JP2002511745A - ２段階ハイブリダイゼーションおよびポリヌクレオチドの捕捉 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 試料中の標的ポリヌクレオチドを、捕捉プローブおよび好ましくは温度のみが異なる２つの異なるハイブリダイゼーション条件を用いることにより、固体支持体に結合した固定プローブで固体支持体上に捕捉する方法が開示される。２つのハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイゼーションの順序を調節し、第一のハイブリダイゼーション条件は、捕捉プローブおよび標的ポリヌクレオチドがハイブリダイズするのを可能にし、そして第二のハイブリダイゼーション条件は、捕捉プローブおよび固定プローブがハイブリダイズするのを可能にし、固定プローブ、捕捉プローブおよび標的ポリヌクレオチドの複合体を産生する。標的ポリヌクレオチドを捕捉し、捕捉された標的ポリヌクレオチドを増幅し、そして増幅配列を検出することにより、試料中の標的ポリヌクレオチドの存在を決定する方法もまた、開示される。

Description

【発明の詳細な説明】 ２段階ハイブリダイゼーションおよびポリヌクレオチドの捕捉 発明の技術分野 本発明は、試料中に存在する可能性があるポリヌクレオチドを、固体支持体上 に捕捉するための方法に関する。本発明は、標的ポリヌクレオチドを試料中の他 の成分から分離するのに特に有用であり、そして好ましくは、試料中の標的ポリ ヌクレオチドの存在を検出するための診断法の一部として使用される。 発明の背景 標的ポリヌクレオチドは、試料中に存在するポリヌクレオチドであって、１つ またはそれ以上の試料構成要素から精製することが可能であり、および／または その存在が異なる技術を用いて検出することが可能である。こうした技術は、典 型的には、感染性病原体または病原性状態の存在を示す標的ポリヌクレオチドの 存在を検出する診断法の一部として実施される。 標的ポリヌクレオチドに存在する、標的ポリヌクレオチド塩基配列領域の存在 は、標的配列にハイブリダイズする核酸プローブを使用するものなど、多様な方 法により検出してもよい。プローブは、微生物、ウイルス、ヒト遺伝子、植物ま たは動物遺伝子、および／または病原性状態に特徴的なものなど、異なる標的配 列を検出するよう設計してもよい。 標的ポリヌクレオチドを精製する技術はしばしば診断法において用いられ、該 技術には、標的ポリヌクレオチドを固体支持体上に捕捉することが含まれる。固 体支持体は、標的ポリヌクレオチド精製法の、１つまたはそれ以上の洗浄段階中 、標的ポリヌクレオチドを保持する。 Rankiら、米国特許第4,486,539号は、標的ポリヌクレオチドを捕捉するため、 そしてその存在を検出するためのハイブリダイゼーション・サンドイッチ技術を 記載する。該技術には、固体支持体に結合したプローブによる標的ポリヌクレオ チドの捕捉、および捕捉された標的ポリヌクレオチドへの検出プローブのハイブ リダイゼーションが含まれる。標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズしなかっ た検出プローブは、固体支持体から容易に洗い流される。したがって、残った標 識は、試料中に初めに存在していた標的ポリヌクレオチドと結合している。 Stabinskyら、来国特許第4,751,177号は、標的ポリヌクレオチドおよび固体支 持体に固定されたポリヌクレオチドの両方にハイブリダイズする媒介ポリヌクレ オチドを用いる方法を記載する。媒介ポリヌクレオチドは標的ポリヌクレオチド を固体支持体に連結し(join)、結合標的を産生する。標識プローブを結合標的に ハイブリダイズさせてもよく、そして非結合標識プローブを固体支持体から洗い 流してもよい。 Englehardtら、米国特許第4,894,324号および第5,288,609号は、標的ポリヌク レオチドを検出する方法を記載する。該方法は標的と同一のまたは反対の鎖と相 補的な２つの一本鎖ポリヌクレオチド部分を利用し、そして標的ポリヌクレオチ ドとの二重ハイブリッドの形成を起こす。１つの態様において、二重ハイブリッ ドを支持体上に捕捉してもよい。 Capeら、EP特許公告第0 370 694号は、固相捕捉手段を用いた核酸検出のため の方法およびキットを記載する。該方法は、特異的な結合パートナーで標識した オリゴヌクレオチドプライマーを使用し、プライマーおよびプライマー伸長産物 を固定する。標識は、固体支持体に結合したその受容体と特異的に複合体を形成 する。 発明の概要 本発明の１つの側面にしたがい、試料中に存在する標的ポリヌクレオチドを捕 捉する方法であって：標的ポリヌクレオチド、捕捉プローブ、および固定プロー ブを含む混合物を、捕捉プローブおよび標的ポリヌクレオチドから構成される捕 捉プローブ：標的ハイブリダイゼーション複合体の形成に都合の良い、そして固 定プローブおよび捕捉プローブから構成される固定プローブ：捕捉プローブハイ ブリダイゼーション複合体の形成に都合の良くない、第一のハイブリダイゼーシ ョン条件においてインキュベーションし；そしてその後、該混合物を、固定プロ ーブ：捕捉プローブハイブリダイゼーション複合体の形成に都合の良い第二のハ イブリダイゼーション条件においてインキュベーションし、それにより固定プロ ーブ、捕捉プローブおよび標的ポリヌクレオチドから構成される固定プローブ： 捕捉プローブ：標的ハイブリダイゼーション複合体中に標的ポリヌクレオチドを 捕捉する段階を含む、前記方法が開示される。１つの態様において、第一のイン キュベーション段階は、捕捉プローブ：標的ハイブリダイゼーション複合体のT_m より低く、そして固定プローブ：捕捉プローブハイブリダイゼーション複合体の T_mより高い温度を使用し、そして第二のインキュベーション段階は、固定プロー ブ：捕捉プローブハイブリダイゼーション複合体のT_mより低い温度を使用する。 好ましくは、第二のインキュベーション段階は、第一のハイブリダイゼーション 条件の温度を少なくとも約10℃、または少なくとも約20℃下げることにより達成 される。１つの態様において、第一のインキュベーション段階は、約60℃の温度 を使用し、そして第二のインキュベーション段階は約40℃またはそれより低い温 度を使用する。該方法にはまた、固定プローブ：捕捉プローブ：標的ハイブリダ イゼーション複合体を精製する段階も含んでもよい。該方法の他の態様には、標 識プローブを標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズさせ、そして標識プローブ を検出することにより、固定プローブ：捕捉プローブ：標的ハイブリダイゼーシ ョン複合体中の標的ポリヌクレオチドを検出する段階が含まれる。該方法はまた 、標的ポリヌクレオチドを、好ましくは転写関連増幅により、増幅し、増幅核酸 を産生する段階も含んでもよい。増幅段階が含まれるとき、該方法はまた、増幅 核酸を検出する段階であって、好ましくは標識プローブを標的ポリヌクレオチド に相補的である増幅核酸にハイブリダイズさせ、そして標識プローブを検出する 段階を含む、前記段階も含んでもよい。該方法はまた、検出段階中に、ハイブリ ダイズしなかった標識プローブを除去する段階も含んでもよい。好ましい態様に おいて、インキュベーション段階はどちらも、少なくとも長さ５ヌクレオチド塩 基認識基の捕捉プローブ結合領域を含む固定プローブ、および少なくとも長さ５ ヌクレオチド塩基認識基の固定プローブ結合領域を含む捕捉プローブを用いるこ とを含み、但し、捕捉プローブ結合領域は固定プローブ結合領域と相補的である 。好ましくは、捕捉プローブ結領域は：(a)少なくとも１つの糖−リン酸ジエス テル結合、または少なくとも１つのペプチド核酸基、少なくとも１つのホスホロ チオエート結合、またはそれらの組み合わせを含む第一の骨格(backbone)、およ び（b）第一の骨格に連結する少なくとも10ヌクレオチド塩基認識基、ここで各 ヌクレオチド認識基は、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシルまた はイノシンと水素結合することが可能である、を含み；そして固定プローブ 結合領域は：(a)少なくとも１つの糖−リン酸ジエステル結合、または少なくと も１つのペプチド核酸基、少なくとも１つのホスホロチオエート結合、またはそ れらの組み合わせを含む第二の骨格、および（b）第一の骨格に連結したヌクレ オチド塩基認識基に水素結合することが可能な、第二の骨格に連結した少なくと も10ヌクレオチド塩基認識基を含む。該方法の１つの態様において、捕捉プロー ブ結合領域は、少なくとも10ヌクレオチドを含むホモポリマーからなり、そして 固定プローブ結合領域は、少なくとも25ヌクレオチドを含むホモポリマーであっ て、このうち少なくとも10ヌクレオチドが捕捉プローブ結合領域の10ヌクレオチ ドと相補的である前記ホモポリマーからなる。好ましくは、捕捉プローブ結合領 域は、約14の連続したAまたはT塩基を含み、そして固定プローブ結合領域は、約 30塩基のそれに相補的な配列を含む。好ましい態様において、インキュベーショ ン段階は、固定プローブおよび捕捉プローブの混合物を用い、ここで各プローブ はデオキシヌクレオチド、リボヌクレオチド、2'−メトキシ置換ヌクレオチド、 2'−ハロ置換ヌクレオチド成分、またはそれらの組み合わせを含む。 本発明の別の側面は、試料中の標的ポリヌクレオチドの存在を決定する方法で ある。本方法は：試料中に存在する標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする ことが可能な捕捉プローブを提供し；捕捉プローブを標的ポリヌクレオチドを含 むと疑われる試料と、捕捉プローブおよび標的ポリヌクレオチドのハイブリダイ ゼーションを助ける第一のインキュベーション温度で混合し、それにより捕捉プ ローブ：標的ポリヌクレオチド複合体を産生し；捕捉プローブとハイブリダイズ することが可能な固定プローブを提供し；捕捉プローブ：標的ポリヌクレオチド 複合体および固定プローブを、固定プローブおよび捕捉プローブのハイブリダイ ゼーションを助ける第二のインキュベーション温度でインキュベーションし、そ れにより固定プローブ：捕捉プローブ：標的ポリヌクレオチド複合体を含む、捕 捉された標的ポリヌクレオチドを産生し；捕捉された標的ポリヌクレオチドを精 製し、それにより精製標的ポリヌクレオチドを産生し；精製標的ポリヌクレオチ ドを増幅し、それにより増幅核酸を産生し；そして増幅核酸を検出し、試料中の 標的ポリヌクレオチドの存在を決定する段階を含む。本方法の１つの態様におい て、検出段階は、標識プローブを、標的ポリヌクレオチドまたはその一部に相補 的な増幅核酸にハイブリダイズさせ、そして標識プローブを検出することを含む 。 図の簡単な説明 図1AおよびBは、固体支持体10に結合した「(a)」と示された固定プローブ、お よび「(b)」と示された捕捉プローブを用い、「(c)」と示された標的ポリヌクレ オチドを捕捉するための、２つの異なるハイブリダイゼーション条件の使用を図 式的に例示する。図1Aにおいて、第一のハイブリダイゼーション条件は、捕捉プ ローブ（b）および標的ポリヌクレオチド（c）のハイブリダイゼーションを可能 にし、捕捉プローブ：標的ポリヌクレオチド複合体15を形成するが、捕捉プロー ブ（b）および固定プローブ（a）のハイブリダイゼーションを可能にしない。図 1Bにおいて、第二のハイブリダイゼーション条件は、捕捉プローブ（b）および 固定プローブ（a）のハイブリダイゼーションを可能にし、固定プローブ：捕捉 プローブ：標的ポリヌクレオチド複合体20を形成する。 図２は、転写関連増幅（段階（B）から(F)）を用いた、捕捉された標的ポリヌ クレオチド配列の増幅（段階(A)）を含む方法の、段階AからFを例示する。図2、 段階（A）において、固体支持体10に結合した固定プローブ(a)、捕捉プローブ(b )、および標的ポリヌクレオチド配列（c）は図１のように示されている。RNAポ リメラーゼにより認識されるプロモーター配列は、「Ｐ」と示され；「(−)」は 核酸の5'端を示し、そして「(＋)」は相補的核酸の3'端を示し；そしてダッシュ 「(---)」は核酸重合を示す。 図3A、3Bおよび3Cは、図１のように示された、標的ポリヌクレオチド（c）の 存在を検出するための、固体支持体10に結合した固定プローブ(a)、捕捉プロー ブ(b)、および「(d)」と示された標識プローブを用いた、２つの異なるハイブリ ダイゼーション条件の使用を例示する。図3Aにおいて、第一のハイブリダイゼー ション条件は、捕捉プローブ：標的ポリヌクレオチド：標識プローブ複合体30の 形成を可能にする。図3Bにおいて、第二のハイブリダイゼーション条件は、固定 プローブ：捕捉プローブ：標的ポリヌクレオチド：標識プローブ複合体40の形成 を可能にし、非結合標識プローブ50を残す。図3Cにおいて、非結合標識プローブ は洗い流されており、精製された固定プローブ：捕捉プローブ：標 的ポリヌクレオチド：標識プローブ複合体40が残されている。 図４は、T₁₄配列からなる結合した固定プローブを持つ固体支持体１０の例を 例示する；上部のプローブ（右側に「(a)」が隣接）は、T₁₄固定プローブが相補 的なA₁₄配列を含む捕捉プローブ（3'A₁₄TTTGTCAGTAACCTTGATTCATCAAG5'(配列番 号1)）にハイブリダイズしている(塩基間で「:」と示される)、固定プローブ： 捕捉プローブ複合体中にあり；中央のプローブ（右側に「(b)」が隣接）は、よ り大きい配列（末端の「NNNNNN」配列により示される）中の標的配列（5'CAGTCA TTGGAACTAAGTAGTTC3'(配列番号2)）にハイブリダイズしている捕捉プローブにハ イブリダイズしている固定プローブを含む、固定プローブ：捕捉プローブ：標的 ポリヌクレオチド複合体中にあり；そして下部のプローブ（右側に「(c)」が隣 接）は、ハイブリダイズしていない固定T₁₄プローブである。 発明の詳細な説明 本発明は、捕捉プローブおよび２つの異なるハイブリダイゼーション条件を用 い、標的ポリヌクレオチドを固体支持体上に捕捉する方法を特徴とする。異なる ハイブリダイゼーション条件を用い、捕捉プローブおよび固定プローブと混合さ れた、標的ポリヌクレオチドを含む試料中のハイブリダイゼーションの順序を調 節する。「ハイブリダイゼーション条件」とは、１つの一本鎖核酸を、第二の一 本鎖核酸に水素結合させ、ハイブリダイゼーション複合体（本明細書において、 時に「複合体」と称される）を産生する反応に用いられる、累積環境（cumulati ve environment）を意味する。