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ES2992295T3 - Composiciones potenciadoras de Vcn y métodos de uso de las mismas - Google Patents

Composiciones potenciadoras de Vcn y métodos de uso de las mismas Download PDF

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ES2992295T3
ES2992295T3 ES22191258T ES22191258T ES2992295T3 ES 2992295 T3 ES2992295 T3 ES 2992295T3 ES 22191258 T ES22191258 T ES 22191258T ES 22191258 T ES22191258 T ES 22191258T ES 2992295 T3 ES2992295 T3 ES 2992295T3
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promoter
globin
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ES22191258T
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Melissa Bonner
Olivier Negre
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Original Assignee
Bluebird Bio Inc
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Publication date
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Abstract

La invención proporciona métodos y composiciones de terapia génica mejorados. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Composiciones potenciadoras de Vcn y métodos de uso de las mismas
ANTECEDENTES
Campo técnico
[0001] La presente invención se refiere en general, en parte, a composiciones de terapia génica mejoradas y métodos para elaborarlas.
Descripción de la técnica relacionada
[0002] La terapia génica tiene un enorme potencial para una nueva era en la medicina humana. Las metodologías de terapia génica permitirán el tratamiento de afecciones que no se han podido abordar con la práctica médica estándar. Sin embargo, la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) aún no ha aprobado ningún producto de terapia génica humana para su venta. La terapia génica actual es experimental y ha tenido resultados mixtos en ensayos clínicos. Ginn et al., J Gene Med 2013 y Naldini et al., Nature Review 2015.
[0003] En 1999, la terapia génica sufrió un revés importante con la muerte de Jesse Gelsinger, de 18 años de edad. Jesse estaba participando en un ensayo de terapia génica para la deficiencia de ornitina transcarboxilasa (OTCD). Murió por insuficiencia orgánica múltiple 4 días después de comenzar el tratamiento. Se cree que su muerte fue provocada por una respuesta inmunitaria grave al portador del adenovirus. Sibbald et al., CMAJ2001.
[0004] Otro golpe importante llegó en enero de 2003, cuando la FDA suspendió temporalmente todos los ensayos de terapia génica que utilizaban vectores retrovirales en células madre sanguíneas. La FDA tomó esta medida después de enterarse de que un segundo niño tratado en un ensayo de terapia génica francés había desarrollado una afección similar a la leucemia. Hacein-Bey-Abina et al., Science 2003. Tanto este niño como otro que había desarrollado una afección similar en agosto de 2002 habían sido tratados con éxito mediante terapia génica para la enfermedad de inmunodeficiencia combinada grave ligada al cromosoma X (X-SCID), también conocida como "síndrome del niño burbuja". El Comité Asesor de Modificadores de la Respuesta Biológica (BRMAC) de la FDA se reunió a fines de febrero de 2003 para discutir posibles medidas que podrían permitir que una serie de ensayos de terapia génica retroviral para el tratamiento de enfermedades potencialmente mortales se llevaran a cabo con las salvaguardas adecuadas. En abril de 2003, la FDA suavizó la prohibición de los ensayos de terapia génica que utilizaban vectores retrovirales en células madre sanguíneas.
[0005] Sin embargo, recientemente varios grupos han llevado a cabo ensayos de terapia génica con un éxito moderado para combatir varias enfermedades. En 2008, investigadores del Reino Unido del Instituto de Oftalmología de la UCL y del Centro de Investigación Biomédica del NIHR del Hospital Oftalmológico Moorfields anunciaron un ensayo clínico de terapia génica con éxito para el tratamiento de la amaurosis congénita de Leber, un tipo de ceguera hereditaria. Los resultados mostraron que el tratamiento experimental es seguro y puede mejorar la visión (Maguire et al., N EnglJ Med.
358(21):2240 (2008)).
[0006] En 2009, un grupo de científicos franceses informó del uso de terapia génica mediada por células madre hematopoyéticas para tratar con éxito la adrenoleucodistrofia ligada al cromosoma X (ALD). Cartier et al., Science 2009. Se extrajeron células madre autólogas de los pacientes, se corrigieron genéticamenteex vivoy luego se volvieron a infundir en los pacientes después de que habían recibido tratamiento mieloablativo. Durante un período de seguimiento de 24 a 30 meses, se detectó una reconstitución policlonal, con un 9 a 14 % de granulocitos, monocitos y linfocitos T y B que expresaban la proteína ALD. Estos resultados sugieren firmemente que se transdujeron células madre hematopoyéticas en los pacientes. A partir de los 14 a 16 meses después de la infusión de las células corregidas genéticamente, se detuvo la desmielinización cerebral progresiva en los dos pacientes.
[0007] En 2011, Neurologix, Inc. anunció resultados positivos en un ensayo de Fase 2 de su terapia génica en investigación para la enfermedad de Parkinson (EP) avanzada, NLX-P101. Los participantes del estudio que recibieron NLX-P101 experimentaron mejoras estadísticamente significativas y clínicamente significativas en las puntuaciones motoras sin medicación en comparación con los sujetos de control que recibieron cirugía simulada. En el ensayo, este beneficio se observó al mes y continuó prácticamente sin cambios durante el período de estudio ciego de seis meses. Los resultados también demostraron un perfil de seguridad positivo para NLX-P 101, sin eventos adversos graves relacionados con la terapia génica o el procedimiento quirúrgico informados. Los pacientes inscritos en el ensayo tenían EP moderada a avanzada y no respondían adecuadamente a las terapias actuales.
[0008] Los recientes avances en el campo de la terapia génica han suscitado la esperanza de que los pacientes afectados por hemoglobinopatías como la p-talasemia y la anemia de células falciformes se beneficiarán de nuevos enfoques terapéuticos. Cavazzana-Calvo et al., Nature 2010. El trasplante de células hematopoyéticas (HSC) modificadas con vectores lentivirales que portan el gen de la p-globina ha dado como resultado la corrección a largo plazo de varios modelos de ratón de trastornos de la hemoglobina, por ejemplo, Imren et al., Proc Natl Acad Sci USA.
2002;99(22):14380-14385; Malik et al., Ann NY Acad Sci. 2005;1054:238-249; May et al., Nature. 2000;406(6791):82-86; Pawliuk et al., Science. 2001;294(5550): 2368-2371).
[0009] Aunque las principales ventajas de infundir células autólogas modificadas genéticamente son evitar los riesgos de EIC<h>y el acondicionamiento pretrasplante inmunosupresor, así como abordar la falta de donantes compatibles, la terapia actual enfrenta al menos tres advertencias sustanciales: el requisito de mieloablación tóxica (Dunbar et al., Hum Gene Ther. 1998;9(17):2629-2640); los métodos de transferencia genética actuales no pueden transducir más de una fracción de células madre hematopoyéticas (HSC) (Santoni de Sio y Naldini, Methods Mol Biol. 2009;506:59-70); los números de copias del vector de HSC transducidas a menudo están en el extremo inferior para la eficacia terapéutica; y varias estrategias de selecciónin vivodisponibles adolecen de una eficacia y seguridad subóptimas (Beard et al., J Clin Invest. 2010; 120(7):2345-2354; Cornetta et al., Cancer Gene Ther. 2006;13(9):886-895; Milsom et al., Cancer Res. 2008;68(15): 6171-6180).
[0010] Actualmente, existe una gran cantidad de protocolos utilizados entre los grupos de investigación y clínicos para introducir vectores de terapia génica lentiviral en células diana. Históricamente, se ha logrado una transferencia génica de alta eficiencia en varios tipos de células utilizando diferentes estrategias. Sin embargo, la mayoría de estas estrategias, por ejemplo, policationes, liposomas catiónicos, polibreno, implican el uso de tratamientos adyuvantes que son tóxicos para las células, lo que limita su uso con células diana sensibles de origen primario, como células madre hematopoyéticas y progenitoras.
[0011] Se sabe que las células madre y progenitoras hematopoyéticas son notoriamente difíciles de transducir de manera eficiente y, por lo tanto, la transducción ineficiente es uno de los principales factores limitantes que impiden que la terapia génica basada en HSC ingrese a la clínica. La transducción ineficiente también aumenta el costo de desarrollo de terapias génicas porque se requieren grandes cantidades de vector para generar la cantidad requerida de células transducidas. Por lo tanto, no solo aumentar la eficiencia de transducción de células madre y progenitoras hematopoyéticas proporcionaría beneficios clínicos cuánticos, sino que reduciría la cantidad de virus necesaria para generar los productos farmacéuticos y, por lo tanto, reduciría los costos de los ensayos clínicos.
[0012] Los documentos US2014234278 y US2015216903 describen compuestos para mejorar la transducción viral.
[0013] El documento US2015064788 describe la transducción retroviral utilizando poloxámeros.
[0014] Hofig et al (2012) describen que el poloxámero sinperónico F108 mejora la transducción celular con vectores lentivirales; (The Journal of Gene Medicine, vol. 14, no. 8:549-560).
BREVE RESUMEN
[0015] La presente invención proporciona un método para transducir una población de células madre o progenitoras hematopoyéticas CD34+ que comprende cultivar las células en un medio de cultivo, en presencia de un vector lentiviral, prostaglandina E<2>(PGE<2>) o 16,16-dimetil PGE<2>, y poloxámero 407, en donde la población de células se transduce al menos aproximadamente 24 horas. En el presente documento se contemplan terapias génicas mejoradas. Las terapias génicas comprenden composiciones de células madre y progenitoras hematopoyéticas con mayor eficacia terapéutica y métodos para prepararlas y usarlas. La presente invención puede contemplar composiciones y métodos para aumentar la eficiencia de transducción y NCV de células madre y progenitoras hematopoyéticas humanas (HSPC) para producir composiciones de terapia génica mejoradas.
[0016] En formas de realización particulares, el vector lentiviral transduce las HSPC a una multiplicidad de infección (MOI) de aproximadamente 10 a aproximadamente 30.
[0017] En formas de realización particulares, el vector lentiviral transduce las HSPC a una multiplicidad de infección (MOI) de aproximadamente 10 a aproximadamente 25.
[0018] En formas de realización particulares, el vector lentiviral transduce las HSPC a una multiplicidad de infección (MOI) de aproximadamente 10 a aproximadamente 20.
[0019] En esta invención, las HSPC comprenden células CD34+.
[0020] En ciertas formas de realización, las HSPC comprenden células CD34+CD38LoCD90+CD45RA'.
[0021] En formas de realización adicionales, al menos el 75 % de las células han sido transducidas.
[0022] En formas de realización adicionales, al menos el 90 % de las células han sido transducidas.
[0023] En formas de realización particulares, el NCV promedio es al menos 2,0.
[0024] En formas de realización particulares, el NCV promedio es al menos 2,5.
[0025] En ciertas formas de realización, la viabilidad de la población de células es al menos del 75 %.
[0026] En formas de realización adicionales, la viabilidad de la población de células es al menos del 85 %.
[0027] En formas de realización adicionales, la viabilidad de la población de células es al menos del 95 %.
[0028] En otras formas de realización, el nivel de endotoxina de la población de células hematopoyéticas es como máximo 5,0 UE/mL.
[0029] En ciertas formas de realización, el nivel de endotoxina de la población de células hematopoyéticas es como máximo 0,5 UE/mL.
[0030] En formas de realización adicionales, la población de células comprende al menos 1 x 106 células HSPC.
[0031] En formas de realización particulares, la población de células comprende al menos 1 x 107 células HSPC.
[0032] En formas de realización particulares, la población de células comprende al menos 1 x 108 células HSPC.
[0033] En algunas formas de realización, la población de células comprende al menos 1 x 109 células HSPC.
[0034] En formas de realización particulares, el vector lentiviral codifica un polipéptido del casete de unión a ATP, subfamilia D, miembro 1 (ABCD1).
[0035] En otras formas de realización, el vector lentiviral comprende un potenciador del virus del sarcoma mieloproliferativo, región de control negativo eliminada, promotor sustituido del sitio de unión del cebador d1587rev (MND) o un fragmento transcripcionalmente activo del mismo unido operativamente a un polinucleótido que codifica un polipéptido del casete de unión a ATP, subfamilia D, miembro 1 (ABCD1).
[0036] En ciertas formas de realización, el vector lentiviral codifica la adenosina desaminasa.
[0037] En ciertas formas de realización, el vector lentiviral comprende un promotor del factor de elongación 1 alfa unido operativamente a un polinucleótido que codifica la adenosina desaminasa.
[0038] En ciertas formas de realización, el vector lentiviral codifica el receptor de interleucina 2 gamma.
[0039] En ciertas formas de realización, el vector lentiviral comprende un promotor del factor de elongación 1 alfa unido operativamente a un polinucleótido que codifica el receptor de interleucina 2 gamma.
[0040] En formas de realización particulares, el vector lentiviral codifica la tripeptidil peptidasa 1.
[0041] En ciertas formas de realización, el vector lentiviral comprende un promotor del factor de elongación 1 alfa o comprende un potenciador del virus del sarcoma mieloproliferativo, región de control negativo eliminada, promotor sustituido por el sitio de unión del cebador d1587rev (MND) unido operativamente a un polinucleótido que codifica la tripeptidil peptidasa 1.
[0042] En formas de realización particulares, el vector lentiviral codifica alfa-L iduronidasa.
[0043] En ciertas formas de realización, el vector lentiviral comprende un promotor del factor de elongación 1 alfa o comprende un potenciador del virus del sarcoma mieloproliferativo, región de control negativo eliminada, promotor sustituido por el sitio de unión del cebador d1587rev (MND) unido operativamente a un polinucleótido que codifica la alfa-L iduronidasa.
[0044] En formas de realización particulares, el vector lentiviral codifica iduronato 2-sulfatasa.
[0045] En ciertas formas de realización, el vector lentiviral comprende un promotor del factor de elongación 1 alfa o comprende un potenciador del virus del sarcoma mieloproliferativo, región de control negativo eliminada, promotor sustituido por el sitio de unión del cebador d1587rev (MND) unido operativamente a un polinucleótido que codifica iduronato 2-sulfatasa.
[0046] En ciertas formas de realización, el vector lentiviral comprende un promotor que comprende uno o más elementos de un LCR de p-globina humana.
[0047] En algunas formas de realización, el LCR de p-globina humana comprende el sitio hipersensible a la ADNasa I 2, 3 y 4 del LCR de p-globina humana.
[0048] En formas de realización particulares, el vector lentiviral comprende además un elemento potenciador 3' de pglobina humana.
[0049] En formas de realización adicionales, el gen de interés codifica una proteína antidrepanocítica o un gen de globina.
[0050] En formas de realización particulares, el gen de interés codifica una proteína p-globina humana, una proteína 5-globina humana, una proteína Y-globina humana, una proteína pA-T87Q-globina humana, una proteína pA-G16D/E<2>2A/T87Q-globina humana o una proteína pA-T87Q/K95E/K120E-globina humana.
[0051] En formas de realización particulares, el vector lentiviral es un vector AnkT9W, un vector T9Ank2W, un vector TNS9, un vector de lentiglobina HPV569, un vector de lentiglobina BB305, un vector BG-1, un vector BGM-1, un vector d432pAY, un vector mLARpAYV5, un vector GLOBE, un vector G-GLOBE, un vector pAS3-FB, un vector V5, un vector V5m3, un vector V5m3-400, un vector G9 y un vector BCL11A shmir.
[0052] En formas de realización particulares, el vector lentiviral transduce las HSPC o células CD34+ a una multiplicidad de infección (MOI) de aproximadamente 10 a aproximadamente 30.
[0053] En formas de realización particulares, el vector lentiviral transduce las HSPC o células CD34+ a una multiplicidad de infección (MOI) de aproximadamente 10 a aproximadamente 25.
[0054] En formas de realización particulares, el vector lentiviral transduce las HSPC o células CD34+ a una multiplicidad de infección (MOI) de aproximadamente 10 a aproximadamente 20.
[0055] En algunas formas de realización, el MOI es aproximadamente 10, aproximadamente 11, aproximadamente 12, aproximadamente 13, aproximadamente 14, aproximadamente 15, aproximadamente 16, aproximadamente 17, aproximadamente 18, aproximadamente 19, aproximadamente 20, aproximadamente 21, aproximadamente 22, aproximadamente 23, aproximadamente 24, aproximadamente 25, aproximadamente 26, aproximadamente 27, aproximadamente 28, aproximadamente 29 o aproximadamente 30.
[0056] En ciertas formas de realización, al menos el 75 % de las células han sido transducidas.
[0057] En formas de realización adicionales, al menos el 90 % de las células han sido transducidas.
[0058] En formas de realización particulares, el NCV promedio es al menos 2,0.
[0059] En formas de realización particulares, el NCV promedio es al menos 2,5.
[0060] En algunas formas de realización, la viabilidad de la población de células es al menos del 85 %.
[0061] En ciertas formas de realización, la viabilidad de la población de células es al menos del 95 %.
[0062] En otras formas de realización, el nivel de endotoxina de la población de células hematopoyéticas es como máximo 5,0 UE/mL.
[0063] En algunas formas de realización, el nivel de endotoxina de la población de células hematopoyéticas es como máximo 0,5 UE/mL.
[0064] En otras formas de realización, la población de células comprende al menos 1 x 107 células HSPC.
[0065] En formas de realización adicionales, la población de células comprende al menos 1 x 108 células HSPC.
[0066] En ciertas formas de realización, la población de células comprende al menos 1 x 109 células HSPC.
[0067] En ciertas formas de realización, la fuente de las células es sangre del cordón umbilical, médula ósea o sangre periférica movilizada.
[0068] En algunas formas de realización, la fuente de las células es sangre periférica movilizada.
[0069] En formas de realización adicionales, el vector se deriva de un lentivirus seleccionado del grupo que consiste en: VIH (virus de inmunodeficiencia humana; incluyendo VIH tipo 1 y VIH tipo 2); virus visna-maedi (VVM); virus de la artritis-encefalitis caprina (VAEC); virus de la anemia infecciosa equina (VAIE); virus de la inmunodeficiencia felina (FIV); virus de la inmunodeficiencia bovina (BIV); y virus de la inmunodeficiencia simia (SIV).
[0070] En ciertas formas de realización, el vector se deriva de un lentivirus del VIH.
[0071] En formas de realización adicionales, el vector se deriva de un lentivirus VIH-1.
[0072] En ciertas formas de realización, el vector comprende: a) un terminal largo 5' (LTR); b) un elemento de exportación de ARN; c) un tracto central de polipurina lentiviral (cPPT); d) un promotor unido operativamente a un gen de interés; y e) un LTR 3' de SIN.
[0073] En algunas formas de realización, el LTR 5' modificado comprende además una eliminación en comparación con el LTR 5' de tipo salvaje.
[0074] En formas de realización particulares, el promotor del LTR 5' se reemplaza con un promotor heterólogo seleccionado del grupo que consiste en: un promotor del citomegalovirus (CMV), un promotor del virus del sarcoma de Rous (RSV) o un promotor del virus de simio 40 (SV40).
[0075] En otras formas de realización, el elemento de exportación de ARN comprende un elemento regulador postranscripcional del virus de la hepatitis B (PRE) o un elemento de respuesta rev del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) (RRE).
[0076] En ciertas formas de realización, la LTR 3' comprende una secuencia de poliadenilación.
[0077] En formas de realización particulares, el vector lentiviral codifica un polipéptido del casete de unión a ATP, subfamilia D, miembro 1 (ABCD1).
[0078] En otras formas de realización, el vector lentiviral comprende un potenciador del virus del sarcoma mieloproliferativo, región de control negativo eliminada, promotor sustituido del sitio de unión del cebador d1587rev (MND) o un fragmento transcripcionalmente activo del mismo unido operativamente a un polinucleótido que codifica un polipéptido del casete de unión a ATP, subfamilia D, miembro 1 (ABCD1).
[0079] En ciertas formas de realización, el vector lentiviral codifica la adenosina desaminasa.
[0080] En ciertas formas de realización, el vector lentiviral comprende un promotor del factor de elongación 1 alfa unido operativamente a un polinucleótido que codifica la adenosina desaminasa.
[0081] En ciertas formas de realización, el vector lentiviral codifica el receptor de interleucina 2 gamma.
[0082] En ciertas formas de realización, el vector lentiviral comprende un promotor del factor de elongación 1 alfa unido operativamente a un polinucleótido que codifica el receptor de interleucina 2 gamma.
[0083] En formas de realización particulares, el vector lentiviral codifica la tripeptidil peptidasa 1.
[0084] En ciertas formas de realización, el vector lentiviral comprende un promotor del factor de elongación 1 alfa o comprende un potenciador del virus del sarcoma mieloproliferativo, región de control negativo eliminada, promotor sustituido por el sitio de unión del cebador d1587rev (MND) unido operativamente a un polinucleótido que codifica la tripeptidil peptidasa 1.
[0085] En formas de realización particulares, el vector lentiviral codifica alfa-L iduronidasa.
[0086] En ciertas formas de realización, el vector lentiviral comprende un promotor del factor de elongación 1 alfa o comprende un potenciador del virus del sarcoma mieloproliferativo, región de control negativo eliminada, promotor sustituido por el sitio de unión del cebador d1587rev (MND) unido operativamente a un polinucleótido que codifica la alfa-L iduronidasa.
[0087] En formas de realización particulares, el vector lentiviral codifica iduronato 2-sulfatasa.
[0088] En ciertas formas de realización, el vector lentiviral comprende un promotor del factor de elongación 1 alfa o comprende un potenciador del virus del sarcoma mieloproliferativo, región de control negativo eliminada, promotor sustituido por el sitio de unión del cebador d1587rev (MND) unido operativamente a un polinucleótido que codifica iduronato 2-sulfatasa.
[0089] En ciertas formas de realización, el promotor comprende uno o más elementos de un LCR de p-globina humano.
[0090] En algunas formas de realización, el LCR de p-globina humana comprende el sitio hipersensible a la ADNasa I 2, 3 y 4 del LCR de p-globina humana.
[0091] En formas de realización particulares, el vector lentiviral comprende además un elemento potenciador 3' de pglobina humana.
[0092] En formas de realización adicionales, el gen de interés codifica una proteína antidrepanocítica o un gen de globina.
[0093] En formas de realización particulares, el gen de interés codifica una proteína p-globina humana, una proteína 5-globina humana, una proteína Y-globina humana, una proteína pA-T87Q-globina humana, una proteína pA-G16D/E<2>2A/T87Q-globina humana o una proteína pA-T87Q/K95E/K120E-globina humana.
[0094] En formas de realización particulares, el vector lentiviral es un vector AnkT9W, un vector T9Ank2W, un vector TNS9, un vector de lentiglobina HPV569, un vector de lentiglobina BB305, un vector BG-1, un vector BGM-1, un vector d432pAY, un vector mLARpAYV5, un vector GLOBE, un vector G-GLOBE, un vector pAS3-FB, un vector V5, un vector V5m3, un vector V5m3-400, un vector G9 y un vector BCL11A shmir.
[0095] En formas de realización particulares, las células transducidas con los vectores y composiciones contempladas en el presente documento comprenden los alelos de p-globina: (pE/p0, pC/p0, p0/p0, PE/pE, pC/p+, pE/p+, p0/p+, P+/p+, PC/pC, pE/pS, p0/pS, pC/pS, p+/pS o pS/pS
[0096] En formas de realización particulares, las células transducidas con los vectores y composiciones contempladas en el presente documento comprenden los alelos de p-globina: pE/p0, pC/p0, p0/p0, pC/pC, pE/pE, pE,p+, pC/pE, pC/p+, p0/p+ o p+/p+.
[0097] En formas de realización particulares, las células transducidas con los vectores y composiciones contemplados en este documento comprenden los alelos de p-globina: pE/pS, p0/pS, pC/pS, p+/pS o pS/pS
[0098] En diversas formas de realización, la presente invención contempla, en parte, una composición que comprende la población de células hematopoyéticas contemplada en este documento.
[0099] En diversas formas de realización, la presente invención contempla, en parte, una composición farmacéutica que comprende la población de células hematopoyéticas contemplada en este documento y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
[0100] La presente invención contempla, en parte, una composición que comprende: una célula madre o progenitora hematopoyética; un vector lentiviral; y poloxámero 407. La presente invención contempla, en parte, un cultivo que comprende: una célula madre o progenitora hematopoyética CD34+; un medio de cultivo; un vector lentiviral; y poloxámero 407.
[0101] La presente invención contempla, en parte, un cultivo que comprende: una célula madre o progenitora hematopoyética CD34+; un medio de cultivo; un vector lentiviral; prostaglandina E<2>(PGE<2>) o 16,16-dimetil PGE<2>; y poloxámero 407.
[0102] En esta invención, el agente que aumenta la señalización del receptor de prostaglandina EP se selecciona del grupo que consiste en: prostaglandina E<2>(PGE<2>), o 16,16-dimetil PGE<2>.
[0103] En formas de realización particulares, el agente que aumenta la señalización del receptor EP de prostaglandina es PGE<2>.
[0104] En esta invención, las células madre o progenitoras hematopoyéticas son células CD34+.
[0105] En esta invención, las células madre o progenitoras hematopoyéticas se transducen en presencia de poloxámero 407.
[0106] En algunas formas de realización, las células madre o progenitoras hematopoyéticas se transducen en presencia de un polímero policatiónico.
[0107] En formas de realización adicionales, el polímero policatiónico es polibreno, sulfato de protamina, polietilenimina o un copolímero de bloque de polietilenglicol/poli-L-lisina.
[0108] En algunas formas de realización, el vector es un vector lentiviral. En algunas formas de realización, el vector se deriva de un lentivirus seleccionado del grupo que consiste en: VIH (virus de inmunodeficiencia humana; incluyendo VIH tipo 1 y VIH tipo 2); virus visna-maedi (VVM); virus de la artritis-encefalitis caprina (VAEC); virus de la anemia infecciosa equina (VAIE); virus de la inmunodeficiencia felina (FIV); virus de la inmunodeficiencia bovina (BIV); y virus de la inmunodeficiencia simia (SIV).
[0109] En ciertas formas de realización, el vector se deriva de un lentivirus del VIH.
[0110] En formas de realización particulares, el vector se deriva de un lentivirus VIH-1.
[0111] En formas de realización particulares, el vector lentiviral está presente en un MOI de aproximadamente 10 a aproximadamente 30.
[0112] En formas de realización particulares, el vector lentiviral está presente en un MOI de aproximadamente 10 a aproximadamente 25.
[0113] En formas de realización particulares, el vector lentiviral está presente en un MOI de aproximadamente 10 a aproximadamente 20.
[0114] En algunas formas de realización, el vector lentiviral está presente en un MOI de aproximadamente 10, aproximadamente 11, aproximadamente 12, aproximadamente 13, aproximadamente 14, aproximadamente 15, aproximadamente 16, aproximadamente 17, aproximadamente 18, aproximadamente 19, aproximadamente 20, aproximadamente 21, aproximadamente 22, aproximadamente 23, aproximadamente 24, aproximadamente 25, aproximadamente 26, aproximadamente 27, aproximadamente 28, aproximadamente 29 o aproximadamente 30.
[0115] En formas de realización particulares, el vector lentiviral codifica un polipéptido del casete de unión a ATP, subfamilia D, miembro 1 (ABCD1).
[0116] En otras formas de realización, el vector lentiviral comprende un potenciador del virus del sarcoma mieloproliferativo, región de control negativo eliminada, promotor sustituido del sitio de unión del cebador d1587rev (MND) o un fragmento transcripcionalmente activo del mismo unido operativamente a un polinucleótido que codifica un polipéptido del casete de unión a ATP, subfamilia D, miembro 1 (ABCD1).
[0117] En ciertas formas de realización, el vector lentiviral codifica la adenosina desaminasa.
[0118] En ciertas formas de realización, el vector lentiviral comprende un promotor del factor de elongación 1 alfa unido operativamente a un polinucleótido que codifica la adenosina desaminasa.
[0119] En ciertas formas de realización, el vector lentiviral codifica el receptor de interleucina 2 gamma.
[0120] En ciertas formas de realización, el vector lentiviral comprende un promotor del factor de elongación 1 alfa unido operativamente a un polinucleótido que codifica el receptor de interleucina 2 gamma.
[0121] En formas de realización particulares, el vector lentiviral codifica la tripeptidil peptidasa 1.
[0122] En ciertas formas de realización, el vector lentiviral comprende un promotor del factor de elongación 1 alfa o comprende un potenciador del virus del sarcoma mieloproliferativo, región de control negativo eliminada, promotor sustituido por el sitio de unión del cebador d1587rev (MND) unido operativamente a un polinucleótido que codifica la tripeptidil peptidasa 1.
[0123] En formas de realización particulares, el vector lentiviral codifica alfa-L iduronidasa.
[0124] En ciertas formas de realización, el vector lentiviral comprende un promotor del factor de elongación 1 alfa o comprende un potenciador del virus del sarcoma mieloproliferativo, región de control negativo eliminada, promotor sustituido por el sitio de unión del cebador d1587rev (MND) unido operativamente a un polinucleótido que codifica la alfa-L iduronidasa.
[0125] En formas de realización particulares, el vector lentiviral codifica iduronato 2-sulfatasa.
[0126] En ciertas formas de realización, el vector lentiviral comprende un promotor del factor de elongación 1 alfa o comprende un potenciador del virus del sarcoma mieloproliferativo, región de control negativo eliminada, promotor sustituido por el sitio de unión del cebador d1587rev (MND) unido operativamente a un polinucleótido que codifica iduronato 2-sulfatasa.
[0127] En ciertas formas de realización, el vector lentiviral comprende un promotor que comprende uno o más elementos de un LCR de p-globina humana.
[0128] En algunas formas de realización, el LCR de p-globina humana comprende el sitio hipersensible a la ADNasa I 2, 3 y 4 del LCR de p-globina humana.
[0129] En formas de realización particulares, el vector lentiviral comprende además un elemento potenciador 3' de pglobina humana.
[0130] En formas de realización adicionales, el gen de interés codifica una proteína anti-falciforme o un gen de globina.
[0131] En formas de realización particulares, el gen de interés codifica una proteína p-globina humana, una proteína 5-globina humana, una proteína Y-globina humana, una proteína pA-T87Q-globina humana, una proteína pA-G16D/E22A/T87Q-globina humana o una proteína pA-T87Q/K95E/K120E-globina humana.
[0132] En formas de realización particulares, el vector lentiviral es un vector AnkT9W, un vector T9Ank2W, un vector TNS9, un vector de lentiglobina HPV569, un vector de lentiglobina BB305, un vector BG-1, un vector BGM-1, un vector d432pAY, un vector mLARpAYV5, un vector GLOBE, un vector G-GLOBE, un vector pAS3-FB, un vector V5, un vector V5m3, un vector V5m3-400, un vector G9 y un vector BCL11A shmir.
En algunas formas de realización, las células madre o progenitoras hematopoyéticas son células CD34+.
[0133] En esta invención, el poloxámero es el poloxámero 407.
[0134] En algunas formas de realización, las células madre o progenitoras hematopoyéticas se transducen en presencia de un polímero policatiónico.
[0135] En formas de realización adicionales, el polímero policatiónico es polibreno, sulfato de protamina, polietilenimina o un copolímero de bloque de polietilenglicol/poli-L-lisina.
[0136] En otras formas de realización, el vector es un vector lentiviral.
[0137] En formas de realización adicionales, el vector se deriva de un lentivirus seleccionado del grupo que consiste en: VIH (virus de inmunodeficiencia humana; incluyendo VIH tipo 1 y VIH tipo 2); virus visna-maedi (VVM); virus de la artritis-encefalitis caprina (VAEC); virus de la anemia infecciosa equina (VAIE); virus de la inmunodeficiencia felina (FIV); virus de la inmunodeficiencia bovina (BIV); y virus de la inmunodeficiencia simia (SIV).
[0138] En algunas formas de realización, el vector se deriva de un lentivirus del VIH.
[0139] En formas de realización particulares, el vector se deriva de un lentivirus VIH-1.
[0140] En formas de realización particulares, el vector lentiviral está presente en un MOI de aproximadamente 10 a aproximadamente 30.
[0141] En formas de realización particulares, el vector lentiviral está presente en un MOI de aproximadamente 10 a aproximadamente 25.
[0142] En formas de realización particulares, el vector lentiviral está presente en un MOI de aproximadamente 10 a aproximadamente 20.
[0143] En algunas formas de realización, el vector lentiviral está presente en un MOI de aproximadamente 10, aproximadamente 11, aproximadamente 12, aproximadamente 13, aproximadamente 14, aproximadamente 15, aproximadamente 16, aproximadamente 17, aproximadamente 18, aproximadamente 19, aproximadamente 20, aproximadamente 21, aproximadamente 22, aproximadamente 23, aproximadamente 24, aproximadamente 25, aproximadamente 26, aproximadamente 27, aproximadamente 28, aproximadamente 29 o aproximadamente 30.
[0144] En formas de realización particulares, el vector lentiviral codifica un polipéptido del casete de unión a ATP, subfamilia D, miembro 1 (ABCD1).
[0145] En otras formas de realización, el vector lentiviral comprende un potenciador del virus del sarcoma mieloproliferativo, región de control negativo eliminada, promotor sustituido del sitio de unión del cebador d1587rev (MND) o un fragmento transcripcionalmente activo del mismo unido operativamente a un polinucleótido que codifica un polipéptido del casete de unión a ATP, subfamilia D, miembro 1 (ABCD1).
[0146] En ciertas formas de realización, el vector lentiviral codifica la adenosina desaminasa.
[0147] En ciertas formas de realización, el vector lentiviral comprende un promotor del factor de elongación 1 alfa unido operativamente a un polinucleótido que codifica la adenosina desaminasa.
[0148] En ciertas formas de realización, el vector lentiviral codifica el receptor de interleucina 2 gamma.
[0149] En ciertas formas de realización, el vector lentiviral comprende un promotor del factor de elongación 1 alfa unido operativamente a un polinucleótido que codifica el receptor de interleucina 2 gamma.
[0150] En formas de realización particulares, el vector lentiviral codifica la tripeptidil peptidasa 1.
[0151] En ciertas formas de realización, el vector lentiviral comprende un promotor del factor de elongación 1 alfa o comprende un potenciador del virus del sarcoma mieloproliferativo, región de control negativo eliminada, promotor sustituido por el sitio de unión del cebador d1587rev (MND) unido operativamente a un polinucleótido que codifica la tripeptidil peptidasa 1.
[0152] En formas de realización particulares, el vector lentiviral codifica alfa-L iduronidasa.
[0153] En ciertas formas de realización, el vector lentiviral comprende un promotor del factor de elongación 1 alfa o comprende un potenciador del virus del sarcoma mieloproliferativo, región de control negativo eliminada, promotor sustituido por el sitio de unión del cebador d1587rev (MND) unido operativamente a un polinucleótido que codifica la alfa-L iduronidasa.
[0154] En formas de realización particulares, el vector lentiviral codifica iduronato 2-sulfatasa.
[0155] En ciertas formas de realización, el vector lentiviral comprende un promotor del factor de elongación 1 alfa o comprende un potenciador del virus del sarcoma mieloproliferativo, región de control negativo eliminada, promotor sustituido por el sitio de unión del cebador d1587rev (MND) unido operativamente a un polinucleótido que codifica iduronato 2-sulfatasa.
[0156] En ciertas formas de realización, el vector lentiviral comprende un promotor que comprende uno o más elementos de un LCR de p-globina humana.
[0157] En algunas formas de realización, el LCR de p-globina humana comprende el sitio hipersensible a la ADNasa I 2, 3 y 4 del LCR de p-globina humana.
