JP2000509031A

JP2000509031A - 一酸化窒素（ｎｏ）の溶媒としてのパーフルオロ化合物のエマルジョン

Info

Publication number: JP2000509031A
Application number: JP9537410A
Authority: JP
Inventors: イー．ガーフィールド，ロバート; ティー．バラバン，アレキサンドル; エイ．セイツ，ウイリアム
Original assignee: University of Texas System
Current assignee: University of Texas System
Priority date: 1996-04-17
Filing date: 1997-04-16
Publication date: 2000-07-18
Also published as: AU2735697A; NZ332807A; CA2254823A1; AU730156B2; EP0938258A4; WO1997038579A1; EP0938258A1; US5869539A

Abstract

(57)【要約】本発明は、一酸化窒素を含むパーフルオロ化合物エマルジョン、その調製およびその使用を含む。これらのエマルジョンは、新しい一酸化窒素源を提供する。このような一酸化窒素含有エマルジョンは、それらを必要とする個体への一酸化窒素の投与のために使用され得る。一酸化窒素投与を必要とする個体は、例えば、血流が増加することが望ましい、高血圧、子癇前症、および多くの他の状況を罹患しているものを含み得る。さらに、血液代替物としてパーフルオロ化合物エマルジョンを長期間使用すると、本発明は、強力な好ましくない副作用（例えば、薬物代謝による毒性）なしに、比較的に安全な、一酸化窒素の投与および分配のための態様（図１参照）を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】一酸化窒素（NO）の溶媒としてのパーフルオロ化合物のエマルジョン発明の分野本発明は、一酸化窒素源およびその使用に関する。一酸化窒素を含むパーフルオロカーボンエマルジョンおよび好ましくは一酸化窒素源。発明の背景 FurchgottおよびZawadskiは、最初に、1980年に、血管を弛緩させるために、アセチルコリンに対して内皮がインタクトでなければならないことを示した。結果として、多くの研究が、ニューロ体液のもしくは薬理学的な試剤が、内皮を介して血管拡張を媒介することを示した。血管拡張を起こすかまたは血管構造を調節する様々な刺激に応答して、内皮が、強力な、不安定な、非プロスタノイド血管拡張剤を放出することが現在、認識されている。この因子は、最初は、内皮細胞由来緩和因子（EDRF）と命名され、一酸化窒素（ＮＯ）または一酸化窒素部分を有する化合物であることが示されている。ＮＯは、フラビン含有酵素、一酸化窒素シンターゼの少なくとも３つの異なるアイソフォームによるL-アルギニンのグアニジノ窒素の酸化的脱アミン化により合成される（Moncadaら、1991）。一酸化窒素シンターゼは、最近精製され、そしてその遺伝子がクローニングされている（BredtおよびSnyder、1990；Stuehr ら、1991）。一酸化窒素の合成は、L-アルギニンのアナログ；Ｎ^G-ニトロ-L-アルギニンメチルエステル（L-NAME）、Ｎ^G-モノエチル-L-アルギニン（L-NMMA）、Ｎ-イミノエチル-L-アルニチン(arnithine)（L-NIO）、L-モノメチル-L-アルギニン（L-NNMA）および、L-Ｎ^G-メチルアルギニン（L-NMA）ならびに、Ｎｗ-ニトロ-L-アルギニン（L-NA）により競争的に阻害されることが示されている。ＮＯは、その小さいサイズ、親油性の性質、および短い作用期間のために、理想的な局所的経細胞メッセンジャーである。一般的に使用される化学的ニトロ- 血管拡張剤（例えば、ニトログリセリンおよびニトロプルシド）は、ＮＯを放出することにより作用するようである。一酸化窒素シンターゼ（ＮＯｓ）は、アルギニンからＮＯを合成する酵素である。これらの酵素は、それらが1989年に最初に記載されてから、クローニングされており、そして特徴づけられている。３つの異なるアイソフォームが精製され、クローニングされ、そして発現されている。そしてＮＯＳの存在のための証拠は、哺乳動物の体のほとんどすべての組織に、レベルが広範に異なっていても、存在する。アイソフォームは、ｂＮＯＳ（脳ＮＯＳ）、ｅＮＯＳ（上皮ＮＯＳ）、およびｍＮＯＳ（マクロファージＮＯＳ ir ｉＮＯＳ：誘発し得るＮＯＳ）が挙げられる。ｂＮＯＳおよびｅＮＯＳアイソフォームは、カルシウムによって構成されそして刺激される。ｉＮＯＳ形態は、様々なサイトカインに応答して発現する。それらの役割を以下に広く概説する。一酸化窒素は、ｃGMP（1,3,5-環状グアノシンモノホスフェート）の血管平滑筋内でのレベルを上昇させて、血管の緩和および緊張の減少を生じる（Moncada ら、1991年）。一酸化窒素は、ヘムに結合し、そして可溶性グアニル化シクラーゼを活性化して（Ignarro、1991年）、ｃGMPに対する細胞含量を上昇させる。ニトロ血管拡張剤（例えば、ニトロプルシドおよびニトログリセリン）は、血管平滑筋の血管収縮性を阻害して血管の緊張の緩和または減少を起こすと長い間認識されていた。これらの試剤は、1800年代の後半から、血管拡張剤として使用されている。しかし、これらの化合物の作用のメカニズムが理解されたのは、ほんの最近のことである。