累積環境には、例えば、一本鎖核酸を含む水性ま たは有機性溶液の濃度および構成要素(例えば、塩、キレート剤および非競合阻 害剤核酸)、および反応混合物の温度が含まれる。累積環境に寄与する可能性が ある他の要因には、例えば、水素結合をおこさせる時間の長さ、反応物を入れる 容器（chamber）の物理的形状、およびハイブリダイゼーション中の混合または 攪拌の使用が含まれる。これらの環境条件のすべては、当業によく知られている (例えば、Sambrookら,Molecular Cloning,A Laboratory Manual 2^nd ed.（Cold Spring Harbor Laboratory Press,ニューヨーク州コールドスプリングハーバー ，1989）を参照されたい)。本発明において、第一のハイブリダイゼーション条 件 は、捕捉プローブの標的ポリヌクレオチドへのハイブリダイゼーションを容易に する一方、捕捉プローブおよび固定プローブのハイブリダイゼーションを本質的 に妨げ、そして第二のハイブリダイゼーション条件はその後、捕捉プローブおよ び固定プローブのハイブリダイゼーションを容易にする。 固定プローブは、捕捉プローブを固定支持体に連結する手段を提供する。固定 プローブは、固体支持体に連結した塩基配列認識分子であり、結合された標的ポ リヌクレオチドを非結合成分から分離するのを容易にする。マトリックスおよび 溶液中の遊離粒子など、いかなる既知の固体支持体を使用してもよい。例えば、 固体支持体は、ニトロセルロース、ナイロン、ガラス、ポリアクリル酸、混合ポ リマー、ポリスチレン、シラン・ポリプロピレン、および好ましくは、磁気誘引 可能粒子であってもよい。特に好ましい支持体は、単分散（すなわち、大きさが 約±5％で均一）であり、それにより一定の結果を提供し、自動アッセイに使用 するのに特に有用である、磁気球体である。 固定プローブは、本発明に使用される第一および第二のハイブリダイゼーショ ン条件中に、安定である結合または相互作用により、固体支持体に直接、または 間接的に連結される。直接連結は、固定プローブ分子が、中間基の非存在下で固 体支持体に連結されるとき、起こる。例えば、直接連結は、共有結合、キレート 化、またはイオン性相互作用を介してもよい。間接連結は、固定プローブが１つ またはそれ以上のリンカーにより、固体支持体に連結されているとき、起こる。 「リンカー」は、少なくとも２つの異なる分子を安定した複合体になるよう結合 させる手段を意味し、そして結合パートナーセットの、１つまたはそれ以上の構 成要素を含む。 結合パートナーセットのメンバーは、互いを認識し、そして結合することが可 能である。結合パートナーセットは、例えば、受容体およびリガンド、酵素およ び基質、酵素および補因子、酵素および補酵素、抗体および抗原、糖およびレク チン、ビオチンおよびストレプトアビジン、リガンドおよびキレート剤、ニッケ ルおよびヒスチジン、実質的に相補的なヌクレオチド塩基認識分子、および相補 的なホモポリマー核酸または重合核酸のホモポリマー部分であってもよい。結合 パートナーセットの構成要素は、結合に関与するメンバーの領域である。 本発明の方法は、多くの異なる態様を有する。１つにおいて、リンカーは固体 支持体に直接連結し、そして結合対セットの構成要素を通じて固定プローブに連 結する。他の態様において、１つより多いリンカーが存在し、第一のリンカーは 直接固体支持体に連結し、そして少なくとも１つの第二のリンカーは、結合対セ ットの構成要素を通じて固定プローブに連結する。第一および第二のリンカーを 連結するのに、さらなるリンカーを使用してもよい。 「塩基配列認識分子」とは、骨格により共に結合された、ヌクレオチド塩基認 識基を含むポリマーである。ヌクレオチド塩基認識基は、相補的分子とハイブリ ダイズするための配列情報を提供する。個々のヌクレオチド塩基認識基は、アデ ニン(A)、グアニン(G)、シトシン(C)、チミン(T)、ウラシル(U)またはそれらの 誘導体と水素結合することが可能である。塩基配列認識分子の骨格は、特に核酸 塩基へのハイブリダイゼーション中の水素結合のため、ヌクレオチド塩基認識基 を正しい方向および間隔で提供する。塩基配列認識分子は、例えばRNA、DNA、ペ プチド核酸、またはそれらの誘導体であってもよい。 捕捉プローブは、標的ポリヌクレオチドおよび固定プローブが安定して連結す るための手段を提供する。捕捉プローブは、１つまたはそれ以上の塩基配列認識 部分：標的ポリヌクレオチド結合領域および固定プローブ結合領域を含む。これ ら２つの結合領域は、１つまたはそれ以上の塩基配列認識分子上に存在していて もよいが、好ましくは２つの結合領域を含む単一の塩基配列認識分子に含まれる 。他の態様において、捕捉プローブは、１つまたはそれ以上のリンカーにより共 に連結された２つの異なる塩基配列認識分子上に存在する、標的ポリヌクレオチ ド結合領域および固定プローブ結合領域を含む。例えば、固定プローブ結合領域 は、第一の塩基配列認識分子上に存在してもよく、標的ポリヌクレオチド結合領 域は、第二の塩基配列認識分子上に存在してもよく、そして２つの異なる分子は 、第一および第二の塩基配列認識分子にハイブリダイズする塩基配列認識分子で あるリンカーにより連結される。 本発明は、試料中に存在する標的ポリヌクレオチドを捕捉する方法を含む。ま ず、試料、捕捉プローブおよび固定プローブを含む混合物を産生し、そして第一 のハイブリダイゼーション条件下でインキュベーションし、標的ポリヌクレオチ ドに捕捉プローブがハイブリダイズして構成された捕捉プローブ：標識複合体を 形成する。第一のハイブリダイゼーション条件は、捕捉プローブ：標的複合体の T_mより低く、そして固定プローブ：捕捉プローブハイブリッドのT_mより高い温度 を使用する。好ましくは、第一のハイブリダイゼーション条件において、捕捉プ ローブの少なくとも50％未満が、固定プローブ：捕捉プローブ複合体中にある。 より好ましくは、第一のハイブリダイゼーション条件において、捕捉プローブの 25％未満、さらにより好ましくは、10％未満、そして最も好ましくは1％未満が 、固定プローブ：捕捉プローブ複合体中にある。 その後、第二のハイブリダイゼーション条件を用い、標的ポリヌクレオチドに ハイブリダイズした捕捉プローブにハイブリダイズした固定プローブから構成さ れる固定プローブ：捕捉プローブ：標的ポリヌクレオチド複合体を形成する。第 二のハイブリダイゼーション条件の温度は、固定プローブ：捕捉プローブハイブ リダイゼーション複合体のT_mより低く、そしてしたがって固定プローブ：捕捉プ ローブ複合体の形成に適合する。好ましくは、固定プローブは、捕捉プローブに 比べ、過剰である。 「T_m」とは、２つの塩基配列認識分子間に形成されたハイブリダイゼーション 複合体の50％が変性する融解温度を指す。T_mより低い温度では、ハイブリダイゼ ーション複合体形成が補助され、一方T_mより高い温度では、複合体形成は補助さ れない。 捕捉プローブまたは固定プローブを含むハイブリダイゼーション複合体のT_mに 関し、存在してもよい１つまたはそれ以上のリンカーとのハイブリダイゼーショ ンを通じて形成された複合体が含まれる。リンカーが存在している場合、ハイブ リダイゼーション複合体のT_mは、当業者により容易に計算されるように、複合体 の全体の安定性を反映する。例えば、３つのオリゴヌクレオチドから構成される 捕捉プローブにおいて、第一のオリゴヌクレオチドが第二のオリゴヌクレオチド にハイブリダイズする第一のT_m、および第二のオリゴヌクレオチドが第三のオリ ゴヌクレオチドにハイブリダイズする第二のT_mがある。これらの第一および第二 のT_mのより低いものが、捕捉プローブの安定性、および捕捉プローブを構成する ３つのオリゴヌクレオチドが特定のハイブリダイゼーション条件下でハ イブリダイズしつづけるかを決定する。 捕捉プローブ：標的ポリヌクレオチドハイブリダイゼーション複合体は、本明 細書に記載される他の複合体と同様、示された構成要素のほかに、さらなる基を 含んでもよい。こうしたさらなる基には、例えば、標的ポリヌクレオチドにハイ ブリダイズした標識プローブ、または標的ポリヌクレオチドの増幅に有用な、標 的にハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドが含まれる。本発明が機能するのに 影響しないさらなる基もまた、存在してもよい。 標識プローブは、検出可能な基を含む塩基配列認識分子である。検出可能な基 は、例えば、蛍光部分、化学発光部分、放射性同位元素、ビオチン、アビジン、 酵素または酵素基質、または反応基であってもよい。 本発明の方法はさらに精製段階を含んでもよい。「精製」とは、精製前の試料 を構成する１つまたはそれ以上の構成要素を、試料の１つまたはそれ以上の他の 構成要素から除去することを意味する。試料構成要素には核酸が含まれ、そして タンパク質、炭水化物、脂質および標識プローブなどの成分もまた含まれる可能 性がある。好ましくは、精製段階は、試料中に存在する非標的核酸の少なくとも 約70％、より好ましくは少なくとも約90％そして、さらにより好ましくは少なく とも約95％を除去する。 本発明の方法はまた、捕捉に続き、精製された標的ポリヌクレオチド（本明細 書において、「捕捉された標的」と称される）を増幅し、増幅核酸を産生するこ とも含んでもよい。標的核酸増幅は、核酸ポリメラーゼを用い、全標的ポリヌク レオチドまたはその断片、または全標的ポリヌクレオチドまたはその断片に相補 的な核酸の、複数のコピーを産生する。当業によく知られた、適した増幅技術に は、例えば、転写関連増幅、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、レプリカーゼ媒介 増幅、およびリガーゼ連鎖反応(LCR)が含まれる。 「その断片」の増幅は、完全長標的ポリヌクレオチドまたはその相補体より少 ないものを含む増幅核酸の産生を指す。こうした断片は、標的ポリヌクレオチド の一部を増幅することにより、例えば、標的ポリヌクレオチドの内部部分にハイ ブリダイズし、そしてそこから重合を開始する、増幅オリゴヌクレオチドを使用 することにより、産生してもよい。好ましくは、増幅断片は検出可能な標的配列 を含む。増幅核酸の存在を、異なるよく知られた技術、例えば、標識プローブを 増幅核酸にハイブリダイズさせることなどを用いて検出してもよい。当業によく 知られた、核酸を検出する他の技術には、例えば、ゲルろ過、ゲル電気泳動、お よび高速液体クロマトグラフィー（HPLC）が含まれる。 標識プローブを用い、精製捕捉標識の存在を検出してもよい。好ましくは、精 製段階を用い、捕捉された標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズした結合標識 プローブから非結合プローブを除去する。精製段階を、捕捉された標的ポリヌク レオチドの精製と同時に使用してもよい。また別に、標識プローブを精製捕捉標 的ポリヌクレオチドに添加してもよく、そして非結合標識プローブを続く精製段 階において除去してもよい。 試料構成要素またはハイブリダイゼーション反応構成要素（例えば、非結合標 識プローブなど）に関し、「除去」とは、望ましくない構成要素の少なくとも70 ％が、保持される構成要素から分離されることを意味する。より好ましくは望ま しくない構成要素の少なくとも90％、そして、さらにより好ましくは少なくとも 95％が除去される。構成要素は、例えば洗浄処理を用いることによるなど、標準 的な処理を用いて除去してもよい。 捕捉された標的ポリヌクレオチドの存在は、捕捉プローブ上または別の検出プ ローブ上に位置してもよい均質な検出可能標識を用いて検出してもよい。「均質 な検出可能標識」は、標識が、標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズした分子 上にあるかどうかに基づく、均質な様式でその存在を検出することが可能な標識 を指す。したがって、均質な検出可能標識は、標識のハイブリダイズしていない 型からハイブリダイズした型を物理的に除去することなく検出することが可能で ある。均質な検出可能標識については、Arnoldら、米国特許第5,283,174号；Woo dheadら、米国特許第5,656,207号;およびNelsonら、米国特許第5,658,737号の実 施例等にすでに記載されている。 固定プローブは、捕捉プローブの１つまたはそれ以上の反復塩基配列に相補的 な、１つまたはそれ以上の反復塩基配列を含んでもよい。これらの相補的な反復 配列は、好ましくは、少なくとも長さ５塩基の配列であり、そして結合領域とし て働く(すなわち、固定プローブの捕捉プローブ結合領域、および捕捉プローブ の固定プローブ結合領域)。固定および捕捉プローブの相補的な反復配列は２つ のプローブ間のハイブリダイゼーションを容易にする。 「反復」配列とは、規則的に繰り返す塩基配列の配列、例えば、ポリアデニン (A_n)、ポリチミン(T_n)、ポリシトシン(C_n)、およびポリグアニン（G_n）の核酸ホ モポリマーにより形成されるものなどを指す。反復配列にはまた、ATリピート（ [AT]_n）など、核酸混合ポリマーも含まれる。 好ましくは、捕捉プローブの反復塩基配列は、固定プローブの相補的な反復塩 基配列より長い。２つのプローブの相補的な反復配列の長さは、固定プローブ： 捕捉プローブ複合体のT_mを決定する。捕捉プローブの反復塩基配列がより長けれ ば、固定プローブの反復塩基配列への結合が容易になる。これは、付加された長 さが、そうでなければ固定プローブへのハイブリダイゼーションに干渉する標的 ポリヌクレオチドの二次構造との間に距離を提供するからである。好ましくは、 固定プローブの反復塩基配列は、少なくとも長さ約10塩基、さらにより好ましく は約14塩基であり；そして相補的な捕捉プローブの反復塩基配列は少なくとも長 さ約10塩基であり、より好ましくは少なくとも約14塩基であり、さらにより好ま しくは少なくとも長さ約25塩基であり、そして最も好ましくは長さ約30塩基であ る。 本発明の方法を用い、標的ポリヌクレオチドが試料中に存在するか決定する。 該方法は、２つのハイブリダイゼーションを含む標的捕捉段階、精製段階、所望 による増幅段階および検出段階を含む。標的ポリヌクレオチドの存在下で、第一 のハイブリダイゼーションにおいて、捕捉プローブ：標的ポリヌクレオチド複合 体が産生され、そして第二のハイブリダイゼーションにおいて、固定プローブが 捕捉プローブとハイブリダイズする。