[0158] En formas de realización particulares, el vector lentiviral comprende además un elemento potenciador 3' de pglobina humana.
[0159] En formas de realización adicionales, el gen de interés codifica una proteína anti-falciforme o un gen de globina.
[0160] En formas de realización particulares, el gen de interés codifica una proteína p-globina humana, una proteína 5-globina humana, una proteína Y-globina humana, una proteína p-T87Q-globina humana, una proteína pA-G16D/E22A/T87Q-globina humana o una proteína pA-T87Q/K95E/K120E-globina humana.
[0161] En formas de realización particulares, el vector lentiviral es un vector AnkT9W, un vector T9Ank2W, un vector TNS9, un vector de lentiglobina HPV569, un vector de lentiglobina BB305, un vector BG-1, un vector BGM-1, un vector d432pAY, un vector mLARpAYV5, un vector GLOBE, un vector G-GLOBE, un vector pAS3-FB, un vector V5, un vector V5m3, un vector V5m3-400, un vector G9 y un vector BCL11A shmir.
[0162] La presente invención contempla, en parte, un método para transducir una población de células hematopoyéticas que comprende cultivar las células en un medio de cultivo, en presencia de un lentivirus y poloxámero 407, opcionalmente, en donde las células se ponen en contacto con estaurosporina, si está presente, antes del contacto con el vector y el poloxámero.
[0163] La presente invención contempla, en parte, un método para transducir una población de células hematopoyéticas que comprende cultivar las células en un medio de cultivo, en presencia de un lentivirus, prostaglandina E2(PGE2) o 16,16-dimetil PGE2, y poloxámero 407, opcionalmente, en donde las células se ponen en contacto con estaurosporina, si está presente, antes del contacto con el vector y el poloxámero.
[0164] En esta invención, el agente que aumenta la señalización del receptor de prostaglandina EP se selecciona del grupo que consiste en: prostaglandina E<2>(PGE<2>), o 16,16-dimetil PGE<2>.
[0165] En formas de realización particulares, el agente que aumenta la señalización del receptor EP de prostaglandina es PGE<2>.
[0166] En esta invención, el poloxámero es el poloxámero 407.
[0167] En algunas formas de realización, la población de células hematopoyéticas se transduce en presencia de un polímero policatiónico.
[0168] En formas de realización particulares, el polímero policatiónico es polibreno, sulfato de protamina, polietilenimina o un copolímero de bloque de polietilenglicol/poli-L-lisina.
[0169] En otras formas de realización, el vector lentiviral se deriva de un lentivirus seleccionado del grupo que consiste en: VIH (virus de inmunodeficiencia humana; incluyendo VIH tipo 1 y VIH tipo 2); virus visna-maedi (VVM); virus de la artritis-encefalitis caprina (VAEC); virus de la anemia infecciosa equina (VAIE); virus de la inmunodeficiencia felina (FIV); virus de la inmunodeficiencia bovina (BIV); y virus de la inmunodeficiencia simia (SIV).
[0170] En ciertas formas de realización, el vector lentiviral se deriva de un lentivirus del VIH.
[0171] En formas de realización particulares, el vector lentiviral se deriva de un lentivirus VIH-1.
[0172] En formas de realización adicionales, el vector es un vector lentiviral que comprende: a) un terminal largo 5' (LTR); b) una señal de empaquetamiento Psi (V); c) un elemento de exportación de ARN; d) un tracto central de polipurina lentiviral (cPPT); e) un promotor unido operativamente a un polinucleótido de interés; y f) un LTR 3' de SIN.
[0173] En ciertas formas de realización, el LTR 5' modificado comprende además una eliminación en comparación con el LTR 5' de tipo salvaje.
[0174] En algunas formas de realización, el promotor del LTR 5' se reemplaza con un promotor heterólogo seleccionado del grupo que consiste en: un promotor del citomegalovirus (CMV), un promotor del virus del sarcoma de Rous (RSV) o un promotor del virus de simio 40 (SV40).
[0175] En algunas formas de realización, el elemento de exportación de ARN comprende un elemento regulador postranscripcional del virus de la hepatitis B (PRE) o un elemento de respuesta rev del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) (RRE).
[0176] En ciertas formas de realización, la LTR 3' comprende una secuencia de poliadenilación.
[0177] En formas de realización particulares, el vector lentiviral está presente en un MOI de aproximadamente 10 a aproximadamente 30.
[0178] En formas de realización particulares, el vector lentiviral está presente en un MOI de aproximadamente 10 a aproximadamente 25.
[0179] En formas de realización particulares, el vector lentiviral está presente en un MOI de aproximadamente 10 a aproximadamente 20.
[0180] En algunas formas de realización, el vector lentiviral está presente en un MOI de aproximadamente 10, aproximadamente 11, aproximadamente 12, aproximadamente 13, aproximadamente 14, aproximadamente 15, aproximadamente 16, aproximadamente 17, aproximadamente 18, aproximadamente 19, aproximadamente 20, aproximadamente 21, aproximadamente 22, aproximadamente 23, aproximadamente 24, aproximadamente 25, aproximadamente 26, aproximadamente 27, aproximadamente 28, aproximadamente 29 o aproximadamente 30.
[0181] En formas de realización particulares, el vector lentiviral codifica un polipéptido del casete de unión a ATP, subfamilia D, miembro 1 (ABCD1).
[0182] En otras formas de realización, el vector lentiviral comprende un potenciador del virus del sarcoma mieloproliferativo, región de control negativo eliminada, promotor sustituido del sitio de unión del cebador d1587rev (MND) o un fragmento transcripcionalmente activo del mismo unido operativamente a un polinucleótido que codifica un polipéptido del casete de unión a ATP, subfamilia D, miembro 1 (ABCD1).
[0183] En ciertas formas de realización, el vector lentiviral codifica la adenosina desaminasa.
[0184] En ciertas formas de realización, el vector lentiviral comprende un promotor del factor de elongación 1 alfa unido operativamente a un polinucleótido que codifica la adenosina desaminasa.
[0185] En ciertas formas de realización, el vector lentiviral codifica el receptor de interleucina 2 gamma.
[0186] En ciertas formas de realización, el vector lentiviral comprende un promotor del factor de elongación 1 alfa unido operativamente a un polinucleótido que codifica el receptor de interleucina 2 gamma.
[0187] En formas de realización particulares, el vector lentiviral codifica la tripeptidil peptidasa 1.
[0188] En ciertas formas de realización, el vector lentiviral comprende un promotor del factor de elongación 1 alfa o comprende un potenciador del virus del sarcoma mieloproliferativo, región de control negativo eliminada, promotor sustituido por el sitio de unión del cebador d1587rev (MND) unido operativamente a un polinucleótido que codifica la tripeptidil peptidasa 1.
[0189] En formas de realización particulares, el vector lentiviral codifica alfa-L iduronidasa.
[0190] En ciertas formas de realización, el vector lentiviral comprende un promotor del factor de elongación 1 alfa o comprende un potenciador del virus del sarcoma mieloproliferativo, región de control negativo eliminada, promotor sustituido por el sitio de unión del cebador d1587rev (MND) unido operativamente a un polinucleótido que codifica la alfa-L iduronidasa.
[0191] En formas de realización particulares, el vector lentiviral codifica iduronato 2-sulfatasa.
[0192] En ciertas formas de realización, el vector lentiviral comprende un promotor del factor de elongación 1 alfa o comprende un potenciador del virus del sarcoma mieloproliferativo, región de control negativo eliminada, promotor sustituido por el sitio de unión del cebador d1587rev (MND) unido operativamente a un polinucleótido que codifica iduronato 2-sulfatasa.
[0193] En ciertas formas de realización, el vector lentiviral comprende un promotor que comprende uno o más elementos de un LCR de p-globina humana.
[0194] En algunas formas de realización, el LCR de p-globina humana comprende el sitio hipersensible a la ADNasa I 2, 3 y 4 del LCR de p-globina humana.
[0195] En formas de realización particulares, el vector lentiviral comprende además un elemento potenciador 3' de pglobina humana.
[0196] En formas de realización adicionales, el gen de interés codifica una proteína anti-falciforme o un gen de globina.
[0197] En formas de realización particulares, el gen de interés codifica una proteína p-globina humana, una proteína 5-globina humana, una proteína Y-globina humana, una proteína pA-T87Q-globina humana, una proteína pA-G16D/E22A/T87Q-globina humana o una proteína pA-T87Q/K95E/K120E-globina humana.
[0198] En formas de realización particulares, el vector lentiviral es un vector AnkT9W, un vector T9Ank2W, un vector TNS9, un vector de lentiglobina HPV569, un vector de lentiglobina BB305, un vector BG-1, un vector BGM-1, un vector d432pAY, un vector mLARpAYV5, un vector GLOBE, un vector G-GLOBE, un vector pAS3-FB, un vector V5, un vector V5m3, un vector V5m3-400, un vector G9 y un vector BCL11A shmir.
[0199] En esta invención, la población de células hematopoyéticas se transduce al menos aproximadamente 24 horas.
[0200] En esta invención, las células hematopoyéticas comprenden células madre o progenitoras hematopoyéticas.
[0201] En esta invención, las células hematopoyéticas comprenden células CD34+.
[0202] En algunas formas de realización, la población de células hematopoyéticas se selecciona para la expresión de CD34+ antes de la transducción.
[0203] En esta invención, el poloxámero es el poloxámero 407.
[0204] En esta invención, el agente que aumenta la señalización del receptor de prostaglandina EP se selecciona del grupo que consiste en: prostaglandina E<2>(PGE<2>), o 16,16-dimetil PGE<2>.
[0205] En ciertas formas de realización, el agente que aumenta la señalización del receptor EP de prostaglandina es PGE2.
BREVE DESCRIPCIÓN DE VARIAS VISTAS DE LOS DIBUJOS
[0206]
La figura 1 muestra el análisisin vivode células hCD34+ tratadas con PGE<2>. (A) Injerto de células hCD34+ medido por tinción positiva con anti-hCD45. (B) Análisis de NCV de células humanas injertadas en médula ósea de ratón.
La figura 2 muestra que las células hCD34+ transducidas en presencia de concentraciones crecientes de F108 muestran un aumento dependiente de la dosis en (A) la entrada viral y (B) NCV.
La figura 3 muestra que las células hCD34+ transducidas en presencia de F108, PGE<2>o F108 y PGE<2>no muestran una viabilidad celular disminuida en comparación con las células tratadas de control.
La figura 4 muestra que las células hCD34+ transducidas en presencia de concentraciones crecientes de F68 no muestran un aumento dependiente de la dosis en (A) la entrada viral y (B) NCV.
La figura 5 muestra un aumento en el NCV y la eficiencia de transducción en células hCD34+ transducidas en presencia de F108 y PGE<2>en comparación con las células transducidas en presencia de F108 solo o controles.
La figura 6 muestra el análisis de colonias individuales de dos experimentos independientes que demuestra un aumento en el NCV medio con el tratamiento combinado de F108 y PGE<2>, así como una disminución sustancial en el número de progenitores que no se transducen.
La figura 7 muestra que las células hCD34+ transducidas en presencia de concentraciones crecientes de PGE<2>y una concentración estática de F108 no muestran un aumento dependiente de la dosis en el NCV. La figura 8 muestra que ambas poblaciones de células hematopoyéticas en masa y células madre fenotípicas (CD34+CD38LoCD90+CD45RA-) transducidas en presencia de PGE<2>y el tratamiento con F108 muestran una mayor eficiencia de transducción en comparación con las condiciones de transducción estándar utilizando sulfato de protamina.
La figura 9 muestra que las células hCD34+ transducidas en presencia de F108 o F108 y PGE<2>muestran un aumento de NCV en comparación con los controles.
La figura 10 muestra el análisis de NCV y la eficiencia de transducción de células hCD34+ tratadas con PGE<2>, F108 o una combinación de los mismos. (A) F108, solo o en combinación con PGE<2>, mejora el NCV de un lote de células de baja transducción. (B) F108, solo o en combinación con PGE<2>, mejora la eficiencia de transducción de un lote de células de baja transducción. (C) El análisis de NCV a los 2 meses posteriores al trasplante revela que F108, solo o en combinación con PGE<2>, mejora el NCVin vivode las células hCD34+ injertadas. (D) El análisis de NCV a los 4 meses posteriores al trasplante revela que F108, solo o en combinación con PGE<2>, mejora el NCVin vivode las células hCD34+ injertadas.
La figura 11 muestra el nivel de injerto y las capacidades de diferenciación de las células hCD34+ tratadas con PGE<2>, F108 o una combinación de los mismos a los 2 y 4 meses posteriores al trasplante. (A) Ni F108, PGE 2 ni la combinación afectan los niveles de injerto de las células hCD34+ transducidas en un entorno de xenotrasplante. (B) Se mantiene la capacidad de diferenciación mieloide de las células injertadas. (C y D) Se mantiene la capacidad de diferenciación linfoide de las células injertadas.
La figura 12 muestra que las células hCD34+ transducidas en presencia de estaurosporina, F108 o F108 y estaurosporina muestran un aumento de NCV en comparación con los controles.
La figura 13 muestra que tanto F108 como F127 aumentan el NCV en células hCD34+ en comparación con la transducción estándar con sulfato de protamina. El NCV se mejora aún más con la adición de PGE 2 a las transducciones F108 y F127.
La figura 14 muestra que tanto F108 como P105 aumentan el NCV en células hCD34+ en comparación con la transducción estándar con sulfato de protamina. El NCV se mejora aún más con la adición de PGE<2>a las transducciones P105 y F108.
La figura 15 muestra que P105 (datos de la figura 14), F127 (datos de la figura 13), F108 y F98 aumentan el NCV en células hCD34+ en comparación con la transducción estándar con sulfato de protamina. El NCV se mejora aún más con la adición de PGE<2>. La figura 15 también muestra que la transducción de células hCD34+ en presencia de P105, F127, F108 o F98 y, opcionalmente, PGE<2>no afectó el crecimiento celular.
La figura 16 muestra que P123, P104, L101 y F108 aumentan el NCV en las células hCD34+ en comparación con la transducción estándar con sulfato de protamina, pero que P123, P104 y L101 también disminuyen el crecimiento celular. El NCV se mejora con la adición de P123 y PGE<2>.
La figura 17 muestra que F87, F88 y F68 no aumentan el NCV en las células hCD34+ durante la transducción estándar con sulfato de protamina y no afectan el crecimiento celular.
La figura 18 muestra que las células p0/p0 hCD34+ transducidas en presencia de PGE<2>y F108 tienen un aumento de aproximadamente tres veces en NCV y porcentaje de células transducidas (%VLV+) en comparación con las células transducidas de control.
La figura 19 muestra que el número de células eritroides enucleadas diferenciadas a partir de células p°/p° hCD34+ transducidas en presencia de PGE<2>y F108 es comparable al número de células eritroides enucleadas diferenciadas a partir de células hCD34+ obtenidas de donantes sanos.
La figura 20 muestra que la cantidad de HbA producida por células eritroides enucleadas diferenciadas a partir de células hCD34+ p0/p0 transducidas en presencia de PGE<2>y F108 es comparable a la cantidad de HbA producida por células eritroides enucleadas diferenciadas a partir de células hCD34+ obtenidas de donantes sanos.
La figura 21 muestra análisis de formación de colonias para células progenitoras hematopoyéticas humanas transducidas con 8 mg/mL de sulfato de protamina (SP), 10 mg/mL de F108 (F108Lo), 1000 mg/mL de F108 (F108Hi) o 1000 mg/mL de F108 en combinación con 8 mg/mL de sulfato de protamina (F108Hi/SP). La formación de colonias no se vio afectada significativamente por los tratamientos.
La figura 22 muestra que F108 aumenta la eficiencia de transducción de HSC fenotípicas a largo plazo (CD34+CD38-CD45RA-CD90+CD49f+) con un vector lentiviral GFP.
La figura 23 muestra tres lotes de células diferentes (629, 703, 010) representativos de transductores bajos, medios y altos transducidos con LentiGlobin BB305 a dos MOI. Las colonias transducidas se agruparon y analizaron para NCV. (SP = 8 pg/mL de sulfato de protamina, F108Hi/PGE2 = 1000 pg/mL de F108 y 10 pM de PGE<2>). F108 y PGE<2>aumentaron NCV en todos los lotes de células.
La figura 24 muestra células CD34+ humanas transducidas con un vector lentiviral que codifica IL2Ry y sulfato de protamina (fila superior) o F108 y PGE<2>(fila inferior), donde el vector lentiviral se produjo por transfección transitoria o por clones de células productoras (PrCL1, PrCL2). Los NCV D14 de colonias de metilcelulosa agrupadas se muestran en los paneles más a la izquierda; Las colonias individuales NCV de las colonias extraídas y las colonias %VLV+ se muestran en los paneles centrales; y la enumeración de colonias se muestra en los paneles más a la derecha.
La figura 25 muestra que F108 y PGE<2>aumentan la transducción con vectores lentivirales que codifican tripeptidil peptidasa 1 (TPP1). Las células CD34+ humanas se transdujeron con VLV que codificaban EF1a-TpP1 o MND-TPP1 a un MOI de 5 o 15 con y sin F108 y PGE<2>. Las NCV de colonias de metilcelulosa agrupadas del día 14 se muestran en el panel superior izquierdo. La actividad de la enzima TPP-1 de los cultivos de citocinas del día 7 se muestra en el panel superior central (pellet celular) y en el panel superior derecho (sobrenadante celular). Las células de médula ósea negativas al linaje de ratón (Lin-) se transdujeron con un VLV MND-TPP1 a un MOI de 5, 15 o 30 con y sin F108 y PGE<2>. Las NCV de cultivo líquido D7 se muestran en el panel inferior izquierdo; la NCV de colonia individual por qPCR se muestra en el panel inferior central; y las colonias %VLV+ se muestran en el panel inferior derecho.
La figura 26 Las células CD34+ humanas de pacientes con AMN (figura 26, paneles AD), pacientes con ALD (figura 26, paneles EH) y donantes sanos (HD; Figura 26, paneles IL) se transdujeron con un VLV MND-ABCD1 y sulfato de protamina, F108, PGE<2>o F108 y PGE<2>. La expresión de la proteína ALDP se muestra en los paneles A, E e I; el NCV de la colonia agrupada se muestra en los paneles B, F y J; el NCV de la colonia individual se muestra en los paneles C, G y K; y el análisis de la formación de colonias se muestra en los paneles D, H y L.
La figura 27 muestra la colonia NCV agrupada (panel izquierdo), el análisis de formación de colonias (panel central) y la colonia NCV individual y las células %VLV+ (panel derecho) de células hCD34+ transducidas en MOI de 10 o 25, con y sin F108 y p Ge 2.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
A. VISIÓN GENERAL
[0207] Diversos ejemplos ilustrativos de la divulgación contemplan terapias genéticas que comprenden composiciones de células madre y progenitoras hematopoyéticas con mayor eficacia terapéutica y métodos para elaborarlas y utilizarlas.
[0208] La terapia génica se basa, en parte, en la expresión suficiente de un gen terapéutico y la proteína correspondiente. Uno de los factores que influye en la expresión génica es el número de copias, o cuántas copias del gen terapéutico están presentes en la célula. Los virus, como los retrovirus, por ejemplo, lentivirus, adenovirus y virus adenoasociados, se utilizan a menudo como vectores de terapia génica para introducir el gen terapéutico en la célula; un proceso conocido como transducción. La transducción viral ineficiente de células madre y progenitoras hematopoyéticas es uno de los factores más importantes que limita el alcance y la aplicabilidad de las terapias génicas para muchas enfermedades y trastornos que se beneficiarían de células modificadas genéticamente derivadas del sistema hematopoyético. Una transducción viral deficiente se manifiesta como un bajo número de copias del vector (NCV) y/o un bajo porcentaje de células transducidas. Por lo tanto, un problema significativo con las terapias génicas que utilizan vectores virales para administrar transgenes terapéuticos a células madre y progenitoras hematopoyéticas es la transducción viral ineficiente, que puede dar lugar a un producto farmacológico subterapéutico. La transducción ineficiente también conduce a mayores costos de los bienes, por ejemplo, aumenta el costo de producción de lentivirus porque cuanto más ineficiente sea la transducción, más lentivirus se necesita.
[0209] Las terapias genéticas basadas en células madre y progenitoras hematopoyéticas contempladas en este documento, y los métodos para elaborarlas y utilizarlas, resuelven estos y otros problemas que afectan a la técnica.
[0210] Forma de realización ejemplares particulares contemplan una población de células hematopoyéticas transducidas con un vector, en donde la población de células comprende un número o porcentaje aumentado de células madre y progenitoras hematopoyéticas transducidas en comparación con las poblaciones de células transducidas con métodos y composiciones existentes en la técnica. En esta invención, una población de células hematopoyéticas transducidas con un vector lentiviral comprende un NCV aumentado en comparación con el NCV de las poblaciones de células transducidas con métodos y composiciones existentes en la técnica.
[0211] Ciertas formas de realización contemplan cultivos celulares que comprenden una población de células hematopoyéticas, un lentivirus y poloxámero 407.
[0212] Varias formas de realización contempladas en el presente documento emplearán, a menos que se indique específicamente lo contrario, métodos convencionales de química, bioquímica, química orgánica, biología molecular, microbiología, técnicas de ADN recombinante, genética, inmunología y biología celular que están dentro de la habilidad de la técnica, muchas de las cuales se describen a continuación con fines ilustrativos. Dichas técnicas se explican completamente en la bibliografía. Véase, por ejemplo, Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3.a edición, 2001); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2.a edición, 1989); Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, actualizado en julio de 2008); Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods de Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates y Wiley-Interscience; Glover, DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I y II (IRL Press, Oxford, 1985); Anand, Techniques for the Analysis of Complex Genomes, (Academic Press, Nueva York, 1992); Transcription and Translation (B. Hames y S. Higgins, eds., 1984); Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); Harlow y Lane, Antibodies, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1998); Current Protocols in Immunology (QE Coligan, AM Kruisbeek, DH Margulies, EM Shevach y W. Strober, eds., 1991);Annual Review of Immunology;así como monografías en revistas comoAdvances in Immunology.
B. DEFINICIONES
[0213] A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que entienden comúnmente los expertos en la materia a la que pertenece la divulgación. Aunque se pueden utilizar métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento en la práctica o prueba de la presente invención, en el presente documento se describen formas de realización preferidas de composiciones, métodos y materiales. A los efectos de la presente divulgación, se definen a continuación los siguientes términos.
[0214] Los artículos "un", "una", "el" y "ella" se utilizan en el presente documento para hacer referencia a uno o más de uno (es decir, al menos a uno, o a uno o más) de los objetos gramaticales del artículo. A modo de ejemplo, "un elemento" significa un elemento o uno o más elementos.
[0215] El uso de la alternativa (por ejemplo, "o") debe entenderse como que significa una, ambas o cualquier combinación de las alternativas.
[0216] El término "y/o" debe entenderse como que significa una o ambas alternativas.
[0217] Como se utiliza en el presente documento, el término "aproximadamente” o “alrededor de" se refiere a una cantidad, nivel, valor, número, frecuencia, porcentaje, dimensión, tamaño, cantidad, peso o longitud que varía hasta en un 30, 25, 20, 25, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 % con respecto a una cantidad, nivel, valor, número, frecuencia, porcentaje, dimensión, tamaño, cantidad, peso o longitud de referencia. Los términos "aproximadamente” o “alrededor de" cuando preceden a un valor numérico pueden indicar el valor más o menos un rango de 15 %, 10 %, 5 % o 1 %.
[0218] Como se utiliza en el presente documento, el término "sustancialmente" se refiere a una cantidad, nivel, valor, número, frecuencia, porcentaje, dimensión, tamaño, cantidad, peso o longitud que es 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o superior en comparación con una cantidad, nivel, valor, número, frecuencia, porcentaje, dimensión, tamaño, cantidad, peso o longitud de referencia. "Sustancialmente igual" puede referirse a una cantidad, nivel, valor, número, frecuencia, porcentaje, dimensión, tamaño, cantidad, peso o longitud que produce un efecto, por ejemplo, un efecto fisiológico, que es aproximadamente el mismo que una cantidad, nivel, valor, número, frecuencia, porcentaje, dimensión, tamaño, cantidad, peso o longitud de referencia.
[0219] A lo largo de esta especificación, a menos que el contexto requiera lo contrario, las palabras "comprender", "comprende" y "que comprende" se entenderán como que implican la inclusión de un paso o elemento o grupo de pasos o elementos indicados, pero no la exclusión de cualquier otro paso o elemento o grupo de pasos o elementos. Tal como se utilizan en el presente documento, los términos "incluir" y "comprender" se utilizan como sinónimos. Por "que consiste en" se entiende que incluye, y se limita a, lo que sigue a la frase "que consiste en". Por lo tanto, la frase "que consiste en" indica que los elementos enumerados son necesarios u obligatorios, y que no puede haber otros elementos presentes. Por "que consiste esencialmente en" se entiende que incluye cualquier elemento enumerado después de la frase, y se limita a otros elementos que no interfieren con ni contribuyen a la actividad o acción especificada en la divulgación para los elementos enumerados. Por lo tanto, la frase "que consiste esencialmente en" indica que los elementos enumerados son necesarios u obligatorios, pero que no hay otros elementos presentes que afecten materialmente la actividad o acción de los elementos enumerados.
[0220] La referencia en toda esta especificación a "una forma de realización", "forma de realización", "una forma de realización particular", "una forma de realización relacionada", "una forma de realización determinada", "una forma de realización adicional" o "una forma de realización adicional" o combinaciones de las mismas significa que una característica, estructura o característica particular descrita en relación con la forma de realización está incluida en al menos una forma de realización de la presente invención. Por lo tanto, las apariciones de las frases anteriores en varios lugares a lo largo de esta especificación no necesariamente se refieren todas a la misma realización. Además, las características, estructuras o características particulares se pueden combinar de cualquier manera adecuada en una o más formas de realización. También se entiende que la recitación positiva de una característica en una forma de realización sirve como base para excluir la característica en una forma de realización particular.
[0221] "Transfección" se refiere al proceso de introducir ADN desnudo en células mediante métodos no virales.
[0222] "Infección" se refiere al proceso de introducir ADN extraño en células utilizando un vector viral.
[0223] "Transducción" se refiere a la introducción de ADN extraño en el genoma de una célula utilizando un vector viral.
[0224] "Número de copias de vector" o "NCV" se refiere al número de copias de un vector, o parte del mismo, en el genoma de una célula. El NCV promedio puede determinarse a partir de una población de células o de colonias de células individuales. Los métodos ejemplares para determinar el NCV incluyen la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y la citometría de flujo.
[0225] "Eficiencia de transducción" se refiere al porcentaje de células transducidas con al menos una copia de un vector. Por ejemplo, si 1 x 106 células se exponen a un virus y se determina que 0,5 x 106 células tienen al menos una copia de un virus en su genoma, entonces la eficiencia de transducción es del 50 %. Los métodos ejemplares para determinar la eficiencia de transducción incluyen PCR y citometría de flujo. Las frases "número de células positivas al vector lentiviral" o "porcentaje de células positivas al vector lentiviral" pueden usarse para indicar la eficiencia de transducción.
[0226] Como se utiliza en el presente documento, el término "retrovirus" se refiere a un virus de ARN que transcribe de forma inversa su ARN genómico en una copia de ADN bicatenario lineal y posteriormente integra de forma covalente su ADN genómico en un genoma huésped. Los retrovirus son una herramienta común para la administración de genes (Miller, 2000, Nature. 357: 455-460). Una vez que el virus se integra en el genoma huésped, se lo denomina "provirus". El provirus sirve como plantilla para la ARN polimerasa II y dirige la expresión de las moléculas de ARN codificadas por el virus.
[0227] Los retrovirus ilustrativos incluyen, pero no se limitan a: virus de la leucemia murina de Moloney (M-MuLV), virus del sarcoma murino de Moloney (MoMSV), virus del sarcoma murino de Harvey (HaMuSV), virus del tumor mamario murino (MuMTV), virus de la leucemia del mono gibón (GaLV), virus de la leucemia felina (FLV), espumavirus, virus de la leucemia murina Friend, virus de células madre murinas (MSCV) y virus del sarcoma de Rous (RSV)) y lentivirus.
[0228] Como se utiliza en el presente documento, el término "lentivirus" se refiere a un grupo (o género) de retrovirus complejos. Los lentivirus ilustrativos incluyen, pero no se limitan a: VIH (virus de inmunodeficiencia humana; incluyendo VIH tipo 1 y VIH tipo 2); virus visna-maedi (VVM); el virus de la artritis-encefalitis caprina (VAEC); virus de la anemia infecciosa equina (VAIE); virus de inmunodeficiencia felina (FIV); virus de inmunodeficiencia bovina (BIV); y virus de inmunodeficiencia de simios (SIV). Las estructuras principales del vector basadas en VIH (es decir, elementos de secuencia que actúan en cis del VIH) pueden ser preferidas.
[0229] Se pueden utilizar vectores lentivirales en la práctica de la presente invención.
[0230] El término "vector" se utiliza en el presente documento para referirse a una molécula de ácido nucleico capaz de transferir o transportar otra molécula de ácido nucleico. El ácido nucleico transferido generalmente está unido a, p. ej., insertado en, la molécula de ácido nucleico del vector. Un vector puede incluir secuencias que dirigen la replicación autónoma en una célula, o puede incluir secuencias suficientes para permitir la integración en el ADN de la célula huésped. Los vectores útiles incluyen, por ejemplo, plásmidos (p. ej., plásmidos de ADN o plásmidos de ARN), transposones, cósmidos, cromosomas artificiales bacterianos y vectores virales. Los vectores virales útiles incluyen, p. ej., retrovirus y lentivirus con replicación defectuosa.
[0231] Como será evidente para un experto en la materia, el término "vector viral" se utiliza ampliamente para referirse a una molécula de ácido nucleico (por ejemplo, un plásmido de transferencia) que incluye elementos de ácido nucleico derivados de virus que normalmente facilitan la transferencia de la molécula de ácido nucleico o la integración en el genoma de una célula o a una partícula viral que media la transferencia de ácido nucleico. Las partículas virales incluirán normalmente varios componentes virales y, a veces, también componentes de la célula huésped además de ácido(s) nucleico(s).
[0232] El término vector viral puede referirse a un virus o partícula viral capaz de transferir un ácido nucleico a una célula o al propio ácido nucleico transferido. Los vectores virales y plásmidos de transferencia contienen elementos genéticos estructurales y/o funcionales que se derivan principalmente de un virus. El término "vector retroviral" se refiere a un vector viral o plásmido que contiene elementos genéticos estructurales y funcionales, o porciones de los mismos, que se derivan principalmente de un retrovirus. El término "vector lentiviral" se refiere a un vector retroviral o plásmido que contiene elementos genéticos estructurales y funcionales, o porciones de los mismos, incluyendo LTR que se derivan principalmente de un lentivirus. El término "híbrido" se refiere a un vector, LTR u otro ácido nucleico que contiene secuencias retrovirales, por ejemplo, lentivirales, y secuencias virales no lentivirales. Un vector híbrido puede referirse a un vector o plásmido de transferencia que comprende secuencias retrovirales, por ejemplo, lentivirales, para transcripción inversa, replicación, integración y/o empaquetamiento.
[0233] Los términos "vector lentiviral" y "vector de expresión lentiviral" pueden utilizarse para referirse a plásmidos de transferencia lentiviral y/o partículas lentivirales infecciosas. Cuando en el presente documento se hace referencia a elementos tales como sitios de clonación, promotores, elementos reguladores, ácidos nucleicos heterólogos, etc., se debe entender que las secuencias de estos elementos están presentes en forma de ARN en las partículas lentivirales de la invención y están presentes en forma de ADN en los plásmidos de ADN de la invención.
[0234] En cada extremo del provirus hay estructuras llamadas "repeticiones terminales largas" o "LTR". El término "repeticiones terminales largas (LTR)" se refiere a dominios de pares de bases ubicados en los extremos de los ADN retrovirales que, en su contexto de secuencia natural, son repeticiones directas y contienen regiones U3, R y U5. Las LTR generalmente proporcionan funciones fundamentales para la expresión de genes retrovirales (por ejemplo, promoción, iniciación y poliadenilación de transcripciones de genes) y para la replicación viral. La LTR contiene numerosas señales reguladoras que incluyen elementos de control transcripcional, señales de poliadenilación y secuencias necesarias para la replicación e integración del genoma viral. La LTR viral se divide en tres regiones llamadas U3, R y U5. La región U3 contiene los elementos potenciadores y promotores. La región U5 es la secuencia entre el sitio de unión del cebador y la región R y contiene la secuencia de poliadenilación. La región R (repetición) está flanqueada por las regiones U3 y U5. La LTR está compuesta por las regiones U3, R y U5 y aparece tanto en los extremos 5' como 3' del genoma viral. Adyacente a la LTR 5' se encuentran secuencias necesarias para la transcripción inversa del genoma (el sitio de unión del cebador del ARNt) y para el empaquetamiento eficiente del ARN viral en partículas (el sitio Psi).
[0235] Como se utiliza en el presente documento, el término "señal de empaquetamiento" o "secuencia de empaquetamiento" se refiere a secuencias ubicadas dentro del genoma retroviral que son necesarias para la inserción del ARN viral en la cápside o partícula viral, véase, por ejemplo, Clever et al., 1995. J. of Virology, Vol. 69, No. 4; págs.
2101-2109. Varios vectores retrovirales utilizan la señal de empaquetamiento mínima (también denominada secuencia psi [V] o [V+]) necesaria para la encapsidación del genoma viral. Por lo tanto, como se utiliza en el presente documento, los términos "secuencia de empaquetamiento", "señal de empaquetamiento", "psi" y el símbolo "V", se utilizan en referencia a la secuencia no codificante necesaria para la encapsidación de las cadenas de ARN retroviral durante la formación de partículas virales.
[0236] Los vectores pueden comprender LTR 5' y/o LTR 3' modificados. Las modificaciones de los LTR 3' se realizan a menudo para mejorar la seguridad de los sistemas lentivirales o retrovirales haciendo que los virus sean defectuosos en cuanto a replicación. El experto en la técnica podría determinar si un LTR está modificado en comparación con un LTR de referencia. Como se utiliza en el presente documento, el término "defectuoso en cuanto a replicación" se refiere a un virus que no es capaz de una replicación completa y eficaz de modo que no se producen viriones infecciosos (por ejemplo, progenie lentiviral defectuosa en cuanto a replicación). El término "competente en cuanto a replicación" se refiere a un virus de tipo salvaje o virus mutante que es capaz de replicarse, de modo que la replicación viral del virus es capaz de producir viriones infecciosos (por ejemplo, progenie lentiviral competente en cuanto a replicación).
[0237] Los vectores "autoinactivantes" (SIN) se refieren a vectores defectuosos en la replicación, por ejemplo, vectores retrovirales o lentivirales, en los que la región potenciadora-promotora LTR derecha (3'), conocida como la región U3, se ha modificado (por ejemplo, por deleción y/o sustitución) para evitar la transcripción viral más allá de la primera ronda de replicación viral. Esto se debe a que la región U3 LTR derecha (3') se utiliza como plantilla para la región U3 LTR izquierda (5') durante la replicación viral y, por lo tanto, la transcripción viral no se puede realizar sin el potenciadorpromotor U3. La LTR 3' se puede modificar de manera que la región U5 se reemplace, por ejemplo, con una secuencia poli(A) heteróloga o sintética, uno o más elementos aisladores y/o un promotor inducible. Se debe tener en cuenta que las modificaciones a los LTR, tales como modificaciones al LTR 3', al LTR 5' o a ambos LTR 3' y 5', también pueden incluirse en la invención.
