JP2002186479A

JP2002186479A - 無機塩により安定化されたセルラーゼ調製物およびその製造方法

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Publication number: JP2002186479A
Application number: JP2000390180A
Authority: JP
Inventors: Koichiro Murashima; 弘一郎村島; Tomoko Nishimura; 智子西村; Uichi Sato; 右一佐藤; Jinichiro Koga; 仁一郎古賀; Toshiaki Kono; 敏明河野
Original assignee: Meiji Seika Kaisha Ltd
Current assignee: Meiji Seika Kaisha Ltd
Priority date: 2000-12-22
Filing date: 2000-12-22
Publication date: 2002-07-02
Anticipated expiration: 2020-12-22
Also published as: JP4644363B2

Abstract

(57)【要約】【課題】遺伝子操作などによって特定のセルラーゼ成
分の含量を増やした固形セルラーゼ調製物の安定化方法
を提供する。【解決手段】エンドグルカナーゼを全蛋白質重量の１
０重量％以上含有するセルラーゼを含む溶液に二価カチ
オンと塩化物からなる無機塩をエンドグルカナーゼ重量
の９０重量％以上含有せしめ、乾燥することにより、特
定のセルラーゼ成分の含量が多い固体セルラーゼ調製物
の貯蔵安定性が顕著に増大した。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、加工、貯蔵時にお
いてセルラーゼが安定化された固体セルラーゼ調製物と
その製造方法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】セルラーゼは、その特性を活かしてさま
ざまな産業分野で利用されている。具体的な利用分野の
一つは繊維加工分野であり、特にセルロース含有繊維に
所望の特性を与えるための処理がなされている。すなわ
ち、セルロース含有繊維の肌ざわり及び外観を改善する
ために、そして、着色されたセルロース含有繊維に色の
局所的な変化を提供する「ストーンウオッシュ」様外観を
与える「バイオウオッシュ」のためにセルラーゼが使用さ
れている。また、近年では木材パルプ由来のセルロース
を有機溶媒に溶解して紡糸する再生セルロース系繊維で
あるリヨセルが、その強度や吸水性等の性質、さらには
環境汚染を起こしにくい製造法から注目を集めている
が、その製造工程で発生する織物表面の毛羽を除く加工
にセルラーゼが用いられている。

【０００３】従来、セルラーゼは複数の酵素の共同作用
によりセルロースを分解する作用があるとされてきた。
近年、蛋白分離技術や遺伝子技術の進展により、複合酵
素であるセルラーゼから、上記の繊維加工に適した酵素
成分を分離し製造する試みがなされている。とりわけ、
糸状菌のトリコデルマ(Trichoderma)属、フミコーラ(Hu
micola)属由来のセルラーゼについては研究が進み、フ
ミコーラ属では、ＣＢＨＩ、ＥＧＶ、ＮＣＥ４、ＮＣＥ
２などが、トリコデルマ属では、ＣＢＨＩ、ＣＢＨＩ
Ｉ、ＥＧＩＩ、ＥＧＩＩＩなどの成分が単離され、遺伝
子操作によって過剰発現酵素やモノコンポーネント酵素
などを調製することにより、種々の特定セルラーゼ成分
を多量に含むセルラーゼ調製物が製造されるようになっ
てきた。

【０００４】また、従来からセルラーゼを利用するため
にさまざまな手法の製剤化が行われてきた。一般的に
は、セルロースを分解する能力を有する微生物を液体培
養し、その培養濾過液や膜濾過液を噴霧乾燥や凍結乾燥
などの手法により粉末製剤としたり、添加物を加えて液
体製剤とする方法などがある。さらに、粉末製剤を無機
塩や土などに混ぜ込んで造粒加工して粒状製剤とする方
法もある。