したがって、標的ポリヌクレオチドの存在 下で、標的捕捉段階の結果、固定プローブ、捕捉プローブ、および標的ポリヌク レオチドを含む、固定プローブ：捕捉プローブ：標的複合体が形成される。標的 ポリヌクレオチドが存在しなければ、この固定プローブ：捕捉プローブ：標的複 合体は形成されず、そして第二のハイブリダイゼーションの固定プローブ：捕捉 プローブ複合体のみが形成される。標的捕捉段階中に形成される複合体を精製し 、標的ポリヌクレオチドを含む試料に関し、精製標的ポリヌクレオチドを産生す る。 精製標的ポリヌクレオチドを増幅し、そしてその後検出してもよく、または精 製標的ポリヌクレオチドを増幅段階なしに検出してもよい。好ましくは、精製捕 捉標的ポリヌクレオチドまたは増幅核酸の存在を、標識プローブを用いて検出す る。より好ましくは、標識プローブは標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズし 、第一のハイブリダイゼーション条件の温度より高いT_mを有する標識プローブ： 標的ポリヌクレオチド複合体を形成する。複合体中の標識プローブの検出は、試 料中の標的ポリヌクレオチドの存在を示す。 任意の増幅段階が該方法に含まれるとき、精製標的ポリヌクレオチドを増幅し 、増幅核酸を産生し、該増幅核酸をその後上述のように標識プローブを用い、ま たは核酸を検出する多様ないかなる既知の技術(例えば、蛍光挿入剤(intercalat ing agent)を用いた視覚化）によって検出する。増幅核酸の検出は、標的ポリヌ クレオチドが初めに試料中に存在していたことを示す。 捕捉プローブの標的ポリヌクレオチドへのハイブリダイゼーションの間、遊離 捕捉プローブの濃度を最大にし、そして当業者に知られる好ましい液相ハイブリ ダイゼーション動力学を利用するため、捕捉プローブを固体支持体に結合させる より溶液中に置くことが有用である。すなわち、溶液相ハイブリダイゼーション は一般的に、同一の相補的な結合配列を用いる固体相ハイブリダイゼーションよ り、100倍速く起こる。また、試薬添加および分離の回数、および化学反応の複 雑さを最小にするため、捕捉プローブの標的ポリヌクレオチドへのハイブリダイ ゼーション前に、固定プローブを添加することも望ましい。本発明のこれらの側 面は、自動アッセイには特に重要である。 捕捉プローブおよび２つの異なるハイブリダイゼーション条件を用いて、標的 ポリヌクレオチドを固体支持体上に捕捉する本発明の方法において、固定プロー ブを含む固体支持体、捕捉プローブ、および標的核酸が、両方のハイブリダイゼ ーション条件中に存在してもよい。存在する他の成分を、捕捉標的が保持される 条件を用いて洗い落とすことにより、他の成分から捕捉された標的核酸を精製し てもよい。その後、捕捉プローブ：固定プローブ複合体のT_mより高い温度でイン キュベーションすることによるなど、適切な条件を用いて、精製標的ポリヌクレ オチドを固体支持体から溶出させてもよい。 これらの方法は、標的ポリヌクレオチドを増幅し、溶液中に遊離の増幅核酸を より大量に産生する、診断アッセイの一部として特に有用である。溶液中の増幅 核酸は、核酸ハイブリダイゼーションなど、よく知られた技術を用いて検出して もよい。 本発明の方法を用いた自動診断アッセイを、例えば：(1)標的ポリヌクレオチ ドを有すると疑われる試料を、標的に特異的な捕捉プローブおよび固体支持体に 連結した固定プローブを含む容器に添加し；(2)２段階ハイブリダイゼーション を行い、第一のハイブリダイゼーション条件においてインキュベーションするこ とにより、そしてその後、第二のハイブリダイゼーション条件のものに温度を下 げることにより、標的ポリヌクレオチドを固体支持体上に捕捉し；(3)固体支持 体に結合していない試料構成要素を、例えば洗浄段階を用いることにより除去し ；(4)標的のすべてまたは一部の核酸増幅において用いるオリゴヌクレオチド、 増幅を行うのに適切な溶液構成要素、および増幅核酸にハイブリダイズしそして 均質な検出可能標識を含むプローブを含む溶液を、固体支持体に添加し；(5)増 幅核酸を産生し；そして（6）試料を処理し、増幅核酸にハイブリダイズした標 識からシグナルを産生することなどにより、増幅核酸を検出することにより、行 ってもよい。シグナルの検出は、試料中の標的ポリヌクレオチドの存在を示す。 本明細書に提供される開示に基づき、上記の計画の異なる変形を行ってもよい。 図１から３は、標的ポリヌクレオチドを捕捉し、随意にポリヌクレオチド標的 を増幅し、そしてポリヌクレオチド標的の存在を検出する本発明の使用の図式的 例示を提供する。図１から３は、好ましい態様を例示するが、当業者は、他の変 形および同等物もまた、本明細書に提供される記述に基づき、記載される発明を 実施するのに用いてもよいことを認識するであろう。図４は、ホモポリマーであ る固定プローブを介して固体支持体に結合することが可能である複合体の種類の 例を示す。 図1Aおよび1Bは、標的ポリヌクレオチドの捕捉を例示する。アッセイの開始時 、固定プローブ（a）を固定支持体粒子10に結合させ、そして捕捉プローブ（b） および標的ポリヌクレオチド（c）は溶液中に遊離している。図1Aを参照すると 、第一のハイブリダイゼーション条件において、捕捉プローブ：標的ポリ ヌクレオチド複合体15が溶液中に形成されるが、捕捉プローブ（b）は実質的に 固定プローブ（a）に結合していない。その後、図1Bに示されるように、該反応 を第二のハイブリダイゼーション条件においてインキュベーションする。第二の ハイブリダイゼーション条件において、捕捉プローブ（b）は、固定プローブ（a ）にハイブリダイズし、それにより、標的ポリヌクレオチド（c）を固定プロー ブ：捕捉プローブ：標的核酸複合体20中に捕捉する。好ましくは、第二のハイブ リダイゼーション条件は、第一のハイブリダイゼーション条件から温度を下げる ことにより、同じ溶液中で起こる。固定プローブを介して固体支持体に結合する ことが可能な複合体の特定の例は、図４に例示される。 図２は、転写関連増幅を用いた、標的ポリヌクレオチド配列（c）の増幅を含 む、さらに１つの態様を例示する。核酸の5'端および3'端は、それぞれ核酸を表 す列の隣、図の右側に(−)および(＋)により示されている；この表記を用い、「 (−)」と示された鎖は、アンチセンス鎖を示し、そして「(＋)」と記された鎖は 、センス鎖を示す。末端が矢印（→または←）になっているダッシュ（---）は 、核酸の相補鎖の核酸重合を示す。 図２において、段階（A）は、プロモーター配列「ｐ」を含むオリゴヌクレオ チドとハイブリダイズしており、核酸ハイブリダイゼーション複合体22を形成す る、図1Bに記載されるような、捕捉された標的ポリヌクレオチド（c）を例示す る。逆転写酵素などのポリメラーゼを用い、相補的DNAを合成する（---により示 される)。段階（B）において、（−）鎖はプライマー24にハイブリダイズし、そ して逆転写酵素を用い、重合（---により示される）により二本鎖プロモーターP を含むDNA二本鎖23を形成する。段階（B）において、複合体23は溶液中に遊離し て示されているが、固体支持体10から離れている必要はない。プライマー24とハ イブリダイズすることが可能な（−）鎖の作成は、変性段階またはRNase H活性 を用いることによるなど、当業によく知られる異なる技術を用いて達成してもよ い。好ましくは、標的がRNAポリヌクレオチドである場合は、RNase H活性を使用 する。 図2、段階（C）から（E）は、段階（B）の産物からの増幅核酸の産生を例示す る。T7 RNAポリメラーゼなどのRNAポリメラーゼを用いて、複数のセンス RNA転写物を生成し(段階(C))、これにプライマー伸長のため、プライマー24が結 合できる(段階(D))。段階（D）のダッシュは、プライマー伸長を例示する。プラ イマー24は、時にプロモーター・プライマーと称されるが、これを増幅を開始す る前に添加してもよい。 段階（C）から（F）の間、（−）鎖をプロモーター・プライマー24へのハイブ リダイゼーションに利用できるようにする。図2、段階（D）から（F）は、RNAポ リメラーゼにより認識され、そしてさらなるRNA転写物を産生するのに用いられ る、二本鎖プロモーターを形成するためのプロモーター・プライマーの使用を例 示する。産生された転写物を、他の増幅サイクルに使用してもよい(段階(F)およ び（C）を結ぶ、図２の左の矢印により示される)。増幅段階は、「転写関連増幅 」以下に、さらに詳細に記載される。 図3Aから3Cは、標識プローブ（d）を用いた標的ポリヌクレオチド（c）の捕捉 および検出を例示する。アッセイ開始時、試薬混合物は、固体粒子10に結合した 固定プローブ(a)、捕捉プローブ(b)、標的ポリヌクレオチド(c)、および溶液中 に遊離の標識プローブ（d）を含む。図3Aに示されるように、第一のハイブリダ イゼーション条件において、捕捉プローブ：標的ポリヌクレオチド：標識プロー ブハイブリダイゼーション複合体30が、溶液中に形成される。図3Aに示される捕 捉プローブ（b）は、第一の塩基配列認識ポリヌクレオチド33および第二の塩基 配列認識ポリヌクレオチド35に連結するリンカー31からなる。第一の塩基配列認 識ポリヌクレオチド33は、標的ポリヌクレオチド結合領域32を含み、そして第二 の塩基配列認識ポリヌクレオチド35は、固定プローブ結合領域34を含む。 図3Bに示されるように、第二のハイブリダイゼーション条件において、捕捉プ ローブ：標的ポリヌクレオチド：標識プローブハイブリダイゼーション複合体30 は、固定プローブ（a）にハイブリダイズし、それにより、固定プローブ：捕捉 プローブ：標的ポリヌクレオチド：標識プローブ複合体40（すなわち、結合標識 プローブ）を産生する。この複合体40は、固定プローブ（a）が固定プローブ結 合領域34とハイブリダイズするとき、形成される。第二のハイブリダイゼーショ ン条件は、第一のハイブリダイゼーション条件の温度を下げることにより達 成してもよい。 図3Cを参照すると、洗浄段階を用い、固体支持体10に結合した複合体40中に存 在する結合標識プローブ（d）から非結合標識プローブ（未提示）を除去しても よい。結合標識プローブ（d）の検出は、試料中に標的ポリヌクレオチドが初め に存在していたことを示す。 図４は、T₁₄配列として示される固定プローブが結合した固体支持体10の例を 例示する。上部の固定プローブ（右側に（a）と記される）は、T₁₄プローブが、 3'A₁₄TTTGTCAGTAACCTTGATTCATCAAG5'(配列番号1)と示される捕捉プローブの相補 的なA₁₄配列にハイブリダイズする(塩基間の「:」として示される)、固定プロー ブ：捕捉プローブ複合体中に示される。中央の固定プローブ（右側に（b）と記 される）は、固定プローブ：捕捉プローブ複合体の構成要素を、5'CAGTCATTGGAA CTAAGTAGTTC3'(配列番号2)と示される相補的な標的配列にハイブリダイズする捕 捉プローブの5'領域と共に含む、固定プローブ：捕捉プローブ：標的ポリヌクレ オチド複合体中に示される。例示される標的配列は、末端の「NNNNNN」配列によ り示されるように内部配列である。最下段の固定プローブ（右側に（c）と記さ れる）はハイブリダイズしていない。塩基配列認識分子 塩基配列認識分子は、適切な反応条件において、十分に相補的な核酸にハイブ リダイゼーションするのを可能にする配列情報を含む。「十分に相補的な」とは、 連続する核酸塩基配列であって、相補的塩基間の水素結合により、塩基配列認識 分子（例えば、他の連続する核酸塩基配列）にハイブリダイズするのが可能であ る、核酸塩基配列を意味する。相補的塩基配列は、標準的な塩基対形成（例えば 、G:C、A:TまたはA:U対形成）を用いて、塩基配列認識分子の各位で相補的であ ってもよい。また別に、相補的塩基配列は、標準的水素結合を用いて相補的でな い１つまたはそれ以上の残基（非塩基性「ヌクレオチド」を含む）を含んでもよ いが、相補的塩基配列全体は、適切なハイブリダイゼーション条件において、塩 基配列認識分子と特異的にハイブリダイズすることが可能である。当業者には、 適切なハイブリダイゼーション条件がよく知られており、配列組成物に基づき容 易に予測することが可能であり、または慣例の試験を用いて経験的に決定するこ とが可能である(例えば、Sambrookら，Molecular Cloning，A Laboratory Manua l 2^nd ed.(Cold Spring Harbor Laboratory Press,ニューヨーク州コールドスプ リングハーバー，1989)の§§1.90-1.91，7.37-7.57，9.47-9.51および11.47-11 .57、特に§§9.50-9.51,11.12-11.13,11.45-11.47,11.55-11.57を参照されたい )。これらの塩基配列認識分子は、配列情報を提供しない付加的な基を含んでも よい。付加的な基は、存在する場合は、反応条件において、塩基配列認識分子の 、十分に相補的な核酸へのハイブリダイゼーションを妨げない。 塩基配列認識分子は、骨格により共に連結されたヌクレオチド塩基認識基を含 む。ヌクレオチド塩基認識基は、核酸に存在するヌクレオチド窒素性塩基に水素 結合することが可能である。骨格は、適切なコンホメーションおよび間隔を提供 し、該基が核酸のヌクレオチドに水素結合するのを可能にする。 既定のヌクレオチド塩基認識基は、特定のヌクレオチド（例えば、A、G、C、T 、およびU）に相補的であってもよく、そしてしたがって核酸に存在するヌクレ オチドと水素結合することが可能であってもよい。ヌクレオチド塩基認識基はま た、異なるヌクレオチドと水素結合することが可能であってもよい。例えば、イ ノシンがヌクレオチド塩基認識基であるとき、U、A、またはCと水素結合するこ とが可能である。 好ましいヌクレオチド塩基認識基は、A、G、C、T、Uまたはイノシン（I）のい ずれかに水素結合することが可能である、窒素性プリンまたはピリミジン塩基、 またはそれらの誘導体である。塩基認識基の例には、A、G、C、T、UまたはI、お よびそれらの誘導体が含まれる。誘導体の例には、N⁴−メチルデオキシグアノシ ン、天然プリンおよびピリミジン塩基の代わりに使用されるデアザ−またはアザ −プリンおよびデアザ−またはアザ−ピリミジン、５または６位に置換基を有す るピリミジン塩基、および２、６または８位に改変されたまたは置き換えられた 置換基を有するプリン塩基など、修飾プリンまたはピリミジン塩基が含まれる。 