JP2000501621A - ヘリコバクターピロリに関係した核酸及びアミノ酸配列並びにそれらのワクチン組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ヘリコバクター ピロリポリペプチドの組み換えまたは実質的に純粋な調製物が記述される。また、これらのポリペプチドをコードする核酸も記述される。ヘリコバクター ピロリポリペプチドは診断用及びワクチン組成物において有用である。

Description

【発明の詳細な説明】 ヘリコバクター ピロリに関係した核酸及びアミノ酸配列並びにそれらのワクチ ン組成物発明の背景 ヘリコバクター ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）はヒト 胃の生検標本から発見されそして培養されたグラム陰性のＳ字状の微好気性細菌 である（Ｗａｒｒｅｎ、Ｊ．Ｒ．及びＢ．Ｍａｒｓｈａｌｌ、（１９８３）Ｌａ ｎｃｅｔ １：１２７３−１２７５；及びＭａｒｓｈａｌｌ等、（１９８４） Ｍｉｃｒｏｂｉｏｓ Ｌｅｔｔ 、２５：８３−８８）。ヘリコバクター ピロリ は慢性胃炎及び十二指腸潰瘍疾患に強い関連がある（Ｒａｔｈｂｏｎｅ等、（１ ９８６）Ｇｕｔ ２７：６３５−６４１）。さらに、非潰瘍性消化不良、胃潰瘍 疾患及び胃腺癌におけるヘリコバクター ピロリの病因的役割に関する証拠が集 まっている（Ｂｌａｓｅｒ Ｍ．Ｊ．、（１９９３）Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｉｃｒｏ ｂｉｏｌ 、１：２５５−２６０）。この細菌の伝播は経口経路を通して起こり、 感染の危険は年齢と共に増加する（Ｔａｙｌｏｒ、Ｄ．Ｎ．及びＭ．Ｊ．Ｂｌａ ｓｅｒ、（１９９１）Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．Ｒｅｖ １３：４２−５０）。ヘリ コバクター ピロリはヒト胃の粘膜にコロニーを形成し、通常何十年も持続する 感染を樹立する。ヘリコバクター ピロリによる感染は世界中に広く一般に存在 している。先進国では成人人口の５０％を越える感染率を有し、一方、後進国で は２０歳を越える成人の９０％に達する感染率を有する（Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｒ． Ｊ．及びＪ．Ｇ．Ｍｏｒｒｉｓ（１９９４）Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．９７：２６５− ２７７）。 胃の環境のコロニー形成及びこの病原菌の毒性に必要な細菌因子は十分に理解 されていない。推定される毒性因子の例は以下のもの、すなわち、胃の酸性ｐＨ を中和する役割を果たす可能性がある酵素のウレアーゼ（Ｅａｔｏｎ等、（１９ ９１）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５９：２４７０−２４７５；Ｆｅｒｒｅ ｒｏ、Ｒ．Ｌ．及びＡ．Ｌｅｅ（１９９１）Ｍｉｃｒｏｂ．Ｅｃｏｌ．Ｈｌｔｈ ．Ｄｉｓ ．４：１２１−１３４；Ｌａｂｉｇｎｅ等、（１９９１）Ｊ．Ｂａｃｔ ｅｒｉｏｌ ．１７３：１９２０−１９３１）；粘膜層を越える運動に必要な細菌 鞭毛タンパク質（Ｈａｚｅｌｌ等、（１９８６）Ｊ．Ｉｎｆ．Ｄｉｓ．１５３： ６５８−６６３；Ｌｅｙｉｎｇ等（１９９２）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６ ：２８６３−２８７４；及びＨａａｓ等、（１９９３）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉ ｏｌ ．８：７５３−７６０）；上皮細胞において細胞内液胞の形成を引き起こす 細菌毒素のＶａｃＡ（Ｓｃｈｍｉｔｔ、Ｗ．及びＲ．Ｈａａｓ、（１９９４）Ｍ ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ．１２（２）：３０７−３１９）及びい くつかの胃の組織特異的アドヘシン（Ｂｏｒｅｎ等、（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃ ｅ ２６２：１８９２−１８９５；Ｅｖａｎｓ等、（１９９３）Ｊ．Ｂａｃｔｅ ｒｉｏｌ ．１７５：６７４−６８３；及びＦａｌｋ等（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎ ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ．ＵＳＡ ９０：２０３５−２０３）を含む。 現在、インビトロでヘリコバクター ピロリ感染を根絶する多数の治療薬が利 用できる（Ｈｕｅｓｃａ等、（１９９３）Ｚｂｌ．Ｂａｋｔ．２８０：２４４− ２５２；Ｈｏｐｋｉｎｓ、Ｒ．Ｊ．及びＪ．Ｇ．Ｍｏｒｒｉｓ、上記）。しかし ながら、細菌の耐性、変化した薬物分布、患 者の非コンプライアンス（ｎｏｎ−ｃｏｍｐｌｉａｎｃｅ）または不十分な薬物 利用能のために、これらの処置の多くはインビボでは次善のものとして有効であ る。ビスマスと組み合わせた抗生物質での処置は、ヘリコバクター ピロリ感染 を処置するために用いられる標準的な処方計画の一部である（Ｍａｌｆｅｒｔｈ ｅｉｎｅｒ、Ｐ．及びＪ．Ｅ．Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ−Ｍｕｎｏｚ（１９９）Ｃｌ ｉｎｉｃａｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ １５ Ｓｕｐｐ．Ｂ：３７−４８） 。最近、プロトンポンプインヒビター及び単一の抗生物質の組み合わせが十二指 腸潰瘍疾患を改善することが示されている（Ｍａｌｆｅｒｔｈｅｉｎｅｒ、Ｐ． 及びＪ．Ｅ．Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ−Ｍｕｎｏｚ、上記）。しかしながら、抗生物 質剤を用いる方法はこれらの薬剤に耐性である細菌株の出現の問題があることが ある（Ｈｏｐｋｉｎｓ、Ｒ．Ｊ．及びＪ．Ｇ．Ｍｏｒｒｉｓ、上記）。これらの 制約は、インビボでヘリコバクター ピロリ感染と闘うために新しいより効果的 な方法が必要とされていることを示す。特に、この細菌による感染を防ぐことが できる新規なワクチンの設計が非常に望ましい。発明の要約 本発明は微生物ヘリコバクター ピロリ（Ｈ．Ｐｙｌｏｒｉ）からの新規な遺 伝子、例えば細菌の表面タンパク質のようなポリペプチドをコードする遺伝子及 び他の関連遺伝子、それらの産物並びにそれらの用途に関する。本発明の核酸及 びペプチドはヘリコバクター ピロリ及び他のヘリコバクター種の診断法及び治 療に有用性がある。また、サンプル中のヘリコバクター ピロリ及び他のヘリコ バクター種の存在を検出するために用いることができ、そしてヘリコバクター ピロリの生活環を 妨げるかまたはヘリコバクター ピロリの感染を防ぐ能力に関して化合物をスク リーニングすることに使用することもできる。より具体的には、本発明は表面も しくは分泌タンパク質を初めとするヘリコバクター ピロリタンパク質の全コー ディング配列またはそれらの一部に相当する核酸の組成、ヘリコバクター ピロ リタンパク質のｍＲＮＡに結合してタンパク質翻訳を阻止する核酸、並びにペプ チド合成及び組み換えＤＮＡ技術を用いたヘリコバクター ピロリタンパク質ま たはそれらの一部の製造方法に特徴がある。また、本発明はヘリコバクター ピ ロリ感染を検出するための抗体及びプローブとして有用な核酸に特徴もある。さ らに、ヘリコバクター ピロリによる感染に対する防護のためのワクチン組成物 及び方法は本発明の範囲内である。図面の簡単な説明 図１は特定のヘリコバクター ピロリ抗原で免疫後のマウス血清中の抗体価を 示す棒グラフである。 図２は特定のヘリコバクター ピロリ抗原で免疫後のマウス粘膜中の抗体価を 示す棒グラフである。 図３はＨＥＰＥＳバッファーに溶解した特定の抗原を用いたヘリコバクター ピロリ感染マウスの治療免疫を示す棒グラフである。 図４はＤＯＣを含有するバッファーに溶解した特定の抗原を用いたヘリコバク ター ピロリ感染マウスの治療免疫を示す棒グラフである。 図５は組み換えＰＰＩａｓｅの活性を示すグラフである。 図６はヘリコバクター ピロリ抽出物中のＰＰＩａｓｅ活性を示すグラフであ る。 図７はＬ−セリン−Ｏ−スルフェートでのグルタメートラセマーゼ活 性の減少を示すグラフである。 図８は１２個のヘリコバクター ピロリタンパク質の配列の一部のアミノ酸配 列を並べたものを示す（１文字アミノ酸コードで示され、それらのアミノ酸配列 番号により示される；左から右へＮ末端からＣ末端が示される）。 図９は９個のヘリコバクター ピロリタンパク質のＮ末端部分を示す（１文字 アミノ酸コードで示され、それらのアミノ酸配列番号により示される；左から右 へＮ末端からＣ末端が示される）。発明の詳細な説明 １つの態様として、本発明は配列番号４９２のヘリコバクター ピロリポリペ プチドの組み換えまたは実質的に純粋な調製物に特徴がある。また、本発明は配 列番号４９２のヘリコバクター ピロリポリペプチドをコードする実質的に純粋 な核酸も含み、そのような核酸は配列番号１に含まれている。本明細書に記述さ れるヘリコバクター ピロリポリペプチド配列は配列表に含まれ、そしてヘリコ バクター ピロリポリペプチドをコードする核酸は配列表に含まれている。 別の態様として、本発明は配列番号４９２ないし配列番号５４１のヘリコバク ター ピロリポリペプチドからなる群から選択されるヘリコバクター ピロリポ リペプチドの組み換えまたは実質的に純粋な調製物に特徴がある。また、本発明 は配列番号４９２ないし配列番号５４１のヘリコバクター ピロリポリペプチド からなる群から選択されるヘリコバクター ピロリポリペプチドをコードする実 質的に純粋な核酸も含み、そのような核酸は配列番号１ないし配列番号５０に含 まれている。 別の態様として、本発明は配列番号５４２ないし配列番号５９１のヘ リコバクター ピロリポリペプチドからなる群から選択されるヘリコバクター ピロリポリペプチドの組み換えまたは実質的に純粋な調製物に特徴がある。また 、本発明は配列番号５４２ないし配列番号５９１のヘリコバクター ピロリポリ ペプチドからなる群から選択されるヘリコバクター ピロリポリペプチドをコー ドする実質的に純粋な核酸も含み、そのような核酸は配列番号５１ないし配列番 号１００に含まれている。 別の態様として、本発明は配列番号５９２ないし配列番号６４１のヘリコバク ター ピロリポリペプチドからなる群から選択されるヘリコバクター ピロリポ リペプチドの組み換えまたは実質的に純粋な調製物に特徴がある。また、本発明 は配列番号５９２ないし配列番号６４１のヘリコバクター ピロリポリペプチド からなる群から選択されるヘリコバクター ピロリポリペプチドをコードする実 質的に純粋な核酸も含み、そのような核酸は配列番号１０１ないし配列番号１５ ０に含まれている。 別の態様として、本発明は配列番号６４２ないし配列番号６９１のヘリコバク ター ピロリポリペプチドからなる群から選択されるヘリコバクター ピロリポ リペプチドの組み換えまたは実質的に純粋な調製物に特徴がある。また、本発明 は配列番号６４２ないし配列番号６９１のヘリコバクター ピロリポリペプチド からなる群から選択されるヘリコバクター ピロリポリペプチドをコードする実 質的に純粋な核酸も含み、そのような核酸は配列番号１５１ないし配列番号２０ ０に含まれている。 別の態様として、本発明は配列番号６９２ないし配列番号７４１のヘリコバク ター ピロリポリペプチドからなる群から選択されるヘリコバクター ピロリポ リペプチドの組み換えまたは実質的に純粋な調製物に特徴がある。また、本発明 は配列番号６９２ないし配列番号７４１のヘ リコバクター ピロリポリペプチドからなる群から選択されるヘリコバクター ピロリポリペプチドをコードする実質的に純粋な核酸も含み、そのような核酸は 配列番号２０１ないし配列番号２５０に含まれている。 別の態様として、本発明は配列番号７４２ないし配列番号７５９、配列番号７ ６１、配列番号７６３、配列番号７６５ないし配列番号７９１のヘリコバクター ピロリポリペプチドからなる群から選択されるヘリコバクター ピロリポリペ プチドの組み換えまたは実質的に純粋な調製物に特徴がある。また、本発明は配 列番号配列番号７４２ないし配列番号７５９、配列番号７６１、配列番号７６３ 、配列番号７６５ないし配列番号７９１のヘリコバクター ピロリポリペプチド からなる群から選択されるヘリコバクター ピロリポリペプチドをコードする実 質的に純粋な核酸も含み、そのような核酸は配列番号２５１ないし配列番号２６ ８、配列番号２７０、配列番号２７２及び配列番号２７４ないし配列番号３００ に含まれている。 別の態様として、本発明は配列番号７９２ないし配列番号８１８及び配列番号 ８２０ないし配列番号８４１のヘリコバクター ピロリポリペプチドからなる群 から選択されるヘリコバクター ピロリポリペプチドの組み換えまたは実質的に 純粋な調製物に特徴がある。また、本発明は配列番号７９２ないし配列番号８１ ８及び配列番号８２０ないし配列番号８４１のヘリコバクター ピロリポリペプ チドからなる群から選択されるヘリコバクター ピロリポリペプチドをコードす る実質的に純粋な核酸も含み、そのような核酸は配列番号３０１ないし配列番号 ３２７及び配列番号３２９ないし配列番号３５０に含まれている。 別の態様として、本発明は配列番号８４２ないし配列番号８４６及び 配列番号８４８ないし配列番号８９１のヘリコバクター ピロリポリペプチドか らなる群から選択されるヘリコバクター ピロリポリペプチドの組み換えまたは 実質的に純粋な調製物に特徴がある。また、本発明は配列番号８４２ないし配列 番号８４６及び配列番号８４８ないし８９１のヘリコバクター ピロリポリペプ チドからなる群から選択されるヘリコバクター ピロリポリペプチドをコードす る実質的に純粋な核酸も含み、そのような核酸は配列番号３５１ないし配列番号 ３６４及び配列番号３６６ないし配列番号４００に含まれている。 別の態様として、本発明は配列番号８９２ないし配列番号８９６及び配列番号 ８９８ないし配列番号９４１のヘリコバクター ピロリポリペプチドからなる群 から選択されるヘリコバクター ピロリポリペプチドの組み換えまたは実質的に 純粋な調製物に特徴がある。また、本発明は配列番号８９２ないし配列番号８９ ６及び配列番号８９８ないし配列番号９４１のヘリコバクター ピロリポリペプ チドからなる群から選択されるヘリコバクター ピロリポリペプチドをコードす る実質的に純粋な核酸も含み、そのような核酸は配列番号４０１ないし配列番号 ４０５及び配列番号４０７ないし配列番号４５０に含まれている。 別の態様として、本発明は配列番号９４２ないし配列番号９６３及び配列番号 ９６６ないし配列番号９８２のヘリコバクター ピロリポリペプチドからなる群 から選択されるヘリコバクター ピロリポリペプチドの組み換えまたは実質的に 純粋な調製物に特徴がある。また、本発明は配列番号９４２ないし配列番号９６ ３及び配列番号９６６ないし配列番号９８２のヘリコバクター ピロリポリペプ チドからなる群から選択されるヘリコバクター ピロリポリペプチドをコードす る実質的に純粋な 核酸も含み、そのような核酸は配列番号４５１ないし配列番号４７２及び配列番 号４７５ないし配列番号４９１に含まれている。 別の態様として、本発明は配列番号１０３７、配列番号１０３８、配列番号１ ０４１ないし配列番号１０８７及び配列番号１０９０のヘリコバクター ピロリ ポリペプチドからなる群から選択されるヘリコバクター ピロリポリペプチドの 組み換えまたは実質的に純粋な調製物に特徴がある。また、本発明は配列番号１ ０３７、配列番号１０３８、配列番号１０４１ないし配列番号１０８７及び配列 番号１０９０のヘリコバクター ピロリポリペプチドからなる群から選択される ヘリコバクターピロリポリペプチドをコードする実質的に純粋な核酸も含み、そ のような核酸は配列番号９８３、配列番号９８４、配列番号９８７ないし配列番 号１０３３及び配列番号１０３６に含まれている。 別の態様として、本発明は配列番号１２９６ないし配列番号１２９８のヘリコ バクター ピロリポリペプチドからなる群から選択されるヘリコバクター ピロ リポリペプチドの組み換えまたは実質的に純粋な調製物に特徴がある。また、本 発明は配列番号１２９６ないし配列番号１２９８のヘリコバクター ピロリポリ ペプチドからなる群から選択されるヘリコバクター ピロリポリペプチドをコー ドする実質的に純粋な核酸も含み、そのような核酸は配列番号１２９３ないし配 列番号１２９５に含まれている。 別の態様として、本発明は配列表に示されるようなヘリコバクターピロリポリ ペプチドからなる群から選択されるヘリコバクター ピロリポリペプチドの組み 換えまたは実質的に純粋な調製物に特徴がある。また、本発明は配列表に示され るようなヘリコバクター ピロリポリペプ チドからなる群から選択されるヘリコバクター ピロリポリペプチドをコードす る実質的に純粋な核酸も含む。本発明は定められた配列番号により配列表に同定 されるようなヘリコバクター ピロリポリペプチド及びそのようなポリペプチド をコードする核酸の各々を包含すると理解すべきである。例えば、代表的なヘリ コバクター ピロリポリペプチドは配列番号４９４に含まれている。従って、本 発明は配列番号４９４のヘリコバクター ピロリポリペプチドの組み換えまたは 実質的に純粋な調製物を包含する。また、本発明は配列番号４９４のヘリコバク ター ピロリポリペプチドをコードする実質的に純粋な核酸も含む。 別の態様として、本発明は上に同定されたヘリコバクター ピロリポリペプチ ド（例えば、配列番号５４２−配列番号５９１）または核酸（例えば、配列番号 ５１−配列番号１００）の群からのあらゆる個々のヘリコバクター ピロリポリ ペプチドメンバーまたはそのようなメンバーをコードする核酸、並びに上に同定 された群内のあらゆる亜群に関する。さらに、好ましくは亜群は上に同定された 群のいずれかの１、３、５、１０、１５、２０、３０または４０個のメンバー並 びにこれらのあらゆる組み合わせからなることができる。例えば、配列番号６９ ２ないし配列番号７４１のヘリコバクター ピロリポリペプチドからなる群を以 下、すなわち、配列番号６９２−配列番号６８０、配列番号６８１−配列番号７ １０、配列番号７１１−配列番号７３０、配列番号７３１−配列番号７４１また はこれらのあらゆる組み合わせのように１つまたはそれ以上の亜群に分けること ができる。 特に好ましいものはヘリコバクター ピロリ細胞エンベロープポリペプチドま たはそのフラグメントをコードするヌクレオチド配列を含んで なる単離された核酸である。そのような核酸は配列番号２５５、配列番号２６３ 、配列番号２６６、配列番号２７７、配列番号２８０、配列番号２８５、配列番 号２９２、配列番号２９４、配列番号２９９、配列番号３１１、配列番号３１２ 、配列番号３１３、配列番号３２１、配列番号３２７、配列番号３２９、配列番 号３３１、配列番号３５３、配列番号３６４、配列番号３６６、配列番号３６８ 、配列番号３７５、配列番号３８４、配列番号３９１、配列番号３９２、配列番 号３９７、配列番号３９８、配列番号４０２、配列番号４０４、配列番号４０９ 、配列番号４１０、配列番号４１２、配列番号４２７、配列番号４３３、配列番 号４３４、配列番号４４１、配列番号４４４、配列番号４４５、配列番号４４９ 、配列番号４５０、配列番号４５２、配列番号４５３、配列番号４６６、配列番 号４６８、配列番号４６９、配列番号９８３、配列番号９８９、配列番号１００ ８、配列番号１０１１、配列番号１０１４、配列番号１０１５、配列番号１０２ ９、配列番号１０３２、配列番号２５９、配列番号２８６、配列番号３２６、配 列番号３７４、配列番号３９９、配列番号４２２、配列番号４５４、配列番号４ ６５、配列番号９９８、配列番号１００９、配列番号１０２３、配列番号１２９ ４、配列番号１２９５、配列番号３１９、配列番号３２５、配列番号４２５、配 列番号４３７、配列番号４３８、配列番号４４７、配列番号４４８、配列番号４ ６７、配列番号９９６、配列番号１０２７、配列番号１０３１、配列番号２５４ 、配列番号３５２、配列番号４１５、配列番号１０１９、配列番号３８１、配列 番号３８９、配列番号１０１０、配列番号１０１２、配列番号３５４、配列番号 ３７２、配列番号４００、配列番号４２１、配列番号１０２２、配列番号４６３ 、配列番号２８１、配列番号９ ８８、配列番号４１１、配列番号４０７、配列番号１０１７、配列番号２９０、 配列番号４１７、配列番号４３０、配列番号９９２、配列番号１０２５、配列番 号４７７、配列番号４１４、配列番号２５３、配列番号２９３、配列番号３３４ 、配列番号３４３、配列番号４１８、配列番号４２４及び配列番号４４３からな る群から選択される。 別の態様として、ヘリコバクター ピロリ細胞エンベロープポリペプチドまた はそのフラグメントは配列番号２５５、配列番号２６３、配列番号２６６、配列 番号２７７、配列番号２８０、配列番号２８５、配列番号２９２、配列番号２９ ４、配列番号２９９、配列番号３１１、配列番号３１２、配列番号３１３、配列 番号３２１、配列番号３２７、配列番号３２９、配列番号３３１、配列番号３５ ３、配列番号３６４、配列番号３６６、配列番号３６８、配列番号３７５、配列 番号３８４、配列番号３９１、配列番号３９２、配列番号３９７、配列番号３９ ８、配列番号４０２、配列番号４０４、配列番号４０９、配列番号４１０、配列 番号４１２、配列番号４２７、配列番号４３３、配列番号４３４、配列番号４４ １、配列番号４４４、配列番号４４５、配列番号４４９、配列番号４５０、配列 番号４５２、配列番号４５３、配列番号４６６、配列番号４６８、配列番号４６ ９、配列番号９８３、配列番号９８９、配列番号１００８、配列番号１０１１、 配列番号１０１４、配列番号１０１５、配列番号１０２９、配列番号１０３２、 配列番号２５９、配列番号２８６、配列番号３２６、配列番号３７４、配列番号 ３９９、配列番号４２２、配列番号４５４、配列番号４６５、配列番号９９８、 配列番号１００９、配列番号１０２３、配列番号１２９４、配列番号１２９５、 配列番号３１９、配列番号３２５、配列番号４２５、配列番号４３７、 配列番号４３８、配列番号４４７、配列番号４４８、配列番号４６７、配列番号 ９９６、配列番号１０２７、配列番号１０３１、配列番号２５４、配列番号３５ ２、配列番号４１５、配列番号１０１９、配列番号３８１、配列番号３８９、配 列番号１０１０及び配列番号１０１２からなる群から選択される核酸によりコー ドされるヘリコバクター ピロリ外膜ポリペプチドまたはそのフラグメントであ る。 別の態様として、ヘリコバクター ピロリ外膜ポリペプチドまたはそのフラグ メントは配列番号２５５、配列番号２６３、配列番号２６６、配列番号２７７、 配列番号２８０、配列番号２８５、配列番号２９２、配列番号２９４、配列番号 ２９９、配列番号３１１、配列番号３１２、配列番号３１３、配列番号３２１、 配列番号３２７、配列番号３２９、配列番号３３１、配列番号３５３、配列番号 ３６４、配列番号３６６、配列番号３６８、配列番号３７５、配列番号３８４、 配列番号３９１、配列番号３９２、配列番号３９７、配列番号３９８、配列番号 ４０２、配列番号４０４、配列番号４０９、配列番号４１０、配列番号４１２、 配列番号４２７、配列番号４３３、配列番号４３４、配列番号４４１、配列番号 ４４４、配列番号４４５、配列番号４４９、配列番号４５０、配列番号４５２、 配列番号４５３、配列番号４６６、配列番号４６８、配列番号４６９、配列番号 ９８３、配列番号９８９、配列番号１００８、配列番号１０１１、配列番号１０ １４、配列番号１０１５、配列番号１０２９及び配列番号１０３２からなる群か ら選択される核酸によりコードされる末端フェニルアラニン残基を有するヘリコ バクター ピロリポリペプチドまたはそのフラグメントである。 別の態様として、ヘリコバクター ピロリ外膜ポリペプチドまたはそ のフラグメントは配列番号２８６、配列番号３２６、配列番号３７４、配列番号 ３９９、配列番号４２２、配列番号４５４、配列番号４６５、配列番号９９８、 配列番号１００９、配列番号１０２３、配列番号１２９４及び配列番号１２９５ からなる群から選択される核酸によりコードされるＣ末端チロシンクラスターを 有するヘリコバクター ピロリポリペプチドまたはそのフラグメントである。 別の態様として、ヘリコバクター ピロリ外膜ポリペプチドまたはそのフラグ メントは配列番号３１９、配列番号３２５、配列番号４２５、配列番号４３７、 配列番号４３８、配列番号４４７、配列番号４４８、配列番号４６７、配列番号 ９９６、配列番号１０２７及び配列番号１０３１からなる群から選択される核酸 によりコードされる末端フェニルアラニン残基及びＣ末端チロシンクラスターを 有するヘリコバクター ピロリポリペプチドまたはそのフラグメントである。 別の態様として、ヘリコバクター ピロリ細胞エンベロープポリペプチドまた はそのフラグメントは配列番号３５４、配列番号３７２、配列番号４００、配列 番号４２１、配列番号１０２２、配列番号４６３、配列番号２８１、配列番号９ ８８、配列番号４１１、配列番号４０７、配列番号１０１７、配列番号２９０、 配列番号４１７、配列番号４３０、配列番号９９２及び配列番号１０２５からな る群から選択される核酸によりコードされるヘリコバクター ピロリ内膜ポリペ プチドまたはそのフラグメントである。 別の態様として、ヘリコバクター ピロリ内膜ポリペプチドまたはそのフラグ メントは配列番号３５４のヌクレオチド配列を含んでなる核酸によりコードされ る外膜及び細胞壁合成に関与するヘリコバクター ピ ロリポリペプチドまたはそのフラグメントである。 別の態様として、ヘリコバクター ピロリ内膜ポリペプチドまたはそのフラグ メントは配列番号３７２、配列番号４００、配列番号４２１及び配列１０２２か らなる群から選択される核酸によりコードされるエネルギー転化に関与するヘリ コバクター ピロリポリペプチドまたはそのフラグメントである。 別の態様として、ヘリコバクター ピロリ内膜ポリペプチドまたはそのフラグ メントは配列番号４６３のヌクレオチド配列を含んでなる核酸によりコードされ る補因子代謝に関与するヘリコバクター ピロリポリペプチドまたはそのフラグ メントである。 別の態様として、ヘリコバクター ピロリ内膜ポリペプチドまたはそのフラグ メントは配列番号２８１及び配列番号９８８からなる群から選択される核酸によ りコードされる分泌または接着に関与するヘリコバクター ピロリポリペプチド またはそのフラグメントである。 別の態様として、ヘリコバクター ピロリ内膜ポリペプチドまたはそのフラグ メントは配列番号４０７及び配列番号１０１７からなる群から選択される核酸に よりコードされる輸送に関与するヘリコバクター ピロリポリペプチドまたはそ のフラグメントである。 別の態様として、ヘリコバクター ピロリ細胞エンベロープポリペプチドまた はそのフラグメントは配列番号４７７のヌクレオチド配列を含んでなる核酸によ りコードされるヘリコバクター ピロリ鞭毛ポリペプチドまたはそのフラグメン トである。 別の態様として、ヘリコバクター ピロリ細胞エンベロープポリペプチドまた はそのフラグメントは配列番号４１４のヌクレオチド配列を含 んでなる核酸によりコードされるヘリコバクター ピロリ輸送ポリペプチドまた はそのフラグメントである。 特に好ましいものはヘリコバクター ピロリ細胞質ポリペプチドまたはそのフ ラグメントをコードするヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸である。 そのような核酸は配列番号４７０、配列番号１０３３、配列番号３５７、配列番 号４５７、配列番号４６１、配列番号１０３０、配列番号３４５、配列番号３８ ３、配列番号３８７、配列番号４５５、配列番号１００３、配列番号３５１、配 列番号４１６、配列番号２７８、配列番号３３５、配列番号３４６、配列番号３ ５０、配列番号４１９、配列番号４６０、配列番号４７２、配列番号１０００、 配列番号１００４、配列番号１０２０、配列番号１２９３、配列番号３１８、配 列番号３２２、配列番号３２４、配列番号３３０、配列番号３４７、配列番号４ ４０、配列番号４４６、配列番号４６４、配列番号４９０、配列番号４９１、配 列番号９９５、配列番号９９７、配列番号１００５及び配列番号１０２８からな る群から選択される。 