【発明の詳細な説明】
原核生物RNAポリメラーゼ自己遺伝子を利用する細胞質遺伝子発現系
本願は、1996年４月26日に出願された米国暫定特許出願60/016,304の受益を請
求し、この内容は参考として本明細書中に援用される。
発明の分野
本発明は、真核生物細胞内の核酸配列の発現に関する。より詳細には、本発明
は、細胞においてDNAの細胞質発現を容易にする原核生物RNAポリメラーゼ自己遺
伝子（autogene）を利用する細胞質発現系に関する。
発明の背景
これまでに、多数の発現系が、インビトロおよびインビボの両方において真核
生物細胞内で遺伝子を発現するために利用されている。しかし、これらの系の多
くが、真核生物プロモーターの制御下で目的の遺伝子を含むDNA発現ベクターか
らなるので、これらの発現系は、真核生物プロモーターに対する転写機構が備わ
っている宿主細胞核へのDNAベクターの移行を必要とする。不運なことに、真核
生物細胞によって取り込まれるDNAの非常に小さい割合のみが、核に移行される
；それ故、このような核内発現系からの遺伝子の発現は限定され得る。従って、
原核生物プロモーター制御下の目的の遺伝子を含む発現ベクターは、細胞質内の
発現を駆動するように設計されている。分子内の核局在性シグナルの非存在によ
り、真核生物細胞によるDNAの細胞質内取り込みがより効率的であり、そして原
核生物RNAポリメラーゼは真核生物細胞の細胞質にのみ備わっているので、これ
は有益である。しかし、このような系を介した、高い、継続的なレベルの細胞内
DNAの発現は、細胞の細胞質中への原核生物RNAポリメラーゼの継続的な提供に依
存するので、このような細胞質発現系でさえ、欠点を有する。従って、例えば、
T7発現ベクターは、外来性供給のT7 RNAポリメラーゼと共に細胞に同時送達され
るか、またはT7 RNAポリメラーゼを発現する細胞株において利用されなければな
らない。不運なことに、前者のアプローチは費用が高く、そして細胞に対して強
い毒性であり、一方、後者のアプローチは、T7 RNAポリメラーゼ遺伝子が真核生
物細胞内で内在性に発現しない細菌性遺伝子であるので、真核生物細胞内のT7発
現ベクターの使用において大きな制限を有する。これらの理由から、発明者らは
、真核生物細胞の細胞質でのT7 RNAポリメラーゼの自己開始、および自己増幅供
給源として機能するT7 RNAポリメラーゼ自己遺伝子を設計することを試みた。
Gaoら（(1993)Nucleic Acids Res．21:2867-2872）は、バクテリオファージT7
プロモーターにより駆動されるレポーター遺伝子の真核生物細胞内での細胞質発
現を首尾良く支持する、pT7 AUTO 2C-と命名されたT7自己遺伝子を記載した。し
かし、この自己遺伝子は、pT7 AUTO 2CのT7プロモーターからのT7 RNAポリメラ
ーゼの自己触媒性産生を開始するのに十分な、大量の外因性T7 RNAポリメラーゼ
と共に細胞に同時送達される場合のみ、T7 RNAポリメラーゼを産生し得た。従っ
て、pT7 AUTO 2C-自己遺伝子は、実際のところ、pT7 AUTO 2C-自己遺伝子は自己
触媒サイクルを始めるための外因性T7ポリメラーゼの送達を必要としたという点
でT7ポリメラーゼの自己産生供給源ではなかった。
Dengら（(1993)Gene，143:245-249）は、T7プロモーター、脳心筋炎内部リポ
ソーム侵入配列（EMC IRES）、およびT7 RNAポリメラーゼ遺伝子を含む自己遺伝
子プラスミドについて言及する。この自己遺伝子単独、または自己遺伝子プラス
ミドDNAとの組合せにおける、インビトロでの転写物は、インビトロでの外来遺
伝子発現を支持することが報告された。しかし、自己遺伝子プラスミドDNA単独
により支持された外来遺伝子発現が、自己遺伝子プラスミドDNAのT7プロモータ
ーからのT7 RNAポリメラーゼ遺伝子の転写を明白に開始するのに十分な、低いレ
ベルのT7 RNAポリメラーゼを、安定して発現する細胞株について報告されたのみ
であった。
WO 94/26911は、T7 RNAポリメラーゼ遺伝子、EMC IRES、およびT7プロモータ
ーを含む構築物について言及する。この構築物の、T7 RNAポリメラーゼとのイン
キュベーションは、構築物の細胞内への導入の前に、T7 RNAポリメラーゼの構築
物への結合（それにより、T7 RNAポリメラーゼ：構築物複合体が、細胞の細胞質
への移入に際してT7 RNAポリメラーゼの自己開始供給源および自己増殖供給源と
して作用することを可能にする）を生じることが報告されている。しかし、増幅
プロセスを開始するために、外因性T7 RNAポリメラーゼ酵素を必要としない、真
核生物細胞内での持続的な、高いレベルのT7 RNAポリメラーゼを生じ得るT7 RNA
ポリメラーゼ自己遺伝子の必要性が依然としてある。このような自己遺伝子は、
遺伝子治療での使用を含め、インビトロおよびインビボの両方でのタンパク質発
現に有益である。遺伝子治療は、近年、最も急速な発達をしている生物医学分野
の１つになっている（Anderson，W.F.（1992）Science，256:808-813）。
発明の要旨
本発明は、自己開始、自己増幅の原核生物RNAポリメラーゼ自己遺伝子を利用
する細胞質遺伝子発現系に関する。
本発明の原核生物RNAポリメラーゼ自己遺伝子は、5'から3'の向きで作動可能
に連結される以下の成分：真核生物プロモーター、原核生物RNAポリメラーゼの
コグネイトプロモーター、および原核生物RNAポリメラーゼをコードする核酸配
列、を最小限に含むDNA構築物である。別の実施態様において、自己遺伝子構築
物内のコグネイトプロモーターは、内部リボソーム侵入部位配列（IRES）により
RNAポリメラーゼ遺伝子から分離され得る。
本発明はさらに、標的配列を発現するためのインビトロおよびインビボでの細
胞質発現系におけるこの自己遺伝子の使用に関する。
１つの実施態様において、細胞質発現系は、「二重配列細胞質発現系」であり
、これは、原核生物RNAポリメラーゼ自己遺伝子を含む第１の配列、および標的
配列に作動可能に連結された同族のRNAポリメラーゼプロモーターを含む第２の
配列を含む。
別の実施態様において、この細胞質発現系は、「単一配列細胞質発現系」であ
り得、これは、5'から3'の向きで、以下：真核生物プロモーター、原核生物RNA
ポリメラーゼのコグネイトプロモーター、RNAポリメラーゼをコードする核酸配
列、コグネイトプロモーターの第２のコピー、および標的配列を含む単一の核酸
配列からなる。別の実施態様において、コグネイトプロモーターは、IRESにより
、二重配列系および単一配列系において標的配列から分離される。
本発明はさらに、二重配列細胞質発現系、または単一配列細胞質発現系のいず
れかを含む、薬学的組成物を提供する。さらに、薬学的組成物中に含まれる標的
配列によってコードされる分子に依存して、本発明の組成物は、予防的におよび
/または治療的に投与され得る。
本発明はまた、二重配列細胞質発現系としてまたは標的配列に作動可能に連結
された同族RNAポリメラーゼプロモーターの第２のコピーとの組合せにおける単
一配列として標的配列に作動可能に連結された同族RNAポリメラーゼプロモータ
ーを含む第２の配列との組合せで、原核生物RNAポリメラーゼ自己遺伝子を単独
に含むキットに関する。
本発明はまた、本発明の原核生物RNAポリメラーゼ自己遺伝子で、安定に形質
転換される細胞株を提供する。
図面の簡単な説明
図１は、本トランスフェクション研究において使用される線状DNAフラグメン
トおよび通常のプラスミドのマップを示す。線状PCRフラグメントを生成するた
めに使用したプライマーの配列もまた示す。DNA配列の略語は以下の通りである
：pT7-CAT：T7-CATプラスミド；fT7-CAT：T7-CAT PCRフラグメント；pUCCMV-CAT
：CMV-CATプラスミド；fCMV-CAT：CMV-CAT PCRフラグメント；pCMV/T7-T7pol：T
7自己遺伝子プラスミドであり、ここでT7 RNAポリメラーゼ遺伝子はCMVプロモー
ターおよびT7プロモーターの両方の制御下にある；pT7：T7プロモーター；tT7：
T7ターミネーター；T7pol：T7 RNAポリメラーゼ遺伝子；IRES：脳心筋炎ウイル
スの内部リボソーム侵入部位配列。
図２は、pcDNA3、pAR3126、およびpCMV/T7-T7polのプラスミドマップを示す。
T7 RNAポリメラーゼのcDNAを含むpAR3126からのHindIII/BamHIフラグメントを、
