JP2002535995A

JP2002535995A - 染色体標的部位での二本鎖ｄｎａ切断の誘導を含む遺伝子修復

Info

Publication number: JP2002535995A
Application number: JP2000597445A
Authority: JP
Inventors: シューリカ，アンドレ; マリガン，リチャード，シー．
Original assignee: ザチルドレンズメディカルセンターコーポレイション; ザインスティチュートパスツール
Priority date: 1999-02-03
Filing date: 2000-02-03
Publication date: 2002-10-29
Also published as: WO2000046386A9; US20020107214A1; WO2000046386A2; US20170037434A1; US20100111924A1; US8921332B2; US20040019002A1; CA2361191A1; US20150259655A1; US20070141038A1; WO2000046386A3; US7629326B2; US9458439B2; AU2982900A; EP1147209A2; US20120230971A1

Abstract

(57)【要約】ＳｃｅＩ誘導二本鎖切断により細胞中の遺伝子または他の染色体ＤＮＡを改変、修復、減弱化および不活化する方法が開示される。その必要がある個体の遺伝病を治療または予防する方法もまた開示される。さらに、キメラ制限ヌクレアーゼが開示される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の背景相同組換えは、染色体ＤＮＡ配列を正確に遺伝子改変する方法を提供する。染
色体ＤＮＡ配列の活性を変化させるための小さく精密な変異を導入する可能性に
加えて、このような方法により疾病を生じ得る遺伝子の遺伝的欠陥を修復するこ
とが可能になる。相同組換え媒介性性遺伝子修復が通常、関連する「標的（targ
eting ）または修正」ＤＮＡを取り込んだ細胞のごく僅かな割合でしか達成され
ない点で、残念ながら相同組換えを行う現在の方法は本質的に効率が悪い。例え
ば、培養動物細胞において、通常この様な組換え事象は、目的の標的または修正
ＤＮＡを取り込んだ数万の細胞の内の１個でしか生じない。

【０００２】従って、相同組換え媒介性遺伝子修復による新しい改良された方法を開発する
必要がある。

【０００３】発明の概要本発明は、染色体ＤＮＡ中の特定部位における二本鎖ＤＮＡ切断（cleavage）
の誘導が、その部位で高効率の組換え事象を導く細胞の修復機構を誘導するとい
う、出願人の発見に基づいている。その結果、本発明は、染色体ＤＮＡ中の特定
部位で細胞内二本鎖ＤＮＡ切断を誘導する方法に関する。１つの態様では、細胞
の染色体ＤＮＡ中の目的の部位における二本鎖切断の誘導は、切断部位の周囲の
（surrounding ）領域に相同である標的ＤＮＡ（targeting DNA ）の導入を伴い
、標的ＤＮＡを効率よくその部位へ導入する。第２の態様では、細胞の染色体Ｄ
ＮＡ中の目的の部位における二本鎖切断の誘導により、遺伝子転換（gene conve
rsion ）により目的の部位の周囲の領域に相同な染色体ＤＮＡの目的の部位への
導入が導かれる。

【０００４】本発明は細胞の染色体ＤＮＡの目的の特定配列を修復する方法に関し、その方
法は（ａ）細胞において、目的の部位にて二本鎖切断（break ）を誘導する工程
（ｂ）細胞中に標的ＤＮＡを導入する工程を含み、ここで標的ＤＮＡは（１）
目的の部位の周囲の領域に相同であるＤＮＡ、および（２）標的ＤＮＡと染色体
ＤＮＡとの間の組換えの際に目的の特定配列を修復するＤＮＡを有する。目的の
部位への標的ＤＮＡの導入に適した条件下で標的ＤＮＡが細胞中に導入される。
第２の態様では、細胞の染色体ＤＮＡ中の目的の特定配列を修復する方法は、目
的の部位の周囲の領域に相同である染色体ＤＮＡが目的の部位に導入されるのに
とって、および目的の特定配列の修復にとって適した条件下で、細胞において、
目的の部位にて二本鎖切断を誘導する工程を含む。

【０００５】ある態様では、目的の特定配列は変異である。

【０００６】本発明はまた、細胞の染色体ＤＮＡ中の特定配列を改変する方法に関し、その
方法は（ａ）細胞において、改変対象の特定配列中の目的の部位にて二本鎖切断
を誘導する工程、（ｂ）標的ＤＮＡを細胞中に導入する工程を含み、ここで標的
ＤＮＡは（１）目的の部位の周囲の領域と相同であるＤＮＡ、および（２）標
的ＤＮＡと染色体ＤＮＡの間の組換えの際に特定配列を改変するＤＮＡを有する
。目的の部位への標的ＤＮＡの導入に適した条件下で標的ＤＮＡが細胞中に導入
される。第２の態様では、細胞の染色体ＤＮＡ中の特定配列を改変する方法は、
目的の部位の周囲の領域に相同である染色体ＤＮＡが目的の部位に導入されるの
にとって、および特定配列の改変にとって適した条件下で、細胞において、改変
対象の特定配列中の目的の部位にて二本鎖切断を誘導する方法を含む。

【０００７】本発明はさらに、細胞中の目的の内因性遺伝子を減弱化させる方法に関し、（
ａ）細胞において、目的の内因性遺伝子中の目的の部位で目的の部位に二本鎖切
断を誘導する工程、（ｂ）細胞に標的ＤＮＡを導入する方法を含み、ここで標的
ＤＮＡは（１）目的の部位の周囲の領域に相同であるＤＮＡ、および（２）標
的ＤＮＡと目的の遺伝子との間の組換えの際に目的の遺伝子を減弱化させるＤＮ
Ａを含む。標的ＤＮＡは、目的の部位への標的ＤＮＡの導入に適した条件下で、
細胞に導入される。

【０００８】本発明は、細胞の染色体DNA 中の目的の部位に変異を導入する方法に関し、そ
の方法は（ａ）細胞において、目的の部位にて二本鎖切断を誘導する工程、（ｂ
）標的ＤＮＡを細胞中に導入する工程を含み、ここで標的ＤＮＡは（１）目的の
部位の周囲の領域と相同であるＤＮＡ、および（２）染色体ＤＮＡに導入すべき
変異を含む。標的ＤＮＡは、目的の部位への標的ＤＮＡの導入に適した条件下で
細胞中に導入される。

【０００９】本発明はまた、その必要がある個体の遺伝病を治療または予防する方法に関し
、その方法は（ａ）個体の細胞中において、目的の部位にて二本鎖切断を誘導す
る工程、（ｂ）個体に標的ＤＮＡを導入する工程を含み、ここで標的ＤＮＡは（
１）目的の部位の周囲の領域に相同であるＤＮＡ、および（２）標的ＤＮＡと染
色体ＤＮＡとの間の組換えの際に目的の部位を修復するＤＮＡを含む。目的の部
位への標的ＤＮＡの導入に適した条件下で、標的ＤＮＡが個体に導入される。第
２の態様では、その必要がある個体の遺伝病を治療または予防する方法は、目的
の部位の周囲の領域に相同である染色体ＤＮＡが目的の部位に導入されるのにと
って、および目的の部位の修復にとって適した条件下で、個体の細胞において、
目的の部位にて二本鎖切断を誘導する工程を含む。あるいは、治療対象の個体か
ら細胞が取り出され、本発明の方法で改変され、個体に導入されうる。

【００１０】本発明は、細胞の染色体ＤＮＡ中の遺伝子損傷を補正する方法に関し、その方
法は、目的の部位の周囲の領域に相同な染色体DNA が目的の部位に導入されるの
にとって、および遺伝子損傷の補正にとって適した条件下で、細胞において、遺
伝子損傷の目的の部位にて二本鎖切断を誘導する工程を含む。また、この方法は
、個体中に存在する細胞において、または個体から取り出され、改変され、個体
の戻される細胞（エキソビボ）において行うことができる。

【００１１】目的の部位での二本鎖切断（break ）（切断（cleavage））は、目的の部位を
認識し切断する制限エンドヌクレアーゼまたは化学物質（entity）で行うことが
できる。また、目的の部位における二本鎖切断は、本発明のキメラ制限エンドヌ
クレアーゼで行うこともできる。

【００１２】また、本発明は、ＤＮＡ結合配列とＤＮＡ切断ドメインとを連結して作製され
るキメラ制限エンドヌクレアーゼに関する。ＤＮＡ結合配列には、亜鉛フィンガ
ードメインとメガヌクレアーゼ認識部位が含まれる。ＤＮＡ切断ドメインには制
限エンドヌクレアーゼ切断ドメインが含まれる。本発明のキメラ制限エンドヌク
レアーゼをコードする核酸分子、および本発明の核酸分子を含む宿主細胞も本発
明に含まれる。