【０００５】さらに、製剤化した酵素を安定化する方法
についても検討され、培養濾過液や膜濾過液に合成高分
子等を主成分とする酵素安定化剤や防腐剤を添加する試
みがなされている。例えば、特許３００９６９２号で
は、水溶性ポリマーを用いた安定化水性酵素分散液を開
示しているが、多種類セルラーゼ成分を含む混合セルラ
ーゼ液状製剤を安定化させるものであって、特定のセル
ラーゼ成分を多量に含むセルラーゼ調製物の安定化につ
いては何ら開示がない。また、特開平９−１５４５７６
号では塩で安定化させた酵素配合物を開示しているが、
添加する塩の種類によっては酵素の加工安定性や貯蔵安
定性は低下している。そのため、添加物による酵素の安
定化においては、各々の酵素成分ごとに適切な添加物の
組合せを十分に検討する必要がある。

【０００６】近年の技術の進展により得られるようにな
った特定のセルラーゼ成分を多量に含有するセルラーゼ
調製物は、従来の混合セルラーゼ製剤と比較して著しく
安定性が低い。そのため、製剤化する工程中、あるいは
製剤後や製剤をさらに加工した後の貯蔵期間中における
酵素活性の損失が特に問題となっている。そのため、商
業的に安定なセルラーゼ酵素製剤を調製するために、従
来よりも高い安定性が得られ、かつ簡便で経済的な安定
化法の開発が望まれてきた。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】特定のセルラーゼ成分
を含有するセルラーゼ調製物を、簡便かつ経済的に安定
化する手法の開発を課題とする。

【０００８】

【課題を解決するための手段】発明者らは、種々の化合
物を液体状態のセルラーゼの溶液に添加後、噴霧乾燥し
て得られたセルラーゼ粉末調製物の加工安定性と貯蔵安
定性を評価した。その結果、フミコーラ属セルラーゼの
繊維加工に有効な酵素成分である国際公開第ＷＯ９８／
０３６４０に記載されたエンドグルカナーゼＮＣＥ４を
多量に含む溶液に、塩化カルシウムなどの二価のカチオ
ンからなる無機塩を特定量添加することによって安定性
が著しく向上することを見出し、本発明を完成するに至
った。

【０００９】すなわち、本発明は (１)下記の成分を含む安定化された固体セルラーゼ調製
物。ａ）エンドグルカナーゼを全蛋白質重量の10重量％以上
含有する。ｂ）ニ価カチオンと塩化物からなる無機塩をエンドグル
カナーゼ重量の90重量％以上含有する。 (２)二価のカチオンと塩化物からなる無機塩が、塩化カ
ルシウム、塩化コバルト、塩化ニッケル、塩化ストロン
チウム、塩化マグネシウム、塩化亜鉛のいずれかであ
る、(１)記載の固体セルラーゼ調製物。

【００１０】(３)エンドグルカナーゼがフミコーラ・イ
ンソレンス（Humicola insolens）由来のエンドグルカ
ナーゼＮＣＥ４もしくはＮＣＥ５、接合菌由来のエンド
グルカナーゼRCE I、RCE II、RCEIII、MCE I、MCE II、
もしくはPCEIのいずれかである、(１)または(２)のいず
れか一項に記載の固体セルラーゼ調製物。

【００１１】(４)エンドグルカナーゼを全蛋白質重量の
10重量％以上含有するセルラーゼ溶液に、二価カチオン
と塩化物からなる無機塩をエンドグルカナーゼ重量に対
して9０重量％以上添加し、乾燥することを特徴とする
安定化された固体セルラーゼ調製物の製造方法に関す
る。

【００１２】本発明は、繊維加工、紙パルプ加工、洗剤
用途で有効とされるセルラーゼの安定性を高める方法を
提供するものである。本発明は、繊維加工、紙パルプ加
工、洗剤用途で有効とされるセルラーゼの培養濃縮液及
び加工液に二価カチオンの塩化物塩を有効量添加するこ
とを特徴とし、その後乾燥させて得られたセルラーゼ酵
素乾燥粉末は、乾燥工程での失活が抑制され、保存安定
性が向上する。また、得られた乾燥粉末を原料にして加
工操作性に優れる粒状製剤を製造する際は、製造工程で
の失活が抑制され、貯蔵時の安定性が向上する。

