JP2002508184A

JP2002508184A - 高力価で安全な組換えレンチウイルスベクター作成の方法及び手段

Info

Publication number: JP2002508184A
Application number: JP2000539150A
Authority: JP
Inventors: ナルディニ，ルイジ; ダル，トーマス; エー．ファーソン，デボラー; ウィット，ロシェル
Original assignee: セルジェネシス，インコーポレイティド
Priority date: 1997-12-12
Filing date: 1998-12-11
Publication date: 2002-03-19
Anticipated expiration: 2018-12-11
Also published as: US20080286836A1; US7083981B2; WO1999031251A1; KR20010033064A; US6165782A; US6924144B2; US5994136A; CA2314609C; EP1036182A1; US8846385B2; DE69838758D1; JP2010227122A; CA2314609A1; EP1036182B1; WO1999031251A9; AU751985B2; JP4640742B2; US20050255597A1; DE69838758T2; US20020173030A1

Abstract

(57)【要約】５側ＬＴＲ又は５’及び３’側ＬＴＲの両方で修飾されたレンチウイルスベクターは、組換えレンチウイルスベクターの作製に有用である。このようなベクターは、機能性ｔａｔ遺伝子の不存在下で作製することができる。この導入遺伝子を保持するベクターによる宿主細胞の複数の形質転換は、ウイルス産生を増強する。