pCMV/T7-T7pol自己遺伝子を産生するためにpcDNA3プラスミドの対応部位に挿入
した。
図３は、PAUTOM2-Cと命名したT7 RNAポリメラーゼ自己遺伝子のプラスミドマ
ップを示す。これは5'から3'の向きに以下：CMV前初期プロモーター；変異体T7
プロモーター（m2プロモーター）、Encv IRES、T7 RNAポリメラーゼ遺伝子、お
よびT7ターミネーターを含む。
図４は、PT7-H1-AUTODと命名したT7 RNAポリメラーゼ自己遺伝子のプラスミド
マップを示す。これは5'から3'の向きに以下：CMV前初期プロモーター；lacオペ
レーターに融合されたT7プロモーター、Emcv IRES，T7 RNAポリメラーゼ遺伝子
、およびT7ターミネーターを含む。
図５は、単一配列細胞質発現系の図を示す。これは単一核酸配列中に以下のエ
レメントを5'から3'の向きに含む：CMVプロモーター、T7プロモーター、T7 RNA
ポリメラーゼ遺伝子、T7プロモーターの第２のコピー、EMCV IRES、およびCATレ
ポーター遺伝子。
図６は、pTex2と命名した単一配列細胞質発現系の図を示す。これは単一核酸
配列中に以下のエレメントを5'から3'の向きに含む：CMV前初期プロモーター；
変異T7プロモーター（m2）、IRES、T7 RNAポリメラーゼ遺伝子、野生型T7プロモ
ーター（T7 WT）、IRES、およびIRAPレポーター遺伝子。
図７は、pT7-CAT DNAおよびfT7-CAT DNAの濃度の関数として、CAT活性を示す
。DC-chol:DOPEリポソームと10nmol脂質/μgの比で複合体化した、種々の量のpT
7-CAT DNAまたはfT7-CAT DNAを、293-T7細胞に４時間のトランスフェクトをする
ために使用した。CATアッセイを、トランスフェクションの48時間後に行った。
図８は、時間の関数として、CAT発現を示す。図４に記載するように、0.27pmo
lのpT7-CAT DNAまたはfT7-CAT DNAを、DC-chol:DOPEリポソームにより293-T7細
胞に送達した。細胞を９日間毎日回収し、そしてそれらが100％コンフルエント
になったトランスフェクション後４日目に一度１：１に分割した。
図９は、0.27pmolのpT7-CATまたはfT7-CAT、およびDC-chol:DOPEリポソーム（
10nmol脂質/μｇ DNA）と複合体化した種々のモル数のpCMV/T7-T7pol自己遺伝子
複合体の混合物を用いる４時間の正常293細胞への同時トランスフェクション後4
8時間でのCAT活性を示す。
図10は、pT7-CAT DNAおよびfT-CAT DNAの濃度の関数として、正常293細胞にお
けるCAT活性を示す。293細胞を、DC-chol:DOPEリポソーム（l0nmol脂質/μｇ DN
A）によってpCMV/T7-T7pol（pT7-CATまたはfT7-CAT対pCMV/T7-T7polが、５：１m
ol/mol）と同時送達された種々の量のpT7-CATまたはfT7-CATと、４時間トランス
フェクションした。CATアッセイは、トランスフェクション後48時間で行った。
図11Aおよび図11Bは、0.27pmolのpT7-CATまたはfT7-CATおよびDC-Chol:DOPEリ
ポソーム（10nmol脂質/μｇ DNA）と複合体化した54.11fmol pCMV/T7-T7pol自己
遺伝子を用いて４時間トランスフェクトした293細胞における時間の関数として
のCAT発現（図11A）および毒性(図11B)を示す。図11Aでは、CAT活性をトランス
フェクションして48時間後に測定した。図11Bでは、毒性を、トランスフェクシ
ョンして48時間後にトランスフェクト細胞内で回収したタンパク質として測定し
た。
図12Aおよび図12Bは、10nmolのDC-chol:DOPEリポソーム（３：２、mol/mol）
と複合体化したpT7-CAT（１μｇ）およびT7 RNAポリメラーゼ（150ユニット）な
らびに/またはT7自己遺伝子（0.3μｇ）pT7 AUTO 2C-もしくはpCMV/T7-T7 polと
４時間同時トランスフェクトした293細胞のトランスフェクション効率（図12A）
および毒性（図12B）を示す。図12Aでは、トランスフェクション効率は、トラン
スフェクションして48時間後に測定したCAT活性として評価した。図12Bでは、毒
性を、トランスフェクションして48時間後のトランスフェクト細胞内で回収した
タンパク質として測定し、未処理コントロール細胞内で回収したタンパク質に対
する割合として表した。
図13Aおよび図13Bは、２つのT7自己遺伝子、pT7 AUTO 2C-およびpCMV/T7-T7po
lの経時的なpT7-CATの発現を維持する能力（図13A）、およびそれらの経時的な
相対毒性（図13B）についての２つのT7自己遺伝子、pT7 AUTO 2C-およびpCMV/T7
-T7polの比較を示す。図10Aおよび図10Bの両方において、293細胞は１μｇのpT7
-CATおよびpCMV/T7-T7pol（0.3μｇ）または１μｇのpT7-CAT、pT7 AUTO 2C-（0
.3μｇ）、および10nmolのDC-Chol:DOPE（３：２、mol/mol）リポソームと複合
体化した150ユニットのT7 RNAポリメラーゼを用いて４時間トランスフェクトし
た。
図14Aおよび図14Bは、２つのT7自己遺伝子、pT7 AUTO 2C-およびpCMV/T7-T7po
lの経時的なpT7-CATまたはfT7-CATの発現を維持する能力（図14A）、およびそれ
らの経時的な相対毒性（図14B）についての２つのT7自己遺伝子、pT7 AUTO 2C-
およびpCMV/T7-T7polの比較を示す。図13Aおよび図13Bの両方において、293細胞
は、0.27pmolのpT7-CATまたはfT7-CATおよびpCMV/T7-T7pol（0.3μｇ）または0.
27pmolのpT7-CATまたはfT7-CAT、pT7 AUTO 2C-（0.3μg）、および10nmolのDC-C
hol:DOPE（３：２、mol/mol）リポソームと複合体化した150ユニットのT7 RNAポ
リメラーゼを用いて４時間トランスフェクトした。
図15A、図15B、図16A、および図16Bは、10nmol脂質/μｇDNAでのDC-chol:DOPE
リポソームによる漸増濃度のpT7 AUTO 2C-（図l5Aおよび図16A）またはpCMV/T7-
T7pol（図15Bおよび図16B）と細胞に同時送達されるpT7-CAT（１μｇ/ウェル）
でトランスフェクトした2008、C3、CHO、および293細胞におけるCAT活性（図15A
および図15B）および回収されたタンパク質（図16Aおよび図16B）を示す。
図17A、図17B、図18A、および図18Bは、５nmol脂質/μｇDNAでのLipofectAMIN
Eによる漸増濃度のpT7 AUTO 2C-（図17Aおよび図18A）またはpCMV/T7-T7pol（図
17Bおよび図18B）と細胞に同時送達される、pT7-CAT（１μｇ/ウェル）でトラン
スフェクトした2008、C3、CHO、および293細胞におけるCAT活性（図17Aおよび図
17B）、およびタンパク質回収（図18Aおよび図18B）を示す。
図19は、DC-chol:DOPE（３：２mol/mol）リポソームまたはリポソーム/ポリリ
ジン/DNA三元複合体（LPD）により送達されたプラスミド（pT7-CATおよびpCMV-C
AT）および線状（fT7-CATおよびfCMV-CAT）DNA配列のCAT活性の比較を示す。リ
ポソーム脂質（10nmol脂質/μｇDNA）と複合体化するか、またはLPD複合体にお
いて処方される0.27pmolのDNA（pT7-CAT、pCMV-CAT、fT7-CAT、またはfCMV-CAT
）を使用して、293-T7細胞（pCMV/T7-T7polと安定にトランスフェクトした293細
胞株）を４時間トランスフェクトした。CATアッセイは、トランスフェクション
して48時間後に行った。
図20Aおよび20Bは、293、BL6、およびC3細胞株におけるCAT活性を示す（図20A
）。細胞質発現系のために、0.27pmol/ウェルの線状（fT7-CAT）DNAまたはプラ
スミド（pT7-CAT）DNAを、DC-cholリポソーム（図20A）またはlipofectAMINE
（図20B）と複合体化（10nmol脂質/μgDNA）したpCMV/T7-T7 pol自己遺伝子（0.
