidos por los expertos en la técnica. Como se usa en la presente memoria descriptiva, el factor VIII o fragmento del mismo que incluye al menos un epitopo de la proteína puede ser usado como el reactivo de diagnóstico. Ejemplos de otros ensayos en los que puede ser usado factor VIII humano, porcino o porcino modificado o un fragmento del mismo incluyen el ensayo de Bethesda y ensayos de anti-coagulación.

La expresión "DNA que codifica una proteína, como factor VIII porcino" significa un ácido polidesoxinucleico cuya secuencia de nucleótidos realiza la información codificadora para una célula hospedante para la secuencia de aminoácidos de la proteína, por ejemplo, factor VIII porcino, según las relaciones conocidas del código genético.

El "producto de expresión" de un DNA que codifica un factor VIII humano o de animal o un factor VIII modificado es el producto obtenido a partir de la expresión del DNA de referencia en una célula hospedante adecuada, que incluye las características de modificación pre- o post-translacionales de la proteína codificada por el DNA de referencia, incluidas, pero sin limitación, la glicosilación, escisión proteolítica y similares. Es conocido en la técnica que estas modificaciones se pueden producir y pueden diferir en alguna medida dependiendo del tipo de célula hospedante y otros factores, y pueden dar lugar a isoformas moleculares del producto, con retención de la actividad pro-coagulante. Véase por ejemplo, Lind, P. et al., Eur. J. Biochem. 232:1927 (1995).

Un "vector de expresión" es un elemento de DNA, a menudo de estructura circular que tiene la capacidad de replicarse autónomamente en una célula hospedante deseada, o integrarse en el genoma de la célula hospedante y que posee también ciertas características bien conocidas que permiten la expresión de un DNA codificador insertado en la secuencia del vector en el sitio apropiado y en la orientación apropiada. Estas características pueden incluir, pero sin limitación, una o más secuencias promotoras para dirigir el inicio de la trascripción del DNA codificador y otros elementos de DNA como mejoradores, sitios de poliadenilación y similares, todo como es conocido en la técnica. La expresión "vector de expresión" se usa para indicar tanto un vector que tiene un DNA que codifica la secuencia que va a ser expresada insertada en su secuencia, como un vector que tiene los elementos necesarios de control de la expresión dispuestos con respecto a un sitio de inserción de forma que pueden servir para expresar cualquier DNA codificador insertado en el sitio, todo como es conocido en la técnica. Por tanto, por ejemplo, un vector que carece de un promotor puede convertirse en un vector de expresión mediante la inserción de un promotor combinado con un DNA codificador.

Descripción general de procedimientos

La patente de EE.UU. 5.364.771 describe el descubrimiento de moléculas de factor VIII híbrido humano/porcino que tienen actividad coagulante, en las que elementos de la molécula de factor VIII de ser humano o cerdo sustituyen a los correspondientes elementos de la molécula de factor VIII de las otras especies. La patente de EE.UU. 5.663.060 describe moléculas de factor VIII híbrido pro-coagulante humano/animal y equivalentes híbridos, en las que los elementos de la molécula de factor VIII de una especie sustituyen a los correspondientes elementos de la molécula de factor VIII de las otras especies.

Como la información actual indica que el dominio B no tiene ningún epitopo inhibidor y no tiene ningún efecto conocido sobre la función del factor VIII, en algunas realizaciones el dominio B es completa o parcialmente suprimido en las moléculas de factor VIII híbridas activas o equivalentes híbridas o sus fragmentos ("factor VIII B(-)") preparadas mediante cualquiera de los procedimientos descritos en la presente memoria descriptiva.

El gen de factor VIII humano fue aislado y expresado en células de mamíferos, como se describe por Toole, J.J. et al. (1984) Nature 312:342-347 (Genetics Institute); Gitschier, J. et al. (1984) Nature 312:326-330 (Genentech); Wood, W.L. et al. (1984) Nature 312:330-337 (Genentech); Vehar, G.A. et al. (1984) Nature 312: 337-342 (Genentech); documentos WO 87/04187; WO 88/08035; WO 88/03558; patente de EE.UU. Nº 4.757.006 y la secuencia de aminoácidos fue deducida a partir de cDNA. La patente de EE.UU. nº 4.965.199 de Capon et al. describe un procedimiento de DNA recombinante para producir factor VIII en células hospedantes de mamífero y la purificación de factor VIII humano. Se ha descrito la expresión de factor VIII humano en células de CHO (ovario de hámster chino) y BHKC (células de riñón de cría de hámster). El factor VIII humano ha sido modificado para suprimir parte o la totalidad del dominio B (patente de EE.UU. Nº 4.868.112) y se ha intentado la sustitución del dominio B del factor VIII humano con dominio B de factor V humano (patente de EE.UU. Nº 5.004.803). La secuencia de cDNA que codifica factor VIII humano y la secuencia de aminoácidos prevista se muestran en las SEQ ID NO. 1 y 2, respectivamente. En la SEQ ID NO. 1, la región codificadora comienza en la posición del nucleótido 208, siendo el triplete GCC el codón para el aminoácido número 1 (Ala) y la proteína madura como se proporciona en la SEQ ID NO. 2.

El factor VIII porcino ha sido aislado a partir de plasma [Fass, D.N. et al. (1982) Blood 59:594]. La secuencia parcial de aminoácidos del factor VIII porcino correspondiente a partes de la secuencia de cadena ligera N terminal que tiene homología con ceruloplasmina y factor V de coagulación fueron descritos por Church et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6934. Toole, J.J. et al. (1984) Nature 312: 342-347 describieron el secuenciado parcial del extremo N terminal de cuatro fragmentos de aminoácidos de factor VIII porcino pero no caracterizaron los fragmentos en cuanto a sus posiciones en la molécula de factor VIII. La secuencia de aminoácidos de los dominios B y parte del A2 del factor VIII porcino fueron expuestos por Toole, J.J. et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci, USA 83:5939-5942. La secuencia de cDNA que codifica el dominio A2 completo del factor VIII porcino y la secuencia de aminoácidos prevista y el factor VIII híbrido humano/porcino que tenía sustituciones para todos los dominios, todas las subunidades y las secuencias especificas de aminoácidos se describen en la patente de EE.UU. 5.364.771 titulada "Hybrid Human/Porcine factor VIII" concedida el 25 de noviembre de 1994 y en el documento WO 93/20093 publicado el 14 de octubre de 1993. La secuencia de cDNA que codifica el dominio A2 del factor VIII porcino correspondiente a los residuos 373-740 en factor VIII humano maduro, como se muestra en la SEQ ID NO. 1, y la secuencia de aminoácidos prevista se muestran en las SEQ ID NO. 3 y 4, respectivamente. Más recientemente, las secuencias de nucleótidos y aminoácidos correspondientes como parte del dominio A1 que carecen de los 198 primeros aminoácidos y el dominio A2 del factor VIII porcino fueron expuestas en el documento WO 94/11503, publicado el 26 de mayo de 1994. El factor VIII porcino que codifica a secuencia de nucleótidos completa, incluido el dominio A1 completo péptido de activación, dominios A3, C1 y C2, así como la secuencia de aminoácidos codificados, fue finalmente obtenido por Lollar, como se describe en la patente de EE.UU. 5.859.204 concedida el 12 de enero de 1999 y en el documento WO97/49725, publicado el 31 de diciembre de 1997. El documento 99/46274 describe factor VIII porcino en el que es suprimido el dominio B completo.

El factor VIII tanto porcino como humano es aislado a partir de plasma en forma de proteína de dos subunidades. Las subunidades, conocidas como la cadena pesada y la cadena ligera son mantenidas conjuntamente mediante un enlace no covalente que requiere calcio u otros iones metálicos divalentes. La cadena pesada de factor VIII contiene tres dominios A1, A2 y B, que están covalentemente conectados. La cadena ligera de factor VIII contiene también tres dominios, denominados A3, C1 y C2. El dominio B no tiene ninguna función biológica conocida y puede ser suprimido o parcialmente suprimido de la molécula de forma proteolítica o mediante procedimientos de tecnología de DNA recombinante sin una alteración significativa de ningún parámetro medible de factor VIII. El factor VIII recombinante humano tiene una estructura y función similares al factor VIII derivado de plasma, aunque no está glicosilado a menos que sea expresado en células de mamíferos.

El factor VIII activado tanto humano como porcino ("factor VIIIa") tiene tres subunidades debido a la escisión de la cadena pesada entre los dominios A1 y A2. Esta estructura es denominada A1/A2/A3-C1-C2. el factor VIIIa humano no es estable bajo las condiciones que estabilizan el factor VIIIa porcino supuestamente debido a la asociación más débil de la subunidad A2 del factor VIIIa humano. La disociación de la subunidad A2 del factor VIIIa humano y porcino está asociada con una pérdida de actividad en la molécula de factor VIIIa. Yakhyaev, A. et al. (1997) Blood 90:Suppl. 1, Abstract Nº 126, describieron la unión del dominio A2 mediante una proteína relacionada con receptores de lipoproteínas de baja densidad, sugiriendo que la absorción celular de A2 mediada por esta unión actúa para infra-regular la actividad del factor VIII.

La expresión de "factor VIII sin dominio B", es mejorada mediante la inclusión de partes del dominio B. La inclusión de esas partes del dominio B denominadas "SQ" [Lind, P. et al. (1995) supra] se expuso que daba lugar a una expresión favorable. Los constructos "SQ" carecen de la totalidad del dominio B humano excepto los 5 aminoácidos del N terminal del dominio B y 9 aminoácidos del C terminal del dominio B.

El factor VIII híbrido purificado o fragmento del mismo puede ser ensayado en cuanto a la inmunorreactividad y actividad de coagulación mediante ensayos estándar que incluyen, por ejemplo, el ensayo de factor VIII exento de plasma el ensayo de coagulación en una etapa y el ensayo inmunoabsorbente conectado a enzimas usando factor VIII humano recombinante purificado como patrón.

Otros vectores, que incluyen vectores virales tanto plásmidos como eucarióticos, pueden ser usados para expresar un constructo de gen recombinante en células eucarióticas dependiendo de la preferencia y el criterio del facultativo experto (véase, por ejemplo, Sambrook et al., Capítulo 16). Pueden ser usados otros vectores y sistemas de expresión, incluidos sistemas de células bacterianas, de levaduras y de insectos, pero no son preferidos debido a diferencias o carencia de glicosilación.

La proteína de factor VIII recombinante puede ser expresada en una diversidad de células comúnmente usadas para la expresión de cultivos y proteínas de mamíferos recombinantes. En particular, se ha encontrado que un cierto número de líneas celulares de roedores son hospedantes especialmente útiles para la expresión de proteínas grandes. Las líneas celulares preferidas disponibles en la entidad American Type Culture Collection, Rockville, MD, incluyen células de cría de hámster y células de ovarios de hámster chino (CHO) que son cultivadas usando procedimientos y medios rutinarios.

La base para la mayor actividad coagulante del factor VIII porcino parece que es la disociación espontánea más rápida de la subunidad A2 human del factor VIIIa humano que la subunidad A2 porcina del factor VIIIa porcino. La disociación de la subunidad A2 conduce a una pérdida de actividad [Lollar, P. et al (1990) J. Biol. Chem. 265: 1688-1692; Lollar, P. et al. (1992) J. Bio. Chem. 267:23652-23657; Fay, P.J. et al. (1992) J. Biol. Chem. 267:13246-13250].

Moléculas de factor VIII con inmunorreactividad reducida

Han sido caracterizados epitopos que son inmunorreactivos con anticuerpos que inhiben la actividad coagulante del factor VIII ("inhibidores" o "anticuerpos inhibidores") basados en relaciones conocidas de estructura-función en el factor VIII. Presumiblemente, los inhibidores podrían actuar interrumpiendo cualquiera de las interacciones macromoleculares asociadas con la estructura de los dominios del factor VIII o sus asociaciones con el factor de von Willebrand, trombina, factor Xa, factor IXa o factor X. Sin embargo, la mayoría de los anticuerpos inhibidores para el factor VIII humano actúan mediante unión a epitopos ubicados en el dominio A2 de 40 kDa o el dominio C2 de 20 kDa del factor VIII, interrumpiendo funciones específicas asociadas con estos dominios, como se describe por Fulcher et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci USA 82:7728-7732; y Scandella et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:6152-6156. Además de los epitopos A2 y C2, puede haber un tercer epitopo en el dominio A3 o C1 de la cadena ligera del factor VIII, según Scandella et al. (1993) Blood 82:1767.1775. El carácter significativo de este tercer epitopo putativo es desconocido, pero parece que supone una fracción menor de la reactividad del epitopo en el factor VIII.

Los anticuerpos anti-A2 bloquean la activación del factor X, como se muestra por Lollar et al. (1994) J. Clin. Invest. 93:2497-2504. Estudios previos de correlación mediante mutagénesis de deleción descritos por Ware et al. (1992) Blood Coagul. Fibrinolysis 3:703-716, ubicaron el epitopo de A2 en la región de 20 kDa del extremo NH_{2}-terminal del dominio A2 de 40 kDa. Unos ensayos inmunorradiométricos de competición han indicado que los inhibidores de A2 reconocen un epitopo común o epitopos estrechamente reunidos, como se describe por Scandella et al. (1992) Throm. Haemostas 67:665-671, y como se demuestra en la patente de EE.UU. 5.859.204.

Las moléculas de factor VIII de animales o de animales modificadas pueden ser ensayadas en seres humanos en cuanto a su antigenicidad y/o inmunogenicidad reducida en ensayos clínicos. En un tipo de ensayo, diseñado para determinar si el factor VIII es inmunorreactivo con anticuerpos inhibidores, se administra factor VIII, preferentemente por infusión intravenosa, a aproximadamente 25 pacientes que tienen deficiencia de factor VIII y que tienen anticuerpos que inhiben la actividad coagulante del factor VIII humano terapéutico. La dosificación del factor VIII de animal o de animal modificado está en un intervalo entre 5 y 50 unidades/kg de peso corporal, preferentemente 10-50 unidades/kg y lo más preferentemente 40 unidades/kg de peso corporal. Aproximadamente 1 hora después de cada administración, se mide la recuperación de factor VIII de muestras de sangre en un ensayo de coagulación en una etapa. Se toman muestras de nuevo aproximadamente 5 horas después de la infusión y se mide la recuperación. La recuperación total y la velocidad de desaparición de factor VIII de las muestras es una predicción del título de anticuerpos y la actividad inhibidora. Si el título de anticuerpos es elevado, la recuperación de factor VIII habitualmente no puede ser medida. Los resultados de la recuperación se comparan con los resultados de recuperación en pacientes tratados con factor VIII humano derivado de plasma, factor VIII humano recombinante, factor VIII porcino derivado de plasma y otras formas terapéuticas comúnmente usadas de factor VIII o sustitutos de factor VIII.