ニトロ血管拡張剤は、現在、一酸化窒素源として分類されている（Moncadaら、1991年）。長期間使用されたニトロ血管拡張剤は、生理学的なメカニズムの欠失に対する代替治療と考えられ得る。一酸化窒素はまた、マクロファージおよび他の免疫細胞により生産される（Stuehrら、1991）。刺激されたマクロファージは、L-アルギニンから一酸化窒素を生産し、そしてこれは、侵入する病原に対する防御の第一線であると考えられる。一酸化窒素の欠乏が多くの疾患（高血圧、アテローム硬化、および糖尿病を含む）の病原に寄与することの、動物研究からの証拠の実質的な体が存在する（Mo ncadaら、1991年）。一酸化窒素シンターゼの阻害が血圧を劇的に上昇させることを示す多くの最近の研究がある。L-NNMA、L-NA、またはL-NAMEによる、一酸化窒素シンターゼの阻害は、長期持続性の血圧上昇を起こし、そして一酸化窒素の合成の減少が高血圧の病原に寄与し得ることを示唆する（Moncadaら、1991年）。さらに、L-NAME処置は、アンジオテンシンII、バソプレッシン、およびノルエピネフリンに対する圧力応答を増強する。また、妊娠誘発高血圧を有する患者においては、臍帯血管による一酸化窒素の放出が、鈍くなり（Pintoら、1991年）、そして妊娠自発的高血圧ラットの血圧の生理学的な減少が、内皮一酸化窒素に依存することが示された（Ahokasら、1991年）。さらに、L-NAの注入が妊娠ラットの血圧を上昇させ、そして昇圧剤への応答を強化する（MolnarおよびHertelendy 、1992年）。これらの研究は、害された一酸化窒素合成が、妊娠誘発高血圧（子癇前症）の病因における重要なメカニズムであり得ることを示唆している。実際、妊娠ラットにおけるＮＯの阻害は、子癇前症と同じ症状を起こす（Yallampall iおよびGarfield、1993年）。子癇前症は、内皮細胞障害であると示唆されていた（Robertsら、1989年）。女性における多くの他の病原的な問題（例えば、早期分娩、更年期、妊娠誘発糖尿病、分娩後出血、冠状動脈疾患、ガンおよび行動性および消化の問題）に一酸化窒素（過剰かまたは欠乏のいずれか）が関連する可能性がある。一酸化窒素は、子宮壁で生産され、そしてそれは、妊娠中の子宮収縮性を効率的に阻害するが、出産中は阻害しない（Yallampalliら、1993ｂ）。一方、ステロイドホルモンは、子宮における一酸化窒素-ｃGMP緩和メカニズムを調整するようである（Yallampalliら、l993ｂ）。高レベルのステロイドホルモン（主にプロゲステロン）が妊娠期間中に一酸化窒素の作用の発生のいずれかを調節するのはもっともらしく思われる。一酸化窒素がステロイドホルモンの伝達物質メカニスムであれば、おそらく一酸化窒素は、再生および女性の健康（排卵、移植、月経、更年期などを含む）における他のエストロゲンおよび／またはプロゲステロン依存工程を調整する。さらに、抗ホルモン剤（例えば、抗プロゲスチン）の作用のいくつかは、一酸化窒素により媒介される。一酸化窒素はまた、血液凝集（Clotting）に制御に非常に関与する。一酸化窒素は、非常に強力な凝固のインヒビターであり、そしてこの作用は、胎盤の凝集の防止において極めて重要であり得る。以前において、プロスタサイクリンが胎盤凝集を調整することが示唆されていた。しかし、現在では、プロスタサイクリンの阻害効果と結合したか、または単独で作用するかのいずれかのプロセスにおいて一酸化窒素が非常に重要であり得ることが明らかである。一酸化窒素は、体内のほとんどすべての組織（脳、末梢神経系、平滑筋（血管、上記を参照）、腎臓、肺、子宮などを含む）で合成されることが分かっている。子宮において、一酸化窒素は、様々な組織により生産され、そしてそれは、子宮収縮に対する非常に強力な阻害剤である（以下を参照）。一酸化窒素は、様々な生物学的現象を調節する（いくつかの組織の平滑筋収縮の調節を含む）。一酸化窒素は、L-アルギニンから合成され、そして上昇する環状グアノシンモノホスフェート（ｃGMP）レベルによる平滑筋の緩和を起こす。本発明者らの研究によれば、ラットの子宮組織を、インビトロで試験して、L-アルギニン-一酸化窒素-cGMP系がラット子宮に存在するかどうかを決定した（Garf ieldおよびYallampalliら、1993年；Yallampalliら、l993ｂ；Izumiら、1993）。これらの研究は、以下のことを示す：(1)基質および一酸化窒素のドナーが子宮の緩和をもたらしたこと、(2)一酸化窒素cGMP経路のインヒビターが緩和応答をブロックしたこと、(3)一酸化窒素シンターゼが、いくつかの子宮細胞タイプに局在化したこと、(4)L-アルギニンが消費されそしてシトルリンレベルが上昇した期間に、一酸化窒素が子宮により生産されたこと、(5)一酸化窒素基質の緩和の効果が、cGMPにより模倣（mimick）されたこと、(6)L-アルギニンおよびNO への応答が、満産（term）および早期分娩の間に減少したこと、(7)ＮＯＳアイソフォームが子宮に存在し、そして妊娠中にアップレギュレーションされるが、分娩が始まると減少すること。これらの研究は、ＮＯが妊娠中の子宮収縮をコントロールし得ることを示している。上記の考察に基づけば、一酸化窒素ドナーは、強力な子宮緩和剤であり、そして一酸化窒素インヒビターは、子宮収縮を増加させ得る。最近のデータは、これらの競合を支持する。一酸化窒素ドナー化合物ニトログリセリンは、１３ヒト被検体において、早期分娩を阻害することが示されている（Leeら、1994年）。