別の態様として、ヘリコバクター ピロリ細胞質ポリペプチドまたはそのフラ グメントは配列番号４７０及び配列番号１０３３からなる群から選択される核酸 によりコードされるエネルギー転化に関与するヘリコバクター ピロリポリペプ チドまたはそのフラグメントである。 別の態様として、ヘリコバクター ピロリ細胞質ポリペプチドまたはそのフラ グメントは配列番号３５７及び配列番号４５７からなる群から選択される核酸に よりコードされるアミノ酸代謝及び輸送に関与するへリコバクター ピロリポリ ペプチドまたはそのフラグメントである。 別の態様として、ヘリコバクター ピロリ細胞質ポリペプチドまたは そのフラグメントは配列番号４６１及び配列１０３０からなる群から選択される 核酸によりコードされるヌクレオチド代謝及び輸送に関与するヘリコバクター ピロリポリペプチドまたはそのフラグメントである。 別の態様として、ヘリコバクター ピロリ細胞質ポリペプチドまたはそのフラ グメントは配列番号３４５、配列番号３８３、配列番号３８７、配列番号４５５ 及び配列番号１００３からなる群から選択される核酸によりコードされる補因子 代謝に関与するヘリコバクター ピロリポリペプチドまたはそのフラグメントで ある。 別の態様として、ヘリコバクター ピロリ細胞質ポリペプチドまたはそのフラ グメントは配列番号３５１及び配列番号４１６からなる群から選択される核酸に よりコードされる脂質代謝に関与するヘリコバクター ピロリポリペプチドまた はそのフラグメントである。 別の態様として、ヘリコバクター ピロリ細胞質ポリペプチドまたはそのフラ グメントは配列番号２７８、配列番号３３５、配列番号３４６、配列番号３５０ 、配列番号４１９、配列番号４６０、配列番号４７２、配列番号１０００、配列 番号１００４、配列番号１０２０及び配列番号１２９３からなる群から選択され る核酸によりコードされるゲノム複製、転写、組み換え及び修復に関与するヘリ コバクター ピロリポリペプチドまたはそのフラグメントである。 特に好ましいものはヘリコバクター ピロリ分泌ポリペプチドまたはそのフラ グメントをコードするヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸である。そ のような核酸は配列番号３５５、配列番号１００６、配列番号２５７、配列番号 ２５８、配列番号２６０、配列番号２６１、配列番号２６４、配列番号２６５、 配列番号２６８、配列番号２７０、 配列番号２７２、配列番号２７４、配列番号２７５、配列番号２７６、配列番号 ２７９、配列番号２８３、配列番号２８４、配列番号２８７、配列番号２８８、 配列番号２８９、配列番号２９１、配列番号２９５、配列番号２９６、配列番号 ２９７、配列番号２９８、配列番号３００、配列番号３０１、配列番号３０２、 配列番号３０３、配列番号３０４、配列番号３０５、配列番号３１４、配列番号 ３１５、配列番号３２３、配列番号３３８、配列番号３４２、配列番号３４８、 配列番号３４９、配列番号３５６、配列番号３５８、配列番号３５９、配列番号 ３６０、配列番号３６１、配列番号３６２、配列番号３６３、配列番号３６７、 配列番号３７０、配列番号３７１、配列番号３７３、配列番号３７７、配列番号 ３７８、配列番号３７９、配列番号３８０、配列番号３８８、配列番号３９０、 配列番号３９４、配列番号３９５、配列番号３９６、配列番号４０１、配列番号 ４０３、配列番号４０５、配列番号４０８、配列番号４２０、配列番号４２６、 配列番号４２８、配列番号４２９、配列番号４３２、配列番号４３９、配列番号 ４４２、配列番号４５１、配列番号４７１、配列番号４７８、配列番号４８８、 配列番号９８７、配列番号９９０、配列番号９９１、配列番号９９３、配列番号 １００１、配列番号１００２、配列番号１００７、配列番号１０１３、配列番号 １０１６、配列番号１０１８、配列番号１０２１及び配列番号１０２６からなる 群から選択される。 別の態様として、ヘリコバクター ピロリ分泌ポリペプチドまたはそのフラグ メントは配列番号３５５及び配列番号１００６からなる群から選択される核酸に よりコードされる分泌及び接着に関与するヘリコバクター ピロリポリペプチド またはそのフラグメントである。 特に好ましいものはヘリコバクター ピロリ細胞ポリペプチドまたはそのフラ グメントをコードするヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸である。そ のような核酸は配列番号２５６、配列番号２６７、配列番号２８２、配列番号３ ０６、配列番号３０７、配列番号３０８、配列番号３０９、配列番号３１０、配 列番号３１６、配列番号３１７、配列番号３３２、配列番号３３３、配列番号３ ３６、配列番号３３７、配列番号３３９、配列番号３４０、配列番号３４１、配 列番号３４４、配列番号３６９、配列番号３７６、配列番号３８２、配列番号３ ８６、配列番号４２３、配列番号４３１、配列番号４３５、配列番号４３６、配 列番号４５８、配列番号４６２、配列番号４７５、配列番号４７６、配列番号４ ７９、配列番号４８０、配列番号４８１、配列番号４８２、配列番号４８３、配 列番号４８４、配列番号４８５、配列番号４８６、配列番号４８７、配列番号４ ８９、配列番号９８４、配列番号９９４、配列番号１０２４及び配列番号１０３ ６からなる群から選択される。 特に好ましいものは、ポリペプチドが配列番号７４６、配列番号７５４、配列 番号７５７、配列番号７６８、配列番号７７１、配列番号７７６、配列番号７８ ３、配列番号７８５、配列番号７９０、配列番号８０２、配列番号８０３、配列 番号８０４、配列番号８１２、配列番号８１８、配列番号８２０、配列番号８８ ２、配列番号８４４、配列番号８５５、配列番号８５７、配列番号８５９、配列 番号８６６、配列番号８７５、配列番号８８２、配列番号８８３、配列番号８８ ８、配列番号８８９、配列番号８９３、配列番号８９５、配列番号９００、配列 番号９０１、配列番号９０３、配列番号９１８、配列番号９２４、配列番号９２ ５、配列番号９３２、配列番号９３５、配列番号９３６、配列番号９４ ０、配列番号９４１、配列番号９４３、配列番号９４４、配列番号９５７、配列 番号９５９、配列番号９６０、配列番号１０３７、配列番号１０４３、配列番号 １０６２、配列番号１０６５、配列番号１０６８、配列番号１０６９、配列番号 １０８３、配列番号１０８６、配列番号７５０、配列番号７７７、配列番号８１ ７、配列番号８６５、配列番号８９０、配列番号９１３、配列番号９４５、配列 番号９５６、配列番号１０５２、配列番号１０６３、配列番号１０７７、配列番 号１２９７、配列番号１２９８、配列番号８１０、配列番号８１６、配列番号９ １６、配列番号９２８、配列番号９２９、配列番号９３８、配列番号９３９、配 列番号９５８、配列番号１０５０、配列番号１０８１、配列番号１０８５、配列 番号７４５、配列番号８４３、配列番号９０６、配列番号１０７３、配列番号８ ７２、配列番号８８０、配列番号１０６４、配列番号１０６６、配列番号８４５ 、配列番号８６３、配列番号８９１、配列番号９１２、配列番号１０７６、配列 番号９５４、配列番号７７２、配列番号１０４２、配列番号９０２、配列番号８ ９８、配列番号１０７１、配列番号７８１、配列番号９０８、配列番号９２１、 配列番号１０４６、配列番号１０７９、配列番号９６８、配列番号９０５、配列 番号７４４、配列番号７８４、配列番号８２５、配列番号８３４、配列番号９０ ９、配列番号９１５及び配列番号９３４からなる群から選択される、精製または 単離されたヘリコバクター ピロリ細胞エンベロープポリペプチドまたはそのフ ラグメントである。 別の態様として、ヘリコバクター ピロリ細胞エンベロープポリペプチドまた はそのフラグメントは配列番号７４６、配列番号７５４、配列番号７５７、配列 番号７６８、配列番号７７１、配列番号７７６、配列 番号７８３、配列番号７８５、配列番号７９０、配列番号８０２、配列番号８０ ３、配列番号８０４、配列番号８１２、配列番号８１８、配列番号８２０、配列 番号８８２、配列番号８４４、配列番号８５５、配列番号８５７、配列番号８５ ９、配列番号８６６、配列番号８７５、配列番号８８２、配列番号８８３、配列 番号８８８、配列番号８８９、配列番号８９３、配列番号８９５、配列番号９０ ０、配列番号９０１、配列番号９０３、配列番号９１８、配列番号９２４、配列 番号９２５、配列番号９３２、配列番号９３５、配列番号９３６、配列番号９４ ０、配列番号９４１、配列番号９４３、配列番号９４４、配列番号９５７、配列 番号９５９、配列番号９６０、配列番号１０３７、配列番号１０４３、配列番号 １０６２、配列番号１０６５、配列番号１０６８、配列番号１０６９、配列番号 １０８３、配列番号１０８６、配列番号７５０、配列番号７７７、配列番号８１ ７、配列番号８６５、配列番号８９０、配列番号９１３、配列番号９４５、配列 番号９５６、配列番号１０５２、配列番号１０６３、配列番号１０７７、配列番 号１２９７、配列番号１２９８、配列番号８１０、配列番号８１６、配列番号９ １６、配列番号９２８、配列番号９２９、配列番号９３８、配列番号９３９、配 列番号９５８、配列番号１０５０、配列番号１０８１、配列番号１０８５、配列 番号７４５、配列番号８４３、配列番号９０６、配列番号１０７３、配列番号８ ７２、配列番号８８０、配列番号１０６４及び配列番号１０６６からなる群から 選択されるヘリコバクター ピロリ外膜ポリペプチドまたはそのフラグメントで ある。 別の態様として、ヘリコバクター ピロリ外膜ポリペプチドまたはそのフラグ メントは配列番号７４６、配列番号７５４、配列番号７５７、 配列番号７６８、配列番号７７１、配列番号７７６、配列番号７８３、配列番号 ７８５、配列番号７９０、配列番号８０２、配列番号８０３、配列番号８０４、 配列番号８１２、配列番号８１８、配列番号８２０、配列番号８８２、配列番号 ８４４、配列番号８５５、配列番号８５７、配列番号８５９、配列番号８６６、 配列番号８７５、配列番号８８２、配列番号８８３、配列番号８８８、配列番号 ８８９、配列番号８９３、配列番号８９５、配列番号９００、配列番号９０１、 配列番号９０３、配列番号９１８、配列番号９２４、配列番号９２５、配列番号 ９３２、配列番号９３５、配列番号９３６、配列番号９４０、配列番号９４１、 配列番号９４３、配列番号９４４、配列番号９５７、配列番号９５９、配列番号 ９６０、配列番号１０３７、配列番号１０４３、配列番号１０６２、配列番号１ ０６５、配列番号１０６８、配列番号１０６９、配列番号１０８３及び配列番号 １０８６からなる群から選択される末端フェニルアラニン残基を有するヘリコバ クター ピロリポリペプチドまたはそのフラグメントである。 別の態様として、ヘリコバクター ピロリ外膜ポリペプチドまたはそのフラグ メントは配列番号７７７、配列番号８１７、配列番号８６５、配列番号８９０、 配列番号９１３、配列番号９４５、配列番号９５６、配列番号１０５２、配列番 号１０６３、配列番号１０７７、配列番号１２９７及び及び配列番号１２９８か らなる群から選択されるＣ末端チロシンクラスターを有するヘリコバクター ピ ロリポリペプチドまたはそのフラグメントである。 別の態様として、ヘリコバクター ピロリ外膜ポリペプチドまたはそのフラグ メントは配列番号８１０、配列番号８１６、配列番号９１６、 配列番号９２８、配列番号９２９、配列番号９３８、配列番号９３９、配列番号 ９５８、配列番号１０５０、配列番号１０８１及び配列番号１０８５からなる群 から選択される末端フェニルアラニン残基及びＣ末端チロシンクラスターを有す るヘリコバクター ピロリポリペプチドまたはそのフラグメントである。 別の態様として、ヘリコバクター ピロリ細胞エンベロープポリペプチドまた はそのフラグメントは配列番号８４５、配列番号８６３、配列番号８９１、配列 番号９１２、配列番号１０７６、配列番号９５４、配列番号７７２、配列番号１ ０４２、配列番号９０２、配列番号８９８、配列番号１０７１、配列番号７８１ 、配列番号９０８、配列番号９２１、配列番号１０４６及び配列１０７９からな る群から選択されるヘリコバクター ピロリ内膜ポリペプチドまたはそのフラグ メントである。 別の態様として、ヘリコバクター ピロリ内膜ポリペプチドまたはそのフラグ メントは配列番号８４５のアミノ酸配列を含んでなる外膜及び細胞壁合成に関与 するヘリコバクター ピロリポリペプチドまたはそのフラグメントである。 別の態様として、ヘリコバクター ピロリ内膜ポリペプチドまたはそのフラグ メントは配列番号８６３、配列番号８９１、配列番号９１２及び配列番号１０７ ６からなる群から選択されるエネルギー転化に関与するヘリコバクター ピロリ ポリペプチドまたはそのフラグメントである。 別の態様として、ヘリコバクター ピロリ内膜ポリペプチドまたはそのフラグ メントは配列番号９５４のアミノ酸配列を含んでなる補因子代謝に関与するヘリ コバクター ピロリポリペプチドまたはそのフラグメントである。 別の態様として、ヘリコバクター ピロリ内膜ポリペプチドまたはそのフラグ メントは配列番号７７２及び配列番号１０４２からなる群から選択される分泌ま たは接着に関与するヘリコバクター ピロリポリペプチドまたはそのフラグメン トである。 別の態様として、ヘリコバクター ピロリ内膜ポリペプチドまたはそのフラグ メントは配列番号８９８及び配列番号１０７１からなる群から選択される輸送に 関与するヘリコバクター ピロリポリペプチドまたはそのフラグメントである。 別の態様として、ヘリコバクター ピロリ細胞エンベロープポリペプチドまた はそのフラグメントは配列番号９６８のアミノ酸配列を含んでなるヘリコバクタ ー ピロリ鞭毛ポリペプチドまたはそのフラグメントである。 別の態様として、ヘリコバクター ピロリ細胞エンベロープポリペプチドまた はそのフラグメントは配列番号９０５のアミノ酸配列を含んでなるヘリコバクタ ー ピロリ輸送ポリペプチドまたはそのフラグメントである。 特に好ましいものは、ポリペプチドが配列番号９６１、配列番号１０８７、配 列番号８４８、配列番号９４８、配列番号９５２、配列番号１０８４、配列番号 ８３６、配列番号８７４、配列番号８７８、配列番号９４６、配列番号１０５７ 、配列番号８４２、配列番号９０７、配列番号７６９、配列番号８２６、配列番 号８３７、配列番号８４１、配列番号９１０、配列番号９５１、配列番号９６３ 、配列番号１０５４、配列番号１０５８、配列番号１０７４、配列番号１２９６ 、配列番号８０９、配列番号８１３、配列番号８１５、配列番号８２１、配列番 号８３８、 配列番号９３１、配列番号９３７、配列番号９５５、配列番号９８１、配列番号 ９８２、配列番号１０４９、配列番号１０５１、配列番号１０５９及び配列番号 １０８２からなる群から選択される、精製または単離されたヘリコバクター ピ ロリ細胞質ポリペプチドまたはそのフラグメントである。 別の態様として、ヘリコバクター ピロリ細胞質ポリペプチドまたはそのフラ グメントは配列番号９６１及び配列番号１０８７からなる群から選択されるエネ ルギー転化に関与するヘリコバクター ピロリポリペプチドまたはそのフラグメ ントである。 別の態様として、ヘリコバクター ピロリ細胞質ポリペプチドまたはそのフラ グメントは配列番号８４８及び配列番号９４８からなる群から選択されるアミノ 酸代謝及び輸送に関与するヘリコバクター ピロリポリペプチドまたはそのフラ グメントである。 別の態様として、ヘリコバクター ピロリ細胞質ポリペプチドまたはそのフラ グメントは配列番号９５２及び配列１０８４からなる群から選択されるヌクレオ チド代謝及び輸送に関与するヘリコバクター ピロリポリペプチドまたはそのフ ラグメントである。 別の態様として、ヘリコバクター ピロリ細胞質ポリペプチドまたはそのフラ グメントは配列番号８３６、配列番号８７４、配列番号８７８、配列番号９４６ 及び配列番号１０５７からなる群から選択される補因子代謝に関与するヘリコバ クター ピロリポリペプチドまたはそのフラグメントである。 別の態様として、ヘリコバクター ピロリ細胞質ポリペプチドまたはそのフラ グメントは配列番号８４２、配列番号９０７からなる群から選 択される脂質代謝に関与するヘリコバクター ピロリポリペプチドまたはそのフ ラグメントである。 別の態様として、ヘリコバクター ピロリ細胞質ポリペプチドまたはそのフラ グメントは配列番号７６９、配列番号８２６、配列番号８３７、配列番号８４１ 、配列番号９１０、配列番号９５１、配列番号９６３、配列番号１０５４、配列 番号１０５８、配列番号１０７４及び配列番号１２９６からなる群から選択され るゲノム複製、転写、組み換え及び修復に関与するヘリコバクター ピロリポリ ペプチドまたはそのフラグメントである。 特に好ましいものは、ポリペプチドが配列番号８４６、配列番号１０６０、配 列番号７４８、配列番号７４９、配列番号７５１、配列番号７５２、配列番号７ ５５、配列番号７５６、配列番号７５９、配列番号７６１、配列番号７６３、配 列番号７６５、配列番号７６６、配列番号７６７、配列番号７７０、配列番号７ ７４、配列番号７７５、配列番号７７８、配列番号７７９、配列番号７８０、配 列番号７８２、配列番号７８６、配列番号７８７、配列番号７８８、配列番号７ ８９、配列番号７９１、配列番号７９２、配列番号７９３、配列番号７９４、配 列番号７９５、配列番号７９６、配列番号８０５、配列番号８０６、配列番号８ １４、配列番号８２９、配列番号８３３、配列番号８３９、配列番号８４０、配 列番号８４７、配列番号８４９、配列番号８５０、配列番号８５１、配列番号８ ５２、配列番号８５３、配列番号８５４、配列番号８５８、配列番号８６１、配 列番号８６２、配列番号８６４、配列番号８６８、配列番号８６９、配列番号８ ７０、配列番号８７１、配列番号８７９、配列番号８８１、配列番号８８５、配 列番号８８６、配列番号８ ８７、配列番号８９２、配列番号８９４、配列番号８９６、配列番号８９９、配 列番号９１１、配列番号９１７、配列番号９１９、配列番号９２０、配列番号９ ２３、配列番号９３０、配列番号９３３、配列番号９４２、配列番号９６２、配 列番号９６９、配列番号９７９、配列番号１０４１、配列番号１０４４、配列番 号１０４５、配列番号１０４７、配列番号１０５５、配列番号１０５６、配列番 号１０６１、配列番号１０６７、配列番号１０７０、配列番号１０７２、配列番 号１０７５及び配列番号１０８０からなる群から選択される、精製または単離さ れたヘリコバクター ピロリ分泌ポリペプチドまたはそのフラグメントである。 別の態様として、ヘリコバクター ピロリ分泌ポリペプチドまたはそのフラグ メントは配列番号８４６及び配列番号１０６０からなる群から選択される分泌及 び接着に関与するヘリコバクター ピロリポリペプチドまたはそのフラグメント である。 特に好ましいものは、ポリペプチドが配列番号７４７、配列番号７５８、配列 番号７７３、配列番号７９７、配列番号７９８、配列番号７９９、配列番号８０ ０、配列番号８０１、配列番号８０７、配列番号８０８、配列番号８２３、配列 番号８２４、配列番号８２７、配列番号８２８、配列番号８３０、配列番号８３ １、配列番号８３２、配列番号８３５、配列番号８６０、配列番号８６７、配列 番号８７３、配列番号８７７、配列番号９１４、配列番号９２２、配列番号９２ ６、配列番号９２７、配列番号９４９、配列番号９５３、配列番号９６６、配列 番号９６７、配列番号９７０、配列番号９７１、配列番号９７２、配列番号９７ ３、配列番号９７４、配列番号９７５、配列番号９７６、配列番号９７７、配列 番号９７８、配列番号９８０、配列番号１０３８、配列番号１ ０４８、配列番号１０７８及び配列番号１０９０からなる群から選択される、精 製または単離されたヘリコバクター ピロリ細胞ポリペプチドまたはそのフラグ メントである。 別の態様として、本発明はヘリコバクター ピロリポリペプチドの上に同定さ れた群からのあらゆる個々のヘリコバクター ピロリポリペプチドメンバーまた はそのようなメンバーをコードする核酸に関する。 別の態様として、本発明はヘリコバクター ピロリのｍＲＮＡに結合すること ができる核酸に特徴がある。そのような核酸はヘリコバクター ピロリのｍＲＮ Ａの翻訳を制御するためのアンチセンス核酸として作用することができる。さら なる特徴として、ヘリコバクター ピロリ核酸に特異的に結合することができる 核酸に特徴がある。これらの核酸は本明細書において相補体（ｃｏｍｐｌｅｍｅ ｎｔｓ）とも呼ばれ、プローブ及び捕捉試薬としての有用性を有する。 別の態様として、本発明はヘリコバクター ピロリ核酸に対応する読み枠を含 んでなる発現系に特徴がある。この核酸は意図する宿主に適合する制御配列をさ らに含んでなる。発現系はヘリコバクター ピロリ核酸に相当するポリペプチド を生産するために有用である。 別の態様として、本発明はヘリコバクター ピロリポリペプチドを生産するた めの発現系で形質転換された細胞に特徴がある。 別の態様として、本発明はヘリコバクター ピロリポリペプチドに特異的に結 合することができるヘリコバクター ピロリポリペプチドに対する抗体の作製方 法の特徴を記述する。そのような抗体はヘリコバクター ピロリ特異的抗原の存 在量及び分布を評価するための免疫アッセイ用試薬としての有用性を有する。 別の態様として、本発明は個体をヘリコバクター ピロリに対して免疫にする ためのワクチンの作製方法に特徴がある。この方法は、対象をヘリコバクター ピロリポリペプチド、例えば表面もしくは分泌ポリペプチド、またはその活性部 分及び製薬学的に受容しうる担体で免疫にすることを含む。そのようなワクチン は治療的及び予防的有用性を有する。 別の態様として、本発明は修飾した免疫原性ヘリコバクター ピロリポリペプ チド、例えば表面もしくは分泌ポリペプチド、またはその活性部分及び製薬学的 に受容しうる担体を含んでなるワクチンの作製方法を提供する。 別の態様として、本発明はヘリコバクター ピロリポリペプチドを結合する能 力に関して化合物、例えばポリペプチド、例えば宿主細胞ポリペプチドのフラグ メントを評価する方法に特徴がある。この方法は、候補化合物をヘリコバクター ピロリポリペプチドと接触させ、化合物がヘリコバクター ピロリポリペプチ ドと結合するかまたはそうでなければ相互作用するかどうかを確かめることを含 む。ヘリコバクター ピロリを結合する化合物は、この細菌の生活環のアクチベ ーターまたはインヒビターとしての候補である。これらのアッセイをインビトロ またはインビボで実施することができる。 別の態様として、本発明はヘリコバクター ピロリ核酸、例えばＤＮＡまたは ＲＮＡに結合する能力に関して化合物、例えばポリペプチド、例えば宿主細胞ポ リペプチドのフラグメントを評価する方法に特徴がある。この方法は、候補化合 物をヘリコバクター ピロリ核酸と接触させ、化合物がヘリコバクター ピロリ 核酸と結合するかまたはそうでなければ相互作用するかどうかを確かめることを 含む。ヘリコバクター ピロ リを結合する化合物は、この細菌の生活環のアクチベーターまたはインヒビター としての候補である。これらのアッセイをインビトロまたはインビボで実施する ことができる。 本発明はヘリコバクター ピロリポリペプチド、好ましくはヘリコバクター ピロリポリペプチドの実質的に純粋な調製物または組み換えヘリコバクター ピ ロリポリペプチドに特徴がある。好ましい態様として、ポリペプチドは生物学的 活性を有し、ポリペプチドは配列表に含まれるアミノ酸配列に少なくとも６０％ 、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％または９９％相同なアミノ酸配列を 有し、ポリペプチドは配列表のアミノ酸配列と本質的に同じアミノ酸配列を有し 、ポリペプチドは少なくとも５、１０、２０、５０、１００または１５０アミノ 酸残基の長さであり、ポリペプチドは配列表に含まれるポリペプチドの少なくと も５個、好ましくは少なくとも１０個、より好ましくは少なくとも２０個、より 好ましくは少なくとも５０、１００または１５０個の連続したアミノ酸残基を含 む。 好ましい態様として、ヘリコバクター ピロリポリペプチドは配列表に含まれ る核酸かまたは配列表に示される核酸と少なくとも６０％、７０％、８０％、９ ０％、９５％、９８％もしくは９９％の相同性を有する核酸によりコードされる 。 好ましい態様として、主題のヘリコバクター ピロリポリペプチドはアミノ酸 配列が配列表の配列と１、２、３、５、１０またはそれ以上の残基で異なる。し かしながら、これらの違いはヘリコバクター ピロリポリペプチドがヘリコバク ター ピロリの生物学的活性を示すようにであり、例えばヘリコバクター ピロ リポリペプチドが天然に存在するヘ リコバクター ピロリ酵素の生物学的活性を保持するようにである。 好ましい態様として、ポリペプチドはさらなるアミノ酸残基、好ましくは配列 表に含まれる配列をコードするゲノムＤＮＡの５’のゲノムＤＮＡによりコード される残基に読み枠で融合された、配列表に含まれるアミノ酸配列の全てまたは フラグメントを含む。 さらに別の好ましい態様として、ヘリコバクター ピロリポリペプチドは第一 のヘリコバクター ピロリポリペプチド部分及び第二のポリペプチド部分、例え ばヘリコバクター ピロリに関係のないアミノ酸配列を有する第二のポリペプチ ド部分を有する組み換え融合タンパク質である。第二のポリペプチド部分は、例 えばグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、ＤＮＡ結合ドメインまたはポリメ ラーゼ活性化ドメインのいずれであってもよい。好ましい態様として、融合タン パク質を２−ハイブリッドアッセイに用いることができる。 本発明のポリペプチドは代替転写事象、代替ＲＮＡスプライシング事象並びに 代替翻訳及び翻訳後事象の結果として生じるものを含む。 また、本発明は免疫原性調製物中にヘリコバクター ピロリポリペプチドを含 む免疫原性成分も包含し、免疫原性成分はヘリコバクター ピロリポリペプチド に特異的な免疫反応、例えば体液性反応、抗体反応または細胞性反応を引き出す ことができる。好ましい態様として、免疫原性成分は配列表に含まれるポリペプ チドからの少なくとも１つの抗原決定基を含んでなる。 別の態様として、本発明はヘリコバクター ピロリポリペプチドをコードする ヌクレオチド配列を有する実質的に純粋な核酸を提供する。好ましい態様として 、コードされるポリペプチドは生物学的活性を有し、 コードされるポリペプチドは配列表に含まれるアミノ酸配列に少なくとも６０％ 、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％または９９％相同なアミノ酸配列を 有し、コードされるポリペプチドは配列表のアミノ酸と本質的に同じアミノ酸配 列を有し、コードされるポリペプチドは少なくとも５、１０、２０、５０、１０ ０または１５０アミノ酸の長さであり、コードされるポリペプチドは配列表に含 まれる少なくとも５個、好ましくは少なくとも１０個、より好ましくは少なくと も２０個、より好ましくは少なくとも５０、１００または１５０個の連続したア ミノ酸を含んでなる。 好ましい態様として、核酸は配列表に示されるようなものであり、核酸は配列 表に含まれる核酸配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、 ９８％または９９％相同である。 好ましい態様として、コードされるヘリコバクター ピロリポリペプチドは（ 例えば、少なくとも１アミノ酸残基のアミノ酸置換、付加または欠失により）ア ミノ酸配列が配列表の配列と１、２、３、５、１０またはそれ以上の残基で異な る。しかしながら、これらの違いはヘリコバクター ピロリのコードされるポリ ペプチドがヘリコバクター ピロリの生物学的活性を示すようなものであり、例 えばコードされるヘリコバクター ピロリ酵素が天然に存在するヘリコバクター ピロリの生物学的活性を保持するようなものである。 好ましい態様として、コードされるポリペプチドはさらなるアミノ酸残基、好 ましくは配列表に含まれる配列をコードするゲノムＤＮＡの５’のゲノムＤＮＡ によりコードされる残基に読み枠で融合された、配列表に含まれるアミノ酸配列 の全てまたはフラグメントを含む。 