Después de la identificación de epitopos clínicamente significativos, pueden ser expresadas moléculas de factor VIII recombinante que tengan una reactividad cruzada menor o igual en comparación con factor VIII porcino derivado de plasma al ser ensayados con in vitro frente a una amplia gama de plasmas inhibidores. Se puede hacer una mutagénesis adicional en regiones epitópicas para reducir la reactividad cruzada. Una reactividad cruzada reducida, aunque es deseable, no es necesaria para preparar un producto que pueda tener ventajas sobre el concentrado de factor VIII porcino derivado de plasma existente, que puede producir efectos secundarios debido a proteínas porcinas contaminantes o agentes infecciones contaminantes como virus o priones. Un factor VIII porcino recombinante o porcino modificado no contendrá proteínas porcinas ajenas.

Ensayos de diagnóstico

El cDNA de factor VIII y/o la proteína expresada a partir del mismo, en su totalidad o en parte, puede ser usado en ensayos como reactivos de diagnóstico para la detección de anticuerpos inhibidores para factor VIII humano o de animal o factor VIII de animal modificado en sustratos que incluyen, por ejemplo, muestras de suero y fluidos corporales de pacientes humanos con deficiencia de factor VIII. Estos ensayos de anticuerpos incluyen ensayos como los ensayos ELISA, inmunotransferencias, radioinmunoensayos, ensayos de inmunodifusión y ensayo de la actividad biológica del factor VIII (por ejemplo, ensayo de coagulación). Las técnicas para preparar estos reactivos y los procedimientos para su uso son conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, un inmunoensayo para la detección de anticuerpos inhibidores en una muestra de suero de un paciente puede incluir hacer reaccionar la muestra del ensayo con una cantidad suficiente del factor VIII que va a ser ensayado de manera que se forme un complejo detectable con los anticuerpos inhibidores en la muestra del factor VIII del ensayo que es de hecho antígeno.

Se pueden preparar sondas de ácidos nucleicos y aminoácidos basadas en la secuencia del cDNA de factor VIII híbrido o molécula de proteína o fragmentos del mismo. En algunas realizaciones, éstas pueden ser marcadas usando colorantes o marcadores enzimáticos, fluorescentes, quimioluminiscentes o radioactivos que están disponibles en el comercio. Por ejemplo, pueden ser usadas sondas de aminoácidos para seleccionar sueros u otros fluidos corporales en los que se sospecha la presencia de inhibidores para el factor VIII de animal o híbrido humano/animal. Los niveles de inhibidores pueden ser cuantificados en pacientes y comparados con testigos sanos y pueden ser usados, para determinar si un paciente con una deficiencia de factor VIII puede ser tratado con un factor VIII de animal o animal modificado. Las sondas de cDNA pueden ser usadas por ejemplo, para fines de investigación en la selección de bibliotecas de DNA.

Composiciones farmacéuticas

Las composiciones farmacéuticas que contienen factor VIII porcino recombinante o porcino modificado, solo o en combinación con compuestos apropiados de estabilización farmacéutica, vehículos de suministro y/o vehículos portadores, se preparan según procedimientos conocidos, como se describe en Reminton's Pharmaceutical Sciences por E. W. Martín.

Los vehículos portadores o de suministro preferidos para una infusión intravenosa son solución salina fisiológica o solución salina tamponada con fosfato.

Los compuestos de estabilización adecuados, vehículos de suministro y vehículos portadores incluyen, pero sin limitación, otras proteínas humanas o de animales como albúmina.

Las vesículas de fosfolípidos o suspensiones liposomales son también preferidas como vehículos o vehículos de suministro farmacéuticamente aceptables. Éstas se pueden preparar según procedimientos conocidos por los expertos en la técnica y pueden contener, por ejemplo, fosfatidilserina/fosfatidilcolina u otras composiciones o fosfolípidos o detergentes que confieren conjuntamente una carga negativa a la superficie ya que el factor VIII se une a membranas de fosfolípidos con carga negativa. Los liposomas pueden ser preparados disolviendo lípido (S) apropiado (S) (como estearoil-fosfatidil-etanolamina, estearoil-fosfatidil-colina, aracadoil-fosfatidil-colina y colesterol) en un disolvente inorgánico que es seguidamente evaporado, dejando atrás una película fina de lípido seco sobre la superficie del recipiente. Seguidamente se introduce una solución acuosa del factor VIII híbrido en el recipiente. El recipiente es seguidamente agitado a mano para liberar el material de lípido de los lados del recipiente y dispersar los agregados de lípidos, formando así la suspensión liposomal.

El factor VIII porcino recombinante o porcino modificado puede ser combinado con otros compuestos de estabilización adecuados, vehículos de suministros y/o vehículos portadores, incluidos factores de coagulación dependientes de vitamina K, factor de tejidos y factor de von Willebrand (vWf) o fragmento de vWf que contiene el sitio de unión del factor VIII, y polisacáridos como sacarosa.

El factor VIII porcino recombinante o porcino modificado puede ser suministrado también mediante una terapia génica de la misma forma que puede ser suministrado el factor VIII humano usando medios de suministro como vectores retrovirales. Este procedimiento consiste en la incorporación del cDNA de constructo de factor VIII deseado en células humanas que son trasplantadas directamente al paciente deficiente en factor VIII o son colocadas en un dispositivo implantable, permeable a las moléculas de factor VIII pero impermeable a las células, que es seguidamente trasplantado. El procedimiento preferido será la transferencia génica de mediación retroviral. En este procedimiento, un gen exógeno (por ejemplo, un cDNA de factor VIII) es clonado en el genoma de un retrovirus modificado. El gen es insertado en el genoma de la célula hospedante mediante una maquinaria viral en la que será expresado mediante la célula. El vector retroviral es modificado de forma que no producirá el virus evitando la infección viral del hospedante. Los principios generales para este tipo de terapia son conocidos por los expertos en la técnica y son expuestos en la bibliografía [por ejemplo, Kohn, D.B. et al. (1989) Transfusion 29:812-820].

El factor VIII porcino o porcino modificado puede ser almacenado unido a vWf para aumentar la semi-vida y la vida en almacenamiento de la molécula híbrida. Adicionalmente, la liofilización del factor VIII puede mejorar los rendimientos de moléculas activas en presencia de vWf. Los procedimientos actuales para el almacenamiento de factor VIII humano y animal usados por los proveedores comerciales pueden ser empleados para el almacenamiento de factor VIII recombinante. Estos procedimientos incluyen: (1) liofilización de factor VIII en estado parcialmente purificada (como un "concentrado" de factor VIII que es aportado por infusión sin purificación adicional); (2) purificación por inmunoafinidad de factor VIII mediante el procedimiento de Zimmerman y liofilización en presencia de albúmina, que estabiliza el factor VIII; (3) liofilización de factor VIII recombinante en presencia de albúmina.

Adicionalmente, el factor VIII porcino o porcino modificado se ha encontrado que es estable indefinidamente a 4ºC en NaCl 0,6 M, MES 20 mM y CaCl_{2} 5 mM a pH 6,0 y puede ser también almacenado congelado en estos tampones y descongelado con una pérdida mínima de actividad.

Procedimientos de tratamiento

El factor VIII porcino recombinante o porcino modificado es usado para tratar hemorragias incontroladas debidas a una deficiencia de factor VIII (por ejemplo, hemorragia intraarticular, intracraneal o gastrointestinal) en hemofílicos con y sin anticuerpos inhibidores y en pacientes con deficiencia adquirida de factor VIII debida al desarrollo de anticuerpos inhibidores. Los materiales activos son administrados preferentemente por vía intravenosa.

Adicionalmente el factor VIII porcino recombinante o porcino modificado puede ser administrado mediante un trasplante de células tratadas por ingeniería genética para producir la proteína mediante la implantación de un dispositivo que contiene estas células como se describió anteriormente.

Las composiciones farmacéuticas de factor VIII porcino recombinante o porcino modificado solo o en combinación con estabilizadores, vehículos de suministro y/o portadores son aportadas por infusión en pacientes por vía intravenosa según el mismo procedimiento que es usado para la infusión de factor VIII humano o animal.

Las dosificaciones de tratamiento de composición de factor VIII porcino recombinante o porcino modificado que deben ser administradas a un paciente que necesita este tratamiento variarán dependiendo de la gravedad de la deficiencia de factor VIII. Generalmente, el nivel de dosificación es ajustado en frecuencia, duración y unidades para ajustarlo a la gravedad y duración de cada episodio de hemorragia de un paciente. Consecuentemente, el factor VIII es incluido en un vehículo farmacéuticamente aceptable, vehículo de suministro o estabilizador en una cantidad suficiente para suministrar a un paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de la proteína para detener la hemorragia, según se mide mediante ensayos estándar de coagulación.

El factor VIII es clásicamente definido como la sustancia presente en plasma sanguíneo normal que corrige el defecto coagulante en plasma derivado de individuos con hemofilia A. La actividad coagulante in vitro de las formas purificadas y parcialmente purificadas de factor VIII es usada para calcular la dosis de factor VIII para infusiones en pacientes humanos y es un indicador fiable de la actividad recuperada del plasma del paciente y de la corrección del defecto hemorrágico in vivo. No hay discrepancias descritas ente un ensayo estándar de moléculas de factor VIII nuevo in vitro y su comportamiento el modelo de infusión en perros o en pacientes humanos, según Lusher, J.M. et al. 328 New Engl. J. Med. 328:453-459; Pittman, D.D. et al. (1992) Blood 79:389-397; y Brinkhous et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. 82:8752-8755.

Habitualmente, el nivel de actividad deseado de factor VIII en plasma para ser conseguido en el paciente a través de la administración de factor VIII porcino recombinante o porcino modificado está en el intervalo de 30-100% del normal. En un modo preferido de administración del factor VIII terapéutico, la composición es proporcionada por vía intravenosa a una dosificación preferida en el intervalo de aproximadamente 5 a 50 unidades/kg de peso corporal, más preferentemente en un intervalo de 10-50 unidades/kg de peso corporal y lo más preferentemente a una dosificación de 20-40 unidades/kg de peso corporal; la frecuencia de intervalos está en el intervalo de aproximadamente 8 a 24 horas (en hemofílicos gravemente afectados); y la duración del tratamiento en días está en el intervalo de 1 a 10 días o hasta que se resuelva el episodio hemorrágico. Véase, por ejemplo, Roberts, H:R: y M.R. Jones, "Hempophilia and Conditions - Congenital Deficiences of Prothrombin (Factor II, Factor V, and Factors VII to XII)", capítulo 153, 1453-1474, 1460 en Hematology, Williams, W.J. et al., ed. (1990). Los pacientes con inhibidores pueden requerir una cantidad diferente de factor VIII porcino recombinante o porcino modificado respecto a su forma previa de factor VIII. Por ejemplo, los pacientes pueden requerir menos factor VIII porcino recombinante o porcino modificado debido a su actividad específica superior respecto al factor VIII humano y su reactividad de anticuerpos disminuida. Como en el tratamiento con factor VIII humano o porcino derivado de plasma la cantidad de factor VIII terapéutico aportada por infusión está definida por el ensayo de coagulación de factor VIII en una etapa y, en casos seleccionados, la recuperación in vivo se determina midiendo el factor VIII en el plasma del paciente después de la infusión. Debe entenderse que para cualquier sujeto particular, los regímenes específicos de dosificación deben ser ajustados en el tiempo según la necesidad del individuo y el criterio profesional de la persona que administra o supervisa la administración de las composiciones, y que los intervalos de concentraciones expuestos en la presente memoria descriptiva son solamente ilustrativos y no están destinados a limitar el alcance o la práctica de la composición reivindicada.

El tratamiento puede adoptar la forma de una administración intravenosa única de la composición o una administración periódica o continua durante un período de tiempo prolongado en la medida necesaria. Alternativamente, el factor VIII terapéutico puede ser administrado por vía subcutánea o por vía oral con liposomas en una o varias dosis a intervalos variables de tiempo.

El factor VIII porcino recombinante o porcino modificado puede ser usado también para tratar una hemorragia incontrolada debido a una deficiencia de factor VIII en hemofílicos que han desarrollado anticuerpos para el factor VIII humano. En este caso, no es necesaria la actividad coagulante que es superior a la de factor VIII humano o animal solo. La actividad coagulante que es inferior a la de factor VIII humano (es decir, menos de 3.000 unidades/mg) será útil si la actividad no es neutralizada por anticuerpos en el plasma del paciente.

Se ha demostrado en la presente invención que los factores VIII porcinos recombinantes y porcinos modificados pueden diferir en actividad específica del factor VIII humano. Las proteínas del factor VIII que tienen una actividad pro-coagulante mayor que el factor VIII humano son útiles en el tratamiento de la hemofilia porque se requieren dosificaciones inferiores para corregir una deficiencia de factor VIII de un paciente. Los factores VIII que tienen una actividad pro-coagulante inferior al factor VIII humano son adecuados también para un uso terapéutico con la condición de que tengan al menos un 1% de actividad específica en comparación con el factor VIII humano normal. Por lo tanto, un factor VIII de la presente invención que tiene una actividad pro-coagulante se define por tener al menos un 1% de la actividad específica del factor VIII humano.

La molécula de factor VIII porcino recombinante o porcino modificado y los procedimientos para su aislamiento, caracterización, preparación y uso que se describieron anteriormente con anterioridad se comprenderán adicionalmente mediante una referencia a los siguientes ejemplos no limitativos.

