ES2273716T3

ES2273716T3 - Sistema donador de electrones para enzimas y su empleo en la transformacion bioquimica de substratos.

Info

Publication number: ES2273716T3
Application number: ES00951460T
Authority: ES
Inventors: Bernhard Hauer; Rolf D. Schmid; Ulrich Schwaneberg
Original assignee: BASF SE
Current assignee: BASF SE
Priority date: 1999-07-27
Filing date: 2000-07-27
Publication date: 2007-05-16
Anticipated expiration: 2020-07-27
Also published as: WO2001007573A8; CN100482789C; EP1196545A1; PT1196603E; AU6439000A; NO20020376D0; ES2291219T3; ATE371028T1; CN1196789C; WO2001007573A1; EP1196545B1; EP1196603A2; CN1376194A; US20100267083A1; WO2001007574A3; CA2378615C; DE50014590D1; NO20020350D0; NO20020376L; WO2001007574A2

Abstract

Sistema donador de electrones para la transferencia de electrones hasta enzimas con propiedades Redox, caracterizado porque el sistema abarca una fuente de electrones inorgánica, no enlazada mediante electrodos y un mediador, que es capaz de transferir electrones desde la fuente de electrones hasta el enzima, siendo el enzima una monooxigenasa que contiene citocromo P450 (E.C. 1.14.-.-), y siendo la fuente de electrones un metal con un potencial normal normalizado menor que el del mediador.

Description

Sistema donador de electrones para enzimas y su empleo en la transformación bioquímica de substratos.

La invención se refiere a un nuevo sistema donador de electrones para enzimas que contienen citocromo P450 con propiedades Redox, que comprende una fuente de electrones inorgánica, no enlazada por electrodos y un mediador, capaz de realizar la transferencia de los electrones desde una fuente de electrones hasta los enzimas, siendo la fuente de electrones un metal con un potencial normal normalizado menor que el del mediador, y a su empleo en reacciones de oxidación catalizadas por medio de enzimas, tal como, especialmente, para la obtención de ácidos grasos \omega-hidroxilados. La invención se refiere, además, a un procedimiento mejorado para la detección de monooxigenasas de ácidos grasos, biorreactores así como estuches de ensayo, en los que puede ser empleado ventajosamente el sistema donador de electrones.

El aprovechamiento biotecnológico de los enzimas con propiedades Redox, tal como por ejemplo el de las monooxigenasas, en sistemas de reacción exentos de células, presenta, básicamente, el problema de que el empleo de cofactores naturales, para la preparación del equivalente Redox necesario (por ejemplo NADH o del NADPH), está relacionado con costes inadmisiblemente elevados.

Esto es válido también para el aprovechamiento biotecnológico de las monooxigenasas que contienen citocromo P450. Desde el punto de vista funcional, todos los enzimas P450 tienen en común el hecho de transferir átomos de oxígeno hasta enlaces alifáticos o aromáticos, no activados X-H (X = -C, -N, -S). Además, los enzimas P450 son capaces de epoxidar el doble enlace -C=C-. La mayoría de los sistemas P450 necesitan, para las reacciones de oxigenación, cofactores tales como NADPH o NADH, como fuente de electrones. De acuerdo con la realización de este sistema de transferencia de electrones (sistema de reductasa) se subdividen los sistemas P450 en cuatro clases. La clase I de enzimas P450 contiene como reductasa un dominio FAD y otra proteína Fe-S (en la mayoría de los casos enzimas P450 mitocondriales y bacterianas), la clase II de enzimas P450 tiene una reductasa FAD/FMN (en la mayoría de los casos enzimas ER-P450) y la clase III de enzimas P450 no requiere ningún otro equivalente de reducción, éstas transforman substratos peroxigenados, que contengan ya el oxígeno. El único enzima P450 de la clase IV recibe sus electrones directamente del NADH, sin sistema de transferencia.

La multiplicidad funcional de las monooxigenaciones, catalizadas mediante sistemas P450, por vía química de compuestos frecuentemente accesibles solamente con dificultad, ofrece un enorme potencial biotecnológico, farmacológico y toxicológico. Una condición previa importante para el aprovechamiento in vitro de este potencial consiste en el desarrollo de sistemas adecuados de expresión, de purificación y, ante todo, de detección de la actividad, que permitan caracterizar los sistemas P450 y encontrar variantes enzimáticas con propiedades "mejoradas".

Otra importante condición previa, para el aprovechamiento de estas monooxigenasas P450, especialmente de las clases I y II, consistiría en la disponibilidad de un sistema donador de electrones económico.

Se ha propuesto, en la publicación de Deffner et al., Ann. N.Y. Acad. Sci.(1987) 501, 171, un sistema para el reciclo del cofactor NADPH. Sin embargo, éste representa, cuando es empleado a escala preparativa, un problema de costes y realizaciones complicadas de la reacción en reactores de enzima-membrana. Por lo tanto, se han buscado donadores de electrones alternativos. Una vía prometedora está representada por la reducción electroquímica de enzimas P450. Los autores Estabrook et al. (Methods Enzymol. (1996) 272, 44) pudieron determinar, por medio de un sistema mediador de sepulcrato de Co(III) y electrodos de Pt conversiones para seis enzimas diferentes P450. Las actividades eran, sin embargo, aproximadamente 8 veces menor que con el equivalente de reducción NADPH. En lugar de los mediadores se encontró en ditionito de sodio (Fang et al., Drug. Metab. Dispos. (1996) 24(11): 1282) un compuesto, que reduce directamente los enzimas P450. En el caso de la P450 BM-3 la actividad con ditionito de sodio era 8.150 veces menor que con el NADPH; probablemente se reduce tres veces la P450 BM-3 mediante el ditionito de sodio y, por lo tanto, se inactiva en gran medida.

Una primera tarea de la invención consistía, por lo tanto, en poner a disposición un sistema donador de electrones económico, eficiente, alternativo, para enzimas con propiedades Redox. Especialmente este sistema debería poderse emplear en transformaciones bioquímicas, en las que intervengan enzimas que contengan citocromo P450. Además, debería ponerse a disposición un procedimiento mejorado para la detección de enzimas p450. Otra tarea de la invención consistía en la puesta a disposición de un procedimiento biotecnológico, mejorado, para la transferencia enzimática de oxígeno hasta moléculas orgánicas y, especialmente, para la hidroxilación terminal o subterminal de compuestos de hidrocarbilo con grupos polares, tales como, especialmente, los ácidos grasos.

Esta tarea se resolvió, sorprendentemente, mediante la puesta a disposición de un sistema donador de electrones para la transferencia de electrones hasta los enzimas que contengan citocromo P450 con propiedades Redox, caracterizado porque el sistema abarca una fuente de electrones inorgánica, no enlazada por electrodos y un mediador, que es capaz de efectuar la transferencia de los electrones desde la fuente de electrones hasta el enzima, siendo la fuente de electrones un metal con un potencial normal normalizado más bajo que el del mediador. En este caso pueden presentarse los componentes del sistema individualmente o en mezcla, en forma dispuesta sobre un soporte o, preferentemente, sin soporte.

\newpage

Una "fuente de electrones no enlazada a través de electrodos" en el sentido de la invención es capaz de suministrar electrones al mediador sin la aplicación de una tensión externa entre un par de electrodos. Especialmente se reducirá en este caso el mediador por medio de una fuente de electrones a través de una reacción química Redox.

El sistema donador de electrones, preparado según la invención, puede emplearse para los enzimas que contengan citocromo P450 de los enzimas abarcados por la gran familia de las monooxigenasas (E.C. 1.14.-.-). Como ejemplo no limitativo puede citarse en este caso la citocromo P450-monooxigenasa BM-3 que puede ser aislada de Bacillus megaterium.

En una forma de realización preferente del sistema donador de electrones, éste abarca un mediador con un potencial normal normalizado (por ejemplo medido contra electrodo de calomelanos; bajo condiciones normalizadas; véase más adelante Caesar et al.) en el intervalo situado por debajo de aproximadamente -0,4 V. Ejemplos no limitantes de los mediadores, empleables según la invención, son el sepulcrato de cobalto(III), el metilviológeno, el rojo neutro, la riboflavina, el triacetato de rutenio, FMN y FAD, siendo preferente el sepulcrato de cobalto(III). El sepulcrato de cobalto(III) tiene, por ejemplo, un potencial normal bajo condiciones normalizadas de -0,54 V (véase la publicación de Caesar et al. (1977), J. Am. Chem. Soc., 99, 3181).

El sistema donador de electrones, según la invención, abarca como fuente de electrones un metal con un potencial normal normalizado menor que el del mediador. Como ejemplo no limitativo de fuente de electrones puede citarse el cinc metálico. El metal se presenta en este caso, preferentemente, en una forma reactiva, es decir con gran superficie, tal como por ejemplo en forma de polvo.

Los sistemas donadores de electrones según la invención, preferentes, abarcan las siguientes combinaciones de fuentes de electrones y de mediador:

\bullet: Zn/sepulcrato de cobalto(III) o

\bullet: Zn/rojo neutro

Otro objeto de la invención se refiere a un procedimiento para la oxidación enzimática de, es decir la transferencia de oxígeno hasta una molécula donadora de hidrógeno que contenga hidrocarburo (es decir un compuesto oxidable), caracterizado porque se incuba la molécula donadora de hidrógeno en un medio de reacción, que comprende el enzima para la transferencia de oxígeno y un sistema donador de electrones según la definición dada anteriormente, en presencia de oxígeno bajo condiciones de reacción.

Una "oxidación" en el sentido de la presente invención se refiere a reacciones de oxidación catalizadas por medio de enzimas, que se catalizan por enzimas de la clase de las monooxigenasas (E.C. 1.14.-.-) y, ante todo, por el enzima citocromo P450. Estas reacciones de oxidación comprenden:

a): oxidaciones del carbono sobre átomos de carbono saturados o insaturados, alifáticos o aromáticos, tales como por ejemplo hidroxilaciones y epoxidaciones;

b): oxidaciones del azufre;

c): oxidaciones del nitrógeno;

d): desalquilaciones por oxidación; y

e): deshalogenaciones por oxidación.

En este caso se elegirá, preferentemente, la molécula donadora de hidrógeno entre los compuestos de la fórmula

R-X

en la que

R: significa un resto alquilo de cadena lineal o de cadena ramificada, preferentemente de cadena lineal, con 8 o más átomos de carbono, tal como, por ejemplo, con 10 hasta 30 átomos de carbono, y

X: significa un grupo polar, capaz de formar puentes de hidrógeno, preferentemente un grupo carboxi, amido, nitrilo, sulfato, sulfona, amina o hidroxi.

Una variante del procedimiento anterior se refiere a la obtención enzimática de ácidos grasos hidroxilados en forma terminal o subterminal (es decir en la posición \omega-1 hasta \omega-4), caracterizado porque

a): se hace reaccionar un ácido graso hidroxilable o un derivado de ácido graso hidroxilable en presencia de un sistema donador de electrones según la definición anterior, con una citocromo P450 monooxigenasa y oxígeno; y

b): se aíslan el o los productos hidroxilados.

Los ácidos grasos \omega-hidroxilables (es decir hidroxilables en posición terminal o subterminal) o bien sus derivados se elegirán preferentemente, según la invención, entre o bien derivados de ácidos grasos terminales saturados, ramificados o no ramificados con 8 o más, tal como por ejemplo con más de 10 átomos de carbono, especialmente ácidos grasos con 12 hasta 30 átomos de carbono. Como ejemplos no limitativos de los ácidos grasos hidroxilables según la invención pueden citarse: el ácido caprínico, el ácido pelargónico, el ácido undecanoico, el ácido láurico, el ácido tridecanoico, el ácido mirístico, el ácido pentadecanoico, el ácido palmítico, el ácido margarínico, el ácido esteárico, el ácido nonadecanoico, el ácido araquinoico, el ácido behénico, el ácido lignocerínico, el ácido cerotínico y el ácido melísico.

Ejemplos de derivados adecuados de ácidos grasos son los ésteres de alquilo con 1 hasta 4 átomos de carbono, las amidas o los anhídridos con, preferentemente, ácidos carboxílicos de cadena corta, especialmente con 1 hasta 4 átomos de carbono.

En el procedimiento, según la invención, anteriormente descrito, se emplea, como enzima, una citocromo P450 monooxigenasa, que se elige entre:

\bullet: citocromo P450 monooxigenasa de la clase de enzimas E.C. 1.14.-.-, especialmente de la familia P450 CYP102, de origen eucariota o procariota, especialmente bacteriano y, preferentemente, del enzima de tipo natural aislable a partir de Bacillus megaterium (DSM 32T); o

\bullet: un mutante del mismo.

Un grupo preferente de mutantes se deriva de la citocromo P450 monooxigenasa BM-3 procedente de Bacillus megaterium con una secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 35, que presenta al menos una mutación funcional en uno de los intervalos de la secuencia de aminoácidos siguientes: 24-28, 45-51, 70-72, 73-82 (hélice 5), 86-88 (hélice 6), 172-224 (F/G-loop) y 352-356 (\beta-hebra 8); así como equivalentes funcionales de estos mutantes.

Una "mutación funcional" en el sentido de la presente invención abarca un intercambio de aminoácidos en los intervalos de secuencia citados, que conduce a un mutante, que es capaz, además, de catalizar una de las reacciones de oxidación anteriormente citadas, tales como, por ejemplo, las hidroxilaciones.

Según la invención son especialmente preferentes los mutantes de la P450 BM-3-monooxigenasa, que abarcan al menos respectivamente una mutación funcional en los intervalos de la secuencia de aminoácidos 86-88, 172-224, 73-82, 45-51, 24-28 70-72 y 352-356 (según SEQ ID NO: 35) individualmente o en combinación.

Especialmente puede presentarse la substitución de los aminoácidos en al menos una de las posiciones 26, 47, 72, 74, 87, 188 y 354 según SEQ ID NO: 35 del enzima de tipo natural.

De este modo puede reemplazarse, por ejemplo, Phe87 por un aminoácido con una cadena lateral alifática, tal como por ejemplo Ala, Val, Leu, especialmente Val o Ala; puede reemplazarse Leu188 por un aminoácido con cadenas laterales de amina o de amida; tal como por ejemplo Asn, Gln, Arg o, especialmente, Lys, o aminoácidos tales como Ala, Gly, Ser y Trp; el Ala74 puede reemplazarse por otro aminoácido con cadenas laterales alifáticas, tal como por ejemplo Val y, especialmente, Gly; el Arg47 puede reemplazarse por un aminoácido con grupos laterales en forma de anillo, tal como por ejemplo His, Tyr o, especialmente, Phe; y val26 puede reemplazarse por un aminoácido con grupos laterales de hidroxilo tal como por ejemplo Ser o, especialmente, Thr. De manera ejemplificativa puede reemplazarse Ser72 por un aminoácido con cadenas laterales alifáticas, tal como por ejemplo Ala, Val, Leu, Lle y, especialmente, Gly, y Met354 puede reemplazarse por un aminoácido con grupos laterales de hidroxilo, tal como por ejemplo Ser o, especialmente, Thr.

Ejemplos de mutantes son:

a): F87V;

b): F87A, L188K;

c): F87V, L188K;

d): F87A, L188K; A74G;

e): F87V, L188K, A74G;

f): F87A, L188K, A74G, R47F;

g): F87V, L188K, A74G, R47F;

h): F87A, L188K, A74G, R47F, V26T; o

i): F87V, L188K, A74G, R47F, V26T;

k): V26T,

l): R47F,

m): S72G,

n): A74G,

o): F87A

p): L188z, donde z significa K, R, W, Q, N, G, A o S, y

q): M354T;

así como equivalentes funcionales de los mismos.

Los mutantes adecuados han sido descritos, por ejemplo, también en la publicación anterior DE-A-100 11 723, a la que se hace referencia por la presente.

Los mutantes empleados y los equivalentes funcionales pueden presentar en este caso un "perfil modificado del substrato" en comparación con el enzima de tipo natural.

Un "perfil modificado del substrato" significa en el ámbito de la presente invención, especialmente:

a): una modificación de la reactividad, tal como, por ejemplo, un aumento de la actividad específica (expresada como nmol de substrato transformado/minuto/nmol del enzima P450) y/o al menos de un parámetro cinético, elegido entre Kcat, Km y Kcat/Km, por ejemplo en al menos un 1%, tal como por ejemplo de un 10 hasta un 1.000%, un 10 hasta un 500% o un 10 hasta un 100%, de los mutantes frente a al menos un substrato oxidable en comparación con el enzima de tipo natural; y/o

b): una modificación de la regioselectividad, tal como especialmente un desplazamiento de la posición preferente de la reacción de oxidación; en este caso puede desplazarse, por ejemplo, la posición de la hidroxilación preferentemente terminal o subterminal (\omega-1, \omega-2, \omega-3, \omega-4, especialmente \omega-1 bis \omega-3) al menos en un ácido carboxílico hidroxilable, o en un derivado hidroxilable de un ácido carboxílico alifático. La modificación del perfil del substrato puede expresarse en este caso a través de todo el intervalo mayor (es decir desde 8 hasta 30 átomos de carbono) o únicamente en intervalos parciales, por ejemplo en ácidos carboxílicos con 8 hasta 12 átomos de carbono, con 10 hasta 12 átomos de carbono, con 12 hasta 30 átomos de carbono, con 12 hasta 25 átomos de carbono o con 12 hasta 20 átomos de carbono o en ácidos carboxílicos individuales procedentes de estos intervalos parciales.

