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JP2003505066A - 酵素の電子供与体系ならびに基質の生化学的変換におけるその使用 - Google Patents

酵素の電子供与体系ならびに基質の生化学的変換におけるその使用

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JP2003505066A
JP2003505066A JP2001512844A JP2001512844A JP2003505066A JP 2003505066 A JP2003505066 A JP 2003505066A JP 2001512844 A JP2001512844 A JP 2001512844A JP 2001512844 A JP2001512844 A JP 2001512844A JP 2003505066 A JP2003505066 A JP 2003505066A
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JP
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electron
enzyme
coo
reaction
acid
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JP2001512844A
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ハウアー，ベルンハルト
シュミット，ロルフ，デェー．
シュワネベルク，ウルリッヒ
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Original Assignee
BASF SE
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Priority claimed from DE10011723A external-priority patent/DE10011723A1/de
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、酸化還元特性を有する酵素のための新規の電子供与体系、ならびに酵素により触媒される酸化反応（例えば、ω-ヒドロキシル化脂肪酸の製造）におけるその使用に関する。本発明はさらに、脂肪酸モノオキシゲナーゼの改良検出方法、ならびに本発明の電子供与体系が有効に用いられるバイオリアクターおよび検査キットに関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明は酸化還元特性を有する酵素のための新規の電子供与体系、および酵素
により触媒される酸化反応、たとえば、特にω-ヒドロキシル化脂肪酸の調製、
におけるその使用に関する。本発明はさらに、脂肪酸モノオキシゲナーゼ検出法
の改善、バイオリアクター、および検査キットに関するが、これらには上記の電
子供与体系を有効に利用することができる。
【０００２】 無細胞反応系において、たとえばモノオキシゲナーゼのような酸化還元酵素を
生物工学的に利用する場合、常に随伴する問題は、必要な酸化還元当量を与える
ために天然の補因子（たとえばNADHまたはNADPH）を使用すると、許容できない
高コストに結びつくことである。
【０００３】 これはシトクロムP450含有モノオキシゲナーゼの生物工学的利用にも当てはま
る。すべてのP450酵素は、活性化されていない脂肪族または芳香族X-H(ここで、
X = -C, -N, -S)結合に酸素原子を伝達するという共通の機能を有する。さらに
、P450酵素は-C=C-二重結合をエポキシ化することができる。ほとんどのp450系
は、電子の供給源として上記のNADPHやNADHのような酸素添加反応の補因子を要
求する。P450系はこのような電子伝達系（レダクターゼ系）の手段によって、４
クラスに分けられる。クラスI P450酵素はレダクターゼとしてFADドメインおよ
び別のFe-Sタンパク質を含有し（通例、ミトコンドリアおよび細菌のP450酵素）
、クラスII P450酵素はFAD/FMNレダクターゼを有し（通例、ER P450酵素）、さ
らにクラスIII P450酵素は他の還元当量を必要としない；この酵素はすでに酸素
を含有する過酸素化された基質を変換する。クラスIVのP450酵素だけがNADHから
の伝達系によらず直接、電子を獲得する。
【０００４】 かろうじて化学的手段で得ることができる化合物について、P450系によって触
媒される１原子酸素添加反応の機能的多様性は、バイオテクノロジー、薬理学お
よび毒物学上多大な可能性を提供する。in vitroでこうした可能性を利用するた
めに、１つ重要な前提条件は、P450系の特徴付けおよび「改善された」性質を有
する酵素突然変異体の発見を可能にする、適当な発現方法、精製方法、特に活性
検出系を開発することである。
【０００５】 上記のP450モノオキシゲナーゼ、特にクラスIおよびII、を利用するために、
さらに重要な前提条件は、妥当なコストで電子供与体系が利用可能となることで
あろう。
【０００６】 NADPH補因子再循環系がDeffnerら, Ann. N.Y. Acad. Sci.(1987) 501, 171に
述べられている。しかしながら、調製用のスケールで使用するには、これはコス
トの問題があり、酵素-膜リアクターで行なわれる反応をさらに複雑にする。し
たがって、代わりの電子供与体が探し求められてきた。１つの有望な方法は、P4
50酵素の電気化学的還元である。Estabrook ら(Methods Enzymol. (1996) 272,
44) は、Co(III)セパルクレートメディエーター系およびPt電極を用いて6種類の
P450酵素に関わる変換を測定することができた。しかしながら、その活性は還元
当量のNADPHで得られる活性より約8倍低かった。上記メディエーターの代わりに
亜ジチオン酸ナトリウム(Fangら、 Drug. Metab. Dispos.(1996) 24(11): 1282)
が、P450酵素を直接還元する化合物であることが明らかになった。P450 BM-3の
場合、NADPHと比較して亜ジチオン酸ナトリウムでは活性は8150だけ低下した；P
450 BM-3が亜ジチオン酸ナトリウムによって３重に還元され、それによってほと
んど失活したと推定される。
【０００７】 本発明の目的は第一に、酸化還元特性を有する酵素のための、効率のよい、代
替電子供与体系を妥当なコストで提供することである。シトクロムP450含有酵素
が関与する生化学的変換にこのような系が使用可能であることを特に目的とした
。加えて、よりよいP450酵素検出法を提供することを目指した。本発明のもうひ
とつの目的は、有機分子に酸素を酵素的に転移する、より詳細には、特に脂肪酸
のような、極性基を有するヒドロカルビル化合物の末端または末端付近をヒドロ
キシル化するための改良された生物工学的方法を提供することであった。
【０００８】 これらの目的は、酸化還元特性を有する酵素に電子を伝達する電子供与体系を
提供することによって達成されることが明らかになった。ここで、上記の系は、
無機の、電極に結合していない電子供給源、およびその電子供給源から酵素に電
子を伝達することができるメディエーターを含んでなる。ちなみに、この系の成
分は、単独でもしくは混合物として、担体に結合した状態で、または、望ましく
は担体に結合しない状態で、存在することができる。
【０００９】 本発明の目的にかなう「電極に結合していない電子供給源」は、一対の電極間
に外部から電圧をかけることなしに、電子をメディエーターに伝達することがで
きる。より詳細には、これは必然的に、化学的な酸化還元反応を介した、電子供
給源によるメディエーターの還元を伴う。
【００１０】 本発明にしたがって提供される電子供与体系は、特にシトクロムP450含有酵素
、たとえばモノオキシゲナーゼ(E.C. 1.14.-.-)の大きなファミリーに含まれる
酵素、のために使用される。本文で言及される例は、バシラス・メガテリウム(B
acillus megaterium)から分離されるシトクロムP450モノオキシゲナーゼBM-3で
あるが、これに限定するものではない。
【００１１】 電子供与体系に関する望ましい実施形態において、この系は約-0.4Vより低い
範囲の標準電位（たとえば、カロメル電極に対して測定される；標準条件下；下
記のCreasarら参照）を有するメディエーターを含んでなる。本発明にしたがっ
て使用することができるメディエーターの例として、コバルト(III)セパルクレ
ート、メチルビオロゲン、ニュートラルレッド、リボフラビン、ルテニウムトリ
アセテート、FMNおよびFADがあり、コバルト(III)セパルクレートが望ましいが
、限定しない。コバルト(III)セパルクレートは、たとえば標準条件下で、-0.54
Vの標準電位を有する（Creasarら(1977), J. Am. Chem. Soc., 99, 3181を参照
されたい). 本発明の電子供与体系は、電子の供給源としてメディエーターより低い標準電
位を有する金属を含むことが望ましい。本文で言及される電子供給源の例として
は、金属亜鉛があるが、これに限定されない。こうした目的のために、金属は反
応性の状態、すなわち表面積の大きい状態、たとえば粉末状で存在することが望
ましい。
【００１２】 本発明の望ましい電子供与体系は、下記のような電子供給源およびメディエー
ターを組み合わせて含んでなる： - Zn/コバルト(III)セパルクレート、または - Zn/ニュートラルレッド 本発明はさらに、酵素による酸化方法、言い換えれば炭化水素を含有する水素
供与分子（すなわち酸化可能な化合物）に酸素を伝達するための方法に関する。
この方法は酸素伝達酵素および上記の定義に従う電子供与体系を含んでなる反応
媒体中で、反応条件下、酸素の存在下で、水素供与分子をインキュベートするこ
とを含んでなる。
【００１３】 本発明において「酸化」は、最も広い意味で、酵素によって触媒される酸化反
応に関わる。より詳細には、この用語はモノオキシゲナーゼ（E. C. 1. 14. -.
-）クラスに属する酵素、特にシトクロムP450酵素、によって触媒される酸化反
応を含む。このような酸化反応には下記が含まれる： a) 飽和もしくは不飽和、脂肪族もしくは芳香族の炭素原子における炭素の酸化
、たとえばヒドロキシル化およびエポキシ化； b) 硫黄の酸化； c) 窒素の酸化； d) 酸化的脱アルキル化；および e) 酸化的脱ハロゲン化。
【００１４】 水素供与分子は式 R-X の化合物から選択することが望ましく、 式中、Rは、直鎖または分枝鎖であるが、望ましくは直鎖の、8個以上の炭素原子
、たとえば10〜30個の炭素原子、を有するアルキル基であり、 Xは、水素結合を形成することのできる極性基、望ましくは、カルボキシル、ア
ミド、ニトリル、スルフェート、スルホン、アミンまたはヒドロキシル基である
。
【００１５】 上記方法の望ましい変法は、末端または末端付近で（すなわちω-1位からω-4
位において）ヒドロキシル化された脂肪酸の酵素的調製に関わる。この方法は a) ヒドロキシル化可能な脂肪酸またはヒドロキシル化可能な脂肪酸誘導体を、
上記の定義に従う電子供与体系の存在下で、シトクロムP450モノオキシゲナーゼ
および酸素を用いて変換すること；および b) ヒドロキシル化された生成物を単離すること、 を含んでなる。
【００１６】 本発明にしたがってω-ヒドロキシル化可能な（すなわち、末端または末端付
近でヒドロキシル化可能な）脂肪酸またはその誘導体は、末端が飽和で、分枝し
た、または分枝のない脂肪酸であって、8個以上、たとえば10個より多い炭素原
子を有する、とりわけC12-C30脂肪酸から選択するか、または誘導することが望
ましい。
【００１７】 本発明にしたがってヒドロキシル化することができる脂肪酸の、言及すべき例
としては、カプリル酸、ペラルゴン酸、ウンデカン酸、ラウリン酸、トリデカン
酸、ミリスチン酸、ペンタデカン酸、パルミチン酸、マルガリン酸、ステアリン
酸、ノナデカン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸、セロチン酸、お
よびメリシン酸があるが、これらに限定するものではない。
【００１８】 適当な脂肪酸誘導体の例としては、望ましくは短鎖の、より望ましくはC1-C4-
カルボン酸とのC1-C4-アルキルエステル、アミド、または酸無水物がある。
【００１９】 上記の本発明の方法において使用することが望ましい酵素は、下記から選択さ
れるシトクロムP450モノオキシゲナーゼである：酵素分類E.C.1.14.-.-のシトク
ロムP450モノオキシゲナーゼであって、特にCYP102 P450ファミリー由来の酵素
、または真核生物もしくは原核生物、特に細菌由来の酵素、および、望ましくは
バシラス・メガテリウム(Bacillus megaterium) (DSM 32T)から単離された野生
型酵素；またはそれらの変異体。
【００２０】 配列番号35に示すアミノ酸配列を有する、バシラス・メガテリウム(Bacillus
megaterium)由来のシトクロムP450モノオキシゲナーゼから望ましい一群の突然
変異体が誘導されたが、これは下記のアミノ酸配列領域のひとつにおいて少なく
とも１の機能的突然変異を有する：24-28, 45-51, 70-72, 73-82 (ヘリックス5)
, 86-88 (ヘリックス6), 172-224 (F/Gループ) および352-356 (βストランド8)
;ならびに、これらの突然変異体の機能的に同等の突然変異を有する。
【００２１】 本発明において「機能的突然変異」は、規定された配列領域内にアミノ酸置換
を含むが、たとえばヒドロキシル化のような、上記の酸化反応の１つを依然とし
て触媒することができる突然変異体をもたらすものである。
【００２２】 本発明にしたがって、特に望ましいのは、P450 BM-3モノオキシゲナーゼ突然
変異体であって、これらはそれぞれ、86-88, 172-224, 73-82, 45-51, 24-28, 7
0-72および352-356 (配列番号35に示すとおり)のアミノ酸領域内に少なくとも１
つの機能的突然変異を単独でまたは組合せで含む。
【００２３】 特に、野生型酵素の配列番号35に示す位置26, 47, 72, 74, 87, 188および354
のうち少なくとも１箇所にアミノ酸置換を存在させることが可能性である。
【００２４】 したがって、たとえば、Phe87を、Ala, Val, Leu, 特に ValもしくはAlaのよ
うな、脂肪族側鎖を有するアミノ酸で置換することができる；Leu88を、たとえ
ばAsn, Gln, Argもしくは特に Lysのような、アミンまたはアミド側鎖を有する
アミノ酸、またはAla, Gly, SerおよびTrp のようなアミノ酸で置換することが
できる；Ala74を、たとえばValおよび、特にGlyのような脂肪族側鎖を有する別
のアミノ酸で置換することができる；Arg47を、たとえばHis、Tyrまたは、特にP
heのような、環状の側鎖を有するアミノ酸で置換することができる ；さらにVal
26を、たとえばSerまたは望ましくはThrのような、ヒドロキシル側鎖を有するア
ミノ酸で置換することができる。たとえば、Ser72を、たとえば、Ala, Val, Leu
, Ileおよび、特にGlyのような、脂肪族側鎖を有するアミノ酸で置換することが
でき、さらにMet354を、たとえばSer、または望ましくはThrのような、ヒドロキ
シル側鎖を有するアミノ酸で置換することができる。 突然変異体の例は： a) F87V; b) F87A, L188K; c) F87V, L188K; d) F87A, L188K; A74G; e) F87V, L188K, A74G; f) F87A, L188K, A74G, R47F; g) F87V, L188K, A74G, R47F; h) F87A, L188K, A74G, R47F, V26T; または i) F87V, L188K, A74G, R47F, V26T; k) V26T, l) R47F, m) S72G, n) A74G, o) F87A p) L188z, ここにおいて zはK, R, W, Q, N, G, AまたはSである、 および q) M354T; ならびに、これらと機能的に同等なものである。
【００２５】 適当な突然変異体は、たとえば先行するDE-A-100 11 723にも記載されており
、これを、参考として本明細書に含めるものとする。
【００２６】 使用された突然変異体および機能的に同等なものは、さらに、野生型酵素と比
較して、「変化した基質プロフィール」を示す可能性がある。
【００２７】 「変化した基質プロフィール」は、本発明において、下記を意味する： a) 反応性の変化、たとえば、突然変異体の、少なくとも１つの酸化可能な基質
に対する比活性（変換された基質のnmol数/分/P450酵素のnmol数、として表され
る）、および／または、Kcat、KmおよびKcat/Kmから選択される少なくとも１つ
の速度論的パラメーターが、野生型酵素と比較してたとえば少なくとも1%、たと
えば10〜1000%、10〜500%、もしくは10〜100%増加すること；および／または b) 位置選択性の変化、たとえば、酸化反応のために望ましい位置の移動；これ
は必然的に、少なくとも１つの、ヒドロキシル化可能なカルボン酸、またはヒド
ロキシル化可能な脂肪族カルボン酸の誘導体の望ましい、末端または末端付近（
ω-1,ω-2,ω-3,ω-4、特にω-1からω-3まで）のヒドロキシル化位置の移動を
伴う。基質プロフィールの変化は、全長範囲（すなわちC8-C30)にわたり、また