【００１３】本発明はさらに、得られた細胞と、個体（例えばヒトまたはその他の哺乳動物
または脊椎動物）の症状または障害の治療または予防等のその使用に関する。例
えば、本明細書記載の方法で細胞を生産し（例えばエキソビボ）、次いで既知の
方法を用いて個体中に導入することができる。あるいは、細胞を個体中（個体か
ら取り出さずに）で改変することもできる。

【００１４】発明の詳細な説明本発明は、二本鎖ＤＮＡ切断を染色体ＤＮＡの特定の部位に誘導することによ
り、細胞修復機構を誘導し、その座位で非常に効率の良い組換えが行われるとい
う出願人の発見に基づいている。相同組換えの頻度が１０００倍に刺激され、本
明細書に記載の方法を用いて特定の遺伝子改変を約１０％（形質移入効率につい
ては不正確）の形質移入細胞に導入することができる。例えば、二本鎖切断の導
入は目的の部位を認識する制限エンドヌクレアーゼで行われる。本発明の一態様
では、二本鎖切断の導入は切断部位の周囲の領域に相同であるＤＮＡ標的セグメ
ントの導入を伴い、その座位へ標的配列を効率よく導入することができる（遺伝
子損傷の修復または染色体ＤＮＡの特定の方法による変更）。本発明の第２の態
様では、目的の部位における二本鎖切断の誘導は、遺伝子転換により遺伝子損傷
を修復するために用いられ、ここで、遺伝子の他のコピー由来の相同な染色体Ｄ
ＮＡが、二本鎖切断が誘導された配列に配列を付加する。この後者のストラテジ
ーにより、欠陥遺伝子の１個のコピーが病気の表現形を生じるか（優性変異の場
合）、または変異が双方の対立遺伝子に、ただし異なる位置で生じる（異型接合
変異の場合）遺伝病の補正が導かれる。ＤＮＡの大きなセグメントがこの方法で
改変されるので、染色体ＤＮＡの大きな欠失でも修復することが可能である。切
断部位の周囲の領域に相同である標的ＤＮＡ（またはＤＮＡの標的セグメント）
は、本明細書では修復マトリックスとも呼ぶ。

【００１５】目的の部位での二本鎖切断（break ）（切断（cleavage））は、目的の部位を
認識し切断する制限エンドヌクレアーゼまたは化学物質（entity）で行うことが
できる。目的の部位を認識し切断する化学物質の例は、例えばデルバン（Ｄｅ
ｒｖａｎ）ら米国特許第４、６６５、１８４号、米国特許第４、９４２、２２７
号、米国特許第４、７９５、７００号および米国特許第５、７８９、１５５号に
記載され、本明細書中に参考資料として含まれる。目的の部位での二本鎖切断は
また、本明細書に記載される通り、本発明のキメラ制限エンドヌクレアーゼでも
行われうる。

【００１６】制限エンドヌクレアーゼ部位を、相同組換えによる遺伝子標的法、または様々
な方法を用いるランダム挿入法により、細胞のゲノムＤＮＡの目的の部位に挿入
することができる。適当な方法には、裸のＤＮＡのミクロ注入法、安定リン酸カ
ルシウム沈殿法、形質移入および組換えレトロウイルスの使用が含まれる。制限
エンドヌクレアーゼ部位の挿入は、目的の場所（座位または部位）に適切なコピ
ー数の制限エンドヌクレアーゼが挿入された細胞の選択により達成されうる。改
変細胞の解析後に弾き出す（pop ）ことができるレポーター遺伝子を用いて選択
を行うことができる。本明細書で用いる「レポーター遺伝子」と言う用語は、β
−ガラクトシダーゼをコードするｌａｃＺ遺伝子等の、その産物が酵素反応生成
物として、例えば比色法で容易に分析できる核酸配列のことである。レポーター
遺伝子が適当なプロモータに作動可能に連結され、細胞のゲノム中への制限エン
ドヌクレアーゼ部位の組み込みの分析にレポーター遺伝子の発現を用いることが
できる。広く用いられているレポーター分子の例には、β−ガラクトシダーゼ、
β−グルクロニダーゼ、β−グルコシダーゼ等の酵素；緑色蛍光タンパク質およ
びホタルルシフェラーゼ等の発光分子；およびＨｉｓ３ｐおよびＵｒａ３ｐ等の
栄養要求性マーカーが含まれる（例えばアウスベル（Ａｕｓｕｂｅｌ、Ｆ．Ｍ）
ら、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌ
ｏｇｙ、第９章、ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、（１９８８）参照）。
細胞標的によっては、細胞は、キメラを産生するための再移植により、動物への
再移植、組織培養またはトランスジェニック動物を作製するために使用されうる
。トランスジェニック動物を生産するため、構築物を含む制限エンドヌクレアー
ゼ部位（例えばＩ−ＳｃｅＩ部位）を受精卵中に注入することができる。

【００１７】制限エンドヌクレアーゼ部位を相同組換えによる標的化で細胞のゲノムDNA の
目的の部位に挿入するために、制限エンドヌクレアーゼ部位が目的のゲノムの細
胞標的と相同であるＤＮＡを有する標的ＤＮＡ分子中に挿入される。好ましくは
、相同ＤＮＡの長さは少なくとも約４〜６ｋｂであり、標的ＤＮＡ構築物の左右
のアームとなりうる。制限エンドヌクレアーゼ部位と、得られた組換え細胞の選
択を可能にする発現カセットが２本の相同アームの間に挿入される。ある特定の
態様では、発現カセットはＰｇｋプロモーターに作動可能に連結された、３’末
端にＳＶ４０ウイルスのポリアデニル化部位を含むネオマイシン耐性遺伝子（ｎ
ｅｏ）である。カセットの選択後切除工程のために、カセットはＰ１ファージの
２個のダイレクトリピートｌｏｘＰ部位に結合している。ジェネチシン耐性クロ
ーン（ジェネチシン耐性はｎｅｏカセットの発現の結果である）の適切な標的化
を、耐性クローンのゲノムＤＮＡ上のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、および
サザンブロット分析により評価することができる。次いで標的細胞をＰ１ファー
ジのＣｒｅタンパク質で処理し、抑制耐性カセットの喪失を誘導する。その結果
、適当な位置に１個のＩ−ＳｃｅＩ部位を有する細胞が得られる。標的細胞は組
換え分子または胚幹細胞（ＥＳＣ）を生産するために用いられる細胞であり、Ｅ
ＳＣを胚盤胞に注入し、里親に胚盤胞を再移植することによりトランスジェニッ
ク動物を生産するために用いられる。これらの動物は、組換えタンパク質生産ま
たは疾病モデルに使用することができる。

【００１８】本発明に用いられる制限エンドヌクレアーゼは、制限エンドヌクレアーゼによ
るＤＮＡ配列の切断により細胞を死滅させない標的ＤＮＡ配列（例えば制限エン
ドヌクレアーゼ部位）を認識することができる。非常に大きなＤＮＡ配列を認識
するメガヌクレアーゼ酵素は、本発明で使用し得る制限エンドヌクレアーゼの一
例である。メガヌクレアーゼ酵素の一例はＩ−ＳｃｅＩであり、マウスまたはヒ
トＤＮＡ中に発現しないようである１８−ｂｐ部位（ＤＮＡ配列）を認識する。
メガヌクレアーゼ酵素の別な例は図５に示される。その他のメガヌクレアーゼ酵
素（天然および合成）も知られており、文献に記載されている。ある特定の態様
では、本発明に用いられる制限エンドヌクレアーゼは少なくとも６．７×１０^-1 ⁰ の切断（break ）（切断（cleavage））の頻度の特異性を有する。本発明で用
いられる制限エンドヌクレアーゼを、制限エンドヌクレアーゼそのものとして、
または制限エンドヌクレアーゼをコードする核酸を含むベクターとして細胞また
は個体中に導入することができる。

【００１９】モデル染色体遺伝子座が作製され、メガヌクレアーゼＩ−ＳｃｅＩの部位が組
換えのための標的領域内に導入され、制限エンドヌクレアーゼをコードするベク
ターの導入による二本鎖ＤＮＡ切断が誘導された。本発明の方法を任意の染色体
ＤＮＡ遺伝子座の操作に応用するために、特定のＤＮＡ結合配列（ある場合には
特定の亜鉛フィンガー結合ドメインの連結で生じる）とＤＮＡ切断ドメインの並
列により生じたキメラ制限エンドヌクレアーゼを切断を、適当な発現構築物、即
ち酵素、または酵素をコードするＲＮＡの導入により、誘導するために用いるこ
とができる。酵素を直接導入する場合は、酵素ドメインをタンパク質の細胞中へ
の侵入を促進する因子、例えば、ｔａｔ、ＨＳＶＶＰ２２または炭疽毒素と組
み合せることができる。Ｉ−ＳｃｅＩ認識部位を認識するドメインおよびＦｏｋ
ｌ酵素由来の切断ドメインを含む機能性キメラ制限エンドヌクレアーゼを作製し
た。別の態様では、特定の染色体部位を認識し、切断しうる化学物質を組換えを
誘導するために使用し得る。