Según la invención, se entenderá por "equivalentes funcionales" también aquellos mutantes que presenten otra substitución de los aminoácidos diferente de la que ha sido citada concretamente en al menos una de las posiciones de la secuencia anteriormente citadas, pero que, a pesar de ello, conduzcan a un mutante que catalice también, igual que el mutante concreto citado, una de las reacciones de oxidación anteriormente definidas.

La equivalencia funcional se da, especialmente también, cuando las modificaciones coincidan cualitativamente en la plantilla de reactividad.

Los "equivalentes funcionales" abarcan naturalmente también los mutantes de P450-monooxigenasa, que sean accesibles a partir de otros organismos del mismo modo que los mutantes P450 BM3 citados concretamente, mediante mutación de los enzimas P450. De manera ejemplificativa pueden observarse, mediante la comparación de las secuencias, intervalos de regiones homólogas de secuencias. Con los métodos modernos de la modelación molecular (Molecular Modeling) pueden llevarse a cabo mutaciones equivalentes, influenciadoras de la plantilla de reacción de acuerdo con las especificaciones concretas de la invención.

Los "equivalentes funcionales" abarcan también los mutantes obtenibles por medio de una o varias adiciones de aminoácidos, substituciones de aminoácidos, eliminaciones de aminoácidos y/o inversiones de aminoácidos adicionales, pudiéndose presentar las citadas modificaciones adicionales en cualquier posición de la secuencia, en tanto en cuanto conduzcan a un mutante con "perfil modificado del substrato" en el sentido anteriormente indicado.

Los mutantes, preferentemente empleados, abarcan una mutación en la posición 87 y se eligen entre las mutaciones F87A y F8V y, en caso dado, presenta, al menos, otra de las siguientes mutaciones: L188K, A74G, R47F y V26T. Es especialmente preferente el mutante simple F87A y el mutante quíntuple F87A, L188K, A74G, R47F, V26T (indicaciones de los aminoácidos en el código de monoletras, originalmente el aminoácido a la izquierda de los datos de posición; nuevos aminoácidos a la derecha de los datos de posición).

Preferentemente se llevarán a cabo los procedimientos anteriormente indicados con empleo del sistema donador de electrones constituido por cinc/sepulcrato de Co(III).

En una forma preferente de realización del procedimiento se condujo la conversión en presencia de iones cloruro.

Además, puede ser ventajosa la presencia de un enzima disociador de peróxido de hidrógeno, tal como por ejemplo la catalasa.

Otro objeto de la invención se refiere a un biorreactor para el empleo en la transferencia enzimática de oxígeno hasta una molécula donadora de hidrógeno que contenga hidrocarburo, y, especialmente, para el empleo en la obtención de ácidos grasos \omega-hidroxilados, caracterizado por una monooxigenasa inmovilizada (por ejemplo inmovilizada sobre un material de soporte, tal como por ejemplo DEAE 650 M o Super Q650M) y un sistema donador de electrones según la definición anteriormente indicada, en medio de reacción líquido. La configuración especial del reactor se lleva a cabo de acuerdo con los conocimientos usuales del ramo.

Otro objeto de la invención se refiere a un procedimiento para la detección de los ácidos grasos-monooxigenasas, caracterizado porque:

a): se incuba un analito, en el que se supone actividad enzimática, con un ácido graso \omega-hidroxilable o derivado de ácido graso, que porta o que portan un fluoróforo o cromóforo terminal, disociable, en presencia de un sistema donador de electrones según la definición anteriormente indicada; y

b): la determinación cualitativa o cuantitativa de la disociación del fluoróforo o del cromóforo.

Como analito entra en consideración, por ejemplo, un homogeneato celular, por ejemplo de una cepa bacteriana. Con ayuda del procedimiento de detección, según la invención, pueden revisarse, por ejemplo, colecciones de cepas en cuanto a la actividad enzimática.

La reacción se lleva a cabo en este caso, preferentemente, en presencia de un enzima disociador de peróxido de hidrógeno y, en caso dado, en presencia de iones cloruro.

Ejemplos de fluorórofos y de cromóforos adecuados son los fenoles, los catecoles, las hidroxicumarinas, tal como la umbeliferona, la fenoxazina y, especialmente, la resorufina.

El establecimiento de los parámetros óptimos para el procedimiento, para las conversiones enzimáticas, anteriormente descritas, y las reacciones de detección es posible sin mayor problema teniéndose en consideración las indicaciones dadas en la parte experimental siguiente. De este modo es especialmente ventajosa, por ejemplo, sin carácter limitativo, una concentración de sepulcrato de cobalto(III) mayor que 0,1 mM, tal como, por ejemplo, especialmente desde 0,5 hasta 1,0 mM; igual que un valor del pH desde aproximadamente 8 hasta 8,5; una concentración en cinc mayor que aproximadamente 2 mg/ml, tal como por ejemplo desde aproximadamente 5 hasta 50 mg/ml. El enzima disociador de peróxido de hidrógeno puede emplearse, por ejemplo, en cantidades desde aproximadamente 10 hasta 5.000 U/ml.

Finalmente, la invención se refiere, a título de otro objeto, a un estuche de ensayo, especialmente para la realización del procedimiento de detección anteriormente descrito para ácidos carboxílicos-monooxigenasas, que comprende un sistema donador de electrones según la definición anteriormente indicada.

Las múltiples posibilidades de aplicación de la presente invención se explicarán con mayor detalle en las secciones siguientes:

Reacciones catalizadas de sistemas P450 y ejemplos de aplicaciones industriales en la síntesis de productos químicos finos

Los enzimas citocromo P450 sirven en los organismos, entre otras cosas, para la síntesis del ergosterol, para la biosíntesis de las feromonas de los insectos y de las plantas, para la formación de la maduración de las frutas, el olor y el color de las plantas, en la biosíntesis de glucocorticoides y de corticoides minerales, para la aromatización de andrógenos para dar estrógenos, para el metabolismo de retinoides para la regulación del crecimiento/diferenciación normal y epitelial, para el metabolismo del ácido araquidónico para la formación de prostaglandinas, leucotrienos y tromboxanos y para la formación de productos vasoactivos. Además sirven para la activación y la detoxificación de productos xenobióticos.

Los enzimas P450 pertenecen a los enzimas denominados de fase I, que se preparan mediante oxigenaciones de compuestos insolubles en agua o difícilmente solubles para otra metabolización. Para ello sirven los enzimas de la fase II tales como la glutationa-transferasa, la N-acetiltransferasa o la sulfotransferasa, que añaden un grupo polar sobre aquellos compuestos hidroxilados o epoxidados. De este modo estos metabolitos se hacen solubles en agua y por lo tanto están biodisponibles. La pluralidad de las reacciones, que son catalizadas por los enzimas de citocromo P450 se ha tratado en la recopilación siguiente y con relación a su significado económico y funcional. En la tabla 1 se encuentra una recopilación, codificada por medio de las familias seleccionadas.

TABLA 1

1

Los enzimas P450 de la familia de enzimas CYP1-3 son los responsables principales del metabolismo de los productos xenobióticos; las reacciones oxidantes, que se producen en este caso, se han subdividido a continuación como oxidaciones C, S, N, desalquilaciones y deshalogenaciones.

a) C-oxidaciones

Los enzimas P450 hidrolizan o epoxidan enlaces C-H y/o dobles enlaces C=C no activados en sistemas alifáticos y aromáticos. Los metabolitos formados son tóxicos frecuentemente como el veneno nervioso 2,5-hexanodiona o carcinógenos como los epóxidos alquilantes del ADN (por ejemplo óxido de estireno). Además las nitrosaminas y los benzopirenos, oxidados en C por los enzimas P450 son carcinógenos.

Los medicamentos, tales como los barbituratos y los fenobarbitales se transforman en su forma activa igualmente por medio de los enzimas P450. La hidroxilación de los enlaces -C-H no activados es una de las reacciones de biotransformación más útiles debido a la rara competencia provocada por los procedimientos químicos. En contra de las reacciones entre radicales, las reacciones de bio-hidroxilación en los átomos de carbono presentan la siguiente serie de actividad: secundario > terciario > primario. Procedimientos conocidos, llevados a cabo a escala industrial, consisten en la hidroxilación de la progesterona en la posición 11\alpha mediante Aspergillus niger, que hace innecesaria aproximadamente la mitad de las 37 etapas convencionales, y la 7\beta-hidroxilación del ácido 3\alpha-hidroxi-5\beta-cólico mediante Fusarium equiseti. El producto constituido por el ácido ursodesoxicólico es capaz de disolver la colesterina y se emplea para el tratamiento de los cálculos biliares. En la síntesis asimétrica se emplean las biotransformaciones, entre otras cosas, para la síntesis del ácido \beta-hidroxibutírico, que es un material de partida para la síntesis de las vitaminas (\alpha-tocoferol), de productos sazonantes, de antibióticos (calcimicina) y de alquenos epoxidados, ramificados, quirales.

b) N-oxidación / S-oxidación

Los enzimas P450 hidrolizan las arilaminas y las acetilaminas tales como la bencidina, la 4-bifenilamina y el 2-acetaminofluoreno y heterociclos semejantes, que se forman durante la combustión de los artículos comestibles, sobre el átomo de N. Tras una acetalización o sulfonación de los grupos hidroxi se forman substancias electrófilas, de acción fuertemente carcinógena.

Los ariltioéteres y los alquiltioéteres se oxidan directamente por las P450-monooxigenasas, sobre el átomo de S, para dar sulfóxidos. La oxidación no se detiene sin embargo, frecuentemente, al nivel del sulfóxido; muchos sulfóxidos son oxidados adicionalmente para dar los correspondientes compuestos de sulfona, que frecuentemente tienen una acción tóxica para la célula. Las oxidaciones microbianas de los ditioacetales quirales se consiguen con elevados excesos enantiómeros con Corynebacterium equi y Helminthosporium sp.

c) Desalquilaciones por oxidación

Los enzimas P450 catalizan también la desalquilación por oxidación de O, de N y de S. Ejemplos de estas reacciones importantes son la O-desalquilación de la codeína, de la mezcalina, de la fenacetina, las desalquilaciones en N de la efedrina, de la metanfetamina, de la aminopurina y la desalquilación en S de la 6-metiltiopurina para dar 6-metilpurina.

d) Desaminación por oxidación

Los enzimas P450 catalizan también la desaminación por oxidación de aminas. Esta reacción tiene, básicamente, una función desintoxicante para el organismo. La histamina, la noradrenalina y la mezcalina pueden desaminarse, entre otras, de esta manera.

e) Deshalogenación por oxidación

Muchos alcanos y alquenos halogenados forman, tras hidroxilación sobre un enlace -C-H un producto intermedio inestable, que se disocia en un aldehído o cetona y en H-Hal. Ejemplos son la oxidación del dibromuro de etileno para dar 2-bromoacetaldehído y la oxidación del cloroformo para dar fosgeno. El metano monohalogenado y dihalogenado forman, en comparación con el cloroformo trihalogenado, únicamente metabolitos ligeramente tóxicos para la célula.

Una descripción mecanística de los tipos de reacción presentados con P450 se encuentra en la recopilación de Koymans et al., en Xenobiotica, (1993) 23(6):633.

Aprovechamiento in vivo / in vitro de las P450-monooxigenasas para la síntesis de productos químicos finos

En contra de lo que ocurre con la biotransformación microbiana, se limita el empleo de las P450-monooxigenasas expresadas de manera recombinante, para la síntesis de productos químicos finos, a pesar de su enorme potencial, únicamente a un reducido número de procedimientos in vivo tal como la obtención de ácidos dicarboxílicos como productos intermedios para productos odorizantes, esteroides tales como la progesterona y ácidos grasos saturados e insaturados hidroxilados de manera subterminal como productos de partida para productos odorizantes (lactonas), polímeros y formas de administración para medicamentos.

El empleo de los enzimas P450 monooxigenasas in vitro para la síntesis de productos químicos finos no es conocido todavía por la literatura. Para emplear las P450-monooxigenasas para la síntesis de productos químicos finos tiene que estar presentes sistemas de expresión, que permitan la expresión funcional de P450 activo más allá de los límites de la especie con elevados rendimientos. Además el enzima debe tener una actividad y una estabilidad suficientemente elevadas (estabilidad a la temperatura, estabilidad frente a los disolventes, estabilidad frente a la oxidación). Los metabolitos producidos no deben ser tóxicos para la proteína ni para el huésped. Para la clase I y la clase II debería estar presente, además, un sistema de reciclo de cofactor adecuado. La presente invención consigue las condiciones previas para ello.

El sistema de la P450 BM-3 monooxigenasa

La P450 BM-3 (CYP102) se expresó de manera funcionalmente activa y se caracterizó por primera vez en el año 1986 como tercera P450-monooxigenasa a partir de Bacillus megaterium en E. coli. La P450 BM-3, con un peso molecular de 118 kDa, fue la primera proteína de fusión natural, soluble en agua, conocida, que contiene los tres dominios (FAD, FMN, P450) en una sola cadena polipéptida. En el año 1993 se consiguió la cristalización del dominio P450 sin substrato (Ravichandran et al., Science (1993) 261, 731) y en el año 1997 se consiguió la cristalización con substrato (Li et al. Nature Structural Biology (1997), 4(2):140). La P450 BM-3 sirve como modelo estructural preferente para este enzima P450 debido a su homología secuencial con respecto a P450 eucariota y a la carencia de estructuras cristalinas de P450 eucariota.

La P450 BM-3 es una hidroxilasa de ácidos grasos, que hidroxila de manera subterminal los ácidos carboxílicos, los alcoholes, las amidas, los compuestos de alquilamonio a partir de una longitud de cadena de 12 átomos de carbono hasta 22 átomos de carbono. La regioespecificidad de la hidroxilación depende, como muestra la tabla 2, en gran medida de la longitud de la cadena del ácido graso.

TABLA 2

3

La invención se explicará ahora con mayor detalle haciéndose referencia a las figuras adjuntas y a los ejemplos de realización siguientes, que se refieren a la aplicación del sistema donador según la invención para la hidroxilación de ácidos grasos con ayuda del enzima P450. En este caso

la figura 1 muestra el esquema de clonación de la P450 BM3 tomándose como ejemplo pCYTEXP1;

la figura 2 muestra el principio de la detección espectroscópica según la invención de la P450;

la figura 3 muestra el espectro de absorción para la reducción del sepulcrato de cobalto(III) con polvo de Zn en tris/HCl, 0,2 M, pH 8,2; línea de puntos sepulcrato de Co(III) oxidado; línea continua Zn/sepulcrato de Co(III) reducido;

la figura 4 muestra la modificación de absorción en la conversión de 12-pNCA por P450 BM-3 F87A con Zn/sepul-
crato de Co(III) en 50 mM de tris/HCl, 50, pH 8,2, 0,25 mm de KCl;

la figura 5 muestra un esquema de la vía de transferencia de electrones desde el Zn/sepulcrato de Co(III) hasta la P450 con una vía de reacción "shunt" y pNCA como substrato;

la figura 6 muestra la conversión de 12-PCA por la P450 BM-3 F87A y Zn/sepulcrato de Co(III) en 50 mM de tris/HCl, pH 8,2, 0,25 mM de KCl con y sin adición de catalasa;

la figura 7 muestra el efecto de la mezcla tampón constituida por tris/HCl y fosfato potásico sobre la reducción del p-nitrofenolato en presencia de la P450 BM-3 F87A y Zn/sepulcrato de Co(III);

la figura 8 muestra la conversión de (A) 12-pNCA por la P450 BM-3 F87A como función de la concentración de sepulcrato de Co(III); (B) el efecto del sepulcrato de Co(III) sobre la actividad de la P450 BM-3 F87A en presencia de substrato;

la figura 9 muestra la conversión de 12-pNCA como función de la cantidad de polvo de cinc empleada en presencia de sepulcrato de Co(III) 0,5 mM;

la figura 10 muestra la reactividad residual de la P450 BM-3 F87A al cabo de una incubación durante 5 minutos con diversas concentraciones de peróxido de hidrógeno sin substrato.

Ejemplo de referencia 1

Métodos microbiológicos 1. Microorganismos y plásmidos, productos químicos y enzimas

Se adquirieron el bacterio Bacillus megaterium de la colección de cepas DSMZ (32^{T}, Braunschweig, Alemania), las cepas E. coli DH5\alpha, JM105 y JM109 en Clontech (Heidelberg, Alemania) y XL1-Blue en Stratagene (Heidelberg, Alemania). La cepa W3110 la obtuvimos del instituto para la ingeniería de bioprocedimientos (Stuttgart, Alemania). La cepa E. coli DH5\alpha (supE44, lacU169 [80lacZ M15] hsdR17 recA1 endA1 gyrA96 thi-1 relA1), se empleó, en tanto en cuanto no se diga otra cosa, para los trabajos de clonación descritos a continuación. Como plásmidos encontraron aplicación pCYTEXP1 con el sistema promotor P_{R}P_{L} inducible mediante la temperatura, del bacteriófago \lambda (Belev T.N., et al., Plasmid (1991) 26:147) y pASK-IBA1CA con promotor de tetraciclina (Schmidt, T.G.M., et al., J. Chromatogr. A (1994) 676:337; Schmidt, T.G.M. et al., J. Mol. Biol. (1996) 255:753). Las cepas y plásmidos, empleados en el ámbito de este trabajo para la expresión heteróloga de la P450 BM-3 se han reunido en la tabla 3, caracterizando pT el origen del constructo P450 BM-3 del plásmido pCYTEXP1 y pA el origen del plásmido pASK-IBA1CA.