Ejemplo 1 Ensayo de factor VIII porcino y factor VIII híbrido humano/porcino

El factor VIII porcino tiene más actividad coagulante que el factor VIII humano, basada en la actividad específica de la molécula. Esta conclusión está basada en el uso de curvas patrón apropiadas que permiten una comparación ajustada del factor VIII humano o porcino. Los ensayos de coagulación están basados en la capacidad del factor VIII para acortar el tiempo de coagulación del plasma derivado de un paciente con hemofilia A. Se emplearon dos tipos de ensayo: el ensayo en una etapa y el ensayo en dos etapas.

En el ensayo en una etapa se incubaron 0,1 ml de plasma de hemofilia A (George King Bimedical, Inc.) con 0,1 ml de reactivo de tromboplastina parcialmente activado (APTT) (Organon Teknika)y 0,01 ml de muestra o patrón, que consistía en plasma humano normal citrado y diluido, durante 5 minutos a 37ºC en un baño de agua. La incubación estuvo seguida de la adición de 0,1 ml de CaCl_{2} 20 mM y se determinó el tiempo de desarrollo de un coagulo de fibrina mediante inspección visual.

Una unidad de factor VIII se define como la cantidad presente en 1 ml de plasma humano normal citrado. Con plasma humano como patrón, la actividad del factor VIII porcino y humano se comparó directamente. Se prepararon diluciones del patrón de plasma o proteínas purificadas en NaCl 0,15 M, HEPES 0,02 M, pH 7,4. La curva patrón se construyó basada en 3 o 4 diluciones de plasma, siendo la dilución más elevada 1/50 y en el tiempo de log_{10} de coagulación representado gráficamente frente a la concentración de log_{10} plasma, que da lugar a una representación gráfica lineal. Las unidades de factor VIII en una muestra desconocida se determinaron mediante una interpolación a partir de la curva patrón.

El ensayo en una etapa se basa en la activación endógena del factor VIII por los activadores formados en el plasma de hemofilia A, mientras que el ensayo de dos etapas mide la actividad pro-coagulante de un factor VIII previamente activado. En el ensayo en dos etapas, se añadieron muestras que contenían factor VIII que se había hecho reaccionar con trombina a una mezcla de tromboplastina parcialmente activada y plasma de hemofilia A humano que había sido preincubado durante 5 minutos a 37ºC. Los tiempos de coagulación resultantes se convirtieron seguidamente en unidades/ml, basadas en la misma curva patrón humana anteriormente descrita. La actividad relativa en el ensayo en dos etapas fue superior que en el ensayo en una etapa porque el factor VIII había sido previamente activado.

Ejemplo 2 Caracterización de la diferencia funcional entre factor VIII humano y porcino

El aislamiento de factor VIII porcino y derivado de plasma humano y factor VIII recombinante humano ha sido descrito en la bibliografía por Fulcher, C. A. et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 1648-1652; Toole et al. (1984) Nature 312: 342-347 (Genetics Institute); Gitschier et al. (1984) Nature 312: 326-330 (Genentech); Wood et al. (1984) Nature 312: 330337 (Genentech); Vehar et al. 312 Nature 312: 337-342 (Genentech); Fass et al. (1982) Blood 59: 594; Toole et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 5939-5942. Esto se puede realizar de varias formas. Todas estas preparaciones son similares en la composición de subunidades, aunque hay una diferencia funcional de estabilidad entre el factor VIII humano y porcino.

Para la comparación de factor VIII recombinante humano y porcino, las preparaciones de factor VIII recombinante humano altamente purificado (Cutter Laboratories, Berkeley, CA) y factor VIII porcino [inmunopurifiocado como se describe por Fass et al. (1982) Blood 59: 594] Se sometieron a cromatografía líquida a presión elevada (HPLC)en una columna de intercambio aniónico Mono Q® (Pharmacia-LKB, Piscataway, NJ) (Pharmacia, Inc.). Los fines de la etapa de HPLC con Mono Q® fueron la eliminación de impurezas menores de intercambio de factor VIII humano y porcino en un tampón común para fines comparativos. Vales que contenían 1000-2000 unidades de factor VIII fueron reconstituidos con 5 ml de H_{2}O. Seguidamente se añadió Hepes (2 M a pH 7,4) hasta una concentración final de 0,02 M. El factor VIII fue aplicado a una columna Mono Q® HR 5/5 equilibrada en NaCl 0,15 M Hepes 0,02 M, CaCl_{2} 5 mM a pH 7,4 (tampón A + NaCl 0,15 M); se lavó con 10 ml de tampón A + NaCl 0,15 M y se eluyó con un gradiente lineal, NaCl de 0,15 M a 0,90 M en tampón A a un caudal de 1 ml/minuto.

Para la comparación de factor VIII derivado de plasma humano (purificado mediante HPLC con Mono Q®) y factor VIII porcino, purificado por inmunoafinidad, el factor VIII porcino derivado de plasma se diluyó 1:4 con Hepes 0,04 M, CaCl_{2} 5 mM, 0,01% de Tween-80, a pH 7,4 y se sometió a HPLC con Mono Q® bajo las mismas condiciones descritas en el párrafo anterior para factor VIII humano. Estos procedimientos para el aislamiento de factor VIII humano y porcino son patrones para los expertos en la técnica.

Las fracciones de la columna fueron ensayadas en cuanto a la actividad de factor VIII mediante un ensayo de coagulación en una etapa. Los resultados medios de los ensayos, expresados en unidades de actividad por A_{280} de material se proporcionan en la Tabla II e indican que el factor VIII porcino tiene una actividad al menos seis veces mayor que el factor VIII humano cuando se usa el ensayo en una etapa.

TABLA II

2

Ejemplo 3 Comparación de la estabilidad de factor VIII humano y porcino

Los resultados del ensayo en una etapa para el factor VIII reflejan la activación de factor VIII en factor VIIIa en la muestra y la posibilidad de pérdida de actividad del factor VIIIa formado. Se hizo una comparación directa de la estabilidad del factor VIII humano y porcino. Las muestras HPLC en Mono Q® (Pharmacia, Inc., Piscataway, N. J.) se diluyeron a la misma concentración y composición de tampón y se hicieron reaccionar con trombina. A diversos valores del tiempo, se retiraron muestras para el ensayo de coagulación en dos etapas. Normalmente, la actividad pico (a los dos minutos) era 10 veces mayor para el factor VIIIa porcino que para el humano y las actividades del factor VIIIa tanto porcino como humano disminuyeron posteriormente con una disminución más rápida de la actividad del factor VIIIa humano.

Generalmente, los intentos de aislar factor VIIIa humano estable no son satisfactorios incluso cuando se usan condiciones que producen el factor VIIIa porcino estable. Para demostrar esto, el factor VIII humano purificado por HPLC en Mono Q® se activó con trombina y se sometió a intercambio catiónico en Mono S® (Pharmacia, Inc.). Y se sometieron a HPLC de intercambio catiónico con Mono S® (Pharmacia, Inc.)bajo condiciones que producen factor VIRA porcino estable como se describe por Lollar et al. (1989) Biochemistry 28:666.

El factor VIII humano, 43 \mu/ml (0,2 \muM) NaCl 0,2 M, Hepes 0,01 M CaCl_{2} 2,5 mM a pH 7,4, en un volumen total de 10 ml, se hizo reaccionar con trombina (0,036 \muM) durante 10 minutos, momento en el que se añadió FPR-CH_{2}CI D-fenil-prolil-arginil-clorometil-cetona hasta una concentración de 0,2 \muM para la inactivación irreversible de la trombina. La mezcla se diluyó seguidamente 1:1 con ácido 2-(N-morfolino)-etano-sulfónico (MES) 40 mM, CaCl_{2} 5 mM a pH 6,0, y se introdujo a 2 ml/minuto en una columna de HPLC Mono S® HR 5/5 (Pharmacia, Inc.) equilibrada en MES 5 mM, CaCl_{2} 5 mM, a pH 6,0 (tampón B) más NaCl 0,1 M. El factor VIIIa se eluyó sin lavar la columna con un gradiente de 20 ml de NaCl 0,1 M a NaCl 0,9 M en tampón B a 1 ml/minuto.

La fracción con actividad coagulante en el ensayo en dos etapas eluyó como un pico único bajo estas condiciones. La actividad específica de la fracción del pico era de aproximadamente 7.500 U/A_{280}. Una electroforesis sobre gel de dodecil-sulfato de sodio-poliacrilamida (SDS-PAGE) del pico de factor VIIIa en Mono S®, seguida de teñido con plata de la proteína, puso de manifiesto dos bandas correspondientes a un derivado heterodímero (A3-C1-C2/A1) de factor VIII. Aunque el fragmento A2 no fue identificado mediante teñido con plata bajo estas condiciones debido a su baja concentración, fue identificado como un constituyente residual mediante marcado con ^{125}I.

En contraste con los resultados con factor VIII humano, el factor VIIIa porcino aislado mediante HPLC con Mono S® bajo las mismas condiciones tenía una actividad específica de 1,6 x 10^{6} U/A_{280}. Un análisis del factor VIIIa porcino mediante SDS-PAGE puso de manifiesto tres fragmentos correspondiente a subunidades A1, A2 y A3-C1-C2, demostrando que el factor VIIIa porcino posee tres subunidades.

Los resultados de HPLC con Mono S® de preparaciones de factor VIII activado con trombina humana a pH 6,0 indican que el factor VIIIa humano es lábil bajo condiciones que producen factor VIIIa porcino estable. Sin embargo, aunque fueron identificadas cantidades residuales de fragmento A2 en la fracción pico, la determinación de si la actividad coagulante resultaba de cantidades pequeñas de factor VIIIa heterotrímero o de factor VIIIa heterodímero que tiene una baja actividad específica, no fue posible a partir de este procedimiento solo.

Es deseable una forma de aislar factor VIIIa humano antes de que pierda la subunidad A2 para resolver esta cuestión. Con esta finalidad, se realizó el aislamiento en un procedimiento que incluye la reducción del pH de los tampones de Mono S® a pH 5. Se diluyó factor VIII humano purificado con Mono R® (0,5 mg) con H_{2}O para proporcionar una composición final de 0,25 mg/ml (1\mum) de factor VIII en NaCl 0,25 M, Hepes 0,01 M, CaCl_{2} 2,5 mM, 0,005% de Tween-80, a pH 7,4 (volumen total 7,0 ml). Se añadió trombina hasta una concentración final de 0,072 \muM y se dejó reaccionar durante 3 minutos. La trombina fue seguidamente inactivada con FPR-CH_{2}Cl (0,2 \muM). La mezcla se diluyó seguidamente 1:1 con acetato de sodio 40 mM, CaCl_{2} 5 mM, 0,01% de Tween-80, a pH 5,0, y se introdujo a dos ml/minuto en una columna de HPLC Mono R® HR 5/5 equilibrada en acetato de sodio 0,01 M, CaCl_{2} 5 mM, 0,01% de Tween-80, a pH 5,0, más NaCl 0,1 M. Se eluyó factor VIIIa sin lavado en columna con un gradiente de 20 ml de NaCl 0,1 M a NaCl 1,0 M en el mismo tampón a 1 ml/minuto. Esto dio lugar a la recuperación de la actividad coagulante en un pico que contenía cantidades detectables del fragmento A2 como se mostró mediante SDS-PAGE y teñido con plata. La actividad específica de la fracción del pico fue diez veces mayor que la recuperada a pH 6,0 (75.000 U/A_{280} frente a 7.500 U/A_{280}). Sin embargo, en contraste con el factor VIIIa porcino aislado a pH 6,0 que era indefinidamente estable a 4ºC, la actividad del factor VIIIa humano disminuyó de forma estacionaria durante un período de varias horas después de una elución a partir de Mono S®. Adicionalmente, la actividad específica de factor VIIIa purificado a pH 5,0 y ensayado inmediatamente es solamente un 5% de la del factor VIIIa porcino, indicando que se produjo una disociación sustancial antes del ensayo.

Estos resultados demuestran que el factor VIIIa tanto humano como porcino está compuesto por tres subunidades (A1, A2 y A3-C1-C2). La disociación de la subunidad A2 es responsable de la pérdida de actividad del factor VIIIa tanto humano como porcino en ciertas condiciones, como resistencia iónica fisiológica, pH y concentración. La estabilidad relativa del factor VIIIa porcino bajo ciertas condiciones es debida a la asociación más fuerte de la subunidad A2.

Ejemplo 4 Aislamiento y secuenciado de DNA que codifica el dominio A2 de factor VIII porcino

Solamente la secuencia de nucleótidos que codifica el domino B y parte del dominio A2 del factor VIII porcino ha sido previamente secuenciada [Toole et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 5939-5942]. El cDNA y las secuencias de aminoácidos previstas (SEQ ID NO. 3 y 4, respectivamente) para el dominio A2 completo de factor VIII porcino se describen en la presente memoria descriptiva.

El dominio A2 del factor VIII porcino fue clonado mediante trascripción inversa de RNA total de bazo porcino y amplificación por PCR; se usaron cebadores degenerados en la secuencia de cDNA de factor VIII humano conocido y un cebador porcino exacto basado en una parte de la secuencia de factor VIII porcino. Se aisló un producto por PCR de 1 kb y se amplificó mediante inserción en un vector fagémido Bluescript® (Stratagene).

El dominio A2 porcino fue completamente secuenciado mediante didesoxi-secuenciado. El cDNA y las secuencias de aminoácidos previstas son como se describe en las SEQ ID NO. 3 y 4, respectivamente.

