JP2002535994A

JP2002535994A - 標的ｄｎａのインビボ除去による遺伝子修復

Info

Publication number: JP2002535994A
Application number: JP2000597444A
Authority: JP
Inventors: シューリカ，アンドレ; マリガン，リチャード，シー．
Original assignee: Institut Pasteur
Current assignee: Institut Pasteur
Priority date: 1999-02-03
Filing date: 2000-02-03
Publication date: 2002-10-29
Also published as: EP1151124A1; CA2360878A1; US20120165400A1; US20020110898A1; US20030229039A1; US7960525B2; US7285538B2; WO2000046385A1; AU2982300A; US20090060896A1

Abstract

(57)【要約】ＳＣＥＩ誘導組換えにより、細胞内で遺伝子または他の染色体ＤＮＡを改変、修復、転写減衰および不活化する方法を開示する。その必要がある個体における遺伝病の治療または予防方法も開示する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】関連出願本願は、１９９９年２月３日に出願された米国仮特許出願第６０／１１８，４
７２号の利益を主張し、その全教示を参照により本明細書中に含む。

【０００２】発明の背景相同的組換え、およびより詳細にはＤ−ループ媒介組換えは、正確に染色体Ｄ
ＮＡ配列を遺伝子的に改変（modifying）する方法を提供する。染色体ＤＮＡ配
列の活性を変えるために、わずかで正確な変異を導入できることに加え、このよ
うな方法論は、疾患を引き起こしうる遺伝子欠損を修正することを可能とする。
あいにく、相同的組換えを達成するための現在の方法は、相同的組換えまたはＤ
−ループ組換え媒介遺伝子修復が、通常、関連する「標的または修正」ＤＮＡを
取り込む小集団の細胞においてのみ達成されうるという点で本質的に非効率的で
ある。例えば、培養ホ乳類細胞では、このような組換え事象は、通常関連する標
的または修正ＤＮＡを取り込む細胞一万個のうち一個にしか起こらない。従って
、生化学的選択の使用には、通常、良好に導入ＤＮＡが組換えられた細胞を同定
し、かつ単離することが必要である。

【０００３】従って、新しく、しかも改良された相同的組換えまたはＤ−ループ組換え媒介
遺伝子修復の方法を開発することが必要である。

【０００４】発明の概要本発明は、ベクターを取り込んだ細胞内の該ベクターからの標的または修正Ｄ
ＮＡの除去が、これらの細胞内の相同的組換えおよびＤ−ループ組換え媒介遺伝
子修復の頻度を有意に増大するという、出願人の発見に関する。結果として、出
願人の発明はベクターを取り込んだ細胞内の該ベクターからの標的または修正Ｄ
ＮＡの除去をもたらす方法に関する。本方法は、（ａ）標的ＤＮＡを含んでなる
第１ベクターであって、標的ＤＮＡが染色体標的部位に相同的なＤＮＡを含んで
なり、かつ特異的制限エンドヌクレアーゼ部位により隣接される、第１ベクター
、および（ｂ）制限エンドヌクレアーゼ部位を切断する、制限エンドヌクレアー
ゼをコードする核酸を含んでなる第１ベクターまたは第２（分離）ベクターに存
在するか、または制限エンドヌクレアーゼ自体として導入される、制限エンドヌ
クレアーゼを細胞に導入する工程を含む。一実施態様では、二つのベクター：す
なわち標的ＤＮＡを含んでなり、該標的ＤＮＡが染色体標的部位に相同的なＤＮ
Ａを含んでなり、特異的な制限エンドヌクレアーゼ部位により隣接される、第１
ベクターおよび制限エンドヌクレアーゼをコードする核酸（例えば、ＤＮＡ）を
含んでなる第２ベクターを細胞内に導入する。代替的には、染色体標的部位に相
同的なＤＮＡを含んでなり、かつ特異的制限エンドヌクレアーゼ部位により隣接
される標的ＤＮＡと制限エンドヌクレアーゼ部位を切断する制限エンドヌクレア
ーゼをコードする核酸の両方を含む単一のベクターを細胞に導入する。本明細書
中に記載する実施態様では、制限エンドヌクレアーゼ部位が標的ＤＮＡの両末端
若しくはそのどちらかに、またはその近くに存在する場合は、標的ＤＮＡはその
ような部位により隣接される。つまり、標的ＤＮＡの一端にまたはその近くに制
限エンドヌクレアーゼ部位が１個、または標的ＤＮＡの各末端にもしくはその近
くに一つずつで、２個のこのような部位がありえる。制限エンドヌクレアーゼ部
位は、本方法で用いられる制限エンドヌクレアーゼにより認識（切断）される。
以下に記載するように、本方法で用いられるエンドヌクレアーゼは、それが切断
を行なう細胞の死をもたらさない活性を有するものである。本方法において有用
なエンドヌクレアーゼの一例は、メガヌクレアーゼ酵素である。本方法では、二
つ（またはそれ以上）の異なる制限エンドヌクレアーゼを用いてもよい。

【０００５】本発明は、細胞の染色体ＤＮＡの対象とする特定配列を修復する方法であって
、（ａ）標的ＤＮＡを含んでなるベクターであって、該標的ＤＮＡが１つまたは
複数の制限エンドヌクレアーゼ部位により隣接され、（１）対象の特定配列に隣
接する染色体ＤＮＡに相同的なＤＮＡおよび（２）標的ＤＮＡと染色体ＤＮＡと
の間の組換えの際に対象の特定配列を修復するＤＮＡを含んでなるベクター、な
らびに（ｂ）ベクターに存在する制限エンドヌクレアーゼ部位を切断する制限エ
ンドヌクレアーゼを細胞に導入する工程を含む方法に関する。その二つは、前記
のように同じ若しくは別のベクターにおいて導入され得、または特定の制限エン
ドヌクレアーゼ部位により隣接される標的ＤＮＡを含んでなるベクターとエンド
ヌクレアーゼ自体（ベクター中でない）を導入できる。好ましくは、標的ＤＮＡ
は二つの制限エンドヌクレアーゼ部位により隣接される。典型的には、相同的Ｄ
ＮＡが標的ＤＮＡ構築物の左側および右側にあるように標的ＤＮＡを設計し、対
象の特定配列を修復するＤＮＡを両側の間に挿入する。本方法の別の実施態様で
は、ベクターに存在する制限エンドヌクレアーゼ部位を切断する制限エンドヌク
レアーゼをコードする核酸を含んでなる第２ベクターを細胞に導入することによ
り、制限エンドヌクレアーゼを細胞に導入する。この方法のさらに別の実施態様
では、標的ＤＮＡ、およびベクターに存在する特定部位を切断する制限エンドヌ
クレアーゼをコードする核酸の両者を同じベクターで細胞中に導入する。本明細
書で用いるように、対象の特定配列に隣接する染色体ＤＮＡとは、対象の特定配
列の近辺にまたは隣に存在する染色体ＤＮＡをいう。

【０００６】特定の実施態様では、対象の特定配列は変異である。

【０００７】また本発明は、細胞の染色体ＤＮＡの特定配列（または遺伝子）を改変する方
法であって、（ａ）標的ＤＮＡを含んでなるベクターであって、該標的ＤＮＡが
制限エンドヌクレアーゼ部位により隣接され、かつ（１）改変される特定配列（
または遺伝子）に相同的なＤＮＡおよび（２）標的ＤＮＡと染色体ＤＮＡとの間
の組換えの際に特定配列（または遺伝子）の改変をもたらすＤＮＡを含んでなる
、ベクター、ならびに（ｂ）ベクターに存在する制限エンドヌクレアーゼ部位を
切断する制限エンドヌクレアーゼを細胞に導入する工程を含む方法にも関する。
好ましくは、標的ＤＮＡは二つの制限エンドヌクレアーゼ部位（標的ＤＮＡの各
末端にまたはその近くに一つがある）により隣接される。典型的には、相同的Ｄ
ＮＡが標的ＤＮＡ構築物の左側および右側にあるように標的ＤＮＡを設計し、特
定配列（または遺伝子）の改変をもたらすＤＮＡを両側の間に挿入する。本方法
の別の実施態様では、制限エンドヌクレアーゼをコードする核酸を含んでなる第
２ベクター（ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれか）を細胞に導入することにより、制
限エンドヌクレアーゼを細胞に導入する。この方法のさらに別の実施態様では、
標的ＤＮＡおよび制限エンドヌクレアーゼをコードする核酸の両者を同じベクタ
ーで細胞中に導入する。

【０００８】さらに本発明は、細胞内の対象の内因性遺伝子を転写減衰する方法であって、
（ａ）標的ＤＮＡを含んでなるベクターであって、該標的ＤＮＡが制限エンドヌ
クレアーゼ部位により隣接され、かつ（１）対象の内因性遺伝子の標的部位に相
同的なＤＮＡおよび（２）標的ＤＮＡと対象遺伝子との間の組換えの際に対象遺
伝子を転写減衰するＤＮＡを含んでなる、ベクター、ならびに（ｂ）ベクターに
存在する制限エンドヌクレアーゼ部位を切断する制限エンドヌクレアーゼを細胞
に導入する工程を含む方法に関する。好ましくは、標的ＤＮＡは二つの制限エン
ドヌクレアーゼ部位により隣接される。典型的には、相同的ＤＮＡが標的ＤＮＡ
構築物の左側および右側にあるように標的ＤＮＡを設計し、対象の遺伝子を転写
減衰するＤＮＡは両側の間に位置する。本方法の別の実施態様では、制限エンド
ヌクレアーゼをコードする核酸を含んでなる第２ベクター（ＲＮＡまたはＤＮＡ
のいずれか）を細胞に導入することにより、制限エンドヌクレアーゼを細胞に導
入する。この方法のさらに別の実施態様では、標的ＤＮＡおよび制限エンドヌク
レアーゼをコードする核酸の両者を同じベクターで細胞中に導入する。

【０００９】また本発明は、細胞の染色体ＤＮＡの標的部位に変異を導入する方法であって
、（ａ）標的ＤＮＡを含んでなる第１ベクターであって、該標的ＤＮＡが制限エ
ンドヌクレアーゼ部位により隣接され、かつ（１）標的部位に相同的なＤＮＡお
よび（２）染色体ＤＮＡに導入される変異を含んでなる、ベクター、ならびに（
ｂ）第１ベクターに存在する制限エンドヌクレアーゼ部位を切断する制限エンド
ヌクレアーゼをコードする核酸を含んでなる第２ベクター（ＲＮＡまたはＤＮＡ
）を導入する工程を含む方法にも関する。好ましくは、標的ＤＮＡは二つの制限
エンドヌクレアーゼ部位により隣接される。典型的には、相同的ＤＮＡが標的Ｄ
ＮＡ構築物の左側および右側にあるように標的ＤＮＡを設計し、変異は両側の間
に位置する。本方法の別の実施態様では、制限エンドヌクレアーゼを細胞に直接
導入する。この方法のさらに別の実施態様では、標的ＤＮＡおよび制限エンドヌ
クレアーゼ部位を切断する制限エンドヌクレアーゼをコードする核酸の両者を同
じベクターで細胞中に導入する。