TABLA 3

4

En tanto en cuanto no se diga otra cosa, todos los productos químicos fueron adquiridos en la firma Fluka Chemie (Buchs, Suiza) y todos los enzimas se adquirieron en las firmas New England Biolabs (Beverly, USA) o Boehringer Mannheim (Penzberg, Alemania).

2. Medios de cultivo

Todos los medios de cultivo fueron adquiridos en Difco (Augsburg, Alemania).

a): Medio nutriente (medio completo para Bacillus megaterium)

5

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b): Luria-Bertani-Amp (LB-Amp, medio completo para E. coli)

6

3. Cultivo de cepas de E. coli y de Bacillus megaterium a) Ensayos con matraces sometidos a trepidaciones

El cultivo de Bacillus megaterium se llevó a cabo en medio nutriente a 30ºC, se cultivó la cepa de E. coli recombinante (DH5\alpha, JM105, JM109, XL1-Blue, W3110) en medio LB-Amp a 37ºC. Para ello se transfirió respectivamente una colonia mediante inoculación desde una placa de agar en 5 ml de LB-Amp. Aproximadamente al cabo de 18 horas de cultivo a 30ºC (Bacillus megaterium) y a 37ºC (E. coli) con una frecuencia de aplicación de las trepidaciones de 220 revoluciones por minuto se inocularon 400 ml de medio en un matraz de 2 litros con 4 ml de cultivo. La inducción de la expresión de P450 en E. coli se llevó a cabo cuando se alcanzó un valor OD_{578} comprendido entre 0,8 y 1,0 por medio de una inducción producida por choque térmico durante tres hasta cuatro horas a 42ºC en el caso del constructo de pT-plásmido o mediante adición de anhidrotetraciclina (concentración final 0,4 mg/l) en el caso del pA-USC4BM3-plásmido y una incubación de 14 horas a 30ºC.

b) Fermentaciones en tandas de 30 litros

Para la producción preparativa de la P450 BM-3 se empleó la caja de expresión pT-USC1BM3, el huésped DH5\alpha y un fermentador Bioengineering tipo LP351 con una ventilación de 3,5 l/min, una velocidad de agitación de 300 revoluciones por minuto a 37ºC en medio LB-Amp con un valor inicial del pH de 7,5. Para evitar la formación de espuma y para aumentar los rendimientos se añadieron 2,0 ml de Contraspum 210 estéril (ZSchimmer & Schwarz, Lahnstein, Alemania) y 0,1 mg/l de FeCl_{3} como paso previo a la inoculación del medio LB-Amp (Nishihara et al. 1997). Se inoculó mediante adición de dos cultivos a matraces sometidos a trepidaciones de 400 ml (OD_{578} = 0,8-1,0; sección a)). Una vez alcanzado un valor OD_{578} de 1,0 en el fermentador se llevó a cabo la producción de P450 por medio de inducción por choque térmico por aumento de la temperatura durante tres hasta cinco horas desde 37ºC hasta 42ºC. La P450 BM-3 o el mutante F87A se expresaron en E. coli DH5\alpha con rendimientos de 36 hasta 48 mg/l de caldo de fermentación. La concentración del cultivo de E. coli desde 30 litros hasta 2 litros se llevó a cabo mediante filtración en corriente transversal con una membrana Millipore Application (Eschborn, Alemania) con un Filtron (Dreieich, Alemania) Centrasette OMEGA (0,3 \mum). Tras centrifugación a 9.200 g durante 20 min se volvieron a suspender las células en tampón de fosfato de potasio (50 mM, pH 7,5) o en tampón tris/HCl (50 mM, pH 7,5), se distribuyeron en alícuotas en doce tubos de Falcon de 50 ml (Greiner) y se congelaron a -20ºC hasta su utilización.

Ejemplo de referencia 2

Oligonucleótidos sintéticos

Todos los cabadores fueron fabricados por ARK Scientific GmbH Biosystems (Düsseldorf, Alemania). Únicamente se purificaron mediante HPLC los cabadores para la mutación puntual y para el aislamiento del gen P450 BM-3 procedente del ADN genómico de Bacillus megaterium.

a) Oligonucleótidos para el ADN genómico de Bacillus megaterium

\vskip1.000000\baselineskip

B1)	5'-GTGAAAGAGGGATCCCATGACAATTAAAGAAATGCC-3'	(SEQ ID NO: 1)

B2)	5'-GCCTCTTGGATCCTTACCCAGCCCACACGTCTTTTGCG-3'	(SEQ ID NO: 2)

b) Cabador para la secuenciación

7

c) Oligonucleótidos para Tags sobre el extremo C

8

d) Cabador para P450 BM-3 mutante puntual F87A

80

\newpage

Ejemplo de referencia 3

Métodos de ingeniería genética 1. Aislamiento y precipitación del ADN genómico de Bacillus y ADN plásmido procedente de E. coli

Para el aislamiento del ADN genómico a partir de Bacillus megaterium mediante extracción con fenol-cloroformo se suspendió de nuevo el pellet celular procedente de 200 ml de sobrenadante de cultivo (OD_{578} = 1,2) en 20 ml de mezcla de lisozima (18 mg de lisozima, 50 mM de EDTA, 50 mM de NaCl, 30 mM de tris/HCl, pH 8,0) y se sometió a trepidaciones a 37ºC y durante 30 minutos a 220 revoluciones por minuto. Tras adición de 2 ml de SDS (al 10% (m/v)) se prosiguió la incubación durante otros 60 minutos a 37ºC y a 220 revoluciones por minuto. Para la eliminación de los desechos celulares se extrajo tres veces con una mezcla formada por cloroformo/alcohol isoamílico (Roth, Karlsruhe, Alemania) y una vez con fenol. El ADN genómico se precipita mediante adición de 10% (v/v) de NaAc 3 M, pH 4,8 y 60% (v/v) de isopropanol, agitación con varilla de vidrio, transferencia a un tubito de Corex y centrifugación a 32.570 g. Al cabo de tres lavados con etanol a 70% se seca el ADN al "vacío de la casa" y se disuelve en 3 ml de tampón TE (10 mM de tris/HCl, 1 mM de EDTA, pH 7,5). La pureza del ADN se determinó con un valor de 2,2 mediante espectroscopia con formación de los cocientes desde 260 nm hasta 280.

El aislamiento del plásmido ADN a partir de E. coli se llevó a cabo con el estuche QIAprep-Spin-Miniprep basado en la lisis alcalina de las células, exactamente según las indicaciones del fabricante (Qiagen).

2. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) a) PCR para aislamiento del gen P450 BM-3 a partir del ADN genómico de Bacillus megaterium

\hskip0,5cm Protocolo normalizado para la PCR

9

Carga normalizada

8 \mul de dNTP-Mix (200 \muM), 10 \mul de tampón de Taq-polimerasa (10x) sin MgCl_{2}, 8\mul de MgCl_{2} (25 mM), 1 \mul de cabador B1 (0,1 \muM), 1 \mul de cabador B2 (0,1 \muM), 1\mul de ADN genómico de Bacillus megaterium, 2,5 U de Taq-polimerasa (MBI Fermentas, Vilnius, Lituania), hasta 100 \mul de agua desmineralizada.

b) Inserción de la secuencia Tag en el extremo C

Para simplificar la proteinación y para posibilitar una inmovilización orientada de la P450 BM-3, se añadió sobre el gen de la P450 BM-3 un Tag C-terminal con una longitud respectiva de seis aminoácidos. Como matriz actuó el ADN genómico de Bacillus megaterium. Como extremos de restricción sobresalientes se eligieron BamHI y EcoRI para los His-, Arg- y Glu-Tag, para clonar a continuación el gen P450-BM-3, modificado, en el plásmido pCYTEXP1. Para el Strip-Tag se eligieron BsaI para los extremos 5' y 3'; esto posibilita una clonación en el plásmido pASK-IBA1CA. El BsaI corta sólo después de la secuencia de reconocimiento, con lo cual los extremos de restricción sobresalientes presentan secuencias diferentes y, por lo tanto, permiten una ligadura orientada.

Para la PCR se empleó el programa PCR normalizado y la carga normalizada. A diferencia de la carga normalizada se emplearon para el His_{6}-Tag los cabadores H1 y H2, para el Arg_{6}-Tag los cabadores A1 y A2, para el Glu_{6}-Tag los cabadores G1 y G2 así como para el Strep-Tag los cabadores S1 y S2.

3. Disociación por restricción, separación mediante electrofóresis y purificación de fragmentos de ADN

Las endonucleasas de restricción cortan de manera específica al ADN. La disociación por restricción del ADN se llevó a cabo en un volumen de reacción de 10 \mul en presencia de 2 a 3 \mul de ADN (Spin-Präp (Qiagen)), 1 a 2 U de enzima de restricción, 1 \mul de tampón de restricción (10x) y hasta 10 \mul de ddH_{2}O por medio de incubación durante una hasta dos horas de la solución de la reacción a 37ºC (excepto BsaI) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La purificación de los fragmentos de ADN se llevó a cabo mediante electrofóresis de gel con agarosa de acuerdo con la rutina de Sambrook et al. 1989. En función del tamaño de los fragmentos de ADN a ser separados se empleó gel de agarosa desde el 0,8 hasta el 2%. Como tampón para la electrofóresis sirvió el tampón TAE (40 mM de tris/HCl, 20 mM de ácido acético glacial, 2 mM de EDTA, pH 8,3). Se aplicó una tensión de 120 V debido al desprendimiento de calor en el caso de los geles de agarosa hasta del uno por ciento y de 100 V en el caso de los geles de agarosa de hasta el dos por cierto. Se empleó bromuro de etidio intercalante (concentración final 0,25 \muM) para la visualización del ADN en transiluminación por medio de UV de un transiluminador (312 nm).

El aislamiento de los fragmentos de ADN a partir de los geles de agarosa se llevó a cabo con empleo del estuche de extracción de gel QIAquick (Qiagen). En este caso se inmoviliza el ADN mediante enlaces en columna que contiene gel de sílice y se libera de las impurezas por medio de diversas etapas de lavado. Mediante elución subsiguiente con agua desmineralizada pueden obtenerse con este método hasta 8 \mug de ADN (100 bp-10 kb).

4. Ligadura y transformación en E. coli

Para la ligadura del ADN se empleó T4-ADN-ligasa (New England Biolabs, Beverly, USA), que cataliza la formación de enlaces de fosfodiéster entre los extremos 5'-fosfato y 3'-hidroxi del ADN y, por lo tanto, une dos moléculas lineales de ADN o posibilita la ciclación de una molécula lineal.

Para la ligadura se añadieron al recipiente de reacción de Eppendorf fragmentos del vector y del inserto, purificados en gel de agarosa (véase el punto 3) en la proporción molar de 1 a 3 hasta 1 a 5 a favor del inserto. Como paso previo a la adición de 2 \mul de tampón de ligasa (10x) y 2-10 unidades de T4-ADN-ligasa, se añadió agua desmineralizada (volumen total 20 \mul).La carga de la reacción se incubó durante una hora a temperatura ambiente o durante la noche a 7ºC.

Para la obtención de células más competentes para la transformación se utilizaron 500 \mul de un cultivo realizado durante la noche de E. coli para la inoculación de un matraz de 250 ml sometido a trepidaciones, que contenía 50 ml de medio LB. Aproximadamente al cabo de tres horas de incubación a 37ºC y 220 revoluciones por minuto se centrifuga el cultivo, una vez alcanzado un valor OD_{600} de 0,4-0,6, a 5.500 g durante 3 minutos a 4ºC. El pellet celular se vuelve a suspender en 2 ml de tampón TSS (10 g de PEG6000, 5 ml de DMSO, 0,6 g de MgSO_{4}, hasta 100 ml de LB), se incuba sobre hielo y se distribuye en partes alícuotas de 200 \mul y se almacena, tras congelación instantánea en nitrógeno líquido a -80ºC.

Para la transformación se añaden a 200 \mul de las células competentes desde 5 hasta 15 \mul de la substancia de ligadura. Al cabo de 30 minutos de incubación sobre hielo se incuba la carga de la transformación durante 30 segundos a 42ºC en el termomezclador y se añaden 800 \mul de medio LB calentado a 37ºC. Las cargas se someten a trepidaciones durante hora en el incubador a 37ºC. Las células se centrifugan a continuación a 5.500 g (3 minutos), se recogen en medio LB de Tropeen a reciclo y se distribuyen en pocillos en placas de agar LB-Amp. Durante la noche se incubaron las plaquetas de agar a 37ºC en el armario de incubación.

5. Secuenciación del ADN

La secuenciación del ADN se llevó a cabo con empleo del dispositivo automático para la secuenciación de ADN de Applied Biosystems 373A y del estuche Dye Terminator Cycle Sequencing con AmpliTaq-ADN-polimerasa. La secuenciación se llevó a cabo según el método didesoxi de Sanger, sin embargo se emplean dNTPs con marcadores de fluorescencia en lugar de dNTPs, marcados de manera radioactiva, que se incorporan en los fragmentos de ADN sintetizados en el transcurso de la reacción de secuenciación.

Los productos de la reacción se precipitan a continuación con etanol enfriado a -20ºC, al 100 por ciento. Tras el secado del ADN y recogida en 4 \mul de una mezcla 5:1 constituida por formamida y por 25 mM de EDTA, pH 8,0, se llevó a cabo la desnaturalización de cada una de dichas cargas PCR a 95ºC durante 5 minutos y transferencia inmediata de las muestras sobre hielo.

Los fragmentos de ADN, marcados con colorantes de fluorescencia atraviesan un rayo láser durante la electrofóresis de gel. La luz fluorescente emitida perpendicularmente a este rayo es medida por fotodiodos situados por detrás del gel y se transforman en un diagrama de curvas por medio del programa de ordenador.

Carga para la secuenciación

8 \mul de Terminator Ready Reaction Mix; 3,2 pmol de cabador; 300-500 ng de matriz ADN;

H_{2}O hasta 20 \mul.

Programa PCR

10

\vskip1.000000\baselineskip

Composición del gel para la secuenciación

Urea 30 g (Roth); tampón Rotiphorese NF-10x-TBE 6 ml (Roth); solución de acrilamida/bis 40% (29:1) 9 ml (Roth); ddH_{2}O desmineralizada 23,5 ml.

La solución lista se filtra y se desgasifica. La polimerización se inicia mediante adición de 24 \mul de TEMED y 180 \mul de APS al 10% (m/v). Con relación a los detalles, a la evaluación de los datos de la secuencia y del marcaje con dNTP se hará referencia al manual del dispositivo automático para la secuenciación.

6. Mutación puntual F87A mediante el estuche OuikChange (Stratagene)

Para aumentar la sensibilidad del sistema de ensayo pNCA se reemplazó en la posición 87 el aminoácido constituido por la fenilalanina por una alanina. Para poder identificar más fácilmente los mutantes puntuales se introdujo un punto de corte adicional de restricción EaeI teniéndose en consideración la posición de la mutación, sin otras modificaciones de la secuencia de los aminoácidos.

En contra de lo que ocurre con el programa PCR normalizado, se llevó a cabo en este caso únicamente una desnaturalización del ADN durante cuatro minutos y la etapa de la reacción de secuenciación se recorrió únicamente 16 veces a una temperatura de anillado de 52,3ºC, y etapa de elongación durante 17 minutos. La tercera etapa del programa fue eliminada.

Carga para la PCR

1,2 \mul de dNTP-Mix (200 \muM), 5 \mul de tampón de Pfu-polimerasa (10x), 2,5 U de Pfu-polimerasa, 2,5 \mul de cabador F87A1 (5 nM), 2,5 \mul de cabador F87A2 (5 nM), 1 \mul de pT-USC1BM3 (procedente de minipreparación 1:20 diluida con agua desmineralizada), hasta 50 \mul de agua desmineralizada.

La temperatura de "anillación" de 52,3ºC mostró, tras la PCR anterior, sobre un gel de agarosa al uno por ciento, una banda nítida con el tamaño esperado de los fragmentos.

Tras separación del aceite mineral de la mezcla de la reacción se combinó la carga de la PCR con 1 \mul de DpnI (10 U/\mul) y la solución se mezcló cuidadosamente mediante recogida y expulsión por medio de una pipeta. Se llevó a cabo una centrifugación momentánea y se incubó a 37ºC durante una hora. Durante la digestión se descongelaron sobre hielo los ultracomponentes E. coli XL1-Blue y se distribuyeron en partes alícuotas en 50 \mul en tubos de Falcon de 15 ml. Tras adición de 1 \mul de \beta-mercaptoetanol, 4 \mul de la carga de la reacción PCR, digerida, e incubación durante 30 minutos sobre hielo, se llevó a cabo un choque térmico con una duración de 30 segundos a 42ºC y una refrigeración sobre hielo durante dos minutos. Se añadieron a la carga para la transformación 450 \mul de medio NZY calentado (temperatura del baño de aceite 42ºC) (12 g de NZamina, 5 g de extracto de levadura, 5 g de NaCl, pH 7,5). Al cabo de una hora de incubación a 37ºC y 220 revoluciones por minuto y centrifugación (5.500 g, 3 min) se volvió a suspender el pellet celular en el líquido residual y se raspó sobre placas de LB-Amp.