Ejemplo 5 Secuencia completa de DNA que codifica factor VIII porcino

El fragmento Klenow conectores CIAI fosforilados, conectores NOTL, T4 ligasa y Taq DNA polimerasa fueron adquiridos a la empresa Promega (Madison, Wisconsin). La polinucleótido quinasa fue adquirida a la empresa Life Technologies, Inc., Gaithersburg, Maryland. La \gamma^{32}P-ATP (Redivue, > 5000Ci/mmol) fue adquirida a la empresa Amersham. Se adquirieron células pBluescript II KS epicúreas XL1-Blue de E. coli a la empresa Stratagene (La Jolla, California). Se adquirieron oligonucleótidos sintéticos a la empresa Life Technologies, Inc. o Cruachem, Inc. y se usaron cebadores 5'-fosforilados cuando se produjeron productos por PCR para fines de clonación. La numeración de nucleótidos (nt) de los oligonucleótidos usados como cebadores para la amplificación mediante reacción de cadena de polimerasa (PCR) de cDNA de fVIII porcino o DNA genómico usa el cDNA de fVIII humano como referencia (Wood et al. (1984) supra).

Se aisló RNA total de bazo porcino mediante extracción con tiocianato de guanidinio ácido-fenol-cloroformo [Chomczynski et al. (1987) Anal. Biochem. 162: 156-159]. Se preparó cDNA a partir de RNA de bazo total usando transcriptasa inversa (RT) de virus de leucemia de los múridos Moloney y hexámeros al azar para cebar la reacción (estuche de ensayo First-Strand cDNA Synthesis, Pharmacia Biotech) salvo que se indique otra cosa. Las reacciones de RT contenían Tris-Cl 45 mM pH 8,3 KCl 68 mM DTT 1% mM, MgCl_{2} 9 mM, 0,08 mg/ml del albumina de suero bovino y desoxinucleótido trifosfato 1,8 mM (dNTP). Se aisló DNA genómico porcino a partir de bazo usando un procedimiento estándar (Strauss, W. M. (1995) en la publicación Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel et al., editors, John Wiley & Sons, pag. 2.2.1-2.2.3). El aislamiento de DNA de geles de agarosa se hizo usando un estuche de ensayo Geneclean II (Bio 101) o Quiex II Gel Extraction (Qiagen).

Las reacciones de PCR se hicieron usando un termociclador Hybaid OmniGene. Para las reacciones de PCR que empleaban Taq DNA polimerasa, las reacciones incluían MgCl_{2} 0,6 mM, dNTPs 0,2 mM, cebadores de oligonucleótidos 0,5 \muM, 50 U/ml de polimerasa y 0,1 volumen de la mezcla de reacción de cDNA de la primera cadena. Excepto cuando se indique otra cosa, los productos de PCR fueron purificados sobre gel, rematados en los grupos terminales con fragmento Klenow, precipitados con etanol y ligados al sitio EcoRV de pBluescript II KS desfosforilado o ligados con conectores CIaI fosforilados usando ligasa T4, digeridos con CIaI, purificados mediante cromatografía en Sephacryl S400 y ligados a corte de CIaI, pBluescript II KS desfósforilado. Las ligaduras se hicieron usando T4 DNA ligasa (estuche de ensayo de ligadura de DNA Rapid, Boehringer Mannheim) excepto cuando se indicara otra cosa. Se usaron plásmidos pBluescript II ks que contenían inserciones para transformar células epicúreas XL1-Blue de E.coli.

El secuenciado de DNA de plásmido se hizo usando un secuenciador de DNA automatizado Applied Biosystems 373a y el estuche de ensayo PRISM dye terminator o manualmente usando un estuche de ensayo de secuenciado Sequenase v. 2.0 (Amersham Corporation). El secuenciado directo de los productos de PCR, incluido el marcado terminal con ^{32}P de oligonucleótidos se hizo usando un protocolo de secuenciado cíclico (dsDNA Cycle Sequencing System, Life Technologies).

Aislamiento de clones de cDNA de fVIII porcino que contenían secuencia de 5'-UTR, péptido de señal y codones del dominio A1

El cDNA de fVIII porcino en 5' respecto al dominio A2 fue amplificado mediante RTPCR anidada de RNA total de bazo de cerdo hembra usando un protocolo de amplificación rápida en 5' de extremos de cDNA (5'-RACE) (amplificación de cDNA Marathon, Clontech, Versión PR55453). Éste incluía la síntesis de cDNA de la primera cadena usando un cebador de oligo (dT) de acoplamiento-ensamblaje [Borson, N. D. et al. (1992) PCR Methods Appl. 4-148], una síntesis de cDNA de la segunda cadena usando DNA polimerasa I de E.coli y ligadura con un adaptador de cadena doble extendida en 5', SEQ ID NO. 5.

3

cuya cadena corta estaba bloqueada en el extremo 3' con un grupo amino para reducir la cebadura PCR no específica que era complementaria respecto a los nucleótidos en el extremo 3' (Siebert, P. D., et al. (1995) Nucleic. Acids. Res. 23: 1087-1088). La primera tanda de PCR se hizo usando un oligonucleótido específico adaptador, SEQ ID NO. 6 5'-CCA TCC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC- 3' (denominado AP1) como cebador sentido y un oligonucleótido específico del dominio A2 de FVIII porcino SEQ ID NO. 7 5'-CCA TTG ACA TGA AGA CCG TTT CTC-3' (nt 2081-2104) como cebador antisentido. La segunda de PCR se hizo usando un oligonucleótido específico adaptador anidado, SEQ ID NO. 8 5'-ACT CAC TAT AGG GCT CGA GCG GC-3' (denominado AP2) como cebador sentido y un oligonucleótido específico del dominio A2 porcino anidado SEQ ID NO. 9 5'-GGG TGC AAA GCG CTG ACA TCA GTG-3' (nt 1497-1520) como cebador antisentido. La PCR se llevó a cabo usando un estuche de ensayo comercial (estuche de ensayo de núcleo de PCR de cDNA Advantage) que emplea un protocolo de inicio en caliente mediado por anticuerpos [Kellogg, D. E. et al. (1994) BioTechniques 16: 1134-1137]. Las condiciones de PCR incluían una desnaturalización a 94ºC durante 60 segundos, seguido de 30 ciclos (primera PCR) o 25 ciclos (segunda PCR) de desnaturalización durante 30 segundos a 94ºC, reasociación durante 30 segundos a 60ºC y alargamiento durante 4 minutos a 68ºC usando un control de temperatura del tubo. Este procedimiento proporcionó un producto de \approx 1,6 kb que era congruente con la amplificación de un fragmento que se extiende aproximadamente en 150 bp en el 5'-UTR. El producto de PCR fue clonado en pBluescript usando conectores de CIaI. Los insertos de cuatro clones fueron secuenciados en ambas direcciones.

La secuencia de estos clones incluía regiones correspondientes a los 137 bp del 5'-UTR, el péptido de señal, el dominio A1 y parte del dominio A2. Se alcanzó un consenso en al menos 3 de 4 sitios. Sin embargo, los clones contenían una media de 4 mutaciones aparentes generadas por PCR, presumiblemente debidas a las múltiples tantas de PCR requeridas para generar un producto clonable. Por lo tanto, se usó una secuencia obtenida a partir de la región del péptido de señal para diseñar un cebador de PCR fósforilado de cadena de sentido, SEQ ID NO. 10 5'-CCT CTC GAG CCA CCA TGT CGA GCC ACC ATG CAG CTA GAG CTC TCC ACC TG-3', denominado RENEOPIGSP, para la síntesis de otro producto de PCR para confirmar la secuencia y para clonar en un vector de expresión. La secuencia en negrita representa el codón de partida. La secuencia 5' respecto a ésta representa una secuencia igual a la de 5' del sitio de inserción en el vector de expresión de mamífero ReNeo usado para la expresión de f VIII (Lubin et al. (1994) supra). Este sitio incluye un sitio de escisión Xho 1 (subrayado). RENEOPIGSP y los nt oligonucleótidos 1497-1520 se usaron para cebar una reacción de PCR mediada por Taq DNA polimerasa usando cDNA de bazo porcino hembra como plantilla. Las DNA polimerasas de otros diversos fabricantes no consiguieron producir un producto detectable. Las condiciones de PCR incluían una desnaturalización a 94ºC durante cuatro minutos, seguida de 35 ciclos de desnaturalización durante 1 minuto a 94ºC, reasociación durante 2 minutos a 55ºC y alargamiento durante 2 minutos a 72ºC, seguido de una etapa de alargamiento final durante 5 minutos a 72ºC. El producto de PCR fue clonado en Pbluescript usando conectores de CIaI. Los insertos de dos de estos clones fueron secuenciados en ambas direcciones y acoplados a la secuencia de consenso.

Aislamiento de clones de cDNA de fVIII porcino que contienen codones de los dominios A3, C1 y la mitad en 5' de los C2

Inicialmente, se clonaron dos productos de RT-PCR de bazo porcino correspondientes a un fragmento del dominio B-A3 (nt 4519-5571) y un fragmento del dominio C1-C2 (nt 6495-6990). El extremo en 3' del dominio C2 que se obtuvo se extendió en la región del exon 26, que es el exon terminal en fVIII. El producto de B-A3 se preparó usando un cebador de dominio B específico porcino, SEQ ID NO. 11 5' CGC GCG GCC GCG CAT CTG GCA AAG CTG AGT T 3', en el que la región subrayada corresponde a una región en fVIII porcino que se alinea con los nt 4519-4530 en fVIII humano. La región en 5' del oligonucleótido incluye un sitio NotI que estaba originalmente destinado a fines de clonación. El cebador antisentido usado para generar el producto B-A3, SEQ ID NO. 12 5'-GAA ATA AGC CCA GGC TTT GCA GTC RAA-3' estaba basado en el complemento inverso de la secuencia de cDNA de fVIII humano en los nt 5545-5571. La reacción de PCR contenía KCl 50 mM, Tris-Cl a0 mM, pH 9,0, 0,1% de tritón X-100, MgCl_{2} 1,1 mM, dNTPs 2,5 mM, cebadores 20 \muM, 25 unidades/ml de Taq DNA polimerasa y 1/20 volumen de mezcla de reacción de RT. Las condiciones de la PCR fueron una desnaturalización a 94ºC durante 3 minutos, seguida de 30 ciclos de desnaturalización durante 1 minuto a 94ºC, reasociación durante 2 minutos a 50ºC y alargamiento durante 2 minutos a 72ºC. Los productos PCR fueron fosforilados usando T4 DNA quinasa y se añadieron conectores de NotI. Después de cortar con NotI, los fragmentos de PCR fueron clonados en el sitio de NotI de Bluescript II KS y transformados en células XL1-Blue.

El producto de C1-C2 se preparó usando la secuencia de cDNA humano conocida para sintetizar cebadores sentido y antisentido, SEQ ID NO. 13 5'-AGG AAA TTC CAC TGG AAC CTT N-3' (nt 6405-6426) y SEQ ID NO. 14 5'-CTG GGG GTG AAT TCG AAG GTA GCG N-3' (complemento inverso de nt 6966-6990), respectivamente. Las condiciones de PCR fueron iguales a las usadas para generar el producto B-A2. El fragmento resultante fue ligado al vector de clonación pNOT usando el sistema de clonación Prime PCR Cloner Cloning System (5 Prime-3 Prime, Inc., Boulder, Colorado) y se hicieron crecer en células JM109.

Los plásmidos B-A3 y C1-C2 fueron parcialmente secuenciados para preparar los oligonucleótidos de sentido y antisentido específicos porcinos, SEQ ID NO. 15 15 5'-GAG TTC ATC GGG AAG ACC TGT TG-3' (nt 4551-4573) y SEQ ID NO. 16 5'-ACA GCC CAT CAA CTC CAT GCG AAG-3' (nt 6541-6564), respectivamente. Estos oligonucleótidos fueron usados como cebadores para generar un producto de RT-PCR de 2013 bp usando un estuche de ensayo de cDNA PCR Clontech Advantage. Este producto, que corresponde a los nt 4551-6564 humanos, incluye la región correspondiente al péptido de activación de cadena ligera (nt 5002-5124), dominio A3 (nt 5125-6114) y la mayor parte del dominio C1 (nt 6115-6573). La secuencia del clon C1-C2 había establecido que los cDNA humano y porcino de los nt 6565 para el extremo en 3' del dominio C1 eran iguales. El producto de PCR fue clonado en el sitio EcoRV de pBluescript II KS-. Fueron completamente secuenciados cuatro clones en las dos direcciones. Se alcanzó un consenso en al menos 3 de 4 sitios.

Aislamiento de clones de cDNA de fVIII porcino que contienen la mitad en 3' de los codones del dominio C2

El dominio C2 de fVIII humano (nucleótidos 6574-7053) está contenido en los exones 24-26 [Gitschier J. et al. (1984) Nature 312: 326-330]. El exon 26 humano contiene 1958 bp, correspondiente a los nucleótidos 6901.8858. Incluye 1478 bp de la secuencia sin traducir en 3'. Los intentos de clonar el cDNA del exon 26 correspondiente al extremo en 3' del dominio C2 y el 3'-UTR mediante 3' RACE [Siebert et al. (1995) supra], Ochman, H. et al. (1990) Biotechnology (N. Y). 8: 759-760], PCR del sitio de restricción [Sarkar, G. et al. (1993) PCR Meth. Appl. 2: 318-322], PCR "impredeciblemente cebada" [Dominguez, O. et al. (1994) Nucleic. Acids Res. 22: 3247-3248] y mediante selección de una biblioteca de cDNA de hígado porcino fallaron. Se intentó una RACE en 3' usando la misma biblioteca de cDNA de cadena doble ligada a un adaptador que fue usada para usar satisfactoriamente el clon en el extremo en 5' del cDNA de fVIII porcino. Por tanto, El fallo de este procedimiento no era debido a la ausencia de cDNA correspondiente al exon 26.