【００２０】本発明は、細胞の染色体ＤＮＡ中の目的の特定配列を修復する方法に関し、そ
の方法は（ａ）細胞において、目的の部位にて二本鎖切断を誘導する工程、（ｂ
）細胞中に標的ＤＮＡを導入する工程を含み、ここで標的ＤＮＡは（１）目的の
部位の周囲の領域と相同であるＤＮＡおよび（２）標的ＤＮＡと染色体ＤＮＡと
の間の組換えの際に目的の特定配列を修復するＤＮＡを有する。標的ＤＮＡは目
的の部位への標的ＤＮＡの導入に適した条件下で細胞中に導入される。第２の態
様では、細胞の染色体ＤＮＡ中の目的の特定配列を修復する方法は、目的の部位
の周囲の領域と相同である染色体ＤＮＡが目的の部位に導入されるのにとって、
および目的の特定配列の修復にとって適した条件下で、細胞において、目的の部
位にて二本鎖切断を誘導する工程を含む。

【００２１】細胞の染色体ＤＮＡ中の目的の特定配列を修復する方法では、特定の態様にお
いて、標的ＤＮＡは（１）目的の特定配列に隣接する染色体ＤＮＡに相同である
ＤＮＡ、ここで相同ＤＮＡは標的ＤＮＡと染色体ＤＮＡとの間の組換えに十分で
ある、および（２）標的ＤＮＡと染色体ＤＮＡの間の組換えの際に目的の特定配
列を修復するＤＮＡを含むように設計される。典型的には、標的ＤＮＡ構築物の
相同ＤＮＡは、目的の特定配列を修復するＤＮＡの各末端に隣接する。即ち、相
同ＤＮＡは標的ＤＮＡ構築物の左右のアームにあり、目的の配列を修復するＤＮ
Ａは２本のアームの間に位置する。

【００２２】特定の態様では、目的の特定配列は変異である。従って、この態様では、本発
明は細胞の染色体ＤＮＡ中の変異を修復する方法に関し、（ａ）細胞において、
目的の部位にて二本鎖切断を誘導する工程、（ｂ）細胞中に標的ＤＮＡを導入す
る工程を含み、標的ＤＮＡは（１）目的の部位の周囲の領域に相同であるＤＮＡ
および（２）標的ＤＮＡと染色体ＤＮＡとの間の組換えの際に変異を修復するＤ
ＮＡを有する。標的ＤＮＡは、目的の部位への標的ＤＮＡの導入に適した条件下
で細胞中に導入される。第２の態様では、細胞の染色体ＤＮＡ中の変異を修復す
る方法は、目的の部位の周囲の領域に相同である染色体ＤＮＡが目的の部位に導
入されるのにとって、および変異の修復にとって適した条件下で、細胞において
、目的の部位にて二本鎖切断を誘導する工程を含む。

【００２３】細胞の染色体ＤＮＡ中の変異を修復する方法では、特定の態様において、標的
ＤＮＡは（１）変異に隣接する染色体ＤＮＡに相同であるＤＮＡ、ここで標的Ｄ
ＮＡと染色体ＤＮＡとの間の組換えに十分であり、および（２）標的ＤＮＡと染
色体ＤＮＡとの間の組換えの際に変異を修復するＤＮＡを含むように設計される
。典型的には、標的ＤＮＡ構築物の相同ＤＮＡは、変異を修復するＤＮＡの各末
端の両側に隣接する。即ち、相同ＤＮＡは標的ＤＮＡ構築物の左右のアームにあ
り、変異を修復するＤＮＡは２本のアームの間に位置する。

【００２４】本明細書で用いる変異とは、１または複数のヌクレオチド置換、欠失または挿
入等の、ヌクレオチド配列におけるヌクレオチドの変化のことである。好ましく
は、変異は点変異である。変異を含む染色体ＤＮＡは、対応する野性型染色体Ｄ
ＮＡの配列と異なる核酸配列を有する。

【００２５】本明細書で用いる目的の特定配列に隣接する染色体ＤＮＡとは、目的の特定配
列の近く、またはそれに続いて存在する染色体ＤＮＡのことである。

【００２６】本発明はまた、細胞の染色体ＤＮＡ中の特定配列（または遺伝子）を改変する
方法に関し、（ａ）細胞において、改変対象の特定配列中の目的の部位にて二本
鎖切断を誘導する工程、（ｂ）細胞に標的ＤＮＡを導入する工程、ここで標的Ｄ
ＮＡは（１）目的の部位の周囲の領域に相同であるＤＮＡ、および（２）標的Ｄ
ＮＢＡと染色体ＤＮＡとの間の組換えの際に特定配列を改変するＤＮＡを含む。
標的ＤＮＡは、目的の部位への標的ＤＮＡの導入に適した条件下で細胞中に導入
される。第２の態様では、細胞の染色体ＤＮＡ中の特定配列を改変する方法は、
目的の部位の周囲の領域と相同である染色体ＤＮＡが目的の部位に導入されるの
にとって、および特定配列の改変にとって適した条件下で、細胞において、改変
対象の目的の部位にて二本鎖切断を誘導する工程を含む。

【００２７】細胞の染色体ＤＮＡ中の特定配列（または遺伝子）を改変する方法では、特定
の態様において、標的ＤＮＡは（１）改変対象の特定配列（または遺伝子）に相
同であるＤＮＡ、ここで相同ＤＮＡは、標的ＤＮＡと染色体ＤＮＡとの間の組換
えに十分である、および（２）標的ＤＮＡと染色体ＤＮＡとの間の組換えの際に
特定配列（または遺伝子）を改変するＤＮＡを含むように設計される。典型的に
は、標的ＤＮＡ構築物の相同ＤＮＡは、特定配列（または遺伝子）を改変するＤ
ＮＡの各末端に隣接する。即ち、相同ＤＮＡは標的ＤＮＡ構築物の左右のアーム
にあり、特定配列（または遺伝子）を改変するＤＮＡは２本のアームの間に位置
する。

【００２８】本発明はさらに、細胞中の目的の内因性遺伝子を減弱化する方法に関し、（
ａ）細胞において、目的の内因性遺伝子中の目的の部位にて二本鎖切断を誘導す
る工程、（ｂ）細胞中に標的ＤＮＡを導入する工程を含み、標的ＤＮＡは（１）
目的の部位の周囲の領域に相同であるＤＮＡ、および（２）標的ＤＮＡと目的の
遺伝子との間の組換えの際に目的の遺伝子を減弱化させるＤＮＡを含む。標的Ｄ
ＮＡは、目的の部位への標的ＤＮＡの導入に適した条件下で導入される。

【００２９】細胞中の目的の内因性遺伝子を減弱化または不活化する方法では、特定の態様
において、標的ＤＮＡは（１）目的の内因性遺伝子の標的部位に相同なＤＮＡ、
ここで相同ＤＮＡは標的ＤＮＡと目的のＤＮＡとの間の組換えに十分である、お
よび（２）標的ＤＮＡと目的のＤＮＡとの間の組換えの際に目的の遺伝子を減弱
化または不活化するＤＮＡを含むように設計される。典型的には、標的ＤＮＡ構
築物の相同ＤＮＡは、目的の遺伝子を減弱化または不活化するＤＮＡの各末端に
位置する。即ち、相同ＤＮＡは標的ＤＮＡ構築物の左右のアームにあり、目的の
遺伝子を減弱化または不活化するＤＮＡは２本のアームの間に位置する。

【００３０】本発明は細胞の染色体ＤＮＡ中の目的の部位に変異を導入する方法に関し、そ
の方法は（ａ）細胞において、目的の部位にて二本鎖切断を誘導する工程、（ｂ
）標的ＤＮＡを細胞中に導入する工程を含み、ここで標的ＤＮＡは（１）目的の
部位の周囲の領域と相同であるＤＮＡおよび（２）目的の部位に導入すべき変異
を含む。標的ＤＮＡは、目的の部位への標的ＤＮＡの導入に適した条件下で細胞
中に導入される（interest）。

【００３１】細胞の染色体中の目的の部位（または遺伝子）に変異を導入する方法では、特
定の態様において、標的ＤＮＡは（１）標的部位（または遺伝子）に相同である
ＤＮＡ、ここで相同ＤＮＡは、標的ＤＮＡと染色体ＤＮＡとの間の組換えに十分
である、および（２）標的ＤＮＡと染色体ＤＮＡの間の組換えの際に染色体ＤＮ
Ａ中に導入される変異を含むように設計される。典型的には、標的ＤＮＡ構築物
の相同ＤＮＡは、変異の各末端の両側に位置する。即ち、相同ＤＮＡは標的ＤＮ
Ａ構築物の左右のアームにあり、染色体ＤＮＡ（即ち標的部位または遺伝子）に
導入すべき変異は２本のアームの間に位置する。