一方、一酸化窒素は実質的に、抗プロゲステロン化合物がラットにおいて未熟児出生を誘発する作用を改良し、そして同じ化合物は、単独では、モルモットの未熟児出生を誘発する。正常な産の間、頚（cervix）が軟化し、または成熟し、かつ消して(effaces) 、胎児が産道を降りてくるのを可能にする。頚は、大部分は結合性の組織から構成され、そして出生の間、この組織の含量の減少がある。出生に関する、頚の変化を開始する原因となる正確なメカニズムは、未知である。しかし、このプロセスが炎症応答と同様であり、そして白血球の浸透および酵素の放出に伴うことは周知である（Chwalisz、1993年）。プロゲステロンは、頚の成熟を阻害し、そして抗プロゲステロン化合物は、早期の軟化および未熟児分娩／出生を促進するすると考えられている。サイトカインはまた、これらの応答に関係している（Chwaliszら、1994a；Chwaliszら、199 4b）。本発明者らの研究によるデータは、一酸化窒素が妊娠末期に頚の機能を調節し得ることを示唆している。ラット頚は、一酸化窒素を生産し、そしてウエスタンブロットおよびＰＣＲ^TMを用いる一酸化窒素およびＮＯＳのアッセイにより判断されるように、ｂＮＯＳおよびｍＮＯＳのアイソフォームを含む。分娩の間、ＮＯＳアイソフォームは上昇し、そしてこれは、ＮＯ生産の上昇を伴う。従って、ＮＯは、分娩および出産に関連する頚の拡張に関与し得る。これは、分娩および出産の間に子宮で見られるＮＯ経路のダウンレギュレーションとは反対である（上記を参照のこと）。ステロイドホルモンがＮＯＳ酵素、グアニル化シクラーゼ、および／またはｃ GMPのためのエフェクターシステムを調節し得るという概念についての周辺的な証拠を提供する多くの研究がある。従って、一酸化窒素合成、グアニル化シクラーゼまたは一酸化窒素エフェクターシステム（ｃＧＭＰ依存性緩和メカニズム）がステロイドホルモンにより調節され得る。閉経後の女性に、心臓血管疾病の増加があり、これらは、性ステロイドの減少および一酸化窒素の変化に関連しているかも知れない（上記を参照）。女性ステロイドホルモンは、一酸化窒素による血管平滑筋の内皮依存性緩和を調節することが示されている。ラットのエストラジオール処置は、血管組織による一酸化窒素生産の上昇を引き起こすが、プロゲステロンは、この現象に反作用すると考えられる（MillerおよびVan Houtte、19 91年）。一方、ステロイドホルモンは、子宮における一酸化窒素-cGMP緩和メカニズムを調節するようである（Yallampalliら、1993ｂ）。さらに、プロゲステロンアゴニストは、SHRラットおよび一酸化窒素インヒビターで処置されたラットの血圧を下げた。一酸化窒素のステロイドホルモンコントロールに関する上記の仮説に関するひとつの重要な観察は、妊娠自発的高血圧ラット血圧が妊娠中に下がることである（Ahokasら、1991）。この研究は、妊娠が奥深い抗高血圧効果を有することを実証する。妊娠が心臓出力の上昇に関連することが周知であり、そして現実の体内のすべての血管ベッド（vascular beds）の抵抗の現象は、この現象のメカニズムを除いて未知である。妊娠中の高レベルのステロイドホルモン（主にプロゲステロン）は、一酸化窒素の生産または作用のいずれかを調節する。一酸化窒素がステロイドホルモンの伝達メカニズムであれば、おそらく一酸化窒素は、再生および女性の健康における他のホルモン依存性工程を調節する。最近、ウシ内皮ＮＯＳ遺伝子が単離され、クローニングされた（Venemaら、19 94）。この研究は、5'-隣接領域が15エストロゲン半パリンドローム領域を含むことを実証する。ＮＯＳプロモータ一中の１以上のこれらのエストロゲンモチーフが、少なくとも特定の内皮表現型において、エストロゲン応答性を遺伝子に与え得ることが考えられる。エストロゲン応答性は、脳においてＮＯＳ活性を上昇させることが示されている（Weinerら、1994）。すべての３つのＮＯＳアイソフォーム遺伝子は、推定AＰ−１コンセンサス配列を含み、従って、予宮組織中でのガン遺伝子c-fosおよびc-junの調節が、ステロイドホルモンがＮＯＳ発現を上昇させ得るメカニズムであることが示されている。エストロゲンは、c-fos、jun-B、およびjun-D発現を刺激し、そして子宮内膜でのc-jun発現を減少させる。対称的に、エストロゲンは、子宮筋層中のc-jun を刺激する。これらのガン遺伝子は、ホモまたはヘテロ２量体としてAP-1転写因子部位に結合することにより、遺伝子発現を調節する。エストロゲンは、子宮内膜中のJun-B／c-fosおよびJun-D／c-fosおよびc-fos／c-fos２量体を増加させるが、子宮筋層中ではc-jun／c-fos２量体のみを増加させる。異なる２量体形成が、AP-1部位メカニズムを介する遺伝子発現の選択的刺激のメカニズムとして示唆されている。従って、本発明者らは、ＮＯＳ発現が、ステロイドホルモンによる AP-1転写因子媒介メカニズムにより調節され得ることを示唆する。閉経前の女性は、男性よりも心臓血管疾病の出現率が少ない。閉経後、心臓血管疾病は、急激に増加する。冠状動脈心臓疾病の危険性は、卵巣機能の切除の後に急速に上昇する。これらの変化は、ホルモン的に媒介され、そしてエストロゲンおよびプロゲステロンの両方の生産の減少に関すると考えられる。(l)一酸化窒素は、血管機能のコントロールに非常に重要であり、(2)一酸化窒素生産または作用の減少は、血管における病態生理学的な変化（すなわち、高血圧およびアテローム硬化に関する心臓血管疾病）に関し、そして(3)ステロイドホルモンは、一酸化窒素合成を調節するので、一酸化窒素は、すべてまたは少なくとも幾分かのステロイドホルモンが閉経前の女性の心臓血管疾病を防止する作用を媒介し得る。