Description

【発明の詳細な説明】発明の分野本発明は、新規レンチウイルスパッケージングベクター、問題の外来遺伝子を
保持する導入ベクター、安定したパッケージング細胞株、安定したプロデューサ
ー細胞株、及び哺乳類細胞中で組換えレンチウイルスを産生するためのそれらの
使用に関する。発明の背景レトロウイルスベクターは、遺伝子送達のための一般的道具である（Ｍｉｌｌ
ｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ、３５７：４５５−４６０（１９９２））。レトロウイルス
ベクターの再編成されない単一コピー遣伝子を広い範囲の齧歯類、霊長類及びヒ
トの体細胞にと送達する能力は、細胞への遺伝子導入に良く適したレトロウイル
スベクターを作出する。組換えレトロウイルスベクターを作製するために有用な付属物は、感染性ビリ
オンの作製に必要なタンパク質をトランス（ｉｎｔｒａｎｓ）で供給するパッ
ケージング細胞株であるが、このような細胞は、内因性のウイルスゲノム核酸を
パッケージングすることが不可能である（Ｗａｔａｎａｂｅ及びＴｅｍｉｎ、Ｍ
ｏｌｅｃ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．、３（１２）：２２４１−２２４９（１９８３
）；Ｍａｎｎら、Ｃｅｌｌ、３３：１５３−１５９（１９８３）；Ｅｍｂｒｅｔ
ｓｏｎ及びＴｅｍｉｎ、Ｊ．Ｖｉｏｌ．、６１（９）：２６７５−２６８３（１
９８７））。レトロウイスルパッケージング細胞株の構築に関する考察は、齧歯
類（Ｃｌｏｙｄら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１５１：５４２−５５２（１９８０
））及び霊長類（Ｄｏｎａｈｕｅら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７６：１１２５
−１１３５（１９９２））においてＴリンパ球を産生することが示されている、
組換えの複製コンピテントのレトロウイルス（ＲＣＲ）を含まない高力価のベク
ターの上清の作製である。パッケージング細胞においてＲＣＲの生成の可能性を最小にするひとつの方法
は、パッケージング機能を２個のゲノム、例えば、一方はｇａｇ及びｐｏｌ遺伝
子産物を発現し、他方はｅｎｖ遺伝子産物を発現するものに分割することである
（Ｂｏｓｓｅｌｍａｎら、Ｍｏｌｅｃ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．、７（５）１７９
７−１８０６（１９８７）；Ｍａｒｋｏｗｉｔｚら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６２（
４）：１１２０−１１２４（１９８８）；Ｄａｎｏｓ及びＭｕｌｌｉｇａｎ．Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、８５：６４６０−６４６４（１９８８
））。この方法は、これらの２個のゲノムの同時パッケージング及びそれに続く
導入の能力、更にはＲＣＲを産生するための該パッケージング細胞における３個
のレトロウイルスゲノムの存在に起因した組換え頻度を顕著に減少する能力を最
小化する。組換え体が生じる事象において、いずれか可能性のある組換え体を機能しなく
するために望ましくない遺伝子産物内に変異（Ｄａｎｏｓ及びＭｕｌｌｉｇａｎ
、前記）又は欠失（Ｂｏｓｅｌｍａｎら、前記；Ｍａｒｋｏｗｉｔｚら、前記）
を設計することができる。加えて、両パッケージング構築物上の３’側ＬＴＲの
欠失は、機能的組換え体を形成する能力も低下させる。レンチウイルスは、一般的なレトロウイルス遺伝子ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ
に加えて、調節又は構造機能を伴う他の遺伝子を含む複合レトロウイルスである
。高度な複雑性は、潜伏感染期に、レンチウイルスがその生活環を変調すること
を可能にする。典型的レンチウイルスは、ＡＩＤＳの病原物質であるヒト免疫不全ウイルス（
ＨＩＶ）である。ＩｎｖｉｖｏにおいてＨＩＶは、リンパ球及びマクロファー
ジのような分裂が稀である最終的に分化した細胞に感染することができる。Ｉｎ
ｖｉｔｒｏにおいて、ＨＩＶは、単球由来マクロファージ（ＭＤＭ）の初代培
養、更にはアフィディコリン又はγ線照射の処理によって細胞周期が抑制された
ＨｅＬａ−Ｃｄ４細胞又はＴリンパ球細胞に感染することができる。細胞の感染は、標的細胞の核膜孔を通じてのＨＩＶの組込み前複合体の核への
能動輸送に左右される。これは、標的細胞の核への輸送機構と、該複合体中の複
数の部分的に多重複の分子決定基の相互作用によって生じる。同定された決定基
は、ｇａｇマトリックス（ＭＡ）タンパク質、親核性の（Ｋａｒｙｏｐｈｉｌｉ
ｃ）ビリオン−関連タンパク質、ｖｐｒ、及びｇａｇＭＡタンパク質のＣ−末
端ホスホチロシン残基の機能的核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む。発明の概要従って、本発明は、パッケージできるレンチウイルスベクター転写物及び哺乳
類細胞における高力価組換えレンチウイルスの迅速な作製のためのレンチウイル
スタンパク質の両方の合成に関係する新規の安全化されたレンチウイルスベクタ
ーに関する。これらの結果は、問題の外来遺伝子を標的細胞へ送達するための感
染性粒子である。本発明は更に、ウイルス産生のための細胞株を提供する。発明の詳細な説明本発明は、非分裂細胞を感染することが可能な組換えレンチウイルス、更には
これを製造する方法及び手段を提供する。このウイルスは、核酸配列のｉｎｖ
ｉｖｏ及びｅｘｖｉｖｏにおける導入及び発現に有用である。レンチウイルスゲノム及びプロウイルスＤＮＡは、レトロウイスルにおいて発
見された３個の遺伝子を有する：ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖであり、これらには
、２個の長い末端反復配列（ＬＴＲ）が隣接している。ｇａｇ遺伝子は、内部構
造（マトリックス、キャプシド及びヌクレオキャプシド）タンパク質をコードし
；ｐｏｌ遺伝子は、ＲＮＡ−依存性ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）、プロテ
アーゼ及びインテグラーゼをコードし；並びに、ｅｎｖ遺伝子は、ウイルスのエ
ンベロープの糖タンパク質をコードしている。５’及び３’側ＬＴＲは、ビリオ
ンＲＮＡの転写及びポリアデニル化を促進するのに利用できる。ＬＴＲは、ウイ
ルス複製に必要な他のシス作用性配列を全て含む。レンチウイルスは、ｖｉｆ、
ｖｐｒ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｖｐｕ、ｎｅｆ及びｖｐｘ（ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２
及び／又はＳＩＶ）を含む追加遺伝子を有する。５’側ＬＴＲへの隣接物は、ゲノムの逆転写に必要な配列（ｔＲＮＡプライマ
ー結合部位）及びウイルスＲＮＡの粒子への効果的なキャプシド形成に必要な配
列（プサイ部位）である。キャプシド形成（又はレトロウイルスＲＮＡの感染ビ
リオンへのパッケージング）に必要な配列がウイルスゲノムから失われた場合は
、このシス欠損は、ゲノムＲＮＡのキャプシド形成を妨げる。しかし、得られる
変異体は、依然全てのビリオンタンパク質の合成を指向することが可能である。本発明は、パッケージング機能、すなわちｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ、更には
ｒｅｖ及びｔａｔを有する２種以上のベクターにより適当な宿主細胞へトランス
フェクションすることを含む、非分裂細胞を感染することが可能な組換えレンチ
ウイルスを作製する方法を提供する。以下に説明するように、機能性ｔａｔ遺伝
子を欠いているベクターが、特定の用途のためには望ましい。従って、パッケー
ジング細胞を産生するために、例えば第一のベクターは、ウイルス性ｇａｇ及び
ウイルス性ｐｏｌをコードしている核酸を提供することができ、かつ別のベクタ
ーは、ウイルス性ｅｎｖをコードしている核酸を提供することができる。本願明
細書において導入ベクターと同定される異種遺伝子を提供するベクターのパッケ
ージング細胞への組入れは、問題の外来遺伝子を保持する感染性ウイルス粒子を
放出するプロデューサー細胞を生じる。前述のベクターそれ自体は、本願明細書において開示された新規に構築された
ベクターの範囲外であるが、これは当該技術分野において公知であり、Ｎａｌｄ
ｉｎｉらの論文（Ｓｃｉ．、２７２：２６３−２６７（１９９６））；及びＺｕ
ｆｆｅｒｅｙらの論文（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１５：８７１−８７５（１
９９７））を参照のこと。一般にこれらのベクターは、プラスミドをベースにし
た又はウイルスをベースにしたものであり、外来核酸の組入れ、核酸の選択及び
宿主細胞への導入に必須の配列を保持するように設計されている。問題のベクタ
ーのｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ遺伝子も、当該技術分野において公知である。従
って関連する遺伝子が、選択されたベクターにクローニングされ、その後問題の
標的細胞の形質転換に使用される。前述のベクター及び外来遺伝子の設計に従い、第二のベクターは、ウイルス性
エンベロープ（ｅｎｖ）遺伝子をコードしている核酸を提供することができる。
ｅｎｖ遺伝子は、レトロウイルスを含むあらゆるウイルスに由来することができ
る。好ましくはｅｎｖは、ヒト及び他種の細胞の形質導入を可能にする両種指向
性エンベロープタンパク質である。このエンベロープタンパク質の抗体との結合、又は特定の細胞種のレセプター
への標的化のための特定のリガンドにより組換えウイルスを標的化することが望
ましい。ウイルスベクターに問題の配列（調節領域を含む）を、例えば特異的標
的細胞上の受容体のリガンドをコードしている他の遺伝子と共に挿入することに
より、このベクターは標的特異性となる。レトロウイルスベクターは、例えば糖
脂質又はタンパク質の挿入により、標的特異性に作製することができる。標的化
は、抗体又は組換え抗体型分子、例えば１本鎖抗体などの抗原−結合部分を使用
することにより達成され、レトロウイルスベクターを標的化する事が多い。当業
者には、特異的標的へのレトロウイルスベクターの送達を達成する具体的な方法
は公知であるか、又は過度の実験をすることなく容易に確かめるであろう。レトロウイルス−由来のｅｎｖ遺伝子の例は、モロニーマウス白血病ウイルス
（ＭｏＭｕＬＶ又はＭＭＬＶ）、ハーベイマウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ又
はＨＳＶ）、マウス乳がんウイルス（ＭｕＭＴＶ又はＭＭＴＶ）、ギボンサル白
血病ウイルス（ＧａＬＶ又はＧＡＬＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）及び
ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）を含むが、これらに限定されるものではない。水
泡性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）プロテインＧ（ＶＳＶＧ）、肝炎ウイルス及びイ
ンフルエンザのそれのような他のｅｎｖ遺伝子も使用することができる。ウイルス性ｅｎｖ核酸配列を提供するベクターは、例えばプロモーター又はエ
ンハンサーのような調節配列に機能的に結合している。この調節配列は、真核生
物のプロモーターまたはエンハンサーであることができ、例えばモロニーマウス
白血病ウイルスのプロモーター−エンハンサーエレメント、ヒトサイトメガロウ
イルスのエンハンー又はワクシニアＰ７．５のプロモーターを含む。一部の場合
は、モロニーマウス白血病ウイルスのプロモーター−エンハンサーエレメントの
ように、プロモーター−エンハンサーエレメントが、ＬＴＲ配列内に又はこれに
隣接して位置する。好ましくはこの調節配列は、ベクターが構築されたレンチウイルスにとって内
因性でないものである。従って、ベクターがＳＩＶから作出された場合は、ＳＩ
ＶＬＴＲに認められるＳＩＶ調節配列は、ＳＩＶを起源としない調節エレメン
トによって置き換えられるであろう。ＶＳＶＧは組換えウイルスに広範な宿主細胞の範囲を付与するので、ＶＳＶ
Ｇタンパク質は望ましいｅｎｖ遺伝子であるが、ＶＳＶＧは宿主細胞にとっ
て有害であり得る。従って、ＶＳＶＧに関する遺伝子のような遺伝子が使用さ
れる場合は、誘導性プロモーターシステムを使用し、その結果ＶＳＶＧ発現が
必要でない場合には、ＶＳＶＧ発現を宿主毒性が最小になるように調節できる
ようにすることが好ましい。例えばＧｏｓｓｅｎ及びＢｕｊａｒｄの論文（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ．、８９：５５４７−５５５１（１９９２））に記載されたテトラサイ
クリン−調節性遺伝子発現システムを用いて、テトラサイクリンが導入された細
胞から取り除かれた場合にＶＳＶＧの誘導発現を提供するために利用すること
ができる。従って、ｔｅｔ／ＶＰ１６トランスアクチベーターは、第一のベクタ
ー上に存在し、かつＶＳＶＧをコードする配列は、別のベクター上のｔｅｔオ
ペレーター配列によって制御されたプロモーターの下流にクローニングされる。異種又は外来の核酸配列である導入遺伝子は、調節核酸配列に操作できるよう
に連結される。本願明細書において使用される用語「異種」核酸配列は、外来種
を起源とする配列、又は同種に由来する場合にはこれが当初の形から実質的に修
飾されていることを意味する。あるいは、細胞では通常は発現しない未変化の核
酸配列は、異種核酸配列である。用語「操作できるように連結」とは、調節配列と異種核酸配列が機能的に連結
し、後者の発現を生じることを意味する。好ましくは、異種配列は、プロモータ
ーに連結され、キメラ遺伝子を生じる。この異種核酸配列は、好ましくはウイル
ス性ＬＴＲプロモーター−エンハンサーシグナル又は内部プロモーターのいずれ
かの制御下にあり、レトロウイスルＬＴＲ内に保持されたシグナルは、依然導入
遺伝子の効果的発現をもたらすことができる。前記外来遺伝子は、転写することができる問題の核酸のいずれかであることが
できる。一般に外来遺伝子はポリペプチドをコードしている。このポリペプチド
は、何らかの治療上の利点があるものが好ましい。ポリペプチドは、宿主細胞に
おいて、内因性タンパク質の発現の欠損又は不存在を補うことができる。このポ
リペプチドは、宿主細胞に新たな特性、例えば米国特許第５，３５９，０４６号
に開示されたキメラシグナル受容体などを与えることができる。技術者は、本願
明細書に記載しかつ当該技術分野において公知である技術を実践し外来遺伝子の
適性を決定することができる。例えば技術者は、外来遺伝子はキャプシド形成に
適した大きさかどうかか、及び外来遺伝子産物が適切に発現されるかどうかとい
うことを知っているであろう。本発明の方法による分子の組入れにより細胞において分子を調節する遺伝子の
発現を変調することが望ましい。用語「変調」は、過剰発現された場合の遺伝子
発現の抑制、又は過小発現された場合の発現の増大を描いている。細胞の増殖障
害が遺伝子発現に関連している場合は、翻訳レベルで遺伝子発現を妨害している
核酸配列を使用することができる。この方法は、例えばアンチセンス核酸リボザ
イム又はトリプレックス物質（ｔｒｉｐｌｅｘａｇｅｎｔ）を用いて、核酸又
はトリプレックス物質によりｍＲＮＡを隠すか、又はリボザイムでこれを切断す
るかのいずれかにより、特異的ｍＲＮＡの転写又は翻訳を阻害することができる
。アンチセンス核酸は、特異的ｍＲＮＡ分子の少なくとも一部と相補的であるＤ
ＮＡ又はＲＮＡ分子である（Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ、Ｓｃｉ．Ａｍ．、２６２：４
０（１９９０））。細胞において、アンチセンス核酸は、対応するｍＲＮＡにハ
イブリダズし、２本鎖分子を形成する。細胞は２本鎖ｍＲＮＡを翻訳しないので
、アンチセンス核酸はｍＲＮＡの翻訳を妨害する。約１５個以上のヌクレオチド
のアンチセンスオリゴマーが、容易に合成され、かつ恐らく標的細胞に組入れら
れた際により大きい分子よりも問題を引き起こすことが少ないので、好ましい。
遺伝子のｉｎｖｉｔｒｏ翻訳を阻害するためのアンチセンス法の使用は、当該
技術分野において周知である（Ｍａｒｃｕｓ−Ｓａｋｕｒａ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１７２：２８９
（１９８８））。アンチセンス核酸は、アルツハイマー病において蓄積するアミロイド前駆体タ
ンパク質のような変異タンパク質又はドミナントアクティブ遺伝子産物の発現を
ブロックするために使用することができる。このような方法は、更にハンチント
ン病、遺伝性パーキンソン病及び他の疾患の治療についても有用である。アンチ
センス核酸は、毒性に関連したタンパク質の発現の阻害についても有用である。転写を停止するためのオリゴヌクレオチドの使用は、オリゴマーが二重らせん
ＤＮＡの周りに巻きつき、３本鎖らせんを形成するトリプレックス戦略として公
知のメカニズムによることができる。従って、トリプレックス化合物は、選択さ
れた遺伝子上の独自の部位を認識するように設計することができる（Ｍａｈｅｒ
ら、ＡｎｔｉｓｅｎｓｅＲＥｓａｎｄＤｅｖ．、１（３）２２７（１９９
１）；Ｈｅｌｅｎｅ、ＡｎｔｉｃａｎｃｅｒＤｒｕｇＤｉｓ．、６（６）：
５６９（１９９１））。リボザイムとは、他の１本鎖ＲＮＡをＤＮＡ制限エンドヌクレアーゼに類似の
方法で特異的に切断する能力を有するＲＮＡ分子である。これらのＲＮＡをコー
ドしているヌクレオチド配列の修飾を通じて、ＲＮＡ分子において特異的ヌクレ
オチド配列を認識し切断する分子を操作することが可能である（Ｃｅｃｈ、Ｊ．
Ａｍｅｒ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｎ．、２６０：３０３０（１９８８））。このような
方法の大きい利点は、特定の配列を有するｍＲＮＡのみが不活性化されることで
ある。生体反応調節剤をコードしている核酸を導入することが望ましい。この範疇に
含まれるのは、「インターロイキン」に分類される多くのサイトカイン類、例え
ばインターロイキン１から１２をコードしている核酸を含む免疫賦活剤である。
更にこの範疇に含まれるのは、必ずしも同じメカニズムに従って作用するもので
はないが、インターフェロン、特にγインターフェロン（γ−ＩＦＮ）であり、
腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）及び顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−
ＣＳＦ）である。このような核酸が骨髄細胞又はマクロファージに送達され、先
天性の酵素欠損又は免疫不全を治療することが望ましい。増殖因子、毒素性ペプ
チド、リガンド、受容体又は他の生理学的に重要なタンパク質をコードしている
核酸も、特異的非分裂細胞に組入れることができる。従って、本発明の組換えレンチウイルスは、抗ＨＩＶ−分子によりＨＩＶ−感
染細胞（例えばＴ細胞又はマクロファージ）を治療するために使用することがで
きる。加えて、例えば気道上皮を、嚢胞性繊維症の治療のために、嚢胞性繊維症