3μｇ/ウェル）を用いて細胞に同時送達した。核内発現系のために、pCMV-CAT-C
ATまたはfCMV-CAT（0.27pmol/ウェル）のいずれかを、細胞に送達するためにDC-
Chol:DOPEリポソーム（図20A）またはlipofectAMINE（図20B）（10nmol/脂質/μ
ｇ）と複合体化した。細胞は４時間トランスフェクトし、そしてCAT活性はトラ
ンスフェクションして48時間後に測定した。
図21Aおよび図21B：pCMV/T7-T7pol は、T7 RNAポリメラーゼのより高い産生に より、pT7 AUTO 2C-自己遺伝子よりも高いレベルのCAT活性を産生する。
（21A）
１μｇのpT7-CATを、１）150UのT7 RNAポリメラーゼ単独；２）漸増濃度のpCMV/
T7-T7polまたはpT7 AUTO 2C単独；または３）漸増濃度の150UのT7 RNAポリメラ
ーゼと結合させたpCMV/T7-T7polまたはpT7 AUTO 2C-のいずれかと同時トランス
フェクトした。CAT活性を、トランスフェクトして２日後に細胞溶解物に対して
行った。（21B）0.3μｇのpCMV/T7-T7polまたはpT7 AUTO 2C-を、単独で、また
は150UのT7 RNAポリメラーゼ酵素と一緒に、DC-chol:DOPEリポソーム（１μｇ D
NA/10nmol脂質）を介して293細胞にトランスフェクトした。細胞は、トランスフ
ェクトして２日後に溶解した。細胞溶解物のウェスタンブロット分析を、ヤギポ
リクローナル抗-T7 RNAポリメラーゼ抗体を用いてメンブレンのハイブリダイゼ
ーション、続いてウサギ抗-ヤギIgG抗体を用いたハイブリダイゼーションにより
行った。レーンa：ポジティブコントロール＝１Uの純粋なT7 RNAポリメラーゼ酵
素；レーンb：ネガティブコントロール＝未処置細胞溶解物；レーンc：pCMV/T7-
T7pol；レーンd：pCMV/T7-T7pol＋T7 RNAポリメラーゼ；レーンe：T7AUT02C-；
レーンf：T7 AUTO 2C-＋T7 RNAポリメラーゼ。
図22Aおよび図22B：pCMV/T7-T7pol は、高い持続性レベルのT7 RNAポリメラー ゼおよびCAT発現を促進する。
（22A）図13Aに示される同じデータに基づくCAT活
性の時間経過分析。図22Aのデータを、図13Aに示されるように、１mgタンパク質
当たりではなく全CAT活性として表す。１μｇのpT7-CATを、0.3μｇのpCMV/T7-T
7polまたは0.3μｇのpT7 AUTO 2C-＋150UのT7 RNAポリメラーゼのいずれかと結
合させ、そしてDC-chol:DOPEリポソーム（１μ ｇDNA/10nmol脂質）を介して293
細胞にトランスフェクトした。細胞をトランスフェクション後７日まで毎日溶解
し、
そしてそれらが100％コンフルエントであった４日目に一度１：１に分割した。C
AT活性を、７日後に全ての細胞溶解物について測定した。（22B）(22A)における
トランスフェクションからの細胞溶解物を、ポリクローナルヤギ抗-T7 RNAポリ
メラーゼ抗体、続いてウサギ抗-ヤギIgG抗体を用いたハイブリダイゼーションに
よるウェスタンブロット分析に供した。各バンドの容量は、濃度測定により決定
した。これらの値を、相対単位における全T7 RNAポリメラーゼを産生するために
、各トランスフェクション/1000から回収した全タンパク質で乗じた。全T7 RNA
ポリメラーゼは、pT7 AUTO 2C-を用いたトランスフェクションについて検出不可
能であった。レーン１〜４：トランスフェクション後１、３、５、および７日目
のpCMV/T7-T7pol溶解物；レーン５〜８：トランスフェクション後１、３、５、
および７日目のpT7 AUTO 2C-＋T7 RNAポリメラーゼ溶解物、レーン９：ネガティ
ブコントロール＝未処置細胞溶解物。
図23：pT7-CAT/pCMV/T7-T7pol （細胞質発現）は、pCMV-CAT（核内発現）と比 較する場合、より高いレベルのCAT発現を誘導する。
１μｇのpT7-CATを、0.3、0
.7、1.0、または2.0μｇのpCMV/T7-T7polと結合させ、そしてDC-chol:DOPEリポ
ソーム（１μｇ DNA/10nmol脂質）により、37℃にて４時間、293細胞にトランス
フェクトした。比較のために、DC-chol:DOPEリポソームに複合体化した１μｇの
pCMV-CATを、同じ条件下で293細胞に送達した。CAT活性を、トランスフェクトし
て２日後に測定した。
図24：293 細胞におけるpT7-CAT/pCMV/T7-T7pol（細胞質発現）およびpCMV-CAT （核内発現）を比較する時間経過。
１μｇのpT7-CATを、DC-chol:DOPEリポソー
ム（１μｇ DNA/10nmol脂質）を介して、0.7、1.0、または2.0μｇのpCMV/T7-T7
polのいずれかを用いて37℃にて４時間、293細胞にトランスフェクトした。１μ
ｇのpCMV-CATをDC-chol:DOPEリポソームに複合体化し、そして同じ方法で293細
胞に送達した。細胞は、トランスフェクション後７日目まで毎日溶解し、トラン
スフェクション後４日目に１：１に分割した。
図25Aおよび図25B：DNA/ プロタミン/リポソーム複合体は、細胞質発現系にお いて発現を増強し得る。
１μｇのpT7-CAT（25A）またはpCMV-CAT（25B）を、以
下のリポソーム処方物（１μｇ DNA/l0nmol脂質）：D0TAP（２μmol/ml）、DOTA
P:D
OPE（2μmol/ml）、LipofectAMINE（2.34μmol/mｌ)、DC-chol:DOPE（2μmpl/ml
）、およびLipofectin（1.6μmol/ml）の１つと複合体化する前に、０または２
μｇのプロタミンと結合させた。これらのDNA/プロタミン/リポソーム複合体を
、pCMV/T7-T7pol自己遺伝子を安定に発現する293細胞にトランスフェクトした。
CATアッセイを、トランスフェクションして２日後に行った。
図26：pCMV/T7-T7pol におけるHindIII接合部位についての配列決定結果。pAR3
126からのT7遺伝子１を、pcDNAベクター骨格中にHindIII/BamHIフラグメントと
してクローン化した。J角括弧内の配列は接合部位である。A角括弧内の配列はpc
DNA3からのT7プロモーターであり、B角括弧内の配列はHindIII部位である。
図27：pCMV/T7-T7pol におけるBamHIII接合部位についての配列決定結果。J角
括弧内の配列は、pcDNA3ベクター中にHindIII/BamHIフラグメントとしてクロー
ン化されたpAR3126からのT7遺伝子１の接合部位である。C角括弧内の配列はBamH
I部位である。
図28：T7 遺伝子１を含む、pAR3126からのHindIII/BamHIフラグメント配列。 発明の詳細な説明
本発明は、真核生物細胞での使用のための細胞質遺伝子発現系に関する。細胞
質発現系での遺伝子輸送は、多くの理由のため核発現系よりも有利であり得る。
まず第１に、多くの非ウイルス遺伝子輸送ベクターが、細胞の細胞質へのDNA送
達を改良するために開発されている；しかし、DNAの核輸送を改良することにお
ける顕著な進歩はなかった。細胞質DNAの核輸送が非常に低効率であることが以
前に示されている（Capecchi（1980）Cell 22，479-488）。したがって、DNAの
全体の発現は、転写機構が存在する核へのDNAの非効率的輸送によって妨害され
る。
細胞に送達されるDNAの大多数が細胞質に残るので、これらの遺伝子が細胞質
で発現され得るならばそれは有益である。バクテリオファージT7 RNAポリメラー
ゼのような酵素の送達は、T7プロモーターのようなコグネイトプロモーターを含
む遺伝子の発現を駆動する。バクテリオファージT7 RNAポリメラーゼが核局在化
シグナルを含まず（Dunnら（1988）Gene 68，259-266）そして細胞質中にとどま
るので、この発現は、大部分は細胞質である。
本発明の細胞質発現系は、外因性原核生物RNAポリメラーゼの添加を伴わずに
細胞の細胞質での二重プロモーター原核生物発現に頼る。この自己遺伝子は、核
で原核生物RNAポリメラーゼの初期発現を駆動する真核生物プロモーターを含む
。自己遺伝子の核送達は少ないと考えられるが、十分な原核生物RNAポリメラー
ゼは、自己遺伝子内の第２の原核生物プロモーターを介して細胞質で産生され得
る。したがって、この自己遺伝子からの原核生物RNAポリメラーゼの発現は、原
核生物プロモーターによって細胞質で大部分が駆動される。次いで、自己遺伝子
から生成される連続的なRNAポリメラーゼは、同じ原核生物プロモーターに作動
可能に連結される同時トランスフェクトされた核酸配列の持続性の発現を誘導し
得る。したがって、このような自己遺伝子は、例えば、高いおよび持続性の細胞
質発現が望まれる遺伝子治療／輸送適用に有用である。
本明細書および請求の範囲全体を通して使用される場合、「標的配列」とは、
その発現が望まれる二本鎖DNA配列を意味する。本発明での使用に適切な標的配
列の例は、アンチセンスRNA分子をコードする配列あるいはタンパク質またはペ
プチドをコードする配列である。したがって、標的配列がアンチセンスRNA分子
またはリボザイム分子をコードする場合、「発現」とは、標的配列の転写をいい
、そして標的配列がタンパク質またはペプチドをコードする場合、「発現」とは
、標的配列の転写および翻訳をいう。本発明の細胞質発現系に利用されるべき標
的配列が、線状DNAまたはプラスミドDNAであり得ることが理解される。
本発明の自己遺伝子は、最小限、作動可能に連結された以下のエレメントを含
む：原核生物RNAポリメラーゼ遺伝子をコードする核酸配列、RNAポリメラーゼの
コグネイトプロモーターおよび真核生物細胞で機能し得るプロモーター（例えば
、真核生物プロモーター）。「作動可能に連結された」とは、エレメントが、コ
グネイトプロモーターを介して、RNAポリメラーゼをコードする核酸配列の転写
を開始するために十分なレベルで、RNAポリメラーゼの発現を生じる空間的配置
にあることを意味する。
本発明の自己遺伝子が、プラスミドDNAのような環状形態で、あるいは化学的
に合成されたDNAまたはPCR増幅産物のような線状形態であり得ることが、理解さ
れるべきである。さらに、本発明の自己遺伝子は、プラスミドDNAに存在する標