従って、心臓血管疾病を防止するために、HRT（ホルモン交換治療）の一部としてＮＯドナーを投与し、そしてステロイドホルモンの副作用を回避することは、可能であり得る。上記に加えて、一酸化窒素は、骨の再構築に関係している（以下を参照）。ステロイドホルモンはまた、閉経後の女性において骨粗鬆症を防止するのに使用されるので、一酸化窒素ドナーは、骨粗鬆症を防止し得、そしてまたＨＲＴに関係する。骨再構築疾患（例えば、骨粗鬆症および骨関節炎は、しばしば、局所的および全身的骨再構築調節経路の間の相互作用中の動揺（pertubation）に関連する。ステロイドホルモンの減少に関連する閉経後の骨損失は、サイトカインレベルの上昇と相関する。さらに、エストロゲンおよびプロゲスチンの両方が、閉経後の骨損失の防止に有効である（Abdallaら、1985；Christiansenら、1980）。骨分解溶骨細胞は、単球マクロファージ系列内の細胞から生じる。過剰な溶骨細胞活性は、高レベルの骨破壊および骨粗鬆症をもたらす。これらの細胞は、骨を再吸収する独特な能力を有するが、これらは、マクロファージと様々な特性を共有する。マクロファージは、炎症性サイトカインおよび試剤に応答して一酸化窒素を放出する。多くの最近の研究は、溶骨細胞が、マクロファージと同様に、一酸化窒素を合成することを示唆する（Kastenら、1994；Lowikら、1994；MacIntyreら、1991； Zaidiら、1993；Alamら、1992）。骨粗鬆症のモデルにおいて、一酸化窒素阻害は、骨ミネラル密度損失を増強する（Kastenら、1994）。これらの研究は、インビトロおよびインビボにおけるＮＯＳ活性の阻害が溶骨細胞活性の明らかな増強をもたらすことを示す。一方、一酸化窒素は、溶骨細胞活性および骨再吸収を強力に抑制する。これは、ｃＧＭＰに依存しないと考えられる。これは、平滑筋におけるＮＯ作用との重要な区別である。なぜならプロゲステロンは、この工程をコントロールし得るからである（上記を参照）。一酸化窒素が軟骨細胞で生産されることを実証する研究もある。造骨性細胞（造骨細胞および軟骨細胞）によるＮＯ生産は、骨破壊活性の重要な調節メカニズムを示す。上記の発見の可能な治療の結果は、驚くべきものである。骨破壊活性の阻害は、骨粗鬆症、Paget骨疾病およびリュウマチ関節における主要な目的である。ＮＯドナーは、これらの症状に有用であり得る。一酸化窒素、骨破壊活性およびステロイドホルモンの間の正確な関係は、依然として確立されるべきである。しかし、ステロイドホルモンは、溶骨細胞におけるＮＯ合成を調節し得、そしてこのことがそれらの活性に影響を与えるようである。存在するデータは、慢性ステロイド（chronic steroid）（エストロゲンおよび／またはプロゲステロン）の血管への効果が一酸化窒素により媒介されることを強力に示している。一酸化窒素合成の阻害は、動物モデルにおいてアテローム硬化症および骨粗鬆症の両方を起こす（Moncadaら、1991年）。一方、一酸化窒素は、増殖および異化による子宮内膜への直接的な効果を示さない。従って、HR Tのためのステロイドを、適切な窒素酸化物ドナーに置き換えることが可能であり得る。この画期的なストラテジーにより、HRTの主要な問題（子宮内膜のハイパーラシア(hyperlasia)および子宮出血）が避けられ得る。従って、ＮＯドナーは、アテローム硬化症および骨損失を、出血を誘発することなく防止する（いわゆる「HRTにおける無出血セクター」）ために使用され得る。加えて、これらの化合物はホルモン活性を発揮しないので、適切な一酸化窒素ドナーが、HRT用に使用され得る。現在、３種類だけ、臨床的に使用される一酸化窒素ドナー化合物がある。これらは、ニトログリセリン、亜硝酸アミル、およびニトロプルシドナトリウムである。ニトログリセリンは、表において舌下、ＩＶ、またはパッチ形態の用途のために利用可能である。亜硝酸アミルは、吸入薬として処方され、そして通常、破壊可能なカプセル中で使用される。ニトロプルシドナトリウムは、ＩＶ注入のみに使用される。現在、一酸化窒素ドナーは、冠状動脈疾病による狭心症（ニトログリセリンおよび亜硝酸アミル）、ならびに心筋梗塞または外科的手順に関連した血圧のコントロール（ニトログリセリンまたはニトロプルシドナトリウム）のために使用される。現在の一酸化窒素ドナーについての問題現在の一酸化窒素ドナー化合物についての問題は、以下を含む：１．短い作用期間２．短い半減期３．組織特異性の欠如４．耐性の発展５．毒性物質（例えば、ニトロプルシドナトリウムについてのシアニド）の蓄積一酸化窒素（ＮＯ）は、水および水溶液（例えば、血清）への溶解性が低い気体である。ＮＯはフリーラジカルであるが、これは安定であり、そして生物学的流体または通常の有機溶媒と化学的に相互作用しない；状況は、酸素（これは安定なジラジカルである）のそれと同様である。３種類のガス、窒素、酸素、および一酸化窒素は、二原子分子であり、そして同様な分子量を有する。しかし、最初の２者は、非極性分子であり、そしてそれゆえに、ＮＯより低い水への溶解性を有する。０℃かつ大気圧におけるこれらの溶解性（水l00mLあたりのグラムで）は、それぞれ、2.33、4.89、および7.34である；２０℃かつ同じ圧力においては（水100mLあたりのグラムで）、それぞれ、1.6、3.0、および4.6である。