JP2003009864A - 塩基配列が全然知られないデオキシリボ核酸の選択的増幅方法｛ＳｅｌｅｃｔｉｖｅＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎｏｆＤＮＡｏｆｗｈｉｃｈｂａｓｅｓｅｑｕｅｎｃｅｉｓｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙｕｎｋｎｏｗｎ｝ - Google Patents
塩基配列が全然知られないデオキシリボ核酸の選択的増幅方法｛ＳｅｌｅｃｔｉｖｅＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎｏｆＤＮＡｏｆｗｈｉｃｈｂａｓｅｓｅｑｕｅｎｃｅｉｓｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙｕｎｋｎｏｗｎ｝Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】本発明は生物体のデオキシリボ核酸(DNA)の選
択的増幅方法に関するもので、より詳しくは生物体のDN
Aを増幅するのに必要なプライマーに対する情報がなく
てもポリメラーゼ酵素連鎖反応(Polymerase Chain Reac
tion)を通じて生物体のデオキシリボ核酸(DNA)を増幅さ
せる方法に対するものである。 【解決手段】本発明の方法を使うと、塩基配列が完全に
明けない生物体の前場DNAをポリメラーゼ酵素連鎖反応
を通じて完全に増幅できる。従って、ほかの試料から発
現されるmRNAの程度を比べて測定できて各々の変異の塩
基配列での突然変異多形性(mutation polymorphism)を
本発明の方法によって容易に分析できる。
択的増幅方法に関するもので、より詳しくは生物体のDN
Aを増幅するのに必要なプライマーに対する情報がなく
てもポリメラーゼ酵素連鎖反応(Polymerase Chain Reac
tion)を通じて生物体のデオキシリボ核酸(DNA)を増幅さ
せる方法に対するものである。 【解決手段】本発明の方法を使うと、塩基配列が完全に
明けない生物体の前場DNAをポリメラーゼ酵素連鎖反応
を通じて完全に増幅できる。従って、ほかの試料から発
現されるmRNAの程度を比べて測定できて各々の変異の塩
基配列での突然変異多形性(mutation polymorphism)を
本発明の方法によって容易に分析できる。
Description
【０００１】
【発明が属する技術分野】本発明は生物体のデオキシリ
ボ核酸(DNA)の選択的増幅方法に関するもので、より詳
しくは生物体のDNAを増幅するのに必要なプライマーに
対する情報がなくてもポリメラーゼ酵素連鎖反応 (Poly
merase Chain Reaction)を通じて生物体のデオキシリボ
核酸(DNA)を増幅させる方法に対するものである。
ボ核酸(DNA)の選択的増幅方法に関するもので、より詳
しくは生物体のDNAを増幅するのに必要なプライマーに
対する情報がなくてもポリメラーゼ酵素連鎖反応 (Poly
merase Chain Reaction)を通じて生物体のデオキシリボ
核酸(DNA)を増幅させる方法に対するものである。
【０００２】
【従来の技術】一つの生物体が持つDNAとこれから転写
されるmRNAは非常に多様で微量であるから、これらの塩
基配列を明けるためには例外的な場合を除いては全部増
幅過程を必要とするようになる。これのために一般的に
二種類の技術が使用される。
されるmRNAは非常に多様で微量であるから、これらの塩
基配列を明けるためには例外的な場合を除いては全部増
幅過程を必要とするようになる。これのために一般的に
二種類の技術が使用される。
【０００３】一番目の方法はDNAを微生物で選択的にク
ローニングをしたり、ライブラリー形態で作って微生物
を多量増殖させた後目的とするDNAを含む微生物で分離
する。