トランスメンブランコンダクタンス調節（ＣＦＴＲ）遺伝子を有する本発明の組
換えレンチウイルスにより感染することができる。本発明の方法は、更にｅｘｖｉｖｏでの本発明の組換えレンチウイルスに感
染した細胞の移植、又は中枢神経系もしくは脳室洞（ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ
ｃａｖｉｔｙ）への又は宿主脳の表面の硬膜下へのｉｎｖｉｖｏでの感染に関
連している、神経細胞、グリア細胞、繊維芽細胞又は間充織細胞の移植（ｔｒａ
ｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）又は「グラフト」に有用である。このようなグラフ
ト化に関する方法は、当業者には周知であり、かつＢｊｏｒｋｌｕｎｄ及びＳｔ
ｅｎｅｖｉ編集のＮｅｕｒａｌＧｒａｆｔｉｎｇｉｎｔｈｅＭａｍｍａ
ｌｉａｎＣＮＳ（１９８５年）に記載されている。タンパク質産物の欠損に起因する疾患に関して、遺伝子導入は、代償療法のた
めに正常遺伝子を感染組織へ組入れることができ、更にはアンチセンス変異を用
いた疾患のための動物モデルを作製することができる。例えば、筋肉、脾臓又は
肝臓細胞の感染のためには、ファクターＶＩＩＩ又はＩＸをコードする核酸をレ
ンチウイルスに挿入することが望ましい。プロモーター配列は、所望の遺伝子配列に対して同種又は異種であることがで
きる。広範なプロモーター類を利用することができ、これはウイルス又は哺乳類
のプロモーターを含む。細胞又は組織に特異的なプロモーターは、特異的細胞集
団における遺伝子配列の発現の標的指向化に利用することができる。本発明に適
した哺乳類又はウイルスプロモーターは、当該技術分野において入手することが
できる。任意に、クローニング段階の間に、パッケージングシグナル及び異種クローニ
ング部位を有する導入ベクターと称される核酸構築物は、更に選択マーカー遺伝
子を含む。マーカー遺伝子は、該ベクターの存在を調べるために利用され、その
結果感染又は組込みが確認される。マーカー遺伝子の存在は、該挿入物を発現し
ている宿主細胞のみの選択及び増殖を保証する。典型的な選択遺伝子は、抗生物
質又は他の毒物、例えばヒスチジノール、プロマイシン、ハイグロマイシン、ネ
オマイシン、メトトレキセートなどに対する耐性を付与するタンパク質、及び細
胞表面マーカーをコードしている。本発明の組換えウイルスは、哺乳類細胞に核酸配列を導入することが可能であ
る。用語「核酸配列」は、本願明細書において詳細に論ぜられるように、いずれ
かの核酸分子、特にＤＮＡを意味する。核酸分子は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成Ｄ
ＮＡ、ＲＮＡ又はそれらの組合せを含む様々な起源に由来することができる。こ
のような核酸配列は、天然のイントロンを含むこともあり、含まないこともある
ようなゲノムＤＮＡを包含し得る。更にこのようなゲノムＤＮＡは、プロモータ
ー領域、ポリＡ配列又は他の関連する配列に関連して得ることができる。ゲノム
ＤＮＡは、当該技術分野において周知の手段により、適当な細胞から抽出及び精
製することができる。あるいは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）は、細胞か
ら単離し、逆転写又は他の手段によりｃＤＮＡを作製するために使用することが
できる。好ましくは、本発明の方法で作製された組換えレンチウイルスは、ヒト免疫不
全ウイルス（ＨＩＶ）の誘導体である。このｅｎｖはＨＩＶ以外のウイルスに由
来するであろう。本発明の方法は、いくつかの実施態様において、前述のように、例えばｇａｇ
、ｐｏｌ、ｅｎｖ、ｔａｔ及びｒｅｖのような組換えビリオンのパッケージング
に必要な全ての機能をもたらす３種のベクターを提供する。本願明細書において
記したように、ｔａｔは、予想外の利点を機能的に欠失し得る。これらのベクタ
ーがパッケージング細胞株の形質転換及び作出に使用され、組換えレンチウイル
スを生じる限りは、使用されるベクターの数に制約はない。前述のベクターは、トランスフェクション又は感染によりパッケージング細胞
株に組入れられる。このパッケージング細胞林は、該ベクターゲノムを含むウイ
ルス粒子を産生する。トランスフェクション又は感染の方法は、当業者には周知
である。パッケージングベクター及び導入ベクターのパッケージング細胞株への
同時トランスフェクション後、当業者によって用いられる常法により組換えウイ
ルスは培養培地から回収され、かつ力価測定される。従って、このパッケージング構築物は、リン酸カルシウムトランスフェクショ
ン法、リポフェクション法又は電気穿孔法により、通常はｎｅｏ、ＤＨＦＲ、Ｇ
ｌｎシンテターゼ又はＡＤＡのようなドミナントな選択マーカーと一緒に、ヒト
細胞株に導入し、その後適当な薬物の存在下で選択しかつクローンを単離するこ
とができる。これらの選択マーカー遺伝子は、該構築物の中のパッケージング遺
伝子に物理的に連結することができる。パッケージング機能が適当なパッケージング細胞によって発現されるように設
計された安定した細胞株は公知である。例えばパッケージング細胞について開示
した米国特許第５，６８６，２７９号；及びにＯｒａｙらの論文（Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、９３：１１４００−１１４０６（１９９６））を
参照のこと。前記Ｚｕｆｆｅｒｅｙらの論文は、ＨＩＶ−１ｅｎｖ遺伝子を含むｐｏｌの
３’側配列が欠失しているレンチウイルスパッケージングプラスミドを示してい
る。この構築物は、ｔａｔ及びｒｅｖ配列を含み、かつ３’側ＬＴＲはポリＡ配
列で置換されている。５’側ＬＴＲ及びｐｓｉ配列は、誘導性であるもののよう
な別のプロモーターによって置換されている。例えば、ＣＭＶプロモーター又は
それらの誘導体を使用することができる。問題のパッケージングベクターは、レンチウイルスタンパク質の発現を増強し
かつ安全性を増強するために、パッケージング機能を更に変更することを含む。
例えばｇａｇの上流のＨＩＶ配列は全て除去することができる。更にｅｎｖの下
流の配列も除去することができる。更に、ＲＮＡのスプライシング及び翻訳を増
強するために、ベクターを修飾する工程を行うことができる。複製コンピテントなレンチウイルスの作出の可能性がよりごくわずかであるベ
クターを提供するために、本発明は、転写機構によりウイルス発現を促進する調
節タンパク質であるｔａｔ配列が機能的に欠失されているようなレンチウイルス
パッケージングプラスミドを提供する。その結果、ｔａｔ遺伝子が、一部又は全
て欠失されるか、もしくは様々な点突然変異又は他の突然変異がｔａｔ配列に生
じ、遺伝子を非機能性にする。技術者は、ｔａｔ遺伝子を非機能性にする公知の
技術を実践することができる。ベクターの構築並びに細胞のトランスフェクション及び感染に使用される技術
は、当該技術分野において広範に実践されている。実施者は、特定の条件及び手
順を説明する標準の手段材料を熟知している。しかし、便宜上、下記の段落にお
いてガイドラインを示す。本発明のベクターの構築には、当該技術分野において周知の標準的連結及び制
限法を用いる（Ｍａｎｉａｔｉｓら、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：Ａ
ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、コールドスプリングハーバー、ＮＹ、
１９８２年を参照のこと）。単離されたプラスミド、ＤＮＡ配列又は合成された
オリゴヌクレオチドは、切断し、望ましい形状に適合させかつ再連結する。位置特異的ＤＮＡ切断は、当該技術分野において理解される条件下、及び特別
な場合は市販の制限酵素の製造業者の指定する条件下で、適当な制限酵素（又は
酵素類）で処理することによって行われ、これについては、例えばＮｅｗＥｎ
ｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ社の製品カタログを参照のこと。一般に、プラスミ
ド又はＤＮＡ配列約１μｇを、約２０μｌのバッファー液中で酵素１ユニットで
切断する。典型的には、制限酵素の過剰量を用いて、ＤＮＡ基質の完全な消化を
確実にする。およそ３７℃で約１〜２時間のインキュベーション時間が実行可能
であるが、その変形も許容することができる。各インキュベーション後、フェノ
ール／クロロホルムを用いる抽出によりタンパク質を除去し、その後エーテルで
抽出し、かつ核酸を水性画分からエタノール沈殿により回収する。所望であるな
らば、切断された断片のサイズ分離を、常法を用いポリアクリルアミドゲル又は
アガロースゲル電気泳動により行うことができる。サイズ分離の一般的説明は、
ＭｅｔｈｏｄｏｆＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、６５：４９９−５６０（１９８０
）に見ることができる。制限切断された断片は、５０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ７．６）、５０ｍＭＮａ
Ｃｌ、６ｍＭＭｇＣｌ_２、６ｍＭＤＴＴ及び５〜１０μＭｄＮＴＰの中で
、２０℃で約１５〜２５分のインキュベーション時間を用いた、４種のデオキシ
ヌクレオチド３リン酸（ｄＮＴＰ）の存在下における、Ｅ．ｃｏｌｉＤＮＡポ
リメラーゼＩの巨大断片（クレノウ）による処理により平滑末端であり得る。ク
レノウ断片は、５’の粘着末端を満たすが、たとえ４種のｄＮＴＰが存在したと
しても、突出している３’側の１本鎖を砕いてしまう（ｃｈｅｗｂａｃｋ）。
所望であるならば、選択性の修復が、粘着末端の性質によって指示された制約内
で、唯一のｄＮＴＰの、又は選択されたｄＮＴＰの供給によって行わうことがで
きる。クレノウによる処理後、この混合物はフェノール／クロロホルムで抽出さ
れ、エタノール沈殿される。適当な条件下でのＳ１ヌクレアーゼ又はＢａｌ−３
１による処理は、いずれかの１本鎖部分の加水分解を生じる。連結は、下記の標準条件及び温度下で、容量１５〜５０μｌの中で行うことが
できる：２０ｍＭＴｒｉｓ−ＣｌｐＨ７．５、１０ｍＭＭｇＣｌ_２、．１
０ｍＭＤＴＴ、３３ｍｇ／ｍｌＢＳＡ、１０ｍＭ−５０ｍＭＮａＣｌ、及
び４０μＭＡＴＰ、０．０１〜０．０２（Ｗｅｉｓｓ）ユニットのＴ４ＤＮ
Ａリガーゼを用い０℃（「粘着末端」の連結）又は１ｍＭＡＴＰ、０．３〜０
．６（Ｗｅｉｓｓ）ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼを用い１４℃（「平滑末端
」の連結）のいずれか。分子内「粘着末端」の連結は、通常総ＤＮＡ濃度３３〜
１００μｇ／ｍｌで行われる（総末端濃度５〜１００ｍＭ）。分子内平滑末端の
連結は、（通常１０〜３０倍のモル過剰量のリンカーを用いて）１μＭの総末端
濃度で行われる。従って、本発明において、レンチウイルスパッケージングベクターは、プロモ
ーター及び、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｒｅｖ、ｅｎｖ又はそれらの組合せ、並びにｔａ
ｔの特異的機能の又は実際の削除を伴うような、当業者によって決定された他の
任意又は必要な調節配列、及び任意に他のレンチウイルスアクセサリー遺伝子を
含むように作出される。レンチウイルス導入ベクター（Ｎａｌｄｉｎｉら、前記；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、９３：１１３８２−１１３８８（１９９６））は、ｉｎ
ｖｉｔｒｏにおいてヒト細胞を増殖抵抗性（ｇｒｏｗｔｈ−ａｒｒｅｓｔｅｄ
）に感染するために、及び成体ラットの脳へ直接注射した後に神経を形質導入す
るために使用されている。このベクターは、ｉｎｖｉｖｏにおける神経へのマ
ーカー遺伝子導入時の効率がよく、かつ検出可能な病理が存在しない場合に長期
間発現が達成される。これまで試験した中で最長である該ベクターの単回注射後
１０ヶ月間にわたって分析した動物は、導入遺伝子発現の平均レベルにおいて減
少を示さず、かつ組織病理又は免疫反応の徴候を示さなかった（Ｂｌｏｍｅｒら
、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７１：６６４１−６６４９（１９９７））。非分裂細胞を
形質導入するベクターの能力を損なうことなく、ＨＩＶビルレンス遺伝子である
ｅｎｖ、ｖｉｆ、ｖｐｒ，ｖｐｕ及びｎｅｆが欠失されたレンチウイルスベクタ
ーの改善されたバージョンが開発されている。多様に減弱されたバージョンは、
該ベクターの生体安全性の実質的改善を示している（Ｚｕｆｆｅｒｅｙら、前記
）。形質導入された細胞においては、組込まれたレンチウイルスベクターは、一般
に各末端にＬＴＲを有する。５’側ＬＴＲは、特にＨＩＶ−感染細胞において、
組換えの基質となり得る「ウイルス性」転写物の蓄積を引き起こすことがある。
３’側ＬＴＲは、細胞のプロトオンコジーンを活性化した結果生じる危険性を伴
う下流の転写を促進する。Ｕ３配列は、ＨＩＶＬＴＲの大部分を含む。このＵ３領域は、感染細胞にお
ける及び細胞活性化に反応したＨＩＶゲノムの基本的かつ誘導された発現を変調
するエンハンサーエレメント及びプロモーターエレメントを含む。プロモーター
エレメントのいくつかが、ウイルス複製には必須である。エンハンサーエレメン
トの一部は、ウイルス単離体において高度に保存され、かつウイルス病原性の重
大なビルレンス因子であることが示されている。エンハンサーエレメントは、ウ
イルスの様々な標的細胞において、複製率に影響を及ぼすように作用することが
できる（Ｍａｒｔｈａｓら、Ｊ．Ｖｉｏｌ．、６７：６０４７−６０５５（１９
９３））。ウイルス転写は５’側ＬＴＲのＵ３領域の３’末端から始まるので、これらの
配列は、ウイルスｍＲＮＡの一部ではなく、かつ３’側ＬＴＲ由来のそれらのコ
ピーは、組込まれたプロウイルスにおいて両ＬＴＲ生成の鋳型として作用する。
Ｕ３領域の３’コピーがレトロウイルスベクター構築物において変更される場合
は、このベクターＲＮＡは依然プロデューサー細胞の完全な５’側ＬＴＲから産
生されるが、標的細胞において再生することはできない。このようなベクターの
形質導入は、子孫ウイルスにおいて両ＬＴＲの不活性化を生じる。従ってレトロ
ウイルスは、自己不活性（ＳＩＮ）であり、かつこれらのベクターはＳｉｎ導入
ベクターとして公知である。しかしながら、３’側ＬＴＲの欠失の程度には制限がある。第一に、Ｕ３領域
の５’末端は、組込みに必要である、ベクター導入における他の本質的機能を提
供する（末端のジヌクレオチド＋ａｔｔ配列）。従って末端ジヌクレオチド及び
ａｔｔ配列は、欠失されているＵ３配列の５’側境界を示すことができる。加え
て、一部の曖昧に定義された領域は、Ｒ領域下流のポリアデニル化部位の活性に
影響を及ぼすことができる。３’側ＬＴＲのＵ３配列の過剰な欠失は、プロデュ
ーサー細胞におけるベクターの力価及び標的細胞における導入遺伝子の発現の両
方に対し、有害な結果を伴うベクター転写物のポリアデニル化を減少することが
できる。他方、限定された欠失は、形質導入された細胞においてＬＴＲの転写活
性を無効にすることはできない。本願明細書において説明したレンチウイルス導入ベクターの新規バージョンで
は、３’側ＬＴＲのＵ３領域の増加する欠失を保持している（図１：Ｕ３ＬＴ
Ｒのヌクレオチド−４１８から指定された位置までのＵ３欠失の長さ：ＳＩＮ−
７８、ＳＩＮ−４５、ＳＩＮ−３６及びＳＩＮ−１８）。プロデューサー細胞に
おけるベクターの力価及び標的細胞における導入遺伝子の発現のいずれも損なう
ことなく、３’側ＬＴＲからのＵ３配列のほぼ完全な欠失を有するレンチウイル
スベクターが開発された。最も広範な欠失（−４１８から−１８）は、ＴＡＴＡ
ボックスにまで及び、その結果形質導入された細胞のＬＴＲの転写活性が無効に
なっている。従って、３’側の欠失に関するより低い限界は、ＴＡＴＡボックス
を含む位置まで及ぶ。この欠失は、Ｒ領域までのＵ３領域の残りである。これは
、ベクターの安全性が劇的に増すことを意味している。様々な欠失が当該技術分
野において公知の実施法により作出された。驚くべきことに、導入遺伝子の平均の発現レベルは、より完全なベクターと比
べて、ＳＩＮベクターによって形質導入された細胞においてでさえ高かった。こ
れは恐らく、内部プロモーター上の上流ＨＩＶＬＴＲから転写の妨害が除かれ
たためであろう。このようなＵ３領域の広範囲の欠失を伴うＳＩＮ−型ベクター
は、形質導入効率を損なうことなく、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）を基にし
たレトロウイルスベクターについて作出することはできない。導入ベクターの５’側ＬＴＲは、異種エンハンサー／プロモーターを伴うＵ３
領域の転写調節エレメントの一部又は全部を置換することによって修飾された。
この変更は、プロデューサー細胞における導入ベクターＲＮＡの発現を増強する
ように；ＨＩＶのｔａｔ遺伝子不存在下でのベクターの作製を可能にするように
；並びに、前述のＳＩＮベクターを「救出」するための３’側が欠失したバージ
ョンと再結合することができる上流のＨＩＶＬＴＲの野生型コピーを除去する
ように作出された。従って、５’側ＬＴＲに前述の変更を含むベクターである５’ベクターは、発
現を増強する配列及びｔａｔを発現しないパッケージング細胞との組合せのため
に、導入ベクターとしての使用を見出すことができる。このような５’ベクターは、更に先に説明したように３’側ＬＴＲに修飾を保
持することもでき、単に発現が増強されず、ｔａｔを発現しないパッケージング
細胞において使用することができるだけでなく、更に自己不活性化することがで
きるような改善された導入ベクターを生じる。ＨＩＶＬＴＲからの転写は、ｔａｔタンパク質のトランスアクチベーター機
能に高度に依存している。プロデューサー細胞に存在するコアパッケージング構
築物によってしばしば発現されるｔａｔが存在する場合、ＨＩＶＬＴＲからの
ベクターの転写は強力に刺激される。完全な長さの「ウイルス」ＲＮＡは、パッ
ケージングシグナルの完全な相補性を有しているので、このＲＮＡは効率的にベ
クター粒子中でキャプシド形成され、かつ標的細胞に導入される。プロデューサ
ー細胞のパッケージングによって利用できるベクターＲＮＡの量は、感染性ベク
ター作製の律速段階である。５’側ＬＴＲのエンハンサー領域又はエンハンサー及びプロモーター領域は、
各々、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）又はマウスラウス肉腫ウイルス（Ｒ
ＳＶ）のエンハンサー又はエンハンサー及びプロモーターにより置換された。該
構築物の概略及びハイブリッドベクターのコード名については、図２を参照のこ
と。ＣＣＬ及びＲＲＬベクターは、５’側Ｕ３領域が完全に置換されている。対照のレンチベクターＨＲ２及び５’側ハイブリッドのパネルを、導入ベクタ
ーによりトランスフェクションされたプロデューサー細胞において、ｔａｔトラ
ンスアクチベーターを提供するパッケージング構築物の存在下又は不存在下で、
比較した。４種のキメラベクターの転写レベルは、パッケージング構築物の存在
下及び不存在下の両方で、対照レンチベクターのそれよりも高い。全てのキメラ
ベクターは、導入遺伝子を標的細胞に効率的に導入し、かつＲＲＬベクターは対
照ＨＲ２ベクターと同様に作用する。最後に、ベクターの標的細胞への組込みを
、形質導入後の初期及び後期継代時に形質導入された細胞を調べることにより確