【００３２】本発明はまた、その必要がある個体の遺伝病を治療または予防する方法に関し
、その方法は（ａ）個体の細胞において、目的の部位にて二本鎖切断を誘導する
工程、（ｂ）個体に標的ＤＮＡを導入する工程を含み、ここで標的ＤＮＡは（１
）目的の部位の周囲の領域に相同であるＤＮＡおよび（２）目的の部位を修復す
るＤＮＡを含む。標的ＤＮＡは、目的の部位への標的ＤＮＡの導入に適した条件
下で個体に導入される。第２の態様では、その必要がある個体の遺伝病を治療ま
たは予防する方法は、目的の部位の周囲の領域に相同である染色体ＤＮＡが目的
の部位に導入されるのにとって適した条件下で、個体の細胞において、目的の部
位にて二本鎖切断を誘導する工程を含む。

【００３３】本発明は染色体ＤＮＡ中の遺伝子損傷を補正する方法に関し、その方法は、目
的の部位の周囲の領域に相同である染色体ＤＮＡが目的の部位に導入されるのに
とって適した条件下で、遺伝子損傷中の目的の部位にて二本鎖切断を誘導する工
程を含む。

【００３４】本発明はまた、最適な送達技術を評価するために、制限エンドヌクレアーゼ部
位（例えばＩ−ＳｃｅＩ標的部位）が疾病遺伝子の部位に導入された疾患の動物
モデルの作製に関する。

【００３５】本発明はまた、特定のＤＮＡ結合配列とＤＮＡ切断ドメインの並列により作製
されるキメラ制限エンドヌクレアーゼに関する。これらのキメラ制限エンドヌク
レアーゼは当該分野で知られる方法で作製される。例えば、ＤＮＡ結合配列とＤ
ＮＡ切断ドメインは別々の「構成成分」として製造され、次いで既知の方法を用
いて結合（連結）するか、または単一の連続ユニットとして作製される。例えば
、キメラ制限エンドヌクレアーゼを化学合成または組換えＤＮＡ／ＲＮＡ技術で
製造できる（例えばサムブルックら編集、「分子クローニング（Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ）：実験室マニュアル」第２版、コールドスプリングハ
ーバーユニバーシティプレス（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＵｎｉ
ｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ、ニューヨーク、１９８９年、およびアウスベルら
編集、「分子生物学の現在のプロトコール」ジョンウイリーアンドサンズ社（Ｊ
ｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ）、ニューヨーク、１９９８年参照）。特定
の態様では、疾病対立遺伝子に独特である特定のＤＮＡ配列を認識可能であるキ
メラ制限エンドヌクレアーゼを亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインと制限エンド
ヌクレアーゼ切断ドメインの並列で作製することができる。

【００３６】ＤＮＡ結合配列は亜鉛フィンガー結合ドメインとメガヌクレアーゼ認識部位を
含む。ＤＮＡ切断ドメインは制限エンドヌクレアーゼ切断ドメインを含む。従っ
て、特定の態様では、キメラ制限エンドヌクレアーゼは特定の亜鉛フィンガー結
合ドメインとＤＮＡ切断ドメインとの連結で作製される。他の態様では、キメラ
制限エンドヌクレアーゼはメガヌクレアーゼ認識部位と制限エンドヌクレアーゼ
切断部位との結合で作製される。さらに別な態様では、キメラ制限エンドヌクレ
アーゼはＩ−ＳｃｅＩメガヌクレアーゼ認識部位とＦｏｋＩ切断ドメインの結合
で生成する。

【００３７】本明細書で用いる「目的の部位」、「標的部位」および「特定の部位」という
用語は、二本鎖切断（break ）（切断（clevage ））が誘導され、その遺伝子座
で効率の高い組換えが行われる細胞修復機構が誘導される独立した染色体位置を
意味する。

【００３８】上記の様に細胞または個体中に導入された標的ＤＮＡおよび／または制限エン
ドヌクレアーゼをベクター中に挿入することができる。本明細書で用いる「ベ
クター」という用語は、核酸ベクター、例えばプラスミド等のＤＮＡベクター、
ＲＮＡベクター、ウイルスまたは他の適当なレプリコン（例えばウイルスベクタ
ー）を意味する。

【００３９】ウイルスベクターにはレトロウイルス、アデノウイルス、パルボウイルス（
例えばアデノ随伴ウイルス）、コロナウイルス、オルソミキソウイルス（orthom
yxovirus）等のマイナス鎖ＲＮＡウイルス（例えばインフルエンザウイルス）、
レブドウイルス（例えば恐水病および水疱性口内炎ウイルス）、パラミキソウイ
ルス（paramyxovirus ）（例えば麻疹およびセンダイウイルス）、ピコルナウイ
ルスおよびアルファウイルス等のプラス鎖ＲＮＡウイルス、およびアデノウイル
ス、ヘルペスウイルス（例えば単純疱疹ウイルスタイプ１及びタイプ２、エプス
タインバーウイルス、サイトメガロウイルス）およびポックスウイルス（例えば
ワクチナ、鶏痘ウイルス、カナリア痘瘡ウイルス）をが含まれる。その他のウイ
ルスには例えばノーウオークウイルス、トガウイルス、フラビウイルス、レオウ
イルス、パポバウイルス、ヘパドナウイルスおよび肝炎ウイルスが含まれる。レ
トロウイルスの例にはニワトリ白血症−肉腫（leukosis-sarcoma）ウイルス、哺
乳動物Ｃ型、Ｂ型ウイルス、Ｄ型ウイルス、ＨＴＬＶ−ＢＬＶグループ、レンチ
ウイルス、スプマウイルス（コフィン（Ｃｏｆｆｉｎ）、Ｊ．Ｍ．、Ｒｅｔｒｏ
ｖｉｒｉｄａｅ：ウイルスおよびその複製物、ＦｕｎｄａｍｅｎｔａｌＶｉｒ
ｏｌｏｇｙ、第３版、Ｂ．Ｎ．フィールドら編集、リピンコット−ラーベン（Ｌ
ｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ出版、フィラデルフィア、１９６６年））が含
まれる。他の例にはマウス白血病ウイルス、マウス肉腫ウイルス、マウス乳癌ウ
イルス、ウシ白血病ウイルス、ネコ白血病ウイルス、ネコ肉腫ウイルス、ニワト
リ白血病ウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス、ヒヒ内因性ウイルス、ギボン（
Gibbon）サル（ape ）白血病ウイルス、メーソンファイツァー（Mason Pfizer）
モンキーウイルス、サル免疫不全ウイルス、サル肉腫ウイルス、ラウス肉腫ウイ
ルスおよびレンチウイルスが含まれる。ベクターの他の例は例えばマックベイ（
Ｍｃｖｅｙ）ら、米国特許第５、８０１、０３０号に記載されており、その教示
は本発明に参考資料として含まれる。

【００４０】制限エンドヌクレアーゼをコードする核酸を含むベクターは、少なくとも１個
の発現制御配列に作動可能に連結した制限エンドヌクレアーゼに対するコード配
列の全て、またはその一部を含み、それにより、コード配列は、転写シグナルの
制御下で制限エンドヌクレアーゼを生産または合成することができる。このよう
な発現制御配列にはプロモーター配列、エンハンサーおよび転写結合部位が含ま
れる。プロモーターの選択は、一般に、制限エンドヌクレアーゼを発現するため
の所望のルートに依存する。そのエレメントは天然から単離され、天然の配列か
ら修飾されるか新たに製造される（例えば、当該技術分野で公知の方法による化
学合成または組換えＤＮＡ／ＲＮＡ技術による［例えば、サムブルック（Ｓａｍ
ｂｒｏｏｋ）ら編集、分子クローニング（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ
）、実験室マニュアル、第２版、コールド・スプリング・ハーバー・ユニバーシ
ティ・プレス、ニューヨーク、１９８９年；およびアウスベル（Ａｕｓｕｂｅｌ
）ら編集、分子生物学の現在のプロトコール（ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏ
ｌｓＩｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ）、ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ
＆Ｓｏｎｓ、ニューヨーク、１９９７年］参照）。次いでこのエレメントを単
離し、適合するクローニングまたは制限部位を利用し製造する等の当該技術分野
で公知の方法で融合することができる。

【００４１】同様に、切断部位の周囲の領域に相同である標的ＤＮＡを含むベクターを当該
技術分野で公知の方法で製造し得る。例えば、標的ＤＮＡを有するベクターを化
学合成または組換えＤＮＡ／ＲＮＡ技術で製造できる［例えば、サムブルック（
Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編集、分子クローニング（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎ
ｉｎｇ）、実験室マニュアル、第２版、コールド・スプリング・ハーバー・ユニ
バーシティ・プレス、ニューヨーク、１９８９年；およびアウスベル（Ａｕｓｕ
ｂｅｌ）ら編集、分子生物学の現在のプロトコール（ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔ
ｏｃｏｌｓＩｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ）、ＪｏｈｎＷｉｌ
ｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ニューヨーク、１９９４〜１９９７年）参照］。