【００１３】

【発明の実施の形態】本発明が適用できるセルラーゼ酵
素は、繊維加工、紙パルプ加工、洗剤用途で有効とされ
る特定の成分、及び特定の成分を多量に含むものであ
る。特定の成分とは、例えば国際公開第ＷＯ９１／１７
２４３号記載の成分、国際公開第ＷＯ９４／２１８０１
号記載の成分、国際公開第ＷＯ９８／０３６４０号記載
の成分などで、糸状菌やグラム陽性棹菌由来のセルラー
ゼ成分であるエンドグルカナーゼ（以下ＥＧと略す）、
セロビオヒドラーゼ（以下ＣＢＨと略す）を挙げること
ができる。

【００１４】更に詳しくは、国際公開第ＷＯ９８／０
３６４０号記載のフミコーラ属由来のエンドグルカナー
ゼであるＮＣＥ４、特願２０００−１５０４６３記載の
ＮＣＥ５、国際公開第ＷＯ00/24879号記載の接合菌由来
のエンドグルカナーゼであるRCE I、RCE II、RCEIII、M
CE I、MCE II、及びPCEIなどである。

【００１５】ＮＣＥ４については、国際公開第ＷＯ９８
／０３６４０号の記載に従い、フミコーラ・インソレン
スＭＮ２００−１にＮＣＥ４エンドグルカナーゼ遺伝子
を含む発現プラスミドｐＥＧＤ０１(図１)を導入するこ
とによって得られた形質転換体を培養することにより得
られる。なお、上記プラスミドｐＥＧＤ０１を導入した
大腸菌はＦＥＲＭ BP−5973(原寄託：ＦＥＲＭ P−１
５７２９、原寄託日：1996年7月12日)の受託番号のもと
工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている。

【００１６】また、上記フミコーラ・インソレンスＭＮ
２００−１は、ＦＥＲＭ BP−5977(原寄託：ＦＥＲＭ
P−１５７３６、原寄託日：1996年7月15日) の受託番
号のもと工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託され
ている。

【００１７】ＮＣＥ５については、特願２０００−１５
０４６３の記載に従い、前述のフミコーラ・インソレン
ス（Humicola insolens）ＭＮ２００−１の培養液から
精製することにより得られる。すなわち、(Ｎ)培地でフ
ミコーラ・インソレンスＭＮ２００−１を培養し、得ら
れた培養液をSource PHEカラム、Source ISOカラム、
SP SepharoseFFカラム、Mono Sカラムを用いて分画
し、綿毛羽除去活性を示す画分を採取する。最終的に、
SDS−PAGEにて約25kDaを示す単一成分であるＮＣＥ５が
得られる。またはフミコーラ・インソレンスＭＮ２００
−１にＮＣＥ５エンドグルカナーゼ遺伝子を含む発現プ
ラスミドpJND−c5を導入することによって得られた形質
転換体を培養することにより得られる。すなわち、特願
２０００−３５４２９６号に記載のように、プラスミド
pM21を用いて、遺伝子組換えによりプラスミドpM21−m
−A1を作製し、プラスミドpMKD01(pMKD01で形質転換さ
れた大腸菌JM109株：FERM BP−5974)と連結したpJD01
を作製する。特願２０００−１５０４６３の記載に従
い、pJD01とプラスミドpNCE5Bam(pNCE5Bamで形質転換さ
れた大腸菌JM109株：FERM BP−7138)とを連結した発現
プラスミドpJND−c5を作製し、フミコーラ・インソレン
スＭＮ２００−１に導入した形質転換体を得る。この形
質転換体を培養し、ＮＣＥ５増強品が得られる。

