JP2002335998A - Ｖｅｇｆの生物活性を定量するためのｖｅｇｆ応答性細胞をベースとしたアッセイ - Google Patents
Ｖｅｇｆの生物活性を定量するためのｖｅｇｆ応答性細胞をベースとしたアッセイInfo
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 ＶＥＧＦの生物活性を定量するためのＶＥＧ
Ｆ応答性細胞をベースとしたアッセイのための方法の提
供。 【解決手段】 このアッセイはサンプル中のＶＥＧＦ生
物活性を定量する方法において、確立されたシグナル伝
達経路を利用することからなる。すなわち、ＶＥＧＦ活
性をアッセイするサンプルを、発現可能なレポーターエ
レメントおよびそれに隣接して配置されるＤＮＡ結合部
位を有するレポーターベクター、リン酸化可能なタンパ
ク質およびＤＮＡ結合部位に特異的に結合するＤＮＡ結
合ドメインをコードする遺伝子からなるキメラ的トラン
ス活性化が可能なベクター、ならびにＶＥＧＦ活性を示
すレポーターエレメントの発現の存在を検出するＶＥＧ
Ｆ受容体の遺伝子をコードする発現ベクターによってト
ランスフェクトされた細胞からなる安定な細胞系と接触
させる工程、ついでレポーターエレメントの発現がＶＥ
ＧＦ活性を示すレポーターエレメントを発現させる工程
からなる。
Ｆ応答性細胞をベースとしたアッセイのための方法の提
供。 【解決手段】 このアッセイはサンプル中のＶＥＧＦ生
物活性を定量する方法において、確立されたシグナル伝
達経路を利用することからなる。すなわち、ＶＥＧＦ活
性をアッセイするサンプルを、発現可能なレポーターエ
レメントおよびそれに隣接して配置されるＤＮＡ結合部
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ク質およびＤＮＡ結合部位に特異的に結合するＤＮＡ結
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ス活性化が可能なベクター、ならびにＶＥＧＦ活性を示
すレポーターエレメントの発現の存在を検出するＶＥＧ
Ｆ受容体の遺伝子をコードする発現ベクターによってト
ランスフェクトされた細胞からなる安定な細胞系と接触
させる工程、ついでレポーターエレメントの発現がＶＥ
ＧＦ活性を示すレポーターエレメントを発現させる工程
からなる。
Description
【０００１】
【技術分野】本発明は一般的にサンプル中の血管内皮増
殖因子（ＶＥＧＦ）の検出に関する。特に、本発明はＶ
ＥＧＦの生物活性の測定に使用するためのＶＥＧＦ応答
性細胞をベースとしたアッセイに関する。
殖因子（ＶＥＧＦ）の検出に関する。特に、本発明はＶ
ＥＧＦの生物活性の測定に使用するためのＶＥＧＦ応答
性細胞をベースとしたアッセイに関する。
【０００２】
【背景技術】ＶＥＧＦには血管形成の促進を含む多数の
生物学的性質が知られている。他の性質には内皮細胞の
遊走、内皮細胞の増殖、インビトロ毛細血管の形成、内
皮細胞のアポトーシスの阻害、およびインビボにおける
血管透過性の増大による浮腫の産生がある。
生物学的性質が知られている。他の性質には内皮細胞の
遊走、内皮細胞の増殖、インビトロ毛細血管の形成、内
皮細胞のアポトーシスの阻害、およびインビボにおける
血管透過性の増大による浮腫の産生がある。
【０００３】ＶＥＧＦは多くの重要な生物学的性質を有
するので、ＶＥＧＦおよびその性質の検出のためのアッ
セイの重要性が増大してきた。
するので、ＶＥＧＦおよびその性質の検出のためのアッ
セイの重要性が増大してきた。
【０００４】これまでに開発されたインビトロバイオア
ッセイの一つはＶＥＧＦに応答して遊走するヒト臍帯静
脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の能力に基づくものである。
このバイオアッセイは、まずラット−２（Ｒat−２）細
胞をウイルスでトランスフェクトし、その結果ＶＥＧＦ
タンパク質を産生する細胞を得、ついで産生されたタン
パク質抽出液についてＨＵＶＥＣの遊走刺激能を試験す
る各工程を包含する。このアッセイは細胞の条件付け培
地においてＶＥＧＦタンパク質によって刺激された内皮
細胞の遊走の証明に使用できるものではあるが、このア
ッセイには時間のかかる多くの工程が包含され、これら
の自動化は容易ではない。
ッセイの一つはＶＥＧＦに応答して遊走するヒト臍帯静
脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の能力に基づくものである。
このバイオアッセイは、まずラット−２（Ｒat−２）細
胞をウイルスでトランスフェクトし、その結果ＶＥＧＦ
タンパク質を産生する細胞を得、ついで産生されたタン
パク質抽出液についてＨＵＶＥＣの遊走刺激能を試験す
る各工程を包含する。このアッセイは細胞の条件付け培
地においてＶＥＧＦタンパク質によって刺激された内皮
細胞の遊走の証明に使用できるものではあるが、このア
ッセイには時間のかかる多くの工程が包含され、これら
の自動化は容易ではない。
【０００５】最近、ＶＥＧＦは高血圧症を有する患者に
おける心血管系疾患のリスクのマーカーになりうること
が提案された。患者のＶＥＧＦおよび／またはＦＬＴ−
２レベルの測定は高血圧症治療の有効性のインディケー
ターになり得る。
おける心血管系疾患のリスクのマーカーになりうること
が提案された。患者のＶＥＧＦおよび／またはＦＬＴ−
２レベルの測定は高血圧症治療の有効性のインディケー
ターになり得る。
【０００６】ＶＥＧＦの重要性が明らかに増大している
現在では、従来のアッセイほど複雑ではなく、自動化可
能で、またＶＥＧＦ受容体（ＶＥＧＦ−Ｒ）／ＦＬＫ−
１シグナル伝達経路につながるレポータータンパク質に
直接連結するＶＥＧＦ応答性アッセイをもつことは有利
であるとともに望ましい。