【００４２】制限エンドヌクレアーゼをコードする標的ＤＮＡおよび／または核酸を含むベ
クターを様々な方法で細胞中に導入することができる（例えばトランスフォーメ
ーション、トランスフェクション、直接取り込み、噴出性照射（projectile bom
bardment）、リポソームの使用）。細胞をトランスフェクトまたはトランスフォ
ームする好適な方法の例にはリン酸カルシウム沈殿、エェクトロポーレーション
、マイクロインジェクション、感染、リポフェクションおよび直接取り込みが含
まれる。このような方法は例えばサムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編集、分
子クローニング（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ）、実験室マニュアル、
第２版、コールド・スプリング・ハーバー・ユニバーシティ・プレス、ニューヨ
ーク、１９８９年；およびアウスベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら編集、分子生物学の
現在のプロトコール（ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃ
ｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ）、ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ニューヨ
ーク、１９９８年により詳細に記載され、その教示は参照により本明細書に含ま
れる。

【００４３】制限エンドヌクレアーゼをコードする標的ＤＮＡおよび／または核酸を含むベ
クターを、細胞膜リン脂質にベクターを標的化することにより細胞中に導入する
こともできる。例えば、本発明のベクターの標的化は、ベクター分子をすべての
細胞膜リン脂質に対する親和性を有するウイルスタンパク質であるＶＳＶ−Ｇタ
ンパク質と連結して行うことができる。このような構築物を、当業者に公知の方
法で製造することができる。

【００４４】制限エンドヌクレアーゼを、特定の制限エンドヌクレアーゼと細胞型に適した
当該技術分野で公知の方法に従って細胞中へ導入することができる。例えば、制
限エンドヌクレアーゼを直接取り込み、マイクロインジェクション、リン酸カル
シウム沈殿、エレクトロポーレーション、感染およびリポフェクションにより細
胞中に導入することができる。このような方法は例えばサムブルック（Ｓａｍｂ
ｒｏｏｋ）ら編集、分子クローニング（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ）
、実験室マニュアル、第２版、コールド・スプリング・ハーバー・ユニバーシテ
ィ・プレス、ニューヨーク、１９８９年；およびアウスベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）
ら編集、分子生物学の現在のプロトコール（ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌ
ｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ）、ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆
Ｓｏｎｓ、ニューヨーク、１９９８年により詳細に記載されている。その他の
適当な方法も当該技術分野において記載されている。制限エンドヌクレアーゼを
タンパク質取り込み促進因子と結合させ、酵素の細胞中への導入を促進すること
ができる。タンパク質導入の促進因子にはｔａｔ、ＨＳＶＶＰ２２および炭疽
毒素が含まれる。タンパク質とタンパク質取り込み促進因子の結合を、当業者に
周知の方法で行うことができる。タンパク質輸送戦略（例えばＨＳＶＶＰ２２
、炭疽毒素）を本明細書に記載の本発明の方法で評価することができる。

【００４５】細胞中に入ると、制限エンドヌクレアーゼ、および制限エンドヌクレアーゼを
コードする標的ＤＮＡおよび／または核酸を有するベクターは、細胞により細胞
質から核中の作用部位に移行または転座（translocate ）する。

【００４６】本明細書で用いるように、細胞は、バクテリア細胞等の原核細胞、または動物
、植物または酵母細胞等の真核細胞をいう。動物または植物起源の細胞は幹細胞
または体細胞であり得る。適当な動物細胞は例えば、哺乳動物、トリまたは無脊
椎動物起源である。哺乳動物細胞の例にはヒト（ＨｅＬａ細胞等）、ウシ、ヒツ
ジ、ブタ、マウス（胚幹細胞等）、ウサギおよびサル（ＣＯＳＩ細胞等）の細胞
が含まれる。細胞は胚細胞、骨髄幹細胞またはその他の前駆細胞であり得る。細
胞が体細胞である場合、細胞は例えば上皮細胞、繊維芽細胞、平滑筋細胞、血球
（造血細胞、赤血球、Ｔ細胞、Ｂ細胞等を含む）、腫瘍細胞、心筋細胞、マクロ
ファージ、樹状細胞、神経細胞（例えばグリア細胞または星状細胞）または病原
体感染細胞（バクテリア、ウイルス、ウイルソイド、寄生体またはプリオン感染
細胞等）であり得る。

【００４７】細胞は市販品として、または寄託物から、またはバイオプシー等により個体か
ら直接得ることができる。それ自身が戻される個体、または同一もしくは異なっ
た種の他の／異なった個体から使用する細胞を得ることができる。例えば、ブタ
細胞等のヒト以外の細胞を修飾してＤＮＡ構築物を含ませ、ついでそれをヒトに
導入することができる。また、例えば遺伝子治療においてベクターを個体に送達
することが望ましい場合は、細胞を個体から単離する必要はない。

【００４８】本明細書で用いる「個体」という用語には哺乳動物の他、他の動物（例えば鳥
、魚、爬虫類、昆虫）も含まれる。本明細書で用いる「哺乳動物」および「哺乳
類」と言う用語は、単孔類、有袋類および胎盤動物を含む任意の脊椎動物を指し
、乳児に乳を飲ませ、生きた乳児を産むか（真獣類（eutharian ）または胎盤哺
乳動物）、または卵を産む（原獣類（metatharian ）または非胎盤哺乳動物）動
物である。哺乳類種の例にはヒトまたはその他の霊長類（例えば、サル、チンパ
ンジー等）、齧歯類（例えば、ラット、マウス、モルモット等）および反芻動物
（ruminent）（例えば、ウシ、ブタ、ウマ）が含まれる。

【００４９】制限エンドヌクレアーゼ、ならびに切断部位の周囲の領域に相同である標的Ｄ
ＮＡおよび／または制限エンドヌクレアーゼをコードする核酸をを含むベクター
を、当該技術分野で公知の投与経路（例えば非経口、粘膜、経鼻、注射、全身、
移植、腹腔内、経口、皮内、経皮（例えば徐放ポリマー中）、筋肉内、点滴およ
び／またはボーラス注射を含む静脈内、皮下、局所、硬膜外、口腔、直腸、膣等
）を用いて個体中に導入することができる。制限エンドヌクレアーゼとベクター
を、生理食塩水、滅菌水、リンガー液および等張塩化ナトリウム溶液等の薬学的
に許容し得る担体中で投与することが好ましい。投与形態は標的細胞の位置であ
ることが好ましい。

【００５０】個体に投与される本発明の制限エンドヌクレアーゼまたはベクターの、投与回
数を含む用量は、投与形態と経路、受容者の体格、年齢、性別、健康状態、体重
および食事、治療する疾患または障害の性質と症状の程度、平行して行われてい
る治療の種類、治療の頻度および所望の効果等、様々な因子によって変わる。

【００５１】本発明を以下の実施例により説明するが、なんら限定するものではない。

【００５２】実施例実施例１プラスミドの構築ＤＮＡの操作はすべて標準の技術と方法を用いて行った。このような方法は例
えばサムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編集、分子クローニング（Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ）、実験室マニュアル、第２版、コールド・スプリン
グ・ハーバー・ユニバーシティ・プレス、ニューヨーク、１９８９年；およびア
ウスベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら編集、分子生物学の現在のプロトコール（Ｃｕｒ
ｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ）
、ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ニューヨーク、１９９８年に記載され
ている。合成オリゴヌクレオチドはすべて、標準技術を用いて自動装置で合成し
た。

【００５３】５’−ＡＴＴＡＣＣＣＴＧＴＴＡＴＣＣＣＴＡＴＧＣＡＴ−３’（配列番号：
２）と対になったオリゴヌクレオチド５’−ＧＡＴＣＡＴＧＣＡＴＡＧＧＧＡＴ
ＡＡＣＡＧＧＧＴＡＡＴＡＧＣＴ−３’（配列番号：１）をｐＰｙｔｋｎｌｓｌ
ａｃＺプラスミド（ヘンリー（Ｈｅｎｒｙ）ら、Ｃ．Ｒ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．第
３巻、３２２（１２）：１０６１−１０７０、１９９９年）のＢｃｌＩ−Ｓａｃ
Ｉ制限部位間に挿入してｐＰｙｔｋｎＢＷＳａｃＺプラスミドを構築した。Ｂ
ｃｌＩとＳａｃＩ制限部位を挿入すると、ＢｃｌＩとＳａｃＩ制限部位が破壊さ
れ、ＮｓｉＩ制限部位とＩ−ＳｃｅＩ制限部位が挿入された。