認した。そのベクターが組込まれたことを示す導入遺伝子−陽性細胞の割合に減
少は認められなかった。パッケージング構築物不存在下でプロデューサー細胞において得られた５’側
ＬＴＲが修飾された導入ベクターＲＮＡの高レベルの発現は、作製されるベクタ
ーが機能性ｔａｔ遺伝子の不存在下で機能していることを示している。先に本願
明細書において説明したパッケージングプラスミドについて示されたｔａｔ遺伝
子の機能欠損は、ｔａｔタンパク質に関連した多くの病理活性が授けられたレン
ンチウイルスベクターシステムに対するより高レベルの生体安全性をもたらすで
あろう。従って、生体安全性が顕著に改善されたレンチウイルスベクターは、５
’末端又は３’末端のいずれにもＨＩＶＬＴＲの野生型コピーを有さないＳＩ
Ｎ導入ベクターであり、これは本願明細書において説明したｔａｔ−不含有パッ
ケージングベクターと共同して使用される。ウイルス上清は、トランスフェクションの４８時間後の上清のろ過のような常
法を用いて回収される。ウイルスの力価は、例えば適量のウイルスの上清による
、１０^６個のＮＩＨ３Ｔ３細胞又は１０^５個のＨｅＬａ細胞の感染により、ポ
リブレン（シグマケミカル社、セントルイス、ＭＯ）８μｇ／ｍｌの存在下で測
定される。４８時間後、形質導入効率がアッセイされる。このように本発明は、高力価組換えウイルスを作製する方法及び手段を提供す
る。このようなウイルス粒子調製物を用いて、当該技術分野において公知の方法
により標的細胞を感染することができる。従って本発明は、標的細胞が宿主から
取り出され、公知の方法を行い培地において形質転換され、その後該宿主に戻さ
れるような、ｅｘｖｉｖｏ遺伝子治療の用途における使用を見出すであろう。以下に記された本発明の詳細な説明は、本発明の様々な実施態様を示す限定を
意図しない実施例である。実施例１レンチウイルスパッケージングプラスミドの構築レンチウイルスパッケージングプラスミドは、前記Ｚｕｆｆｅｒｅｙらの論文
において先に記されたプラスミドｐＣＭＶΔＲ８．９（ΔＶｐｒΔＶｉｆΔＶｐ
ｕΔＮｅｆ）に由来した。ｐＣＭＶΔＲ８．９のｎｅｆ遺伝子の残りの配列を、
ＸｈｏＩ及びＢｓｔＥＩＩによる消化により除去し、クレノウで満たし、かつ再
連結した。この構築物の、１００塩基対を欠失し、ＨＩＶ−１の切断型ｅｎｖの
リーディングフレームを、ゲノムインスリンのポリアデニル化部位に結合し、プ
ラスミドｐＣＭＶΔＲ８．７３を得た。本発明の別の実施態様において、プラスミドｐＣＭＶΔＲ８．７３は、ＣＭＶ
プロモーターの下流のＣＭＶ由来の配列の１３３塩基対が欠失されている。この
配列は、スプライスドナー部位を含み、かつこれはプラスミドｐＣＭＶΔＲ８．
７３のＳａｃＩＩによる消化及びより大きい断片への再連結によって除去され、
プラスミドｐＣＭＶΔＲ８．７４が得られた。別の本発明の実施態様においては、ｇａｇ遺伝子の開始コドンの上流のプラス
ミドｐＣＭＶΔＲ８．７４に残っているＨＩＶ−由来配列の、コンセンサス５’
スプライスドナー部位以外の全てを除去した。同時に、ｇａｇ遺伝子の上流の配
列を、最適翻訳効率で変更し、プラスミドｐＣＭＶΔＲ８．７５を得た。ｐＣＭ
ＶΔＲ８．７５は、ｐＣＭＶΔＲ８．７４に由来し、９４塩基対のＳｓｔＩＩ−
ＣｌａＩ断片を、以下から成るＳｓｔＩＩ−ＣｌａＩオリゴヌクレオチドリンカ
ーで置き換えることによって得た：５’−ＧＧＧＡＣＴＧＧＴＧＡＧＴＧＡＡＴ
ＴＣＧＡＧＡＴＣＴＧＣＣＧＣＣＧＣＣＡＴＧＧＧＴＧＣＧＡＧＡＧＣＧＴＣＡ
ＧＴＡＴＴＡＡＧＣＧＧＧＧＧＡＧＡＡＴＴＡＧＡＴ−３’（配列番号：）及び５’−ＣＧＡＴＣＴＡＡＴＴＣＴＣＣＣＣＣＧＣＴＴＡＡＴＡＣＴＧＡＣ
ＧＣＴＣＴＣＧＣＡＣＣＣＡＴＧＧＣＧＧＣＧＧＣＡＧＡＴＣＴＣＧＡＡＴＴＣ
ＡＣＴＣＡＣＣＡＧＴＣＣＣＧＣ−３’（配列番号：）。別の本発明の実施態様において、誘導可能なパッケージング構築物が、ＣＭＶ
プロモーターを含むｐＣＭＶΔＲ８．７４のＰｓｔＩ−ＳａｃＩＩ断片を、最小
のＣＭＶプロモーターに連結したテトラサイクリンオペレーター配列の７個のタ
ンデムコピーと置き換えることにより得た。ｔｅｔ−調節されたパッケージング
プラスミドｐＴｅｔΔＲ８．７４を得た。実施例２レンチウイルス導入ベクターの構築レンチウイルス導入ベクタープラスミドは、先にＮａｌｄｉｎｉらの論文（Ｓ
ｃｉ．、２７２：２６３−２６７（１９９６））に記されたプラスミドｐＨＲ’
−ＣＭＶ−ＬａｃＺに由来した。ｐＨＲ２は、ｐＨＲ’中の３’側ＬＴＲの上流
のｎｅｆ配列の１２４塩基対が、ＨＩＶ１配列を減少しかつ導入遺伝子のクロー
ニングが促進されるように両方のポリリンカーと置き換えられているような、レ
ンチウイルス導入ベクターである。ｐＨＲ２は、ｐＨＲ’−ＣＭＶ−ＬａｃＺに
由来し、４．６ｋｂＣｌａＩ−ＳｔｕＩ断片を、鋳型としてｐＨＲ’−ＣＭＶ
−ＬａｃＺを用いかつオリゴヌクレオチドとして下記を使用するＰＣＲにより作
製された８２８塩基対のＣｌａＩ−ＳｔｕＩ断片の、ｐＨＲ’−ＣＭＶ−Ｌａｃ
Ｚ由来の４．４ｋｂＳｔｕＩ−ＮｃｏＩ断片及び４．５ｋｂＮｃｏＩ−Ｃｌ
ａＩ断片と３部位で連結したものと置き換えることによって得た；５’−ＣＣＡ
ＴＣＧＡＴＣＡＣＧＡＧＡＣＴＡＧＴＣＣＴＡＣＧＴＡＴＣＣＣＣＧＧＧＧＡＣ
ＧＧＧＡＴＣＣＧＣＧＧＡＡＴＴＣＣＧＴＴＴＡＡＧＡＣ−３’（配列番号：
）及び５’−ＴＴＡＴＡＡＴＧＴＣＡＡＧＧＣＣＴＣＴＣ−３’（配列番号
：）。本発明の別の実施態様において、ｐＨＲ３は、ｐＨＲ２のＲｅｖ反応エレメン
ト（ＲＲＥ）の上流のｅｎｖコード配列の１４８塩基対（ＡＴＧを含む）が欠失
しているようなレンチウイルスベクターである。ｐＨＲ３はｐＨＲ２に由来し、
ｐＨＲ２の８３９塩基対ＮｏｔＩ−ＳｐｅＩ断片を、鋳型としてｐＨＲ２を用い
かつオリゴヌクレオチドプライマーとして下記を使用するＰＣＲにより得られた
７４７塩基対ＮｏｔＩ−ＳｐｅＩ断片と置き換えることによって得た：５’−Ｇ
ＣＧＧＣＣＧＣＡＧＧＡＧＣＴＴＴＧＴＴＣＣＴＴ’ＧＧ−３’（配列番号：
）及び５’−ＴＡＣＧＴＡＧＧＡＣＴＡＧＴＣＴＣＧ−３’（配列番号：）。本発明の別の実施態様において、ｐＲＨ５は、３１０塩基対ｇａｇコード配列
（Ｇａｇタンパク質の１５番目のアミノ酸の下流の全ｇａｇコード配列）がｐＨ
Ｒ２から欠失されているレンチウイルス導入ベクターである。ｐＨＲ５は、ｐＨ
Ｒ２のＮｒｕＩによる消化、ＮｏｔＩリンカー（合成オリゴヌクレオチド５’−
ＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡ−３’、（配列番号：））の付加、３１０塩基対
の断片を切り出すためのＮｏｔＩによる消化、その後の再連結によって得た。本発明の別の実施態様において、ｐＲＨ６は、パッケージすることが可能な完
全な長さの転写物の産生を増強するために、５’側スプライスドナーシグナルが
変異された（ＴＧＧＴがＴＧＡＴへ）レンチウイルスベクターである。ｐＨＲ６
はｐＨＲ５に由来し、２３９塩基対ＡｆｌＩＩＡｐｏＩ断片を、鋳型としてｐＨ
Ｒ２を用いかつオリゴヌクレオチドプライマーとして下記を使用するＰＣＲによ
り作製された２３９塩基対ＡｆｌＩ−ＡｐｏＩ断片によって置き換えることによ
って得た：５’−ＣＣＡＣＴＧＣＴＴＡＡＧＣＣＴ−３’（配列番号：）
及び５’−ＣＡＡＡＡＴＴＴＴＴＧＧＣＧＴＡＣＴＣＡＴＣＡＧＴＣＧＣＣＧＣ
ＣＣＣＴＣＧ−３’（配列番号：）。全てのＰＣＲ断片は、直接ＴＡクローニングベクターｐＣＲ２．１（インビト
ロゲン社）へのＰＣＲ反応産物の最初のクローニング、それに続く配列の検証及
び適当な酵素による切り出しにより作製した。実施例３５’側ＬＴＲキメラレンチウイルス導入ベクターの構築本発明の別の実施態様において、レンチウイルスベクターの５’側ＬＴＲは、
ＨＩＶ−１のＲ領域に結合したラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）のＵ３領域由来の
エンハンサー及びプロモーターを含む（プラスミドｐＲＲＬ）。ｐＲＲＬは、オ
リゴヌクレオチドリンカーを用いて、ＲＳＶのエンハンサー及びプロモーター（
転写開始位置に対してヌクレオチド−２３３から−１）がＨＩＶ−１のＲ領域に
正確に融合されたようなレンチウイルス導入ベクターである。ｐＲＲＬは、国際
公開公報第９７／０７２２５号を参照し、プラスミドｐＲＴ４３．ＲＳＶ．Ｆ３
及びｐＲＨ２に由来し、かつｐＲＴ４３．ＲＳＶ．Ｆ３の３．４ｋｂＥｃｏＲ
Ｉ−ＨｐａＩ断片を、ｐＨＲ２の０．６７ｋｂＢｇｌＩＩ−ＮｏｔＩ断片及び
ｐＨＲ２の１．７ｋｂＮｏｔＩ−ＳｔｕＩ断片で、５’−ＡＡＴＴＧＣＣＧＣ
ＡＴＴＧＣＡＧＡＧＡＴＡＴＴＧＴＡＴＴＴＡＡＧＴＧＣＣＴＡＧＣＴＧＡＴＡ
ＣＡＡＴＡＡＡＣＧＧＧＴＣＴＣＴＣＴＧＧＴＴＡＧＡＣＣＡ−３’（配列番号
：）及び５’−ＧＡＴＣＴＧＧＴＣＴＡＡＣＣＡＧＡＧＡＧＡＣＣＣＧＴＴ
ＴＡＴＴＧＴＡＴＣＧＡＧＣＴＡＧＧＣＡＣＴＴＡＡＡＴＡＣＡＡＴＡＴＣＴＣ
ＴＧＣＡＡＴＧＣＧＧＣ−３’（配列番号：）のオリゴヌクレオチドからな
る合成ＥｃｏＲＩ−ＢｇｌＩＩオリゴヌクレオチドリンカーにより置き換えるこ
とによって得た。本発明の別の実施態様において、レンチウイルスベクターの５’側ＬＴＲは、
ＨＩＶ−１のプロモーター領域（転写開始位置に対して−７８塩基対の位置から
）に結合したラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）のエンハンサー（転写開始位置に対
してヌクレオチド−２３３から−５０）を含む（プラスミドｐＲＬＬ）。ｐＲＬＬは、ＲＳＶのエンハンサーがＨＩＶ−１のプロモーター領域にオリゴ
ヌクレオチドリンカーを用いて融合されたレンチウイルス導入ベクターである。
ｐＲＲＬは、プラスミドｐＲＴ４３．ＲＳＶ．Ｆ３及びｐＨＲ２に由来し、かつ
ｐＲＴ４３．ＲＳＶ．Ｆ３の３．４ｋｂＥｃｏＲＩ−ＨｐａＩ断片を、ｐＲＨ
２の０．７２４ｋｂＡｌｗＮＩ−ＮｏｔＩ断片及びｐＲＨ２の１．７ｋｂＮ
ｏｔＩ−ＳｔｕＩ断片で、オリゴ５’−ＡＡＴＴＧＧＡＧＧＣＧＴＧＧＣＣＴＧ
ＧＧＣＧＧＧＡＣＴＧＧＧＧＡＧＴＧＧＣＧＡＧＣＣＣＴＣＡＧＡＴＣ−３’（
配列番号：）及びオリゴヌクレオチド５’−ＣＴＧＡＧＧＧＣＴＣＧＣＣ
ＡＣＴＣＣＣＣＡＧＴＣＣＣＧＣＣＣＡＧＧＣＣＡＣＧＣＣＴＣＣ−３’（配列
番号：）からなる合成ＥｃｏＲＩ−ＡｌｗＮＩオリゴヌクレオチドリンカー
により置き換えることによって得た。本発明の別の実施態様（プラスミドｐＣＣＬ）において、レンチウイルスベク
ターの５’側ＬＴＲは、ＨＩＶ−１のＲ領域に結合した、ヒトサイトメガロウイ
ルス（ＣＭＶ）の直前の初期（ｉｍｍｅｄｉａｔｅｅａｒｌｙ）エンハンサー
及びプロモーター（Ｂｏｓｈａｒｔらの発表した（Ｃｅｌｌ、４１：５２１−５
３０（１９８５））転写開始位置に対してヌクレオチド−６７３から−１）を含
む。ｐＣＣＬは、プラスミドｐＲＴ４３．２Ｆ３（米国特許第５，６８６，２７
９号）及びｐＨＲ２に由来し、かつｐＲＴ４３．２Ｆ３の３．８ｋｂＳｓｔＩ
−ＨｐａＩ断片を、ｐＲＨ２の１．７ｋｂＢｇｌＩＩ−ＮｏｔＩ断片及びｐＲ
Ｈ２の１．７ｋｂＮｏｔＩ−ＳｔｕＩ断片で、オリゴヌクレオチド５’−ＣＧ
ＴＴＴＡＧＴＧＡＡＣＣＧＧＧＧＴＣＴＣＴＣＴＧＧＴＴＡＧＡＣＣＡ−３’（
配列番号：）及び５’−ＧＡＴＣＴＧＧＴＣＴＡＡＣＣＡＧＡＧＡＧＡＣＣ
ＣＣＧＧＴＴＣＡＣＴＴＡＡＡＣＧＡＧＣＴ−３’（配列番号：）からなる
合成ＳｓｔＩ−ＢｇｌＩＩオリゴヌクレオチドリンカーにより置き換えることに
よって得た。本発明の別の実施態様（プラスミドｐＣＬＬ）において、レンチウイルスベク
ターの５’側ＬＴＲは、ＨＩＶ−１のプロモーター領域（転写開始位置に対して
−７８塩基対位から）に結合したサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の転写開始位
置に対して−２２０から−６７３のエンハンサーヌクレオチドを含む。ｐＣＬＬ
は、プラスミドｐＲＴ４３．２Ｆ３及びｐＨＲ２に由来し、かつｐＲＴ４３．２
Ｆ３の３．６ｋｂＮｃｏＩ−ＨｐａＩ断片を、ｐＲＨ２の０．７２４ｋｂＡ
ｌｗＮＩ−ＮｏｔＩ断片及びｐＲＨ２の１．７ｋｂＮｏｔＩ−ＳｔｕＩ断片で
、オリゴ５’−ＣＡＴＧＧＡＧＧＣＧＴＧＧＣＣＴＧＧＧＣＧＧＧＡＣＴＧＧＧ
ＧＡＧＴＧＧＣＧＡＧＣＣＣＴＣＡＧＡＴＣ−３’（配列番号：及び５’
−ＣＴＧＡＧＧＧＣＴＣＧＣＣＡＣＴＣＣＣＣＡＧＴＣＣＣＧＣＣＣＡＧＧＣＣ
ＡＣＧＣＣＴＣ−３’（配列番号：）からなる合成ＮｃｏＩ−ＡｌｗＮＩオ
リゴヌクレオチドリンカーにより置き換えることによって得た。実施例４自己不活性化するレンチウイルスベクターの構築ｐＲＲＬ．ＳＩＮ−１８はｐＲＲＬに由来し、消化及び再連結により３’ＬＲ
Ｔにおける４００塩基対ＥｃｏＲＶ−ＰｖｕＩＩ断片が欠失された。ｐＲＲＬ．ＳＩＮ−３６はｐＲＲＬに由来し、３’側ＬＴＲの４９３塩基対Ｂ
ｂｓＩ−ＡｌｗＮＩ断片を、合成オリゴヌクレオチド５’−ＧＡＴＡＴＧＡＴＣ
ＡＧＡＴＣ−３’（配列番号：）及び５’−ＣＴＧＡＴＣＡ−３’並びにｐ
ＲＲＬ由来の０．５４ｋｂＡｌｗＮ−ＡｖｒＩＩ断片及び６．１ｋｂＡｖｅ
ｒＩＩ−ＢｂｓＩ断片との３部位の連結からなるオリゴヌクレオチドリンカーに
より置き換えることによって得た。ｐＲＲＬ．ＳＩＮ−４５はｐＲＲＬに由来し、３’側ＬＴＲの４９３塩基対Ｂ
ｂｓＩ−ＡｌｗＮＩ断片を、合成オリゴヌクレオチド５’−ＧＡＴＡＴＧＡＴＣ
ＡＧＡＧＣＣＣＴＣＡＧＡＴＣ−３’（配列番号：）及び５’−ＣＴＧＡＧ
ＧＧＣＴＣＴＧＡＴＣＡ−３’（配列番号：）並びにｐＲＲＬ由来の６．１
ｋｂＡｌｗＮＩ−ＡｖｒＩＩ断片及び６．１ｋｂＡｖｅｒＩＩ−ＢｂｓＩ断
片との３部位の連結からなるオリゴヌクレオチドリンカーにより置き換えること
によって得た。ｐＲＲＬ．ＳＩＮ−７８はｐＲＲＬに由来し、３’側ＬＴＲの４９３ｂｐＢ
ｂｓＩ−ＡｌｗＮＩ断片を、５’−ＧＡＴＡＴＧＡＴＣＡＧＧＡＧＧＣＧＴＧＧ
ＣＣＴＧＧＧＣＧＧＧＡＣＴＧＧＧＧＡＧＴＧＧＣＧＡＧＣＣＣＴＣＡＧＡＴＣ
−３’（配列番号；）及びオリゴヌクレオチド５’−ＣＴＧＡＧＧＧＣＴＣ
ＧＣＣＡＣＴＣＣＣＣＡＧＴＣＣＣＧＣＣＣＡＧＧＣＣＡＣＧＣＣＴＣＣＴＧＡ
ＴＣＡ−３’（配列番号：）並びにｐＲＲＬ由来の０．５４ｋｂＡｌｗＮ
Ｉ−ＡｖｒＩＩ断片及び６．１ｋｂＡｖｅｒＩＩ−ＢｂｓＩ断片との３部位の
連結からなるオリゴヌクレオチドリンカーにより置き換えることによって得た。
実施例５安定したレンチウイルスパッケージング細胞００−２８の構築及びレンチウイル
スベクターの安定した産物２９３Ｇ細胞株を用いて、安定したレンチウイルスパッケージング細胞を作製
した。２９３Ｇ細胞は、ＭＤカセット（ＣＭＶプロモーター、並びにヒトβグロ
ビン遺伝子由来の介入配列−エクソン２及び３、イントロン２−及びポリ（Ａ）
部位）からのｔｅｔ^Ｒ／ＶＰ１６トランスアクチベーター、並びに７個のテトラ
サイクリンオペレーター部位（ｔｅｔ^Ｏ）の縦列反復配列に連結した最小のＣＭ
Ｖプロモーター由来のＶＳＶエンベローブを発現する。従って、ＶＳＶＧの発
現は、培養培地のテトラサイクリン濃度により調節され、この抗生物質が存在す
る場合には抑制される（Ｇｏｓｓｅｎ及びＢｕｊａｒｄ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：５５４７−５５５１（１９９２）；Ｏｒｙら
、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３：１１４００−１１４
０６（１９９７））。２９３Ｇ細胞は、通常１０％ドナーウシ血清を補充し、か
つ１μｇ／ｍｌテトラサイクリンを含有するＤＭＥＭ／低濃度グルコース培養培
地中で維持される。２９３Ｇ細胞の１５ｃｍプレートを、リポフェクタミン（Ｇ
ＩＢＣＯＢＲＬ）を用い、パッケージングプラスミドｐＣＭＶΔＲ８．７４の
１３．３６μｇ及び選択プラスミドｐＺｅｏＳＶ２の１．３３μｇで、トランス
フェクションした。この培地を２４時間後に交換し、４８時間後に細胞を、ゼオ
シン２５０μｇ／ｍｌ及びテトラサイクリン１μｇ／ｍｌを含有する培地に分け
た。３〜４週間選択した後、２５０クローンを採取し、９６ウェルプレートに移
し、かつこの培地を市販のキットを用いて、免疫捕獲によりＨＩＶ−１ｐ２４
Ｇａｇ抗原についてスクリーニングした。５２個のｐ２４陽性クローンを更な
る分析のために増殖した。最良の５個のクローンが、１２〜２３ｎｇ／ｍｌのｐ
２４値を有することが決定された。これらの５個のクローンのうち４個は、ウェ
スタンブロット分析により、テトラサイクリン除去後、ＶＳＶ．Ｇ発現について
陽性であった。更に４個のｐ２４／ＶＳＶ．Ｇ陽性クローンを、レンチウイルス導入ベクター
をパッケージする能力について分析した。これらのクローンを、ＣＭＶプロモー
ターで起動されたＡ．Ｖｉｃｔｏｒｉａのグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の
発現カセットを含む一過性に産生されたレンチウイルスベクター（ＶＳＶ．Ｇ偽
型）で、感染多重度１０かつポリブレン（８μｇ／ｍｌ）存在下で、感染した。
次に感染したクローンを拡張し（ｅｘｐａｎｄｅｄ）、テトラサイクリンを除去
した。誘導の７２時間後、２４時間培地の収集を行い、上清をろ過し、急速凍結
した。凍結した上清を、ＧＦＰ遺伝子の形質導入について天然のＨｅＬａ細胞上
で力価測定した。ＦＡＣＳ分析により、パッケージングクローン００−２８の感
染によって生じた細胞集団（１０−２８と称される）は、最大の力価５×１０^４
形質導入単位（Ｔ．Ｕ．）／ｍｌを有することが決定された。感染されたパッケージング集団１０−２８を、ＧＦＰレンチウイルスベクター
の高力価産生クローンの作出に用いた。１０−２８細胞は、ＦＡＣＳにより調べ
、かつ最高のＧＦＰ発現細胞を保持し拡張した。その後この集団を、一過性に作
製されたＧＦＰレンチウイルス（ＶＳＶ．Ｇ偽型）で更に４回、連続的に（「ピ
ング（ｐｉｎｇ）」）感染した。各々感染した後、上清をＶＳＶ．Ｇ誘導の７２
〜９６時間後に収集した。上清を、ＨｅＬａ細胞上で力価決定し、かつ免疫捕獲
アッセイによりｐ２４含量について分析した。感染力価は、３回目のピング後に
ピークを示し、１．５×１０^６Ｔ．Ｕ．／ｍｌに達した（図３参照）。３回目の
ピングからの細胞集団を、サブクローニングし、高力価ベクターのプロデューサ
ーを単離した。本願明細書に引用した論文及び特許出願は全て、個々の論文又は特許出願が明
確かつ個別に参照として組込まれることが示されるように、それらの全体が本願
明細書に参照として組込まれている。本発明に関連する当業者には明らかであるように、本発明は、先に明確に示さ
れたもの以外の形、例えば、他の哺乳類細胞型のトランスフェクション及び形質
導入も、本発明の精神又は本質的特長から逸脱することがない限りは包含してい
る。従って前述の本発明の特定の実施態様は、例証のためであり制限するもので
はないとみなすべきである。本発明の範囲は、記したように、前述の説明におい
て限定された実施例に制限されるものではなく、添付された特許請求の範囲であ
る。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】これは様々なレンチウイルスベクターを示す。ＲＳＶはラウス肉腫ウ
イルスエンハンサー／プロモーターであり；ＲはＬＴＲのＲ領域であり；Ｕ５は
ＬＴＲのＵ５領域であり；ＳＤはスプライスドナー部位であり、例えばＨＩＶ
５’主要スプライスドナー部位であり：ψはプサイキャプシド形成シグナル配列
であり；Ｇａはｇａｇ遺伝子の一部であり；ＲＲＥはｒｅｖ反応性エレメントで
あり；ＳＡはスプライスアクセプター配列であり；Ｕ３はＬＴＲのＵ３領域であ
る。