【００１０】また本発明は、タンパク質若しくは他の遺伝子産物の生産のため、または遺伝
子欠損（変異）の結果として生じる個体（例えば、ヒト若しくは他のホ乳類また
は脊椎動物）の状態または疾患の治療または予防のためなどの、得られた細胞お
よびそれらの使用にも関する。例えば、本明細書に記載する方法により細胞を生
産し（例えば、エキソビボ）、次に既知の方法により個体に導入するとよい。代
替的には、細胞を個体内で（個体から除去することなく）改変してもよい。

【００１１】このように、本発明はさらに、治療または予防をする必要がある個体の遺伝病
の治療または予防をする方法に関する。一態様では、本方法は（ａ）標的ＤＮＡ
を含んでなる第１ベクターであって、該標的ＤＮＡが１つまたは複数の制限エン
ドヌクレアーゼ部位により隣接され、かつ（１）対象の特定配列に隣接する染色
体ＤＮＡに相同的なＤＮＡおよび（２）標的ＤＮＡと染色体ＤＮＡとの間の組換
えの際に対象の特定配列を修復するＤＮＡを含んでなる、ベクター、ならびに（
ｂ）第１ベクターに存在する制限エンドヌクレアーゼ部位を切断する制限エンド
ヌクレアーゼをコードする核酸を含んでなる第２ベクター（ＲＮＡまたはＤＮＡ
）を含んでなる細胞を個体に導入することを含んでなる。第２の実施態様では、
本方法は、（ａ）標的ＤＮＡを含んでなるベクターであって、該標的ＤＮＡが制
限エンドヌクレアーゼ部位により隣接され、かつ（１）染色体ＤＮＡに相同的な
ＤＮＡおよび（２）標的ＤＮＡと染色体ＤＮＡとの間の組換えの際に対象の特定
配列を修復するＤＮＡを含んでなる、ベクター、ならびに（ｂ）ベクターに存在
する制限エンドヌクレアーゼ部位を切断する制限エンドヌクレアーゼを含んでな
る細胞を個体に導入する工程を含む。第３の実施態様では、本方法は、（ａ）標
的ＤＮＡであって、該標的ＤＮＡが制限エンドヌクレアーゼ部位により隣接され
、かつ（１）染色体ＤＮＡに相同的なＤＮＡおよび（２）標的ＤＮＡと染色体Ｄ
ＮＡとの間の組換えの際に対象の特定配列を修復するＤＮＡを含んでなる、およ
び（ｂ）プラスミドに存在する制限エンドヌクレアーゼ部位を切断する制限エン
ドヌクレアーゼをコードする核酸を含んでなるベクターを含んでなる細胞を個体
に導入する工程を含む。好ましくは、標的ＤＮＡは二つの制限エンドヌクレアー
ゼ部位により隣接される。典型的には、相同的ＤＮＡが標的ＤＮＡ構築物の左側
および右側にあるように標的ＤＮＡを設計し、対象の特定配列を修復するＤＮＡ
は両側の間に位置する。

【００１２】代替的には、治療または予防をする必要がある個体の遺伝病の治療または予防
をする方法において、制限エンドヌクレアーゼ、並びに標的ＤＮＡおよび／また
は制限エンドヌクレアーゼをコードする核酸を含んでなるベクターを個体に直接
投与してもよい。

【００１３】発明の詳細な説明本発明は、相同的組換えおよびＤ−ループ組換え媒介遺伝子修復の頻度を有意
に増大する一般的に有用な方法の開発に関する。本明細書中に記載する方法を用
いれば、少なくともインビトロで、トランスフェクトした細胞集団の１％以上が
所望とする組換え事象を生ずることを示しうる。これらの発見によれば、相同的
組換えおよび／または遺伝子修復はトランスフェクションの効率（ＤＮＡを取り
込む細胞パーセント）を修正すると、成功したトランスフェクエト細胞が１０％
近く（またはそれより高い）に達する能力を表すようである。

【００１４】本発明は、トランスフェクトした細胞（ベクターを取り込んだ細胞）内の組換
えベクター由来の相同的な標的ＤＮＡ配列を除去することとなる方法の使用に関
する。本方法は、（ａ）標的ＤＮＡを含んでなる第１ベクターであって、該標的
ＤＮＡが特異的制限エンドヌクレアーゼ部位により隣接され、かつ染色体標的部
位に相同的なＤＮＡを含んでなる、ベクター、および（ｂ）制限エンドヌクレア
ーゼをコードする核酸を含んでなる第１ベクターまたは第２ベクターに存在する
制限エンドヌクレアーゼ部位を切断する制限エンドヌクレアーゼを細胞に導入す
る工程を含む。代替的には、標的ＤＮＡおよび制限エンドヌクレアーゼ部位を切
断する制限エンドヌクレアーゼをコードする核酸の両者を含んでなるベクターを
細胞に導入する。また制限エンドヌクレアーゼをコードする核酸を、本明細書で
は制限エンドヌクレアーゼをコードする発現カセットと呼ぶ。また標的ＤＮＡを
、本明細書では修復マトリックスおよび修正ＤＮＡと呼ぶ。

【００１５】本明細書に記載する実施態様では、制限エンドヌクレアーゼ部位が標的ＤＮＡ
の両末端若しくはどちらかに、またはその近くに存在する場合、標的ＤＮＡはそ
のような部位により隣接される。つまり、標的ＤＮＡの一端にまたはその近くに
１つの制限エンドヌクレアーゼ部位がありうるか、または２つのかかる部位が標
的ＤＮＡの各末端にまたはその近くに１つずつありえる。

【００１６】本発明で用いられる制限エンドヌクレアーゼは、制限エンドヌクレアーゼによ
るＤＮＡ配列の切断の際、細胞の死をもたらさない標的ＤＮＡ配列（例えば、制
限エンドヌクレアーゼ部位）を認識する。メガヌクレアーゼ酵素は、非常に大き
なＤＮＡ配列を認識し、本発明に用いることができる制限エンドヌクレアーゼの
一例である。メガヌクレアーゼ酵素の一例は、マウスまたはヒトＤＮＡに現れる
ようではない１８ｂｐ部位（ＤＮＡ配列）を認識するＩ−ＳｃｅＩである。メガ
ヌクレアーゼ酵素の他の例を、図３に示す。他のメガヌクレアーゼ酵素（天然お
よび合成）は当該技術分野で知られ、記載されている。特定の実施態様では、本
発明で用いる制限エンドヌクレアーゼは少なくとも６．７×１０^-10の切断（開
裂）頻度の特異性を有する。

【００１７】慣用の４および６塩基を開裂する制限酵素の細胞内での発現は、酵素に認識さ
れる細胞ＤＮＡ内の多くの制限部位の存在により、染色体ＤＮＡの切断および細
胞死を通常もたらす。従って、このような制限酵素を本発明では用いない。

【００１８】細胞内（おそらく核内）のＤＮＡ直鎖セグメントの除去は、細胞に導入される
、環状ＤＮＡまたは（トランスフェクションの前に）インビトロで直鎖状にされ
るＤＮＡのいずれよりも組換えにとってより効率的に用いることができるＤＮＡ
の型を生成するようである。これは、トランスフェクションされる直鎖ＤＮＡよ
りもエキソヌクレアーゼ分解に対しより耐性のあるＤＮＡの直鎖セグメントの生
成、またはおそらく組換え事象に必須の遺伝子産物との複合体形成がより容易な
鋳型の生成に関しうる。

【００１９】効率の高い相同的組換えおよび遺伝子修復を達成することができれば、現在遺
伝子治療の主な焦点となっているように、遺伝子に機能的遺伝子を付加するとい
うよりは、真の遺伝子修復による遺伝病の治療が可能となる。本明細書に記載す
る方法は、適切な制限エンドヌクレアーゼの一時的発現のみがＤＮＡ直鎖セグメ
ントの「修正」を除去するために必要となるので、現在の遺伝子治療実験に共通
の問題である、インビボでの導入ＤＮＡの長期の発現を必要としない。

【００２０】本発明は、細胞の染色体ＤＮＡにある対象の特定配列を修復する方法であって
、（ａ）標的ＤＮＡを含んでなるベクターであって、該標的ＤＮＡが１つまたは
複数の制限エンドヌクレアーゼ部位により隣接され、かつ（１）対象の特定配列
に隣接する染色体ＤＮＡに相同的なＤＮＡおよび（２）標的ＤＮＡと染色体ＤＮ
Ａとの間の組換えの際に対象の特定配列を修復するＤＮＡを含んでなる、ベクタ
ー、および（ｂ）ベクターに存在する制限エンドヌクレアーゼ部位を切断する制
限エンドヌクレアーゼを細胞に導入する工程を含む方法に関する。好ましくは、
標的ＤＮＡは２つの制限エンドヌクレアーゼ部位（標的ＤＮＡの各末端にまたは
その近くに１つがある）により隣接される。本発明の別の実施態様では、ベクタ
ーに存在する制限エンドヌクレアーゼ部位を切断する制限エンドヌクレアーゼを
コードする核酸を含んでなる第２ベクターを細胞に導入することにより、制限エ
ンドヌクレアーゼを細胞に導入する。この方法のさらに別の実施態様では、標的
ＤＮＡおよび制限エンドヌクレアーゼをコードする核酸の両者を同じベクターで
細胞中に導入する。

【００２１】細胞の染色体ＤＮＡにある対象の特定配列を修復する方法では、相同的組換え
、およびより好ましくはＤ−ループ媒介組換えが標的ＤＮＡと染色体ＤＮＡとの
間で起こるように、および組換えの際に対象の特定配列の修復が起こるように、
標的ＤＮＡを設計する。こうして、特定の実施態様では、（１）対象の特定配列
に隣接する染色体ＤＮＡに相同的なＤＮＡであって、該相同的なＤＮＡは標的Ｄ
ＮＡと染色体ＤＮＡとの間の組換えに充分である、ＤＮＡ、および（２）標的Ｄ
ＮＡと染色体ＤＮＡとの間の組換えの際に対象の特定配列を修復するＤＮＡを含
むように標的ＤＮＡを設計する。典型的には、標的ＤＮＡ構築物の相同的ＤＮＡ
が対象の特定配列を修復するＤＮＡの各末端に隣接する。つまり、相同的ＤＮＡ
が標的ＤＮＡ構築物の左側および右側にあり、対象の配列を修復するＤＮＡは両
側の間に位置する。

【００２２】特定の実施態様では、対象の特定配列は変異である。このように、この実施態
様では、本発明は細胞の染色体ＤＮＡにある変異を修復する方法であって、（ａ
）標的ＤＮＡを含んでなるベクターであって、該標的ＤＮＡが１つまたは複数の
制限エンドヌクレアーゼ部位により隣接され、かつ（１）変異に隣接する染色体
ＤＮＡに相同的なＤＮＡおよび（２）標的ＤＮＡと染色体ＤＮＡとの間の組換え
の際に変異を修復するＤＮＡを含んでなる、ベクター、および（ｂ）ベクターに
存在する制限エンドヌクレアーゼ部位を切断する制限エンドヌクレアーゼを細胞
に導入する工程を含む方法に関する。好ましくは、標的ＤＮＡは２つの制限エン
ドヌクレアーゼ部位（標的ＤＮＡの各末端にまたはその近くに１つがある）によ
り隣接される。本方法の別の実施態様では、ベクターに存在する制限エンドヌク
レアーゼ部位を切断する制限エンドヌクレアーゼをコードする核酸を含んでなる
第２ベクターを細胞に導入することにより、制限エンドヌクレアーゼを細胞に導
入する。この方法のさらに別の実施態様では、標的ＤＮＡおよび制限エンドヌク
レアーゼをコードする核酸の両者を同じベクターで細胞中に導入する。