これらの３種類の気体の揮発性はまたかなり類似しているが、常圧における沸点（-1 95.8、-183.0、および-151.8℃）からわかるように、ＮＯ分子の極性は、それを最少の揮発性にする。一酸化窒素は、瞬間的に空気中の酸素と反応し、二酸化窒素を生じる。これは毒性の赤褐色のガスである。従って、ＮＯについてのすべての研究は、酸素または酸化性の媒体の不存在下で行わなければならない。パーフルオロ化合物（PFC）は、すべてのその水素原子がフッ素原子により置換されている。血液置換のために、現実に使用される代表的なＰＦＣは、過フッ化炭化水素（例えば、過フッ化デカリン、過フッ化アダマンタン）、ハロゲン誘導体（例えば、臭化オクチル）、第三級アミン（例えば、過フッ化トリブチルアミンまたは過フッ化トリプロピルアミン）、窒素含有ヘテロ環（例えば、過フッ化N-メチル-イソキノリン、過フッ化N-(4-メチルシクロヘキシル)-ピペリジン) および酸素含有ヘテロ環（例えば、過フッ化2-n-ブチル-テトラヒドロフラン）である。さらに、高度にフルオロ化された原子がまた使用されている；その例は、パーフルオロオクチル-エタン、パーフルオロヘキシル-エタン、1,2-ビス（パーフルオロブチル)-エテン、および1,2-ビス（パーフルオロヘキシル）-エテンである。単純化するために、これらのすべての化合物をこれより、PFCと記す。 ClarkおよびGolan（1966）は、PFC（特にパーフルオロ-2-ブチルテトラヒドロフラン）が気体に対する優れた溶媒であり、そしてこの特性がこのような化合物を「血液代替物」として使用することに導くことを発見した。他の歴史上の重要な進歩は、SloviterらおよびGeyerによる。Sloviterらは、最初にPFCエマルジョンを使用した。Geyerは、「無血液ラット」（その赤血球は、PFCエマルジョンにより置換されていた）が正常に挙動し、そしてそのプラズマタンパク質およびヘマトクリットレベルが約１週間後に正常の値に戻ったことを示した。PFCがヘモグロビンの代わりの酸素キャリアーである時間の間、これらのラットは、２０％一酸化炭素を含む雰囲気中で２日間生存したが、同じ雰囲気に曝された正常なラットは、数分で死亡した。このようなPFC液体中への酸素の溶解性は、標準圧力および温度下にて35〜44m mol O₂/Lであり、一方、同一条件下で水は2.2mmol O₂/Lしか溶解しない。このようなPFCは、完全に化学的に不活性であり、そして動物またはヒトに投与した場合に実質的に有害な反応を引き起こさない。異なるタイプのPFCは、他の医療目的に広く使用されている：麻酔、整形外科インプラント、置換筋肉構造、人工心臓弁など。さらに、(i)テフロンは現在、その優れた機械特性、化学不活性、および自己潤滑特性のため、種々の目的について大量に製造されている；(ii)数十年にわたってスプレー缶、冷蔵庫、およびエアコンディショナーに使用されていたクロロフルオロカーボン(CFC)は、化学的に非常に安定であり、そして成層圏に達し、ここで太陽の強い紫外線照射により分解され、塩素原子の放出により高緯度でオゾン層を破壊する；これらのCFC は、現在削減されており、そしてオゾン層に対してそれほど損傷を与えない他の流体で置き換えられている；ヒドロクロロフルオロカーボンはこれらの置換流体のうちの１つである、ことを言及すべきである。 PFCに戻って、低い粘性および1.8〜2.0g/mLの密度を有するこれらの無色液体は、水およびほとんどの有機溶媒と非混和性である。従って、静脈内投与について、PFCは電解質および緩衝液の水溶液で乳化されなければならず、界面活性剤および腫脹（コロイド−浸透）成分もまた含む。乳化は、しばしば、超音波振動（音波処理）、続いて音波処理中に形成される痕跡量の毒性のフルオライドアニオンを除去するための透析によるか、あるいは高圧均一化（これは、エマルジョンの大規模製造により適している）により、達成される。 1970年代後半に、日本、USSR、中国およびいくつかの他の国において数千のヒト患者に使用されていた第一世代のPFCは、エマルジョンの不安定性、身体中でのPFCの高い保持時間、および徹底的なフッ素化条件下でのPFCの合成中に形成される不純物の存在による副作用により妨げられた。これは、いくつかの欧州の国々（イギリス、フランス）、およびUSAにおいて、FDAが、虚血組織（例えば、バルーン血管形成中の心筋損傷）を含む特定の治療目的にのみPFCのエマルジョンの使用を許可したからである。Fluosolと呼ばれる第一世代のPFCエマルジョンの代表例は、Green Cross Corporationにより日本で製造され、その組成は表１に示される。それは、乳化および投与前に３つの別の溶液を混合することにより生じた。表１ Fluosolの組成（注射可能水中10％エマルジョン）（％w/v）幹エマルジョン（凍結）パーフルオロデカリン 14.0 酸素キャリアパーフルオロートリプロピルアミン 6.0 酸素キャリア Pluronic F-68 2.7 界面活性剤卵黄リン脂質 0.4 界面活性剤グリセロール 0.8 凍結保護剤追加溶液Ｃ塩化カリウム 0.034 イオン性バランス炭酸水素ナトリウム 0.210 pHコントロール追加溶液Ｈ塩化ナトリウム 0.60 イオン性バランス塩化カルシウム 0.028 浸透圧コントロール塩化マグネシウム 0.020 浸透圧コントロールグルコース 0.180 栄養ヒドロキシエチル−スターチ 3.0 腫脹剤 Pluronic F-68界面活性剤は、エチレンオキシドとプロピレンオキシドとの非イオン性ブロックコポリマーであり；8400の平均分子量を有するこのポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマーは、時としてヒトにおいて一時的な急性反応（補足的な活性化による）を与える；これにより、PFCエマルジョンの投与前にプレスクリーニングの必要が生じる。