好ましい態様として、主題のヘリコバクター ピロリ核酸は、例えばヘリコバ クター ピロリ遺伝子配列を組み換え宿主細胞での発現のために適すようにする ために、ヘリコバクター ピロリ遺伝子配列に機能的に（ｏｐｅｒａｂｌｙ）連 結された転写調節配列、例えば少なくとも１種の転写プロモーターまたは転写エ ンハンサー配列含む。 なおさらに好ましい態様として、本発明のヘリコバクター ピロリポリペプチ ドをコードする核酸は厳しい条件下で配列表に含まれる核酸の少なくとも８個の 連続したヌクレオチド、より好ましくは配列表に含まれる核酸の少なくとも１２ 個の連続したヌクレオチド、より好ましくは配列表に含まれる核酸の少なくとも ２０個の連続したヌクレオチド、より好ましくは配列表に含まれる核酸の少なく とも４０個の連続したヌクレオチドに相当する核酸プローブにハイブリダイズす る。 好ましい態様として、核酸は配列表に示される配列と少なくとも１アミノ酸残 基で異なるペプチドをコードする。 好ましい態様として、核酸は配列表に示されるアミノ酸をコードする配列表に 示されるヌクレオチド配列と少なくとも１ヌクレオチドで異なる。 別の態様として、本発明は本明細書に記述されるようなヘリコバクター ピロ リポリペプチドまたはヘリコバクター ピロリポリペプチド変異体をコードする 核酸を含有するベクター；そのベクターでトランスフェクトされた宿主細胞；及 び例えば細胞培養培地中で細胞を培養し、そして例えば細胞または細胞培養培地 からヘリコバクター ピロリポリペプチドまたはヘリコバクター ピロリポリペ プチド変異体を単離することを初めとする組み換えヘリコバクター ピロリポリ ペプチドまたはヘリ コバクター ピロリポリペプチド変異体の製造方法を包含する。 別の態様として、本発明は配列表に含まれる配列と少なくとも５０％、６０％ 、７０％、８０％、９０％。９５％、９８％または９９％の相同性を有する精製 された組み換え核酸に特徴がある。 また、本発明は実質的に精製されたオリゴヌクレオチドを含むプローブまたは プライマーも提供する。オリゴヌクレオチドは厳しい条件下で配列表に含まれる 少なくとも１０個の連続したヌクレオチドのセンスまたはアンチセンス配列にハ イブリダイズするヌクレオチド配列の領域、または天然に存在するその変異体を 含む。好ましい態様として、プローブまたはプライマーはそれに結合した標識基 をさらに含む。標識基は、例えば放射性同位体、蛍光化合物、酵素及び／または 酵素補因子であってもよい。好ましくは、オリゴヌクレオチドは少なくとも１０ ヌクレオチドで且つ２０、３０、５０、１００または１５０ヌクレオチド未満の 長さである。 本発明は、本発明のポリペプチドをコードする核酸、例えばＲＮＡまたはＤＮ Ａをさらに提供する。これは二本鎖の核酸並びにコーディング及びアンチセンス 一本鎖を含む。 ゲノム配列をシークエンスしたヘリコバクター ピロリ株はＨＰ−Ｊ９９株と してアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙ ｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ））に寄託されている 。 本発明に含まれるものは、対立遺伝子変異体；天然の突然変異体；誘導された 突然変異体；配列表に示されるようなポリペプチドをコードする核酸に高いかま たは低いストリンジェンシー条件下でハイブリダイズ するＤＮＡによりコードされるタンパク質（高い及び低いストリンジェンシーの 定義に関しては、引用することにより本明細書に組み込まれるＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８９、６．３．１−６．３ ．６を参照）；及びヘリコバクター ピロリポリペプチドに対する抗血清、特に ヘリコバクター ピロリポリペプチドの活性部位または結合ドメインに対する抗 血清が特異的に結合するポリペプチドである。また、本発明はフラグメント、好 ましくは生物学的に活性のあるフラグメントも含む。これら及び他のポリペプチ ドは本明細書においてヘリコバクター ピロリポリペプチド類似体または変異体 とも呼ばれる。 表１に示されるように、本発明のヘリコバクター ピロリポリペプチドのいく つかの推定機能が決定されている。 従って、請求されるヘリコバクター ピロリポリペプチドのこれらの同定され た機能における使用も本発明の範囲内である。 さらに、本発明はヘリコバクター ピロリ細胞エンベロープタンパク質、ヘリ コバクター ピロリ分泌タンパク質、ヘリコバクター ピロリ細胞質タンパク質 及びヘリコバクター ピロリ細胞タンパク質を初めとする、以下の表１に示され るように特性化されたヘリコバクター ピロリポリペプチドを包含する。これら の群のメンバーはＢＬＡＳＴ相同性検索及び分泌シグナルまたは膜貫通タンパク 質モチーフの検索により同定された。（アミノ酸配列のＦＡＳＴＡ比較により示 され、以下の表３−６の多くの場合で示されるような）表１のポリペプチドに対 する著しい相同性により関連づけられるポリペプチドも表１に示される相同体の ように分類されると考えられる。 ［表１で、「ｎｔ」はヌクレオチド配列番号を表し、「ａａ」はアミノ酸配列番 号を表す］定義 ポリペプチドの精製された調製物または実質的に純粋な調製物は、本明細書に 用いられる場合、天然に共に存在する他のタンパク質、脂質及び核酸から分離さ れているポリペプチドを意味する。好ましくは、ポリペプチドはそれを精製する ために用いられる物質、例えば抗体またはゲルマトリックス、例えばポリアクリ ルアミドからも分離されている。好ましくは、ポリペプチドは精製された調製物 の少なくとも１０、２０、５０、７０、８０または９５％の乾燥重量を構成する 。好ましくは、調製物はタンパク質シークエンシングができるために十分なポリ ペプチド；少なくとも１、１０または１００μｇのポリペプチド；少なくとも１ 、１０または１００ｍｇのポリペプチドを含む。 細胞の精製された調製物は、植物または動物細胞の場合は細胞のインビトロ調 製物をさし、完全な植物または動物全体ではない。培養細胞または微生物細胞の 場合には、主題細胞の少なくとも１０％、より好ましくは５０％の調製物からな る。 実質的に純粋な核酸、例えば実質的に純粋なＤＮＡは、以下、すなわち、核酸 が由来する生物の天然に存在するゲノムにおいて直接隣接するコーディング配列 の両方（すなわち、５’末端のもの及び３’末端のも の）と直接隣接しないか；または核酸が由来する生物に存在する核酸を実質的に 含まないかのいずれかまたは両方である核酸である。例えば、この用語はベクタ ー、例えば自律複製するプラスミドもしくはウイルス中または原核生物もしくは 真核生物のゲノムＤＮＡ中に組み込まれているか、あるいは他のＤＮＡ配列に関 係なく別個の分子（例えば、ＰＣＲまたは制限エンドヌクレアーゼ処理により生 成されるｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡフラグメント）として存在する組み換えＤ ＮＡを含む。実質的に純粋なＤＮＡはさらなるヘリコバクター ピロリＤＮＡ配 列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である組み換えＤＮＡも含む。 本明細書に用いられる場合、「コンティグ（ｃｏｎｔｉｇ）」は生物のゲノム 配列の連続した長さに相当する核酸である。 本明細書においてＯＲＦとも呼ばれる「読み枠」はポリペプチドをコードする 核酸の領域である。この領域はコンティグ配列の一部または全配列を表すことが できる。 本明細書に用いられる場合、「コーディング配列」は適切な調節配列の制御下 に配置された場合にメッセンジャーＲＮＡに転写され、そして／またはポリペプ チドに翻訳される核酸である。コーディング配列の境界は５’末端の翻訳開始コ ドン及び３’末端の翻訳終止コドンにより決定される。コーディング配列はメッ センジャーＲＮＡ、合成ＤＮＡ及び組み換え核酸配列を含むことができるが、こ れらに限定されない。 本明細書に用いられる場合、核酸の「相補体」は元の配列とワトソン−クリッ ク塩基対合する逆平行またはアンチセンス配列をさす。 「遺伝子産物」は遺伝子により特異的にコードされるタンパク質または構造的 ＲＮＡである。 本明細書に用いられる場合、「プローブ」という用語は目的の分子に特異的に 結合する核酸、ペプチドまたは他の化学的存在物をさす。プローブはしばしば標 識と結合しているかまたは結合することができる。標識は検出可能な化学的成分 である。典型的な標識は色素、放射性同位体、発光及び化学発光成分、発蛍光団 、酵素、沈殿剤、増幅配列等を含んでなる。同様に、目的の分子に特異的に結合 し、そのような分子を固定する核酸、ペプチドまたは他の化学的存在物は本明細 書において「捕捉リガンド」と呼ばれる。捕捉リガンドは典型的にはニトロセル ロース、ガラス、ナイロン膜、ビーズ、粒子等のような支持体に結合しているか または結合することができる。ハイブリダイゼーションの特異性はヌクレオチド の塩基対組成並びに反応の温度及び塩濃度のような条件による。これらの条件は 慣例の実験法を用いて当業者に容易に理解される。 相同は、２つのポリペプチド間または２つの核酸分子間の配列類似性または配 列同一性をさす。比較される２つの配列の両方のある位置が同じ塩基またはアミ ノ酸モノマーサブユニットで占められる場合、例えば、２つのＤＮＡ分子の各々 のある位置がアデニンで占められる場合、これらの分子はその位置で相同である 。２つの配列の間の相同性のパーセントは、比較される位置の数で割った２つの 配列が共有する一致するかまたは相同である位置の数 ｘ １００の結果である。 例えば、２つの配列の１０のうち６の位置が一致するかまたは相同である場合、 これら２つの配列は６０％相同である。例として、ＤＮＡ配列ＡＴＴＧＣＣ及び ＴＡＴＧＧＣは５０％の相同性を共有する。通例、２つの配列を最大の相同性を 生じるように並べて比較を実施する。 特定のストリンジェンシー条件下で核酸の少なくとも片方の鎖がもう 片方の核酸にアニールすることができる場合、核酸は相互にハイブリダイズでき る。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、（ａ）ハイブリダイゼー ション及び洗浄が実施される温度；並びに（ｂ）ハイブリダイゼーション及び洗 浄溶液のイオン強度及び極性により決定される。ハイブリダイゼーションは２つ の核酸が相補的な配列を含むことを必要とするが、しかしながら、ハイブリダイ ゼーションのストリンジェンシーによってはミスマッチを許容することができる 。典型的には、（例えば、６５℃で０．５ Ｘ ＳＳＣの溶液中のような）高いス トリンジェンシーでの２つの配列のハイブリダイゼーションは、これらの配列が 本質的に完全に相同であることを必要とする。（例えば、６５℃で２ Ｘ ＳＳＣ のような）中間的なストリンジェンシー及び（例えば、５５℃で２ Ｘ ＳＳＣの ような）低いストリンジェンシーの条件はハイブリダイズする配列間の対応して 低い全体的な相補性を必要とする（１Ｘ ＳＳＣは０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０． ００１５Ｍクエン酸Ｎａである）。 ペプチド、タンパク質及びポリペプチドという用語は本明細書において互換的 に用いられる。 本明細書に用いられる場合、「表面タンパク質」という用語は全ての表面の到 達可能なタンパク質、例えば、内膜及び外膜タンパク質、細胞壁に接着している タンパク質及び分泌タンパク質をさす。 ポリペプチドが以下の特性、すなわち、（１）ヘリコバクター ピロリ感染の 過程で発現された場合に細胞へのヘリコバクター ピロリの接着を促進するかま たは媒介することができる；（２）ヘリコバクターピロリタンパク質に特有の酵 素活性を有する；または（３）コードする遺伝子がヘリコバクター ピロリ遺伝 子の致死突然変異を救うことがで きるの１つ、２つ、好ましくはそれ以上を有する場合、それはヘリコバクター ピロリの生物学的活性を有する。ポリペプチドが上に挙げた特性のいずれかを有 するポリペプチドのアンタゴニスト、アゴニストまたは超アゴニストである場合 それは生物学的活性を有する。 生物学的に活性のあるフラグメントまたは類似体は、配列表に示されるヘリコ バクター ピロリポリペプチドまたは他の天然に存在するヘリコバクター ピロ リポリペプチドに特有であるインビボまたはインビトロ活性、例えば本明細書に 記述される生物学的活性の１つまたはそれ以上を有するものである。特に好まし いものは、インビボで存在するフラグメント、例えば、転写後のプロセッシング から生じるかまたは代わりにスプライスされたＲＮＡの翻訳から生じるフラグメ ントである。フラグメントは天然または内生の細胞において発現されるもの及び 発現系、例えばＣＨＯ細胞において作られるものを含む。ヘリコバクター ピロ リポリペプチドのようなポリペプチドは多様な生理的特性をしばしば示し、その ような特性は分子の異なる部分に起因する可能性があるので、有用なヘリコバク ター ピロリフラグメントまたはヘリコバクター ピロリ類似体はヘリコバクタ ー ピロリ活性のいずれかの生物学的アッセイにおいて生物学的活性を示すもの である。最も好ましくは、フラグメントまたは類似体はいずれかのインビボまた はインビトロアッセイにおいてヘリコバクター ピロリの１０％、好ましくは４ ０％、より好ましくは９０％またはそれより大きい活性を保有する。 類似体はアミノ酸配列においてかもしくは配列に関係せずにかまたはこれらの 両方で天然に存在するヘリコバクター ピロリポリペプチドと異なっていてもよ い。配列以外の修飾はアセチル化、メチル化、リン酸 化、カルボキシル化またはグリコシル化における変化を含む。好ましい類似体は 、ヘリコバクター ピロリポリペプチドの生物学的活性を実質的に減少させない １個もしくはそれ以上の保存的アミノ酸置換または１個もしくはそれ以上の非保 存的アミノ酸置換、欠失もしくは挿入により配列が野生型配列と異なるヘリコバ クター ピロリポリペプチド（または生物学的に活性のあるそれらのフラグメン ト）を含む。保存的置換は典型的にはあるアミノ酸の類似した特徴を有する別の ものでの置換、例えば以下の群、すなわち、バリン、グリシン；グリシン、アラ ニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸；アス パラギン、グルタミン；セリン、トレオニン；リシン、アルギニン；及びフェニ ルアラニン、チロシン内の置換を含む。他の保存的置換を以下の表２に略述する 。 本発明の範囲内の他の類似体はペプチド安定性を増す修飾を有するものであり 、そのような類似体は例えばペプチド配列中に（ペプチド結合に置き換わる）１ 個またはそれ以上の非ペプチド結合を含んでいてもよい。また含まれるものは、 天然に存在するＬ−アミノ酸以外の残基、例えばＤ−アミノ酸または天然に存在 しないかもしくは合成のアミノ酸、例えばβもしくはγアミノ酸を含む類似体及 び環式類似体である。 本明細書に用いられる場合、ヘリコバクター ピロリ類似体に適用されるよう な「フラグメント」という用語は通常少なくとも約２０残基、より典型的には少 なくとも約４０残基、好ましくは少なくとも約６０残基の長さである。当業者に 知られている方法によりヘリコバクター ピ ロリポリペプチドのフラグメントを作製することができる。候補フラグメントが ヘリコバクター ピロリポリペプチドの生物学的活性を示す能力を本明細書に記 述されような当業者に知られている方法により評価することができる。また含ま れるものはペプチドの生物学的活性のために必要でないかまたは選択的ｍＲＮＡ スプライシングもしくは選択的タンパク質プロセッシング事象から生じる残基を 含有するヘリコバクターピロリポリペプチドである。 本明細書に用いられる場合、「免疫原性成分」はヘリコバクター ピロリポリ ペプチド、その類似体またはフラグメントのような、宿主動物において体液性及 び／または細胞性免疫反応を引き出すことができる成分である。 本明細書に用いられる場合、「抗原成分」はヘリコバクター ピロリポリペプ チド、その類似体またはフラグメントのような、特定の抗体に十分に高い親和性 で結合して検出可能な抗原−抗体複合体を形成することができる成分である。 本明細書に用いられる場合、「導入遺伝子」という用語は導入されるトランス ジェニック動物もしくは細胞に部分的もしくは完全に異種起源、すなわち外来で あるかまたは導入されるトランスジェニック動物もしくは細胞の内因性遺伝子に 相同であるが、挿入される細胞のゲノムを改変するように細胞のゲノム中に挿入 されるように設計されるかもしくは挿入される（例えば、天然の遺伝子と異なる 位置で挿入されるかまたはその挿入がノックアウトをもたらす）（例えば１つま たはそれ以上のポリペプチドをコードする）核酸を意味する。導入遺伝子は、選 択された核酸に機能的に全て連結された、選択された核酸の最適発現のために必 要 である可能性のある１つまたはそれ以上の転写調節配列及びイントロンのような 他の核酸を含むことができ、エンハンサー配列を含んでもよい。 本明細書に用いられる場合、「トランスジェニック細胞」は導入遺伝子を含有 する細胞をさす。 本明細書に用いられる場合、「トランスジェニック動物」は、動物の細胞の１ 個またはそれ以上、好ましくは本質的に全てが導入遺伝子を含むあらゆる動物で ある。顕微鏡下注射または組み換えウイルスでの感染によるような周到な遺伝子 操作の方法を用いて細胞の前駆体中に導入することにより直接的または間接的に 導入遺伝子を細胞中に導入することができる。この分子は染色体内に組み込まれ ることができるかまたは染色体外でＤＮＡを複製することができる。 本明細書に用いられる場合、「抗体」という用語はヘリコバクターピロリポリ ペプチドと特異的に反応するそのフラグメントを含むと考えられる。 本明細書に用いられる場合、「細胞特異的プロモーター」という用語はプロモ ーターとして働く、すなわち、プロモーターに機能的に連結された選択されたＤ ＮＡ配列の発現を調節し、そして組織の特定の細胞で選択されたＤＮＡ配列の発 現をもたらすＤＮＡ配列を意味する。また、この用語は、主にある組織において 選択されたＤＮＡの発現を調節するが別の組織においても同様に発現を引き起こ すいわゆる「漏れやすい」プロモーターも含む。 本明細書に用いられるミス発現（ｍｉｓｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）は遺伝子発現 の非野生型様式をさす。これは非野生型レベルの発現、すなわち過剰または不十 分な発現；遺伝子が発現される時間または時期の点で 野生型と異なる発現の様式、例えば前以て決められた発生期間または時期で（野 生型と比較した場合の）増加または減少した発現；前以て決められた細胞型また は組織型における（野生型と比較した場合の）減少した発現の点で野生型と異な る発現の様式；スプライシングの大きさ、アミノ酸配列、転位後の修飾または発 現ポリペプチドの生物学的活性の点で野生型と異なる発現の様式；遺伝子の発現 時の環境刺激または細胞外刺激の効果の点で野生型と異なる発現の様式、例えば 刺激の強さの増加または減少が存在する（野生型と比較した場合の）増加または 減少した発現の様式を含む。 本明細書に用いられる場合、単細胞存在物として培養される微生物またはより 高等な真核細胞系を示す「宿主細胞」及び他のそのような用語は、組み換えベク ターまたは他の伝達ＤＮＡの受容体として用いられるようになることができるか または用いられている細胞をさし、トランスフェクトされた元の細胞の子孫を含 む。偶然または故意の突然変異のために、単一の親細胞の子孫がゲノムまたは全 ＤＮＡ数量（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔ）において元の親と必ずしも完全に同一では ない可能性があることを当業者は理解する。 本明細書に用いられる場合、「制御配列」という用語は、連結されているコー ド配列の発現をもたらすように宿主生物により認識される塩基配列を有する核酸 をさす。そのような制御配列の特性は宿主生物によって異なり、原核生物ではそ のような制御配列は通常プロモーター、リボソーム結合部位及びターミネーター を含み、真核生物ではそのような制御配列は通常プロモーター、ターミネーター 及びある場合にはエンハンサーを含む。制御配列という用語は発現のためにその 存在が必要である 全ての成分を最低限含むと考えられ、そしてその存在が有益であるさらなる成分 、例えばリーダー配列を含んでもよい。 本明細書に用いられる場合、「機能的に連結された」という用語は意図された ように機能するように連結または結合された配列をさす。例えば、コーディング 配列の発現が制御配列及び宿主細胞に適合する条件下で得られるようにライゲー ションにより制御配列がコーディング配列に機能的に連結される。 本明細書に用いられる場合、物質の代謝は物質の発現、機能、作用または調節 のあらゆる面を意味する。物質の代謝は修飾、例えば物質の共有結合的または非 共有結合的修飾を含む。物質の代謝は、他の物質において物質が誘導する修飾、 例えば共有結合的または非共有結合的修飾物を含む。また、物質の代謝は物質の 分布の変化も含む。物質の代謝は、他の物質の分布において物質が誘導する変化 を含む。 本明細書に用いられる場合、「サンプル」は例えば（血漿、血清、髄液、リン パ液、涙、唾液及び組織分泌物を初めとするがこれらに限定されない）個体から またはインビトロ細胞培養成分から単離された組織または体液のような生物学的 サンプル及び環境からのサンプルをさす。 別に示さないかぎり、本発明の実践は当該技術分野内である化学、分子生物学 、微生物学、組み換えＤＮＡ及び免疫学の通常の技術を用いる。そのような技術 は文献に完全に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｆｒｉｔｓｃｈ及 びＭａｎｉａｔｉｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ｌａｂｏｒａｔｏ ｒｙ Ｍａｎｎｕａｌ 第２版（１９８９）；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ、第Ｉ及 びII巻（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編集１９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄ ｅ Ｓｙｎｔｈｅｓ ｉｓ （Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編集、１９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂ ｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ （Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編集 、１９８４）；シリーズ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃ ａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）、特に第１５４巻及び第１５５巻（Ｗｕ 及びＧｒｏｓｓｍａｎ編集）及びＰＣＲ−Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏ ａｃｈ （ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ、Ｑｕｉｒｋｅ及びＴａｙｌｏｒ編集、１９９１） を参照。Ｉ．ヘリコバクター ピロリの核酸の単離及びヘリコバクター ピロリゲノムシ ークエンスのためのそれらの使用 本発明はヘリコバクター ピロリのゲノムのヌクレオチド配列を提供し、従っ て、ヘリコバクター ピロリゲノムＤＮＡのＤＮＡ配列ライブラリーを含んでな る。以下の詳細な記述はヘリコバクター ピロリのヌクレオチド配列を与え、ま たどのようにしてそれらの配列が得られ、そしてどのようにしてＯＲＦ及びタン パク質コーディング配列が同定されたかも説明する。また記述されるものは診断 及び治療用途を初めとする方法に開示されるヘリコバクター ピロリ配列を用い る方法である。さらに、ヘリコバクター ピロリのこの及び他の株における医学 的に重要な配列の同定及び比較のためのデータベースとしてこのライブラリーを 用いることができる。 ヘリコバクター ピロリのゲノム配列を決定するために、ヘリコバクター ピ ロリの株からＤＮＡを単離し、ネブライゼーションにより２ｋｂの中央値の大き さに機械的に剪断した。ゲル電気泳動によるサイズ分画後にフラグメントを平滑 末端にし、アダプターオリゴヌクレオチドに連結し、２０の異なるｐＭＰＸベク ターの各々にクローン化して（Ｒｉ ｃｅ等、Ｍｅｅｔｉｎｇ ｏｆ Ｇｅｎｏｍｅ Ｍａｐｐｉｎｇ ａｎｄ Ｓｅ ｑｕｅｎｃｉｎｇの抄録、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、 ５／１１−５／１５、１９９４、ｐ２２５）一連の「ショットガン」サブクロー ンライブラリーを構築した。 本質的にＣｈｕｒｃｈ等、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１８５；米国 特許番号第４，９４２，１２４号及び第５，１４９，６２５号に記述されたよう な多重シークエンシング方法を用いてＤＮＡシークエンシングを実施した。集め た培養物からＤＮＡを抽出し、化学的または酵素的シークエンシングに供した。 電気泳動によりシークエンシング反応物を分離し、生成物をナイロン膜に移し、 共有的に結合させた。最後に、異なるショットガンクローニングベクター中に存 在する「タグ（ｔａｇ）」配列に相補的な一連の標識オリゴヌクレオチドを用い て逐次膜をハイブリダイズさせた。このようにして、単一組のシークエンシング 反応から非常に多数の配列を得ることができた。クローニング及びシークエンシ ング方法は実施例でより詳細に記述される。 このようにして得られた個々の配列の読み取りをＦＡＬＣＯＮ^TM（商標）プロ グラム（Ｃｈｕｒｃｈ等、１９９４、Ａｕｔｏｍａｔｅｄ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅ ｎｃｉｎｇ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ 、Ｊ．Ｃ．Ｖｅｎｔｅｒ編集、Ａｃａｄ ｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）及びＰＨＲＡＰ（Ｐ．Ｇｒｅｅｎ、ＤＯＥ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｇｒａｍ Ｃｏｎｔｒａｃｔｏｒ−Ｇｒａｎｔｅｅ Ｗ ｏｒｋｓｈｏｐ Ｖの抄録、１９９６年１月、ｐ１５７）を用いて集成した。そ の結果、各々が連続した長さのＤＮＡまたはＤＮＡ配列に相当するコンティグの 集成が得られた。平均のコンティグの長さは約３ｋｂであった。 全ヘリコバクター ピロリゲノムに相当する連続した配列を得るようにコンテ ィグを並べるために様々な方法が用いられる。各コンティグの末端の配列に相補 的な合成オリゴヌクレオチドを設計する。これらのオリゴヌクレオチドを例えば ラムダファージベクターまたはプラスミドベクター中のヘリコバクター ピロリ ゲノムＤＮＡのライブラリーにハイズリダイズさせて個々のコンティグ間の連結 領域に相当する配列を含むクローンを同定することができる。次に、そのような クローンを用いて鋳型ＤＮＡを単離し、そして同じオリゴヌクレオチドをポリメ ラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のプライマーとして用いて連結フラグメントを増幅し 、次にそのヌクレオチド配列を決定する。 少なくとも１８０ヌクレオチドを含んでなる読み枠（ＯＲＦ）の存在に関して ヘリコバクター ピロリ配列を分析した。