Ejemplo de referencia 4

Métodos preparativos 1. Digestión celular

Se descongelaron sobre hielo pellets celulares con una biomasa húmeda de hasta 15 g de E. coli DH5\alpha/pT-USC1BM-3 o DH5\alpha/pT-USC1BM-3F87A y se suspendieron en 25 ml de tampón de fosfato de potasio (50 mM, pH 7,5, 1 mM EDTA) o tampón de tris/HCl (50 mM, pH 7,5, 1 mM de EDTA). Mediante tratamiento por medio de ultrasonidos durante tres minutos (Branson Sonifier W250, (Dietzenbach, Alemania), aplicación de potencia 80 W, intervalo de trabajo 20%) se maceró la suspensión celular de E. coli enfriada sobre hielo. Como paso previo a la purificación de la proteína se centrifugó la suspensión celular durante 20 minutos a 32.500 g y se filtró a través de un filtro de 0,22 \mum Sterivex-GP (Millipore). La solución clara se denominará a continuación como extracto en bruto.

2. Purificación cromatográfica de la P450 BM-3 mediante intercambio de aniones

Para la purificación de la proteína se empleó un sistema ÄKTAexplorer (Amersham Pharmacia Biotech) con un ordenador personal basado en programa OS/2-UNICORN v2.1 y con un acumulador de fracciones Frac-900, que permite la medida simultánea de la elución total de la proteína a 280 nm y la elución de la P450 BM-3 a 417 nm.

Todas las purificaciones analíticas de la proteína P450 BM-3 por medio de cromatografía de intercambio de aniones se llevaron a cabo a 200 cm/h, a temperatura ambiente y con una carga de 6-10 mg de la P450 BM-3 por cada 100 ml de matriz. Todos los materiales cromatográficos se adquirieron en la firma TosoHaas (Stuttgart, Alemania).

a) Empaquetado y caracterización de las columnas cromatográficas

Para el revelado de un protocolo de purificación de la P450 BM-3 se emplearon columnas cromatográficas MPD-DEAE 650S (7,5 mm x 85 mm, diámetro de las partículas 35 \mum, Af = 1,1, 4100 TP/m) empaquetada por el fabricante y XK16/20 (16 mm x 100 mm, APB) empaquetada por nosotros, que contenían Toyopearl DEAE 650M (Af = 1,1, 1610 Tp/m), SuperQ 650M, (Af = 1,2, 1840 Tp/m) y QAE 550M (Af = 1,0, 1780 Tp/m) con un diámetro de las partículas de 65 \mum. Para la purificación preparativa por cromatografía se utilizó una columna de vidrio INDEX200 (APB) (20 cm x 19 cm, Af = 1,4, 3800 Tp/m), seis litros de Toyopearl DEAE 650M y una bomba con rueda dentada (ISMATEC, PB, USA). En contra de lo que ocurre en el caso de la purificación analítica por cromatografía de la P450 BM-3 se empleó como monitor el sistema ÄKTAexplorer por medio de un flujo subdividido en 1/20 y el tampón se preparó manualmente como paso previo a la purificación preparativa. El tampón estaba constituido por tris/HCl (0,1 M, pH 7,8) con 1 mM de EDTA así como 150 mM de NaCl para la primera etapa salina, por 250 mM de NaCl para la segunda etapa salina y por 1 M de NaCl para la tercera etapa salina.

b) Elección de las condiciones de pH, de elución y del tampón

Ensayos previos a base de las medidas de actividad sobre el consumo del NADPH proporcionaron un intervalo de pH adecuado comprendido entre 6,8 y 8,0 para la purificación de la P450 BM-3. Ensayos ulteriores relativos a la estabilidad al pH con el sistema de detección pNCA confirmaron este intervalo de pH.

La cromatografía con intercambio de aniones con gradientes lineales de NaCl mostraron que un tampón de tris/HCl (0,1 M, pH 7,8), con 1 mM de EDTA era claramente mas conveniente que un tampón de fosfato (0,1 M, pH 7,0 hasta pH 7,5) con 1 mM de EDTA, en relación a la capacidad enlazante y a la capacidad de disolución para la P450 BM-3. Por estos motivos se empleó el sistema tampón tris/HCl para todas las optimaciones adicionales de purificación.

3. Inmovilización del mutante P450 BM-3 F87A a) Experimentos previos para la elección de los materiales de soporte

Se ensayaron diversos métodos de adsorción y covalentes para la inmovilización de la P450 BM-3 F87A en experimentos previos. En todos los experimentos previos se emplearon 100 mg de material de soporte (excepción: EP-100, 50 mg) y 5 nmol de la P450 BM-3 F87A (procedente del extracto en bruto).

Para la elección de un material de soporte adecuado se añadieron, en el caso de los métodos por adsorción, 5 nmol de la P450 BM-3 F87A suspensión de material de soporte al tampón de K_{x}PO_{4}-(20 mM, pH 7,5, hasta 1.600 \mul) en un recipiente de reacción de Eppendorf de 2 ml. Los recipientes de la reacción se voltearon cabeza abajo y cabeza arriba, tras aplicación por medio de cinta adhesiva sobre el lado externo de un matraz redondo de 250 ml, durante una hora en el evaporador rotativo lentamente para la inmovilización de la proteína. Para la determinación de las capacidades de adsorción se centrifugaron los inmovilizados durante un minuto a 9.000 g y se tomaron 200 \mul del sobrenadante para la medida de la actividad.

b) Instrucciones optimadas destinadas a la inmovilización para DEAE 650M y Super Q650M

Pueden inmovilizarse hasta 81 nmol de un extracto en bruto de la P450 BM-3 F87A o de liofilizados por ml de material de adsorción sedimentado DEAE 650M en 5 ml de tampón tris/HCl (pH 7,5). En el caso del material de adsorción SuperQ 650M pueden inmovilizarse hasta 102 nmol de un extracto en bruto de la P450 BM-3 F87A. Para la inmovilización se recogió el liofilizado en 4 ml de dH_{2}O en un recipiente de reacción de Falcon de 15 ml y se combinaron con una concentración final de 0,1 mM de 12-pNCA. Tras cinco minutos de incubación a temperatura ambiente se añadió 1 ml de la matriz de adsorción, lavada dos veces con 5 ml de agua y centrifugada (9.000 g, 1 min), y se volteó, cabeza abajo y cabeza arriba, durante media hora de manera análoga a la de los recipientes de reacción de Eppendorf descritos en la sección precedente. Tras centrifugación y retirada del sobrenadante se combinó el inmovilizado en 5 ml de tampón tris/HCl (pH 7,5, 0,02 mM), se suspendió cuidadosamente de nuevo y nuevamente se centrifugó (9.000 g, 1 min). Este proceso de lavado se repitió dos veces. Tras adición de tampón tris/HCl (0,1 M, pH 7,5) hasta un volumen final de 2,0 ml al inmovilizado, éste se suspendió de nuevo y se distribuyó en partes alícuotas de 200 \mul en recipientes de reacción de Eppendorf de 1,5 ml, que contenían ya 495 \mul de este tampón. Tras adición de 5 \mul de 12-pNCA (15 mM) y al cabo de un tiempo de incubación de cinco minutos se inició la reacción en un aparato de Eppendorf sometido a trepidaciones (Ika-Vibrax, con accesorio de Janke y Kunkel VX2E) mediante adición de 100 \mul del NADPH (1 mM) y se detuvo tras diversos tiempos de reacción con 100 \mul de KOH 6 M. Tras centrifugación a 9.000 g (1 min) se recogió el sobrenadante y se determinó la absorción a 410 nm.

Para la inmovilización covalente de la P450 BM-3 F87A por medio de glutarodialdehído se maceró la P450 BM-3 F87A en un tampón de fosfato de potasio 20 mM (pH 7,5). Se trataron con vapor de glutarodialdehído 5 g de cristales de Trisopor aminomodificados (Schueller, diámetro 500-800 \mum) a temperatura ambiente entre tres y doces horas en un aparato cerrado. Los cristales aminomodificados con glutarodialdehído mostraron un color rojo violeta que se mantuvo a través de una frita incluso al cabo de dos lavados con 100 ml de solución de carbonato de potasio (50 mM, pH 7,8). Se combinaron desde 50 hasta 150 mg de estos cristales rojo violetas con 0,5 hasta 0,8 nmol de la P450 BM-3 F87A y se sometieron a trepidaciones hasta la decoloración de la solución en recipientes de reacción de Eppendorf de 2 ml en el molino de bolas de Retsch, a bajo nivel y a 6ºC, durante una hora.

4. Reactor enzima-membrana

Para ensayar el concepto de reactor enzima-membrana se inmovilizaron 25 nmol de la P450 BM-3 F87A sobre 4 ml de SuperQ 650M y se añadieron, en el recipiente para la reacción, a 200 ml del tampón tris/HCl (pH 7,8). Tras adición de 1,2 \mumol de 12-pNCA a una velocidad de alimentación de 40 ml/min se removió la solución durante 20 minutos sin contrapresión sobre el módulo de filtración. La reacción se inició a una contrapresión de 2 psi, mediante adición de 2 ml de solución acuosa del NADPH (1 mM) y el desarrollo de la reacción se siguió mediante la determinación de las longitudes de onda a 410 nm. Durante el desarrollo de la reacción se añadió solución del NADPH en alícuotas de 1 ml hasta la conversión completa del 12-pNCA.

Ejemplo de referencia 5

Síntesis química

Todos los espectros ^{1}H-RMN se tomaron con un aparato de 500 MHz-RMN, todo los ^{13}C-RMN se tomaron con un aparato 125 MHz-RMN y con CDCl_{3} como disolvente.

1. Obtención de los ácidos \omega-fenoxicarboxílicos (PCA)

El esquema de reacción A muestra la síntesis directa de los PCA a partir de los ácidos \omega-bromo-carboxílicos.

Esquema de reacción A

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Cargas

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Rutina general para la reacción

Se añade fenol e hidróxido de potasio a los ácidos bromograsos, disueltos en DMF. La solución se calentó, bajo reflujo, durante 6 a 7 horas hasta 160ºC y la reacción se siguió por medio de cromatografía en capa delgada (DC, eluyente éter e petróleo:dietiléter 1:1). Tras eliminación del disolvente se disolvió el precipitado pardo en un sistema bifásico de agua-dietiléter (1:1) y se ajustó un valor del pH de 2 con ácido clorhídrico diluido. Tras extracción de la fase acuosa con dietiléter se liberaron del disolvente las fracciones reunidas de dietiléter en el evaporador rotativo, se recogieron en éter de petróleo:acetato de etilo 1:1 y se purificaron por medio de una columna de cromatografía de gel de sílice DC60 (Merck) y con la misma mezcla eluyente.

Caracterización

Ácido \omega-fenoxidodecanoico (12-PCA): rendimiento: 76%; pf: = 98-99ºC calculado: C 73,93% H 9,65% O 16,41%, encontrado: C 73,92% H 9,67%

^{1}H-RMN: \delta: = 7,26-7,29 (m, 2H, fenil-), 6,88-6,94 (m, 3H, fenil), 3,94 (t, 2H, fenil-O-CH_{2}-, J = 6,5 Hz), 2,35 (t, 2H, -CH_{2}-COO, J = 7,5 Hz), 1,74-1,80 (m, 2H, -O-CH_{2}-CH_{2}-), 1,59-1,66 (m, 2H, -CH_{2}-CH_{2}-COO), 1,42-1,48 (m, 2H, -O-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-), 1,29-1,35 (m, 12 H, -O-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-(CH_{2})_{6}-CH_{2}-).

^{13}C-RMN: \delta: = 180,4 (-COO), 159,3 (C 1'), 129,8 (C 3'), 120,8 (C 4'), 114,7 (C2') 68,3 (-O-CH_{2}), 34,5 (-CH_{2}-COO-), 29,9, 29,8, 29,7, 29,7, 29,5, 29,4, 29,1, 26,5, 25,1 (C-3-C-11).

Ácido \omega-fenoxiundecanoico (11-PCA): rendimiento: 78%; pf: = 95ºC calculado: C 73,35% H 9,41% O 17,24%, encontrado: C 73,32% H 9,44%

^{1}H-RMN: \delta: = 7,18-7,21 (m, 2H, fenil-), 6,81-6,86 (m, 3H, fenil), 3,87 (t, 2H, fenil-O-CH_{2}-, J = 6,5 Hz), 2,27 (t, 2H, -CH_{2}-COO, J = 7,5 Hz), 1,67-1,73 (m, 2H, -O-CH_{2}-CH_{2}-), 1,53-1,57 (m, 2H, -CH_{2}-CH_{2}-COO), 1,35-1,39 (m, 2H, -O-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-), 1,18-1,30 (m, 10H, -O-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-(CH_{2})_{5}-CH_{2}-).

^{13}C-RMN: \delta: = 180,5 (-COO), 159,5 (C 1'), 129,8 (C 3'), 120,7 (C 4'), 114,7 (C 2'), 68,2 (-O-CH_{2}-), 34,5 (-CH_{2}-COO-), 29,9, 29,7, 29,7, 29,7, 29,6, 29,4, 26,4, 25,0 (C-3-C-10).

2. Obtención de los ácidos p-nitrofenoxicarboxílicos (pNCA)

En contra de lo que ocurre en el caso de la síntesis de los PCA no fue posible una síntesis correspondiente de los compuestos pNCA. La síntesis de los pNCA se consiguió solo una vez que habían sido esterificados los ácidos \omega-bromocarboxílicos y se elaboraron en forma anhidra.

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Rutina general para la síntesis

A partir de los ácidos \omega-bromocarboxílicos se esterificaron el \omega-bromocarboxilato de metilo y el \omega-bromo-carboxilato de etilo en hexano de acuerdo con un método normalizado (Becker et al. 1993) con solución anhidra de metanol o de etanol, que contenía 1 M de HCl. El desarrollo de la reacción se siguió mediante DC (eluyente hexano:dietiléter:ácido acético 70:30:1). La fase acuosa se extrae dos veces con dietiléter, se lava dos veces con solución saturada de bicarbonato de sodio y una vez con agua desmineralizada, se seca durante la noche con sulfato de sodio anhidro, se filtra y se purifica mediante cromatografía, empleándose como eluyente éter de petróleo:dietiléter en la proporción de 70:30. Una vez que se había evaporado el disolvente en el evaporador rotativo, se conectó el éster durante una hora a alto vacío. Para la obtención de los ésteres de los pNCA, se añadió a 17 mmol del éster del ácido \omega-bromo-carboxílico, que estaban disueltas en 100 ml de DMSO, un ligero exceso de 18,5 nmol de p-nitrofenol. La solución se calentó bajo reflujo durante dos a tres horas a 120ºC. Tras refrigeración de la solución ligeramente pardusca hasta la temperatura ambiente se añadió, gota a gota, agua desmineralizada para precipitar los ésteres de los pNCA. El precipitado se filtró, se lavó con 1,5 litros de agua helada para la eliminación del p-nitrofenol en exceso y se recristalizó en DMSO para dar un polvo blanco. Para la hidrólisis del éster de los pNCA se añadió una mezcla de lipasas constituida por 100 mg de Pseudomonas cepacia (PCL) y 100 mg de Candida antarctica lipasa B de Amano (Nagoya, Japón), a una mezcla de 100 ml de acetona/agua (pH 7,5, 0,2 M de fosfato de potasio, hasta un 50% de acetona). Tras adición de los ésteres de los pNCA (5 mmoles) se agitó la suspensión a temperatura ambiente hasta 16 horas. Para la eliminación del inmovilizado de la lipasa se filtró la suspensión clara y se cristalizaron los pNCA mediante evaporación de acetona. Los compuestos constituidos por los pNCA se lavaron con agua fría, se recristalizaron en DMSO y se purificaron mediante cromatografía a través de gel de sílice (Merck, Darmstadt) (éter de petróleo:acetato de etilo 1:1 hasta 1:3).

Caracterización de los pNCA

Los rendimientos indicados de los pNCA se refieren siempre a los ésteres correspondientes de los pNCA como eductos, y los rendimientos para los ésteres de los pNCA se refieren siempre a los correspondientes ácidos \omega-bromocarboxílicos.

Ácido p-nitrofenoxihexanoico (6-pNCA): rendimiento: 81%; pf: = 94ºC

^{1}H-RMN: \delta: = 8,18 (d, 2H, NO_{2}-fenil-, J = 9,3Hz), 6,94 (d, 2H, fenil-O-, J = 9,3 Hz), 4,06 (t, 2H, fenil-O-CH_{2}-, J = 6,3 Hz), 2,42 (t, 2H, -CH_{2}-COO, J = 7,1 Hz), 1,80-1,92 (m, 2H, -O-CH_{2}-CH_{2}-), 1,68-1,77 (m, 2H, -CH_{2}-CH_{2}-COO), 1,49-1,61 (m, 2H, -O-CH_{2}-CH_{2}-).

^{13}C-RMN: \delta: = 180,0 (-COOH), 164,1 (C-4'), 141,4 (C-1'), 125,9 (C-2'), 114,4 (C-3'), 68,5 (-O-CH_{2}-), 33,9 (-CH_{2}-COOH), 28,6, 25,5, 24,3 (C-3, C-5, C-4).

p-Nitrofenoxihexanoato de etilo (6-pNCAEt): rendimiento: 81%

^{1}H-RMN: \delta: = 8,09 (d, 2H, NO_{2}-fenil-, J = 9,3Hz), 6,85 (d, 2H, fenil-O-, J = 9,3 Hz), 4,05 (q, 2H, -COO-CH_{2}-), 3,97 (t, 2H, fenil-O-CH_{2}-, J = 6,4 Hz), 2,26 (t, 2H, -CH_{2}-COO, J = 7,3 Hz), 1,69-1,82 (m, 2H, -O-CH_{2}-CH_{2}-), 1,57-1,67 (m, 2H,-CH_{2}-CH_{2}-COO), 1,40-1,50 (m, 2H, -O-CH_{2}-CH_{2}-), 1,17 (t, 3H, -COOCH_{2}-CH_{3}).