こうした誘導体およびその合成は当業によく知られている(Cook、PCT国際公告第 WO 93/13121号を参照されたい)。さらなる例は、2−アミノ−6−メチルアミノプ リン、O⁶−メチルグアニン、4−チオーピリミジン、4−アミノ−ピリミジン、4 −ジメチルヒドラジン−ピリミジン、O⁴−アルキル−ピリミジン、および 当業に知られる他のものである。 塩基配列認識分子の骨格は、当業に知られる異なる基または結合により構成さ れてもよい。好ましくは、骨格は１つまたはそれより多い糖−リン酸ジエステル 結合、１つまたはそれより多いペプチド核酸骨格基、１つまたはそれより多いホ スホロチオエート結合、またはそれらの組み合わせを含む。 構造Iは、糖−リン酸ジエステル型骨格基を例示し、糖基はペントフラノシル 基である。糖基は、リン酸ジエステル結合または他の適切な結合により、共に連 結されている。 構造Iを参照すると、Xは２つの糖を連結する基を表す。Xの例には、-P(O)₃-、 -NHP(O)₃-、-OCOO-、-OCH₂CONH-、-OCH₂COO-および-OCONH-が含まれる。 本明細書に提供される他の例と同様、提供される開示に基づき、当業によく知ら れる他の同等物もまた使用してもよい。Y₁およびY₂は独立して選択される基であ る。Y₁およびY₂の例には、H、OH、最大４つまでの炭素原子を含むアルコキシ、 ハロゲン、およびC₁−C₄アルキルが含まれる。好ましくは、Y₁およびY₂は独立し て、H、OH、FまたはOCH₃のいずれかである。塩基₁(Base₁)および塩基₂(Base₂)は 、独立して選択されるヌクレオチド塩基認識基である。好ましくは、塩基₁およ び塩基₂は独立して、A、G、C、T、Uまたはイノシン（I）である。R₁およびR₂は 、独立して選択される基であって、さらなる糖−リン酸ジエ ステル型基、ペプチド核酸、および非塩基性「ヌクレオチド」(リン酸ジエステ ル骨格を含むが、ヌクレオチド塩基認識基を欠いている)、ポリエチレングリコ ール、多糖、ポリペプチド、ペプチドおよび他の非ヌクレオチド結合などのポリ マーなど、配列情報を提供しない部分を含んでもよい基を表す。他の種類の非ヌ クレオチドリンカーがよく知られている(Arnoldら、米国特許第5,585,481号を参 照されたい)。 塩基配列認識分子の構成要素であってもよい構造Iの誘導体は、骨格に異なる 種類の糖を有する分子など、当業によく知られている。例えば、塩基配列認識分 子は結合部分により連結されたシクロブチル部分を有してもよく、ここでシクロ ブチル部分は、これに結合した複素環塩基を有する(例えば、Cookら、PCT国際公 告第WO 94/19023号を参照されたい)。 塩基配列認識分子の骨格の他の型は、ペプチド核酸に存在するものなど、ペプ チド型結合である。「ペプチド核酸」は、以前記載されたように(HyrupおよびNi elsen,1996,Bioorg.& Med.Chem.4:5-23;Hydig-Hielsenら、PCT国際公告第WO 95/ 32305号)、デオキシリボースリン酸骨格が偽ペプチド（pseudopeptide）骨格に より置き換えられたDNA類似体（analog）を指す。好ましくは、ペプチド核酸は 、構造IIに例示されるように、N−（2−アミノエチル）グリシンユニットから構 成され、ここでR₁、R₂および塩基₁は、構造I型化合物に記載されたのと同様であ る。 塩基配列認識分子は、オリゴヌクレオチドおよび修飾オリゴヌクレオチドを産 生する標準的有機合成法など既知の方法を用いて産生してもよい(例えば、Eckst ein,F.,Oligonucleotides and Analogues,a Practical Approach,Chapters 1-5, 1991；Caruthersら,Meth.In Enzymol.,vol.154,p.287,1987；Bhatt、米国特許第 5,252,723号；Klemら、PCT国際公告第WO 92/07864号；Cookら、PCT国際公告第WO 93/13121号;Millerら、PCT国際公告第WO 94/15619号；McGeeら、PCT国際公告第 WO 94/02051号；Cookら、PCT国際公告第WO 94/19023号;Hyrupら,Bioorg.Med.Che m.4:5-23,1996;およびHydig-Hielsenら、PCT国際公告第WO 95/32305号；Ordoukh anianら,Nuc.Acids Res.25(19):3783-3786,1997;Myerら,Bioconjug.Chem.7(4):4 01-412,1996;Shultzら,Nuc.Acids Res.24(15):2966-2973,1996；Wooら,Nuc.Acid s Res.24(13):2470-2475,1996；Agrisら,Biochimie 77:125-134,1995；Berresse mら,Nuc.Acids Res.23(17):3465-3472,1995；Seelaら,Nuc.Acids Res.23(13):24 99-2505,1995;Vinayakら,Nuc.Acids Symp.Ser.33:123-125,1995；Limbachら,Nuc .Acids Res.22(12):2183-2196,1994；Gryaznovら,Nuc.Acids Res.20(8):1879-18 82,1992；Kawanaら,Nuc.Acids Symp.Ser.25:93-94,1991；Pfleidererら,Nuc.Aci ds Symp.Ser.24:29-32,1991；Wagnerら,Nuc.Acids Res.19(21):5965-5971,1991 ；Marquezら,Nuc.Acids Symp.Ser.22:35-36,1990；Linら,Nuc.Acids Res.17(24) :10373-10383,1989；Farranceら,Anal.Biochem.179(1):60-65,1989；Gildeaら,N uc.Acids Res.17(6):2261-2281,1989；Yeungら,Nuc.Acids Res.16(10):4539-455 4,1988；Ponら,Nuc.Acids Res.13(18):6447-6465,1985；Millicanら,Nuc.Acids Res.12(19):7435-7453,1984；Schinaziら,J.Med.Chem.21(11):1141-1146,1978を 参照されたい)。 好ましい塩基配列認識分子は独立して：(i)少なくとも１つの糖−リン酸ジエ ステル型基、少なくとも１つのペプチド核酸基、少なくとも１つのホスホロチオ エート基、またはそれらの組み合わせを含む骨格、および（ii）骨格に連結した A、G、C、T、UまたはIに水素結合することが可能な、独立して選択されるヌクレ オチド塩基認識基を含む。塩基配列認識分子は、デオキシヌクレオチド、リボヌ クレオチド、2'−メトキシ置換リボヌクレオチド、または2'−ハロ置換リボヌク レオチドである、選択された構成要素を含んでもよい。好ましくは、言及された 構成要素の１つまたはそれ以上が、塩基配列認識分子の少なくとも約70％、より 好ましくは少なくとも約80％、さらにより好ましくは少なくとも約90％、そして 最も好ましくは約100％を構成する。固体支持体への固定 塩基配列認識分子をさまざまな既知の手段により、異なるタイプの支持体に連 結し、固定プローブを形成してもよい。標準的化学技術を用いて合成されるオリ ゴヌクレオチドの固体支持体への共有結合が、すでに記載されている(Lundら,Nu c.Acids Res.16:10861-10880,1988；欧州特許出願公告第0444120号)。特に好ま しい固体支持体は、磁気誘引可能粒子であり、該粒子は、反応容器位置に誘引さ れ、そして非結合溶液構成要素が洗い流される間、その場に保持されることが可 能であるため、分離段階に有用である。磁気誘引可能粒子は、標準的な技術を用 いて産生してもよく、または入手可能な商業的供給源より得てもよい。T_m およびハイブリダイゼーション条件 本発明の方法は、ハイブリダイゼーション条件を変化させ、捕捉プローブ：標 的複合体および固定プローブ：捕捉プローブ複合体の形成時期を調節する。２つ の塩基配列認識分子がハイブリダイズする能力は、構造および周囲の反応環境に 依存する。反応環境には、２つまたはそれより多い認識分子を含む溶液の組成お よび溶液温度が含まれる。 特定のアッセイ組成を用いると、ハイブリダイゼーション複合体は、アッセイ 温度が複合体のT_mより高いとき、安定でない。塩濃度および変性剤の存在など、 当業によく知られる溶液要因が、与えられた複合体のT_mに影響する可能性がある 。ハイブリダイゼーション複合体を構成する２つの塩基配列認識分子を、本明細 書に提供される説明および当業によく知られる技術に基づき、本発明の使用に適 したT_m特性を持つよう、構築してもよい（例えば、Sambrookら,MolecularClonln g,A Laboratory Manual 2^nd ed.(Cold Spring Harbor Laboratory Press,ニュー ヨーク州コールドスプリングハーバー,1989)の§§1.90-1.91，7.37-7.57，9.47 -9.51および11.47-11.57、特に§§9.50-9.51，11.12-11.13，11.45-11.47，11. 55-11.57を参照されたい)。 ハイブリダイゼーション複合体安定性は、２つの塩基配列認識分子間の長さお よび相補性の度合い、ヌクレオチド塩基認識基、および塩基配列認識分子の骨格 により影響される。例えば、２つの塩基配列認識分子間に形成される複合体のT_m は、分子が、互いに100％未満の相補性の内部領域を持つよう構築することによ り下げることが可能である。これは、ミスマッチ、または非ヌクレオチドリンカ ーおよび非塩基性「ヌクレオチド」などのリンカー構成要素を含むことにより達 成してもよい。リンカー構成要素は、反対の鎖中の塩基の反対の位置に置かれて もよく、または鎖から「ふくらみ(bulge)」出て、それにより複合体安定性を減 少させてもよい。反対の鎖に存在するヌクレオチド塩基認識基の種類もまた、プ ローブハイブリダイゼーション複合体の安定性に影響するであろう。例えば、G: C対形成は、G:C対における水素結合はA:T対に比べ増加しているため、A:T対形成 よりも強い。 塩基配列認識分子の骨格構成要素を異なる方法で調整し、ハイブリダイゼーシ ョン複合体安定性に影響を与えてもよい。好ましい骨格は、ペプチド核酸に存在 するものなどのペプチド結合、およびリボ核酸およびデオキシリボ核酸、または それらの誘導体に存在するものなどの糖−リン酸ジエステル型結合である。ペプ チド核酸は一般的に、対応するDNA配列よりRNAと、より安定した複合体を形成す る。より好ましくは、骨格は、糖−リン酸ジエステル型結合から構成され、この 結合において、糖基および該基に連結する結合両方が複合体安定性に影響する可 能性がある。例えば、糖の影響は2'−メトキシ置換RNA基と共に示されてもよく 、ここで、2'−メトキシ置換RNAおよび相補的な2'OH RNA間に形成されるハイブ リダイゼーション複合体は、対応するDNA：RNA複合体より、一般的により安定で ある。2'−フルオロ置換RNAは、複合体安定性に対し、2'−メトキシ置換RNAと本 質的に同じ種類の影響を有する。 ２つの糖基を連結する結合は、全体の電荷または電荷密度に影響することによ り、または２つの分子構成要素間の立体会合に影響することにより、ハイブリダ イゼーション複合体安定性に影響する可能性がある。ふくらんだ結合による立体 相互作用は、複合体安定性を減少させる「ふくらみ」を生じる。荷電基（例えば ホスホロチオエート）または中性（例えばメチルホスホネート）基との結合は、 複合体安定性に影響する可能性がある。 T_mは、標準的計算を用いて予測し、そして当業によく知られる慣例試験技術を 用いて測定してもよい。こうした方法は、例えば、Sambrookら,MolecularClonin g,A Laboratory Manual 2^nd ed.(Cold Spring Harbor Laboratory Press,ニュー ヨーク州コールドスプリングハーバー,1989)の§§1.90-1.91，7.37-7.57，9.47 -9.51および11.47-11.57、特に§§9.50-9.51，11.12-11.13，11.45-11.47，11. 55-11.57、およびHoganら、米国特許第5,547,842号に記載されている。 本発明の好ましい態様の第一のハイブリダイゼーション溶液において、捕捉プ ローブ：標的ポリヌクレオチド複合体のT_mは、固定プローブ：捕捉プローブ複合 体のT_mより、少なくとも約5℃、より好ましくは少なくとも約10℃、さらにより 好ましくは少なくとも約20℃、そして最も好ましくは少なくとも約25℃、高い。ハイブリダイゼーション条件の変化 ハイブリダイゼーション条件を変える好ましい方法は、アッセイ組成物を含む ハイブリダイゼーション溶液の温度を変えることによる。温度変化は、溶液に試 薬を添加することなく容易に達成することが可能であり、そしてしたがって、自 動化により適している。自動アッセイは本発明の好ましい態様である。好ましく は、第二のハイブリダイゼーション条件は、第一のハイブリダイゼーション条件 を、少なくとも約10℃、より好ましくは少なくとも約15℃、さらにより好ましく は少なくとも約20℃、そして最も好ましくは少なくとも約25℃下げることにより 達成される。しかし、溶液のイオン強度を増加すること、または溶液を変性剤で 希釈することによるなど、ハイブリダイゼーション条件の厳密性（stringency） を下げるいかなる既知の方法を用い、第二のハイブリダイゼーション条件を達成 してもよい。増幅 増幅は、標的ポリヌクレオチドのコピー数を増加する。増幅条件は、核酸重合 に適し、少なくとも１つの核酸ポリメラーセを用いることにより、核酸テンプレ ートに相補的な核酸鎖を産生する。増幅条件には、１つまたはそれ以上の酵素、 増幅オリゴヌクレオチド、ヌクレオシド三リン酸基質、緩衝液、および適切な温 度でのインキュベーションが含まれる。特異的な条件は当業によく知られ、そし て用いられる核酸増幅の種類に依存する。 酵素 核酸増幅法を行うのに適した核酸ポリメラーゼは、容易に、商業的に入手可能 であり、または単離し、そして精製することが可能である。