【００１８】このフミコーラ・インソレンス由来のエン
ドグルカナーゼ酵素ＮＣＥ５は、セルロース含有繊維の
毛羽立ち、肌触りや外観を改善する活性、及び着色セル
ロースの色の澄明化や色の局所的変化を提供する活性、
紙パルプの濾水性を改善する活性を有する。また、分子
量が約２５ kDaと小さく、かつ、セルロース結合部位
(CBD)が構造中に存在しないというフミコーラ由来のフ
ァミリ−45に属するエンドグルカナーゼとしては例がな
い構造を有している。

【００１９】接合菌としては、国際公開第ＷＯ00/24879
号に記載されているように、リゾプス・オリゼー(ＦＥ
ＲＭＢＰ−６８８９の受託番号のもと工業技術院生命
工学工業技術研究所に寄託)、ムコール・サーシネロイ
デス(ＦＥＲＭＢＰ−６８９０の受託番号のもと工業
技術院生命工学工業技術研究所に寄託)及びファイコマ
イセス・ニテンス(ＦＥＲＭＢＰ−６８９１の受託番
号のもと工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託)が
代表的である。

【００２０】また、セルラーゼは分子構造上共通の組成
を持つことが知られている。すなわち、セルラーゼを基
質であるセルロース上に集中させて反応の効率を向上さ
せるセルロースバインディングドメイン（以下ＣＢＤと
略す）、セルロースを加水分解する活性部位（以下ＣＡ
Ｄと略す）、ＣＡＤとＣＢＤを連結させるリンカー部位
である。また、一次構造の共通性から、糖分解酵素を分
類したアンリサットらの分類（Henrissat B. A classif
ication of glycosyl hydrolases based on amino-acid
sequence similarities. Biochem. J. 280:309-316(19
91).、Henrissat B., Bairoch A. New families in the
classification of glycosyl hydrolases based on am
ino-acid sequence similarities. Biochem. J. 293:78
1-788(1993).等）に従えば、以上のエンドグルカナーゼ
群は、ファミリー４５のエンドグルカナーゼに属する。
すなわち、本発明の安定化方法は、特にファミリー４５
に属するエンドグルカナーゼに有効である。

【００２１】本発明において、エンドグルカナーゼはエ
ンド−β−１，４−Ｄ−グルカナーゼを指すものであ
る。上述の繊維加工、紙パルプ加工、洗剤用途で有効と
される高活性エンドグルカナーゼを多量に含むセルラー
ゼは、遺伝子操作による過剰発現により、培養、調製す
ることができ、本発明で好ましいエンドグルカナーゼの
含有量は、全蛋白質重量の１0重量％以上といえる。ま
た、セルラーゼ調製物に含まれる好ましいエンドグルカ
ナーゼの含有量は、全蛋白質重量の１0重量％以上とい
える。

【００２２】例えば、ＮＣＥ４含有セルラーゼ培養物の
場合、エンドグルカナーゼの含有量が全蛋白質重量の１
０重量％未満の場合は、貯蔵により活性がほとんど失活
しないために、二価カチオンの塩化物塩の安定化効果が
ほとんど認められない。しかしながら、エンドグルカナ
ーゼの含有量が全蛋白質重量の１０重量％以上になる
と、貯蔵による活性の失活が生じてくるために、二価カ
チオンの塩化物塩の安定化効果が認められてくる。

【００２３】セルラーゼを含む溶液中、およびセルラー
ゼ調製物中におけるエンドグルカナーゼの全蛋白質重量
中の重量％は以下の方法により決定することができる。
まず、全蛋白質重量は、蛋白質量標準として牛血清アル
ブミンを用いたブラッドフォード法で決定することがで
きる。より具体的には、バイオラッドラボラトリー社よ
り販売されているプロテインアッセイキットを用い決定
することが好ましい。