は一部の範囲にのみ（たとえばC8-C12-, C10-C12-, C12-C30-, C12-C25-もしく
は C12-C20 カルボン酸、または上記の部分範囲からの個々のカルボン酸の場合
）現れうる。
【００２８】 「機能的に同等なもの」は、本発明によれば、さらに、上記配列位置の少なく
とも１箇所に、特に言及した以外のアミノ酸置換を有するが、依然として、明確
に言及した突然変異体とまったく同様に、上記で定義された酸化反応の１つを触
媒する突然変異体を意味する。
【００２９】 また、特に、反応性パターンにおける変化が質的に一致する場合にも、機能的
な同等性が存在する。
【００３０】 「機能的に同等なもの」はまた、当然、特に言及したP450 BM3突然変異体と同
様の方法で、他の生物に由来するP450酵素の突然変異によって得られるP450モノ
オキシゲナーゼ突然変異体を包含する。たとえば、配列を比較することによって
、相同配列領域を明らかにすることができる。さらに、分子モデリングの最新の
方法を用いて、本発明の明確に限定された要求に基づいて、反応パターンに影響
を及ぼす同等の突然変異を起すことができる。
【００３１】 「機能的に同等なもの」は、同様に、１個以上の追加のアミノ酸の付加、置換
、欠失、および／または逆位によって得られる突然変異体を包含するが、前記の
追加の変化は、上記の意味で「変化した基質プロフィール」を有する突然変異体
を結果として生じる限り、配列のいかなる位置に起ることも可能である。
【００３２】 使用に適した突然変異体は、87位に突然変異を含んでなり、突然変異F87Aまた
はF87Vから選択されるが、これは、場合によっては、下記の突然変異：L188K, A
74G, R47FおよびV26T、のうち少なくとも１の他の突然変異を有することがある
。特に望ましいのは、一重突然変異体F87Aおよび五重突然変異体F87A, L188K, A
74G, R47F, V26T（アミノ酸は一文字コードで表記；表示された位置の左側が元
のアミノ酸；表示された位置の右側が新たなアミノ酸）である。
【００３３】 上記の方法は、亜鉛／コバルト(III)セパルクレート電子供与体系を用いて実
施することができる。
【００３４】 本方法の望ましい実施形態において、変換は塩素イオンの存在下で行なった。
【００３５】 過酸化水素開裂酵素、たとえばカタラーゼ、が存在することも、有利であると
考えられる。
【００３６】 本発明はさらに、炭化水素を含有する水素供与分子に酸素を酵素的に伝達する
ために使用するバイオリアクターに関するが、特にω-ヒドロキシル化脂肪酸を
製造するための使用に関する。これは、固定化モノオキシゲナーゼ（たとえば、
DEAE 650MまたはSuper Q650Mのような担体材料上に固定化される）および上記の
定義に従う電子供与体系を、液体の反応媒体中に含んでなる。リアクターの具体
的な設計は、通常の専門的知識に基づく。
【００３７】 さらに本発明は、脂肪酸モノオキシゲナーゼの検出法に関するが、これは下記
を含んでなる： a) 上記の定義に従う電子供与体系の存在下で、酵素活性をもつと予想される被
検体を、末端に除去可能な発蛍光団または発色団を有するω-ヒドロキシル化可
能な脂肪酸または脂肪酸誘導体とともにインキュベートすること；および b) 発蛍光団または発色団の脱離を定性的または定量的に測定すること。
【００３８】 適当な被検体の例は、たとえば細菌株の細胞ホモジネートである。本発明の検
出法を用いて、酵素活性について、たとえば菌株のコレクションをスクリーニン
グすることができる。
【００３９】 こうした場合、反応は、過酸化水素開裂酵素の存在下で、さらに、適当ならば
塩素イオンの存在下で、行なうことが望ましい。
【００４０】 適当な発蛍光団および発色団の例は、フェノール、カテコール、ヒドロキシク
マリン、フェノキサジンがあるが、特に、レゾルフィンである。
【００４１】 上記の酵素的変換および検出反応のための方法に関する最適なパラメーターの
設定は、以下の実験の項にある指示説明を考慮することによって直接行なうこと
ができる。これに限定されるわけではないが、たとえばコバルト(III)セパルク
レート濃度が0.1mMより大で、たとえば0.5〜1.0 mMであれば特に有利である；同
様に、pHは約8〜8.5；亜鉛濃度は約2 mg/mlより大で、約5〜50 mg/mlである。過
酸化水素開裂酵素は、たとえば約10〜5000U/mlの量を使用することができる。
【００４２】 最後に、本発明はさらに、検査キットに関するが、より詳細には、上記のカル
ボン酸モノオキシゲナーゼ検出法を実施するためのキットであって、上記の定義
に従う電子供与体系を含んでなる。
【００４３】 本発明の様々な実施可能な使用法を、さらに下記の項で説明する。
【００４４】P450系の触媒反応およびファインケミカルズ合成における工業的応用の実例 生物において、P450酵素は、エルゴステロール合成、昆虫ホルモンおよび植物
ホルモンの生合成、植物における果実、芳香および色の成熟の進行、グルココル
チコイドおよびミネラルコルチコイドの生合成、アンドロゲンのエストロゲンへ
の芳香族化、正常な上皮の増殖／分化を制御するレチノイドの代謝、プロスタグ
ランジン、ロイコトリエンおよびトロンボキサンを生成するアラキドン酸代謝、
および血管作動性産物の生成に特に役割を担っている。
【００４５】 P450酵素は、酸素添加によって、水に不溶性または難溶性の化合物をさらに代
謝するために準備する、いわゆるフェーズI酵素に属する。グルタチオントラン
スフェラーゼ、N-アセチルトランスフェラーゼまたはスルホトランスフェラーゼ
のような、先にヒドロキシル化またはエポキシ化された化合物に極性基を付加す
るフェーズII酵素は、上記の目的に適している。これによって、上記の代謝物は
水溶性となり、したがって生物学的に利用可能となる。シトクロムP450酵素によ
って触媒される反応の多様性を下記にまとめ、その経済的および機能的な重要性
に関して検討した。表1は、選択されたファミリーに分類された概要を示す。
【００４６】
【表１】
【００４７】 CYP1-3酵素ファミリーのP450酵素はおもに生体異物の代謝を担う；そこで起る
酸化反応は、以後、C、SおよびNの酸化、脱アルキル化、ならびに脱ハロゲン化
に分けられる。
【００４８】 a) Cの酸化 P450酵素は、脂肪族および芳香族系において、活性化されていないC-H結合お
よび／またはC=C二重結合をヒドロキシル化またはエポキシ化する。生成した代
謝物は、神経毒素2,5-ヘキサンジオンのように毒性があり、あるいはDNAをアル
キル化するエポキシド（たとえばスチレンオキシド）のように発癌性があること
も多い。さらに、P450酵素によってC-酸化されたニトロソアミンおよびベンゾピ
レンは発癌作用を有する。
【００４９】 バルビツール酸塩やフェノバルビタールのような薬物も、同様にP450酵素によ
って活性型に変換される。活性化されていない-C-H結合のヒドロキシル化は、化
学的な方法との競合がほとんどないため、最も有用な生物変換反応の１つである
。フリーラジカル反応とは異なり、C原子に関する生物学的なヒドロキシ化反応
は次のような活性順を示す：第２級＞第３級＞第１級。工業的に行なわれる公知
の方法は、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)によるプロゲステロン
の11α位でのヒドロキシル化であり、これは従来の37工程のうち約半分を不要に
したが、さらにフサリウム・エクイセチ(Fusarium equiseti)による3α-ヒドロ
キシ-5β-コール酸の7β-ヒドロキシル化がある。産物であるウルソデオキシコ
ール酸は、コレステロールを溶解することができるので、胆石の治療に使用され
る。不斉合成において生物変換は、とりわけ、ビタミン合成（α-トコフェロー
ル）、香料、抗生物質（カルシマイシン）、およびキラルな分枝したエポキシ化
アルケンの出発材料であるβ-ヒドロキシ酪酸を合成するために使用される。
【００５０】 b) Nの酸化／Sの酸化 P450酵素は、ベンジジン、4-ビフェニルアミンおよび2-アセトアミノフルオレ
ンのような、アリールアミンおよびアセチル化アミン、ならびに食料品を黒こげ
にすると生じる類似のヘテロ環を、N原子のところでヒドロキシル化する。ヒド
ロキシル基をさらにアセチル化またはスルホン化すると、高い発癌性を有する求
電子性物質を生じる。
【００５１】 アリールおよびアルキルチオエーテルは、P450モノオキシゲナーゼによって、
S原子のところで、直接酸化されスルホキシドとなる。しかしながら、酸化はし
ばしばスルホキシドの段階では止まらない；スルホキシドの大部分がさらに酸化
されて対応するスルホン化合物となるが、それらは細胞傷害作用を有することが
多い。キラルなジチオアセタールの微生物による酸化は、コリネバクテリウム・
エクイ(Corynebacterium equi)およびヘルミントスポリウム sp. (Helminthospo
rium sp.)を使用して、高いエナンチオマー過剰で起こる。
【００５２】 c) 酸化的脱アルキル化 P450酵素は、また、酸化的O-、N-およびS-脱アルキル化も触媒する。 このよ
うな重要な反応の例は、コデイン、メスカリン、フェナセチンのO-脱アルキル化
、エフェドリン、メタンフェタミン、アミノプリンのN-脱アルキル化、ならびに
6-メチルチオプリンの6-メチルプリンへのS-脱アルキル化である。
【００５３】 d) 酸化的脱アミノ化 P450酵素は、また、アミンの酸化的脱アミノ化も触媒する。この反応は、主と
して、生物にとって解毒作用を有する。特にヒスタミン、ノルエピネフリンおよ
びメスカリンは、この方法によって脱アミノ化することができる。
【００５４】 e) 酸化的脱ハロゲン化 多くのハロゲン化アルカンおよびアルケンは、-C-H結合のヒドロキシル化の後
に、アルデヒドまたはケトン、およびH-ハロゲンに分解する不安定な中間体を生
成する。例としては、二臭化エチレンの2-ブロモアセトアルデヒドへの酸化、お
よびクロロホルムのホスゲンへの酸化がある。モノおよびジハロゲン化メタンは
トリハロゲン化クロロホルムと比べてわずかに低い細胞傷害性を有する代謝物を
生成する。
【００５５】 提示されたP450反応タイプの機構の説明は、Koymansら、Xenobiotica, (1993)
23(6):633による総説に見出すことができる。ファインケミカルズ合成へのP450モノオキシゲナーゼのin vivo/in vitroでの使 用: 微生物による生物変換とは異なり、組換え的に発現されたP450モノオキシゲナ
ーゼのファインケミカルズ合成への使用は、その大きな可能性にもかかわらず、
いくつかのin vivo法、たとえば香料の中間体としてのジカルボン酸の調製、プ
ロゲステロンのようなステロイドの調製、ならびに芳香物質（ラクトン）、ポリ
マーおよび医薬剤形の前駆体としての、末端付近でヒドロキシル化された飽和お
よび不飽和脂肪酸の調製、に制限されている。
【００５６】 ファインケミカルズ合成へのP450モノオキシゲナーゼ酵素のin vitroでの利用
は、現在までのところ文献に発表されていない。P450モノオキシゲナーゼをファ
インケミカルズ合成に利用するためには、機能的に活性なP450が種の境界を越え
て高収率で発現することを可能にする発現系が利用できることが必要である。さ
らに、酵素は十分高い活性および安定性（温度安定性、溶媒安定性、酸化安定性
）を有していなくてはならない。生成した代謝物はタンパク質や宿主に対して毒
性を示してはならない。クラスIおよびクラスIIについては、さらに、適当な補
因子再循環系が利用できる必要がある。本発明はこのための状況を作り出す。
【００５７】P450 BM-3モノオキシゲナーゼ系 P450 BM-3 (CYP102)は、1986年に初めて、バシラス・メガテリウム(Bacillus
megaterium)由来の第３のP450モノオキシゲナーゼとして、機能的な活性を有す
る状態で大腸菌(E. coli)において発現され、特性が決定された。分子量は118 k
Daであって、P450 BM-3は、一本のポリペプチド鎖に３つのすべてのドメイン（F
AD, FMN, P450）を含有する、最初に認められた水溶性天然融合タンパク質であ
った。基質を含まないP450ドメインの結晶化は1993年に達成され(Ravichandran
ら、 Science (1993) 261, 731)、基質を有するドメインの結晶化は1997年に達
成された (Li ら、Nature Structural Biology (1997), 4(2): 140)。 P450 BM-
3は、その配列の真核生物P450との相同性のために、さらに真核生物P450の結晶
構造を欠くために、これらのP450酵素のための望ましい構造モデルとしての役割
を果す。
【００５８】 P450 BM-3は、鎖長C12〜C22のカルボン酸、アルコール、アミド、アルキルア
ンモニウム化合物を末端付近でヒドロキシル化する、脂肪酸ヒドロキシラーゼで
ある。ヒドロキシル化の位置特異性は表2に示すように、脂肪酸の鎖長に大きく
依存する。
【００５９】
【表２】
【００６０】 ここで、添付の図面を参照して、また本発明の供与体系の、P450酵素を用いた
脂肪酸のヒドロキシル化への利用に関する下記の実施例を参照して、本発明をよ
り詳細に説明する。
【００６１】参考例１：微生物学的方法 1. 微生物およびプラスミド、化学薬品および酵素 細菌Bacillus megateriumは、DSMZ菌株コレクション(32T, Braunschweig, Ger
many)から分譲され、大腸菌（E.coli）菌株DH5α, JM105およびJM109はClontech
(Heidelberg, Germany)より購入し、XL1-BlueはStratagene(Heidelberg, German
y)より購入した。菌株W3110はInstitut fur Bioverfahrenstechnik(Stuttgart,
Germany)から入手した。特に言及しない限り、後述のクローニング操作には大腸
菌株DH5α(supE44, lacU169 [80lacZ M15] hsdR17 recA1 endA1 gyrA96 thi-1 r
elA1)を使用した。使用したプラスミドは、バクテリオファージλの温度-誘導性
PRPLプロモーター系を有するpCYTEXP1(Belev T.N.ら、Plasmid (1991) 26:147)
、およびテトラサイクリンプロモーターを有するpASK-IBA1CA(Schmidt, T.G.M.
ら、J. Chromatogr. A (1994) 676:337; Schmidt, T.G.M.ら、J.Mol.Biol. (199
6) 255:753)である。P450 BM-3の異種発現のためにこの実験で使用した菌株およ
びプラスミドを表３にまとめたが、ここで、pTは、pCYTEXP1プラスミド由来のP4
50 BM-3構築物の起源を表し、pAはpASK-IBA1CAプラスミドの起源を示す。
【００６２】
【表３】 特に言及しない限り、すべての化学製品はFluka Chemie(Buchs, Switzerland)
から購入し、すべての酵素はNew England Biolabs(Beverly, USA)またはBoehrin
ger Mannheim(Penzberg, Germany)から入手した。
【００６３】 2. 培地 すべての複合培地はDifco(Augsburg, Germany)製を用いた。
【００６４】 a) 栄養培地(Bacillus megaterium用完全培地) ペプトン 5.0 g バクトビーフ 3.0 g バクトペプトン 5.0 g 寒天 15 g (平板培養用のみ) MnSO4*H2O 10 mg H2O 最終 1000 ml グリセロール培養 グリセロール(86%) 500 μl 培養(OD578=1.0) 500 μl b) Luria-Bertani-Amp(LB-Amp, 大腸菌用完全培地) トリプトン 10.0 g NaCl 5.0 g 酵母エキス 5.0 g 寒天 20.0 g(平板培養用のみ) アンピシリン 100 g/ml H2O 最終1000 ml
【００６５】 3. 大腸菌株およびBacillus megateriumの培養 a) 振盪フラスコ実験 Bacillus megateriumは栄養培地において30℃で培養し、組換え型大腸菌株(DH
5a, JM105, JM109, XL1-Blue, W3110)は、LB-Amp培地において37℃で培養した。
このために、それぞれの場合について、１コロニーを、植菌耳によって寒天平板
から5 mlのLB-Amp中に移した。30℃（Bacillus megaterium）および37℃（大腸
菌）で、220 rpmの速度で振盪して約18時間培養した後、2 lフラスコに入れた40
0 mlの培地に4 mlの培養物を植菌した。OD578が0.8〜1.0に達した後、pTプラス
ミド構築物の場合には42℃で3〜4時間の熱ショック誘導によって、また、pA-USC
4BM3プラスミドの場合には無水テトラサイクリンを添加（最終濃度0.4 mg/l）し
14時間30℃でインキュベートすることによって、大腸菌においてP450発現を誘導
した。
【００６６】 b) 30-lバッチ発酵 発現カセットpT-USC1BM3、宿主DH5a、およびバイオエンジニアリング発酵槽タ
イプLP351を使用し、通気は3.5 l/分、撹拌速度は300 rpmとし、37℃で、初発pH
7.5のLB-Amp培地を用いて、調製用のP450 BM-3生産を行なった。発泡を抑え、収
率を上げるために、LB-Amp培地に植菌する前に、2.0 mlの滅菌済みContraspum 2
10(ZSchimmer & Schwarz, Lahnstein, Germany)および0.1 mg/l FeCl3を添加し
た(Nishihara ら、1997)。植菌は、２つの400 ml振盪フラスコ培養物（OD578=0.