[0238] Se proporciona una mejora de seguridad adicional reemplazando la región U3 del LTR 5' con un promotor heterólogo para impulsar la transcripción del genoma viral durante la producción de partículas virales. Los ejemplos de promotores heterólogos que se pueden utilizar incluyen, por ejemplo, el virus viral de simios 40 (SV40) (por ejemplo, temprano o tardío), el citomegalovirus (CMV) (por ejemplo, temprano inmediato), el virus de la leucemia murina de Moloney (MoMI,V), el virus del sarcoma de Rous (RSV) y los promotores del virus del herpes simple (HSV) (timidina quinasa). Los promotores típicos pueden impulsar altos niveles de transcripción de una manera independiente de Tat. Este reemplazo reduce la posibilidad de recombinación para generar un virus competente para la replicación porque no hay una secuencia U3 completa en el sistema de producción del virus. El promotor heterólogo puede ser inducible, de modo que la transcripción de todo o parte del genoma viral se producirá solo cuando estén presentes uno o más factores de inducción incluyen, pero no se limitan a uno o más compuestos químicos o condiciones fisiológicas, por ejemplo, temperatura o pH, en los que se cultivan las células huésped.
[0239] Los vectores virales pueden comprender un elemento TAR. El término "TAR" se refiere al elemento genético de "respuesta de transactivación" ubicado en la región R de los LTR lentivirales (por ejemplo, VIH). Este elemento interactúa con el elemento genético transactivador lentiviral (tat) para mejorar la replicación viral. Sin embargo, este elemento no es necesario cuando la región U3 del LTR 5' se reemplaza por un promotor heterólogo.
[0240] La "región R" se refiere a la región dentro de los LTR retrovirales que comienza al inicio del grupo de protección (es decir, el inicio de la transcripción) y termina inmediatamente antes del inicio del tracto poli A. La región R también se define como flanqueada por las regiones U3 y U5. La región R desempeña un papel durante la transcripción inversa al permitir la transferencia de ADN naciente de un extremo del genoma al otro.
[0241] Como se utiliza en el presente documento, el término "elemento FLAP" se refiere a un ácido nucleico cuya secuencia incluye el tracto de polipurina central y las secuencias de terminación central (cPPT y CTS) de un retrovirus, por ejemplo, VIH-1 o VIH-2. Los términos "elemento FLAP" y "cPPT/FLAP" se pueden utilizar indistintamente para referirse al elemento FLAP anterior. Los elementos FLAP adecuados se describen en la patente de EE. UU. n.° 6.682.907 y en Zennou, et al., 2000, Cell, 101:173. Durante la transcripción inversa del VIH-1, la iniciación central del ADN de cadena positiva en el tracto de polipurina central (cPPT) y la terminación central en la secuencia de terminación central (CTS) conducen a la formación de una estructura de ADN de tres cadenas: el colgajo de ADN central del VIH-1. Sin querer limitarnos a ninguna teoría, el ADN flap puede actuar como un determinante cis-activo de la importación nuclear del genoma lentiviral y/o puede aumentar el título del virus. Las estructuras principales del vector lentiviral pueden comprender uno o más elementos FLAP aguas arriba o aguas abajo de los genes heterólogos de interés en los vectores. Por ejemplo, un vector puede incluir un elemento FLAP. Un vector puede comprender un elemento FLAP aislado del VIH-1.
[0242] Los vectores de transferencia lentiviral pueden comprender uno o más elementos de exportación. El término "elemento de exportación" se refiere a un elemento regulador postranscripcional que actúa en cis y que regula el transporte de un transcrito de ARN desde el núcleo hasta el citoplasma de una célula. Los ejemplos de elementos de exportación de ARN incluyen, pero no se limitan a el elemento de respuesta rev (RRE) del virus de inmunodeficiencia humana (VIH) (véase, por ejemplo, Cullen et al., 1991. J. Virol. 65: 1053; y Cullen et al., 1991. Cell 58: 423), y el elemento regulador postranscripcional del virus de la hepatitis B (HPRE). Generalmente, el elemento de exportación de ARN se coloca dentro del uTr 3' de un gen, y se puede insertar como una o múltiples copias.
[0243] La expresión de secuencias heterólogas en vectores virales puede aumentarse incorporando elementos reguladores postranscripcionales, sitios de poliadenilación eficientes y, opcionalmente, señales de terminación de la transcripción en los vectores. Una variedad de elementos reguladores postranscripcionales pueden aumentar la expresión de un ácido nucleico heterólogo en la proteína, por ejemplo, el elemento regulador postranscripcional del virus de la hepatitis de la marmota (WPRE; Zufferey et al., 1999, J. Virol., 73:2886); el elemento regulador postranscripcional presente en el virus de la hepatitis B (HPRE) (Huang y Yen, 1995, Mol. Cell. Biol., 5:3864); y similares (Liu et al., 1995, Genes Dev., 9:1766). Los vectores pueden carecer o no incluir un elemento regulador postranscripcional como un WPRE o HPRE porque en algunos casos estos elementos aumentan el riesgo de transformación celular y/o no aumentan de manera sustancial o significativa la cantidad de transcripción de ARNm ni aumentan la estabilidad del ARNm. Por lo tanto, los vectores pueden carecer o no incluir un WPRE o HPRE como medida de seguridad adicional.
[0244] Los vectores pueden comprender una secuencia de poliadenilación 3' de un polinucleótido que codifica un polipéptido que se va a expresar. El término "sitio poliA" o "secuencia poliA" como se utiliza en el presente documento denota una secuencia de ADN que dirige tanto la terminación como la poliadenilación del transcrito de ARN naciente por la ARN polimerasa II. Las secuencias de poliadenilación pueden promover la estabilidad del ARNm mediante la adición de una cola de poliA al extremo 3' de la secuencia codificante y, por lo tanto, contribuir a una mayor eficiencia de traducción. La escisión y la poliadenilación están dirigidas por una secuencia de poli(A) en el ARN. La secuencia poli(A) central para los pre-ARNm de mamíferos tiene dos elementos de reconocimiento que flanquean un sitio de escisión-poliadenilación. Normalmente, un hexámero AAUAAA casi invariante se encuentra 20-50 nucleótidos aguas arriba de un elemento más variable rico en residuos U o GU. La escisión del transcrito naciente se produce entre estos dos elementos y está acoplada a la adición de hasta 250 adenosinas al producto de escisión 5'. La secuencia poli(A) central puede ser una secuencia poliA ideal (por ejemplo, AATAAA, ATTAAA, AGTAAA). La secuencia poli(A) puede ser una secuencia poliA de SV40, una secuencia poliA de hormona de crecimiento bovina (BGHpA), una secuencia poliA de p-globina de conejo (rpgpA) u otra secuencia poliA heteróloga o endógena adecuada conocida en la técnica.
[0245] El vector lentiviral puede comprender además uno o más elementos aislantes. Los elementos aislantes pueden contribuir a proteger las secuencias expresadas por lentivirus, por ejemplo, polipéptidos terapéuticos, de los efectos del sitio de integración, que pueden estar mediados por elementos que actúan en cis presentes en el ADN genómico y conducir a la expresión desregulada de las secuencias transferidas (es decir, efecto de posición; véase, por ejemplo, Burgess-Beusse et al., 2002, Proc. Natl. Acad. Sci., EE. UU., 99: 16433; y Zhan et al., 2001, Hum. Genet., 109: 471). Los vectores de transferencia pueden comprender uno o más elementos aislantes en la LTR 3' y tras la integración del provirus en el genoma del huésped, el provirus comprende uno o más aislantes en la LTR 5' y/o la LTR 3', en virtud de la duplicación de la LTR 3'. Los aislantes adecuados incluyen, entre otros, el aislante de p-globina de pollo (véase Chung et al., 1993. Cell 74:505; Chung et al., 1997. PNAS 94:575; y Bell et al., 1999. Cell 98:387). Los ejemplos de elementos aislantes incluyen, entre otros, un aislante de un locus de p-globina humano, como HS4 de pollo.
[0246] La mayoría o la totalidad de las secuencias de la estructura principal del vector viral pueden derivarse de un lentivirus, por ejemplo, VIH-1. Sin embargo, debe entenderse que pueden usarse muchas fuentes diferentes de secuencias lentivirales, y pueden acomodarse numerosas sustituciones y alteraciones en ciertas de las secuencias lentivirales sin perjudicar la capacidad de un vector de transferencia para realizar las funciones descritas en este documento. Además, se conocen en la técnica una variedad de vectores lentivirales, véase Naldiniet al.,(1996a, 1996b y 1998); Zuffereyet al.,(1997); Dullet al.,1998, Patentes de EE. UU. N.° 6.013.516; y 5.994.136, muchas de las cuales pueden adaptarse para producir un vector viral o un plásmido de transferencia.
[0247] Como se utiliza en este documento, el término "agente" abarca poloxámeros, polímeros policatiónicos, estaurosporina, moléculas orgánicas pequeñas, prostaglandinas, potenciadores de AMPc, agonistas de la vía de Wnt, agonistas de la vía de AMPc/PI3K/AKT, agonistas de la vía del segundo mensajero de Ca2+, agonistas de señalización de óxido nítrico (NO)/angiotensina y productos químicos inorgánicos, incluidos, entre otros, todos los análogos y derivados de los mismos.
[0248] Una "molécula pequeña", "molécula orgánica pequeña" o "compuesto de molécula pequeña" se refiere a un compuesto de bajo peso molecular que tiene un peso molecular de menos de aproximadamente 5 kD, menos de aproximadamente 4 kD, menos de aproximadamente 3 kD, menos de aproximadamente 2 kD, menos de aproximadamente 1 kD o menos de aproximadamente 0,5 kD. Las moléculas pequeñas pueden incluir ácidos nucleicos, péptidos, peptidomiméticos, peptoides, otros compuestos orgánicos pequeños o fármacos y similares. En la técnica se conocen bibliotecas de mezclas químicas y/o biológicas, como extractos fúngicos, bacterianos o de algas, y se pueden analizar con cualquiera de los ensayos de la divulgación. Se pueden encontrar ejemplos de métodos para la síntesis de bibliotecas moleculares en: (Carellet al.,1994a; Carellet al.,1994b; Choet al.,1993; DeWittet al.,1993; Gallopet al.,1994; Zuckermannet al.,1994).
[0249] En referencia a agentes, tales como moléculas orgánicas, "análogo" o "derivado" se refiere a una molécula que es similar a otra sustancia química en estructura y función, a menudo difiriendo estructuralmente por un solo elemento o grupo, pero puede diferir por la modificación de más de un grupo (por ejemplo, 2, 3 o 4 grupos) si conserva la misma función que la sustancia química original. Dichas modificaciones son rutinarias para los expertos en la materia, e incluyen, por ejemplo, fracciones químicas adicionales o sustituidas, tales como ésteres o amidas de un ácido, grupos protectores tales como un grupo bencilo para un alcohol o tiol, y grupos tercbutoxicarbonilo para una amina. También se incluyen modificaciones en las cadenas laterales de alquilo, tales como sustituciones de alquilo (por ejemplo, metilo, dimetilo, etilo, etc.), modificaciones en el nivel de saturación o insaturación de las cadenas laterales, y la adición de grupos modificados tales como fenilo sustituido y fenoxi. Los derivados también pueden incluir conjugados, tales como fracciones de biotina o avidina, enzimas tales como peroxidasa de rábano picante y similares, e incluir fracciones radiomarcadas, bioluminiscentes, quimioluminiscentes o fluorescentes. Además, se pueden añadir fracciones a los agentes descritos en este documento para alterar sus propiedades farmacocinéticas, tales como aumentar la vida mediain vivooex vivo,o para aumentar sus propiedades de penetración celular, entre otras propiedades deseables. También se incluyen profármacos, que se sabe que mejoran numerosas cualidades deseables de los productos farmacéuticos (por ejemplo, solubilidad, biodisponibilidad, fabricación, etc.) (véase, por ejemplo, WO/2006/047476 para profármacos agonistas de EP ejemplares).
[0250] Como se utiliza en el presente documento, los términos "polinucleótido" o "ácido nucleico" se refieren a ADN genómico (gADN), ADN complementario (cADN) o ADN. Los polinucleótidos incluyen polinucleótidos monocatenarios y bicatenarios, ya sean recombinantes, sintéticos o aislados. El término polinucleótido puede referirse a ARN mensajero (ARNm), ARN, ARN genómico (gARN), ARN de cadena positiva (ARN(+)), ARN de cadena negativa (ARN(-)). Como se utiliza en el presente documento, los términos "polirribonucleótido" o "ácido ribonucleico" también se refieren a ARN mensajero (ARNm), ARN, ARN genómico (gARN), ARN de cadena positiva (ARN(+)), ARN de cadena negativa (ARN(-)) y ARN inhibidores, incluidos, entre otros, ARNsi, ARNsh, ARNpi, miARN o microARN, y ARNsh incrustados en una estructura principal de microARN (shmir). Preferentemente, los polinucleótidos pueden incluir polinucleótidos o variantes que tienen al menos aproximadamente un 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con cualquiera de las secuencias de referencia descritas en el presente documento (véase, por ejemplo, el listado de secuencias), normalmente donde la variante mantiene al menos una actividad biológica de la secuencia de referencia. Se pueden contemplar secuencias de polinucleótidos de plásmidos de transferencia y vectores virales y composiciones que las comprenden. Se pueden contemplar polinucleótidos que codifican un polipéptido terapéutico que incluye, entre otros, un polipéptido de globina, un polipéptido de globina antidrepanocítico, un polipéptido de adenosina desaminasa, un polipéptido gamma del receptor de interleucina 2, un polipéptido de tripeptidil peptidasa 1, un polipéptido de alfa-L iduronidasa, un polipéptido de iduronato 2-sulfatasa o un polipéptido de casete de unión a ATP, subfamilia D (ALD), miembro 1 (ABCD1), como se analiza en otra parte del presente documento.
[0251] Tal como se utilizan en el presente documento, los términos "variante de polinucleótido" y "variante" y similares se refieren a polinucleótidos que muestran una identidad de secuencia sustancial con una secuencia de polinucleótido de referencia o polinucleótidos que se hibridan con una secuencia de referencia en condiciones rigurosas que se definen a continuación. Estos términos incluyen polinucleótidos en los que se han añadido o eliminado uno o más nucleótidos, o se han reemplazado con nucleótidos diferentes en comparación con un polinucleótido de referencia. En este sentido, se entiende bien en la técnica que se pueden realizar ciertas alteraciones, que incluyen mutaciones, adiciones, eliminaciones y sustituciones, en un polinucleótido de referencia, por lo que el polinucleótido alterado conserva la función o actividad biológica del polinucleótido de referencia.
[0252] Como se utiliza en el presente documento, el término "aislado" significa material, por ejemplo, un polinucleótido, un polipéptido, una célula, que está sustancialmente o esencialmente libre de componentes que normalmente lo acompañan en su estado nativo. El término "obtenido" o "derivado" puede utilizarse como sinónimo de aislado. Por ejemplo, un "polinucleótido aislado", como se utiliza en el presente documento, se refiere a un polinucleótido que ha sido purificado a partir de las secuencias que lo flanquean en un estado natural, por ejemplo, un fragmento de ADN que ha sido eliminado de las secuencias que normalmente están adyacentes al fragmento.
[0253] Los términos que describen la orientación de los polinucleótidos incluyen: 5' (normalmente el extremo del polinucleótido que tiene un grupo fosfato libre) y 3' (normalmente el extremo del polinucleótido que tiene un grupo hidroxilo (OH) libre). Las secuencias de polinucleótidos se pueden anotar en la orientación 5' a 3' o en la orientación 3' a 5'.
[0254] Los términos "complementario" y "complementariedad" se refieren a polinucleótidos (es decir, una secuencia de nucleótidos) relacionados por las reglas de emparejamiento de bases. Por ejemplo, la cadena complementaria de la secuencia de ADN 5' AGTCATG 3' es 3' t Ca g Ta C 5'. La última secuencia se escribe a menudo como el complemento inverso con el extremo 5' a la izquierda y el extremo 3' a la derecha, 5' CATGACT 3'. Una secuencia que es igual a su complemento inverso se dice que es una secuencia palindrómica. La complementariedad puede ser "parcial", en la que solo algunas de las bases de los ácidos nucleicos coinciden de acuerdo con las reglas de emparejamiento de bases. O bien, puede haber complementariedad "completa" o "total" entre los ácidos nucleicos.
[0255] El término "casete de ácido nucleico" o "casete de expresión" como se utiliza en el presente documento se refiere a secuencias genéticas dentro del vector que pueden expresar un ARN y, posteriormente, un polipéptido. El casete de ácido nucleico puede contener un gen o genes de interés, por ejemplo, un polinucleótido o polinucleótidos de interés. El casete de ácido nucleico puede contener una o más secuencias de control de expresión, por ejemplo, un promotor, un potenciador, una secuencia poli(A) y un gen o genes de interés, por ejemplo, un polinucleótido o polinucleótidos de interés. Los vectores pueden comprender uno, dos, tres, cuatro, cinco o más casetes de ácido nucleico. El casete de ácido nucleico está orientado posicional y secuencialmente dentro del vector de tal manera que el ácido nucleico en el casete puede transcribirse en ARN y, cuando sea necesario, traducirse en una proteína o un polipéptido, sufrir modificaciones postraduccionales apropiadas requeridas para la actividad en la célula transformada y ser translocado al compartimento apropiado para la actividad biológica mediante la orientación a compartimentos intracelulares apropiados o la secreción en compartimentos extracelulares. Preferiblemente, el casete tiene sus extremos 3' y 5' adaptados para una fácil inserción en un vector, por ejemplo, tiene sitios de endonucleasa de restricción en cada extremo. El casete de ácido nucleico puede contener la secuencia de un gen terapéutico utilizado para tratar, prevenir o mejorar un trastorno genético. El casete puede extraerse e insertarse en un plásmido o vector viral como una sola unidad.
[0256] Como se utiliza en el presente documento, el término "polinucleótido(s) de interés" se refiere a uno o más polinucleótidos, por ejemplo, un polinucleótido que codifica un polipéptido (es decir, un polipéptido de interés), insertado en un vector de expresión que se desea expresar. Los vectores y/o plásmidos pueden comprender uno o más polinucleótidos de interés, por ejemplo, un polinucleótido que codifica un polipéptido de globina, un polipéptido de globina antidrepanocítico, un polipéptido de adenosina desaminasa, un polipéptido gamma del receptor de interleucina 2, un polipéptido de tripeptidil peptidasa 1, un polipéptido de alfa-L iduronidasa, un polipéptido de iduronato 2-sulfatasa o un polipéptido de casete de unión a ATP, subfamilia D (ALD), miembro 1 (ABCD1). Un polinucleótido de interés puede codificar un polipéptido que proporciona un efecto terapéutico en el tratamiento, la prevención o la mejora de una enfermedad o trastorno hematopoyético, al que se puede denominar "polipéptido terapéutico", por ejemplo, un gen de globina. Véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. 6.051.402 y 7.901.671.
[0257] Un polinucleótido de interés puede codificar un polipéptido que proporciona un efecto terapéutico en el tratamiento, prevención o mejora de una adrenoleucodistrofia o adrenomieloneuropatía, al que se puede hacer referencia como un "polipéptido terapéutico", por ejemplo, un gen ABCD1. Véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. 5.869.039; y 6.013.769.
[0258] El término "globina" como se utiliza en el presente documento se refiere a proteínas o subunidades proteínicas que son capaces de unirse covalentemente o no covalentemente a una fracción de hemo, y por lo tanto pueden transportar o almacenar oxígeno. Las subunidades de hemoglobinas de vertebrados e invertebrados, mioglobinas de vertebrados e invertebrados o mutantes de las mismas se incluyen en el término globina. El término excluye las hemocianinas. Los ejemplos de globinas incluyen a-globina o una variante de la misma, p-globina o una variante de la misma, una Y-globina o una variante de la misma, y 5-globina o una variante de la misma.
[0259] El polinucleótido de interés puede ser un transgén que codifica un polipéptido que proporciona una función terapéutica para el tratamiento de una hemoglobinopatía, por ejemplo, a-globina, Y-globina, p-globina o p-globina antidrepanocítica, por ejemplo, p-globinaA'T87Q. Los polinucleótidos de interés y los polipéptidos codificados a partir de ellos incluyen tanto polinucleótidos que codifican polipéptidos de tipo salvaje como variantes funcionales y fragmentos de los mismos. Una variante funcional puede tener al menos un 80 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad con una secuencia polipeptídica o polinucleotídica de referencia de tipo salvaje correspondiente. Una variante o fragmento funcional puede tener al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 %, al menos un 100 %, o al menos un 110% o más de una actividad biológica de un polipéptido de tipo salvaje correspondiente. Las secuencias de polinucleótidos representativas incluyen, entre otras, polinucleótidos que codifican a-globina, p-globina, p-globinaA'T87Q, globinas antifalciformes, Y-globina y 5-globina.
[0260] Los polinucleótidos, independientemente de la longitud de la secuencia codificante en sí, se pueden combinar con otras secuencias de ADN, como promotores y/o potenciadores, regiones no traducidas (UTR), secuencias Kozak, señales de poliadenilación, sitios de enzimas de restricción adicionales, sitios de clonación múltiple, sitios de entrada ribosomal interna (IRES), sitios de reconocimiento de recombinasa (por ejemplo, sitios LoxP, FRT y Att), codones de terminación, señales de terminación transcripcional y polinucleótidos que codifican polipéptidos autoescindibles, etiquetas de epítopos, como se describe en otra parte del presente documento o como se conoce en la técnica, de modo que su longitud total puede variar considerablemente. Por lo tanto, se contempla que se puede emplear un fragmento de polinucleótido de casi cualquier longitud, estando la longitud total preferiblemente limitada por la facilidad de preparación y uso en el protocolo de ADN recombinante previsto.
[0261] El término "secuencia de control de expresión" se refiere a una secuencia de polinucleótidos que comprende uno o más promotores, potenciadores u otros elementos de control transcripcional o combinaciones de los mismos que son capaces de dirigir, aumentar, regular o controlar la transcripción o expresión de un polinucleótido unido operativamente. Los vectores pueden comprender una o más secuencias de control de expresión que son específicas para células, tipos de células o linajes celulares particulares, por ejemplo, células diana; es decir, la expresión de polinucleótidos unidos operativamente a una secuencia de control de expresión específica para células, tipos de células o linajes celulares particulares se expresa en células diana y no en otras células no diana. Cada una de las una o más secuencias de control de expresión en un vector que son específicas de la célula puede expresarse en el mismo tipo de células o en diferentes tipos de células dependiendo de la terapia deseada. Los vectores pueden comprender una o más secuencias de control de expresión específicas para células hematopoyéticas, por ejemplo, células madre o progenitoras hematopoyéticas. Los vectores pueden comprender una o más secuencias de control de expresión específicas para células hematopoyéticas y/o eritroides.
[0262] El término "promotor" como se utiliza en el presente documento se refiere a un sitio de reconocimiento de un polinucleótido (ADN o ARN) al que se une una ARN polimerasa. El término "potenciador" se refiere a un segmento de ADN que contiene secuencias capaces de proporcionar una transcripción mejorada y puede funcionar independientemente de su orientación con respecto a otra secuencia de control. Un potenciador puede funcionar de forma cooperativa o aditiva con promotores y/u otros elementos potenciadores. El término "promotor/potenciador" se refiere a un segmento de ADN que contiene secuencias capaces de proporcionar funciones tanto de promotor como de potenciador.
[0263] Un vector puede comprender secuencias de control exógenas, endógenas o heterólogas, tales como promotores y/o potenciadores. Una secuencia de control "endógena" es una que está naturalmente ligada a un gen dado en el genoma. Una secuencia de control "exógena" es una que se coloca en yuxtaposición a un gen por medio de manipulación genética (es decir, técnicas de biología molecular) de manera que la transcripción de ese gen está dirigida por el potenciador/promotor ligado. Una secuencia de control "heteróloga" es una secuencia exógena que es de una especie diferente a la célula que se está manipulando genéticamente. Una secuencia de control "sintética" puede comprender elementos de una o más secuencias endógenas y/o exógenas, y/o secuencias determinadasin vitroo in silico que proporcionan una actividad promotora y/o potenciadora óptima para la terapia génica particular.
[0264] El término "unido de manera operativa" se refiere a una yuxtaposición en la que los componentes descritos se encuentran en una relación que les permite funcionar de la manera prevista. El término puede referirse a un enlace funcional entre una secuencia de control de expresión de ácido nucleico (tal como un promotor y/o potenciador u otra secuencia de control de expresión) y una segunda secuencia de polinucleótidos, por ejemplo, un polinucleótido de interés, en donde la secuencia de control de expresión dirige la transcripción del ácido nucleico correspondiente a la segunda secuencia.
[0265] Como se utiliza en el presente documento, el término "secuencia de control de expresión constitutiva" se refiere a un promotor, potenciador o promotor/potenciador que permite de forma continua o continua la transcripción de una secuencia unida operativamente. Una secuencia de control de expresión constitutiva puede ser un promotor, potenciador o promotor/potenciador "ubicuo" que permite la expresión en una amplia variedad de tipos de células y tejidos o un promotor, potenciador o promotor/potenciador "específico de célula", "específico de tipo celular", "específico de linaje celular" o "específico de tejido" que permite la expresión en una variedad restringida de tipos de células y tejidos, respectivamente. Las secuencias de control de expresión ubicuas ilustrativas incluyen, entre otras, un promotor temprano inmediato del citomegalovirus (CMV), un virus simio viral 40 (SV40)(p. ej.,temprano o tardío), un promotor LTR del virus de la leucemia murina de Moloney (MoMLV), un LTR del virus del sarcoma de Rous (RSV), un promotor del virus del herpes simple (HSV) (timidina quinasa), promotores H5, P7.5 y P11 del virus vaccinia, un promotor del factor de elongación 1-alfa (EF1a), respuesta de crecimiento temprano 1 (EGR1), ferritina H (FerH), ferritina L (FerL), gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH), factor de iniciación de la traducción eucariota 4A1 (EIF4A1), proteína de choque térmico de 70 kDa 5 (HSPA5), proteína de choque térmico de 90 kDa beta, miembro 1 (HSP90B 1), proteína de choque térmico de 70 kDa (HSP70), p-kinesina (p-KlN), el locus humano ROSA 26 (Irions et al., (2007) Nature Biotechnology 25, 1477 - 1482), un promotor de ubiquitina C (UBC), un promotor de fosfoglicerato quinasa-1 (PGK), un promotor de citomegalovirus/p-actina de pollo (CAG) y un promotor de p-actina.
[0266] Puede ser deseable utilizar una secuencia de control de expresión específica de una célula, un tipo de célula, un linaje celular o un tejido para lograr una expresión específica de un tipo de célula, un linaje o un tejido de una secuencia de polinucleótido deseada (por ejemplo, para expresar un ácido nucleico particular que codifica un polipéptido solo en un subconjunto de tipos de células, linajes celulares o tejidos o durante etapas específicas de desarrollo).
[0267] Ejemplos ilustrativos de promotores específicos de tejido incluyen, pero no se limitan a: un promotor B29 (expresión de células B), un promotor del factor de transcripción runt (CBFa2) (expresión específica de células madre), un promotor CD14 (expresión de células monocíticas), un promotor CD43 (expresión de leucocitos y plaquetas), un promotor CD45 (expresión de células hematopoyéticas), un promotor CD68 (expresión de macrófagos), un promotor CYP450 3A4 (expresión de hepatocitos), un promotor de desmina (expresión muscular), un promotor de elastasa 1 (expresión de células acinares pancreáticas), un promotor de endoglina (expresión de células endoteliales), un promotor de proteína 1 específica de fibroblastos (FSP1) (expresión de células de fibroblastos), un promotor de fibronectina (expresión de células de fibroblastos), un promotor de tirosina quinasa 1 relacionada con fms (FLT1) (expresión de células endoteliales), un promotor de glial promotor de proteína ácida fibrilar (GFAP) (expresión de astrocitos), un promotor de insulina (expresión de células beta pancreáticas), un promotor de integrina alfa 2b (ITGA2B) (megacariocitos), un promotor de molécula de adhesión intracelular 2 (ICAM-2) (células endoteliales), un promotor de interferón beta (IFN-p) (células hematopoyéticas), un promotor de queratina 5 (expresión de queratinocitos), un promotor de mioglobina (MB) (expresión muscular), un promotor de diferenciación miogénica 1 (MYOD1) (expresión muscular), un promotor de nefrina (expresión de podocitos), un promotor de proteína gamma-carboxiglutamato ósea 2 (OG-2) (expresión de osteoblastos), un promotor de 3-oxoácido CoA transferasa 2B (Oxct2B), (expresión de espermátidas haploides), un promotor de proteína surfactante B (SP-B) (expresión pulmonar), un promotor de sinapsina (expresión neuronal), un promotor de la proteína del síndrome de Wiskott-Aldrich (WASP) (expresión de células hematopoyéticas).
[0268] Un vector puede comprender uno o más promotores y/o potenciadores específicos de tejido o célula hematopoyética seleccionados del grupo que consiste en: un promotor de p-globina humana; un LCR de p-globina humana; y un potenciador HS40 de a-globina humana y un promotor de anquirina-1, unidos operativamente a un polinucleótido que codifica un polipéptido de globina.
[0269] Un vector puede comprender un promotor activo en una célula microglial, unido operativamente a un polinucleótido que codifica un polipéptido de la subfamilia D, miembro 1 (ABCD1) del casete de unión a ATP. El promotor puede comprender un promotor potenciador del virus del sarcoma mieloproliferativo, región de control negativa eliminada, sitio de unión del cebador dl587rev sustituido (MND) o un fragmento transcripcionalmente activo del mismo.
[0270] Como se utiliza en el presente documento, "expresión condicional" puede referirse a cualquier tipo de expresión condicional, incluyendo, pero sin limitarse a expresión inducible; expresión reprimible; expresión en células o tejidos que tienen un estado fisiológico, biológico o patológico particular, etc. Esta definición no pretende excluir la expresión específica de un tipo de célula o tejido. Puede haber expresión condicional de un polinucleótido de interés, por ejemplo, la expresión se controla sometiendo una célula, tejido, organismo, etc., a un tratamiento o condición que hace que se exprese el polinucleótido o que causa un aumento o disminución en la expresión del polinucleótido codificado por el polinucleótido de interés.
[0271] Ejemplos ilustrativos de promotores/sistemas inducibles incluyen, pero no se limitan a promotores inducibles por esteroides tales como promotores para genes que codifican receptores de glucocorticoides o estrógenos (inducibles por tratamiento con la hormona correspondiente), promotor de metalotionina (inducible por tratamiento con varios metales pesados), promotor MX-1 (inducible por interferón), el sistema regulable por mifepristona "GeneSwitch" (Sirin et al., (2003) Gene, 323:67), el interruptor genético inducible por cumato (WO 2002/088346), sistemas reguladores dependientes de tetraciclina,etc.
[0272] La expresión condicional también se puede lograr utilizando una recombinasa de ADN específica del sitio. Un vector puede comprender al menos uno (normalmente dos) sitios para la recombinación mediada por una recombinasa específica del sitio. Tal como se utiliza En este documento, los términos "recombinasa" o "recombinasa de sitio específico" incluyen proteínas excisivas o integradoras, enzimas, cofactores o proteínas asociadas que están involucradas en reacciones de recombinación que involucran uno o más sitios de recombinación (por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco, siete, diez, doce, quince, veinte, treinta, cincuenta, etc.), que pueden ser proteínas de tipo salvaje(verLandy, (1993) Current Opinion in Biotechnology 3:699-707), o mutantes, derivados (por ejemplo, proteínas de fusión que contienen las secuencias de proteínas de recombinación o fragmentos de las mismas), fragmentos y variantes de las mismas. Los ejemplos ilustrativos de recombinasas incluyen, entre otros: Cre, Int, IHF, Xis, Flp, Fis, Hin, Gin, OC31, Cin, Tn3 resolvasa, TndX, XerC, XerD, TnpX, Hjc, Gin, SpCCE1 y ParA.
[0273] Los vectores pueden comprender uno o más sitios de recombinación para cualquiera de una amplia variedad de recombinasas específicas de sitio. Se debe entender que el sitio objetivo para una recombinasa específica de sitio es además de cualquier sitio(s) requerido(s) para la integración de un vector, por ejemplo, un vector lentiviral. Tal como se utilizan en el presente documento, los términos "secuencia de recombinación", "sitio de recombinación" o "sitio de recombinación específico de sitio" se refieren a una secuencia de ácido nucleico particular a la que una recombinasa reconoce y se une.
[0274] Por ejemplo, un sitio de recombinación para la recombinasa Cre es loxP, que es una secuencia de 34 pares de bases que comprende dos repeticiones invertidas de 13 pares de bases (que sirven como sitios de unión de la recombinasa) que flanquean una secuencia central de 8 pares de bases (véase la FIG. 1 de Sauer, B., (1994) Current Opinion in Biotechnology 5:521-527). Otros sitios loxP ejemplares incluyen, pero no se limitan a: lox511 (Hoesset al.,1996; Bethke y Sauer, 1997), lox5171 (Lee y Saito, 1998), lox2272 (Lee y Saito, 1998), m2 (Langeret al.,2002), lox71 (Albertet al.,1995) y lox66 (Albertet al.,1995).
[0275] Los sitios de reconocimiento adecuados para la recombinasa FLP incluyen, pero no se limitan a: FRT (McLeod,et al.,1996), F1, F2, F3 (Schlake y Bode, 1994), F4, F5 (Schlake y Bode, 1994), FRT(LE) (Senecoffet al.,1988), FRT(RE) (Senecoffet al.,1988).
[0276] Otros ejemplos de secuencias de reconocimiento son las secuencias attB, attP, attL y attR, que son reconocidas por la enzima recombinasa A Integrasa, por ejemplo, phi-c31. El SSR $C31 media la recombinación solo entre los sitios heterotípicos attB (34 pb de longitud) y attP (39 pb de longitud) (Grothet al.,2000). attB y attP, llamados así por los sitios de unión para la integrasa del fago en los genomas bacteriano y del fago, respectivamente, ambos contienen repeticiones invertidas imperfectas que probablemente estén unidas por homodímeros $C31 (Grothet al.,2000). Los sitios de producto, attL y attR, son efectivamente inertes a una recombinación mediada por $C31 adicional (Beltekiet al.,2003), lo que hace que la reacción sea irreversible. Para catalizar las inserciones, se ha descubierto que el ADN portador de attB se inserta en un sitio genómico attP con mayor facilidad que un sitio attP en un sitio genómico attB (Thyagarajanet al.,2001; Beltekiet al.,2003). Por lo tanto, las estrategias típicas posicionan mediante recombinación homóloga un "sitio de acoplamiento" portador de attP en un locus definido, que luego se asocia con una secuencia entrante portadora de attB para la inserción.
[0277] Como se utiliza en el presente documento, un "sitio de entrada interna al ribosoma" o "IRES" se refiere a un elemento que promueve la entrada interna directa al ribosoma al codón de iniciación, como ATG, de un cistrón (una región codificante de proteínas), lo que conduce de ese modo a la traducción independiente de la tapa del gen. Véase, por ejemplo, Jackson et al., (1990) Trends Biochem Sci 15(12):477-83) y Jackson y Kaminski. (1995) RNA 1(10):985-1000. Un vector puede incluir uno o más polinucleótidos de interés que codifican uno o más polipéptidos. Para lograr una traducción eficiente de cada uno de la pluralidad de polipéptidos, las secuencias de polinucleótidos pueden estar separadas por una o más secuencias IRES o secuencias de polinucleótidos que codifican polipéptidos autoescindibles.