Se usó un procedimiento de PCR de desplazamiento génico dirigido a diana [Parker, J. D. et al. (1991) Nucleic. Acids. Res. 19: 3055-3060] para clonar la mitad en 3' del dominio C2. Se sintetizó un cebador sentido específico porcino, SEQ ID NO. 17 5'- TCAGGGCAATCAGGACTCC-3' (nt 6904-6924) basado en la secuencia del dominio C2 inicial y se usó en una reacción de PCR con cebadores "de desplazamiento" no específicos seleccionados entre oligonucleótidos disponibles en el laboratorio. Los productos de PCR se dirigieron seguidamente a diana mediante análisis de extensión de cebadores [Parker et al. (1991) BioTechniques 10: 94-101] usando un cebador interno específico porcino marcado en el extremo con ^{32}P, SEQ ID NO. 18 5'-CCGTGGTGAACGCTCTGGACC-3' (nt 6932-6952). De forma interesante, de los 40 cebadores no específicos ensayados, solamente dos produjeron productos positivos en el análisis de extensión de cebadores y estos dos correspondían a una secuencia humana exacta y degenerada en el extremo en 3' del dominio C2: SEQ ID NO. 19 5'-GTAGAGGTCCTGTGCCTCGCAGCC-3' (nt 7030-7053) y SEQ ID NO. 20 5'-GTAGAGSTSCTGKGCCTCRCAKCCYAG-3' (nt 7027-7053). Estos cebadores habían sido inicialmente diseñados para proporcionar un producto mediante RT-PCR convencional pero no consiguieron producir suficiente producto para que pudiera ser visualizado mediante unión a colorante de bromuro de etidio. Sin embargo, pudo ser identificado un producto de PCR mediante un procedimiento de extensión de cebadores más sensible. Este producto fue purificado sobre gel y directamente secuenciado. Éste extendió la secuencia de fVIII porcino 3' hasta nt 7026.

Se obtuvo una secuencia adicional mediante un análisis de extensión de cebadores de un producto de PCR anidado generado mediante el uso de la biblioteca de cDNA de cadena doble ligada a adaptador usada en el protocolo 5'-RACE previamente descrito. La reacción de la primera tanda usó el cebador exacto porcino SEQ ID NO. 21 5'-CTTCGCATGGAGTTGATGGGCTGT-3' (nt 6541-6564) y el cebador AP1. La reacción de la segunda tanda usó SEQ ID NO. 22 5'-AATCAGGACTCCTCCACCCCCG-3' (nt 6913-6934) y el cebador AP2. El secuenciado por PCR directo extendió la secuencia 3' hasta el extremo del dominio C2 (nt 7053). La secuencia del dominio C2 era única excepto en el nt 7045 cercano al extremo 3' del dominio C2. Un análisis de las reacciones de PCR repetidas produjo A, G o una lectura doble de A/G en este sitio.

El secuenciado se extendió en el 3'-UTR usando dos cebadores adicionales, SEQ ID NO. 23 5'-GGA TCC ACC CCA CGA GCT GG-3' (nt 6977-6996) y SEQ ID NO. 24 5'-CGC CCT GAG GCT CGA GGT TCT AGG-3' (nt 7008-7031). Se obtuvieron aproximadamente 15 bp de 3'-UTR, aunque la secuencia no estaba clara en diversos sitios. Seguidamente se sintetizaron varios cebadores antisentido basados en las mejores estimaciones de la secuencia sin traducir en 3'. Estos cebadores incluían el complemento inverso del codon de detención de TGA en sus terminaciones en 3'. Se obtuvieron productos de PCR a partir de DNA genómico de bazo porcino y cDNA de bazo porcino que fueron visualizados mediante electroforesis sobre gel de agarosa y teñido con bromuro de etidio usando un cebador sentido específico SEQ ID NO. 25 5'-AAT CAG GAC TCC TCC ACC CCC G-3' (nt 6913-6934) y el cebador antisentido de 3'-UTR, SEQ ID NO. 26 5'-CCTTGCAGGAATTCGATTCA-3'. Para obtener cantidades suficientes del material para fines de clonación, se hizo una segunda ronda de PCR usando un cebador sentido anidado, SEQ ID NO. 27 5'-CCGTGGTGAACGCTCTGGACC-3' (nt 6932-6952) y el mismo cebador antisentido. El producto de PCR de 141 bp fue clonado en un corte en EcoRV de pBluescript II KS-. Se obtuvo la secuencia de tres clones derivados de DNA genómico y tres clones derivados de cDNA en las dos direcciones. La secuencia era ambigua excepto en el nt 7045, en el que el DNA genómico era siempre A y el cDNA era siempre G.

Alineaciones de secuencias múltiples de DNA de fVIII humano, porcino y de ratón (Fig. 1A-1H)

Las alineaciones del péptido de señal y las regiones A1, A2, A3, C1 y C2 se hicieron usando el programa CLUSTALW [Thompson, J. D. et al. (1994) Nucleic. Acids. Res. 22: 4673-4680]. Las penalizaciones de abertura de huecos y extensión de huecos eran 10 y 0,05, respectivamente. Las alineaciones de los dominios B humanos, de ratón y de cerdo han sido descritas previamente [Elder et al. (1993) supra]. La secuencia A2 humana corresponde a los aminoácidos 373-740 en SEQ ID NO. 2. La secuencia de aminoácidos A2 porcina se proporciona en SEQ ID NO. 4 y la secuencia de aminoácidos del dominio A2 de ratón se proporciona en SEQ ID NO. 28, aminoácidos 392-759.

Ejemplo 6 Expresión de factor VIII activo, recombinante y sin dominio B (PB^{-}) Materiales

Se adquirieron plasmas humanos reunidos de hemofilia A citrado y normal a la empresa George King Biomedical, Inc. Se adquirieron suero bovino fetal, geneticina, penicilina, estreptomicina, medio DMEM/F12 y medio AIM-V a la empresa Life Technologies, Inc. Se adquirió Taq DNA polimerasa de la empresa Promega. Se adquirió Vent DNA polimerasa a la empresa New England Biolabs. Se adquirieron Pfu DNA polimerasa y el fagénido pBluescript II KS- a la empresa Stratagene. Se adquirieron oligonucleótidos sintéticos a la empresa Life Technologies o Cruachem, Inc. Se adquirieron enzimas de restricción a la empresa New England Biolabs o Promega. Se usaron cebadores 5'-fosforilados cuando se produjeron productos de PCR para fines de clonación. La numeración de nucleótidos (nt) de los oligonucleótidos usados como cebadores para la amplificación por reacción de cadena de polimerasa (PCR) de cDNA de fVIII porcino o DNA genómico usa el cDNA de fVIII humano como referencia [Wood et al. (1984) Nature 312: 330-337]. Se obtuvo un vector de expresión de fVIII, denominado HB-/ReNeo, de la empresa Biogen, Inc. El HB-/ReNeo contiene genes de resistencia a la ampicilina geneticina y un cDNA de fVIII que carece del dominio B completo, definido como el fragmento de escisión de Ser741-Argl648 producido por trombina. Para simplificar la mutagénesis de cDNA del dominio C2 de fVIII, que está en el extremo en 3' de inserto de fVIII en ReNeo, se introdujo un sitio NotI dos bases 3' respecto al codón de detención de HB-/ReNeo mediante mutagénesis de extensión de empalme por solapamiento (SOE) [Horton, R. M. et al. (1993) Methods Enzymol. 217: 270-279]. Este constructo es denominado HB-EeNeo/NotI.

El RNA total fue aislado mediante extracción con tiocianato de guanidinio-fenol-cloroformo [Chomczynski, P. et al. (1987) Anal. Biochem. 162: 156-159]. El cDNA se sintetizó a partir de mRNA usando transcriptasa inversa (RT) del virus de la leucemia de los múridos Moloney y hexámeros al azar según las instrucciones suministradas por el fabricante (estuche de ensayo de síntesis First-Strand cDNA, Pharmacia Biotech). El DNA de plásmido se purificó usando un estuche de ensayo Qiagen Plasmid Maxi (Qiagen, Inc.). Las reacciones de PCR se hicieron usando un termociclador Hybaid OmniGene que usa DNA polimerasas Taq, Vent, o Pfu. Los productos de PCR se purificaron sobre gel, se precipitaron con etanol y se ligaron en DNA de plásmido usando T4 DNA ligasa (estuche de ensayo de ligadura de DNA Rapid, Boehringer Mannheim). Los plásmidos que contenían insertos se usaron para transformar células XL1-Blue epicúreas de E.coli. Todas las secuencias nuevas de DNA de fVIII generadas mediante PCR fueron confirmadas mediante didesoxi-secuenciado usando un secuenciador de DNA automatizado Applied Biosystems 373a y el estuche de ensayo PRISM dye terminator.

Construcción de un vector de expresión de fVIII híbrido, HP20, que contiene el dominio C2 porcino

Un cDNA de fVIII porcino correspondiente al extremo en 3' del dominio C1 y la totalidad del dominio C2 fueron clonados en pBluescript mediante RT-PCR a partir de RNA total de bazo usando cebadores basados en una secuencia conocida de cDNA de fVIII porcino [Healey, J. F. et al. (1996) Blood 88: 4209-4214]. este constructo y el Hb-/ReNeo se usaron como plantillas para construir un producto de fusión de C1 humano- C2 porcino en pBluescript mediante mutagénesis SOE. El fragmento de C1-C2 en este plásmido se separó con ApaI y NotI y fue ligado en ApaI/corte NotI HB^{-}/ReNeo/NotI para producir HP20/ReNeo/NotI.

Construcción de fVIII humano/porcino híbrido con deleción de dominio B que contiene la cadena ligera porcina (HP18)

La cadena ligera de fVIII humano consiste en los residuos de aminoácidos Aspl649-Tyr2332. Los residuos correspondientes en el cDNA de fVIII porcino sustituyeron en esta región a HB^{-} para producir en una molécula de fVIII humano/porcino híbrido denominada HP18. Esto se hizo sustituyendo la correspondiente región en HP20 con un producto de PCR correspondiente a la región A2 porcina, el dominio A3, el dominio C1 y parte del dominio C2. Para facilitar las construcciones, se introdujo un sitio sinónimo AvrII en el nt 2273 en la unión de los dominios A2 y A3 de HP20 mediante mutagénesis SOE.

Construcción de fVIII humano/porcino híbrido con deleción de dominio B que contiene el péptido de señal porcino, dominio A1 y dominio A2 (HP22)

El péptido de señal de fVIII humano, dominio A1 y dominio A2 consiste en residuos de aminoácidos (Met(-19)-Arg740. los residuos correspondientes en el cDNA de fVIII porcino sustituyeron a esta región de HB^{-} para producir una molécula denominada HP22. Adicionalmente, se introdujo un sitio AvrII sinónimo en el nt 2273 en la unión de los dominios A2 y A3 de HP22 mediante mutagénesis SOE. El HP22 se contruyó mediante la fusión de un péptido de señal porcino- fragmento A1 parcial A2 en pBluescript [Healy et al. (1996) supra] con fVIII humano/porcino híbrido sin dominio B que contenía el dominio A2 porcino, denominado HP1 [Lubin et al. (1994) supra].

Construcción de fVIII sin dominio B porcino (PB^{-})

Un fragmento SpeI/NotI de HP18/BS (+ AvrII) fue digerido con AvrII/NotI y ligado en HP22/Bs digerido con AvrII/NotI (+ AvrII) para producir un constructo PB^{-}/BS (AvrII), que consiste en el fVIII porcino que carece del dominio B completo. Se clonó PB- en ReNeo ligando un fragmento de XbaI/NotI de PB^{-}/BS (+ AvrII) en HP22/ReNeo/NotI (+ AvrII).

Expresión de moléculas de fVIII recombinante

Se transfectaron transitoriamente PB-/ReNeo/NotI (+ AvrII) y HP22/ReNeo/NotI (+AvrII) en células de COS y se expresaron como se describió previamente [Lubin, I. M. et al. (1994) J. Biol. Chem. 269: 8639-8641]. Se transfectaron HB-/ReNeo/NotI sin DNA (similación) como un testigo.

La actividad de fVIII de PB^{-}, HP22 y HB^{-} se midió mediante un ensayo cromógeno como sigue. Muestras de fVIII en materias sobrenadantes de cultivo de células de COS fueron activadas mediante trombina 40 nM en NaCl 0,15 M, HEPES 20 mM, cAC12 5 mM, 0,01% de Tween-80, pH 7,4, en presencia de factor IXa 10nM, factor X 425 nM y vesículas de fosfatidil-serina-fosfatidilcolina (25/75 p/p) unilaminares 50 \muM. Después de 5 minutos, la reacción se detuvo con EDTA 0,05 M y desulfatohirudina recombinante 100 nM y el factor Xa resultante se midió mediante un ensayo en sustrato cromógeno. En el ensayo en sustrato cromógeno, se añadió Spectrozyme Xa 0,4 mM y se midió la velocidad de liberación de para-nitroanilida midiendo la absorbancia de la solución a 405 nM.

Resultados de materias sobrenadantes de cultivos celulares por duplicados transfectados (absorbancia a 405 nM por minuto)

HB^{-}: 13,9

PB^{-}: 139

HP22: 100

Simulación: < 0,2

Estos resultados indican que el fVIII sin dominio B porcino y el fVIII sin dominio B que consisten en las subunidades A1 y A2 porcinas son activos y sugieren que tienen una actividad superior respecto al fVIII sin dominio B humano.

Se purificó parcialmente PB^{-} y se concentró a partir del medio de crecimiento mediante cromatografía de Heparina-Sefarosa. La heparina-Sefarosa (10 ml) se equilibró con NaCl 0,075 M, HEPES 10 mM, CaCl_{2} 2,5 mM, 0,005% de Tween-80, 0,02% de azida de sodio, pH 7,40. El medio (100-200 ml) de las células de expresión fue aplicado a la heparina-Sefarosa, que seguidamente se lavó con 30 ml de tampón de equilibrio sin azida de sodio. El PB- se eluyó con NaCl 0,65 M, HEPES 20 mM, CaCl_{2} 5 mM, 0,01% de Tween-80, pH 7,40 y se almacenó a -80ºC. El rendimiento de actividad coagulante de fVIII fue normalmente de 50-75%.