現在の、第二世代のPFCエマルジョンは、第一世代の前駆体のほとんどの欠点を是正した。PFCは、より穏和な条件下、すなわち、純粋なパーフルオロ前駆体から始めて、それらを別の化合物と反応させ、純粋な物質を生成することにより、調製される。非常に低い揮発性（身体中での長い保持時間を生じる）と非常に高い揮発性（肺病の問題を生じる）との間の最適トレードオフについて、PFCの分子量の範囲は、460〜520ダルトンの範囲内にあるべきである。最適粒子サイズは、0.1〜0.3μｍである。現在使用される界面活性剤は、最終滅菌エマルジョンにおいて室温で長い貯蔵寿命を有するエマルジョンを提供する。例えば、Schwei ghardt、Kaufmanら；Erner、およびClark,Jr.ら(1987)を参照のこと。本発明前、パーフルオロ化合物エマルジョンが、優れた一酸化窒素溶媒であり、生体系に対して一酸化窒素を供与するのに使用可能であることは公知でなかった。発明の要旨本発明は、パーフルオロ化合物および一酸化窒素を含有するエマルジョンならびにその使用を開示する。インビボ投与に適したこのような一酸化窒素源の調製方法が開示される。これらは、一酸化窒素をパーフルオロ化合物エマルジョン溶媒に溶解する工程を包含する。この方法は、パーフルオロ化合物および一酸化窒素を含有するエマルジョンを投与することにより、哺乳動物を一酸化窒素で処置するのに有用である。適切な一酸化窒素処置から恩恵を受ける例示的な状態は、高血圧、狭心症、予癇前症および広範な種々の付加的状態（例えば、過度に制限された血流に関連する状態）を含む。本発明の一酸化窒素およびパーフルオロ化合物含有エマルジョンは、好ましくは、過フッ化(perfluorinated)化合物として過フッ化炭化水素を含むが、過フッ化ヘテロ環、炭化水素アミンまたは類似のタイプの化合物が利用され得る。好ましいパーフルオロ化合物は以下を含む：過フッ化デカリン、過フッ化アダマンタン、過フッ化トリブチルアミン、過フッ化トリプロピルアミン、過フッ化N-メチル-イソキノリン、過フッ化N-(4-メチルシクロヘキシル)-ピペリジン)、過フッ化2-n-ブチル-テトラヒドロフラン、パーフルオロオクチル-エタン、パーフルオロヘキシル-エタン、1,2-ビス(パーフルオロブチル)-エテンまたは1,2-ビス(パーフルオロヘキシル)-エテン。本発明の重要な局面は、インビボ投与に適した、パーフルオロ化合物および一酸化窒素を含有するエマルジョンの調製である。このような投与は、治療有効量，すなわち，特定の生物学的問題を矯正する量であるべきである。投与は、非経口、局所または腔内であり得る。脈管内投与は、非経口投与の好ましい様式（例えば、高血圧の処置のため）であり得る。腔内投与は、例えば、気管支（吸入による）、頚部、子宮または膣（生殖管の障害を治療するため）、経口（例えば、小袋に入れられる）または肛門であり得る。一酸化窒素の最も広範に知られた使用は、血管拡張を誘起することである。従って、血圧は、低下し得、そして血液灌流を所望の部位に指向させ得、後者は、しばしば、その部位またはその部位の血液供給領域に一酸化窒素ドナーを投与することを含む。図面の簡単な説明図１は、記載のパーフルオロ化合物のエマルジョンにおける化学ルミネッセンスによるNO濃度の測定を示す。図２は、以下の溶媒中で同様に調製した溶液と比較して、パーフルオロ化合物のエマルジョンにおけるNO溶液の効果を示す：蒸留水、0.9％水性生理食塩水溶液、Krebs溶液、ポリ（ビニルピロリドン）のコロイド溶液、テトラヒドロフラン。図3A〜Dは、フェニレフリン、KCl、アセチルコリン、ニトロプルシドナトリウムパーフルオロカーボンエマルジョンおよびNO含有パーフルオロカーボンエマルジョンの、哺乳動物大動脈環に対する収縮効果を示す。発明の詳細な説明 NOは、本質的に非常に不安定であり、例えば、容易に酸素と反応する。NOのための安定化溶媒は知られておらず、従って、身体中へのNOの送達は、公知の直接または間接一酸化窒素薬物ドナー、あるいは酵素（一酸化窒素シンターゼ）のための基質を介して進めなければならない。ニトログリセリンのような薬物は、NO ドナーとして作用することが公知であるが、未知の機構を介してそのように作用する。 NO源のための指標（ここで、例えば、本発明のNO含有パーフルオロ化合物エマルジョンが使用され得る）は、以下の通りである：心臓脈管は、高血圧、狭心症、アテローム硬化症、子癇前症（妊娠誘起高血圧、毒血症、子癇、HELP症候群）、脈管コンダクタンスの調節、血流の調節、血圧の調節、および心筋虚血を含む。運動性、幽門狭窄症を変化させる胃腸疾患。喘息、肺機能を増強するための未熟児の処置および肺高血圧を含む肺機能。急性炎症、関節炎、感染に対する抵抗、ガン、SLE-狼瘡、アナフィラキシー反応および同種移植片拒絶を含む、炎症、自己免疫および免疫疾患および状態。 CNSは、行動、てんかん、アルツハイマー病、卒中、成長ホルモン障害（例えば、末端肥大症）を含む。膵臓は、糖尿病を含む。女性の生殖系または問題（直接および間接）、例えば、排卵、着床／インビトロ受精、月経前症候群、月経困難症、子宮収縮障害、早期分娩、頚部拡張、避妊、閉経症状、骨粗鬆症、内分泌障害およびホルモン置換治療。男性の生殖の問題（直接および間接）、例えば、インポテンス、陰茎勃起、男性閉経症状、内分泌障害、骨粗鬆症および前立腺肥大。