【図２】これは、別のレンチウイルスベクターを示す。ＣＭＶはサイトメガロ
ウイルスである。他の点では、記号は図１に示したものと同じである。

【図３】これは、導入ベクターの量を漸増する場合の等級化されたベクター産
生を示すグラフである。

【手続補正書】

【提出日】平成１２年６月２７日（２０００．６．２７）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正内容】

【発明の名称】高力価で安全な組換えレンチウイルスベクター作成の方法及び
手段

【特許請求の範囲】

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の分野本発明は、新規レンチウイルスパッケージングベクター、問題の外来遺伝子を
保持する導入ベクター、安定したパッケージング細胞株、安定したプロデューサ
ー細胞株、及び哺乳類細胞中で組換えレンチウイルスを産生するためのそれらの
使用に関する。発明の背景レトロウイルスベクターは、遺伝子送達のための一般的道具である(Miller 、
Nature 、357:455-460(1992))。レトロウイルスベクターの再編成されない単一
コピー遺伝子を広い範囲の齧歯類、霊長類及びヒトの体細胞に送達する能力は、
細胞への遺伝子導入に良く適したレトロウイルスベクターを作出する。

【０００２】組換えレトロウイルスベクターを作製するために有用な付属物は、感染性ビリ
オンの作製に必要なタンパク質をトランス(in trans)で供給するパッケージング
細胞株であるが、このような細胞は、内因性のウイルスゲノム核酸をパッケージ
ングすることが不可能である(Watanabe 及びTemin 、Molec. Cell Biol. 、3(12
):2241-2249(1983) ；Mannら、Cell、33:153-159(1983)；Embretson 及びTemin
、J. Viol.、61(9):2675-2683(1987) ) 。レトロウイスルパッケージング細胞株
の構築に関する考察は、齧歯類(Cloydら、J. Exp. Med.、151:542-552(1980))及
び霊長類(Donahueら、J. Exp. Med.、176:1125-1135(1992))においてＴリンパ球
を産生することが示されている、組換えの複製コンピテントのレトロウイルス(R
CR) を含まない高力価のベクターの上清の作製である。

【０００３】パッケージング細胞においてRCR の生成の可能性を最小にするひとつの方法は
、パッケージング機能を２個のゲノム、例えば、一方はgag 及びpol 遺伝子産物
を発現し、他方はenv 遺伝子産物を発現するものに分割することである(Bosselm
anら、Molec. Cell Biol. 、7(5):1797-1806(1987)；Markowitz ら、J. Virol.
、62(4):1120-1124(1988) ；Danos 及びMulligan、Proc. Natl. Acad. Sci.、85
:6460-6464(1988)）。この方法は、これらの２個のゲノムの同時パッケージング
及びそれに続く導入の能力、更にはRCR を産生するための該パッケージング細胞
における３個のレトロウイルスゲノムの存在に起因した組換え頻度を顕著に減少
する能力を最小化する。

【０００４】組換え体が生じる事象において、いずれか可能性のある組換え体を機能しなく
するために望ましくない遺伝子産物内に変異(Danos及びMulligan、前記）又は欠
失(Boselman ら、前記；Markowitz ら、前記）を設計することができる。加えて
、両パッケージング構築物上の３’側LTR の欠失は、機能的組換え体を形成する
能力も低下させる。

【０００５】レンチウイルスは、一般的なレトロウイルス遺伝子gag 、pol 及びenv に加え
て、調節又は構造機能を伴う他の遺伝子を含む複合レトロウイルスである。高度
な複雑性は、潜伏感染期に、レンチウイルスがその生活環を変調することを可能
にする。典型的レンチウイルスは、AIDSの病原物質であるヒト免疫不全ウイルス(HIV)
である。In vivo においてHIV は、リンパ球及びマクロファージのような分裂が
稀である最終的に分化した細胞に感染することができる。In vitroにおいて、HI
V は、単球由来マクロファージ(MDM) の初代培養、更にはアフィディコリン又は
γ線照射の処理によって細胞周期が抑制されたHeLa-Cd4細胞又はＴリンパ球細胞
に感染することができる。

【０００６】細胞の感染は、標的細胞の核膜孔を通じてのHIV の組込み前複合体の核への能
動輸送に左右される。これは、標的細胞の核への輸送機構と、該複合体中の複数
の部分的に多重複の分子決定基の相互作用によって生じる。同定された決定基は
、gag マトリックス(MA)タンパク質、親核性の(karyophilic）ビリオン−関連タ
ンパク質、vpr 、及びgag MAタンパク質のC-末端ホスホチロシン残基の機能的核
局在化シグナル(NLS）を含む。発明の概要従って、本発明は、パッケージできるレンチウイルスベクター転写物及び哺乳
類細胞における高力価組換えレンチウイルスの迅速な作製のためのレンチウイル
スタンパク質の両方の合成に関係する新規の安全化されたレンチウイルスベクタ
ーに関する。これらの結果は、問題の外来遺伝子を標的細胞へ送達するための感
染性粒子である。本発明は更に、ウイルス産生のための細胞株を提供する。発明の詳細な説明本発明は、非分裂細胞を感染することが可能な組換えレンチウイルス、更には
これを製造する方法及び手段を提供する。このウイルスは、核酸配列のin vivo
及びex vivo における導入及び発現に有用である。

【０００７】レンチウイルスゲノム及びプロウイルスDNA は、レトロウイスルにおいて発見
された３個の遺伝子を有する：gag 、pol 及びenv であり、これらには、２個の
長い末端反復配列(LTR) が隣接している。gag 遺伝子は、内部構造（マトリック
ス、キャプシド及びヌクレオキャプシド）タンパク質をコードし；pol 遺伝子は
、RNA-依存性DNA ポリメラーゼ（逆転写酵素）、プロテアーゼ及びインテグラー
ゼをコードし；並びに、env 遺伝子は、ウイルスのエンベロープの糖タンパク質
をコードしている。５’及び３’側LTR は、ビリオンRNA の転写及びポリアデニ
ル化を促進するのに利用できる。LTR は、ウイルス複製に必要な他のシス作用性
配列を全て含む。レンチウイルスは、vif 、vpr 、tat 、rev 、vpu 、nef 及び
vpx （HIV-1 、HIV-2 及び／又はSIV ）を含む追加遺伝子を有する。

【０００８】５’側LTR への隣接物は、ゲノムの逆転写に必要な配列（tRNAプライマー結合
部位）及びウイルスRNA の粒子への効果的なキャプシド形成に必要な配列（プサ
イ部位）である。キャプシド形成（又はレトロウイルスRNA の感染ビリオンへの
パッケージング）に必要な配列がウイルスゲノムから失われた場合は、このシス
欠損は、ゲノムRNA のキャプシド形成を妨げる。しかし、得られる変異体は、依
然全てのビリオンタンパク質の合成を指向することが可能である。

【０００９】本発明は、パッケージング機能、すなわちgag 、pol 及びenv 、更にはrev 及
びtat を有する２種以上のベクターにより適当な宿主細胞へトランスフェクショ
ンすることを含む、非分裂細胞を感染することが可能な組換えレンチウイルスを
作製する方法を提供する。以下に説明するように、機能性tat 遺伝子を欠いてい
るベクターが、特定の用途のためには望ましい。従って、パッケージング細胞を
産生するために、例えば第一のベクターは、ウイルス性gag 及びウイルス性pol
をコードしている核酸を提供することができ、かつ別のベクターは、ウイルス性
env をコードしている核酸を提供することができる。本願明細書において導入ベ
クターと同定される異種遺伝子を提供するベクターのパッケージング細胞への組
入れは、問題の外来遺伝子を保持する感染性ウイルス粒子を放出するプロデュー
サー細胞を生じる。

【００１０】前述のベクターそれ自体は、本願明細書において開示された新規に構築された
ベクターの範囲外であるが、これは当該技術分野において公知であり、Naldini
らの論文（Sci.、272:263-267(1996) ）；及びZuffereyらの論文（Nat. Biotech
. 、15:871-875(1997)）を参照のこと。一般にこれらのベクターは、プラスミド
をベースにした又はウイルスをベースにしたものであり、外来核酸の組入れ、核
酸の選択及び宿主細胞への導入に必須の配列を保持するように設計されている。
問題のベクターのgag 、pol 及びenv 遺伝子も、当該技術分野において公知であ
る。従って関連する遺伝子が、選択されたベクターにクローニングされ、その後
問題の標的細胞の形質転換に使用される。

【００１１】前述のベクター及び外来遺伝子の設計に従い、第二のベクターは、ウイルス性
エンベロープ(env) 遺伝子をコードしている核酸を提供することができる。env
遺伝子は、レトロウイルスを含むあらゆるウイルスに由来することができる。好
ましくはenv は、ヒト及び他種の細胞の形質導入を可能にする両種指向性エンベ
ロープタンパク質である。

【００１２】このエンベロープタンパク質の抗体との結合、又は特定の細胞種のレセプター
への標的化のための特定のリガンドにより組換えウイルスを標的化することが望
ましい。ウイルスベクターに問題の配列（調節領域を含む）を、例えば特異的標
的細胞上の受容体のリガンドをコードしている他の遺伝子と共に挿入することに
より、このベクターは標的特異性となる。レトロウイルスベクターは、例えば糖
脂質又はタンパク質の挿入により、標的特異性に作製することができる。標的化
は、抗体又は組換え抗体型分子、例えば１本鎖抗体などの抗原−結合部分を使用
することにより達成され、レトロウイルスベクターを標的化する事が多い。当業
者には、特異的標的へのレトロウイルスベクターの送達を達成する具体的な方法
は公知であるか、又は過度の実験をすることなく容易に確かめるであろう。

【００１３】レトロウイルス−由来のenv 遺伝子の例は、モロニーマウス白血病ウイルス(M
oMuLV 又はMMLV) 、ハーベイマウス肉腫ウイルス（HaMuSV又はHSV ）、マウス乳
がんウイルス（MuMTV 又はMMTV）、ギボンサル白血病ウイルス（GaLV又はGALV）
、ヒト免疫不全ウイルス(HIV) 及びラウス肉腫ウイルス(RSV) を含むが、これら
に限定されるものではない。水泡性口内炎ウイルス(VSV) プロテインG(VSVG) 、
肝炎ウイルス及びインフルエンザのそれのような他のenv 遺伝子も使用すること
ができる。

【００１４】ウイルス性env 核酸配列を提供するベクターは、例えばプロモーター又はエン
ハンサーのような調節配列に機能的に結合している。この調節配列は、真核生物
のプロモーターまたはエンハンサーであることができ、例えばモロニーマウス白
血病ウイルスのプロモーター−エンハンサーエレメント、ヒトサイトメガロウイ
ルスのエンハンサー又はワクシニアP7.5のプロモーターを含む。一部の場合は、
モロニーマウス白血病ウイルスのプロモーター−エンハンサーエレメントのよう
に、プロモーター−エンハンサーエレメントが、LTR 配列内に又はこれに隣接し
て位置する。

【００１５】好ましくはこの調節配列は、ベクターが構築されたレンチウイルスにとって内
因性でないものである。従って、ベクターがSIV から作出された場合は、SIV LT
R に認められるSIV 調節配列は、SIV を起源としない調節エレメントによって置
き換えられるであろう。 VSV G は組換えウイルスに広範な宿主細胞の範囲を付与するので、VSV G タン
パク質は望ましいenv 遺伝子であるが、VSV G は宿主細胞にとって有害であり得
る。従って、VSV G に関する遺伝子のような遺伝子が使用される場合は、誘導性
プロモーターシステムを使用し、その結果VSV G 発現が必要でない場合には、VS
V G 発現を宿主毒性が最小になるように調節できるようにすることが好ましい。

【００１６】例えばGossen及びBujardの論文（Proc. Natl. Acad. Sci.、89:5547-5551(199
2)）に記載されたテトラサイクリン−調節性遺伝子発現システムを用いて、テト
ラサイクリンが導入された細胞から取り除かれた場合にVSV G の誘導発現を提供
するために利用することができる。従って、tet/VP16トランスアクチベーターは
、第一のベクター上に存在し、かつVSV G をコードする配列は、別のベクター上
のtet オペレーター配列によって制御されたプロモーターの下流にクローニング
される。

【００１７】異種又は外来の核酸配列である導入遺伝子は、調節核酸配列に操作できるよう
に連結される。本願明細書において使用される用語「異種」核酸配列は、外来種
を起源とする配列、又は同種に由来する場合にはこれが当初の形から実質的に修
飾されていることを意味する。あるいは、細胞では通常は発現しない未変化の核
酸配列は、異種核酸配列である。

【００１８】用語「操作できるように連結」とは、調節配列と異種核酸配列が機能的に連結
し、後者の発現を生じることを意味する。好ましくは、異種配列は、プロモータ
ーに連結され、キメラ遺伝子を生じる。この異種核酸配列は、好ましくはウイル
ス性LTR プロモーター−エンハンサーシグナル又は内部プロモーターのいずれか
の制御下にあり、レトロウイスルLTR 内に保持されたシグナルは、依然導入遺伝
子の効果的発現をもたらすことができる。