Expresión estable de fVIII sin dominio B porcino (PB^{-})

Se mantuvieron líneas celulares transfectadas en medio de Eagle modificado de Dulbecco F-12 que contenía 10% de suero bovino fetal, 50 U/ml de penicilina, 50 \mug/ml de estreptomicina. El suero bovino fetal se inactivó con calor a 50ºC durante una hora antes de ser usado. Se transfectó establemente HB-/ReNeo and PB-ReNeo/NotI (+ Avril) en células de BHK y se seleccionó en cuanto a la resistencia a geneticina usando un protocolo general que ha sido previamente descrito [Lubin et al. (1994) Biol. Chem. 269: 8639-8641] con la excepción de que las células de expresión se mantuvieron en un medio de crecimiento que contenía 600 \mug/ml de geneticina. Células de matraces Corning T-75 que se hicieron crecer hasta confluir fueron transferidas a matraces triples Nunc en un medio que contenía 600 \mug/ml de geneticina y se hicieron crecer hasta confluir. El medio se retiró y se sustituyó con un medio AIM-V exento de suero (Life Technologies, Inc.) sin geneticina. El crecimiento de factor VIII se verificó mediante la actividad coagulante de factor VIII en una etapa (véase lo que antecede) y se recogieron 100-150 ml de medio una vez al día durante cuatro a cinco días. Los niveles máximos de expresión en un medio para HB^{-} y PB^{-} fueron 103 unidades por ml y 10-12 unidades por ml de actividad coagulante de factor VIII, respectivamente.

Purificación de PB^{-}

El medio se precipitó a partir de la materia sobrenadante del cultivo usando sulfato de amonio saturado al 60% y seguidamente se purificó mediante cromatografía de inmunoafinidad W3-3 y cromatografía líquida a presión elevada en mono-Q como se describió anteriormente para la purificación de factor VIII porcino derivado de plasma [Lollar et al. (1993) Factor VIII/factor VIIIa. Methods Enzymol. 222: 128-143]. La actividad coagulante específica de PB^{-} se midió mediante un ensayo de coagulación en una etapa [Lollar et al.(1993) supra] y era similar a la de factor VIII porcino derivado de plasma.

Cuando se analizó mediante electroforesis sobre gel de SDS-poliacrilamida, la preparación de PB^{-} contenía tres bandas de pesos moleculares aparentes de 160 kDa, 82 kDa y 76 kDa. Las bandas de 82 kDa y 76 kDa han sido anteriormente descritas como un heterodímero que contiene los dominios A1-A2 y ap-A3-C1-C2 (en los que ap se refiere a un péptido de activación) [Toole et al. (1984) Nature 312: 342-347]. La banda de 160 kDa fue transferida a una membrana de poli(fluoruro de vinilideno) y fue sometida a secuenciado del NH_{2}-terminal, lo que produjo Arg-Ile-Xx-Xx-Tyr ( en donde Xx representa sin determinar) que es la secuencia NH_{2}-terminal del factor VIII de cadena única [Toole et al. (1984) supra]. Por tanto, el PB^{-} es parcialmente tratado mediante escisión entre los dominios A2 y A3, de manera que consiste en dos formas, una proteína A1-A2-ap-A3-C1-C2 de cadena única y un heterodímero A1-A2/ap-A3-C1-C2. Ha sido descrito un tratamiento similar de HB^{-} recombinante [Lind et al. (1995) Eur. J. Biochem. 232: 19-27].

Caracterización de factor VIII porcino

Se ha determinado la secuencia de cDNA de fVIII porcino correspondiente a 137 bp de la 5'-UTR, la región codificadora del péptido de señal (57 bp) y los dominios A1 (1119 bp), A3 (990 bp), C1 (456 bp) y C2 (483 bp). Junto con la secuencia previamente publicada del dominio B y las regiones de péptidos de activación de cadena ligera [Toole et al. (1986) supra] y el dominio A2 [Lubin et al. (1994) supra], la secuencia expuesta en la presente memoria descriptiva completa la determinación del cDNA de fVIII porcino correspondiente al producto traducido. Un fragmento que incluía la región de 5'-UTR, péptido de señal y cDNA del dominio A1 fue clonada usando un protocolo de RT-PCR de 5'-RACE. Un cebador basado en la secuencia C2 humana fue satisfactorio para proporcionar un producto de RT-PCR que condujo a la clonación del dominio A3, C1 y la mitad en 5' del C2. El cDNA correspondiente a la mitad en 3' del dominio C2 y el cDNA de 3'-UTR mostró que era difícil de clonar. El resto del dominio C2 finalmente fue clonado mediante un procedimiento de PCR de desplazamiento génico dirigido a Diana [Parker et al.(1991) supra].

La secuencia descrita en la presente memoria descriptiva SEQ ID NO. 29 era ambigua excepto en el nt 7045 cercano al extremo en 3' del dominio C2, que es A o G como se describió con anterioridad. El codon correspondiente es GAC (Asp) o AAC (Asn). Los codones humanos y de ratón son GAC y CAG (Gln), respectivamente. Se desconoce si esto representa un polimorfismo o un artefacto de PCR reproducible. Los cDNA de fVIII sin dominio de humano/porcino híbrido recombinante que contienen sustituciones del dominio C2 porcino correspondiente a los codones GAC y AAC han sido establemente expresados sin una diferencia detectable en la actividad pro-coagulante. Esto indica que no hay ninguna diferencia funcional entre estas dos variantes del dominio C2.

La alineación de la secuencia de aminoácidos prevista de la SEQ ID NO. 30 fVIII porcino de longitud completa con secuencias humanas publicadas [Wood et al. (1984) supra] y de múridos [Elder et al.(1993) supra] se muestra en la Fig. 1A-1H junto con los sitios para una modificación post-translacional, escisión proteolítica y reconocimiento por otras macromoléculas. El grado de identidad de las secuencias alineadas se muestra en la Tabla VII. Como se indicó anteriormente, los dominios B de estas especies son más divergentes que los dominios A o C. Esto es congruente con la observación de que el dominio B no tiene una función conocida, a pesar de su gran tamaño [Elder et al. (1993) supra; Toole et al. (1986) supra]. Los resultados de la presente invención confirman que el dominio B de fVIII porcino no es necesario para la actividad. Basándose en los datos de secuencias presentados en la presente memoria descriptiva, el fVIII porcino que tiene la totalidad o parte del dominio B suprimido puede ser sintetizado expresando el DNA que codifica fVIII porcino que tiene suprimidos del mismo la totalidad o parte de los codones del dominio B porcino. Hay también más divergencia de secuencias correspondiente al APC del dominio A1/péptido de escisión de factor IXa (residuos 337-372) y el péptido de activación de cadena ligera (Tabla VII). El sitio de escisión de trombina en la posición 336 para generar el péptido 337-372 aparentemente se pierde en el ratón ya que este residuo es glutamina en lugar de argimina [Elder et al.(1993) supra]. La divergencia relativamente rápida de los péptidos de escisión de trombina (o en fVIII de ratón un péptido de activación 337-372 posiblemente residual) ha sido previamente indicado para los fibrinopéptidos [Creighton, T. E. (1993) In Proteins: Structures and Molecular Properties, W. H. Freeman, New York, pag. 105-138]. La falta de una función biológica de estos péptidos una vez escindidos ha sido citada como una posible razón de la rápida divergencia. La Arg 562 en el fVIII humano se ha sido propuesto que es el sitio de escisión más importante para la proteína C inactivada durante la inactivación de fVIIIa [Fay, P. J. et al. (1991) J. Biol. Chem. 266: 20139-20145]. Este sitio es conservado en fVIII humano, porcino y de ratón.

Los sitios de glicosilación potenciales unidos en N (NXS/T en los que X no es prolina) pueden ser observados en la Fig. 1A-1H. Hay ocho sitios de glicosilación unidos a N conservados: uno en el dominio A1, uno en el dominio A2, cuatro en el dominio B, uno en el dominio A3 y uno en el dominio C1. Las 19 cisteínas en el dominio A y C son conservadas, mientras que hay una divergencia en las cisteínas del dominio B. Seis de los siete enlaces de disulfuro en fVIII se encuentran en sitios homólogos en el factor V y ceruloplasmina, y los dos enlaces de disulfuro del dominio C se encuentran en el factor V [McMullen, B. A. et al. (1995) Protein Sci. 4: 740-746]. El fVIII humano contiene tirozinas sulfatadas en las posiciones 346, 718, 719, 723, 1664 y 1680 [Pittman, D. D. et al. (1992) Biochemistry 31: 3315-3325; Michnick, D. A. et al. (1994) 7. Biol. Chem. 269: 20095-20102]. Estos residuos se conservan en fVIII de ratón y fVIII porcino (Fig. 1), aunque el programa CLUSTALW no consiguió alinear la tirosina de ratón correspondiente a Tyr346 en fVIII humano.

El plasma de ratón y de cerdo puede corregir el defecto coagulante en plasma A de hemofilia humana, lo que es congruente con el nivel de conservación de residuos en los dominios A y C de estas especies. La actividad pro-coagulante del fVIII porcino es superior a la del fVIII humano [Lollar, P. et al. (1992) J. Biol. Chem. 267: 23652-23657]. El factor VIII porcino recombinante (con deleción del dominio B) expresado y purificado como se describe en la presente memoria descriptiva exhibe también una mayor actividad coagulante específica que el fVIII humano, siendo comparable al fVIII porcino derivado de plasma. Esto puede ser debido a una velocidad de disociación espontánea disminuida de la subunidad A2 del heterotrímero de fVIIIa activo de A1/A2/A3-C1-C2. es desconocido si esta diferencia en la actividad pro-coagulante refleja un cambio de evolución de la función como un ejemplo de la adaptación de las especies [Perutz, M. F. (1996) Adv. Protein Chem. 36: 213-244]. Ahora que está completa la secuencia de cDNA de fVIII porcino correspondiente al producto traducido, la mutagénesis de exploración de homólogos [Cunningham, B. C., et al. (1989) Science 243: 1330-1336] puede proporcionar una forma de identificar las diferencias estructurales entre el fVIII humano y porcino que son responsables de la superior actividad de este último.

El fVIII porcino es normalmente menos reactivo con anticuerpos inhibidores que surgen en hemofílicos que han tenido una transfusión con fVIII o que surgen como anticuerpos en la población general. Esta es la base de usar concentrado de fVIII porcino en el tratamiento de pacientes con anticuerpos inhibidores [Hay and Lozier (1995) supra]. La mayoría de los inhibidores son dirigidos contra epitopos ubicados en el dominio A2 o en el dominio C2 [Fulcher, C. A. et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 7728-7732; Scandella, D. et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 6152-6156; Scandella, D. et al. (1989) Blood 74: 1618-1626]. Adicionalmente, ha sido identificado un epitopo de carácter significativo desconocido que está en el domino A3 o C1 [Scandella et al. (1989) supra; Scandella, D. et al. (1993) Blood 82: 1767-1775; Nakai, H. et al. (1994)Blood 84: 224a]. El epitopo de A2 ha sido correlacionado a los residuos 484-508 mediante mutagénesis de exploración de homólogos [Healey et al. (1995) supra]. En este segmento de 25 residuos, hay una proporción relativamente baja de secuencias idénticas (16/25 o 64%). Es interesante que esta región que parece que es funcionalmente importante basada en el hecho de que los anticuerpos en la misma son inhibidores, ha sido sometida aparentemente a un desplazamiento genético relativamente más rápido. La alineación del domino A2 porcino y los dominios A3 indica que el epitopo de A2 no comparte ninguna homología detectable con la región correspondiente en el dominio A3.

El epitopo del inhibidor C2 de fVIII humano se ha propuesto que está ubicado en los residuos 2248-2312 mediante correlación de supresiones [Scandella, D. et al. (1995) Blood 86: 1811-1819]. El fVIII humano y porcino son idénticos en un 83% en este segmento de 65 residuos. Sin embargo, una mutagénesis de exploración de homólogos en esta región para caracterizar el epitopo de C2 ha puesto de manifiesto que un determinante principal del epitopo de C2 estaba inesperadamente ubicado en la región correspondiente a los aminoácidos humanos 2181.2243 (SEQ ID NO. 2) y en la Fig. 1H.

Se prepararon proteínas de factor VIII híbrido humano-porcino en las que las diversas partes del domino C2 del factor VIII humano estaban sustituidas con las correspondientes partes de factor VIII porcino, usando las estrategia descrita en la presente memoria descriptiva (Ejemplo 5). La síntesis de los diversos factores VIII híbridos de C2 se realizó por medio de DNA codificador híbrido de construcción, usando la secuencia de nucleótidos que codifica la región C2 porcina proporcionada en la SEQ ID NO. 30. Cada DNA híbrido fue expresado en células transfectadas, de forma que los factores VIII híbridos pudieron ser parcialmente purificados a partir del medio de crecimiento. La actividad, en ausencia de cualquier inhibidor, se midió mediante el ensayo de coagulación en una etapa.

Se usó una batería de cinco inhibidores humanos para ensayar cada factor VIII híbrido. Los plasmas inhibidores que contenían anticuerpo anti-factor VIII se había mostrado previamente que se dirigían contra el dominio C'' humano basándose en la capacidad del dominio C2 humano recombinante para neutralizar la inhibición. En todos los plasmas de los ensayos, el título de inhibidor fue neutralizado en más de 79% por el dominio C2 o la cadena ligera pero en menos de 10% por el dominio A2 recombinante. Además, los factores VIII híbridos de C2 fueron ensayados contra un anticuerpo monoclonal de múridos, que se une al dominio C2, y como los anticuerpos inhibidores de C2 humanos, inhibió la unión de factor VIII a fosfolípidos y al factor de von Willebrand.

Comparando los títulos de inhibidores de anticuerpos frente a factores VIII híbridos de C2, el determinante principal del epitopo de inhibidor C2 humano se mostró que era la región de los residuos 2181-2243 (SEQ ID NO. 2, véase también la Fig. 1H). Los anticuerpos anti-C2 dirigidos a una región COOH-terminal para el residuo 2253 no fueron identificados en cuatro de los cinco sueros de pacientes. Comparando los híbridos que tenían una secuencia porcina correspondiente a los números de residuos de aminoácidos humanos 2181-2199 y 2207-2243, era evidente que ambas regiones contribuyen a la unión de los anticuerpos. La secuencia de aminoácidos porcinos correspondiente a los residuos humanos 2181-2243 es numerada como 1982-2044 en la SEQ ID NO. 30. La secuencia de DNA porcino que codifica aminoácidos porcinos numerados 1982-2044 es la de nucleótidos numerados 5944-6132 en la SEQ ID NO. 29.