膀胱および腎臓病は、失禁、腎動脈狭窄、高血圧、局所的脱毛、種々の皮膚病、湿疹(外来粒子への皮膚の反応)、自己免疫皮膚疾患および乾癬を含む。これらの状況は、NO源が利用可能である１次的なものとして、またはそれらが利用可能であると思われる２次的なものとして分類され得る。１次的な徴候は、月経困難、早期分娩、頚部不全を含む子宮収縮障害；女性および男性におけるホルモン置換治療；および高血圧治療を含む。２次的(潜在的)徴候は、挙動、排卵および着床-避妊、分娩の誘導、血液凝固、インポテンツ、感染、分娩後出血、突破出血、局所塗布、肺機能およびガンを含む。本発明は、NOが脱酸素パーフルオロ化合物エマルジョン中で可溶であり、かつ安定であるという発見を含む。このようなパーフルオロ化合物エマルジョン中に溶解した場合、酸素のない状態で保管されれば、NOは少なくとも14日間以上安定である。本明細書中に示したデータは、この後のサンプル中のNOの存在を示す。これらの生物学的適合性(合成血液、例えば、PriesおよびRiessら、1982、1988 、1994を参照のこと)およびこれらのNO溶媒特性(生物学的組織に影響するNO放出 )のため、このようなエマルジョンは有利である。これらの概念および実験的検証の組み合わせは、新規で、予期しないものであった。NOは、ヒトの循環系への注射に適切であると以前例示したエマルジョン中で安定に保たれ得る(実際にこれらのエマルジョンは血液置換治療に使用されてきた)。パーフルオロカーボンに吸着されたNOとともに(通常の用途で吸着される酸素と反対のものとして)、これは組織へのNOの送達のための機構を提供する。所望のNO投与(すなわち、どれだけのNOが、特定の生物学的反応を達成するための与えられた量のエマルジョンに溶解されるか)は、例えば、異なる血液置換および他のパーフルオロカーボンエマルジョンに、種々のNOレベルを用いて最初に決定され得る。重要な発見は、本明細書中で開示されており、すなわち発明者らは、生物学的に適合性のパーフルオロカーボンエマルジョン中で数週間実質的に安定にNOを保持し得る。これは実験的に証明され、そして可能性な用途は莫大である。実施例１パーフルオロ化合物のエマルジョン中の一酸化窒素の溶液一酸化窒素のための溶媒として使用される２次生成PFCエマルジョンの組成物を、表２に示す。これは少量のフルオロカーボン-ハイドロカーボン「分子ドエル(dowel)」化合物(1-パーフルオロ-n-ヘキシル-デカン)を含み、PFC液滴の表面とリン脂質界面活性剤の間に挿入する。これは、１次生成PFCエマルジョンよりもかなり高い濃度を有する。表２パーフルオロ-オクチル-エタンエマルジョン(60% w/w) このパーフルオロカーボンエマルジョンをミクロ流動化(microfluidization) により調製し、そして121℃で15分間滅菌した。リン酸ナトリウム緩衝液で調節したpH(滅菌後)は6.9であった。平均粒子径(光沈降(photo sedimentation)により測定した)は、滅菌前および滅菌後でそれぞれ0.08μｍおよび0.12μｍであった。 PFCのエマルジョンは、純粋に物理的プロセスによってガスを溶解し、そして溶解度が、ヘンリーの法則により、ガスの分圧に伴って直線的に変化する。ガスの分子量が大きいほど、溶解度は大きい。従って、NOの溶解度は、O₂とN₂との間の中間の溶解度であることが期待され得る。 PFCエマルジョン中のNOの溶液を調製するために、好ましくは酸素が排除され、そして同時にエマルジョンの滅菌が保持される。これは、滅菌PFCエマルジョンを有し、ゴムの隔壁でキャップされたバイアルを有する手段により最も良く行われる；注射針を通じて、次いでこのエマルジョンを脱酸素し、そしてNOを導入する。脱酸素のために適用され得る手順は、(i)凍結し、バイアル中のガスを真空ポンプで吸引し、そして解凍する繰り返しサイクル；または(ii)不活性ガス(例えば、窒素またはアルゴン)を通気することにより溶解した酸素を置換する；を含む。酸素を含まない圧カシリンダーで容易に利用でき、そしてたとえ少量の漏れがあったとしても良好で、重いガスブランケットを提供するので、後者が好ましい。第２の代替手順は以下に記載される。実施例２アルゴン脱酸素を用いるPFCエマルジョン中でのNO溶液の調製エマルジョンを適切なバイアル中に設置する。このバイアルはゴムの隔壁で硬く閉じられており、２つの注射針が挿入されている；これらのうちの一方はバイアルの底面に到達し、そしてガスを導入するために役立ち、もう一方は過剰のガスを、作業が行われるフードの中に逃がす。加圧したシリンダーからのアルゴンガスを、３〜４分間エマルジョンに通気し、その後、適切な三方コックを用いて、気体一酸化窒素(NO)を同じ注射針を通じて５分間通気する。隔壁がバイアルの内容物と外気とが触れるのを防ぐために２本(１本または３本の代わりに)の注射針を使用することが有利であることが見出された。一酸化窒素が酸素に遭遇するとすぐに、二酸化窒素に置換され得るからである。小さな隔壁のために通常必要とされる、３本の注射針は込み合いすぎており、隔壁を通じる穴の数を不必要に増加させる。１本の注射針の場合には非常に複雑なコックシステムを必要とする。作業の終わりに、NOの気流がまだ通気したままで両方の注射針は同時に隔壁から除去される。この一酸化窒素溶液は、室温で少なくとも数日間は保存され得、冷蔵庫(冷凍庫ではない)で冷却される場合、数週間安定である。NOの濃度は、特に亜硝酸塩または他のNOの酸化生成物に関して、標準的な化学発光法を用いて、あるいは他の分析的手順によって計測され得る。