【００５４】ｐ−ＳｌａｃＢプラスミドは以下の様に構築された。まず、ｐＰｙｔｋｎｌｓ
ｌａｃＺプラスミドをＳｐｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素で消化し、プラス
ミドからＡＴＧ開始コドンとｎｌｓｌａｃＺ遺伝子のコード領域の５’末端の１
７８ｂｐを含む５７８ｂｐフラグメントを切り出した。ｐＰｙｔｋｎｌｓｌａｃ
ＺプラスミドのＳｐｅＩ−ＨｉｎｄｌＩＩ制限部位の５’延長部をＴ４ＤＮＡ
ポリメラーゼを用いる埋め込み（ｆｉｌｌｉｎｇ−ｉｎ）反応により平滑端に転
換した。次いで平滑端同士を連結し、ｐ−ＳｌａｃＺプラスミドを製造した。ｐ
−ＳｌａｃＺプラスミドをＮｈｅＩおよびＢｇｌＩＩ制限酵素で消化し、プラス
ミドから停止コドンおよびｎｌｓｌａｃＺ遺伝子の３’末端のＳＶ４０ポリアデ
ニル化シグナルを含む０．６ｋｂフラグメントを切り出した。ｐ−ＳｌａｃＺプ
ラスミドのＮｈｅＩ−ＢｇｌＩＩ制限部位の５’延長部を、Ｔ４ＤＮＡポリメ
ラーゼを用いる埋め込み反応により平滑端に転換した。次いで平滑端同士を連結
した。その結果、ＡＴＧ開始コドン、５’末端の１７８ｂｐ、停止コドンおよび
ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルの欠失したｎｌｓｌａｃＺ遺伝子を含むｐ−Ｓ
ｌａｃＢプラスミドが得られた。開始コドンおよびコード領域の５’末端の１７
８ｂｐの欠失の結果、ｎｌｓｌａｃＺ遺伝子発現が不活性化される。

【００５５】ｐ−ＢｌａｃＳプラスミドは以下の様に構築された。まず、ｐＰｙｔｋｎｌｓ
ｌａｃＺプラスミドをプラスミドの脱メチル化後にＳｐｅＩおよびＢｃｌＩ制限
酵素で消化し、プラスミドから１．９ｋｂフラグメントを切り出した。ｐＰｙｔ
ｋｎｌｓｌａｃＺプラスミドのＳｐｅＩ−ＢｃｌＩＩ制限部位の５’延長部をＴ
４ＤＮＡポリメラーゼを用いる埋め込み反応で平滑端に転換した。次いで平滑
端同士を連結してｐ−ＢｌａｃＺプラスミドを製造した。ｐ−ＢｌａｃＺプラス
ミドをＳａｃＩおよびＢｇｌＩＩ制限酵素で消化し、プラスミドから１．５ｋｂ
フラグメントを切り出した。ｐＰｙｔｋｎｌｓｌａｃＺプラスミドのＳａｃＩ−
ＢｇｌＩＩ制限部位の５’延長部をＴ４ＤＮＡポリメラーゼをもちいる埋め込
み反応で平滑端に転換した。次いで平滑端同士を連結した。その結果、ｐＰｙｔ
ｋｎＢＷＳａｃＺプラスミドに含まれるギャップを正確に埋めるｎｌｓｌａｃ
Ｚ遺伝子の０．６ｋｂフラグメントを含むｐ−ＢｌａｃＳプラスミドが得られる
。

【００５６】ｐ−ＢｌａｃＢプラスミドを以下の様に構築した。まず、プラスミドを脱メチ
ル化した後に、ｐＰｙｔｋｎｌｓｌａｃＺプラスミドをＳｐｅＩおよびＢｃｌＩ
制限酵素で消化し、該プラスミドから１．９ｋｂフラグメントを切り出した。ｐ
ＰｙｔｋｎｌｓｌａｃＺプラスミドのＳｐｅＩ−ＢｃｌＩＩ制限部位の５’延長
部を、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを用いる埋め込み反応で平滑端に転換した。次
いで平滑端同士を連結し、ｐ−ＢｌａｃＺプラスミドを作製した。ｐ−Ｂｌａｃ
ＺプラスミドをＮｈｅＩおよびＢｇｌＩＩ制限酵素で消化し、プラスミドから０
．６ｋｂフラグメントを切り出した。ｐＰｙｔｋｎｌｓｌａｃＺプラスミドのＮ
ｈｅＩ−ＢｇｌＩＩ制限部位をＴ４ＤＮＡポリメラーゼを用いる埋め込み反応
で平滑端に転換した。ついで平滑端同士を連結した。ｐ−ＳｌａｃＢプラスミド
が得われる。

【００５７】ｐ−ＳｌａｃＳプラスミドは以下の様に構築された。まず、ｐＰｙｔｋｎｌｓ
ｌａｃＺプラスミドをＳｐｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素で消化し、プラス
ミドからＡＴＧ開始コドンとｎｌｓｌａｃＺ遺伝子のコード領域の５’末端の１
７８ｂｐを含む５７８ｂｐフラグメントを切り出した。ｐＰｙｔｋｎｌｓｌａｃ
ＺプラスミドのＳｐｅＩ−ＨｉｎｄｌＩＩ制限部位の５’延長部をＴ４ＤＮＡ
ポリメラーゼを用いる埋め込み反応により平滑端に転換した。次いで、平滑端同
士を連結した。ｐ−ＢｌａｃＺプラスミドをＳａｃＩおよびＢｇｌＩＩ制限酵素
で消化し、プラスミドから１．５ｋｂのフラグメントを切り出した。ｐ−Ｂｌａ
ｃＺプラスミドのＳａｃＩ−ＢｇｌＩＩ制限部位の５’延長部をＴ４ＤＮＡポ
リメラーゼを用いる埋め込み反応により平滑端に転換した。次いで平滑端同士を
連結した。ｐＰｙｔｋｎＢＷＳａｃＺプラスミドに含まれるギャップを正確に
埋めるｎｌｓｌａｃＺ遺伝子の０．６ｋｂフラグメントを含むｐ−ＳｌａｃＳプ
ラスミドが得られる。

【００５８】本明細書に記載される実験で用いられるプラスミドの直線化フラグメントは、
プラスミドをＳｃａＩ制限酵素で消化し、フラグメントをアガロースゲル電気泳
動で精製して得られた。

【００５９】ｐ−ｌａｃプラスミドを以下の様に構築した。まず、ｐＰｙｔｋｎｌｓｌａｃ
ＺプラスミドをＳｐｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素で消化し、プラスミドか
らＡＴＧ開始コドンとｎｌｓｌａｃＺ遺伝子のコード領域の５’末端の１７８ｂ
ｐを含む５７８ｂｐフラグメントを切り出した。ｐＰｙｔｋｎｌｓｌａｃＺプラ
スミドのＳｐｅＩ−ＨｉｎｄｌＩＩ制限部位の５’延長部をＴ４ＤＮＡポリメ
ラーゼを用いる埋め込み反応で平滑端に転換した。平滑端同士を連結しｐ−ｌａ
ｃＺプラスミドを製造した。ｐ−ｌａｃＺプラスミドをＮｈｅＩおよびＢｇｌＩ
Ｉ制限酵素で消化し、プラスミドから停止コドンとｎｌｓｌａｃＺ遺伝子の３’
末端のＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを含む０．６ｋｂフラグメントを切り出
した。ｐＷｎｌｓｌａｃＺプラスミドのＮｈｅＩ−ＢｇｌＩＩ制限部位の５’延
長部をＴ４ＤＮＡポリメラーゼを用いる埋め込み反応で平滑端に転換し、平滑
端同士を連結した。その結果ｐ−ｌａｃプラスミドが得られるが、ＡＴＧ開始コ
ドン、５’末端の１７８ｂｐ、停止コドンおよびＳＶ４０ポリアデニル化シグナ
ルが欠失したｎｌｓｌａｃＺ遺伝子の５’または３’末端にＩ−ＳｃｅＩ部位が
結合していない。開始コドンおよびコード領域の５’末端の１７８ｂｐが欠失し
ている結果、ｎｌｓｌａｃＺ遺伝子の発現が不活性化される。

【００６０】ｐＣＭＶＩ−ＳｃｅＩ（＋）およびｐＣＭＶＩ−ＳｃｅＩ（−）プラスミ
ドはチャウリカ（Ｃｈｏｕｌｉｋａ）ら、Ｃ．Ｒ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＩＩＩ、
３１７（１１）：１０１３−１０１９、１９９４年に記載されている。