ローニングをしたり、ライブラリー形態で作って微生物
を多量増殖させた後目的とするDNAを含む微生物で分離
する。
【０００４】二番目方法はポリメラーゼ酵素連鎖反応(P
CR)を利用して望むDNA部位だけを選択的に増幅する。し
かし、この方法は望む部位の両末端の一定の長さの塩基
配列をまえもって知っていなければならないという問題
点がある。従って、既に塩基配列が完全に明けられる生
物体がない場合には、生物体が持つ前場のDNAまたは相
補DNAを従来のポリメラーゼ酵素連鎖反応だけを通じて
抜ける部分がなくて完全に増幅することは不可能であ
る。
CR)を利用して望むDNA部位だけを選択的に増幅する。し
かし、この方法は望む部位の両末端の一定の長さの塩基
配列をまえもって知っていなければならないという問題
点がある。従って、既に塩基配列が完全に明けられる生
物体がない場合には、生物体が持つ前場のDNAまたは相
補DNAを従来のポリメラーゼ酵素連鎖反応だけを通じて
抜ける部分がなくて完全に増幅することは不可能であ
る。
【０００５】大規模のDNA塩基配列分析作業を遂行しに
あって、一つの生物体が持つ全体DNAを比較的に均一の
大きさで分割して、これを増幅用運搬体に入れて、増幅
した後塩基配列を分析するようになる。
あって、一つの生物体が持つ全体DNAを比較的に均一の
大きさで分割して、これを増幅用運搬体に入れて、増幅
した後塩基配列を分析するようになる。
【０００６】一般的に、これのために使う従来の技術は
既に塩基配列が明けられるライブラリ(ordered librar
y)を利用する技術である。しかし、この技術は非常に複
雑でむずかしくて、多い時間と費用がかかる問題点によ
って、現在大規模の生物体塩基配列決定作業にあって一
番大きい障害物中の一つである。
既に塩基配列が明けられるライブラリ(ordered librar
y)を利用する技術である。しかし、この技術は非常に複
雑でむずかしくて、多い時間と費用がかかる問題点によ
って、現在大規模の生物体塩基配列決定作業にあって一
番大きい障害物中の一つである。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は増幅しようとするDNAの塩基配列に対する情報が全然
知られない生物体のDNAを抜ける部分を無くし増幅する
方法を提供することである。
は増幅しようとするDNAの塩基配列に対する情報が全然
知られない生物体のDNAを抜ける部分を無くし増幅する
方法を提供することである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明は生物体のデオキ
シリボ核酸(DNA)の選択的増幅方法に関するもので、よ
り詳しくは制限酵素を使ってDNAを単一筋の粘着性末端
を持つ数個の断片で切る段階及びこれとは独立的に、こ
のようなDNA断片の単一筋の粘着性末端と相補的に結合
する単一筋の粘着性末端とへアピンの輪部分で成るアダ
プタを用意する段階;前記のDNA断片と前記へアピン輪構
造を持つアダプタをDNAリガーゼを使って結合させる段
階;
シリボ核酸(DNA)の選択的増幅方法に関するもので、よ
り詳しくは制限酵素を使ってDNAを単一筋の粘着性末端
を持つ数個の断片で切る段階及びこれとは独立的に、こ
のようなDNA断片の単一筋の粘着性末端と相補的に結合
する単一筋の粘着性末端とへアピンの輪部分で成るアダ
プタを用意する段階;前記のDNA断片と前記へアピン輪構
造を持つアダプタをDNAリガーゼを使って結合させる段
階;
【０００９】前記DNAリガーゼによる結合反応に参与し
ないDNA断片及びへアピン輪構造を持つアダプタをエキ
ソヌクレアーゼを使って除く段階;選択的段階として、
アルカリ溶液、RNA分解酵素(RNase)または単一筋選択性
エクソヌクレアーゼを使ってへアピン構造を除く段階;
前記アダプタのへアピン輪部分だけの除去した後に居残
る部位に相補的結合するプライマーを使ってDNA断片を