現在では、従来のアッセイほど複雑ではなく、自動化可
能で、またＶＥＧＦ受容体（ＶＥＧＦ−Ｒ）／ＦＬＫ−
１シグナル伝達経路につながるレポータータンパク質に
直接連結するＶＥＧＦ応答性アッセイをもつことは有利
であるとともに望ましい。
【０００７】
【発明の開示】本発明はサンプル中のＶＥＧＦ活性を定
量する方法を提供する。本発明はまた、ＶＥＧＦ受容体
を修飾する化合物を同定するために有用な二次スクリー
ニングに関する。
量する方法を提供する。本発明はまた、ＶＥＧＦ受容体
を修飾する化合物を同定するために有用な二次スクリー
ニングに関する。
【０００８】本発明はまた、ＶＥＧＦ機能のインヒビタ
ーとして化合物をスクリーニングするための一次スクリ
ーニング機構を提供する。
ーとして化合物をスクリーニングするための一次スクリ
ーニング機構を提供する。
【０００９】本発明はまた、ＶＥＧＦ生物活性を定量す
るために有用であり、ＶＥＧＦ機能またはＶＥＧＦ受容
体機能を修飾する化合物のスクリーニングに有用な安定
な細胞系を提供する。
るために有用であり、ＶＥＧＦ機能またはＶＥＧＦ受容
体機能を修飾する化合物のスクリーニングに有用な安定
な細胞系を提供する。
【００１０】以下の詳細な説明を添付の図面と関連させ
て考慮しながら参照すれば、本発明の他の利点は容易に
明らかにされ、よりよく理解されるもの確信する。図面
において：図１(Ａ)は、ＶＥＧＦ応答性アッセイを例示
するグラフであり、様々な血清とのプレインキュベーシ
ョン条件の効果をルシフェラーゼ発現の増加の関数とし
て示す。この場合、細胞はＶＥＧＦ添加２４時間前に接
種し、ＶＥＧＦ添加４８時間後に収穫した。図１(Ｂ)
は、図１(Ａ)に示したグラフと類似のＶＥＧＦ応答性ア
ッセイを例示するグラフであり、アッセイに用いたＶＥ
ＧＦの濃度は図１Ａにおける２５ng／mLに対して５０ng
／mLまで上昇させた。図２は、ＶＥＧＦ受容体で安定に
トランスフェクトされたＨela-ルシフェラーゼＨＬＲ−
ＥＬＫ−１細胞系におけるルシフェラーゼの発現に対す
る細胞密度およびＶＥＧＦ121濃度の効果を例示する。
図３は、ＨＬＲ−ＥＬＫ−１細胞系におけるルシフェラ
ーゼのＶＥＧＦ刺激産生を例示するグラフであり、この
場合、ＶＥＧＦ121濃度を変動させ各ウエルに接種する
細胞数は約５０,０００の一定に維持した。図４は、Ｖ
ＥＧＦ受容体で安定にトランスフェクトされたＨＬＲ−
ＥＬＫ−１細胞系におけるルシフェラーゼのＶＥＧＦ刺
激産生を例示するグラフであり、この場合、各ウエルに
接種する細胞数は約 50,000 の一定に維持し、ＶＥＧＦ
121の濃度は変動させた。図５は、ＶＥＧＦ受容体細胞
系におけるルシフェラーゼの産生に対するＶＥＧＦ抗体
の効果を例示する。図６はＶＥＧＦ-受容体（ＶＥＧＦ
Ｒ）細胞系におけるルシフェラーゼの産生を例示するグ
ラフであり、この場合、インキュベーション時間を２４
時間および４８時間について比較した。図７は、ＶＥＧ
Ｆ受容体細胞系におけるルシフェラーゼの産生の刺激に
至適なＶＥＧＦ濃度を例示するグラフである。図８は、
ＶＥＧＦ受容体細胞系におけるＶＥＧＦ誘導ルシフェラ
ーゼ産生に至適な時間を例示するグラフである。図９
は、ＶＥＧＦ受容体細胞系におけるＶＥＧＦ刺激ルシフ
ェラーゼの産生に対する化合物ＺＤ４１９０（既知ＶＥ
ＧＦ受容体チロシンキナーゼの阻害剤）の効果を例示す
るグラフである。図１０は、ＶＥＧＦ受容体細胞系をＡ
dＶＥＧＦ121でトランスフェクトしたのちにおけるルシ
フェラーゼの産生を例示するグラフである。図１１は、
ＡdＶＥＧＦ121でトランスフェクトしたラット-2 細胞
からの培地を用いたＶＥＧＦ刺激を受けたルシフェラー
ゼの産生を例示するグラフである。
て考慮しながら参照すれば、本発明の他の利点は容易に
明らかにされ、よりよく理解されるもの確信する。図面
において：図１(Ａ)は、ＶＥＧＦ応答性アッセイを例示
するグラフであり、様々な血清とのプレインキュベーシ
ョン条件の効果をルシフェラーゼ発現の増加の関数とし
て示す。この場合、細胞はＶＥＧＦ添加２４時間前に接
種し、ＶＥＧＦ添加４８時間後に収穫した。図１(Ｂ)
は、図１(Ａ)に示したグラフと類似のＶＥＧＦ応答性ア
ッセイを例示するグラフであり、アッセイに用いたＶＥ
ＧＦの濃度は図１Ａにおける２５ng／mLに対して５０ng
／mLまで上昇させた。図２は、ＶＥＧＦ受容体で安定に
トランスフェクトされたＨela-ルシフェラーゼＨＬＲ−
ＥＬＫ−１細胞系におけるルシフェラーゼの発現に対す
る細胞密度およびＶＥＧＦ121濃度の効果を例示する。
図３は、ＨＬＲ−ＥＬＫ−１細胞系におけるルシフェラ
ーゼのＶＥＧＦ刺激産生を例示するグラフであり、この
場合、ＶＥＧＦ121濃度を変動させ各ウエルに接種する
細胞数は約５０,０００の一定に維持した。図４は、Ｖ
ＥＧＦ受容体で安定にトランスフェクトされたＨＬＲ−
ＥＬＫ−１細胞系におけるルシフェラーゼのＶＥＧＦ刺
激産生を例示するグラフであり、この場合、各ウエルに
接種する細胞数は約 50,000 の一定に維持し、ＶＥＧＦ
121の濃度は変動させた。図５は、ＶＥＧＦ受容体細胞
系におけるルシフェラーゼの産生に対するＶＥＧＦ抗体
の効果を例示する。図６はＶＥＧＦ-受容体（ＶＥＧＦ
Ｒ）細胞系におけるルシフェラーゼの産生を例示するグ
ラフであり、この場合、インキュベーション時間を２４
時間および４８時間について比較した。図７は、ＶＥＧ
Ｆ受容体細胞系におけるルシフェラーゼの産生の刺激に
至適なＶＥＧＦ濃度を例示するグラフである。図８は、
ＶＥＧＦ受容体細胞系におけるＶＥＧＦ誘導ルシフェラ
ーゼ産生に至適な時間を例示するグラフである。図９
は、ＶＥＧＦ受容体細胞系におけるＶＥＧＦ刺激ルシフ
ェラーゼの産生に対する化合物ＺＤ４１９０（既知ＶＥ
ＧＦ受容体チロシンキナーゼの阻害剤）の効果を例示す
るグラフである。図１０は、ＶＥＧＦ受容体細胞系をＡ