（終止ないし終止コドンの読み取りに 基づく）少なくとも１８０ヌクレオチドのＯＲＦを予想した。終止ないし終止コ ドンの読み取りに基づくＯＲＦの分析の結果として、これらのＯＲＦが天然に存 在するヘリコバクター ピロリポリペプチドのＯＲＦに相当しない可能性がある ことを理解すべきである。これらのＯＲＦは天然に存在するヘリコバクター ピ ロリポリペプチドのタンパク質合成の開始を示す開始コドンを含む可能性がある 。本明細書に与えられるＯＲＦ内のそのような開始コドンを関連技術分野の従事 者は同定することができ、得られるＯＲＦ及びコードされるヘリコバクター ピ ロリポリペプチドは本発明の範囲内である。例えば、ＯＲＦ内にタンパク質合成 の開始シグナルの一部である（メチオニンまたはバリンをコードする）ＡＵＧま たはＧＵＧのようなコドンを同定することができ、そしてＯＲＦを天然に存在す るヘリコバクター ピロリポリペプ チドに相当するように修飾することができる。プログラムＧＥＮＥＭＡＲＫ^TM（ 商標）（Ｂｏｒｏｄｏｖｓｋｙ及びＭｃＩｎｉｎｃｈ、１９９３、Ｃｏｍｐ．Ｃ ｈｅｍ ．１７：１２３）でそのような配列のコーディング可能性を評価すること により、予想されるコーディング領域を特定した。 他のヘリコバクター ピロリ核酸 ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いることにより上に引用したヘリコバク ター ピロリ株のＤＮＡから直接本発明の核酸を得ることができる。ＰＣＲにつ いての詳細に関しては「ＰＣＲ、Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ」 （ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ、Ｑｕｉｒｋｅ及びＴａｙｌｏｒ編集、ＩＲＬ Ｐｒｅｓ ｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、ＵＫ、１９９１）を参照。発現前の正確なＤＮＡコピーを保 証するために高フィデリティーＰＣＲを用いることができる。さらに、増幅産物 を通常のシークエンシング方法により調べることができる。ＰＣＲを用いるかま たは当該技術分野で知られているようなライブラリーコロニーもしくはプラーク を取り上げたフィルターへの合成オリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼ ーションによりライブラリーをスクリーニングすることにより本発明に記述され る所望する配列を保有するクローンを得ることができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏ ｏｋ等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍ ａｎｎｕａｌ 第２版、１９８９、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐ ｒｅｓｓ、ＮＹを参照）。 また、本明細書に記述されるプロトコルに従ってｃＤＮＡライブラリーからヘ リコバクター ピロリポリペプチドをコードする核酸を得ることも可能である。 適切な細胞系から全ｍＲＮＡを単離することによりへ リコバクター ピロリポリペプチドをコードするｃＤＮＡを得ることができる。 次に、全ｍＲＮＡから二本鎖のｃＤＮＡを調製することができる。続いて、多数 の既知の技術のいずれかを用いてｃＤＮＡを適当なプラスミドまたはウイルス（ 例えばバクテリオファージ）ベクター中に挿入することができる。また、本発明 により与えられるヌクレオチド配列情報に従って確立されたポリメラーゼ連鎖反 応技術を用いてヘリコバクター ピロリポリペプチドをコードする遺伝子をクロ ーン化することもできる。本発明の核酸はＤＮＡまたはＲＮＡであってもよい。 好ましい核酸を配列表に示す。 また、本発明の核酸を標準的な技術を用いて化学的に合成することもできる。 ペプチド合成のように市販されているＤＮＡ合成機で完全に自動化されている固 相合成を初めとする、ポリデオキシヌクレオチドを化学的に合成する様々な方法 が知られている（例えば、引用することにより本明細書に組み込まれるＩｔａｋ ｕｒａ等、米国特許番号第４，５９８，０４９号；Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ等、米国 特許番号第４，４５８，０６６号；及びＩｔａｋｕｒａ 米国特許番号第４，４ ０１，７９６号及び第４，３７３，０７１号を参照）。 本発明の特徴に従って単離または合成される核酸は限定されずに例えばプロー ブ、プライマー、捕捉リガンド、アンチセンス遺伝子として、そしてそのような 配列に相当するタンパク質及びペプチドの合成のための発現系を開発するために 有用である。プローブ、プライマー、捕捉リガンド及びアンチセンス試薬として 、核酸は通常配列表に示される核酸の全てまたは一部（特異性及び安定なハイブ リダイゼーション生成物を形成ことができるためには約２０またはそれ以上のヌ クレオチド）から なる。これらの用途を以下にさらに詳細に記述する。 プローブ 配列表に示されるヌクレオチド配列による単離または合成される核酸をヘリコ バクター ピロリを特異的に検出するためのプローブとして用いることができる 。本用途で示される配列情報を用いて、ヘリコバクター ピロリ及びハイブリダ イゼーション状態中に遭遇すると思われる関係のない核酸に関して適切な包括及 び排除を与える２０ヌクレオチドまたはそれ以上の配列が同定される。より好ま しくは、プローブ及び意図される標的分子間に形成されるハイブリダイゼーショ ン生成物に安定性を与えるためにこの配列は少なくとも２０ないし３０ヌクレオ チドを含んでなる。 １０００ヌクレオチドより大きい長さの配列を合成するのは困難であるが、組 み換えＤＮＡ技術により作製することができる。ハイブリダイゼーション生成物 の検出を容易にするためにプローブとして使用する核酸に標識を与えることがで きることを当業者は容易に認識する。 また、配列表により単離及び合成される核酸は、本明細書に記述されるような 適切なストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件を用いて他のヘリコバク ター種の相同領域（特に相同遺伝子）を検出するためのプローブとしても有用で ある可能性もある。 捕捉リガンド 捕捉リガンドとしての使用のために、プローブに関して上に記述したように選 択される核酸を支持体と容易に結合することができる。核酸を支持体と結合する 方法はよく知られている。配列表に含まれる配列の２０ヌクレオチドまたはそれ 以上を有する核酸は、ヘリコバクター ピロ リ核酸を相互及び他の生物の核酸から分離する有用性がある。また、配列表に示 される配列の２０ヌクレオチドまたはそれ以上を有する核酸は、他のヘリコバク ター種を相互及び他の生物から分離する有用性もある。好ましくは、プローブ及 び意図される標的分子間に形成されるハイブリダイゼーション生成物に安定性を 与えるためにこの配列は少なくとも２０ヌクレオチドを含んでなる。１０００ヌ クレオチドより大きい長さの配列を合成するのは困難であるが、組み換えＤＮＡ 技術により作製することができる。 プライマー 本明細書に記述される配列により単離または合成される核酸はヘリコバクター ピロリ核酸の増幅のためのプライマーとしての有用性がある。これらの核酸は 他のヘリコバクター種の核酸の増幅のためのプライマーとしての有用性もある。 ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術に関して、配列表に含まれる＞１０−１５ ヌクレオチドの核酸は適当な酵素及び試薬と合わせてヘリコバクター ピロリ核 酸のコピーを作製するために有用である。より好ましくは、プローブ及び意図さ れる標的分子間に形成されるハイブリダイゼーション生成物に安定性を与えるた めにこの配列は少なくとも２０ヌクレオチドまたはそれ以上を含んでなる。１０ ０ヌクレオチドより大きいプライマーの結合条件を特異性を得るために制御する ことはより困難である。発現前の正確なＤＮＡコピーを保証するために高フィデ リティーＰＣＲを用いることができる。さらに、増幅産物を通常のシークエンシ ング方法により調べることができる。 これらのコピーをヘリコバクター ピロリ及び／または他のヘリコバクター種 からの遺伝子を初めとする特定の配列を検出するための診断アッ セイに用いることができる。また、本明細書にかなり詳細に記述されるように、 これらのコピーをクローニング及び発現ベクター中に組み込んでＰＣＲにより合 成される核酸に相当するポリペプチドを生成することもできる。 アンチセンス 本明細書に記述される配列により単離または合成される核酸または核酸にハイ ブリダイズする誘導体はヘリコバクター ピロリ遺伝子の発現を妨げるためのア ンチセンス試薬としての有用性がある。また、これらの配列は他のヘリコバクタ ー種の遺伝子の発現を妨げるためのアンチセンス試薬としての有用性もある。 一つの態様として、ヘリコバクター ピロリ核酸に相当する核酸または誘導体 をバクテリア細胞中への導入のためにリポソームまたはバクテリオファージのよ うな適当なキャリヤー中に入れる。例えば、２０ヌクレオチドまたはそれ以上を 有する核酸はバクテリアの核酸またはバクテリアのメッセンジャーＲＮＡに結合 することができる。好ましくは、アンチセンス核酸は天然に存在しない核酸及び バクテリアの核酸及び／またはバクテリアのメッセンジャーＲＮＡのハイブリダ イゼーション生成物に必要な安定性を与えるために２０ヌクレオチドまたはそれ 以上を含んでなる。１０００ヌクレオチドより大きい長さの配列を有する核酸を 合成するのは困難であるが、組み換えＤＮＡ技術により作製することができる。 リポソームにアンチセンス核酸を入れるための方法は１９８０年１２月２３日に Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ等に発布された米国特許第４，２４１，０４６ 号により例示されるように当該技術分野において知られている。II ．ヘリコバクター ピロリ核酸の発現 本明細書に記述される配列により単離または合成される核酸はポリペプチドを 生成するために有用である。ヘリコバクター ピロリポリペプチドの活性部分を コードする配列表に例示される核酸または該核酸のフラグメントを適当なベクタ ー中にクローン化するかまたは核酸を単離するために用いることができる。単離 された核酸を適当なＤＮＡリンカーと結合し、適当なベクター中にクローン化す る。 特定の遺伝子またはオペロンの機能を当該遺伝子またはオペロンにより特定さ れる遺伝子産物の活性を特異的に測定できる条件下でバクテリア株で発現させる ことにより確かめることができる。あるいは、抗原、工業用試薬として使用する ため、構造研究のため等に、発現する株で遺伝子産物を大量に生産することがで きる。試験される遺伝子の活性を欠く突然変位体株かまたは同じ遺伝子産物を生 産しない株でこの発現を達成することができる。これは、他のヘリコバクター株 、並びにエシェリキアコリ（Ｅ．Ｃｏｌｉ）、ノルカルジア（Ｎｏｒｃａｒｄｉ ａ ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）及びストレプト マイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｏｙｃｅｓ）種のような他のバクテリア株を含むが これらに限定されない。ある場合には、発現宿主は天然のヘリコバクタープロモ ーターを利用し、一方ある場合には、発現する生物由来のプロモーター配列（例 えば、大腸菌での発現には大腸菌β−ガラクトシダーゼプロモーター）で遺伝子 を動かすことが必要である。 天然のヘリコバクター ピロリプロモーターを用いて遺伝子産物を発現するた めには、以下のような方法を用いることができる。宿主生物で機能する複製起点 及び適切な選択マーカーを含有する適切な組み換えプ ラスミド中に、目的の遺伝子を含んでいる制限フラグメントを（ＤＮＡ配列デー タを用いて同定された）その結合する天然のプロモーター成分及び調節配列と共 にクローン化する。これを当業者に知られている多数の方法により達成すること ができる。最も好ましくは、プラスミド及びクローン化されるフラグメントを一 緒に連結することができる適合した末端を生じるようにこれら２つの断片を同じ 制限酵素で切断することによりこれを実施する。組み換えプラスミドを例えばエ レクトロポレーションにより宿主生物中に導入し、組み換えプラスミドを保有す る細胞をプラスミド上のマーカーを選択することにより同定する。所望する遺伝 子産物の発現を遺伝子産物に特異的なアッセイを用いて検出する。 異なるプロモーターを必要とする遺伝子の場合には、遺伝子の本体（コーディ ング配列）を特異的に切り出し、適切な発現プラスミド中にクローン化する。こ のサブクローニングをいくつかの方法により実施することができるが、特定のフ ラグメントをＰＣＲ増幅し、ＰＣＲ産物を制限酵素またはエキソヌクレアーゼで 処理してクローニングのために適した末端を作製した後に発現プラスミド中にラ イゲーションすることにより最も容易に達成される。 遺伝子の発現のために適した宿主細胞は、あらゆる原核生物または真核生物の 細胞であってもよい。例えば、大腸菌のようなバクテリア細胞、昆虫細胞（バキ ュロウイルス）、酵母またはチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）のよう な哺乳類細胞でヘリコバクター ピロリポリペプチドを発現することができる。 他の好適な宿主細胞は当業者に知られている。 哺乳類、酵母または昆虫細胞のような真核細胞における発現は、組み 換えペプチド産物の部分的もしくは完全なグリコシル化及び／または適切な鎖間 もしくは鎖内ジスルフィド結合の形成をもたらすことができる。酵母サッカロミ セスセリビシアエ（Ｓ．ｃｅｒｉｖｉｓｉａｅ）における発現のためのベクター の例はｐＹｅｐＳｅｃｌ（Ｂａｌｄａｒｉ等、（１９８７）Ｅｍｂｏ Ｊ．６： ２２９−２３４）、ｐＭＦａ（Ｋｕｒｊａｎ及びＨｅｒｓｋｏｗｉｔｚ、（１９ ８２）Ｃｅｌｌ ３０：９３３−９４３）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚ等、 （１９８７）Ｇｅｎｅ ５４：１１３−１２３）及びｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒ ｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を含む。培養 した昆虫細胞（ＳＦ ９細胞）におけるタンパク質の発現のために利用できるバ キュロウイルスベクターは、ｐＡｃシリーズ（Ｓｍｉｔｈ等、（１９８３）Ｍｏ ｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ．３：２１５６−２１６５）及びｐＶＬシリーズ（Ｌｕ ｃｋｌｏｗ、Ｖ．Ａ．及びＳｕｍｍｅｒｓ、Ｍ．Ｄ．、（１９８９）Ｖｉｒｏｌ ｏｇｙ １７０：３１−３９）を含む。通常、哺乳類細胞における一時的増幅／ 発現のためにはＣＯＳ細胞（Ｇｌｕｚｍａｎ、Ｙ．、（１９８１）Ｃｅｌｌ ２ ３ ：１７５−１８２）をｐＣＤＭ８（Ａｒｕｆｆｏ、Ａ．及びＳｅｅｄ、Ｂ．、 （１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：８５７３ −８５７７）のようなベクターと一緒に用い、一方、哺乳類細胞における安定な 増幅／発現のためにはＣＨＯ（ｄｈｆｒ^-チャイニーズハムスター卵巣（Ｃｈｉ ｎｅｓｅ Ｈａｍｓｔｅｒ Ｏｖａｒｙ））細胞をｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａ ｎ等、（１９８７）、ＥＭＢＯ Ｊ．６：１８７−１９５）のようなベクターと 共に用いる。リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈殿、ＤＥＡＥ−デキス トランが媒介す るトランスフェクションまたはエレクトロポレーションのような通常の技術によ りベクターＤＮＡを哺乳類細胞中に導入することができる。宿主細胞を形質転換 するために適した方法をＳａｍｂｒｏｏｋ等（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉ ｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ 、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉ ｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９））及び他 の実験教本に見いだすことができる。 原核生物における発現は融合または非融合誘導性発現ベクターを用いて大腸菌 で最も頻繁に実施される。融合ベクターは通常発現される標的遺伝子に多数のＮ Ｈ₂末端アミノ酸を付加する。これらのＮＨ₂末端アミノ酸はしばしばレポーター 基と呼ばれる。そのようなレポーター基は通常２つの目的、すなわち、１）標的 組み換えタンパク質の可溶性を増すため及び２）アフィニティー精製におけるリ ガンドとして働くことにより標的組み換えタンパク質の精製を容易にするために 役立つ。しばしば融合発現ベクターにおいて、融合タンパク質の精製後にレポー ター基から標的組み換えタンパク質を分離できるようにレポーター基と標的組み 換えタンパク質の連結部にタンパク質分解の切断部位が導入される。そのような 酵素及びそれらの同種の認識配列は第Ｘａ因子、トロンビン及びエンテロキナー ゼを含む。典型的な融合発現ベクターは、標的組み換えタンパク質にそれぞれグ ルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、マルトースＥ結合タンパク質またはプロテ インＡを融合するｐＧＥＸ（Ａｍｒａｄ Ｃｏｒｐ．、Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ、Ａ ｕｓｔｒａｌｉａ）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂ ｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）及びｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗ ａｙ、Ｎ Ｊ）を含む。好ましいレポーター基はポリ（Ｈｉｓ）であり、これをタンパク質 のアミノまたはカルボキシ末端に融合することができ、組み換え融合タンパク質 を金属キレートクロマトグラフィーにより容易に精製できるようにする。 誘導性の非融合発現ベクターはｐＴｒｃ（Ａｍａｎｎ等、（１９８８）Ｇｅｎ ｅ ６９：３０１−３１５）及びｐＥＴ１１ｄ（Ｓｔｕｄｉｅｒ等、Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚ ｙｍｏｌｏｇｙ １８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ 、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ（１９９０）６０−８９）を含む。ｐＴｒｃでは標的遺 伝子発現はハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃ融合プロモーターから宿主ＲＮＡポリメ ラーゼ転写によるが、ｐＥＴ１１ｄに挿入された標的遺伝子の発現は同時に発現 されるウイルスのＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７ ｇｎ１）により媒介されるＴ７ｇ ｎ１０−１ａｃ ０融合プロモーターからの転写による。このウイルスポリメラ ーゼは１ａｃＵＶ５プロモーターの転写制御下にＴ７ ｇｎ１を保有する内在す るλプロファージから宿主株ＢＬ２１（ＤＥ３）またはＨＭＳ１７４（ＤＥ３） により供給される。 例えば、ヘリコバクター ピロリポリペプチドをコードするヌクレオチド配列 の発現を導く核酸ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞をポリペプチドの 発現を生じさせる適切な条件下で培養することができる。ポリペプチドを分泌さ せ、細胞及びペプチドを含有する培地の混合物から単離することができる。ある いは、ポリペプチドを細胞質に保持し、細胞を集め、溶解し、タンパク質を単離 することができる。細胞培養物は宿主細胞、培地及び他の副産物を含む。細胞培 養のために適した 培地は当該技術分野においてよく知られている。本発明のポリペプチドを細胞培 養培地、宿主細胞またはこれらの両方からイオン交換クロマトグラフィー、ゲル 濾過クロマトグラフィー、限外濾過、電気泳動、及びそのようなポリペプチドに 特異的な抗体を用いた免疫アフィニティー精製を初めとするタンパク質を精製す るための当該技術分野で知られている技術を用いて単離することができる。さら に、多くの状況において、ポリペプチドを天然のタンパク質の化学的切断（例え ばトリプシン消化）により生成することができ、次に切断生成物を標準的な技術 により精製することができる。 膜結合タンパク質の場合には、膜結合タンパク質画分を溶剤と接触させて可溶 化された複合体を生じることにより宿主細胞からこれらを単離することができ、 この場合、膜結合タンパク質はもはや膜画分に完全には埋め込まれておらず、少 なくともある程度まで可溶化されており、これにより膜画分からクロマトグラフ ィーでそれを単離することができる。これらの複合体を可溶化するために適した 溶剤を選択するためにいくつかの異なる規準が用いられる。例えば、考慮される １つの特性は、タンパク質の再構成時に膜結合タンパク質の活性または機能性が 戻ることを可能にする膜結合タンパク質の最低限の変性で膜画分内のヘリコバク ター ピロリタンパク質を可溶化する溶剤の能力である。溶剤を選択する際に考 慮される別の特性は、選択した溶剤が好ましくは再構成後の除去を容易にできる 高い臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）値を有する点において溶剤のＣＭＣである。溶剤 を選択する際に考慮される第三の特性は溶剤の疎水性である。典型的には、膜結 合タンパク質は非常に疎水性であり、それ故、同様に疎水性である溶剤、例えば トリトンシリーズは疎水性タ ンパク質を可溶化するために有用である。溶剤に重要な別の特性は、さらなる精 製を容易にする最小のタンパク質−タンパク質相互作用でヘリコバクター ピロ リタンパク質を取り出す溶剤の能力であってもよい。考慮すべき溶剤の第四の特 性は溶剤の電荷である。例えば、精製工程にイオン交換樹脂を用いることが適切 である場合、好ましくは溶剤は無荷電溶剤であるべきである。最終精製工程に用 いることができるクロマトグラフィー技術は当該技術分野において知られており 、疎水性相互作用、レクチンアフィニティー、イオン交換、色素アフィニティー 及び免疫アフィニティーを含む。 大腸菌における組み換えヘリコバクター ピロリペプチド発現を最大にする一 つの方法は、組み換えタンパク質をタンパク質分解で切断する能力を損なった宿 主バクテリアでタンパク質を発現することである（Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ、Ｓ．、Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉ ｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ 、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ（１９９０）１１９−１２８）。別の方法は 、各アミノ酸の個々のコドンが大量発現される大腸菌タンパク質で優先的に用い られるものであるように発現ベクター中に挿入されるヘリコバクター ピロリペ プチドをコードする核酸を改変することである（Ｗａｄａ等、（１９９２）Ｎｕ ｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ．２０：２１１１−２１１８）。本発明の核酸のそのよ うな改変を標準的なＤＮＡ合成技術により実施することができる。 また、標準的な技術を用いて本発明の核酸を化学的に合成することもできる。 ペプチド合成のように市販されているＤＮＡ合成機で完全に自 動化されている固相合成を初めとするポリデオキシヌクレオチドを化学的に合成 する様々な方法が知られている（例えば、引用することにより本明細書に組み込 まれるＩｔａｋｕｒａ等、米国特許番号第４，５９８，０４９号；Ｃａｒｕｔｈ ｅｒｓ等、米国特許番号第４，４５８，０６６号；及びＩｔａｋｕｒａ、米国特 許番号第４，４０１，７９６号及び第４，３７３，０７１号を参照）。III ．ヘリコバクター ピロリポリペプチド 本発明は、配列表に含まれるポリペプチドを初めとする、開示されたヘリコバ クター ピロリゲノム配列によりコードされる単離されたヘリコバクター ピロ リポリペプチドを包含する。本発明のポリペプチドは好ましくは少なくとも５ア ミノ酸残基の長さである。本明細書に与えられるＤＮＡ配列情報を用いて、本明 細書により包含されるポリペプチドのアミノ酸配列を当該技術分野でよく知られ ている方法を用いて推定することができる。ヘリコバクター ピロリポリペプチ ドをコードする全核酸の配列を同種のタンパク質コーディング領域のフラグメン トのみをコードするＯＲＦに基づいて単離及び同定することができると理解され る。例えば、鋳型としてヘリコバクター ピロリゲノムＤＮＡを用いてポリメラ ーゼ連鎖反応を開始するようにＯＲＦをコードする単離された核酸またはそのフ ラグメントを用いることによりこれを実施することができ、これに続いて増幅産 物をシークエンスする。 本発明のポリペプチドを野生型もしくは突然変異体ヘリコバクターピロリ細胞 からまたはヘリコバクター ピロリ核酸を導入し発現させた（バクテリア、酵母 、昆虫、植物及び哺乳類細胞を初めとするがこれらに限定されない）異種起源の 生物もしくは細胞から単離することができ る。さらに、ポリペプチドは組み換え融合タンパク質の一部であってもよい。 本発明のヘリコバクター ピロリポリペプチドを本明細書に引用されるものの ような市販の自動化された方法を用いて化学的に合成することができる。 本発明のポリペプチドの多くは相互に関係している。これらの関係のいくつか を以下の表３−６に記述する。表３のポリペプチドの長さの全てはヘリコバクタ ー ピロリのヌクレオチド配列中の終止コドンから終止コドンまでである。当該 技術分野で知られているように、活性化開始ｔＲＮＡの開始コドンは通常前の終 止コドンから数ヌクレオチド下流で且つ（「シャイン−ダルガーノ（Ｓｈｉｎｅ −Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列」としても知られている）リボソーム結合部位に続い て数ヌクレオチド内に現れるので、実際のポリペプチドの長さは通常終止ないし 終止コドンの長さより短い。ヘリコバクター ピロリの大部分のリボソーム結合 部位は大腸菌で知られているものと同じ一般的な特徴の多くを有するので、当業 者は読み枠の終止ないし終止のヌクレオチド配列からかなりの信頼性で実際の開 始コドンを予想することができる。本発明の配列番号４９２−７４３のポリペプ チド配列は、配列番号１−２５２の終止ないし終止コドンの長さの読み枠に相当 する。本発明の全ての他のポリペプチド配列はヌクレオチド配列から推定される 開始ないし終止のタンパク質の長さに相当する。当業者は本明細書に示されるヌ クレオチド配列の終止ないし終止読み枠中の開始部位を見分けることができる。 さらに、当業者は時折別の開始部位を見い出し、それらのいくつかは細胞機構に よりインビボで用いられる可能性がある。これらの別の開始部位の数は十分 に少ないので当業者は当該技術分野で知られている組み換え発現系でそれらを容 易に試験してどれが真の機能的タンパク質産物を与えるかを決定することができ る。 