増幅する段階を含む塩基配列が全然知られないDNA一部
の選択的増幅方法を提供することである。
ないDNA断片及びへアピン輪構造を持つアダプタをエキ
ソヌクレアーゼを使って除く段階;選択的段階として、
アルカリ溶液、RNA分解酵素(RNase)または単一筋選択性
エクソヌクレアーゼを使ってへアピン構造を除く段階;
前記アダプタのへアピン輪部分だけの除去した後に居残
る部位に相補的結合するプライマーを使ってDNA断片を
増幅する段階を含む塩基配列が全然知られないDNA一部
の選択的増幅方法を提供することである。
【００１０】また、本発明の他の目的は、制限酵素を使
ってデオキシリボ核酸(DNA)を単一筋の粘着性末端を持
つ断片で切る段階及びこれとは独立的に、塩基配列を既
に知っている単一筋の粘着性末端を持つへアピン輪構造
のアダプタを製造する段階;
ってデオキシリボ核酸(DNA)を単一筋の粘着性末端を持
つ断片で切る段階及びこれとは独立的に、塩基配列を既
に知っている単一筋の粘着性末端を持つへアピン輪構造
のアダプタを製造する段階;
【００１１】前記DNA断片とへアピン輪構造アダプタをD
NAリガーゼ(ligase)を使って結合させる段階;それか
ら、前記アダプタと結合されるDNA断片 にアルカリ溶
液、RNA分解酵素または単一筋選択性エキソヌクレアー
ゼ(single strand specific exonuclease)を使って、前
記アダプタのへアピン輪部分だけを除く段階を含む塩基
配列が全然知られないDNAから両末端の塩基配列が知ら
れるDNA断片のライブラリーを製造する方法を提供する
ことである。
NAリガーゼ(ligase)を使って結合させる段階;それか
ら、前記アダプタと結合されるDNA断片 にアルカリ溶
液、RNA分解酵素または単一筋選択性エキソヌクレアー
ゼ(single strand specific exonuclease)を使って、前
記アダプタのへアピン輪部分だけを除く段階を含む塩基
配列が全然知られないDNAから両末端の塩基配列が知ら
れるDNA断片のライブラリーを製造する方法を提供する
ことである。
【００１２】また、本発明の他の目的は、4種のヌクレ
オチドの組合によって製造されるすべての種類の単一筋
のDNAから成る単一筋の粘着性末端を持つへアピン輪の
アダプタを含むへアピン輪のアダプタセットを提供する
ことである。
オチドの組合によって製造されるすべての種類の単一筋
のDNAから成る単一筋の粘着性末端を持つへアピン輪の
アダプタを含むへアピン輪のアダプタセットを提供する
ことである。
【００１３】以下本発明の方法、DNA断片、へアピン輪
のアダプタ、制限酵素及びプライマーを図面を通じてよ
り詳しく説明する。以下の図面内容は本発明の一つの例
を説明するためのことであり、本発明の内容が下記の図
面に出たことに限定されない。
のアダプタ、制限酵素及びプライマーを図面を通じてよ
り詳しく説明する。以下の図面内容は本発明の一つの例
を説明するためのことであり、本発明の内容が下記の図
面に出たことに限定されない。
【００１４】図1に示すへアピン輪構造を持つアダプタ
は図3に示した配列に次の方式で分配する。例えば、図3
で7行がCGであり、3列がAGである場合には、単一筋の粘
着性末端部位がCGの配列を持つアダプタと単一筋の粘着
性末端部位がAGの配列を持つアダプタを混合させてお
く。
は図3に示した配列に次の方式で分配する。例えば、図3
で7行がCGであり、3列がAGである場合には、単一筋の粘
着性末端部位がCGの配列を持つアダプタと単一筋の粘着
性末端部位がAGの配列を持つアダプタを混合させてお
く。
【００１５】単一筋の粘着性末端を構成する塩基の個数
が2個である場合には、この時必要な試験管の個数は112
個になる。もし、単一筋の末端部位を構成する塩基の個
数がNなら、へアピン輪のアダプタの種類は(42n-2×4n)