図１は、表２に記載したパーフルオロ化合物のエマルジョン中の化学発光によるNO濃度の決定を表し、以下の溶媒に同様に調製した溶液と比較して示す：蒸留水、0.9％生理食塩水、クレブス溶液、ポリ(ビニルピロリドン)のコロイド溶液、およびテトラヒドロフラン。PFCエマルジョン中のNOの濃度が、他の溶媒中よりも１桁高い規模であることが見られ得、このような濃縮溶液が医用用途のために少量で用いられ得る。低濃度のNOが受容可能な場合、他の生体適合性溶媒(例えば、生理食塩水、クレブス溶液、またはコロイドポリ(ビニルピロリドン))中のNOの溶液もまた、使用され得る。図２は、パーフルオロ化合物のエマルジョン中のNO溶液の効果を、以下の溶媒中で同様に調製した溶液と比較して示す：蒸留水、0.9％生理食塩水、クレブス溶液、ポリ(ビニルピロリドン)のコロイド溶液、およびテトラヒドロフラン。クレブス溶液(生理学的溶液)中およびフルオロカーボンエマルジョン中のNOの安定性。この溶液の調製の直後、このエマルジョンはクレブス溶液の10倍以上の量のNOを含む。クレブス溶液中のNOは約10分間で消失するが、エマルジョン中の NOは、比較的安定であり、かつ数カ月かけてゆっくり減少する。図２は、パーフルオロ化合物エマルジョン中に溶解したNOが長い間安定であることを示す。実施例３動脈血圧におけるNO含有パーフルオロ化合物エマルジョンの効果血圧コントロールおよび生物学的組織感受性に関して優れたエクスビボモデルであるラットの大動脈環で、血管に効果を有する公知の薬剤、パーフルオロ化合物エマルジョンおよび上記(アルゴン脱酸素に次いでNO溶解)のように調製したNO -含有パーフルオロ化合物エマルジョンに対する収縮反応についてテストした。図３A〜Dは、インビトロでのラット大動脈環の収縮のトレースを示す。この大動脈を成体雌ラットから除去し、そしてO₂-CO₂ガス(95:5)で通気した生理学的溶液中に懸濁する。収縮性をコンピュータに接続したストレインゲージで計測する。図３Aは、KCl(45mM)、フェニレフリン(10^-9M〜10⁵M)に対するコントロール収縮反応、次いでアセチルコリン(10^-8M〜10^-5M、内因性一酸化窒素放出を刺激することが公知である)に対する弛緩反応を示す。図３Bは、Kcl，L-NAME(L-ニトロアルギニンメチルエステル)、フェニレフリンおよびニトロプルシドナトリウム( SNP、10^-9M〜10^-5M、公知の一酸化炭素ドナー)に対する大動脈収縮反応を示す。 L-NAMEおよびフェニレフリンに供した大動脈組織環に対する脱酸素パーフルオロ化合物エマルジョン単独の以下の適用は効果が見られない(図３C)。図３Dは、エマルジョン中の一酸化窒素の飽和調製液100μｌの適用に対しての典型的な弛緩反応を示す。参考文献以下の参考文献は、それらが関連する教示について、本明細書中の関連部分において参考として援用される。当業者は、本発明の情報が一旦公知になれば、他のおよび新規に開発されたパーフルオロカーボン化合物含有エマルジョンは、以下の請求の範囲において表現されるような、本明細書中で特定に開示されたエマルジョンと同等に置き換えられ得ることを理解する。同様に、類似および調製、投与、および治療の方法が明らかである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者ガーフィールド，ロバートイー. アメリカ合衆国テキサス 77546，フリンズウッド，ウィンディングウェイ 1814 (72)発明者バラバン，アレキサンドルティー. ルーマニア国バチャレストアール― 70502，ストラダポエナウボルダ６ (72)発明者セイツ，ウイリアムエイ. アメリカ合衆国テキサス 77539，ディッキンソン，オークドライブ 3406

Claims

【特許請求の範囲】１．実質的にパーフルオロ化合物および一酸化窒素からなるエマルジョン。２．前記パーフルオロ化合物が過フッ化炭化水素、過フッ化ヘテロ環式化合物、または過フッ化炭化水素アミンである、請求項１に記載のエマルジョン。３．前記パーフルオロ化合物が、過フッ化デカリン、過フッ化アダマンタン、過フッ化トリブチルアミン、過フッ化トリプロピルアミン、過フッ化Ｎ-メチル- イソキノリン、過フッ化Ｎ-(4-メチルシクロヘキシル)-ピペリジン、過フッ化2 一n-ブチル-テトラヒドロフラン、過フッ化オクチル-エタン、過フッ化ヘキシル -オクタン、1,2-ビス(パーフルオロブチル)-エテンまたは1,2-ビス(パーフルオロヘキシル)-エテンである、請求項１に記載のエマルジョン。４．一酸化窒素をミクロ流動化により調製されたパーフルオロ化合物エマルジョンに溶解する工程を包含する、インビボ投与に適切な一酸化窒素源を調製する方法。５．実質的にパーフルオロ化合物および一酸化窒素からなるエマルジョンを、治療的に有効な量で投与する工程を包含する、哺乳動物を一酸化窒素で処置する方法。６．実質的に一酸化窒素からなる、パーフルオロ化合物エマルジョンに溶解された組成物を、治療的に有効な量で投与する工程を包含する、高血圧を処置する方法。７．前記投与工程が、非経口、局所的または腔内投与である、請求項５または６に記載の方法。８．前記投与工程が、経気管支的、経頚管的、経子宮的、経膣的、経口的、または経肛門的投与である、請求項７に記載の方法。９．前記非経口投与が、血管内投与である、請求項７に記載の方法。１０．一酸化窒素処置が、特定の部位に血液灌流を増強するためであり、そして前記投与が、その近接部位に行われる、請求項５に記載の方法。