【００２３】細胞の染色体ＤＮＡにある変異を修復する方法では、相同的組換え、およびよ
り好ましくはＤ−ループ媒介組換えが標的ＤＮＡと染色体ＤＮＡとの間で起こる
ように、および組換えの際に変異の修復が起こるように標的ＤＮＡを設計する。
こうして、特定の実施態様では、（１）変異に隣接する染色体ＤＮＡに相同的な
ＤＮＡであって、該相同的なＤＮＡは標的ＤＮＡと染色体ＤＮＡとの間の組換え
に充分である、ＤＮＡ、および（２）標的ＤＮＡと染色体ＤＮＡとの間の組換え
の際に変異を修復するＤＮＡを含むように標的ＤＮＡを設計する。典型的には、
標的ＤＮＡ構築物の相同的ＤＮＡが変異を修復するＤＮＡの各末端に隣接する。
つまり、相同的ＤＮＡが標的ＤＮＡ構築物の左側および右側にあり、変異を修復
するＤＮＡは両側の間に位置する。

【００２４】本明細書で用いる変異とは、ヌクレオチド配列中の一または複数のヌクレオチ
ドの置換、欠失または挿入といった、ヌクレオチドの変更をいう。好ましくは、
変異は点変異である。変異をかかえる染色体ＤＮＡは、野生型染色体ＤＮＡに対
応する配列とは異なる配列である核酸配列を有する。

【００２５】本明細書で用いる対象の特定配列に隣接する染色体ＤＮＡとは、対象の特定配
列近くにまたはその隣に存在する染色体ＤＮＡをいう。

【００２６】また本発明は、細胞の染色体ＤＮＡにある特定配列（または遺伝子）を改変す
る方法であって、（ａ）標的ＤＮＡを含んでなるベクターであって、該標的ＤＮ
Ａが制限エンドヌクレアーゼ部位により隣接され、かつ（１）改変する特定配列
（または遺伝子）に相同的なＤＮＡおよび（２）標的ＤＮＡと染色体ＤＮＡとの
間の組換えの際に特定配列（または遺伝子）を改変するＤＮＡを含んでなる、ベ
クター、および（ｂ）ベクターに存在する制限エンドヌクレアーゼ部位を切断す
る制限エンドヌクレアーゼを細胞に導入する工程を含む方法に関する。好ましく
は、標的ＤＮＡは２つの制限エンドヌクレアーゼ部位により隣接される。本方法
の別の実施態様では、制限エンドヌクレアーゼをコードする核酸を含んでなる第
２ベクター（ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれか）を細胞に導入することにより、制
限エンドヌクレアーゼを細胞に導入する。この方法のさらに別の実施態様では、
標的ＤＮＡおよび制限エンドヌクレアーゼをコードする核酸の両者を同じベクタ
ーで細胞中に導入する。

【００２７】細胞の染色体ＤＮＡにある特定配列（または遺伝子）を改変する方法では、相
同的組換え、およびより好ましくはＤ−ループ媒介組換えが標的ＤＮＡと染色体
ＤＮＡとの間で起こるように、および組換えの際に配列（または遺伝子）の改変
が起こるように標的ＤＮＡを設計する。こうして、特定の実施態様では、（１）
改変する特定配列（または遺伝子）に相同的なＤＮＡであって、該相同的なＤＮ
Ａは標的ＤＮＡと染色体ＤＮＡとの間の組換えに充分である、ＤＮＡ、および（
２）標的ＤＮＡと染色体ＤＮＡとの間の組換えの際に特定配列（または遺伝子）
を改変するＤＮＡを含むように、標的ＤＮＡを設計する。典型的には、標的ＤＮ
Ａ構築物の相同的ＤＮＡが特定配列（または遺伝子）を改変するＤＮＡの各末端
を隣接する。つまり、相同的ＤＮＡが標的ＤＮＡ構築物の左側および右側にあり
、特定配列（または遺伝子）を改変するＤＮＡは両側の間に位置する。

【００２８】さらに本発明は、細胞内の対象の内因性遺伝子を転写減衰する方法または不活
化する方法であって、（ａ）標的ＤＮＡを含んでなるベクターであって、該標的
ＤＮＡが制限エンドヌクレアーゼ部位により隣接され、かつ（１）対象の内因性
遺伝子の標的部位に相同的なＤＮＡおよび（２）標的ＤＮＡと対象遺伝子との間
の組換えの際に対象遺伝子を転写減衰または不活化するＤＮＡを含んでなるベク
ター、および（ｂ）ベクターに存在する制限エンドヌクレアーゼ部位を切断する
制限エンドヌクレアーゼを細胞に導入する工程を含む方法に関する。好ましくは
、標的ＤＮＡは、前記のように２つの制限エンドヌクレアーゼ部位により隣接さ
れる。本方法の別の実施態様では、制限エンドヌクレアーゼをコードする核酸を
含んでなる第２ベクター（ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれか）を細胞に導入するこ
とにより、制限エンドヌクレアーゼを細胞に導入する。この方法のさらに別の実
施態様では、標的ＤＮＡおよび制限エンドヌクレアーゼをコードする核酸の両者
を同じベクターで細胞中に導入する。

【００２９】細胞の対象の内因性遺伝子を転写減衰する方法または不活化する方法では、相
同的組換え、およびより好ましくはＤ−ループ媒介組換えが標的ＤＮＡと対象の
内因性遺伝子との間で起こるように、および組換えの際に、対象の遺伝子の転写
減衰または不活化が起こるように、標的ＤＮＡを設計する。こうして、特定の実
施態様では、（１）対象の内因性遺伝子の標的部位に相同的なＤＮＡであって、
該相同的なＤＮＡは標的ＤＮＡと対象の遺伝子との間の組換えに充分である、Ｄ
ＮＡ、および（２）標的ＤＮＡと対象の遺伝子との間の組換えの際に対象の遺伝
子を転写減衰または不活化するＤＮＡを含むように、標的ＤＮＡを設計する。典
型的には、標的ＤＮＡ構築物の相同的ＤＮＡが対象の遺伝子を転写減衰または不
活化するＤＮＡの各末端に隣接する。つまり、相同的ＤＮＡが標的ＤＮＡ構築物
の左側および右側にあり、対象の遺伝子を転写減衰または不活化するＤＮＡは両
側の間に位置する。

【００３０】また本発明は、細胞の染色体ＤＮＡの標的部位（または遺伝子）に変異を導入
する方法であって、（ａ）標的ＤＮＡを含んでなる第１ベクターであって、該標
的ＤＮＡが制限エンドヌクレアーゼ部位により隣接され、かつ（１）標的部位（
または遺伝子）に相同的なＤＮＡおよび（２）染色体ＤＮＡに導入する変異を含
んでなる、ベクター、および（ｂ）第１ベクターに存在する制限エンドヌクレア
ーゼ部位を切断する制限エンドヌクレアーゼをコードする核酸を含んでなる第２
ベクター（ＲＮＡまたはＤＮＡ）を細胞に導入する工程を含む方法にも関する。
好ましくは、標的ＤＮＡは２つの制限エンドヌクレアーゼ部位により隣接される
。本方法の別の実施態様では、制限エンドヌクレアーゼを細胞に直接導入する。
この方法のさらに別の実施態様では、標的ＤＮＡおよび制限エンドヌクレアーゼ
部位を切断する制限エンドヌクレアーゼをコードする核酸の両者を同じベクター
で細胞中に導入する。

【００３１】細胞の染色体ＤＮＡの標的部位（または遺伝子）に変異を導入する方法では、
相同的組換え、およびより好ましくはＤ−ループ媒介組換えが標的ＤＮＡと染色
体ＤＮＡとの間で起こるように、および組換えの際に変異が標的部位（または遺
伝子）に導入されるように、標的ＤＮＡを設計する。こうして、特定の実施態様
では、（１）標的部位（または遺伝子）に相同的なＤＮＡであって、該相同的な
ＤＮＡは標的ＤＮＡと染色体ＤＮＡとの間の組換えに充分である、ＤＮＡ、およ
び（２）標的ＤＮＡと染色体ＤＮＡとの間の組換えの際に染色体ＤＮＡに導入さ
れる変異を含むように、標的ＤＮＡを設計する。典型的には、標的ＤＮＡ構築物
の相同的ＤＮＡが変異の各末端に隣接する。つまり、相同的ＤＮＡが標的ＤＮＡ
構築物の左側および右側にあり、染色体ＤＮＡに（すなわち、標的部位または遺
伝子に）導入される変異は両側の間に位置する。

【００３２】さらに本発明は、治療または予防をする必要がある個体の遺伝病を治療または
予防をする方法に関する。本明細書で用いる遺伝病とは、個体の遺伝子における
遺伝的欠陥（変異）の結果として生じる疾患または障害をいう。特定の実施態様
では、遺伝病は個体の遺伝子における点変異の結果として生じる。

【００３３】一実施態様では、治療または予防をする必要がある個体の遺伝病を治療または
予防をする方法は、（ａ）標的ＤＮＡを含んでなる第１ベクターであって、該標
的ＤＮＡが制限エンドヌクレアーゼ部位により隣接され、かつ（１）対象の特定
配列に隣接する染色体ＤＮＡに相同的なＤＮＡおよび（２）標的ＤＮＡと染色体
ＤＮＡとの間の組換えの際に対象の特定配列を修復するＤＮＡを含んでなる、ベ
クター、および（ｂ）第１ベクターに存在する制限エンドヌクレアーゼ部位を切
断する制限エンドヌクレアーゼをコードする核酸を含んでなる第２ベクター（Ｒ
ＮＡまたはＤＮＡ）を含んでなる細胞を個体に導入（投与）する工程を含む。第
２の実施態様では、本方法は、（ａ）標的ＤＮＡを含んでなるベクターであって
、該標的ＤＮＡが制限エンドヌクレアーゼ部位により隣接され、かつ（１）対象
の特定配列に隣接する染色体ＤＮＡに相同的なＤＮＡ、（２）標的ＤＮＡと染色
体ＤＮＡとの間の組換えの際に対象の特定配列を修復するＤＮＡを含んでなる、
ベクター、ならびに（ｂ）ベクターに存在する制限エンドヌクレアーゼ部位を切
断する制限エンドヌクレアーゼを含んでなる細胞を個体に導入する工程を含む。
第３の実施態様では、本方法は、（ａ）標的ＤＮＡであって、該標的ＤＮＡが制
限エンドヌクレアーゼ部位により隣接され、かつ（１）対象の特定配列に隣接す
る染色体ＤＮＡに相同的なＤＮＡおよび（２）標的ＤＮＡと染色体ＤＮＡとの間
の組換えの際に対象の特定配列を修復するＤＮＡを含んでなる、ＤＮＡ、ならび
に（ｂ）プラスミドに存在する制限エンドヌクレアーゼ部位を切断する制限エン
ドヌクレアーゼをコードする核酸を含んでなるベクターを含んでなる細胞を個体
に導入する工程を含む。好ましくは、標的ＤＮＡは２つの制限エンドヌクレアー
ゼ部位により隣接される。典型的には、標的ＤＮＡ構築物の相同的ＤＮＡが対象
の特定配列を修復するＤＮＡの各末端に隣接する。つまり、相同的ＤＮＡが標的
ＤＮＡ構築物の左側および右側にあり、対象の配列を修復するＤＮＡは両側の間
に位置する。