Haciendo referencia a la Fig. 1H, se puede observar que en la región 2181-2243 hay 16 diferencias de aminoácidos entre las secuencias humana y porcina. Las diferencias se encuentran en los residuos 2181, 2182, 2188, 2195-2197, 2199, 2207, 2216, 2222, 2224-2227, 2234, 2238 y 2243. Se puede llevar a cabo una sustitución de aminoácidos en uno o más de estos residuos numerados para preparar un factor VIII humano modificado no reactivo con anticuerpos inhibidores anti-C2 humanos. La mutagénesis de exploración de alanina proporciona un procedimiento conveniente para generar sustituciones de alanina para residuos que se producen de forma natural, como se describió anteriormente. Los aminoácidos distintos de alanina también pueden ser sustituidos, como se describe en la presente memoria descriptiva. Las sustituciones de alanina para aminoácidos individuales, especialmente los que no son idénticos entre humanos/porcinos o humano/ratón o que son los más propensos a contribuir a la unión de anticuerpos, pueden producir un factor VIII modificado con reactividad reducida respecto a los anticuerpos inhibidores.

Las Fig. 1A-1H conjuntamente tomadas proporcionan una comparación de secuencias alineadas de las secuencias de aminoácidos del factor VIII humano, de cerdo y de ratón. La Fig. 1A compara las regiones de péptidos de señal (humano, SEQ ID NO. 31; porcina SEQ ID NO. 30; aminoácidos 1-19; de múridos, SEQ ID NO. 28, aminoácidos 1-19). Debe apreciarse que los aminoácidos en las Fig. 1A-1H están numerados en la primera alanina de la proteína madura como numero 1, y a los aminoácidos del péptido de señal se les asignan números negativos. La secuencia de fVIII humano en la SEQ ID NO. 2 comienza también con la primera alanina de la proteína madura como el número 1 de aminoácidos. En las secuencias de aminoácidos de fVIII de ratón (SEQ ID NO. 28) y fVIII porcino (SEQ ID NO. 30), el primer aminoácido (alanina) de la secuencia de aminoácidos es el aminoácido número 20. Las Fig. 1A-1H muestran una alineación de las secuencias correspondientes de fVIII humano, de ratón y de cerdo, de forma que se yuxtaponen las regiones de mayor identidad de aminoácidos. Los números de aminoácidos en las Fig. 1A-1H se aplican solamente al fVIII humano. La Fig. 1B proporciona las secuencias de aminoácidos del domino A1 de humano (SEQ ID NO. 2, aminoácidos 1-372), porcino (SEQ ID NO. 30, aminoácidos 20-391) y de múridos (SEQ ID NO. 28, aminoácidos 20-391). La Fig.1C proporciona las secuencias de aminoácidos de los dominios A2 de factor VIII de humanos (SEQ ID NO. 2, aminoácidos 373-740), de cerdo (SEQ ID NO. 30, aminoácidos 392-759) y de ratón (SEQ ID NO. 28, aminoácidos 392-759). La Fig. 1D proporciona las secuencias de aminoácidos de dominios B de factor VIII humano (SEQ ID NO. 2, aminoácidos 741-1648), de cerdo (SEQ ID NO. 30, aminoácidos 760-1449) y de ratón (SEQ ID NO. 28, aminoácidos 760-1640). La Fig.1E compara las secuencias de aminoácidos de péptidos de activación de cadena ligera de factor VIII humano, de cerdo y de ratón (SEQ ID NO. 2, aminoácidos 1649-1689; SEQ ID NO. 30, aminoácidos 1450-1490 y SEQ ID NO. 28, aminoácidos 1641-1678, respectivamente). La Fig. 1F proporciona la comparación de secuencias para dominios A3 de factor VIII humano, de cerdo y de ratón (SEQ ID NO. 2, aminoácidos 1690-2019; SEQ ID NO. 30, aminoácidos 1491-1820 y SEQ ID NO. 28, aminoácidos 1679-2006, respectivamente). La Fig. 1G proporciona las secuencias de aminoácidos de dominios C1 de factor VIII humano, de cerdo y de ratón (SEQ ID NO. 2, aminoácidos 2020-2172; SEQ ID NO. 30, aminoácidos 1821-1973 y SEQ ID NO. 28, aminoácidos 2007-2159, respectivamente). La Fig. 1H proporciona datos de secuencias para los dominios C2 de factor VIII humano, de cerdo y de ratón (SEQ ID NO. 2, aminoácidos 2173-2332; SEQ ID NO. 30, aminoácidos 1974-2133 y SEQ ID NO. 28, aminoácidos 2160-2319, respectivamente).

Los rombos representan sitios de sulfatación de tirosina, sitios de unión propuestos para el factor IXa, los fosfolípidos y proteína C están doblemente subrayados y las regiones involucradas en la unión de anticuerpos inhibidores anti-A2 y anti-C2 están con letra cursiva. Los asteriscos resaltan las secuencias de aminoácidos que son conservadas. Véase también la SEQ ID NO. 29 (cDNA de factor VIII porcino) y SEQ ID NO. 30 (secuencia de aminoácidos deducida de factor VIII porcino. Se usa el sistema de numeración humano como referencia [Wood et al. (1984) supra]. Los dominios A1, A2 y B están definidos por sitios de escisión de trombina en las posiciones 372 y 740 y un sitio de escisión de proteasa desconocido en 1648 como los residuos 1-372, 373-740 y 741-1648, respectivamente [Eaton, D. L. et al. (1986) Biochemistry 25: 8343-8347]. Los dominios A3, C1 y C2 son definidos como residuos 1690-2019, 2020-2172 y 2173-2332, respectivamente [Vehar et al. (1984) supra]. Los sitios de escisión para trombina (factor IIa), factor IXa, factor Xa y APC [Fay et al. (1991) supra; Eaton, D. et al. (1986) Biochemistry 25: 505-512; Lamphear, B. J. et al. (1992) Blood 80: 3120-3128] son mostrados colocando el nombre de la enzima sobre la arginina reactiva. Un péptido ácido es escindido de la cadena ligera de fVIII mediante trombina o factor Xa en la posición 1689. Los sitios de unión propuestos para el factor IXa [Fay, P. J. et al. (1994) J. Biol. Chem. 269: 20522-20527; Lenting, P. J. et al. (1994) J. Biol. Chem. 269: 7150-7155), fosfolípido (Foster, P. A. et al. (1990) Blood 75: 1999-2004) y proteína C (Walker, F. J. et al. (1990) J. Biol. Chem. 265: 1484-1489] están doblemente subrayados. Las regiones involucradas en la unión de anti-A2 [Lubin et al. (1994) supra; Healey et al. (1995) supra] y los anticuerpos inhibidores anti-C2 previamente propuestos están en letra cursiva. El peitopo inhibidor de C2 identificado como se describe en la presente memoria descriptiva (aminoácidos 2181-2243 humanos) se muestra mediante subrayado único en la Fig. 1H. Los sitios de sulfatación de tirosina [Pittman et al. (1992) supra; Michnick et al. (1994) supra] se muestran por
medio de \blacklozenge.

Ejemplo 7 Construcción de POL 1212 y expresión en células de riñón de cría de hámster

El POL1212 es un factor VIII porcino parcialmente sin nomino B, que tiene suprimido el dominio B excepto los 12 aminoácidos del NH_{2}-terminación del dominio B y están retenidos 12 aminoácidos de la terminación en COOH.

Los cDNA que codifican las secuencias para los dominios de fVIII porcino A1, A2, ap-A3-C1 y C2 se obtuvieron como se describe en el Ejemplo 5. La secuencia de nucleótidos de DNA y la secuencia derivada de aminoácidos del factor VIII porcino se presentan como SEQ ID NO. 29 y SEQ ID NO. 30, respectivamente. Los fragmentos amplificados fueron separadamente clonados en el plásmido pBluescript II KS^{-} (pBS).

POL1212 se refiere al cDNA que codifica fVIII porcino que carece de la mayor parte del dominio B pero que contiene la secuencia de DNA que codifica un conector de 24 aminoácidos entre los dominios A2 y ap. El POL1212 se construyó en un vector de expresión de mamífero, ReNeo, que se obtuvo de la empresa Biogen. El ReNeo se puede replicar en bacterias, o replicar como un episoma en células de COS para la expresión transitoria de factor VIII o puede estar establemente integrado en una diversidad de células de mamíferos. Consiste en 1) secuencias derivadas del plásmido pBR322 que incluye un origen de replicación y gen de resistencia a la ampicilina, 2) un gen de resistencia a la neomicina cuya expresión está bajo control del promotor/mejorador SV40, intron t pequeño de SV40 y los elementos reguladores de las señales de poliadenilación de SV40, promotor tardío principal del tipo 2 de adenovirus y secuencia líder tripartita del tipo 2 de adenovirus. Cualquier vector que tenga componentes funcionales similares puede ser usado en lugar del vector ReNeo.

Se preparó POL1212/ReNeo en varias etapas. En primer lugar, se codificaron los cDNA para la cadena pesada de fVIII porcino (A1-A2) y los cDNA que codifican la cadena ligera de fVIII porcino (ap-A3-C1-C2) fueron ensamblados separadamente en pBS. A partir de estos constructos, se ensambló el DNA que codifica fVIII sin dominio B porcino en pBS (PB-/pBS). Esta forma de fVIII porcino carece del dominio B completo, definido como los aminoácidos correspondientes a los residuos 741-1648 en fVIII humano (nucleótidos humanos 2278-5001). Seguidamente, el DNA que codifica A2 porcino sustituyó al dominio A2 humano en el vector de expresión ReNeo de fVIII sin dominio B humano (HB-/ReNeo). El DNA que codifica el resto de la cadena pesada porcina y el DNA que codifica la cadena ligera porcina sustituyó a los dominios humanos en dos etapas adicionales usando los constructos de cadena pesada porcina/pBS y PB-/pBS previamente preparados. Un fragmento del dominio B humano que codifica los 5 aminoácidos C terminales y 9 N terminales fue insertado entre los dominios A2 y A3 produciendo un constructo denominado PSQ/ReNeo [Healey et al. (1998) 92: 3701-3709]. Los residuos Glu2181-Val2243 contienen un determinante principal del epitopo inhibidor en el dominio C2 del factor VIII humano. Este constructo se usó como una plantilla para preparar un fragmento del dominio B porcino que codifica los 12 aminoácidos C terminales y 12 N terminales. Este fragmento se insertó entre los dominios A2 y A3 que resultan en el constructo final, POL1212/ReNeo.

El conector de 24 aminoácidos POL1212 consiste en los 12 primeros y al menos 12 residuos del dominio B de fVIII porcino. El conector POL1212 tiene la siguiente secuencia:

SFAQNSRPPSASAPKPPVLRRHQR.

(SEQ ID NO. 32).

\vskip1.000000\baselineskip

La secuencia de nucleótidos correspondiente al conector 1212 y los aminoácidos circundantes es:

4

El conector POL1212 se sintetizó mediante mutagénesis de extensión de empalme por solapamiento (SOE), como sigue:

Las reacciones de PCR usadas para preparar productos de SOE fueron como sigue:

Reacción Nº 1

Cebador exterior: Rev 4, que es un cebador a dos porcino, nucleótidos 1742-1761 (SEQ ID NO. 29). La secuencia es 5'-GAGGAAAACCAGATGATGTCA-3' (SEQ ID NO. 34).

Cebador interior: OL 12, que es un cebador inverso porcino que abarca los 15 primeros (5') aminoácidos de OL1212 y los último 5 (3') aminoácidos de A2 porcino. La secuencia es:

5

Plantilla: PQS/ReNeo

Producto: DNA porcino de nucleótido 1742 en el dominio A2 a 2322 en OL1212, 580 bp.

\vskip1.000000\baselineskip

Reacción Nº 2

Cebador exterior: P2949 es un cebador de A3 inverso porcino nucleótidos 2998-3021 de SEQ ID NO. 29. La secuencia es: 5'-GGTCACTTGTCTACCGTGAGCAGC-3' (véase SEQ ID NO. 29).

Cebador interior: OL 12+, un cebador porcino que abarca al menos 16 (3') aminoácidos de OL1212 y los 6 primeros (5') aminoácidos del péptido de activación, nucleótidos 2302-2367 de SEQ ID NO. 29. La secuencia es:

6

Plantilla: PSQ/ReNeo_

Producto: porcino de nucleótido 2302 en OL 1212 a nucleótido 3021 en el dominio A3, 719 bp.

\vskip1.000000\baselineskip

Reacción de SOE

Cebadores: Rev 4, P2949-

Plantillas: Fragmento de rxn Nº 1 (bp) y fragmento de baja fusión de rxn Nº 2 (bp).

Producto: DNA porcino de nucleótido 1742 en el dominio A2 a nucleótido 3021 en el dominio A3 (SEQ ID NO. 29) que incluye OL 1212, 1279 bp. El producto de reacción se precipitó en etanol.

El conector 1212 se insertó en PSQ/ReNeo cortando el producto de SOE (inserto) y PSQ/ReNeo (vector) con BsaB I. El vector y el inserto se ligaron usando T4 ligasa y el producto se usó para transformar células XL1-Blue de E. coli. Se preparó DNA de plásmido a partir de varias colonias y la secuencia del conector 1212 y otra secuencia generada por PCR se verificó mediante análisis de secuencias de DNA.

Cultivo de células CRL-1632 de riñón de cría de hámster (BHK)

Se obtuvo una línea celular BHK a partir de la entidad ATCC, identificación de acceso CRL-1632 y se almacenó congelada a -20ºC hasta otro uso. Las células se descongelaron a 37ºC y se pusieron en 10 ml de medio completo, definido como DMEM/F12, 50 U/ml de penicilina, 50 \mug/ml de estreptomicina más 10% de suero bovino fetal (FBS). El FBS fue adquirido a la empresa Hyclone, Logan Utah. Las células se cintrifugaron durante 2 minutos a 300 rpm. El medio fue aspirado y Las células se volvieron a poner en suspensión en dos ml de medio completo en un matraz T-75 que contenía 20 ml de medio completo.