こうしたポリメラー ゼには、例えば、大腸菌（Escherichia coli）DNAポリメラーゼI、バシラス・ス テアロテルモフィルス（Bacillus stearothermophilus）DNAポリメラーゼI、B． カルドテネクス（B.caldotenex）DNAポリメラーゼI、T4 DNAポリメラーゼおよび Taqポリメラーゼなど、DNA依存DNAポリメラーゼが含まれる。他の適した酵素は 、例えば、T7 RNAポリメラーゼ、T3 RNAポリメラーゼ、およびSP6 RNAポリメラ ーゼなど、DNA依存RNAポリメラーゼである。適した酵素にはまた、例えば、トリ 骨髄芽球症ウイルス（AMV）逆転写酵素およびモロニーネズミ白血病ウイルス（M MLV）逆転写酵素など、RNA依存DNAポリメラーゼも含まれる。増幅はまた、レプ リカーゼ(例えばQβレプリカーゼ)、リガーゼ（例えば大腸菌DNAリガーゼおよび T4 DNAリガーゼ）または酵素の組み合わせを用いて達成してもよい。 増幅オリゴヌクレオチド 「増幅オリゴヌクレオチド」は、標的核酸またはその相補体にハイブリダイズ し、そして増幅反応に関与するオリゴヌクレオチドである。増幅オリゴヌクレオ チドの例には、プライマーおよびプロモーター・プライマーが含まれる。 増幅オリゴヌクレオチドの選択は、用いられる増幅方法および増幅される核酸 に依存する。特定の増幅オリゴヌクレオチドは、望ましい標的核酸配列および本 発明の実施者により選択される増幅方法に依存して、当業者により、容易に設計 されそして合成されてもよい。一般的に用いられる増幅オリゴヌクレオチドの例 には、ヌクレオチド塩基配列に類似または相補的であり、そして所望により標的 核酸に相補的でない核酸配列領域を随意に含んでもよいものが含まれる。例えば 、増幅オリゴヌクレオチドは、RNAポリメラーゼにより認識されるプロモーター 配列、またはレプリカーゼにより認識される塩基配列を含んでもよい。 類似増幅オリゴヌクレオチドには、標的核酸の領域に完全に相補的な核酸（例 えば、標的核酸がRNAであるとき、cDNA）にハイブリダイズすることが可能な領 域が含まれる。類似オリゴヌクレオチドは、相補的標的配列の3'端近傍に位置す る位で相補的核酸にハイブリダイズしてもよい。類似オリゴヌクレオチドはまた 、プロモーター配列領域などの非相補的領域、および／または核酸ポリメラーゼ 活性を阻害する修飾など、１つまたはそれより多い修飾も含んでもよい。好まし くは、類似オリゴヌクレオチドは、少なくとも約10の連続する塩基、そしてより 好ましくは少なくとも約12の連続する塩基であって、標的核酸の領域と完全に相 補的である核酸に相補的な前記塩基を含む。連続する塩基は、標的核酸配列の領 域に、好ましくは少なくとも約80％、より好ましくは少なくとも約90％、そして 最も好ましくは約100％相補的である。類似オリゴヌクレオチドは好ましくは、 長さ約12から60ヌクレオチド塩基であり、そして所望により修飾ヌクレオチド塩 基を随意に含んでもよい。 テンプレートに相補的な増幅オリゴヌクレオチドは、標的配列の3'端に位置す る位で標的核酸にハイブリダイズすることが可能な領域を有する。テンプレート に相補的なオリゴヌクレオチドは、5'端プロモーター領域など、非相補的領域を 含んでもよい。好ましくは、標的に相補的なオリゴヌクレオチドは、少なくとも 約10の連続する塩基、より好ましくは少なくとも約12の連続する塩基であって、 標的核酸配列の領域に相補的である塩基を含む。連続する塩基は、標的配列の領 域に、好ましくは少なくとも約80％、より好ましくは少なくとも約90％、そして 最も好ましくは約100％相補的である。テンプレートに相補的なオリゴヌクレオ チドは好ましくは、長さ約12から60塩基であり、そして修飾ヌクレオチドを含ん でもよい。 「プライマー」とは、随意に修飾されたオリゴヌクレオチドであって、テンプ レートにハイブリダイズすることが可能であって、そして既知の重合反応におい て、効率的に伸長されることが可能である3'端を有する、オリゴヌクレオチドを 指す。プライマーの5'領域は、標的核酸に相補的でなくてもよい。5'端の相補的 でない領域がプロモーター配列を含む場合、「プロモーター・プライマー」と称 される。プライマーまたはプロモーター・プライマーは、標的核酸に類似または 相補的であってもよい。転写関連増幅 転写関連増幅は、RNAポリメラーゼを用い、核酸テンプレートから複数のRNA転 写物を産生する。転写関連増幅は、一般的に、RNAポリメラーゼ、DNAポリメラー ゼ、デオキシリボヌクレオシド三リン酸、リボヌクレオシド三リン酸、およびプ ロモーター・テンプレート相補的オリゴヌクレオチドを使用する。しばしば類似 オリゴヌクレオチドもまた用いられる。 転写関連増幅の異なるバリエーションが当業によく知られる。異なる反応条件 および異なる数および種類の増幅オリゴヌクレオチドを用いる、異なるバリエー ションの例は、Burgら、米国特許第5,437,990号；Kacianら、米国特許第5,399,4 91号および第5,554,516号；Kacianら、PCT国際公告第WO 93/22461号；Gingeras ら、PCT国際公告第WO 88/01302号；Gingerasら、PCT国際公告第WO 88/10315号； Malekら、米国特許第5,130,238号；Urdeaら、米国特許第4,868,105号および第5, 124,246号；McDonoughら、PCT国際公告第WO 94/03472号；およびRyderら、PCT国 際公告第WO 95/03430号に詳細に記載されている。 簡潔には、一般的に、転写関連増幅は、プロモーター・テンプレート相補的オ リゴヌクレオチドを用い、該オリゴヌクレオチドは、二本鎖を形成するとRNAポ リメラーゼにより認識される5'塩基配列領域(図２において「P」と示される)、 および（図2、段階（A）に示されるように）標的配列の3'の位置でテンプレート 核酸にハイブリダイズすることが可能な3'配列領域を含む。プロモーター・テン プレート相補的オリゴヌクレオチドおよびテンプレートがハイブリダイズした後 、二本鎖プロモーターがテンプレートの上流に形成される。二本鎖プロモーター は、ポリメラーゼが媒介するプロモーター・テンプレート相補的オリゴヌクレオ チドのプライマー伸長により形成され、標的相補的鎖を産生した（図2、段階（A ）を参照されたい）後、類似オリゴヌクレオチド（例えば、図2、段階（B）のプ ライマー24）のハイブリダイゼーションおよび類似オリゴヌクレオチドのプライ マー伸長を行ってもよい(図2、段階（B）を参照されたい)。二本鎖プロモーター を形成するのに、標的核酸のプライマー伸長が関与するものなど、他の既知の技 術が適切である。 転写関連増幅は、RNAポリメラーゼ活性を有する酵素がプロモーター領域に結 合し、そして一本鎖RNA転写物が5'から3'方向に合成されることにより進行する( 図2、段階（C）を参照されたい)。単一のテンプレートを用いた転写関連増幅に より複数のRNA転写物（例えば、約100から3,000）を産生してもよい(例えば図2 、段階（C）から（F）を繰り返すことにより)。 本発明の好ましい態様において、RNase H活性を用いる転写関連増幅法が、標 的増幅に用いられる。これは、本質的に一定の反応条件において、一本鎖増幅核 酸を大量に生成する。より好ましくは、RNase H活性は、逆転写酵素により供給 される。 他の増幅方法 本発明の方法の増幅段階において、他のよく知られる増幅法を用いてもよく、 レプリカーゼ媒介増幅、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、およびリガーゼ連鎖反応 （LCR）が含まれる。レプリカーゼ媒介増幅は、自己複製RNA分子、およびQBレプ リカーゼなどのレプリカーゼを使用する(例えば、Kramerら、米国特許第4,786,6 00号；PCT国際公告第WO 90/14439号を参照されたい)。PCR増幅はよく知られてお り、そしてDNAポリメラーゼ、プライマーおよび熱サイクルを使用し、DNAまたは RNAの２つの相補鎖の複数のコピーを合成する(例えば、Mullisら、米国特許第4, 683,195号、第4,683,202号、および第4,800,159号；Methods in Enzymology,198 7,Vol.155:335-350を参照されたい)。LCRは少なくとも４つの別々のオリゴヌク レオチドを用い、標的およびその相補鎖を、ハイブリダイゼーション、連結、お よび変性の複数のサイクルを用いることにより、増幅する(欧州特許出願公告第0 320 308号を参照されたい)。標的ポリヌクレオチドの検出 標的ポリヌクレオチドの存在は、検出プローブを用いおよび／または増幅核酸 を検出する、異なる技術を用い、検出してもよい。好ましくは、標的ポリヌクレ オチドまたは標的ポリヌクレオチドの増幅産物、特に標的ポリヌクレオチドに相 補的な増幅核酸にハイブリダイズする標識プローブを用い、標的ポリヌクレオチ ドを検出する。 標識プローブは、異なる種類の標識を含んでもよく、そして異なる技術を用い 標識を検出してもよい。例えば、よく知られるプローブ標識には、放射性同位元 素、蛍光部分、化学発光部分、および触媒基（例えば、色の変化を生じる反応に 関与する酵素）が含まれる。こうした標識プローブの産生および／または使用の 例は、Sambrookら,Molecular Cloning,A Laboratory Manual 2^nd ed.(ColdSprin g Habor Laboratory Press,ニューヨーク州コールドスプリングハーバー，1989) 、第10章；Nelsonら、米国特許第5,658,737号；Woodheadら、米国特許第5,656,2 07号；Hoganら、米国特許第5,547,842号；Arnoldら、米国特許第5,283,174号；K ourilskyら、米国特許第4,581,333号；およびBeckerら、欧州特許出願公告第0 7 47 706号に詳細に記載されている。 標識プローブは標的ポリヌクレオチド、増幅核酸、または直接または間接的に 標的ポリヌクレオチドまたは増幅核酸にハイブリダイズする中間分子にハイブリ ダイズしてもよい。間接ハイブリダイゼーションは、共にハイブリダイズする複 数の中間分子を用いることにより達成してもよい。 増幅核酸は、標識プローブを用い、または核酸を検出する他のよく知られた方 法を用い、検出してもよい。例えば、標識前駆体を用いることにより増幅中に、 または蛍光挿入剤（例えばエチジウム・ブロミド）を用い増幅後に、増幅核酸を 標識してもよい。例えば、ゲルろ過、ゲル電気泳動、およびHPLCなど、よく知ら れる方法を用い、標識増幅核酸を検出してもよい。 以下の例は、本発明のいくつかの好ましい態様を例示するが、当業者は、他の 試薬および反応条件を用い、本発明の方法を同等に実行してもよいことを認識す るであろう。 実施例1：相補的長さを変化させることによるT_mの調整 ハイブリダイゼーション複合体のT_mを調整する１つの方法は、複合体を構成す る２つの核酸間の相補的な長さを変化させることである。本実施例は、複合体に おける相補的な長さの違いによる、T_mの変化を例示する。 ハイブリッドを第一および第二のオリゴヌクレオチド鎖間に形成した。第一の 鎖は40デオキシチミジン（dT₄₀）のホモポリマーであり、そして第二の鎖は異な る大きさのデオキシアデノシン（dA_n）のホモポリマーであった。これらのオリ ゴヌクレオチドを、標準的な核酸合成法を用い、合成した。 両方の鎖(各350pmol)を20μlの2Xハイブリダイゼーション緩衝液(200mMコハク 酸リチウム(pH 5.1-5.2)、17％ラウリル硫酸リチウム(LLS)、３mMエチレンジア ミン四酢酸(EDTA)、および３mMエチレングリコールN,N,N',N'−四酢酸(EGTA))を 含め、体積40μl中で混合し、そして55℃で30分加熱した。その後、各複合体を1 Xハイブリダイゼーション緩衝液（すなわち、2Xハイブリダイゼーション緩衝液 の半分の濃度）で300μlに希釈した。 この溶液中で、深色シフト（hyperchromatic shift）を検出することにより、 T_mを測定した。簡潔には、反応混合物温度における増加性変化中、260nmの吸光 度を測定し、そしてその温度範囲にわたり、溶液の吸光度におけるシフトを検出 した。T_mは吸光度シフトの中点の温度である。表１は、dA_n長がdA₁₀からdA₄₀の 範囲にわたり変化する、ハイブリダイゼーション複合体の結果を示す。 これらの結果からわかるように、相補的な長さが増加するにつれ、複合体のT_m もまた増加した。より長いハイブリダイゼーション複合体（例えば、dA₃₀：dT₄₀ ）は、派生対形成（offset pairing）(例えば、30量体、29量体、28量体対形成 など)により、混合物中に潜在的に多くの種類のハイブリダイゼーション複合体 が存在するため、比較的広い吸光度シフトを有する傾向があった。より短いハイ ブリダイゼーション複合体を生じるホモポリマーの組み合わせ（例えば、最大15 量体複合体を形成することが可能なdA₁₅：dT₄₀）は、約60℃より低いT_mを有した 。 溶液中で、磁気ビーズに結合した固定ポリdT₁₄またはdT₃₀プローブ100μgを³² P標識したdA₃₀捕捉プローブ2.5pmolとインキュベーションすることによ り、この特性をさらに調べた。反応物は、ハイブリダイゼーション緩衝液（3mME DTA、３mM EGTA、17％ LLS、190mMコハク酸、250mM水酸化リチウム、pH 5.1±0. 1）中で60℃または室温（約25℃）で30分インキュベーションし、各ハイブリダ イゼーション条件に関し、５回反復した。室温では、dT₁₄およびdT₃₀プローブに ハイブリダイズする標識dA₃₀プローブの平均パーセンテージは、それぞれ90％お よび88％であり、60℃では、dT₁₄およびdT₃₀プローブにハイブリダイズする標識 dA₃₀プローブの平均パーセンテージは、それぞれ61％および1％であった。 これらのハイブリダイゼーション特性は、次の実施例に示されるように、２つ の異なる温度でのハイブリダイゼーション条件中に固定プローブが存在する、２ 段階ハイブリダイゼーションアッセイにおいて利用した。 実施例2：2段階ハイブリダイゼーション 本実施例は、２つのハイブリダイゼーション温度を用い、標的ポリヌクレオチ ド捕捉を達成する、２段階ハイブリダイゼーション法を例示する。１つのアッセ イ条件においては、捕捉プローブ、標的ポリヌクレオチドおよび固定プローブは 、両方のハイブリダイゼーション条件を通じ、混合物中に共存した。