/2種類になる。また、DNA断片の5'、3'の末端とアダプ
タの5'、3'の末端が相補的に結合しなければならない。
が2個である場合には、この時必要な試験管の個数は112
個になる。もし、単一筋の末端部位を構成する塩基の個
数がNなら、へアピン輪のアダプタの種類は(42n-2×4n)
/2種類になる。また、DNA断片の5'、3'の末端とアダプ
タの5'、3'の末端が相補的に結合しなければならない。
【００１６】前述と同様に、各アダプタを試験管に分配
した後、制限酵素で切断されるDNA断片を各試験管に対
して適当な量に混ぜる。その後、ライゲーション反応を
進行させる。ライゲーション反応が終ると、結合反応に
参与しないDNA断片及びアダプタをエキソヌクレアーゼ
を使って除く。この時、末端がへアピン輪の構造を持つ
アダプタがライゲーションされるDNA断片はエキソヌク
レアーゼによって切断されない。
した後、制限酵素で切断されるDNA断片を各試験管に対
して適当な量に混ぜる。その後、ライゲーション反応を
進行させる。ライゲーション反応が終ると、結合反応に
参与しないDNA断片及びアダプタをエキソヌクレアーゼ
を使って除く。この時、末端がへアピン輪の構造を持つ
アダプタがライゲーションされるDNA断片はエキソヌク
レアーゼによって切断されない。
【００１７】アルカリ溶液、RNase、または単一筋の選
択性エキソヌクレアーゼで処理しへアピン輪部位だけを
分解して、一般的な形態の二本鎖のDNA断片を作る。こ
のようにへアピン輪を除いた後、前記二本鎖のDNA断片
に居残るアダプタの一部に相補的結合するプライマーを
使ってポリメラーゼ酵素連鎖反応を遂行する。ポリメラ
ーゼ酵素連鎖反応産物をポリアクリルアミドゲルで電気
泳動するなどの方法で分離して、ゲルの各バンドから得
られるDNAはDNA塩基配列を分析するために使用されるこ
とができる。
択性エキソヌクレアーゼで処理しへアピン輪部位だけを
分解して、一般的な形態の二本鎖のDNA断片を作る。こ
のようにへアピン輪を除いた後、前記二本鎖のDNA断片
に居残るアダプタの一部に相補的結合するプライマーを
使ってポリメラーゼ酵素連鎖反応を遂行する。ポリメラ
ーゼ酵素連鎖反応産物をポリアクリルアミドゲルで電気
泳動するなどの方法で分離して、ゲルの各バンドから得
られるDNAはDNA塩基配列を分析するために使用されるこ
とができる。
【００１８】前記の過程を認識部位が異なる制限酵素を
使って反復的に等しく遂行する。異なる二種類、または
それ以上の制限酵素を使って得られる塩基配列をお互い
に重畳させて、生物体が持つ全体DNAの塩基配列を得る
ことができる。mRNAの場合にも本発明による方法を使っ
て一つの生物体が持つすべての種類のmRNAの塩基配列を
決めることができる。
使って反復的に等しく遂行する。異なる二種類、または
それ以上の制限酵素を使って得られる塩基配列をお互い
に重畳させて、生物体が持つ全体DNAの塩基配列を得る
ことができる。mRNAの場合にも本発明による方法を使っ
て一つの生物体が持つすべての種類のmRNAの塩基配列を
決めることができる。
【００１９】
【発明の実施の形態】以下で本発明を実施例に基づいて
より具体的に説明する。しかし、下記の実施例は本発明
を説明するためのものであって、本発明の権利範囲を本
実施例に限定するものではない。
より具体的に説明する。しかし、下記の実施例は本発明
を説明するためのものであって、本発明の権利範囲を本
実施例に限定するものではない。
【００２０】第１実施例：大腸菌ゲノムの選択的増幅
1)タイプIIsの制限酵素Hpy118IIIを利用する大腸菌ゲノ
ムの制限酵素断片化。観察しようとする大腸菌菌株DH5
αとBL21で全体ゲノムを各分離する。分離される各ゲノ
ム10μgにHpy118III制限酵素30unitを入れて50mM酢酸カ
リウム、20mM Tris-acetate、10mM酢酸マグネシウム、1