【００１９】前記外来遺伝子は、転写することができる問題の核酸のいずれかであることが
できる。一般に外来遺伝子はポリペプチドをコードしている。このポリペプチド
は、何らかの治療上の利点があるものが好ましい。ポリペプチドは、宿主細胞に
おいて、内因性タンパク質の発現の欠損又は不存在を補うことができる。このポ
リペプチドは、宿主細胞に新たな特性、例えば米国特許第5,359,046 号に開示さ
れたキメラシグナル受容体などを与えることができる。技術者は、本願明細書に
記載しかつ当該技術分野において公知である技術を実践し外来遺伝子の適性を決
定することができる。例えば、技術者は、外来遺伝子はキャプシド形成に適した
大きさかどうか、及び外来遺伝子産物が適切に発現されるかどうかということを
知っているであろう。

【００２０】本発明の方法による分子の組入れにより細胞において分子を調節する遺伝子の
発現を変調することが望ましい。用語「変調」は、過剰発現された場合の遺伝子
発現の抑制、又は過小発現された場合の発現の増大を描いている。細胞の増殖障
害が遺伝子発現に関連している場合は、翻訳レベルで遺伝子発現を妨害している
核酸配列を使用することができる。この方法は、例えばアンチセンス核酸リボザ
イム又はトリプレックス物質(triplex agent) を用いて、核酸又はトリプレック
ス物質によりmRNAを隠すか、又はリボザイムでこれを切断するかのいずれかによ
り、特異的mRNAの転写又は翻訳を阻害することができる。

【００２１】アンチセンス核酸は、特異的mRNA分子の少なくとも一部と相補的であるDNA 又
はRNA 分子である(Weintraub、Sci. Am.、262:40(1990)) 。細胞において、アン
チセンス核酸は、対応するmRNAにハイブリダズし、２本鎖分子を形成する。細胞
は２本鎖mRNAを翻訳しないので、アンチセンス核酸はmRNAの翻訳を妨害する。約
15個以上のヌクレオチドのアンチセンスオリゴマーが、容易に合成され、かつ恐
らく標的細胞に組入れられた際により大きい分子よりも問題を引き起こすことが
少ないので、好ましい。遺伝子のin vitro翻訳を阻害するためのアンチセンス法
の使用は、当該技術分野において周知である（Marcus-Sakura 、Anal. Biochem.
、172:289(1988））。

【００２２】アンチセンス核酸は、アルツハイマー病において蓄積するアミロイド前駆体タ
ンパク質のような変異タンパク質又はドミナントアクティブ遺伝子産物の発現を
ブロックするために使用することができる。このような方法は、更にハンチント
ン病、遺伝性パーキンソン病及び他の疾患の治療についても有用である。アンチ
センス核酸は、毒性に関連したタンパク質の発現の阻害についても有用である。

【００２３】転写を停止するためのオリゴヌクレオチドの使用は、オリゴマーが二重らせん
DNA の周りに巻きつき、３本鎖らせんを形成するトリプレックス戦略として公知
のメカニズムによることができる。従って、トリプレックス化合物は、選択され
た遺伝子上の独自の部位を認識するように設計することができる（Maher ら、An
tisense REs and Dev.、1(3)227(1991) ；Helene、Anticancer Drug Dis.、6(6)
:569(1991)）。

【００２４】リボザイムとは、他の１本鎖RNA をDNA 制限エンドヌクレアーゼに類似の方法
で特異的に切断する能力を有するRNA 分子である。これらのRNA をコードしてい
るヌクレオチド配列の修飾を通じて、RNA 分子において特異的ヌクレオチド配列
を認識し切断する分子を操作することが可能である（Cech、J. Amer. Med. Assn
. 、260:3030(1988)）。このような方法の大きい利点は、特定の配列を有するmR
NAのみが不活性化されることである。

【００２５】生体反応調節剤をコードしている核酸を導入することが望ましい。この範疇に
含まれるのは、「インターロイキン」に分類される多くのサイトカイン類、例え
ばインターロイキン１から12をコードしている核酸を含む免疫賦活剤である。更
にこの範疇に含まれるのは、必ずしも同じメカニズムに従って作用するものでは
ないが、インターフェロン、特にγインターフェロン（γ-IFN) であり、腫瘍壊
死因子(TNF) 及び顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)である。こ
のような核酸が骨髄細胞又はマクロファージに送達され、先天性の酵素欠損又は
免疫不全を治療することが望ましい。増殖因子、毒素性ペプチド、リガンド、受
容体又は他の生理学的に重要なタンパク質をコードしている核酸も、特異的非分
裂細胞に組入れることができる。

【００２６】従って、本発明の組換えレンチウイルスは、抗HIV-分子によりHIV-感染細胞（
例えばＴ細胞又はマクロファージ）を治療するために使用することができる。加
えて、例えば、気道上皮を、嚢胞性繊維症の治療のために、嚢胞性繊維症トラン
スメンブランコンダクタンス調節(CFTR)遺伝子を有する本発明の組換えレンチウ
イルスにより感染することができる。

【００２７】本発明の方法は、更にex vivo での本発明の組換えレンチウイルスに感染した
細胞の移植、又は中枢神経系もしくは脳室洞(ventricular cavity)への又は宿主
脳の表面の硬膜下へのin vivo での感染に関連している、神経細胞、グリア細胞
、繊維芽細胞又は間充織細胞の移植(transplantation) 又は「グラフト」に有用
である。このようなグラフト化に関する方法は、当業者には周知であり、かつBj
orklund 及びStenevi 編集のNeural Grafting in the Mammalian CNS（1985年）
に記載されている。

【００２８】タンパク質産物の欠損に起因する疾患に関して、遺伝子導入は、代償療法のた
めに正常遺伝子を感染組織へ組入れることができ、更にはアンチセンス変異を用
いた疾患のための動物モデルを作製することができる。例えば、筋肉、脾臓又は
肝臓細胞の感染のためには、ファクターVIII又はIXをコードする核酸をレンチウ
イルスに挿入することが望ましい。

【００２９】プロモーター配列は、所望の遺伝子配列に対して同種又は異種であることがで
きる。広範なプロモーター類を利用することができ、これはウイルス又は哺乳類
のプロモーターを含む。細胞又は組織に特異的なプロモーターは、特異的細胞集
団における遺伝子配列の発現の標的指向化に利用することができる。本発明に適
した哺乳類又はウイルスプロモーターは、当該技術分野において入手することが
できる。

【００３０】任意に、クローニング段階の間に、パッケージングシグナル及び異種クローニ
ング部位を有する導入ベクターと称される核酸構築物は、更に選択マーカー遺伝
子を含む。マーカー遺伝子は、該ベクターの存在を調べるために利用され、その
結果感染又は組込みが確認される。マーカー遺伝子の存在は、該挿入物を発現し
ている宿主細胞のみの選択及び増殖を保証する。典型的な選択遺伝子は、抗生物
質又は他の毒物、例えばヒスチジノール、プロマイシン、ハイグロマイシン、ネ
オマイシン、メトトレキセートなどに対する耐性を付与するタンパク質、及び細
胞表面マーカーをコードしている。

【００３１】本発明の組換えウイルスは、哺乳類細胞に核酸配列を導入することが可能であ
る。用語「核酸配列」は、本願明細書において詳細に論ぜられるように、いずれ
かの核酸分子、特にDNA を意味する。核酸分子は、DNA 、cDNA、合成DNA 、RNA
又はそれらの組合せを含む様々な起源に由来することができる。このような核酸
配列は、天然のイントロンを含むこともあり、含まないこともあるようなゲノム
DNA を包含し得る。更にこのようなゲノムDNA は、プロモーター領域、ポリＡ配
列又は他の関連する配列に関連して得ることができる。ゲノムDNA は、当該技術
分野において周知の手段により、適当な細胞から抽出及び精製することができる
。あるいは、メッセンジャーRNA(mRNA) は、細胞から単離し、逆転写又は他の手
段によりcDNAを作製するために使用することができる。

【００３２】好ましくは、本発明の方法で作製された組換えレンチウイルスは、ヒト免疫不
全ウイルス(HIV) の誘導体である。このenv はHIV 以外のウイルスに由来するで
あろう。本発明の方法は、いくつかの実施態様において、前述のように、例えばgag 、
pol 、env 、tat 及びrev のような組換えビリオンのパッケージングに必要な全
ての機能をもたらす３種のベクターを提供する。本願明細書において記したよう
に、tat は、予想外の利点を機能的に欠失し得る。これらのベクターがパッケー
ジング細胞株の形質転換及び作出に使用され、組換えレンチウイルスを生じる限
りは、使用されるベクターの数に制約はない。

【００３３】前述のベクターは、トランスフェクション又は感染によりパッケージング細胞
株に組入れられる。このパッケージング細胞株は、該ベクターゲノムを含むウイ
ルス粒子を産生する。トランスフェクション又は感染の方法は、当業者には周知
である。パッケージングベクター及び導入ベクターのパッケージング細胞株への
同時トランスフェクション後、当業者によって用いられる常法により組換えウイ
ルスは培養培地から回収され、かつ力価測定される。

【００３４】従って、このパッケージング構築物は、リン酸カルシウムトランスフェクショ
ン法、リポフェクション法又は電気穿孔法により、通常はneo 、DHFR、Gln シン
テターゼ又はADA のようなドミナントな選択マーカーと一緒に、ヒト細胞株に導
入し、その後適当な薬物の存在下で選択しかつクローンを単離することができる
。これらの選択マーカー遺伝子は、該構築物の中のパッケージング遺伝子に物理
的に連結することができる。

【００３５】パッケージング機能が適当なパッケージング細胞によって発現されるように設
計された安定した細胞株は公知である。例えばパッケージング細胞について開示
した米国特許第5,686,279 号；及びにOrayらの論文（Proc. Natl. Acad. Sci.、
93:11400-11406(1996)）を参照のこと。前記Zuffereyらの論文は、HIV-1 env 遺伝子を含むpol の３’側配列が欠失し
ているレンチウイルスパッケージングプラスミドを示している。この構築物は、
tat 及びrev 配列を含み、かつ３’側LTR はポリＡ配列で置換されている。５’
側LTR 及びpsi 配列は、誘導性であるもののような別のプロモーターによって置
換されている。例えば、CMV プロモーター又はそれらの誘導体を使用することが
できる。

【００３６】問題のパッケージングベクターは、レンチウイルスタンパク質の発現を増強し
かつ安全性を増強するために、パッケージング機能を更に変更することを含む。
例えばgag の上流のHIV 配列は全て除去することができる。更にenv の下流の配
列も除去することができる。更に、RNA のスプライシング及び翻訳を増強するた
めに、ベクターを修飾する工程を行うことができる。

【００３７】複製コンピテントなレンチウイルスの作出の可能性がよりごくわずかであるベ
クターを提供するために、本発明は、転写機構によりウイルス発現を促進する調
節タンパク質であるtat 配列が機能的に欠失されているようなレンチウイルスパ
ッケージングプラスミドを提供する。その結果、tat 遺伝子が、一部又は全て欠
失されるか、もしくは様々な点突然変異又は他の突然変異がtat 配列に生じ、遺
伝子を非機能性にする。技術者は、tat 遺伝子を非機能性にする公知の技術を実
践することができる。

【００３８】ベクターの構築並びに細胞のトランスフェクション及び感染に使用される技術
は、当該技術分野において広範に実践されている。実施者は、特定の条件及び手
順を説明する標準の手段材料を熟知している。しかし、便宜上下記の段落におい
てガイドラインを示す。本発明のベクターの構築には、当該技術分野において周知の標準的連結及び制
限法を用いる（Maniatisら、Molecular Cloning : A Laboratory Manual 、コー
ルドスプリングハーバー、NY、1982年を参照のこと）。単離されたプラスミド、
DNA 配列又は合成されたオリゴヌクレオチドは、切断し、望ましい形状に適合さ
せかつ再連結する。

【００３９】位置特異的DNA 切断は、当該技術分野において理解される条件下、及び特別な
場合は市販の制限酵素の製造業者の指定する条件下で、適当な制限酵素（又は酵
素類）で処理することによって行われ、これについては、例えばNew England Bi
olabs 社の製品カタログを参照のこと。一般に、プラスミド又はDNA 配列約１μ
g を、約20μl のバッファー液中で酵素１ユニットで切断する。典型的には、制
限酵素の過剰量を用いて、DNA 基質の完全な消化を確実にする。およそ37℃で約
１〜２時間のインキュベーション時間が実行可能であるが、その変形も許容する
ことができる。各インキュベーション後、フェノール／クロロホルムを用いる抽
出によりタンパク質を除去し、その後エーテルで抽出し、かつ核酸を水性画分か
らエタノール沈殿により回収する。所望であるならば、切断された断片のサイズ
分離を、常法を用いポリアクリルアミドゲル又はアガロースゲル電気泳動により
行うことができる。サイズ分離の一般的説明は、Method of Enzymology、65:499
-560(1980)に見ることができる。

【００４０】制限切断された断片は、50mM Tris(pH7.6)、50mM NaCl 、6mM MgCl₂、6mM DT
T 及び５〜10μM dNTPの中で、20℃で約15〜25分のインキュベーション時間を用
いた、４種のデオキシヌクレオチド３リン酸(dNTP)の存在下における、E.coli D
NAポリメラーゼＩの巨大断片（クレノウ）による処理により平滑末端であり得る
。クレノウ断片は、５’の粘着末端を満たすが、たとえ４種のdNTPが存在したと
しても、突出している３’側の１本鎖を砕いてしまう(chew back) 。所望である
ならば、選択性の修復が、粘着末端の性質によって指示された制約内で、唯一の
dNTPの、又は選択されたdNTPの供給によって行うことができる。クレノウによる
処理後、この混合物はフェノール／クロロホルムで抽出され、エタノール沈殿さ
れる。適当な条件下でのS1ヌクレアーゼ又はBal-31による処理は、いずれかの１
本鎖部分の加水分解を生じる。

【００４１】連結は、下記の標準条件及び温度下で、容量15〜50μl の中で行うことができ
る：20mM Tris-Cl pH7.5、10mM MgCl₂、10mM DTT、33mg/ml BSA 、10mM-50mM Na
Cl、及び40μM ATP 、0.01〜0.02(Weiss）ユニットのT4 DNAリガーゼを用い０℃
（「粘着末端」の連結）又は1mM ATP 、0.3 〜0.6(Weiss)ユニットのT4 DNAリガ
ーゼを用い14℃（「平滑末端」の連結）のいずれか。分子内「粘着末端」の連結
は、通常総DNA 濃度33〜100 μg/mlで行われる（総末端濃度５〜100mM ）。分子
内平滑末端の連結は、（通常10〜30倍のモル過剰量のリンカーを用いて）１μM
の総末端濃度で行われる。

【００４２】従って、本発明において、レンチウイルスパッケージングベクターは、プロモ
ーター及び、gag 、pol 、rev 、env 又はそれらの組合せ、並びにtat の特異的
機能の又は実際の削除を伴うような、当業者によって決定された他の任意又は必
要な調節配列、及び任意に他のレンチウイルスアクセサリー遺伝子を含むように
作出される。

【００４３】レンチウイルス導入ベクター（Naldini ら、前記；Proc. Natl. Acad. Sci.、
93:11382-11388(1996)）は、in vitroにおいてヒト細胞を増殖抵抗性(growth-ar
rested) に感染するために、及び成体ラットの脳へ直接注射した後に神経を形質
導入するために使用されている。このベクターは、in vivo における神経へのマ
ーカー遺伝子導入時の効率がよく、かつ検出可能な病理が存在しない場合に長期
間発現が達成される。これまで試験した中で最長である該ベクターの単回注射後
10ヶ月間にわたって分析した動物は、導入遺伝子発現の平均レベルにおいて減少
を示さず、かつ組織病理又は免疫反応の徴候を示さなかった（Blomerら、J. Vir
ol. 、71:6641-6649(1997)）。非分裂細胞を形質導入するベクターの能力を損な
うことなく、HIV ビルレンス遺伝子であるenv 、vif 、vpr 、vpu 及びnef が欠
失されたレンチウイルスベクターの改善されたバージョンが開発されている。多
様に減弱されたバージョンは、該ベクターの生体安全性の実質的改善を示してい
る（Zuffereyら、前記）。