他のアッセ イにおいては、第一のハイブリダイゼーション条件において、捕捉プローブが標 的ポリヌクレオチドにハイブリダイズした後、固定プローブを添加した。第一の アッセイの共存混合物は、必要とされる試薬添加段階がより少ないため有益であ るが、固定プローブを別に添加することにより、共存混合物状態で行われる２段 階ハイブリダイゼーションで見られるものより、一般的に、約２倍高いシグナル が生じた。 捕捉プローブオリゴヌクレオチドおよびアクリジニウムエステル（AE）標識標 的ポリヌクレオチドを合成し、そして標準的技術を用い検出した。こうした技術 は、Sambrookら,Molecular Cloning,A Laboratory Manual 2^nded.(Cold Spring Harbor Laboratory Press,ニューヨーク州コールドスプリングハーバー，1989) 、第10章；Nelsonら、米国特許第5,658,737号；Woodheadら、米国特許第5,656,2 07号；Hoganら、米国特許第5,547,842号；およびArnoldら、米国特許第5,283,17 4号に記載されるように、当業に知られている。 初めに、捕捉プローブ（1.25pmol）およびAE標識標的ポリヌクレオチドを、Se radyn磁気ビーズに結合したポリT固定プローブ100μgを含むまたは含まない、1X ハイブリダイゼーション緩衝液（実施例１を参照されたい）中で60℃で30分イン キュベーションし、そしてその後30分、室温に変えた。ビーズに結合した固定プ ローブなしで60℃でインキュベーションした試料に関し、本構成要素(1Xハイブ リダイゼーション緩衝液50μl中)を第二のインキュベーションの開始時に添加し た。両試料は、固定プローブを既に含むアッセイに、1Xハイブリダイゼーション 緩衝液50μlを添加することにより、同体積に保った。固定プローブは、磁気ビ ーズである固体支持体に結合されたdT₁₄またはdT₃₀のホモポリマーであった。捕 捉プローブは、標的ポリヌクレオチド（淋菌（Neisseria gonorrhoeae）16S rRN A配列）中の配列に相補的な塩基配列およびdA₁₅またはdA₃₀のポリAテールを有す るポリヌクレオチドであった。標的配列はAE標識淋菌16Sr RNAであった。この組 み合わせを用い、60℃における第一のハイブリダイゼーション中、標的配列を捕 捉プローブの標的相補的配列とハイブリダイズさせ、そして室温における第二の ハイブリダイゼーション中、捕捉プローブのdA領域を固定プローブのdT領域とハ イブリダイゼーションさせることにより、固定プローブ：捕捉プローブ：標的ポ リヌクレオチド複合体が形成された。 固定プローブを含むビーズを反応容器の位置に誘引するため磁気場を適用し、 そしてその後結合緩衝液（50mMコハク酸リチウム、100mM LiCl、1.5％LLS、1.5m M EDTA、1.5mM EGTA、pH5.2）で２回洗浄することにより、捕捉されたAE標識標 的ポリヌクレオチドを精製した。該ビーズを再懸濁し、そしてAE標識から産生さ れる化学発光を測定することにより、捕捉された標的ポリヌクレオチドを検出し た。化学発光は、実質的に以前記載された（Arnoldら,Clinical Chemistry 35:1 588-1594(1989)；Nelsonら、米国特許第5,658,737号）ような技術を用い、相対 光単位（RLU）として検出した。表２に示されるRLUの結果は、三重に試験した試 料の平均値である。 ¹は標識標的の62％の捕捉に相当する² は標識標的の67％の捕捉に相当する 表２の結果は、２段階ハイブリダイゼーションを用い、捕捉プローブと、両方 のハイブリダイゼーション中反応混合物に存在するかまたは第二のハイブリダイ ゼーション前に添加される固定プローブとを用い、標的ポリヌクレオチドを有効 に捕捉することが可能であることを示す。したがって、本方法は、両方のハイブ リダイゼーション中に、すべての試薬が共存して存在するため、必要とされる試 薬添加段階がより少ないとき、標的捕捉を達成することが可能である。表２の結 果はまた、相対的に短い相補配列（dT₁₄およびdA₁₅）が固定プローブ：捕捉プロ ーブ：標的ポリヌクレオチド複合体において、標的捕捉に有効であったことを示 す。14量体の固定プローブを使用すると、固定プローブが第二のハイブリダイゼ ーション時に添加されても、または両方のハイブリダイゼーション中に存在して いても、実質的に同じシグナルが生じた。dT₃₀:dA₁₅の組み合わせに比べ、dT₁₄: dA₃₀の組み合わせの方が、より高いシグナルが得られることからわかるように、 より短い固定プローブホモポリマーは、より短い捕捉プローブホモポリマーより 、より有用であるようだった。 実施例3：増幅標的配列を用いた２段階ハイブリダイゼーション 本実施例は、本発明の２段階ハイブリダイゼーション法を用い、臨床試料中に 存在するヒト結核菌（Mycobacterium tuberculosis）標的ポリヌクレオチドを検 出することが可能であることを示す。該アッセイはまた、他のマイコバクテリウ ム属種（すなわち、ウシ結核菌(M.bovis)、サル結核菌（M.simiae）およびM.ア フリカヌム(M.africanum)、しばしば集合的にヒト結核菌複合体と称される）を 検出することも可能であったが、わかりやすくするため、本明細書ではヒト結核 菌に関して記載されるであろう。 基本的なプロトコルには以下の段階が含まれる。臨床試料（例えば、痰、気管 支肺胞洗浄または気管支洗浄の沈渣500μl）を、同体積の溶解緩衝液（4％（w/v ）LLSを含む、2.2M LiCl、250mM HEPES緩衝液、pH7.5）に添加することにより、 試料の溶解物を調製し、そして溶解物中の生物を熱（95℃で15分）で殺した。ヒ ト結核菌が臨床試料に存在する場合、ヒト結核菌由来の標的ポリヌクレオチド（ 例えばrRNA配列）が溶解物中に存在するであろう。溶解物のアリコット（250μl ）を、ヒト結核菌標的配列に特異的な捕捉プローブおよび固体支持体に結合した 固定プローブを含む同体積の溶液と混合した。捕捉プローブは、ヒト結核菌のrR NA配列に相補的な5'の15塩基配列、内部のT₃、および3'のdA₄₀テールを含む、58 塩基オリゴヌクレオチドであった。固定プローブは、磁気粒子(0.7−1.05μ粒子 、Seradyn、インディアナ州インディアナポリス）の固体支持体にカルボジイミ ド化学反応を用い(実質的に、Lundら,Nuc.Acids Res.16:10861-10880,1988に以 前記載されたように)、結合されたポリdT₁₄配列であった。本アッセイにおいて 、反応１回に対し、捕捉プローブ５pmolおよび固定プローブ粒子50μgを用いた 。混合物を続けて２つの異なる温度（60℃で20分、および25℃で15分）でインキ ュベーションした。第一の温度では、ハイブリダィゼーション複合体のT_mが60℃ より大きかったため、捕捉プローブのヒト結核菌に相補的な配列が標的配列にハ イブリダイズし、そして第二の温度では、dA：dT複合体のT_mが約50℃より低かっ たため、ホモポリマーである固定プローブが捕捉プローブの相補的ホモポリマー 領域にハイブリダイズした。両インキュベーション後、実質的に実施例２に記載 されたように、磁気場を用い、溶液から磁気ビーズを分離した。ヒト結核菌が試 料中に存在していた場合、これらの磁気ビーズは固定プローブ：捕捉プローブ： 標的ポリヌクレオチドからなるハイブリダイゼーション複合体と結合していた。 ヒト結核菌が試料中に存在していなかった場合、ビーズは固定プローブおよび捕 捉プローブからなるハイブリダイゼーション複合体と結合していた。ビーズを緩 衝液に再懸濁し、そしてその後磁気分離段階を繰り返すことにより、ビーズを１ 回の洗浄について洗浄緩衝液１mlで２回洗浄した。実質的にKacianら、米国特許 第5,399,491号および第5,554,516号に記載された方法を用い、転写関連増幅を行 うため、洗浄したビーズをその後、核酸増幅試薬溶液75μlに再懸濁した。ビー ズおよびヒト結核菌標的ポリヌクレオ チドに特異的なプライマー各15pmolを、蒸発を防ぐため不活性油の層(200μl)で 覆い、反応混合物(40mM Trizma塩基、pH 7.5、17.5mM KCl、20mM MgCl₂、5％ポ リビニルピロリドン(PVP)、１mM各dNTP、４mM各rNTP)中で、60℃で10−15分、そ してその後41.5−42℃で５分、インキュベーションした。逆転写酵素（25μl中 、T7 RNAポリメラーゼ約750単位および約2,000単位）を反応ごとに添加し、混合 し、そして標的ポリヌクレオチド増幅を41.5−42℃で２時間続けた。実質的に以 前記載されたように(米国特許第5,658,737号の第25欄、27−46行；Nelsonら,199 6,Biochem.35:8429-8438の8432)、化学発光として検出されそして相対光単位（R LU）で表されるAE標識プローブを用い、増幅されたヒト結核菌標的配列を検出し た。各アッセイに関し、試料として同体積の陰性痰で置き換える以外はすべて同 一の試薬からなる陰性コントロール、および試料の代わりに、抽出総細胞ヒト結 核菌RNA（rRNA約2000コピーを含む）を含む以外はすべて同一の試薬からなる陽 性コントロールを含んだ。試料を各アッセイに関し、二重に試験した(表３のRLU No.1およびRLU No.2)。 ヒト結核菌の存在が陽性であるか独立して決定した（標準的な臨床塗沫分析お よび／またはBACTEC培養液培養結果に基づく）15の臨床試料に対する本アッセイ の結果を、表３に示す。 表３に示される結果から理解可能であるように、少なくとも１つの臨床アッセ イ結果に基づきヒト結核菌に関し陽性であった試料は、２段階ハイブリダイゼー ションアッセイにおいて、陰性コントロールと比較して、陽性に試験された。陽 性結果は陰性コントロールの少なくとも約10倍大きいRLU表示度数を有する試料 に基づいていた。大部分の試料に関し、陽性結果は、陰性コントロールの少なく とも約100倍大きいRLU表示度数に基づいた。一般的に、試料中にヒト結核菌標的 ポリヌクレオチドが存在することを示す化学発光は、陰性コントロールにおいて 検出されるものより約1,000倍大きく、そして本質的に陽性コントロールのもの と等しいかまたはそれ以上だった。 実施例4：淋菌標的の異なるレベルを検出するための２段階ハイブリダイゼーシ ョンアッセイ 本実施例は、本発明の２段階ハイブリダイゼーション法を用いて、細菌感染を 示す、わずか５fgの標的ポリヌクレオチドを検出することが可能であることを示 す。標的ポリヌクレオチドは、淋菌に特異的なrRNA配列（Hoganら、米国特許第5 ,541,308号；Nelsonら,1996,Biochem.35:8429-8438）であった。さらに、試料を ３日にわたり０−４℃で保存し、そして１日目、２日目および３日目にアッセイ したとき、結果はほとんど変動がなく再現性があった。アッセイされた淋菌量、 ５fgおよび50fgは、それぞれ１細胞および10細胞に存在するrRNAに対応する。 用いた基本的プロトコルには、以下の段階が含まれる。各アッセイサンプルに 関し、水400μl中の淋菌標的ポリヌクレオチド０fg(陰性コントロール)、５fgま たは50fgのいずれかの水溶液20μlを、合成尿コントロール(KOVATROL^TM;Hycor B iomedical,Inc)400μlおよび淋菌標的ポリペプチドに相補的な配列およびdT₃dA_{3 0} 配列を有する捕捉オリゴヌクレオチド（6.25nM）を含む標的捕捉緩衝液（TCB； 2.2M LiCl、250mM HEPES緩衝液、pH7.5）200μlと混合した。固体支持体となる 磁気粒子に結合した固定dT₁₄プローブを添加して100μg/mlとし、そして該混合 物を続けて２つの異なる温度（60℃で20分、および25℃で15分）でインキュベー ションした。第一の温度では、捕捉プローブ：標的ポリヌクレオチド複合体のT_m が60℃より大きいため、捕捉プローブおよび標的ポリヌクレオチドがハイブリダ イズし、そして第二の温度では、dA：dT複合体のT_mが約52℃より低いため、固定 プローブおよび捕捉プローブのポリdA部分がハイブリダイズした。インキュベー ション後、実質的に実施例２に記載されたように、磁気場を用い、溶液から磁気 ビーズを分離した。淋菌標的ポリヌクレオチドを含む試料では、磁気ビーズは固 定プローブ：捕捉プローブ：標的ポリヌクレオチド複合体と結合しており、一方 、陰性コントロール試料では、ビーズは固定プローブ：捕捉プローブと結合して いた。その後、実質的に実施例３に記載されるようにして、ビーズを２回洗浄し 、そして洗浄したビーズを核酸増幅試薬75μlに再懸濁し、そして淋菌標的ポリ ヌクレオチドに特異的なプライマーを用いて、実質的に実施例３に記載されるよ うにして増幅した。増幅後、増幅された標的配列を、実施例３に記載されるよう に、化学発光アッセイを用いて検出されるAE標識プ ローブを用いて検出し、そしてシグナルを相対光単位（RLU）で表した。各日の アッセイに関し、陰性コントロールおよび陽性コントロールのバックグラウンド RLUを、同じ試薬を用い、同じ様式で測定した。アッセイ結果は、各実験試料のR LU結果、および各日に得られた２つの陽性コントロールおよび10の陰性コントロ ールの平均値を含め、表４に示している。バックグラウンド（２つの試料の平均 ）値は、１日目、２日目および３日目に対し、それぞれ6.81x10²、1.18x10³およ び6.61x10²RLUだった。 表４に示される結果は、２段階ハイブリダイゼーションアッセイがわずか５fg の淋菌標的ポリヌクレオチドを、再現性をもって検出することが可能であり、同 一の条件下で試験された標的ポリヌクレオチドを含まない試料のものより有意に 高い化学発光を産生することを示す。さらに、試料を保存し、そして該方法を用 い、３日の経過にわたり再試験したとき、全期間にわたり、再現性の良い結果で あった。結果はまた、試料間の再現性が３日間にわたり良好であることも示した 。 実施例5：臨床尿試料において細菌を検出するための２段階ハイブリダイゼーシ ョンアッセイ 本実施例は、本発明の２段階ハイブリダイゼーション法を用い、臨床尿試料を 用いて、細菌感染を示す標的を検出することが可能であることを示す。標的ポリ ヌクレオチドは、トラコーマクラミジア（Chlamydia trachomatis）に特異的な 配列であった。