的配列の発現を持続するために使用され得る。
本発明によってコードされるRNAポリメラーゼは、好ましくは、高親和性およ
び特異性を有するそのコグネイトプロモーター配列を認識し得、そしてコグネイ
トプロモーターからの転写を開始するために宿主細胞因子を必要としない、単一
ポリペプチド酵素である。本発明の自己遺伝子での使用に適切なRNAポリメラー
ゼの例には、バクテリオファージRNAポリメラーゼT7、SP6、およびT3、ならびに
ミトコンドリアRNAポリメラーゼが含まれるが、これらに限定されない。
本発明の自己遺伝子の「真核細胞プロモーター」は、真核生物細胞の核で転写
を開始し得る任意のプロモーターであり得る。
「コグネイトプロモーター」とは、自己遺伝子によってコードされるRNAポリ
メラーゼによって認識される任意のプロモーター配列を意味する。コグネイトプ
ロモーター配列は、RNAポリメラーゼのゲノムからクローニングされたプロモー
ター配列であり得るか、または自己遺伝子からRNAポリメラーゼの発現のレベル
を減少させ、そのためE．coliおよび哺乳動物細胞に対する自己遺伝子の毒性を
減少させるために変異によって改変され得る。
１つの実施態様では、本発明の自己遺伝子は、作動可能に連結された以下のエ
レメントを5'〜3'の順序で含む：真核生物プロモーター、RNAポリメラーゼのた
めのコグネイトプロモーター、およびRNAポリメラーゼをコードする核酸配列。
好ましい実施態様では、RNAポリメラーゼは、バクテリオファージT7 RNAポリメ
ラーゼであり、コグネイトプロモーターはT7プロモーターであり、そして真核生
物プロモーターはサイトメガロウイルス（CMV）プロモーターである。好ましいR
NAポリメラーゼ自己遺伝子の例は、図２に示すpCMV/T7-T7 pol自己遺伝子である
。この自己遺伝子は、E．coliおよび哺乳動物細胞の両方に対して非毒性である
ことが示されており、そして線状DNAおよびプラスミドDNAの両方に含まれる標的
配列の細胞質発現を支持する。
しかし、本発明の自己遺伝子からのRNAポリメラーゼの発現のレベルが、自己
遺伝子に存在する最少エレメント（すなわち、真核生物プロモーター、コグネイ
トプロモーター、およびRNAポリメラーゼ遺伝子）の改変によって、または自己
遺伝子へのさらなるエレメントの挿入によって調節され得ることが、当業者に理
解されるべきである。例えば、変異体RNAポリメラーゼは、細菌宿主に対して致
死的でなく、そのコグネイトプロモーターに結合しそして転写を行い得るように
設計され得（米国特許5,122,457）、そして野生型コグネイトプロモーターは、
コグネイトプロモーターに作動可能に連結された遺伝子の転写を減少させるよう
に（好ましくは点変異によって）変異され得る。T7プロモーターの変異の例には
、インビトロ転写アッセイで野生型T7プロモーターの活性の１％および10％を有
することが示されているm2T7pおよびM3T7pが含まれるが、これらに限定されない
。あるいは、コグネイトプロモーターは、オペレーターが細菌宿主での自己遺伝
子構築物の毒性を減少させるように作用し得る場合、lacオペレーターのような
細菌オペレーター配列をその3'末端に付着させることによって改変され得る。し
たがって、本発明の自己遺伝子が、作動可能に連結された以下のエレメントを含
み得ると考えられる：真核生物細胞で活性なプロモーター（例えば、真核生物プ
ロモーター）、改変されたコグネイトプロモーター、およびRNAポリメラーゼを
コードする核酸配列。
代わりの実施態様では、改変されたかまたは改変されていないコグネイトプロ
モーターは、その3'末端で、RNAが5'末端でキャップされる必要なく真核生物細
胞で転写開始複合体の形成を可能にすることによってRNAポリメラーゼ遺伝子の
翻訳を増強するために、内部リボゾーム侵入部位配列（IRES）の5'末端に連結さ
れ得る。好ましい実施態様では、IRESはプリオルナウイルス(priornaviral)IRES
であり、最も好ましくは脳心筋炎（EMC）IRES配列である。
さらに他の実施態様では、RNAポリメラーゼ遺伝子は、その3'末端で、RNAポリ
メラーゼ遺伝子の転写の正確さを増強させるために、そのコグネイト転写終結配
列に連結され得る。このような終結配列は、例えば、当業者に公知の方法によっ
てRNA転写物の3'末端を物理的にマッピングすることによって、RNAポリメラーゼ
をコードするゲノムからクローニングされ得、または、コグネイトターミネータ
ーの配列が公知である場合、配列は合成され得る。コグネイトプロモーターがIR
ESに連結されそしてポリメラーゼ遺伝子の3'末端がターミネーター配列に連結さ
れる自己遺伝子構築物の例は、図３において示され、ここで自己遺伝子構築物は
、
5'〜3'の順序で、CMV前初期プロモーター、変異体T7プロモーター、EMC IRES配
列、T7 RNAポリメラーゼ遺伝子、およびT7ターミネーターを含む。そして図４に
おいては、自己遺伝子は、5'〜3'の順序で、CMVプロモーター、lacオペレーター
に融合したT7プロモーター、EMC IRES配列、T7 RNAポリメラーゼ遺伝子、および
T7ターミネーターを含む。もちろん、IRES配列が細菌ではほとんど翻訳されない
ので、IRESを含む自己遺伝子の毒性が減少することを、当業者は認識し、したが
って、図４に示される自己遺伝子構築物において、改変されていない野生型T7プ
ロモーターをlac改変されたT7プロモーターに置き換え得る。さらに、本発明の
自己遺伝子構築物が、IRESまたはターミネーター配列のいずれかあるいは両方を
含むように設計され得ると考えられる。
本発明はまた、本発明のRNAポリメラーゼ自己遺伝子を利用する細胞質発現系
に関する。
１つの実施態様では、細胞質発現系は、原核生物RNAポリメラーゼ遺伝子に作
動可能に連結されるコグネイトプロモーターに作動可能に連結した真核生物プロ
モーターを含む第１の核酸配列、および標的配列に作動可能に連結した第１の配
列のコグネイトプロモーターの第２のコピーを含む第２の配列からなる、二重配
列細胞質発現系である。
別の実施態様では、本発明はまた、上記の第１および第２の配列が単一の核酸
分子に含まれる「単一配列細胞質発現系」を提供する。このような単一配列発現
系の例を、図５および６に提供する。
図５に示すように、単一配列系において、コグネイトプロモーターの第１のコ
ピーは変異プロモーターであり得、そして（標的配列の発現を駆動する）コグネ
イトプロモーターの第２のコピーは野生型プロモーターであり得るとも考えられ
る。
単一配列系が、２つの別々のプラスミドから構成される二重系よりも、宿主細
胞への導入に有効であり得ると考えられる。しかし、二重系は、２つのプラスミ
ドの種々の比を提供することによって、発現されたRNAポリメラーゼの比および
目的の標的配列を調節することが望ましい状況で、特に有用であり得る。本発明
はまた、タンパク質、アンチセンス分子、またはリボザイムを含む他の遺伝子産
物を真核生物細胞で発現させるための、上記の単一配列または二重配列発現系に
おける自己開始および自己持続する自己遺伝子の使用に関する。
このような発現系は、広範な種々の適用を包含する。例えば、特定の細胞タイ
プにおいて、その細胞タイプについての適切なプロモーターが利用可能でない場
合に、遺伝子を発現させるために特に適切である。したがって、自己遺伝子は、
インビトロまたはインビボで所望のタンパク質を合成するために使用され得る。
また、コードされた遺伝子産物の同一性の確認のための新たにクローニングされ
た遺伝子の一過性発現、ならびに特異的抗体の生成のための動物の免疫での使用
のための大量のタンパク質の迅速な産生に、インビトロで有用である。このこと
については、本発明は、抗原特異的宿主免疫応答を誘発するための遺伝子産物の
一過性発現のために、インビボで細胞および組織に外因性遺伝子を導入するため
に使用され得る。遺伝子発現の短期の性質は、抗原に対する宿主のインビボ免疫
のためのビヒクルとしての使用に理想的であり得る。
遺伝子治療の現在の試みにおける主な障害は、分裂していない真核生物宿主細
胞における外来遺伝子の組込みである。遺伝子発現が静止細胞で達成され得るの
で、本発明の系が細胞質で遺伝子発現を可能にする能力は、この潜在的な問題を
回避する。しかし、細胞が時間の経過とともに分裂する場合、DNA構築物が、細
胞質で徐々に分解されるかまたは数が希釈されるので、本発明はまた、自己制限
的(self-limiting)である。この発現系の自己制限的性質は、遺伝子発現が一時
的または一過性でのみ望まれる設定での使用に特に適切である。例えば、本発明
は、腫瘍細胞溶解を媒介するための細胞傷害性リンパ球のインサイチュ活性化の
ために、インビボで腫瘍部位にリンホカイン遺伝子を標的するために使用され得
る。外因性遺伝子の発現は一過性であるので、プロセスで溶解されない細胞によ
るDNAの取り込みは、自己免疫のような潜在的に有害な結果に至るリンホカイン
の永久的なおよび持続性の合成を、最終的に誘導しない。
単一または二重の配列発現系は、生理食塩水、PBS、無血清培地、またはイン
ビボ投与に適切な任意の水性溶液に懸濁され得る。溶液は、ヒトを含む動物に、
静脈内に、筋肉内に、頭蓋内に、皮下に、あるいは直接的に組織または器官に注
入され得る。単一または二重の配列系は、単独で、リポソームにカプセル化され
て、あるいは形質膜を横切って系を転位させ得る任意のキャリア分子に連結され
て注入され得る。インビボ投与については、発現系は、0.01〜100mg/kgの用量範
囲で注入され得る。標的配列の発現産物が、血流中に分泌されることが望まれる
場合、この系は、内皮細胞取り込みおよび発現産物の循環への直接的な放出を生
じさせるために静脈内に注入され得る。
本明細書で参照されるあらゆる文献または特許は、参考として本明細書に援用
される。以下の実施例は、本発明の種々の局面を説明するが、いかなるようにも
その範囲を制限することは意図されない。
実施例 略号
PCR：ポリメラーゼ連鎖反応；CAT：Ecoliクロラムフェニコールアセチルトラン
スフェラーゼ；CMV：サイトメガロウイルス前初期プロモーター；T7：バクテリ
オファージT7プロモーター；T7pol：バクテリオファージT7 RNAポリメラーゼコ
ード遺伝子；DC-chol：3β[N-(N',N'-ジメチルアミノエタン)-カルバモイル]コ
レステロール；DOPE：1,2-ジオレイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジル-エタノー