dＶＥＧＦ121でトランスフェクトしたのちにおけるルシ
フェラーゼの産生を例示するグラフである。図１１は、
ＡdＶＥＧＦ121でトランスフェクトしたラット-2 細胞
からの培地を用いたＶＥＧＦ刺激を受けたルシフェラー
ゼの産生を例示するグラフである。
【００１１】
【発明の詳述】本発明は、ＶＥＧＦの生物活性を定量す
るための、ＶＥＧＦ応答性細胞をベースとしたアッセイ
およびそれに使用する安定な細胞系を提供する。本発明
のアッセイは、血漿、細胞培養培地、組織からの組織抽
出液もしくはＶＥＧＦ ＤＮＡ配列でトランスフェクト
された細胞またはそれらの組み合わせを包含する生物学
的サンプルに由来するＶＥＧＦの生物活性の測定を可能
にする。本発明の方法はまた、ＶＥＧＦ受容体特にＦＬ
Ｋ−１の新規な小分子修飾物質（インヒビターまたはア
クティベーター）を同定するための高スループットスク
リーニングおよび二次スクリーニングにおける使用に適
合させることができる。
るための、ＶＥＧＦ応答性細胞をベースとしたアッセイ
およびそれに使用する安定な細胞系を提供する。本発明
のアッセイは、血漿、細胞培養培地、組織からの組織抽
出液もしくはＶＥＧＦ ＤＮＡ配列でトランスフェクト
された細胞またはそれらの組み合わせを包含する生物学
的サンプルに由来するＶＥＧＦの生物活性の測定を可能
にする。本発明の方法はまた、ＶＥＧＦ受容体特にＦＬ
Ｋ−１の新規な小分子修飾物質（インヒビターまたはア
クティベーター）を同定するための高スループットスク
リーニングおよび二次スクリーニングにおける使用に適
合させることができる。
【００１２】本発明のアッセイは、発現可能なレポータ
ーエレメントおよびそれに隣接して配置されるＤＮＡ結
合エレメントを有するレポーターベクターで安定にトラ
ンスフェクトされたＨeＬa 細胞からなる安定なＶＥＧ
Ｆ応答性細胞系を利用する。好ましくは、レポーターベ
クターには、結合エレメント好ましくはＧＡＬ4 結合エ
レメントに連結する基本的プロモーターエレメント好ま
しくはＴＡＴＡボックスの下流に配置される検出可能な
遺伝子産物をコードする遺伝子が包含される。安定な細
胞系はまたＣＭＶプロモーター駆動ＥＬＫ-1 転写因子
（これはＭＡＰキナーゼ経路に結ばれる）をコードする
ベクターによりトランスフェクトされ、酵母ＧＡＬ４Ｄ
ＮＡ結合ドメインならびに酵母ＧＡＬ4 結合エレメント
駆動ルシフェラーゼレポーター構築体に融合される。マ
ウスＦＬＫ−１ＶＥＧＦ受容体を発現できる遺伝子をコ
ードする第三のベクターもこの細胞にトランスフェクト
され、これから発生する安定な細胞系はＶＥＧＦの存在
下に検出可能な遺伝子産物（ルシフェラーゼ発現）のア
ップレギュレーションを証明するために使用することが
できる。すなわち確立されたシグナル伝達経路を利用し
てＶＥＧＦ生物活性がアッセイされ得る。
ーエレメントおよびそれに隣接して配置されるＤＮＡ結
合エレメントを有するレポーターベクターで安定にトラ
ンスフェクトされたＨeＬa 細胞からなる安定なＶＥＧ
Ｆ応答性細胞系を利用する。好ましくは、レポーターベ
クターには、結合エレメント好ましくはＧＡＬ4 結合エ
レメントに連結する基本的プロモーターエレメント好ま
しくはＴＡＴＡボックスの下流に配置される検出可能な
遺伝子産物をコードする遺伝子が包含される。安定な細
胞系はまたＣＭＶプロモーター駆動ＥＬＫ-1 転写因子
（これはＭＡＰキナーゼ経路に結ばれる）をコードする
ベクターによりトランスフェクトされ、酵母ＧＡＬ４Ｄ
ＮＡ結合ドメインならびに酵母ＧＡＬ4 結合エレメント
駆動ルシフェラーゼレポーター構築体に融合される。マ
ウスＦＬＫ−１ＶＥＧＦ受容体を発現できる遺伝子をコ
ードする第三のベクターもこの細胞にトランスフェクト
され、これから発生する安定な細胞系はＶＥＧＦの存在
下に検出可能な遺伝子産物（ルシフェラーゼ発現）のア
ップレギュレーションを証明するために使用することが
できる。すなわち確立されたシグナル伝達経路を利用し
てＶＥＧＦ生物活性がアッセイされ得る。
【００１３】一般に、既知のシグナル伝達関連および／
または経路を利用して、ＶＥＧＦの生物活性をアッセイ
するサンプルを上述のような安定な細胞系を含有する容
器中に配置する。サンプル中にＶＥＧＦが存在すれば、
ＶＥＧＦは、安定な細胞系により発現されるＦＬＫ−１
を活性化する。ＶＥＧＦ受容体として知られる活性化さ
れたＦＬＫ−１はついでＭＡＰキナーゼを活性化する
（Kroll & Waltenberger,J.Biol.Chem. 1997, 272:3252
1-32527; Doanesら, Biochem. Biophys. Res. Comm. 19
99, 255: 545-548)。活性化ＭＡＰキナーゼは、融合ト
ランス活性化タンパク質をリン酸化する（ＥＬＫ−１融
合ＧＡＬ４ＤＮＡ結合ドメイン［dbd］)。リン酸化され
た融合タンパク質は、ルシフェラーゼ発現を活性化する
レポーターベクターのＧＡＬ4 ＤＮＡ結合部位に結合す
る。ルシフェラーゼの発現は本技術分野において周知の
技術を用いて検出することができる。ルシフェラーゼの
存在または発現はサンプル中のＶＥＧＦ活性を指示す
る。
または経路を利用して、ＶＥＧＦの生物活性をアッセイ
するサンプルを上述のような安定な細胞系を含有する容
器中に配置する。サンプル中にＶＥＧＦが存在すれば、
ＶＥＧＦは、安定な細胞系により発現されるＦＬＫ−１
を活性化する。ＶＥＧＦ受容体として知られる活性化さ
れたＦＬＫ−１はついでＭＡＰキナーゼを活性化する
（Kroll & Waltenberger,J.Biol.Chem. 1997, 272:3252
1-32527; Doanesら, Biochem. Biophys. Res. Comm. 19
99, 255: 545-548)。活性化ＭＡＰキナーゼは、融合ト
ランス活性化タンパク質をリン酸化する（ＥＬＫ−１融