試料は、PCRに基づくアッセイを用い、独立してトラコーマクラ ミジアに関し試験されており、そして２段階ハイブリダイゼーション法で得られ た結果を、PCRに基づくアッセイで得られた結果と比較した。尿試料は、段階ハ イブリダイゼーション法を用い二重に試験したが、その際、試料をPCRに基づく アッセイ結果に基づく分類（陽性または陰性）に対して無作為な順序で配置した 。 簡潔には、２段階ハイブリダイゼーションアッセイプロトコルは以下のようで あった。各反応試験管は、トラコーマクラミジア標的ポリヌクレオチドに相補的 な配列およびdT₃dA₃₀配列を有する捕捉オリゴヌクレオチド6.25pmolを含むTCB( 実施例４に定義される)200μlを含み、ここに調製尿試料800μl(尿400μlに加え TM緩衝液（100mM(NH₄)₂SO₄、50mM Hepes、pH 7.5、8％ LLS）400μl)またはコン トロール800μl（陰性コントロールはKOVATROL^TM400μlに加えTM緩衝液400μlで あり；陽性コントロールはKOVATROL^TM400μlに加えトラコーマクラミジア総細胞 RNA(すなわち、rRNA標的ポリヌクレオチド)５fgを含むTM緩衝液400μlであった ）を添加した。試験管を密封し、混合し、そして60℃で30分、そしてその後40℃ で30分インキュベーションした。試験管をその後、磁気場に供し、そして固定プ ローブと共に磁気ビーズを溶液から分離し、そして固定構成要素を実質的に実施 例２に記載されるように、２回洗浄した。60℃では、捕捉プローブ：標的ポリヌ クレオチド複合体のT_mが60℃より大きいため、捕捉プローブおよびトラコーマク ラミジア標的ポリヌクレオチドがハイブリダイズし、そして第二の温度では、dA ：dT複合体のT_mが約52℃より低 いため、固定ポリdTプローブおよび捕捉プローブのポリA部分がハイブリダイズ した。トラコーマクラミジア標的配列に特異的なプライマーおよび体積75μlに 含まれる転写関連増幅の試薬を用いて、増幅が１時間であった以外は実質的に実 施例３に記載されるように、標的ポリヌクレオチドを増幅した。トラコーマクラ ミジア標的配列に特異的なAE標識プローブを添加し(100μl中)、混合し、そして 混合物を60℃で20分インキュベーションし、その後、選択試薬300μlを添加し、 混合し、インキュベーションし、そしてRLUとして検出した(実施例３を参照され たい)。 表５は、２段階ハイブリダイゼーションアッセイ（「RLU」は30の尿試料に関す る二重試験の平均、および５つの陽性および５つの陰性コントロールの平均であ る）およびPCRに基づく試験（トラコーマクラミジア核酸の検出に関し、陽性ま たは陰性）の結果を示す。 表５の結果から理解可能であるように、アッセイされたすべての試料において 、 ２段階ハイブリダイゼーション法は、PCRに基づくアッセイを用い独立して陽性 に試験された試料に関し、陽性の結果を提供し、そしてPCRに基づくアッセイを 用い陰性に試験されたすべての試料は、２段階ハイブリダイゼーション法により アッセイされた場合もまた陰性だった。比較的高い（10³）陰性シグナルを有し た陰性試料（試料2、8および22）に対しては、二重アッセイではつねに、１つの 「0」RLUシグナルおよび１つの比較的高いバックグラウンドシグナルが含まれた 。したがって、２段階ハイブリダイゼーションアッセイを用い、臨床尿試料中に 存在する細菌を検出し、そしてPCRアッセイにおいて得られるものに匹敵する陽 性または陰性結果を提供することが可能である。 実施例6：試料中の複数の細菌標的を検出するための２段階ハイブリダイゼーシ ョンアッセイ 本実施例は、本発明の２段階ハイブリダイセーション法を用い、単一の試料中 の、異なる種による細菌感染を示す複数の標的を検出することが可能であること を示す。標的ポリヌクレオチドは、淋菌およびトラコーマクラミジアに特異的な 配列であり、そしてアッセイは実質的に実施例3−6に記載されるように行った。 これらの試料にはまた、汚染物質（1％から10％v/vの血液）を加えた。 アッセイは、実質的に実施例3−6に記載されるように行い、試料は正常尿(細 菌汚染がない)であって、標的ポリヌクレオチドを含まない(陰性コントロール) ；トラコーマクラミジア標的ポリヌクレオチド５fgを含む;淋菌標的ポリヌクレ オチド５fgを含む;またはトラコーマクラミジア標的ポリヌクレオチド５fgおよ び淋菌標的ポリヌクレオチド５fgの混合物を含むものであった。試料各組に関し 、アッセイ試験管はさらに、0％、1％、5％または10％v/v血液を含んだ。化学発 光プローブを用いた２つの標的配列の同時検出は、実質的にNelsonら（1996,Bio chem.35:8429-8438の8432）に記載されるようなものであり、トラコーマクラミ ジア標的ポリヌクレオチドに特異的なオルト−F−AE標識プローブおよび淋菌標 的ポリヌクレオチドに特異的な2−Me−AE標識プローブを用いた。尿試料を調製 し、そして上述のようにいくつかの試料中に血液汚染物質を含む以外は、実質的 に本明細書の実施例５に記載されるように、連続ハイブリダイゼーション段階の ために、60℃で30分、そしてその後40℃で30分、インキュベーション した。ハイブリダイゼーション複合体中の固定プローブは、磁気場および洗浄段 階を用いて精製し、そして、上述の実施例４および５に記載されるように、トラ コーマクラミジア標的ポリヌクレオチドおよび淋菌標的ポリヌクレオチドに特異 的なプライマーを含む転写関連増幅法を用いて、精製標的配列を増幅した。検出 試薬を添加し、そしてトラコーマクラミジア特異的標識プローブおよび淋菌特異 的標識プローブから、同時に化学発光を検出した。アッセイされた各種類の試料 に関し、４つの反復をアッセイし、そしてRLU結果（各種類の試料の平均値）を 表６に示している。表６において、トラコーマクラミジア特異的標識プローブに 関し検出されたシグナル（RLU）は「CT」と示され、そして淋菌特異的標識プロ ーブに関し検出されたシグナルは「NG」と示される。 表６に示される結果は、２段階ハイブリダイゼーションアッセイを用い、単一 の試料中の２つの標的を同時に検出することが可能であることを示す。陰性コン トロールは、トラコーマクラミジアのみ、淋菌のみ、または組み合わせた標的を 含む試料に比べ、本質的に無視できるシグナルを示した。いずれの標的の検出も 最大10％v/v血液汚染により妨げられず、そして血液汚染が最大10％v/vであって も、単一試料中の両方の標的が検出された。 本発明のいくつかの態様が本明細書に記載されてきたが、以下の請求項により 定義される本発明の精神および範囲から逸脱することなく、特定のプローブに対 する多様な修飾を作成してもよい。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】平成１０年１１月２０日（１９９８．１１．２０） 【補正内容】転写関連増幅 転写関連増幅は、RNAポリメラーゼを用い、核酸テンプレートから複数のRNA転 写物を産生する。転写関連増幅は、一般的に、RNAポリメラーゼ、DNAポリメラー ゼ、デオキシリボヌクレオシド三リン酸、リボヌクレオシド三リン酸、およびプ ロモーター・テンプレート相補的オリゴヌクレオチドを使用する。しばしば類似 オリゴヌクレオチドもまた用いられる。 転写関連増幅の異なるバリエーションが当業によく知られる。異なる反応条件 および異なる数および種類の増幅オリゴヌクレオチドを用いる、異なるバリエー ションの例は、Burgら、米国特許第5,437,990号；Kacianら、米国特許第5,399,4 91号および第5,554,516号；Kacianら、PCT国際公告第WO 93/22461号；Gingeras ら、PCT国際公告第WO 88/01302号；Gingerasら、PCT国際公告第WO 88/10315号； Malekら、米国特許第5,130,238号；Urdeaら、米国特許第4,868,105号および第5, 124,246号；McDonoughら、PCT国際公告第WO 94/03472号；およびRyderら、PCT国 際公告第WO 95/03430号に詳細に記載されている。 簡潔には、一般的に、転写関連増幅は、プロモーター・テンプレート相補的オ リゴヌクレオチドを用い、該オリゴヌクレオチドは、二本鎖を形成するとRNAポ リメラーゼにより認識される5'塩基配列領域(図2Aにおいて「P」と示される)、 および（図2Aに示されるように）標的配列の3'の位置でテンプレート核酸にハイ ブリダイズすることが可能な3'配列領域を含む。プロモーター・テンプレート相 補的オリゴヌクレオチドおよびテンプレートがハイブリダイズした後、二本鎖プ ロモーターがテンプレートの上流に形成される。二本鎖プロモーターは、ポリメ ラーゼが媒介するプロモーター・テンプレート相補的オリゴヌクレオチドのプラ イマー伸長により形成され、標的相補的鎖を産生した（図2Aを参照されたい）後 、類似オリゴヌクレオチド（例えば、図2Bのプライマー24）のハイブリダイゼー ションおよび類似オリゴヌクレオチドのプライマー伸長を行ってもよい(図2Bを 参照されたい)。二本鎖プロモーターを形成するのに、標的核酸のプライマー伸 長が関与するものなど、他の既知の技術が適切である。 転写関連増幅は、RNAポリメラーゼ活性を有する酵素がプロモーター領域に結 合し、そして一本鎖RNA転写物が5'から3'方向に合成されることにより進行する( 図2Cを参照されたい)。単一のテンプレートを用いた転写関連増幅により複数のR NA転写物（例えば、約100から3,000）を産生してもよい(例えば図2Cから図2Fを 繰り返すことにより)。 本発明の好ましい態様において、RNase H活性を用いる転写関連増幅法が、標 的増幅に用いられる。これは、本質的に一定の反応条件において、一本鎖増幅核 酸を大量に生成する。より好ましくは、RNase H活性は、逆転写酵素により供給 される。 他の増幅方法 本発明の方法の増幅段階において、他のよく知られる増幅法を用いてもよく、 レプリカーゼ媒介増幅、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、およびリガーゼ連鎖反応 （LCR）が含まれる。レプリカーゼ媒介増幅は、自己複製RNA分子、およびQBレプ リカーゼなどのレプリカーゼを使用する(例えば、Kramerら、米国特許第4,786,6 00号；PCT国際公告第WO 90/14439号を参照されたい)。PCR増幅はよく知られてお り、そしてDNAポリメラーゼ、プライマーおよび熱サイクルを使用し、DNAまたは RNAの２つの相補鎖の複数のコピーを合成する(例えば、Mullisら、米国特許第4, 683,195号、第4,683,202号、および第4,800,159号；Methods in Enzymology,198 7,Vol.155:335-350を参照されたい)。LCRは少なくとも４つの別々のオリゴヌク レオチドを用い、標的およびその相補鎖を、ハイブリダイゼーション、連結、お よび変性の複数のサイクルを用いることにより、増幅する(欧州特許出願公告第0 320 308号を参照されたい)。標的ポリヌクレオチドの検出 標的ポリヌクレオチドの存在は、検出プローブを用いおよび／または増幅核酸 を検出する、異なる技術を用い、検出してもよい。好ましくは、標的ポリヌクレ オチドまたは標的ポリヌクレオチドの増幅産物、特に標的ポリヌクレオチドに相 補的な増幅核酸にハイブリダイズする標識プローブを用い、標的ポリヌクレオチ ドを検出する。 標識プローブは、異なる種類の標識を含んでもよく、そして異なる技術を用い 標識を検出してもよい。例えば、よく知られるプローブ標識には、放射性同位元 素、蛍光部分、化学発光部分、および触媒基（例えば、色の変化を生じる反応に 関与する酵素）が含まれる。こうした標識プローブの産生および／または使用の 例は、Sambrookら,Molecular Cloning,A Laboratory Manual 2^nd ed.(ColdSprin g Harbor Laboratory Press,ニューヨーク州コールドスプリングハーバー,1989) 、第10章；Nelsonら、米国特許第5,658,737号；Woodheadら、米国特許第5,656,2 07号；Hoganら、米国特許第5,547,842号；Arnoldら、米国特許第5,283,174号；K ourilskyら、米国特許第4,581,333号；およびBeckerら、欧州特許出願公告第0 7 47 706号に詳細に記載されている。 標識プローブは標的ポリヌクレオチド、増幅核酸、または直接または間接的に 標的ポリヌクレオチドまたは増幅核酸にハイブリダイズする中間分子にハイブリ ダイズしてもよい。間接ハイブリダイゼーションは、共にハイブリダイズする複 数の中間分子を用いることにより達成してもよい。 増幅核酸は、標識プローブを用い、または核酸を検出する他のよく知られた方 法を用い、検出してもよい。例えば、標識前駆体を用いることにより増幅中に、 または蛍光挿入剤（例えばエチジウム・ブロミド）を用い増幅後に、増幅核酸を 標識してもよい。例えば、ゲルろ過、ゲル電気泳動、およびHPLCなど、よく知ら れる方法を用い、標識増幅核酸を検出してもよい。 以下の例は、本発明のいくつかの好ましい態様を例示するが、当業者は、他の 試薬および反応条件を用い、本発明の方法を同等に実行してもよいことを認識す るであろう。 実施例1：相補的長さを変化させることによるT_mの調整 ハイブリダイゼーション複合体のT_mを調整する１つの方法は、複合体を構成す る２つの核酸間の相補的な長さを変化させることである。本実施例は、複合体に おける相補的な長さの違いによる、T_mの変化を例示する。 ハイブリッドを第一および第二のオリゴヌクレオチド鎖間に形成した。第一の 鎖は40デオキシチミジン（dT₄₀）のホモポリマーであり、そして第二の鎖は異な る大きさのデオキシアデノシン（dA_n）のホモポリマーであった。これらのオリ ゴヌクレオチドを、標準的な核酸合成法を用い、合成した。 【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】平成１１年６月２８日（１９９９．６．２８） 【補正内容】 請求の範囲 1. 