mM DTT、pH7.9の緩衝溶液に入れて制限酵素反応を遂行
する。
ムの制限酵素断片化。観察しようとする大腸菌菌株DH5
αとBL21で全体ゲノムを各分離する。分離される各ゲノ
ム10μgにHpy118III制限酵素30unitを入れて50mM酢酸カ
リウム、20mM Tris-acetate、10mM酢酸マグネシウム、1
mM DTT、pH7.9の緩衝溶液に入れて制限酵素反応を遂行
する。
【００２１】2)DNA断片とへアピン輪の構造を持つアダ
プタのライゲーション。1)で得られるDNA断片を Accupr
epTM PCR purification KIT(（株）バイオニア)で精製
して、ここから得られるDNA断片1μgを50mM Tris-HCl、
10mM MgCl2、5mMDTT、2mM ATP、25mg/mL BSAが入る緩衝
溶液で希釈して、ここに9種類の組合のi)へアピンアダ
プタ2μM、ii)へアピンアダプタ2μMを各々付け加えた
後1unitのT4DNAリガーゼを入れて全体体積50μlで選択
的に結合させる。本実施例では図3の行と列の双中AT+G
A、CC+CG、CA+AA、CT+CC、GA+GC、AG+CA、GC+AC、AC+A
T、CG+AGの各9双を利用した。
プタのライゲーション。1)で得られるDNA断片を Accupr
epTM PCR purification KIT(（株）バイオニア)で精製
して、ここから得られるDNA断片1μgを50mM Tris-HCl、
10mM MgCl2、5mMDTT、2mM ATP、25mg/mL BSAが入る緩衝
溶液で希釈して、ここに9種類の組合のi)へアピンアダ
プタ2μM、ii)へアピンアダプタ2μMを各々付け加えた
後1unitのT4DNAリガーゼを入れて全体体積50μlで選択
的に結合させる。本実施例では図3の行と列の双中AT+G
A、CC+CG、CA+AA、CT+CC、GA+GC、AG+CA、GC+AC、AC+A
T、CG+AGの各9双を利用した。
【００２２】3)エキソヌクレアーゼIIIを利用する結合
されないDNAの除去。2)で得られる結合反応物 5μl各々
に500mM Tris-HCl(pH8.0)、50mM MgCl2、100mM 2-Merca
ptoethanolが混合される緩衝溶液に入れて、20unitのエ
キソヌクレアーゼIIIを付け加えた後、全体の体積を30
μlで合わせてから37℃で45分間反応させた。
されないDNAの除去。2)で得られる結合反応物 5μl各々
に500mM Tris-HCl(pH8.0)、50mM MgCl2、100mM 2-Merca
ptoethanolが混合される緩衝溶液に入れて、20unitのエ
キソヌクレアーゼIIIを付け加えた後、全体の体積を30
μlで合わせてから37℃で45分間反応させた。
【００２３】4)ポリメラーゼ酵素連鎖反応を通じる増幅
反応。3)で得られる反応物中3μlを鋳型として図2に示
す行のプライマーと列のプライマー各々1μMと100mM Tr
is-HCl(pH8.3)、400mM KCl、15mM MgCl2、10mM DTT、5u
g/ml acetylated BSA、Taq DNA polymerase 1unitを全
体の体積20μlに入れてから1回の94℃で5分、55℃で35
秒、72℃で2分、30回の94℃で35秒、55℃で35秒、72℃
で2分、1回の94℃で35秒、55℃で35秒72℃に上げて5分
反応で増幅した。
反応。3)で得られる反応物中3μlを鋳型として図2に示
す行のプライマーと列のプライマー各々1μMと100mM Tr
is-HCl(pH8.3)、400mM KCl、15mM MgCl2、10mM DTT、5u
g/ml acetylated BSA、Taq DNA polymerase 1unitを全
体の体積20μlに入れてから1回の94℃で5分、55℃で35
秒、72℃で2分、30回の94℃で35秒、55℃で35秒、72℃