合ＧＡＬ４ＤＮＡ結合ドメイン［dbd］)。リン酸化され
た融合タンパク質は、ルシフェラーゼ発現を活性化する
レポーターベクターのＧＡＬ4 ＤＮＡ結合部位に結合す
る。ルシフェラーゼの発現は本技術分野において周知の
技術を用いて検出することができる。ルシフェラーゼの
存在または発現はサンプル中のＶＥＧＦ活性を指示す
る。
【００１４】
【実施例】以下の実施例は本発明をさらに例示する。実
施例は単に本発明の例示を意図するものであり、限定を
意味するものではない。
施例は単に本発明の例示を意図するものであり、限定を
意味するものではない。
【００１５】方法 細胞系の産生 ＧＡＬ４ルシフェラーゼレポーターならびにＧＡＬ４Ｄ
ＮＡ結合ドメインおよび転写因子ＥＬＫ−１のトランス
活性化ドメインから構成される融合タンパク質（ＧＡＬ
４−ＥＬＫ−１融合）を発現するベクターで安定にトラ
ンスフェクトされたＨeＬa細胞は Stratagene Inc. か
ら購入した。これらの細胞は、ＣＭＶ駆動ＦＬＫ−１発
現ベクター（Ludwig Institute, Germany承認）および
Invitrogenから入手したＨeＬa細胞中 Zeocin選択発現
ベクター（ｐｃＤＮＡ３.１／zeo(＋), ＃Ｖ860−20）
でコトランスフェクトした。適当な抗生物質で選択後、
ＶＥＧＦに対してルシフェラーゼの発現増大によって応
答する安定なトランスフェクタントを同定した。
ＮＡ結合ドメインおよび転写因子ＥＬＫ−１のトランス
活性化ドメインから構成される融合タンパク質（ＧＡＬ
４−ＥＬＫ−１融合）を発現するベクターで安定にトラ
ンスフェクトされたＨeＬa細胞は Stratagene Inc. か
ら購入した。これらの細胞は、ＣＭＶ駆動ＦＬＫ−１発
現ベクター（Ludwig Institute, Germany承認）および
Invitrogenから入手したＨeＬa細胞中 Zeocin選択発現
ベクター（ｐｃＤＮＡ３.１／zeo(＋), ＃Ｖ860−20）
でコトランスフェクトした。適当な抗生物質で選択後、
ＶＥＧＦに対してルシフェラーゼの発現増大によって応
答する安定なトランスフェクタントを同定した。
【００１６】細胞培養およびルシフェラーゼアッセイ 至適にトランスフェクトされたＶＥＧＦ受容体細胞系
（以下、クローン＃５と呼ぶ）を１０％ウシ胎児血清
（ＦＢＳ）、ゲネチシン（250μg／mL)、ハイグロマイ
シンＢ（100μg／mL）およびゼオシン（100μg／mL）を
含むダルベッコ修飾イーグルメジウム（Life Technolog
ies, Gaithersburg, MD）中に維持した。細胞を２４ウ
エル培養プレート中に接種して付着させたのち、ＶＥＧ
Ｆ121（298-VS−005, R & D Systems, Minneapolis, M
D）を指示した濃度で添加してルシフェラーゼの産生を
刺激した。ルシフェラーゼ活性は刺激２４〜４８時間後
Promega Corporation（Ｅ151, Madison, WI）から入手
できるルシフェラーゼアッセイシステムの技術説明書に
略述されたようにして測定した。細胞をＰＢＳで洗浄後
200μLの１×レポーター溶解緩衝液中で溶解させた。プ
レート全体を−８０℃で凍結し、細胞の溶解を進行させ
た。解凍して細胞抽出液５０μLを９６ウエルプレート
に移した。ルシフェラーゼアッセイ試薬を自動的に注入
し、生成した光をマイクロプレートルミノメーターで測
定した。
（以下、クローン＃５と呼ぶ）を１０％ウシ胎児血清
（ＦＢＳ）、ゲネチシン（250μg／mL)、ハイグロマイ
シンＢ（100μg／mL）およびゼオシン（100μg／mL）を
含むダルベッコ修飾イーグルメジウム（Life Technolog
ies, Gaithersburg, MD）中に維持した。細胞を２４ウ
エル培養プレート中に接種して付着させたのち、ＶＥＧ
Ｆ121（298-VS−005, R & D Systems, Minneapolis, M
D）を指示した濃度で添加してルシフェラーゼの産生を
刺激した。ルシフェラーゼ活性は刺激２４〜４８時間後
Promega Corporation（Ｅ151, Madison, WI）から入手
できるルシフェラーゼアッセイシステムの技術説明書に
略述されたようにして測定した。細胞をＰＢＳで洗浄後
200μLの１×レポーター溶解緩衝液中で溶解させた。プ
レート全体を−８０℃で凍結し、細胞の溶解を進行させ
た。解凍して細胞抽出液５０μLを９６ウエルプレート
に移した。ルシフェラーゼアッセイ試薬を自動的に注入
し、生成した光をマイクロプレートルミノメーターで測
定した。
【００１７】実施例１ ルシフェラーゼ活性に対する血清プレインキュベーショ
ン条件の影響 ＶＥＧＦの添加24時間前に細胞をウエルに播種した。Ｖ
ＥＧＦ２５ng／mLの添加４８時間後に細胞を収穫した。
細胞を様々な条件：(１)１０％ＦＢＳ、(２)０.２％ＦＢ
Ｓ、(３)血清なし、または(４)ニュートリドーマ、血清
を含まないメジウム補充物とプレインキュベートした。
結果は図１Ａに示す。至適血清プレインキュベーション
条件は１０％ＦＢＳ中プレインキュベーションであるこ
とが見出された。添加するＶＥＧＦ濃度を５０ng／mLに
増大させたほかは同一の実験を行った。結果は図１Ｂに
示す。ＶＥＧＦ濃度の増大はルシフェラーゼの発現を上
昇させることが見出された。
ン条件の影響 ＶＥＧＦの添加24時間前に細胞をウエルに播種した。Ｖ
ＥＧＦ２５ng／mLの添加４８時間後に細胞を収穫した。
細胞を様々な条件：(１)１０％ＦＢＳ、(２)０.２％ＦＢ
Ｓ、(３)血清なし、または(４)ニュートリドーマ、血清
を含まないメジウム補充物とプレインキュベートした。
結果は図１Ａに示す。至適血清プレインキュベーション
条件は１０％ＦＢＳ中プレインキュベーションであるこ
とが見出された。添加するＶＥＧＦ濃度を５０ng／mLに
