JP2002027993A - 特定の核酸を検出定量するための等長プライマー伸長法およびキット - Google Patents
特定の核酸を検出定量するための等長プライマー伸長法およびキットInfo
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6851—Quantitative amplification
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- Chemical & Material Sciences (AREA)
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- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 簡便であり、時間がかからず、感度が高く、
費用に対して効果が高く、環境への悪影響が少ない核酸
検出法を提供する。 【解決手段】 等長プライマー伸長法により、試料中の
標的ＤＮＡまたはＲＮＡを検出および／または定量する
方法が提供される。この方法では、特定の遊離ヌクレオ
チドを存在させずに、プライマー伸長反応を行い、その
ようなヌクレオチドが入るべき場所において、プライマ
ー伸長反応を停止させる。このようにして得られたプラ
イマー伸長物に組込まれた標識ヌクレオチドを検出すれ
ば、試料中の標的ＲＮＡまたはＤＮＡの量を測定するこ
とができる。
費用に対して効果が高く、環境への悪影響が少ない核酸
検出法を提供する。 【解決手段】 等長プライマー伸長法により、試料中の
標的ＤＮＡまたはＲＮＡを検出および／または定量する
方法が提供される。この方法では、特定の遊離ヌクレオ
チドを存在させずに、プライマー伸長反応を行い、その
ようなヌクレオチドが入るべき場所において、プライマ
ー伸長反応を停止させる。このようにして得られたプラ
イマー伸長物に組込まれた標識ヌクレオチドを検出すれ
ば、試料中の標的ＲＮＡまたはＤＮＡの量を測定するこ
とができる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、等長プライマー伸
長（isometric primer extension）（iPE）法を使用す
ることによって特定のＤＮＡまたはＲＮＡを検出かつ定
量するための方法に関する。
長（isometric primer extension）（iPE）法を使用す
ることによって特定のＤＮＡまたはＲＮＡを検出かつ定
量するための方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】従来、ＤＮＡやＲＮＡなどの核酸の特定
の配列を検出かつ定量するための方法には、サザンブロ
ット法、ノーザン分析法、ＲＮアーゼプロテクションア
ッセイ、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などがある。
しかし、試料中に存在する特定のＲＮＡ種を検出しよう
とする場合、ノーザンブロット法やＲＮアーゼプロテク
ションアッセイには、効率に限界があり、手間がかか
り、精度がそれほど高くなく、コストがかかり、感受性
がそれほど高くなく、比較的多量のＲＮＡ試料を必要と
し、特殊な装置が必要になり、大量の生体に有害な物質
と放射性同位体の廃棄物が生じるといった問題がある。
特に、ノーザンブロット法とＲＮアーゼプロテクション
アッセイはともに、分析が終了するまで２〜３日を要す
る。また、ノーザンブロット法には、ＲＮＡゲルでの泳
動、ＲＮＡの固体支持体への転写、プローブの調製、お
よびハイブリダイゼーション反応の実施が必要である。
そのため十分な感度を得るには、たとえば５μｇの試料
が必要である。ノーザンブロット法は、標的とプローブ
の核酸との間でハイブリダイゼーションが起こるという
原理に基くものである。また、大量の生体に有害な物質
と放射性同位体の廃棄物が生じ、その一反応あたりのコ
ストは、かなり高くなる。
の配列を検出かつ定量するための方法には、サザンブロ
ット法、ノーザン分析法、ＲＮアーゼプロテクションア
ッセイ、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などがある。
しかし、試料中に存在する特定のＲＮＡ種を検出しよう
とする場合、ノーザンブロット法やＲＮアーゼプロテク
ションアッセイには、効率に限界があり、手間がかか
り、精度がそれほど高くなく、コストがかかり、感受性
がそれほど高くなく、比較的多量のＲＮＡ試料を必要と
し、特殊な装置が必要になり、大量の生体に有害な物質
と放射性同位体の廃棄物が生じるといった問題がある。
特に、ノーザンブロット法とＲＮアーゼプロテクション
アッセイはともに、分析が終了するまで２〜３日を要す
る。また、ノーザンブロット法には、ＲＮＡゲルでの泳
動、ＲＮＡの固体支持体への転写、プローブの調製、お
よびハイブリダイゼーション反応の実施が必要である。
そのため十分な感度を得るには、たとえば５μｇの試料
が必要である。ノーザンブロット法は、標的とプローブ
の核酸との間でハイブリダイゼーションが起こるという
原理に基くものである。また、大量の生体に有害な物質
と放射性同位体の廃棄物が生じ、その一反応あたりのコ
ストは、かなり高くなる。
【０００３】同様に、ＲＮアーゼプロテクションアッセ
イも、適当な結果を得るのに２〜３日かかる。その実験
の手順では、テンプレートＤＮＡの調製、ＲＮＡプロー
ブの調製、ハイブリダイゼーション反応の実施、酵素に
よる消化反応、およびゲルでの泳動が必要になる。そし
て、よい結果を得るのに、たとえば１μｇの標的ＲＮＡ
試料が必要になる。ＲＮアーゼプロテクションアッセイ
が基いている原理は、ハイブリダイゼーション反応と酵
素による消化反応との組合わせである。ノーザンブロッ
ト法と同様、この反応を行うのに費用がかかる。さら
に、この方法では、生体に有害な物質と放射性同位体の
廃棄物が多く生じる。なお、後に示す表１には、ノーザ
ンブロット法、ＲＮアーゼプロテクションアッセイおよ
び本発明による複数プライマー伸長法に関係するファク
ターを比較して示している。
イも、適当な結果を得るのに２〜３日かかる。その実験
の手順では、テンプレートＤＮＡの調製、ＲＮＡプロー
ブの調製、ハイブリダイゼーション反応の実施、酵素に
よる消化反応、およびゲルでの泳動が必要になる。そし
て、よい結果を得るのに、たとえば１μｇの標的ＲＮＡ
試料が必要になる。ＲＮアーゼプロテクションアッセイ
が基いている原理は、ハイブリダイゼーション反応と酵
素による消化反応との組合わせである。ノーザンブロッ
ト法と同様、この反応を行うのに費用がかかる。さら
に、この方法では、生体に有害な物質と放射性同位体の
廃棄物が多く生じる。なお、後に示す表１には、ノーザ
ンブロット法、ＲＮアーゼプロテクションアッセイおよ
び本発明による複数プライマー伸長法に関係するファク
ターを比較して示している。
【０００４】米国特許明細書第５，８４６，７１０号
は、変異ＤＮＡ分子をスクリーニングするためプライマ
ー伸長法を使用することを開示する。しかし、この公報
は、試料中の標的ＤＮＡまたは標的ＲＮＡを検出するこ
とを開示しない。
は、変異ＤＮＡ分子をスクリーニングするためプライマ
ー伸長法を使用することを開示する。しかし、この公報
は、試料中の標的ＤＮＡまたは標的ＲＮＡを検出するこ
とを開示しない。
【０００５】米国特許明細書第５，９９４，０７９号
は、ＤＮＡプライマーを特定のＲＮＡにアニールするこ
とによってＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを形成し、逆転
写酵素を使用することによってプライマーを伸長させる
ことを開示する。このハイブリッドは、ＲＮＡ／ＤＮＡ
ハイブリッドに特異的な抗体によって検出される。しか
し、この公報は、本発明のような試料中に存在する標的
ＤＮＡまたは標的ＲＮＡを検出する方法を開示しない。
は、ＤＮＡプライマーを特定のＲＮＡにアニールするこ
とによってＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを形成し、逆転
写酵素を使用することによってプライマーを伸長させる
ことを開示する。このハイブリッドは、ＲＮＡ／ＤＮＡ
ハイブリッドに特異的な抗体によって検出される。しか
し、この公報は、本発明のような試料中に存在する標的
ＤＮＡまたは標的ＲＮＡを検出する方法を開示しない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】簡便であり、時間がか
からず、感度が高く、費用に対して効果が高く、環境へ
の悪影響が少ない核酸検出法が、当該技術分野において
必要であることがわかる。本発明は、これらの必要性を
すべて満たし得る方法を提供することを目的とする。
からず、感度が高く、費用に対して効果が高く、環境へ
の悪影響が少ない核酸検出法が、当該技術分野において
必要であることがわかる。本発明は、これらの必要性を
すべて満たし得る方法を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】上述した必要性を満たす
ため、本発明により、試料中の標的核酸を検出または定
量する方法が提供される。この方法は、（ａ）標的核酸
の所定の位置に特異的に対合する１つまたは複数のプラ
イマーを準備すること、（ｂ）高ストリンジェンシーの
条件下で（ａ）からの１つまたは複数のプライマーを標
的核酸とアニーニリングさせて、標的核酸の所定の位置
でプライマー−核酸二本鎖を得ること、（ｃ）（１）１
種、２種または３種の遊離の非ターミネーターヌクレオ
チドと、必要に応じて検出可能なマーカーで標識された
少なくとも１種の非ターミネーターヌクレオチドを含
み、かつ（２）（１）の１種、２種または３種の非ター
ミネーターヌクレオチドとは異なる種類のターミネータ
ヌクレオチドを含むか含まない混合物を、（ｂ）からの
プライマー−核酸二本鎖と混合すること、および（ｄ）
適当な緩衝液中で酵素または化学反応によりプライマー
伸長を行うことを含み、さらに（ｅ）プライマー伸長し
たヌクレオチド上の標識シグナルを検出または定量する
こと、もしくは（ｆ）伸長したプライマーを質量分析に
よって検出または定量することのいずれかを含む。
ため、本発明により、試料中の標的核酸を検出または定
量する方法が提供される。この方法は、（ａ）標的核酸
の所定の位置に特異的に対合する１つまたは複数のプラ
イマーを準備すること、（ｂ）高ストリンジェンシーの
条件下で（ａ）からの１つまたは複数のプライマーを標