で2分、1回の94℃で35秒、55℃で35秒72℃に上げて5分
反応で増幅した。
【００２４】5)染色方法を利用するポリアクリルアミド
ゲルで試料展開。4)で得られる反応物の中10μlを8Mウ
レアが入る4%ポリアクリルアミドゲルで電気泳動した
後、ゲルを固定液(10%)酢酸が入る溶液で30分間反応さ
せる。その次にイオンを取り除いた蒸留水 てゲルを3
回洗浄する。このようなゲルを1g AgNO 3と1.5mL 37%ホ
ルムアルデヒドが入る1L溶液で30分間染色させる。染色
されたゲルを5秒間イオンを取り除いた蒸留水で洗った
後、4℃に調整した現像液(40g炭酸ナトリウム、1.5mL 3
7% ホルムアルデヒド200μlチオ硫酸ナトリウム (10mg/
mL)が入る1L溶液)で染色した後、また固定液で5分間反
応させて、蒸留水で10分間洗って保管する。
ゲルで試料展開。4)で得られる反応物の中10μlを8Mウ
レアが入る4%ポリアクリルアミドゲルで電気泳動した
後、ゲルを固定液(10%)酢酸が入る溶液で30分間反応さ
せる。その次にイオンを取り除いた蒸留水 てゲルを3
回洗浄する。このようなゲルを1g AgNO 3と1.5mL 37%ホ
ルムアルデヒドが入る1L溶液で30分間染色させる。染色
されたゲルを5秒間イオンを取り除いた蒸留水で洗った
後、4℃に調整した現像液(40g炭酸ナトリウム、1.5mL 3
7% ホルムアルデヒド200μlチオ硫酸ナトリウム (10mg/
mL)が入る1L溶液)で染色した後、また固定液で5分間反
応させて、蒸留水で10分間洗って保管する。
【００２５】その結果を図4に示している。ここでAT+GA
等は 実施例2)で利用されるへアピンアダプタの各々の
組合を意味してDNAバンドの右側の数字は相対的なDNAバ
ンドの大きさであり矢印は二種類の大腸菌で出るDNA断
片の差異である。
等は 実施例2)で利用されるへアピンアダプタの各々の
組合を意味してDNAバンドの右側の数字は相対的なDNAバ
ンドの大きさであり矢印は二種類の大腸菌で出るDNA断
片の差異である。
【００２６】このような実施例の結果を総合すると、平
均的に各々の組合で出るバンドの平均大きさは400bp程
度であり一つの組合から出る平均バンド数は110個くら
いである。120個のすべての反応を遂行する時結論的に
この方法は5.28mega bp程度に展開したから大腸菌の全
体ゲノムの大きさ(4.72mega bp)全部を含むことができ
ると判断される。
均的に各々の組合で出るバンドの平均大きさは400bp程
度であり一つの組合から出る平均バンド数は110個くら
いである。120個のすべての反応を遂行する時結論的に
この方法は5.28mega bp程度に展開したから大腸菌の全
体ゲノムの大きさ(4.72mega bp)全部を含むことができ
ると判断される。
【００２７】また図4で示したように、AA+CT双で11個、
GC+AG双で3個、AC+AT、CG+AG双で各1個の異なるバンド
を確かめたし、E。coli DH5αとE。coli BL21菌株間に
は約5000 bp程度がゲノム上で異なる配列を見られて、
現在本実施例で探されるほかの配列はすべての反応を遂
行すると、約7200 bp程度だから本方法で二種類の異な
る個体のゲノムで異なる部位すべてを探すことができる
。
GC+AG双で3個、AC+AT、CG+AG双で各1個の異なるバンド
を確かめたし、E。coli DH5αとE。coli BL21菌株間に
は約5000 bp程度がゲノム上で異なる配列を見られて、
現在本実施例で探されるほかの配列はすべての反応を遂
行すると、約7200 bp程度だから本方法で二種類の異な
る個体のゲノムで異なる部位すべてを探すことができる
。
【図１】図1は行(a)または列(b)で示す塩基配列を持つ
へアピン構造アダプタの例であり(rNはリボヌクレオチ
ドまたは輪状の構造を形成できるデオキシリボヌクレオ