【００２４】次に、セルラーゼ調製物に含まれるエンド
グルカナーゼの重量は、例えば前述のＮＣＥ４において
は、セルラーゼ調製物のCMCアーゼ活性を精製ＮＣＥ４
のCMCアーゼ活性で割った値に精製ＮＣＥ４の重量を乗
じた値として求めることができる。ここで、精製ＮＣＥ
４の蛋白質重量は、国際公開第WO98/03640号記載の方法
でフミコーラ・インソレンス培養液から単離精製したも
のを、プロテインアッセイキット（バイオラッドラボラ
トリー社製）により求めることができる。（蛋白質量標
準として牛血清アルブミンを用いる。）また、CMCアー
ゼ活性は、セルラーゼ酵素、１％のカルボキシメチルセ
ルロース（CMC、東京化成工業株式会社製）、および５
０ｍM酢酸ナトリウムバッファー（ｐH６）を含んだ１ｍ
ｌの溶液にて、５０℃で３０分間反応させた後、遊離し
てくる還元糖量を測定することにより求めることができ
る。この場合、１分間に１μmolのグルコース相当の還
元糖を生成する酵素量を１単位と定義する。

【００２５】本発明が適用できるセルラーゼ調製物は、
その製造過程により定義することが可能である。微生物
由来セルラーゼ調製物は、通常、以下の方法で調製でき
る。セルラーゼ生産微生物や繊維加工、紙パルプ加工、
洗剤用途で有効とされる特定のセルラーゼ成分の遺伝子
を過剰発現させた形質転換体を、前記セルラーゼ成分の
製造に適した培地で培養し、得られた培養液を適切な方
法で除菌する。除菌方法の一例として、フィルタープレ
スなどの濾過機を用いた濾過や遠心分離機を用いた除菌
を挙げることが出来る。得られた除菌液に適切な防腐剤
や酵素安定化剤などの化学物質を加えた後、噴霧乾燥、
凍結乾燥、減圧乾燥、流動層乾燥、及びマイクロ波乾燥
などの手法を用いて水分を除去、乾燥させ、セルラーゼ
酵素粉末を得ることが出来る。除菌液は、一般的な限外
濾過法等の手法を用いて濃縮した後、以降の操作を行う
ことも可能である。得られたセルラーゼ酵素粉末は、ベ
ントナイトなどの鉱物や硫酸曹達に代表される無機の塩
類、セルロース末、スターチなどの天然高分子などと混
合し、水、天然高分子、合成高分子などを結着剤やバイ
ンダーとして用いて、押し出し造粒、熱溶融造粒、転動
造粒など一般的に粒剤を製造する際に用いられる方法を
用いて粒剤や造粒剤に加工することができる。さらに、
このようにして得られたセルラーゼ酵素粉末、及び粒
剤、造粒剤に他の添加物を混合し、それぞれの産業用途
に適した組成、形態に加工した組成物を調製することが
できる。本発明における固体セルラーゼ調製物とは、セ
ルラーゼ酵素粉末、粒剤、造粒剤、及びこれらに添加物
を混合してさらに加工した組成物をいう。

【００２６】本発明では、上述の培養液、除菌液（濾過
液、遠心分離上清、濃縮液含む）及び酵素粉末を再溶解
させた溶液のようなセルラーゼを含む溶液に対して、二
価カチオンの塩化物塩を添加することにより、噴霧乾
燥、凍結乾燥する際に生じる繊維加工、紙パルプ加工、
洗剤用途で有効とされる特定成分セルラーゼの失活を防
止し、貯蔵安定性が向上する。

【００２７】本発明に用いることのできる二価カチオン
の塩化物塩は、使用目的により安定化度合い、毒性、溶
解性を勘案し、通常入手可能な化合物を選択して使用す
ることができる。また、無水塩、結晶水を含む塩いずれ
をも用いることが可能である。詳しくは、塩化カルシウ
ム、塩化コバルト、塩化ニッケル、塩化ストロンチウ
ム、塩化マグネシウム、塩化亜鉛をあげることができ
る。

【００２８】本発明でセルラーゼを含む溶液中に添加さ
れる二価カチオンの塩化物塩の濃度は、好ましくは、エ
ンドグルカナーゼ重量の90重量％以上といえる。また、
セルラーゼ調製物に含まれる好ましい二価カチオンの塩
化物塩の濃度は、エンドグルカナーゼ重量の90重量％以
上といえる。