ルアミン；LPD：リポソーム/ポリカチオン/DNA三重複合体；CHEMS：コレステリ
ルヘミスクシネート材料．
T7 RNAポリメラーゼ（New England Biolabs，Beverly，MA）を、さらなる精製
をせずに使用した。Taqポリメラーゼ、ヌクレオチド、および緩衝液を含むPCR用
の化学薬品はすべて、Gibco BRL（Gaithersburg，MD）から購入した。アセチル
コエンザイムＡ、クロラムフェニコール、Triton X-100、およびポリカチオンポ
リ-L-リジンの臭化水素塩（MW 25,600）を、Sigma（St Louis，MO）から購入し
た。[3H]アセチルコエンザイムＡおよびBeta-Maxシンチレーションカクテルを、
ICN Biomedicals（Costa Mesa，CA）から購入した。
ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（DOPE）およびコレステリル−
ヘミスクシネート（CHEMS）を、Avanti Polar Lipids，Inc（Birmingham，AL）
から得た。3β[N-(N',N'-ジメチルアミノエタン)-カルバモイル]コレステロール
（DC-chol）を、Gaoおよび有uang（(1991)Biochem ．Biophys．Res．Commun．179
:280-285）に従って合成した。約150nmの直径の単層DC-chol：DOPEリポソームを
、DC-cholおよびDOPEの水和した混合物（3:2，mol/mol）の微流動化(microfluid
ization)によって調製し、そして濾過滅菌した。CHEMSおよびDOPE（3:2，mol/mo
l）から構成されるpH-感受性リポソーム（約120nmの直径）を、超音波処理によ
って調製した。LipofectAMINEを、Gibro BRLから得た。PCR 増幅した線状DNAフラグメントおよびプラスミドDNA
PCRについては、10ngのプラスミドテンプレート、50pmolの各プライマー（図
１に示す）、0.2mM dNTP、および2.5ユニットのThermus aquaticus（Taq）DNAポ
リメラーゼを使用した。PCRプロトコルは、94℃にて４分の変性、次いで94℃に
て45秒、68℃にて１分、および72℃にて２分の30サイクル、ならびに最後に72℃
にて５分の伸長からなる。得られるPCR増幅したフラグメントを、フェノール−
クロロホルムで抽出し、エタノール沈殿し、水に再懸濁し、次いでサイズ排除フ
ィルターを通す濾過によってさらに精製して、使用されないプライマーおよび遊
離のオリゴヌクレオチドを除去した。
バクテリオファージT7プロモーターによって駆動されるCATリポーター遺伝子
を含むプラスミド（Elroy-Steinら（1989）Proc ．Natl．Acad．Sci．USA 86:612
6-6130）である、pT7-EMC-CATと同一であるプラスミドpT7-CATは、B．Moss博士
（米国国立保健研究所）によって提供された好意による贈与であった。T7 RNAポ
リメラーゼ遺伝子およびその対応するプロモーターから構成される自己遺伝子で
ある、pT7 AUTO 2C-を、Gaoら（Gao，X.ら（1994）Biochem ．Biophys．Res．Com mun．
200:1201-1206）に既に記載されたように維持し、そして精製した。プラス
ミドpUCCMV-CATを、H．Farhood博士(Farhood，H.ら（1995）Biochem ．Biophys． Acta.
，1235:289-295）によって構築した。pCMV/T7-T7pol自己遺伝子を、T7 RNA
ポリメラーゼのcDNAを含むpAR3126（Dunn，J.J.ら（1988）Gene 68:259-266）か
らのHindIII/BamHIフラグメントをpcDNA3プラスミドベクター（Invitrogen Corp
.，San Diego，CA）の対応する部位に挿入することによって構築した（図
２、26〜28を参照のこと）。この自己遺伝子を、E．coli DH5αF'細胞中で増幅
し、そしてCsClグラジエント遠心分離法によって精製した（Sambrook，J.ら（19
89）Molecular Cloning:A Laboratory Manual．Cold Spring Harbor Laboratory
Press:Plainview，NY）。LPD 複合体の調製
LPDを産生するために使用したポリ-L-リジンの臭化水素塩の分子量は、25,600
であった。LPD複合体を、CHEMSおよびDOPEを含むpH-感受性リポソームとカチオ
ン性DNA/ポリリジン（1:0.75，w/w）複合体とを混合することによって、トラン
スフェクション前に調製した。最終LPD複合体中の脂質対DNA比は、3:1（w/w）で
あった。得られるLPD複合体は、カチオン性電荷を有した。組織培養
ヒト胚腎臓293細胞、BL6マウスメラノーマ細胞、2008卵巣ガン腫細胞、CHOチ
ャイニーズハムスター卵巣細胞、およびC3 HeLa細胞（すべてが、マイコプラズ
マを含まないことを日常的にテストおよび観察された）を、293細胞についてはD
MEM培地、BL6、C3、および2008細胞についてはRPMI培地、ならびにCHO細胞につ
いてはF12培地中で培養した。すべての培地に、37℃にて５％CO2を含む湿潤雰囲
気中、10％ウシ胎児血清、ペニシリン（200単位/ml）、およびストレプトマイシ
ン（100ug/ml）を補充した。内因性T7 RNAポリメラーゼを産生する293細胞株で
ある293-T7を、293細胞をpCMV/T7-T7polおよびpBK-CMV（Neor）ファージミドで
同時トランスフェクションし、次いでG418により選択することによって樹立した
。次いで、293-T7細胞を、G418（0.4mg/ml）を補充したDMEM培地（293細胞につ
いては血清および抗生物質）中で培養した。図７〜11および19についてのトランスフェクションプロトコル
24ウェルプレート中で培養した細胞（293または293-T7細胞）（約70〜80％コ
ンフルエント）を、トランスフェクションに使用した。DC-chol:DOPEリポソーム
（10nmol脂質/μｇ DNA）と複合体化した、またはLPD複合体中に処方されたDNA
（プラスミドまたはPCRフラグメント）を使用して、細胞をトランスフェクトし
た。293細胞については、pCMV/T7-T7pol（T7 RNAポリメラーゼの供給源として）
をT7-EMC-CAT（プラスミドまたはPCRフラグメント）と同時送達した。トランス
フェクションの４時間後、培地（無血清培地）を、正常増殖培地（10％ウシ胎児
血清および抗生物質を含む）と置換し、そして細胞をCATアッセイを行う前に２
日間培養した。図５に示すタイムコース研究については、細胞を９日間毎日採集
し、そして100％コンフルエントになる４日に１度、1:1に分割した。図12〜14についてのトランスフェクションプロトコル
293細胞を、24ウェルプレート中で70〜80％コンフルエントになるまで増殖し
た。無血清DMEM培地で希釈されたpT7-CAT（１μｇ）を、T7 RNAポリメラーゼ（1
50 U，New England Biolabs，Beverly，MA）、0.3μｇの自己遺伝子（pCMV/T7-T
7polまたはpT7 AUTO 2C-）またはDC-chol:DOPEリポソーム（10nmol総脂質）で複
合体化される前の酵素と自己遺伝子との組み合わせのいずれかと混合した。トラ
ンスフェクション培地（無血清培地）を増殖培地（10％FBS＋抗生物質を含むDME
M）で置換した後に、この混合物を使用して、37℃にて４時間、細胞をトランス
フェクトした。トランスフェクション効率研究については、細胞を、トランスフ
ェクションの48時間後にCATアッセイのために溶解した。タイムコース研究につ
いては、細胞を４日目に１度分割し、そしてCATアッセイのためにトランスフェ
クション後７日目まで毎日採集した。図15〜18についてのトランスフェクション
2008、C3、293、およびCH0細胞株を、トランスフェクション前に24ウェルプレ
ート中で約70％コンフルエントまで培養した。
pT7-CAT（１μｇ/ウェル）を、漸増濃度のpCMV/T7-T7polまたはpT7AUTO2C-自
己遺伝子T7 RNAポリメラーゼ（150U）とともに、DC-cholリポソーム（イオンモ
ル脂質/mgDNA）またはLipofectAmine（５nmol脂質/μｇ DNA）のいずれかによっ
て、細胞に同時送達した。４時間後、トランスフェクション培地を、増殖培地と
置換し、そして細胞を48時間後に溶解した。図20Aおよび20Bについてのトランスフェクションプロトコル
293、BL6、およびC3細胞を、トランスフェクションの前に約80％コンフルエン
トまで24ウェルプレート中で培養した。細胞質発現系については、pT7-CATまた
はfT7-CATのいずれか（0.27pmol/ウェル）を、DC-cholリポソームまたはLipofec
tAMINE（10nmol脂質/μｇ DNA）を介してpCMV/T7-T7pol自己遺伝子（0.3μｇ/ウ
ェル）とともに、細胞に同時送達した。核発現系については、pCMV-CATまたはfC
MV-CATのいずれか（0.27pmol/ウェル）を、細胞送達のために、DC-cholリポソー
ムまたはLipofectAMINEのいずれか（10nmol脂質/μｇ DNA）と複合体化した。ト
ランスフェクション培地の培養培地との置換の前に、細胞を４時間トランスフェ
クトした。次いで、細胞をトランスフェクション後48時間で溶解した。図21〜25についてのトランスフェクションプロトコル
細胞のトランスフェクションを、図12〜14について記載されたように、37℃に
て４時間の標準的インキュベーションプロトコルを使用して、図21〜25について
の図面の簡単な説明に記載のように行った。すべての実施例についてのCATアッセイ
トランスフェクション後、細胞をPBSで１回洗浄し、そして200mM Tris-HCl(pH
7.8)中0.1％ Triton X-100(Sigma，St.Louis，MO)からなる200μｌの溶解緩衝液
で溶解した。CATアッセイを、少し改変したSankaran（Sankaran，K．(1992)Anal ．Biochem.