表３に示されるポリペプチド間の関係を以下のように記述することができる。 第一に、表３のポリペプチドの全てはそれらの長さの大部分にわたって相互に少 なくとも９０％同一であり、大部分は相互に９５％以上同一である。第二に、終 止ないし終止の長さがポリペプチドの相同組のいくつかで異なる。ある場合には 、短い方のポリペプチドが本発明の有用性を示すタンパク質の関係のある部分を 含み、ある場合には、長い方のポリペプチドが向上した有用性を示す可能性があ る。第三に、２列目のいくつかのポリペプチドは５列目の第二の短い方のポリペ プチドに相同である。 全ての場合で、表３に記述される相同性の関係は非常に顕著である。例えば、 典型的なヘリコバクター ピロリ遺伝子産物はヒト患者から選択されたヘリコバ クター ピロリの異なる株間で９２％ないし１００％の間のアミノ酸配列の同一 性を示す。また、本発明の関連ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列も相 互に非常に類似している。例えば、本発明のポリペプチドのコーディング配列に 由来するヌクレオチドプローブを相同な関連ポリペプチドをコードするヌクレオ チド配列を保有するクローンを同定するためにＰＣＲまたはハイブリダイゼーシ ョン実験において用いることができる。 本発明のポリペプチド間のさらなる関係を以下の表４に記述する。以下の表４ のポリペプチドの長さは全てヘリコバクター ピロリのヌクレオチド配列中の終 止コドンから終止コドンまでである。 表４に示されるポリペプチド間の関係を以下のように記述することができる。 第一に、表４のポリペプチドの全てはそれらの長さの大部分にわたって相互に少 なくとも９０％同一であり、大部分は相互に９５％以上同一である。第二に、終 止ないし終止の長さがポリペプチドの相同組のいくつかで異なる。ある場合には 、短い方のポリペプチドが本発明の有用性を示すタンパク質の関係のある部分を 含み、ある場合には、長い方のポリペプチドが向上した有用性を示す可能性があ る。第三に、２列目のいくつかのポリペプチドは５列目の第二の短い方のポリペ プチドに相同である。 全ての場合で、表４に記述される相同性の関係は非常に顕著である。例えば、 典型的なヘリコバクター ピロリ遺伝子産物はヒト患者から選択されたヘリコバ クター ピロリの異なる株間で９２％ないし１００％の間のアミノ酸配列の同一 性を示す。また、本発明の関連ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列も相 互に非常に類似している。例えば、本発明のポリペプチドのコーディング配列に 由来するヌクレオチドプローブを相同な関連ポリペプチドをコードするヌクレオ チド配列を保有するクローンを同定するためにＰＣＲまたはハイブリダイゼーシ ョン実験において用いることができる。 本発明のポリペプチド間のさらなる関係を以下の表５に記述する。以下の表５ のポリペプチドの長さは全てヘリコバクター ピロリのヌクレオチド配列中の開 始コドンから終止コドンまでである。 表５に示されるポリペプチド間の関係を以下のように記述することができる。 第一に、表５のポリペプチドの全てはそれらの長さの大部分にわたって相互に少 なくとも９０％同一であり、大部分は相互に９５％以上同一である。第二に、開 始ないし終止の長さがポリペプチドの相同組のいくつかで異なる。ある場合には 、短い方のポリペプチドが本発明の有用性を示すタンパク質の関係のある部分を 含み、ある場合には、長い方のポリペプチドが向上した有用性を示す可能性があ る。第三に、２列目のいくつかのポリペプチドは５列目の第二の短い方のポリペ プチドに相同である。 全ての場合で、表５に記述される相同性の関係は非常に顕著である。例えば、 典型的なヘリコバクター ピロリ遺伝子産物はヒト患者から選択されたヘリコバ クター ピロリの各種株間で９２％ないし１００％の 間のアミノ酸配列の同一性を示す。また、本発明の関連ポリペプチドをコードす るヌクレオチド配列も相互に非常に類似している。例えば、本発明のポリペプチ ドのコーディング配列に由来するヌクレオチドプローブを相同な関連ポリペプチ ドをコードするヌクレオチド配列を保有するクローンを同定するためにＰＣＲま たはハイブリダイゼーション実験において用いることができる。 本発明のポリペプチド間のさらなる関係を以下の表６に記述する。以下の表６ のポリペプチドの長さは全てヘリコバクター ピロリのヌクレオチド配列中の終 止コドンから終止コドンまでである。 表６に示されるポリペプチド間の関係を以下のように記述することができる。 第一に、表６のポリペプチドの全てはそれらの長さの大部分にわたって相互に少 なくとも９０％同一であり、大部分は相互に９５％以上同一である。第二に、終 止ないし終止の長さがポリペプチドの相同組のいくつかで異なる。ある場合には 、短い方のポリペプチドが本発明の有用性を示すタンパク質の関係のある部分を 含み、ある場合には、長い方のポリペプチドが向上した有用性を示す可能性があ る。 全ての場合で、表６に記述される相同性の関係は非常に顕著である。例えば、 典型的なヘリコバクター ピロリ遺伝子産物はヒト患者から選択されたヘリコバ クター ピロリの各種株間で９２％ないし１００％の間のアミノ酸配列の同一性 を示す。また、本発明の関連ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列も相互 に非常に類似している。例えば、本発明のポリペプチドのコーディング配列に由 来するヌクレオチドプローブを相同な関連ポリペプチドをコードするヌクレオチ ド配列を保有するクローンを同定するためにＰＣＲまたはハイブリダイゼーショ ン実験において用いることができる。 IV ．ワクチン成分及びヘリコバクター ピロリに対して有効な薬剤の標的をコー ドする核酸の同定 開示されたヘリコバクター ピロリゲノム配列はリボ核酸及びポリペプチドの 合成を導くセグメント並びに複製起点、プロモーター、他の型の調節配及び遺伝 子間核酸を含む。本発明はワクチンの免疫原性成分及びヘリコバクター ピロリ に対して有効な薬剤の標的をコードする核酸の同定を包含する。この同定の重要 な特徴は開示された配列の機能を決定することであり、様々な方法を用いてこれ を実施することができる。これらの方法の限定されない実施例を以下に簡潔に記 述する。 既知の配列に対する相同性：公的に利用できるデータベースに存在する以前に 報告された配列と開示されたヘリコバクター ピロリ配列のコンピューター補助 分析は、機能的なヘリコバクター ピロリ核酸及びポリペプチド配列を同定する ための有用な手段である。例えば、タンパク質をコードする配列を全体として比 較することができ、そして２つのタンパク質間のアミノ酸レベルでの（例えば、 ＞８０−９０％のような）高度な配列の相同性はこれら２つのタンパク質が例え ば代謝、ＤＮＡ合成または細胞壁合成に関与する酵素、及び輸送、細胞分裂等に 関与するタンパク質のようなある程度の機能的相同性も有することを強く示唆す ると理解される。さらに、特定のタンパク質の種類の多数の構造的特徴が同定さ れており、これらは例えば、ヌクレオチド、ＤＮＡ、金属イオン及び他の小分子 の結合ドメイン；リン酸化、アシル化等のような共有結合的修飾の部位；タンパ ク質：タンパク質相互作用の部位等のような特定の共通配列と相関関係がある。 これらの共通配列はかなり短くてもよく、従って、全タンパク質コーディン配列 のほんの一部分に相当する 可能性がある。従って、ヘリコバクター ピロリ配列中のそのような特徴の同定 は、コードされるタンパク質の機能の決定及び有効な可能性のある抗菌薬の標的 の同定に有用である。 本発明に特に関係するものは分泌シグナルペプチド及び疎水性膜貫通ドメイン を初めとする、分泌、膜貫通及び表面タンパク質に共通の構造的特徴である。推 定されるシグナル配列及び／または膜貫通ドメインを含むと同定されるヘリコバ クター ピロリタンパク質はワクチンの免疫原性成分として有用である。必須遺伝子の同定：ヘリコバクター ピロリの生育または生存能力のために必 須であるタンパク質をコードする核酸は好ましい薬剤標的である。関係分野の従 事者に知られている技術を用いて遺伝子を欠失及び／または破壊する効果を調べ ることにより、すなわち、いわゆる遺伝子「ノックアウト」によりヘリコバクタ ー ピロリ遺伝子をその生物に対するそれらの生物学的関連性に関して試験する ことができる。このようにして、必須遺伝子を同定することができる。 株特異的配列：異なるヘリコバクター ピロリ株間の進化的関係のために、現 在開示されているヘリコバクター ピロリ配列は、以前に知られているヘリコバ クター ピロリ株と新しい株を同定し、そして／またはこれらを識別するために 有用であると考えられる。正しいかどうかは本発明に必須ではないけれども、他 のヘリコバクター ピロリ株は現在開示された配列と少なくとも７０％の配列相 同性を示すと考えられる。ヘリコバクター ピロリ株を含有するサンプルから得 られるＤＮＡ配列の体系的且つ慣例的な分析及び本発明の配列との比較により、 株間を識別するために用いることができる配列及び全てのヘリコバクター ピロ リ株に共通のものを同定することができる。一つの態様として、本発明はヘリコ バクター ピロリの各種株を識別するプローブを初めとする核酸並びにペプチド 及びポリペプチド配列を提供する。また、１種またはそれ以上のヘリコバクター ピロリ株を選択的に認識する抗体を誘導するかまたはそれらと反応する能力に より株特異的成分を機能的に同定することもできる。 別の態様として、本発明 は全てのヘリコバクターピロリ株に共通であるが、他のバクテリア種には見いだ されないプローブを初めとする核酸並びにペプチド及びポリペプチド配列を提供 する。特定の実施例：抗体及びワクチン開発のための候補タンパク質抗原の決定 ワクチン開発のための候補タンパク質抗原の選択をヘリコバクターピロリポリ ペプチドをコードする核酸から得ることができる。まず、ＯＲＦを他の既知の輸 出または膜タンパク質に対する相同性に関して分析することができ、輸出及び膜 タンパク質を予想するためにＫｅｌｉｎ等により記述された判別解析（Ｋｌｅｉ ｎ、Ｐ．、Ｋａｎｅｈｓｉａ、Ｍ．及びＤｅＬｉｓｉ、Ｃ．（１９８５）Ｂｉｏ ｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ ８１５、４６８−４ ７６）を用いて分析することができる。 各々の予想されるＯＲＦアミノ酸配列を現在のＧｅｎＢａｎｋ、ＳＷＩＳＳ− ＰＲＯＴ及びＰＩＲデータベースに見いだされる全ての配列と比較するために、 ウィスコンシン配列分析パッケージ（Ｗｉｓｃｏｎｓ ｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ）（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ、 Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ５３７１１）に含まれるＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いて 相同性検索を実施することができる。ＢＬＡＳＴはＯＲＦとデータバンク配列の 間の局所的な並びを検索し、データベースで偶然この配列を見いだす確率を示す 確率スコアを報告する。膜または輸出タンパク質に著しい相同性を有するＯＲＦ （例えば、１ｘ１０（ｅｅ−６）よりよい確率）はワクチン開発のための適当な タンパク質抗原である。他の生物のクローン化された遺伝子に対する配列の相同 性に基づいてヘリコバクター ピロリ遺伝子に可能な機能を与えることができる 。 ＯＲＦアミノ酸配列を調べるために判別解析（Ｋｌｅｉｎ等、上記）を用いる ことができる。このアルゴリズムはＯＲＦアミノ酸配列に含まれる固有の情報を 用い、それを既知の膜及び輸出タンパク質の特性から得られた情報と比較する。 この比較はどのタンパク質が輸出、膜結合または細胞質であるかを予想する。こ のアルゴリズムにより輸出または膜結合と同定されるＯＲＦアミノ酸配列はワク チン開発のための適当なタンパク質抗原である。 表面に露出した外膜タンパク質はヘリコバクター ピロリに対する防護的免疫 反応をもたらす最も優れた抗原であると思われる。これらの外膜タンパク質の予 想を助けるために用いることができるアルゴリズムの中には、それらのＣ末端の 両親媒性β−シート領域の存在を含む。グラム陰性細菌の非常に多数の外膜タン パク質で検出されているこの領域は、しばしば、Ｃ末端からおおよそ１、３、５ 、７及び９番目の位置の疎水性残基（ＰｈｅまたはＴｙｒ）を特徴とする（例え ば、図８、ブロックＦを参照）。重要なことには、これらの配列は周辺細胞質タ ンパク質のＣ末端には検出されておらず、従って、一次配列データに基づいてこ れ らのタンパク質の種類を予備的に識別することができる。このことはＳｔｒｕｙ ｖｅ等により以前に報告されている（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１８：１４１− １４８、１９９１）。 また図８に示されるものは、ヘリコバクター ピロリの多数の外膜タンパク質 に見いだされるさらなるアミノ酸配列モチーフである。図８のアミノ酸配列の並 びは（１文字アミノ酸コードで示される）１２個のヘリコバクター ピロリタン パク質の配列の一部を示し、アミノ酸配列番号で示され、そして左から右へＮ末 端からＣ末端が示される。外膜タンパク質のＣ末端近くの位置でしばしば見いだ される特有の疎水性残基（ＰｈｅまたはＴｙｒ；アミノ酸残基の１文字コードで はＦまたはＹ）を初めとする類似したアミノ酸残基の（ＡないしＦで示される） ６つの異なるブロックが見いだされる。いくつかの共有モチーフの存在はこの群 のタンパク質のメンバー間の類似性を明らかに定める。 さらに、ヘリコバクター ピロリから単離された外膜タンパク質は、図９のブ ロック化されたアミノ酸残基で示されるようにしばしば成熟Ｎ末端近くに（すな わち、分泌シグナルを取り除くプロセッシング後に）モチーフを共有する。図９ は（アミノ酸配列番号により示され、左から右へＮ末端からＣ末端が示される） ９個のヘリコバクター ピロリタンパク質のＮ末端部分を示す。 これらの共通配列モチーフが非常に重要であり、この群のタンパク質間の類似 性を定めることを当業者は理解する。 時折、核酸配列の与えられた位置で複数の可能なヌクレオチドを識別すること が可能ではない。それらの場合、その不明瞭さを以下のように増補アルファベッ トで示す。 これらは公式のＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ１文字塩基コードである。コード 塩基 Ｇ グアニン Ａ アデニン Ｔ チミン Ｃ シトシン Ｒ プリン （ＡまたはＧ） Ｙ ピリミジン （ＣまたはＴまたはＵ） Ｍ アミノ （ＡまたはＣ） Ｋ ケトン （ＧまたはＴ） Ｓ 強い相互作用 （ＣまたはＧ） Ｗ 弱い相互作用 （ＡまたはＴ） Ｈ Ｇ以外 （ＡまたはＣまたはＴ） Ｂ Ａ以外 （ＣまたはＧまたはＴ） Ｖ Ｔ以外（Ｕ以外） （ＡまたはＣまたはＧ） Ｄ Ｃ以外 （ＡまたはＧまたはＴ） Ｎ 全て （ＡまたはＣまたはＧまたはＴ） 本発明のアミノ酸翻訳は不明瞭なコドンを文字「Ｘ」として翻訳することによ り核酸配列の不明瞭さを明らかにする。全ての場合で、ある位置で許容されるア ミノ酸残基は、標準的な遺伝子コードに基づいて核酸配列を調べることから明ら かである。Ｖ．ヘリコバクター ピロリ核酸及びポリペプチドのフラグメント及び類似体の 生成 配列表に示されるヘリコバクター ピロリ遺伝子産物の発見に基づい て、当業者は例えば、フラグメントまたは類似体を生成することにより（ヘリコ バクター ピロリ遺伝子の）開示された構造を改変し、新しく生成された構造を 活性に関して試験することができる。フラグメント及び類似体の生成及び試験を 可能にする関連分野の従事者に知られている技術の例を以下に説明する。これら または類似した方法をポリペプチドのライブラリー、例えばランダムペプチドの ライブラリーまたは細胞タンパク質のフラグメントもしくは類似体のライブラリ ーを作製し、ヘリコバクター ピロリポリペプチドを結合する能力に関してスク リーニングするために用いることができる。そのようなスクリーニングはヘリコ バクター ピロリのインヒビターの発見のために有用である。 フラグメントの生成 タンパク質のフラグメントをいくつかの方法、例えば、組み換えで、タンパク 質分解消化により、または化学合成により生成することができる。ポリペプチド をコードする核酸の（末端フラグメントでは）一方の末端または（内部フラグメ ントでは）両方の末端から１個またはそれ以上のヌクレオチドを取り除くことに よりポリペプチドの内部または末端フラグメントを生成することができる。突然 変異を起こさせたＤＮＡの発現はポリペプチドフラグメントを生じる。従って、 「末端を少しずつ削り取る」エンドヌクレーゼでの消化は一連のフラグメントを コードするＤＮＡを生じることができる。タンパク質のフラグメントをコードす るＤＮＡをランダム剪断、制限消化または上に説明した方法の組み合わせによっ ても生成することができる。 また、フラグメントを通常のメリフィールド固相ｆ−Ｍｏｃまたはｔ−Ｂｏｃ 化学のような当該技術分野で知られている技術を用いて化学的 に合成することもできる。例えば、本発明のペプチドをフラグメントの重複を含 まない適切な長さのフラグメントに任意に分けるかまたは適切な長さの重複する フラグメントに分けることができる。 核酸及びポリペプチドの改変：ランダム法 タンパク質またはタンパク質の特定のドメインもしくは領域をコードするＤＮ Ａのランダム突然変異生成により、タンパク質のアミノ酸配列変異体を調製する ことができる。有用な方法はＰＣＲ突然変異生成及び飽和突然変異生成を含む。 また、一組の縮重オリゴヌクレオチド配列の合成によってもランダムアミノ酸配 列変異体のライブラリーを作製することができる（変異体のライブラリーのタン パク質をスクリーニングする方法は本明細書の他の所にある）。 （Ａ）ＰＣＲ突然変異生成 ＰＣＲ突然変異生成では、クローン化されたＤＮＡのフラグメント中にランダ ムな突然変異を導入するためにＴａｑポリメラーゼの減少したフィデリティーを 用いる（Ｌｅｕｎｇ等、１９８９、Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ １：１１−１５）。Ｔ ａｑＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成のフィデリティーを減少する条件下で ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて、例えば５のｄＧＴＰ／ｄＡＴＰ比を 用いて且つＰＣＲ反応にＭｎ²⁺を添加することにより、突然変異を起こさせるＤ ＮＡ領域を増幅する。増幅されたＤＮＡフラグメントのプールを適切なクローニ ングベクター中に挿入してランダム突然変異体ライブラリーを生じる。 （Ｂ）飽和突然変異生成 飽和突然変異生成により、クローン化されたＤＮＡフラグメント中に非常に多 数の単一塩基置換を迅速に導入するこができる（Ｍａｙｅｒ ｓ等、１９８５、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：２４２）。この技術は、例えばイン ビトロで一本鎖ＤＮＡを化学処理または照射し、そしてＤＮＡ相補鎖を合成する ことにより突然変異を生成することを含む。処理の厳しさを調整することにより 突然変異の頻度を調節することができ、本質的に全ての可能な塩基置換を得るこ とができる。この方法は突然変異体フラグメントの遺伝的選択を含まないので、 中立置換及び機能を変えない置換の両方が得られる。点突然変異の分布は保存配 列成分に偏らない。 （Ｃ）縮重オリオヌクレオチド 一組の縮重オリオヌクレオチド配列からも相同体のライブラリーを作製するこ とができる。縮重配列の化学合成を自動ＤＮＡ合成機で実施し、次に合成遺伝子 を適切な発現ベクター中に連結することができる。縮重オリオヌクレオチドの合 成は当該技術分野で知られている（例えば、Ｎａｒａｎｇ、ＳＡ（１９８３）Ｔ ｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ３９：３；Ｉｔａｋｕｒａ等（１９８１）Ｒｅｃｏｍｂ ｉｎａｎｔ ＤＮＡ，Ｐｒｏｃ ３ｒｄ Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ Ｓｙｍｐｏｓ． Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ 、ＡＧ Ｗａｌｔｏｎ編集、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ ：Ｅｌｓｅｖｉｅｒ ｐｐ２７３−２８９；Ｉｔａｋｕｒａ等（１９８４）Ａｎ ｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｃｈｏｅｍ ．５３：３２３；Ｉｔａｋｕｒａ等（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８：１０５６；Ｉｋｅ等（１９８３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａ ｃｉｄ Ｒｅｓ ．１１：４７７を参照）。そのような技術は他のタンパク質の誘 導進化に用いられている（例えば、Ｓｃｏｔｔ等（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３８６−３９０；Ｒｏｂｅｒｔｓ等（１９９２）ＰＮＡＳ ８９：２４ ２９−２４３３；Ｄｅｖｌｉｎ等（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：４０４ − ４０６；Ｃｗｉｒｌａ等（１９９０）ＰＮＡＳ ８７：６３７８−６３８２；並 びに米国特許番号第５，２２３，４０９号、第５，１９８，３４６号及び第５， ０９６，８１５号を参照）。 核酸及びポリペプチドの改変：選択的突然変異生成の方法 非ランダムまたは選択的突然変異生成技術を用いて特定の領域に特定の配列ま たは突然変異を生じることができる。これらの技術を用いてタンパク質の既知の アミノ酸配列の残基の例えば欠失、挿入または置換を初めとする変異体を作製す ることができる。例えば、（１）まず、保存的アミノ酸で置換し、次に得られた 結果によってはより極端な選択で置換するか、（２）標的残基を除くか、または （３）定めた部位の近くに同じかもしくは異なる種類の残基を挿入するか、ある いは選択肢１−３の組み合わせにより、突然変異部位を個々にかまたは順次修飾 することができる。 （Ａ）アラニン走査突然変異生成 アラニン走査突然変異生成は、所望するタンパク質の突然変異生成のために好 ましい位置またはドメインである残基または領域を同定するための有用な方法で ある、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ及びＷｅｌｌｓ（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１０８ １−１０８５、１９８９）。アラニン走査では、標的残基の残基または基（例え ば、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ及びＧｌｕのような荷電した残基）を同定 し、中性または負に荷電したアミノ酸（最も好ましくはアラニンまたはポリアラ ニン）で置換する。アミノ酸の置換は細胞の中または外側の周りの水性環境とア ミノ酸の相互作用に影響を及ぼす可能性がある。次に、これらの置換に対して機 能的感受性を示すドメインを置換の部位にさらなる変異かまたは代わ りに他の変異を導入することにより純化する。従って、アミノ酸配列変異を導入 する部位は前以て決められているけれども、突然変異自体の特性は前以て決めら れている必要はない。例えば、特定の部位での突然変異の成果を最適にするため に、アラニン走査またはランダム突然変異生成を標的コドンまたは領域で実施す ることができ、発現される所望するタンパク質サブユニット変異体を所望する活 性の最適な組み合わせに関してスクリーニングする。 （Ｂ）オリゴヌクレオチドが媒介する突然変異生成 オリゴヌクレオチドが媒介する突然変異生成はＤＮＡの置換、欠失及び挿入変 異体を調製するための有用な方法である、例えば、Ａｄｅｌｍａｎ等、（ＤＮＡ ２：１８３、１９８３）を参照。簡潔に言えば、突然変異をコードするオリゴ ヌクレオチドをＤＮＡ鋳型にハイブリダイズさせることにより所望するＤＮＡを 改変し、ここで鋳型は所望するタンパク質の改変されていないかまたは天然のＤ ＮＡ配列を含有する一本鎖型のプラスミドまたはバクテリオファージである。ハ イブリダイゼーション後に、ＤＮＡポリメラーゼを用いて鋳型のもう一方の全相 補鎖を合成し、従ってこれはオリゴヌクレオチドプライマーを含んでおり、所望 するタンパク質ＤＮＡ中に選択した改変をコードする。通例、少なくとも２５ヌ クレオチドの長さのオリゴヌクレオチドを用いる。最適なオリゴヌクレオチドは 突然変異をコードするヌクレオチドの両側で鋳型に完全に相補的な１２ないし１ ５ヌクレオチドを有する。これにより、オリゴヌクレオチドが一本鎖のＤＮＡ鋳 型分子に正確にハイブリダイズすることが保証される。オリゴヌクレオチドはＣ ｒｅａ等（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７５：５７６５［ １９７８］）に より記述されたような当該技術分野で知られている技術を用いて容易に合成され る。 （Ｃ）カセット突然変異生成 変異体を調製するための別の方法であるカセット突然変異生成はＷｅｌｌｓ等 （Ｇｅｎｅ、３４：３１５［１９８５］）により記述された技術に基づく。開始 材料は突然変異させるタンパク質サブユニットＤＮＡを含むプラスミド（または 他のベクター）である。突然変異させるタンパク質サブユニットＤＮＡのコドン を同定する。同定された突然変異部位の各側に唯一の制限エンドヌクレアーゼ部 位がなければならない。そのような制限部位が存在しない場合、所望するタンパ ク質サブユニットＤＮＡ中の適切な場所にそれらを導入するために上記のオリゴ ヌクレオチドが媒介する突然変異生成法を用いてそれらを作製することができる 。プラスミドに制限部位を導入した後、プラスミドをこれらの部位で切断して直 鎖状にする。制限部位の間のＤＮＡの配列をコードするが所望する突然変異を含 んでいる二本鎖のオリゴヌクレオチドを標準的な方法を用いて合成する。２本鎖 を別個に合成し、次に標準的な技術を用いて一緒にハイブリダイズさせる。この 二本鎖オリゴヌクレオチドをカセットと呼ぶ。このカセットはプラスミドに直接 連結することができるように、直鎖状にしたプラスミドの末端に適合する３’及 び５’末端を有するように設計される。このプラスミドは今や突然変異した所望 するタンパク質サブユニットＤＮＡ配列を含む。 （Ｄ）組み合わせ突然変異生成 突然変異体を作製するために組み合わせ突然変異生成も用いることができる（ Ｌａｄｎｅｒ等、ＷＯ第８８／０６６３０号）。この方法では、 好ましくは可能な最も高い相同性を促進するように一群の相同体または他の関連 タンパク質のアミノ酸配列を並べる。並べた配列の特定の部位に現れるアミノ酸 の全てを組み合わせ配列の縮重組を作製するために選択することができる。変異 体の多様なライブラリーが核酸レベルで組み合わせ突然変異生成により作製され 、多様な遺伝子ライブラリーによりコードされる。例えば、縮重組の可能な配列 が個々のペプチドとしてかまたは縮重配列の組を含有する一組のより大きい融合 タンパク質として発現できるように、合成オリゴヌクレオチドの混合物を遺伝子 配列中に酵素的に連結することができる。 ヘリコバクター ピロリ核酸及びポリペプチドの他の修飾 可溶性を増し、安定性を高める（例えば、エクスビボでの保存寿命及びインビ ボでのタンパク質分解に対する耐性）ような目的のためにヘリコバクター ピロ リポリペプチドの構造を修飾することが可能である。