的核酸とアニーニリングさせて、標的核酸の所定の位置
でプライマー−核酸二本鎖を得ること、（ｃ）（１）１
種、２種または３種の遊離の非ターミネーターヌクレオ
チドと、必要に応じて検出可能なマーカーで標識された
少なくとも１種の非ターミネーターヌクレオチドを含
み、かつ（２）（１）の１種、２種または３種の非ター
ミネーターヌクレオチドとは異なる種類のターミネータ
ヌクレオチドを含むか含まない混合物を、（ｂ）からの
プライマー−核酸二本鎖と混合すること、および（ｄ）
適当な緩衝液中で酵素または化学反応によりプライマー
伸長を行うことを含み、さらに（ｅ）プライマー伸長し
たヌクレオチド上の標識シグナルを検出または定量する
こと、もしくは（ｆ）伸長したプライマーを質量分析に
よって検出または定量することのいずれかを含む。
【０００８】上記方法において、プライマーは、核酸プ
ライマー、オリゴデオキシリボヌクレオチド、オリゴリ
ボヌクレオチド、あるいは、デオキシリボ核酸とリボ核
酸との共重合体とすることができる。標的となる核酸
は、デオキシリボ核酸、リボ核酸、あるいは、デオキシ
リボ核酸とリボ核酸との共重合体とすることができる。
ライマー、オリゴデオキシリボヌクレオチド、オリゴリ
ボヌクレオチド、あるいは、デオキシリボ核酸とリボ核
酸との共重合体とすることができる。標的となる核酸
は、デオキシリボ核酸、リボ核酸、あるいは、デオキシ
リボ核酸とリボ核酸との共重合体とすることができる。
【０００９】好ましい態様において、本発明による方法
は、以下に示すような非ターミネーターヌクレオチド
（ターミネーターでないヌクレオチド）とターミネータ
ーヌクレオチド（ターミネーターであるヌクレオチド）
との組合わせからなる混合物を含み得る。
は、以下に示すような非ターミネーターヌクレオチド
（ターミネーターでないヌクレオチド）とターミネータ
ーヌクレオチド（ターミネーターであるヌクレオチド）
との組合わせからなる混合物を含み得る。
【００１０】(a) dATP, dCTP, dGTP, ddTTP もしくは d
dUTP,(b) dATP, dCTP, dTTP もしくは dUTP, ddGTP,(c)
dATP, dGTP, dTTP もしくは dUTP, ddCTP,(d) dCTP, d
GTP, dTTP もしくは dUTP, ddATP,(e) dATP, dCTP, dGT
P,(f) dATP, dCTP, dTTP もしくは dUTP,(g) dATP, dGT
P, dTTP もしくは dUTP, または(h) dCTP, dGTP, dTTP
もしくは dUTP。
dUTP,(b) dATP, dCTP, dTTP もしくは dUTP, ddGTP,(c)
dATP, dGTP, dTTP もしくは dUTP, ddCTP,(d) dCTP, d
GTP, dTTP もしくは dUTP, ddATP,(e) dATP, dCTP, dGT
P,(f) dATP, dCTP, dTTP もしくは dUTP,(g) dATP, dGT
P, dTTP もしくは dUTP, または(h) dCTP, dGTP, dTTP
もしくは dUTP。
【００１１】本発明による方法は、検出可能なマーカー
で標識された少なくとも１つの非ターミネーターヌクレ
オチドを使用することができる。検出可能なマーカー
は、酵素、タンパク質成分、放射性同位体、蛍光成分、
あるいは、ビオチンなどの化学基からなり得る。また、
検出または定量する方法の工程は、質量分析によって行
ってもよい。
で標識された少なくとも１つの非ターミネーターヌクレ
オチドを使用することができる。検出可能なマーカー
は、酵素、タンパク質成分、放射性同位体、蛍光成分、
あるいは、ビオチンなどの化学基からなり得る。また、
検出または定量する方法の工程は、質量分析によって行
ってもよい。
【００１２】本発明のプライマー伸長反応に使用される
酵素には、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩもしくはその
「クレノウフラグメント」などのテンプレート（鋳型）
依存性酵素、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ＤＮＡポリ
メラーゼ、T. aquaticus ＤＮＡポリメラーゼ、レトロ
ウイルスの逆転写酵素、または、それらの組合わせがあ
る。
酵素には、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩもしくはその
「クレノウフラグメント」などのテンプレート（鋳型）
依存性酵素、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ＤＮＡポリ
メラーゼ、T. aquaticus ＤＮＡポリメラーゼ、レトロ
ウイルスの逆転写酵素、または、それらの組合わせがあ
る。
【００１３】添付の図面を参照し、以下に本発明の構成
および目的をさらに詳細に説明する。
および目的をさらに詳細に説明する。
【００１４】
【発明の実施の形態】本発明により、等長プライマー伸
長（iPE）法を使用することによって特定のヌクレオチ
ド配列を検出かつ定量する方法が提供される。本発明の
重要な点は、試料中の標的ＤＮＡまたは標的ＲＮＡが、
単数または複数のオリゴヌクレオチドプライマーとハイ
ブリダイゼーションされることである。次いで、１種、
２種または３種の予め標識された遊離のヌクレオチドの
存在下において、該プライマーは伸長される。伸長をと
ぎれさせないために必要な４種のヌクレオチドのうち少
なくとも１種を、反応に入れないでおくか、あるいは、
ジデオキシヌクレオチドのようなそれに対応するタイプ
のターミネーターヌクレオチドで置き換える。その後、
伸長した単数または複数のプライマー上の標識により生
成されるシグナルが存在するか否かを測定することによ
って、特定の標的核酸を検出かつ定量することができ
る。伸長したプライマーを遊離のヌクレオチドから分離
し、伸長したプライマーの標識の組込みについて分析す
る。
長（iPE）法を使用することによって特定のヌクレオチ
ド配列を検出かつ定量する方法が提供される。本発明の
重要な点は、試料中の標的ＤＮＡまたは標的ＲＮＡが、
単数または複数のオリゴヌクレオチドプライマーとハイ
ブリダイゼーションされることである。次いで、１種、
２種または３種の予め標識された遊離のヌクレオチドの
存在下において、該プライマーは伸長される。伸長をと
ぎれさせないために必要な４種のヌクレオチドのうち少
なくとも１種を、反応に入れないでおくか、あるいは、
ジデオキシヌクレオチドのようなそれに対応するタイプ
のターミネーターヌクレオチドで置き換える。その後、
伸長した単数または複数のプライマー上の標識により生
成されるシグナルが存在するか否かを測定することによ
って、特定の標的核酸を検出かつ定量することができ
る。伸長したプライマーを遊離のヌクレオチドから分離
し、伸長したプライマーの標識の組込みについて分析す
る。
【００１５】標的核酸の位置に相当するプライマーが伸
長され、一群の長さの等しいプライマー伸長した核酸
（等長プライマー伸長核酸）が生成する。というのも、
一定の数のヌクレオチドが、配列に依存して取り込まれ
るからである。これらの等しく伸長したプライマーを定
量することによって、標的核酸の量または数を定量する
ことができる。試料中に標的ＤＮＡまたはＲＮＡの多数
の複製物が存在する場合、標識ヌクレオチドが組込まれ
たプライマー伸長物の複製物の数はそれに対応して増
え、全体のシグナルはより強くなる。かくして、未知の
試料において観測されたシグナルの強度を、標準化され
た既知量のＤＮＡまたはＲＮＡと比較することによっ
て、試料中の標的ＤＮＡまたは標的ＲＮＡを検出および
／または定量することができる。他の態様では、これら
の等長プライマー伸長核酸種を質量分析を用いて測定す
ることにより、特定の標的核酸を検出または定量するこ
とができる。
長され、一群の長さの等しいプライマー伸長した核酸
（等長プライマー伸長核酸）が生成する。というのも、
一定の数のヌクレオチドが、配列に依存して取り込まれ
るからである。これらの等しく伸長したプライマーを定
量することによって、標的核酸の量または数を定量する
ことができる。試料中に標的ＤＮＡまたはＲＮＡの多数
の複製物が存在する場合、標識ヌクレオチドが組込まれ
たプライマー伸長物の複製物の数はそれに対応して増
え、全体のシグナルはより強くなる。かくして、未知の
試料において観測されたシグナルの強度を、標準化され
た既知量のＤＮＡまたはＲＮＡと比較することによっ
て、試料中の標的ＤＮＡまたは標的ＲＮＡを検出および
／または定量することができる。他の態様では、これら
の等長プライマー伸長核酸種を質量分析を用いて測定す
ることにより、特定の標的核酸を検出または定量するこ
とができる。
【００１６】反応緩衝液中にある遊離のヌクレオチドが
存在しないと、そのヌクレオチドが入るべき場所でプラ
イマー伸長は停止する。かくして、別個の長さのプライ
マー伸長物が得られる。
存在しないと、そのヌクレオチドが入るべき場所でプラ
イマー伸長は停止する。かくして、別個の長さのプライ
マー伸長物が得られる。
【００１７】本発明の範囲において、種々の明らかな変
形が可能である。たとえば、１種のヌクレオチドではな
く、２種または３種のヌクレオチドをプライマー伸長反
応から除いてもよい。さらに、種々の標識を使用するこ
とができ、それらは、放射性ヌクレオチドに限定され
ず、蛍光体や酵素でもよい。
形が可能である。たとえば、１種のヌクレオチドではな
く、２種または３種のヌクレオチドをプライマー伸長反
応から除いてもよい。さらに、種々の標識を使用するこ
とができ、それらは、放射性ヌクレオチドに限定され
ず、蛍光体や酵素でもよい。
【００１８】ここで使用する「核酸」または「ヌクレオ
チド」は、デオキシリボ核酸、リボ核酸、あるいはデオ
キシリボ核酸とリボ核酸の共重合体とすることができ
る。核酸の試料は、天然のものでも合成のものでもよ
い。核酸の試料は、天然に存在する核酸でもよいし、任
意の生物から得られるものでもよい。本発明が適用され
る生物には、たとえば、植物、微生物、ウイルス、鳥、
脊椎動物、無脊椎動物、哺乳動物、ヒト、ウマ、イヌ、
ウシ、ネコ、ブタ、ヒツジがある。標的核酸は、天然由
来のものでもよいし、インビボで酵素により合成された
もの、インビトロで酵素により合成されたもの、あるい
は非酵素的に合成されたものでもよい。
チド」は、デオキシリボ核酸、リボ核酸、あるいはデオ
キシリボ核酸とリボ核酸の共重合体とすることができ