【００３４】代替的には、治療または予防をする必要がある個体の遺伝病の治療または予防
をする方法において、制限エンドヌクレアーゼ、並びに標的ＤＮＡおよび／また
は制限エンドヌクレアーゼをコードする核酸を含んでなるベクターを個体に直接
投与してもよい。投与形態は、好ましくは標的細胞の位置である。一実施態様で
は、本方法は、（ａ）標的ＤＮＡを含んでなる第１ベクターであって、該標的Ｄ
ＮＡが制限エンドヌクレアーゼ部位により隣接され、かつ（１）対象の特定配列
に隣接する染色体ＤＮＡに相同的なＤＮＡおよび（２）標的ＤＮＡと染色体ＤＮ
Ａとの間の組換えの際に対象の特定配列を修復するＤＮＡを含んでなる、ベクタ
ー、ならびに（ｂ）第１ベクターに存在する制限エンドヌクレアーゼ部位を切断
する制限エンドヌクレアーゼをコードする核酸を含んでなる第２ベクター（ＲＮ
ＡまたはＤＮＡ）を個体に導入（投与）する工程を含む。第２の実施態様では、
本方法は、（ａ）標的ＤＮＡを含んでなるベクターであって、該標的ＤＮＡが制
限エンドヌクレアーゼ部位により隣接され、かつ（１）対象の特定配列に隣接す
る染色体ＤＮＡに相同的なＤＮＡおよび（２）標的ＤＮＡと染色体ＤＮＡとの間
の組換えの際に対象の特定配列を修復するＤＮＡを含んでなる、ベクター、なら
びに（ｂ）ベクターに存在する制限エンドヌクレアーゼ部位を切断する制限エン
ドヌクレアーゼを個体に導入する工程を含む。第３の実施態様では、本方法は、
（ａ）標的ＤＮＡであって、該標的ＤＮＡが制限エンドヌクレアーゼ部位により
隣接され、かつ（１）対象の特定配列に隣接する染色体ＤＮＡに相同的なＤＮＡ
、および標的ＤＮＡと染色体ＤＮＡとの間の組換えの際に対象の特定配列を修復
するＤＮＡを含んでなる、ＤＮＡ、ならびに（ｂ）プラスミドに存在する制限エ
ンドヌクレアーゼ部位を切断する制限エンドヌクレアーゼをコードする核酸を含
んでなるベクターを個体に導入する工程を含む。好ましくは、標的ＤＮＡは二つ
の制限エンドヌクレアーゼ部位により隣接される。

【００３５】また本発明は、最適送達技術を評価するために制限エンドヌクレアーゼ部位（
例えば、Ｉ−ＳｃｅＩ標的部位）を疾患遺伝子の部位に導入する疾患の動物モデ
ル生成にも関する。

【００３６】遺伝子改変／修復の効率は、他の遺伝子産物の追加発現により高めることがで
きる。制限エンドヌクレアーゼおよび他の遺伝子産物を、修正ＤＮＡと共に、ま
たはＲＮＡ発現を介して、細胞に直接導入することができる。該アプローチは、
全ての生物に適用しうる。

【００３７】標的ＤＮＡは、当該技術分野で一般に知られる方法に従って製造することがで
きる。例えば、標的ＤＮＡを化学合成または組換えＤＮＡ／ＲＮＡ技術により製
造することができる（例えば、サムブルックら編、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏ
ｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、第２版、ＣｏｌｄＳ
ｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹ
ｏｒｋ（１９８９）；およびアウスベルら編、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏ
ｌｓＩｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ
＆Ｓｏｎｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９９７）を参照のこと）。

【００３８】本明細書で用いる「標的部位」とは、明確な染色体の位置であって、本明細書
に記載する方法に従って染色体ＤＮＡ配列が正確に改変される位置をいう。

【００３９】本明細書で用いる「ベクター」としては、核酸ベクター、例えばプラスミド等
のＤＮＡベクター、ＲＮＡベクター、ウイルスまたは他の適切なレプリコン（例
えば、ウイルスベクター）が挙げられる。

【００４０】ウイルスベクターとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、パルボウイル
ス（例えば、アデノ随伴ウイルス）、コロナウイルス、オルトミクソウイルス（
例えば、インフルエンザウイルス）、ラブドウイルス（例えば、狂犬病および水
疱性口内炎ウイルス）、パラミクソウイルス（例えば、麻疹およびセンダイ）等
のマイナス鎖ＲＮＡウイルス、ピコルメウイルスおよびアルファウイルス等のプ
ラス鎖ＲＮＡウイルス、ならびにアデノウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、
単純疱疹ウイルス１型および２型、エプスタイン−バーウイルス、サイトメガロ
ウイルス）、およびポックスウイルス（例えば、ワクシニア、鶏痘およびカナリ
ア痘）を含む２本鎖ＤＮＡウイルスが挙げられる。他のウイルスとしては、例え
ばノーウォークウイルス、トガウイルス、フラビウイルス、レオウイルス、パポ
ウイルス、ヘパドナウイルス（hepadnavirus）、および肝炎ウイルスが挙げられ
る。レトロウイルスの例としては、トリ白血球性肉腫（avian leukosis-sarcoma
）、ホ乳類Ｃ型、Ｂ型ウイルス、Ｄ型ウイルス、ＨＴＬＶ−ＢＬＶ群、レンチウ
イルス、スプマウイルス（コッフィン・ジェイ・エム、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａ
ｅ：Ｔｈｅｖｉｒｕｓｅｓａｎｄｔｈｅｉｒｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ
，ＩｎＦｕｎｄａｍｅｎｔａｌＶｉｒｏｌｏｇｙ、第３版、ビー・エヌ・
フィールズら編、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−ＲａｖｅｎＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，
Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，１９９６）。他の例としては、マウス白血病ウ
イルス、マウス肉腫ウイルス、マウス乳ガンウイルス、ウシ白血病ウイルス、ネ
コ白血病ウイルス、ネコ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、ヒトＴ細胞白血病
ウイルス、ヒヒ内因性ウイルス、ギボンサル白血病ウイルス、メーソンファイツ
ァーサルウイルス、サル免疫不全ウイルス、サル肉腫ウイルス、ラウス肉腫ウイ
ルスおよびレンチウイルスが挙げられる。他のベクターの例は、例えばマックベ
イら、米国特許第５，８０１，０３０号明細書に記載されており、その教示は参
照により本明細書に取り込まれる。

【００４１】制限エンドヌクレアーゼをコードする核酸を含んでなるベクターは、１つまた
はそれ以上の発現制御配列に作動可能に連結した制限エンドヌクレアーゼのため
のコード配列の全てまたは部分を含み、それによりコード配列は転写シグナルの
制御下で制限エンドヌクレアーゼの産生または合成を可能とする。このような発
現制御配列としては、プロモーター配列、エンハンサーおよび転写結合部位が挙
げられる。プロモーターの選択は、一般に制限エンドヌクレアーゼを発現するた
めの所望とする経路によるであろう。当該技術分野で知られる方法に従って、エ
レメントを自然から単離してもよく、天然の配列から修飾してもよく、または（
例えば、化学合成または組換えＤＮＡ／ＲＮＡ技術によりデノボで製造してもよ
い（例えば、サムブルックら編、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：Ａ
ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、第２版、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａ
ｒｂｏｒＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９８９
）；およびアウスベルら編、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓＩｎＭｏ
ｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，
ＮｅｗＹｏｒｋ（１９９７））。次に、適合性クローニングまたは制限部位を
開発しかつ製造するなど、当該技術分野で知られる方法により、エレメントを単
離し、共に融合してもよい。

【００４２】同様に、制限エンドヌクレアーゼ部位により隣接される標的ＤＮＡを含んでな
るベクターを、当該技術分野で一般に知られる方法に従って製造することができ
る。例えば、制限エンドヌクレアーゼ部位により隣接される標的ＤＮＡを含んで
なるベクターは、化学合成又は組換えＤＮＡ／ＲＮＡ技術により製造することが
できる（例えば、サムブルックら編、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，
ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、第２版、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ
ＨａｒｂｏｒＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１
９８９；及びアウスベルら編、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓＩｎＭ
ｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，
ＮｅｗＹｏｒｋ，１９９４- １９９７）。

【００４３】制限エンドヌクレアーゼ部位により隣接される標的ＤＮＡ及び／又は制限エン
ドヌクレアーゼをコードする核酸を含んでなるベクターは、種々の方法（例えば
、形質転換、トランスフェクション、直接の取り込み、プロジェクタイルボンバ
ードメント、リポソームの使用）により細胞に導入することができる。細胞をト
ランスフェクション又は形質転換する適切な方法の例としては、リン酸カルシウ
ム沈殿、エレクロトポレーション、マイクロインジェクション、感染、リポフェ
クション及び直接の取り込みが挙げられる。このような方法は、例えばサムブル
ックら、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ、第２版、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＵｎｉｖｅｒ
ｓｉｔｙＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９８９）；及びアウスベルら、
ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏ
ｇｙ，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９９８
）に、より詳細に記載されており、その教示は参照により本明細書に取り込まれ
る。

【００４４】また制限エンドヌクレアーゼ部位により隣接される標的ＤＮＡ及び／又は制限
エンドヌクレアーゼをコードする核酸を含んでなるベクターは、細胞膜リン脂質
にベクターを標的することにより細胞に導入することができる。例えば、本発明
のベクターの標的は、全ての細胞膜リン脂質に親和性を有する、ウイルスタンパ
ク質であるＶＳＶ- Ｇタンパク質にベクター分子を連結することにより成し遂げ
ることができる。このような構築物は、当該技術分野の通常の知識を有する者に
よく知られる方法を用いて生産することができる。

【００４５】制限エンドヌクレアーゼは、特定の制限エンドヌクレアーゼ及び細胞型にとっ
て適切であり、当該技術分野で一般に知られる方法に従って細胞に導入すること
ができる。例えば、制限エンドヌクレアーゼは、直接の取り込み、マイクロイン
ジェクション、リン酸カルシウム沈殿、エレクトロポレーション、感染及びリポ
フェクションにより細胞に導入することができる。このような方法は、例えば、
サムブルックら、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔ
ｏｒｙＭａｎｕａｌ、第２版、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＵｎ
ｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９８９）；及びアウス
ベルら、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓＩｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢ
ｉｏｌｏｇｙ，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ（
１９９８）に、より詳細に記載されている。また他の適切な方法も、当該技術分
野で記載されている。制限エンドヌクレアーゼをタンパク質エントリーの促進因
子（ｆａｃｉｌｉｔａｔｏｒ）に結合して細胞への酵素の導入を促進してもよい
。タンパク質エントリーの促進因子の例としては、ｔａｔ、ＨＳＶＶＰ２２及
びアントラックス（ａｎｔｈｒａｘ）毒素が挙げられる。タンパク質のタンパク
質エントリーの促進因子への結合は、当該技術分野における通常の知識を有する
者によく知られる方法を用いて成し遂げることができる。タンパク質送達ストラ
テジー（例えば、ＨＳＶＶＰ２２、アントラックス毒素）は、本明細書に記載
する発明の方法に従って評価するとよい。