[0278] Como se utiliza en el presente documento, el término "secuencia de Kozak" se refiere a una secuencia de nucleótidos corta que facilita en gran medida la unión inicial del ARNm a la subunidad pequeña del ribosoma y aumenta la traducción. La secuencia de consenso de Kozak es (GCC)RCCATGG, donde R es una purina (A o G) (Kozak, (1986) Cell. 44(2):283-92, y Kozak, (1987) Nucleic Acids Res. 15(20):8125-48). Los vectores pueden comprender polinucleótidos que tienen una secuencia de consenso de Kozak y que codifican un polipéptido deseado.
[0279] Los vectores pueden comprender un gen de selección, también denominado marcador seleccionable. Los genes de selección típicos codifican proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina, higromicina, metotrexato, zeocina, blastocidina o tetraciclina, (b) complementan deficiencias auxotróficas o (c) suministran nutrientes críticos no disponibles en medios complejos, por ejemplo, el gen que codifica la D-alanina racemasa para Bacilli. Se puede utilizar cualquier número de sistemas de selección para recuperar líneas celulares transformadas. Estos incluyen, pero no se limitan a los genes de la timidina quinasa del virus del herpes simple (Wigler et al., (1977) Cell 11:223-232) y de la adenina fosforribosiltransferasa (Lowy et al., (1990) Cell 22:817-823) que se pueden emplear en células tk o aprt, respectivamente.
[0280] Los vectores pueden utilizarse para aumentar, establecer y/o mantener la expresión de uno o más polipéptidos. Los términos "polipéptido" y "proteína" se utilizan indistintamente en el presente documento para referirse a un polímero de residuos de aminoácidos y a variantes y análogos sintéticos del mismo. Por lo tanto, estos términos se aplican a polímeros de aminoácidos en los que uno o más residuos de aminoácidos son aminoácidos sintéticos que no se producen de forma natural, como un análogo químico de un aminoácido de origen natural correspondiente, así como a polímeros de aminoácidos de origen natural. Los ejemplos ilustrativos de polipéptidos incluyen, pero no se limitan a polipéptidos de globina. También,véanse,por ejemplo, las patentes de EE. UU. 6.051.402; 7.901.671; y 9.068.199.
[0281] Ejemplos ilustrativos de polipéptidos también incluyen polipéptidos ABCD1. Véase también, por ejemplo, las patentes de EE. UU. 5.869.039; 6.013.769; 8.858.928; y 9.061.031.
[0282] Otros ejemplos ilustrativos de polipéptidos incluyen, entre otros, un polipéptido de globina, un polipéptido de globina antidrepanocítico, un polipéptido de adenosina desaminasa, un polipéptido gamma del receptor de interleucina 2, un polipéptido de tripeptidil peptidasa 1, un polipéptido de alfa-L iduronidasa, un polipéptido de iduronato 2-sulfatasa o un polipéptido de casete de unión a ATP, subfamilia D (ALD), miembro 1 (ABCD1).
[0283] Estos también pueden incluir "variantes" de polipéptidos. La "variante" de polipéptido de recitación se refiere a polipéptidos que se distinguen de un polipéptido de referencia por la adición, eliminación, truncamiento, modificación y/o sustitución de al menos un residuo de aminoácido, y que conservan una actividad biológica. Una variante de polipéptido se puede distinguir de un polipéptido de referencia por una o más sustituciones, que pueden ser conservadoras o no conservadoras, como se conoce en la técnica.
[0284] Un polipéptido variante puede incluir una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más de identidad o similitud de secuencia con una secuencia correspondiente de un polipéptido de referencia. Las adiciones o eliminaciones de aminoácidos se producen en el extremo C-terminal y/o en el extremo N-terminal del polipéptido de referencia.
[0285] Como se ha indicado anteriormente, los polipéptidos pueden alterarse de diversas maneras, incluidas sustituciones, deleciones, truncamientos e inserciones de aminoácidos. Los métodos para dichas manipulaciones son generalmente conocidos en la técnica. Por ejemplo, las variantes de la secuencia de aminoácidos de un polipéptido de referencia pueden prepararse mediante mutaciones en el ADN. Los métodos para la mutagénesis y las alteraciones de la secuencia de nucleótidos son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Kunkel (1985) Proc. Natl. Sci. EE. UU.. 82: 488-492, Kunkel et al., (1987) Methods in Enzymol, 154: 367-382, Patente de EE. UU. N.° 4.873.192, Watson, JD et al., (1987) Molecular Biology of the Gene, Cuarta edición, Benjamin/Cummings, Menlo Park, California, y las referencias citadas en el mismo. Se pueden encontrar instrucciones sobre sustituciones de aminoácidos adecuadas que no afecten la actividad biológica de la proteína de interés en el modelo de Dayhoff et al., (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, DC).
[0286] Una "célula huésped" incluye células transfectadas, infectadas o transducidasin vivo, ex vivooin vitrocon un vector recombinante o un polinucleótido contemplado en el presente documento. Las células huésped pueden incluir células de empaquetamiento, células productoras y células infectadas con vectores virales. Las células huésped infectadas con un vector viral pueden administrarse a un sujeto que necesita terapia. El término "célula diana" puede usarse indistintamente con célula huésped y se refiere a células transfectadas, infectadas o transducidas de un tipo celular deseado. La célula diana puede ser una célula madre o una célula progenitora. La célula diana puede ser una célula somática, por ejemplo, una célula madre adulta, una célula progenitora o una célula diferenciada. La célula diana puede ser una célula hematopoyética, por ejemplo, una célula madre o progenitora hematopoyética. Se analizan otras células diana terapéuticas, más adelante.
[0287] Las células diana pueden ser una célula primaria. El término "célula primaria" como se utiliza en el presente documento se conoce en la técnica para referirse a una célula que ha sido aislada de un tejido y se ha establecido para el crecimientoin vitrooex vivo.Las células correspondientes han experimentado muy pocas duplicaciones de población, si es que las ha experimentado, y por lo tanto son más representativas del componente funcional principal del tejido del que se derivan en comparación con las líneas celulares continuas, representando así un modelo más representativo del estadoin vivo.Los métodos para obtener muestras de varios tejidos y los métodos para establecer líneas celulares primarias son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Jones y Wise, Methods Mol Biol. 1997). Las células primarias pueden derivarse, por ejemplo, de la sangre, linfoma y tumores epiteliales. La célula primaria puede ser una célula madre hematopoyética o progenitora.
[0288] El término "célula madre" se refiere a una célula que es una célula indiferenciada capaz de (1) autorrenovación a largo plazo, o la capacidad de generar al menos una copia idéntica de la célula original, (2) diferenciación a nivel de célula única en múltiples, y a veces sólo un, tipo de célula especializada y (3) regeneración funcionalin vivode tejidos. Las células madre se subclasifican según su potencial de desarrollo como totipotentes, pluripotentes, multipotentes y oligo/unipotentes. "Autorrenovación" se refiere a una célula con una capacidad única para producir células hija inalteradas y para generar tipos de células especializadas (potencia). La autorrenovación se puede lograr de dos maneras. La división celular asimétrica produce una célula hija que es idéntica a la célula parental y una célula hija que es diferente de la célula parental y es una célula progenitora o diferenciada. La división celular simétrica produce dos células hija idénticas. La "proliferación" o "expansión" de células se refiere a células que se dividen simétricamente.
[0289] Tal como se utiliza en el presente documento, el término "progenitor" o "células progenitoras" se refiere a células que tienen la capacidad de autorenovarse y diferenciarse en células más maduras. Muchas células progenitoras se diferencian a lo largo de un único linaje, pero pueden tener una capacidad proliferativa bastante amplia.
[0290] Las células madre hematopoyéticas (HSC) dan lugar a células progenitoras hematopoyéticas comprometidas (HPC) que son capaces de generar todo el repertorio de células sanguíneas maduras a lo largo de la vida de un organismo. El término "célula madre hematopoyética" o "HSC" se refiere a células madre multipotentes que dan lugar a todos los tipos de células sanguíneas de un organismo, incluyendo mieloides (por ejemplo, monocitos y macrófagos, neutrófilos, basófilos, eosinófilos, eritrocitos, megacariocitos/plaquetas, células dendríticas), y linajes linfoides (por ejemplo, células T, células B, células NK), y otros conocidos en la técnica (véase Fei, R., et al., Patente de EE. UU. N.° 5.635.387; McGlave, et al., Patente de EE. UU. N.° 5.460.964; Simmons, P., et al., Patente de EE. UU. N.° 5.677.136; Tsukamoto, et al., Patente de EE. UU. N.° 5.750.397; Schwartz, et al., Patente de EE. UU. N.° 5.759.793; DiGuisto, et al., patente de EE. UU. n.° 5.681.599; Tsukamoto, et al., patente de EE. UU. n.° 5.716.827). Cuando se trasplantan a animales o seres humanos irradiados letalmente, las células madre y progenitoras hematopoyéticas pueden repoblar el conjunto de células hematopoyéticas eritroides, neutrófilos, macrófagos, megacariocitos y linfoides.
[0291] La producción de partículas virales a gran escala es a menudo necesaria para lograr un título viral razonable. Las partículas virales se producen transfectando un vector de transferencia en una línea celular de empaquetamiento que comprende genes virales estructurales y/o accesorios, por ejemplo, genes gag, pol, env, tat, rev, vif, vpr, vpu, vpx o nef u otros genes retrovirales.
[0292] Como se utiliza en el presente documento, el término "vector de empaquetamiento" se refiere a un vector de expresión o vector viral que carece de una señal de empaquetamiento y comprende un polinudeótido que codifica uno, dos, tres, cuatro o más genes virales estructurales y/o accesorios. Normalmente, los vectores de empaquetamiento se incluyen en una célula de empaquetamiento y se introducen en la célula mediante transfección, transducción o infección. Los métodos de transfección, transducción o infección son bien conocidos por los expertos en la materia. Un vector de transferencia lentiviral contemplado puede introducirse en una línea celular de empaquetamiento, mediante transfección, transducción o infección, para generar una célula productora o una línea celular. Los vectores de empaquetamiento pueden introducirse en células o líneas celulares humanas mediante métodos estándar que incluyen, por ejemplo, transfección con fosfato de calcio, lipofección o electroporación. Los vectores de empaquetamiento pueden introducirse en las células junto con un marcador seleccionable dominante, como neomicina, higromicina, puromicina, blastocidina, zeocina, timidina quinasa, DHFR, Gln sintetasa o ADA, seguido de la selección en presencia del fármaco apropiado y el aislamiento de clones. Un gen marcador seleccionable puede vincularse físicamente a genes que codifica el vector de empaquetamiento, por ejemplo, mediante IRES o péptidos virales autoescindibles.
[0293] Las proteínas de la envoltura viral (env) determinan el rango de células hospedadoras que pueden ser infectadas y transformadas en última instancia por retrovirus recombinantes generados a partir de las líneas celulares. En el caso de lentivirus, tales como VIH-1, VIH-2, SIV, FIV y EIV, las proteínas env incluyen gp41 y gp120. Preferentemente, las proteínas env virales expresadas por células de empaquetamiento están codificadas en un vector separado de los genes gag y pol virales, como se ha descrito previamente.
[0294] Ejemplos ilustrativos de genes env derivados de retrovirus que pueden emplearse incluyen, pero no se limitan a: envolturas de MLV, envoltura de 10A1, BAEV, FeLV-B, RD114, S<s>AV, Ébola, Sendai, FPV (virus de la peste aviar) y envolturas del virus de la gripe. De manera similar, pueden utilizarse genes que codifican envolturas de virus de ARN (por ejemplo, familias de virus de ARN de Picomaviridae, Calciviridae, Astroviridae, Togaviridae, Flaviviridae, Coronaviridae, Paramyxoviridae, Rhabdoviridae, Filoviridae, Orthomyxoviridae, Bunyaviridae, Arenaviridae, Reoviridae, Birnaviridae, Retroviridae) así como de virus de ADN (familias de Hepadnaviridae, Circoviridae, Parvoviridae, Papovaviridae, Adenoviridae, Herpesviridae, Poxyiridae e Iridoviridae). Los ejemplos representativos incluyen FeLV, VEE, HFVW, WDSV, SFV, Rabia, ALV, BIV, BLV, EBV, VAEC, SNV, ChTLV, STLV, MPMV, SMRV, RAV, FuSV, MH2, AEV, AMV, CT10 y VAIE.
[0295] Las proteínas de envoltura para pseudotipificar un virus pueden incluir, pero no pueden limitarse a cualquiera de los siguientes virus: Influenza A, como H1N1, H1N2, H3N2 y H5N1 (gripe aviar), Influenza B, virus de la Influenza C, virus de la Hepatitis A, virus de la Hepatitis B, virus de la Hepatitis C, virus de la Hepatitis D, virus de la Hepatitis E, Rotavirus, cualquier virus del grupo de los virus Norwalk, adenovirus entéricos, parvovirus, virus de la fiebre del dengue, viruela del mono, Mononegavirales, Lyssavirus como el virus de la rabia, virus del murciélago de Lagos, virus Mokola, virus Duvenhage, virus del murciélago europeo 1 y 2 y virus del murciélago australiano, Ephemerovirus, Vesiculovirus, Virus de la estomatitis vesicular (VSV), Herpesvirus como el virus del herpes simple tipos 1 y 2, varicela zóster, citomegalovirus, virus de Epstein-Barr (VEB), herpesvirus humanos (HHV), herpesvirus humano tipo 6 y 8, virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), virus del papiloma, gammaherpesvirus murino, Arenavirus como el virus de la fiebre hemorrágica argentina, virus de la fiebre hemorrágica boliviana, virus de la fiebre hemorrágica asociada a Sabia, virus de la fiebre hemorrágica venezolana, virus de la fiebre de Lassa, virus Machupo, virus de la coriomeningitis linfocítica (LCMV), Bunyaviridiae como Virus de la fiebre hemorrágica de Crimea-Congo, Hantavirus, virus causante de fiebre hemorrágica con síndrome renal, virus de la fiebre del Valle del Rift, Filoviridae (filovirus) incluyendo la fiebre hemorrágica del Ébola y la fiebre hemorrágica de Marburgo, Flaviviridae incluyendo el virus de la enfermedad del bosque de Kaysanur, virus de la fiebre hemorrágica de Omsk, virus causante de encefalitis transmitida por garrapatas y Paramyxoviridae como el virus Hendra y el virus Nipah, viruela mayor y viruela menor (viruela), alfavirus como el virus de la encefalitis equina venezolana, el virus de la encefalitis equina del este, el virus de la encefalitis equina del oeste, coronavirus asociado al SARS (SARS-CoV), virus del Nilo Occidental, cualquier virus causante de encefalitis.
[0296] Se pueden contemplar células de empaquetamiento que producen retrovirus recombinantes, por ejemplo, lentivirus, pseudotipados con la glicoproteína VSV-G.
[0297] Los términos "pseudotipo" o "pseudotipificación" como se utilizan en el presente documento, se refieren a un virus cuyas proteínas de envoltura viral se han sustituido por las de otro virus que posee características preferibles. Por ejemplo, el VIH puede seudotipificarse con proteínas de envoltura de la proteína G del virus de la estomatitis vesicular (VSV-G), lo que permite al VIH infectar una gama más amplia de células porque las proteínas de envoltura del VIH (codificadas por el gen env) normalmente dirigen el virus a las células presentadoras de CD4+. Las proteínas de envoltura lentivirales pueden seudotipificarse con VSV-G. Las células de empaquetamiento pueden producir retrovirus recombinantes, por ejemplo, lentivirus, seudotipificados con la glicoproteína de envoltura VSV-G.
[0298] Como se utiliza en el presente documento, el término "líneas celulares de empaquetamiento" se utiliza en referencia a líneas celulares que no contienen una señal de empaquetamiento, pero que expresan de manera estable o transitoria proteínas estructurales virales y enzimas de replicación (por ejemplo, gag, pol y env) que son necesarias para el empaquetamiento correcto de partículas virales. Se puede emplear una línea celular adecuada para preparar células de empaquetamiento. Generalmente, las células son células de mamífero. Las células utilizadas para producir la línea celular de empaquetamiento pueden ser células humanas. Las líneas celulares adecuadas que pueden utilizarse incluyen, por ejemplo, células CHO, células BHK, células MDCK, células C3H 10T1/2, células FLY, células Psi-2, células Bo s C 23, células PA317, células WEHI, células COS, células BSC 1, células BSC 40, células BMT 10, células VERO, células W138, células MRC5, células A549, células HT1080, células 293, células 293T, células B-50, células 3T3, células NIH3T3, células HepG2, células Saos-2, células Huh7, células HeLa, células W163, células 211 y células 211A. Las células de empaquetamiento pueden ser células 293, células 293T, células 293F o células A549.
[0299] Como se utiliza en el presente documento, el término "línea celular productora" se refiere a una línea celular que es capaz de producir partículas retrovirales recombinantes, que comprende una línea celular de empaquetamiento y un constructo de vector de transferencia que comprende una señal de empaquetamiento. La producción de partículas virales infecciosas y soluciones madre virales se puede llevar a cabo utilizando técnicas convencionales. Los métodos de preparación de soluciones madre virales son conocidos en la técnica y se ilustran, por ejemplo, en Y. Soneoka et al. (1995) Nucl. Acids Res. 23:628-633, y NR Landau et al. (1992) J. Virol. 66:5110-5113. Las partículas virales infecciosas se pueden recolectar de las células de empaquetamiento utilizando técnicas convencionales. Por ejemplo, las partículas infecciosas se pueden recolectar mediante lisis celular o recolección del sobrenadante del cultivo celular, como se conoce en la técnica. Opcionalmente, las partículas virales recolectadas se pueden purificar si se desea. Las técnicas de purificación adecuadas son bien conocidas por los expertos en la materia, por ejemplo, Kutner et al., BMC Biotechnol. 2009;9:10. doi: 10.1186/1472-6750-9-10; Kutner et al. Nat. Protoc. 2009;4(4):495-505. doi: 10.1038/nprot.2009.22.
[0300] Por "mejorar" o "promover", o "aumentar" o "expandir" se hace referencia en general a la capacidad de las composiciones y/o métodos contemplados en este documento para obtener, causar o producir un mayor número de células transducidas en comparación con el número de células transducidas por el vehículo o una molécula/composición de control. Una célula madre o progenitora hematopoyética transducida con composiciones y métodos contemplados en este documento puede comprender un aumento en el número de células transducidas en comparación con las composiciones y métodos de transducción existentes. Los aumentos en la transducción celular se pueden determinar utilizando métodos conocidos en la técnica, como ensayos de reporteros, RT-PCR y expresión de proteínas de la superficie celular, entre otros. Una cantidad "aumentada" o "mejorada" de transducción es típicamente una cantidad "estadísticamente significativa", y puede incluir un aumento de 1,1, 1,2, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30 o más veces (por ejemplo, 500, 1000 veces) (incluidos todos los números enteros y puntos decimales entre y por encima de 1, por ejemplo, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, etc.) el número de células transducidas por el vehículo, una composición de control u otro método de transducción.
[0301] Por "disminuir" o "disminución", o "disminuido", o "reducir" o "abatir" se hace referencia generalmente a composiciones o métodos que dan como resultado comparativamente menos células transducidas en comparación con las células transducidas con composiciones y/o métodos descritos en este documento. Una cantidad "disminuida" o "reducida" de células transducidas es típicamente una cantidad "estadísticamente significativa", y puede incluir una disminución que es 1,1, 1,2, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30 o más veces (por ejemplo, 500, 1000 veces) (incluyendo todos los números enteros y puntos decimales entre y por encima de 1, por ejemplo, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, etc.) el número de células transducidas (respuesta de referencia) producida por composiciones y/o métodos descritos en este documento.
[0302] Por "mantener", o "preservar", o "mantenimiento" o "ningún cambio", "ningún cambio sustancial" o "ninguna disminución sustancial" se refiere generalmente a una respuesta fisiológica que es comparable a una respuesta causada por un vehículo, una molécula/composición de control o la respuesta en una célula particular. Una respuesta comparable es aquella que no es significativamente diferente o mediblemente diferente de la respuesta de referencia.
[0303] En la siguiente descripción, se exponen ciertos detalles específicos para proporcionar una comprensión completa de varias formas de realización ilustrativas de la invención contemplada en el presente documento. Sin embargo, un experto en la materia entenderá que se pueden poner en práctica formas de realización ilustrativas particulares sin estos detalles. Además, se debe entender que los vectores individuales, o grupos de vectores, derivados de las diversas combinaciones de las estructuras y sustituyentes descritos en el presente documento, se divulgan en la presente solicitud en la misma medida que si cada vector o grupo de vectores se expusiera individualmente. Por lo tanto, la selección de estructuras de vector particulares o sustituyentes particulares está dentro del alcance de la presente invención.
C. AGENTES
[0304] En diversas formas de realización, la eficiencia de transducción aumenta significativamente al poner en contacto las células,in vitro, ex vivo o in vivo,con un lentivirus y poloxámero 407. En diversas formas de realización, la eficiencia de transducción aumenta significativamente al poner en contacto las células,in vitro, ex vivo o in vivo,con un lentivirus y poloxámero 407, opcionalmente en combinación con uno o más polímeros o péptidos policatiónicos. En diversas formas de realización, la eficiencia de transducción aumenta significativamente al poner en contacto las células,in vitro, ex vivo o in vivo,con un lentivirus, poloxámero 407 y prostaglandina E<2>(PGE<2>) o 16,16-dimetil PGE<2>, opcionalmente en combinación con estaurosporina, opcionalmente en combinación con uno o más polímeros o péptidos policatiónicos.
1. AGONISTAS DE LA VÍA DE SEÑALIZACIÓN DEL RECEPTOR EP DE PROSTAGLANDINA
[0305] Sorprendentemente, los presentes inventores han descubierto que la eficiencia de transducción y/o NCV de poblaciones de células que comprenden células madre y progenitoras hematopoyéticas se pueden aumentar cultivando las células en presencia de un retrovirus, un poloxámero y uno o más agentes que estimulan la vía de señalización del receptor EP de prostaglandina, y análogos y derivados de los mismos.
[0306] Los agentes que estimulan la señalización del receptor EP de prostaglandina incluyen, pero no se limitan a moléculas pequeñas o aquellos compuestos divulgados en los documentos WO 2007/112084 y WO2010/108028. Tal como se utilizan en el presente documento, los términos "estimular la señalización del receptor EP de prostaglandina", "activar la señalización del receptor EP de prostaglandina" o "aumentar la señalización del receptor EP de prostaglandina" se refieren generalmente a la capacidad de un agente para aumentar la actividad de señalización celular aguas abajo de un receptor EP de prostaglandina en la célula en contacto con uno o más agentes en comparación con la actividad de señalización celular aguas abajo del receptor EP de prostaglandina en ausencia de uno o más agentes. Los ensayos que se pueden utilizar para medir la activación o estimulación de la vía de señalización del receptor EP de prostaglandina son conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en el documento WO2010/108028.
[0307] Ejemplos ilustrativos de agentes que estimulan la vía de señalización del receptor EP de prostaglandina incluyen, pero no se limitan a moléculas pequeñas, por ejemplo, moléculas orgánicas pequeñas, prostaglandinas, agonistas de la vía Wnt, agonistas de la vía cAMP/PI3K/AKT, agonistas de la vía del segundo mensajero Ca2+, agonistas de señalización de óxido nítrico (NO)/angiotensina y otros compuestos conocidos por estimular la vía de señalización de prostaglandina seleccionados del grupo que consiste en: Mebeverina, Flurandrenolida, Atenolol, Pindolol, Gaboxadol, Ácido Quinurénico, Hidralazina, Tiabendazol, Biculina, Vesamicol, Peruvosida, Imipramina, Clorpropamida, 1,5-Pentametilentetrazol, 4-Aminopiridina, Diazóxido, Benfotiamina, Ácido 12-Metoxi-dodecenoico, N-Formil-Met-Leu-Phe, Galamina, IAA 94, clorotrianiseno y derivados de estos compuestos.
[0308] Las prostaglandinas se relacionan generalmente con moléculas similares a hormonas que se derivan de ácidos grasos que contienen 20 átomos de carbono, incluido un anillo de 5 carbonos, como se describe en este documento y se conoce en la técnica.
[0309] En esta invención, el agente que estimula una vía del receptor EP de prostaglandina es PGE<2>o 16,16-dimetil PGE2.
[0310] En una forma de realización, el agente que estimula una vía del receptor EP de prostaglandina es PGE<2>.
[0311] En esta invención, se cultiva una población de células en presencia de un vector lentiviral, prostaglandina E<2>(PGE<2>) o 16,16-dimetil PGE<2>y poloxámero 407.
[0312] En esta invención, el poloxámero es el poloxámero 407.
2. ESTAUROSPORINA
[0313] Estaurosporina, un alcaloide producido en las estaurosporas deStreptomycesoriginalmente como un agente antifúngico en 1977. La estaurosporina es un inhibidor de la proteína quinasa de amplio espectro, que inhibe quinasas como, por ejemplo, la proteína quinasa C (PKC), la proteína quinasa dependiente de AMPc (PKA), la quinasa de fosforilasa, la proteína quinasa<s>6 ribosomal, la quinasa del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGF-R) y la proteína quinasa II dependiente de Ca2+/calmodulina (Ca/CaM PKII). La potencia de inhibición es más fuerte para la PKC (CI<50>= 2,7 nM) pero varias veces menor para otras proteínas quinasas. La estaurosporina exhibe una fuerte citotoxicidad para algunas líneas celulares tumorales de mamíferos, induce la apoptosis celular y detiene la elongación de las células de levadura de fisión específicamente en una etapa inmediatamente posterior a la división celular.
[0314] Sorprendentemente, los presentes inventores también han descubierto que la eficiencia de transducción y/o NCV de poblaciones de células que comprenden células madre y progenitoras hematopoyéticas se pueden aumentar cultivando las células en presencia de un retrovirus, un poloxámero y estaurosporina, y análogos y derivados de los mismos.
[0315] En esta invención, el poloxámero es el poloxámero 407.
3. POLOXÁMEROS Y POLÍMEROS POLICATIÓNICOS
[0316] "Poloxámero" se refiere a un copolímero de tribloque no iónico compuesto por una cadena hidrófoba central de polioxipropileno flanqueada por dos cadenas hidrófilas de polioxietileno. Los poloxámeros también se conocen con el nombre comercial de "Pluronics" o "Synperonics" (BASF). El copolímero de bloque se puede representar mediante la siguiente fórmula: HO(C<2>H<40>)x(C<3>H<60>)y(C<2>H<40>)zH.
[0317] Las longitudes de los bloques de polímero se pueden personalizar; como resultado, existen muchos poloxámeros diferentes. Por lo tanto, el término "poloxámero" como se usa en el presente documento se puede usar indistintamente con el término "poloxámeros" (que representa una entidad de varios poloxámeros, también denominado mezcla de poloxámeros) si no se indica explícitamente lo contrario. El término "promedio" en relación con el número de unidades monoméricas o el peso molecular de (un) poloxámero(s) como se usa en el presente documento es una consecuencia de la incapacidad técnica para producir poloxámeros que tengan todos la misma composición y, por lo tanto, el mismo peso molecular. Los poloxámeros producidos de acuerdo con los métodos de última generación estarán presentes como una mezcla de poloxámeros que muestran cada uno una variabilidad en cuanto a su peso molecular, pero la mezcla en su conjunto promedia el peso molecular especificado en el presente documento. BASF y Sigma Aldrich son fuentes adecuadas de poloxámeros para su uso en formas de realización particulares contempladas en el presente documento.
[0318] Los inventores han descubierto sorprendentemente que los poloxámeros como se definen en este documento solos o en combinación con un agente que estimula la vía de señalización del receptor EP de prostaglandina o estaurosporina mejoran significativamente la eficiencia de transducción y/o NCV de vectores retrovirales en células objetivo adherentes y en suspensión sin afectar esencialmente su viabilidad.
[0319] En esta invención, el poloxámero adecuado para su uso es el poloxámero 407.
[0320] En esta invención, se utiliza poloxámero 407 (F127; HO(C2H40)x(C3H60)y(C2H40)zH; x+y=200,45, z=65,17; peso molecular promedio de 12,6 kDa) para aumentar la eficiencia de transducción y/o NCV en una población de células hematopoyéticas que comprende células madre o progenitoras hematopoyéticas. F127 se puede utilizar solo o en combinación con un agente que estimule la vía de señalización del receptor EP de prostaglandina o estaurosporina para aumentar la eficiencia de transducción y/o NCV.
[0321] "Polímeros policatiónicos" se refiere a polímeros cargados cuyas unidades repetitivas tienen una carga positiva, en donde la carga positiva en una unidad repetitiva proviene de fracciones de nitrógeno protonadas. Ejemplos ilustrativos de polímeros policatiónicos que son adecuados para su uso en formas de realización particulares contempladas en este documento incluyen, pero no se limitan a polietilenimina (PEI), copolímero de bloque de poli(etilenglicol)-poli(L-lisina) (PEG-PLL), 1,5-dimetil- ,5-diaza-undeca-metil-polimetobromuro (Polybrene), péptidos policatiónicos, por ejemplo, poli-L-lisina y sulfato de protamina.
D. VECTORES VIRALES
[0322] Se han probado vectores retrovirales y lentivirales y se ha descubierto que son vehículos de administración adecuados para la introducción estable de genes de interés, por ejemplo, que codifican polipéptidos terapéuticos, en el genoma de una amplia gama de células diana. Las formas de realización particulares contempladas en el presente documento proporcionan una eficiencia de transducción mejorada y/o NCV de vectores de terapia génica a una población de células que se administran a un sujeto para proporcionar terapia génica.
[0323] En una forma de realización, el vector es un vector de transferencia. Si bien el experto en la materia apreciará que dichos vectores de transferencia pueden producirse utilizando una variedad de vectores virales diferentes, en formas de realización particulares, el vector de transferencia es un vector lentiviral, en parte porque los vectores lentivirales son capaces de proporcionar una administración, integración y expresión a largo plazo eficientes de transgenes en células que no se dividen tantoin vitrocomoin vivo.Se conocen diversos vectores lentivirales en la técnica, véase Naldiniet al.,(1996a, 1996b y 1998); Zuffereyet al.,(1997); Dullet al.,1998, Patentes de EE. UU. N.° 6.013.516; y 5.994.136, cualquiera de las cuales puede adaptarse para producir un vector de transferencia contemplado en el presente documento.
[0324] En general, estos vectores se basan en plásmidos o virus, y están configurados para transportar las secuencias esenciales para la transferencia de un ácido nucleico que codifica un polipéptido terapéutico a una célula huésped.
[0325] En esta invención, el vector es un vector lentiviral. Por lo tanto, los vectores pueden derivarse del virus de inmunodeficiencia humana-1 (VIH-1), el virus de inmunodeficiencia humana-2 (VIH-2), el virus de inmunodeficiencia de simios (VIS), el virus de inmunodeficiencia felina (VIF), el virus de inmunodeficiencia bovina (VIB), el virus de la enfermedad de Jembrana (VJD), el virus de la anemia infecciosa equina (VAIE), el virus de la artritis-encefalitis caprina (VECA) y similares. Las estructuras principales de los vectores basados en el VIH (es decir, los elementos de secuencia que actúan en cis del VIH y los genes gag, pol y rev del VIH) son generalmente preferibles en relación con la mayoría de los aspectos de la presente invención, ya que las construcciones basadas en el VIH son las más eficientes en la transducción de células humanas.
[0326] Aunque las formas de realización ilustrativas particulares incluyen una descripción más detallada de vectores, composiciones y métodos utilizados para corregir trastornos hematopoyéticos, por ejemplo, hemoglobinopatías, las formas de realización contempladas en el presente documento no deben considerarse limitadas por esta divulgación. Un experto en la materia apreciará fácilmente que los principios ilustrados en el presente documento pueden aplicarse a la terapia génica en otros sistemas, por ejemplo, el sistema nervioso, incluido el ojo, el sistema nervioso central y el sistema nervioso periférico; el sistema circulatorio; el sistema muscular; el sistema esquelético; órganos, incluidos la piel, el corazón, los pulmones, el páncreas, el hígado, el riñón, el intestino y similares.
[0327] En una forma de realización, los vectores comprenden una secuencia de control de expresión que dirige la expresión de un polinucleótido de interés, por ejemplo, un gen de globina, en un tipo de célula o linaje celular particular. El uso de una secuencia de control de expresión de un tipo de célula o linaje celular ofrece ventajas de seguridad al restringir la expresión de polinucleótidos a una etapa deseada de diferenciación celular en un único linaje; y por lo tanto, los vectores de la invención alivian las preocupaciones relacionadas con la expresión ectópica de polipéptidos en tipos de células no deseados.
[0328] En un ejemplo no limitante, la secuencia de control de expresión puede ser una secuencia de control de expresión ubicua como se describe en otra parte del presente documento.
[0329] En otro ejemplo no limitante, la secuencia de control de expresión puede ser una secuencia de control de expresión específica de células madre que dirige la expresión específica de células madre del polinucleótido de interés en una célula madre embrionaria, una célula madre neural, una célula madre mesenquimal, una célula madre hepática, una célula madre pancreática, una célula madre cardíaca, una célula madre renal o una célula madre hematopoyética.
[0330] En otro ejemplo no limitante, la secuencia de control de expresión puede ser una secuencia de control de expresión específica de un tipo de célula o de un linaje celular que dirige la expresión del polinucleótido de interés en una célula madre hematopoyética, una célula progenitora hematopoyética, una célula mieloide, una célula linfoide, un linaje trombopoyético, un mastocito, una célula de linaje eritropoyético, una célula de linaje granulopoyético y una célula de linaje monocitopoyético.
[0331] En casos particulares, un vector contemplado en el presente documento expresa un polinucleótido, p. ej., gen de interés en una o más o todas las células hematopoyéticas, incluyendo, pero sin limitarse a células madre hematopoyéticas, células progenitoras hematopoyéticas, progenitores mieloides, progenitores linfoides, progenitores trombopoyéticos, progenitores eritroides, progenitores granulopoyéticos, progenitores monocitopoyéticos, megacarioblastos, promegacariocitos, megacariocitos, trombocitos/plaquetas, proeritroblastos, eritroblastos basófilos, eritroblastos policromáticos, eritroblastos ortocromáticos, eritrocitos policromáticos, eritrocitos (RBC), promielocitos basófilos, mielocitos basófilos, metamielocitos basófilos, basófilos, promielocitos neutrófilos, mielocitos, metamielocitos neutrófilos, neutrófilos, promielocitos eosinofílicos, mielocitos eosinofílicos, macrófagos, células dendríticas, linfoblastos, prolinfocitos, células asesinas naturales (NK), linfocitos pequeños, linfocitos T, linfocitos B, células plasmáticas y células dendríticas linfoides.
[0332] En formas de realización preferidas, un vector expresa un polinucleótido, por ejemplo, un gen de interés en una o más células eritroides, por ejemplo, proeritroblasto, eritroblasto basófilo, eritroblasto policromático, eritroblasto ortocromático, eritrocito policromático y eritrocito (RBC).
[0333] En una forma de realización, el vector comprende un promotor, potenciador o promotor/potenciador de células hematopoyéticas unido operativamente a un gen de interés, por ejemplo, globina.