【００２９】本発明の固体セルラーゼ調製物の安定性
は、以下のようにして確認することができる。すなわ
ち、前述のセルラーゼ調製物をビニール袋を二重にした
袋に封入し、40℃で３ヶ月間保存し、残存する酵素活性
をデニム染めセルロース繊維の脱色活性により評価す
る。デニム染めセルロース含有繊維の脱色活性評価方法
は、20kgワッシャー（三洋電機株式会社製全自動洗濯
機 SCW5101）中に、糊抜きした 12オンスのブルージー
ンズパンツを入れ、水道水を用いて調製した6.7mMリン
酸緩衝液(pH6.2)15Ｌと前記セルラーゼ調製物からなる
処理液、ゴムボールを適当量加え、55℃、60分間脱色処
理を行う。処理後のブルージーンズパンツの脱色度は、
分光測色計（ミノルタ社製 CM-5251）を用い、Lａｂ表
示系のＬ値（明度）で評価する。コントロール（脱色処
理をしていないブルージーンズパンツ）に対する脱色処
理後のブルージーンズパンツのＬ値の増加（白色度の増
加）＝ΔＬ値を求め、このΔＬ値により脱色の度合いを
評価する。すなわち、各試験区につき10点のΔＬ値を測
定し（ｎ＝10）、その平均値を算出し、ΔＬ値＝７とな
るのに必要なセルラーゼの重量を基準に、脱色度からセ
ルラーゼ活性の残存度％を算出する。（活性の残存度％）＝（保存前サンプルにおけるΔＬ値
＝７となるために必要なセルラーゼ重量）／（保存後サ
ンプルにおけるΔＬ値＝７となるために必要なセルラー
ゼ重量）×100 活性の残存度％の数値が高い試験区は、安定性が高いと
いえる。

【００３０】

【実施例】本発明を以下の実施例により更に詳細に説明
するが、本発明はこれらの例に限定されるものではな
い。 (実施例１) 非組換え株由来のセルラーゼと特定成分酵
素を過剰発現させたセルラーゼの安定性比較フミコーラ・インソレンスＭＮ200−１株（非組換え
株）と国際公開第ＷＯ９８／０３６４０号に記載のエン
ドグルカナーゼNCE4を過剰発現させたフミコーラ・イン
ソレンス株それぞれを5.0 ％アビセル、2.0 ％酵母エキ
ス、0.1 ％ポリペプトン、0.03 ％塩化カルシウム、0.0
3 ％硫酸マグネシウムを含むpH 6.8に調整した液体培地
に接種し、培養し得られた培養液を、遠心分離（7,000
r.p.m.、20分間）し除菌体後、培養上清液を限外濾過機
を用いＢｒｉｘ15 %まで濃縮した。それぞれの膜濃縮液
に、膜濃縮液固形重量と同じ重量の乳糖を溶解添加し、
凍結乾燥し酵素粉末を得た。得られた粉末各々を、ビニ
ール袋を２重にした袋に封入し、40℃で３ヶ月間保存
し、残存する酵素活性をデニム染めセルロース繊維の脱
色活性により評価した。

【００３１】デニム染めセルロース含有繊維の脱色活性
評価方法：糊抜きした 12オンスのブルージーンズパン
ツを下記の条件で脱色処理をした。試験機械：20kgワッシャー（三洋電機株式会社製全自
動洗濯機 SCW5101）温度：55℃ 時間：60分 pH：6.2 処理液：水道水を用いて調製した6.7mMリン酸緩衝液15
Ｌに、セルラーゼ調製液とともにゴムボールを適当量加
えた。