増大させたほかは同一の実験を行った。結果は図１Ｂに
示す。ＶＥＧＦ濃度の増大はルシフェラーゼの発現を上
昇させることが見出された。
【００１８】実施例２ 細胞密度およびＶＥＧＦ121濃度のルシフェラーゼ発現
に及ぼす影響 細胞は上述のように調製した。ＶＥＧＦ121の添加24時
間前に細胞をウエルに接種した。ＶＥＧＦ121をそれぞ
れ２５および５０ng／mLの濃度で細胞に加えた。ウエル
に接種した細胞を５０、１００、１５０および２００Ｋ
／ウエルの密度で試験した。結果は図２に示す。
に及ぼす影響 細胞は上述のように調製した。ＶＥＧＦ121の添加24時
間前に細胞をウエルに接種した。ＶＥＧＦ121をそれぞ
れ２５および５０ng／mLの濃度で細胞に加えた。ウエル
に接種した細胞を５０、１００、１５０および２００Ｋ
／ウエルの密度で試験した。結果は図２に示す。
【００１９】実施例３ 親細胞系（ＨＬＲ−ＥＬＫ−１）におけるＶＥＧＦに対
する用量応答 細胞は上述のように調製した。５０Ｋ／ウエルを接種
し、実験中を通じて１０％ＦＢＳ中に維持した。ＶＥＧ
Ｆ121を添加する24時間前にウエルに細胞を接種し、Ｖ
ＥＧＦ121の添加48時間後に細胞を収穫し、分析した。
結果を図３に示す。結果は親細胞系が対照と同様、ＶＥ
ＧＦ121刺激に応答を示さないというものであった。
する用量応答 細胞は上述のように調製した。５０Ｋ／ウエルを接種
し、実験中を通じて１０％ＦＢＳ中に維持した。ＶＥＧ
Ｆ121を添加する24時間前にウエルに細胞を接種し、Ｖ
ＥＧＦ121の添加48時間後に細胞を収穫し、分析した。
結果を図３に示す。結果は親細胞系が対照と同様、ＶＥ
ＧＦ121刺激に応答を示さないというものであった。
【００２０】実施例４ ＶＥＧＦ受容体で安定にトランスフェクトされたＨＬＲ
−ＥＬＫ−１細胞系の用量応答 細胞は上述のように調製した。細胞をＦＬＫ−１ＶＥＧ
Ｆ受容体を発現するプラスミドベクターでトランスフェ
クトし、５０Ｋ／ウエルに接種し、実験中を通じて１０
％ＰＢＳ中に維持した。接種24時間後にＶＥＧＦ121を
添加し、ＶＥＧＦ121の添加４８時間後に細胞を収穫し
た。ＶＥＧＦ121の濃度１０、２５、５０、７５、１０
０および１５０ng／mLで試験した。ルシフェラーゼ発現
の最大増加はＶＥＧＦ121濃度１００ng／mLにおいて図
４に示すように認められた。
−ＥＬＫ−１細胞系の用量応答 細胞は上述のように調製した。細胞をＦＬＫ−１ＶＥＧ
Ｆ受容体を発現するプラスミドベクターでトランスフェ
クトし、５０Ｋ／ウエルに接種し、実験中を通じて１０
％ＰＢＳ中に維持した。接種24時間後にＶＥＧＦ121を
添加し、ＶＥＧＦ121の添加４８時間後に細胞を収穫し
た。ＶＥＧＦ121の濃度１０、２５、５０、７５、１０
０および１５０ng／mLで試験した。ルシフェラーゼ発現
の最大増加はＶＥＧＦ121濃度１００ng／mLにおいて図
４に示すように認められた。
【００２１】実施例５ ＶＥＧＦ受容体細胞系の用量応答特異性 ＶＥＧＦ受容体細胞系の用量応答特異性を証明するため
に、細胞を上述のように調製した。トランスフェクトさ
れた細胞をＶＥＧＦ121とインキュベートし、アデノウイ
ルスＮＵＬＬベクター（ＡdＣＬＸ）、抗ヒトＶＥＧＦ
121抗体（ＡＦ−293−ＮＡ［ポリクローナル］、ＭＡＢ
２９３［モノクローナル］，R & D Systems)、ＶＥＧＦ
受容体特異的チロシンキナーゼインヒビター（ＺＤ 419
0, Zeneca［Wedge S.R., Ogilvie D.J. Inhibition of
VEGF signal transduction: Identification of ZD 419
0. Adv. Exp. Med. Biol., 2000; 476 (Angiogenesis:
From the Molecular to Integrative Pharmacology): 3
07-310 および Wedge S.R.,Ogilvie D., Dukes M., Ken
drew J., Curwen J.O., Hennequin L.F., Thomas A.P.
ら, ZD4190: An orally active inhibitor of vascular
endothelial growthfactor signaling with broad-spe
ctrum anti-tumor efficacy. Cancer Res. 2000, 60
(4): 970-975)、様々な濃度のＡＤＶＥＧＦ121でトラン
スフェクトされたラット２細胞からのメジウム、もしく
はＶＥＧＦ受容体細胞系を直接、ＶＥＧＦ121（ＡdGV 1
21.10, CI−1023, GenVec, Inc., Rockville, MD）を様
々な濃度で含むアデノウイルスによって感染させた。
に、細胞を上述のように調製した。トランスフェクトさ
れた細胞をＶＥＧＦ121とインキュベートし、アデノウイ
ルスＮＵＬＬベクター（ＡdＣＬＸ）、抗ヒトＶＥＧＦ
121抗体（ＡＦ−293−ＮＡ［ポリクローナル］、ＭＡＢ
２９３［モノクローナル］，R & D Systems)、ＶＥＧＦ
受容体特異的チロシンキナーゼインヒビター（ＺＤ 419
0, Zeneca［Wedge S.R., Ogilvie D.J. Inhibition of
VEGF signal transduction: Identification of ZD 419
0. Adv. Exp. Med. Biol., 2000; 476 (Angiogenesis:
From the Molecular to Integrative Pharmacology): 3
07-310 および Wedge S.R.,Ogilvie D., Dukes M., Ken
drew J., Curwen J.O., Hennequin L.F., Thomas A.P.