[0334] Las secuencias de control de expresión específicas de un tipo celular o linaje celular adecuadas incluyen, entre otras, secuencias de control de expresión de células hematopoyéticas, tales como, por ejemplo, un promotor de células madre hematopoyéticas y un promotor de células progenitoras hematopoyéticas. En formas de realización en las que se desea la expresión del gen de interés en una o más células eritroides, una secuencia de control de expresión de células hematopoyéticas adecuada puede incluir, entre otras, un promotor específico de células eritroides y, opcionalmente, un potenciador específico de células eritroides, un promotor de p-globina humana, un LCR de p-globina humana o un potenciador de HS40 de a-globina humana y un promotor de anquirina-1.
[0335] En una forma de realización, las secuencias de control de expresión específicas de un tipo celular o linaje celular adecuadas incluyen, entre otros, un promotor activo en una célula microglial. En ciertas formas de realización, el promotor comprende un promotor MND o un fragmento transcripcionalmente activo del mismo, unido operativamente a un gen de interés, por ejemplo, ABCD1.
[0336] El uso de una secuencia de control de expresión de un tipo celular o linaje celular ofrece ventajas de seguridad al restringir la expresión de polinucleótidos a esta etapa deseada de diferenciación celular en un único linaje; y por lo tanto, los vectores contemplados en el presente documento alivian las preocupaciones relacionadas con la expresión ectópica de polipéptidos en tipos de células no deseados. En una forma de realización, un vector comprende uno o más LTR y una secuencia de control de expresión unida operativamente a un gen de interés. En una forma de realización relacionada, la secuencia de control de expresión es una secuencia de control de expresión específica de células eritroides que se selecciona del grupo que consiste en: un promotor de p-globina humana; un LCR de p-globina humana; y un potenciador HS40 de a-globina humana y un promotor de anquirina-1.
[0337] En diversas formas de realización, el diseño del vector se realizará con el objetivo de tratar, prevenir o mejorar una enfermedad, trastorno o afección hematopoyética particular. Por ejemplo, la presente invención contempla vectores para terapia génica de hemoglobinopatías que comprenden un gen de interés seleccionado del grupo que consiste en: a-globina humana, p-globina humana, 5-globina humana y Y-globina humana, o variantes biológicamente activas o fragmentos de las mismas. En una forma de realización, el gen de globina se selecciona del grupo que consiste en un gen de p-globina humana de tipo salvaje, un gen de p-globina humana eliminado que comprende una o más deleciones de secuencias de intrones y un gen de p-globina humana mutado que codifica al menos un residuo de aminoácido antidrepanocítico.
[0338] En una forma de realización particular, en la que la afección que se está tratando es una hemoglobinopatía, por ejemplo, una talasemia o una enfermedad de células falciformes, el gen de interés puede ser una proteína antidrepanocítica. Tal comoseutiliza en el presente documento, "proteína antidrepanocítica" se refiere a un polipéptido que previene o revierte los eventos patológicos que conducen a la drepanocitosis de los eritrocitos en las afecciones de células falciformes. En una forma de realización de la invención, las células transducidas de la invención se utilizan para administrar proteínas antidrepanocíticas a un sujeto con una afección hemoglobinopática. Las proteínas antidrepanocíticas también incluyen genes de p-globina mutados que comprenden residuos de aminoácidos antidrepanocíticos.
[0339] En una forma de realización preferida, una de dichas variantes de globina es el gen de pA-globina humana que codifica una mutación de treonina a glutamina en el codón 87 (pA-T87Q) o un gen de pA-globina humana (la forma madura del polipéptido de globina se ha procesado por escisión de la metionina N-terminal, el codón 87 del polipéptido de globina maduro es treonina; el codón 88 del polipéptido de globina de longitud completa, no escindido es treonina). Otros residuos de aminoácidos antidrepanocíticos son conocidos en la técnica y pueden ser útiles en la presente invención. Por ejemplo, véase la Patente de EE. UU. 6.051.402; la Patente de EE. UU. 5.861.488; la Patente de EE. UU. 6.670.323; la Patente de EE. UU. 5.864.029; la Patente de EE. UU. 5.877.288; y Levasseur et al., Blood 102:4312-4319 (2003).
[0340] En ciertas formas de realización, se utiliza un vector que comprende una secuencia de control de expresión específica de eritroides para tratar, prevenir o mejorar una gran cantidad de trastornos que se extienden mucho más allá de las hemoglobinopatías. Los precursores de glóbulos rojos son una población celular útil en la que se pueden expresar polipéptidos que se pueden secretar en la circulación y, por lo tanto, administrar sistémicamente. Un ejemplo de dicha administración de proteínasin vivoes el factor IX humano, un factor de coagulación que falta en pacientes con hemofilia B, véase, por ejemplo, AH Chang, et al., Molecular Therapy (2008).
[0341] En una forma de realización, las células transducidas con vectores de la invención se pueden utilizar como "fábricas" para la secreción de proteínas,in vitro, ex vivooin vivo.Por ejemplo, un vector que comprende una secuencia de control de expresión específica de células eritroides se puede utilizar para la producciónin vitroa gran escala de proteínas a partir de células eritroides diferenciadas a partir de HSC o de células madre embrionarias.
[0342] Los polinucleótidos de interés que podrían expresarse de esta manera incluyen, pero no se limitan a: adenosina desaminasa, las enzimas afectadas en enfermedades de almacenamiento lisosomal, apolipoproteína E, factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), proteína morfogenética ósea 2 (BMP-2), proteína morfogenética ósea 6 (BMP-6), proteína morfogenética ósea 7 (B<m>P-7), cardiotrofina 1 (CT-1), CD22, CD40, factor neurotrófico ciliar (CNTF), CCL1-CCL28, CXCL1-CXCL17, CXCL1, CXCL2, CX3CL1, factor de crecimiento de células endoteliales vasculares (VEGF), dopamina, eritropoyetina, factor IX, factor VIII, factor de crecimiento epidérmico (EGF), estrógeno, ligando FAS, factor de crecimiento de fibroblastos 1 (FGF-1), factor de crecimiento de fibroblastos 2 (FGF-2), factor de crecimiento de fibroblastos 4 (FGF-4), factor de crecimiento de fibroblastos 5 (FGF-5), factor de crecimiento de fibroblastos 6 (FGF-6), factor de crecimiento de fibroblastos 1 (FGF-7), factor de crecimiento de fibroblastos 1 (FGF-10), Flt-3, factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), factor estimulante de granulocitos y macrófagos (GM-CSF), hormona del crecimiento, factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), interferón alfa (IFN-a), interferón beta (IFN-b), interferón gamma (IFNg), insulina, glucagón, factor de crecimiento similar a la insulina 1 (IGF-1), factor de crecimiento similar a la insulina 2 (IGF-2), interleucina 1 (IL-1), interleucina 2 (IL-2), interleucina 3 (IL-3), interleucina 4 (IL-4), interleucina 5 (IL-5), interleucina 6 (IL-6), interleucina 7 (IL-7), interleucina 8 (IL-8), interleucina 9 (IL-9), interleucina 10 (IL-10), interleucina 11 (IL-11), interleucina 12 (IL-12), interleucina 13 (IL-13), interleucina 15 (IL-15), interleucina 17 (IL-17), interleucina 19 (IL-19), factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF), proteína quimiotáctica de monocitos 1 (MCP-1), proteína inflamatoria de macrófagos 3a (MIP-3a), proteína inflamatoria de macrófagos 3b (MIP-3b), factor de crecimiento nervioso (NGF), neurotrofina 3 (NT-3), neurotrofina 4 (NT-4), hormona paratiroidea, factor de crecimiento derivado de plaquetas AA (PDGFAA), factor de crecimiento derivado de plaquetas AB (PDGF-AB), factor de crecimiento derivado de plaquetas BB (PDGF-BB), factor de crecimiento derivado de plaquetas CC (PDGF-CC), factor de crecimiento derivado de plaquetas DD (p Dg F-DD), RANTES, factor de células madre (SCF), factor derivado de células estromales 1 (SDF-1), testosterona, factor de crecimiento transformante alfa (TGF-a), factor de crecimiento transformante beta (TGF-b), factor de necrosis tumoral alfa (TNF-a), Wnt1, Wnt2, Wnt2b/13, Wnt3, Wnt3a, Wnt4, Wnt5a, Wnt5b, Wnt6, Wnt7a, Wnt7b, Wnt7c, Wnt8, Wnt8a, Wnt8b, Wnt8c, Wnt10a, Wnt10b, Wnt11, Wnt14, Wnt15 o Wnt16, Sonic hedgehog, Desert hedgehog y Indian hedgehog.
[0343] En una forma de realización, un vector utilizado en la invención comprende al menos un LTR retroviral modificado o no modificado, por ejemplo, LTR lentiviral, un promotor de p-globina y una región de control del locus (LCR) de p-globina unida operativamente a un polinucleótido de interés, por ejemplo, que codifica un polipéptido de globina. Las modificaciones adecuadas de los LTR incluyen, pero no se limitan a: reemplazo del LTR 5' con un promotor heterólogo, por ejemplo, promotor de citomegalovirus (CMV), un promotor de virus del sarcoma de Rous (RSV), un promotor de timidina quinasa o un promotor de virus de simio 40 (SV40); y una o más modificaciones, adiciones y/o deleciones de un LTR 3' como se analiza en otra parte del presente documento.
[0344] En una forma de realización particular, la expresión específica eritroide de un polinucleótido se logra utilizando un promotor de p-globina humana, un LCR de p-globina que comprende uno o más de los sitios hipersensibles a la ADNasa I 2, 3 y 4 del LCR de p-globina humana, y/o un elemento potenciador 3' de p-globina humana.
[0345] En diversas formas de realización, un vector contemplado en este documento comprende uno o más elementos seleccionados del grupo que consiste en: una secuencia de empaquetamiento Psi (V+), un tracto de polipurina central/colgajo de ADN (cPPT/FLAP), un elemento de exportación retroviral, un elemento regulador postranscripcional, uno o más elementos aislantes, una secuencia de poliadenilación, un marcador seleccionable y un gen suicida celular, como se analiza en otra parte del presente documento.
[0346] En diversas formas de realización, un vector contemplado en el presente documento comprende un promotor operable en una célula hematopoyética unido operativamente a un gen que codifica un polipéptido que proporciona terapia para hemoglobinopatías. Los vectores pueden tener uno o más LTR, en donde cada LTR comprende una o más modificaciones, tales como una o más sustituciones, adiciones o deleciones de nucleótidos. Los vectores pueden comprender además uno o más elementos accesorios para aumentar la eficiencia de transducción (por ejemplo, un cPPT/FLAP), empaquetamiento viral (por ejemplo, una señal de empaquetamiento Psi (V), RRE) y/u otros elementos que aumentan la expresión génica terapéutica (por ejemplo, secuencias poli (A)).
[0347] En una forma de realización, un vector comprende un LTR retroviral izquierdo (5'), una secuencia de empaquetamiento Psi (V+), un tracto de polipurina central/colgajo de ADN (cPPT/FLAP), un elemento de exportación retroviral, un promotor de p-globina, una región de control del locus de p-globina (LCR) y, opcionalmente, un potenciador de p-globina 3' unido operativamente a un polinucleótido de interés, y un LTR retroviral derecho (3') que comprende uno o más elementos aisladores, o una secuencia de poliadenilación.
[0348] En una forma de realización particular, un vector es un vector lentiviral que comprende un LTR izquierdo (5') del VlH-1, una secuencia de empaquetamiento Psi (V+), un tracto de polipurina central/colgajo de<a>D<n>del VIH-1 (cPPT/FLAP), un elemento de respuesta rev (RRE), un promotor de p-globina, una región de control del locus de pglobina (LCR) y, opcionalmente, un potenciador de p-globina 3' unido operativamente a un polinucleótido de interés, y un LTR retroviral derecho (3') que comprende uno o más elementos aisladores y una secuencia de poliA de p-globina de conejo (rpgpA).
[0349] En diversas formas de realización, un vector contemplado en el presente documento comprende un promotor operable en una célula microglial unido operablemente a un gen que codifica un polipéptido que proporciona terapia para adrenoleucodistrofias y/o adrenomieloneuropatías. Los vectores pueden tener uno o más lTr , en donde cada LTR comprende una o más modificaciones, tales como una o más sustituciones, adiciones o deleciones de nucleótidos. Los vectores pueden comprender además uno o más elementos accesorios para aumentar la eficiencia de transducción (por ejemplo, un cPPT/FLAP), empaquetamiento viral (por ejemplo, una señal de empaquetamiento Psi (V), RRE), y/u otros elementos que aumentan la expresión génica terapéutica (por ejemplo, secuencias poli (A)).
[0350] En una forma de realización particular, un vector de transferencia contemplado en este documento comprende un LTR retroviral izquierdo (5'); un tracto de polipurina central/colgajo de ADN (cPPT/FLAP); un elemento de exportación retroviral; un promotor activo en una célula microglial, unido operativamente a un polinucleótido que codifica un polipéptido de casete de unión a ATP, subfamilia D, miembro 1 (ABCD1); y un LTR retroviral derecho (3').
[0351] En una determinada realización, un vector lentiviral contemplado en este documento comprende: un LTR izquierdo (5') del VIH-1; una señal de empaquetamiento Psi (V); un cPPT/FLAP; un RRE; un promotor MND, unido operativamente a un polinucleótido que codifica un polipéptido ABCD1 humano; un LTR autoinactivante (SIN) del VIH-1 derecho (3'); y una secuencia de poliadenilación de p-globina de conejo.
[0352] En formas de realización particulares, el vector lentiviral codifica un polipéptido del casete de unión a ATP, subfamilia D, miembro 1 (ABCD1).
[0353] En otras formas de realización, el vector lentiviral comprende un potenciador del virus del sarcoma mieloproliferativo, región de control negativo eliminada, promotor sustituido del sitio de unión del cebador d1587rev (MND) o un fragmento transcripcionalmente activo del mismo unido operativamente a un polinucleótido que codifica un polipéptido del casete de unión a ATP, subfamilia D, miembro 1 (ABCD1).
[0354] En ciertas formas de realización, el vector lentiviral codifica la adenosina desaminasa.
[0355] En ciertas formas de realización, el vector lentiviral comprende un promotor del factor de elongación 1 alfa unido operativamente a un polinucleótido que codifica la adenosina desaminasa.
[0356] En ciertas formas de realización, el vector lentiviral codifica el receptor de interleucina 2 gamma.
[0357] En ciertas formas de realización, el vector lentiviral comprende un promotor del factor de elongación 1 alfa unido operativamente a un polinucleótido que codifica el receptor de interleucina 2 gamma.
[0358] En formas de realización particulares, el vector lentiviral codifica la tripeptidil peptidasa 1.
[0359] En ciertas formas de realización, el vector lentiviral comprende un promotor del factor de elongación 1 alfa o comprende un potenciador del virus del sarcoma mieloproliferativo, región de control negativo eliminada, promotor sustituido por el sitio de unión del cebador d1587rev (MND) unido operativamente a un polinucleótido que codifica la tripeptidil peptidasa 1.
[0360] En formas de realización particulares, el vector lentiviral codifica la alfa-L iduronidasa.
[0361] En ciertas formas de realización, el vector lentiviral comprende un promotor del factor de elongación 1 alfa o comprende un potenciador del virus del sarcoma mieloproliferativo, región de control negativo eliminada, promotor sustituido por el sitio de unión del cebador d1587rev (MND) unido operativamente a un polinucleótido que codifica la alfa-L iduronidasa.
[0362] En formas de realización particulares, el vector lentiviral codifica iduronato 2-sulfatasa.
[0363] En ciertas formas de realización, el vector lentiviral comprende un promotor del factor de elongación 1 alfa o comprende un potenciador del virus del sarcoma mieloproliferativo, región de control negativo eliminada, promotor sustituido por el sitio de unión del cebador d1587rev (MND) unido operativamente a un polinucleótido que codifica iduronato 2-sulfatasa.
[0364] En ciertas formas de realización, el promotor comprende uno o más elementos de un LCR de p-globina humana.
[0365] En algunas formas de realización, el LCR de p-globina humana comprende el sitio hipersensible a la ADNasa I 2, 3 y 4 del LCR de p-globina humana.
[0366] En formas de realización particulares, el vector lentiviral comprende además un elemento potenciador 3' de pglobina humana.
[0367] En formas de realización adicionales, el gen de interés codifica una proteína antidrepanocítica o un gen de globina.
[0368] En formas de realización particulares, el gen de interés codifica una proteína p-globina humana, una proteína 5-globina humana, una proteína Y-globina humana, una proteína pA'T87Q-globina humana, una proteína pA-G16D/E22A/T87Q-globina humana o una proteína pA-T87Q/K95E/K120E-globina humana.
[0369] En formas de realización particulares, el vector lentiviral es un vector AnkT9W, un vector T9Ank2W, un vector TNS9, un vector de lentiglobina HPV569, un vector de lentiglobina BB305, un vector BG-1, un vector BGM-1, un vector d432pAY, un vector mLARpAYV5, un vector GLOBE, un vector G-GLOBE, un vector pAS3-FB, un vector V5, un vector V5m3, un vector V5m3-400, un vector G9 y un vector BCL11A shmir, véase, por ejemplo, la publicación de patente de EE. UU. n.° 20150307867; Arumugam y Malik, Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2010; 2010(1):445-50; Hoban et al., Blood. 2016 127:839-848; Scott y DeFrancesco, Nature Biotechnology 34, 600-607 (2016); Finotti et al., Journal of Blood Medicine. 2015:669-85; Pestina et al., Molecular Therapy. 2009; 17(2): 245-252.
[0370] El técnico experto apreciará que se pueden crear muchas otras formas de realización diferentes a partir de las instancias existentes de la divulgación.
E. COMPOSICIONES Y FORMULACIONES
[0371] Las formulaciones y composiciones contempladas en este documento pueden comprender una combinación de cualquier número de células transducidas o no transducidas o una combinación de las mismas, vectores virales, polipéptidos, polinucleótidos y uno o más agentes que aumentan la eficiencia de transducción y/o NCV, por ejemplo, poloxámeros, agentes que aumentan la señalización de prostaglandinas, estaurosporina, polímeros policatiónicos y péptidos policatiónicos, como se describe en este documento, formulados en soluciones farmacéuticamente aceptables o fisiológicamente aceptables (por ejemplo, mediodecultivo) para administración a una célula, tejido, órgano o un animal, ya sea solo o en combinación con una o más modalidades de terapia. Las composiciones incluyen, sin limitación, cultivos contemplados en este documento, y los términos composición y cultivo pueden usarse como sinónimos.
[0372] Las formulaciones y composicionesex vivo e in vitroparticulares contempladas en este documento pueden comprender una combinación de células transducidas o no transducidas o una combinación de las mismas, vectores virales y uno o más agentes que aumentan la eficiencia de transducción y/o NCV, por ejemplo, poloxámeros, agentes que aumentan la señalización de prostaglandina, estaurosporina, polímeros policatiónicos y péptidos policatiónicos, como se describe en este documento, formulados en soluciones farmacéuticamente aceptables o fisiológicamente aceptables (por ejemplo, medio de cultivo) para administración a una célula, tejido, órgano o un animal, ya sea solo o en combinación con una o más modalidades de terapia.
[0373] Las formulaciones y composicionesin vivoparticulares contempladas en este documento pueden comprender una combinación de vectores virales y uno o más agentes que aumentan la eficiencia de transducción y/o NCV, por ejemplo, poloxámeros, agentes que aumentan la señalización de prostaglandina, estaurosporina, polímeros policatiónicos y péptidos policatiónicos, como se describe en este documento, formulados en soluciones farmacéuticamente aceptables o fisiológicamente aceptables (por ejemplo, medio de cultivo) para administración a una célula, tejido, órgano o un animal, ya sea solo o en combinación con una o más modalidades de terapia.
[0374] En ciertas formas de realización, las composiciones contempladas en este documento comprenden una población de células que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de células transducidas, como se describe en este documento, formuladas junto con uno o más vehículos (aditivos) y/o diluyentes farmacéuticamente aceptables
(por ejemplo, medio de cultivo celular farmacéuticamente aceptable).
[0375] La presente invención proporciona composiciones que comprenden un vector y poloxámero 407, formulados junto con uno o más vehículos (aditivos) y/o diluyentes farmacéuticamente aceptables (por ejemplo, medio de cultivo celular farmacéuticamente aceptable).
[0376] En esta invención, la población de células comprende células madre y progenitoras hematopoyéticas. En esta invención, la población de células comprende células CD34+. En una forma de realización, la población de células son células seleccionadas CD34+.
[0377] En formas de realización preferidas, la población de células comprende células CD34+ que tienen uno de los siguientes alelos de p-globina: pE/p°, pC/p°, p°/p°, pE/pE, pC/p+, pE/p+, p°/p+, p+/p+, pC/pC, pE/pS, p°/pS, PS/pS.
[0378] En formas de realización preferidas, la población de células comprende células CD34+ que tienen uno de los siguientes alelos de p-globina: pE/p0, pC/p0, p<0>/p0, pC/pC, pE/pE, pE/p+, pC/pE, pC/p+, p<0>/p+ o p+/p+.
[0379] En formas de realización preferidas, la población de células comprende células CD34+ que tienen uno de los siguientes alelos de p-globina: pE/pS, p<0>/pS, pC/pS p+/pS o pS/pS.
[0380] Las composiciones farmacéuticas contempladas en este documento comprenden células transducidas producidas de acuerdo con los métodos descritos en este documento y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
[0381] En esta invención, las composiciones farmacéuticas comprenden un vector y poloxámero 407.
[0382] La frase "farmacéuticamente aceptable" se refiere a entidades moleculares y composiciones que no producen una reacción alérgica o similar adversa cuando se administran a un ser humano. El término "farmacéuticamente aceptable" puede significar que está aprobado por una agencia reguladora del gobierno federal o estatal o que figura en la Farmacopea de los EE. UU. u otra farmacopea generalmente reconocida para su uso en animales, y más particularmente en seres humanos.
[0383] El término "portador" se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente o vehículo con el que se administran las células terapéuticas. Ejemplos ilustrativos de portadores farmacéuticos pueden ser líquidos estériles, tales como medios de cultivo celular, agua y aceites, incluidos los de origen petrolífero, animal, vegetal o sintético, tales como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo y similares. También se pueden emplear soluciones salinas y soluciones acuosas de dextrosa y glicerol como portadores líquidos, particularmente para soluciones inyectables. Los excipientes farmacéuticos adecuados en formas de realización particulares incluyen almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, tiza, gel de sílice, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, talco, cloruro de sodio, leche desnatada en polvo, glicerol, propileno, glicol, agua, etanol y similares. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el ingrediente activo, se contempla su uso en las composiciones terapéuticas. También se pueden incorporar a las composiciones ingredientes activos complementarios.
[0384] En una forma de realización, una composición que comprende un portador es adecuada para administración parenteral, por ejemplo, administración intravascular (intravenosa o intraarterial), intraperitoneal o intramuscular. Los portadores farmacéuticamente aceptables incluyen soluciones acuosas estériles, medios de cultivo celular o dispersiones. El uso de dichos medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es bien conocido en la técnica. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con las células transducidas, se contempla su uso en las composiciones farmacéuticas.
[0385] En formas de realización particulares, las composiciones contempladas en el presente documento comprenden células madre y/o progenitoras hematopoyéticas modificadas genéticamente y un vehículo farmacéuticamente aceptable, por ejemplo, un medio de cultivo celular farmacéuticamente aceptable. Una composición que comprende una composición basada en células contemplada en el presentedocumentose puede administrar por separado mediante métodos de administración enteral o parenteral o en combinación con otros compuestos adecuados para lograr los objetivos de tratamiento deseados.
[0386] El portador farmacéuticamente aceptable debe tener una pureza suficientemente alta y una toxicidad suficientemente baja para que sea adecuado para su administración al sujeto humano que se está tratando. Además, debe mantener o aumentar la estabilidad de la composición. El portador farmacéuticamente aceptable puede ser líquido o sólido y se selecciona, teniendo en cuenta la forma de administración planificada, para proporcionar el volumen, la consistencia, etc. deseados, cuando se combina con otros componentes de la composición. Por ejemplo, el vehículo farmacéuticamente aceptable puede ser, sin limitación, un agente aglutinante (por ejemplo, almidón de maíz pregelatinizado, polivinilpirrolidona o hidroxipropilmetilcelulosa, etc.), un relleno (por ejemplo, lactosa y otros azúcares, celulosa microcristalina, pectina, gelatina, sulfato de calcio, etilcelulosa, poliacrilatos, hidrogenofosfato de calcio, etc.), un lubricante (por ejemplo, estearato de magnesio, talco, sílice, dióxido de silicio coloidal, ácido esteárico, estearatos metálicos, aceites vegetales hidrogenados, almidón de maíz, polietilenglicoles, benzoato de sodio, acetato de sodio, etc.), un desintegrante (por ejemplo, almidón, glicolato de almidón sódico, etc.), o un agente humectante (por ejemplo, lauril sulfato de sodio, etc.). Otros vehículos farmacéuticamente aceptables adecuados para las composiciones contempladas en este documento incluyen, pero no se limitan a agua, soluciones salinas, alcoholes, polietilenglicoles, gelatinas, amilosas, estearatos de magnesio, talcos, ácidos silícicos, parafinas viscosas, hidroximetilcelulosas, polivinilpirrolidonas y similares.
[0387] Dichas soluciones portadoras también pueden contener tampones, diluyentes y otros aditivos adecuados. El término "tampón" tal como se utiliza en el presente documento se refiere a una solución o líquido cuya composición química neutraliza los ácidos o bases sin un cambio significativo en el pH. Los ejemplos de tampones contemplados en el presente documento incluyen, entre otros, solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (PBS), solución de Ringer, dextrosa al 5 % en agua (D5W), solución salina normal/fisiológica (NaCl al 0,9 %).
[0388] Los vehículos y/o diluyentes farmacéuticamente aceptables pueden estar presentes en cantidades suficientes para mantener un pH de la composición terapéutica de aproximadamente 7. Alternativamente, la composición terapéutica tiene un pH en un intervalo de aproximadamente<6 ,8>a aproximadamente 7,4, por ejemplo,<6>,<8>, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3 y 7,4. En otra forma de realización más, la composición terapéutica tiene un pH de aproximadamente 7,4.
[0389] Las composiciones contempladas en el presente documento pueden comprender un medio farmacéuticamente aceptable y no tóxico. Las composiciones pueden ser una suspensión. El término "suspensión" tal como se utiliza en el presente documento se refiere a condiciones no adherentes en las que las células no están unidas a un soporte sólido. Por ejemplo, las células mantenidas como una suspensión pueden agitarse y no adherirse a un soporte, como una placa de cultivo.
[0390] En formas de realización particulares, las composiciones contempladas en el presente documento se formulan en una suspensión, donde las células madre y/o progenitoras hematopoyéticas se dispersan dentro de un medio o solución líquida aceptable, por ejemplo, medio salino o sin suero, en una bolsa intravenosa (IV) o similar. Los diluyentes aceptables incluyen, entre otros, agua, PlasmaLyte, solución de Ringer, solución isotónica de cloruro de sodio (salina), medio de cultivo celular sin suero y medio adecuado para almacenamiento criogénico, por ejemplo, medio Cryostor®.
[0391] En ciertas formas de realización, un portador farmacéuticamente aceptable está sustancialmente libre de proteínas naturales de origen humano o animal, y es adecuado para almacenar una composición que comprende una población de células, por ejemplo, células madre y progenitoras hematopoyéticas. La composición terapéutica está destinada a ser administrada a un paciente humano, y por lo tanto está sustancialmente libre de componentes de cultivo celular tales como albúmina de suero bovino, suero de caballo y suero bovino fetal.
[0392] En algunas formas de realización, las composiciones se formulan en un medio de cultivo celular farmacéuticamente aceptable. Dichas composiciones son adecuadas para la administración a sujetos humanos. En formas de realización particulares, el medio de cultivo celular farmacéuticamente aceptable es un medio sin suero.
[0393] El medio sin suero tiene varias ventajas sobre el medio que contiene suero, incluyendo una composición simplificada y mejor definida, un grado reducido de contaminantes, eliminación de una fuente potencial de agentes infecciosos y un menor costo. En varias formas de realización, el medio sin suero está libre de animales y opcionalmente puede estar libre de proteínas. Opcionalmente, el medio puede contener proteínas recombinantes biofarmacéuticamente aceptables. El medio "libre de animales" se refiere a un medio en el que los componentes se derivan de fuentes no animales. Las proteínas recombinantes reemplazan a las proteínas animales nativas en el medio libre de animales y los nutrientes se obtienen de fuentes sintéticas, vegetales o microbianas. El medio "libre de proteínas", por el contrario, se define como sustancialmente libre de proteínas.
[0394] Los ejemplos ilustrativos de medios sin suero utilizados en composiciones particulares incluyen, entre otros, QBSF-60 (Quality Biological, Inc.), StemPro-34 (Life Technologies) y X-VIVO 10.
[0395] En una forma de realización preferida, las composiciones que comprenden células madre y/o progenitoras hematopoyéticas se formulan en PlasmaLyte.
[0396] En diversas formas de realización, las composiciones que comprenden células madre y/o progenitoras hematopoyéticas se formulan en un medio de criopreservación. Por ejemplo, se pueden utilizar medios de criopreservación con agentes de criopreservación para mantener un alto resultado de viabilidad celular después de la descongelación. Ejemplos ilustrativos de medios de criopreservación utilizados en composiciones particulares incluyen, entre otros, CryoStor CS10, CryoStor CS5 y CryoStor CS2.
[0397] En una forma de realización, las composiciones se formulan en una solución que comprende 50:50 PlasmaLyte A a CryoStor CS 10.
[0398] En formas de realización particulares, la composición está sustancialmente libre de micoplasma, endotoxina y contaminación microbiana. Por "sustancialmente libre" con respecto a la endotoxina se entiende que hay menos endotoxina por dosis de células de lo que permite la FDA para un producto biológico, que es una endotoxina total de 5 UE/kg de peso corporal por día, que para una persona promedio de 70 kg es 350 UE por dosis total de células. En formas de realización particulares, las composiciones que comprenden células madre o progenitoras hematopoyéticas transducidas con un vector contemplado en este documento contienen aproximadamente 0,5 UE/mL a aproximadamente 5,0 UE/mL, o aproximadamente 0,5 UE/mL, 1,0 UE/mL, 1,5 UE/mL, 2,0 UE/mL, 2,5 UE/mL, 3,0 UE/mL, 3,5 UE/mL, 4,0 UE/mL, 4,5 UE/mL o 5,0 UE/mL.
[0399] Las formulaciones ejemplares para administraciónex vivotambién pueden incluir el uso de varios agentes de transfección conocidos en la técnica, tales como fosfato de calcio, electroporación, choque térmico y varias formulaciones de liposomas (es decir, transfección mediada por lípidos). Los liposomas, como se describe con mayor detalle a continuación, son bicapas lipídicas que atrapan una fracción de fluido acuoso. El ADN se asocia espontáneamente a la superficie externa de los liposomas catiónicos (en virtud de su carga) y estos liposomas interactuarán con la membrana celular.
[0400] También se entenderá que, si se desea, las composiciones pueden administrarse en combinación con otros agentes también, tales como, por ejemplo, citocinas, factores de crecimiento, hormonas, moléculas pequeñas o diversos agentes farmacéuticamente activos. Prácticamente no existe límite para otros componentes que también pueden incluirse en las composiciones en casos particulares, siempre que los agentes adicionales no afecten negativamente la capacidad de la composición para administrar la terapia génica prevista.
[0401] En formas de realización particulares, la formulación de excipientes y soluciones portadoras farmacéuticamente aceptables es bien conocida por aquellos expertos en la materia, como lo es el desarrollo de regímenes de dosificación y tratamiento adecuados para usar las composiciones particulares descritas en este documento en una variedad de regímenes de tratamiento, incluyendo, por ejemplo, administración y formulación enteral y parenteral, por ejemplo, intravascular, intravenosa, intraarterial, intraósea e intramedular.
[0402] El experto en la materia entenderá que las formas de realización particulares contempladas en el presente documento pueden comprender otras formulaciones, como las que son bien conocidas en la técnica farmacéutica y se describen, por ejemplo, en Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20.a edición. Baltimore, MD: Lippincott Williams & Wilkins, 2005.
F. COMPOSICIONES DE CULTIVO CELULAR
[0403] Como se analiza en este documento, en formas de realización particulares, las composiciones y los métodos contemplados en este documento son útiles para terapias génicas basadas en célulasex vivoein vivo.En formas de realización particulares, las composiciones pueden comprender células en cultivo, es decir, una composición de cultivo celular. Una composición de cultivo celular puede comprender una población de células que comprende células madre o progenitoras hematopoyéticas, un medio de cultivo celular adecuado y poloxámero 407.
[0404] En formas de realización particulares, las células cultivadas son células madre o progenitoras hematopoyéticas o células CD34+.
[0405] En formas de realización particulares, las células cultivadas son células madre o progenitoras hematopoyéticas o células CD34+ que tienen los siguientes alelos de p-globina: pE/p°, pC/p°, p°/p°, PE/pE, PC/p+, PE/p+, p<0>/p+, P+/P+, PC/pC, PE/pS, p<0>/pS, pC/pS, p+/pS o pS/pS.
[0406] En formas de realización particulares, las células cultivadas son células madre o progenitoras hematopoyéticas o células CD34+ que tienen los siguientes alelos de p-globina: pE/p°, pC/p°, p°/p°, pC/pC, PE/pE, PE/p , pC/pE, pC/p+, p°/p+ o p+/p+.
[0407] En formas de realización particulares, las células cultivadas son células madre o progenitoras hematopoyéticas o células CD34+ que tienen los siguientes alelos de p-globina: pE/pS, p°/pS, pC/pS, p+/pS o pS/pS.
[0408] En una forma de realización, una composición de cultivo celular comprende una población de células que comprende células madre o progenitoras hematopoyéticas, un medio de cultivo celular adecuado para administración humana y poloxámero 4°7. En una forma de realización, una composición de cultivo celular comprende una población de células que comprende células madre o progenitoras hematopoyéticas, un medio de cultivo celular adecuado para administración humana, poloxámero 4°7 y prostaglandina E<2>(PGE<2>) o 16,16-dimetil PGE<2>.
[0409] En una forma de realización, una composición de cultivo celular comprende una población de células que comprende células madre o progenitoras hematopoyéticas modificadas genéticamente, un medio de cultivo celular adecuado para administración a un ser humano y poloxámero 4°7.
[0410] En algunas formas de realización, el medio de cultivo celular es un medio de cultivo celular farmacéuticamente aceptable.
[0411] Las composiciones de cultivos celulares contemplados en este documento, que comprenden células madre o progenitoras hematopoyéticas transducidas, se pueden administrar sistémicamente o mediante inyección dirigida a un sujeto que lo necesite para efectuar la terapia génica deseada.
G. MÉTODOS DE TRANSDUCCIÓN
[0412] Los métodos y composiciones contemplados en el presente documento aumentan significativamente la eficiencia de transducción (ET) y el número de copias del vector (NCV) de las células diana. Sin querer limitarse a ninguna teoría en particular, se contempla que las composiciones y métodos contemplados en el presente documento pueden usarse para aumentar el NCV y transducir significativamente más células con significativamente menos virus, minimizando así el riesgo de alteración genómica y/o activación insercional de protooncogenes en el genoma de la célula terapéutica, mientras que al mismo tiempo aumentan la eficacia terapéutica del producto farmacológico producido. Por lo tanto, las composiciones y métodos contemplados en el presente documento no solo conducen a la producción de una terapia génica más segura, sino a un producto farmacológico más robusto y terapéuticamente eficaz. Además, una transducción más eficiente permite que se utilice menos virus por transducción y, por lo tanto, disminuye el costo de los productos para la terapia génica lentiviral.