【００４６】一旦細胞内に入ると、制限エンドヌクレアーゼ並びに制限エンドヌクレアーゼ
部位により隣接される標的ＤＮＡ及び／又は制限エンドヌクレアーゼをコードす
る核酸を含んでなるベクターは、細胞によって細胞質から核内の作用部位へ取り
込まれ又は輸送される。

【００４７】本明細書で用いる細胞とは、細菌細胞等の原核細胞、動物、植物又は酵母細胞
等の真核細胞をいう。動物又は植物起源の細胞は、幹細胞又は体細胞であるとよ
い。適切な動物細胞は、例えばホ乳類、トリ又は無脊椎動物起源であるとよい。
ホ乳類細胞の例としては、ヒト（ＨｅＬａ細胞等）、ウシ、ヒツジ、ブタ、ネズ
ミ（胚幹細胞等）、ウサギ及びサル（ＣＯＳ１細胞等）細胞が挙げられる。細胞
は、胚細胞、骨髄幹細胞又は他の始原細胞であってもよい。細胞が体細胞である
場合は、細胞は、例えば上皮細胞、線維芽細胞、平滑筋細胞、血液細胞（造血細
胞、赤血球、Ｔ細胞、Ｂ細胞等）、腫瘍細胞、心筋細胞、マクロファージ、樹状
細胞、神経細胞（例えば、膠細胞又は星状細胞）又は病原感染細胞（例えば、細
菌、ウイルス、ウイルソイド、寄生体又はプリオンにより感染されたもの）であ
ればよい。

【００４８】細胞は、商業的に若しくは寄託機関から入手できる細胞又は生検等個体から直
接得られる細胞であればよい。用いる細胞は、それらを戻す個体から又は同じも
しくは異なる種の別の／異なる個体から得ることができる。例えば、ブタ細胞等
のヒト以外の細胞を改変してＤＮＡ構築物を含ませ、その後ヒトに導入すること
ができる。このような処理手順を、ときにエクソビボ処理という。エクソビボ治
療は、例えばカシドら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ８７：４７３（１９９０）；ローセンベルクら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．
Ｍｅｄ．、３２３：５７０（１９９０）；ウィリアムズら、Ｎａｔｕｒｅ、３１
０：４７６（１９８４）；ディックら、Ｃｅｌｌ、４２：７１（１９８５）；ケ
ラーら、Ｎａｔｕｒｅ、３１８：１４９（１９８５）；及びアンダーソンら、米
国特許第５，３９９，３４６号明細書に記載されている。代替的には、例えば遺
伝子治療においてベクターを個体に送達することを所望とする場合には、細胞を
個体から単離する必要はない。

【００４９】本明細書で用いる用語「個体」としては、ホ乳類、ならびに他の動物（例えば
、トリ、サカナ、ハ虫類、昆虫）も挙げられる。本明細書で用いる用語「ホ乳類
」及び「ホ乳類の」とは、その子供に授乳し、生体として誕生するか（真獣類又
は胎盤性ホ乳類）又は卵孵化する（有袋類又は非胎盤性ホ乳類）単孔類、有袋類
及び胎盤性等のいずれの脊椎動物をもいう。ホ乳類性の種の例としては、ヒト及
び他の霊長類（例えば、サル、チンパンジー）、げっ歯類（例えば、ラット、マ
ウス、モルモット）並びに反芻動物（例えば、ウシ、ブタ、ウマ）が挙げられる
。

【００５０】制限エンドヌクレアーゼ並びに制限エンドヌクレアーゼ部位により隣接される
標的ＤＮＡ及び／又は制限エンドヌクレアーゼをコードする核酸を含んでなるベ
クターは、当該技術分野で一般に知られる投与経路（例えば、非経口、粘膜、鼻
、注射、全身、移植、腹腔内、経口、皮内、経皮（例えば、徐放性ポリマーにお
いて）、筋肉内、点滴及び／又は巨丸注射等の静脈内、皮下、局所、硬膜外、頬
内、直腸内、膣内等）を用いて個体に導入することができる。制限エンドヌクレ
アーゼ及びベクターは、好ましくは食塩水、水、リンガー溶液及び塩化ナトリウ
ム等張溶液等の薬学的に許容しうる担体において投与することができる。投与形
態は、好ましくは標的細胞の位置である。

【００５１】投与頻度を含む、個体へ投与する本発明の制限エンドヌクレアーゼ又はベクタ
ーの投与量は、投与形態及び経路；患者の大きさ、年齢、性別、健康状態、体重
及び食事；治療する疾患又は障害の症状の性質及び範囲；併用治療の種類、治療
の頻度並びに所望とする効果といった種々の因子により変わるであろう。

【００５２】ここで本発明を以下の実施例により説明するが、これらはいかなる限定をも意
図しない。

【００５３】実施例実施例１プラスミド構築全てのＤＮＡ操作は標準の技術及び方法を用いた。そのような方法は、例えば
Ｓａｍｂｒｏｏｋら，分子クローニング；ラボラトリーマニュアル、第２版、Ｃ
ｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ，ニ
ューヨーク（１９８９）；及びＡｕｓｕｂｅｌら、分子生物学の現在のプロトコ
ル、ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ニューヨーク（１９９８）に記載さ
れる。全ての合成オリゴヌクレオチドは標準的な技術を用いて自動装置で合成さ
れた。

【００５４】ｐ２Ｗｌａｃプラスミドは次の通り構築した：最初に、ｐＰｙｔｋｎｌｓｌａ
ｃＺプラスミド（Ｈｅｎｒｙら、Ｃ．Ｒ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＩＩＩ，３２２
（１２）：１０６１−１０７０（１９９９））はＳｐｅＩとＨｉｎｄＩＩＩ制限
酵素で消化し、ｎｌｓｌａｃＺ遺伝子のコード領域の５’末端でＡＴＧ開始コド
ンと１７８ｂｐを含む５７８ｂｐフラグメントの該プラスミドからの削除を行っ
た。第２に、オリゴヌクレオチド５’−ＣＴＡＧＡＴＧＣＡＴＡＧＧＧＡＴＡＡＣＡＧＧＧＴＡＡＴ−３’（配列
番号：１）、と対をなす５’−ＡＧＣＴＡＴＴＡＣＣＣＴＧＴＴＡＴＣＣＣＴＡＴＧＣＡＴ−３’（配列
番号：２）は、ｐＷｎｌｓｌａｃＺプラスミドを生産するためｐＰｙｔｋｎｌｓ
ｌａｃＺプラスミド（Ｈｅｎｒｙら、Ｃ．Ｒ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＩＩＩ，３２
２（１２）：１０６１−１０７０（１９９９））のＳｐｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ制
限部位に挿入した。ＳｐｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位での該オリゴヌクレオチ
ドの挿入は、ＳｐｅＩとＨｉｎｄＩＩＩ制限部位の破壊およびＮｓｉＩ制限部位
とＩ−ＳｃｅＩ制限部位の挿入に帰着した。ｐＷｎｌｓｌａｃＺプラスミドをＮ
ｈｅＩとＢｇｌＩＩ制限酵素で消化し、ｎｌｓｌａｃＺ遺伝子の３’末端で停止
コドンとＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを含む０．６ｋｂフラグメントのプラ
スミドからの削除を行った。オリゴヌクレオチド５’−ＧＡＴＣＡＴＧＣＡＴＡＧＧＧＡＴＡＡＣＡＧＧＧＴＡＡＴ−３’（配列
番号：３）、と対をなす５’−ＣＴＡＧＡＴＴＡＣＣＣＴＧＴＴＡＴＣＣＣＴＡＴＧＣＡＴ−３’（配列
番号：４）を、ｐＷｎｌｓｌａｃＺプラスミドのＮｈｅＩ−ＢｇｌＩＩ制限部位
に挿入した。ＮｈｅＩ−ＢｇｌＩＩ制限部位でのオリゴヌクレオチドの挿入は、
ＮｈｅＩとＢｇｌＩＩ制限部位の破壊及びＩ−ＳｃｅＩ制限部位とＮｓｉＩ制限
部位の挿入に帰結した。これらの挿入の結果は、ＡＴＧ開始コドン、５’末端で
の１７８ｂｐ、停止コドンおよびＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを削除したｎ
ｌｓｌａｃＺ遺伝子が２つのＩ−ＳｃｅＩ部位の間に挿入されるｐ２Ｗｌａｃプ
ラスミドである。開始コドンおよびコード領域の５’末端での１７８ｂｐの削除
の結果として、ｎｌｓｌａｃＺ遺伝子発現が不活化される。

【００５５】ｐＷｌａｃプラスミドは以下の通り構築した：最初に、ｐＰｙｔｋｎｌｓｌａ
ｃＺプラスミドはＳｐｅＩとＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素で消化し、ｎｌｓｌａｃＺ
遺伝子のコード領域の５’末端でＡＴＧ開始コドンと１７８ｂｐを含む５７８ｂ
ｐフラグメントの該プラスミドからの削除を行った。第２に、オリゴヌクレオチ
ド５’−ＣＴＡＧＡＴＧＣＡＴＡＧＧＧＡＴＡＡＣＡＧＧＧＴＡＡＴ−３’（配
列番号：１）、と対をなす５’−ＡＧＣＴＡＴＴＡＣＣＣＴＧＴＴＡＴＣＣＣＴ
ＡＴＧＣＡＴ−３’（配列番号：２）を、ｐＷｎｌｓｌａｃＺプラスミドを生産
するためｐＰｙｔｋｎｌｓｌａｃＺプラスミドのＳｐｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ制限
部位に挿入した。この制限部位での挿入は、ＳｐｅＩとＨｉｎｄＩＩＩ制限部位
の破壊およびＮｓｉＩ制限部位とＩ−ＳｃｅＩ制限部位の挿入に帰着した。ｐＷ
ｎｌｓｌａｃＺプラスミドはＮｈｅＩとＢｇｌＩＩ制限酵素で消化し、ｎｌｓｌ
ａｃＺ遺伝子の３’末端で停止コドンとＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを含む
０．６ｋｂフラグメントの該プラスミドからの切り出しを行った。ｐＷｎｌｓｌ
ａｃＺプラスミドのＮｈｅＩ−ＢｇｌＩＩ制限部位の５’伸長部は、Ｔ４ＤＮＡ
ポリメラーゼを用いた充填反応によって平滑末端に変換した。該平滑末端はその
後互いに連結した。その結果は、ＡＴＧ開始コドン、５’末端での１７８ｂｐ、
停止コドンおよびポリアデニル化シグナルを削除したｎｌｓｌａｃＺ遺伝子が一
つのＩ−ＳｃｅＩ部位と５’−末端で隣接したｐＷｌａｃプラスミドであり；ｎ
ｌｓｌａｃＺ遺伝子の３’末端はＩ−ＳｃｅＩ部位と隣接していない。コード領
域の５’末端で開始コドンと１７８ｂｐの削除の結果として、ｎｌｓｌａｃＺ遺
伝子発現が不活化される。