8-1.0、a）項参照）を添加することによって行なった。発酵槽のOD578が1.0に達
した後、温度を3〜4時間のあいだ37℃から42℃に上げることによって、熱ショッ
ク誘導によりP450生産が生じた。P450 BM-3または変異体F87Aは、大腸菌DH5aに
おいて、発酵槽培養液1 lについて36〜48 mgの収率で発現した。大腸菌培養物は
、Filtron(Dreieich, Germany)のCentrasette OMEGA(0.3 μm)膜を有するMillip
oreアプリケーション(Eschborn, Germany)を使用したクロスフロー濾過によって
30リットルから2リットルに濃縮した。9200 gで20分間遠心分離した後、細胞を
リン酸カリウムバッファー(50 mM, pH 7.5)またはTris/HClバッファー(50 mM, p
H 7.5)に再び懸濁し、12本の50 ml Falconチューブ(Greiner)に等分し、さらに
また使用するまで-20℃で凍結した。
【００６７】参考例２：合成オリゴヌクレオチド すべてのプライマーは、ARK Scientific GmbH Biosystems(Dusseldorf, Germa
ny)によって調製された。点突然変異のためのプライマー、およびBacillus mega
teriumゲノムDNAからP450 BM-3遺伝子を単離するためのプライマーだけは、HPLC
によって精製した。
【００６８】 a) Bacillus megateriumゲノムDNAのためのオリゴヌクレオチド B1) 5'-GTGAAAGAGGGATCCCATGACAATTAAAGAAATGCC-3' (配列番号 1) B2) 5'-GCCTCTTGGATCCTTACCCAGCCCACACGTCTTTTGCG-3' (配列番号 2)
【００６９】 b) 配列決定のためのプライマー R0_5 5'-GTACGTGATTTTGCAGGAG-3' (配列番号 3) R1 5'-GGCTATCATGCGATGATGGT-3' (配列番号 4) R1_5 5'-CCCAGCTTATGATGAAAAC-3' (配列番号 5) R2 5'-GGAAAAGATCCAGAAACGGG-3' (配列番号 6) R2_5 5'-GTCGGCATGGTCTTAAACG-3' (配列番号 7) R3 5'-ATTCCTCAGCTTCACCGTGA-3' (配列番号 8) R3_5 5'-CTTGGCGGTATTCCTTCAC-3' (配列番号 9) R4 5'-ATTTGCACCGCAGGTCGCAA-3' (配列番号 10) R4_5 5'-CTGGGCTACTACGTATC-3' (配列番号 11) R5 5'-TTCAATTTGTCGACAGCGCC-3' (配列番号 12) R5_5 5'-GAAGGAGATCATTTAGGTG-3' (配列番号 13) R6 5'-TCGCGCAATGGCTGCTAAAA-3' (配列番号 14) R6_5 5'-CGATTTCTTCATCACCTC-3' (配列番号 15) R7 5'-CTGCCAAAAGACCCTGAAAC-3' (配列番号 16) L1 5'-ACCATCATCGCATGATAGCC-3' (配列番号 17) L2 5'-CCCGTTTCTGGATCTTTTCC-3' (配列番号 18) L3 5'-TCACGGTGAAGCTGAGGAAT-3' (配列番号 19) L4 5'-TTGCGACCTGCGGTGCAAAT-3' (配列番号 20) L5 5'-GGCGCTGTCGACAAATTGAA-3' (配列番号 21) L6 5'-TTTTAGCAGCCATTGCGCGA-3' (配列番号 22) L7 5'-GTTTCAGGGTCTTTTGGCAG-3' (配列番号 23)
【００７０】 c) C末端のタグのためのオリゴヌクレオチド A1) 5'-GTGAAAGAGGGATCCCATGACAATTAAAGAAATGCC-3' (配列番号 24) A2) 5'-CGGAATTCTTAACGACGACGACGACGACGCCCAGCCCACACG-3' (配列番号 25) G1) 5'-GTGAAAGAGGGATCCCATGACAATTAAAGAAATGCC-3' (配列番号 26) G2) 5'-CGGAATTCTTATTCTTCTTCTTCTTCTTCCCCAGCCCACACG-3' (配列番号 27) H1) 5'-GTGAAAGAGGGATCCCATGACAATTAAAGAAATGCC-3' (配列番号 28) H2) 5'-CGCAATTCTTAATGATGATGATGATGATGCCCAGCCCACACG-3' (配列番号 29) S1) 5'-GTCTCAGCGTGAGACCCCCAGCCCACACGTCTTTTGCC-3' (配列番号 30) S2) 5'-GTGAAAGAGGTCTCCAATGACAATTAAAGAAATGCC-3' (配列番号 31)
【００７１】 d) P450 BM-3 F87A点突然変異体のためのプライマー F87A1 5'-GCAGGAGACGGGTTGGCCACAAGCTGGACGCATG-3' (配列番号 32) F87A2 5'-CATGCGTCCAGCTTGTGGCCAACCCGTCTCCTGC-3' (配列番号 33)
【００７２】参考例３：遺伝子工学的方法 1. BacillusゲノムDNAおよび大腸菌由来プラスミドDNAの単離および沈澱 Bacillus megateriumからゲノムDNAを、フェノール／クロロホルム抽出によっ
て単離するために、200 mlの培養上清(OD578=1.2)から得られた細胞ペレットを
、20 mlのリゾチーム混合物(18 mgリゾチーム, 50 mM EDTA, 50 mM NaCl, 30 mM
Tris/HCl, pH 8.0)に再懸濁し、37℃で30分間、220 rpmで振盪した。2 ml SDS(
10% (m/v))の添加後、37℃、200 rpmで、60分間インキュベーションを継続した
。クロロホルム／イソアミルアルコール混合物(Roth, Karlsruhe, Germany)で3
回、フェノールで1回抽出することによって、細胞破砕片を除去した。10% (v/v)
3 M酢酸ナトリウム, pH 4.8および60% (v/v)イソプロパノールの添加によって
ゲノムDNAを沈澱させ、ガラス棒に巻き取ってCorexチューブに移し、32,570 gで
遠心分離した。70%エタノールで3回洗浄後、"house vacuum"下でDNAを乾燥し、3
mlのTEバッファー(10 mM Tris/HCl, 1 mM EDTA, pH 7.5)に溶解した。DNAの純
度は、分光学的に280 nmに対する260 nmの比、たとえば2.2、をとることによっ
て、判定した。 プラスミドDNAは、QIAprep spin miniprepキットを製造業者(Qiagen)の使用説
明書に厳密にしたがって使用して、大腸菌から単離されたが、これは細胞のアル
カリ溶解に基づくものである。
【００７３】 2. ポリメラーゼ連鎖反応(PCR) a) Bacillus megateriumゲノムDNAからP450 BM-3遺伝子を単離するためのPCR 標準のPCRプロトコール 標準混合物 8 μlのdNTP混合物(200μM), 10 μlのMgCl2を除いたTaqポリメラーゼバッフ
ァー(10 x), 8 μl MgCl2 (25mM), 1 μlのプライマーB1 (0.1 μM), 1 μlのプ
ライマーB2 (0.1 μM), 1 μlのBacillus megateriumゲノムDNA, 2.5 U Taqポリ
メラーゼ(MBI Fermentas, Vilnius, Lithuania), 100 μlまでの脱塩水。
【００７４】 b) C末端のタグ配列の導入 タンパク質の精製を簡素化し、P450 BM-3を指向性固定化するために、P450 BM
-3遺伝子に、それぞれの場合ごとに6アミノ酸の長さのC末端タグを付した。Baci
llus megateriumゲノムDNAは、鋳型として機能した。His, ArgおよびGluタグの
ために選択する突出した制限末端は、後で、修飾されたP450-BM-3遺伝子をプラ
スミドpCYTEXP1にクローニングするために、BamHIおよびEcoRIとした。Strepタ
グのための5'および3'末端には、BsaIを選択した。これによって、プラスミドpA
SK-IBA1CAにクローニングすることが可能になる。BsaIは、認識配列後のみを切
断するので、その結果、異なった配列を有する突出した制限末端となり、したが
って方向性のある連結反応が可能となる。 PCRには標準のPCR手順および標準混合物を使用した。標準混合物との相違点は
、His6タグのためにはプライマーH1およびH2を使用し、Arg6タグにはプライマー
A1およびA2を用い、Glu6タグにはプライマーG1およびG2を、さらにStrepタグに
はプライマーS1およびS2を使用したことである。
【００７５】 3. DNA断片の制限切断、電気泳動による分離および精製 制限エンドヌクレアーゼによってDNAを配列-特異的に切断する。DNAの制限切
断は、反応容量10μlで、2-3μl DNA(spin-prep (Qiagen)), 1-2 U制限酵素, 1
μl制限バッファー(10x)および10μlまでのddH2Oの存在下で、メーカーの説明書
の方法に従って、制限溶液を（BsaIを除き）37℃で2時間インキュベートするこ
とによって行なった。DNA断片をSambrookら、1989の方法に従って、アガロース
ゲル電気泳動によって精製した。分画すべきDNA断片の大きさに応じて0.8-2%ア
ガロースゲルを使用した。電気泳動バッファーとして、TAEバッファー(40 mM Tr
is/HCl, 20mM 酢酸, 2 mM EDTA, pH 8.3)を使用した。発熱するため、アガロー
ス濃度1%までのゲルには120Vの電圧をかけ、アガロース濃度2%までのゲルには10
0Vをかけた。エチジウムブロマイドの挿入(最終濃度 0.25 μM)はトランスイル
ミネーターの透過UV光(312 nm)によってDNAを可視的に検出するために使用した
。 QIAquickゲル抽出キット(Qiagen)を使用して、DNA断片をアガロースゲルから
単離した。これによって必然的にDNAは、シリカゲル含有カラムに結合すること
によって固定化され、不純物は様々な洗浄ステップによって除去される。この方
法を用いて、次に脱塩水で溶出することによって、8 μgまでのDNA(100 bp-10 k
b)を得ることができる。
【００７６】 4. 大腸菌への連結反応および形質転換 T4 DNAリガーゼ(New England Biolabs, Beverly, USA)は、DNAの5'-リン酸お
よび3'-ヒドロキシ末端の間のホスホジエステル結合の形成を触媒し、それによ
って2つの線状DNA分子を結合し、または線状分子の環化を可能にするが、これを
DNAの連結に使用した。
【００７７】 連結反応のために、アガロースゲルで精製したベクターおよび挿入断片（3項
参照）を、その挿入断片を多くして1:3から1:5までのモル比で、Eppendorf反応
容器に入れた。2 μlのリガーゼバッファー(10x)および2-10 Uの T4 DNAリガー
ゼを添加する前に、脱塩水を加えた(総容量 20μl)。反応混合物を室温で1時間
、または7℃で一晩インキュベートした。
【００７８】 形質転換のためのコンピテント細胞を調製するために、500 μlの大腸菌一夜
培養物を用いて、50 ml LB培地を入れた250 ml振盪フラスコに植菌した。培養は
、約3時間後にOD600が0.4-0.6に達するまで、37℃で220 rpmでインキュベートし
、その後4℃で3分間、5500gで遠心分離する。細胞ペレットは2 mlのTSSバッファ
ー(10g PEG6000, 5 ml DMSO, 0.6 g MgSO4, 100 mlまでのLB)に再懸濁し、氷上
でインキュベートして200 μlに等分し、液体窒素中で急速凍結後、-80℃で保存
する。
【００７９】 形質転換のために、5から15 μlの連結反応混合物を、200 μlのこのコンピテ
ント細胞に添加した。氷上で30分間インキュベートした後、その形質転換混合物
を42℃で30秒間、サーモミキサー内でインキュベートし、37℃のLB培地800 μl
を添加する。この混合物をインキュベーターにおいて、37℃で1時間振盪する。
次に、細胞を5500 gで遠心し（3分）、滴下したLB培地に懸濁し、LB-Amp寒天平
板上に塗布した。この寒天平板を37℃で一晩、インキュベーター内でインキュベ
ートした。
【００８０】 5. DNAシークエンシング Applied Biosystems DNA 373A自動シークエンサー、およびAmpliTaq DNAポリ
メラーゼを用いたダイターミネーターサイクルシークエンシングキットを使用し
て、DNA配列決定を行なった。Sangerのジデオキシ法を配列決定に用いたが、シ
ークエンシング反応中に合成されるDNA断片に取り込まれるdNTPは、蛍光標識を
有するものを放射能標識dNTPの代わりに使用する。
【００８１】 次に、反応生成物を-20℃に冷却した100％エタノールで沈澱させた。DNAを乾
燥し、ホルムアミドおよび25 mM EDTA, pH 8.0の5:1混合物4 μlに混合後、それ
ぞれのPCR混合物を95℃で5分間変性し、そのサンプルを直ちに氷に移した。
【００８２】 蛍光染料で標識されたDNA断片は、ゲル電気泳動の間、レーザー光線を通過す
る。この光線に垂直に放射された蛍光をゲルの後ろにあるフォトダイオードによ
って測定し、ソフトウェアによってグラフに変換する。
【００８３】 シークエンシング混合物 8 μl調合済みターミネーター反応混合物；3.2 pmolプライマー； 300-500ng
鋳型DNA；H2O 最終20 μlまで。
【００８４】 PCRプログラム シークエンシングゲルの組成： 尿素 30 g (Roth); Rotiphorese NF 10x TBEバッファー 6 ml (Roth); アクリル
アミド／ビス溶液40% (29:1) 9 ml (Roth); 脱塩されたddH2O 23.5 ml。
【００８５】 完成した溶液を濾過し、脱気する。24 μlのTEMEDおよび180 μlの10% (m/v)A
PSを添加して、重合を開始する。配列データの分析およびdNTP標識についての詳
細は、自動シークエンサーのためのハンドブックを参照することができる。
【００８６】 6. QuikChangeキット(Stratagene)を使用したF87A点突然変異 pNCAアッセイ系の感度を上げるために、87位のアミノ酸フェニルアラニンをア
ラニンに置換した。より簡単に点突然変異体を同定することができるように、変
異位置を包含する追加のEaeI制限切断サイトを、アミノ酸配列をそれ以上変化す
ることなしに導入した。
【００８７】 標準のPCRプログラムとは異なり、この場合はわずか4分だけDNA変性を行ない
、シークエンシング反応ステップは、アニーリング温度の52.3℃で行なわれ、17
分の伸長ステップは、16回だけ実施した。第３のプログラムは省略した。
【００８８】 PCR混合物: 1.2 μlのdNTP混合物(200 μM), 5 μl Pfuポリメラーゼバッファー(10x), 2.
5 UのPfuポリメラーゼ, 2.5 μlプライマーF87A1 (5nM), 2.5 μlプライマーF87
A2 (5nM), 1 μl pT-USC1BM3(脱塩水で1:20 に希釈したミニ標品より), 最終容
量 50 μlとなる脱塩水。
【００８９】 52.3℃の「アニーリング」温度によって、上記のPCR後、1パーセントアガロー
スゲル上で、予想された断片の大きさを示すシャープなバンドが明らかになった
。
【００９０】 反応混合物から鉱油を除去した後、1 μlのDpnI(10 U/μl)をPCR混合物に添加
し、その溶液を慎重にピペッティングで上下させて混合した。これを、短時間遠
心し、37℃で1時間インキュベートした。消化の間、ウルトラコンピテント大腸
菌XL1-Blueを氷上で解凍し、15 ml Falconチューブに50 μlずつ等分して分注し
た。1 μlのβ-メルカプトエタノールおよび4 μlの消化されたPCR混合物を添加
し、氷上で30分間インキュベートした後、42℃で30秒間熱ショックを与え、2分
間氷上で冷却した。450 μlの加温した(油浴温度 42℃)NZY培地(12 g NZamine,
5g 酵母エキス, 5 g NaCl, pH 7.5)を形質転換混合物に添加した。37℃、220 rp
mで1時間インキュベートし、遠心(5500 g, 3 分)した後、細胞ペレットを残りの
液体に再懸濁し、LB-Amp 平板上に線状に塗布した。
【００９１】参考例４：調製法 1. 細胞破砕 湿生物量15 g以下の大腸菌DH5α/pT-USC1BM-3またはDH5α/pT-USC1BM-3F87Aの
細胞ペレットを氷上で解凍し、25 mlのリン酸カリウムバッファー(50 mM, pH 7.