^{13}C-RMN: \delta: = 173,7 (-COO), 164,3 (C 4'), 141,5 (C 1'), 126,0 (C 2'), 114,6 (C 3'), 68,7 (-O-CH_{2}-), 60,4 (-COO-CH_{2}-), 34,3 (-CH_{2}-COO-), 28,8, 25,7, 24,8 (C-3, C-5, C-4), 14,4 (-O-CH_{2}-CH_{3}).

Ácido p-nitrofenoxioctanoico (8-pNCA): rendimiento: 92%; pf: = 98ºC

^{1}H-RMN: \delta: = 8,11 (d, 2H, NO_{2}-fenil-, J = 9,2 Hz), 6,86 (d, 2H, fenil-O-, J = 9,3 Hz), 3,97 (t, 2H, fenil-O-CH_{2}-, J = 6,4 Hz), 2,29 (t, 2H, -CH_{2}-COO, J = 7,4 Hz), 1,69-1,80 (m, 2H, -O-CH_{2}-CH_{2}), 1,56-1,61 (m, 2H, -CH_{2}-CH_{2}-COO), 1,32-1,43 (m, 6H, -O-CH_{2}-CH_{2}-(CH_{2})_{3}-CH_{2}-).

^{13}C-RMN: \delta: = 180,2 (-COOH), 164,3 (C 4'), 141,4 (C 1'), 125,9 (C 2'), 114,4 (C 3'), 68,8 (-O-CH_{2}-), 34,0 (-CH_{2}-COOH), 28,9, 28,9, 28,9, 25,8, 24,6 (C-3-C-7).

p-Nitrofenoxioctanoato de metilo (8-pNCAMe): rendimiento: 79%

^{1}H-RMN: \delta: = 8,10 (d, 2H, NO_{2}-fenil-, J = 9,2Hz), 6,86 (d, 2H, fenil-O-, J = 9,3 Hz), 3,97 (t, 2H, fenil-O-CH_{2}-, J = 6,5 Hz), 3,59 (s, 3H, -COOCH_{3}), 2,24 (t, 2H, -CH_{2}-COO, J = 7,4 Hz), 1,69-1,77(m, 2H, -O-CH_{2}-CH_{2}-), 1,51-1,59 (m, 2H, -CH_{2}-CH_{2}-COO), 1,27-1,43 (m, 6H, -O-(CH_{2})_{2}-(CH_{2})_{3}-).

^{13}C-RMN: \delta: = 174,2 (-COO), 164,3 (C 4'), 141,4 (C 1'), 125,9 (C 2'), 114,4 (C 3'), 68,8 (-O-CH_{2}-), 51,5 (-COO-CH_{3}), 34,0 (-CH_{2}-COO-), 29,0, 28,9, 28,9, 25,8, 24,9 (C-3-C-7).

Ácido p-nitrofenoxidecanoico (10-pNCA): rendimiento: 84%; pf: = 101ºC

^{1}H-RMN: \delta: = 8,18 (d, 2H, NO_{2}-fenil-, J = 9,2 Hz), 6,93 (d, 2H, fenil-O-, J = 9,3 Hz), 4,03 (t, 2H, fenil-O-CH_{2}-, J = 6,5 Hz), 2,35 (t, 2H, -CH_{2}-COO, J = 7,4 Hz), 1,75-1,86 (m, 2H, -O-CH_{2}-CH_{2}-), 1,60-1,63 (m, 2H, -CH_{2}-CH_{2}-COO), 1,32-1,45 (m, 10H, -O-CH_{2}-CH_{2}-(CH_{2})_{5}-CH_{2}-).

^{13}C-RMN: \delta: = 180,4 (-COO), 164,4 (C 4'), 141,5 (C 1'), 126,1 (C 2'), 114,6 (C 3'), 69,1 (-O-CH_{2}-), 34,2 (-CH_{2}-COOH), 29,9, 29,4, 29,4, 29,3, 29,2, 26,3, 26,1, 24,8 (C-3-C-9).

p-Nitrofenoxidecanoato de metilo (10-pNCAMe): rendimiento: 73%

^{1}H-RMN: \delta: = 8,11 (d, 2H, NO_{2}-fenil-, J = 9,2 Hz), 6,86 (d, 2H, fenil-O-, J = 9,3 Hz), 3,97 (t, 2H, fenil-O-CH_{2}-, J = 6,5 Hz), 3,59 (s, 3H, -COOCH_{3}), 2,23 (t, 2H, -CH_{2}-COO, J = 7,5 Hz), 1,68-1,77 (m, 2H, -O-CH_{2}-CH_{2}-), 1,52-1,57 (m, 2H, -CH_{2}-CH_{2}-COO), 1,22-1,45 (m, 10H, -O-CH_{2}-CH_{2}-(CH_{2})_{5}-CH_{2}-).

^{13}C-RMN: \delta: = 174,2 (-COO), 164,2 (C 4'), 141,2 (C 1'), 125,8 (C 2'), 114,3 (C 3'), 68,8 (-O-CH_{2}-), 51,3
(-COOCH_{3}), 34,3 (-CH_{2}-COO-), 29,2, 29,1, 29,1, 29,0, 28,9, 25,8, 24,8 (C-3-C-9).

Ácido p-nitrofenoxiundecanoico (11-pNCA): rendimiento: 89%; pf: = 102ºC

^{1}H-RMN: \delta: = 8,19 (d, 2H, NO_{2}-fenil-, J = 9,2 Hz), 6,94 (d, 2H, fenil-O-, J = 9,1 Hz), 4,05 (t, 2H, fenil-O-CH_{2}-, J = 6,5 Hz), 2,35 (t, 2H, -CH_{2}-COO, J = 7,6 Hz), 1,79-1,84 (m, 2H, -O-CH_{2}-CH_{2}-), 1,61-1,66 (m, 2H, -CH_{2}-CH_{2}-COO), 1,43-1,49 (m, 2H, -O-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-), 1,32-1,45 (m, 10H, -O-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-(CH_{2})_{5}-CH_{2}-).

^{13}C-RMN: \delta: = 180,12 (-COO), 164,3 (C 4'), 141,3 (C 1'), 125,9 (C 2'), 114,4 (C 3'), 68,9 (-O-CH_{2}-), 34,0 (-CH_{2}-COO-), 29,4, 29,3, 29,3, 29,2, 29,0, 29,0, 25,9, 24,6 (C-3-C-10).

p-Nitrofenoxiundecanoato de metilo (11-pNCAMe): rendimiento: 80%

^{1}H-RMN: \delta: = 8,18 (d, 2H, NO_{2}-fenil-, J = 9,3 Hz), 6,93 (d, 2H, fenil-O-, J = 9,2 Hz), 4,03 (t, 2H, fenil-O-CH_{2}-, J = 6,5 Hz), 3,66 (s, 3H, -COOCH_{3}), 2,29 (t, 2H, -CH_{2}-COO, J = 7,5 Hz), 1,75-1,86 (m, 2H, -O-CH_{2}-CH_{2}-), 1,58-1,64 (m, 2H, -CH_{2}-CH_{2}-COO), 1,29-1,45 (m, 12H, -O-CH_{2}-CH_{2}-(CH_{2})_{6}-CH_{2}-).

^{13}C-RMN: \delta: = 174,5 (-COO), 164,4 (C 4'), 141,5 (C 1'), 126,1 (C 2'), 114,6 (C 3'), 69,0 (-O-CH_{2}-), 51,6
(-COOCH_{3}), 34,2 (-CH_{2}-COO-), 29,6, 29,5, 29,4, 29,4, 29,3, 29,1, 26,1, 25,1 (C-3-C-10).

Ácido p-nitrofenoxidodecanoico (12-pNCA): rendimiento: 89%; pf: = 106ºC

calculado: C 64,07% H 8,07% N 4,06%, O 23,71%, encontrado: C 63,99% H 8,18% N 4,15%

^{1}H-RMN: \delta: = 8,19 (d, 2H, NO_{2}-fenil-, J = 9,3 Hz), 6,94 (d, 2H, fenil-O-, J = 9,4 Hz), 4,04 (t, 2H, fenil-O-CH_{2}-, J = 6,6 Hz), 2,35 (t, 2H, -CH_{2}-COO, J = 7,5 Hz), 1,79-1,84 (m, 2H, -O-CH_{2}-CH_{2}-), 1,60-1,66 (m, 2H, -CH_{2}-CH_{2}-COO), 1,43-1,49 (m, 2H, -O-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-), 1,29-1,35 (m, 12H, -O-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-(CH_{2})_{6}-CH_{2}-).

^{13}C-RMN: \delta: = 180,4 (-COO), 164,3 (C 4'), 141,3 (C 1'), 125,9 (C 2'), 114,4 (C 3'), 68,9 (-O-CH_{2}-), 34,1 (-CH_{2}-COO-), 29,5, 29,4, 29,3, 29,2, 29,2, 29,0, 29,0, 25,9, 24,7 (C-3-C-11).

p-Nitrofenoxidodecanoato de etilo (12-pNCAEt): rendimiento: 73%

^{1}H-RMN: \delta: = 8,18 (d, 2H, NO_{2}-fenil-, J = 9,2 Hz), 6,94 (d, 2H, fenil-O-, J = 9,3 Hz), 4,12 (q, 2H, -COO-CH_{2}-, J = 7,1 Hz) 4,05 (t, 2H, fenil-O-CH_{2}-, J = 6,5 Hz), 2,29 (t, 2H, -CH_{2}-COO, J = 7,5 Hz), 1,70-1,87 (m, 2H, -O-CH_{2}-CH_{2}-), 1,59-1,69 (m, 2H, -CH_{2}-CH_{2}-COO), 1,32-1,45 (m, 14H, -O-CH_{2}-CH_{2}-(CH_{2})_{7}-CH_{2}-), 1,26 (t, 3H, -COOCH_{2}-CH_{3}, J = 7,2 Hz).

^{13}C-RMN: \delta: = 174,8 (-COO), 164,4 (C 4'), 141,5 (C 1'), 126,1 (C 2'), 114,6 (C 3'), 69,0 (-O-CH_{2}-), 60,5 (-COO-CH_{2}-), 34,2 (-CH_{2}-COO-), 29,6, 29,5, 29,4, 29,4, 29,3, 29,2, 29,1, 26,1, 25,1 (C-3-C-11), 14,4 (-COO-CH_{2}-CH_{3}).

Ácido p-nitrofenoxipentadecanoico (15-pNCA): rendimiento: 87%; pf: = 115ºC

^{1}H-RMN: \delta: = 8,19 (d, 2H, NO_{2}-fenil-, J = 9,2 Hz), 6,94 (d, 2H, fenil-O-, J = 9,3 Hz), 4,05 (t, 2H, fenil-O-CH_{2}-, J = 6,5 Hz), 2,35 (t, 2H, -CH_{2}-COO, J = 7,5 Hz), 1,79-1,85 (m, 2H, -O-CH_{2}-CH_{2}-), 1,59-1,66 (m, 2H, -CH_{2}-CH_{2}-COO), 1,43-1,49 (m, 2H, -O-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-), 1,26-1,35 (m, 18H, -O-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-(CH_{2})_{9}-CH_{2}-).

^{13}C-RMN: \delta: = 180,0 (-COO), 164,3 (C.4'), 141,3 (C 1'), 126,0 (C 2'), 114,4 (C 3'), 68,9 (-O-CH_{2}-), 34,0 (-CH_{2}-COO-), 29,6, 29,6, 29,5, 29,4, 29,4, 29,3, 29,3, 29,2, 29,1, 29,0, 25,9, 24,7 (C-3-C-14).

p-Nitrofenoxipentadecanoato de metilo (15-pNCAMe): rendimiento: 75%

^{1}H-RMN: \delta: = 8,19 (d, 2H, NO_{2}-fenil-, J = 9,2 Hz), 6,94 (d, 2H, fenil-O-, J = 9,3 Hz), 4,05 (t, 2H, fenil-O-CH_{2}-, J = 6,5 Hz), 3,66 (s, 3H, -COOCH_{3}), 2,26 (t, 2H, -CH_{2}-COO, J = 7,5 Hz), 1,79-1,85 (m, 2H, -O-CH_{2}-CH_{2}-), 1,59-1,66 (m, 2H, -CH_{2}-CH_{2}-COO), 1,43-1,49 (m, 2H, -O-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-), 1,26-1,35 (m, 18H, -O-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-(CH_{2})_{9}
-CH_{2}-).

^{13}C-RMN: \delta: = 174,6 (-COO), 164,3 (C 4'), 141,3 (C 1'), 126,0 (C 2'), 114,4 (C 3'), 68,9 (-O-CH_{2}-), 51,7
(-COOCH_{3}), 34,0 (-CH_{2}-COO-), 29,7, 29,6, 29,5, 29,5, 29,4, 29,3, 29,3, 29,2, 29,1, 29,1, 26,1, 25,0 (C-3-C-14).

3. Obtención de los ácidos resorufinilcarboxílicos (RCA) a) Obtención del \omega-resorufinildodecanoato de metilo y del \omega-resorufinilundecanoato de metilo

Para la síntesis de los RCA se esterificaron los ácidos \omega-bromocarboxílicos, de acuerdo con el procedimiento seguido en el caso de los compuestos constituidos por los pNCA, se hicieron reaccionar con la sal constituida por el resorufinato de sodio en DMF y se hidrolizaron por medio de una mezcla de PCL/CAL-B-lipasas.

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Carga para el \omega-resorufinil-laurato de metilo

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Carga para el \omega-resorufinilundecanoato de metilo

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Realización

Para la disolución del éster de los ácidos bromograsos en DMF se añade la resorufina, que no se disuelve por completo. La suspensión de color violeta obscuro se calienta bajo reflujo durante cuatro horas y la reacción se sigue mediante DC (eluyente éter de petróleo:dietiléter 1:1). Tras la eliminación del disolvente se disuelve el precipitado pardo en éter de petróleo:acetato de etilo 1:1 durante media hora y se purifica mediante una columna para cromatografía con gel de sílice DC60 (Merck) con la misma mezcla eluyente. La columna no debe ser elegida con un tamaño demasiado grande puesto que el compuesto se descompone en pequeña medida sobre la columna.

\omega-Resorufinil-laurato de metilo: rendimiento: 17%

^{1}H-RMN: \delta: = 7,62 (d, 1H, -H-9', J = 8,89 Hz), 7,35 (d, 1H, -H-1', J = 9,79 Hz), 6,85 (dd, 1H, -H-8', J_{8'}, _{9'} = 8,87 Hz, J_{8',6'} = 2,41 Hz), 6,76 (dd, 1H, -H-2', J_{2', 1'} = 9,74 Hz, J_{2',4'} = 1,74 Hz), 6,73 (d, 1H, -H-6', J = 2,40 Hz), 6,25 (d, 1H, -H-4', J = 1,74 Hz), 3,98 (t, 2H, fenil-O-CH_{2}-, J = 6,50 Hz), 3,59 (s, 3H, -COO-CH_{3}), 2,23 (t, 2H, -CH_{2}-COO, J = 7,50 Hz), 1,73-1,79 (m, 2H, -O-CH_{2}-CH_{2}-), 1,53-1,56 (m, 2H, -CH_{2}-CH_{2}-COO), 1,37-1,41 (m, 2H, -O-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-), 1,22-1,29 (m, 12H, -O-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-(CH_{2})_{6}-CH_{2}-).

^{13}C-RMN: \delta: = 186,7 (-C 3'), 174,7 (-COO), 163,7, 150,3 146,1, 145,7 (C 4a', C-5a', C-9a', C-10a'), 135,1, 134,5, 131,9, 128,7, 114,5, 107,1, 100,8 (C 2', C 4', C 1', C 9', C 6', C 8', C 9'), 69,5 (-O-CH_{2}-), 51,9 (-COO-CH_{3}), 34,5 (-CH_{2}-COO-), 30,1, 29,8, 29,7, 29,7, 29,6, 29,5, 29,3, 26,3, 25,3 (C-3-C-11).

\omega-Resorufinilundecanoato de metilo: rendimiento: 15%;

^{1}H-RMN: \delta: = 7,62 (d, 1H, -H-9', J = 8,91 Hz), 7,35 (d, 1H, -H-1', J = 9,70 Hz), 6,86 (dd, 1H, -H-8', J_{8'}, _{9'} = 8,90 Hz, J_{8',6'} = 2,53 Hz), 6,76 (dd, 1H, -H-2', J_{2'}, _{1'} = 9,72 Hz, J_{2'},_{4'} = 1,95 Hz), 6,73 (d, 1H, -H-6', J = 2,54 Hz), 6,25 (d, 1H, -H-4', J = 1,94 Hz), 3,98 (t, 2H, fenil-O-CH_{2}-, J = 6,49 Hz), 3,60 (s, 3H, -COO-CH_{3}), 2,23 (t, 2H, -CH_{2}-COO, J = 7,50 Hz), 1,74-1,79 (m, 2H, -O-CH_{2}-CH_{2}-), 1,54-1,57 (m, 2H, -CH_{2}-CH_{2}-COO), 1,35-1,42 (m, 2H, -O-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-), 1,18-1,29 (m, 10H, -O-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-(CH_{2})_{5}-CH_{2}-).