【００３２】脱色度を分光測色計（ミノルタ社製 CM-5
251）を用い、Lａｂ表示系のＬ値（明度）を測定した。
コントロール（脱色処理をしていないブルージーンズパ
ンツ）に対する脱色処理後のブルージーンズパンツのＬ
値の増加（白色度の増加）＝ΔＬ値を求め、このΔＬ値
により脱色の度合いを評価した。すなわち、各試験区に
つき10点のΔＬ値を測定し（ｎ＝10）、その平均値を算
出した。そして、ΔＬ値＝７となるのに必要なセルラー
ゼの重量を基準に、脱色度からセルラーゼ活性の残存度
％を算出した。（活性の残存度％）＝（保存前サンプルにおけるΔＬ値
＝７となるために必要なセルラーゼ重量）／（保存後サ
ンプルにおけるΔＬ値＝７となるために必要なセルラー
ゼ重量）×100

【００３３】以上の値を用い、フミコーラ・インソレン
スＭＮ200−１株由来のセルラーゼ（非組換え株由来）
と、国際公開第WO９８／０３６４０号記載のフミコーラ
・インソレンス株をホストとし特定成分酵素(具体的に
はＮＣＥ４)を過剰発現させたセルラーゼの安定性を比
較した結果を表１に示す。

【００３４】

【表１】

【００３５】以上表１に示したように、同様の製造過程
を経た非組換え株由来セルラーゼと過剰発現ＮＣＥ４で
は、40℃、３ヶ月保存でのジーンズ脱色活性の残存活性
に約39 ％の差異を生ずることがわかった。すなわち、
繊維加工に有用な成分であるＮＣＥ４を多量に含む調製
品(エンドグルカナーゼの含有量が全蛋白質重量の約３
３重量％)は、複数のセルラーゼ成分を含む非組換え株
酵素(エンドグルカナーゼの含有量が全蛋白質重量の１
０重量％未満)よりも保存安定性が著しく低い傾向がみ
られた。

【００３６】(実施例２) 無機塩を添加したNCE4セルラ
ーゼの粉末の保存安定性国際公開第WO９８／０３６４０号記載のＮＣＥ４を過剰
発現させたフミコーラ・インソレンスを5.0 ％アビセ
ル、2.0 ％酵母エキス、0.1 ％ポリペプトン、0.03 ％
塩化カルシウム、0.03 ％硫酸マグネシウムを含むpH 6.
8に調整した液体培地に接種し、培養し得られた培養液
を、遠心分離（7,000 r.p.m.、20分間）し除菌体後、培
養上清液を限外濾過機を用いＢｒｉｘ15 %まで濃縮し、
得られた濃縮液を用い試験を行った。無機塩を含有する
酵素粉末は、上の濃縮液１mlに0.1M各種無機塩溶液１m
l、脱イオン水３mlを混合後、凍結乾燥を行い調製し
た。得られた酵素粉末を密閉容器に入れ、120℃、24時
間保存後、ジーンズ脱色活性を測定し、保存前後のΔL
を測定し、セルラーゼの安定化効果を評価した。この結
果を表２に示した。ここで、120℃、24時間の保存試験
は常温での長期保存試験を加速するために行った。

【００３７】

【表２】

【００３８】表２より、塩化カルシウム、塩化コバル
ト、塩化ニッケル、塩化ストロンチウム、塩化マグネシ
ウム、塩化亜鉛など二価カチオンの塩化物塩に顕著なセ
ルラーゼ安定化効果が確認できた。

【００３９】(実施例３) 保存安定性の増したＮＣＥ４
セルラーゼ調製に必要な塩化カルシウム量実施例２記載の方法に基づき、ＮＣＥ４セルラーゼの培
養濃縮液を得た。得られた濃縮液１mlに、濃縮液の含有
するセルラーゼ重量を基準に、種々の濃度の塩化カルシ
ウム溶液１mlと脱イオン水３mlを混合後凍結乾燥し、種
々の濃度の塩化カルシウムを含有するＮＣＥ４セルラー
ゼ酵素粉末を得た。得られたセルラーゼ酵素粉末は、密
封後120℃、24時間保存し残存ジーンズ脱色活性を評価
した。この結果を表３に示した。