5, 1 mM EDTA)またはTris/HClバッファー(50 mM, pH 7.5, 1 mM EDTA)に再懸濁
した。氷冷した大腸菌細胞懸濁液を3分間の超音波処理(Branson Sonifier W250,
(Dietzenbach, Germany), 出力 80 W, 動作間隔 20%)によって破砕した。タン
パク質精製の前に、細胞懸濁液を32,500 gで20分間、遠心分離し、0.22 μm Ste
rivex GPフィルター(Millipore)を通して濾過した。この透明な液体を、以後、
粗抽出物と称する。
【００９２】 2. 陰イオン交換クロマトグラフィーを用いたP450 BM-3の精製 総タンパク質溶出を280 nmで、P450 BM-3溶出を417 nmで、同時に測定するこ
とを可能にする、パソコンベースのOS/2-UNICORNコントロールソフトウェア v2.
1およびFrac-900フラクションコレクターを有するAKTAexplorerシステム(Amersh
am Pharmacia Biotech)を、タンパク質精製のために使用した。
【００９３】 陰イオン交換クロマトグラフィーによる分析用のP450 BM-3タンパク質の精製
はすべて、200 cm/h、室温で、マトリクス100 ml当りP450 BM-3を6-10 mg添加し
て行なった。すべてのクロマトグラフィー材料はTosoHaas(Stuttgart, Germany)
から購入した。
【００９４】 a) クロマトグラフィーカラムの充填および性質検討 P450 BM-3精製プロトコールは、本発明者らが充填したMPD-DEAE 650S(7.5 mm
x 85 mm, 粒径 35 μm, Af=1.1, 4100 TP/m)クロマトグラフィーカラムおよびXK
16/20(16 mm x 100 mm, APB)クロマトグラフィーカラムを使用すること、ならび
に、Toyopearl DEAE 650M(Af=1.1, 1610 Tp/m), SuperQ 650M(Af=1.2, 1840 Tp/
m)およびQAE 550M(Af=1.0, 1780 Tp/m)、粒径65 μm、を包含させることによっ
て開発された。INDEX200 (APB)ガラス製カラム(20 cm x 19 cm, Af=1.4, 3800Tp
/m), 6リットルのToyopearl DEAE 650Mおよびギアポンプ(ISMATEC, PB, USA)を
、調製用クロマトグラフィー精製のために使用した。P450 BM-3の分析用クロマ
トグラフィー精製に対して、AKTAexplorerシステムは、モニターとして1/20に分
割されたフローで使用され、バッファーは調製用精製の前に手作業で作製する。
バッファーは、1 mM EDTAを含有するTris/HCl(0.1 M, pH 7.8)に、塩について第
1段階では150 mM NaClを加え、第2段階では250 mM NaClを加え、さらに第3段階
では1 M NaClを加えたものからなる。
【００９５】 b) pH, 溶出およびバッファー条件の選択 NADPH消費による活性測定に基づいた予備的な検討によって、P450 BM-3の精製
に適したpH範囲が6.8から8.0であることが明らかになった。pNCA検出システムを
用いたpH安定性に関するその後の研究は、上記pH範囲を確認した。 NaClの直線濃度勾配を用いた陰イオン交換クロマトグラフィーによって、1 mM
EDTA含有Tris/HClバッファー(0.1 M, pH 7.8)が、1 mM EDTA含有リン酸バッフ
ァー(0.1 M, pH 7.0〜pH 7.5)よりも、P450 BM-3に対する結合能力および分離能
力について明白に優れていることが明らかになった。上記の理由により、これ以
降すべての精製をもっとも有効にするためにTris/HClバッファー系を使用した。
【００９６】 3. 変異体P450 BM-3 F87Aの固定化 a) 担体材料の選択に関する予備的実験 P450 BM-3 F87Aの固定化について、予備的な実験で、様々な吸着法および共有
結合法を研究した。100 mgの担体材料(例外: EP-100, 50 mg)および5 nmolのP45
0 BM-3 F87A(粗抽出物由来)を、すべての予備的実験に使用した。 吸着法に適した担体材料を選択するために、5 nmolのP450 BM-3 F87Aを、2 ml
Eppendorf反応容器にいれたKxPO4バッファー(20 mM, pH7.5, 最終 1600 μl)担
体材料懸濁液に添加した。反応容器を250 ml丸底フラスコの外側に粘着テープで
留め付けた後、タンパク質の固定化のために1時間ロータリーエバポレーターで
、ゆっくりと反転する回転に供した。吸着能力を判定するために、固定化物を90
00 gで1分間遠心し、上清の200 μlを活性測定のために取り分けた。
【００９７】 b) DEAE 650MおよびSuper Q650Mのための最適な固定化法 沈降させたDEAE 650M吸着材ml当り、81 nmol以下のP450 BM-3 F87A粗抽出物ま
たは凍結乾燥物を5 mlのTris/HClバッファー(pH 7.5)中で固定化することができ
る。SuperQ 650M吸着材については、固定化できるのは102 nmol以下のP450 BM-3 F87A粗抽出物である。固定化のために、凍結乾燥物を、15 ml Falcon反応容器
に入れた4 mlのdH2Oに溶解し、12-pNCAを最終濃度0.1 mMとなるように添加した
。室温で5分間インキュベートした後、2回5mlの水で洗浄し、遠心(9000 g, 1 分
)した吸着マトリクス1 mlを、前項で述べたEppendorf反応容器と同様に、30分間
反転する回転に供した。遠心して、上清を除去した後、固定化物を5 ml Tris/HC
lバッファー(pH 7.5, 0.02 mM)と混合し、慎重に再懸濁して、もう1度遠心した(
9000 g, 1 分)。この洗浄プロセスを2回繰り返した。Tris/HClバッファー(0.1 M
, pH 7.5)を固定化物に最終容量 2.0 mlとなるように加えて、固定化物を再懸濁
し、あらかじめ495μlの上記バッファーをいれた1.5 ml Eppendorf反応容器に、
200 μlずつ等量に分注した。12-pNCA(15 mM)を5μl添加し、5分間インキュベー
トした後、Eppendorfシェーカー(Ika-Vibrax, Janke and Kunkel VX2E アタッチ
メントを有する)内で100μl NADPH(1 mM)を添加することによって反応を開始し
、様々な時間反応させた後、100 μlの6 M KOHで反応を止めた。9000 g(1分)で
遠心後、上清を取り分け、410 nmの吸収を測定した。
【００９８】 グルタルアルデヒドを用いたP450 BM-3 F87Aの共有結合固定化のために、P450
BM-3 F87Aを20 mMリン酸カリウムバッファー(pH 7.5)中で破壊した。5 gのアミ
ノ-修飾Trisoporガラス(Schueller, 粒径 500-800 μm)を、室温で3から12時間
の間、密閉した装置内でグルタルアルデヒド蒸気に暴露した。グルタルアルデヒ
ドを有するアミノ修飾ガラスは赤紫色を示し、この色は100 mlの炭酸カリウム溶
液(50 mM, pH 7.8)を用いて2回洗浄した後もフリット（ガラス粉粒）上に残存し
た。50から150 mgの上記赤紫色ガラスを0.5-0.8 nmolのP450 BM-3 F87Aと混合し
、溶液の色が消えるまで、最も低い設定で、6℃で1時間、Retschボールミル内で
、2 ml Eppendorf反応容器にいれて振盪した。
【００９９】 4. 酵素膜リアクター 酵素膜リアクターの概念を検討するために、25 nmolのP450 BM-3 F87Aを4 ml
のSuperQ 650Mに固定化し、リアクター反応容器内の200 ml Tris/HClバッファー
(pH 7.8)に加えた。40 ml/分の流速で1.2 μmol 12-pNCAを添加した後、その溶
液を濾過モジュールで、逆圧なしで20分間混合した。2 psiの逆圧で、2 ml NADP
H水溶液(1 mM)の添加によって反応を開始し、反応の進行を、410 nmの波長で測
定して追跡した。反応の進行中に、12-pNCAの変換が完了するまで、1 mlずつNAD
PH溶液を添加した。
【０１００】参考例５：化学合成 すべての 1H-NMR スペクトルは500 MHz NMR 装置で記録し、すべての 13C-NMR
は、125 MHz NMR 装置を用いてCDCl3を溶媒として記録した。
【０１０１】 ω-フェノキシカルボン酸 (PCA)の調製 １．反応スキームAは、ω-ブロモカルボン酸からのPCA直接合成法を示す。
【０１０２】 ２．反応スキームA
【化１】 混合物 1.01 g(3.77 mmol)のブロモウンデカン酸または 1.05 g(3.77 mmol)のブロモドデカン酸 355 mg(3.77 mmol)のフェノール 417 mg(7.44 mmol)の水酸化カリウム 50 mlのDMF 一般的反応工程 フェノールおよび水酸化カリウムをDMFに溶解したブロモ-脂肪酸に添加する。
その溶液を6〜7時間還流させながら160℃に加熱し、この反応の次に薄層クロマ
トグラフィー(TLC, 移動相 石油エーテル : ジエチルエーテル 1:1)を行なった
。
【０１０３】 溶媒を除去した後、茶色の沈澱を水-ジエチルエーテル2相系(1:1)に溶解し、希
塩酸を用いてpH 2に調整した。水相をジエチルエーテルで抽出した後、ロータリ
ーエバポレーターで、合わせたジエチルエーテル画分から溶媒を除去し、残渣を
石油エーテル:酢酸エチル1:1に溶解し、DC60 シリカゲルクロマトグラフィーカ
ラム (Merck) および同じ溶媒混合物を用いて精製した。
【０１０４】 特性決定: ω-フェノキシドデカン酸 (12-PCA): 収率: 76%; mp:= 98-99℃ 計算値: C 73.93% H 9.65% O 16.41%, 実測値: C 73.92% H 9.67%1 H-NMR: δ:= 7.26-7.29 (m, 2H, フェニル-), 6.88-6.94 (m, 3H, フェニル),
3.94 (t, 2H, フェニル-O-CH2-, J= 6.5 Hz), 2.35 (t, 2H, -CH2-COO, J=7.5 H
z), 1.74-1.80 (m, 2H, -O-CH2-CH2-), 1.59-1.66 (m, 2H, -CH2-CH2-COO), 1.4
2-1.48 (m, 2H, -O-CH2-CH2-CH2-), 1.29-1.35 (m, 12 H, -O-CH2-CH2-CH2-(CH2 )6-CH2-) 13 C-NMR: δ:= 180.4 (-COO), 159.3 (C 1'), 129.8 (C 3'), 120.8 (C4'), 114
.7 (C 2'), 68.3 (-O-CH2-), 34.5 (-CH2-COO-), 29.9, 29.8, 29.7, 29.7, 29.
5, 29.4, 29.1, 26.5, 25.1 (C-3-C-11)
【０１０５】 ω-フェノキシウンデカン酸 (11-PCA): 収率: 78%; mp:= 95℃ 計算値: C 73.35% H 9.41% O 17.24%, 実測値: C 73.32% H 9.44%1 H-NMR: δ:= 7.18-7.21 (m, 2H, フェニル-), 6.81-6.86 (m, 3H, フェニル),
3.87 (t, 2H, フェニル-O-CH2-, J= 6.5 Hz), 2.27 (t, 2H, -CH2-COO, J=7.5 H
z), 1.67-1.73 (m, 2H, -O-CH2-CH2-), 1.53-1.57 (m, 2H, -CH2-CH2-COO), 1.3
5-1.39 (m, 2H, -O-CH2-CH2-CH2-), 1.18-1.30 (m, 10H, -O-CH2-CH2-CH2-(CH2) 5 -CH2-)13 C-NMR: δ:= 180.5 (-COO), 159.5 (C 1'), 129.8 (C 3'), 120.7 (C4'), 11
4.7 (C 2'), 68.2 (-O-CH2-), 34.5 (-CH2-COO-), 29.9, 29.7, 29.7, 29.7, 29
.6, 29.4, 26.4, 25.0 (C-3-C-10)
【０１０６】 2. p-ニトロフェノキシカルボン酸 (pNCA)の調製 PCA合成とは異なり、pNCA化合物の対応する合成法は不可能であった。pNCA 合
成は、ω-ブロモカルボン酸のエステル化後に初めて可能となり、さらに無水条
件を使用した。
【０１０７】
【化２】 一般的合成法: ω-ブロモカルボン酸のエステル化はヘキサン中で標準的な方法(Beckerら 199
3)にしたがって、1 M HClを含有する無水メタノールまたはエタノール溶液を用
いて行なわれるが、これによってω-ブロモカルボン酸メチルエステルおよびω-
ブロモカルボン酸エチルエステルが生じる。反応の経過はTLC(移動相 ヘキサン
: ジエチルエーテル : 酢酸 70:30:1)を用いて追跡した。 水相をジエチルエー
テルで2回抽出し、その有機相を飽和炭酸水素ナトリウム溶液で2回、脱塩水で1
回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで一晩乾燥し、濾過した後、移動相として石油エ
ーテル：ジエチルエーテル 70:30を用いたクロマトグラフィーによって精製した
。溶媒をロータリーエバポレーターで蒸発させて除いた後、エステルを高真空に
1時間接続した。pNCAエステルを調製するために、少し過剰量の18.5 nmol p-ニ
トロフェノール を、 100 ml DMSOに溶解した17 mmol ω-ブロモカルボン酸エス
テルに添加した。溶液を還流冷却器のもとで2〜3時間120℃に加熱した。うす茶
色がかった溶液を室温に冷却した後、pNCAエステルを沈澱させるために脱塩水を
滴下して加えた。沈澱を濾過し、1.5リットルの氷冷水で洗浄して過剰なp-ニト
ロフェノールを除去し、次にDMSOから再結晶して白色粉末を得た。pNCAエステル
を加水分解するために、Amano (Nagoya, Japan)から購入した100mg の Pseudomo
nas cepacia (PCL) および 100 mg のCandida antarctica リパーゼB からなる
リパーゼ混合物を、100mlのアセトン／水混合物 (pH 7.5, 0.2 M リン酸カリウ
ム、アセトン 50%以下)に添加した。pNCAエステル (5 mmol)を加えた後、その懸
濁液を室温で16時間までの間、撹拌した。固定化されたリパーゼを除くために、
透明な懸濁液を濾過し、アセトンの蒸発によってpNCAを結晶化した。pNCA化合物
を冷水で洗浄し、DMSOから再結晶し、シリカゲル DC60 (Merck, Darmstadt) (石
油エーテル:酢酸エチル 1:1〜1:3)を用いたクロマトグラフィーで精製した。
【０１０８】 pNCAの特性決定 pNCAの記載された収率は、常に前駆体である対応するpNCAエステルに基づき、
pNCAエステルの収率は、常に関連のω-ブロモカルボン酸に基づく。
【０１０９】
【０１１０】 p-ニトロフェノキシヘキサン酸 (6-pNCA): 収率: 81%; mp:= 94℃1 H-NMR: δ:= 8.18 (d, 2H, NO2-フェニル-, J= 9.3Hz), 6.94 (d, 2H, フェニ
ル-O-, J= 9.3 Hz), 4.06 (t, 2H, フェニル-O-CH2-, J= 6.3 Hz), 2.42 (t, 2H
, -CH2-COO, J= 7.1 Hz), 1.80-1.92 (m, 2H, -O-CH2-CH2-), 1.68-1.77 (m, 2H
, -CH2-CH2-COO), 1.49-1.61 (m, 2H, -O-CH2-CH2-)13 C-NMR: δ:= 180.0 (-COOH), 164.1 (C-4'), 141.4 (C-1'), 125.9 (C-2'), 1
14.4 (C-3'), 68.5 (-O-CH2-), 33.9 (-CH2-COOH), 28.6, 25.5, 24.3 (C-3, C-
5, C-4)
【０１１１】 p-ニトロフェノキシヘキサン酸エチル (6-pNCAEt): 収率: 81%1 H-NMR: δ:= 8.09 (d, 2H, NO2-フェニル-, J= 9.3Hz), 6.85 (d, 2H, フェニ
ル-O-, J= 9.3 Hz), 4.05 (q, 2H, -COO-CH2-), 3.97 (t, 2H, フェニル-O-CH2-
, J= 6.4 Hz), 2.26 (t, 2H, -CH2-COO, J= 7.3 Hz), 1.69-1.82 (m, 2H, -O-CH 2 -CH2-), 1.57-1.67 (m, 2H, -CH2-CH2-COO), 1.40-1.50 (m, 2H, -O-CH2-CH2-)
, 1.17 (t, 3H, -COOCH2-CH3)13 C-NMR: δ:= 173.7 (-COO), 164.3 (C 4'), 141.5 (C 1'), 126.0 (C2'), 114
.6 (C 3'), 68.7 (-O-CH2-), 60.4 (-COO-CH2-), 34.3 (-CH2-COO-), 28.8, 25.