ら, ZD4190: An orally active inhibitor of vascular
endothelial growthfactor signaling with broad-spe
ctrum anti-tumor efficacy. Cancer Res. 2000, 60
(4): 970-975)、様々な濃度のＡＤＶＥＧＦ121でトラン
スフェクトされたラット２細胞からのメジウム、もしく
はＶＥＧＦ受容体細胞系を直接、ＶＥＧＦ121（ＡdGV 1
21.10, CI−1023, GenVec, Inc., Rockville, MD）を様
々な濃度で含むアデノウイルスによって感染させた。
【００２２】細胞をＶＥＧＦ／抗ＶＥＧＦの添加24時間
前に５０Ｋ／ウエルで接種し、48時間後に収穫した。図
５に抗ヒトＶＥＧＦ抗体についての結果を示す。ポリク
ローナル抗体はルシフェラーゼの発現に有意な影響を与
えなかった。モノクローナル抗体は１：１００および
１：１０００の希釈でルシフェラーゼの発現に影響し
た。
前に５０Ｋ／ウエルで接種し、48時間後に収穫した。図
５に抗ヒトＶＥＧＦ抗体についての結果を示す。ポリク
ローナル抗体はルシフェラーゼの発現に有意な影響を与
えなかった。モノクローナル抗体は１：１００および
１：１０００の希釈でルシフェラーゼの発現に影響し
た。
【００２３】図９には、ルシフェラーゼの発現に対する
既知のＶＥＧＦ受容体チロシンキナーゼインヒビター
（ZD 4190）の影響を示す。ＶＥＧＦ受容体チロシンキ
ナーゼインヒビターは用量依存的様式でルシフェラーゼ
の発現に影響した。
既知のＶＥＧＦ受容体チロシンキナーゼインヒビター
（ZD 4190）の影響を示す。ＶＥＧＦ受容体チロシンキ
ナーゼインヒビターは用量依存的様式でルシフェラーゼ
の発現に影響した。
【００２４】図１０には、ＡdＶＥＧＦ121でトランスフ
ェクトされたラット２細胞からのメジウムの使用により
得られたＡdＶＥＧＦ121の効果を示す。ＶＥＧＦ受容体
細胞系へのＡdＶＥＧＦ121の添加は、ＡdＶＥＧＦ121そ
れ自体およびＡdＶＥＧＦ121でトランスフェクトされた
ラット２細胞の両者と類似の応答様式でルシフェラーゼ
の発現に影響した。
ェクトされたラット２細胞からのメジウムの使用により
得られたＡdＶＥＧＦ121の効果を示す。ＶＥＧＦ受容体
細胞系へのＡdＶＥＧＦ121の添加は、ＡdＶＥＧＦ121そ
れ自体およびＡdＶＥＧＦ121でトランスフェクトされた
ラット２細胞の両者と類似の応答様式でルシフェラーゼ
の発現に影響した。
【００２５】実施例６ ＶＥＧＦの添加２４および４８時間後のＶＥＧＦ受容体
細胞系におけるルシフェラーゼの産生 細胞は上述のように調製した。ＶＥＧＦ121は細胞（50
Ｋ／ウエル）の接種２４時間後に加えた。ＶＥＧＦ121
は細胞に２５または５０ng／mLのいずれかの濃度で添加
した。ルシフェラーゼの発現はＶＥＧＦ121の添加２４
時間後およびＶＥＧＦ121の添加４８時間後に測定し
た。結果は図６に示す。ルシフェラーゼの最大発現は、
５０ng／mLのＶＥＧＦ121で処理した細胞においてＶＥ
ＧＦ121の導入２４時間後に認められた。
細胞系におけるルシフェラーゼの産生 細胞は上述のように調製した。ＶＥＧＦ121は細胞（50
Ｋ／ウエル）の接種２４時間後に加えた。ＶＥＧＦ121
は細胞に２５または５０ng／mLのいずれかの濃度で添加
した。ルシフェラーゼの発現はＶＥＧＦ121の添加２４
時間後およびＶＥＧＦ121の添加４８時間後に測定し
た。結果は図６に示す。ルシフェラーゼの最大発現は、
５０ng／mLのＶＥＧＦ121で処理した細胞においてＶＥ
ＧＦ121の導入２４時間後に認められた。
【００２６】実施例７ 至適ＶＥＧＦ濃度の決定 ＶＥＧＦ受容体細胞を５０Ｋ／ウエルにおいて接種し、
実験期間中を通じ１０％ＦＢＳ中でインキュベートし
た。接種２４時間後に、細胞にＶＥＧＦ121を加え、１
８時間後に細胞を収穫した。ＶＥＧＦ121は細胞に次の
濃度で適用した。すなわち、１、５、１０および２００
ng／mLである。結果は図７に示す。至適ＶＥＧＦ121濃
度は約５０ng／mLから約２００ng／mLの範囲である。
実験期間中を通じ１０％ＦＢＳ中でインキュベートし
た。接種２４時間後に、細胞にＶＥＧＦ121を加え、１
８時間後に細胞を収穫した。ＶＥＧＦ121は細胞に次の
濃度で適用した。すなわち、１、５、１０および２００
ng／mLである。結果は図７に示す。至適ＶＥＧＦ121濃
度は約５０ng／mLから約２００ng／mLの範囲である。
【００２７】実施例８ ＶＥＧＦ誘発ルシフェラーゼ産生のための至適インキュ
ベーション時間 細胞は上述のように調製し、ＶＥＧＦ受容体細胞は５０
Ｋ／ウエルで接種し、ＶＥＧＦ121を添加する前に２４
時間１０％ＦＢＳ中でインキュベートした。細胞はＶＥ
ＧＦ121（25ng／mL）の添加後、０.５、１、２、３、
４、５、６、７、８、１８および２４時間に収穫した。
図８にはこの実験の結果を示す。発現時間約 18 時間が
最大のルシフェラーゼの発現（産生）を生じることが見
出された。
ベーション時間 細胞は上述のように調製し、ＶＥＧＦ受容体細胞は５０
Ｋ／ウエルで接種し、ＶＥＧＦ121を添加する前に２４
時間１０％ＦＢＳ中でインキュベートした。細胞はＶＥ
ＧＦ121（25ng／mL）の添加後、０.５、１、２、３、
４、５、６、７、８、１８および２４時間に収穫した。
図８にはこの実験の結果を示す。発現時間約 18 時間が
最大のルシフェラーゼの発現（産生）を生じることが見
出された。
【００２８】明細書中に言及したすべての刊行物は、そ
れぞれ独立の刊行物が引用により特別におよび個々に導
入されたのと同様に、引用によって本明細書に導入され
る。
れぞれ独立の刊行物が引用により特別におよび個々に導
入されたのと同様に、引用によって本明細書に導入され
る。
【００２９】以上、本発明をその特定の実施態様との関
連で説明してきたが、それはさらに修飾が可能であるこ
とを理解すべきである。本出願は、一般的に本発明の原
理に従うすべての変化、使用および適用をカバーする意
図であり、本発明に関連し、本明細書に前述した本質的
な特徴に適用される技術における既知または慣用的な実
務内のこのような本発明からの逸脱を包含する意図であ
る。
連で説明してきたが、それはさらに修飾が可能であるこ
とを理解すべきである。本出願は、一般的に本発明の原
理に従うすべての変化、使用および適用をカバーする意
図であり、本発明に関連し、本明細書に前述した本質的
な特徴に適用される技術における既知または慣用的な実
務内のこのような本発明からの逸脱を包含する意図であ
る。
【図１】ＶＥＧＦ応答性アッセイを例示するグラフであ