[0413] La administración de un gen(es) u otras secuencias de polinucleótidos utilizando un vector lentiviral por medio de una infección viral en lugar de por transfección se denomina transducción. En una forma de realización, los vectores se transducen en una célula a través de la infección y la integración del provirus. En ciertas formas de realización, una célula, por ejemplo, una céluladiana,se transduce si comprende un gen u otra secuencia de polinucleótidos administrada a la célula por infección utilizando un vector lentiviral. En formas de realización particulares, una célula transducida comprende uno o más genes u otras secuencias de polinucleótidos administradas por un vector lentiviral en su genoma celular.
[0414] En formas de realización particulares, las células huésped o las células diana transducidas con un vector viral expresan un polipéptido terapéutico y se administran a un sujeto para tratar y/o prevenir una enfermedad, trastorno o afección.
[0415] La producción de partículas virales infecciosas y soluciones madre virales se puede llevar a cabo utilizando técnicas convencionales. Los métodos de preparación de soluciones madre virales son conocidos en la técnica y se ilustran, por ejemplo, en Y. Soneoka et al. (1995) Nucl. Acids Res. 23:628-633, y NR Landau et al. (1992) J. Virol.
66:511°-5113.
[0416] En formas de realización particulares, las partículas virales basadas en el VIH tipo 1 (VIH-1) pueden generarse mediante la coexpresión de los elementos de empaquetamiento del virión y el vector de transferencia en una célula productora. Estas células pueden transfectarse transitoriamente con una serie de plásmidos. Normalmente se emplean de tres a cinco plásmidos, pero la cantidad puede ser mayor dependiendo del grado en el que los componentes lentivirales se descomponen en unidades separadas. Por ejemplo, un plásmido puede codificar los componentes enzimáticos y del núcleo del virión, derivados del VIH-1. Este plásmido se denomina plásmido de empaquetamiento. Otro plásmido codifica normalmente la(s) proteína(s) de la envoltura, más comúnmente la proteína G del virus de la estomatitis vesicular (VSV G) debido a su alta estabilidad y amplio tropismo. Este plásmido puede denominarse plásmido de expresión de la envoltura. Otro plásmido codifica el genoma que se va a transferir a la célula diana, es decir, el vector en sí, y se denomina vector de transferencia. Los plásmidos de empaquetamiento pueden introducirse en líneas celulares humanas mediante técnicas conocidas, que incluyen transfección con fosfato de calcio, lipofección o electroporación. Mediante esta técnica y sus variantes pueden generarse virus recombinantes con títulos de varios millones de unidades de transducción por mililitro (UT/mL). Después de la ultracentrifugación, pueden obtenerse stocks concentrados de aproximadamente 10<8>UT/mL, 10<9>UT/mL, 10<10>UT/mL, 10<11>UT/mL, 10<12>UT/mL o aproximadamente 10<13>UT/mL.
[0417] Las partículas de virus infecciosas pueden recolectarse de las células de empaquetamiento utilizando técnicas convencionales. Por ejemplo, las partículas infecciosas pueden recolectarse mediante lisis celular o recolección del sobrenadante del cultivo celular, como se conoce en la técnica. Opcionalmente, las partículas de virus recolectadas pueden purificarse si se desea. Las técnicas de purificación adecuadas son bien conocidas por los expertos en la técnica, por ejemplo, Kutner et al., BMC Biotechnol. 2009;9:10. doi:10.1186/1472-6750-9-10; Kutner et al. Nat. Protoc. 2009;4(4):495-505. doi: 10.1038/nprot.2009.22.
[0418] Los virus pueden utilizarse para infectar célulasin vivo, ex vivooin vitroutilizando técnicas bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, cuando las células, por ejemplo células de sangre periférica movilizadas, células de médula ósea, células CD34+ o células madre o progenitoras hematopoyéticas se transducenex vivo,las partículas del vector pueden incubarse con las células utilizando una dosis generalmente en el orden de entre 1 y 50 multiplicidades de infección (MOI) que también corresponde a 1 x 10<5>a 50 x 10<5>unidades de transducción del vector viral por 10<5>células. Esto, por supuesto, incluye la cantidad de vector correspondiente a 1, 2, 3, 4, 5,<6>, 7,<8>, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 y 50 MOI y todos los valores enteros intermedios.
[0419] En formas de realización particulares, el vector lentiviral se utiliza a un MOI de aproximadamente 10 a aproximadamente 25 para transducir una población de células.
[0420] En formas de realización particulares, el vector lentiviral se utiliza en un MOI de aproximadamente 10 a aproximadamente<20>para transducir una población de células.
[0421] En algunas formas de realización, el vector lentiviral se utiliza en un MOI de aproximadamente 10, aproximadamente 11, aproximadamente 12, aproximadamente 13, aproximadamente 14, aproximadamente 15, aproximadamente 16, aproximadamente 17, aproximadamente 18, aproximadamente 19, aproximadamente 20, aproximadamente 21, aproximadamente 22, aproximadamente 23, aproximadamente 24, aproximadamente 25, aproximadamente 26, aproximadamente 27, aproximadamente 28, aproximadamente 29 o aproximadamente 30 para transducir una población de células.
[0422] Los virus también pueden administrarse a un sujetoin vivo,mediante inyección directa a la célula, tejido u órgano que necesita terapia. La inyección directa requiere del orden de entre 1 y 100 multiplicidades de infección (MOI), lo que también corresponde a 1 x 10<5>a 100 x 10<5>unidades de transducción del vector viral por 10<5>células. Esto, por supuesto, incluye la cantidad de vector correspondiente a 1, 2, 3, 4, 5,<6>, 7,<8>, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 50, 65, 70, 75,<8 0>, 85, 90, 95 y 100 MOI y todos los valores enteros intermedios.
[0423] Los virus también pueden administrarse según el título viral (UT/mL), que puede medirse, por ejemplo, utilizando un ensayo de título de p24 disponible comercialmente, que es un ELISA contra la proteína de la cubierta viral p24. La siguiente fórmula puede utilizarse para calcular los pg/mL de p24: hay aproximadamente 2000 moléculas de p24 por partícula física (<p>P) de lentivirus: (2 x 103) x (24 x 10<3>Da de p24 por PP), 48 x 106/Avogadro = (48 x 106) /<( 6>x 1023) =<8>x 10<-17>g de p24 por PP, aproximadamente 1 PP por 1 x 10<-16>g de p24, 1 x 10<4>PP por pg de p24. Un vector lentiviral pseudotipado VSV-G razonablemente bien empaquetado tendrá un índice de infectividad en el rango de 1 UT por 1000 partículas físicas (PP) a 1 UT por 100 PP (o menos). Por lo tanto, el rango es aproximadamente de 10 a 100 UT/pg de p24. Es a través de esta conversión que se obtienen las UT/mL.
[0424] Según la experiencia previa, la cantidad de lentivirus inyectado directamente se determina por la UT total y puede variar en función tanto del volumen que se podría inyectar de forma factible en el sitio como del tipo de tejido que se va a inyectar. Por ejemplo, un sitio de inyección en la médula ósea puede permitir solamente la inyección de un volumen muy pequeño de virus, por lo que se preferiría una preparación de alto título, se podría utilizar una UT de aproximadamente<1>x<106>a<1>x<10>7, aproximadamente<1>x<106>a<1>x<10>8,<1>x<106>a<1>x<10>9, aproximadamente<1>x<107>a<1>x<10>10,<1>x<10>8 a<1>x<10>11, aproximadamente<1>x<108>a<1>x<10>12, o aproximadamente<1>x<1010>a<1>x<1012>o más por inyección. Sin embargo, una administración sistémica podría acomodar una UT mucho más grande, es decir, se podría administrar una carga de<1>x<10>8,<1>x<10>9,<1>x<10>10,<1>x<10>11,<1>x<10>12,<1>x<10>13,<1>x<1014>o<1>x [0425] Las composiciones y métodos contemplados en este documento proporcionan una alta eficiencia de transducción y NCV de células hematopoyéticasin vitro, ex vivoein vivo,utilizando títulos virales más bajos que los descritos anteriormente para lograr eficiencias de transducción comparables en ausencia de las composiciones y métodos proporcionados en este documento.
[0426] En esta invención, el poloxámero es el poloxámero 407.
[0427] Las concentraciones finales ilustrativas de poloxámero utilizadas para transducir células hematopoyéticas incluyen, pero no se limitan a aproximadamente 10 pg/mL a aproximadamente 5000 pg/mL, aproximadamente 10 |jg/mL a aproximadamente 2500 pg/mL, aproximadamente 10 pg/mL a aproximadamente 1000 pg/mL, aproximadamente 50 pg/mL a aproximadamente 1000 pg/mL, aproximadamente 100 pg/mL a aproximadamente 1000 |jg/mL, aproximadamente 200 pg/mL a aproximadamente 1000 pg/mL, aproximadamente 200 pg/mL a aproximadamente 500 pg/mL, o aproximadamente 10 pg/mL, aproximadamente 20 pg/mL, aproximadamente 30 pg/mL, aproximadamente 40 pg/mL, aproximadamente 50 pg/mL, aproximadamente 60 pg/mL, aproximadamente 70 pg/mL, aproximadamente 80 pg/mL, aproximadamente 90 pg/mL, aproximadamente 100 pg/mL, aproximadamente 110 pg/mL, aproximadamente 120 pg/mL, aproximadamente 130 pg/mL, aproximadamente 140 pg/mL, aproximadamente 150 pg/mL, aproximadamente 160 pg/mL, aproximadamente 170 pg/mL, aproximadamente 180 pg/mL, aproximadamente 200 pg/mL, aproximadamente 220 pg/mL, aproximadamente 240 pg/mL, aproximadamente 260 pg/mL, aproximadamente 280 pg/mL, aproximadamente 300 pg/mL, aproximadamente 320 pg/mL, aproximadamente 340 pg/mL, aproximadamente 360 pg/mL, aproximadamente 380 pg/mL, aproximadamente 400 pg/mL, aproximadamente 420 pg/mL, aproximadamente 440 pg/mL, aproximadamente 500 pg/mL, aproximadamente 600 pg/mL, aproximadamente 700 pg/mL, aproximadamente 800 pg/mL, aproximadamente 900 pg/mL, aproximadamente 1000 pg/mL, aproximadamente 1150 pg/mL, aproximadamente 1250 pg/mL, aproximadamente pg/mL, aproximadamente 90 pg/mL, aproximadamente 100 pg/mL, aproximadamente 200 pg/mL, aproximadamente 300 pg/mL, aproximadamente 400 pg/mL, aproximadamente 500 pg/mL, aproximadamente 600 pg/mL, aproximadamente 700 pg/mL, aproximadamente 800 pg/mL, aproximadamente 900 pg/mL, aproximadamente 1000 pg/mL, aproximadamente 1250 pg/mL, aproximadamente 1500 pg/mL, aproximadamente 1750 pg/mL, aproximadamente 2000 pg/mL, aproximadamente 2500 pg/mL, o aproximadamente 5000 pg/mL o más, y cualquier concentración intermedia de la misma.
[0428] En una forma de realización, el agente que estimula la vía de señalización del receptor EP de prostaglandina es PGE<2>.
[0429] Las concentraciones finales ilustrativas del agonista de la vía de señalización del receptor EP de prostaglandina utilizadas para transducir células hematopoyéticas incluyen, pero no se limitan a aproximadamente 10 pM a aproximadamente 200 pM, aproximadamente 10 pM a aproximadamente 100 pM, aproximadamente 50 pM a aproximadamente 100 pM, o aproximadamente 10 pM, aproximadamente 20 pM, aproximadamente 30 pM, aproximadamente 40 pM, aproximadamente 50 pM, aproximadamente 60 pM, aproximadamente 70 pM, aproximadamente 80 pM, aproximadamente 90 pM, o aproximadamente<100>pM o más, y cualquier concentración intermedia de las mismas.
[0430] En una forma de realización, el polímero policatiónico es sulfato de protamina o polibreno.
[0431] En una forma de realización, el polímero policatiónico es sulfato de protamina. El sulfato de protamina o polibreno se puede utilizar a una concentración final de aproximadamente 5 pg/mL a aproximadamente 15 pg/mL, aproximadamente 5 pg/mL a aproximadamente 10 pg/mL, o aproximadamente 5 pg/mL, aproximadamente<6>pg/mL, aproximadamente 7 pg/mL, aproximadamente<8>pg/mL, aproximadamente 9 pg/mL, aproximadamente 10 pg/mL, aproximadamente 11 pg/mL, aproximadamente 12 pg/mL, aproximadamente 13 pg/mL, aproximadamente 14 pg/mL o aproximadamente 15 pg/mL o más.
[0432] Las concentraciones finales ilustrativas de estaurosporina utilizadas para transducir células hematopoyéticas incluyen, pero no se limitan a aproximadamente 100 nM a aproximadamente 1000 nM, aproximadamente 110 nM a aproximadamente 800 nM, aproximadamente 200 nM a aproximadamente 800 nM, aproximadamente 400 nM a aproximadamente 800 nM, aproximadamente 200 nM a aproximadamente 400 nM, aproximadamente 200 nM a aproximadamente 500 nM, o aproximadamente 100 nM, aproximadamente 200 nM, aproximadamente 300 nM, aproximadamente 400 nM, aproximadamente 500 nM, aproximadamente 600 nM, aproximadamente 700 nM, aproximadamente 800 nM, aproximadamente 900 nM, o aproximadamente 1000 nM o más, y cualquier concentración intermedia de los mismos.
[0433] En ciertas formas de realización, se contempla que las células hematopoyéticas se pueden cultivar con poloxámero 407 y prostaglandina E<2>(PGE<2>) o 16,16-dimetil PGE<2>, y opcionalmente un polímero policatiónico antes del cultivo con un lentivirus, durante el cultivo con un lentivirus, o después del cultivo con un lentivirus, o cualquier combinación de los mismos.
[0434] En formas de realización particulares, las células hematopoyéticas se transducen en un vaso, tal como una bolsa, por ejemplo, una bolsa de sangre, y se agitan durante la transducción.
[0435] Como se describe en todo momento, las composiciones y los métodos contemplados en este documento ofrecen aumentos inesperados en la eficiencia de transducción y NCV de las células hematopoyéticas, que son notoriamente difíciles de transducir y típicamente tienen NCV bajos.
[0436] En diversas formas de realización, las composiciones y métodos contemplados en este documento aumentan la eficiencia de transducción a al menos aproximadamente 30 %, al menos aproximadamente 40 %, al menos aproximadamente 50 %, al menos aproximadamente 60 %, al menos aproximadamente 65 %, al menos aproximadamente 70 %, al menos aproximadamente 75 %, al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 85 %, al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 91 %, al menos aproximadamente 92 %, al menos aproximadamente 93 %, al menos aproximadamente 94 %, al menos aproximadamente 95 %, al menos aproximadamente 96 %, al menos aproximadamente 97 %, al menos aproximadamente 98 %, al menos aproximadamente 99 %, o al menos aproximadamente 100 %, incluyendo cualquier porcentaje intermedio.
[0437] En diversas formas de realización, las composiciones y métodos contemplados en este documento aumentan el NCV promedio a al menos aproximadamente 2,0, al menos aproximadamente 2,5, al menos aproximadamente 3,0, al menos aproximadamente 3,5, al menos aproximadamente 4,0, al menos aproximadamente 4,5 o al menos aproximadamente 5,0.
[0438] En diversas formas de realización, las células hematopoyéticas transducidas con las composiciones y métodos contemplados en este documento tienen una eficiencia de transducción de al menos aproximadamente 75 %, al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 85 %, al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 91 %, al menos aproximadamente 92 %, al menos aproximadamente 93 %, al menos aproximadamente 94 %, al menos aproximadamente 95 %, al menos aproximadamente 96 %, al menos aproximadamente 97 %, al menos aproximadamente 98 %, al menos aproximadamente 99 %, o al menos aproximadamente 100 % y un NCV promedio de al menos aproximadamente 2,0, o al menos aproximadamente 2,5.
[0439] En formas de realización particulares, un aumento en la eficiencia de transducción representa al menos 2 veces, al menos 5 veces, al menos 10 veces, al menos 25 veces, al menos 50 veces, o al menos 100 veces, o más veces un enriquecimiento de células hematopoyéticas transducidas con las composiciones y métodos contemplados en este documento en comparación con las células hematopoyéticas transducidas con el vector solo.
[0440] En formas de realización particulares, el aumento en el NCV promedio representa enriquecimiento de al menos 2 veces, al menos 5 veces, al menos<10>veces, al menos 25 veces, al menos 50 veces o al menos<100>veces, o más veces, en NCV de células hematopoyéticas transducidas con las composiciones y métodos contemplados en este documento en comparación con las células hematopoyéticas transducidas con el vector solo.
[0441] Después de la transducción, las células transducidas pueden cultivarse en condiciones adecuadas para su mantenimiento, crecimiento o proliferación. En formas de realización particulares, las células transducidas se cultivan durante aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5,<6>, 7,<8>, 9, 10, 11, 12, 13 o 14 días antes del trasplante.
[0442] Antes, durante y/o después de la transducción, las células pueden cultivarse en condiciones que promuevan la expansión de células madre o células progenitoras. Puede utilizarse cualquier método conocido en la técnica. En ciertas formas de realización, antes, durante o después de la transducción, las células se cultivan en presencia de uno o más factores de crecimiento que promueven la expansión de células madre o células progenitoras. Los ejemplos de factores de crecimiento que promueven la expansión de células madre o células progenitoras incluyen, entre otros, el ligando de tirosina quinasa hepática fetal (Flt3), el factor de células madre y las interleucinas<6>y 11, que se ha demostrado que promueven la autorrenovación de células madre hematopoyéticas murinas. Otros incluyen Sonic hedgehog, que induce la proliferación de progenitores hematopoyéticos primitivos mediante la activación de la proteína morfogenética ósea 4, Wnt3a, que estimula la autorrenovación de las HSC, el factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), el factor de crecimiento epidérmico (EGF), el factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), el factor neurotrófico ciliar (CNF), el factor de crecimiento transformante p (TGF-p), un factor de crecimiento de fibroblastos (FGF, por ejemplo, FGF básico, FGF ácido, FGF-17, FGF-4, FGF-5, FGF-<6>, FGF-<8>b, FGF-<8>c, FGF-9), el factor estimulante de colonias de granulocitos (GCSF), un factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF, por ejemplo, PDGFAA, PDGFAB, PDGFBB), el factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GMCSF), el factor de células madre (SCF), el factor derivado de célulasdelestroma (SCDF), el factor de crecimiento similar a la insulina (IGF), trombopoyetina (TPO) o interleucina-3 (IL-3). En formas de realización particulares, antes, durante o después de la transducción, las células se cultivan en presencia de uno o más factores de crecimiento que promueven la expansión de células madre o células progenitoras.
[0443] Las células adecuadas para su uso con las composiciones y métodos contemplados en este documento se pueden obtener de cualquier animal, preferiblemente un mamífero, por ejemplo, un primate no humano o un ser humano, y más preferiblemente un ser humano, y se pueden trasplantar en cualquier animal, preferiblemente un mamífero, y más preferiblemente un ser humano.
[0444] Ciertas formas de realización contemplan el aislamiento y la transducción de una población de células. Como se utiliza en el presente documento, el término "población de células" se refiere a una pluralidad de células que pueden estar formadas por cualquier número y/o combinación de tipos de células homogéneas o heterogéneas, como se describe en otra parte del presente documento. Por ejemplo, para la transducción de células madre o progenitoras hematopoyéticas, una población de células puede aislarse u obtenerse de sangre del cordón umbilical, sangre placentaria, médula ósea o sangre periférica. Una población de células puede comprender aproximadamente el 10 %, aproximadamente el 20 %, aproximadamente el 30 %, aproximadamente el 40 %, aproximadamente el 50 %, aproximadamente el 60 %, aproximadamente el 70 %, aproximadamente el 80 %, aproximadamente el 90 % o aproximadamente el 100 % del tipo de célula diana que se va a transducir. En ciertas formas de realización, las células madre o progenitoras hematopoyéticas pueden aislarse o purificarse a partir de una población de células heterogéneas utilizando métodos conocidos en la técnica.
[0445] Los tipos de células diana preferidos transducidos con las composiciones y métodos contemplados en este documento incluyen células hematopoyéticas, por ejemplo, células hematopoyéticas humanas.
[0446] En formas de realización preferidas, las composiciones y métodos contemplados en este documento se utilizan para aumentar la eficiencia de transducción y/o NCV de células madre o progenitoras hematopoyéticas.
[0447] Las fuentes ilustrativas para obtener células hematopoyéticas transducidas con los métodos y composiciones contemplados en este documento incluyen, pero no se limitan a: sangre del cordón umbilical, médula ósea o sangre periférica movilizada.
[0448] Ejemplos ilustrativos de células hematopoyéticas adecuadas para la transducción con los métodos y composiciones contemplados en el presente documento incluyen células CD34+. El término "célula CD34+", como se utiliza en el presente documento, se refiere a una célula que expresa la proteína CD34 en su superficie celular. "CD34", como se utiliza en el presente documento, se refiere a una glicoproteína de la superficie celular (por ejemplo, proteína sialomucina) que a menudo actúa como un factor de adhesión célula-célula. CD34+ es un marcador de la superficie celular tanto de células madre hematopoyéticas como de células progenitoras.
[0449] Ejemplos ilustrativos adicionales de células madre o progenitoras hematopoyéticas adecuadas para la transducción con los métodos y composiciones contemplados en este documento incluyen células hematopoyéticas que son CD34+CD38LoCD90+CD45RA', células hematopoyéticas que son CD34+, CD59+, Thy1/CD90+, CD38Lo/-, C-kit/CD117+ y Lin(-), y células hematopoyéticas que son CD133+.
[0450] Existen varios métodos para caracterizar la jerarquía hematopoyética. Un método de caracterización es el código SLAM. La familia SLAM (Molécula de activación de linfocitos de señalización) es un grupo de >10 moléculas cuyos genes se encuentran ubicados principalmente en tándem en un solo locus en el cromosoma<1>(ratón), todos pertenecientes a un subconjunto de la superfamilia de genes de inmunoglobulina, y originalmente se pensó que estaban involucrados en la estimulación de células T. Esta familia incluye CD48, CD150, CD244, etc., siendo CD150 el miembro fundador y, por lo tanto, también llamado slamF1, es decir, miembro 1 de la familia SLAM. El código SLAM característico para la jerarquía hematopoyética es células madre hematopoyéticas (HSC) - CD150+CD48'CD244_; células progenitoras multipotentes (MPP) - CD150'CD48'CD244+; células progenitoras restringidas por linaje (LRP): CD150'CD48+CD244+; progenitor mieloide común (CMP): lin-SCA-1-c-kit+CD34+CD16/32mid; progenitor de granulocitos y macrófagos (PGM): lin-SCA-1-c-kit+CD34+CD16/32hi; y progenitor de megacariocitos y eritroides (MEP): lin-SCA-1-c-kit+CD34-CD16/32low.
[0451] En formas de realización particulares, las células CD34+ que se transducen con los vectores y composiciones contempladas en el presente documento tienen los siguientes alelos de p-globina: pE/p°, pC/p°, p°/p°, PE/pE, PC/p+, PE/p+, p<0>/p+, p+/p+, pC/pC, pE/pS, p<0>/pS, pC/pS, p+/pS o pS/pS.
[0452] En formas de realización particulares, las células CD34+ que se transducen con los vectores y composiciones contempladas en el presente documento tienen los siguientes alelos de p-globina: pE/p0, pC/p0, p<0>/p0, pC/pC, PE/pE, PE/p+, pC/pE, pC/p+, p<0>/p+ o p+/p+.
[0453] En formas de realización particulares, las células CD34+ que se transducen con los vectores y composiciones contemplados en este documento tienen los siguientes alelos de p-globina: pE/pS, p<0>/pS, pC/pS, p+/pS o pS/pS.
H. MÉTODOS DE TERAPIA GÉNICA
[0454] Los productos farmacéuticos que comprenden una mayor proporción de células transducidas, en donde el número de copias de los genes terapéuticos en cada célula también es mayor, proporcionan terapias génicas terapéuticamente más eficaces. Como se utiliza en el presente documento, el término "producto farmacéutico" se refiere a células genéticamente modificadas producidas utilizando las composiciones y métodos contemplados en el presente documento. En formas de realización particulares, el producto farmacéutico comprende células madre o progenitoras hematopoyéticas modificadas genéticamente, por ejemplo, células CD34+. Sin querer limitarse a ninguna teoría en particular, aumentar la cantidad de un gen terapéutico en un producto farmacéutico puede permitir el tratamiento de sujetos que no tienen expresión o tienen una expresión mínima del gen correspondientein vivo,expandiendo significativamente de ese modo la oportunidad de llevar la terapia génica a sujetos para los que la terapia génica no era previamente una opción de tratamiento viable.
[0455] Las células transducidas y los vectores correspondientes contemplados en el presente documento proporcionan métodos mejorados de terapia génica. Tal como se utiliza en el presente documento, el término "terapia génica" se refiere a la introducción de un gen en el genoma de una célula. En diversos casos, un vector viral de la divulgación comprende una secuencia de control de expresión hematopoyética que expresa un transgén terapéutico que codifica un polipéptido que es adecuado para proporcionar beneficios curativos, preventivos o de mejora a un sujeto diagnosticado con o que se sospecha que tiene una enfermedad, trastorno o afección monogénica o una enfermedad, trastorno o afección que es susceptible de terapia con células madre hematopoyéticas.
[0456] En un caso preferido, las células transducidas comprenden el potencial de convertirse en células microgliales cerebrales (macrófagos). En casos particulares, las células madre hematopoyéticas se transducen con un vector contemplado en el presente documento que es adecuado para administrar a un individuo que necesita terapia para un trastorno de almacenamiento lisosomal, una adrenoleucodistrofia o adrenomieloneuropatía. Las células madre hematopoyéticas son el origen de las células microgliales cerebrales y, por lo tanto, son preferidas en dichos casos.
[0457] En casos particulares, las células madre o progenitoras hematopoyéticas transducidas comprenden vectores virales que tienen una secuencia de control de expresión hematopoyética que expresa un transgén terapéutico que codifica un polipéptido que es adecuado para proporcionar beneficios curativos, preventivos o mejoradores a un sujeto diagnosticado con o que se sospecha que tiene una enfermedad, trastorno o condición monogénica o una enfermedad, trastorno o condición del sistema hematopoyético.
[0458] En ciertos casos, los vectores, partículas virales y/o células transducidas contemplados en este documento son adecuados para usarse para tratar, prevenir y/o mejorar una enfermedad, trastorno o condición monogénica o una enfermedad, trastorno o condición del sistema hematopoyético en un sujeto, por ejemplo, una hemoglobinopatía.
[0459] Ejemplos ilustrativos de trastornos monogénicos y sus genes terapéuticos correspondientes que son adecuados para su uso en casos particulares contemplados en este documento incluyen, pero no se limitan a: X-SCID (IL2Ry), ADA-SCID (adenosina desaminasa), enfermedad de Batten (tripeptidil peptidasa 1), mucopolisacaridosis tipo 1 -síndrome de Hurler (alfa-L iduronidasa), mucopolisacaridosis tipo 2 - síndrome de Hunter (iduronato 2-sulfatasa), mucopolisacaridosis tipo 3 - síndrome de Sanfilippo (Nsulfoglucosamina sulfohidrolasa), mucopolisacaridosis tipo 4A -síndrome de Morquio A (galactosamina<- 6>sulfatasa), mucopolisacaridosis tipo 4B - síndrome de Morquio B (betagalactosidasa), Mucopolisacaridosis tipo<6>- Síndrome de Maroteaux-Lamy (N-acetilgalactosamina- 4-sulfatasa), Enfermedad de Gaucher (glucocerebrosidasa), Leucodistrofia metacromática (arilsulfatasa A), Enfermedades granulomatosas crónicas (cadena alfa del citocromo b-245, cadena beta del citocromo b-245, factor citosólico de neutrófilos 1, factor citosólico de neutrófilos 2, factor citosólico de neutrófilos 4), Síndrome de Wiskott-Aldrich (proteína del síndrome de Wiskott-Aldrich), Deficiencia de perforina (PRF1), Anemia de Fanconi (genes FANC,p. ej.,FANCA, FANCC, FANCG), síndrome linfoproliferativo ligado al cromosoma X (SH2D1A), deficiencia de RAG (RAG1/2), deficiencia de proteína Artemisa (DCLRE1C), hemofilia A (factor VIII), hemofilia B (factor IX) y deficiencia de adhesión leucocitaria (CD18).
[0460] Como se utiliza en el presente documento, "hematopoyesis" se refiere a la formación y desarrollo de células sanguíneas a partir de células progenitoras, así como a la formación de células progenitoras a partir de células madre. Las células sanguíneas incluyen, entre otras, eritrocitos o glóbulos rojos (RBC), reticulocitos, monocitos, neutrófilos, megacariocitos, eosinófilos, basófilos, células B, macrófagos, granulocitos, mastocitos, trombocitos y leucocitos.
[0461] Como se utiliza en el presente documento, el término "hemoglobinopatía" o "afección hemoglobinopática" se refiere a un grupo diverso de trastornos sanguíneos hereditarios que implican la presencia de moléculas de hemoglobina anormales resultantes de alteraciones en la estructura y/o síntesis de la hemoglobina. Normalmente, la hemoglobina consta de cuatro subunidades proteínicas: dos subunidades de p-globina y dos subunidades de a-globina. Cada una de estas subunidades proteínicas está unida (enlazada) a una molécula que contiene hierro denominada hemo; cada hemo contiene una molécula de hierro en su centro que puede unirse a una molécula de oxígeno. La hemoglobina dentro de los glóbulos rojos se une a las moléculas de oxígeno en los pulmones. Estas células luego viajan a través del torrente sanguíneo y suministran oxígeno a los tejidos de todo el cuerpo.
[0462] La hemoglobina A (HbA) es la denominación de la hemoglobina normal que existe después del nacimiento. La hemoglobina A es un tetrámero con dos cadenas alfa y dos cadenas beta (a<2>p<2>). La hemoglobina A<2>es un componente menor de la hemoglobina que se encuentra en los glóbulos rojos después del nacimiento y consta de dos cadenas alfa y dos cadenas delta (a<2>Ó<2>). La hemoglobina A2 generalmente comprende menos del 3 % de la hemoglobina total de los glóbulos rojos. La hemoglobina F es la hemoglobina predominante durante el desarrollo fetal. La molécula es un tetrámero de dos cadenas alfa y dos cadenas gamma (a<2>Y<2>).
[0463] Las hemoglobinopatías más comunes incluyen la enfermedad de células falciformes, la p-talasemia y la atalasemia.
[0464] En casos particulares, las composiciones y métodos contemplados en el presente documento son adecuados para proporcionar terapia génica a sujetos que padecen una enfermedad de células falciformes. El término "anemia de células falciformes" o "enfermedad de células falciformes" se define en el presente documento para incluir cualquier condición anémica sintomática que resulte de la drepanocitosis de los glóbulos rojos. La anemia de células falciformes pS/pS, una forma común de enfermedad de células falciformes (SCD), es causada por la hemoglobina S (HbS). La HbS se genera por reemplazo de ácido glutámico (E) con valina (V) en la posición<6>en la p-globina, conocida como Glu<6>Val o E<6>V. Reemplazar el ácido glutámico con valina hace que las subunidades anormales de HbS se adhieran entre sí y formen moléculas largas y rígidas que doblan los glóbulos rojos en una forma de hoz (semiluna). Las células en forma de hoz mueren prematuramente, lo que puede conducir a una escasez de glóbulos rojos (anemia). Además, las células falciformes son rígidas y pueden bloquear pequeños vasos sanguíneos, causando dolor intenso y daño a los órganos.
[0465] Mutaciones adicionales en el gen de la p-globina también pueden causar otras anormalidades en la p-globina, dando lugar a otros tipos de enfermedad de células falciformes. Estas formas anormales de la p-globina a menudo se designan con letras del alfabeto o, a veces, con un nombre. En estos otros tipos de enfermedad de células falciformes, una subunidad de la p-globina se reemplaza con HbS y la otra subunidad de la p-globina se reemplaza con una variante anormal diferente, como la hemoglobina C (HbC; alelo de la p-globina indicado como pC) o la hemoglobina E (HbE; alelo de la p-globina indicado como pE).
[0466] En la enfermedad de la hemoglobina SC (HbSC), las subunidades de p-globina son reemplazadas por HbS y HbC. La HbC resulta de una mutación en el gen de la p-globina y es la hemoglobina predominante encontrada en personas con enfermedad de HbC (a<2>p<C2>). La HbC resulta cuando el aminoácido lisina reemplaza al aminoácido ácido glutámico en la posición<6>en la p-globina, anotado como Glu<6>Lys o E<6>K. La enfermedad de HbC es relativamente benigna, produciendo una anemia hemolítica leve y esplenomegalia. La gravedad de la enfermedad de HbSC es variable, pero puede ser tan grave como la anemia de células falciformes.
[0467] La HbE se produce cuando el aminoácido ácido glutámico se reemplaza por el aminoácido lisina en la posición 26 de la p-globina, denominada Glu26Lys o E<26>K. Las personas con enfermedad por HbE tienen anemia hemolítica leve y esplenomegalia leve. La HbE es extremadamente común en el sudeste asiático y en algunas áreas iguala a la hemoglobina A en frecuencia. En algunos casos, la mutación de HbE está presente con HbS. En estos casos, una persona puede tener signos y síntomas más graves asociados con la anemia de células falciformes, como episodios de dolor, anemia y función anormal del bazo.
[0468] Otras afecciones, conocidas como talasemias falciformes de hemoglobina (HbSBetaThal), se producen cuando se producen juntas mutaciones que producen hemoglobina S y talasemia p. Las mutaciones que combinan la enfermedad de células falciformes con talasemia beta cero (p<0>; mutaciones genéticas que impiden la producción de pglobina) conducen a una enfermedad grave, mientras que la enfermedad de células falciformes combinada con talasemia beta plus (p+; mutaciones genéticas que disminuyen la producción de p-globina) es más leve.
[0469] Tal como se utiliza en el presente documento, "talasemia" se refiere a un trastorno hereditario caracterizado por una producción defectuosa de hemoglobina. Entre los ejemplos de talasemias se incluyen la talasemia a y la p.
[0470] En casos particulares, las composiciones y métodos contemplados en el presente documento son adecuados para proporcionar terapia génica a sujetos que tienen una p-talasemia. Las p-talasemias son causadas por una mutación en la cadena de p-globina y pueden ocurrir en una forma mayor o menor. Se ha descubierto que casi 400 mutaciones en el gen de p-globina causan p-talasemia. La mayoría de las mutaciones implican un cambio en un único bloque de construcción de ADN (nucleótido) dentro o cerca del gen de p-globina. Otras mutaciones insertan o eliminan una pequeña cantidad de nucleótidos en el gen de p-globina. Como se señaló anteriormente, las mutaciones del gen de p-globina que disminuyen la producción de p-globina dan como resultado un tipo de la afección denominada talasemia betaplus (p+). Las mutaciones que impiden que las células produzcan beta-globina dan como resultado talasemia beta-cero (p<0>). En la forma mayor de p-talasemia, los niños nacen normales, pero desarrollan anemia durante el primer año de vida. La forma menor de p-talasemia produce glóbulos rojos pequeños. La talasemia menor se produce si se recibe el gen defectuoso de un solo progenitor. Las personas con esta forma del trastorno son portadoras de la enfermedad y, por lo general, no presentan síntomas.