^{13}C-RMN: \delta: = 186,7 (-C 3'), 174,7 (-COO), 163,7, 150,3 146,1, 145,7 (C 4a', C-5a', C-9a', C-10a'), 135,0, 135,0, 132,0, 128,6, 114,5, 107,0, 100,8 (C 2', C 4', C 1', C 9', C 6', C 8', C 9'), 69,5 (-O-CH_{2}-), 51,8 (-COO-CH_{3}), 34,5 (-CH_{2}-COO-), 29,9, 29,8, 29,7, 29,6, 29,5, 29,3, 26,3, 25,3 (C-3-C-10).

b) Obtención de los ácidos \omega-resorufinildodecanoico y \omega-resorufinilundecanoico

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Ensayos

La hidrólisis química mediante NaOH condujo a la disociación del éster, sin embargo el producto amarillo anaranjado, deseado, pudo aislarse únicamente con un rendimiento del 10%; esto se debe a que el aromato de resorufinilo se descompone con pérdida de color en soluciones fuertemente alcalinas (pH > 12). Sobre las plaquetas de DC podían reconocerse cinco productos. El éster de los ácidos resorufinilgrasos mostró en medio alcalino una coloración verdosa. La disociación mediante lipasas transcurrió con un éxito sensiblemente mayor tras la optimación y la elaboración. Para la elección de una lipasa adecuada se ensayaron las lipasas siguientes en el termomezclador a 40ºC durante la noche en un tampón de fosfato de sodio 0,1 M, pH 7,5 con 10% de acetona como solubilizante: Candida antarctica Lipasa A y B, Aspergillus niger lipasa y Pseudomonas cepacia Lipasa (PCL).

La Candida antarctica Lipasa B y la PCL disociaron el éster de los ácidos resorufinilcarboxílicos, empleándose finalmente la lipasa PCL para la disociación preparativa de los ésteres.

Carga para el ácido \omega-resorufinildodecanoico

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Carga para el ácido \omega-resorufinilundecanoico

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Realización

Se disolvieron los ésteres en acetona en un matraz redondo de 50 ml, tras adición de 9 ml de tampón de fosfato de sodio, pH 7,3, se añade una punta de espátula de PCL y se incuba a 40ºC durante la noche. El desarrollo de la reacción se sigue por medio de DC (eluyente éter de petróleo:dietiléter 1:1). Tras varias extracciones cuidadosas por medio de cloroformo se lava la fase de cloroformo dos veces con agua desmineralizada, se seca durante cuatro horas sobre sulfato de sodio, se filtra y se concentra por evaporación en el evaporador rotativo.

Ácido \omega-resorufinil-láurico: rendimiento: 73%

^{1}H-RMN: \delta: = 7,62 (d, 1H, -H-9', J = 8,9 Hz), 7,35 (d, 1H, -H-1', J = 9,8 Hz), 6,85 (dd, 1H, -H-8', J_{8'}, _{9'} = 8,87 Hz, J_{8'}, _{6'} = 2,4 Hz), 6,76 (dd, 1H, -H-2', J_{2'}, _{1'} = 9,7 Hz, J_{2'}, _{4'} = 1,7 Hz), 6,73 (d, 1H, -H-6', J = 2,4 Hz), 6,25 (d, 1H, -H-4', J = 1,7 Hz), 3,98 (t, 2H, fenil-O-CH_{2}-, J = 6,5 Hz), 2,34 (t, 2H, -CH_{2}-COO, J = 7,5 Hz), 1,73-1,79 (m, 2H, -O-CH_{2}-CH_{2}-), 1,55-1,59 (m, 2H, -CH_{2}-CH_{2}-COO), 1,37-1,41 (m, 2H, -O-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-), 1,22-1,29 (m, 12H, -O-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-(CH_{2})_{6}-CH_{2}-).

^{13}C-RMN: \delta: = 186,6 (-C 3'), 180,4 (-COO), 163,7, 150,3 146,1, 145, 7 (C 4a', C-5a', C-9a', C-10a'), 135,1, 134,5, 131,9, 128,7, 114,5, 107,1, 100,8 (C 2', C 4', C 1', C 9', C 6', C 8', C 9'), 69,5 (-O-CH_{2}-), 34,2 (-CH_{2}-COO-), 30,1, 29,8, 29,7, 29,7, 29,6, 29,5, 29,3, 26,3, 25,3 (C-3-C-11).

Ácido \omega-resorufinilundecanoico: rendimiento: 78%

^{1}H-RMN: \delta: = 7,63 (d, 1H, -H-9', J = 8,9 Hz), 7,35 (d, 1H, -H-1', J = 9,7 Hz), 6,85 (dd, 1H, -H-8', J_{8'}, _{9'} = 8,9 Hz, J_{8',6'} = 2,53 Hz), 6,76 (dd, 1H, -H-2', J_{2', 1'} = 9,7 Hz, J_{2',4'} = 1,9 Hz), 6,73 (d, 1H, -H-6', J = 2,5 Hz), 6,25 (d, 1H, -H-4', J = 1,9 Hz), 3,98 (t, 2H, fenil-O-CH_{2}-, J = 6,5 Hz), 2,35 (t, 2H, -CH_{2}-COO, J = 7,5 Hz), 1,74-1,79 (m, 2H, -O-CH_{2}-CH_{2}-), 1,54-1,59 (m, 2H, -CH_{2}-CH_{2}-COO), 1,35-1,42 (m, 2H, -O-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-), 1,18-1,29 (m, 10H, -O-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-(CH_{2})_{5}-CH_{2}-).

^{13}C-RMN: \delta: = 186,7 (-C 3'), 180,7 (-COO), 163,7, 150,3 146,1, 145,7 (C 4a', C-5a', C-9a', C-10a'), 135,0, 135,0, 132,0, 128,6, 114,5, 107,0, 100,8 (C 2', C 4', C 1', C 9', C 6', C 8', C 9'), 69,5 (-O-CH_{2}-), 34,1 (-CH_{2}-COO-), 29,9, 29,8, 29,7, 29,6, 29,5, 29,3, 26,3, 25,3 (C-3-C-10).

c) Ensayo de actividad de la P450 BM-3 con el ácido \omega-resorufinil-láurico y con el ácido \omega-resorufinilundecanoico

Se disolvió una punta de espátula de 11-RCA o de 12-RCA en 0,5 ml de acetona, de etanol, de THF, de dioxano y 5,5 ml de tampón de fosfato de potasio (pH 7,5, 0,1 M). Se añadieron 5 ml de tampón de fosfato de potasio (pH 7,5, 0,1 M) a los disolventes orgánicos que actuaron como solubilizantes. Tras adición de 5 nmol de P450 se incubó durante 10 minutos a temperatura ambiente y se redujo la P450 BM-3 mediante adición de 200 \mul del NADPH (50 \muM). Al cabo de una hora se transfirieron 200 \mul de la correspondiente carga de la reacción hasta una placa de microvaloración. En la segunda serie se han pipetado, adicionalmente, muestras en blanco correspondientes, sin adición del NADPH.

Ejemplo de referencia 6

Métodos analíticos 1. Separación de las proteínas en la electrofóresis de gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE)

Las proteínas pueden separarse según su tamaño mediante la SDS-PAGE. Las muestras de proteínas purificadas se mezclaron, como paso previo a la electrofóresis de gel, en la proporción de 1:1 con SDS-tampón de la muestra (tris/HCl 500 mM, pH 6,8, glicerina 10% (v/v), SDS 20% (p/v), mercaptoetanol 2% (p/v), azul de bromofenilo 0,05%) y se calentaron durante 5 minutos hasta 95ºC para la desnaturalización de las proteínas. Para el análisis de la expresión de las proteínas en células de E. coli se tomó por medio de una pipeta, al cabo de una fase de incubación durante cinco horas OD_{578} = 1,5-2,0) 1 ml del cultivo y se centrifugó a 12.000 g. El pellet celular se sometió a digestión con 100 \mul del tampón de la muestra y se centrifugó durante 1 minuto a 12.000 g. Tras refrigeración de las muestras de proteína sobre hielo, se llevó a cabo la separación de las proteínas en el tampón de electrofóresis (9,0 g de Tris, 43,2 g de glicerina, 3,0 g de SDS, ddH_{2}O hasta 600 ml) con 25 mA por gel.

Como patrones de las proteínas sirvieron un marcador de bajo peso molecular (fosforilasa B 97,4 kDa, BSA 66,3 kDa, ovalbumina 45,0 kDa, carboanhidrasa 31,0 kDa, inhibidor de tripsinina 21,5 kDa, lisozima 14,4 kDa) y un estuche de elevado peso molecular (miosina 200 kDa, \beta-galactosidasa 116,25 kDa, fosforilasa B 97,4 kDa, BSA 66,3 kDa, ovalbumina 45 kDa) de la firma Bio-Rad (Richmond, USA).

Para la separación de las proteínas se empleó un gel separador al 7,5 por ciento (2,5 ml de tris/HCl (1,5 M, pH 8,8), 100 \mul de SDS (10% m/v), 2,5 ml de acrilamida: N,N'-metilenbisacrilamida 30:1 (Roth), 50 \mul de APS, 5 \mul de TEMED) y gel recolector al 4 por ciento (1 ml de tampón recolector (12,11 g de Tris, 0,8 g de SDS, hasta 200 ml de H_{2}O, pH 6,8 ajustado con HCl), 0,52 \mul de acrilamida: N,N'-metilen-bisacrilamida 30:1 (Roth), 40 \mul de APS 10% (p/v), 4 \mul de TEMED). Después de la electrofóresis se colorearon de azul las proteínas separadas durante tres horas bajo aplicación lenta de trepidaciones con solución colorante (0,1% de Coomassie Brilliant Blue R250, 10% (v/v) de ácido acético, 30% de metanol). La incubación en la solución decolorante (10% (v/v) de ácido acético, 30% de metanol) se llevó a cabo hasta que eran claramente visibles las bandas de proteína. Para la documentación se dispuso el gel, en ausencia de burbujas de aire, entre un papel de filtro de celulosa y una lámina copiadora y se secaron bajo el vacío de la casa durante dos horas en el secadero para gel (Bio-Rad, modelo 583) a 80ºC.

2. Determinación del contenido en proteínas mediante la detección de los BCA

Las concentraciones de las proteínas se determinaron mediante el sistema de detección de proteínas con el ácido bicinconinoico-(BCA) de Pierce (St. Augustin, Alemania) mediante espectrometría a 562 nm según las indicaciones del fabricante de acuerdo con el protocolo normalizado. Los grados de calibración se recogieron con diluciones de BSA.

3. Métodos espectroscópicos de detección

Todas las detecciones espectroscópicas UV-Vis se llevaron a cabo bajo condiciones aerobias en un espectrofotómetro de la firma Pharmacia, modelo BioChrom4060 (APB, Uppsala, Suecia), con el sistema informático BioChrom4060 Windows 3.11 Software v2.0.

a) Determinación de la concentración de P450 Las concentraciones de la P450 BM-3 se determinaron por medio de

los métodos espectroscópicos de la diferencia de CO (Omura et al. 1964) y con un coeficiente de extinción \varepsilon = 91 mM^{-1} * cm^{-1} con una velocidad de avance de 125 nm/min a intervalos de 0,1 nm. Para ello se añadió a 5 ml de extracto en bruto de la P450 BM-3 tamponado con fosfato (20 mM, pH 7,3 hasta 7,5), una punta de espátula de ditionito de sodio y 10 \mul de una solución acuosa al 0,1 por ciento (p/v) de metilviológeno. La muestra coloreada de azul obscuro hasta verde azulado, en función de la concentración en P450 BM-3, se subdividió en dos fracciones. Una de las dos fracciones se gasificó durante un minuto con CO, evitándose la formación de espuma, la otra sirvió como referencia para la medida espectroscópica diferencial.

b) Medida de la actividad de la reductasa

Las medidas se llevaron a cabo a temperatura ambiente en tampón de fosfato de potasio 0,1 M, pH 7,4, midiéndose el aumento de absorción a 550 nm con \varepsilon = 8,9 mM^{-1} (Fulco et al. 1992). 1 ml de muestra contenía 50 nmol de citocromo c (procedente de corazón de caballo), 100 nmol del NADPH y una cantidad, visible en la tabla 6, de la P450 BM-3. Como referencia sirvió la misma muestra, antes de la adición del NADPH. Las soluciones se prepararon en estado fresco y se almacenaron sobre hielo hasta su utilización en el mismo día. Para la medida de la actividad de la reductasa de la P450 BM-3His_{6} se añadieron las soluciones del NADPH a la solución de citocromo-c al cabo de cinco minutos de incubación.

4. Protocolos para la caracterización de la P450 BM-3 y/o de la P450 BM-3 F87A

Para la medida de las constantes cinéticas así como de la estabilidad al pH y a la temperatura se empleó P450 BM-3 F87A purificada. Para todas las otras determinaciones se empleó extracto en bruto claro, centrifugado y filtrado. Para todos los experimentos se emplearon, por carga, desde 0,05 hasta 0,2 nmol de la P450 BM-3 o de la P450 BM-3 F87A en un volumen total de 1 ml y 8 \mul de solución 5 a 15 mM de pNCA. Con excepción de los ensayos con el disolvente, se llevaron a cabo los experimentos de caracterización en cubetas de plástico de 1 ml, de un solo uso. En tanto en cuanto no se describa otra cosa, los ensayos se realizaron a temperatura ambiente.

a) Determinación de las constantes cinéticas

Las constantes cinéticas se determinaron tras adición de 792 \mul de tris/HCl (pH 8,2, 0,2 M) y de 100 \mul de la P450 BM-3 para a 8 \mul de solución de substrato en DMSO a concentraciones variables del substrato. Tras cinco minutos de incubación a temperatura ambiente se inició la reacción mediante adición de 100 \mul de solución 1 mM del NADPH.

b) Estabilidad en solución de la P450 BM-3 F87A

La medida de las estabilidades en solución se llevó a cabo en cubetas de vidrio (Hellma, modelo 6040), disolviéndose el substrato en acetona, en dioxano, en THF o en etanol en lugar de hacerlo en DMSO. Las determinaciones se llevaron a cabo de acuerdo con la rutina descrita en el caso de las medidas cinéticas; sin embargo se modificó, a diferencia de aquellas, la proporción del tampón de acuerdo con la cantidad empleada de disolvente.

c) Estabilidad frente al pH y estabilidad frente a la temperatura de la P450 BM-3 F87A

La medida de la estabilidad frente al pH se llevó a cabo a 30ºC en el aparato Stratagene Robocycler (modelo gradient40) en recipientes de reacción para PCR, de pared delgada, de 0,5 ml (Stratagene). Se añadieron a 0,1 hasta 0,2 nmol de la P450 BM-3, 392 \mul de solución tamponada como fosfato (50 mM, pH 4 a 10). Al cabo del período de incubación se transfirió hasta una cubeta la solución de la P450 BM-3 y se añadieron 500 \mul de tris/HCl (0,3 M, pH 8,2) y 8 \mul de 12-pNCA (6 mM). Al cabo de cinco minutos de incubación se inició la reacción por medio de 100 \mul de solución del NADPH (1 mM). La estabilidad a la temperatura se ensayó a un valor del pH de 7,5 bajo las mismas condiciones que en el caso de la estabilidad al pH.

d) Efecto de las concentraciones del tampón, de los detergentes, de los inhibidores de la proteasa, de los tio-compuestos, del sepulcrato de Co(III) sobre la actividad de la P450 BM-3 F87A

Los efectos de estos compuestos sobre la actividad de la P450 BM-3 F87A se han llevado a cabo de manera análoga a la de los ensayos cinéticos, reemplazándose una parte variable del tampón por la substancia a ser ensayada disuelta en el mismo sistema tampón.

e) Detección automatizada de la actividad

Para la detección automatizada de la actividad de la P450 BM-3 F87A se eligieron placas de microtitulación con 96 cámaras de reacción (Greiner Frickenhausen, Alemania). El volumen total de la reacción fue de 250 \mul en un tampón tris/HCl (0,1 M, pH 8,2) con 18 nmol de 10-pNCA y de 11-pNCA, 12 nmol de 12-pNCA o 10 nmol de 15-pNCA, que estaban disueltos en 2,2 \mul de DMSO. Para los trabajos de pipetaje se utilizó un dispositivo automático de pipetaje Biomek2000 (Beckman Instruments, Fullerton, USA). Al cabo de cinco minutos de incubación con 0,02 nmol de la P450 BM-3 F87A se inició la reacción mediante inyección de 25 \mul de una solución acuosa del NADPH (1 mM) en cada cámara de reacción. El desarrollo de la reacción se siguió por absorción a 405 nm en un lector de placas de microtitulación FluoStar (BMG LabTechnology, Offenburg, Alemania).

f) Ensayos con peróxido de hidrógeno

Para los ensayos de la actividad se emplearon procedimientos como los que han sido descritos para las medidas cinéticas, con la diferencia de que se añadieron cantidades variables de peróxido de hidrógeno acuoso en lugar de añadirse NADPH.

En los ensayos de estabilidad se incubaron desde 0,05 hasta 0,1 nmol de la P450 BM-3 F87A en ausencia de substrato de pNCA con cantidades variables de peróxido de hidrógeno durante cinco minutos. Tras adición de catalasa (600 U) y otra incubación durante cinco minutos se pipetaron a la solución de la reacción 60 nmol de 12-pNCA-substrato. La reacción se inició cinco minutos más tarde mediante adición de 100 \mul del NADPH (1 mM).

g) Ensayos con el mediador de Zn

Las reacciones se llevaron a cabo en un aparato para la aplicación de trepidaciones para recipientes de reacción de Eppendorf sometidos a trepidaciones (IKA-Labortechnik Vibrax con accesorio de Janke y Kunkel tipo VX2E). Para los ensayos de actividad se aplicaron procedimientos como los que se han descrito para las medidas cinéticas, únicamente se utilizaron cantidades variables de cinc/sepulcrato de cobalto(III) en lugar del NADPH. Al cabo de intervalos diferentes de tiempo se tomaron muestras de 100 \mul de la suspensión de la reacción y se pipetaron en otro recipiente de reacción de Eppendorf de 1,5 ml, en el que se habían dispuesto 10 \mul de KOH (6 M) para detener la reacción. Tras un minuto de centrifugación a 12.000 g se retiró el sobrenadante y se midió la absorción a 410 nm.