7, 24.8 (C-3, C-5, C-4), 14.4 (-O-CH2-CH3)
【０１１２】 p-ニトロフェノキシオクタン酸 (8-pNCA): 収率: 92%; mp:= 98℃1 H-NMR: δ:= 8.11 (d, 2H, NO2-フェニル-, J= 9.2 Hz), 6.86 (d, 2H, フェ
ニル-O-, J= 9.3 Hz), 3.97 (t, 2H, フェニル-O-CH2-, J= 6.4 Hz), 2.29 (t,
2H, -CH2-COO, J= 7.4 Hz), 1.69-1.80 (m, 2H, -O-CH2-CH2), 1.56-1.61 (m, 2
H, -CH2-CH2-COO), 1.32-1.43 (m, 6H, -O-CH2-CH2-(CH2)3-CH2-)13 C-NMR:δ:= 180.2 (-COOH), 164.3 (C 4'), 141.4 (C 1'), 125.9 (C2'), 114
.4 (C 3'), 68.8 (-O-CH2-), 34.0 (-CH2-COOH), 28.9, 28.9, 28.9, 25.8, 24.
6 (C-3-C-7)
【０１１３】 p-ニトロフェノキシオクタン酸メチル (8-pNCAMe): 収率: 79%1 H-NMR:δ:= 8.10 (d, 2H, NO2-フェニル-, J= 9.2 Hz), 6.86 (d, 2H, フェニ
ル-O-, J= 9,3 Hz), 3.97 (t, 2H, フェニル-O-CH2-, J= 6.5 Hz), 3.59 (s, 3H
, -COOCH3), 2.24 (t, 2H, -CH2-COO, J= 7.4 Hz), 1.69-1.77(m, 2H, -O-CH2-C
H2-), 1.51-1.59 (m, 2H, -CH2-CH2-COO), 1.27-1.43 (m, 6H, -O-(CH2)2-(CH2 )3-)13 C-NMR:δ:= 174.2 (-COO), 164.3 (C 4'), 141.4 (C 1'), 125.9 (C2'), 114.
4 (C 3'), 68.8 (-O-CH2-), 51.5 (-COO-CH3), 34.0 (-CH2-COO-), 29.0, 28.9, 28.9, 25.8, 24.9 (C-3-C-7)
【０１１４】 p-ニトロフェノキシデカン酸 (10-pNCA): 収率: 84%; mp:= 101℃1 H-NMR:δ:= 8.18 (d, 2H, NO2-フェニル-, J= 9.2 Hz), 6.93 (d, 2H, フェニ
ル-O-, J= 9.3 Hz), 4.03 (t, 2H, フェニル-O-CH2-, J= 6.5 Hz), 2.35 (t, 2H
, -CH2-COO, J= 7.4 Hz), 1.75-1.86 (m, 2H, -O-CH2-CH2-), 1.60-1.63 (m, 2H
, -CH2-CH2-COO), 1.32-1.45 (m, 10H, -O-CH2-CH2-(CH2)5-CH2-)13 C-NMR:δ:= 180.4 (-COO), 164.4 (C 4'), 141.5 (C 1'), 126.1 (C2'), 114.
6 (C 3'), 69.1 (-O-CH2-), 34.2 (-CH2-COOH), 29.9, 29.4, 29.4, 29.3, 29.2
, 26.3, 26.1, 24.8 (C-3-C-9)
【０１１５】 p-ニトロフェノキシデカン酸メチル (10-pNCAMe): 収率: 73% 1 H-NMR:δ:= 8.11 (d, 2H, NO2-フェニル-, J= 9.2 Hz), 6.86 (d, 2H, フェニ
ル-O-, J= 9.3 Hz), 3.97 (t, 2H, フェニル-O-CH2-, J= 6.5 Hz), 3.59 (s, 3H
, -COOCH3), 2.23 (t, 2H, -CH2-COO, J= 7.5 Hz), 1.68-1.77 (m, 2H, -O-CH2-
CH2-), 1.52-1.57 (m, 2H, -CH2-CH2-COO), 1.22-1.45 (m, 10H, -O-CH2-CH2-(C
H2)5-CH2-)13 C-NMR:δ:= 174.2 (-COO), 164.2 (C 4'), 141.2 (C 1'), 125.8 (C2'), 114.
3 (C 3'), 68.8 (-O-CH2-), 51.3 (-COOCH3), 34.3 (-CH2-COO-), 29.2, 29.1,
29.1, 29.0, 28.9, 25.8, 24.8 (C-3-C-9)
【０１１６】 p-ニトロフェノキシウンデカン酸 (11-pNCA): 収率: 89%; mp:= 102℃1 H-NMR:δ:= 8.19 (d, 2H, NO2-フェニル-, J=9.2 Hz), 6.94 (d, 2H, フェニル
-O-, J= 9.1 Hz), 4.05 (t, 2H, フェニル-O-CH2-, J= 6.5 Hz), 2.35 (t, 2H,
-CH2-COO, J= 7.6 Hz), 1.79-1.84 (m, 2H, -O-CH2-CH2-), 1.61-1.66 (m, 2H,
-CH2-CH2-COO), 1.43-1.49 (m, 2H, -O-CH2-CH2-CH2-), 1.32-1.45 (m, 10H, -O
-CH2-CH2-CH2-(CH2)5-CH2-)13 C-NMR:δ:= 180.12 (-COO), 164.3 (C 4'), 141.3 (C 1'), 125.9 (C2'), 114
.4 (C 3'), 68.9 (-O-CH2-), 34.0 (-CH2-COO-), 29.4, 29.3, 29.3, 29.2, 29.
0, 29.0, 25.9, 24.6 (C-3-C-10)
【０１１７】 p-ニトロフェノキシウンデカン酸メチル (11-pNCAMe): 収率: 80%1 H-NMR:δ:= 8.18 (d, 2H, NO2-フェニル-, J=9.3 Hz), 6.93 (d, 2H, フェニル
-O-, J= 9.2 Hz), 4.03 (t, 2H, フェニル-O-CH2-, J= 6.5 Hz), 3.66 (s, 3H,
-COOCH3), 2.29 (t, 2H, -CH2-COO, J= 7.5 Hz), 1.75-1.86 (m, 2H, -O-CH2-CH 2 -), 1.58-1.64 (m, 2H, -CH2-CH2-COO), 1.29-1.45 (m, 12H, -O-CH2-CH2-(CH2 )6-CH2-)13 C-NMR:δ:= 174.5 (-COO), 164.4 (C 4'), 141.5 (C 1'), 126.1 (C2'), 114.
6 (C 3'), 69.0 (-O-CH2-), 51.6 (-COOCH3), 34.2 (-CH2-COO-), 29.6, 29.5,
29.4, 29.4, 29.3, 29.1, 26.1, 25.1 (C-3-C-10)
【０１１８】 p-ニトロフェノキシドデカン酸 (12-pNCA): 収率: 89%; mp:= 106℃ 計算値: C 64.07% H 8.07% N 4.06%, O 23.71%, 実測値: C 63.99% H8.18% N 4.
15%1 H-NMR:δ:= 8.19 (d, 2H, NO2-フェニル-, J=9.3 Hz), 6.94 (d, 2H, フェニル
-O-, J= 9.4 Hz), 4.04 (t, 2H, フェニル-O-CH2-, J= 6.6 Hz), 2.35 (t, 2H,
-CH2-COO, J= 7.5 Hz), 1.79-1.84 (m, 2H, -O-CH2-CH2-), 1.60-1.66 (m, 2H,
-CH2-CH2-COO), 1.43-1.49 (m, 2H, -O-CH2-CH2-CH2-), 1.29-1.35 (m, 12H, -O
-CH2-CH2-CH2-(CH2)6-CH2-)13 C-NMR: δ:= 180.4 (-COO), 164.3 (C 4'), 141.3 (C 1'), 125.9 (C2'), 114
.4 (C 3'), 68.9 (-O-CH2-), 34.1 (-CH2-COO-), 29.5, 29.4, 29.3, 29.2, 29.
2, 29.0, 29.0, 25.9, 24.7 (C-3-C-11)
【０１１９】 p-ニトロフェノキシドデカン酸エチル (12-pNCAEt): 収率: 73% 1 H-NMR:δ:= 8.18 (d, 2H, NO2-フェニル-, J=9.2 Hz), 6.94 (d, 2H, フェニル
-O-, J= 9.3 Hz), 4.12 (q, 2H, -COO-CH2-, J= 7.1 Hz) 4.05 (t, 2H, フェニ
ル-O-CH2-, J= 6.5 Hz), 2.29 (t, 2H, -CH2-COO, J= 7.5 Hz), 1.70-1.87 (m,
2H, -O-CH2-CH2-), 1.59-1.69 (m, 2H, -CH2-CH2-COO), 1.32-1.45 (m, 14H, -O
-CH2-CH2-(CH2)7-CH2-), 1.26 (t, 3H, -COOCH2-CH3, J= 7.2 Hz)13 C-NMR:δ:= 174.8 (-COO), 164.4 (C 4'), 141.5 (C 1'), 126.1 (C2'), 114.
6 (C3'), 69.0 (-O-CH2-), 60.5 (-COO-CH2-), 34.2 (-CH2-COO-), 29.6, 29.5,
29.4, 29.4, 29.3, 29.2, 29.1, 26.1, 25.1 (C-3-C-11), 14.4 (-COO-CH2-CH3 )
【０１２０】 p-ニトロフェノキシペンタデカン酸 (15-pNCA): 収率: 87%; mp:= 115℃1 H-NMR:δ:= 8.19 (d, 2H, NO2-フェニル-, J=9.2 Hz), 6.94 (d, 2H, フェニル
-O-, J= 9.3 Hz), 4.05 (t, 2H, フェニル-O-CH2-, J= 6.5 Hz), 2.35 (t, 2H,
-CH2-COO, J= 7.5 Hz), 1.79-1.85 (m, 2H, -O-CH2-CH2-), 1.59-1.66 (m, 2H,
-CH2-CH2-COO), 1.43-1.49 (m, 2H, -O-CH2-CH2-CH2-), 1.26-1.35 (m, 18H, -O
-CH2-CH2-CH2-(CH2)9-CH2-)13 C-NMR:δ:= 180.0 (-COO), 164.3 (C 4'), 141.3 (C 1'), 126.0 (C2'), 114.
4 (C 3'), 68.9 (-O-CH2-), 34.0 (-CH2-COO-), 29.6, 29.6, 29.5, 29.4, 29.4
, 29.3, 29.3, 29.2, 29.1, 29.0, 25.9, 24.7 (C-3-C-14)
【０１２１】 p-ニトロフェノキシペンタデカン酸メチル (15-pNCAMe): 収率: 75%1 H-NMR:δ:= 8.19 (d, 2H, NO2-フェニル-, J=9.2 Hz), 6.94 (d, 2H, フェニル
-O-, J= 9.3 Hz), 4.05 (t, 2H, フェニル-O-CH2-, J= 6.5 Hz), 3.66 (s, 3H,
-COOCH3), 2.26 (t, 2H, -CH2-COO, J= 7.5 Hz), 1.79-1.85 (m, 2H, -O-CH2-CH 2 -), 1.59-1.66 (m, 2H, -CH2-CH2-COO), 1.43-1.49 (m, 2H, -O-CH2-CH2-CH2-)
, 1.26-1.35 (m, 18H, -O-CH2-CH2-CH2-(CH2)9-CH2-)13 C-NMR:δ:= 174.6 (-COO), 164.3 (C 4'), 141.3 (C 1'), 126.0 (C2'), 114.
4 (C 3'), 68.9 (-O-CH2-), 51.7 (-COOCH3), 34.0 (-CH2-COO-), 29.7, 29.6,
29.5, 29.5, 29.4, 29.3, 29.3, 29.2, 29.1, 29.1, 26.1, 25.0 (C-3-C-14)
【０１２２】3. レゾルフィニルカルボン酸（RCA）の製造 a) ω-レゾルフィニルドデカン酸メチルおよびω-レゾルフィニルウンデカン酸
メチルの製造 RCAを合成するために、pNCA化合物用の手順に従って、ω-ブロモカルボン酸を
エステル化し、DMF中のレゾルフィンナトリウム塩と反応させ、さらにPCL/CAL-B
リパーゼ混合物を用いて加水分解した。
【０１２３】
【化３】 ω-レゾルフィニルラウリン酸メチル用混合物： 0.90 g（3.1 mmol）の12-ブロモラウリン酸メチル 0.72 g（3.1 mmol）のレゾルフィン 50mlのDMF。
【０１２４】 ω-レゾルフィニルウンデカン酸メチル用混合物： 0.75 g（2.7 mmol）の11-ブロモウンデカン酸メチル 0.63 g（2.7 mmol）のレゾルフィン 50 mlのDMF。
【０１２５】 手順： レゾルフィンを、ブロモ-脂肪酸エステルのDMF溶液に添加するが、これは完全
には溶解しない。この暗青紫色の懸濁液を４時間にわたり加熱還流し、次いで該
反応をTLCで追跡した（移動層には1:1の石油エーテル：ジエチルエーテル）。溶
媒を除去した後に、褐色沈殿物を1:1の石油エーテル：酢酸エチルに0.5時間にわ
たり溶解し、それをさらに同上の移動層混合液を用い、DC60（Merck）シリカゲ
ルクロマトグラフィーカラムにより精製する。化合物はカラム上で、少量程度分
解するため、選択されるカラムは大き過ぎてはならない。
【０１２６】 ω-レゾルフィニルラウリン酸メチル：収率：17％1 H-NMR: δ:= 7.62 (d, 1H, -H-9', J= 8.89 Hz), 7.35 (d, 1H, -H-1', J= 9.7
9 Hz), 6.85 (dd, 1H, -H-8', J8',9'= 8.87 Hz, J8',6' =2.41Hz), 6.76 (dd,
1H, -H-2', J2',1'= 9.74 Hz, J2',4'= 1.74 Hz), 6.73 (d, 1H, -H-6', J= 2.4
0 Hz), 6.25 (d, 1H, -H-4', J= 1.74 Hz), 3.98 (t, 2H, フェニル-O-CH2-, J=
6.50 Hz), 3.59 (s, 3H, -COO-CH3), 2.23 (t, 2H, -CH2-COO, J= 7.50 Hz),
1.73-1.79 (m, 2H, -O-CH2-CH2-), 1.53-1.56 (m, 2H, -CH2-CH2-COO), 1.37-1.