【００５６】ｐ−ｌａｃプラスミドは以下の通り構築した：最初に、ｐＰｙｔｋｎｌｓｌａ
ｃＺプラスミドはＳｐｅＩとＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素で消化し、ｎｌｓｌａｃＺ
遺伝子のコード領域の５’末端でＡＴＧ開始コドンと１７８ｂｐを含む５７８ｂ
ｐフラグメントの該プラスミドからの切り出しを行った。ｐＰｙｔｋｎｌｓｌａ
ｃＺプラスミドのＳｐｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位の５’伸長部は、Ｔ４ＤＮ
Ａポリメラーゼを用いた充填反応によって平滑末端に変換した。該平滑末端はそ
の後、ｐ−ｌａｃＺプラスミドを生産するために互いに連結した。ｐ−ｌａｃＺ
プラスミドはＮｈｅＩとＢｇｌＩＩ制限酵素で消化し、ｎｌｓｌａｃＺ遺伝子の
３’末端で停止コドンとＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを含む０．６ｋｂフラ
グメントの該プラスミドからの切り出しを行った。ｐＷｎｌｓｌａｃＺプラスミ
ドのＮｈｅＩ−ＢｇｌＩＩ制限部位の５’伸長部は、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを
用いた充填反応によって平滑末端に変換した。該平滑末端はその後互いに連結し
た。その結果は、ＡＴＧ開始コドン、５’末端での１７８ｂｐ、停止コドンおよ
びＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを削除したｎｌｓｌａｃＺ遺伝子がＩ−Ｓｃ
ｅＩ部位と５’または３’末端で隣接していないｐ−ｌａｃプラスミドである。
コード領域の５’末端での開始コドンと１７８ｂｐの削除の結果として、ｎｌｓ
ｌａｃＺ遺伝子発現が不活化される。

【００５７】本明細書に記載した実験において用いたｎｌｓｌａｃＺ遺伝子の２．８ｋｂ直
鎖フラグメントは以下の通り得られた：ｐＰｙｔｋｎｌｓｌａｃＺプラスミドを
ＮｈｅＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、そして２．８ｋｂフラグメントをアガロー
スゲル電気泳動で精製した。ｌａｃフラグメントとここでは称される、この２．
８ｋｂフラグメントは、ＡＴＧ開始コドン、５’末端での１７８ｂｐ、停止コド
ンおよびＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを削除したｎｌｓｌａｃＺ遺伝子のフ
ラグメントを含む。

【００５８】ｐＣＭＶＩ−ＳｃｅＩ（＋）とｐＣＭＶＩ−ＳｃｅＩ（−）プラスミドは、Ｃ
ｈｏｕｌｉｋａら、Ｃ．Ｒ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＩＩＩ，３１７（１１）：１０
１３−１０１９（１９９４）中に記載された。

【００５９】標的プラスミドｐＰｙｔｋｎｌｓｌａｃＺＤＢｃｌは、ｐＰｙｔｋｎｌｓｌａ
ｃＺプラスミドの脱メチル化の後、ＢｃｌＩ制限酵素で該プラスミドを消化する
ことによって生産した。５’突出末端は大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ
ウラグメントによって充填し、再連結した。結果は、ｎｌｓｌａｃＺ遺伝子の配
列中の４塩基対直列反復の挿入であり、オープンリーディングフレームのフレー
ムシフトをもたらし、それによって該遺伝子の発現が不活化される。したがって
、該プラスミドはβ−ガラクトシダーゼタンパク質を発現しない。

【００６０】標的プラスミドｐＰｙｔｋｎｌｓｌａｃＺΔＢｃｌは、該プラスミドの脱メチ
ル化の後、ＢｃｌＩ制限酵素でｐＰｙｔｋｎｌｓｌａｃＺプラスミドを消化する
ことによって生産した。４塩基対５’突出末端はＴ４ＤＮＡポリメラーゼによっ
て分解し、得られた平滑化した末端を再連結した。ｎｌｓｌａｃＺ遺伝子の配列
中の４塩基対の削除の結果は、オープンリーディングフレームのフレームシフト
をもたらし、それによって該遺伝子の発現が不活化される。したがって、該プラ
スミドはβ−ガラクトシダーゼタンパク質を発現しない。

【００６１】ｐＵＳＶｎｅｏプラスミドはＣｈｏｕｌｉｋａら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０
（３）：１７９２−１７９８（１９９６）中に記載された。

【００６２】実施例２細胞株作製およびＤ−ループ組換え：４塩基対挿入の修正ｐＰｙｔｋｎｌｓｌａｃＺＤＢｃｌプラスミドの５μｇとｐＵＳＶｎｅｏプラ
スミドの５μｇは、ＣａＰＯ₄沈降法を用い３５ｍｍペトリ皿（Ｆａｌｃｏｎ製
）中の５ｘ１０⁴ＮＩＨ３Ｔ３細胞（ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕ
ｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に共−トランスフェクションした。トランスフェ
クションの４８時間後、その組織培養培地はジェネチシン（ＧｉｂｃｏＢＲＬ
製）の６００μｇ／ｍｌを補充した。抗生物質選択を、ジェネチシン耐性クロー
ンの選択の間およびサブクローニングの間維持した。４８のジェネチシン耐性ク
ローンが単離され、さらにｎｌｓｌａｃＺ遺伝子の存在について評価する前の１
５日間、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、１０％ウシ血清中で独自に
培養した。

【００６３】ｎｌｓｌａｃＺ遺伝子の存在を評価するため、ジェネチシン耐性クローンの４
８の培養物全ての細胞からＤＮＡを抽出した。ｎｌｓｌａｃＺ遺伝子のフラグメ
ントは、バイオ技術のバイオフィードバック、ＨａｎｌｅｙとＪ．Ｐ．Ｍｅｒｌ
ｉｅ，Ｖｏｌ．１０，Ｎｏ．１，ｐ．５６Ｔ（１９９１）に記載されたポリメラ
ーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅した。４８クローン内の４６がｎｌｓｌａ
ｃＺ遺伝子の存在について陽性であった。

【００６４】ｎｌｓｌａｃＺ遺伝子の存在について陽性である４６クローン内の２４を、変
異したｎｌｓｌａｃＺ遺伝子の発現について評価した。変異したｎｌｓｌａｃＺ
遺伝子の発現を評価するため、ジェネチシン耐性クローンの対応する２４の培養
物中の細胞からＲＮＡを抽出した。変異したｎｌｓｌａｃＺ遺伝子をコードして
いるＲＮＡは、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって増幅
した。オリゴヌクレオチドプライマー５’−ＴＡＣＡＣＧＣＧＴＣＧＴＧＡＴＴ
ＡＧＣＧＣＣＧ−３’（配列番号：５）をｌａｃＺ逆転写用に用いた。ＰＣＲは
、バイオ技術のバイオフィードバック、ＨａｎｌｅｙとＪ．Ｐ．Ｍｅｒｌｉｅ，
Ｖｏｌ．１０，Ｎｏ．１，ｐ．５６Ｔ（１９９１）中に記載された通り実行した
。２４クローン内の１１が陽性反応を示した。

【００６５】これらの１１クローンのゲノムＤＮＡのサザンブロット分析を実行し、そして
３つのクローンがｐＰｙｔｋｎｌｓｌａｃＺＤＢｃｌ構築物の３未満の完全コピ
ーを有することが示された。

【００６６】これら３つのクローンの組織化学的解析は、Ｂｏｎｎｅｒｏｔら、酵素学の方
法、マウス発育における技術ガイド、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ｐｐ．４
５１−４６９（１９９３）中に記載された通りＸ−Ｇａｌ染色によって実行した
。３つのクローン内の２つが１ｘ１０⁶細胞未満でβ−ガラクトシダーゼの発現
を示した。これらの細胞中のβ−ガラクトシダーゼは、おそらくＢｃｌＩ制限部
位に挿入した４ｂｐ直列反復の遺伝子内組換えの結果である。組込みｐＰｙｔｋ
ｎｌｓｌａｃＺＤＢｃｌ構築物によって発現したｍＲＮＡのノーザンブロット解
析は、クローンの一つ（バックグラウンド発現なしの一つ）について非常に少な
い発現および他の２つのクローン（１ｘ１０⁶細胞未満でβ−ガラクトシダーゼ
を発現したそれら）について強いシグナルを示した。これら２つの細胞株、ＮＩ
Ｈ３Ｔ３ＤＢｃｌ１とＮＩＨ３Ｔ３ＤＢｃｌ２は、Ｄ−ループ組換えに対する標
的に選択した。

【００６７】ＮＩＨ３Ｔ３ＤＢｃｌ１とＮＩＨ３Ｔ３ＤＢｃｌ２細胞株におけるエクスビボ
組換え３組の実験をＮＩＨ３Ｔ３ＤＢｃｌ１とＮＩＨ３Ｔ３ＤＢｃｌ２細胞株を用い
て、３連で実施した。３連での実験の各々の組は、表１中に示したＤＮＡ混合物
の８つの異なる共トランスフェクションを含む。トランスフェクションは、Ｃａ
ＰＯ₄沈降法を用い６０ｍｍペトリ皿（Ｆａｌｃｏｎ製）中の５ｘ１０⁴ＮＩＨ
３Ｔ３ＤＢｃｌ１細胞または５ｘ１０⁴ＮＩＨ３Ｔ３ＤＢｃｌ２細胞のいずれか
で実行した。

【００６８】

【表１】

【００６９】トランスフェクションの９６時間後、細胞をＸ−Ｇａｌ中でβ−ガラクトシダ
ーゼ発現に関して染色し、そして青色コロニー形成単位（ｂｃｆｕ）をカウント
した。ｂｃｆｕの数はそれぞれの実験でのＤ−ループ修正の結果である。結果は
図３中に示される。

【００７０】混合物番号１（ｐＣＭＶＩ−ＳｃｅＩ（＋）、９μｇ；ｐ２Ｗｌａｃ，１μ
ｇ）によるＮＩＨ３Ｔ３ＤＢｃｌ２細胞のトランスフェクションは、ｐＰｙｔｋ
ｎｌｓｌａｃＺＤＢｃｌ変異プラスミドのＤ−ループ修正のより高い割合として
３〜５％のβ−ガラクトシダーゼ陽性クローン（３つの実験の他）を与えた。し
たがって、混合物番号１による１ｘ１０⁵細胞のトランスフェクション後、９６
の個別の細胞を標準的な方法にしたがい限界希釈によってクローニングした。細
胞は、ＤＭＥＭ，１０％ウシ血清中で増殖させ、さらにβ−ガラクトシダーゼ発
現を解析した。７１クローン内の５つは、１ｘ１０⁶を超える細胞がβ−ガラク
トシダーゼ発現を示した（該細胞の５〜８０％の間の範囲）。これらの５つのク
ローンのサザンブロット解析は、細胞の１００％が回復したＢｃｌＩ部位ととも
にそれのｎｌｓｌａｃＺ遺伝子を有していたことを示した。完全なｎｌｓｌａｃ
Ｚオープンリーディングフレームの発現と該ゲノムの総修復の間の対応の欠如は
、おそらく導入遺伝子多様性の結果であろう。