る。核酸の試料は、天然のものでも合成のものでもよ
い。核酸の試料は、天然に存在する核酸でもよいし、任
意の生物から得られるものでもよい。本発明が適用され
る生物には、たとえば、植物、微生物、ウイルス、鳥、
脊椎動物、無脊椎動物、哺乳動物、ヒト、ウマ、イヌ、
ウシ、ネコ、ブタ、ヒツジがある。標的核酸は、天然由
来のものでもよいし、インビボで酵素により合成された
もの、インビトロで酵素により合成されたもの、あるい
は非酵素的に合成されたものでもよい。
【００１９】対象とする１つまたは複数の核酸を含有す
る試料は、生物からのゲノムＤＮＡ、そのＲＮＡ転写
物、またはそのＲＮＡ転写物から調製されるｃＤＮＡを
含み得る。対象とする１つまたは複数の核酸を含有する
試料はさらに、生物からのゲノム外のＤＮＡ、そのＲＮ
Ａ転写物、またはそのＲＮＡ転写物から調製されるｃＤ
ＮＡを含み得る。さらに、対象とする１つまたは複数の
核酸は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により合成さ
れ得る。
る試料は、生物からのゲノムＤＮＡ、そのＲＮＡ転写
物、またはそのＲＮＡ転写物から調製されるｃＤＮＡを
含み得る。対象とする１つまたは複数の核酸を含有する
試料はさらに、生物からのゲノム外のＤＮＡ、そのＲＮ
Ａ転写物、またはそのＲＮＡ転写物から調製されるｃＤ
ＮＡを含み得る。さらに、対象とする１つまたは複数の
核酸は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により合成さ
れ得る。
【００２０】対象とする核酸は、デオキシイノシンまた
は７−デアザ−２−デオキシグアノシンなどの天然にな
いヌクレオチド類似体を含み得る。これらの類似体は、
ＤＮＡ二本鎖を不安定にし、鎖を完全に分離することな
く、二本鎖試料においてプライマーのアニーリングおよ
び伸長反応が起こることを可能にし得る。
は７−デアザ−２−デオキシグアノシンなどの天然にな
いヌクレオチド類似体を含み得る。これらの類似体は、
ＤＮＡ二本鎖を不安定にし、鎖を完全に分離することな
く、二本鎖試料においてプライマーのアニーリングおよ
び伸長反応が起こることを可能にし得る。
【００２１】対象とする核酸は、組込まれていない試薬
および／またはプライマーからの対象とする核酸のアフ
ィニティ分離を可能にする１つまたは複数の部分を含み
得る。たとえば、対象とする核酸はビオチンを含むこと
ができ、それは、固体支持体へ付着されたアビジン族化
合物へのビオチンの結合を介して、組込まれていない試
薬および／またはプライマーからの対象とする核酸のア
フィニティ分離を可能にする。対象とする核酸の配列
は、固体支持体に付着された核酸中に存在する相補的配
列への塩基対合を介して、組込まれていない試薬および
／またはプライマーからの対象とする核酸のアフィニテ
ィ分離を可能にする、ＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列を含
み得る。対象とする核酸は検出可能なマーカーで標識す
ることができ、この検出可能マーカーは、試薬に存在す
る検出可能なマーカーあるいはプライマーに付着された
検出可能マーカーと異なるものとすることができる。
および／またはプライマーからの対象とする核酸のアフ
ィニティ分離を可能にする１つまたは複数の部分を含み
得る。たとえば、対象とする核酸はビオチンを含むこと
ができ、それは、固体支持体へ付着されたアビジン族化
合物へのビオチンの結合を介して、組込まれていない試
薬および／またはプライマーからの対象とする核酸のア
フィニティ分離を可能にする。対象とする核酸の配列
は、固体支持体に付着された核酸中に存在する相補的配
列への塩基対合を介して、組込まれていない試薬および
／またはプライマーからの対象とする核酸のアフィニテ
ィ分離を可能にする、ＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列を含
み得る。対象とする核酸は検出可能なマーカーで標識す
ることができ、この検出可能マーカーは、試薬に存在す
る検出可能なマーカーあるいはプライマーに付着された
検出可能マーカーと異なるものとすることができる。
【００２２】本発明に関し、「正常なヌクレオチド」ま
たは「正常な塩基」という用語は、野生型塩基または既
知の標準的ヌクレオチド塩基を意味し、それに対して、
当該塩基部位における突然変異を同定することができ
る。「標準的ヌクレオチド塩基」は、任意の既知の塩基
を含むものであり、それは、野生型の塩基を含んでもよ
いし、その塩基が既知でありその変異体を知り得る場合
には、既知の突然変異塩基を含んでもよい。したがっ
て、正常な塩基は、たとえば既知の野生型塩基であり
得、それに対して該当する位置での突然変異を調べるこ
とができる。一方、既知の塩基は、既知の突然変異体で
あり得、それに対して、該当する位置での野生型塩基の
存在を調べることができる。あるいは、既知の正常な塩
基は、既知の突然変異体であり得、それに対して、他の
突然変異体塩基を調べることができる。このように本発
明の方法は、該当する部位において任意の他の塩基変異
体が存在するかどうかを決定するのに用いることができ
る任意の既知の配列に適用することができる。
たは「正常な塩基」という用語は、野生型塩基または既
知の標準的ヌクレオチド塩基を意味し、それに対して、
当該塩基部位における突然変異を同定することができ
る。「標準的ヌクレオチド塩基」は、任意の既知の塩基
を含むものであり、それは、野生型の塩基を含んでもよ
いし、その塩基が既知でありその変異体を知り得る場合
には、既知の突然変異塩基を含んでもよい。したがっ
て、正常な塩基は、たとえば既知の野生型塩基であり
得、それに対して該当する位置での突然変異を調べるこ
とができる。一方、既知の塩基は、既知の突然変異体で
あり得、それに対して、該当する位置での野生型塩基の
存在を調べることができる。あるいは、既知の正常な塩
基は、既知の突然変異体であり得、それに対して、他の
突然変異体塩基を調べることができる。このように本発
明の方法は、該当する部位において任意の他の塩基変異
体が存在するかどうかを決定するのに用いることができ
る任意の既知の配列に適用することができる。
【００２３】ここで使用する「プライマー」または「オ
リゴヌクレオチドプライマー」という用語は、たとえば
ヌクレオチドおよびＤＮＡポリメラーゼなどの酵素、な
らびに適当な温度およびｐＨなどのさまざまな要因の存
在下で、核酸（テンプレート）鎖に相補的なプライマー
伸長物の合成を可能にする条件下におかれたとき、合成
の開始点として作用し得るオリゴヌクレオチドを指す。
リゴヌクレオチドプライマー」という用語は、たとえば
ヌクレオチドおよびＤＮＡポリメラーゼなどの酵素、な
らびに適当な温度およびｐＨなどのさまざまな要因の存
在下で、核酸（テンプレート）鎖に相補的なプライマー
伸長物の合成を可能にする条件下におかれたとき、合成
の開始点として作用し得るオリゴヌクレオチドを指す。
【００２４】一方、用語「プライマー」は、任意の材料
から得られる任意の核酸フラグメントを含む。たとえば
プライマーは、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＰＣＲに
より得られたＤＮＡのようなより大きな核酸フラグメン
トを断片化することにより調製することができる。プラ
イマーの性質は、プライマーを得る方法、たとえば、そ
れが、天然由来の核酸あるいは合成された核酸を断片化
することによるものなのか、あるいは核酸プライマー自
体を合成することによるものなのかによって、限定され
るものではない。またプライマーは、オリゴデオキシリ
ボヌクレオチド、オリゴデオキシリボヌクレオチド類の
共重合体、オリゴリボヌクレオチド、リボヌクレオチド
類の共重合体、またはデオキシリボヌクレオチドとリボ
ヌクレオチドの共重合体とすることができる。プライマ
ーは、天然のものでもよいし合成のものでもよい。オリ
ゴヌクレオチドプライマーは、インビボでの酵素による
合成、インビトロでの酵素による合成、あるいはインビ
トロでの酵素によらない合成のいずれでも合成すること
ができる。プライマーは、検出可能なマーカーで標識す
ることができ、この検出可能なマーカーは、試薬に存在
するかあるいは対象とする核酸に付着されるいずれの検
出可能マーカーとも異なり得る。さらに、プライマー
は、同定すべきヌクレオチド塩基の上流に隣接した対象
とする特定の位置にあるフランキング配列に対応する配
列を有している必要がある。
から得られる任意の核酸フラグメントを含む。たとえば
プライマーは、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＰＣＲに
より得られたＤＮＡのようなより大きな核酸フラグメン
トを断片化することにより調製することができる。プラ
イマーの性質は、プライマーを得る方法、たとえば、そ
れが、天然由来の核酸あるいは合成された核酸を断片化
することによるものなのか、あるいは核酸プライマー自
体を合成することによるものなのかによって、限定され
るものではない。またプライマーは、オリゴデオキシリ
ボヌクレオチド、オリゴデオキシリボヌクレオチド類の
共重合体、オリゴリボヌクレオチド、リボヌクレオチド
類の共重合体、またはデオキシリボヌクレオチドとリボ
ヌクレオチドの共重合体とすることができる。プライマ
ーは、天然のものでもよいし合成のものでもよい。オリ
ゴヌクレオチドプライマーは、インビボでの酵素による
合成、インビトロでの酵素による合成、あるいはインビ
トロでの酵素によらない合成のいずれでも合成すること
ができる。プライマーは、検出可能なマーカーで標識す
ることができ、この検出可能なマーカーは、試薬に存在
するかあるいは対象とする核酸に付着されるいずれの検
出可能マーカーとも異なり得る。さらに、プライマー
は、同定すべきヌクレオチド塩基の上流に隣接した対象
とする特定の位置にあるフランキング配列に対応する配
列を有している必要がある。
【００２５】また、プライマーは、対象とする核酸に存
在するヌクレオチドと、ハイブリダイゼーションまたは
アニーリングできる必要がある。必要なハイブリダイゼ
ーションを達成する方策の１つは、テンプレート依存性
プライマーを、既知の塩基配列に対し実質的に相補的ま
たは完全に相補的にすることである。
在するヌクレオチドと、ハイブリダイゼーションまたは
アニーリングできる必要がある。必要なハイブリダイゼ
ーションを達成する方策の１つは、テンプレート依存性
プライマーを、既知の塩基配列に対し実質的に相補的ま