【００６１】ｐＵＳＶｎｅｏプラスミドはチャウリカ（Ｃｈｏｕｌｉｋａ）ら、Ｊ．Ｖｉｒ
ｏｌ．、７０（３）：１７９２−１７９８、１９９６年に記載されている。

【００６２】実施例２細胞株の生産５μｇのｐＰｙｔｋｎＢＷＳａｃＺプラスミドと５μｇのｐＵＳＶｎｅｏプ
ラスミドを、３５ｍｍペトリ皿（ファルコン（Falcon））中でＣａＰＯ₄沈殿法
を用いて５×１０⁴個のＮＩＨ３Ｔ３細胞（アメリカン・タイプ・カルチャー
・コレクション）に共形質移入させた。形質移入の４８時間後、組織培養培地に
６００μｇ／ｍｌのジェネチシン（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ）（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ
ＢＲＬ））を補充した。ジェネチシン耐性クローンの選択中およびサブクロー
ニング中、抗生物質選択性は維持された。２４個のジェネチシン耐性クローンを
単離し、１０％ウシ血清入りのダルベッコ改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で１
５日間、別々に成育させ、ｎｌｓｌａｃＺ遺伝子の有無を評価した。

【００６３】ｎｌｓｌａｃＺ遺伝子の有無を評価するため、ジェネチシン耐性クローンの２
４個の培養物中の細胞からＤＮＡを抽出した。ｎｌｓｌａｃＺ遺伝子のフラグメ
ントを、ハンレイおよびメルリー（Ｔ．Ｈａｎｌｅｙ＆Ｊ．Ｐ．Ｍｅｒｌｉ
ｅ）、バイオフィードバック・イン・バイオテクニックス（ＢｉｏＦｅｅｄｂａ
ｃｋｉｎＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）、第１０巻、第１号、５６ページ記
載のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で増幅した。２４個のクローンのうち２４
個とのｎｌｓｌａｃＺ遺伝子の存在に関して陽性であった。

【００６４】ｎｌｓｌａｃＺ遺伝子の存在に関して陽性である２４個のクローン中の１８個
を突然変異ｎｌｓｌａｃＺ遺伝子の発現について評価した。突然変異ｎｌｓｌａ
ｃＺ遺伝子の発現を評価するため、１８個の対応するジェネチシン耐性クローン
培養物中の細胞からＲＮＡを抽出した。突然変異ｎｌｓｌａｃＺ遺伝子をコード
するＲＮＡを逆転写酵素ポリメラー連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）で増幅した。オリ
ゴヌクレオチドプライマー５’−ＴＡＣＡＣＧＣＧＴＣＧＴＧＡＴＴＡＧＣＧＣ
ＣＧ−３’（配列番号：１）をｌａｃＺ逆転写に使用した。ハンレイおよびメル
リー（Ｔ．Ｈａｎｌｅｙ＆Ｊ．Ｐ．Ｍｅｒｌｉｅ）（１９９１）、バイオフ
ィードバック・イン・バイオテクニックス（ＢｉｏＦｅｅｄｂａｃｋｉｎＢ
ｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）、第１０巻、第１号、５６ページに記載通りにＰＣ
Ｒを行った。１８個のクローン中１１個で陽性反応を示した。

【００６５】これらの１１個のクローンのゲノムＤＮＡのサザンブロット解析を行い、３個
のクローンはｐＰｙｔｋｎｌｓｌａｃＺＤＢｃｌ構築物の３個未満の無傷の（ｉ
ｎｔａｃｔ）コピーを有することが示された。

【００６６】ボンネロット（Ｂｏｎｎｅｒｏｔ）ら、ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏ
ｌｏｇｙ、ＧｕｉｄｅＴｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓＩｎＭｏｕｓｅＤｅ
ｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、アカデミック・プレス（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ）
、４５１〜４６９ページ、１９９３年に記載通り、これらの３個のクローンの組
織化学解析をＸ−Ｇａｌ染色で行った。β−ガラクトシダーゼの発現を示すクロ
ーンはなかった。組み込まれたｐＰｙｔｋｎＢＷＳａｃＺ構築物により発現し
たｍＲＮＡのノーザンブロット解析では、クローン中の１個では発現が示されず
、その他の２個ではクローンのシグナルが示されなかった。ＮＩＨ３Ｔ３Ｇ
ａｐ１とＮＩＨ３Ｔ３Ｇａｐ２の二つの細胞株をギャップ修復の標的として
選択した。

【００６７】実施例３ＮＩＨ３Ｔ３Ｇａｐ１およびＮＩＨ３Ｔ３Ｇａｐ２細胞株
におけるエクスビボ組換えＮＩＨ３Ｔ３Ｇａｐ１およびＮＩＨ３Ｔ３Ｇａｐ２細胞株を用いて３
セットの実験を三回づつ行った。三回の各セットの実験は、表１に示す様なＤＮ
Ａミックスの８種の異なった共形質移入を含む。６０ｍｍペトリ皿（ファルコン
）中でＣａＰＯ₄沈殿法により、形質移入を５×１０⁴個のＮＩＨ３Ｔ３Ｇ
ａｐ１細胞、または５×１０⁴個のＮＩＨ３Ｔ３Ｇａｐ２細胞で行った。

【００６８】

【表１】

【００６９】第２のセットの実験では、形質移入前にプラスミドをＳｃａＩ制限酵素で直線
化した。３セットの実験を各３回ずつＮＩＨ３Ｔ３Ｇａｐ１およびＮＩＨ
３Ｔ３Ｇａｐ２細胞株を用いて行った。３回の各実験セットは表２に示す様に
ＤＮＡミックスの８種の異なった共形質移入を含む。６０ｍｍペトリ皿（ファル
コン）中でＣａＰＯ₄沈殿法により、形質移入を５×１０⁴個のＮＩＨ３Ｔ３
Ｇａｐ１細胞、または５×１０⁴個のＮＩＨ３Ｔ３Ｇａｐ２細胞で行った
。

【００７０】

【表２】

【００７１】９６時間の形質移入後、細胞をＸ−Ｇａｌでβ−ガラクトシダーゼ発現に関し
て染色し、青色コロニーを形成したユニット（ｂｃｆｕ）を計数した。ｂｃｆｕ
の数は各実験でのＤ−ループ補正（ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ）の結果である。結果
を図４に示す。

【００７２】ミックス番号１（ｐＣＭＶＩ−ＳｃｅＩ（＋）、９μｇ；ｐＳｌａｃＢ、１
μｇ）でのＮＩＨ３Ｔ３Ｇａｐ１細胞の形質移入は、ｐＰｙｔｋｎＢＷＳ
ａｃＺ欠失プラスミドのギャップ修復組換え率が高くなると、１２から２８％
（３回の実験で）のβ−ガラクトシダーゼ陽性クローンを与えた。従って、ミッ
クス番号１による１×１０⁵細胞の形質移入後、９６個の個々の細胞が標準法に
よる限界希釈によりクローン化された。細胞を１０％ウシ血清ＤＭＥＭで生育し
、β−ガラクトシダーゼ発現を解析した。８６個のクローン中２個がβ−ガラク
トシダーゼを発現する細胞を示した（クローン１では１０％の発現、クローン２
では４０％の発現）。これらの２個のクローンのサザンブロット解析は、１００
％の細胞で、そのｎｌｓｌａｃＺ遺伝子中に欠失フラグメントを回復していた。
無傷のｎｌｓｌａｃＺ読み取り枠の発現とゲノムの全修復数との間で対応がない
ことは、遺伝子導入の多様性（ｔｒａｎｓｇｅｎｅｖａｒｉｅｇａｔｉｏｎ）
の結果であると思われる。

【００７３】実施例４メガヌクレアーゼ媒介性遺伝子転換細胞株ＮＩＨ３Ｔ３Ｇａｐ１およびＮＩＨ３Ｔ３Ｇａｐ２細胞株を選
択してギャップ修復の標的とした。これらの細胞では、ｌａｃＺ−Ｇａｐ遺伝子
が転写されるが、β−ガラクトシダーゼ発現は検出されない（β−ｇａｌ^-細胞
）。β−ｇａｌ^-細胞はｐｌａｃプラスミドとＩ−ＳｃｅＩエンドヌクレアーゼ
をコードする発現ベクターで形質移入される。Ｉ−ＳｃｅＩエンドヌクレアーゼ
はゲノム標的中に二本鎖切断を誘導し、うしなわれた配列が二本鎖切断ギャップ
修復によりｌａｃＺ遺伝子中に挿入される。その結果、これらの細胞はβ−ガラ
クトシダーゼを発現するｐＰｙｔｋｎｌｓｌａｃＺプラスミドを含む（β−ｇａ
ｌ⁺細胞）。この実験の模式図を図１に示す。

【００７４】実施例５Ｉ−ＳｃｅＩ誘導遺伝子活性化による生体内での遺伝子転換効率の
測定Ｉ−ＳｃｅＩ誘導遺伝子活性化によるインビボ遺伝子転換効率を測定するため
の実験の模式図を図２および３に示す。マウス細胞ゲノム中の低密度リポタンパ
ク質受容体（Ｉｄｌｒ）の２個の対立遺伝子の模式図も図２および３に示す。