，200:180-186）によって記載された方法に従って行った。１mMクロ
ラムフェニコール（Sigma，St.Louis，MO)、0.1mMアセチルCoA（Sigma，St．Lou
is，MO）、および0.1μCi[3H]アセチルCoA（ICN Biomedicals，Costa Mesa，CA
）を、アッセイ混合物について使用した。反応を37℃にて１時間行い、次いで反
応産物であるアセチル化したクロラムフェニコール（1,3-ジアセチルクロラムフ
ェニコール）を、１mlのトルエンで水相から抽出した。次いで、有機相の半分を
３mlのBeta-MaxTM(ICN Biomedicals，Costa Mesa，CA)と混合し、そして放射活
性をカウントした。１ユニットを、上記反応条件下、１分当たり１nmolのアセチ
ル基をクロラムフェニコールに変換する酵素の量として定義した。実施例１ pT7-CAT またはfT7-CAT DNA濃度の関数としての 293-T7 細胞中のCATレポーター遺伝子の細胞質発現
T7-CAT DNAの細胞質発現を、pT7-CATまたはfT7-CAT DNA濃度の関数として、29
3-T7細胞中でのCATレポーター遺伝子の発現を検査することによって研究した。
図７に示すように、CAT活性はpT7-CATまたはfT7-CATのいずれかの量の増加と
ともに増加したが、T7-CAT DNA濃度が約0.54pmolである場合にプラトーに達した
。DC-chol:DOPEリポソームによって送達される場合、pT7-CATおよびfT7-CATにつ
いてのCAT活性間に顕著な差は見られなかった。
おそらく、中程度の量の酵素を産生する293-T7細胞のみが、同時トランスフェ
クション後の選択から生き残り得たので、T7-CAT DNAの量の連続的増加でのCAT
活性のさらなる増加を観察できないことは、293-T7細胞で産生されるT7 RNAポリ
メラーゼの量のためであり得る。
実施例２ 時間の関数としての293-T7細胞でのCATレポーター遺伝子の細胞質発現
図８に示すように、pT7-CATまたはfT7-CATからのCAT発現は、５日目でピーク
になり、そしてその後、ピークレベルの約1/4である９日目の発現レベルまでゆ
っくり低下した。CAT発現のこの期間は、通常３〜５日である核発現系で見られ
る期間より長い（Gao，X.ら（1994）Biochem ．Biophys．Res．Commun.，200:120
1-1206）；いくつかのT7-CATが残ったままであるという事実のためであり得る結
果は、細胞質への放出後のリポソームに関連し、それによって細胞質酵素によっ
てDNAが迅速に分解されることを妨害した。
実施例３ 正常293細胞におけるCATレポーティッド遺伝子の細胞質発現
CATレポーター遺伝子がT7 RNAポリメラーゼを安定に発現しない293細胞で発現
され得るかどうかを決定するために、pT7-CATまたはfT7-CATを、精製されたT7 R
NAポリメラーゼまたはT7自己遺伝子pCMV/T7-T7polのいずれかを有する293細胞に
同時送達した。表１に示されるデータは、T7 RNAポリメラーゼの供給源がT7自己
遺伝子と比較して外因性の供給された純粋なタンパク質であった場合、プラスミ
ドおよび線状DNAフラグメントの両方についてのCAT発現が、劇的により低かった
ことを明らかに示す。
aT7-CAT（１μｇ）を、純粋T7 RNAポリメラーゼ（150U/ウェル）またはpCMV/T7-
T7pol（0.3μｇ/ウェル）のいずれかで、DC-chol:DOPEリポソーム（10nmol）を
含む293細胞に、４時間同時トランスフェクトした。CAT活性を、トランスフェク
ションの48時間後にアッセイした。
従って、pCMV/T7-T7pol自己遺伝子を、その後の研究においてT7 RNAポリメラ
ーゼの供給源として用いた。
実施例４ pCMV/T7-T7pol 自己遺伝子濃度の関数としてのCAT活性
図９に示すように、pT7-CATおよびfT7-CATからのCAT活性の発現は、pCMV/T7-T
7pol自己遺伝子の量の増加とともに着実に増加した。さらに、fT7-CATのトラン
スフェクション効率は、試験した自己遺伝子のすべての濃度でpT7-CATの効率と
同等であり、そして細胞コンフルエンスがトランスフェクションの時に70％以上
であるかどうかを検査したいずれの比でも、毒性が認められなかった。低い細胞
コンフルエンシーでは、モル比が3/1を超える場合に毒性が認められた。従って
、自己遺伝子対T7-CATの5/1のモル比を、以下の研究のために選択した。
実施例５ T7-CAT DNA 濃度の関数としてのCATレポーター遺伝子の細胞質発現
図10が示すように、CAT活性は、293-T7細胞で初期に観察されたものとはわず
かに異なる様式で、種々の量のpT7-CATまたはfT7-CATおよびpCMV/T7-T7pol（0.3
mg）で同時トランスフェクトされた正常293細胞で増加した。この結果は、293お
よびT7-293細胞で発現される細胞内T7 RNAポリメラーゼの量の差のためであり得
る。試験したどの用量でも毒性は見られなかった。
実施例６ 時間の関数としての293細胞でのCATレポーター遺伝子の細胞質発現
図11Aに示すように、高くおよび持続したCAT発現が、pT7-CATおよびfT7-CATの
両方である時間にわたって見られた。実際に、fT7-CATでの発現レベルは、pT7-C
ATでのレベルよりもわずかに大きかった。さらに、fT7-CATおよびpT7-CATのある
時間にわたるタンパク質回収は、同等であり（図11B）、これは毒性がないこと
を示す。
実施例７ pCMV/T7-T7pol 自己遺伝子またはpT7 AUTO 2C-自己遺伝子のいずれかを使用す る pT7-CAT およびfT7-CATの細胞質発現の比較
図12Aに示すように、pCMV/T7-T7polは、pT7AUTO2C-自己遺伝子で見られる発現
と比較して、より高いレベルのCAT遺伝子発現を生じた。pCMV/T7-T7pol自己遺伝
子でのこの上昇したCAT遺伝子発現は、T7 RNAポリメラーゼ再生プロセスを誘導
するためにどのような追加のT7 RNAポリメラーゼも必要としなかった。しかし、
追加の酵素を添加した場合、CAT活性にさらなる増加があり、これは、細胞質に
送達された外因性T7 RNAポリメラーゼが、自己遺伝子発現を促進するためにT7プ
ロモーター上で作用しており、そのためpCMV/T7-T7-pol単独で見られるよりも高
いレポーター遺伝子発現を誘導することを示唆する。これらの結果は、pT7AUTO2
C-で見られる結果と明確な対照にあり、これは、T7 RNAの自己触媒的産生を開始
するための外因性の添加されたT7 RNAポリメラーゼ酵素の存在に完全に依存する
。
pT7AUTO2C-でのCAT活性は、追加の酵素の存在でのみ見られ、そしてCAT活性は
、
pCMV/T7-T7pol自己遺伝子で観察されたよりも低かった。しかし、両方の自己遺
伝子は、T7 RNAポリメラーゼ単独で見られたよりも非常に高いCAT活性を示した
。この結果は、T7 RNAポリメラーゼの定常的な産生が、細胞質におけるより高い
レベルの遺伝子発現に必要とされることを示唆する。
図12Bに示すように、タンパク質回収は、トランスフェクション処方物のすべ
てについてほぼ同様であり、それによって処方物のすべてが293細胞で毒性を生
じないことを示した。
実施例８ T7 RNA ポリメラーゼ自己遺伝子としてpT7 Auto 2C-またはpCMV/T7-T7polの いずれかを使用するCATレポーター遺伝子の細胞質発現の時間経過
pT7-CATのpCMV/T7-T7polまたはpT7AUTO2C-のいずれかとの同時送達が、より長
い期間にわたるCAT発現を生じるかどうかを試験するために、時間経過研究を、
ある時間にわたるpT7-CATまたはfT7-CAT発現におけるpCMV/T7-T7polおよびpT7AU
TO2C-の効果を比較して行った。図13Aに示すように、pCMV/T7-T7polは、７日間
の期間にわたり、pT7AUTO2C-で見られるよりも高いレベルのpT7-CAT発現を連続
的に生じた。mgタンパク質ベースで発現される場合、pCMV/T7-T7polでのCAT発現
は、トランスフェクションの５日後まで増加し、そしてその後低下したが、活性
は７日目にまだ高いまま残っていた。対照的に、pT7AUTO2C-で見られるCAT発現
は、pCMV/T7-T7pol自己遺伝子で見られるよりも低く、そして３日目までのみ上