チドを意味して、残りはDNAを構成する各ヌクレオチド
を意味する。)
へアピン構造アダプタの例であり(rNはリボヌクレオチ
ドまたは輪状の構造を形成できるデオキシリボヌクレオ
チドを意味して、残りはDNAを構成する各ヌクレオチド
を意味する。)
【図２】図2は行(a)または列(b)の試験管に盛られるア
ダプタに使用されるポリメラーゼ酵素連鎖反応及び塩基
配列決定反応用プライマーの塩基配列の例である。
ダプタに使用されるポリメラーゼ酵素連鎖反応及び塩基
配列決定反応用プライマーの塩基配列の例である。
【図３】図3はライゲーション、エキソヌクレアーゼ反
応、RNAまたは輪のDNA分解反応、ポリメラーゼ酵素連鎖
反応に使用される16×16試験管配列の例である(ここ
で、AAなどは各試験管に使用されるへアピン構造のアダ
プタの単一筋の末端部位の2個の塩基配列である)を示
す。
応、RNAまたは輪のDNA分解反応、ポリメラーゼ酵素連鎖
反応に使用される16×16試験管配列の例である(ここ
で、AAなどは各試験管に使用されるへアピン構造のアダ
プタの単一筋の末端部位の2個の塩基配列である)を示
す。
【図４】図4は、電気泳動方法を通じて分離されるDNAの
断片を銀染色方法で現像させて得るDNAのバンドの写真
である(ここで、AT+GA等はヘアピン構造のアダプタの末
端の塩基組合を表して、DNAバンドの右側に表示される
数字はDNAバンドの相対的大きさを表す。それから、矢
印は2種類の大腸菌(E。coli)間に出るDNAの違いを表
す。)
断片を銀染色方法で現像させて得るDNAのバンドの写真
である(ここで、AT+GA等はヘアピン構造のアダプタの末
端の塩基組合を表して、DNAバンドの右側に表示される
数字はDNAバンドの相対的大きさを表す。それから、矢
印は2種類の大腸菌(E。coli)間に出るDNAの違いを表
す。)
【図５】図5は、電気泳動方法を通じて分離されるDNAの
断片を銀染色方法で現像させて得るDNAのバンドの写真
である(ここで、AT+GA等はヘアピン構造のアダプタの末
端の塩基組合を表して、DNAバンドの右側に表示される
数字はDNAバンドの相対的大きさを表す。それから、矢
印は2種類の大腸菌(E。coli)間に出るDNAの違いを表
す。)
断片を銀染色方法で現像させて得るDNAのバンドの写真
である(ここで、AT+GA等はヘアピン構造のアダプタの末
端の塩基組合を表して、DNAバンドの右側に表示される
数字はDNAバンドの相対的大きさを表す。それから、矢
印は2種類の大腸菌(E。coli)間に出るDNAの違いを表
す。)
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(72)発明者 李 周遠
大韓民国大田広域市大徳区文坪洞 49−３
株式会社バイオニア内
(72)発明者 鄭 仁皙
大韓民国大田広域市大徳区文坪洞 49−３
株式会社バイオニア内
(72)発明者 宋 秀男
大韓民国大田広域市大徳区文坪洞 49−３
株式会社バイオニア内
(72)発明者 元 世淵
大韓民国大田広域市大徳区文坪洞 49−３
株式会社バイオニア内
Ｆターム(参考） 4B024 AA20 BA80 CA01 CA11 DA06
HA08 HA09
(54)【発明の名称】 塩基配列が全然知られないデオキシリボ核酸の選択的増幅方法｛ＳｅｌｅｃｔｉｖｅＰｏｌｙｍ
ｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎｏｆＤＮＡｏｆｗｈｉｃｈｂａｓｅｓｅｑｕｅｎｃｅｉ
ｓｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙｕｎｋｎｏｗｎ｝
Claims (12)
- 【請求項1】1)制限酵素を使ってデオキシリボ核酸(DNA)
を単一筋の粘着性末端を持つ断片で切る段階及びこれと
は独立的に、塩基配列 を既に知っている単一筋の粘着