41 (m, 2H, -O-CH2-CH2-CH2-), 1.22-1.29 (m, 12H, -O-CH2-CH2-CH2-(CH2)6-CH 2 -)13 C-NMR: δ:= 186.7 (-C 3'), 174.7 (-COO), 163.7, 150.3, 146.1, 145.7 (C
4a', C-5a', C-9a', C-10a'), 135.1, 134.5, 131.9, 128.7, 114.5, 107.1, 1
00.8 (C 2', C 4', C 1', C 9', C 6', C 8', C 9'), 69.5 (-O-CH2-), 51.9 (-
COO-CH3), 34.5 (-CH2-COO-), 30.1, 29.8, 29.7, 29.7, 29.6, 29.5, 29.3, 26
.3, 25.3 (C-3-C-11)
【０１２７】 ω-レゾルフィニルウンデカン酸メチル：収率：15％；1 H-NMR: δ:= 7.62 (d, 1H, -H-9', J= 8.91 Hz), 7.35 (d, 1H, -H-1', J= 9.7
0 Hz), 6.86 (dd, 1H, -H-8', J8',9'= 8.90 Hz, J8',6'=2.53Hz), 6.76 (dd, 1
H, -H-2', J2', 1'= 9.72 Hz, J2',4'= 1.95 Hz), 6.73 (d, 1H, -H-6', J= 2.5
4 Hz), 6.25 (d, 1H, -H-4', J= 1.94 Hz), 3.98 (t, 2H, フェニル-O-CH2-, J=
6.49 Hz), 3.60 (s, 3H,-COO-CH3), 2.23 (t, 2H, -CH2-COO, J= 7.50 Hz), 1
.74-1.79 (m, 2H, -O-CH2-CH2-), 1.54-1.57 (m, 2H, -CH2-CH2-COO), 1.35-1.4
2 (m, 2H, -O-CH2-CH2-CH2-), 1.18-1.29 (m, 10H, -O-CH2-CH2-CH2-(CH2)5-CH2 -)13 C-NMR: δ:= 186.7 (-C 3'), 174.7 (-COO), 163.7, 150.3, 146.1, 145.7 (C
4a', C-5a', C-9a', C-10a'), 135.0, 135.0, 132.0, 128.6, 114.5, 107.0, 1
00.8 (C 2', C 4', C 1', C 9', C 6', C 8', C 9'), 69.5 (-O-CH2-), 51.8 (-
COO-CH3), 34.5 (-CH2-COO-), 29.9, 29.8, 29.7, 29.6, 29.5, 29.3, 26.3, 25
.3 (C-3-C-10)
【０１２８】 b) ω-レゾルフィニルドデカン酸およびω-レゾルフィニルウンデカン酸の製造
【化４】 予備実験： NaOHを用いた化学的加水分解によってエステルを切断したが、所望の黄橙色の
生成物の単離はせいぜい10％の収率でなされただけであった。この原因は、退色
を伴う、強アルカリ溶液（pH＞12）中でのレゾルフィニル芳香族系の分解である
。５種類の生成物がTLCプレート上に検出された。アルカリ媒体中、レゾルフィ
ニル-脂肪酸エステルは緑がかった色を呈する。リパーゼを用いた開裂は、操作
の最適化の後は非常にうまくいった。好適なリパーゼを選択するために、次に示
すリパーゼを、Thermomixer中にて40℃で一晩、可溶化剤として10％アセトンを
含む0.1 M リン酸ナトリウム緩衝液pH 7.5中で試験した：カンジダ・アンタルク
ティカ(Candida antarctica)リパーゼAおよびB、アスペルギルス・ニガー(Asper
gillus niger)リパーゼ、ならびにシュードモナス・セパシア(Pseudomonas cepa
cia)リパーゼ（PCL）。
【０１２９】 カンジダ・アンタルクティカ リパーゼBおよびPCLは、レゾルフィニルカルボ
ン酸エステルを開裂するため、最終的にPCLは予備的なエステル開裂のために用
いられた。
【０１３０】 ω-レゾルフィニルドデカン酸用混合液： ω-レゾルフィニルドデカン酸メチル 40 mg（94μmol） アセトン 2 ml リン酸ナトリウム緩衝液, pH 7.3 18 ml PCL スパチュラ１さじ。
【０１３１】 ω-レゾルフィニルウンデカン酸用混合液： ω-レゾルフィニルウンデカン酸メチル 36 mg（30μmol） アセトン 2 ml リン酸ナトリウム緩衝液, pH 7.3 18 ml PCL スパチュラ１さじ。
【０１３２】 手順： エステルを50 ml丸底フラスコ中のアセトンに溶解し、9 mlのリン酸ナトリウ
ム緩衝液, pH 7.3を添加した後、スパチュラ１さじのPCLを加え、その混合物を4
0℃で一晩インキュベートする。その反応の経過はTLCによって追跡する（移動層
は1:1の石油エーテル：ジエチルエーテル）。クロロホルムを用いて慎重な抽出
を数回行った後、そのクロロホルム層を脱塩水を用いて２回洗浄し、硫酸ナトリ
ウム上で４時間かけて乾燥させ、ろ過して、ロータリーエバポレーター中で濃縮
する。
【０１３３】 ω-レゾルフィニルラウリン酸：収率：73％1 H-NMR: δ:= 7.62 (d, 1H, -H-9', J= 8.9 Hz), 7.35 (d, 1H, -H-1', J=9.8 H
z), 6.85 (dd, 1H, -H-8', J8',9'= 8.87 Hz, J8',6'= 2.4 Hz), 6.76 (dd, 1H,
-H-2', J2',1'= 9.7 Hz, J2',4'= 1.7 Hz), 6.73 (d, 1H, -H-6', J= 2.4 Hz),
6.25 (d, 1H, -H-4', J= 1.7 Hz), 3.98 (t, 2H, フェニル-O-CH2-, J= 6.5 Hz
), 2.34 (t, 2H, -CH2-COO, J= 7.5 Hz), 1.73-1.79 (m, 2H, -O-CH2-CH2-), 1.
55-1.59 (m, 2H, -CH2-CH2-COO), 1.37-1.41 (m, 2H, -O-CH2-CH2-CH2-), 1.22-
1.29 (m, 12H, -O-CH2-CH2-CH2-(CH2)6-CH2-)13 C-NMR: δ:= 186.6 (-C 3'), 180.4 (-COO), 163.7, 150.3, 146.1, 145.7 (C
4a', C-5a', C-9a', C-10a'), 135.1, 134.5, 131.9, 128.7, 114.5, 107.1, 1
00.8 (C 2', C 4', C 1', C 9', C 6', C 8', C 9'), 69.5 (-O-CH2-), 34.2 (-
CH2-COO-), 30.1, 29.8, 29.7, 29.7, 29.6, 29.5, 29.3, 26.3, 25.3 (C-3-C-1
1)
【０１３４】 ω-レゾルフィニルウンデカン酸：収率：78％1 H-NMR: δ:= 7.63 (d, 1H, -H-9', J= 8.9 Hz), 7.35 (d, 1H, -H-1', J=9.7 H
z), 6.85 (dd, 1H, -H-8', J8',9'= 8.9 Hz, J8',6'= 2.53 Hz), 6.76 (dd, 1H,
-H-2', J2',1'= 9.7 Hz, J2',4'= 1.9 Hz), 6.73 (d, 1H, -H-6', J= 2.5 Hz),
6.25 (d, 1H, -H-4', J= 1.9 Hz), 3.98 (t, 2H, フェニル-O-CH2-, J= 6.5 Hz
), 2.35 (t, 2H, -CH2-COO, J= 7.5 Hz), 1.74-1.79 (m, 2H, -O-CH2-CH2-), 1.
54-1.59 (m, 2H, -CH2-CH2-COO), 1.35-1.42 (m, 2H, -O-CH2-CH2-CH2-), 1.18-
1.29 (m, 10H, -O-CH2-CH2-CH2-(CH2)5-CH2-)13 C-NMR: δ:= 186.7 (-C 3'), 180.7 (-COO), 163.7, 150.3, 146.1, 145.7 (C
4a', C-5a', C-9a', C-10a'), 135.0, 135.0, 132.0, 128.6, 114.5, 107.0, 1
00.8 (C 2', C 4', C 1', C 9', C 6', C 8', C 9'), 69.5 (-O-CH2-), 34.1 (-
CH2-COO-), 29.9, 29.8, 29.7, 29.6, 29.5, 29.3, 26.3, 25.3 (C-3-C-10)
【０１３５】 c) ω-レゾルフィニルラウリン酸およびω-レゾルフィニルウンデカン酸を用い
たP450 BM-3の活性試験： スパチュラ１さじの11-RCAまたは12-RCAを、0.5 mlのアセトン、エタノール、
THF、ジオキサン、および5.5 mlのリン酸カリウム緩衝液（pH 7.5, 0.1 M）中に
溶解した。5 mlのリン酸カリウム緩衝液（pH 7.5, 0.1 M）を可溶化剤として働
くように有機溶媒に加えた。5 nmolのP450を添加し、続いて室温で10分間インキ
ュベートしてから、200μlのNADPH（50μM）を添加することによりP450 BM-3を
還元した。１時間後、各反応混合物を200μlずつ、マイクロタイタープレート中
に入れた。NADPHを添加しない対応するブランクサンプルを、さらに第２列にピ
ペットで移す。
【０１３６】参考例６：分析法 1. SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）におけるタンパク質分離 タンパク質をSDS-PAGEによりサイズにしたがって分画することができる。ゲル
電気泳動の前に、精製したタンパク質サンプルをSDSサンプルバッファー（Tris/
HCl 500 mM, pH 6.8, グリセロール 10% (v/v), SDS 20% (w/v),メルカプトエタ
ノール 2% (w/v), ブロモフェノールブルー 0.05%）と1:1で混合し、95℃で5分
間加熱してタンパク質を変性させた。大腸菌(E. coli)細胞におけるタンパク質
発現の解析のために、5時間にわたる誘導期（OD578＝1.5〜2.0）の後、培養物1m
lをピペットで採取して12,000 gで遠心分離した。細胞ペレットをサンプルバッ
ファー100μlとともに粉砕し、12,000 gで1分間遠心分離した。このタンパク質
サンプルを氷上で冷却した後、電気泳動バッファー（Tris 9.0 g, グリセロール
43.2 g, SDS 3.0g, ddH2O 総量600 mlとなる量）中でゲル当たり25 mAにてタン
パク質分画化を行った。
【０１３７】 Bio-Rad（Richmond, USA）から入手した低分子量マーカー（ホスホリラーゼB
97.4 kDa、BSA 66.3 kDa、オバルブミン 45.0 kDa、炭酸脱水酵素 31.0 kDa、ト
リプシンインヒビター 21.5 kDa、リゾチーム 14.4 kDa）および高分子量キット
（ミオシン 200 kDa、β-ガラクトシダーゼ 116.25 kDa、ホスホリラーゼB 97.4
kDa、BSA 66.3 kDa、オバルブミン 45 kDa）をタンパク質標準として用いた。
【０１３８】 タンパク質分離のために、7.5％分解ゲル（Tris/HCl(1.5 M, pH 8.8) 2.5 ml,
SDS(10% m/v) 100μl, 30:1のアクリルアミド：N,N'-メチレンビスアクリルア
ミド(Roth) 2.5 ml, APS 50μl, TEMED 5μl）および4％濃縮用ゲル（濃縮用ゲ
ルバッファー（Tris 12.11 g, SDS 0.8 g, H2O 総量200 mlとなる量, HClでpH 6
.8に調整）1ml, 30:1のアクリルアミド：N,N'-メチレンビスアクリルアミド(Rot
h) 0.52 μl, APS 10%(w/v) 40μl, TEMED 4μl）を使用した。電気泳動に続い
て、分画したタンパク質を染色液（0.1％ クーマシーブリリアントブルーR250,
10％(v/v)酢酸, 30％メタノール）で３時間にわたりゆっくりと振とうしながら
青色に染色した。タンパク質のバンドが明瞭に見えてくるまで、脱染色溶液（10
％(v/v)酢酸, 30％メタノール）中でインキュベートした。検証するために、そ
のゲルをセルロースフィルター紙とコピーシートとの間に気泡が入らないように
挟み、家庭用吸引機を使用し、ゲルドライヤー（Bio-Rad, Model 583）中、80℃
にて２時間乾燥させた。
【０１３９】 2. BCAの検出によるタンパク質含量の測定 タンパク質濃度は、Pierce（St. Augustin, Germany）から入手したビシンコ
ニン酸（BCA）タンパク質検出システムを用いて、該製造業者により提供された
標準プロトコールにしたがって562 nmでの分光測定法により測定した。検量線は
BSA希釈物を用いて記録された。
【０１４０】 3. 分光学的検出法 分光学的UV-Vis検出は全て、Pharmacia（APB, Uppsala, Sweden）の分光光度
計（モデル BioChrom4060）にて、BioChrom4060 Windows（登録商標） 3.11 ソ フトウェアv2.0を用いて、好気条件下で行った。
【０１４１】 a) P450濃度の測定 P450 BM-3濃度は、CO差分光法（Omuraら, 1964）、および0.1 nm間隔で125 nm
/分の記録速度で得た吸光係数ε= 91 mM-1 * cm-1を用いて決定された。このた
めに、スパチュラ１さじの亜ジチオン酸ナトリウムおよび0.1％(w/v)メチルビオ
ロゲン水溶液10μlを、リン酸緩衝化（20 mM, pH 7.3〜7.5）P450 BM-3粗抽出物
5 mlに加えた。P450 BM-3濃度に応じて濃青色〜青緑色を呈したそのサンプルを
、２つの画分に分けた。２つの画分のうち一方は、気泡形成を避けながら1分間C
Oでガス処理し、さらに他方は差分光測定の参照として用いる。
【０１４２】 b) レダクターゼ活性の測定 この測定は、0.1 Mリン酸カリウム緩衝液(pH7.4)中で室温にて行い、ε= 8.9
mM-1（Fulcoら 1992）により550 nmでの吸収の増大を測定した。サンプル１ml中
には、チトクロームc（ウマ心臓由来）50 nmol、NADPH 100 nmol、および表６に
明示されているP450 BM-3量を含有していた。NADPH添加前の同じサンプルを参照
として用いた。溶液は当日に新たに調製され、使用まで氷上で保管された。P450
BM-3His6のレダクターゼ活性を測定するために、5分間インキュベートした後、
NADPH溶液をチトクロームc溶液に添加した。
【０１４３】 4. P450 BM-3および／またはP450 BM-3 F87Aの特性解析のためのプロトコール 精製したP450 BM-3 F87Aを用いて、反応速度定数、pH安定性、および温度安定
性を測定した。遠心分離し、さらにろ過した清澄な粗抽出物は、その他のあらゆ
る測定に用いた。全ての実験について、混合液当たり、0.05〜0.2 nmolのP450 B
M-3またはP450 BM-3 F87Aを含む総量１mlと5〜15 mM pNCA溶液8μlとを用いた。
溶媒試験を除く特性解析実験は、１ml用ディスポーサブルプラスティックキュベ
ット中で行った。別途記載しない限り、試験は室温で行った。
【０１４４】 a) 反応速度定数の測定 反応速度定数は、792μlのTris/HCl（pH 8.2, 0.2 M）および100μlのP450 BM
-3を様々な基質濃度のDMSO基質溶液8μlに加えた後、測定した。室温で5分間イ
ンキュベートした後、１mM NADPH溶液を100μl添加することにより反応を開始さ
せた。
【０１４５】 b) P450 BM-3 F87Aの溶媒安定性 溶媒安定性は、ガラスキュベット（Hellma, model 6040）中、DMSOに代わりア
セトン、ジオキサン、THF、およびエタノール中に基質を溶解して、測定した。
該測定は、反応速度測定について記載された手順により行った。しかしながら、
これから得られる差と同様、バッファーの割合は用いた溶媒の量に応じて様々で
あった。
【０１４６】 c) P450 BM-3 F87AのpH安定性および温度安定性 pH安定性の測定は、Stratagene Robocycler（勾配40モデル）において、0.5 m
l 薄壁PCR反応管（Stratagene）中、30℃で行った。リン酸緩衝化溶液（50 mM,
pH 4〜10）392μlを0.1〜0.2 nmolのP450 BM-3に添加した。インキュベーション
時間後、P450 BM-3溶液をキュベット中に移し、500μlのTris/HCl（0.3 M, pH 8
.2）および8μlの12-pNCA（6 mM）を添加した。5分間インキュベートした後、10
0μlのNADPH溶液（１mM）によって反応を開始させた。温度安定性はpH安定性と
同じ条件下でpH 7.5にて調べた。
【０１４７】 d) バッファー塩濃度、界面活性剤、プロテアーゼ阻害剤、チオ化合物、Co(III
)セパルクレートのP450 BM-3 F87A活性に対する影響 これらの化合物のP450 BM-3 F87A活性に対する影響を、反応速度研究と同様に
して、バッファーの様々な構成要素を同じバッファー系に溶解した研究対象物質
で置き換えて、調べた。
【０１４８】 e) 自動化した活性検出 96個の反応チャンバーを有するマイクロタイタープレート（Greiner Frickenh
ausen, Germany）を、自動化したP450 BM-3 F87A活性検出のために選択した。総