昇したままであり、その時点で６日目までにベースラインに低下した。この結果
は、Gaoら（(1994)Biochem ．Biophys．Res．Commun．200:1201-1206）によるpT7
AUTO2C-でのこれまでの実験で見られる時間経過データと一致する。
図14Aが示すように、fT7-CATは、pT7-CATよりもCAT発現のわずかに低いレベル
を示しながら、pCMV/T7pol自己遺伝子で同時送達された場合のpT7-CATと同様の
、ある時間にわたるCAT発現のパターンを示した。対照的に、fT7-CATがT7 AUTO
2C-自己遺伝子で送達された場合に、CAT発現は観察されなかった（図１4A）。さ
らに、図13Bおよび14Bのタンパク質回収データは、pT7AUTO2C-で処理された細胞
がpCMV/T7-T7polで処理した細胞と同様には増殖しなかったことを示し、それに
よ
ってpT7AUTO2C-が、pCMV/T7-T7polよりも細胞に対して幾分毒性であったことを
示唆した。
mgタンパク質当たりのベースに値を標準化することなく、総CAT活性として表
される場合、pCMV/T7-T7polでトランスフェクトした細胞におけるCAT活性は、５
日後の活性の減少を示さなかった（図22A）。タンパク質についての値を標準化
することは、培養物中にまた存在するトランスフェクトされていない細胞が増殖
し続け、従って、存在するタンパク質の総量に寄与しそしてトランスフェクトさ
れた細胞において総CAT活性を薄めるので、トランスフェクトされた細胞におけ
るCAT発現を正確に反映し得ない。４日目（B）に100％コンフルエントである場
合に細胞を分割し（1:1）、そして総CAT活性は、トランスフェクトされた細胞を
含む３つの培養ウェルの平均に基づく。
ウエスタンブロット分析を使用して、CAT活性の最初の一過性の増加の後の減
少を示したpT7 AUTO 2C-トランスフェクトされた細胞と比較したpCMV/T7-T7pol
における持続したCAT活性を研究した。pCMV/T7-T7polでトランスフェクトした細
胞は、トランスフェクション後３日と５日の間で最高レベルのT7 RNAポリメラー
ゼを産生した（図22B）。これは、CAT活性が、トランスフェクション後５日目ま
で一貫して増加するという事実に一致する。CAT活性は、CAT転写を制限するT7 R
NAポリメラーゼ転写の減少のため、５日目の後増加しない。T7 AUTO 2C-によっ
て転写されたT7 RNAポリメラーゼのレベルはまた、低すぎて検出されなかった。
実施例９ pCMV/T7-T7pol 自己遺伝子は、４つの異なる細胞株におけるpT7AUTO2C-よりも pT7-CAT の発現においてより毒性が少なくそしてより効率的である
pT7-CATで同時送達されたpCMV/T7-T7polまたはT7 AUTO 2C-自己遺伝子の効率
および毒性を、図15〜18における2008、C3、CHO、および293細胞で比較した。pC
MV/T7-T7pol自己遺伝子が、pT7AUTO2C-と比較して使用した細胞株すべてにおい
てかなり高いレベルのCAT発現を誘導したことは明白である（図15Bおよび17Bを
図15Aおよび17Aと比較する）。LipofectAMINEが両方の自己遺伝子についてDC-ch
olリポソームで見られるよりもさらに高いレベルのCAT活性を誘導するようであ
ったので、この発現は処方物依存性であるようである（図14Aおよび14Bを図15A
および15Bと比較する）。2008細胞は、DC-cholリポソームでの低いレベルのCAT
発現およびLipofectAMINEでの発現がないことを示したが、発明者らの研究室で
は、pCMV/T7-T7pol自己遺伝子での送達処方物の最適化が、これらの細胞での中
程度のCAT発現を可能にすることを示している（データを示さず）。これらの結
果は、pCMV/T7-T7pol自己遺伝子が、pT7AUTO2C-自己遺伝子で見られる発現より
もいくつかの異なる細胞系でより高いCAT発現を誘導し得ることを確実にする。L
ipofectAMINEでのより高いCAT活性についての理由はこの時点で不明瞭である；
しかし、これは、LipofectAMINEの多価正電荷および細胞侵入のためにさらにDNA
を凝縮する能力のためであり得る。
すべての細胞株におけるタンパク質回収を比較する場合（図16A、16B）、DC-c
holリポソームで送達されるpT7AUTO2C-自己遺伝子が、293細胞以外のすべての細
胞に対して毒性であること（細胞の50％喪失）は明らかである（図16A）。対照
的に、DC-cholで送達されたpCMV/T7-T7pol自己遺伝子は、2008細胞に対してのみ
毒性であった（図16B）。これらのトランスフェクションにおける2008細胞に対
する高毒性は、この時点で理解されない。
これらの自己遺伝子が、LipofectAMINEによってこれらの細胞に送達される場
合、毒性をC3およびCHO細胞で観察した（細胞の50％喪失）（図18Aおよび18B）
。LipofectAMINEでC3およびCHO細胞に送達されたpCMV/T7-T7pol自己遺伝子は、
おそらく自己遺伝子濃度を増加させるとともにLipofectAMINE濃度を増加させる
ため、毒性の用量依存的増加を示した（図18B）。おそらくこれらの細胞はこの
処方物でトランスフェクト可能ではなかったので、LipofectAMINEを有する2008
細胞では毒性が観察されなかった。試験したどの処方物も293細胞に対して毒性
ではなかった。試験した細胞株のすべてにおいて、より高い細胞コンフルエンシ
ーがより少ない毒性を示したので、自己遺伝子の毒性は、トランスフェクション
前の細胞コンフルエンシーに依存した。
pT7AUTO2C-自己遺伝子による毒性についての理由は不明瞭である。毒性は、ト
ランスフェクトされた細胞で生成される非常に高レベルのT7 RNAポリメラーゼの
ため、または細胞にトランスフェクトされていない外因性T7 RNAポリメラーゼの
ためであり得ると考えられる。実験は、これらの自己遺伝子でトランスフェクト
された細胞で産生されるT7 RNAポリメラーゼのレベルを決定するために、現在進
行中である。
実施例10 核および細胞質発現系におけるプラスミドのトランスフェクト能力の比較
細胞質（T7-CAT）および核発現系（CMV-CAT）におけるプラスミドDNA（pT7-CA
TまたはpCM CAT）および線状PCR生成したDNAフラグメント（fT7-CATまたはfCMV-
CAT）のトランスフェクト能力を、内因性T7 RNAポリメラーゼを産生する細胞株
（293-T7）において比較した。
簡単にいえば、プラスミドまたは線状T7-CATおよびCMV-CAT DNAを、DC-chol:D
0PEリポソームまたはLPDによって293-T7細胞に送達し、そして次いでCAT活性を
トランスフェクション後48時間に決定した。結果を図19に示す。
結果は、pT7-CATおよびpCMV-CATについて観察される発現と比較可能な強いCAT
遺伝子発現が、DC-chol:DOPEリポソームによって送達された場合、fT7-CATでト
ランスフェクトされた細胞で見いだされたが、fT7-CAがLPDによって送達された
場合、より少ないCAT活性が検出されたことを示す。
fT7-CATについてのLPDとリポソームとの間の異なる結果は、線状DNAがスーパ
ーコイルDNAで見られる構造制約がないため容易に凝縮され得るという事実によ
るものであり得る。従って、LPD複合体中のポリリジンによって凝縮されたfT7-C
ATのような、高度に凝縮されたDNAは、非常に高度に凝縮されすぎて、転写のた
めに細胞質中でDNAの効率的アンコーティングを可能にし得ない。この点を、pT7
-CATの転写効率がリポソームとの相互作用後に減少したことを示したインビトロ
転写アッセイによって、間接的に確認した。fT7-CATのポリリジンとの複合体化
は、T7 RNAポリメラーゼへの接近可能性を完全に阻害した（データを示さず）。
核発現系（pCMV-CATおよびfCMV-CAT）のトランスフェクト能力に関して、モル
ベースでpCMV CATと比較した場合、DC-chol:DOPEリポソームまたはLPDのいずれ
かによって送達されるfCMV-CATについて、非常に制限された発現を得た。これは
、核膜を横切る線状DNA（fCMV-CAT）の非効率的輸送のためであり得た。実施例11 核および細胞質の両方の発現系におけるトランスフェクションについての 送達ビヒクルとしてのLipofectAMINEおよびDC-cholリポソームの比較