Ejemplo 1 Clonación, expresión y purificación de la P450 BM-3 y mutantes a escala de gramos 1. Clonación del gen p450 BM-3 y del mutante p450 BM-3 F87A y su expresión en fermentaciones de 30 litros

El gen P450 BM-3 se aisló por medio de PCR a partir del ADN genómico de Bacillus megaterium, se dotaron con Tags y se clonaron, como se ha mostrado en la figura 1 para el plásmido pT, en los lectores de expresión pCYTEXP1 y pASK-IBA1CA. Para verificar la inserción correcta del gen P450 BM-3, de las variantes P450 BM-3 dotadas con Tags diferentes y para verificar los mutantes puntuales de la P450 BM-3 F87A se emplearon los cabadores de secuenciación R0_5 hasta L7. Para las reacciones PCR según el protocolo normalizado se emplearon, para el enzima de tipo natural, los cabadores B1 y B2, para la P450 BM-3His_{6} se emplearon los cabadores H1 y H2, para P450 BM-3Glu_{6} se emplearon los cabadores G1 y G2, para P450 BM-3Arg_{6} se emplearon los cabadores A1 y A2 y para P450 BM-3Strep se emplearon los cabadores S1 y S2. El análisis secuencial no proporcionó mutaciones de ningún tipo para un plásmido pT-USCOBM3 y pT-USC1BM3 secuenciado respectivamente a partir de tres. Para pT-USC2BM3 y para pT-USC3BM3 se verificó únicamente con el cabador R7 la inserción correcta del Tag. El clon secuenciado de pA-USC4BM3 mostró dos mutaciones en la parte de la reductasa de la proteína P450 BM-3. La proporción de expresión de la P450 BM-3, dotada con un His_{6}-Tag en DH5\alpha era, con valores de 300 nmol por litro de caldo de fermentación, aproximadamente un 20% mayor que en el caso del tipo natural. Debido a esta mayor proporción de expresión se sometió a una mutación puntual el pT-USC1BM3, para aumentar la sensibilidad del ensayo pNCA, en la posición 87 mediante intercambio de una fenilalanina por alanina en el estuche de Stratagene QuikChange. Mediante la reacción de PCR con los cabadores F87A1 y F87A2 se obtiene el pT-USC1BM3F87A en la posición de la mutación, sin otra modificación de la secuencia proteínica, un punto de corte adicional de restricción EaeI, que se utilizó para la selección del clon elegido para la secuenciación. Este punto de corte adicional de restricción condujo, tras corte por restricción con EaeI a la aparición de nuevas bandas aproximadamente de 800 bp en la huella 2 y a una banda con 1,7 kbp claramente menor en la huella 1, frente a la digestión del tipo natural. Tras aislamiento del plásmido se sometieron a digestión ocho clones con EaeI (2 \mul de tampón EaeI (10x), 1 \mul de EaeI, 3,2 \mul de pT-USC1BM3, hasta 20 \mul de ddH_{2}O, 1 h a 37ºC). Se secuenció un clon. El plásmido pT-USC1BM3F87A tiene una mutación adicional R470C en la región enlazante en la posición 470. Se desistió a una mutación inversa debido a la localización de la mutación R470C al final de la región enlazante, que une la parte P450 de la P450 BM-3 con la parte de la reductasa y que no presenta efecto de ningún tipo sobre la actividad de la P450 BM-3.

2. Purificación de la P450 BM-3 y de la P450 BM-3 F87A

El objetivo consistía en desarrollar un método económico, rápido y realizable a escala preparativa, para la purificación de la P450 BM-3 y de la P450 BM-3 F87A. Para ello se aplicó un Arg_{6}-, His_{6}-, Glu_{6}- y Strip-Tag sobre el extremo C-terminal de la P450 BM-3. Debido al Tag His_{6} y Strep deberían desarrollarse aumentos de afinidad y debido al Arg_{6}- y Glu_{6}-Tag deberían desarrollarse purificaciones cromatográficas con intercambiadores de iones. Una inserción de un Tag sobre el extremo N-terminal del gen P450 BM-3 no se tomó en consideración debido a la localización del extremo N en la zona del canal flexible de entrada al substrato. Una modificación en esta zona conduciría, con gran probabilidad, a una modificación de la actividad y la selectividad de la P450 BM-3.

2.1 Purificación de las proteínas con cromatografía de afinidad a) P450 BM-3 con His_{6}-Tag

En el caso de una purificación de la P450 BM-3His_{6} mediante cromatografía con quelatos metálicos no se enlaza más del 95% de los 4 mg de la P450 BM-3 aplicados sobre la columna de afinidad de 20 ml de XK16/20 con un gradiente lineal de imidazol desde 0 hasta 0,5 molar (10 CV). La purificación cromatográfica con iones Zn^{2+} se llevó a cabo según el protocolo normalizado de la firma Pharmacia. La P450 BM-3 poco purificada ya no mostró actividad en el ensayo del NADPH. El motivo de esta inhibición pudo basarse en el efecto del imidazol. El imidazol provoca un desprendimiento del quinto ligando de cisteinato sobre el hemo-centro catalítico. Esta disociación del quinto ligando del hemo-sistema conduce a la inmediata inactivación de la P450 y se presenta en el espectro diferencial de CO por medio de un desplazamiento característico del máximo de absorción desde 448 nm hacia 420 nm.

b) P450 BM-3 con Strep-Tag

Para la purificación se emplearon 8,2 mg de la P450 BM-3Strep. De manera comparable a la de los resultados de las purificaciones con His_{6}-Tag, la P450 BM-3Strep no mostró enlace sobre la matriz de afinidad de streptoavidina durante la purificación de acuerdo con el estuche READY TO USE (IBA, Göttingen).

c) P450 BM-3 con Glu_{6}-Tag

Una comparación de los gradientes lineales desde 0 hasta 1 M de NaCl (12 CV, tampón tris/HCl (0,1 M, pH 8,0)) no mostró para P450 BM-3Glu_{6} diferencias en el comportamiento a la elución con respecto al enzima de tipo natural cuando se emplearon intercambiadores de aniones Super 650M y DEAE 650M.

d) Conclusiones

Los resultados de la purificación de la P450 BM-3 con His_{6}-, Glu_{6}- y Strip-Tag permiten concluir que el extremo C-terminal de la P450 BM-3 no se encuentra libremente accesible en la superficie de la proteína y que, por lo tanto, no es empleable para finalidades de purificación. Además, en el caso del Tag His_{6}, la elución por medio de imidazol provoca una rápida activación de la proteína mediante modificación del quinto ligando sobre el sistema de porfirina.

2.2 Cromatografía con intercambiadores de aniones

Para minimizar los costes, debería desarrollarse un método para la purificación de la P450 BM-3 eficaz, económico y con ahorro de tiempo, que permitiese una extrapolación sencilla. Como métodos para la purificación de la P450 BM-3 se encontraban a disposición, por lo tanto, únicamente materiales HIC e intercambiadores de iones de acuerdo con los resultados de la purificación de la P450 BM-3 con Tags. La decisión se produjo a favor de los intercambiadores de aniones, que, por regla general, son más baratos y ofrecen una manipulación más sencilla.

a) Gradiente lineal y escalonado

Para desarrollar un método cromatográfico por intercambio de aniones se ensayaron cuatro materiales intercambiadores de aniones de potencia variable DEAE 650S (35 \mum), DEAE 650M (65 \mum), SuperQ 650M (65 \mum) y QAE 550M (65 \mum) con relación a su idoneidad. En los primeros experimento se recogió para cada material de columna un volumen correspondiente a 10 veces el de la columna (CV) con gradiente largo lineal desde 0 hasta 1 M de NaCl para la purificación de 6 a 10 mg de extracto en bruto de la P450 BM-3 en un tampón tris/HCl (0,1 M, pH 7, 8). En todos los casos el rendimiento fue del 80 al 84%. La proporción máxima de proteínas en el pico de elución de la P450 BM-3 fue mostrada por el material DEAE, seguido de cerca por el material SuperQ y QAE.

Para mejorar todavía más la resolución por medio de gradientes escalonados de sal contribuyó la aptitud del sistema ÄKTAexplorer para registrar simultáneamente la conductibilidad y la absorción a 280 nm y a 417 nm. Un gradiente salino optimizado en dos etapas para la columna cromatográfica DEAE 650M tiene una primera etapa de 150 mM de NaCl y una segunda con 250 mM de NaCl. La elución de la P450 BM-3 se inicia como puede deducirse de los valores de conductibilidad del gradiente salino lineal de NaCl, con un aumento de la concentración de NaCl desde 150 mM hasta 170 mM. La etapa salina superior, mínima, se determinó a 250 mM de NaCl; las concentraciones de NaCl < 230 mM provocaron un ensanchamiento del pico de elución de la P450 BM-3, y concentraciones de NaCl > 300 mM condujeron a un efecto limpiador claramente peor. Las etapas salinas se optimizaron de la misma manera para los materiales cromatográficos SuperQ 650M y QAE 550M.

Una comparación entre el DEAE 650M y el gradiente escalonado de NaCl conduce a un aumento de la proporción en proteínas de la P450 BM-3 en el pico de elución del 39% en el caso del gradiente lineal, hasta el 84% en el caso del gradiente escalonado. Se consiguieron resultados comparables con el material cromatográficos SuperQ 650M; el material cromatográfico QAE 550M mostró resultados de purificación claramente peores. En el caso de los métodos de purificación escalonados, los rendimientos en todos los casos fueron > 78%; los rendimientos máximos del 93% en P450 BM-3 en el pico de elución se consiguió con DEAE 650S.

Ejemplo 2 Desarrollo de una detección espectroscópica de la actividad para la P450 BM-3 y para la P450 BM-3 F87A

El objetivo consistía en desarrollar una detección de la actividad por espectrometría o por fluorimetría para la P450 BM-3. Una detección de la actividad de este tipo puede automatizarse de manera sencilla en contra de lo que ocurre con los métodos usuales tales como la HPLC o la GC y, por lo tanto, se emplean para encontrar otras variantes enzimáticas de la P450 BM-3.

Para desarrollar una nueva detección de la actividad para la P450 BM-3 se sintetizaron diversos compuestos, que portan el cromóforo en el átomo de C terminal de los ácidos carboxílicos y se ensayaron en cuanto a su adecuación.

Los trabajos de Oliver et al. Biochemistry (1997), 36(7):1567 muestran en el caso del ácido láurico y del ácido mirístico como substratos, un desplazamiento del perfil de la hidroxilación de la P450 BM-3 desde posiciones subterminales hasta posiciones terminales, cuando se haya reemplazado la fenilalanina en la posición 87 por alanina. Para aumentar la sensibilidad del método de detección pNCA se insertó esta mutación puntual, como se ha descrito en los apartados referentes a material y métodos, y se confirmó mediante análisis secuencial.

1. Principio de la detección

La figura 2 muestra el principio para una detección por espectrometría de la actividad para las hidroxilasas de ácidos grasos hidroxilantes en la posición terminal. Tras la hidroxilación terminal se forma un semiacetal inestable, que se disocia en el ácido \omega-oxicarboxílico y en el cromóforo que puede ser detectado por espectrometría.

2. Detección de la actividad de la P450 BM-3 F87A con PCA a) Síntesis de los ácidos fenoxicarboxílicos (PCA)

Los compuestos PCA se sintetizaron en una síntesis con una sola etapa, como se ha descrito en el ejemplo de referencia 5, a partir de los ácidos \omega-bromocarboxílicos. Las síntesis proporcionaron rendimientos totales comprendidos entre el 76 y el 78%. Los PCA se caracterizaron por medio de ^{1}H-RMN, ^{13}C-RMN y mediante la determinación del punto de fusión.

b) Elección de las condiciones de la reacción

Para poder detectar por espectroscopia la formación de fenol es posible medir la absorción en el intervalo de las longitudes de onda comprendidas entre 250 y 280 nm (Luchter-Wasylewska 1996). El bajo coeficiente de extinción en el máximo de absorción a 274 nm de \varepsilon = 1090 M^{-1}cm^{-1}, el comportamiento variable a la absorción del NADPH y de NADP^{+} en este intervalo de longitudes de onda y la formación de peróxido de hidrógeno en las reacciones no acopladas impiden, sin embargo, una medida por espectroscopia continua de la formación del fenol. Por estos motivos se utilizó el estuche para la detección del fenol de Merck, para la cuantificación de la formación del producto. Con NADPH a modo de cofactor se produjeron, con el empleo de la P450 BM-3 mutante F87A, para 12-PCA, velocidades de conversión de 640 eq/min y para 11-PCA de 410 eq/min.

3. Detección de la actividad de la P450 BM-3 y de la P450 BM-3 F87A con substratos pNCA a) Síntesis de los ácidos p-nitrofenoxicarboxílicos (pNCA)

Los compuestos pNCA se sintetizaron en una nueva síntesis, con tres etapas, como se ha descrito en el ejemplo de regencia 5, a partir de los ácidos \omega-bromocarboxílicos mediante esterificación, reacción S_{n}2 subsiguiente con el p-nitrofenolato de sodio e hidrólisis del éster catalizada con lipasa. La síntesis con tres etapas de los pNCA proporcionó rendimientos totales comprendidos entre un 61 y un 69%. Se caracterizaron los pNCA por medio de ^{1}H-RMN, ^{13}C-RMN y mediante la determinación del punto de fusión.

b) Elección de las condiciones de la reacción

En la figura 2 se ha descrito el principio de reacción de la conversión de los substratos de pNCA mediante P450 BM-3 y P450 BM-3 F87A. Para la medida de la actividad tuvieron que optimizarse los valores del pH y las longitudes de onda del sistema de detección por espectroscopia. Únicamente el p-nitrofenolato desprotonizado (valor pKs 7,1) contribuye al color amarillo; para la sensibilidad de la detección sería recomendable, por lo tanto, un valor del pH > 9,1 (desprotonizado > 99%). Los compuestos pNCA son estables en soluciones fuertemente alcalinas, en contra de lo que ocurre con la proteína P450 BM-3, que pierde el 80% de su actividad a pH 10 y a 30ºC en el transcurso de 5 minutos. Como compromiso entre la estabilidad de las proteínas y la sensibilidad de los métodos de detección se eligió un valor del pH desde 8,1 hasta 8,2. Los cálculos a base de la ecuación de Henderson-Hasselbalch muestran que en este intervalo de pH está desprotonizado del 90 al 92% del p-nitrofenol no convertido y contribuye al color amarillo. El máximo de absorción del p-nitro-fenolato se encuentra en 400 nm. Sin embargo, a estas longitudes de onda absorben, también, el hemo-centro y el cofactor NADPH. La P450 BM-3 tiene un fuerte comportamiento a la absorción entre 350 y 450 nm, que oscila en gran medida en función del enlace con el substrato y del nivel de oxidación del hierro en el centro catalítico. El espectro de absorción del NADPH limita el intervalo de las longitudes de onda a > 390 nm. Finalmente se eligieron para la medida de la actividad las longitudes de onda a 410 nm debido a sus posibilidades de reproducción. Cuando la sensibilidad del sistema detector no sea suficiente, deberá trabajarse a longitudes de onda en el intervalo de 400 nm. Bajo las condiciones elegidas para la detección (pH 8,2, 410 nm) se determinó el coeficiente de extinción como \varepsilon = 13200 M^{-1}cm^{-1}.

Los pNCA tienen únicamente una pequeña solubilidad en agua de tal manera, que se requiere un solubilizante. Para ello puede emplearse DMSO sin efecto sobre la actividad de la P450 BM-3 F87A hasta concentraciones del 1% (v/v). Por lo tanto se empleó un 0,8% (v/v) de DMSO como solubilizante en el sistema para la detección de la actividad.

Las necesidades de tiempo del sistema para la detección de los pNCA dependen en gran medida de la cantidad empleada del enzima. Cuando se utilicen cantidades a escala de nmol de la P450 BM-3 F87A en la detección de la actividad de los pNCA, será suficiente 1 minuto para la detección de la actividad.

c) Automatización de la detección de los pNCA

Para el empleo en un medio HTS se automatizó la detección de la actividad de los pNCA con utilización de una estación de trabajo Biomek2000 y un lector de placas de microtitulación BMG FluoStar. Con empleo de la P450 BM-3 y del mutante F87A se ensayó la capacidad de reproducción del sistema de ensayo respectivamente en 16 medidas con los substratos pNCA 10, 11, 12 y 15-pNCA. En el caso de las absorciones totales se presentaron diferencias con un factor de dos hasta cuatro, debido a las inexactitudes del pipetaje, sin embargo las diferencias de reactividad oscilaron únicamente entre un 2 y un 6%. Se consiguió la mejor posibilidad de reproducción para la P450 BM-3 mutante F87A con desviaciones de 2% y la peor de todas se alcanzó con el tipo natural y 15-pNCA con desviaciones de hasta un 6% del valor medio de todas las medidas. El motivo de las diferencias de exactitud reside en la solubilidad diferente de los substratos pNCA y en las diversas conversiones en función de la longitud de las cadenas.