たは完全に相補的にすることである。
【００２６】オリゴヌクレオチドプライマーは、組込ま
れていない試薬および／または対象とする核酸からのプ
ライマーのアフィニティ分離のため、固体支持体に当該
プライマーを結合させる１つまたは複数の部分を含み得
る。そのようなアフィニティ部分は、限定されることな
く、たとえば、ジギトニン、磁気ビーズ、リガンド類、
たとえば抗体を含むタンパク質リガンド類を含む。好ま
しくは当該部分はビオチンである。ビオチンを用いる場
合、ビオチンを含むプライマーは、固体支持体に付着さ
れたストレプトアビジンへのビオチンの結合を介して、
組込まれていない試薬および／または対象とする核酸か
らのプライマーのアフィニティ分離を可能にする。オリ
ゴヌクレオチドプライマーの配列は、固体支持体に付着
された核酸中に存在する相補的配列への塩基対合を介し
て、組込まれていない試薬および／または対象とする核
酸からの当該プライマーのアフィニティ分離を可能にす
るＤＮＡ配列を含み得る。
れていない試薬および／または対象とする核酸からのプ
ライマーのアフィニティ分離のため、固体支持体に当該
プライマーを結合させる１つまたは複数の部分を含み得
る。そのようなアフィニティ部分は、限定されることな
く、たとえば、ジギトニン、磁気ビーズ、リガンド類、
たとえば抗体を含むタンパク質リガンド類を含む。好ま
しくは当該部分はビオチンである。ビオチンを用いる場
合、ビオチンを含むプライマーは、固体支持体に付着さ
れたストレプトアビジンへのビオチンの結合を介して、
組込まれていない試薬および／または対象とする核酸か
らのプライマーのアフィニティ分離を可能にする。オリ
ゴヌクレオチドプライマーの配列は、固体支持体に付着
された核酸中に存在する相補的配列への塩基対合を介し
て、組込まれていない試薬および／または対象とする核
酸からの当該プライマーのアフィニティ分離を可能にす
るＤＮＡ配列を含み得る。
【００２７】ここで使用する「プライマー伸長反応」と
いう用語は、テンプレート依存性の核酸合成反応が行な
われる反応状態を指す。テンプレート依存性のプライマ
ー伸長反応を起こすための条件は、部分的に、適当なテ
ンプレート依存性酵素を存在させることにより作り出す
ことができる。適当なテンプレート依存性酵素にはＤＮ
Ａポリメラーゼがある。ＤＮＡポリメラーゼには、いく
つかの種類のものが有り得る。しかし、ＤＮＡポリメラ
ーゼは、プライマー依存性でありかつテンプレート依存
性でなければならない。たとえば、大腸菌ＤＮＡポリメ
ラーゼＩまたはその「クレノウフラグメント」、Ｔ４Ｄ
ＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ（シークエ
ナーゼ）、サーマス・アクアチカス（T. aquaticus）
ＤＮＡポリメラーゼ、あるいはレトロウイルス逆転写酵
素を使用することができる。Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼま
たはＴ７ＲＮＡポリメラーゼなどのＲＮＡポリメラーゼ
類も、いくつかのプロトコルで使用できる。ポリメラー
ゼに応じて、異なった条件を使用する必要があり、ま
た、ハイブリダイゼーションおよび伸長反応のために異
なった温度範囲が必要となり得る。
いう用語は、テンプレート依存性の核酸合成反応が行な
われる反応状態を指す。テンプレート依存性のプライマ
ー伸長反応を起こすための条件は、部分的に、適当なテ
ンプレート依存性酵素を存在させることにより作り出す
ことができる。適当なテンプレート依存性酵素にはＤＮ
Ａポリメラーゼがある。ＤＮＡポリメラーゼには、いく
つかの種類のものが有り得る。しかし、ＤＮＡポリメラ
ーゼは、プライマー依存性でありかつテンプレート依存
性でなければならない。たとえば、大腸菌ＤＮＡポリメ
ラーゼＩまたはその「クレノウフラグメント」、Ｔ４Ｄ
ＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ（シークエ
ナーゼ）、サーマス・アクアチカス（T. aquaticus）
ＤＮＡポリメラーゼ、あるいはレトロウイルス逆転写酵
素を使用することができる。Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼま
たはＴ７ＲＮＡポリメラーゼなどのＲＮＡポリメラーゼ
類も、いくつかのプロトコルで使用できる。ポリメラー
ゼに応じて、異なった条件を使用する必要があり、ま
た、ハイブリダイゼーションおよび伸長反応のために異
なった温度範囲が必要となり得る。
【００２８】ここで使用する「プライマー伸長鎖」とい
う用語は、プライマーが添加された後、二本鎖において
テンプレートに対向して形成される鎖を含む。好ましく
は、プライマーの伸長は、プライマー伸長鎖へのターミ
ネーターの組込みによって停止される。
う用語は、プライマーが添加された後、二本鎖において
テンプレートに対向して形成される鎖を含む。好ましく
は、プライマーの伸長は、プライマー伸長鎖へのターミ
ネーターの組込みによって停止される。
【００２９】ここで使用する「テンプレート」という用
語は、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡおよびＲＮＡ、ある
いはその任意の修飾物を含む核酸を指し、任意の長さま
たは配列であり得る。
語は、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡおよびＲＮＡ、ある
いはその任意の修飾物を含む核酸を指し、任意の長さま
たは配列であり得る。
【００３０】ここで使用する「ターミネーター」または
「チェーンターミネーター」という用語は、テンプレー
ト鎖に対向するプライマー伸長鎖に組込まれたとき、効
果的にプライマー伸長反応を終わらせる、Ａ、Ｇ、Ｃ、
ＴもしくはＵ、またはその類似体などの核酸塩基を指
す。好ましくは、ターミネーターはジデオキシヌクレオ
チドである。また好ましくは、ターミネーターは、非タ
ーミネーター上の標識と区別できるように、標識されな
いかまたは標識される。ここで、「ターミネーター」ま
たは「チェーンターミネーター」という用語が単数形で
使用されるとき、それは、ヌクレオチド一分子を使用す
ることを意味するものではない。むしろ「ターミネータ
ー」という用語の単数形は、アッセイに用いられるヌク
レオチド、核酸塩基あるいは核酸類似体の種類を表して
いる。たとえば、ターミネーターがｄｄＡであるとき、
単数形のｄｄＡは集合名詞であり、ｄｄＡのたった一分
子を指しているのではない。一方、「ターミネーター」
は、特定の種類のヌクレオチドが存在しないことでもあ
り得る。その場合、プライマー伸長は、該当する位置に
特定のヌクレオチドがないことによって停止される。た
とえば、テンプレート鎖上の「Ｃ」に対向する位置でプ
ライマー伸長反応を停止させたい場合、非終結塩基であ
るＡ、ＴおよびＣをプライマー伸長反応混合物に含有さ
せる一方、「Ｇ」（「Ｃ」の相補塩基）を含有させない
ようにすることができる。このようにすれば、相補的塩
基が存在しないことにより、プライマー伸長反応を停止
させることができ、たとえばジデオキシターミネーター
ヌクレオチドを添加する場合と同様の結果を得ることが
できる。
「チェーンターミネーター」という用語は、テンプレー
ト鎖に対向するプライマー伸長鎖に組込まれたとき、効
果的にプライマー伸長反応を終わらせる、Ａ、Ｇ、Ｃ、
ＴもしくはＵ、またはその類似体などの核酸塩基を指
す。好ましくは、ターミネーターはジデオキシヌクレオ
チドである。また好ましくは、ターミネーターは、非タ
ーミネーター上の標識と区別できるように、標識されな
いかまたは標識される。ここで、「ターミネーター」ま
たは「チェーンターミネーター」という用語が単数形で
使用されるとき、それは、ヌクレオチド一分子を使用す
ることを意味するものではない。むしろ「ターミネータ
ー」という用語の単数形は、アッセイに用いられるヌク
レオチド、核酸塩基あるいは核酸類似体の種類を表して
いる。たとえば、ターミネーターがｄｄＡであるとき、
単数形のｄｄＡは集合名詞であり、ｄｄＡのたった一分
子を指しているのではない。一方、「ターミネーター」
は、特定の種類のヌクレオチドが存在しないことでもあ
り得る。その場合、プライマー伸長は、該当する位置に
特定のヌクレオチドがないことによって停止される。た
とえば、テンプレート鎖上の「Ｃ」に対向する位置でプ
ライマー伸長反応を停止させたい場合、非終結塩基であ
るＡ、ＴおよびＣをプライマー伸長反応混合物に含有さ
せる一方、「Ｇ」（「Ｃ」の相補塩基）を含有させない
ようにすることができる。このようにすれば、相補的塩
基が存在しないことにより、プライマー伸長反応を停止
させることができ、たとえばジデオキシターミネーター
ヌクレオチドを添加する場合と同様の結果を得ることが
できる。
【００３１】ここで使用される「非ターミネーター」ま
たは「非チェーンターミネーター」という用語は、プラ
イマー伸長鎖に組込まれたときに伸長反応を終わらせな
いヌクレオチド塩基をいう。好ましくは、プライマー伸
長反応における少なくとも１つの非ターミネーターが標
識される。ここで、「非ターミネーター」または「非チ
ェーンターミネーター」という用語を単数形でいうと
き、それは、ヌクレオチド一分子を使用することを意味
するものではない。むしろ「非ターミネーター」という
用語の単数形は、アッセイに用いられるヌクレオチド、
核酸塩基あるいは核酸類似体の種類を表している。たと
えば、ターミネーターがＧであるとき、単数形のＧは集
合名詞であり、Ｇのたった一分子を指しているのではな
い。
たは「非チェーンターミネーター」という用語は、プラ
イマー伸長鎖に組込まれたときに伸長反応を終わらせな
いヌクレオチド塩基をいう。好ましくは、プライマー伸
長反応における少なくとも１つの非ターミネーターが標
識される。ここで、「非ターミネーター」または「非チ
ェーンターミネーター」という用語を単数形でいうと
き、それは、ヌクレオチド一分子を使用することを意味
するものではない。むしろ「非ターミネーター」という
用語の単数形は、アッセイに用いられるヌクレオチド、
核酸塩基あるいは核酸類似体の種類を表している。たと
えば、ターミネーターがＧであるとき、単数形のＧは集
合名詞であり、Ｇのたった一分子を指しているのではな
い。
【００３２】ここで使用する「突然変異体」または「突
然変異」という用語は、野生型の塩基または正常な塩基
と異なる、テンプレート鎖上の任意の塩基を示してい
る。本発明の方法を使用して検出され得る突然変異は、