El POL1212 había sido expresado en células tanto de riñón de cría de hámster (BHK) como de ovarios de hámster chino (CHO). Se usaron dos líneas de BHK, la línea CRL-1632 de la entidad ATCC y otra línea de BHK obtenida de R. Mcgillivray, University of British Columbia, [Funk, et al. (1990) Biochemistry 29: 1654-1660]. Esta últimas fueron subcultivadas sin selección en el laboratorio de los inventores y se denominaron BHK 1362 (Emory). La línea celular de CHO era CHO-K1, acceso de ATCC CCL-61. La expresión del clon medio de la línea celular Emory y de las células CHO-K1 era algo mayor que la de las células CRL-1632 según se estimó mediante la actividad del ensayo cromógeno.

Las células hechas crecer en el matraz T-75 formaron una monocapa confluente. Se preparó un cultivo de 60 ml de células XL1-Blue de E. coli en LB/ampicilina (50 mg/ml) que portaban el plásmido POL1212/ReNeo.

Transfección de células de células de BHK CRL-1632 con POL1212/ReNeo

El Dna del cultivo durante una noche de células POL1212/ReNeo XL1-Blue se preparó usando un estuche de ensayo CA Spin Miniprep de Qiagen, Valencia. Un matraz de células CRL-1632 se dividió entre un matraz de almacenamiento con 0,2 ml y un matraz para la transfección con 0,3 ml de un total de 2 ml. El otro matraz se llenó con medio de reciente aportación. El medio era DMEM/F12 + 10% de Hyclone FBS + 50 U/ml de penicilina y 50 \mug/ml de estreptomicina. Las células CRL-1632 se dividieron entre placas de 6 posillos destinadas a una confluencia de 50-90% para la transfección (0,3 ml de células del matraz T-75 en 2 ml de 1:5000 de Versene [Life Technologies, Gaithersburg, MD] en cada posillo) usando DMEM/F12 + 10% de Hyclone FBS + 50 U/ml de penicilina de resiente aportación y 50 \mug/ml de estreptomicina.

Se prepararon las siguientes soluciones en tubos de ensayo de 1-2 ml esterilizados:

A) 48 \mul (10 \mug) de DNA de Miniprep POL1212/ReNeo más \mul de medio sin suero (DMEM/F12) más 10 \mul de Lipofectin® (Life Technologies, Gaithersburg, MD).

B) 10 \mul de Lipofectinmás 190 \mul de medio (transfección simulada) se mezclaron suavemente y DNA y el Lipofectin se dejaron reaccionar durante 15 minutos a temperatura ambiente. Durante este tiempo, las células se lavaron dos veces con 2ml de DMEM/F12 y seguidamente se añadieron 1,8 ml de DMEM/F12 a las células. El complejo de DNA/Lipofectin se añadió gota a gota a las células y se agitó suavemente para mezclar. Las células permanecieron en el incubador durante una noche. Se separó el DNA/Lipofectin y se añadieron 3 ml de medio con suero a las células. Se incubaron las células 30-48 horas se adquirió geneticina a la empresa Life Technologies, Gaithersburg, MD. Los cultivos de células se dividieron 1:20, 1:50 y 1:100, 1:250, 1:500 en platos de 10 cm en 10 ml de medio con suero que contenía 535 \mug/ml de geneticina. Durante varios días que siguieron, las células que no absorbieron el plásmido POL1212/ReNeo fueron destruidas debido a la presencia de geneticina. Las células restantes continuaron replicándose en geneticina formando colonias de monocapas visibles en los platos.

Expresión y ensayo de POL1212 a partir de células BHK CRL-1632

Se colocaron anillos cilíndricos de plástico pequeños alrededor de las colonias. Las colonias fueron aspiradas separadamente usando medio completo y transferidas a tubos de ensayo. Estas colonias son denominadas colonias clonadas en anillos. Las colonias clonadas en anillos fueron dispuestas en placas separadamente en placas de 24 posillos y se hicieron crecer en medio completo.

Ensayo de sustratos cromógenos para la expresión de factor VIII mediante células CRL-1632 transfectadas

Muestras de POL1212 de materias sobrenadantes de cultivos celulares se mezclaron con factor IXa porcino purificado 50 nM y vesículas de fosfatidilcolina 0,05 mM/fosfatidilserina (PCPS) en NaCl 0,15 M, HEPES 20 mM, CaCl_{2} 5 mM, 0,01% de Tween 80, pH 7,4. Como testigo, se usó medio de cultivo celular de células transfectadas simuladas. Se añadieron simultáneamente trombina y factor X hasta concentraciones finales de 40 y 425 nM, respectivamente, la trombina activa el factor VIII que seguidamente, junto con PCPS, sirve como un cofactor para el factor IXa durante la activación de factor X.

Después de 5 minutos, la activación de factor X por factor IXa/factor VIIIa/PCPS se detuvo mediante la adición de EDTA hasta una concentración final de 50 mM. Al mismo tiempo, la activación de factor VIII por trombina se detuvo mediante la adición del inhibidor de trombina, desulfatohirudina recombinante, hasta una concentración final de 100 nM. Una muestra de 25 \mum de la mezcla de reacción se transfirió a un posillo de microtitulación, al que se añadieron 74 \mul de Spectrozyme Xa (America Diagnostica, Greenwich, CT), que es un sustrato cromógeno para el factor Xa. La concentración final de Spectrozyme Xa era de 0,6 mM. La absorbancia a 405 nm debida a la escisión de Spectrozyme Xa por factor Xa se verificó continuamente durante 5 minutos con un lector de placas Vmax (Molecular Devices, Inc., Menlo park, CA). Los resultados se expresan en términos de A405/minuto.

Ensayo cromógeno de factor VIII de diez colonias clonadas en anillos:

7

Estos resultados muestran que la totalidad de las diez colonias que se seleccionaron expresan una actividad de factor VIII que es al menos diez veces mayor que el de fondo.

La actividad del medio de la colonia 8, que era la colonia de expresión más elevada, fue adicionalmente examinada mediante un ensayo de coagulación de factor VIII en una etapa. En este ensayo, 50 ml de plasma deficiente en factor VIII (George King Biomedical Overland Park, KA), 5 ml de muestra o patrón y 50 ml de reactivo de tiempo de tromboplastina en forma de partículas activadas (Organon Teknika, Durham, NC) fueron incubados 3 minutos a 37ºC. Las muestras incluyen medio de la colonia 8 diluido en NaCl 0,15 M, HEPES mM, pH 7,4 (HBS) o, como testigo, medio completo. La coagulación se inició mediante la adición de 50 ml de CaCl_{2} 20 mM. El tiempo de coagulación se midió usando un instrumento de coagulación ST4 BIO (Diagnostica Stago, Parsippany, NJ). Se obtuvo una curva patrón haciendo diluciones de plasma humano normal citrado reunido, Iot 0641 (George King Biomedical, Overland Park, KA). La concentración de factor VIII del patrón era de 0,9 unidades por ml.

Curva patrón:

8

La regresión lineal de los tiempos de coagulación frente al logaritmo de la concentración de patrón produjo un coeficiente de correlación de 0,997.

Las sustancias del ensayo proporcionaron los siguientes tiempos de coagulación que se convirtieron en unidades por ml usando la curva patrón:

9

Estos resultados muestran que la actividad coagulante de la colonia 8, es aproximadamente 2000 veces mayor que la de la muestra de testigo.

La secuencia de DNA que codifica POL1212 se expone como SEQ ID NO. 37. La secuencia de aminoácidos codificados de POL1212 se expone como SEQ ID NO. 38. Se puede llevar a cabo una purificación adicional de POL1212 usando una diversidad de procedimientos conocidos como cromatografía de inmunoafinidad y cromatografía de HPLC - véanse los Ejemplos 2 y 3.

Comentarios de conclusión final

Debe entenderse que se pueden introducir variaciones menores de la secuencia de aminoácidos o del DNA que codifica esta secuencia relativas a POL1212 sin afectar a las características o función esenciales. Por ejemplo, la longitud de la secuencia del dominio B retenida como un conector entre el dominio A2 y el péptido de activación puede ser aumentada o disminuida dentro de límites conocidos en la técnica. Se pueden introducir variantes en la secuencia en la región del conector mientras se retienen las características funcionales equivalentes de POL1212 como se expone en la presente memoria descriptiva y del factor VIII sin dominio B porcino como se expone en la presente memoria descriptiva y es conocido en la técnica. Basándose en comparaciones de secuencias de aminoácidos de factor VIII conocidas que tienen actividad coagulante en sangre humana, se pueden preparar variantes de las secuencias como sustituciones de aminoácidos individuales o sustitución de segmentos de péptidos con variantes funcionales conocidas en la secuencia básica de aminoácidos de POL1212, mientras se retienen sus características funcionales equivalentes. Los tipos de variaciones que anteceden no está previsto que sean exhaustivos, sino que son meramente ilustrativos de las modificaciones de secuencias que se podrían hacer por los expertos en la técnica, sin modificar sustancialmente las características funcionales de la proteína.

Listado de ID de secuencias

\underbar{SEQ ID NO.}: \underbar{Identificación}

1: cDNA de factor VIII humano. La codificación para el aminoácido número 1 de la proteína madura comienza en el nucleótido número 208.

2: Secuencia de aminoácidos de factor humano

3: cDNA de dominio A2 de factor VIII porcino

4: Secuencia de aminoácidos de dominio A2 de factor VIII porcino

5 a 27: Sec. oligonucleótidos cebador (Ejemplo 5)

28: Secuencia de aminoácidos de factor VIII de múridos

29: cDNA de factor VIII porcino

30: Secuencia de aminoácidos de señal de factor VIII humano

31: Secuencia de aminoácidos de señal de factor VIII humano

32 a 36: Cebador de oligonucleótidos (Ejemplo 7)

37: DNA que codifica POL1212

38: Secuencia de aminoácidos de POL1212

<110> Emory University

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<120> FACTOR VIII MODIFICADO

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\vskip0.400000\baselineskip

<130> 75-95I WO

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\vskip0.400000\baselineskip

<140> TODAVÍA NO ASIGNADO

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<141> 2001-02-16

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\vskip0.400000\baselineskip

<150> US 09/523,656

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 2000-03-10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<150> US 09/037,601

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 1998-03-10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<150> US 08/670,707

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 1996-06-26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<170> PatentIn Ver. 2.0

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9009

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (208)..(7203)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

10

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

21

22

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2332

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

23

24

25

26

27

28

29

30

31

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1130

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Porcino

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

32

320

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 368

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Porcino

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

33

34

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> Descripción de secuencia artificial: cebador de oligonucleótidos

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> Descripción de secuencia artificial: cebador de oligonucleótidos

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> Descripción de secuencia artificial: cebador de oligonucleótidos

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: cebador de oligonucleótidos

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> Descripción de secuencia artificial: cebador de oligonucleótidos

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: cebador de oligonucleótidos

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> Descripción de secuencia artificial: cebador de oligonucleótidos

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

41

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> Descripción de secuencia artificial: cebador de oligonucleótidos

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> Descripción de secuencia artificial: cebador de oligonucleótidos

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> Descripción de secuencia artificial: cebador de oligonucleótidos

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

44

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de secuencia artificial: cebador de oligonucleótidos

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

45

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> Descripción de secuencia artificial: cebador de oligonucleótidos

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

46

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de secuencia artificial: cebador de oligonucleótidos

\vskip1.000000\baselineskip

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<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

47

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de secuencia artificial: cebador de oligonucleótidos

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<400> 18

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\hskip1cm

48

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> Descripción de secuencia artificial: cebador de oligonucleótidos

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

49

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de secuencia artificial: cebador de oligonucleótidos

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> Descripción de secuencia artificial: cebador de oligonucleótidos

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

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\hskip1cm

51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> Descripción de secuencia artificial: cebador de oligonucleótidos

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

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\hskip1cm

52

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: cebador de oligonucleótidos

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

53

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de secuencia artificial: cebador de oligonucleótidos

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

54

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: cebador de oligonucleótidos

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

55

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: cebador de oligonucleótidos

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

56

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: cebador de oligonucleótidos

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

57

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2319

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Músculo mus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

58

59

60

61

62

63

64

65

66

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6402

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Porcino

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(6399)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

67

68

69

70

71

72

73

74

75

76

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2133

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PTR

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Porcino

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

77

78

79

80

81

82

83

84

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

85

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: conector

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

86

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 105

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: conector

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

87

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: cebador de oligonucleótidos

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

\hskip1cm

88

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: cebador de oligonucleótidos

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

\hskip1cm

89

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 66

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: cebador de oligonucleótidos

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

90

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 4404

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Porcino

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<223> (1)..(4401)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

91

92

93

94

95

96

97

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1467

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PTR

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Porcino

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

98

99

100

101

102

103

Claims

1. DNA que codifica la secuencia de aminoácidos de POL1212 como se expone en SEQ ID NO. 38.

2. Un vector de expresión, que comprende un DNA según la reivindicación 1.

3. DNA según la reivindicación 1, que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO. 37.

4. Un vector de expresión, que comprende un DNA según la reivindicación 3.

5. Un factor VIII porcino modificado, que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 38.

6. Una composición terapéutica, que comprende un factor VIII porcino modificado según la reivindicación 5 y un vehículo fisiológicamente aceptable.

7. Un procedimiento para producir una proteína de factor VIII porcino modificado que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 38, que comprende expresar en una célula hospedante de mamífero un DNA que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 38.

8. El procedimiento de la reivindicación 7, en el que el DNA que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 38 codifica también un péptido de señal, con lo que la proteína de factor VIII porcino modificado es exportada desde la célula hospedante de mamífero.

9. El procedimiento de la reivindicación 8, en el que el péptido de señal tiene la secuencia de aminoácidos 1-19 de SEQ ID NO. 30.

10. Una célula hospedante de mamífero, que contiene y que replica un vector de expresión que comprende DNA que codifica la secuencia de aminoácidos de POL1212 como se expone en SEQ ID NO. 38.

11. Una célula hospedante de mamífero según la reivindicación 10, en la que el vector que comprende DNA tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO. 37.

12. Una célula según la reivindicación 11, en la que célula hospedante es BHK CRL-1632.