試料中に存在する標的ポリヌクレオチドを捕捉する方法であって、固体支持 体に間接的に標的ポリヌクレオチドを結合することを含み、該方法が本質的に ： 標的ポリヌクレオチド、捕捉プローブ、および固定プローブを含む混合物を 提供する段階と； 捕捉プローブおよび標的ポリヌクレオチドを含む捕捉プローブ:標的ハイブ リダイゼーション複合体のT_mより低く、そして固定プローブおよび捕捉プロー ブを含む固定プローブ：捕捉プローブハイブリダイゼーション複合体のT_mより 高い温度を用い、それにより捕捉プローブ：標的ハイブリダイゼーション複合 体の形成を助けそして固定プローブ:捕捉プローブハイブリダイゼーション複 合体の形成を助けない、第一のハイブリダイゼーション条件において、該混合 物をインキュベーションする段階と；そして その後、固定プローブ：捕捉プローブハイブリダイゼーション複合体のT_mよ り低い温度を用い、それにより固定プローブ:捕捉プローブハイブリダイゼー ション複合体の形成を助け、そして固定プローブ、捕捉プローブおよび標的ポ リヌクレオチドを含む、固定プローブ:捕捉プローブ:標的ハイブリダイゼーシ ョン複合体中に標的ポリヌクレオチドを捕捉する、第二のハイブリダイゼーシ ョン条件において、該混合物をインキュベーションする段階と からなることにより特徴付けられる、方法。 2. 第二のハイブリダイゼーション条件のインキュベーション段階が、第一のハ イブリダイゼーション条件の温度を少なくとも約10℃下げることを含む、請求 項１の方法。 3. 第二のハイブリダイゼーション条件のインキュベーション段階が、第一のハ イブリダイゼーション条件の温度を少なくとも約20℃下げることを含む、請求 項１の方法。 4. 第一のハイブリダイゼーション条件のインキュベーション段階が約60℃の温 度を用い、そして第二のハイブリダイゼーション条件のインキュベーション段 階が約40℃またはそれより低い温度を用いる、請求項１の方法。 5. 固定プローブ:捕捉プローブ:標的ハイブリダイゼーション複合体を精製する 段階により特徴付けられる、請求項1、2、3または4の方法。 6. 標識プローブを標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズさせ、ハイブリダイ ズした標識プローブを検出することにより、固定プローブ:捕捉プローブ:標的 ハイブリダイゼーション複合体中の標的ポリヌクレオチドを検出する段階によ り特徴付けられる、請求項５の方法。 7. ハイブリダイズした標識プローブを検出することが、ハイブリダイズした標 識プローブを検出する前にハイブリダイズしなかった標識プローブを除去する ことを含む、請求項６の方法。 8. 増幅核酸を産生するために標的ポリヌクレオチドを特異的に増幅する段階に より特徴付けられる、請求項５の方法。 9. 増幅段階が標的特異的転写関連増幅法を含む、請求項８の方法。 10．増幅核酸を検出する段階により特徴付けられる、請求項８の方法。 11．検出段階が、標識プローブを、標的ポリヌクレオチドに相補的な増幅核酸に ハイブリダイズさせることおよびハイブリダイズした標識プローブを検出する ことを含む、請求項10の方法。 12．ハイブリダイズした標識プローブを検出することが、ハイブリダイズした標 識プローブを検出する前にハイブリダイズしなかった標識プローブを除去する ことを含む、請求項11の方法。 13．提供段階が、長さ少なくとも５ヌクレオチド塩基認識基の固定プローブ結合 領域を含む捕捉プローブと、長さ少なくとも５ヌクレオチド塩基認識基の捕捉 プローブ結合領域を含む固定プローブとを含む混合物、但し捕捉プローブ結合 領域が固定プローブ結合領域と相補的である、を提供する、請求項１の方法。 14．固定プローブの捕捉プローブ結合領域が： (a) 少なくとも１つの糖−リン酸ジエステル結合、少なくとも１つの ペプチド核酸基、少なくとも１つのホスホロチオエート結合、または それらの組み合わせを含む第一の骨格と、および (b) 第一の骨格に連結する少なくとも10ヌクレオチド塩基認識基と、 ここで各ヌクレオチド認識基は、アデニン、グアニン、シトシン、チ ミン、ウラシルまたはイノシンと水素結合することが可能である を含み、 捕捉プローブの固定プローブ結合領域が： (a) 少なくとも１つの糖−リン酸ジエステル結合、少なくとも１つの ペプチド核酸基、少なくとも１つのホスホロチオエート結合、また はそれらの組み合わせを含む第二の骨格と、および (b) 第一の骨格に連結したヌクレオチド塩基認識基と水素結合するこ とが可能であり、第二の骨格に連結した少なくとも10ヌクレオチド 塩基認識基と を含む、請求項13の方法。 15．捕捉プローブ結合領域が少なくとも10ヌクレオチドを含むホモポリマーから なり、そして固定プローブ結合領域が少なくとも25ヌクレオチドを含むホモポ リマーであってこのうち少なくとも10ヌクレオチドが捕捉プローブ結合領域の 10ヌクレオチドと相補的であるホモポリマーからなる、請求項13または請求項 14の方法。 16．捕捉プローブ結合領域が約14の連続するAまたはT塩基を含み、そして固定プ ローブ結合領域が捕捉プローブ結合領域の連続する塩基に相補的な約30塩基の 配列を含む、請求項15の方法。 17．提供段階が、デオキシヌクレオチド、リボヌクレオチド、2'−メトキシ置換 ヌクレオチド、2'−ハロ置換ヌクレオチド構成要素、またはそれらの組み合わ せを含む捕捉プローブと、デオキシヌクレオチド、リボヌクレオチド、2'−メ トキシ置換ヌクレオチド、2'−ハロ置換ヌクレオチド構成要素、またはそれら の組み合わせを含む固定プローブとを含む混合物を提供する、請求項１の方法 。 18．試料中に標的ポリヌクレオチドが存在するか決定する方法であって、標的ポ リヌクレオチドを間接的に固体支持体に結合させ、標的ポリヌクレオチドを増 幅し、そして増幅標的ポリヌクレオチドを検出することを含み、該方法が本質 的に： 試料中に存在する標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズすることが可 能な捕捉プローブ、および捕捉プローブにハイブリダイズすることが可 能な固定プローブを提供する段階と； 捕捉プローブ:標的ポリヌクレオチド複合体を産生するために、捕捉プ ローブおよび固定プローブを、標的ポリヌクレオチドを含むと疑われる試 料と、捕捉プローブと標的ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションを 助け、固定プローブと捕捉プローブのハイブリダイゼーションを助けない 第一のインキュベーション温度で混合する段階と； 固定プローブ:捕捉プローブ:標的ポリヌクレオチド複合体を含む捕捉さ れた標的ポリヌクレオチドを産生するために、捕捉プローブ:標的ポリヌ クレオチド複合体および固定プローブを、固定プローブおよび捕捉プロー ブのハイブリダイゼーションを助ける第二のインキュベーション温度でイ ンキュベーションする段階と； 捕捉された標的ポリヌクレオチドを、精製標的ポリヌクレオチドを産生 するために、試料の他の構成要素から精製する段階と； 増幅核酸を産生するために、標的ポリヌクレオチドに特異的なプライマ ーを用いて、精製標的ポリヌクレオチドを特異的に増幅する段階と；そし て 標的ポリヌクレオチドが試料中に存在するか決定するために増幅核酸 を検出する段階と からなることで特徴付けられる方法。 19．検出段階が、標識プローブを増幅核酸にハイブリダイズさせることおよびハ イブリダイズした標識プローブを検出することを含む、請求項18の方法。 20．増幅段階が、標的特異的転写関連増幅法を含み、そして検出段階が、標識プ ローブを、標的ポリヌクレオチドまたはその一部に相補的な増幅核酸にハイブ リダイズさせることおよびハイブリダイズした標識プローブを検出すること を含む、請求項18の方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ベッカー，マイケル・エム アメリカ合衆国カリフォルニア州92131, サン・ディエゴ，メドウデール・レイン 12819 (72)発明者 マジレッシ，メーアダッド アメリカ合衆国カリフォルニア州92127, サン・ディエゴ，サニーフィールド・プレ イス 15895

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 1. 試料中に存在する標的ポリヌクレオチドを捕捉する方法であって： a) 標的ポリヌクレオチド、捕捉プローブ、および固定プローブを含む 混合物を、捕捉プローブおよび標的ポリヌクレオチドを含む捕捉プロ ーブ:標的ハイブリダイゼーション複合体の形成を助ける第一のハイ ブリダイゼーション条件においてインキュベーションし、ここで第一 のハイブリダイゼーション条件は固定プローブおよび捕捉プローブを 含む固定プローブ：捕捉プローブハイブリダイゼーション複合体の形 成を助けない；そして b) その後、該混合物を、固定プローブ：捕捉プローブハイブリダイゼ ーション複合体の形成を助ける第二のハイブリダイゼーション条件に おいてインキュベーションし、それにより固定プローブ、捕捉プロー ブおよび標的ポリヌクレオチドを含む固定プローブ：捕捉プローブ： 標的ハイブリダイゼーション複合体中に標的ポリヌクレオチドを捕捉 する 段階を含む方法。 2. 請求項１の方法であって、第一のインキュベーション段階が、捕捉プロー ブ：標的ハイブリダイゼーション複合体のT_mより低く、そして固定プローブ： 捕捉プローブハイブリダイゼーション複合体のT_mより高い温度を用い、そして 第二のインキュベーション段階が、固定プローブ：捕捉プローブハイブリダイ ゼーション複合体のT_mより低い温度を用いる、前記方法。 3. 第二のインキュベーション段階が、第一のハイブリダイゼーション条件の 温度を少なくとも約10℃下げることを含む、請求項２の方法。 4. 第二のインキュベーション段階が、第一のハイブリダイゼーション条件の 温度を少なくとも約20℃下げることを含む、請求項２の方法。 5. 第一のインキュベーション段階が、約60℃の温度を用い、そして第二のイ ンキュベーション段階が約40℃以下の温度を用いる、請求項２の方法。 6. さらに、固定プローブ：捕捉プローブ：標的ハイブリダイゼーション複合 体の精製段階を含む請求項１から５の何れか１項の方法。 7. さらに、標的ポリヌクレオチドに標識プローブをハイブリダイズさせ、そ して標識プローブを検出することにより、固定プローブ：捕捉プローブ：標識 ハイブリダイゼーション複合体中の標的ポリヌクレオチドを検出する段階を含 む、請求項１から６の何れか１項の方法。 8. さらに、標的ポリヌクレオチドを増幅し、増幅核酸を産生する段階を含む 、請求項１から７の何れか１項の方法。 9. 増幅段階が転写関連増幅を含む、請求項８の方法。 10． さらに、増幅核酸を検出する段階を含む請求項８または請求項９の方法。 11． 検出段階が、標的ポリヌクレオチドに相補的な増幅核酸に標識プローブを ハイブリダイズさせ、そして標識プローブを検出することを含む、請求項10の 方法。 12． 検出段階がさらに、ハイブリダイズしていない標識プローブを除去するこ とを含む、請求項７または11の何れか１項の方法。 13． 両インキュベーション段階が： 長さ少なくとも５ヌクレオチド塩基認識基の捕捉プローブ結合領域を含 む、固定プローブ、および 長さ少なくとも５ヌクレオチド塩基認識基の固定プローブ結合領域を含 む、捕捉プローブ を含み、捕捉プローブ結合領域が固定プローブ結合領域に相補的である、請求 項１から12の何れか１項の方法。 14． 捕捉プローブ結合領域が： (a) 少なくとも１つの糖−リン酸ジエステル結合、または少なくとも １つのペプチド核酸基、少なくとも１つのホスホロチオエート結合 、またはそれらの組み合わせを含む、第一の骨格と、および (b) 第一の骨格に連結する少なくとも10ヌクレオチド塩基認識基と、 ここで各ヌクレオチド認識基は、アデニン、グアニン、シトシン、 チミン、ウラシルまたはイノシンと水素結合することが可能である を含み、そして固定プローブ結合領域は： (a) 少なくとも１つの糖−リン酸ジエステル結合、または少なくとも １ つのペプチド核酸基、少なくとも１つのホスホロチオエート結合、 またはそれらの組み合わせを含む、第二の骨格と、および (b) 第一の骨格に連結するヌクレオチド塩基認識基に水素結合するこ とが可能な、第二の骨格に連結する少なくとも10ヌクレオチド塩基 認識基とを含む 請求項13の方法。 15． 捕捉プローブ結合領域が少なくとも10ヌクレオチドを含むホモポリマーか らなり、そして固定プローブ結合領域が少なくとも25ヌクレオチドを含むホモ ポリマーであって、このうち少なくとも10ヌクレオチドが捕捉プローブ結合領 域の10ヌクレオチドに相補的である前記ホモポリマーからなる、請求項13また たは請求項14の方法。 16． 捕捉プローブ結合領域が約14の連続するAまたはT塩基を含み、そして固定 プローブ結合領域がこれに相補的な約30塩基の配列を含む、請求項13から15の 何れか１項の方法。 17． インキュベーション段階が、固定プローブおよび捕捉プローブを含む混合 物を用い、各プローブがデオキシヌクレオチド、リボヌクレオチド、2'−メト キシ置換ヌクレオチド、2'−ハロ置換ヌクレオチド構成要素、またはそれらの 組み合わせを含む、請求項１から16の何れか１項の方法。 18． 試料中の標的ポリヌクレオチドの存在を決定する方法であって： a. 試料中に存在する標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズすることが 可能な捕捉プローブを提供し； b. 標的ポリヌクレオチドを含むことが疑われる試料と捕捉プローブを、 捕捉プローブおよび標的ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション を助ける第一のインキュベーション温度で混合し、それにより捕捉プ ローブ：標的ポリヌクレオチド複合体を産生し； c. 捕捉プローブとハイブリダイズすることが可能な固定プローブを提供 し； d. 捕捉プローブ：標的ポリヌクレオチド複合体および固定プローブを、 固定プローブおよび捕捉プローブのハイブリダイゼーションを助ける 第二のインキュベーション温度でインキュベーションし、それにより 固定プローブ：捕捉プローブ：標的ポリヌクレオチド複合体を含む、 捕捉された標的ポリヌクレオチドを産生し； e. 捕捉された標的ポリヌクレオチドを精製し、それにより精製標的ポリ ヌクレオチドを産生し； f. 精製標的ポリヌクレオチドを増幅し、それにより増幅核酸を産生し； そして g. 増幅核酸を検出し、標的ポリヌクレオチドが試料中に存在するか決定 する 段階を含む方法。 19． 検出段階が、標識プローブを、標的ポリヌクレオチドまたはその一部に相 補的な増幅核酸にハイブリダイズさせ、そして標識プローブを検出することを 含む、請求項18の方法。