アニーリングされたプライマーのすぐ３′側の塩基に直
接対向するテンプレート上の塩基に変異がある場合、単
一塩基の突然変異、挿入変異、欠失変異または遺伝子の
転座を含むあらゆるタイプの突然変異であり得る。
然変異」という用語は、野生型の塩基または正常な塩基
と異なる、テンプレート鎖上の任意の塩基を示してい
る。本発明の方法を使用して検出され得る突然変異は、
アニーリングされたプライマーのすぐ３′側の塩基に直
接対向するテンプレート上の塩基に変異がある場合、単
一塩基の突然変異、挿入変異、欠失変異または遺伝子の
転座を含むあらゆるタイプの突然変異であり得る。
【００３３】ここで使用する「標識」という用語は、検
出可能なシグナルを与えるため、ターミネーターヌクレ
オチドまたは非ターミネーターヌクレオチドに結合され
る任意の分子を指す。標識は、放射性のもの、化学蛍光
性のもの、抗体などのタンパク質リガンドとすることが
でき、もし蛍光基が使用されるのであれば、非ターミネ
ーターヌクレオチド塩基の各タイプについて異なった蛍
光基を使用してもよい。これらの蛍光性標識は、分光測
定によって識別可能な発光スペクトルを有する。
出可能なシグナルを与えるため、ターミネーターヌクレ
オチドまたは非ターミネーターヌクレオチドに結合され
る任意の分子を指す。標識は、放射性のもの、化学蛍光
性のもの、抗体などのタンパク質リガンドとすることが
でき、もし蛍光基が使用されるのであれば、非ターミネ
ーターヌクレオチド塩基の各タイプについて異なった蛍
光基を使用してもよい。これらの蛍光性標識は、分光測
定によって識別可能な発光スペクトルを有する。
【００３４】一方、プライマー伸長物へのヌクレオチド
塩基の組込みのレベルは、米国特許明細書第５，８８
５，７７５号に例示される質量分析法によっても測定す
ることができる。同公報に記載された内容はすべて本明
細書中に引用により援用する。
塩基の組込みのレベルは、米国特許明細書第５，８８
５，７７５号に例示される質量分析法によっても測定す
ることができる。同公報に記載された内容はすべて本明
細書中に引用により援用する。
【００３５】ここで使用する「高ストリンジェンシーの
ハイブリダイゼーション条件」という用語は、核酸のハ
イブリダイゼーション条件を指し、限定されるものでは
ないが、たとえば４２℃で０．１×ＳＳＣの洗浄条件な
どがある。ハイブリダイゼーション条件は一般的な分子
生物学のプロトコル書に見ることができ、たとえば、Au
subel et al. Current Protocols in Molecular Biolog
y, Greene and Wiley,Pub.（1994）に記載されている。
同書籍の内容すべてをここに引用により援用する。
ハイブリダイゼーション条件」という用語は、核酸のハ
イブリダイゼーション条件を指し、限定されるものでは
ないが、たとえば４２℃で０．１×ＳＳＣの洗浄条件な
どがある。ハイブリダイゼーション条件は一般的な分子
生物学のプロトコル書に見ることができ、たとえば、Au
subel et al. Current Protocols in Molecular Biolog
y, Greene and Wiley,Pub.（1994）に記載されている。
同書籍の内容すべてをここに引用により援用する。
【００３６】ここで使用する「薄層クロマトグラフィ
（ＴＬＣ）」は、セルロース材料をベースとする紙媒体
において行なうことができるが、それに限定されること
なく、複数種の分子を細かく分離し均一な層を形成させ
ることのできる任意の物質で調製することができる。そ
のような材料は、シリカゲル、酸化アルミニウム、ケイ
ソウ土またはケイ酸マグネシウムなどの無機物質を含む
がこれらに限定されるものではない。ＴＬＣのための有
機物質には、セルロース、ポリアミドまたはポリエチレ
ン粉末があるがこれらに限定されるものではない。薄層
クロマトグラフィ法は、化学プロトコル書に一般的に記
述されており、たとえば、Freeman and Co.出版のFreif
elder, Physical Biochemistry-Applications to Bioch
emistry and Molecular Biology, second ed.（198
2）、特にクロマトグラフィの技法について述べる第８
章、とりわけ、薄層クロマトグラフィについて述べる第
２２９頁から２３２頁に記載されている。同書籍の内容
すべてをここに引用により援用する。
（ＴＬＣ）」は、セルロース材料をベースとする紙媒体
において行なうことができるが、それに限定されること
なく、複数種の分子を細かく分離し均一な層を形成させ
ることのできる任意の物質で調製することができる。そ
のような材料は、シリカゲル、酸化アルミニウム、ケイ
ソウ土またはケイ酸マグネシウムなどの無機物質を含む
がこれらに限定されるものではない。ＴＬＣのための有
機物質には、セルロース、ポリアミドまたはポリエチレ
ン粉末があるがこれらに限定されるものではない。薄層
クロマトグラフィ法は、化学プロトコル書に一般的に記
述されており、たとえば、Freeman and Co.出版のFreif
elder, Physical Biochemistry-Applications to Bioch
emistry and Molecular Biology, second ed.（198
2）、特にクロマトグラフィの技法について述べる第８
章、とりわけ、薄層クロマトグラフィについて述べる第
２２９頁から２３２頁に記載されている。同書籍の内容
すべてをここに引用により援用する。
【００３７】対象とする核酸を同定および／または定量
するための方法において、伸長反応の後、適当な変性条
件を使用し、対象とする核酸からプライマー伸長鎖を分
離することができる。この変性条件は、熱、アルカリ、
ホルムアミド、尿素、グリオキサール、酵素、およびそ
れらの組合わせを含み得る。変性条件には、２．０Ｎの
ＮａＯＨによる処理を使用してもよい。
するための方法において、伸長反応の後、適当な変性条
件を使用し、対象とする核酸からプライマー伸長鎖を分
離することができる。この変性条件は、熱、アルカリ、
ホルムアミド、尿素、グリオキサール、酵素、およびそ
れらの組合わせを含み得る。変性条件には、２．０Ｎの
ＮａＯＨによる処理を使用してもよい。
【００３８】当業者には明らかなように、ターミネータ
ーを非ターミネーターと異なる標識で標識することがで
き、それを、プライマー伸長鎖におけるターミネーター
と非ターミネーターの組込みを区別するのに用いること
ができる。ターミネーターの例には、特定の種類のヌク
レオチドが存在しないことも含まれる。そのようなター
ミネーターも一例であり、それにより特許請求の範囲が
限定されるものではない。ターミネーター上の標識が非
ターミネーター上の標識と異なる限り、示差的に標識さ
れたあるいは示差的に標識されていないターミネーター
も本発明に含まれる。
ーを非ターミネーターと異なる標識で標識することがで
き、それを、プライマー伸長鎖におけるターミネーター
と非ターミネーターの組込みを区別するのに用いること
ができる。ターミネーターの例には、特定の種類のヌク
レオチドが存在しないことも含まれる。そのようなター
ミネーターも一例であり、それにより特許請求の範囲が
限定されるものではない。ターミネーター上の標識が非
ターミネーター上の標識と異なる限り、示差的に標識さ
れたあるいは示差的に標識されていないターミネーター
も本発明に含まれる。
【００３９】当業者には明らかなように、テンプレート
の配列の少なくとも一部が既知であれば、テンプレート
鎖に結合するプライマーを設計することができ、そし
て、そのようなプライマーをテンプレート鎖に結合させ
ることができる。また当業者に明らかなように、本発明
の方法は、１またはそれ以上のアッセイチューブにおい
て、数種類のプライマーを用いて行うことができる。
の配列の少なくとも一部が既知であれば、テンプレート
鎖に結合するプライマーを設計することができ、そし
て、そのようなプライマーをテンプレート鎖に結合させ
ることができる。また当業者に明らかなように、本発明
の方法は、１またはそれ以上のアッセイチューブにおい
て、数種類のプライマーを用いて行うことができる。
【００４０】本発明の方法の特徴は、非ターミネーター
が均一に標識されていれば、強いシグナルを発生させる
ことができる点にある。というのも、プライマー伸長鎖
にいくつかの標識された非ターミネーターが組込まれ、
それにより加成的なシグナル効果が得られるからであ
る。種々のターミネーターまたは非ターミネーターに特
異的な種々の標識を使用してシグナルを検出すれば、精
度が向上する。
が均一に標識されていれば、強いシグナルを発生させる
ことができる点にある。というのも、プライマー伸長鎖
にいくつかの標識された非ターミネーターが組込まれ、
それにより加成的なシグナル効果が得られるからであ
る。種々のターミネーターまたは非ターミネーターに特
異的な種々の標識を使用してシグナルを検出すれば、精
度が向上する。
【００４１】また、本発明により、必要に応じて定量的
にあるいは非定量的に試料中の標的核酸の有無を迅速か
つ正確に測定するためのキットおよび試薬が提供され
る。当該キットの各構成要素は、該キットに含まれる適
当な容器に、それぞれ収容することができる。個々の容
器には、その内容物を明らかにするようにラベルをつけ
ることができる。さらに、個々に収容される構成要素
は、必要なすべての構成要素を収容することができるよ
り大きな容器に入れてもよい。また、当該キットの使用
方法を示す説明をキットに付属させることができる。そ
のような説明は、説明書として入れてもよいし、キット
自体に付与してもよい。
にあるいは非定量的に試料中の標的核酸の有無を迅速か
つ正確に測定するためのキットおよび試薬が提供され
る。当該キットの各構成要素は、該キットに含まれる適
当な容器に、それぞれ収容することができる。個々の容
器には、その内容物を明らかにするようにラベルをつけ
ることができる。さらに、個々に収容される構成要素
は、必要なすべての構成要素を収容することができるよ
り大きな容器に入れてもよい。また、当該キットの使用
方法を示す説明をキットに付属させることができる。そ
のような説明は、説明書として入れてもよいし、キット
自体に付与してもよい。
【００４２】以下の例は、本発明の例示として提供され
るものであり本発明を限定するものではない。
るものであり本発明を限定するものではない。
【００４３】例 全ＲＮＡをラットの脳からＲＮＡｚｏｌＢ（Tels-tel,
TX）法により抽出した。全ＲＮＡの濃度をＯＤ２６０ｎ