El mutante F87A convierte por completo al 12-pNCA, mientras que el enzima de tipo natural se detiene después del 33%. El motivo se encuentra, probablemente, en los compuestos 12-pNCA hidroxilados en posición subterminal, que ya no se transforman o únicamente lo hacen lentamente. En las tablas 4 y 5 siguientes se han reunido el perfil de la longitud de las cadenas de los pNCA para P450 BM-3 y P450 BM-3 F87A y la conversión por \omega-hidroxilación de los pNCA, calculada como el cociente entre la coloración amarilla de la solución observada y medida. Además se determinaron los datos cinéticos para la P450 F87A a partir de los diagramas Lineweaver-Burk.

TABLA 4

21

TABLA 5

22

Ejemplo 3 Nuevo sistema cofactor para la P450 BM-3 y para la P450 BM-3 F87A

Un impedimento principal para la utilización industrial de los sistemas P450 consiste en los costes, que provoca el cofactor NADPH. Para la solución del problema de los costes se desarrolló un concepto de cofactor alternativo, en el cual se reemplazó el NADPH por cinc y por el mediador constituido por el sepulcrato de cobalto(III); el cinc sirve como fuente de electrones y el sepulcrato de cobalto(III) como sistema para el transporte electrónico desde el cinc hasta la P450 BM-3.

1. Detección de la reducción del sepulcrato de cobalto(III) mediante cinc

El sepulcrato de cobalto(III) tiene un potencial normal, bajo condiciones normalizadas, de -0,54 V frente a un electrodo de calomelanos (Creaser et al., J. Am. Chem. Soc. (1977) 99: 3181). Este puede reducirse, como se ha mostrado en la figura 3, mediante polvo de Zn en un tampón tris/HCl (0,2 M, pH 8,2) en el transcurso de segundos. En presencia de oxígeno del aire en solución acuosa se oxida en el transcurso de pocos minutos de nuevo para dar sepulcrato de cobalto(III).

2. Detección de la actividad de la P450 BM-3 F87A con el sistema cofactor alternativo 2.1 Ensayo con los pNCA

La figura 4 muestra la conversión del 12-pNCA por medio del sistema Zn/sepulcrato de cobalto(III)/P450 BM-3 F87A. El sistema Zn/sepulcrato de cobalto(III)/P450 BM-3 F87A presenta un color amarillo con un máximo de absorción de 0,8 al cabo de 8 min, que corresponde a una conversión del 70%. En el transcurso de 20 minutos desaparece por completo el color amarillo provocado por el p-nitrofenolato. El valor de absorción residual de 0,15 se debía al mediador. Los experimentos de control mostraron que el polvo de Zn reducía el grupo nitro del p-nitrofenolato en el tampón tris/HCl (pH 8,2, 50 mM, 0,25 M KCl). Otros experimentos de control mostraron que el peróxido de hidrógeno no tiene ningún efecto oxidante sobre el p-nitrofenolato ni sobre los pNCA.

En la figura 5 se han representado las vías descritas para la transferencia electrónica desde Zn, a través del mediador, hasta la P450 BM-3 y la conversión del substrato teniéndose en consideración el camino de reacción más corto del peróxido de hidrógeno ("shunt-pathway").

2.2 Ensayo con PCA

Debido a la reducción del p-nitrofenol por el cinc en un tampón tris/HCl se reemplazó el 12-pNCA por el 12-PCA. La detección del fenol se llevó a cabo por medio del estuche de detección del fenol de Merck a 495 nm. No es posible una detección directa del fenol por fotometría a 274 nm debido al comportamiento a la absorción del sepulcrato de cobalto(III) oxidado y reducido. La figura 6 pone de manifiesto, con 12-PCA como substrato, una coloración lenta en comparación con el 12-pNCA (figura 4). Como origen de la disminución de la absorción pudo identificarse el peróxido de hidrógeno, que se forma mediante el sepulcrato de cobalto(II) reducido en reacciones secundarias mediante la reducción del oxígeno del aire en soluciones acuosas. Además se presenta siempre la formación de peróxido de hidrógeno en el sistema P450 como consecuencia de las reacciones no acopladas, como producto de reacciones secundarias. Debido a este último motivo no se siguió una optimación adicional de las condiciones de reacción PCA.

La disminución de la absorción se verificó de una manera claramente más lenta a 495 nm en presencia de 600 U de catalasa, como muestra la figura 6.

3.1 Composición del tampón

Para evitar la decoloración de la solución debido a la reducción del p-nitrofenolato por el cinc, se modificaron en primer lugar, sin éxito, la concentración de KCl y el valor del pH en el ámbito de la estabilidad de la P450 BM-3 F87A (6,5-8,5). La reducción del p-nitrofenol por el cinc puede impedirse con éxito, tal como muestra la figura 7, mediante la adición de tampón de fosfato de potasio. A partir de una proporción de fosfato de potasio \geq 10% sólo se reduce el p-nitrofenol en pequeña cuantía (\leq 10%) por el cinc y en el caso de una mezcla 1:1 ya no puede detectarse una reducción adicional incluso al cabo de 14 h (no ha sido representada). Tal como muestra la figura 7, se reduce la proporción de sepulcrato de Co(II) reducido en el intervalo de mezcla de hasta un 20% de fosfato de potasio, en primer lugar, claramente alrededor de -25% aproximadamente, para mantenerse constante entre el 60 y el 70% con una proporción de fosfato de potasio comprendida entre el 20 y el 70% (v/v). La menor disponibilidad de sepulcrato de cobalto(II) reducido, en comparación con el sistema tampón tris/HCl, conduce a una pérdida de actividad del 15% aproximadamente.

Teniendo en consideración los resultados anteriores se empleó para las otras optimaciones una mezcla 1:1 de ambas soluciones tampón.

3.2 Efecto de la concentración del mediador sobre la conversión y sobre la actividad de la P450 BM-3 F87A

La figura 8A muestra el efecto del mediador constituido por el sepulcrato de cobalto(III) sobre la actividad de la P450 BM-3 en el ensayo NADPH con diversas concentraciones de mediador. A concentraciones de sepulcrato de cobalto(III) \geq 5 mM, se formó un precipitado coloidal durante el desarrollo de la reacción, que se separó por centrifugación como paso previo a la medida de la absorción. Para las reacciones con el sistema cinc/sepulcrato de cobalto(III) existe una concentración óptima de sepulcrato de cobalto(III) en el intervalo desde 0,5 hasta 0,75 mM por 0,072 nmol de la P450 BM-3 F87A. Tal como se muestra en la figura 8B, el sepulcrato de cobalto(III) inhibe sólo ligeramente hasta concentraciones \leq 0,5 mM de la P450 BM-3 F87A incluso en ausencia de substrato. El grado de inhibición permanece constante cuando se modifican los tiempos de incubación y únicamente depende de la proporción entre la concentración de sepulcrato de cobalto(III) y de la P450 BM-3 F87A.

3.3 Concentración del Zn

En la figura 9 se ha representado la dependencia entre la conversión de 0,072 nmol de la P450 BM-3 F87A y la cantidad empleada de polvo de cinc. Una conversión óptima se consiguió en el intervalo de 20 hasta 40 mg de cinc por mililitro de solución de la reacción. Probablemente fue responsable del descenso de la conversión a 50 y 100 mg, una concentración decreciente de oxígeno en la solución de la reacción debido a la formación creciente de peróxido de hidrógeno catalizada por el mediador.

Una substitución del polvo de cinc por granalla de cinc condujo, incluso cuando se utilizó una cantidad 100 veces mayor, únicamente a velocidades de conversión muy bajas (factor > 20).

3.4 Efecto de la concentración del H_{2}O_{2}

Para la determinación de la proporción del peróxido de hidrógeno a través de la vía de reacción 'shuntA para la conversión del 12-pNCA mediante la contribución de la P450 BM-3 F87A, se incubaron el 12-pNCA y la P450 BM-3 F87A con concentraciones variables de peróxido de hidrógeno. En el intervalo de 8 a 20 \muM de peróxido de hidrógeno se alcanza una meseta, con actividades comparables de la P450 BM-3 F87A al cabo de un minuto con una conversión del 20 al 25%, independientemente de la concentración en peróxido de hidrógeno. La adición ulterior del NADPH en exceso (100 \muM) muestra que la P450 BM-3 F87A no se inactiva por completo debido al peróxido de hidrógeno. Las actividades residuales son elevadas con bajas concentraciones de peróxido de hidrógeno y disminuyen a medida que aumenta la concentración en peróxido de hidrógeno (no mostrado).

Para determinar la estabilidad de la P450 BM-3 frente al peróxido de hidrógeno, se incubó la P450 BM-3 F87A en ausencia de substrato (12-pNCA) durante 5 min con cantidades variables de peróxido de hidrógeno. Tras adición de catalasa (600 U) y de 60 nmol de substrato se determinaron las velocidades de conversión con empleo del NADPH como donador de electrones

Tal como se ha mostrado en la figura 10, las concentraciones de peróxido de hidrógeno en el intervalo de 5 \muM inhiben ya claramente la actividad de la P450 BM-3 F87A en ausencia de substrato. Como consecuencia debe trabajarse, por este motivo, en el caso de un reactor de enzima-membrana de la P450 BM-3 F87A con las concentraciones de substrato tan elevadas como sea posible y debe minimizarse la formación de peróxido de hidrógeno mediante la adición de catalasa o de antioxidante.

Ejemplo 4 Ensayo de actividad con otros mutantes de la P450 BM-3

De manera análoga a la del ejemplo 2 se ensayaron otros mutantes BM-3 así como el tipo natural del enzima (WT) con respecto a la actividad frente a los derivados de pNCA con diversas longitudes de cadena. Los resultados se han reunido en la tabla 6 siguiente:

TABLA 6

23

<110> BASF Aktiengesellschaft

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<120> Sistema donador de electrones para enzimas y su empleo en la conversión bioquímica de substratos

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<130> M/40076

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<140>

\vskip0.400000\baselineskip

<141>

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<170> PatentIn Ver. 2.1

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido para ADN genómico de Bacillus megaterium

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtgaaagagg gatcccatga caattaaaga aatgcc

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

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<211> 38

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcctcttgga tccttaccca gcccacacgt cttttgcg

\hfill

38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cabador para la secuenciación

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtacgtgatt ttgcaggag

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cabador para la secuenciación

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggctatcatg cgatgatggt

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cabador para la secuenciación

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cccagcttat gatgaaaac

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cabador para la secuenciación

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggaaaagatc cagaaacggg

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cabador para la secuenciación

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtcggcatgg tcttaaacg

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cabador para la secuenciación

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

attcctcagc ttcaccgtga

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cabador para la secuenciación

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cttggcggta ttccttcac

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cabador para la secuenciación

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atttgcaccg caggtcgcaa

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cabador para la secuenciación

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctgggctact acgtatc

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cabador para la secuenciación

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttcaatttgt cgacagcgcc

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cabador para la secuenciación

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaaggagatc atttaggtg

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cabador para la secuenciación

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tcgcgcaatg gctgctaaaa

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cabador para la secuenciación

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgatttcttc atcacctc

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cabador para la secuenciación

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctgccaaaag accctgaaac

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cabador para la secuenciación

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

accatcatcg catgatagcc

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cabador para la secuenciación

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cccgtttctg gatcttttcc

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cabador para la secuenciación

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tcacggtgaa gctgaggaat

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cabador para la secuenciación

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttgcgacctg cggtgcaaat

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cabador para la secuenciación

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggcgctgtcg acaaattgaa

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cabador para la secuenciación

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttttagcagc cattgcgcga

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cabador para la secuenciación

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtttcagggt cttttggcag

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido para Tag en el extremo C

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtgaaagagg gatcccatga caattaaaga aatgcc

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cggaattctt aacgacgacg acgacgacgc ccagcccaca cg

\hfill

42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtgaaagagg gatcccatga caattaaaga aatgcc

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cggaattctt attcttcttc ttcttcttcc ccagcccaca cg

\hfill

42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtgaaagagg gatcccatga caattaaaga aatgcc

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgcaattctt aatgatgatg atgatgatgc ccagcccaca cg

\hfill

42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtctcagcgt gagaccccca gcccacacgt cttttgcc

\hfill

38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtgaaagagg tctccaatga caattaaaga aatgcc

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cabador para P450 BM-3 mutante puntual F87A

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcaggagacg ggttggccac aagctggacg catg

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

catgcgtcca gcttgtggcc aacccgtctc ctgc

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 3150

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bacillus megaterium

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (4)..(3150)

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

24

25

26

27

28

29

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1048

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Bacillus megaterium

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Claims

1. Sistema donador de electrones para la transferencia de electrones hasta enzimas con propiedades Redox, caracterizado porque el sistema abarca una fuente de electrones inorgánica, no enlazada mediante electrodos y un mediador, que es capaz de transferir electrones desde la fuente de electrones hasta el enzima, siendo el enzima una monooxigenasa que contiene citocromo P450 (E.C. 1.14.-.-), y siendo la fuente de electrones un metal con un potencial normal normalizado menor que el del mediador.

2. Sistema donador de electrones según la reivindicación 1, caracterizado porque el mediador tiene un potencial normal normalizado en el intervalo menor que aproximadamente -0,4 V.

3. Sistema donador de electrones según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el mediador se elige entre el sepulcrato de cobalto(III), el metilviológeno, el rojo neutro, la riboflavina, el triacetato de rutenio, FMN y FAD.

4. Sistema donador de electrones según la reivindicación 1, caracterizado porque la fuente de electrones es cinc metálico.

5. Sistema donador de electrones según una de las reivindicaciones precedentes, elegido entre los sistemas:

- Zn/sepulcrato de cobalto(III) y

- Zn/rojo neutro.

6. Procedimiento para la transferencia enzimática de oxígeno hasta una molécula donadora de hidrógeno que contiene hidrocarburos, caracterizado porque la molécula donadora de hidrógeno se incuba en un medio de reacción, que abarca el enzima para la transferencia del oxígeno y un sistema donador de electrones según una de las reivindicaciones 1 a 5, en presencia de oxígeno bajo las condiciones de la reacción.

7. Procedimiento según la reivindicación 6, caracterizado porque la molécula donadora de hidrógeno se elige entre los compuestos de la fórmula

R-X

en la que

R: significa un resto alquilo con 8 o más átomos de carbono, y

X: significa un grupo polar, capaz de formar puentes de hidrógeno, preferentemente un grupo carboxi, amida, nitrilo, sulfato, sulfona, amina o hidroxi.

8. Procedimiento para la obtención enzimática de ácidos grasos hidroxilados en posición terminal o subterminal (posición \omega-1 hasta \omega-4), caracterizado porque

a): se hace reaccionar un ácido graso o derivado de ácido graso hidroxilable en presencia de un sistema donador de electrones según una de las reivindicaciones 1 a 5 con una citocromo P450 monooxigenasa y oxígeno; y

b): se aíslan el o los productos hidroxilados.

9. Procedimiento según la reivindicación 8, caracterizado porque el derivado \omega-hidroxilable del ácido graso se elige entre los ácidos grasos saturados en posición terminal, ramificados o no ramificados con más de 10 átomos de carbono, especialmente los ácidos grasos con 12 hasta 30 átomos de carbono.

10. Procedimiento según una de las reivindicaciones 6 a 9, caracterizado porque el enzima es una citocromo P450 monooxigenasa, elegida entre:

a): el enzima de tipo natural aislable a partir de Bacillus megaterium (DSM 32T); o

b): un mutante del enzima de tipo natural obtenible mediante substitución de aminoácidos al menos en una de las posiciones 26, 47, 72, 74, 87, 188 y 354 (SEQ ID NO: 35).

11. Procedimiento según la reivindicación 10, caracterizado porque se emplea un mutante sencillo, que se elige entre F87A, F87V, L188K, V26T, R47F, S72G, A74G y M354T.

12. Procedimiento según la reivindicación 10, caracterizado porque los mutantes en la posición 87 presentan la mutación F87A o F87V y, al menos, otra de las siguientes mutaciones: L188K, A74G, R47F y V26T.

13. Procedimiento según una de las reivindicaciones 8 a 12, caracterizado porque el sistema donador de electrones es cinc/sepulcrato de Co(III).

14. Procedimiento según una de las reivindicaciones 8 a 13, caracterizado porque se lleva a cabo al menos la etapa a) en presencia de iones cloruro.

15. Procedimiento según una de las reivindicaciones 8 a 14, caracterizado porque se lleva a cabo al menos la etapa a) en presencia de un encima disociador de peróxido de hidrógeno.

16. Biorreactor, para el empleo en la obtención de los ácidos grasos \omega-hidroxilados, caracterizado porque comprende monooxigenasa inmovilizada y un sistema donador de electrones según una de las reivindicaciones 1 a 5 en medio líquido de reacción.

17. Procedimiento para la detección de monooxigenasas de ácidos grasos, caracterizado porque

a): se incuba un analito, en el que se supone actividad enzimática, con un ácido graso o con un derivado de ácido graso \omega-hidroxilable, que porta o que portan un cromóforo o fluoróforo disociable, en posición terminal, en presencia de un sistema donador de electrones según una de las reivindicaciones 1 a 5; y

b): se determina cualitativa o cuantitativamente la disociación del cromóforo o del fluoróforo.

18. Procedimiento según la reivindicación 17, caracterizado porque la reacción se lleva a cabo en presencia de un enzima disociador de peróxido de hidrógeno y, en caso dado, en presencia de iones cloruro.

19. Estuche de ensayo, que comprende un sistema donador de electrones según una de las reivindicaciones 1 a 5.