【００４４】形質導入された細胞においては、組込まれたレンチウイルスベクターは、一般
に各末端にLTR を有する。５’側LTR は、特にHIV-感染細胞において、組換えの
基質となり得る「ウイルス性」転写物の蓄積を引き起こすことがある。３’側LT
R は、細胞のプロトオンコジーンを活性化した結果生じる危険性を伴う下流の転
写を促進する。

【００４５】 U3配列は、HIV LTR の大部分を含む。このU3領域は、感染細胞における及び細
胞活性化に反応したHIV ゲノムの基本的かつ誘導された発現を変調するエンハン
サーエレメント及びプロモーターエレメントを含む。プロモーターエレメントの
いくつかが、ウイルス複製には必須である。エンハンサーエレメントの一部は、
ウイルス単離体において高度に保存され、かつウイルス病原性の重大なビルレン
ス因子であることが示されている。エンハンサーエレメントは、ウイルスの様々
な標的細胞において、複製率に影響を及ぼすように作用することができる（Mart
has ら、J. Viol.、67:6047-6055(1993)）。

【００４６】ウイルス転写は５’側LTR のU3領域の３’末端から始まるので、これらの配列
は、ウイルスmRNAの一部ではなく、かつ３’側LTR 由来のそれらのコピーは、組
込まれたプロウイルスにおいて両LTR 生成の鋳型として作用する。U3領域の３’
コピーがレトロウイルスベクター構築物において変更される場合は、このベクタ
ーRNA は依然プロデューサー細胞の完全な５’側LTR から産生されるが、標的細
胞において再生することはできない。このようなベクターの形質導入は、子孫ウ
イルスにおいて両LTR の不活性化を生じる。従ってレトロウイルスは、自己不活
性(SIN) であり、かつこれらのベクターはSin 導入ベクターとして公知である。

【００４７】しかしながら、３’側LTR の欠失の程度には制限がある。第一に、U3領域の５
’末端は、組込みに必要である、ベクター導入における他の本質的機能を提供す
る（末端のジヌクレオチド＋att 配列）。従って末端ジヌクレオチド及びatt 配
列は、欠失されているU3配列の５’側境界を示すことができる。加えて、一部の
曖昧に定義された領域は、Ｒ領域下流のポリアデニル化部位の活性に影響を及ぼ
すことができる。３’側LTR のU3配列の過剰な欠失は、プロデューサー細胞にお
けるベクターの力価及び標的細胞における導入遺伝子の発現の両方に対し、有害
な結果を伴うベクター転写物のポリアデニル化を減少することができる。他方、
限定された欠失は、形質導入された細胞においてLTR の転写活性を無効にするこ
とはできない。

【００４８】本願明細書において説明したレンチウイルス導入ベクターの新規バージョンで
は、３’側LTR のU3領域の増加する欠失を保持している（図１：U3 LTRのヌクレ
オチド-418から指定された位置までのU3欠失の長さ：SIN-78、SIN-45、SIN-36及
びSIN-18）。プロデューサー細胞におけるベクターの力価及び標的細胞における
導入遺伝子の発現のいずれも損なうことなく、３’側LTR からのU3配列のほぼ完
全な欠失を有するレンチウイルスベクターが開発された。最も広範な欠失（-418
から-18 ）は、TATAボックスにまで及び、その結果形質導入された細胞のLTR の
転写活性が無効になっている。従って、３’側の欠失に関するより低い限界は、
TATAボックスを含む位置まで及ぶ。この欠失は、Ｒ領域までのU3領域の残りであ
る。これは、ベクターの安全性が劇的に増すことを意味している。様々な欠失が
当該技術分野において公知の実施法により作出された。

【００４９】驚くべきことに、導入遺伝子の平均の発現レベルは、より完全なベクターと比
べて、SIN ベクターによって形質導入された細胞においてでさえ高かった。これ
は恐らく、内部プロモーター上の上流HIV LTR から転写の妨害が除かれたためで
あろう。このようなU3領域の広範囲の欠失を伴うSIN-型ベクターは、形質導入効
率を損なうことなく、マウス白血病ウイルス(MLV) を基にしたレトロウイルスベ
クターについて作出することはできない。

【００５０】導入ベクターの５’側LTR は、異種エンハンサー／プロモーターを伴うU3領域
の転写調節エレメントの一部又は全部を置換することによって修飾された。この
変更は、プロデューサー細胞における導入ベクターRNA の発現を増強するように
；HIV のtat 遺伝子不存在下でのベクターの作製を可能にするように；並びに、
前述のSIN ベクターを「救出」するための３’側が欠失したバージョンと再結合
することができる上流のHIV LTR の野生型コピーを除去するように作出された。

【００５１】従って、５’側LTR に前述の変更を含むベクターである５’ベクターは、発現
を増強する配列及びtat を発現しないパッケージング細胞との組合せのために、
導入ベクターとしての使用を見出すことができる。このような５’ベクターは、更に先に説明したように３’側LTR に修飾を保持
することもでき、単に発現が増強されず、tat を発現しないパッケージング細胞
において使用することができるだけでなく、更に自己不活性化することができる
ような改善された導入ベクターを生じる。

【００５２】 HIV LTR からの転写は、tat タンパク質のトランスアクチベーター機能に高度
に依存している。プロデューサー細胞に存在するコアパッケージング構築物によ
ってしばしば発現されるtat が存在する場合、HIV LTR からのベクターの転写は
強力に刺激される。完全な長さの「ウイルス」RNA は、パッケージングシグナル
の完全な相補性を有しているので、このRNA は効率的にベクター粒子中でキャプ
シド形成され、かつ標的細胞に導入される。プロデューサー細胞のパッケージン
グによって利用できるベクターRNA の量は、感染性ベクター作製の律速段階であ
る。

【００５３】５’側LTR のエンハンサー領域又はエンハンサー及びプロモーター領域は、各
々、ヒトサイトメガロウイルス(CMV) 又はマウスラウス肉腫ウイルス(RSV) のエ
ンハンサー又はエンハンサー及びプロモーターにより置換された。該構築物の概
略及びハイブリッドベクターのコード名については、図２を参照のこと。CCL 及
びRRL ベクターは、５’側U3領域が完全に置換されている。

【００５４】対照のレンチベクターHR2 及び５’側ハイブリッドのパネルを、導入ベクター
によりトランスフェクションされたプロデューサー細胞において、tat トランス
アクチベーターを提供するパッケージング構築物の存在下又は不存在下で、比較
した。４種のキメラベクターの転写レベルは、パッケージング構築物の存在下及
び不存在下の両方で、対照レンチベクターのそれよりも高い。全てのキメラベク
ターは、導入遺伝子を標的細胞に効率的に導入し、かつRRL ベクターは対照HR2
ベクターと同様に作用する。最後に、ベクターの標的細胞への組込みを、形質導
入後の初期及び後期継代時に形質導入された細胞を調べることにより確認した。
そのベクターが組込まれたことを示す導入遺伝子−陽性細胞の割合に減少は認め
られなかった。

【００５５】パッケージング構築物不存在下でプロデューサー細胞において得られた５’側
LTR が修飾された導入ベクターRNA の高レベルの発現は、作製されるベクターが
機能性tat 遺伝子の不存在下で機能していることを示している。先に本願明細書
において説明したパッケージングプラスミドについて示されたtat 遺伝子の機能
欠損は、tat タンパク質に関連した多くの病理活性が授けられたレンンチウイル
スベクターシステムに対するより高レベルの生体安全性をもたらすであろう。従
って、生体安全性が顕著に改善されたレンチウイルスベクターは、５’末端又は
３’末端のいずれにもHIV LTR の野生型コピーを有さないSIN 導入ベクターであ
り、これは本願明細書において説明したtat −不含有パッケージングベクターと
共同して使用される。

【００５６】ウイルス上清は、トランスフェクションの48時間後の上清のろ過のような常法
を用いて回収される。ウイルスの力価は、例えば適量のウイルスの上清による、
10⁶個のNIH 3T3 細胞又は10⁵個のHeLa細胞の感染により、ポリブレン（シグマ
ケミカル社、セントルイス、MO）８μg/mlの存在下で測定される。48時間後、形
質導入効率がアッセイされる。

【００５７】このように本発明は、高力価組換えウイルスを作製する方法及び手段を提供す
る。このようなウイルス粒子調製物を用いて、当該技術分野において公知の方法
により標的細胞を感染することができる。従って本発明は、標的細胞が宿主から
取り出され、公知の方法を行い培地において形質転換され、その後該宿主に戻さ
れるような、ex vivo 遺伝子治療の用途における使用を見出すであろう。

【００５８】以下に記された本発明の詳細な説明は、本発明の様々な実施態様を示す限定を
意図しない実施例である。実施例１レンチウイルスパッケージングプラスミドの構築レンチウイルスパッケージングプラスミドは、前記Zuffereyらの論文において
先に記されたプラスミドpCMVΔR8.9（ΔVpr ΔVif ΔVpu ΔNef ）に由来した。
pCMVΔR8.9のnef 遺伝子の残りの配列を、XhoI及びBstEIIによる消化により除去
し、クレノウで満たし、かつ再連結した。この構築物の、100 塩基対を欠失し、
HIV-1 の切断型env のリーディングフレームを、ゲノムインスリンのポリアデニ
ル化部位に結合し、プラスミドpCMVΔR8.73 を得た。

【００５９】本発明の別の実施態様において、プラスミドpCMVΔR8.73 は、CMV プロモータ
ーの下流のCMV 由来の配列の133 塩基対が欠失されている。この配列は、スプラ
イスドナー部位を含み、かつこれはプラスミドpCMVΔR8.73 のSacII による消化
及びより大きい断片への再連結によって除去され、プラスミドpCMVΔR8.74 が得
られた。

【００６０】別の本発明の実施態様においては、gag 遺伝子の開始コドンの上流のプラスミ
ドpCMVΔR8.74 に残っているHIV-由来配列の、コンセンサス５’スプライスドナ
ー部位以外の全てを除去した。同時に、gag 遺伝子の上流の配列を、最適翻訳効
率で変更し、プラスミドpCMVΔR8.75 を得た。pCMVΔR8.75 は、pCMVΔR8.74 に
由来し、94塩基対のSstII-ClaI断片を、以下から成るSstII-ClaIオリゴヌクレオ
チドリンカーで置き換えることによって得た：５’-GGGACTGGTGAGTGAATTCGAGATC
TGCCGCCGCCATGGGTGCGAGAGCGTCAGTATTAAGCGGGGGAGAATTAGAT-3’（配列番号：１）
及び５’-CGATCTAATTCTCCCCCGCTTAATACTGACGCTCTCGCACCCATGGCGGCGGCAGATCTCGAA
TTCACTCACCAGTCCCGC-3’（配列番号：２）。

【００６１】別の本発明の実施態様において、誘導可能なパッケージング構築物が、CMV プ
ロモーターを含むpCMVΔR8.74 のPstI-SacII断片を、最小のCMV プロモーターに
連結したテトラサイクリンオペレーター配列の７個のタンデムコピーと置き換え
ることにより得た。tet-調節されたパッケージングプラスミドpTetΔR8.74 を得
た。実施例２レンチウイルス導入ベクターの構築レンチウイルス導入ベクタープラスミドは、先にNaldini らの論文（Sci.、27
2:263-267(1996) ）に記されたプラスミドpHR'-CMV-LacZ に由来した。pHR2は、
pHR'中の３’側LTR の上流のnef 配列の 124塩基対が、HIV1配列を減少しかつ導
入遺伝子のクローニングが促進されるように両方のポリリンカーと置き換えられ
ているような、レンチウイルス導入ベクターである。pHR2は、pHR'-CMV-LacZ に
由来し、4.6kb ClaI-StuI 断片を、鋳型としてpHR'-CMV-LacZ を用いかつオリゴ
ヌクレオチドとして下記を使用するPCR により作製された 828塩基対のClaI-Stu
I 断片の、pHR'-CMV-LacZ 由来の4.4kb StuI-NcoI 断片及び4.5kb NcoI-ClaI 断
片と３部位で連結したものと置き換えることによって得た：５’-CCATCGATCACGA
GACTAGTCCTACGTATCCCCGGGGACGGGATCCGCGGAATTCCGTTTAAGAC-3’（配列番号：３）
及び５’-TTATAATGTCAAGGCCTCTC-３’（配列番号：４）。

【００６２】本発明の別の実施態様において、pHR3は、pHR2のRev 反応エレメント(RRE) の
上流のenv コード配列の 148塩基対（ATG を含む）が欠失しているようなレンチ
ウイルスベクターである。pHR3はpHR2に由来し、pHR2の 839塩基対NotI-SpeI 断
片を、鋳型としてpHR2を用いかつオリゴヌクレオチドプライマーとして下記を使
用するPCR により得られた 747塩基対NotI-SpeI 断片と置き換えることによって
得た：５’-GCGGCCGCAGGAGCTTTGTTCCTTGG-３’（配列番号：５）及び５’-TACGT
AGGACTAGTCTCG-３’（配列番号：６）。

【００６３】本発明の別の実施態様において、pRH5は、 310塩基対gag コード配列（Gag タ
ンパク質の15番目のアミノ酸の下流の全gag コード配列）がpHR2から欠失されて
いるレンチウイルス導入ベクターである。pHR5は、pHR2のNruIによる消化、NotI
リンカー（合成オリゴヌクレオチド５’-TTGCGGCCGCAA-３’、（配列番号：７）
）の付加、 310塩基対の断片を切り出すためのNotIによる消化、その後の再連結
によって得た。

【００６４】本発明の別の実施態様において、pRH6は、パッケージすることが可能な完全な
長さの転写物の産生を増強するために、５’側スプライスドナーシグナルが変異
された（TGGTがTGATへ）レンチウイルスベクターである。pHR6はpHR5に由来し、
239塩基対AflII-ApoI断片を、鋳型としてpHR2を用いかつオリゴヌクレオチドプ
ライマーとして下記を使用するPCR により作製された 239塩基対AflI-ApoI 断片
によって置き換えることによって得た：５’-CCACTGCTTAAGCCT-3’（配列番号：８）及び５’-CAAAATTTTTGGCGTACTCATCAGTCGCCGCCCCTCG-3’（配列番号：９）。

【００６５】全てのPCR 断片は、直接TAクローニングベクターpCR2.1（インビトロゲン社）
へのPCR 反応産物の最初のクローニング、それに続く配列の検証及び適当な酵素
による切り出しにより作製した。実施例３５’側LTR キメラレンチウイルス導入ベクターの構築本発明の別の実施態様において、レンチウイルスベクターの５’側LTR は、HI
V-1 のＲ領域に結合したラウス肉腫ウイルス(RSV) のU3領域由来のエンハンサー
及びプロモーターを含む（プラスミドpRRL）。pRRLは、オリゴヌクレオチドリン
カーを用いて、RSV のエンハンサー及びプロモーター（転写開始位置に対してヌ
クレオチド-233から-1）がHIV-1 のＲ領域に正確に融合されたようなレンチウイ
ルス導入ベクターである。pRRLは、国際公開公報第97/07225号を参照し、プラス
ミドpRT43.RSV.F3及びpRH2に由来し、かつpRT43.RSV.F3の3.4kb EcoRI-HpaI断片
を、pHR2の0.67kb BglII-NotI 断片及びpHR2の1.7kb NotI-StuI 断片で、５’-A
ATTGCCGCATTGCAGAGATATTGTATTTAAGTGCCTAGCTCGATACAATAAACGGGTCTCTCTGGTTAGACC
A-３’（配列番号：１０）及び５’-GATCTGGTCTAACCAGAGAGACCCGTTTATTGTATCGAG
CTAGGCACTTAAATACAATATCTCTGCAATGCGGC-３’（配列番号：１１）のオリゴヌクレ
オチドからなる合成EcoRI-BglII オリゴヌクレオチドリンカーにより置き換える
ことによって得た。