ｍの吸光度により測定した。全ＲＮＡをＲＮアーゼフリ
ーのジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）で処理され
た水で希釈した。表２に示すように異なる量のＲＮＡを
含む希釈したＲＮＡ溶液５μｌを各チューブに入れ、次
いで、１μｌの合成オリゴヌクレオチドプライマー5'-G
TGGGAACCGTGTCA-3'（SEQ ID No.1）を混合した。このプ
ライマーは、ラットの脳の特定のｃＤＮＡ（非公開デー
タ）と対合する配列である。このＲＮＡ−プライマー混
合物を７０℃で３分間加熱し、そして氷上で３分間イン
キュベートした。チューブをすばやくスピナーにかけた
後、最終濃度が２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ
７．５）、１５単位のＲＮアーゼ阻害剤、０．５ｍＭの
ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、１μｌのｄＣＴＰα32Ｐおよび１
００単位のＭＭＶＬ逆転写酵素を含む１４μｌの反応混
合物を添加して、プライマー伸長反応を開始させた。こ
の反応を３７℃で２０分間行った後、１００℃で２分間
反応チューブを加熱することにより反応を停止させた。
１μｌの反応混合物を薄層クロマトグラフィー（TRIM U
SA, メリーランド）にかけ、遊離のｄＣＴＰα32Ｐを分
離した。次いで、標識されたプライマーの放射能をシン
チレーションカウンター（Beckman LS 5000）により計
測した。その結果を表２に示す。
TX）法により抽出した。全ＲＮＡの濃度をＯＤ２６０ｎ
ｍの吸光度により測定した。全ＲＮＡをＲＮアーゼフリ
ーのジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）で処理され
た水で希釈した。表２に示すように異なる量のＲＮＡを
含む希釈したＲＮＡ溶液５μｌを各チューブに入れ、次
いで、１μｌの合成オリゴヌクレオチドプライマー5'-G
TGGGAACCGTGTCA-3'（SEQ ID No.1）を混合した。このプ
ライマーは、ラットの脳の特定のｃＤＮＡ（非公開デー
タ）と対合する配列である。このＲＮＡ−プライマー混
合物を７０℃で３分間加熱し、そして氷上で３分間イン
キュベートした。チューブをすばやくスピナーにかけた
後、最終濃度が２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ
７．５）、１５単位のＲＮアーゼ阻害剤、０．５ｍＭの
ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、１μｌのｄＣＴＰα32Ｐおよび１
００単位のＭＭＶＬ逆転写酵素を含む１４μｌの反応混
合物を添加して、プライマー伸長反応を開始させた。こ
の反応を３７℃で２０分間行った後、１００℃で２分間
反応チューブを加熱することにより反応を停止させた。
１μｌの反応混合物を薄層クロマトグラフィー（TRIM U
SA, メリーランド）にかけ、遊離のｄＣＴＰα32Ｐを分
離した。次いで、標識されたプライマーの放射能をシン
チレーションカウンター（Beckman LS 5000）により計
測した。その結果を表２に示す。
【００４４】上述の工程はすべて、すでに自動化されて
いるかまたは自動化できる、化学反応、操作およびプロ
トコルを含む。したがって、本発明の好ましい実施の態
様を、適当にプログラムされた自動化装置のワークステ
ーション操作に組入れることで、生物試料から得られる
核酸中の特定のヌクレオチド配列または配列の違いの検
出に応じて、実質的にあらゆる診断法について顕著にコ
ストを節約でき、生産性を高めることができる。
いるかまたは自動化できる、化学反応、操作およびプロ
トコルを含む。したがって、本発明の好ましい実施の態
様を、適当にプログラムされた自動化装置のワークステ
ーション操作に組入れることで、生物試料から得られる
核酸中の特定のヌクレオチド配列または配列の違いの検
出に応じて、実質的にあらゆる診断法について顕著にコ
ストを節約でき、生産性を高めることができる。
【００４５】なお、本明細書中で引用するすべての文献
の内容は、そっくりそのまま、本明細書による開示とす
る。
の内容は、そっくりそのまま、本明細書による開示とす
る。
【００４６】
【表１】
【００４７】
【表２】
【００４８】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> WANG, Xiao B. MORISAWA, Shinkatsu <120> Isometric Primer Extension Method and Kit for Detection and Quantification of Specific Nucleic Acid <130> 1010832 <150> US 60/209,987 <151> 2000-06-08 <150> US <151> 2001-05-23 <160> 9 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic oligonucleotide <400> 1 gtgggaaccg tgtca 15 <210> 2 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic oligonucleotide <400> 2 tgatcagcag gctgaaatcg tcgtggattg caacgacgcc gacgattctc gtcctttaag 60 gcgatagcat 70 <210> 3 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic oligonucleotide <400> 3 tcgtcggcgt cgttgc 16 <210> 4 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic oligonucleotide <400> 4 aaaggacgag aa 12 <210> 5 <211> 70 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic oligonucleotide <400> 5 ugaucagcag gcugaaaucg ucguggauug caacgacgcc gacgauucuc guccuuuaag 60 gcgauagcau 70 <210> 6 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic oligonucleotide <400> 6 gcctgctg 8 <210> 7 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic oligonucleotide <400> 7 ccacgacga 9 <210> 8 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic oligonucleotide <400> 8 ttaaagga 8 <210> 9 <211> 5 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic oligonucleotide <400> 9 gattt 5
【図１】 特定のＤＮＡ配列を検出かつ定量するための
複数プライマー伸長反応を示す模式図である。
複数プライマー伸長反応を示す模式図である。
【図２】 ＲＮＡを検出かつ定量するための複数プライ
マー伸長法を使用するための模式図である。
マー伸長法を使用するための模式図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Ｆターム(参考） 4B024 AA11 CA01 CA11 CA20 HA11 HA20 4B063 QA01 QQ42 QQ52 QR08 QR32 QR38 QR42 QR62 QR82 QS03 QS24 QS28 QS36 QS39 QX02 QX10
Claims (40)
- 【請求項１】 試料中の標的核酸を検出または定量する
ための方法であって、 （ａ）標的核酸の所定の位置に特異的に対合する１つま
たは複数のプライマーを準備すること、 （ｂ）高ストリンジェンシーの条件下で（ａ）からの１
つまたは複数のプライマーを標的核酸とアニーリングさ
せて、標的核酸の所定の位置でプライマー−核酸二本鎖
を得ること、 （ｃ）（１）１種、２種または３種の遊離の非ターミネ
ーターヌクレオチドと、必要に応じて検出可能なマーカ
ーで標識された少なくとも１種の非ターミネーターヌク
レオチドを含み、かつ（２）（１）の１種、２種または
３種の非ターミネーターヌクレオチドとは異なる種類の
ターミネータヌクレオチドを含むか含まない混合物を、
（ｂ）からのプライマー−核酸二本鎖と混合すること、 （ｄ）適当な緩衝液中で酵素または化学反応によりプラ
イマー伸長を行うこと、および （ｅ）プライマー伸長したヌクレオチド上の標識シグナ
ルを検出または定量すること、もしくは （ｆ）伸長したプライマーを質量分析によって検出また
は定量することを含む、方法。 - 【請求項２】 プライマーが、核酸プライマー、オリゴ
デオキシリボヌクレオチド、オリゴリボヌクレオチド、
またはデオキシリボ核酸とリボ核酸の共重合体である、
請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 対象とする核酸が、デオキシリボ核酸、
リボ核酸、またはデオキシリボ核酸とリボ核酸の共重合
体である、請求項１または２に記載の方法。 - 【請求項４】 非ターミネーターヌクレオチドが、デオ
キシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドである、
請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項５】 ターミネーターがジデオキシリボヌクレ
オチドである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方
法。 - 【請求項６】 非ターミネーターヌクレオチドとターミ
ネーターヌクレオチドとの組合わせが、(a) dATP, dCT
P, dGTP, ddTTP もしくは ddUTP,(b) dATP, dCTP, dTTP
もしくは dUTP, ddGTP,(c) dATP, dGTP, dTTP もしく