本明細書に記述されるよう なアミノ酸置換、欠失または付加によるような、アミノ酸配列が改変されている 修飾されたヘリコバクター ピロリタンパク質またはペプチドを生成することが できる。 また、ジスルフィド結合による二量化を最低限にするためにシステイン残基を 好ましくはアラニン、セリン、トレオニン、ロイシンまたはグルタミン酸残基で 置換することによりヘリコバクター ピロリペプチドを修飾することもできる。 さらに、本発明のタンパク質のフラグメントのアミノ酸側鎖を化学的に修飾する ことができる。別の修飾はペプチドの環化である。 安定性及び／または反応性を高めるために、あらゆる自然対立遺伝子変異から 生じるタンパク質のアミノ酸配列中の１つまたはそれ以上の多 型を含むようにヘリコバクター ピロリポリペプチドを修飾することができる。 さらに、Ｄ−アミノ酸、非天然のアミノ酸または非アミノ酸類似体を置換または 添加して本発明の範囲内の修飾タンパク質を生成することができる。さらに、Ａ ．Ｓｅｈｏｎ及び共同研究者（Ｗｉｅ等、上記）の方法に従ってポリエチレング リコール（ＰＥＧ）を用いてヘリコバクター ピロリポリペプチドを修飾してＰ ＥＧと結合したタンパク質を生成することができる。さらに、ＰＥＧをタンパク 質の化学合成の間に添加することができる。ヘリコバクター ピロリの他の修飾 は還元／アルキル化（Ｔａｒｒ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｉ ｃｒｏｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ 、Ｊ．Ｅ．Ｓｉｌｖｅｒ編集、Ｈｕｍ ａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｌｉｆｔｏｎ ＮＪ １５５−１９４（１９８６））； アシル化（Ｔａｒｒ、上記）；適切な担体への化学結合（Ｍｉｓｈｅｌｌ及びＳ ｈｉｉｇｉ編集、Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ 、ＷＨ Ｆｒｅｅｍａｎ、Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ 、ＣＡ（１９８０）、米国特許第４，９３９，２３９号）；または穏やかなホル マリン処理（Ｍａｒｓｈ、（１９７１）Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ．ｏｆ Ａｌｌｅｒｇ ｙ ａｎｄ Ａｐｐｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ 、４１：１９９−２１５）を含む。 ヘリコバクター ピロリタンパク質またはペプチドの精製を容易にし、そして 潜在的に可溶性を増加するために、ペプチド主鎖にアミノ酸融合成分を添加する ことが可能である。例えば、固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィ ーによる精製のためにヘキサ−ヒスチジンをタンパク質に添加することができる （Ｈｏｃｈｕｌｉ、Ｅ．等、（１９８８）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、６： １３２１−１３２５）。さ らに、関係のない配列を含まないペプチドの単離を容易にするために、融合成分 の配列とペプチドの間に特定のエンドプロテアーゼ切断部位を導入することがで きる。 ヘリコバクター ピロリポリペプチド内のエピトープの適切な抗原プロセッシ ングを潜在的に促進するために、組み換えまたは合成法により各々少なくとも１ つのエプトープを含んでなる領域間に一般的なプロテアーゼ感受性部位を設計す ることができる。例えば、組み換え体の構築中にＫＫまたはＲＲのような荷電し たアミノ酸組をタンパク質またはフラグメント内の領域間に導入することができ る。得られるペプチドをカテプシン及び／または他のトリプシン様酵素による切 断に感受性にすることができ、これにより１つまたはそれ以上のエプトープを含 有するタンパク質の部分を生じる。さらに、そのように荷電したアミノ酸残基は ペプチドの安定性の増加をもたらすことができる。 ポリペプチド及び類似体をスクリーニングするための主な方法 生成した突然変異体遺伝子産物をスクリーニングするための様々な技術が当該 技術分野で知られている。大きい遺伝子ライブラリーをスクリーニングするため の技術はしばしば遺伝子ライブラリーを複製可能な発現ベクター中にクローニン グし、得られたベクターのライブラリーで適切な細胞を形質転換し、そして所望 する活性の検出、例えばこの場合ヘリコバクター ピロリポリペプチドに結合す るかまたは相互作用するタンパク質、によりその産物を検出した遺伝子をコード するベクターの比較的容易な単離が促進される条件下で遺伝子を発現することを 含む。以下に記述する技術の各々は例えばランダム突然変異生成技術により作製 された非常に多数の配列をスクリーニングするための高処理量分析を容 易にすることができる。（Ａ）２ハイブリッド系 （本明細書に記述される他のスクリーニング方法でのように）上記の系のよう な２ハイブリッドアッセイをポリペプチド、例えば天然に存在するヘリコバクタ ー ピロリポリペプチド、例えば細胞タンパク質の、またはヘリコバクター ピ ロリタンパク質に結合するランダムに作製されたポリペプチドのフラグメントも しくは類似体を同定するために用いることができる。（ヘリコバクター ピロリ ドメインを餌タンパク質として用い、変異体のライブラリーを魚の融合タンパク 質として発現させる。）同様に、（本明細書に記述される他のスクリーニング方 法でのように）２ハイブリッドアッセイをヘリコバクター ピロリポリペプチド を結合するポリペプチドを見いだすために用いることができる。 （Ｂ）表示ライブラリー アッセイをスクリーニングするための一つの方法として、候補ペプチドを細胞 またはウイルス粒子の表面上に表示させ、特定の細胞またはウイルスが表示され た生成物を介して適切なレセプタータンパク質を結合する能力を「パンニングア ッセイ」で検出する。例えば、遺伝子ライブラリーをバクテリア細胞の表面膜タ ンパク質の遺伝子中にクローン化し、得られた融合タンパク質をパンニングによ り検出することができる（Ｌａｄｎｅｒ等、ＷＯ第８８／０６６３０号；Ｆｕｃ ｈｓ等（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：１３７０−１３７１； 及びＧｏｗａｒｄ等（１９９２）ＴＩＢＳ １８：１３６−１４０）。同様に、 検出できるように標識したリガンドを潜在的に機能的なペプチド相同体を評価す るために用いることができる。蛍光で標識したリガンド、 例えばレセプターをリガンド結合活性を保持する相同体を検出するために用いる ことができる。蛍光で標識したリガンドの使用により細胞を蛍光顕微鏡下で目で 見て調べて分離することができ、または細胞の形態が許す場合、蛍光活性化セル ソーターで細胞を分離することができる。 遺伝子ライブラリーをウイルス粒子の表面上で融合タンパク質として発現する ことができる。例えば、繊維状ファージ系で外来ペプチド配列を感染性ファージ の表面上に発現することができ、それにより２つの顕著な利益を与える。第一に 、これらのファージを１ｍｌ当たり１０¹³ファージを十分に越える濃度でアフィ ニティーマトリックスに添加することができるので、非常の多数のファージを一 度にスクリーニングすることができる。第二に、各感染性ファージはその表面に 遺伝子産物を表示するので、特定のファージがアフィニティーマトリックスから 低収量で回収される場合に、もう１回の感染によりファージを増幅することがで きる。ほとんど同一である大腸菌繊維状ファージＭ１３、ｆｄ．及びｆｌの群が ファージ表示ライブラリーにおいて最も頻繁に用いられる。ウイルス粒子の最終 的なパッケージングを妨げずに融合タンパク質を生産するためにファージｇIII またはｇVIIIコートタンパク質のいずれかを用いることができる。外来エピトー プをｐIIIのＮＨ₂末端で発現させ、そのようなエピトープを保有するファージを このエピトープを欠く大過剰のファージから回収することができる（Ｌａｄｎｅ ｒ等、ＰＣＴ公開ＷＯ第９０／０２９０９号；Ｇａｒｒａｒｄ等、ＰＣＴ公開Ｗ Ｏ第９２／０９６９０号；Ｍａｒｋｓ等（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６７：１６００７−１６０１０；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ等（１９９３）ＥＭＢＯ Ｊ １２：７２５−７３４；Ｃｌａｃｋｓｏｎ等（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４−６２８；及びＢａｒｂａｓ等（１９９２）ＰＮ ＡＳ ８９：４４５７−４４６１）。 一般的な方法はペプチド融合相手として大腸菌のマルトースレセプタ−（外膜 タンパク質、ＬａｍＢ）を用いる（Ｃｈａｒｂｉｔ等（１９８６）ＥＭＢＯ ５ 、３０２９−３０３７）。オチゴヌクオチドをＬａｍＢ遺伝子をコードするプラ スミド中に挿入してタンパク質の細胞外ループの一つの中に融合したペプチドを 生産する。これらのペプチドはリガンド、例えば抗体に結合するために利用でき 、細胞を動物に投与すると免疫反応を引き出すことができる。他の細胞表面タン パク質、例えば、ＯｍｐＡ（Ｓｃｈｏｒｒ等（１９９１）Ｖａｃｃｉｎｅｓ ９ １、ｐｐ３８７−３９２）、ＰｈｏＥ（Ａｇｔｅｒｂｅｒｇ等（１９９０）Ｇｅ ｎｅ ８８、３７−４５）及びＰＡＬ（Ｆｕｃｈｓ等（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅ ｃｈ ９、１３６９−１３７２）並びにバクテリアの大きい表面構造はペプチド 表示の媒体として役立っている。重合してバクテリア間の遺伝情報の交換のため の線毛導管を形成するタンパク質であるピリンにペプチドを融合することができ る（Ｔｈｉｒｙ等（１９８９）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ．５５、９８４−９９３）。他の細胞と相互作用する役割のために、線毛はペプ チドを細胞外の環境に提示するための有用な支持体を提供する。ペプチド表示の ために用いられる別の大きい表面構造はバクテリアの運動器官の鞭毛である。サ ブユニットタンパク質フラジェリンへのペプチドの融合は宿主細胞上の多数ペプ チドコピーの密な配置を与える（Ｋｕｗａｊｉｍａ等（１９８８）Ｂｉｏ／Ｔｅ ｃｈ ６、１０８０−１０８３）。他のバクテリア種の表面タンパク質もペプチ ド融合相手として役立っている。例と してはスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）のプロテインＡ及 びナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）の外膜プロテアーゼＩｇＡを含む（Ｈａｎ ｓｓｏｎ等（１９９２）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７４、４２３９−４２４５ 及びＫｌａｕｓｅｒ等（１９９０）ＥＭＢＯ Ｊ．９、１９９１−１９９９）。 上に記述した繊維状ファージ系及びＬａｍＢ系では、ペプチドとそのコードす るＤＮＡの間の物理的連結はペプチドを表面上に保有する粒子（細胞またはファ ージ）内にＤＮＡを含むことにより生じる。ペプチドを捕捉すると粒子及びその 内部のＤＮＡを捕捉する。別の方法はＤＮＡ結合タンパク質ＬａｃＩを用いてペ プチドとＤＮＡの間の連結を生じる（Ｃｕｌｌ等（１９９２）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８９：１８６５−１８６９）。この系は３’末端にオリゴヌクレオチドクロー ニング部位を有するＬａｃＩ遺伝子を含有するプラスミドを用いる。アラビノー スによる制御された誘導下でＬａｃＩ−ペプチド融合タンパク質が生産される。 この融合物はＬａｃＯオペレーターとして知られている短いＤＮＡ配列（Ｌａｃ Ｏ）に結合するＬａｃＩの本来の能力を保持している。発現プラスミド上に２コ ピーのＬａｃＯを置くことにより、ＬａｃＩ−ペプチド融合物はそれをコードし たプラスミドにきつく結合する。各細胞中のプラスミドは単一のオリゴヌクレオ チド配列のみを含み、各細胞は単一のペプチド配列のみを発現するので、ペプチ ドはその合成を導いたＤＮＡ配列に特異的に且つ安定に結合するようになる。ラ イブラリーの細胞を穏やかに溶解し、ペプチド−ＤＮＡ複合体を固定化レセプタ ーのマトリックスにさらして活性のあるペプチドを含有する複合体を回収する。 次に、増幅及びペプチドリガンドの同一性を確認するためのＤＮＡシー クエンシングのために、結合したプラスミドＤＮＡを細胞中に再び導入する。こ の方法の実用性の実例として、ドデカペプチドの大きいランダムライブラリーを 作製し、オピオイドペプチドジノルフィンＢに対して作製したモノクローナル抗 体で選別した。ペプチド群が回収され、全てがジノルフィンＢの６残基部分に相 当する共通配列により相関した（Ｃｕｌｌ等（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，Ｕ．Ｓ．Ａ ．８９−１８６９）。 プラスミド上ペプチドとも呼ばれるこの方法はファージ表示法と２つの重要な 点で異なる。第一に、ペプチドは融合タンパク質のＣ末端に結合され、遊離カル ボキシ末端を有するペプチドとしてライブラリーメンバーの表示をもたらす。繊 維状ファージコートタンパク質、ｐIII及びｐVIIIの両方ともそれらのＣ末端に よりファージに固定され、ゲストペプチドは外側へ突き出るＮ末端ドメイン中に 配置される。ある設計では、ファージが表示するペプチドが融合タンパク質のち ょうどアミノ末端で提示される（Ｃｗｉｒｌａ等（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ ．８７、６３７８−６３８２）。第二の違い はライブラリー中に実際に存在するペプチドの集団に影響を及ぼす生物学的偏り の具合である。ＬａｃＩ融合分子は宿主細胞の細胞質にとどめられる。 ファージコート融合物は翻訳中は細胞質にしばらくの間さらされるが、内膜を通 って周辺細胞質区画中へ迅速に分泌され、ファージ粒子への集合を待ちながらペ プチドを含有するＮ末端を周辺細胞質中に突き出してＣ末端の疎水性ドメインで 膜に固定されたままとどまる。異なるタンパク質分解活性にさらされる結果、Ｌ ａｃＩ及びファージライブラリー中のペプチドは顕しく異なる可能性がある。フ ァージコートタンパク質は ファージへの組み込みに対する準備として内膜を越える輸送及びシグナルペプチ ダーゼプロセッシングを必要する。ある種のペプチドはこれらの工程に有害な影 響を及ぼし、ライブラリー中で実際より少なく示される（Ｇａｌｌｏｐ等（１９ ９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７（９）：１２３３−１２５１）。これらの特 定の偏りはＬａｃＩ表示系の要因ではない。 組み換えランダムライブラリーで利用できる小さいペプチドの数は莫大である 。１０⁷−１０⁹の別個のクローンのライブラリーが日常的に調製される。１０¹¹ 程の組み換え体のライブラリーが作製されているが、この大きさはクローンライ ブラリーの実用限界に達する。このライブラリーの大きさの限界は、無作為に選 んだセグメントを含有するＤＮＡを宿主バクテリア細胞中に形質転換する工程で 生じる。この限界を回避するために、ポリソーム複合体における発生期ペプチド の表示に基づくインビトロ系が最近開発されている。この表示ライブラリー法は 現在利用できるファージ／ファージミドまたはプラスミドライブラリーより３− ６桁大きいライブラリーを生じる可能性がある。さらに、ライブラリーの構築、 ペプチドの発現及びスクリーニングが完全に細胞を含まない形態で実施される。 この方法の１つの応用では（Ｇａｌｌｏｐ等（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅ ｍ ．３７（９）：１２３３−１２５１）、１０¹²のデカペプチドをコードする分 子ＤＮＡライブラリーが構築され、このライブラリーは大腸菌Ｓ３０インビトロ 連結転写／翻訳系で発現された。リボソームをｍＲＮＡ上に引き止め、ポリソー ムにかなりの割合のＲＮＡの蓄積を引き起こし、そしてコードするＲＮＡにまだ 結合した発生期ペプチド を含有する複合体を生じる条件が選択された。ポリソームは十分に活性があり（ ｒｏｂｕｓｔ）、より一般的な組み換えペプチド表示ライブラリーがスクリーニ ングされるのとかなり同じように固定化レセプターでアフィニティ−精製される 。結合した複合体からＲＮＡを回収し、ｃＤＮＡに転化し、ＰＣＲで増幅して次 の過程の合成及びスクリーニングのための鋳型を生じる。ポリソーム表示方法を ファージ表示系に連結することができる。数回のスクリーニング後に、ポリソー ムの濃縮したプールからのｃＤＮＡをファージミドベクター中にクローン化した 。このベクターは、コートタンパク質に融合したペプチドを表示するペプチド発 現ベクター及びペプチド同定のためのＤＮＡシークエンシングベクターの両方と して使える。ファージ上でポリソーム由来のペプチドを発現することにより、こ の形態のアフィニティー選択方法を続けるかまたはファージＥＬＩＳＡで結合活 性に関してかもしくは到達点（ｃｏｍｐｌｅｔｉｏｎ）ファージＥＬＩＳＡで結 合特異性に関して個々のクローン上のペプチドをアッセイすることができる（Ｂ ａｒｒｅｔ等（１９９２）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ ２０４、３５７−３６４ ）。活性のあるペプチドの配列を同定するために、ファージミド宿主により生産 されるＤＮＡをシークエンスする。 ポリペプチド及び類似体の二次スクリーニング 例えば、当業者がアゴニストをアンタゴニストから区別できるさらなる生物学 的活性を同定するために、上記の高処理量アッセイに二次スクリーニングを続け ることができる。用いる二次スクリーニングの型は試験する必要のある所望する 活性による。例えば、上記の一次スクリーニングのいずれかにより単離された一 群のペプチドフラグメントからアン タゴニストを同定するために目的のタンパク質とそのそれぞれのリガンド間の相 互作用を阻害する活性を用いることができるアッセイを開発することができる。 従って、フラグメント及び類似体を作製し、それらの活性を試験する方法は当 該技術分野で知られている。いったん目的のコア配列が同定されると、当業者が 類似体及びフラグメントを得るために実施することは慣例である。 ヘリバクター ピロリポリペプチドの擬似ペプチド 本発明は擬似物、例えば、ペプチドまたは非ペプチド試薬を生成するために主 題のヘリバクター ピロリポリペプチドのタンパク質結合ドメインを減少するこ とにも関する。例えば、天然に存在するリガンドに結合するヘリバクター ピロ リポリペプチドの場合、擬似ペプチドはポリペプチドのその対リガンドへの結合 を妨げることができる。ポリペプチドの分子認識に関与している主題のヘリバク ター ピロリポリペプチドの重要な残基を決定し、相互作用するポリペプチドと ヘリバクター ピロリポリペプチドの結合を競合的または非競合的に阻害するヘ リバクター ピロリ由来の擬似ペプチドを作製するために用いることができる（ 例えば、欧州特許出願ＥＰ−第４１２，７６２Ａ号及びＥＰ−Ｂ第３１，０８０ Ａ号を参照）。 例えば、走査突然変異生成を用いて、相互作用するポリペプチドを結合するこ とに関与する特定のヘリバクター ピロリポリペプチドのアミノ酸残基を位置づ けることができ、相互作用するポリペプチドに結合することにおいてそれらの残 基に似ており、それ故、相互作用するポリペプチドへのヘリバクター ピロリポ リペプチドの結合を阻害することが できる擬似ペプチド化合物（例えば、ジアゼピンまたはイソキノリン誘導体）を 作製することができ、そしてそれによりヘリバクター ピロリポリペプチドの機 能を妨げることができる。例えば、そのような残基の加水分解できないペプチド 類似体をベンゾジアゼピン（例えば、Ｆｒｅｉｄｉｎｇｅｒ等、Ｐｅｐｔｉｄｅ ｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ 中、Ｇ．Ｒ．Ｍａｒｓｈａｌ ｌ編集、ＥＳＣＯＭ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：Ｌｅｉｄｅｎ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎ ｄｓ、１９８８を参照）、アゼピン（例えば、Ｈｕｆｆｍａｎ等、Ｐｅｐｔｉｄ ｅｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ 中、Ｇ．Ｒ．Ｍａｒｓｈａ ｌｌ編集、ＥＳＣＯＭ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：Ｌｅｉｄｅｎ、Ｎｅｔｈｅｒｌａ ｎｄｓ、１９８８を参照）、置換されたガンマラクタム環（Ｇａｒｖｅｙ等、Ｐ ｅｐｔｉｄｅｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ 中、Ｇ．Ｒ．Ｍ ａｒｓｈａｌｌ編集、ＥＳＣＯＭ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：Ｌｅｉｄｅｎ、Ｎｅｔ ｈｅｒｌａｎｄｓ、１９８８）、ケトメチレンプソイドペプチド（Ｅｗｅｎｓｏ ｎ等（１９８６）Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ２９：２９５；及びＥｗｅｎｓｏｎ等 Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ（第９回 Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍの紀要）中 Ｐｉｅｒ ｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．Ｒｏｃｋｌａｎｄ、ＩＬ、１９８５）、β−タ ーンジペプチドコア（Ｎａｇａｉ等（１９８５）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅ ｔｔ ２６：６４７；及びＳａｔｏ等（１９８６）Ｊ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｐｅ ｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ １：１２３１）及びβ−アミノアルコール（Ｇｏｒｄｏ ｎ等（１９８５）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ １ ２６：４１９； 及びＤａｎｎ等（１９８６）Ｂｉｏｃｈｅｍ ＢｉｏｐｈｙＳ Ｒｅｓ Ｃｏｍ ｍｕｎ １３４：７１）を用いて作製することができる。VI ．ヘリバクター ピロリ核酸及びポリペプチドのワクチン配合物 本発明は、ヘリバクター ピロリによる感染の防護またはグラム陰性のらせん 微好気性細菌のヘリバクター ピロリ感染の処置のためのワクチン組成物の特徴 も記述する。一つの態様として、ワクチン組成物はヘリバクター ピロリの表面 タンパク質のような１種またはそれ以上の免疫原性成分またはそれらの一部及び 製薬学的に受容しうる担体を含有する。本発明の範囲内の核酸はヘリバクター ピロリ表面タンパク質をコードする配列表に示される核酸により例示される。し かしながら、細胞で発現することができる、免疫原性ヘリバクター ピロリタン パク質をコードするあらゆる核酸またはそれらの一部を本発明に用いることがで きる。これらのワクチンは治療及び予防の有用性がある。 本発明の１つの態様として、ヘリバクター ピロリタンパク質の少なくとも１ つの免疫原性フラグメント及び製薬学的に受容しうる担体を含有するヘリバクタ ー ピロリによる感染に対する保護のためのワクチン組成物が提供される。好ま しいフラグメントは少なくとも約１０アミノ酸残基の長さ、好ましくは約１０− ２０アミノ酸残基の長さ、より好ましくは約１２−１６アミノ酸残基の長さのペ プチドを含む。 例えば、全長のヘリバクター ピロリタンパク質をコードする核酸の対応する フラグメントから組み換えで生産されるポリペプチドをスクリーニングすること により、本発明の免疫原性成分を得ることができる。さらに、通常のメリフィー ルド固相ｆ−Ｍｏｃまたはｔ−Ｂｏｃ化学のような当該技術分野で知られている 技術を用いてフラグメントを化学的 に合成することができる。 １つの態様として、ペプチドのＴ細胞を刺激する能力により免疫原性成分を同 定する。例えば、Ｔ細胞増殖またはサイトカイン分泌により測定されるようなＴ 細胞を刺激するペプチドは本明細書において少なくとも１つのＴ細胞エピトープ を含んでなると定義される。Ｔ細胞エピトープはアレルギーの臨床症状の原因で あるタンパク質アレルゲンに対する免疫反応の開始及び永続に関与すると考えら れる。これらのＴ細胞エピトープは抗原提示細胞の表面上の適切なＨＬＡ分子に 結合し、それによりエピトープに関係のあるＴ細胞レセプターを有するＴ細胞亜 集団を刺激することによりＴヘルパー細胞のレベルで初期事象を引き起こすと考 えられる。これらの事象はＴ細胞増殖、リンホカイン分泌、局所的炎症反応、抗 原／Ｔ細胞相互作用部位へのさらなる免疫細胞の漸増、及び抗体の生産をもたら すＢ細胞カスケードの活性化を生じる。Ｔ細胞エピトープはＴ細胞レセプターに よる認識の基本成分または最も小さい単位であり、この場合、エピトープはレセ プター認識に必須であるアミノ酸を含んでなる（例えば、約６ないし７アミノ酸 残基）。Ｔ細胞エピトープのものに似ているアミノ酸配列は本発明の範囲内であ る。 別の態様として、本発明の免疫原性成分をゲノムワクチン接種から同定する。 基本的なプロトコルは病原体ゲノム、例えばヘリバクター ピロリゲノムの全部 または一部からなる発現ライブラリーが、受容者を遺伝子で免疫にするために用 いられた場合に保護を与えることができるという考えに基づく。この発現ライブ ラリー免疫（ＥＬＩ）は発現クローニングに類似しており、遺伝子ワクチンとし て作用することができる病原体、例えばヘリバクター ピロリのゲノム発現ライ ブラリーをプラス ミド中に移すことを含む。また、体液性反応を劇的に刺激することができる遺伝 子アジュバントをコードするようにプラスミドを設計することもできる。これら の遺伝子アジュバントを離れた部位に導入することができ、これらは細胞内と同 様に細胞外でも作用する。 これは生／弱毒化病原体の多数の利点を有するが感染の危険のないワクチン製 造のための新規な方法である。病原体ＤＮＡの発現ライブラリーを用いて受容者 を免疫し、それにより危険なしに生ワクチンの抗原提示の効果を生じる。例えば 、本発明では、ヘリバクター ピロリゲノムまたはコスミドもしくはプラスミド クローンからのランダムなフラグメント、及びゲノムシークエンシングにより同 定された遺伝子からのＰＣＲ産物を用いて受容者を免疫することができる。この 方法の実現可能性はマイコプラズマプルモニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｕｌ ｍｏｎｉｓ で例証されており（Ｂａｒｒｙ等、Ｎａｔｕｒｅ ３７７：６３２− ６３５、１９９５）、この場合、齧歯類の天然の病原体であるマイコプラズマプ ルモニスの部分的発現ライブラリーでさえこの病原体からの攻撃に対して防護を 与えた。 ＥＬＩは候補遺伝子をスクリーニングするために免疫系を用いるので、ＥＬＩ は病原体の生物学についてほとんど知られていない場合でさえ非感染性の多くの 部分からなる（ｍｕｌｔｉｐａｒｔｉｔｅ）ワクチンを製造することができる技 術である。いったん単離されると、これらの遺伝子を遺伝子ワクチンとしてかま たは組み換えタンパク質ワクチンの開発のために用いることができる。従って、 ＥＬＩは体系的な大部分機械化されたワクチンの製造を可能にする。 いくつかの異なるアッセイの１つまたはそれ以上を用いて免疫原性成 分のスクリーニングを達成することができる。