【００７１】実施例３細胞株作製およびＤ−ループ組換え：４塩基対削除の修正ｐＰｙｔｋｎｌｓｌａｃＺΔＢｃｌプラスミドの５μｇとｐＵＳＶｎｅｏプラ
スミドの５μｇを、ＣａＰＯ₄沈降法を用い３５ｍｍペトリ皿（Ｆａｌｃｏｎ製
）中の５ｘ１０⁴ＮＩＨ３Ｔ３細胞（ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕ
ｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に共−トランスフェクションした。トランスフェ
クションの４８時間後、その組織培養培地はジェネチシン（ＧｉｂｃｏＢＲＬ
製）の６００μｇ／ｍｌを補充した。抗生物質選択は、ジェネチシン耐性クロー
ンの選択の間およびサブクローニングの間維持した。４８のジェネチシン耐性ク
ローンが単離され、さらにｎｌｓｌａｃＺ遺伝子の存在について評価する前の１
５日間、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、１０％ウシ血清中で独自に
培養した。

【００７２】ｎｌｓｌａｃＺ遺伝子の存在を評価するため、ジェネチシン耐性クローンの４
８の培養物全ての細胞からＤＮＡを抽出した。ｎｌｓｌａｃＺ遺伝子のフラグメ
ントは、バイオ技術のバイオフィードバック、ＨａｎｌｅｙとＪ．Ｐ．Ｍｅｒｌ
ｉｅ，Ｖｏｌ．１０，Ｎｏ．１，ｐ．５６Ｔ（１９９１）に記載されたＰＣＲに
よって増幅した。４８クローン内の４８がｎｌｓｌａｃＺ遺伝子の存在について
陽性であった。

【００７３】ｎｌｓｌａｃＺ遺伝子の存在が陽性の４８クローン内の２４を、変異したｎｌ
ｓｌａｃＺ遺伝子の発現について評価した。変異したｎｌｓｌａｃＺ遺伝子の発
現を評価するため、ジェネチシン耐性クローンの対応する２４の培養物中の細胞
からＲＮＡを抽出した。変異したｎｌｓｌａｃＺ遺伝子をコードしているＲＮＡ
は、ＲＴ−ＰＣＲによって増幅した。オリゴヌクレオチドプライマー５’−ＴＡ
ＣＡＣＧＣＧＴＣＧＴＧＡＴＴＡＧＣＧＣＣＧ−３’（配列番号：５）をｌａｃ
Ｚ逆転写用に用いた。ＰＣＲは、バイオ技術のバイオフィードバック、Ｈａｎｌ
ｅｙとＪ．Ｐ．Ｍｅｒｌｉｅ，Ｖｏｌ．１０，Ｎｏ．１，ｐ．５６Ｔ（１９９１
）中に記載された通り実行した。２４クローン内の９つが陽性反応を示した。

【００７４】これらの９クローンのゲノムＤＮＡのサザンブロット解析を実行し、そして１
つのクローンがｐＰｙｔｕｌｓｌａｃＺΔＢｃｌ構築物の３未満の完全コピーを
有することが示された。

【００７５】これら４つのクローンの組織化学的解析は、Ｂｏｎｎｅｒｏｔら、酵素学の方
法、マウス発育における技術ガイド、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ｐｐ．４
５１−４６９（１９９３）中に記載された通りＸ−Ｇａｌ染色によって実行した
。β−ガラクトシダーゼの発現を示したクローンは無かった。これらの細胞株に
おいて生じることができる遺伝子内組換えは無かった。組込みｐＰｙｔｋｎｌｓ
ｌａｃＺΔＢｃｌ構築物によって発現したｍＲＮＡのノーザンブロット解析は、
クローンの２つについて非常に少ない発現を、および他の２つのクローンについ
て強いシグナルを示した。これら２つの細胞株、ＮＩＨ３Ｔ３ΔＢｃｌ１とＮＩ
Ｈ３Ｔ３ΔＢｃｌ２は、Ｄ−ループ組換えに対する標的に選択した。

【００７６】ＮＩＨ３Ｔ３ΔＢｃｌ１とＮＩＨ３Ｔ３ΔＢｃｌ２細胞株におけるエクソビボ
組換え３組の実験をＮＩＨ３Ｔ３ΔＢｃｌ１とＮＩＨ３Ｔ３ΔＢｃｌ２細胞株を用い
て、３連で実施した。３連での実験の各々の組は、表２中に示したＤＮＡ混合物
の８つの異なる共トランスフェクションを含む。トランスフェクションは、Ｃａ
ＰＯ₄沈降法を用い６０ｍｍペトリ皿（Ｆａｌｃｏｎ製）中の５ｘ１０⁴ＮＩＨ
３Ｔ３ΔＢｃｌ１細胞または５ｘ１０⁴ＮＩＨ３Ｔ３ΔＢｃｌ２細胞のいずれか
で実行した。

【００７７】

【表２】

【００７８】トランスフェクションの９６時間後、細胞をＸ−Ｇａｌ中でβ−ガラクトシダ
ーゼ発現について染色し、そして青色コロニー形成単位（ｂｃｆｕ）をカウント
した。ｂｃｆｕの数はそれぞれの実験でのＤ−ループ修正の結果である。結果は
図３中に示される。

【００７９】混合物番号１（ｐＣＭＶＩ−ＳｃｅＩ（＋）、９μｇ；ｐ２Ｗｌａｃ，１μ
ｇ）によるＮＩＨ３Ｔ３ΔＢｃｌ２のトランスフェクションは、ｐＰｙｔｋｎｌ
ｓｌａｃＺΔＢｃｌ変異プラスミドのＤ−ループ修正のより高い割合として１〜
３％のβ−ガラクトシダーゼ陽性クローン（３つの実験の他）を与えた。したが
って、混合物番号１による１ｘ１０⁵細胞のトランスフェクション後、９６の個
別の細胞を限界希釈によってクローニングした。細胞を、ＤＭＥＭ，１０％ウシ
血清中で増殖させ、さらにβ−ガラクトシダーゼ発現を解析した。６６クローン
内の２つは、β−ガラクトシダーゼ発現細胞を示した（該細胞の３０〜８０％の
間の範囲）。これら２つのクローンのサザンブロット解析は、細胞の１００％が
回復したＢｃｌＩ部位とともにそれのｎｌｓｌａｃＺ遺伝子を有していたことを
示した。完全なｎｌｓｌａｃＺオープンリーディングフレームの発現と該ゲノム
の総修復の間の対応の欠如は、おそらく導入遺伝子多様性の結果であろう。

【００８０】実施例４Ｉ−ＳｃｅＩ誘導Ｄ−ループ組換えｐＰｙｋｎｌｓｌａｃＺＤ−Ｂｃｌ構築物は、実施例２に記載したようにＮＩ
Ｈ３Ｔ３細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれる。これらの細胞において、ｎｌｓｌ
ａｃＺＤＢｃｌ遺伝子は転写されるが、β−ガラクトシダーゼ発現は検出されな
い（β−ｇａｌ^-細胞）。β−ｇａｌ^-細胞は、２つのＩ−ＳｃｅＩ部位を含む
ｐ２ＷｌａｃプラスミドとＩ−ＳｃｅＩエンドヌクレアーゼをコードしている発
現ベクターとで共トランスフェクションされる。ｐ２ＷｌａｃプラスミドはＩ−
ＳｃｅＩエンドヌクレアーゼによってインビボで直鎖化され、さらにＤ−ループ
組換えによってＤＢｃｌ変異を修正される。その結果、これらの細胞はβ−ガラ
クトシダーゼを発現するｐＰｙｋｎｌｓｌａｃＺプラスミドを含む（β−ｇａｌ ⁺ 細胞）。この実験の概要図が図１に示される。

【００８１】本明細書で引用した全ての論文、特許および特許出願の教示はその全体が参照
によって本明細書に組み込まれる。

【００８２】本発明はその好ましい実施態様を参照して特に示され且つ記載されているが、
形態および詳細における種々の変更が添付した特許請求の範囲に規定した通りの
本発明の精神と範囲から逸脱することなしにここになされ得ることは当業者によ
って理解されるであろう。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、本明細書中に記載する相同的組換え又はＤ−ループ組換え媒介修復方
法の一実施態様の図である。

【図２】図２は、ＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるＩ- ＳｃｅＩ誘導Ｄ−ループ組換え媒介修
復実験の結果を表す表である。

【図３】図３は、メガヌクレアーゼ酵素の例を示す表である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (72)発明者マリガン，リチャード，シー．アメリカ合衆国マサチューセッツ 01773 リンカーン，サンディーポンドロード２Ｆターム(参考） 4B024 AA01 CA03 EA02 EA04 HA17 4B065 AA90 AB04 BA02 CA44 4C084 AA13 NA14 ZB211 ZB212 4C086 AA01 EA16 MA01 MA04 NA14 ZB21 4C087 AA01 AA03 BC83 CA12 NA14 ZB21