反応容量は、2.2μlのDMSOに溶解した18 nmolの10-pNCAおよび11-pNCA、12 nmol
の12-pNCAまたは10 nmolの15-pNCAを含むTris/HClバッファー（0.1 M, pH 8.2）
溶液の250μlであった。Biomek2000自動ピペッター（Beckman Instruments, Ful
lerton, USA）をピペッティング操作用に使用した。0.02 nmolのP450 BM-3 F87A
を加えて5分間のインキュベーション時間の後、各反応チャンバー中にNADPH水溶
液（1 mM）25μlを注入することにより、反応を開始させた。反応は、次の過程
でFluoStarマイクロタイタープレートリーダー（BMG LabTechnology, Offenburg
, Germany）における405 nmでの吸収に供された。
【０１４９】 f) 過酸化水素研究 活性研究の手順は、様々な量の水性過酸化水素をNADPHの代わりに添加したこ
と以外は、反応速度測定についての記載と同様であった。
【０１５０】 安定性研究において、0.05〜0.1 nmolのP450 BM-3 F87Aを様々な量の過酸化水
素と共に、pNCA基質不在下で5分間インキュベートした。カタラーゼ（600 U）の
添加、およびさらに5分間のインキュベーション時間の後、60 nmolの12-pNCA基
質を反応液中にピペットで移した。100 mlのNADPH（1 mM）を加えることにより
、5分後に反応を開始させた。
【０１５１】 g) Znメディエーター研究 反応は、エッペンドルフ反応管振とう機（IKA-Labortechnik Vibrax with Jan
ke and Kunkel VX2E型装置）中で行った。活性研究のための手順は、様々な量の
Zn／コバルト(III)セパルクレートをNADPHの代わりに用いたこと以外は、反応速
度測定についての記載と同様であった。様々な時間間隔の後、サンプル100μlを
反応懸濁液から採取し、反応を停止するために10μlのKOH（6 M）を含む別の1.5
mlエッペンドルフ反応管にピペットで移した。12,000 gにて1分間の遠心分離の
後、上清を採取し、410 nmでの吸収を測定した。
【０１５２】実施例１：グラム規模でのP450 BM-3および突然変異体のクローニング、発現、
ならびに精製 1. P450 BM-3遺伝子および突然変異体P450 BM-3 F87Aのクローニングならびに3 0Ｌ発酵におけるそれらの発現 P450 BM-3遺伝子を、バシラス・メガテリウム(Bacillus megaterium)由来のゲ
ノムDNAからPCRにより単離し、タグ付加し、pTプラスミドとして図１に示すよう
な発現ベクターpCYTEXP1およびpASK-IBA1CA中にクローニングした。シークエン
シングプライマーR0 5〜L7を用いて、別々のタグを付したP450 BM-3遺伝子、P45
0 BM-3変異体が正しく挿入されていることを確認し、またP450 BM-3 F87A点突然
変異体を確認した。標準プロトコールによるPCRのために、プライマーB1およびB
2を野生型酵素に対して、プライマーH1およびH2をP450 BM-3His6に対して、プラ
イマーG1およびG2をP450 BM-3Glu6に対して、プライマーA1およびA2をP450 BM-3
Arg6に対して、ならびにプライマーS1およびS2を450 BM-3Strepに対して、用い
た。配列解析からは、pT-USCOBM3およびpT-USC1BM3プラスミドの３回行った配列
決定の各回についての配列に、突然変異は全く示されなかった。タグが正しく挿
入されていることは、pT-USC2BM3およびpT-USC3BM3についてプライマーR7のみを
用いて確認された。配列決定されたpA-USC4BM3クローンには、P450 BM-3タンパ
ク質のレダクターゼ部分の中に２つの突然変異が示された。His6タグ付加された
P450 BM-3のDH5αにおける発現率は、発酵槽ブロス１リットル当たり300 nmolで
あり、これは野生型と比較して約20％高かった。このより高い発現率のため、pT
-USC1BM3について、Stragene QuikChangeキットを使用して87位のフェニルアラ
ニンがアラニンに置換されるように点突然変異を生じさせ、pNCA試験の感度を増
大させた。プライマーF87A1およびF87A2を用いたPCRにより、突然変異部位を含
むが、タンパク質配列、および配列決定用に選択されるクローンを選択するため
に用いた付加的なEaeI制限切断部位にはさらなる変化を有しない、pT-USC1BM3F8
7Aを得る。この付加的制限切断部位のために、EaeIによる制限切断後、レーン２
に、約800 bpの位置に新規のバンドが、そして野生型の消化におけるレーン１の
1.7 kbpのものと比較して明らかにより小さいバンドが、出現する。プラスミド
単離後、８つのクローンをEaeIにより消化した（2μlのEaeIバッファー(10×)、
1μlのEaeI、3.2μlのpT-USC1BM3、総量20μlとする量のddH2O、37℃で1時間）
。１つのクローンを配列決定した。pT-USC1BM3F87Aプラスミドは、そのリンカー
領域中の470位にさらなる突然変異R470Cを有する。P450 BM-3のP450部分をレダ
クターゼ部分に連結し、かつ、P450 BM-3活性には全く影響を与えないリンカー
領域の末端にR470C突然変異が位置するため、戻し突然変異は行われなかった。
【０１５３】 2. P450 BM-3およびP450 BM-3 F87Aの精製 P450 BM-3およびP450 BM-3 F87Aを精製する方法であって、安価、迅速かつ製
造規模で行うことができる方法を開発することが目的であった。この目的のため
に、Arg6、His6、Glu6、およびStrepタグをP450 BM-3のC末端に付加した。His6
およびStrepタグに基づくアフィニティー精製、ならびにArg6およびGlu6タグに
基づくイオン交換体によるクロマトグラフィー精製を開発することが意図された
。N末端の位置が柔軟な基質侵入チャネルの領域にあるため、P450 BM-3遺伝子の
N末端にタグを１つ導入することは考慮に入れなかった。この領域の改変は、P45
0 BM-3の活性および選択性を変化させる可能性が非常に高いであろう。
【０１５４】 2.1 アフィニティークロマトグラフィーによるタンパク質精製 a) His6タグを付加したP450 BM-3 金属キレートクロマトグラフィーによるP450 BM-3His6の精製において、ロー
ドした4 mgのP450 BM-3のうち95％を上回る量は、0〜0.5モル濃度のイミダゾー
ル線形濃度勾配（10CV）では、20 mlのXK16/20アフィニティーカラムに結合しな
い。Zn2+イオンによるクロマトグラフィー精製は、Pharmaciaの標準プロトコー
ルによって行った。ほとんど精製していないP450 BM-3は、もはやNADPHアッセイ
においていかなる活性も示さなかった。この阻害の原因は、イミダゾールの影響
によるものであり得る。イミダゾールは触媒反応ヘム部位における第５システイ
ナートリガンドの脱離を引き起こす。この第５リガンドのヘム系からの解離は、
P450の即時不活化を引き起こし、吸収極大の448 nmから420 nmへの特徴的な変化
によるCO差スペクトルにおいて明らかである。
【０１５５】 b) Strepタグを付加したP450 BM-3 8.2 mgのP450 BM-3Strepを精製に用いた。His6タグ精製の結果と同様に、P450
BM-3Strepは、READY TO USE KIT（IBA, Gottingen）に従った精製においてスト
レプトアビジンアフィニティーマトリックスには結合しないことが示された。
【０１５６】 c) Glu6タグを付加したP450 BM-3 0〜1 M NaCl線形濃度勾配（12CV, Tris/HClバッファー（0.1 M, pH 8.0））に
おける比較からは、Super 650MおよびDEAE 650M 陰イオン交換体を使用した場合
のP450 BM-3Glu6の溶出特性に野生型酵素との差異は示されなかった。
【０１５７】 d) 結論 His6、Glu6、およびStrepタグを付加したP450 BM-3の精製の結果は、P450 BM-
3のC末端はタンパク質表面上で自由に利用できるものではなく、したがって精製
目的で使用することはできないという結論をもたらす。さらに、His6タグの場合
、イミダゾールによる溶出はポルフィリン系における第５リガンドの置換のため
にタンパク質の急速な不活化を引き起こした。
【０１５８】 2.2 陰イオン交換クロマトグラフィー コストを最小限にするため、妥当なコストで効率的かつ時間を節約できる方法
であって、さらにP450 BM-3について簡単にスケールアップが可能な精製法を開
発することを目的とした。したがって、タグ付加したP450 BM-3の精製の結果か
ら、P450 BM-3精製に有用な唯一の方法はHIC材料およびイオン交換体であった。
この決定は、通常、より安価で取り扱いがより簡単な陰イオン交換体を優先する
ようになされる。
【０１５９】 a) 線形および段階的濃度勾配 陰イオン交換クロマトグラフィー法を開発するために、異なる濃度の４種の陰
イオン交換材料であるDEAE 650S（35μm）、DEAE 650M（65μm）、SuperQ 650M
（65μm）、およびQAE 550M（65μm）について、その適合性を調べた。初期実験
においては、6〜10 mgのP450 BM-3粗抽出物を精製するために、各カラム材料を
用いて、0〜1 M NaCl線形濃度勾配の10カラム容量（CV）分を、Tris/HClバッフ
ァー（0.1 M, pH 7.8）中に採取した。収率は全ての場合において80〜84％であ
った。P450 BM-3溶出ピークにおけるタンパク質は、その最も高い割合がDEAE材
料によって示され、少し低くそれに次ぐ割合がSuperQおよびQAE材料によって示
された。
【０１６０】 段階的塩濃度勾配を用いた分離のさらなる改良のために、AKTAexplorerシステ
ムの導伝性および280 nmおよび417 nmにおける吸収を同時に記録することのでき
る能力が役立つ。DEAE 650Mクロマトグラフィーカラム用の最適化した二段階塩
濃度勾配は、第１段階として150 mM NaClおよび第２段階として250 mM NaClを用
いる。NaCl線形塩濃度勾配における導伝性から明らかなように、P450 BM-3溶出
は、NaCl濃度が150 mMから170 mMに増加する時点で開始している。高い方の塩段
階濃度の最低濃度は250 mM NaClであることが判明した。230 mM未満のNaCl濃度
は、P450 BM-3溶出ピークの拡張を引き起こし、さらに300 mMを上回るNaCl濃度
は、明らかに良好でない精製効果をもたらす。SuperQ 650MおよびQAE 550Mクロ
マトグラフィー材料について、塩段階濃度を類似の方法で最適化した。
【０１６１】 線形DEAE 650Mと段階的NaCl濃度勾配とを比較すると、線形濃度勾配による39
％から段階的濃度勾配による84％へと、溶出ピークにおけるP450 BM-3タンパク
質含量の増加が示される。同様の結果がSuperQ 650Mクロマトグラフィー材料に
よって得られた。QAE 550Mクロマトグラフィー材料は、明らかに良好でない精製
結果を示した。段階的精製法を用いた全ての場合について、収率は78％を上回っ
た。溶出ピークにおけるP450 BM-3の最高収率である93％は、DEAE 650Sを用いて
得られた。
【０１６２】実施例２：P450 BM-3およびP450 BM-3 F87Aに対する分光学的活性検出法の開発 P450 BM-3の分光学的または蛍光定量的活性検出法を開発することが目的であ
った。そのような活性検出法は、HPLCまたはGC等の標準法と異なり、簡単に自動
化が可能であることから、他のP450 BM-3酵素変異体を探索するために用いるこ
とができる。
【０１６３】 P450 BM-3の新規の活性検出法を開発するために、カルボン酸の末端C原子に発
色団を担持する各種化合物を合成し、その適合性について調べた。
【０１６４】 Oliverら Biochemistry (1997), 36(7):1567による研究は、基質としてのラウ
リン酸およびミリスチン酸に対するP450 BM-3によるヒドロキシル化プロファイ
ルの変化、それが87位のフェニルアラニンがアラニンに置換される場合であれば
末端近くの位置から末端位置への変化、を示した。pNCA検出法の感度を増大させ
るために、この点突然変異を、「材料および方法」に記載されているように導入
し、配列解析により確認した。
【０１６５】 1. 検出原理 図２は、脂肪酸ヒドロキシラーゼの末端ヒドロキシル化に対する分光学的活性
検出の原理を示す。末端ヒドロキシル化の後、ω-オキシカルボン酸と分光測定
法により検出され得る発色団とに解離する、不安定なヘミアセタールの生成が生
ずる。
【０１６６】 2. PCAによるP450 BM-3 F87A活性の検出 a) フェノキシカルボン酸（PCA）の合成 PCA化合物を、ω-ブロモカルボン酸から出発する実施例５に記載されたような
一段階合成により合成した。全体収率として76〜78％が、合成により得られた。
PCAを、1H-NMR、13C-NMRおよび融点の測定により特性解析した。
【０１６７】 b) 反応条件の選択 分光法によりフェノール生成を検出できるようにするために、波長範囲250〜2
80 nmにおける吸収を測定することは自明である（Luchter-Wasylewska 1996）。
しかしながら、274 nmの吸収極大における吸光係数のε= 1090 M-1cm-1という低
さ、この波長範囲におけるNADPHおよびNADP+の吸収特性の差異、ならびに非共役
反応における過酸化水素の生成が、フェノール生成の連続的な分光測定を妨げた
。これらの理由に対して、Merckフェノール検出キットを、生成物の生成を定量
するために用いた。P450 BM-3突然変異体F87Aを補因子としてのNADPHと共に用い
た際の変換速度は、12-PCAについては640 eq/分、および11-PCAについては410 e
q/分であることが判明した。
【０１６８】 3. pNCA基質によるP450 BM-3およびP450 BM-3 F87A活性の検出 a) p-ニトロフェノキシカルボン酸（pNCA）の合成 pNCA化合物は、ω-ブロモカルボン酸から出発する実施例５に記載のような新
規の３段階合成、すなわちエステル化、続くナトリウムp-ニトロフェノレートと
のSn2反応、さらにエステルのリパーゼ触媒性加水分解、により合成した。３段
階pNCA合成における全体収率は61〜69％であった。pNCAを、1H-NMR、13C-NMRお
よび融点の測定により特性解析した。
【０１６９】 b) 反応条件の選択 図２は、pNCA基質のP450 BM-3およびP450 BM-3 F87Aによる変換の反応原理に
ついて記載している。活性測定のために、分光学的検出系のpHおよび波長を最適
化する必要があった。脱プロトン化p-ニトロフェノレート（pKa 7.1）だけが黄
色に寄与する。したがって9.1を上回るpH（99％を上回る脱プロトン化）が、検
出の感度にとって望ましいであろう。pH 10および30℃にて5分間のうちにその活
性の80％を喪失するP450 BM-3タンパク質とは異なり、pNCA化合物は強アルカリ
溶液中で安定である。8.1〜8.2のpHをタンパク質安定性とその検出の感度との間
の折衷値として採用した。Henderson-Hasselbalchの式に基づく計算により、こ
のpH範囲において変換されたp-ニトロフェノールの90〜92％が脱プロトン化され
、黄色に寄与することが示される。p-ニトロフェノレートの吸収極大は400 nmで
ある。しかしながら、ヘム部位および補因子NADPHもまた、この波長にて吸収す
る。P450 BM-3は、350〜450 nmで高い吸収特性を有しており、それは触媒反応部
位における基質結合性と鉄の酸化状態との関数として、大きく変化する。NADPH
の吸収スペクトルは、390 nmを上回る波長範囲を制限する。最終的に、再現性に
基づく活性測定のために、波長410 nmが選択された。検出系の感度が不十分であ
る場合、400 nmの範囲における波長を用いるべきである。吸光係数は、選択され
た検出条件下（pH 8.2, 410 nm）で、ε= 13,200 M-1cm-1と決定された。
【０１７０】 pNCAは水中への溶解度がごく低く、可溶化剤が必要である。この目的のために
、P450 BM-3 F87A活性に影響を及ぼすことなく、最大で1％（v/v）の濃度までDM
SOを添加することができる。したがって0.8％（v/v）DMSOは、活性検出系におい
て可溶化剤として用いた。
【０１７１】 pNCA検出系に必要とされる時間は、用いる酵素量に大きく依存する。P450 BM-
3 F87Aをnmol単位の量でpNCA活性検出に用いた場合、活性検出には１分で十分で
あった。
【０１７２】 c) pNCA検出の自動化 HTS環境における使用のために、pNCA活性検出はBiomek2000ワークステーショ
ンおよびBMG FluoStarマイクロタイタープレートリーダーを用いて自動化した。
アッセイ系の再現性を、pNCA基質である10-、11-、12-、および15-pNCAを用いた
各場合における16回の測定について、P450 BM-3および突然変異体F87Aを用いて
調べた。ピペッティングの不正確さのために、全吸収における2〜4の要因により
差異が生じたが、反応性における差異は2〜6％の間で変化しただけであった。全
ての測定値の平均から、偏差が約2％という最良の再現性がP450 BM-3 F87A突然