り、(Ａ)は様々な血清とのプレインキュベーション条件
の効果をルシフェラーゼ発現の増加の関数として示し、
(Ｂ)は、(Ａ)と類似のＶＥＧＦ応答アッセイを例示する
グラフである。
り、(Ａ)は様々な血清とのプレインキュベーション条件
の効果をルシフェラーゼ発現の増加の関数として示し、
(Ｂ)は、(Ａ)と類似のＶＥＧＦ応答アッセイを例示する
グラフである。
【図２】ＶＥＧＦ受容体で安定にトランスフェクトされ
たＨela−ルシフェラーゼＨＬＲ−ＥＬＫ−１細胞系に
おけるルシフェラーゼの発現に対する細胞密度およびＶ
ＥＧＦ121濃度の効果を例示するグラフである。
たＨela−ルシフェラーゼＨＬＲ−ＥＬＫ−１細胞系に
おけるルシフェラーゼの発現に対する細胞密度およびＶ
ＥＧＦ121濃度の効果を例示するグラフである。
【図３】ＨＬＲ−ＥＬＫ細胞系におけるルシフェラーゼ
のＶＥＧＦ刺激産生を例示するグラフである。
のＶＥＧＦ刺激産生を例示するグラフである。
【図４】ＶＥＧＦ受容体で安定にトランスフェクトされ
たＨＬＲ−ＥＬＫ−１細胞系におけるルシフェラーゼの
ＶＥＧＦ刺激産生を例示するグラフである。
たＨＬＲ−ＥＬＫ−１細胞系におけるルシフェラーゼの
ＶＥＧＦ刺激産生を例示するグラフである。
【図５】ＶＥＧＦ受容体細胞系におけるルシフェラーゼ
の産生に対するＶＥＧＦ抗体の効果を例示するグラフで
ある。
の産生に対するＶＥＧＦ抗体の効果を例示するグラフで
ある。
【図６】ＶＥＧＦ受容体（ＶＥＧＦＲ）細胞系における
ルシフェラーゼの産生を例示するグラフである。
ルシフェラーゼの産生を例示するグラフである。
【図７】ＶＥＧＦ受容体細胞系におけるルシフェラーゼ
の産生の刺激に至適なＶＥＧＦ濃度を例示するグラフで
ある。
の産生の刺激に至適なＶＥＧＦ濃度を例示するグラフで
ある。
【図８】ＶＥＧＦ受容体細胞系におけるＶＥＧＦ誘導ル
シフェラーゼ産生に至適な時間を例示するグラフであ
る。
シフェラーゼ産生に至適な時間を例示するグラフであ
る。
【図９】ＶＥＧＦ受容体細胞系におけるＶＥＧＦ刺激ル
シフェラーゼの産生に対する化合物ＺＤ４１９０（既知
ＶＥＧＦ−受容体チロシンキナーゼの阻害剤）の効果を
例示するグラフである。
シフェラーゼの産生に対する化合物ＺＤ４１９０（既知
ＶＥＧＦ−受容体チロシンキナーゼの阻害剤）の効果を
例示するグラフである。
【図１０】ＶＥＧＦ受容体細胞系をＡdＶＥＧＦ121でト
ランスフェクトしたのちにおけるルシフェラーゼの産生
を例示するグラフである。
ランスフェクトしたのちにおけるルシフェラーゼの産生
を例示するグラフである。
【図１１】ＡdＶＥＧＦ121でトランスフェクトしたラッ
ト−２細胞からのメジウムを用いたＶＥＧＦ刺激を受け
たルシフェラーゼの産生を例示するグラフである。
ト−２細胞からのメジウムを用いたＶＥＧＦ刺激を受け
たルシフェラーゼの産生を例示するグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (72)発明者 ブライアン・バトリー アメリカ合衆国ミシガン州48105．アンア ーバー．プリマスロード2800．ファイザ ー・グローバル・リサーチ・アンド・デヴ ェロップメント．アンアーバー・ラボラト リーズ (72)発明者 トーニ・ケイ・ダーリング アメリカ合衆国ミシガン州48105．アンア ーバー．プリマスロード2800．ファイザ ー・グローバル・リサーチ・アンド・デヴ ェロップメント．アンアーバー・ラボラト リーズ (72)発明者 ソーティリオス・コンスタンティーノウ・ カーラサナシス アメリカ合衆国ミシガン州48105．アンア ーバー．プリマスロード2800．ファイザ ー・グローバル・リサーチ・アンド・デヴ ェロップメント．アンアーバー・ラボラト リーズ (72)発明者 ロバート・リー・パーネック アメリカ合衆国ミシガン州48105．アンア ーバー．プリマスロード2800．ファイザ ー・グローバル・リサーチ・アンド・デヴ ェロップメント．アンアーバー・ラボラト リーズ (72)発明者 イェー・エドワード・ティアーン アメリカ合衆国ミシガン州48105．アンア ーバー．プリマスロード2800．ファイザ ー・グローバル・リサーチ・アンド・デヴ ェロップメント．アンアーバー・ラボラト リーズ Ｆターム(参考） 2G045 AA40 FB03 4B024 AA11 CA04 DA02 EA04 HA08 4B063 QA01 QA08 QA19 QQ02 4B065 AA01X AA57X AA90X AA90Y AB01 CA24 CA46
Claims (14)
- 【請求項１】 サンプル中の血管内皮増殖因子（ＶＥＧ
Ｆ）活性を定量する方法であって、ＶＥＧＦ活性をアッ
セイするサンプルを、発現可能なレポーターエレメント
およびそれに隣接して配置されるＤＮＡ結合部位を有す
るレポーターベクター、リン酸化可能なタンパク質およ
びＤＮＡ結合部位に特異的に結合するＤＮＡ結合ドメイ
ンをコードする遺伝子からなるキメラ的トランス活性化
が可能なベクター、ならびにＶＥＧＦ活性を示すレポー
ターエレメントの発現の存在を検出するＶＥＧＦ受容体
の遺伝子をコードする発現ベクターによってトランスフ
ェクトされた細胞からなる安定な細胞系と接触させる工
程、ついでレポーターエレメントの発現がＶＥＧＦ活性
を示すレポーターエレメントを発現させる工程からなる
上記方法。 - 【請求項２】 レポーターベクターはさらにＧＡＬ４結
合エレメントを含む請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 キメラ的トランス活性化可能なベクター
によってコードされるリン酸化可能なタンパク質はＭＡ
ＰＫによりリン酸化できる請求項１記載の方法。 - 【請求項４】 リン酸化可能なタンパク質はＥＬＫ−１
からなる請求項１記載の方法。 - 【請求項５】 ＶＥＧＦ受容体はＦＬＫ−１からなる請
求項１記載の方法。 - 【請求項６】 接触工程はさらに、サンプル中に存在す
るＶＥＧＦを、発現したＶＥＧＦ受容体と結合させるこ
とからなる請求項１記載の方法。 - 【請求項７】 包含接触工程はさらに、発現したＶＥＧ
Ｆ受容体によりＭＡＰＫを活性化することを含む請求項
６記載の方法。 - 【請求項８】 リン酸化可能なタンパク質およびＤＮＡ
結合ドメインからなるキメラ産物を産生するトランス−
アクティベーターベクターを発現させる工程をさらに含
む請求項７記載の方法。 - 【請求項９】 キメラ産物を活性化ＭＡＰＫでリン酸化
する工程をさらに含む請求項８記載の方法。 - 【請求項１０】 さらに、リン酸化キメラ産物をレポー
ターベクターのＤＮＡ結合部位に結合させる工程をさら
に含み、ここで、発現可能なレポーターエレメントは発