性末端を持つへアピン輪構造のアダ プタを製造する段
階; 2)前記DNA断片とへアピン輪構造のアダプタをDNAリガー
ゼ(ligase) を使って結合させる段階;それから、 3)前記アダプタと結合されるDNA断片にアルカリ溶液、R
NA分解酵素 または単一筋の選択性エキソヌクレアーゼ
(single strand specific exonuclease)を使って、前記
アダプタの へアピン輪部分 だけを除く段階を含む塩基
配列が全然知られないDNAから両末端の塩基配列が知ら
れるDNA断片のライブラリーを製造する方法。 - 【請求項2】4種のヌクレオチドの組合によって製造され
るすべての種類の単一筋のDNAで成られる単一筋の粘着
性末端を持つ へアピン輪アダプタを含むへアピン輪ア
ダプタのセット。 - 【請求項3】1)制限酵素を使ってデオキシリボ核酸(DNA)
を単一筋の粘着性末端を持つ断片で切る段階及びこれと
は独立的に、このように切断されるDNA断片の両末段と
相補的に結合する単一筋の粘着性末端を持つへアピン輪
アダプタを用意する段階; 2)前記DNA断片とへアピン輪構造のアダプタをDNAリガー
ゼ(ligase)を使って結合させる段階; 3)前記DNAリガーゼによる結合反応に参与しないDNA断片
とへアピ ン輪アダプタをエキソヌクレアーゼ(exonucle
ase)を使って除く段階;それから、 4)前記へアピン構造アダプタの一部分に相補的に結合す
るプライマーとDNAポリメラーゼ酵素を使ってDNA断片を
増幅する段階を含む塩基配列が全然知られないDNAの一
部の選択的増幅方法。 - 【請求項4】前記段階2)で製造されるへアピン輪アダプ
タと結合されるDNA断片からへアピン輪部分だけを除く
段階を追加で含むことを特徴とする請求項3記載の塩基
配列が全然知られないDNA一部の選択的増幅方法。 - 【請求項5】前記制限酵素がtypeIIs制限酵素であること
を特徴とする請求項3記載の塩基配列が全然知られないD
NA一部の選択的増幅方法。 - 【請求項6】前記制限酵素がtypeIIip制限酵素であるこ
とを特徴とする請求項3記載の塩基配列が全然知られな
いDNA一部の選択的増幅方法。 - 【請求項7】前記DNAリガーゼがT4DNAリガーゼであるこ
とを特徴とする請求項3記載の塩基配列が全然知られな
いDNA一部の選択的増幅方法。 - 【請求項8】前記段階3)のエキソヌクレアーゼ(exonucle
ase)がエキソヌクレアーゼIIIであることを特徴とする
請求項3記載の塩基配列が全然知られないDNA一部の選択
的増幅方法。 - 【請求項9】 アルカリ溶液を使って前記へアピン輪部分
だけを除くことを特徴とする請求項４記載の塩基配列が
全然知られないDNA一部の選択的増幅方法。 - 【請求項10】RNaseを使って前記へアピン輪部分だけを
除くことを特徴とする請求項４記載の塩基配列が全然知
られないDNA一部の選択的増幅方法。 - 【請求項11】単一筋選択性エキソヌクレアーゼ(single
strand specific exonuclease)を使って除くことを特徴
とする請求項４記載の塩基配列が全然知られないDNA一
部の選択的増幅方法。 - 【請求項12】前記DNAポリメラーゼ酵素がTaqポリメラー
ゼ酵素であることを特徴とする請求項３記載の塩基配列
が全然知られないDNA一部の選択的増幅方法。
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| JP2012223203A (ja) * | 2005-06-06 | 2012-11-15 | ４５４ ライフ サイエンシーズ コーポレイション | 両末端配列決定（ｐａｉｒｅｄｅｎｄｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ） |
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