変異体について得られ、また偏差が最大6％という最低の再現性が野生型および1
5-pNCAについて得られた。精度に差が出る原因は、pNCA基質とその鎖長に応じて
異なる変換物の溶解度における差異である。
【０１７３】 F87A突然変異体は、12-pNCAへ完全に変換されるが、野生型酵素は33％に達し
た後、停止する。その原因はおそらく、もはや変換されないか、またはさらにご
くゆっくりと変換される、末端付近がヒドロキシル化された12-pNCA化合物であ
る。P450 BM-3およびP450 BM-3 F87Aについて、pNCAのω-ヒドロキシル化からの
pNCA鎖長プロファイルおよび変換を、溶液の測定された黄色呈色にみられる比率
から計算し、下記の表４および５にまとめた。さらに、反応速度データをP450 F
87Aに対するLineweaver-Burk図から読み取った。
【０１７４】
【表４】
【０１７５】
【表５】
【０１７６】実施例３：P450 BM-3およびP450 BM-3 F87Aに対する新規の補因子系 P450系の産業的使用に対する主たる障害は、補因子NADPHによって生じるコス
トである。このコストの問題を解決するために、NADPHを亜鉛およびメディエー
ターコバルト(III)セパルクレートで置換する、代替的補因子という概念を発展
させた。すなわち、亜鉛は電子の供給源として働き、コバルト(III)セパルクレ
ートは亜鉛からP450 BM-3への電子伝達系として働く。
【０１７７】 1. 亜鉛によるコバルト(III)セパルクレートの還元の検出 標準条件下で、コバルト(III)セパルクレートは塩化水銀(I)電極に対して-0.5
4 Vの標準電位差を有する（Creaserら, J. Am. Chem. Soc. (1977) 99: 3181）
。図３に示すように、コバルト(III)セパルクレートは、数秒以内にTris/HClバ
ッファー（0.2 M, pH 8.2）中の亜鉛粉末によって還元され得る。水溶液中の気
体酸素の存在下で、それは数分以内にコバルト(III)セパルクレートへと酸化さ
れて戻る。
【０１７８】 2. 代替的補因子系によるP450 BM-3 F87A活性の検出 2.1 pNCAアッセイ 図４はZn／コバルト(III)セパルクレート／P450 BM-3 F87A系による12-pNCAの
変換を示す。8分後の極大吸収0.8にて、Zn／コバルト(III)セパルクレート／P45
0 BM-3 F87A系は70％の変換に相当する黄色呈色を示す。p-ニトロフェノレート
によって生じる黄色呈色は20分以内に完全に消失する。残存吸収0.15はメディエ
ーターに由来している。対照実験は、亜鉛粉末がTris/HClバッファー（pH 8.2,
50 mM, 0.25 M KCl）中のp-ニトロフェノレートのニトロ基を還元することを示
した。さらに、対照実験は過酸化水素がp-ニトロフェノレートおよびpNCAに対し
て酸化作用をもたないことを示した。
【０１７９】 図５は、Znからメディエーターを介してP450 BM-3へという上述の電子伝達経
路、および短縮化した過酸化水素反応経路（短絡経路）に注目した基質変換を示
している。
【０１８０】 2.2 PCAアッセイ Tris/HClバッファー中の亜鉛によるp-ニトロフェノールの還元により、12-pNC
Aは12-PCAに置換された。フェノールを、Merckフェノール検出キットによって49
5 nmにて検出した。274 nmでの直接光度測定によるフェノール検出は、酸化およ
び還元コバルト(III)セパルクレートの吸収特性によるものではありえない。図
６は、基質である12-PCAのゆっくりとした脱色を12-pNCA（図４）と比較して図
示している。吸収減少の原因は、水溶液中の気体酸素の還元による副反応におい
て還元されたコバルト(II)セパルクレートによって生成される過酸化水素である
と、同定することができた。さらに過酸化水素生成は、常に、P450系に伴う非共
役反応の結果である副反応の産物として生じる。後者の理由については、PCA反
応条件のさらなる最適化をそれ以上行うことはしなかった。
【０１８１】 図６に示すように、600 Uのカタラーゼの存在下では、495 nmでの吸収減少は
明らかによりゆっくりと起こる。
【０１８２】 3.1 バッファー組成 亜鉛によるp-ニトロフェノレートの還元を通じた溶液の脱色を防止するために
、まず、KCl濃度およびpHはP450 BM-3 F87Aの安定性の範囲内で変化させた（6.5
〜8.5）が、不成功に終わった。図７に示すように、リン酸カリウム緩衝液を加
えることにより、亜鉛によるp-ニトロフェノールの還元をうまく防止することが
できる。10％以上のリン酸カリウム含量および1:1混合物を用いると、亜鉛によ
るp-ニトロフェノールの還元は低い程度（10％以下）でしか生じず、14時間後で
さえ、検出可能なさらなる還元は示されない（示していない）。図７に示すよう
に、まず、最大20％におよぶリン酸カリウムと混合される際の還元Co(II)セパル
クレートの含有量に約25％の顕著な減少が生じ、次いで60〜70％で一定となり、
リン酸カリウム含量は20〜70％（v/v）となる。還元コバルト(II)セパルクレー
トは、Tris/HClバッファー系と比較して利用能が低いため、活性の約15％は失わ
れる。
【０１８３】 上記結果から、２種のバッファー溶液の1:1混合物を、さらなる最適化のため
に用いた。
【０１８４】 3.2 変換およびP450 BM-3 F87A活性に対するメディエーター濃度の影響 図8Aは、各種メディエーター濃度でのNADPHアッセイにおけるP450 BM-3活性に
対するコバルト(III)セパルクレートメディエーターの影響を示す。5 mM以上の
コバルト(III)セパルクレート濃度では、反応過程においてコロイド状沈殿物の
生成が起こるので、これを吸収の測定前に遠心分離により除去した。Zn／コバル
ト(III)セパルクレート系を用いた変換のために、P450 BM-3 F87Aを0.072 nmol
当たり0.5〜0.75 mMの範囲に最適なコバルト(III)セパルクレート濃度が存在す
る。図8Bに示されるように、最大で0.5 mMの濃度のコバルト(III)セパルクレー
トは、基質の不在下でさえ、P450 BM-3 F87Aをほんのわずか阻害する。阻害の程
度は様々なインキュベート時間においてずっと一定であり、コバルト(III)セパ
ルクレートとP450 BM-3 F87Aとの濃度比にのみ依存する。
【０１８５】 3.3 亜鉛濃度 使用した亜鉛粉末の量に対する0.072 nmolのP450 BM-3 F87Aの変換の依存度を
図９に示す。最適な変換は、反応溶液１ml当たり亜鉛を20〜40 mgの範囲で達成
された。おそらく、メディエーター触媒性過酸化水素生成の増加による反応溶液
中の酸素濃度の減少が、50および100 mgを用いた変換における減衰の原因であっ
た。
【０１８６】 亜鉛粉末を亜鉛顆粒で置き換えることにより、100倍多い量を使用しても、変
換速度が非常に遅くなった（20倍を上回る遅さ）。
【０１８７】 3.4 H2O2濃度の影響 「短絡」反応経路を経た過酸化水素の、P450 BM-3 F87Aによる12-pNCAの変換
に対する寄与量を測定するために、12-pNCAおよびP450 BM-3 F87Aを様々な過酸
化水素濃度のものと共にインキュベートした。適切なP450 BM-3 F87A活性を示す
8〜20μMの範囲の過酸化水素において、プラトーが、過酸化水素濃度には関わり
なく、１分後に20〜25％の変換に達する。さらに過剰量（100μM）のNADPHを添
加することによって、P450 BM-3 F87Aが過酸化水素によっては完全に不活化され
ないことが示される。残存活性は、過酸化水素濃度が低い場合は高く、過酸化水
素濃度の増加と共に減少する（データは示さない）。
【０１８８】 過酸化水素に対するP450 BM-3の安定性を測定するために、基質（12-pNCA）不
在下で、P450 BM-3 F87Aを様々な量の過酸化水素と共に5分間インキュベートし
た。カタラーゼ（600 U）と60 nmolの基質とを加えた後、変換率を電子供与体で
あるNADPHを用いて測定した。
【０１８９】 図10に示すように、基質不在下で、5μMの範囲の過酸化水素濃度でさえ、明ら
かにP450 BM-3 F87A活性を阻害する。P450 BM-3 F87A酵素膜リアクターについて
これから得られる結果は、できる限り高い基質濃度で操作すること、およびカタ
ラーゼまたは抗酸化剤の添加により過酸化水素生成を最小限にすることである。
【０１９０】実施例４：さらなるP450 BM-3突然変異体を用いた活性アッセイ さらなるBM-3突然変異体および野生型酵素（WT）を、実施例２と同様の様々な
鎖長のpNCA誘導体に対する活性についてアッセイした。その結果を以下の表６に
まとめる。
【０１９１】
【表６】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図1は、pCYTEXP1の例についてP450 BM3のクローニングの概要を示す。
【図２】 図2は、本発明の分光学的P450検出の原理を示す。
【図３】 図3は、Tris/HCl（0.2M, pH 8.2）中におけるZn粉末によるコバルト(III)セパ
ルクレートの還元に関する吸収スペクトルを示す。点線は酸化されたCo(III)セ
パルクレートであり、実線は還元されたZn/Co(III)セパルクレートである。
【図４】 図4は、Tris/HCl（50 mM, pH 8.2, 0.25 M KCl）中におけるP450 BM-3 F87Aと
Zn/Co(III)セパルクレートとによる12-pNCAの変換の際の吸収の変化を示す。
【図５】 図5は、迂回反応経路を伴う、pNCAを基質としたZn/Co(III)セパルクレートか
らP450への電子伝達系の概略を示す。
【図６】 図6は、カタラーゼを添加した場合としない場合の、Tris/HCl（50 mM, pH 8.2
, 0.25 M KCl）中における、P450 BM-3 F87AおよびZn/Co(III)セパルクレートに
よる12-PCAの変換を示す。
【図７】 図7は、P450 BM-3 F87AおよびZn/Co(III)セパルクレート存在下での、ｐ−ニ
トロフェノラートの還元に対するTris/HClおよびリン酸カリウムバッファー混合
物の影響を示す。
【図８】 図8の(A)は、P450 BM-3 F87Aによる12-pNCAの変換をCo(III)セパルクレート濃
度の関数として示し、(B)は、基質存在下の、P450 BM-3 F87A活性へのCo(III)セ
パルクレートの影響を示す。
【図９】 図9は、12-pNCAの変換を、0.5 mM Co(III)セパルクレートの存在下で使用され
た亜鉛粉末の量の関数として示す。
【図１０】 図10は、基質なしで様々な濃度の過酸化水素と共に5分間インキュベートした
後に残存するP450 BM-3 F87Aの活性を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:11） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，Ｃ Ｎ，ＪＰ，ＮＯ，ＵＳ (72)発明者 シュワネベルク，ウルリッヒ ドイツ連邦共和国 ディー−71336 ワイ ブリンゲン，ウーランドシュトラーセ 15 Ｆターム(参考） 4B029 AA21 BB16 CC03 4B050 CC02 CC03 DD02 FF11E GG10 LL03 LL05 4B063 QA01 QQ22 QR47 QS28 QX01 QX02 4B064 AD30 CA21 DA20

Claims (22)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 酸化還元特性を有する酵素に電子を伝達するための電子供与
    体系であって、電極に結合していない無機の電子供給源および該電子供給源から
    酵素に電子を伝達することができるメディエーターを含んでなる、上記電子供与
    体系。
  2. 【請求項２】 前記酵素がシトクロムP450含有酵素である、請求項１に記載
    の電子供与体系。
  3. 【請求項３】 前記酵素がモノオキシゲナーゼ（E.C. 1.14.-.-）である、
    請求項２に記載の電子供与体系。
  4. 【請求項４】 前記メディエーターが約-0.4 Vより低い範囲の標準電位を有
    する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の電子供与体系。
  5. 【請求項５】 前記メディエーターがコバルト(III)セパルクレート、メチ
    ルビオロゲン、ニュートラルレッド、リボフラビン、ルテニウムトリアセテート
    、FMNおよびFADから選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の電子供与
    体系。
  6. 【請求項６】 電子供給源がメディエーターより低い標準電位を有する金属
    である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の電子供与体系。
  7. 【請求項７】 電子供給源が金属亜鉛である、請求項６に記載の電子供与体
    系。
  8. 【請求項８】 下記の系： − Zn／コバルト(III)セパルクレート、および − Zn／ニュートラルレッド、 から選択される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の電子供与体系。
  9. 【請求項９】 炭化水素を含む水素供与分子への酸素の酵素的伝達方法であ
    って、酸素伝達酵素および請求項１〜８のいずれか１項に記載の電子供与体系を
    含む反応媒体中で酸素の存在下に、該水素供与分子を反応条件下でインキュベー
    トすることを含んでなる、上記方法。
  10. 【請求項１０】 水素供与分子が式： R−X [式中、Rは8個以上の炭素原子をもつアルキル基であり、Xは水素結合を形成し得
    る極性基、好ましくはカルボキシル、アミド、ニトリル、スルフェート、スルホ
    ン、アミンまたはヒドロキシル基である] で表される化合物から選択される、請求項９に記載の方法。
  11. 【請求項１１】 末端または末端付近（ω-1位からω-4位）でヒドロキシル
    化された脂肪酸の酵素的製造方法であって、 a) ヒドロキシル化可能な脂肪酸または脂肪酸誘導体を、請求項１〜８のいず
    れか１項に記載の電子供与体系の存在下で、シトクロムP450モノオキシゲナーゼ
    および酸素を用いて変換し、 b) ヒドロキシル化された生成物を単離する、 ことを含んでなる、上記方法。
  12. 【請求項１２】 ω-ヒドロキシル化可能な脂肪酸誘導体が、10個より多い
    炭素原子をもつ、末端が飽和の、分枝または非分枝脂肪酸、特にC12-C30脂肪酸
    から選択される、請求項１１に記載の方法。
  13. 【請求項１３】 前記酵素が、 a) バシラス・メガテリウム(DSM 32T)から単離できる野生型酵素、 b) 該野生型酵素（配列番号35）の26、47、72、74、87、188および354位のう
    ち少なくとも１つにおけるアミノ酸置換により得られる突然変異体、 から選択されるシトクロムP450モノオキシゲナーゼである、請求項９〜１２のい
    ずれか１項に記載の方法。
  14. 【請求項１４】 F87A、F87V、L188K、V26T、R47F、S27G、A74GおよびM354T
    から選択される単一突然変異体を用いる、請求項１３に記載の方法。
  15. 【請求項１５】 前記突然変異体が、87位の突然変異F87AまたはF87Vと、次
    の突然変異：L188K、A74G、R47FおよびV26Tのうちの少なくとも１つの他の突然
    変異を有する、請求項１３に記載の方法。
  16. 【請求項１６】 電子供与体系がZn／Co(III)セパルクレートである、請求
    項１１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
  17. 【請求項１７】 少なくとも工程a)が塩素イオンの存在下で実施される、請
    求項１１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
  18. 【請求項１８】 少なくとも工程a)が過酸化水素開裂酵素の存在下で実施さ
    れる、請求項１１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
  19. 【請求項１９】 ω-ヒドロキシル化脂肪酸の製造に用いるためのバイオリ
    アクターであって、固定化モノオキシゲナーゼおよび請求項１〜８のいずれか１
    項に記載の電子供与体系を液状反応媒体中に含んでなる、ω-ヒドロキシル化脂
    肪酸の製造に使用するためのバイオリアクター。
  20. 【請求項２０】 脂肪酸モノオキシゲナーゼの検出方法であって、 a) 酵素活性をもつと予想される被検体を、末端に除去可能な発色団または発
    蛍光団をもつω-ヒドロキシル化可能な脂肪酸または脂肪酸誘導体と共に、請求
    項１〜８のいずれか１項に記載の電子供与体系の存在下でインキュベートし、 b) 該発色団または発蛍光団の脱離を定性的または定量的に測定する、 ことを含んでなる、上記方法。
  21. 【請求項２１】 前記変換が過酸化水素開裂酵素の存在下で、適宜に塩素イ
    オンの存在下で、実施される、請求項２０に記載の方法。
  22. 【請求項２２】 請求項１〜８のいずれか１項に記載の電子供与体系を含む
    検査キット。
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