例えば、インビトロで、Ｔ細胞培 養において免疫原性とわかっているかまたは思われているペプチドを適切なＭＨ Ｃ分子を提示する抗原提示細胞と接触させることによりペプチドＴ細胞刺激活性 をアッセイする。適切なＭＨＣ分子と結合した免疫原性ヘリコバクター ピロリ ペプチドを必要な同時刺激と共にＴ細胞に提示することは、サイトカイン、特に インターロイキン−２及びインターロイキン−４の増加したレベルの生産を誘導 するシグナルをＴ細胞に伝達する効果を有する。細胞上清を得てインターロイキ ン−２または他の既知のサイトカインに関してアッセイすることができる。例え ば、引用することにより関係がある部分が本明細書に組み込まれるＰｒｏｃ．Ｎ ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６；１３３３（１９８９）に記述された アッセイのようなインターロイキン−２のいくつかの通常のアッセイのいずれで も用いることができる。インターフェロンの生産のアッセイのためのキットもＧ ｅｎｚｙｍｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）から入手 できる。 あるいは、Ｔ細胞増殖の一般的なアッセイはトリチウムを含むチミジンの取り 込みを測定することを伴う。培養細胞の複製するＤＮＡ中に取り込まれる³Ｈで 標識されたチミジンの量を測定することによりＴ細胞の増殖をインビトロで測定 することができる。従って、ＤＮＡ合成の速度及び次に細胞分裂の速度を定量す ることができる。 免疫原性成分（例えば、ヘリコバクター ピロリポリペプチドもしくはそのフ ラグメントまたはヘリコバクター ピロリポリペプチドもしくはそのフラグメン トをコードする核酸）を含有する本発明のワクチン組成物は好ましくは製薬学的 に受容しうる担体を含む。「製薬学的に受容 しうる担体」という用語は、投与される患者においてアレルギー反応または他の 都合の悪い作用を引き起こさない担体をさす。好適な製薬学的に受容しうる担体 は、例えば水、生理的食塩水、リン酸緩衝食塩水、デキトロース、グリセロール 、エタノール等の１つまたはそれ以上及びこれらの組み合わせを含む。製薬学的 に受容しる担体は湿潤剤または乳化剤のような微量の補助物質、抗体の保存寿命 または有効性を高める防腐剤またはバッファーをさらに含んでなることができる 。ヘリコバクター ピロリポリペプチドを含有する本発明のワクチンでは、ポリ ペプチドは好適なアジュバントと同時投与される。 本発明のＤＮＡまたはタンパク質の治療的に有効量がとりわけ投与計画、投与 される抗体の単位服用量、タンパク質またはＤＮＡが他の治療薬と組み合わせて 投与されるかどうか、患者の免疫状態及び健康、並びに特定のタンパク質または ＤＮＡの治療活性によることは当業者に明らかである。 ワクチン組成物は通常非経口的に、例えば皮下または筋肉内のいずれかに注射 により投与される。筋肉内免疫の方法はＷｏｌｆｆ等（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃ ｅ ２４７：１４６５−１４６８及びＳｅｄｅｇａｈ等（１９９４）Ｉｍｍｕｎ ｏｌｏｇｙ ９１：９８６６−９８７０により記述されている。他の投与形態は 経口及び肺の配合物、座薬並びに経皮添加を含む。経口免疫はヘリコバクター ピロリによる感染に対して防護を誘導することに関して非経口的方法より好まし い。Ｃｚｉｎｎ等（１９９３）Ｖａｃｃｉｎｅ １１：６３７−６４２。経口配 合物は例えば製薬等級のマンニトール、ラクトース、澱粉、ステアリン酸マグネ シウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム 等のような通常用いられる賦形剤を含む。 本発明のワクチン組成物は水酸化アルミニウム；Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ −トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）；Ｎ−アセチル−ノル− ムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ＣＧＰ １１６３７、ｎｏｒ− ＭＤＰと呼ばれる）；Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミ ニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３ −ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＣＧＰ １９８３５Ａ、ＭＴ Ｐ−ＰＥと呼ばれる）；バクテリアからの３成分を含むＲＩＢＩ；モノホスホリ ル脂質Ａ；トレハロースジミコロエート；２％スクアレン／Ｔｗｅｅｎ８０エマ ルジョン中の細胞壁骨格（ＭＰＬ ＋ ＴＤＭ ＋ ＣＷＳ）；及びコレラ毒素を初 めとするがこれらに限定されないアジュバントを含むことができる。用いること ができる他のものはＢサブユニットを初めとするコレラ毒素の無毒な誘導体、及 び／またはコレラ毒素もしくはそのＢサブユニット、プロコレラゲノイド、シゾ フィラン（ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌａｎ）を初めとする真菌の多糖、ムラミルジ ペプチド、ムラミルジペプチド誘導体、ホルボールエステル、大腸菌の不安定毒 素、非ヘリコバクター ピロリバクテイアライセート、ブロック重合体またはサ ポニンとヘリコバクター ピロリポリのコジュゲートもしくは遺伝子工学による 融合物である。 他の好適な運搬方法は生物分解性マイクロカプセルまたは免疫刺激複合体（Ｉ ＳＣＯＭｓ）またはリポソーム、ウイルスもしくはバクテリアのような遺伝子工 学による弱毒化生ベクター、及び組み換え（キメラ）のウイルス様粒子、例えば ブルータング（ｂｌｕｅｔｏｎｇｕｅ）を含 む。用いるアジュバントの量は用いるアジュバントの型による。例えば、粘膜ア ジュバントがコレラ毒素である場合、５μｇないし５０μｇ、例えば１０μｇな いし３５μｇの量で好適に用いられる。マイクロカプセルの形態で用いられる場 合、用いる量は所望する服用量を得るためにマイクロカプセルのマトリックス中 に用いられる量による。この量の決定は当業者の技術の範囲内である。 ヒトにおける担体系は、胃の酸性環境から抗原を保護し、そしてヘリコバクタ ー ピロリポリペプチドを融合タンパク質として不溶性形態で含有する腸溶放出 カプセルを含むことができる。本発明のワクチンのために適した担体は腸溶被覆 カプセル及びポリラクチド−グリコリドマイクロスフェアである。好適な希釈剤 は０．２Ｎ ＮａＨＣＯ₃及び／または生理食塩水である。 成人または子供の第一次予防薬として、感染した受容者においてヘリコバクタ ー ピロリをうまく根絶した後の第二次予防として、またはヘリコバクター ピ ロリによる感染を防ぐために感染しやすい受容者で免疫反応を誘導する目的の治 療薬として本発明のワクチンを投与することができる。本発明のワクチンは当業 者により容易に決定される量で投与される。従って、成人では、好適な服用量は １０μｇないし１０ｇ、好ましくは１０μｇないし１００ｍｇ、例えば５０μｇ ないし５０ｍｇの範囲である。また、成人に適した服用量は５μｇないし５００ ｍｇの範囲でもある。同様な服用量の範囲を子供に適用できる。最適服用量が多 かれ少なかれ患者の体重、疾病、投与経路及び他の因子による可能性があること を当業者は認識する。また、例えば大腸菌ライセートに基づくワクチンのような 既知の経口ワクチン（５４０ｍｇの全量まで毎日６ｍ ｇの服用量）及びエンテロ毒素産生性大腸菌精製抗原（１ｍｇの４服用量）での 結果に基づいて適切な服用量レベルを得ることができることも当業者は認識する （Ｓｃｈｕｌｍａｎ等、Ｊ．Ｕｒｏｌ．１５０：９１７−９２１（１９９３）； Ｂｏｅｄｅｃｋｅｒ等、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｉ ｃａｌ Ａｓｓｏｃ ．９９９：Ａ−２２２（１９９３））。服用量の回数は疾病 、配合及び臨床試験からの効能データにより決まる。処置の経過に関していかな る限定も意図せずに、１カ月にわたる第一次免疫計画では３ないし８回の服用量 にわたって処置を与えることができる（Ｂｏｅｄｅｃｋｅｒ、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｓｓｏｃ ．８８８：Ａ−２２２ ）１９９３））。 本発明のワクチン成分のあるものがヘリコバクター ピロリ感染を防護するた めにのみ有用であり、あるものがヘリコバクター ピロリ感染を処置するために のみ有用であり、あるものがヘリコバクター ピロリ感染を防護及び処置する両 方のために有用であることは当業者に明らかである。好ましい態様として、本発 明のワクチン組成物はヘリコバクター ピロリに対する体液性及び／または細胞 媒介免疫を刺激することによりヘリコバクター ピロリ感染に対する防護を与え る。ヘリコバクター ピロリが引き起こす疾病を処理するために用いられる薬剤 の服用量を少なくすることを初めとする、ヘリコバクター ピロリ感染の症状の いずれかの改善が望ましい臨床目標であることを理解すべきである。VII ．ヘリコバクター ピロリポリペプチドと反応する抗体 本発明は主題のヘリコバクター ピロリポリペプチドと特異的に反応する抗体 も含む。抗タンパク質／杭ペプチド抗血清またはモノクローナ ル抗体を標準的なプロトコルにより作製することができる（例えば、Ａｎｔｉｂ ｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｈａｒｌｏｗ及びＬａ ｎｅ編集（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ：１９８８）を 参照）。マウス、ハムスターまたはウサギのような哺乳類を免疫原性型のペプチ ドで免疫することができる。タンパク質またはペプチドに免疫原性を与える技術 は、担体への結合または当該技術分野でよく知られている他の技術を含む。主題 のヘリコバクター ピロリポリペプチドの免疫原性部分をアジュバントの存在下 で投与することができる。血漿または血清中の抗体価の検出により免疫の進展を 調べることができる。免疫原を抗原として標準的なＥＬＩＳＡまたは他の免疫ア ッセイを用いて抗体のレベルを評価することができる。 好ましい態様として、主題抗体は本発明のヘリコバクター ピロリポリペプチ ドの抗原決定基、例えば配列表に示されるポリペプチドの抗原決定基、または近 縁のヒトもしくはヒト以外の哺乳類の相同体（例えば、９０％相同であり、より 好ましくは少なくとも９５％相同である）に免疫特異的である。本発明のなおさ らに好ましい態様として、抗ヘリコバクター ピロリ抗体は例えば配列表に示さ れる配列に８０％未満相同であるタンパク質と実質的に交差反応（すなわち、特 異的に反応）しない。 「実質的に交差反応しない」により、配列表に含まれるタンパク質に対する結合 親和性の１０％未満、より好ましくは５％未満、さらにより好ましくは１％未満 である非相同性タンパク質に対する結合親和性を抗体が有することを意味する。 最も好ましい態様として、バクテリアと哺乳類の抗原間に交差反応性がない。 本明細書に用いられる場合、抗体という用語は同様にヘリコバクター ピロリポリペプチドと特異的に反応するそのフラグメントを含むと考えられる 。通常の技術を用いて抗体を断片化することができ、全抗体に対して上に記述し たものと同じようにこれらのフラグメントを有用性に関してスクリーニングする ことができる。例えば、抗体をペプシンで処理することによりＦ（ａｂ’）₂フ ラグメントを生じることができる。得られたＦ（ａｂ’）₂フラグメントをジス ルフィド架橋を還元するように処理してＦａｂ’フラグメントを生じることがで きる。本発明の抗体はさらに抗ヘリコバクター ピロリ部分を有する２特異的及 びキメラ分子を含むと考えられる。 ヘリコバクター ピロリポリペプチドまたはヘリコバクター ピロリポリペプ チド変異体に対するモノクローナル及びポリクローナルの両方の抗体（Ａｂ）、 並びにＦａｂ’及びＦ（ａｂ’）₂のような抗体フラグメントをヘリコバクター ピロリポリペプチドの作用を阻止するために用いることができ、そして本発明 の抗ヘリコバクター ピロリポリペプチド抗体の顕微鏡下注射により、異常なま たは普通でない細胞内シグナル伝達における本発明の特定のヘリコバクター ピ ロリポリペプチドの役割及びヘリコバクター ピロリの正常な細胞機能を研究で きる。 ヘリコバクター ピロリ抗原の発現の量及び形態を評価するために、ヘリコバ クター ピロリエピトープを特異的に結合する抗体を組織サンプルの免疫組織化 学染色に用いることができる。臨床試験方法の一部として組織または体液中のヘ リコバクター ピロリレベルを検出し評価するために、抗ヘリコバクター ピロ リポリペプチド抗体を免疫沈降及び免疫ブロッティングに診断的に用いることが できる。同様に、個体のヘリコバクター ピロリポリペプチドレベルを調べる能 力により、そのよ うな疾患に悩む個体に対して定められた処置投薬計画の効能を測定することがで きる。ヘリコバクター ピロリポリペプチドのレベルを尿サンプルのような体液 中に見いだされる細胞で測定することができ、または胃の生検により生じるよう な組織で測定することができる。抗ヘリコバクター ピロリ抗体を用いる診断ア ッセイは、例えばヘリコバクターピロリ感染の初期診断に役立つように設計され た免疫アッセイを含むことができる。また、特定のヘリコバクター ピロリ抗原 を用いて、この細菌が感染した個体からのサンプルに含まれる抗体を検出する方 法として本発明を用いることもできる。 本発明の抗ヘリコバクター ピロリポリペプチド抗体の別の用途は、λｇｔ１ １、λｇｔ１８−２３、λＺＡＰ及びλＯＲＦ８のような発現ヘクター中に構築 されたｃＤＮＡライブラリーの免疫学的スクリーニングにおいてである。正しい 読み枠及び方向で挿入されたコーディング配列を有するこの型のメッセンジャー ライブラリーは融合タンパク質を生じることができる。例えばλｇｔ１１は、ア ミノ末端がβ−ガラクトシダーゼのアミノ酸配列からなり、カルボキシ末端が外 来ポリペプチドからなる融合タンパク質を生じる。次に、例えば、感染させたプ レートから持ち上げたニトロセルロースフィルターを抗ヘリコバクター ピロリ ポリペプチド抗体と反応させるように、主題のヘクターポリペプチドの抗原性エ ピトープを抗体で検出することができる。次に、感染させたプレートからこのア ッセイで評価されたファージを単離することができる。従って、ヘリコバクター ピロリ遺伝子相同体の存在を他の種から検出してクローン化することができ、 そして（スプライシング変異体を初めとする）別のアイソフォームを検出してク ローン化することができる。VIII ．本発明の核酸、ポリペプチドまたは抗体を含有するキット 本発明の核酸、ポリペプチド及び抗体を他の試薬及び品物と組み合わせてキッ トを形成することができる。診断目的のためのキットは典型的にバイアルまたは 他の好適な容器中に核酸、ポリペプチドまたは抗体を含んでなる。キットは典型 的に水性媒質、塩、バッファー等のような、ハイブリダイゼーション反応、ポリ メラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実施するためかまたは凍結乾燥成分の再構成のた めの他の試薬を含んでなる。また、キットは溶剤、カオトロピック塩等のような サンプル処理のための試薬も含んでなることができる。また、キットは粒子、支 持体、ウェル、検量ペーパー（ｄｉｐｓｔｉｃｋ）等のような固定化手段も含ん でなることができる。また、キットは色素、発色試薬、放射性同位体、蛍光試薬 、発光または化学発光試薬、酵素、挿入試薬等のような標識手段を含んでなるこ ともできる。本明細書に示される核酸及びアミノ酸配列情報を用いて、当業者は 特定の目的に使えるキットを容易に組み立てることができる。キットは使用説明 書をさらに含むことができる。IX ．ヘリコバクター ピロリポリペプチドを用いる薬剤スクリーニングアッセイ 精製された及び組み換えのヘリコバクター ピロリポリペプチドを利用できる ようにすることにより、本発明は、この場合、主題のヘリコバクター ピロリポ リペプチドの正常な細胞機能または細胞内シグナル伝達におけるそれらの役割の アゴニストまたはアンタゴニストのいずれかである薬剤をスクリーニングするた めに用いることができるアッセイを提供する。そのようなインヒビターまたはポ テンシエーター（ｐｏｔｅｎｔｉａｔｏｒｓ）は、ヒトにおいてヘリコバクター ピロリ感染と闘 うための新規な治療薬として有用である可能性がある。様々なアッセイ形態が可 能であり、本発明から当業者はそれらを理解する。 化合物及び天然の抽出物のライブラリーを試験する多数の薬剤スクリーニング プログラムにおいて、一定の期間に調べられる化合物の数を最大にするためには 高処理量アッセイが望ましい。精製または半精製されたタンパク質を用いて得る ことができるような細胞を含まない系で実施されるアッセイは、試験化合物によ りもたらされる分子標的の変化を迅速に起こし、比較的容易に検出できるように 作製することができる点で、しばしば「一次」スクリーニングとして好ましい。 さらに、インビトロ系では試験化合物の細胞毒性及び／または生物学的利用能の 影響を通常無視することができ、代わりにアッセイは他のタンパク質との結合親 和性の変化または分子標的の酵素特性の変化に示すことができるような分子標的 に対する薬剤の影響に主に集中される。従って、本発明の典型的なスクリーニン グアッセイでは、単離及び精製されたヘリコバクターピロリポリペプチドと目的 の化合物を接触させる。 ポリペプチドの活性が検出できる反応生成物を生じるように、酵素活性を有す るヘリコバクター ピロリポリペプチドのような精製されたヘリコバクター ピ ロリポリペプチドまたはそのフラグメントを用いてスクリーニングアッセイをイ ンビトロで構築することができる。様々な濃度の試験化合物を用いて得られたデ ータから服用量反応曲線を作製することにより化合物の効能を評価することがで きる。さらに、比較のための基準を与えるためにコントロールアッセイも実施す ることができる。例えば、検出を容易に自動化することができるので、好適な生 成物は特有の吸収、蛍光または化学発光特性を有するものを含む。各種合成また は天然に存在する化合物をこのアッセイで試験してヘリコバクター ピロリポリ ペプチドの活性を阻害するかまたは強化するものを同定することができる。また 、これらの活性化合物のあるものは、直接または膜透過性もしくは可溶性を促進 する化学変化を伴って、生の全ヘリコバクター ピロリ細胞の同じ活性（例えば 酵素活性）を阻害するかまたは強化する可能性もある。 本発明は以下の実施例によりさらに具体的に例示され、これらは限定すると解 釈されるべきではない。本出願に引用される全ての参考文献及び公開された特許 出願の中身は引用することにより本明細書に組み込まれる。他の態様 本発明の核酸及び対応するポリペプチドの多くは親出願、１９９６年３月２９ 日に申請されたＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．第０８／６２５，８１１号（代理人の整理番号 ：ＧＴＮ−００９）の部分的に続きである１９９６年１２月６日に申請されたＵ ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．第０８／７６１，３１８号（代理人の整理番号：ＧＴＮ−００９ ＣＰ２）、１９９６年１０月２５日に申請されたＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．第０８／７３ ６，９０５号（代理人の整理番号：ＧＴＮ−０１０ＣＰ）及び１９９６年１０月 ２８日に申請されたＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．第０８／７３８，８５９号（代理人の整理 番号：ＧＴＮ−００９ＣＰ）、並びに１９９６年４月２日に申請されたＵ．Ｓ． Ｓ．Ｎ．第０８／７５８，７３１号（代理人の整理番号：ＧＴＮ−０１０）にお いて以前に開示された。上に同定した親出願の配列番号と本明細書に示される配 列番号の間の相関関係を以下の表７に略述する。 実施例 Ｉ．ヘリコバクター ピロリＤＮＡのクローニング及びシークエンシング わず かに修正したＳｃｈｌｅｉｆ Ｒ．Ｆ．及びＷｅｎｓｉｎｋ Ｐ．Ｃ．、Ｐｒａ ｃｔｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ 、 ｐ９８、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎ．Ｙ．、１９８１に略述された基 本的なＤＮＡプロトコルに従ってヘリコバクター ピロリ染色体ＤＮＡを単離し た。簡潔に言えば、細胞をペレットにし、ＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ｍＭ Ｅ ＤＴＡ、ｐＨ ７．６）に再懸濁し、ＧＥＳ溶解バッファー（５．１Ｍ グアニジ ウムチオシアネート、０．１Ｍ ＥＤＴＡ、ｐＨ ８．０、０．５％ Ｎ−ラウリ ルサルコシン）を添加した。懸濁液を冷却し、酢酸アンモニウム（ＮＨ₄Ａｃ） を２．０Ｍの最終濃度まで添加した。ＤＮＡをまずクロロホルムで、次いでフェ ノール−クロロホルムで抽出し、そしてクロロホルムで再抽出した。ＤＮＡをイ ソプロパノールで沈殿し、７０％ＥｔＯＨで２回洗浄し、乾燥し、ＴＥに再懸濁 した。 単離後、ヘリコバクター ピロリの全ゲノムＤＮＡを２０００ｂｐの中央値の 大きさにネブライズした（Ｂｏｄｅｎｔｅｉｃｈ等、Ａｕｔｏｍａｔｅｄ ＤＮ Ａ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ （Ｊ．Ｃ．Ｖｅｎｔｅｒ 編集）、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９９４）。ネブライゼーション後、 ＤＮＡを濃縮し、標準的な１％アガロースゲルで分離した。９００−１３００ｂ ｐ、１３００−１７００ｂ ｐ、１７００−２２００ｂｐ、２２００−２７００ｂｐのおおよその大きさに相 当するいくつかの画分をゲルから切り出し、ＧｅｎｅＣｌｅａｎ法（Ｂｉｏ１０ １，Ｉｎｃ．）により精製した。 次に、精製されたＤＮＡフラグメントをＴ４ ＤＮＡポリメラーゼを用いて平 滑末端化した。次に、この修正したＤＮＡを１００−１０００倍モル過剰の独特 なＢｓｔＸＩ−リンカーアダプターに連結した。これらのリンカーはＢｓｔＸＩ で切断したｐＭＰＸベクターに相補的であるが、突出部分は自己相補的ではない 。それ故、これらのリンカーはコンカテマー化せず、また切断したベクターもそ れ自体容易に再連結しない。１％アガロースゲルでリンカーが付いたインサート を取り込まれなかったリンカーから分離し、ＧｅｎｅＣｌｅａｎを用いて精製し た。次に、リンカーが付いたインサートを２０のｐＭＰＸベクターの各々に連結 して一連の「ショットガン」サブクローンライブラリーを構築した。これらのベ クターはクローニング部位に読み枠外のＬａｃＺ遺伝子を含み、これはアダプタ ー−ダイマーがクローン化されることで読み枠に合うようになり、青色によりこ れらを避けることができる。 全ての次の工程はＣｈｕｒｃｈ Ｇ．Ｍ．及びＫｉｅｆｆｅｒ−Ｈｉｇｇｉｎ ｓ Ｓ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１８５−１８８、１９８８に略述される多 重ＤＮＡシークエンシングプロトコルに基づいた。このプロトコルに対する主要 な修正のみを強調する。簡潔に言えば、次に２０のベクターの各々をＤＨ５αコ ンピテント細胞中に形質転換した（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ、ＤＨ５α形質転換プロ トコル）。アンピシリン、メチシリン及びＩＰＴＧ／Ｘｇａｌを含有する抗生物 質プレート上で培養することによりライブラリーを評価した。プレートを３７℃ で一晩イン キュベートした。次に、クローンを培養して多重プール中に集めるために、成功 した形質転換体を用いた。クローンを選び取り、４０ｍｌの生育培地培養物中に 集めた。これらの培養物を３７℃で一晩生育させた。Ｑｉａｇｅｎ Ｍｉｄｉ− ｐｒｅｐキット及びＴｉｐ−１００カラム（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）を用いて ＤＮＡを精製した。このようにして、プール当たり１００μｇのＤＮＡが得られ た。２５０−３００塩基の平均の読み取りの長さで５−１０倍の配列の重複を得 るために１５枚の９６ウェルプレートのＤＮＡを作製した。 次に、化学分解法（Ｃｈｕｒｃｈ Ｇ．Ｍ．及びＫｉｅｆｆｅｒ−Ｈｉｇｇｉ ｎｓ Ｓ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１８５−１８８、１９８８）に基づく多 重ＤＮＡシークエンシングを用いるかまたはＳｅｑｕｉｔｈｒｅｍ（Ｅｐｉｃｅ ｎｔｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）ジデオキシシークエンシングプロトコル によりこれらの精製されたＤＮＡサンプルをシークエンスした。シークエンシン グ反応物を電気泳動し、４０ｃｍゲルからの直接移行電気泳動（Ｒｉｃｈｔｅｒ ｉｃｈ Ｐ．及びＣｈｕｒｃｈ Ｇ．Ｍ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍ ｏｌｏｇｙ ２１８：１８７−２２２、１９９３）によるかまたはエレクトロブ ロッティング（Ｃｈｕｒｃｈ、上記）によりナイロン膜上に移した。ゲル当たり ２４のサンプルを泳動した。化学シークエンシングにより４５枚の成功した膜が 得られ、ジデオキシシークエンシングにより８枚が得られた。紫外線光にさらす ことによりＤＮＡを膜に共有結合させ、ベクター上のタグ配列に相補的な標識オ リゴヌクレオチドでハイブリダイズした（Ｃｈｕｒｃｈ、上記）。膜を洗浄して 非特異的に結合したプローブをすすぎ落とし、Ｘ線フィルムに感光させて個々の 配列ラダーを可視 化した。オートラジオグラフィー後、ハイブリダイズしたプローブを６５℃での インキュベーションで取り除き、膜を化学シークエンシング膜では３８回、ジデ オキシシークエンシング膜では１０回プローブで調べるまで別のタグ配列でハイ ブリダイゼーションサイクルを繰り返した。従って、各ゲルは非常に多数のフィ ルムを生じ、各々は新しいシークエンシング情報を含んでいる。新しいブロット を処理した時はいつも、プールの各々に添加された内部標準配列に関してまずプ ローブで調べた。 レーザー走査デンシトメーター（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ、Ｓ ｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を用いてフィルムのデジタルイメージを作製した。デ ジタル化されたイメージをプログラムＲＥＰＬＩＣＡ^TM（商標）（Ｃｈｕｒｃｈ 等、Ａｕｔｏｍａｔｅｄ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ Ａｎａｌｙ ｓｉｓ （Ｊ．Ｃ．Ｖｅｎｔｅｒ編集）、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９９ ４）を用いてコンピューターワークステーション（ＶａｘＳｔａｔｉｏｎ ４０ ００’ｓ）で処理した。イメージ処理はレーンをまっすぐにすること、コントラ ストを調整して強度の差を除くこと、そして反復正規分布解析により解像度を高 めることを含んだ。次に、プロジェクトデータベースに保存する前にＲＥＰＬＩ ＣＡ^TMで配列を自動的に選び取り、対話式校正のために表示した。フィルムイメ ージをすばやく視覚走査し、続いて表示されたイメージのバンド上にマウスをク リックして塩基呼び出しを修正することにより校正を完了した。