【００７５】同じ直接繰り返し配位中のｌｏｘＰ部位により両末端上に隣接している（組換
え細胞を選択可能にするため）Ｐｇｋｎｅｏカセットを有するｎｌｓｌａｃＺ遺
伝子は、相同組換えによりｌｄｌｒ遺伝子のエキソン４中に挿入される。この挿
入により、ｌｄｌｒ遺伝子が不活性化される（野性型の（ｗｔ）と比較し、（−
）の印で示される）。Ｐｇｋｎｅｏカセットは、ネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅ
ｏ）を含む発現カセットであり、Ｐｇｋプロモータに作動可能に連結し、３’末
端にＳＶ４０ポリアデニル化部位を有する。フロックスされた（ｆｌｏｘｅｄ）
ｎｅｏカセットは、Ｃｒｅタンパク質の発現により組換え細胞中に切り出される
。

【００７６】上記の様に、（−）対立遺伝子上のｌｄｌｒ遺伝子の５’末端は相同組換えで
Ｉ−ＳｃｅＩ部位と置換される。この欠失により、ｌｄｌｒ遺伝子のプロモータ
ーおよびエキソン１が失われる。その結果、この対立遺伝子のエキソン４に挿入
されたｌａｃＺ遺伝子が、その発現を活性化するプロモーターが存在しないため
発現しない。従って、β−ガラクトシダーゼ活性がなく、β−ｇａｌ^-細胞とな
る。

【００７７】Ｉ−ＳｃｅＩメガヌクレアーゼによる二本鎖切断のインビボ誘導は、（−）対
立遺伝子のｌｄｌｒプロモーターの代わりに二本鎖切断を誘導する。二本鎖切断
の修復は、野生型（ｗｔ）対立遺伝子を修復マトリックスとして用いる遺伝子転
換により行われる。二本鎖切断ギャップ修復の結果、ｌｄｌｒプロモーターとエ
キソン１が（−）対立遺伝子中に挿入される。従って、ｎｌｓｌａｃＺ遺伝子の
転写と発現が起こり、β−ガラクトシダーゼ陽性細胞（β−ｇａｌ⁺）となる。

【００７８】本明細書に引用した全ての論文、特許、特許出願の教示は、参照によりそのま
ま本明細書に取り込まれる。

【００７９】本発明をその好ましい実施態様に関して示し説明してきたが、形態および詳細
の様々な変更を、添付の請求の範囲に定義される本発明の精神と範囲から逸脱す
ることなく行い得ることは、当業者に理解されるだろう。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１はＩ−ＳｃｅＩで誘導される遺伝子活性化によるインビボ遺伝子転換効率
を測定する実験を説明する模式図である。

【図２】図２はＩ−ＳｃｅＩで誘導される遺伝子活性化によるインビボ遺伝子転換効率
を測定する実験を説明する模式図である。

【図３】図３はメガヌクレアーゼ媒介遺伝子転換実験による遺伝子転換効率の目安（
measure ）を説明する模式図である。

【図４】図４はＩ−ＳｃｅＩが媒介する遺伝子転換実験の結果を示すテーブルである。

【図５】図５はメガヌクレアーゼ酵素の例を示すテーブルである。

【図６】図６はゲノムＤＮＡにＩ−ＳｃｅＩ部位を挿入する方法を説明する模式図であ
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 9/22 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (72)発明者マリガン，リチャード，シー．アメリカ合衆国マサチューセッツ 01773 リンカーン，サンディーポンドロード２Ｆターム(参考） 4B024 AA01 CA03 EA02 HA17 4B050 CC05 LL01 4B065 AA90 AB04 BA02 CA44 4C084 AA13 NA14 ZB21 4C086 AA01 EA16 MA01 MA04 NA14 ZB21

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】（ａ）細胞において、目的の部位にて二本鎖切断を誘導する
工程；および（ｂ）目的の部位への標的ＤＮＡの導入に適切な条件下で細胞に標的ＤＮＡを導
入する工程を含み、該標的ＤＮＡが（１）目的の部位の周囲の領域に相同なＤＮ
Ａおよび（２）該標的ＤＮＡと染色体ＤＮＡとの間の組換えの際に目的の特定配
列を修復するＤＮＡを含有する、細胞の染色体ＤＮＡ中の目的の特定配列の修復方法。
【請求項２】目的の特定配列が変異である、請求項１記載の方法。
【請求項３】（ａ）細胞において、改変対象の特定配列中の目的の部位に
て二本鎖切断を誘導する工程；および（ｂ）目的の部位への標的ＤＮＡの導入に適した条件下で細胞に標的ＤＮＡを導
入する工程を含み、該標的ＤＮＡが（１）目的の部位の周囲の領域に相同なＤＮ
Ａおよび（２）該標的ＤＮＡと染色体ＤＮＡとの間の組換えの際に特定配列を改
変するＤＮＡを含有する、細胞の染色体ＤＮＡ中の特定配列の改変方法。
【請求項４】（ａ）細胞において、目的の内因性遺伝子中の目的部位にて
二本鎖切断を誘導する工程；および（ｂ）目的の部位への標的ＤＮＡの導入に適した条件下で細胞に標的ＤＮＡを導
入する工程を含み、該標的ＤＮＡが（１）目的の部位の周囲の領域に相同なＤＮ
Ａおよび（２）該標的ＤＮＡと目的の遺伝子との間の組換えの際に目的の遺伝子
を減弱化するＤＮＡを含有する、細胞の目的の内因性遺伝子の減弱化方法。
【請求項５】（ａ）細胞において、目的の部位にて二本鎖切断を誘導する
工程；および（ｂ）目的の部位への標的ＤＮＡの導入に適した条件下で細胞に標的ＤＮＡを導
入する工程を含み、該標的ＤＮＡが（１）目的の部位の周囲の領域に相同なＤＮ
Ａおよび（２）目的の部位に導入すべき変異を含有する、細胞の染色体ＤＮＡ中の目的の部位への変異の導入方法。
【請求項６】（ａ）個体の細胞において、目的の部位にて二本鎖切断を誘
導する工程；および（ｂ）目的の部位への標的ＤＮＡの導入に適した条件下で個体に標的ＤＮＡを導
入する工程を含み、該標的ＤＮＡが（１）目的の部位の周囲の領域に相同なＤＮ
Ａおよび（２）標的ＤＮＡと染色体ＤＮＡとの間の組換えの際に目的の遺伝子を
修復するＤＮＡを含有する、その必要がある個体において遺伝病を治療または予防する方法。
【請求項７】目的の部位の周囲の領域に相同な染色体ＤＮＡが目的の部位
に導入されるのにとって、および目的の部位の修復にとって適した条件下で、個
体の細胞において、目的の部位にて二本鎖切断を誘導する工程を含む、その必要
がある個体において遺伝病を治療または予防する方法。
【請求項８】目的の部位の周囲の領域に相同な染色体ＤＮＡが目的の部位
に導入されるのにとって、および遺伝子損傷の補正にとって適した条件下で、細
胞において、遺伝子損傷の目的の部位にて二本鎖切断を誘導する工程を含む、細
胞の染色体ＤＮＡ中の遺伝子損傷の補正方法。
【請求項９】目的の部位の周囲の領域に相同な染色体ＤＮＡが目的の部位
に導入されるのにとって、および特定配列の改変にとって適した条件下で、細胞
において、改変対象の特定配列中の目的の部位にて二本鎖切断を誘導する工程を
含む、細胞の染色体ＤＮＡ中の特定配列の改変方法。
【請求項１０】目的の部位の周辺の領域に相同な染色体ＤＮＡが目的の部
位に導入されるのにとって、および目的の特定配列の修復にとって適した条件下
で、細胞において、目的の部位にて二本鎖切断を誘導する工程を含む、細胞の染
色体ＤＮＡ中の特定配列の修復方法。
【請求項１１】目的の特定配列が変異である、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】ＤＮＡ結合配列およびＤＮＡ切断ドメインを含有してなる
キメラ制限エンドヌクレアーゼ。
【請求項１３】ＤＮＡ結合配列が亜鉛フィンガードメインである、請求項
１２記載のキメラ制限エンドヌクレアーゼ。
【請求項１４】ＤＮＡ結合配列がメガヌクレアーゼ認識部位である、請求
項１２記載のキメラ制限エンドヌクレアーゼ。
【請求項１５】ＤＮＡ切断ドメインが制限エンドヌクレアーゼ切断ドメイ
ンである、請求項１２記載のキメラ制限エンドヌクレアーゼ。
【請求項１６】メガヌクレアーゼ認識部位がＩ−ＳｃｅＩ認識部位であり
、ＤＮＡ切断ドメインがＦｏｋＩ切断ドメインである、請求項１４記載のキメラ
制限エンドヌクレアーゼ。