【００６６】本発明の別の実施態様において、レンチウイルスベクターの５’側LTR は、HI
V-1 のプロモーター領域（転写開始位置に対して -78塩基対の位置から）に結合
したラウス肉腫ウイルス(RSV) のエンハンサー（転写開始位置に対してヌクレオ
チド-233から-50 ）を含む（プラスミドpRLL）。 pRLLは、RSV のエンハンサーがHIV-1 のプロモーター領域にオリゴヌクレオチ
ドリンカーを用いて融合されたレンチウイルス導入ベクターである。pRRLは、プ
ラスミドpRT43.RSV.F3及びpHR2に由来し、かつpRT43.RSV.F3の3.4kb EcoRI-HpaI
断片を、pRH2の0.724kb AlwNI-NotI断片及びpRH2の1.7kb NotI-StuI 断片で、オ
リゴ５’-AATTGGAGGCGTGGCCTGGGCGGGACTGGGGAGTGGCGAGCCCTCAGATC-３’（配列番
号：１２）及びオリゴヌクレオチド５’-CTGAGGGCTCGCCACTCCCCAGTCCCGCCCAGGCC
ACGCCTCC-3’（配列番号：１３）からなる合成EcoRI-AlwNI オリゴヌクレオチド
リンカーにより置き換えることによって得た。

【００６７】本発明の別の実施態様（プラスミドpCCL）において、レンチウイルスベクター
の５’側LTR は、HIV-1 のＲ領域に結合した、ヒトサイトメガロウイルス(CMV)
の直前の初期(immediate early）エンハンサー及びプロモーター（Boshart らの
発表した（Cell、41:521-530(1985)）転写開始位置に対してヌクレオチド-673か
ら-1）を含む。pCCLは、プラスミドpRT43.2F3 （米国特許第5,686,279 号）及び
pHR2に由来し、かつpRT43.2F3 の3.8kb SstI-HpaI 断片を、pRH2の1.7kb BglII-
NotI断片及びpRH2の1.7kb NotI-StuI 断片で、オリゴヌクレオチド５’-CGTTTAG
TGAACCGGGGTCTCTCTGGTTAGACCA-３’（配列番号：１４）及び５’-GATCTGGTCTAAC
CAGAGAGACCCCGGTTCACTAAACGAGCT-３’（配列番号：１５）からなる合成SstI-Bgl
IIオリゴヌクレオチドリンカーにより置き換えることによって得た。

【００６８】本発明の別の実施態様（プラスミドpCLL）において、レンチウイルスベクター
の５’側LTR は、HIV-1 のプロモーター領域（転写開始位置に対して -78塩基対
位から）に結合したサイトメガロウイルス(CMV) の転写開始位置に対して-220か
ら-673のエンハンサーヌクレオチドを含む。pCLLは、プラスミドpRT43.2F3 及び
pHR2に由来し、かつpRT43.2F3 の3.6kb NcoI-HpaI 断片を、pRH2の0.724kb AlwN
I-NotI断片及びpRH2の1.7kb NotI-StuI 断片で、オリゴ５’-CATGGAGGCGTGGCCTG
GGCGGGACTGGGGAGTGGCGAGCCCTCAGATC-3’（配列番号：１６）及び５’-CTGAGGGCT
CGCCACTCCCCAGTCCCGCCCAGGCCACGCCTC-３’（配列番号：１７）からなる合成NcoI
-AlwNIオリゴヌクレオチドリンカーにより置き換えることによって得た。実施例４自己不活性化するレンチウイルスベクターの構築 pRRL.SIN-18 はpRRLに由来し、消化及び再連結により３’ LRTにおける 400塩
基対EcoRV-PvuII 断片が欠失された。

【００６９】 pRRL.SIN-36 はpRRLに由来し、３’側LTR の 493塩基対BbsI-AlwNI断片を、合
成オリゴヌクレオチド５’-GATATGATCAGATC-３’（配列番号：１８）及び５’-C
TGATCA-3’並びにpRRL由来の0.54kb AlwN-AvrII 断片及び6.1kb AverII-BbsI 断
片との３部位の連結からなるオリゴヌクレオチドリンカーにより置き換えること
によって得た。

【００７０】 pRRL.SIN-45 はpRRLに由来し、３’側LTR の 493塩基対BbsI-AlwNI断片を、合
成オリゴヌクレオチド５’-GATATGATCAGAGCCCTCAGATC-3’（配列番号：１９）及
び５’-CTGAGGGCTCTGATCA-３’（配列番号：２０）並びにpRRL由来の6.1kb AlwN
I-AvrII 断片及び6.1kb AverII-BbsI 断片との３部位の連結からなるオリゴヌク
レオチドリンカーにより置き換えることによって得た。

【００７１】 pRRL.SIN-78 はpRRLに由来し、３’側LTR の 493塩基対BbsI-AlwNI断片を、５
’-GATATGATCAGGAGGCGTGGCCTGGGCGGGACTGGGGAGTGGCGAGCCCTCAGATC-３’（配列番
号：２１）及びオリゴヌクレオチド５’-CTGAGGGCTCGCCACTCCCCAGTCCCGCCCAGGCC
ACGCCTCCTGATCA-3’（配列番号：２２）並びにpRRL由来の0.54kb AlwNI-AvrII断
片及び6.1kb AverII-BbsI 断片との３部位の連結からなるオリゴヌクレオチドリ
ンカーにより置き換えることによって得た。実施例５安定したレンチウイルスパッケージング細胞00-28 の構築及びレンチウイルスベ
クターの安定した産物 293G細胞株を用いて、安定したレンチウイルスパッケージング細胞を作製した
。293G細胞は、MDカセット（CMV プロモーター、並びにヒトβグロビン遺伝子由
来の介入配列−エクソン２及び３、イントロン2-及びポリ(A) 部位）からのtet ^R /VP16 トランスアクチベーター、並びに７個のテトラサイクリンオペレーター
部位(tet^O）の縦列反復配列に連結した最小のCMV プロモーター由来のVSV エン
ベローブを発現する。従って、VSV G の発現は、培養培地のテトラサイクリン濃
度により調節され、この抗生物質が存在する場合には抑制される（Gossen及びBu
jard、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、89:5547-5551(1992)；Ory ら、Proc. Natl
. Acad. Sci. USA、93:11400-11406(1997)）。293G細胞は、通常10％ドナーウシ
血清を補充し、かつ１μg/mlテトラサイクリンを含有するDMEM／低濃度グルコー
ス培養培地中で維持される。293G細胞の15cmプレートを、リポフェクタミン(GIB
CO BRL) を用い、パッケージングプラスミドpCMVΔR8.74 の13.36 μg 及び選択
プラスミドpZeoSV2 の1.33μg で、トランスフェクションした。この培地を24時
間後に交換し、48時間後に細胞を、ゼオシン250 μg/ml及びテトラサイクリン１
μg/mlを含有する培地に分けた。３〜４週間選択した後、250 クローンを採取し
、96ウェルプレートに移し、かつこの培地を市販のキットを用いて、免疫捕獲に
よりHIV-1 p24 Gag 抗原についてスクリーニングした。52個のp24 陽性クローン
を更なる分析のために増殖した。最良の５個のクローンが、12〜23ng/ml のp24
値を有することが決定された。これらの５個のクローンのうち４個は、ウェスタ
ンブロット分析により、テトラサイクリン除去後、VSV.G 発現について陽性であ
った。

【００７２】更に４個のp24/VSV.G 陽性クローンを、レンチウイルス導入ベクターをパッケ
ージする能力について分析した。これらのクローンを、CMV プロモーターで起動
されたA. Victoria のグリーン蛍光タンパク質(GFP) の発現カセットを含む一過
性に産生されたレンチウイルスベクター（VSV.G 偽型）で、感染多重度10かつポ
リブレン（８μg/ml）存在下で、感染した。次に感染したクローンを拡張し(exp
anded)、テトラサイクリンを除去した。誘導の72時間後、24時間培地の収集を行
い、上清をろ過し、急速凍結した。凍結した上清を、GFP 遺伝子の形質導入につ
いて天然のHeLa細胞上で力価測定した。FACS分析により、パッケージングクロー
ン00-28 の感染によって生じた細胞集団（10-28 と称される）は、最大の力価５
×10⁴形質導入単位(T.U.)/ml を有することが決定された。

【００７３】感染されたパッケージング集団10-28 を、GFP レンチウイルスベクターの高力
価産生クローンの作出に用いた。10-28 細胞は、FACSにより調べ、かつ最高のGF
P 発現細胞を保持し拡張した。その後この集団を、一過性に作製されたGFP レン
チウイルス（VSV.G 偽型）で更に４回、連続的に（「ピング(ping)」）感染した
。各々感染した後、上清をVSV.G 誘導の72〜96時間後に収集した。上清を、HeLa
細胞上で力価決定し、かつ免疫捕獲アッセイによりp24 含量について分析した。
感染力価は、３回目のピング後にピークを示し、1.5 ×10⁶T.U./mlに達した（図
３参照）。３回目のピングからの細胞集団を、サブクローニングし、高力価ベク
ターのプロデューサーを単離した。

【００７４】本願明細書に引用した論文及び特許出願は全て、個々の論文又は特許出願が明
確かつ個別に参照として組込まれることが示されるように、それらの全体が本願
明細書に参照として組込まれている。本発明に関連する当業者には明らかであるように、本発明は、先に明確に示さ
れたもの以外の形、例えば、他の哺乳類細胞型のトランスフェクション及び形質
導入も、本発明の精神又は本質的特長から逸脱することがない限りは包含してい
る。従って前述の本発明の特定の実施態様は、例証のためであり制限するもので
はないとみなすべきである。本発明の範囲は、記したように、前述の説明におい
て限定された実施例に制限されるものではなく、添付された特許請求の範囲であ
る。

【図面の簡単な説明】

【図１】これは様々なレンチウイルスベクターを示す。RSV はラウス肉腫ウイルスエン
ハンサー／プロモーターであり；ＲはLTR のＲ領域であり；U5はLTR のU5領域で
あり；SDはスプライスドナー部位であり、例えばHIV ５’主要スプライスドナー
部位であり：ψはプサイキャプシド形成シグナル配列であり；Gaはgag 遺伝子の
一部であり；RRE はrev 反応性エレメントであり；SAはスプライスアクセプター
配列であり；U3はLTR のU3領域である。

【図２】これは、別のレンチウイルスベクターを示す。CMV はサイトメガロウイルスで
ある。他の点では、記号は図１に示したものと同じである。

【図３】これは、導入ベクターの量を漸増する場合の等級化されたベクター産生を示す
グラフである。

【手続補正２】

【補正対象書類名】要約書

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正内容】

【要約】５’側LTR 又は５’及び３’側LTR の両方で修飾されたレンチウイルスベクタ
ーは、組換えレンチウイルスベクターの作製に有用である。このようなベクター
は、機能性tat 遺伝子の不存在下で作製することができる。この導入遺伝子を保
持するベクターによる宿主細胞の複数の形質転換は、ウイルス産生を増強する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者ダル，トーマスアメリカ合衆国，カリフォルニア 94404，フォスターシティ，レイクサイドドライブ 342，セルジェネシス，インコーポレイティド (72)発明者ファーソン，デボラーエー．アメリカ合衆国，カリフォルニア 94404，フォスターシティ，レイクサイドドライブ 342，セルジェネシス，インコーポレイティド (72)発明者ウィット，ロシェルアメリカ合衆国，カリフォルニア 94404，フォスターシティ，レイクサイドドライブ 342，セルジェネシス，インコーポレイティドＦターム(参考） 4B024 DA02 EA04 FA02 FA06 HA12

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】各々がＵ３領域を有する５’側ＬＴＲ及び３’側ＬＴＲを含
むレンチウイルス導入ベクターであり、ここで５’側ＬＴＲのＵ３領域の調節エ
レメントの一部又は全てが、該レンチウイルスに対して内因性でなく、哺乳類細
胞において操作できるように、他の調節エレメントによって置換されている、レ
ンチウイルス導入ベクター。
【請求項２】前記３’側ＬＴＲのＵ３領域の１個以上のヌクレオチド塩基
が欠失されている、請求項１記載の導入ベクター。
【請求項３】前記レンチウイルスに対して内因性でない調節エレメントが
、サイトメガロウイルスのエンハンサー、プロモーター又はエンハンサー／プロ
モーターである、請求項１記載のベクター。
【請求項４】前記レンチウイルスに対して内因性でない調節エレメントが
、ラウス肉腫ウイルスのエンハンサー、プロモーター又はエンハンサー／プロモ
ーターである、請求項１記載のベクター。
【請求項５】前記欠失されたＵ３領域が、５’末端ジヌクレオチド及びａ
ｔｔ配列以外の該Ｕ３領域の全てである、請求項２記載のベクター。
【請求項６】前記欠失したＵ３領域が、ＴＡＴＡボックス配列を含む、請
求項５記載のベクター。
【請求項７】前記ベクターが発現された異種遺伝子を保持する、請求項１
記載のベクター。
【請求項８】前記レンチウイルスがヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）であ
る、請求項１記載のベクター。
【請求項９】前記ＨＩＶがＨＩＶ−１である、請求項８記載のベクター。
【請求項１０】該レンチウイルスに対し内因性であるｇａｇの上流の配列
を欠失し、かつ該レンチウイルスに対し内因性であるｅｎｖの下流の配列を欠失
している、レンチウイルスパッケージングプラスミド。
【請求項１１】前記プラスミドが発現されたｇａｇ遺伝子、発現されたｐ
ｏｌ遺伝子又は発現されたｇａｇ及びｐｏｌ遺伝子を保持する、請求項１０記載
のパッケージングプラスミド。
【請求項１２】前記プラスミドが非機能性ｔａｔ遺伝子を保持する、請求
項１０記載のパッケージングプラスミド。
【請求項１３】前記レンチウイルスがヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）で
ある、請求項１０記載のパッケージングプラスミド。
【請求項１４】前記ＨＩＶがＨＩＶ−１である、請求項１３記載のパッケ
ージングプラスミド。
【請求項１５】下記工程を含む、組換えレンチウイルスベクターの製造法
：ａ）ｉ）該レンチウイルスに対し内因性であるｇａｇの上流の配列を欠失し、か
つ該レンチウイルスに対し内因性であるｅｎｖの下流の配列を欠失している、少
なくとも１種のレンチウイルスパッケージングプラスミドであり、かつこれが発
現されたｇａｇ遺伝子、発現されたｐｏｌ遺伝子又は発現されたｇａｇ及びｐｏ
ｌ遺伝子を保持する少なくとも１種のパッケージングプラスミドであるもの；及
びｉｉ）該レンチウイルスに対して内因性でない発現されたｅｎｖ遺伝子を保持す
る該レンチウイルスに対し内因性でない発現プラスミド；により細胞を形質転換し、パッケージング細胞を得る工程；ｂ）前記パッケージング細胞を、発現された異種遺伝子を保持するレンチウイル
ス導入ベクターにより複数の形質転換を行い、プロデューサー細胞を得る工程；ｃ）前記プロデューサー細胞を培地において培養する工程；及びｄ）前記プロデューサー細胞を該培地から分離し、該組換えレンチウイルスベク
ターを該培地から回収する工程。
【請求項１６】前記パッケージング細胞が非機能性ｔａｔ遺伝子を保持す
る、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】前記レンチウイルス導入ベクターが、各々がＵ３領域を有
する５’側ＬＴＲ及び３’側ＬＴＲを含み、ここで５’側ＬＴＲのＵ３領域の調
節エレメントの一部又は全てが、該レンチウイルスに対して内因性でなく、哺乳
類細胞において操作できるように、他の調節エレメントによって置換されている
、請求項１５記載の方法。
【請求項１８】前記３’側ＬＴＲのＵ３領域の１個以上のヌクレオチド塩
基が欠失されている、請求項１７記載の方法。