[0471] La HbE/p-talasemia es el resultado de la combinación de HbE y p-talasemia (pE/p<0>, pE/p+) y produce una afección más grave que la observada con el rasgo de HbE o el rasgo de p-talasemia. El trastorno se manifiesta como una talasemia moderadamente grave que entra en la categoría de talasemia intermedia. La HbE/p-talasemia es más común en personas de origen del sudeste asiático.
[0472] En casos particulares, las composiciones y métodos contemplados en el presente documento son adecuados para proporcionar terapia génica a sujetos que tienen una a-talasemia. La a-talasemia es un trastorno sanguíneo bastante común en todo el mundo. Miles de bebés con síndrome de Hb Bart y enfermedad de HbH nacen cada año, particularmente en el sudeste asiático. La a-talasemia también se produce con frecuencia en personas de países mediterráneos, el norte de África, Oriente Medio, India y Asia central. La a-talasemia normalmente resulta de deleciones que involucran los genesHBA1yHBA2.Ambos genes proporcionan instrucciones para producir una proteína llamada a-globina, que es un componente (subunidad) de la hemoglobina. Las personas tienen dos copias del genHBA1y dos copias del genHBA2en cada célula. Los diferentes tipos de a-talasemia resultan de la pérdida de algunos o todos los alelosHBA1yHBA2.
[0473] El síndrome de Hb Bart, la forma más grave de a-talasemia, resulta de la pérdida de los cuatro alelos de alfaglobina. La enfermedad de HbH es causada por una pérdida de tres de los cuatro alelos de a-globina. En estas dos afecciones, una escasez de a-globina impide que las células produzcan hemoglobina normal. En su lugar, las células producen formas anormales de hemoglobina llamadas hemoglobina Bart (Hb Bart) o hemoglobina H (HbH). Estas moléculas de hemoglobina anormales no pueden transportar oxígeno de manera eficaz a los tejidos del cuerpo. La sustitución de la hemoglobina normal por Hb Bart o HbH causa anemia y otros problemas de salud graves asociados con la a-talasemia.
[0474] Dos variantes adicionales de la a-talasemia están relacionadas con una cantidad reducida de a-globina. Debido a que las células aún producen algo de hemoglobina normal, estas variantes tienden a causar pocos o ningún problema de salud. Una pérdida de dos de los cuatro alelos de a-globina da como resultado el rasgo de a-talasemia. Las personas con el rasgo de a-talasemia pueden tener glóbulos rojos anormalmente pequeños y pálidos y anemia leve. Se encuentra una pérdida de un alelo de a-globina en los portadores silenciosos de a-talasemia. Estos individuos típicamente no tienen signos o síntomas relacionados con la talasemia.
[0475] En un caso preferido, los métodos de terapia génica contemplados en este documento son adecuados para usarse para tratar, prevenir o mejorar una hemoglobinopatía seleccionada del grupo que consiste en: enfermedad de hemoglobina C, enfermedad de hemoglobina E, anemia de células falciformes, enfermedad de células falciformes (SCD), talasemia, p-talasemia, talasemia mayor, talasemia intermedia, a-talasemia, síndrome de hemoglobina Bart y enfermedad de hemoglobina H.
[0476] En un caso preferido, los métodos de terapia génica contemplados en este documento son adecuados para usarse para tratar, prevenir o mejorar una hemoglobinopatía en un sujeto que tiene un genotipo de p-globina seleccionado del grupo que consiste en: pE/p0, pC/p0, p<0>/p0, PE/pE, pC/p+, pE/p+, p<0>/p+, p+/p+, PC/pC, PE/pS, p+/ps o pS/pS.
[0477] En diversos casos, los vectores retrovirales son adecuados para administrarse mediante inyección directa a una célula, tejido u órgano de un sujeto que necesita terapia génica,in vivo.En diversos otros casos, las células se transducenin vitrooex vivocon los vectores contemplados en el presente documento, y opcionalmente se expandenex vivo.Las células transducidas son entonces adecuadas para administrarse a un sujeto que necesita terapia génica.
[0478] Las células adecuadas para la transducción y administración en los métodos de terapia génica contemplados en este documento incluyen, entre otras, células madre, células progenitoras y células diferenciadas como se describe en otra parte de este documento. En ciertos casos, las células transducidas son células madre o progenitoras hematopoyéticas como se describe en otra parte de este documento.
[0479] Las células preferidas adecuadas para su uso en las composiciones y métodos de terapia génica contemplados en este documento incluyen células autólogas/autogénicas ("propias").
[0480] En casos particulares, las células adecuadas para usarse como fuente para terapia génica tienen los siguientes alelos de p-globina: pE/p0, pC/p0, p<0>/p0, pE/pE, pC/p+, pE/p+, p<0>/p+, p+/p+, pC/pC, pE/pS, p<0>/pS, pC/pS, pS o pS/pS.
[0481] En casos particulares, las células adecuadas para usarse como fuente para terapia génica tienen los siguientes alelos de p-globina: pE/p0, pC/p0, p<0>/p0, pC/pC pE/pE, pE/p+, pC/pE, pC/p+, p<0>/p+ o p+/p+.
[0482] En casos particulares, las células adecuadas para ser utilizadas como fuente para terapia génica tienen los siguientes alelos de p-globina: pE/pS, p<0>/pS, pC/pS, p+/pS o pS/pS.
[0483] Un "sujeto", como se utiliza en el presente documento, incluye cualquier animal que presente un síntoma de una enfermedad, trastorno o afección monogénica que pueda tratarse con los vectores de terapia génica, los productos terapéuticos basados en células y los métodos descritos en otra parte del presente documento. En casos preferidos, un sujeto incluye cualquier animal que presente síntomas de una enfermedad, trastorno o afección del sistema hematopoyético, por ejemplo, una hemoglobinopatía, que pueda tratarse con los vectores de terapia génica, los productos terapéuticos basados en células y los métodos descritos en otra parte del presente documento. Los sujetos adecuados (por ejemplo, pacientes) incluyen animalesdelaboratorio (como ratones, ratas, conejos o cobayas), animales de granja y animales domésticos o mascotas (como gatos o perros). Se incluyen primates no humanos y, preferiblemente, pacientes humanos. Los sujetos típicos incluyen animales que presentan cantidades aberrantes (cantidades inferiores o superiores a las de un sujeto "normal" o "sano") de una o más actividades fisiológicas que pueden modularse mediante terapia génica.
[0484] Como se utiliza en el presente documento, "tratamiento" o "tratar", incluye cualquier efecto beneficioso o deseable sobre los síntomas o la patología de una enfermedad o condición patológica, y puede incluir incluso reducciones mínimas en uno o más marcadores mensurables de la enfermedad o condición que se está tratando. El tratamiento puede implicar opcionalmente la reducción o mejora de los síntomas de la enfermedad o condición, o el retraso de la progresión de la enfermedad o condición. "Tratamiento" no indica necesariamente la erradicación o cura completa de la enfermedad o condición, o los síntomas asociados a la misma.
[0485] Como se utiliza en el presente documento, "prevenir" y palabras similares como "previene", "prevenido", etc., indican un enfoque para prevenir, inhibir o reducir la probabilidad de aparición o recurrencia de una enfermedad o afección. También se refiere a retrasar la aparición o recurrencia de una enfermedad o afección o retrasar la aparición o recurrencia de los síntomas de una enfermedad o afección. Como se utiliza en el presente documento, "prevención" y palabras similares también incluyen reducir la intensidad, el efecto, los síntomas y/o la carga de una enfermedad o afección antes de la aparición o recurrencia de la enfermedad o afección.
[0486] Como se utiliza en este documento, el término "cantidad" se refiere a "una cantidad efectiva" o "una cantidad eficaz" de un virus o célula terapéutica transducida para lograr un resultado profiláctico o terapéutico beneficioso o deseado, incluidos los resultados clínicos.
[0487] Una "cantidad profilácticamente eficaz" se refiere a una cantidad de un virus o de una célula terapéutica transducida eficaz para lograr el resultado profiláctico deseado. Normalmente, pero no necesariamente, dado que se utiliza una dosis profiláctica en sujetos antes o en una etapa más temprana de la enfermedad, la cantidad profilácticamente eficaz es menor que la cantidad terapéuticamente eficaz.
[0488] Una "cantidad terapéuticamente eficaz" de un virus o célula terapéutica transducida puede variar según factores tales como el estado de la enfermedad, la edad, el sexo y el peso del individuo, y la capacidad de las células madre y progenitoras para provocar una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad terapéuticamente eficaz también es una en la que cualquier efecto tóxico o perjudicial del virus o de las células terapéuticas transducidas se ve compensado por los efectos terapéuticamente beneficiosos. El término "cantidad terapéuticamente eficaz" incluye una cantidad que es eficaz para "tratar" a un sujeto (por ejemplo, un paciente).
[0489] Sin querer limitarse a ninguna teoría en particular, una ventaja importante proporcionada por los vectores y composiciones adecuados para estos métodos, y los métodos de la presente divulgación es la alta eficacia de la terapia génica que se puede lograr mediante la administración de poblaciones de células que comprenden altos porcentajes de células transducidas en comparación con los métodos existentes.
[0490] Las células transducidas pueden ser adecuadas para administrarse como parte de un trasplante de médula ósea o sangre del cordón umbilical en un individuo que se haya sometido o no a una terapia ablativa de médula ósea. En un caso, las células transducidas de la divulgación son adecuadas para administrarse en un trasplante de médula ósea a un individuo que se haya sometido a una terapia quimioablativa o radioablativa de médula ósea.
[0491] En un caso, una dosis de células transducidas es adecuada para su administración a un sujeto por vía intravenosa. En casos preferidos, las células madre hematopoyéticas transducidas son adecuadas para su administración por vía intravenosa a un sujeto.
[0492] En un ejemplo ilustrativo, la cantidad efectiva de células transducidas adecuadas para ser proporcionadas a un sujeto es al menos 2 x 10<6>células/kg, al menos 3 x 10<6>células/kg, al menos 4 x 10<6>células/kg, al menos 5 x 10<6>células/kg, al menos<6>x 10<6>células/kg, al menos 7 x 10<6>células/kg, al menos<8>x 10<6>células/kg, al menos 9 x 10<6>células/kg, o al menos<10>x<106>células/kg, o más células/kg, incluidas todas las dosis intermedias de células.
[0493] En otro ejemplo ilustrativo, la cantidad efectiva de células transducidas adecuadas para ser proporcionadas a un sujeto es de aproximadamente 2 x 10<6>células/kg, aproximadamente 3 x 10<6>células/kg, aproximadamente 4 x 10<6>células/kg, aproximadamente 5 x 10<6>células/kg, aproximadamente<6>x 10<6>células/kg, aproximadamente 7 x 10<6>células/kg, aproximadamente<8>x 10<6>células/kg, aproximadamente 9 x 10<6>células/kg, o aproximadamente 10 x 10<6>células/kg, o más células/kg, incluidas todas las dosis intermedias de células.
[0494] En otro ejemplo ilustrativo, la cantidad efectiva de células transducidas adecuadas para ser proporcionadas a un sujeto es de aproximadamente 2 x 10<6>células/kg a aproximadamente 10 x 10<6>células/kg, aproximadamente 3 x 10<6>células/kg a aproximadamente 10 x 10<6>células/kg, aproximadamente 4 x 10<6>células/kg a aproximadamente 10 x 10<6>células/kg, aproximadamente 5 x 10<6>células/kg a aproximadamente 10 x 10<6>células/kg, 2 x 10<6>células/kg a aproximadamente<6>x 10<6>células/kg, 2 x 10<6>células/kg a aproximadamente 7 x 10<6>células/kg, 2 x 10<6>células/kg a aproximadamente<8>x 10<6>células/kg, 3 x 10<6>células/kg a aproximadamente<6>x 10<6>células/kg, 3 x 10<6>células/kg a aproximadamente 7 x 10<6>células/kg, 3 x 10<6>células/kg a aproximadamente<8>x 10<6>células/kg, 4 x 10<6>células/kg a aproximadamente<6>x 10<6>células/kg, 4 x 10<6>células/kg a aproximadamente 7 x 10<6>células/kg, 4 x 10<6>células/kg a aproximadamente<8>x 10<6>células/kg, 5 x 10<6>células/kg a aproximadamente<6>x 10<6>células/kg, 5 x 10<6>células/kg a aproximadamente 7 x 10<6>células/kg, 5 x 10<6>células/kg a aproximadamente<8>x 10<6>células/kg, o<6>x 10<6>células/kg a aproximadamente<8>x<106>células/kg, incluidas todas las dosis intermedias de células.
[0495] Dependiendo de la condición del sujeto que se esté tratando, necesariamente se producirá alguna variación en la dosis. La persona responsable de la administración determinará, en cualquier caso, la dosis adecuada para el sujeto individual.
[0496] En diversos casos, los vectores, composiciones y métodos contemplados en el presente documento ofrecen métodos mejorados de terapia génica utilizando terapia génicaex vivoy trasplante autólogo. En un caso preferido, células transducidas, tales como células madre o progenitoras, por ejemplo, células madre o progenitoras hematopoyéticas, o células CD34+. En casos particulares, las células madre o progenitoras hematopoyéticas se transducen con un vector contemplado en el presente documento en presencia de uno o más agentes que aumentan la eficiencia de transducción retroviral, por ejemplo, lentiviral y NCV, y las células transducidas son adecuadas para administrar a un individuo que necesita terapia para una hemoglobinopatía.
[0497] En casos particulares, las células madre o progenitoras hematopoyéticas se transducen con un vector contemplado en este documento en presencia de uno o más agentes que aumentan la eficiencia de transducción retroviral, por ejemplo, lentiviral y NCV, y las células transducidas son adecuadas para administrar a un individuo que necesita terapia para una adrenoleucodistrofia o una adrenomieloneuropatía.
[0498] En casos particulares, las células madre o progenitoras hematopoyéticas se transducen con un vector contemplado en este documento en presencia de uno o más agentes que aumentan la eficiencia de transducción retroviral, por ejemplo, lentiviral y NCV, y las células transducidas son adecuadas para administrar a un individuo que necesita terapia para ADASCID, X-SCID, enfermedad de Batten, MPSI o MPSII.
[0499] En un caso preferido, los sistemas de vectores virales se introducen en células madre o progenitoras hematopoyéticas con el fin de expresar altos niveles de una o más proteínas terapéuticas en células eritroides o células precursoras eritroides. Los vectores retrovirales, incluidos los vectores lentivirales contemplados en el presente documento, comprenden un polinucleótido de interés, que incluye, por ejemplo, un gen de globina o un gen que codifica una proteína antidrepanocítica. En un caso, el gen de globina expresado en el vector retroviral de la divulgación es pglobina, 5-globina o Y-globina. En otro caso, el gen de p-globina humana es el gen de p-globina humana de tipo salvaje o el gen de pA-globina humana. En otro caso, el gen de p-globina humana comprende una o más deleciones de secuencias de intrones o es un gen de p-globina humana mutada que codifica al menos un residuo de aminoácido antidrepanocítico. Los aminoácidos antidrepanocitosis pueden derivarse de la 5-globina humana o de la Y-globina humana. En otro caso, el gen de la p-globina humana mutada codifica una mutación de treonina a glutamina en el codón 87 (pA'T87Q).
[0500] En otro caso, el gen de p-globina humana mutado codifica una o más de, o todas, las siguientes mutaciones: una mutación de treonina a glutamina en el codón 87 (pA'T87Q), una mutación de lisina a glutamato en el codón 120 (pA K120E) y una mutación de lisina a glutamato en el codón 95 (pA'K95E).
[0501] En otro caso, el gen de p-globina humana mutado codifica una o más de, o todas, las siguientes mutaciones: una mutación de treonina a glutamina en el codón 87 (pA'T87Q), una mutación de glicina a aspartato en el codón 16 (pA G16D) y una mutación de glutamato a alanina en el codón<22>(pA'E22A).
[0502] En otro caso preferido, las células madre o progenitoras hematopoyéticas se transducen con los métodos y composiciones contemplados en el presente documento para producir productos farmacéuticos adecuados para su uso en terapia génica, incluida la terapia génica para el tratamiento de hemoglobinopatías. En casos particulares, los productos farmacéuticos generados producen niveles suficientemente estables de expresión génica en células eritroides, por ejemplo, adecuados para su uso en el tratamiento de enfermedades específicas de eritroides. En un caso particular, los productos farmacéuticos son adecuados para su uso en el tratamiento de hemoglobinopatías, incluida, por ejemplo, la enfermedad de células falciformes (ECF). En otro caso preferido, los productos farmacéuticos son adecuados para su uso en el tratamiento de talasemias, incluida, entre otras, la p-talasemia.
[0503] En otro caso preferido, las células madre o progenitoras hematopoyéticas se transducen con los métodos y composiciones contemplados en este documento para producir productos farmacológicos que expresan niveles suficientemente estables de ABCD1 adecuados para el tratamiento de adrenoleucodistrofias y/o adrenomieloneuropatías.
[0504] En otro caso, las células madre o progenitoras hematopoyéticas se transducen con los métodos y composiciones contemplados en este documento para producir productos farmacéuticos que expresan niveles suficientemente estables de adenosina desaminasa adecuados para tratar ADA-SCID; niveles suficientemente estables de receptor de interleucina 2 gamma adecuados para tratar XSCID; niveles suficientemente estables de tripeptidil peptidasa 1 adecuados para tratar la enfermedad de Batten; niveles suficientemente estables de alfa-L iduronidasa adecuados para tratar la mucopolisacaridosis tipo I (MPSI); o niveles suficientemente estables de iduronato 2-sulfatasa adecuados para tratar la mucopolisacaridosis tipo II (MPSII).
[0505] Un experto en la materia podría utilizar métodos rutinarios para determinar la vía de administración apropiada y la dosis correcta de una cantidad eficaz de una composición que comprende células transducidas y/o uno o más agentes que aumentan la eficiencia de transducción o NCV contemplados en el presente documento. También sería sabido por aquellos expertos en la materia reconocer que en ciertas terapias, pueden requerirse múltiples administraciones de composiciones farmacéuticas de la divulgación para efectuar la terapia.
[0506] Uno de los principales métodos adecuados para su uso en el tratamiento de sujetos susceptibles de tratamiento con terapias génicas basadas en células madre y progenitoras hematopoyéticas es la transfusión sanguínea. Por lo tanto, uno de los principales objetivos de las composiciones y métodos contemplados en el presente documento es reducir el número de transfusiones o eliminar la necesidad de las mismas.
[0507] En casos particulares, el producto farmacéutico es adecuado para administrarse una sola vez.
[0508] En ciertos casos, el producto farmacéutico es adecuado para administrarse 1, 2, 3, 4, 5,<6>, 7,<8>, 9 o 10 o más veces durante un lapso de 1 año,<2>años, 5 años,<10>años o más.
EJEMPLOS EJEMPLO 1
ENSAYOS DE VALIDACIÓN
Número de copias del vector (NCV) y eficiencia de transducción
[0509] Las células lavadas se resuspendieron en 2 mL de medio de crecimiento de células madre (MCCM) citocinas y se transfirieron a una placa de cultivo de tejido no adherente de 12 pocillos estándar. Las células se mantuvieron durante<6>días adicionales en una incubadora de cultivo de tejido humidificada estándar (5 % de CO2) y luego se sometieron a un análisis de número de copias del vector (NCV) o PCR anidada de una sola célula para determinar la eficiencia de transducción. Tanto el NCV como el ensayo de PCR anidada de una sola célula se realizaron con qPCR utilizando cebadores y sondas específicos tanto para el vector como para un gen de control endógeno. El NCV se determinó dividiendo la cantidad de señal del vector por la cantidad del gen de control endógeno. Para el ensayo de PCR anidada de una sola célula, se enumeraron los pocillos que contenían una célula positiva para el gen de control endógeno y los pocillos que contenían una célula marcada positiva tanto para el vector como para el gen de control endógeno, y se calculó la proporción de células marcadas o la eficiencia de transducción.
Ensayos de metilcelulosa
[0510] Las células lavadas se resuspendieron en 200 pL de MCCM y luego se transfirieron a alícuotas de 3 mL de metilcelulosa suplementada con citocinas (por ejemplo, Methocult M4434 Classic). A continuación, se transfirieron 1,1 mL a placas de cultivo de tejidos paralelas de 35 mm utilizando una aguja roma de calibre 16. Las placas se mantuvieron en una incubadora de cultivo de tejidos humidificada estándar durante 12-16 días y se puntuaron las colonias según tamaño, morfología y composición celular. A continuación, se seleccionaron colonias individuales para un análisis posterior de NCV o se agruparon los contenidos de una placa completa de 35 mm y luego se sometieron a un análisis de NCV.
Ensayo BlaM para la evaluación de la entrada viral
[0511] Las células se transdujeron durante 2 horas en presencia de F108, PGE<2>y un virus que codifica una proteína de fusión de p-lactamasa-Vpr. Después de la transducción, las células se lavaron y se incubaron con un sustrato de plactamasa fluorescente durante 30-60 minutos. La escisión de p-lactamasa se analizó mediante citometría de flujo: el sustrato no escindido es GFP+ y la escisión de la p-lactamasa fluorescente da como resultado una señal Pacific Blue+. La escisión de la p-lactamasa indica la entrada del lentivirus en la célula. Véase también Cavrois et al. Nature Biotechnology. 2002.
Transducción de células madre hematopoyéticas de larga duración (LT-HSC)
[0512] Las HSC transducidas con lentivirus se trasplantaron a ratones NOD/SCID Gamma (NSG) para evaluar el efecto de los compuestos candidatos en la transducción viral de células madre hematopoyéticas humanas a largo plazo. Las células transducidas se lavaron y se resuspendieron en solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se trasplantaron a la vena de la cola de ratones NSG adultos submieloablados, con una toxicidad residual mínima. Los ratones se alojaron en un entorno libre de patógenos según las pautas estándar de cuidado de animales del IACUC. A los 4 meses posteriores al trasplante, se extrajo médula ósea (MO) de ambos fémures y se analizó tanto para NCV como para injerto de células humanas mediante tinción con un anticuerpo antihCD45 (BD #561864) seguido de un análisis de citometría de flujo.
EJEMPLO 2
ANÁLISISIN VIVODE CÉLULAS CD34+ HUMANAS TRATADAS CON PGE<2>
[0513] Meta-análisis de trasplantes NSG con células hCD34+ transducidas con lentivirus tratadas con PGE<2>de donantes sanos (n = 3). Se trasplantaron células CD34+ humanas en ratones NSG hembra submieloablados y se analizó la médula ósea (MO) a los 4 meses posteriores al trasplante. La MO se extrajo de ambos fémures de ratones NSG y la mitad de la muestra se tiñó con anti-hCD45 durante aproximadamente 30 minutos a 4°C. Después de la incubación, las muestras se lavaron y se analizaron para detectar células CD45+ humanas mediante análisis de flujo utilizando un anticuerpo anti-hCD45 (BD #561864). No se detectó ninguna diferencia estadísticamente significativa en el porcentaje de células hCD45+ en la MO de ratón entre las muestras tratadas con control y las tratadas con PGE<2>. Estos resultados indican que el tratamiento con PGE<2>de células hCD34+ no aumentó significativamente el injerto de HSC. Figura 1A. El NCV medio de las células hCD34+ tratadas con PGE<2>injertadas fue aproximadamente dos veces mayor que el NCV medio de las células de control a los 4 meses posteriores al trasplante. Figura 1B.
E JEM PLO 3
CÉLULAS HCD34+ TRANSDUCIDAS EN PRESENCIA DE CONCENTRACIONES AUMENTADAS DE F108 MUESTRAN UN AUMENTO DEPENDIENTE DE LA DOSIS EN LA ENTRADA VIRAL Y NCV
[0514] Las células hCD34+ se transdujeron durante 2 o 24 horas con lentivirus en presencia de sulfato de protamina o una concentración creciente de F108. El efecto de F108 sobre la entrada lentiviral en las células CD34+ humanas se analizó utilizando un ensayo BlaM. Las células se transdujeron con un vector lentiviral que codifica una proteína de fusión p-lactamasa-Vpr. Después de una transducción de 2 horas, las células se lavaron y se incubaron con un sustrato fluorescente de p-lactamasa. A continuación, las células se analizaron mediante citometría de flujo para determinar la escisión del sustrato de p-lactamasa, que se correlaciona con la entrada lentiviral en las células CD34+. El análisis de citometría de flujo reveló que el aumento de las concentraciones de F108 durante la transducción aumentó la entrada de VLV en las células hCD34+, observada como un aumento en el porcentaje de células con sustrato BlaM escindido. El efecto de una mayor entrada de lentivirus parece estabilizarse entre 62,5 y 200 pg/mL de F108. Figura 2A. Las células CD34+ se transdujeron con un VLV que codifica p-globina. Después de 24 horas, las células se lavaron y se sembraron en MethoCult para un cultivo de 14 días. Después de 14 días, las colonias agrupadas se analizaron para NCV. El aumento de las concentraciones de F108 durante la transducción aumentó el NCV en comparación con las células tratadas de control. Figura 2B.
EJEMPLO 4
LAS CÉLULAS CD34+ TRANSDUCIDAS EN PRESENCIA DE F108 NO MUESTRAN DISMINUCIÓN DE LA VIABILIDAD CELULAR
[0515] Las células hCD34+ se transdujeron con el vector, F108 y PGE<2>durante 24 horas, seguidas de un cultivo en MethoCult durante 14 días. Las colonias en MethoCult se enumeraron utilizando STEMvision (Stemcell Technologies). Las células CD34+ transducidas en presencia de F108 solo, PGE<2>solo y F108 y PGE<2>en combinación no alteraron la capacidad de formación de colonias de las células transducidas, lo que indica que no hubo un efecto sustancial en la viabilidad celular o la capacidad de diferenciación. Figura 3.
EJEMPLO 5
TRANSDUCCIÓN CON COPOLÍMEROS DE BLOQUE
[0516] Las células hCD34+ se transdujeron con VLV durante 2 o 24 horas en presencia de sulfato de protamina o concentraciones crecientes de pluronic F<6 8>. Después de dos horas de transducción, las células se lavaron y procesaron para el ensayo de entrada de BlaM. El análisis de flujo mostró que la adición de F<68>a las células hCD34+ durante la transducción afecta negativamente la entrada de VLV. Figura 4A.
[0517] Después de una transducción de 24 horas, las células se lavaron y se cultivaron durante 14 días en MethoCult. Se recogieron colonias agrupadas y se analizaron para detectar NCV. La presencia de F<68>durante la transducción no afecta al NCV de las células hCD34+. Por lo tanto, la capacidad de F108 para aumentar la entrada viral y el NCV no es una propiedad de todos los copolímeros en bloque de poloxámeros. Figura 4B.
EJEMPLO<6>
F108 Y PGE<2>AUMENTAN LA NCV Y LA EFICIENCIA DE TRANSDUCCIÓN EN CÉLULAS HCD34+ TRANSDUCIDAS CON VLV
[0518] Las células hCD34+ se transdujeron durante 24 horas con VLV en presencia de sulfato de protamina, PGE<2>, F108 o la combinación de F108 y PGE<2>. Después de la transducción, las células se lavaron y se cultivaron en MethoCult durante 14 días o en medios que contenían citocinas durante 7 días.
[0519] Después de un cultivo de MethoCult de 14 días, se recogieron colonias agrupadas y se analizaron para NCV. Los datos de NCV promedio se muestran como un aumento de veces en NCV en comparación con el procedimiento de transducción estándar que utiliza sulfato de protamina en el medio de transducción. Figura 5A. La adición de PGE<2>a la transducción da como resultado un aumento de dos veces en NCV. La adición de F108 supera la adición de PGE<2>, y la combinación de F108 y PGE<2>da como resultado un aumento inesperado en NCV. Además, la combinación de F108 y PGE<2>es eficaz cuando la concentración de F108 es de 62,5 pg/mL o 1000 pg/mL.
[0520] Después de un cultivo líquido de 7 días, se recogieron las células y se clasificaron en una placa de 96 pocillos. Las células se lisaron y se sometieron a PCR anidada para determinar la presencia de VLV en una sola célula. El porcentaje de células que contenían tanto VLV como un gen de control endógeno se determinó a partir del número de células que contenían el gen de control endógeno. La eficiencia de transducción de VLV aumentó en las células hCD34+ transducidas en presencia de F108 y PGE<2>en comparación con las células transducidas con F108 solo o las células tratadas con control. Figura 5B.
EJEMPLO 7
EL ANÁLISIS DE COLONIAS INDIVIDUALES DE CÉLULAS HCD34+ TRANSDUCIDAS EN PRESENCIA DE F108 Y PGE<2>MUESTRA UNA MAYOR EFICIENCIA DE TRANSDUCCIÓN Y NCV
[0521] Las células hCD34+ se transdujeron durante 24 horas con VLV en presencia de PGE<2>, F108 o la combinación de PGE<2>y F108. Las células transducidas se cultivaron luego en MethoCult durante 14 días. Después del cultivo, se seleccionaron colonias individuales y se analizaron para NCV. La combinación de PGE<2>y F108 da como resultado un aumento de NCV medio y también una disminución sustancial en el número de colonias con un NCV = 0. Figuras<6>A y<6>B. Estos datos respaldan aún más que la eficiencia de transducción de las células hCD34+ aumentó con el tratamiento de combinación durante la transducción.
EJEMPLO<8>
CÉLULAS HCD34+ TRANSDUCIDAS EN PRESENCIA DE CONCENTRACIONES CRECIENTES DE PGE<2>EN COMBINACIÓN CON LA CONCENTRACIÓN ESTÁTICA DE F108 NO AUMENTA EL NCV
[0522] Las células hCD34+ se transdujeron durante 24 horas con VLV en presencia de sulfato de protamina o F108 y concentraciones crecientes de PGE<2>. Después de 24 horas, las células se lavaron y se sembraron en MethoCult durante 14 días. A continuación, se recogieron las colonias agrupadas y se analizaron para NCV. En presencia de sulfato de protamina, el aumento de las concentraciones de PGE<2>dio como resultado un aumento dependiente de la dosis en NCV. Sin embargo, en presencia de F108, el aumento de las concentraciones de PGE<2>al menos 10 veces no da como resultado un aumento dependiente de la dosis en NCV. Figura 7.
EJEMPLO 9
LAS CÉLULAS CD34+CD38LoCD90+CD45RA TRANSDUCIDAS EN PRESENCIA DE F108 Y PGE<2>MUESTRAN UNA MAYOR EFICIENCIA DE TRANSDUCCIÓN
[0523] Las preparaciones de células a granel se transdujeron en presencia de vector o vector, F108 y PGE<2>durante 24 horas. Después de la transducción, las células se tiñeron con anticuerpos contra marcadores de superficie celular (células CD34+CD38LoCD90+CD45RA). Las células teñidas se clasificaron luego utilizando un clasificador de células Sony. Para cada muestra de células a granel, se clasificaron aproximadamente 20.000 células de las puertas de dispersión frontal y dispersión lateral. Además, se clasificaron entre 10.000 y 16.000 células de cada muestra que eran células CD34+CD38LoCD90+CD45RA (HSC fenotípicas). Las células clasificadas se cultivaron luego en medios que contenían citocinas durante 4 días adicionales para excluir la pseudotransducción del análisis. Después del cultivo, las células se clasificaron luego de forma individual en placas de 96 pocillos y se analizaron mediante el ensayo de PCR de células individuales para evaluar la eficiencia de la transducción. La eficiencia de transducción de las células en masa y de las células CD34+CD38LoCD90+CD45RA transducidas con el procedimiento de transducción estándar (n = 2) fue equivalente. La eficiencia de transducción de las células en masa y de las células CD34+CD38LoCD90+CD45RA transducidas con F108 y PGE<2>(n = 2) también fue equivalente. Además, la eficiencia de transducción tanto de las células en masa como de las células CD34+CD38LoCD90+CD45RA transducidas en presencia de F108 y PGE<2>fue aproximadamente 3-4 veces mayor que la eficiencia de transducción de estas muestras de células en condiciones de transducción estándar. Figura<8>.
EJEMPLO 10
LAS CÉLULAS HCD34+ TRANSDUCIDAS EN PRESENCIA DE F108 Y PGE<2>MUESTRAN UNA MAYOR EFICIENCIA DE TRANSDUCCIÓN CON LENTIVIRUS PREPARADOS A PARTIR DE CULTIVOS EN SUSPENSIÓN
[0524] Los ejemplos 2-9 se realizaron utilizando lentivirus preparados a partir de cultivos de células adherentes. En este ejemplo, el lentivirus se produjo a partir de cultivos en suspensión. Aunque el esquema de purificación del lentivirus difiere entre los lentivirus preparados a partir de cultivos adherentes en comparación con los cultivos en suspensión, las diferencias en la producción y la purificación no afectaron la capacidad de la combinación de F108 y PGE<2>para aumentar el NCV en las células cultivadas en MethoCult el día 14. Hay un aumento aproximado de 2 veces en el NCV con F108 solo, y la combinación de F108 y PGE<2>da como resultado un aumento aproximado de 5 veces con respecto a los métodos de transducción estándar. Figura 9.
EJEMPLO 11
F108 Y PGE<2>AUMENTAN LA TRANSDUCCIÓN DE CÉLULAS HCD34+IN VIVO
[0525] Un lote de células hCD34+ de baja transducción (NCV de ,3 en condiciones estándar) se transdujo con un vector lentiviral en presencia de sulfato de protamina, PGE<2>, F108 (200 jg/mL o 1000 |jg/mL), o la combinación de PGE<2>y F108 durante 24 horas. Después de la transducción, las células se lavaron y se inyectaron inmediatamente en ratones NSG tratados con busulfán.
[0526] Se retuvo una alícuota de células del injerto para el análisis de NCV y de la eficiencia de transducción. Las células hCD34+ tratadas con PGE<2>y F108 aumentaron la NCV media aproximadamente 3 veces en comparación con las células de control tratadas con sulfato de protamina. Figura 10A. La NCV aumentó aún más cuando se utilizaron PGE<2>y F108 en combinación. Figura 10A. Se utilizó el análisis de qPCR de colonias individuales para medir la eficiencia de transducción de las células hCD34+ tratadas con los diversos agentes. Las eficiencias de transducción de las células hCD34+ aumentaron de ~20 % (control, sulfato de protamina), a ~40 % (células tratadas con PGE<2>o F108), o a ~65-80 % (células tratadas con PGE<2>y F108). Figura 10B.
[0527] Dos meses después del trasplante, se sacrificaron 5 ratones/grupo y se extrajo y analizó la médula ósea para evaluar el NCVin vivo.El NCVin vivode las células injertadas transducidas en presencia de sulfato de protamina fue muy similar al NCV del injerto (~ 0,3). El NCVin vivoaumentó aproximadamente 2 veces en las células tratadas con PGE<2>. Las células tratadas con F108, ya sea solo o en combinación con PGE<2>, mostraron aumentos comparables en el NCVin vivode aproximadamente 1,2, una mejora de 4 veces sobre las condiciones de transducción estándar (sulfato de protamina). Figura 10C. Los aumentos relativos en el NCVin vivoson comparables a las eficiencias de transducción relativas de los injertos.