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ａ）標的ＤＮＡを含んでなる第１のベクターを細胞に導入す
る工程、前記標的ＤＮＡは制限エンドヌクレアーゼ部位に隣接しており、かつ（
１）対象の特定配列に隣接する染色体ＤＮＡに相同のＤＮＡおよび（２）前記標
的ＤＮＡと染色体ＤＮＡとの間での組換えの際に対象の特定配列を修復するＤＮ
Ａを含んでなる；ならびにｂ）第１のベクターに存在する制限エンドヌクレアーゼ部位を切断する制限エン
ドヌクレアーゼをコードする核酸を含んでなる第２のベクターを前記細胞に導入
する工程、を含む、細胞の染色体ＤＮＡにおける対象の特定配列の修復方法。
【請求項２】第１のベクターがウイルスベクターである請求項１記載の方
法。
【請求項３】第２のベクターがウイルスベクターである請求項１記載の方
法。
【請求項４】第１のベクターがプラスミドである請求項１記載の方法。
【請求項５】前記標的ＤＮＡが２つの制限エンドヌクレアーゼ部位に隣接
しており、一方の部位が前記標的ＤＮＡの５’末端にまたはその付近に存在し、
かつ他方の部位が前記標的ＤＮＡの３’末端にまたはその付近に存在する、請求
項１記載の方法。
【請求項６】対象の特定配列が変異である請求項１記載の方法。
【請求項７】ａ）標的ＤＮＡを含んでなるベクターを細胞に導入する工程
、前記標的ＤＮＡは制限エンドヌクレアーゼ部位に隣接しており、かつ（１）対
象の特定配列に隣接する染色体ＤＮＡに相同のＤＮＡおよび（２）前記標的ＤＮ
Ａと染色体ＤＮＡとの間での組換えの際に対象の特定配列を修復するＤＮＡを含
んでなる；ならびにｂ）ベクターに存在する制限エンドヌクレアーゼ部位を切断する制限エンドヌク
レアーゼを細胞に導入する工程、を含む、細胞の染色体ＤＮＡにおける対象の特定配列の修復方法。
【請求項８】ベクターがウイルスベクターである請求項７記載の方法。
【請求項９】前記標的ＤＮＡが２つの制限エンドヌクレアーゼ部位に隣接
する請求項７記載の方法。
【請求項１０】対象の特定配列が変異である請求項７記載の方法。
【請求項１１】（ａ）制限エンドヌクレアーゼ部位に隣接しており、かつ
（１）対象の特定配列に隣接する染色体ＤＮＡに相同のＤＮＡおよび（２）標的
ＤＮＡと染色体ＤＮＡとの間での組換えの際に対象の特定配列を修復するＤＮＡ
を含んでなる、標的ＤＮＡ；ならびに（ｂ）制限エンドヌクレアーゼ部位を切断
する制限エンドヌクレアーゼをコードする核酸を含んでなるベクターを細胞に導
入する工程を含む、細胞の染色体ＤＮＡにおける対象の特定配列の修復方法。
【請求項１２】ベクターがウイルスベクターである請求項１１記載の方法
。
【請求項１３】前記標的ＤＮＡが２つの制限エンドヌクレアーゼ部位に隣
接する請求項１１記載の方法。
【請求項１４】対象の特定配列が変異である請求項１１記載の方法。
【請求項１５】ａ）標的ＤＮＡを含んでなる第１のベクターを細胞に導入
する工程、前記標的ＤＮＡは制限エンドヌクレアーゼ部位に隣接しており、かつ
（１）改変対象の特定配列に相同のＤＮＡおよび（２）前記標的ＤＮＡと染色体
ＤＮＡとの間での組換えの際に特定配列を改変するＤＮＡを含んでなる；ならび
にｂ）第１のベクターに存在する制限エンドヌクレアーゼ部位を切断する制限エン
ドヌクレアーゼをコードする核酸を含んでなる第２のベクターを細胞に導入する
工程、を含む、細胞の染色体ＤＮＡにおける特定配列の改変方法。
【請求項１６】第１のベクターがウイルスベクターである請求項１５記載
の方法。
【請求項１７】第２のベクターがウイルスベクターである請求項１５記載
の方法。
【請求項１８】第１のベクターがプラスミドである請求項１７記載の方法
。
【請求項１９】前記標的ＤＮＡが２つの制限エンドヌクレアーゼ部位に隣
接する請求項１５記載の方法。
【請求項２０】ａ）標的ＤＮＡを含んでなるベクターを細胞に導入する工
程、前記標的ＤＮＡは制限エンドヌクレアーゼ部位に隣接しており、かつ（１）
改変対象の特定配列に相同のＤＮＡおよび（２）前記標的ＤＮＡと染色体ＤＮＡ
との間での組換えの際に特定配列を改変するＤＮＡを含んでなる；ならびにｂ）制限エンドヌクレアーゼによる、工程ａ）のベクターにおける制限エンドヌ
クレアーゼ部位の切断に適する条件下に、ベクターに存在する制限エンドヌクレ
アーゼ部位を切断する制限エンドヌクレアーゼを細胞に導入する工程、を含む、細胞の染色体ＤＮＡにおける特定配列の改変方法。
【請求項２１】ベクターがウイルスベクターである請求項２０記載の方法
。
【請求項２２】前記標的ＤＮＡが２つの制限エンドヌクレアーゼ部位に隣
接する請求項２０記載の方法。
【請求項２３】（ａ）制限エンドヌクレアーゼ部位に隣接しており、かつ
（１）改変対象の特定配列に相同のＤＮＡおよび（２）標的ＤＮＡと染色体ＤＮ
Ａとの間での組換えの際に特定配列の改変をもたらすＤＮＡを含んでなる、標的
ＤＮＡ；ならびに（ｂ）制限エンドヌクレアーゼ部位を切断する制限エンドヌク
レアーゼをコードする核酸を含んでなるベクターを細胞に導入する工程を含む、
細胞の染色体ＤＮＡにおける特定配列の改変方法。
【請求項２４】ベクターがウイルスベクターである請求項２３記載の方法
。
【請求項２５】前記標的ＤＮＡが２つの制限エンドヌクレアーゼ部位に隣
接する請求項２３記載の方法。
【請求項２６】ａ）標的ＤＮＡを含んでなる第１のベクターを含んでなる
細胞を個体に導入する工程、前記標的ＤＮＡは制限エンドヌクレアーゼ部位に隣
接しており、かつ（１）対象の特定配列に隣接する染色体ＤＮＡに相同のＤＮＡ
および（２）前記標的ＤＮＡと染色体ＤＮＡとの間での組換えの際に対象の特定
配列を修復するＤＮＡを含んでなる；ならびにｂ）第１のベクターに存在する制限エンドヌクレアーゼ部位を切断する制限エン
ドヌクレアーゼをコードする核酸を含んでなる第２のベクターを個体に導入する
工程、を含む、その必要がある個体における遺伝病を治療または予防する方法。
【請求項２７】第１のベクターがウイルスベクターである請求項２６記載
の方法。
【請求項２８】第２のベクターがウイルスベクターである請求項２７記載
の方法。
【請求項２９】第１のベクターがプラスミドである請求項２７記載の方法
。
【請求項３０】前記標的ＤＮＡが２つの制限エンドヌクレアーゼ部位に隣
接する請求項２４記載の方法。
【請求項３１】ａ）標的ＤＮＡを含んでなるベクターを含んでなる細胞を
個体に導入する工程、前記標的ＤＮＡは制限エンドヌクレアーゼ部位に隣接して
おり、かつ（１）対象の特定配列に隣接する染色体ＤＮＡに相同のＤＮＡおよび
（２）前記標的ＤＮＡと染色体ＤＮＡとの間での組換えの際に対象の特定配列を
修復するＤＮＡを含んでなる；ならびにｂ）ベクターに存在する制限エンドヌクレアーゼ部位を切断する制限エンドヌク
レアーゼを細胞に導入する工程、を含む、その必要がある個体における遺伝病を治療または予防する方法。
【請求項３２】ベクターがウイルスベクターである請求項３１記載の方法
。
【請求項３３】前記標的ＤＮＡが２つの制限エンドヌクレアーゼ部位に隣
接する請求項３１記載の方法。
【請求項３４】ａ）標的ＤＮＡを含んでなる第１のベクターを細胞に導入
する工程、前記標的ＤＮＡは制限エンドヌクレアーゼ部位に隣接しており、かつ
（１）対象の内因性遺伝子の標的部位に相同のＤＮＡおよび（２）前記標的ＤＮ
Ａと対象の遺伝子との間での組換えの際に対象の遺伝子を転写減衰するＤＮＡを
含んでなる；ならびにｂ）第１のベクターに存在する制限エンドヌクレアーゼ部位を切断する制限エン
ドヌクレアーゼをコードする核酸を含んでなる第２のベクターを細胞に導入する
工程、を含む、細胞における対象の内因性遺伝子の転写減衰方法。
【請求項３５】第１のベクターがウイルスベクターである請求項３４記載
の方法。
【請求項３６】第２のベクターがウイルスベクターである請求項３４記載
の方法。
【請求項３７】第１のベクターがプラスミドである請求項３４記載の方法
。
【請求項３８】前記標的ＤＮＡが２つの制限エンドヌクレアーゼ部位に隣
接する請求項３４記載の方法。
【請求項３９】ａ）標的ＤＮＡを含んでなるベクターを細胞に導入する工
程、前記標的ＤＮＡは制限エンドヌクレアーゼ部位に隣接しており、かつ（１）
対象の内因性遺伝子の標的部位に相同のＤＮＡおよび（２）前記標的ＤＮＡと対
象の遺伝子との間での組換えの際に対象の遺伝子を転写減衰するＤＮＡを含んで
なる；ならびにｂ）ベクターに存在する制限エンドヌクレアーゼ部位を切断する制限エンドヌク
レアーゼを細胞に導入する工程、を含む、細胞における対象の内因性遺伝子の転写減衰方法。
【請求項４０】ベクターがウイルスベクターである請求項３９記載の方法
。
【請求項４１】前記標的ＤＮＡが２つの制限エンドヌクレアーゼ部位に隣
接する請求項３９記載の方法。
【請求項４２】（ａ）制限エンドヌクレアーゼ部位に隣接しており、かつ
（１）対象の内因性遺伝子の標的部位に相同のＤＮＡおよび（２）標的ＤＮＡと
対象の遺伝子との間での組換えの際に対象の遺伝子を転写減衰するＤＮＡを含ん
でなる、標的ＤＮＡ；ならびに（ｂ）制限エンドヌクレアーゼ部位を切断する制
限エンドヌクレアーゼをコードする核酸を含んでなるベクターを細胞に導入する
工程を含む、細胞における対象の内因性遺伝子の転写減衰方法。
【請求項４３】ベクターがウイルスベクターである請求項４２記載の方法
。
【請求項４４】前記標的ＤＮＡが２つの制限エンドヌクレアーゼ部位に隣
接する請求項４２記載の方法。
【請求項４５】ａ）標的ＤＮＡを含んでなる第１のベクターを細胞に導入
する工程、前記は制限エンドヌクレアーゼ部位に隣接しており、かつ（１）標的
部位に相同のＤＮＡおよび（２）染色体ＤＮＡへの導入対象の変異を含んでなる
；ならびにｂ）第１のベクターに存在する制限エンドヌクレアーゼ部位を切断する制限エン
ドヌクレアーゼをコードする核酸を含んでなる第２のベクターを細胞に導入する
工程、を含む、細胞の染色体ＤＮＡの標的部位への変異の導入方法。
【請求項４６】第１のベクターがウイルスベクターである請求項４５記載
の方法。
【請求項４７】第２のベクターがウイルスベクターである請求項４５記載
の方法。
【請求項４８】第１のベクターがプラスミドである請求項４７記載の方法
。
【請求項４９】前記標的ＤＮＡが２つの制限エンドヌクレアーゼ部位に隣
接する請求項４５記載の方法。
【請求項５０】ａ）標的ＤＮＡを含んでなるベクターを細胞に導入する工
程、前記標的ＤＮＡは制限エンドヌクレアーゼ部位に隣接しており、かつ（１）
標的部位に相同のＤＮＡおよび（２）染色体ＤＮＡへの導入対象の変異を含んで
なる；ならびにｂ）ベクターに存在する制限エンドヌクレアーゼ部位を切断する制限エンドヌク
レアーゼを細胞に導入する工程、を含む、細胞の染色体ＤＮＡの標的部位への変異の導入方法。
【請求項５１】ベクターがウイルスベクターである請求項５０記載の方法
。
【請求項５２】前記標的ＤＮＡが２つの制限エンドヌクレアーゼ部位に隣
接する請求項５０記載の方法。
【請求項５３】（ａ）制限エンドヌクレアーゼ部位に隣接しており、かつ
（１）標的部位に相同のＤＮＡおよび（２）染色体ＤＮＡへの導入対象の変異を
含んでなる、標的ＤＮＡ；ならびに（ｂ）制限エンドヌクレアーゼ部位を切断す
る制限エンドヌクレアーゼをコードする核酸を含んでなるベクターを細胞に導入
する工程を含む、細胞の染色体ＤＮＡの標的部位への変異の導入方法。
【請求項５４】ベクターがウイルスベクターである請求項５３記載の方法
。
【請求項５５】前記標的ＤＮＡが２つの制限エンドヌクレアーゼ部位に隣
接する請求項５３記載の方法。