は dUTP, ddCTP,(d) dCTP, dGTP, dTTP もしくは dUTP,
ddATP,(e) dATP, dCTP, dGTP,(f) dATP, dCTP, dTTP
もしくは dUTP,(g) dATP, dGTP, dTTP もしくは dUTP,
または(h) dCTP, dGTP, dTTP もしくは dUTPである、請
求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項７】 少なくとも１つの非ターミネーターヌク
レオチドが検出可能なマーカーで標識されている、請求
項１〜６のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項８】 ターミネーターヌクレオチドは標識され
ており、そのような標識は、非ターミネーターヌクレオ
チドを標識するマーカーと異なる検出可能なマーカーに
よるものか、そのようなマーカーなしによるものであ
る、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項９】 検出可能なマーカーは、酵素もしくはタ
ンパク質の部分、放射性同位体、蛍光性の部分、または
化学基からなる、請求項７または８に記載の方法。 - 【請求項１０】 非ターミネーターヌクレオチドおよび
ターミネーターヌクレオチドは標識されておらず、検出
または定量する工程は伸長したプライマーを質量分析を
用いて分析することにより行われる、請求項１〜６のい
ずれか１項に記載の方法。 - 【請求項１１】 酵素はテンプレート依存性のものであ
る、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項１２】 テンプレート依存性の酵素は、ＤＮＡ
ポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、または逆転写酵素
である、請求項１１に記載の方法。 - 【請求項１３】 テンプレート依存性の酵素は、大腸菌
ＤＮＡポリメラーゼＩ、そのクレノウフラグメント、Ｔ
４ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ、好熱
菌のＤＮＡポリメラーゼ、レトロウイルスの逆転写酵
素、またはそれらの組合わせである、請求項１２に記載
の方法。 - 【請求項１４】 標的核酸は、インビボまたはインビト
ロで酵素により合成されたものであるか、酵素によらず
に合成されたものである、請求項１〜１３のいずれか１
項に記載の方法。 - 【請求項１５】 標的核酸は、ポリメラーゼ連鎖反応に
より合成されたものである、請求項１〜１４のいずれか
１項に記載の方法。 - 【請求項１６】 標的核酸は、天然由来でないヌクレオ
チド類似体を含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記
載の方法。 - 【請求項１７】 天然由来でないヌクレオチド類似体
は、デオキシイノシンまたは７−デアザ−２’−デオキ
シグアノシンを含む、請求項１６に記載の方法。 - 【請求項１８】 標的核酸は、生物からのゲノムＤＮ
Ａ、そのＲＮＡ転写物、またはそのＲＮＡ転写物から調
製されたｃＤＮＡを含む、請求項１〜１５のいずれか１
項に記載の方法。 - 【請求項１９】 生物は、植物、微生物、細菌、または
ウイルスである、請求項１８に記載の方法。 - 【請求項２０】 生物は、脊椎動物または無脊椎動物で
ある、請求項１８に記載の方法。 - 【請求項２１】 生物は哺乳動物である、請求項１８に
記載の方法。 - 【請求項２２】 生物はヒトである、請求項２１に記載
の方法。 - 【請求項２３】 標的核酸について増幅工程を行う、請
求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項２４】 増幅工程は、クローニング、転写、ポ
リメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（Ｌ
ＣＲ）、鎖置換増幅（strand displacementamplificati
on）（ＳＤＡ）、またはループ媒介等温増幅（loop med
iated isothermal amplification）（ＬＡＭＰ）を含
む、請求項２３に記載の方法。 - 【請求項２５】 プライマーは、組込まれなかった試薬
および／または対象とする核酸から該プライマーをアフ
ィニティ分離することを可能にする１つまたは複数の部
分を有する、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方
法。 - 【請求項２６】 プライマーは、固体支持体へのプライ
マーの固定化を可能にし、固定化されたプライマー配列
の提供を可能にする１つまたは複数の部分を有する、請
求項１〜２５のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項２７】 当該部分は、ビオチンまたはジギトニ
ンを含む特定の化学基からなる、請求項２５または２６
に記載の方法。 - 【請求項２８】 当該部分は、固体支持体中に存在する
相補的配列への塩基対合を介して該固体支持体に当該プ
ライマーを結合させることができるＤＮＡ配列またはＲ
ＮＡ配列からなる、請求項２５または２６に記載の方
法。 - 【請求項２９】 プライマーは、固定化されたプライマ
ー配列を提供させるように固体支持体上で直接合成され
たものである、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の
方法。 - 【請求項３０】 当該合成は、酵素による方法、化学的
方法、または物理的方法によりなされている、請求項２
９に記載の方法。 - 【請求項３１】 プライマーは、固定化された標的核酸
配列を提供させるように固体支持体上に固定化されてい
る、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項３２】 プライマーは、可逆的に固体支持体上
に固定化されている、請求項１〜３０のいずれか１項に
記載の方法。 - 【請求項３３】 プライマーは、化学的方法、酵素によ
る方法、または物理的方法によって固体支持体から切り
離すことができる、請求項３２に記載の方法。 - 【請求項３４】 標的核酸は、固定化された標的核酸配
列を提供させるように固体支持体上に固定化されてい
る、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項３５】 標的核酸は、可逆的に固体支持体上に
固定化されている、請求項１〜３３のいずれか１項に記
載の方法。 - 【請求項３６】 標的核酸は、化学的方法、酵素による
方法、または物理的方法によって固体支持体から切り離
すことができる、請求項３５に記載の方法。 - 【請求項３７】 固定化は、光によって開裂させること
ができる結合を介してなされている、請求項３１、３
２、３４または３５に記載の方法。 - 【請求項３８】 固体支持体は、ビーズ、平坦な表面、
チップ、キャピラリー、ピン、くし状体、またはウエハ
からなる、請求項２６、２８、２９、３１、３２、３４
または３５に記載の方法。 - 【請求項３９】 固体支持体に予め固定化された相補的
な捕獲用核酸分子と、標的核酸配列とは異なる核酸分子
の部分との間で起こるハイブリダイゼーションによっ
て、固定化がなされる、請求項３１、３２、３４または
３５に記載の方法。 - 【請求項４０】 固体支持体と、標的核酸配列とは異な
る核酸分子の部分との間での直接的な結合を介して、固
定化がなされる、請求項３１、３２、３４または３５に
記載の方法。
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2023549287A (ja) * | 2020-10-26 | 2023-11-22 | ワイワイゼット ファーマテック インコーポレイティド | 核酸検出及び疾患診断のための、質量分析に基づく方法及びキット |
| WO2025134188A1 (ja) * | 2023-12-18 | 2025-06-26 | 株式会社日立ハイテク | 変異遺伝子検出方法 |
Families Citing this family (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2001245698A (ja) * | 1999-11-22 | 2001-09-11 | Xiao Bing Wang | 核酸検出法 |
| CA2515938A1 (en) * | 2003-02-12 | 2004-08-26 | Genizon Svenska Ab | Methods and means for nucleic acid sequencing |
| CA2609328A1 (en) * | 2005-05-26 | 2006-11-30 | The Trustees Of Boston University | Quantification of nucleic acids and proteins using oligonucleotide mass tags |
| WO2007005649A2 (en) * | 2005-06-30 | 2007-01-11 | Applera Corporation | Proximity probing of target proteins comprising restriction and/or extension field |
| CA2659632A1 (en) * | 2006-08-01 | 2008-02-07 | Applera Corporation | Detection of analytes and nucleic acids |
| WO2009123494A1 (ru) * | 2008-04-01 | 2009-10-08 | Drygin Yury Fedorovich | Способ одновременного обнаружения множества рнк последовательностей в биологическом образце |
| WO2017027783A1 (en) * | 2015-08-13 | 2017-02-16 | Centrillion Technology Holdings Corporation | Methods for synchronising nucleic acid molecules |