pCMV-CATについて観察される発現に対してfCMV-CATについて実施例９で得られ
る低CAT発現が、核への線状DNA輸送について最適化した送達系がないことから生
じ得たかどうかを決定するために、以下の実験を行った：pCMV-CATまたはfCMV-C
AT（核発現系）あるいはpCMV/T7-T7pol自己遺伝子と同時送達されたpT7-CATまた
はfT7-CATを、DC-chol:DOPEリポソームまたはlipofectAMINE（10nmol脂質/１μ
ｇDNA）のいずれかによって、293、BL6、またはC3細胞に送達し、そしてCAT活性
をトランスフェクション後48時間にアッセイした。図20A（DC-cholリポソーム）
および20B（lipofectAMINE）に示される結果は、全体のlipofectAMINEが、検査
された細胞株における核および細胞質の両方の発現系でのトランスフェクション
についてのよりよい送達ビヒクルであることを証明することを示す。
実施例12 T7 RNA ポリメラーゼの自己増幅およびT7プロモーターによって誘導されるレポー ター遺伝子の発現の両方を可能にする単一配列発現系を使用する細胞質発現
293細胞を、環状プラスミド形態（図に示すような）または線状形態のいずれ
かで、DC-chol:DOPEリポソームを使用して、図12に示される単一配列発現系でト
ランスフェクトする。CAT活性を、トランスフェクション後48時間に決定する。
実施例13 T7 プロモーターによって誘導される導入遺伝子とのおよびpCMV/T7-T7-pol 自己遺伝子配列とのインビボ同時トランスフェクション
マウスに、DC-cholリポソームと、T7プロモーター（プラスミドまたは線状）
によって誘導された導入遺伝子との複合体を、単独あるいはpCMV/T7-T7pol自己
遺伝子（プラスミドまたは線状）を組み合わせて、静脈内、筋肉内、頭蓋内、皮
下、あるいは組織または器官に直接的に注入する。約100μｇのトータルDNAを注
入する。動物を２日後に屠殺し、そして目的の組織（肝臓、腎臓、肺、心臓、脳
など）の抽出物を、CAT活性についてアッセイする。CAT活性を、種々の組織にお
いて決定する。実施例14 pCMV/T7-T7pol は、外因性T7 RNAポリメラーゼ酵素の必要性なしに 高レベルの内因性T7 RNAポリメラーゼおよびCAT活性を誘導する
293細胞を、pT7-CAT＋pCMV/T7-T7polでトランスフェクトする場合、自己遺伝
子濃度に依存した高いCAT活性を観察した（図21A）。高いCAT活性が外因性酵素
なしで観察されるので、pCMV/T7-T7polは、転写を開始するために外因性T7 RNA
ポリメラーゼに依存しなかった。しかし、pT7 AUTO 2C-は、外因性T7 RNAポリメ
ラーゼ酵素の不在下で、トランスフェクトした細胞においてCAT活性を誘導しな
かった。さらに、pT7 AUTO 2C-で観察された活性は、pCMV/T7-T7polで見られた
ほど顕著ではなかった。
pCMV-T7-T7polで観察されたCAT活性が、用量依存性でありそしてpT7 AUTO 2C-
で観察された活性よりも高かったので、発明者らは、pCMV/T7-T7polがpT7-CATの
発現を増強させるためにより高いレベルのT7 RNAポリメラーゼを誘導し得る可能
性を研究した。外因性T7 RNAポリメラーゼの存在または不在下でpCMV/T7-T7pol
またはpT7 AUTO 2C-でトランスフェクトされた293細胞を溶解し、そしてウエス
タンブロット分析にかけ、そして抗T7 RNAポリメラーゼポリクローナル抗体でプ
ローブした（図21B）。この結果は、pCMV/T7-T7polが、外因性T7 RNAポリメラー
ゼの存在または不在下で、高レベルの内因性T7 RNAポリメラーゼを産生し得るこ
とを示す；しかし、pT7 AUTO 2C-から転写された内因性T7 RNAポリメラーゼは低
すぎて検出できなかった。従って、pCMV/T7-T7polによって転写されたT7 RNAポ
リメラーゼの高産生のため、pCMV/T7-T7pol自己遺伝子は、pT7-CATでトランスフ
ェクトされた細胞において高いCAT活性を誘導し得る。
実施例15 pCMV-T7-T7pol 細胞質発現系は、他の細胞質または各発現系よりも 高いレベルの活性を生じ得る
細胞質系が、強い核サイトメガロウイルスプロモーターで見られるよりもレポ
ーター遺伝子CATの転写／翻訳を増加させ得るかどうかを決定するために、細胞
質発現系pT7-CAT＋pCMV/T7-T7polを、核発現ベクターpCMV-CATと比較した。0.3
μｇ以上の濃度でのpCMV/T7-T7polの添加は、pCMV/CATよりも高いCAT活性を生じ
た。図23。CAT活性は、pCMV/T7-T7polの2.0μｇまで自己遺伝子濃度を増加させ
るとともに増加した。これらの結果およびpT7 AUTO 2C-との比較を考慮する場合
、pCMV/T7-T7polでの発明者らの発現系が、これまでに使用された細胞質および
核発現系よりも高レベルのレポーター遺伝子発現を生じ得ることが明らかである
。
実施例16 pCMV/T7-T7pol でのトランスフェクションは、pT7-CATでのトランスフェクション と比較してより高いレベルのCAT活性を定常的に産生した
細胞質発現系pT7-CAT＋pCMV/T7-T7polを、時間経過研究でpCMV-CATと比較した
場合、細胞質系は、７日の期間にわたって使用されたすべての自己遺伝子濃度（
0.7、1.0、2.0μｇ）でより高いCAT活性を定常的に生じた。図24。１および２日
目での細胞質系についての活性が最も強く、次いで７日目まで低下し続けた。pC
MV-CATで見られる最も高いレベルの活性が、約３〜４日目のトランスフェクショ
ンで見られた。これは、おそらく、細胞質において高レベルのレポーター遺伝子
発現を誘導するために、高濃度の自己遺伝子が、迅速な高レベルのT7 RNAポリメ
ラーゼを産生するという事実によるものである。
実施例17 プロタミンは、ある脂質送達処方物のトランスフェクション活性を増加させる
細胞質および核の両方の発現系の効率的トランスフェクションは、細胞をトラ
ンスフェクトするために使用されたリポソーム処方物のタイプに依存する。pT7-
CAT（細胞質）（図25A）またはpCMV-CAT（核）（図25B）の送達を比較する場合
、DOTAPおよびLipofectAMINEは、両方の系で高レベルのCAT活性を生じることに
非常に効率的である。DOTAP:DOPE，DC-chol:DOPE、およびLipofectinのような他
の処方物は、高いCAT活性を生じることに効率的ではない。しかし、リポソーム
添
加前の、非常に正荷電の短いペプチドであるプロタミンの、DNAへの添加は、DOT
APおよびLipofectAMINEと比較可能なレベルに、効果的でないリポソームで見ら
れるCAT活性を増強した。プロタミンは、DOTAPおよびLipofectAMINEでのトラン
スフェクションに効果がなかった。図25A。理論に束縛されないとすると、プロ
タミンは、リポソームの添加前にDNAを凝縮することによって、トランスフェク
ション効率を増強し得る。従って、CAT活性は、DNAを細胞に送達するために使用
される処方物を最適化することによって、本発明の細胞質発現系で増強され得る
。
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フロントページの続き
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，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，
ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ
(72)発明者 ジェフルス，ダニエル
アメリカ合衆国 ペンシルバニア 15224,
ピッツバーグ，ウールスレイヤー ウェイ
4402
(72)発明者 ブリソン，マーニ
アメリカ合衆国 ペンシルバニア 15232,
ピッツバーグ，エルマー ストリート
5610，アパートメント ９
(72)発明者 リー，ソン
アメリカ合衆国 ペンシルバニア 15213,
ピッツバーグ，ダウソン ストリート
3431，アパートメント ２
(72)発明者 ヤン，ジンピン
アメリカ合衆国 ペンシルバニア 15232,
ピッツバーグ，５ティーエイチ アベニュ
ー 5826，アパートメント アイ―２