現が活性化され、サンプル中におけるＶＥＧＦの存在を
示す、請求項９記載の方法。 - 【請求項１１】 候補化合物がＶＥＧＦ活性の調節に有
用であるか否かを決定する方法であって、 (ａ) ＶＥＧＦを発現する細胞を提供し、 (ｂ) その細胞を候補化合物と接触させ、 (ｃ) 請求項１記載の方法によりＶＥＧＦ活性を測定す
る工程からなり、ここで、候補化合物と接触させなかっ
た細胞に比較したＶＥＧＦ活性の変化は候補化合物がＶ
ＥＧＦ活性を調節したことを示す、上記方法。 - 【請求項１２】 レポーターベクターは、さらにＧＡＬ
４結合部位を含む請求項１１記載の方法。 - 【請求項１３】 候補化合物がＶＥＧＦ受容体活性の調
節に有用であるか否かを決定する方法において、 (ａ) ＶＥＧＦ受容体ＦＬＫ-1 を発現する細胞を提供
し、 (ｂ) その細胞を候補化合物と接触させ、 (ｃ) ＶＥＧＦ受容体活性を測定する工程からなり、こ
こで、候補化合物と接触させなかった細胞に比較して変
化したＶＥＧＦ活性は候補化合物がＶＥＧＦ受容体活性
を調節したことを示す、上記方法。 - 【請求項１４】 ルシフェラーゼ遺伝子およびＧＡＬ４
ＤＮＡ結合部位をコードするレポーターベクター、ＥＬ
Ｋ−１／ＧＡＬ４ＤＮＡ結合ドメイン融合タンパク質を
コードするキメラトランスアクティベーターベクター、
ならびにＶＥＧＦ受容体ＦＬＫ−１をコードするベクタ
ーでトランスフェクトされた安定な細胞系。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US26820201P | 2001-02-12 | 2001-02-12 | |
| US60/268202 | 2001-02-12 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002335998A true JP2002335998A (ja) | 2002-11-26 |
Family
ID=23021917
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2002032736A Pending JP2002335998A (ja) | 2001-02-12 | 2002-02-08 | Ｖｅｇｆの生物活性を定量するためのｖｅｇｆ応答性細胞をベースとしたアッセイ |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6787323B2 (ja) |
| EP (1) | EP1233074A1 (ja) |
| JP (1) | JP2002335998A (ja) |
| CA (1) | CA2369893A1 (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7595149B1 (en) | 2004-11-08 | 2009-09-29 | University Of Kentucky Research Foundation | Methods for cancer detection |
| US9079953B2 (en) | 2009-06-17 | 2015-07-14 | Abbvie Biotherapeutics Inc. | Anti-VEGF antibodies and their uses |
| WO2012012708A1 (en) * | 2010-07-22 | 2012-01-26 | Regents Of The University Of Minnesota | Induced pluripotent stem cells |
| US20140154255A1 (en) | 2012-11-30 | 2014-06-05 | Abbvie Biotherapeutics Inc. | Anti-vegf antibodies and their uses |
Family Cites Families (2)
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|---|---|---|---|---|
| CN1701814A (zh) * | 1992-11-13 | 2005-11-30 | 马克斯普朗克科学促进协会 | 作为血管内皮生长因子受体的f1k－1 |
| US5981569A (en) * | 1992-11-13 | 1999-11-09 | Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem | Substituted phenylacrylonitrile compounds and compositions thereof for the treatment of disease |
-
2002
- 2002-01-31 CA CA002369893A patent/CA2369893A1/en not_active Abandoned
- 2002-02-05 EP EP02002610A patent/EP1233074A1/en not_active Withdrawn
- 2002-02-07 US US10/072,767 patent/US6787323B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2002-02-08 JP JP2002032736A patent/JP2002335998A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20020110830A1 (en) | 2002-08-15 |
| US6787323B2 (en) | 2004-09-07 |
| CA2369893A1 (en) | 2002-08-12 |
| EP1233074A1 (en) | 2002-08-21 |
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|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20050816 |
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| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20051116 |
|
| A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20051121 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20060613 |