| EP3692049A4 (en) * | 2017-10-04 | 2021-06-23 | Centrillion Technology Holdings Corporation | METHOD AND SYSTEM FOR ENZYMATIC SYNTHESIS OF OLIGONUCLEOTIDES |
| BR112021006044A2 (pt) * | 2018-12-21 | 2021-06-29 | Illumina, Inc. | depleção de rna baseada em nuclease |
| US20220154180A1 (en) * | 2019-03-13 | 2022-05-19 | Toyobo Co., Ltd. | Production and amplification of nucleic acids |
| JP2022538046A (ja) * | 2019-06-18 | 2022-08-31 | マンモス バイオサイエンシズ インコーポレイテッド | 核酸を検出するためのアッセイおよび方法 |
| TW202120693A (zh) * | 2019-08-21 | 2021-06-01 | 美商伊路米納有限公司 | 偵測核苷酸之聚合酶併入的方法 |
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Family Cites Families (27)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4948882A (en) * | 1983-02-22 | 1990-08-14 | Syngene, Inc. | Single-stranded labelled oligonucleotides, reactive monomers and methods of synthesis |
| US4965188A (en) | 1986-08-22 | 1990-10-23 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences using a thermostable enzyme |
| GB8805692D0 (en) | 1988-03-10 | 1988-04-07 | Ici Plc | Method of detecting nucleotide sequences |
| US5179198A (en) * | 1988-07-11 | 1993-01-12 | Hidechika Okada | Glycoprotein and gene coding therefor |
| US6013431A (en) | 1990-02-16 | 2000-01-11 | Molecular Tool, Inc. | Method for determining specific nucleotide variations by primer extension in the presence of mixture of labeled nucleotides and terminators |
| US5846710A (en) * | 1990-11-02 | 1998-12-08 | St. Louis University | Method for the detection of genetic diseases and gene sequence variations by single nucleotide primer extension |
| IE66125B1 (en) | 1991-01-31 | 1995-12-13 | Zeneca Ltd | Detection method for variant nucleotides |
| US5888819A (en) | 1991-03-05 | 1999-03-30 | Molecular Tool, Inc. | Method for determining nucleotide identity through primer extension |
| WO1993014217A1 (en) * | 1992-01-10 | 1993-07-22 | Life Technologies, Inc. | Use of predetermined nucleotides having altered base pairing characteristics in the amplification of nucleic acid molecules |
| US5710028A (en) | 1992-07-02 | 1998-01-20 | Eyal; Nurit | Method of quick screening and identification of specific DNA sequences by single nucleotide primer extension and kits therefor |
| US5650277A (en) * | 1992-07-02 | 1997-07-22 | Diagenetics Ltd. | Method of determining the presence and quantifying the number of di- and trinucleotide repeats |
| US6007987A (en) * | 1993-08-23 | 1999-12-28 | The Trustees Of Boston University | Positional sequencing by hybridization |
| WO1995014108A1 (en) | 1993-11-17 | 1995-05-26 | Amersham International Plc | Primer extension mass spectroscopy nucleic acid sequencing method |
| DE69432919T2 (de) | 1993-12-28 | 2004-05-27 | Tanabe Seiyaku Co., Ltd. | Verfahren für den Nachweis spezifischer Polynukleotiden |
| WO1996030545A1 (en) | 1995-03-24 | 1996-10-03 | Mitokor | Mutation detection by differential primer extension of mutant and wildtype target sequences |
| US5830655A (en) * | 1995-05-22 | 1998-11-03 | Sri International | Oligonucleotide sizing using cleavable primers |
| US5700642A (en) * | 1995-05-22 | 1997-12-23 | Sri International | Oligonucleotide sizing using immobilized cleavable primers |
| US5965363A (en) * | 1996-09-19 | 1999-10-12 | Genetrace Systems Inc. | Methods of preparing nucleic acids for mass spectrometric analysis |
| US5885775A (en) * | 1996-10-04 | 1999-03-23 | Perseptive Biosystems, Inc. | Methods for determining sequences information in polynucleotides using mass spectrometry |
| AU735416B2 (en) * | 1996-11-06 | 2001-07-05 | Sequenom, Inc. | Dna diagnostics based on mass spectrometry |
| US5888778A (en) | 1997-06-16 | 1999-03-30 | Exact Laboratories, Inc. | High-throughput screening method for identification of genetic mutations or disease-causing microorganisms using segmented primers |
| US5994079A (en) * | 1998-02-06 | 1999-11-30 | Digene Corporation | Direct detection of RNA mediated by reverse transcriptase lacking RNAse H function |
| US6723564B2 (en) | 1998-05-07 | 2004-04-20 | Sequenom, Inc. | IR MALDI mass spectrometry of nucleic acids using liquid matrices |
| US6221592B1 (en) * | 1998-10-20 | 2001-04-24 | Wisconsin Alumi Research Foundation | Computer-based methods and systems for sequencing of individual nucleic acid molecules |
| US6156178A (en) * | 1999-07-13 | 2000-12-05 | Molecular Dynamics, Inc. | Increased throughput analysis of small compounds using multiple temporally spaced injections |
| JP2001245698A (ja) * | 1999-11-22 | 2001-09-11 | Xiao Bing Wang | 核酸検出法 |
| US7582420B2 (en) * | 2001-07-12 | 2009-09-01 | Illumina, Inc. | Multiplex nucleic acid reactions |
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