[0528] Cuatro meses después del trasplante, se sacrificaron 5 ratones/grupo y se extrajo y analizó la médula ósea para evaluar el NCVin vivo.El NCVin vivode las células injertadas transducidas en presencia de sulfato de protamina fue muy similar al NCV del injerto (~ 0,3). El NCVin vivoaumentó aproximadamente 1,6 veces en las células tratadas con PGE<2>. Las células tratadas con F108, ya sea solo o en combinación con PGE<2>, mostraron aumentos comparables en el NCVin vivode aproximadamente 1,0-1,2, una mejora de aproximadamente 2,6 a aproximadamente 3 veces con respecto a las condiciones de transducción estándar (sulfato de protamina). Figura 10D.
[0529] Los aumentos relativos en NCVin vivomedidos a los cuatro meses posteriores al trasplante son comparables a las eficiencias de transducción relativas de los injertos.
EJEMPLO 12
CAPACIDAD DE INJERTO Y DIFERENCIACIÓN DE CÉLULAS HCD34+ TRATADAS EN PRESENCIA DE F108 Y PGE<2>
[0530] Dos meses y cuatro meses después del trasplante, se extrajo médula ósea de los ratones trasplantados que se analizaron en el Ejemplo 11. Se analizó la médula ósea para determinar el injerto de células hCD34+. Las células se tiñeron con un cóctel de anticuerpos que reconocen diversos marcadores de superficie celular (CD45, CD33, CD3, CD19) y se analizaron mediante citometría de flujo. Todos los grupos demostraron un alto nivel (~80 %) de injerto de hCD34+ y no hubo un efecto estadísticamente significativo de F108 o PGE<2>. Figura 11A-E. Además, no hubo una diferencia significativa en la proporción de células mieloides (CD33+) o linfoides (CD3+ o CD19+) independientemente del tratamiento (F108, PGE<2>o combinación). Estos datos indican que los potenciadores de NCV, por ejemplo, F108, PGE<2>, no afectan la capacidad de las células hCD34+ transducidas para injertarse ni tampoco sesgan el potencial de diferenciación de las células injertadas.
EJEMPLO 13
F108 Y ESTAUROSPORINA AUMENTAN NCV EN CÉLULAS HCD34+ TRANSDUCIDAS CON VLV
[0531] Las células hCD34+ se transdujeron durante 24 horas con VLV en presencia de sulfato de protamina (estándar), estaurosporina, F108 o la combinación de F108 y estaurosporina. Después de la transducción, las células se lavaron y se cultivaron en MethoCult durante 14 días.
[0532] Después de un cultivo de MethoCult de 14 días, se recogieron colonias agrupadas y se analizaron para NCV. Los datos de NCV se muestran como un aumento de veces en NCV en comparación con el procedimiento de transducción estándar que utiliza sulfato de protamina en el medio de transducción. La adición de F108 a la transducción da como resultado un aumento de dos veces en NCV; la adición de estaurosporina supera la adición de F108, y la combinación de F108 y estaurosporina da como resultado un aumento inesperado en NCV en comparación con el tratamiento con F108 o estaurosporina solos. Figura 12.
EJEMPLO 14
LAS CÉLULAS HCD34+ TRANSDUCIDAS EN PRESENCIA DE F 127 SOLO O EN COMBINACIÓN CON PGE<2>AUMENTAN NCV
[0533] Las células hCD34+ se transdujeron durante 24 horas con VLV en presencia de sulfato de protamina o uno de dos poloxámeros, F108 o F127, con o sin PGE<2>. F127 tiene una masa molecular mayor que F108.
[0534] Después de 24 horas, las células se lavaron y se sembraron en MethoCult durante 14 días. A continuación, se recogieron las colonias agrupadas y se analizaron para NCV. F108 aumenta NCV aproximadamente el doble en comparación con el sulfato de protamina, y aumenta aún más NCV en presencia de PGE<2>. Otro poloxámero, F127, aumentó NCV aproximadamente el doble en dos concentraciones probadas, 100 pg/mLy 1000 pg/mL, en comparación con el sulfato de protamina. Además, F127 combinado con PGE<2>aumentó NCV de manera similar a la combinación de F108 y PGE<2>. Figura 13. Por el contrario, F<68>(véase el Ejemplo 5), que tiene una masa molecular de aproximadamente la mitad de F108, no aumenta NCV ni la eficiencia de transducción de las células hCD34+.
EJEMPLO 15
LAS CÉLULAS HCD34+ TRANSDUCIDAS EN PRESENCIA DE P105 SOLO O EN COMBINACIÓN CON PGE<2>AUMENTAN EL NCV
[0535] Las células hCD34+ se transdujeron durante 24 horas con VLV en presencia de sulfato de protamina o uno de dos poloxámeros, F105 o F108, y F 105 con PGE<2>. F127 tiene una masa molecular mayor que F108.
[0536] Después de 24 horas, las células se lavaron y se sembraron en MethoCult durante 14 días. A continuación, se recogieron las colonias agrupadas y se analizaron para NCV. P105 aumenta NCV aproximadamente 3 veces en ambas concentraciones de prueba en comparación con el sulfato de protamina (estándar) y aumenta aún más NCV en presencia de PGE<2>. Figura 14. Por el contrario, F<68>(ver Ejemplo 5), no aumenta NCV ni la eficiencia de transducción de las células hCD34+.
EJEMPLO 16
POLOXÁMEROS QUE AUMENTAN EL NCV EN CÉLULAS HCD34+
[0537] Las células hCD34+ se enriquecieron a partir de sangre periférica movilizada y se transdujeron durante 24 horas con VLV en presencia de sulfato de protamina o P105, F127, F108 o F98 con y sin adición de PGE<2>. A continuación, las células se cultivaron en MCCM para controlar el crecimiento celular y se sembraron en MethoCult para la formación de colonias y el análisis de NCV. P105, F127, F108 y F98 no afectan la capacidad de las células para crecer. El reemplazo de sulfato de protamina con P105, F127, F108 o F98 aumentó el NCV, que aumentó aún más con la adición de PGE<2>. Figura 15.
EJEMPLO 17
POLOXÁMEROS QUE AUMENTAN EL NCV Y DISMINUYEN LA SUPERVIVENCIA CELULAR DE LAS CÉLULAS HCD34+
[0538] Las células hCD34+ se enriquecieron a partir de sangre periférica movilizada y se transdujeron durante 24 horas con VLV en presencia de sulfato de protamina o P123, P104, L101 o F108 con y sin adición de PGE<2>. A continuación, las células se cultivaron en MCCM para controlar el crecimiento celular y se sembraron en MethoCult para la formación de colonias y el análisis de NCV. El reemplazo de sulfato de protamina con P123, P104 o L101 aumentó el NCV pero también disminuyó el crecimiento celular. PGE<2>aumentó aún más el NCV en combinación con P123. El NCV se calculó a partir de cultivos de MCCM el día 7 para P123 y L101 debido a la formación insuficiente de colonias en las muestras de MethoCult. Figura 16.
EJEMPLO 18
POLOXÁMEROS QUE NO AUMENTAN EL NCV NI AFECTAN LA SUPERVIVENCIA CELULAR DE LAS CÉLULAS HCD34+
[0539] Las células hCD34+ se enriquecieron a partir de sangre periférica movilizada y se transdujeron durante 24 horas con VLV en presencia de sulfato de protamina o F87, F<8 8>, F<68>o F108 con y sin adición de PGE<2>. A continuación, las células se cultivaron en MCCM para controlar el crecimiento celular y se sembraron en MethoCult para la formación de colonias y el análisis de NCV. F87, F<88>y F<68>no afectan el crecimiento celular ni aumentan el NCV. Figura 17.
EJEMPLO 19
F108 Y PGE<2>AUMENTAN EL NCV DE LAS CÉLULAS p<0>/p<0>HCD34+
[0540] Las células hCD34+ se enriquecieron a partir de sangre periférica movilizada de un paciente que tenía un genotipo p°/p° y se transdujeron durante 24 horas con el VLV clínico BB305 que codifica pA-T87Q humano a un MOI de 20 en presencia de 200 pg/mL de F108 y 10 pM de dinoprostona (PGE<2>). Se cultivaron alícuotas de las células hCD34+ transducidas ex vivo en MCCM suplementado con citocinas durante 7 días para eliminar las secuencias VLV no integradas para determinar el % de células VLV+ o las células se cultivaron en MethoCult durante 14 días para la formación de colonias y el análisis de NCV.
[0541] %VLV+: Se aislaron células individuales mediante FACS y se depositaron en placas de 96 pocillos que contenían tampón de lisis. Después de la lisis, se amplificó la secuencia específica viral de un vector lentiviral que codifica una variante de p-globina mediante PCR junto con una secuencia genómica de control que no estaba presente en el vector. A continuación, se analizaron los productos de PCR de cada célula individual mediante qPCR para detectar la presencia de secuencia genómica, lo que indica que la célula se había capturado con éxito. Para cada célula capturada, se utilizó qPCR para identificar si también estaba presente la secuencia viral, lo que indicaba que la célula había sido transducida con el vector lentiviral. A continuación, la fracción del vector se calculó el número de células positivas en todo el conjunto de células muestreadas. El %VLV+ de las células p<0>/p<0>hCD34+ fue de aproximadamente el 77 %. Figura 18, panel derecho.
[0542] NCV: El día 14 se seleccionaron colonias y se las sometió a un ensayo de PCR anidada de una sola célula para determinar el NCV. El NCV de las células hCD34+ fue de aproximadamente 2,9 copias por genoma diploide. Figura 18, panel izquierdo.
EJEMPLO 20
F108 Y PGE<2>AUMENTAN LA ENUCLEOSIS DE CÉLULAS p<0>/p<0>HCD34+ DIFERENCIADAS ERITROIDES [0543] Las células hCD34+ se enriquecieron a partir de sangre periférica movilizada y se transdujeron durante 24 horas con VLV a un MOI de 20 en presencia de sulfato de protamina o F108 con PGE<2>. Las células hCD34+ transducidas se sembraron en un cultivo de expansión eritroide durante 7 días seguido de un cultivo de diferenciación eritroide durante 10 días. Las células diferenciadas se recolectaron luego por centrifugación, se tiñeron con el colorante de ADN DRAQ5 y se analizaron por FACS para cuantificar la fracción de células enucleadas negativas al ADN. La combinación de F108 con PGE<2>restauró el número de células eritroides enucleadas de donantes p<0>/p<0>al número casi normal de células eritroides enucleadas de donantes sanos. Figura 19.
EJEMPLO 21
F108 Y PGE<2>AUMENTAN EL %HBA EN CÉLULAS ERITROIDES DIFERENCIADAS p<0>/p<0>HCD34+
[0544] Las células hCD34+ se enriquecieron a partir de sangre periférica movilizada y se transdujeron durante 24 horas con VLV a un MOI de 20 en presencia de sulfato de protamina o F108 con PGE<2>. Las células hCD34+ transducidas se sembraron en cultivo de expansión eritroide durante 7 días seguido de cultivo de diferenciación eritroide durante 10 días. Las células diferenciadas se recolectaron luego por centrifugación, se tiñeron con el colorante de ADN DRAQ5 y se analizaron por FACS para cuantificar la fracción de células enucleadas negativas al ADN. Las células diferenciadas también se lisaron en tampón ACK y los lisados se analizaron por HPLC de intercambio iónico para cuantificar la fracción de proteína hemoglobina A (HbA). La combinación de F108 con PGE<2>restauró el nivel de HbA de los donantes p<0>/p<0>al nivel de HbA casi normal en donantes sanos. Figura 20.
EJEMPLO 22
F108 Y PGE<2>AUMENTAN EL NCV DE LAS CÉLULAS HCD34+ DE PACIENTES CON SCD
[0545] Se extrajeron células hCD34+ de la médula ósea de un paciente con SCD. Las células se transdujeron durante 24 horas con el VLV clínico BB305 que codifica pA-T87Q humano a un MOI de 30 en presencia de 200 pg/mL de F108 y 10 pM de dinoprostona (PGE<2>). Se cultivaron alícuotas de las células hCD34+ transducidasex vivoen MCCM suplementado con citocinas durante 7 días para eliminar las secuencias VLV no integradas para determinar el % de células VLV+ o las células se cultivaron en MethoCult durante 14 días para la formación de colonias y el análisis de NCV.
[0546] %VLV+: Se aislaron células individuales mediante FACS y se depositaron en placas de 96 pocillos que contenían tampón de lisis. Después de la lisis, se amplificó la secuencia específica viral de un vector lentiviral que codifica una variante de p-globina mediante PCR junto con una secuencia genómica de control no presente en el vector. Los productos de PCR de cada célula individual se analizaron luego mediante qPCR para detectar la presencia de secuencia genómica, lo que indica una célula capturada con éxito. Para cada célula capturada, se utilizó qPCR para identificar si también está presente la secuencia viral, lo que indica que la célula había sido transducida con el vector lentiviral. A continuación, se calculó la fracción de células positivas al vector en todo el conjunto de células muestreadas. El %VLV+ de las células SCD hCD34+ fue de aproximadamente el 83 %.
[0547] NCV: El día 14 se seleccionaron colonias y se las sometió a un ensayo de PCR anidada de una sola célula para determinar el NCV. El NCV de las células hCD34+ fue de aproximadamente 3,3 copias por genoma diploide.
E JEM PLO 23
F108 NO ALTERA SIGNIFICATIVAMENTE LA DIFERENCIACIÓN DE COLONIAS
[0548] Las células CD34+ humanas se transdujeron con<8>pg/mL de sulfato de protamina (SP), 10 pg/mL de F108 (F108Lo), 1000 pg/mL de F108 (F108HÍ) o 1000 pg/mL de<f>108 en combinación con<8>pg/mL de sulfato de protamina (F108HÍ/SP). Se enumeraron las colonias y se determinó que eran del linaje eritroide o mieloide. Ni el SP ni el F108 afectaron significativamente la capacidad de los progenitores hematopoyéticos para formar colonias. Figura 21. EJEMPLO 24
F108 Y PGE<2>AUMENTAN LA EFICIENCIA DE TRANSDUCCIÓN LENTIVIRAL EN HSCS FENOTÍPICOS [0549] Las células CD34+ humanas se transdujeron con un vector lentiviral GFP (VLV) y posteriormente se cultivaron en medios que contenían citocinas. Después de 4 días de cultivo, estas células se tiñeron para detectar marcadores de superficie celular que caracterizan fenotípicamente a las HSC de largo plazo (CD34+CD38-CD45RA-CD90+CD49f+). El análisis de citometría de flujo de las células transducidas mostró que la proporción de células que expresaban GFP cuando se transducían con condiciones de transducción estándar utilizando sulfato de protamina era aproximadamente del 30 % y aumentaba al 45 % con la adición de PGE<2>. La proporción de HSC de largo plazo fenotípicas transducidas aumentó a >90 % en células transducidas en presencia de F108, con o sin la suplementación de PGE<2>. Figura 22. EJEMPLO 25
F108 Y PGE<2>AUMENTAN LA NCV EN LOTES DE HSC CON DIFERENTE TRANSDUCIBILIDAD
[0550] Lotes de células CD34+ humanas clasificados como transductores bajos, medios o altos, mediante la transducción con un lentivirus en presencia de sulfato de protamina (SP). Los lotes de células con transductores bajos tenían un NCV < 0,5 copias/genoma diploide (c/dg); los lotes de células con transductores medios tenían un NCV entre 0,5 c/dg y 1,0 c/dg; y los lotes de células con transductores altos tenían un NCV > 1 c/dg.
[0551] Tres lotes de células (629, 702 y 010) representativos de transductores bajos, medios y altos, respectivamente, se transdujeron con el vector LentiGlobin BB305 a un MOI de 25 o 50. Las células se transdujeron utilizando condiciones de transducción estándar (SP) o con F108 y PGE<2>. El aumento de NCV se correlacionó con una mayor transducibilidad del lote de células cuando las células se transdujeron en presencia de SP, pero no cuando las células se transdujeron en presencia de F108 y PGE<2>. Los datos muestran que los lotes de células con menor transducción reciben una mayor mejora de NCV que los lotes de células con mayor transducción en presencia de F108 y PGE<2>, lo que sugiere que el efecto de mejora de NCV se estabiliza y da como resultado una casi normalización de las NCV del producto farmacéutico. Figura 23.
EJEMPLO 26
F108 Y PGE<2>AUMENTAN LA EFICIENCIA DE TRANSDUCCIÓN Y NCV EN CÉLULAS HCD34+ TRANSDUCIDAS CON UN VECTOR LENTIVIRAL X-SCID
[0552] Las células CD34+ humanas se transdujeron con un vector lentiviral (VLV) que comprendía un promotor EF1a unido operativamente a un polinucleótido que codifica IL2Ry. El VLV se preparó mediante transfección transitoria (transitoria) o se produjo mediante líneas celulares productoras (PrCL1 y PrCL2). Las células se preestimularon en medios que contenían citocinas durante 48 horas y se transdujeron durante 24 horas a un MOI de 10 o 30 utilizando condiciones de transducción estándar de<8>pg/mL de sulfato de protamina (SP) o 200 pg/mL de F108 y 10 pM de PGE<2>. Después de la transducción, las células se sembraron en metilcelulosa y se cultivaron durante aproximadamente 14 días para permitir la formación de colonias progenitoras hematopoyéticas. Se tomaron imágenes de las colonias para enumerarlas y luego se agruparon para el análisis de NCV o se extrajeron colonias individuales para la qPCR de colonias individuales para determinar el NCV medio y la proporción de colonias transducidas (%VLV+).
[0553] La transducción en sulfato de protamina produjo NCV por debajo de 1,5; el NCV aumentó con el aumento del MOI para VLV preparado transitoriamente o VLV producido a partir de PrCL1 pero no cuando VLV se produjo a partir de PrCL2 (figura 24, panel superior izquierdo). La transducción en sulfato de protamina produjo alrededor de un 50 60 % de colonias VLV+ para VLV preparado transitoriamente y alrededor de un 20-30 % de colonias VLV+ cuando se utilizó VLV de PrCL1 o PrCL2 (figura 24, panel superior medio). El sulfato de protamina no afectó significativamente la formación de colonias (figura 24, panel superior derecho). La transducción en presencia de F108 y PGE<2>aumentó el NCV más de 2X a un MOI de 10 para VLV preparado transitoriamente y más de 4x a un MOI de 30 para VLV preparado transitoriamente y VLV producido a partir de PrCL1 o PrCL2 (figura 24, panel inferior izquierdo). Además, la transducción a un MOI de 30 en presencia de F108 y PGE<2>produjo más del 95 % de colonias VLV+ para VLV preparado transitoriamente y VLV producido a partir de PrCL1 (figura 24, panel inferior medio). F108 y PGE<2>no afectaron significativamente la formación de colonias (figura 24, panel inferior derecho).
E JEM PLO 27
F108 Y PGE<2>AUMENTAN LA EFICIENCIA DE TRANSDUCCIÓN Y NCV EN HSC TRANSDUCIDAS CON UN VECTOR LENTIVIRAL TRIPEPTIDIL PEPTIDASA (TPP1)
[0554] Las células CD34+ humanas se transdujeron con un vector lentiviral (VLV) que comprendía un promotor EF1a o un promotor MND unido operativamente a un polinucleótido que codifica TPP1. Las células se preestimularon en un medio que contenía citocinas durante 48 horas y se transdujeron durante 24 horas a un MOI de 5 o 15 utilizando condiciones de transducción estándar de<8>pg/mLde sulfato de protamina (SP) o 200 pg/mLde F108 y 10 pM de PGE<2>. Después de la transducción, las células se sembraron en metilcelulosa y se cultivaron durante aproximadamente 14 días para permitir la formación de colonias progenitoras hematopoyéticas. Las colonias se agruparon para el análisis de NCV.
[0555] La transducción en sulfato de protamina produjo NCV por debajo de 1,5 y el NCV aumentó con el aumento del MOI. Se observaron aumentos sustanciales en NCV en células transducidas en presencia de F108 y PGE<2>en cualquiera de los MOI (figura 25, panel superior izquierdo). Después de que las células transducidas se cultivaron en citocinas durante 7 días, se analizaron los sedimentos celulares y los sobrenadantes para determinar la actividad de TPP-1. La actividad de TPP-1 fue mayor en células con NCV más altos, es decir, células transducidas en presencia de F108 y PGE<2>(figura 25, paneles superior medio y superior derecho).
[0556] La médula ósea de ratón depletada de linaje se transdujo con el VLV MND-TPP1 en MOI de 5, 15 o 30, en presencia de SP o F108 y PGE<2>. El NCV aumentó en las células cultivadas con citocinas el día 7 en todos los MOI de 5, 15 y 30 (figura 25, panel inferior izquierdo). Se extrajeron colonias individuales y se analizaron por qPCR para NCV de progenitores hematopoyéticos de ratón; F108 y PGE<2>aumentaron el NCV en estas células (figura 25, panel inferior medio). F108 y PGE<2>también aumentaron sustancialmente la eficiencia de transducción (figura 25, panel inferior derecho).
EJEMPLO 28
F108 Y PGE<2>AUMENTAN LA EFICIENCIA DE TRANSDUCCIÓN Y NCV EN CÉLULAS HCD34+ TRANSDUCIDAS CON UN VECTOR LENTIVIRAL DE CASSETTE DE UNIÓN A ATP, SUBFAMILIA D, MIEMBRO 1 (ABCD1)
[0557] Las células CD34+ humanas de pacientes con AMN (figura 26, paneles A-D), pacientes con ALD (figura 26, paneles E-H) y donantes sanos (HD; Figura 26, paneles IL) se transdujeron con un vector lentiviral (VLV) que carecía de un WPRE y que comprendía un promotor de MND unido operativamente a un polinucleótido que codificaba ABCD1. Las células se preestimularon en un medio que contenía citocinas durante 48 horas y se transdujeron durante 24 horas utilizando condiciones de transducción estándar de<8>pg/mL de sulfato de protamina (SP) o 200 pg/mL de F108, 10 pM de PGE<2>o F108 y PGE<2>. Después de la transducción, las células se sembraron en metilcelulosa y se cultivaron durante aproximadamente 14 días para permitir la formación de colonias progenitoras hematopoyéticas o se cultivaron en un medio que contenía citocinas durante 7 días. Las células cultivadas se tiñeron intracelularmente para la expresión de ALDP el día 4 o 5 y se analizaron por citometría de flujo. F108, PGE<2>y F108 y PGE<2>aumentaron el número de células que expresaban ALDP, que también se mejoró al aumentar el MOI (figura 26, paneles A, E, I). F108, PGE<2>y F108 y PGE<2>aumentaron NCV en D7 en células cultivadas con citocinas (figura 26, paneles B, F, J) y colonias de metilcelulosa agrupadas D14 (figura 26, paneles C, G, K). Los NCV más altos generados utilizando el VLV MND-ABCD1 se correlacionan con recuentos de colonias reducidos (figura 26, paneles D, H, L). La Figura 26, paneles H y L muestran que F108 solo aumentó NCV con menos efectos en el recuento de colonias, particularmente en MOI más bajos. Por lo tanto, en ciertas circunstancias, por ejemplo cuando los altos NCV de VLV particulares están asociados con recuentos de colonias disminuidos, los poloxámeros solos pueden usarse para aumentar el NCV a MOI bajos sin afectar la formación de colonias, aumentando así la expresión de proteínas con el beneficio de usar menos VLV.
EJEMPLO 29
ABORDAJE DE NCV ESPECÍFICOS CON F108 Y PGE<2>
[0558] Las células CD34+ humanas se transdujeron con VLV a un MOI de 25 en presencia de sulfato de protamina o a un MOI de 10 en presencia de F108 y PGE<2>con el objetivo de dirigirse a NCV similares en el producto final. No hubo diferencia significativa entre las condiciones de tratamiento cuando se analizó NCV de células cultivadas con citocinas el día 7 o células cultivadas con metilcelulosa el día 14 (figura 27, panel izquierdo). Tampoco hubo diferencia significativa en la formación de colonias entre las condiciones de tratamiento (figura 27, panel central).
[0559] Se utilizó qPCR de colonias individuales para evaluar las diferencias en la composición. Los NCV medios de los productos fueron similares. Las células transducidas a un MOI de 10 con F108 y PGE<2>tuvieron un %VLV+ más alto en comparación con las células transducidas a un MOI de 25 con sulfato de protamina, y la distribución de los NCV de colonias individuales fue de 0 a 4 para las células transducidas a un MOI de 10 con F108 y PGE<2>y de 0 a<6>en las células transducidas a un MOI de 25 con sulfato de protamina (figura 27, panel derecho). Por lo tanto, F108 y PGE<2>se pueden utilizar para reducir el costo de los bienes mientras se produce un producto farmacéutico que tiene un perfil de riesgo reducido y otras características deseables.
EJEMPLO 30
ANÁLISISIN VIVODE CÉLULAS CD34+ HUMANAS TRATADAS CON F 127
[0560] Como material de partida para la transducción, se aíslan células CD34+ humanas normales mediante leucoféresis de un único donante voluntario sano después de la movilización con factor estimulante de colonias de granulocitos (G CSF). Las células se dividen en diferentes alícuotas y se someten a transducción a gran escala con LentiGlobin BB305 VLV a un valor de multiplicidad de infección (MOI) de aproximadamente 25 a aproximadamente 50 utilizando<8>pg/mL de sulfato de protamina o 200 pg/mL de F127 y 10 pM de PGE<2>. Las HSC se criopreservan después de la transducción y posteriormente se administran a ratones NSG después de la descongelación, lo que da como resultado un ciclo de congelación/descongelación posterior a la transducción.
[0561] Después de la transducción, los productos de control y de prueba se caracterizan completamente. Los cultivos de CFC se analizan para determinar los valores de NCV compuestos, los valores de NCV de colonias individuales y las colonias %VLV+. Los cultivos eritroides se analizan para determinar la globina %pA T87Q producida. La transducción con F127 aumentará el NCV compuesto, los NCV de colonias individuales y las colonias %VLV+, en comparación con las células transducidas con sulfato de protamina. La médula ósea se caracterizará a los 2 y 4 meses para evaluar el NCV y el %VLV+ en las HSC en repoblación a corto y largo plazo.
EJEMPLO 31
ANÁLISISIN VIVODE CÉLULAS CD34+ HUMANAS TRATADAS CON P105
[0562] Como material de partida para la transducción, se aíslan células CD34+ humanas normales mediante leucoféresis de un único donante voluntario sano después de la movilización con factor estimulante de colonias de granulocitos (G CSF). Las células se dividen en diferentes alícuotas y se someten a transducción a gran escala con LentiGlobin BB305 VLV a un valor de multiplicidad de infección (MOI) de aproximadamente 25 a aproximadamente 50 utilizando<8>pg/mLde sulfato de protamina o 200 pg/mLde P105 y 10 pM de PGE<2>. Las HSC se criopreservan después de la transducción y posteriormente se administran a ratones NSG después de la descongelación, lo que da como resultado un ciclo de congelación/descongelación posterior a la transducción.
[0563] Después de la transducción, los productos de control y de prueba se caracterizan completamente. Los cultivos de CFC se analizan para determinar los valores de NCV compuestos, los valores de NCV de colonias individuales y las colonias %VLV+. Se analizaron los cultivos eritroides para determinar la globina %pA T87Q producida. La transducción con P105 aumentará los valores de NCV compuestos, los valores de NCV de colonias individuales y las colonias %VLV+, en comparación con las células transducidas con sulfato de protamina. Se caracterizará la médula ósea a los 2 y 4 meses para evaluar los valores de NCV y %VLV+ en las HSC en repoblación a corto y largo plazo. EJEMPLO 32
ANÁLISISIN VIVODE CÉLULAS CD34+ HUMANAS TRATADAS CON F98
[0564] Como material de partida para la transducción, se aíslan células CD34+ humanas normales mediante leucoféresis de un único donante voluntario sano después de la movilización con factor estimulante de colonias de granulocitos (G CSF). Las células se dividen en diferentes alícuotas y se someten a transducción a gran escala con LentiGlobin BB305 VLV a un valor de multiplicidad de infección (MOI) de aproximadamente 25 a aproximadamente 50 utilizando<8>pg/mL de sulfato de protamina o 200 pg/mL de F98 y 10 pM de PGE<2>. Las HSC se criopreservan después de la transducción y posteriormente se administran a ratones NSG después de la descongelación, lo que da como resultado un ciclo de congelación/descongelación posterior a la transducción.
[0565] Después de la transducción, los productos de control y de prueba se caracterizan completamente. Los cultivos de CFC se analizan para determinar los valores de NCV compuestos, los valores de NCV de colonias individuales y las colonias %VLV+. Los cultivos eritroides se analizan para determinar la globina %pA T87Q producida. La transducción con F98 aumentará el NCV compuesto, los NCV de colonias individuales y las colonias %VLV+, en comparación con las células transducidas con sulfato de protamina. La médula ósea se caracterizará a los 2 y 4 meses para evaluar el NCV y el %VLV+ en las HSC en repoblación a corto y largo plazo.

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un método para transducir una población de células madre o progenitoras hematopoyéticas CD34+ que comprende cultivar las células en un medio de cultivo, en presencia de un vector lentiviral, prostaglandina E<2>(PGE<2>) o 16,16-dimetil PGE<2>y poloxámero 407, en donde La población de células se transduce al menos aproximadamente 24 horas.
2. El método de la reivindicación 1, en el que:
(a) el vector lentiviral está presente en un MOI de aproximadamente 10 a aproximadamente 30;
(b) el vector lentiviral está presente en un MOI de aproximadamente 10 a aproximadamente 25;
(c) el vector lentiviral está presente en un MOI de aproximadamente 10 a aproximadamente 20; o
(d) el vector lentiviral está presente en un MOI de aproximadamente 10, aproximadamente 11, aproximadamente 12, aproximadamente 13, aproximadamente 14, aproximadamente 15, aproximadamente 16, aproximadamente 17, aproximadamente 18, aproximadamente 19, aproximadamente 20, aproximadamente 21, aproximadamente 22, aproximadamente 23, aproximadamente 24, aproximadamente 25, aproximadamente 26, aproximadamente 27, aproximadamente 28, aproximadamente 29 o aproximadamente 30.
3. El método de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que la población de células hematopoyéticas se transduce en la presencia de un polímero policatiónico o un polímero policatiónico seleccionado del grupo que consiste en: polibreno, sulfato de protamina, polietilenimina o un copolímero de bloque de polietilenglicol/poli-L-lisina.
4. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que:
(a) el vector lentiviral se deriva de un lentivirus
seleccionado del grupo que consiste en: VIH (virus de inmunodeficiencia humana; incluido el tipo VIH) 1 y VIH tipo 2); virus visna-maedi (VVM); El virus de la artritis-encefalitis caprina (VAEC); virus de la anemia infecciosa equina (VAIE);
virus de inmunodeficiencia felina (VIF); virus de inmunodeficiencia bovina (VIB); y virus de inmunodeficiencia simia (VIS);
(b) el vector lentiviral se deriva de un lentivirus del VIH; y/o
(c) el vector lentiviral se deriva de un lentivirus VIH-1.
5. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que:
(a) el vector lentiviral codifica un casete de proteína de unión a ATP, subfamilia D, polipéptido de miembro 1 (ABCD1); o
(b) el vector lentiviral comprende un potenciador del virus del sarcoma mieloproliferativo, región de control negativo eliminada, promotor sustituido del sitio de unión del cebador d1587rev (MND) o un fragmento transcripcionalmente activo del mismo unido operativamente a un polinucleótido que codifica un polipéptido del casete de unión a ATP, subfamilia D, miembro 1 (ABCD1).
6. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que:
(a) el vector lentiviral comprende un polinucleótido que codifica la adenosina desaminasa; o
(b) el vector lentiviral comprende un promotor de elongación del factor 1 alfa unido operativamente a un polinucleótido que codifica la adenosina desaminasa.
7. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que:
(a) el vector lentiviral codifica el receptor de interleucina 2 gamma; o
(b) el vector lentiviral comprende un promotor del factor de elongación 1 alfa unido operativamente a un polinucleótido que codifica el receptor de interleucina 2 gamma.
8. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que:
(a) el vector lentiviral codifica la tripeptidil peptidasa 1; o
(b) el vector lentiviral comprende un promotor del factor de elongación 1 alfa o comprende un potenciador del virus del sarcoma mieloproliferativo, región de control negativo eliminada, promotor sustituido por el sitio de unión del cebador d1587rev (MND) unido operativamente a un polinucleótido que codifica la tripeptidil peptidasa 1.
9. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que:
(a) el vector lentiviral codifica la alfa-L iduronidasa; o
(b) el vector lentiviral comprende un promotor del factor de elongación<1>alfa o comprende un potenciador del virus del sarcoma mieloproliferativo, región de control negativo eliminada, promotor sustituido por el sitio de unión del cebador d1587rev (MND) unido operativamente a un polinucleótido que codifica la alfa-L iduronidasa.
10. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que:
(a) el vector lentiviral codifica la iduronato<2>-sulfatasa; o
(b) el vector lentiviral comprende un promotor del factor de elongación<1>alfa o comprende un potenciador del virus del sarcoma mieloproliferativo, región de control negativo eliminada, promotor sustituido por el sitio de unión del cebador d1587rev (MND) unido operativamente a un polinucleótido que codifica iduronato 2-sulfatasa.
11. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el vector lentiviral es un vector AnkT9W, un vector T9Ank2W, un vector TNS9, un vector de lentiglobina HPV569, un vector de lentiglobina BB305, un vector BG-1, un vector BGM-1, un vector d432pAY, un vector mLARpAYV5, un vector GLOBE, un vector G-GLOBE, un vector pAS3-FB, un vector V5, un vector V5m3, un vector V5m3-400, un vector G9 o un vector BCL11A shmir.
12. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que el vector lentiviral comprende:
a) un terminal de 5' de largo (LTR);
b) una señal de empaquetamiento Psi (^);
c) un elemento exportador de ARN;
d) un tracto central de polipurina lentiviral (cPPT);
e) un promotor unido operativamente a un polinucleótido de interés; y
f) un SIN 3' LTR.
13. El método de la reivindicación 12, en el que:
(a) el 5' LTR es un 5' LTR modificado que comprende además una deleción en comparación con el 5' LTR de tipo salvaje;
(b) el promotor del LTR 5' se reemplaza con un promotor heterólogo seleccionado del grupo que consiste en: un promotor del citomegalovirus (CMV), un promotor del virus del sarcoma de Rous (RSV) o un promotor del virus de simio 40 (SV40);
(c) el elemento de exportación de ARN comprende un elemento regulador postranscripcional del virus de la hepatitis B (PRE) o un elemento de respuesta rev del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) (RRE); (d) la LTR 3' comprende una secuencia de poliadenilación;
(e) el promotor comprende uno o más elementos de un LCR de p-globina humana;
(f) el promotor comprende los sitios hipersensibles a la ADNasa I 2, 3 y 4 del LCR de p-globina humana; o (g) el vector lentiviral comprende además un elemento potenciador 3' de p-globina humana.
14. El método de la reivindicación 12 o la reivindicación 13, en el que:
(a) el polinucleótido de interés codifica una proteína antifalciforme o un gen de globina; o
(b) el polinucleótido de interés codifica una proteína anti-drepanocitosis o un gen de globina que se selecciona del grupo que consiste en: una proteína p-globina humana, una proteína<6>-globina humana, una proteína<y>-globina humana, una proteína pA'T87Q-globina humana, una proteína pA'G16D/E22A/T87Q-globina humana y una proteína pA-T87Q/K95E/K120E-globina humana.
15. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en el que las células madre o progenitoras hematopoyéticas CD34+ se seleccionan para la expresión de CD34+ antes de la transducción.
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