【００４０】

【表３】

【００４１】この結果、塩化カルシウムをＮＣＥ４セル
ラーゼ重量の90％以上添加し得られたＮＣＥ４セルラー
ゼ粉末は、無添加セルラーゼに比べ格段に安定性に優れ
ると結論できる。

【００４２】 (実施例４) 保存安定性を向上させる二価カチオンの塩化物塩を添加したＮＣＥ４セルラーゼ調製物の製造原材料配合中性無水ボウショウ（四国化成社製） 20 ％コーンスターチ（敷島スターチ社製） 70.5 ％ＰＥＧ4000（日本油脂株式会社製） 2.0 ％塩化マグネシウム 0.5 ％明治セルラーゼHEP-100（明治製菓社製） 4.0 ％カルボキシメチルセルロース（第一工業薬品社製） 3.0 ％

【００４３】上記の原材料を混合後、10 ％の水を添加
し混錬する。混錬物をディスクペレッターに送り成形加
工する。得られた射出物をマルメライザー（不二パウダ
ル社製）を用い粒状とし、乾燥、篩かけし造粒物を得
た。上記調製物中には、二価カチオンの塩化物塩として
塩化マグネシウムをエンドグルカナーゼ重量に対して約
110重量％、エンドグルカナーゼを全タンパク質重量中
約33％含有する。

【００４４】

【発明の効果】本発明によって、エンドグルカナーゼの
含量が多い固形セルラーゼ調製物の貯蔵安定性を改善す
ることができ、流通や在庫中の貯蔵における失活を抑制
し、経済的損失を軽減することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】発現プラスミドｐＥＧＤ０１を示す図。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｄ２１Ｃ 3/00 Ｄ２１Ｃ 3/00 Ｚ //(Ｃ１２Ｎ 9/26 (Ｃ１２Ｎ 9/26 Ｃ１２Ｒ 1:645）Ｃ１２Ｒ 1:645） (72)発明者佐藤右一埼玉県坂戸市千代田５−３−１明治製菓株式会社生物科学研究所内 (72)発明者古賀仁一郎埼玉県坂戸市千代田５−３−１明治製菓株式会社生物科学研究所内 (72)発明者河野敏明埼玉県坂戸市千代田５−３−１明治製菓株式会社生物科学研究所内Ｆターム(参考） 4B050 CC03 DD03 HH02 KK01 LL04 LL10 4H003 BA09 DA01 EA19 EC03 FA16 FA47 4L031 BA39 DA00 4L055 AB20 AD20 BA39 BB25 EA32 FA05 FA08 FA30

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】下記の成分を含む安定化された固体セル
ラーゼ調製物。ａ）エンドグルカナーゼを全蛋白質重量の10重量％以上
含有する。ｂ）ニ価カチオンと塩化物からなる無機塩をエンドグル
カナーゼ重量の90重量％以上含有する。
【請求項２】二価のカチオンと塩化物からなる無機塩
が、塩化カルシウム、塩化コバルト、塩化ニッケル、塩
化ストロンチウム、塩化マグネシウム、塩化亜鉛のいず
れかである、請求項１記載の固体セルラーゼ調製物。
【請求項３】エンドグルカナーゼがフミコーラ・イン
ソレンス（Humicolainsolens）由来のエンドグルカナー
ゼＮＣＥ４もしくはＮＣＥ５、接合菌由来のエンドグル
カナーゼRCE I、RCE II、RCEIII、MCE I、MCE II、もし
くはPCEIのいずれかである、請求項１または２のいずれ
か一項に記載の固体セルラーゼ調製物。
【請求項４】エンドグルカナーゼを全蛋白質重量の10
重量％以上含有するセルラーゼ溶液に、二価カチオンと
塩化物からなる無機塩をエンドグルカナーゼ重量に対し
て90重量％以上添加し、乾燥することを特徴とする安定
化された固体セルラーゼ調製物の製造方法。