化学シークエン シングにより得られる典型的な配列では、ＲＥＰＬＩＣＡ^TM塩基呼び出しソフト ウェアのエラー率は２−５％であり、大部分のエラーは配列の読み取りの末端近 くに生じた。ゲノムＤＮＡの同じ部分を含む複数の配列の読み取りは編集のため に適切な配列の 重複を与えるので、配列エラーの多くを検出して修正することができた。各配列 には自動的に（マイクロタイタープレート及びプローブ情報に相当する）番号及 び（マイクロタイタープレートの列に相当する）レーン組番号が与えられた。こ の番号は配列の永久的な識別名として使えるので、専門のデータベースに依頼せ ずにあらゆる特定の配列のオリジナルを同定することがいつも可能である。 ヘリコバクター ピロリ配列のルーチンアセンブリ（ｒｏｕｔｉｎｅ ａｓｓ ｅｍｂｌｙ）をプログラムＦＡＬＣＯＮ（Ｃｈｕｒｃｈ等、Ａｕｔｏｍａｔｅｄ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ （Ｊ．Ｃ．Ｖｅｎ ｔｅｒ編集）、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９９４）を用いて実施した。 このプログラムは大部分の配列に対して迅速で信頼できることが分かっている。 ＲＥＰＬＩＣＡ^TMと相互作用するＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏ ｕｐ（ＧＣＧ）により開発されたＧｅｌＡｓｓｅｍｂｌｅ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ等 、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１２：３８７−９５、１９８４）の修正 バージョンを用いて集成されたコンティグを表示した。これは、複数の配列ゲル イメージをＲＥＰＬＩＣＡ^TMデータベースから即座に呼び出して表示することが でき、コンティグの迅速な走査及び集成において異なる配列読み取り間で矛盾が 生じた場合のゲルトレースの校正ができる統合された編集をもたらした。II ．ヘリコバクター ピロリ核酸の同定、クローニング及び発現 本発明のヘリコバクター ピロリポリペプチドの発現及び精製を本質的に以下 に略述するように実施することができる。 ヘリコバクター ピロリからの膜及び分泌タンパク質のクローニング、 発現及び精製を容易にするために、ｐＥＴ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｎｏｖａｇｅｎ）の ような、大腸菌における組み換えタンパク質のクローニング及び発現のための遺 伝子発現系を選択する。また、組み換えタンパク質産物の精製を容易にするため に、ペプチドタグ、Ｈｉｓ−タグをコードするＤＮＡ配列を目的のＤＮＡ配列の ３’末端に融合する。あらゆる５’末端のシグナル配列の改変を避けるために３ ’末端を融合のために選択する。上記の例外は発現試験のコントロールとして用 いるためにクローン化される遺伝子のｐｐｉＢである。この遺伝子のタンパク質 産物はシグナル配列を含まず、細胞質タンパク質として発現されるので、ヘリコ バクター ピロリｐｐｉＢの配列は全長の遺伝子の５’末端に連結されたＨｉｓ −タグをコードするＤＮＡ配列を含む。ヘリコバクター ピロリからの膜及び分泌ポリペプチドのＯＲＦを含有する核酸 のＰＣＲ増幅及びクローニング ヘリコバクター ピロリのＪ９９株からクローニングのために（例えば、配列 表に示される核酸から）選択された核酸をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によ る増幅クローニングのために調製する。読み枠（ＯＲＦ）の５’及び３’末端の 特異的な合成オリゴヌクレオチドプライマーを設計し、ＧｉｂｃｏＢＲＬ Ｌｉ ｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ、ＵＳＡ） から購入した。（配列の５’末端に特異的な）全てのフォワードプライマーを最 も５’末端にＮｃｏＩクローニング部位に含むように設計する。バリン及び天然 のヘリコバクター ピロリＤＮＡ配列の残りのコーディング配列が続くメチオニ ン残基でタンパク質翻訳が開始されるようにこれらのプライマーを設計する。（ あらゆるヘリコバクター ピロリＯＲＦの３’末端に特異的な） 全てのリバースプライマーは、各ヘリコバクター ピロリ配列がｐＥＴ−２８ｂ の読み枠中にクローニングされるように最も５’末端にＥｃｏＲＩを含む。ｐＥ Ｔ−２８ｂベクターはＨｉｓ−タグを含んでなる（最もＣ末端に）６個のヒスチ ジン残基を含有する付加的な２０個のカルボキシ末端アミノ酸をコードする配列 を与える。上記の例外は前に記述したようにｐｐｉＢ遺伝子のベクター構築であ る。ｐｐｉＢ遺伝子の５’末端に特異的な合成オリゴヌクレオチドプライマーは その最も５’末端にＢａｍＨＩ部位をコードし、ｐｐｉＢ遺伝子の３’末端のプ ライマーはその最も５’末端にＸｈｏｌ部位をコードする。 ヘリコバクター ピロリのＪ９９株から調製されたゲノムＤＮＡをＰＣＲ増幅 反応の鋳型ＤＮＡの供給源として用いる（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌ等、編集、１９９４）。ヘリコバクタ ー ピロリＯＲＦを含有するＤＮＡ配列を増幅するために、１００μｌの最終容 量中に２ｍＭ ＭａＣｌ₂、特定されたヘリコバクター ピロリＯＲＦに相補的で これに隣接する１μＭの合成オリゴヌクレオチドプライマー（フォワード及びリ バースプライマー）、０．２ｍＭの各デオキシヌクレオチド三リン酸；ｄＡＴＰ 、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ及び２．５ユニットの熱安定性ＤＮＡポリメラ ーゼ（Ａｍｐｌｉｔａｑ、Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ．、Ｂｒａｎｃｈｂｕｒｇ、ＮＪ、ＵＳＡ）を含有する反応バイアル中に ゲノムＤＮＡ（５０ｎｇ）を入れる。 サーマルサイクリング反応の終了時に、増幅ＤＮＡの各サンプルを洗浄し、Ｑ ｉａｑｕｉｋ Ｓｐｉｎ ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ、 Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ、ＵＳＡ）を用いて精製する。全ての増幅ＤＮ Ａサンプルを制限エンドヌクレアーゼ、例えばＮｃｏＩ及びＥｃｏＲＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ、ＵＳＡ）での消化 に供する（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、Ｆ．Ａ ｕｓｕｂｅｌ等、編集、１９９４）。次に、ＤＮＡサンプルを１．０％ ＮｕＳ ｅｉｖｅ（ＦＭＣ ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ、Ｒｏｃｋｌａｎｄ、ＭＥ、ＵＳＡ ）アガロースゲルでの電気泳動に供する。臭化エチジウム及び長波長ｕｖ照射に さらすことによりＤＮＡを可視化する。アガロースゲルから単離された切片に含 まれるＤＮＡをＢｉｏ １０１ ＧｅｎｅＣｌｅａｎキットプロトコル（Ｂｉｏ １０１ Ｖｉｓｔａ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて精製する。発現ベクターへのヘリコバクター ピロリ核酸のクローニング エンドヌクレアーゼ、例えばＮｃｏＩ及びＥｃｏＲＩでの消化によりｐＥＴ− ２８ｂベクターをクローニングのために調製する（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏ ｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌ等、編集、１９９４）。ｐ ｐｉＢをクローニングする場合は、挿入遺伝子の５’末端に融合することができ るＨｉｓ−タグをコードするｐＥＴ−２８ａベクターを用い、ＢａｍＨＩ及びＸ ｈｏＩ制限エンドヌクレアーゼでの消化によりｐｐｉＢ遺伝子を用いたクローニ ングのためにクローニング部位を調製する。 消化後に、ｐＥＴ−２８ａ発現ベクター中にクローン化されるｐｐｉＢの増幅 インサートを除いて、先に消化されたｐＥＴ−２８ｂ発現ベク ター中にＤＮＡインサートをクローン化する（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏ ｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａ ｎｄ Ｓｏｎs，Ｉｎｃ．、Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌ等、編集、１９９４）。次に、 以下に記述するようにライゲーション反応の生成物を用いて大腸菌のＢＬ２１株 を形質転換する（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌ ａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、 Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌ等、編集、１９９４）。組み換えプラスミドでのコンピテントバクテリアの形質転換 標準的な方法に従ってコンピテントバクテリアの大腸菌株ＢＬ２１または大腸 菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）をクローン化されたヘリコバクターピロリ配列を含有す る組み換えｐＥＴ発現プラスミドで形質転換する（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏ ｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌ等、編集、１９９４）。簡 潔に言えば、１μｌのライゲーション反応物を５０μｌのエレクトロコンピテン ト細胞と混合し、高電圧パルスを与え、その後、サンプルを０．４５ｍｌのＳＯ Ｃ培地（０．５％酵母抽出物、２．０％トリプトン、１０ｍＭ ＮａＣｌ、２． ５ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１０ｍＭ ＭｇＳＯ₄及び２０ｍＭグルコ ース）中で１時間振盪しながら３７℃でインキュベートする。次に、一晩生育さ せるために２５μｇ／ｍｌのカナマイシン硫酸塩を含有するＬＢ寒天プレート上 に広げる。次にＢＬ２１の形質転換されたコロニーを選び取り、以下に記述する ようにクローン化されたインサートを評価するために分析する。ヘリコバクター ピロリ核酸を含む組み換え発現ベクターの同定 最初のＰＣＲ増幅クローニング反応で用いた、各ヘリコバクター ピロリ配列 に特異的な同じフォワード及びリバースプライマーを用いてクローン化されたイ ンサートをＰＣＲ増幅することにより、組み換え体ｐＥＴ−２８ｂ−ヘリコバク ター ピロリＯＲＦで形質転換された個々のＢＬ２１クローンを分析する。成功 した増幅により、発現ベクターにヘリコバクター ピロリ配列が組込まれたこと が確かめられる（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌ ａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、 Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌ等、編集、１９９４）。形質転換体からの核酸の単離及び調製 正しくクローン化されたヘリコバクター ピロリＯＲＦを保有する組み換えｐ ＥＴ−２８ｂベクターの個々のクローンを選び取り、２５μｇ／ｍｌのカナマイ シン硫酸塩を加えた５ｍｌのＬＢ培地中で一晩インキュベートする。次の日に、 Ｑｉａｇｅｎプラスミド精製プロトコル（Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．、Ｃｈａｔｓ ｗｏｒｔｈ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いてプラスミドＤＮＡを単離し、精製する。大腸菌における組み換えヘリコバクター ピロリ配列の発現 クローニングまたはプラスミド調製の目的のために、あらゆる大腸菌Ｋ−１２ 株、例えばＨＭＳ１７４、ＨＢ１０１、ＪＭ１０９、ＤＨ５等でｐＥＴベクター を増やすことができる。発現のための宿主はＴ７ ＲＮＡポリメラーゼの遺伝子 の染色体コピーを含有する大腸菌株を含む。これらの宿主は、ｌａｃＩ遺伝子、 ｌａｃＵＶ５プロモーター及びＴ７ ＲＮＡポリメラーゼの遺伝子を保有するラ ムダ誘導体のバクテリオファ ージＤＥ３の溶原菌である。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼはイソプロピル−β−Ｄ −チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）の添加により誘導され、Ｔ７ ＲＮＡポリメラ ーゼはｐＥＴ−２８ｂのような目的の遺伝子を保有するあらゆる標的プラスミド を転写する。用いる株は、ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｓｔｕｄｉｅｒ、Ｆ．Ｗ．、Ｒ ｏｓｅｎｂｅｒｇ、Ａ．Ｈ．、ＤＵｎｎ、Ｊ．Ｊ．及びＤｕｂｅｎｄｏｒｆｆ、 Ｊ．Ｗ．（１９９０）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５、６０−８９）を含む 。 組み換えヘリコバクター ピロリ配列を発現するために、上記のように単離さ れたプラスミドＤＮＡ５０ｎｇを用いて上記のようにコンピテントＢＬ２１（Ｄ Ｅ３）バクテリア（ｐＥＴ発現系キットの一部としてＮｏｖａｇｅｎにより供給 される）を形質転換する。、ヘリコバクターピロリ組み換え構築物に対して記述 したようにｐＥＴ−ＳｙｓｔｅｍではｌａｃＺ遺伝子（β−ガラクトシダーゼ） が発現される。形質転換細胞をＳＯＣ培地中で１時間培養し、次に培養物を２５ μｇ／ｍｌのカナマイシン硫酸塩を含有するＬＢプレート上で培養する。次の日 に、バクテリアコロニーを集め、カナマイシン硫酸塩（２５μｇ／ｍｌ）を含有 するＬＢ培地中で６００ｎｍで０．５ないし１．０ Ｏ．Ｄ．ユニットの吸光度 まで生育させ、その時点で１ｍＭ ＩＰＴＧを培養物に３時間添加してヘリコバ クター ピロリ組み換えＤＮＡ構築物の遺伝子発現を誘導する。 ＩＰＴＧでの遺伝子発現の誘導後に、Ｓｏｒｖａｌｌ ＲＣ−３Ｂ遠心機で４ ℃で３５００ ｘ ｇで１５分間遠心分離することによりバクテリアをペレットに する。ペレットを５０ｍｌの冷たい１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ ８．０、 ０．１Ｍ ＮａＣｌ及び０．１ｍＭ ＥＤＴ Ａ（ＳＴＥバッファー）中に再懸濁する。次に、細胞を４℃で２０００ ｘ ｇで ２０分間遠心分離する。湿ったペレットの重さを測り、タンパク質精製の準備が できるまで−８０℃で凍結する。III ．大腸菌からの組み換えタンパク質の精製 分析方法 アミノ酸含有量から計算される吸光度係数を用いて精製されたタンパク質調製 物の濃度を分光光度計で定量する（Ｐｅｒｋｉｎｓ、Ｓ．Ｊ．１９８６ Ｅｕｒ ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１５７、１６９−１８０）。ウシ血清アルブミンを基準 として用いて、Ｂｒａｄｆｏｒｄ、Ｍ．Ｍ．（１９７６）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈ ｅｍ．７２、２４８−２５４及びＬｏｗｒｙ、Ｏ．Ｈ．、Ｒｏｓｅｂｒｏｕｇｈ 、Ｎ．、Ｆａｒｒ、Ａ．Ｌ．＆ Ｒａｎｄａｌｌ、Ｒ．Ｊ．（１９５１）Ｊ．Ｂ ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９３、ｐ２６５−２７５の方法によってもタンパク質濃度 を測定する。 ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（１２％または４．０ないし２５％のアクリ ルアミド勾配ゲル）をＢｉｏＲａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）から購 入し、クーマシーブルーで染色する。分子量マーカーはウサギ骨格筋ミオシン（ ２００ｋＤａ）、大腸菌（−ガラクトシダーゼ（１１６ｋＤａ）、ウサギ筋肉ホ スホリラーゼＢ（９７．４ｋＤａ）、ウシ血清アルブミン（６６．２ｋＤａ）、 オボアルブミン（４５ｋＤａ）、ウシ炭酸脱水酵素（３１ｋＤａ）、ダイズトリ プシンインヒビター（２１．５ｋＤａ）、卵白リゾチーム（１４．４ｋＤａ）及 びウシアプロチニン（６．５ｋＤａ）を含む。１．可溶性タンパク質の精製 全ての工程を４℃で実施する。凍結した細胞を解かし、５容量の溶解 バッファー（１０％グリセロール、０．１％メルカプトエタノール、２００μｇ ／ｍｌリゾチーム、１ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）並びに 各々１０μｇ／ｍｌのロイペプチン、アプロチニン、ペプスタチン、Ｌ−１−ク ロロ−３−［４−トシルアミド］−７−アミノ−２−ヘプタノン（ＴＬＣＫ）、 Ｌ−１−クロロ−３−［４−トシルアミド］−４−フェニル−２−ブタノン（Ｔ ＰＣＫ）及びダイズトリプシンインヒビターを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ ７ ．９、０．５Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭイミダゾール）に再懸濁し、少容量の微量流 動化装置（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ）（Ｍｏｄｅｌ Ｍ−１１０Ｓ、Ｍｉ ｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏ ｎ、Ｎｅｗｔｏｎ、ＭＡ）に数回通すことにより破壊する。得られたホモジネー トを０．１％ Ｂｒｉｊ ３５にし、１００，０００ ｘ ｇで１時間遠心分離して 澄んだ上清を生じる（粗抽出物）。 ０．８μｍ Ｓｕｐｏｒフィルター（Ｇｅｌｍａｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＦＲ Ｇ）を通して濾過した後、粗抽出物を前以て１０％グリセロール、０．１％ Ｂ ｒｉｊ ３５及び１ｍＭ ＰＭＳＦを含有する溶解バッファーに平衡化した５ｍｌ ベッド容量のＮｉ²⁺−ニトロロ三酢酸（ｎｉｔｒｏｌｏｔｒｉａｃｅｔａｔｅ） −アガロース（ＮＴＡ）（Ｈｏｃｈｕｌｉ、Ｅ．、Ｄｂｅｌｉ、Ｈ．及びＳｃｈ ａｃｈｅｅｒ、Ａ．（１９８７）Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ４１１、 １７７−１８４）上に直接添加する。カラムを１０％グリセロール、０．１％Ｂ ｒｉｊ３５を含有する２５０ｍｌ（５０ベッド容量）の溶解バッファーで洗浄し 、１０％グリセロール、０．０５％ Ｂｒｉｊ ３５、１ｍＭ ＰＭＳＦ及び２０ 、１００、２００または５００ｍＭのイミダゾールを含有す る溶解バッファーの段階的工程で溶出する。画分をＯＤ₂₈₀ｎｍの吸光度で調べ 、ピーク画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析する。２．封入体からの不溶性タンパク質の精製 以下の工程を４℃で実施する。細胞ペレットを１０％グリセロール、２００μ ｇ／ｍｌリゾチーム、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＰＭＳＦ及び０．１％メルカプ トエタノールを含む溶解バッファーに再懸濁する。細胞破壊機に通した後、得ら れたホモジネートを０．２％デオキシコール酸塩にし、１０分撹拌し、次に２０ ，０００ ｘ ｇで３０分間遠心分離する。ペレットを１０％グリセロール、１０ ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１ｍＭ ＰＭＳＦ及び０．１％ メルカプトエタノールを含有する溶解バッファで洗浄し、続いて１Ｍ尿素、１ｍ Ｍ ＰＭＳＦ及び０．１％メルカプトエタノールを含有する溶解バッファーで数 回洗浄する。得られた白色のペレットは主に封入体からなり、破壊されていない 細胞及び膜成分を含まない。透析及びタンパク質サンプルの濃縮 次のように、すなわち、６Ｍ、４Ｍ、３Ｍ、２Ｍ、１Ｍ、０．５Ｍそして最後 に尿素を含まないＴｒｉｓ緩衝食塩水（ＴＢＳ；１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ ８． ０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）と尿素を段階的に減少しながら０．５％デオキシコ ール酸塩（ＤＯＣ）を含有するＴＢＳに対して透析することにより、タンパク質 サンプルから尿素を徐々に取り除く。各透析工程を室温で最低４時間実施する。 透析後、Ａｍｉｃｏｎ撹拌セルを用いて圧力濾過によりサンプルを濃縮する。 Ｐｅｒｋｉｎｓ（１９８６ Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１５７、１６９−１ ８０）、Ｂｒａｄｆｏｒｄ（（１９７６）Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２、２４８−２５４）及びＬｏｗｒｙ（（１９５１）Ｊ．Ｂ ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９３、ｐ２６５−２７５）の方法を用いてタンパク質濃度 を測定する。IV ．ヘリコバクター ピロリの外膜に位置する抗原の抗原性の評価 本質的に以下に略述するプロトコルに従うことによりヘリコバクター ピロリ からの外膜の精製を実施することができる。 ヘリコバクター ピロリ株Ｊ９９（ＡＴＣＣ番号５５６７９）及びＡｈ２４４ を５％（容量／容量）ウマ血液を含有するチョコレート血液寒天上で１０％ＣＯ₂ を含有する大気中３７℃で４８時間生育させる。バクテリアを２０ｍＭ Ｔｒｉ ｓ、ｐＨ ７．５に懸濁することにより集めた。これらの細胞を４℃で１２，０ ００ Ｘ ｇで２０分間遠心分離することにより集め、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ ７．５で３回洗浄する。細胞を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ ７．５に懸濁し、氷上 で超音波処理（破壊間で６０秒中断して６０ワットで８回の３０秒の破壊）によ り破壊する。細胞懸濁液にＤＮａｓｅ（０．１ｍｇ）及びＲＮａｓｅ（０．５ｍ ｇ）を添加し、この混合物を室温で３０分間インキュベートする。細胞懸濁液を ４℃で１２，０００ Ｘ ｇで２０分間遠心分離する。上清を残し、再び遠心分離 する。４℃で４０，０００ Ｘ ｇで３０分間遠心分離することにより上清から全 部の膜を集める。ペレットを２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ ７．５で２回洗浄する。 ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を標準としてＢｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセ イを用いてタンパク質含有量をアッセイする。次に、懸濁液を１ｍｇタンパク質 ／ｍｌに調整する。この懸濁液にＮ−ラウリル−サルコシンを１ｍｇのタンパク 質当たり６ｍｇのＮ−ラウリル−サルコシンの割合で添加することにより膜を 可溶化する。懸濁液をＮ−ラウリル−サルコシンの存在下で室温で３０分間イン キュベートする。４℃で４０，０００ Ｘ ｇで３０分間遠心分離することにより 外膜を集める。ペレットをＭｉｌｌｉ Ｑ高品質水（ｑｕａｌｉｔｙ ｗａｔｅ ｒ）で３回洗浄し、等分し、使用するまで−２０℃で保存する。ヘリコバクター ピロリの外膜抗原の同定 以下に略述するプロトコルを用いて外膜抗原を同定することができる。 Ｌａｅｍｍｌｉ、Ｕ．Ｋ．（１９７０）Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）第２２ ７巻、６８０−６８５により記述された方法に従ってタンパク質をドデシル硫酸 ナトリウムポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で分離する。標準的な 処理バッファーに懸濁することによりサンプルを調製し、１００℃で１０分間加 熱する。８ ｘ １０ｃｍのミニゲル（０．７５ｍｍ）でウェル当たり約１−５ｍ ｇのタンパク質を添加する。次に、分離したタンパク質を以下に記述するように ＰＶＤＦ膜に移す。 分離したタンパク質のＰＶＤＦ膜へのエレクトロブロッティングをＢｉｏ Ｒ ａｄ Ｍｉｎｉ−Ｔｒａｎｓ Ｂｌｏｔ Ｅｌｅｃｔｏｐｈｏｒｅｔｉｃ Ｔｒ ａｎｆｅｒ容器で実施する。ＰＶＤＦ膜イモビロン（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ）−ｐ ＳＱを用いる。エレクトロブロッティングをＣＡＰＳトランスファーバッファー （１０ｍＭ ３−［シクロヘキシルアミノ］−１−プロパンスルホン酸、１０％ メタノール）を用いて５０Ｖで６０分間実施する。膜を０．２％ Ｐｏｎｃｅａ ｕ Ｓで染色し、Ｍｉｌｌｉ Ｑ高品質水で脱染色する。 次に、調製物内の抗原をウェスタン免疫ブロッティングを用いて同定 する。エレクトロブロッティング後に、ＰＶＤＦ膜の非特異的結合部位を１０ｍ Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ−０．９％ ＮａＣｌ、ｐＨ ７．５中５％の脱脂ドライミ ルクでブロックする。この膜を１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ−０．９％ ＮａＣｌ −０．５％ Ｔｗｅｅｎ ２０−０．５％ ＢＳＡ、ｐＨ ７．５中の適切な希釈の 正常マウス血清と共に３７℃で２時間インキュベートし、次に１０ｍＭ Ｔｒｉ ｓ−ＨＣｌ−０．９％ ＮａＣｌ−０．５％ Ｔｗｅｅｎ ２０、ｐＨ ７．５（Ｔ ＴＢＳ）で３回洗浄する。次に、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ−０．９％ ＮａＣ ｌ−０．５％ Ｔｗｅｅｎ ２０−０．５％ ＢＳＡ、ｐＨ ７．５中のアルカリホ スファターゼを結合したヤギ抗マウスＩｇを添加し、室温で１時間インキュベー トする。このインキュベーション後、膜をＴＴＢＳで３回洗浄する。５−ブロモ −４−クロロ−３−インドリルホスフェート（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）をアルカリホス ファターゼ基質として、そしてニトロブルーテトラゾリウム（Ｎｉｔｒｏ Ｂｌ ｕｅ Ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を発色試薬として用いて反 応するバンドを明らかにする。 アミノ酸微量シークエンシングのために、免疫反応性と同定されるタンパク質 を新しい未反応のイモビロン膜から切り出し、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ Ｆｏｕｎｄ ａｔｉｏｎ微量シークエンシング施設で微量シークエンスする。次に、タンパク 質バンドが切り出される膜を上記のようにウェスタン免疫ブロットに供して適切 なバンドが切り出されたことを確かめる。Ｖ．ヘリコバクター ピロリタンパク質のワクチン候補としての分析 ヘリコバクター ピロリタンパク質の免疫調節作用を調べるために、マウス／ ヘリコバクター ピロリモデルを用いた。このモデルは多くの 点でヒトのヘリコバクター ピロリ感染に似ている。治療経口免疫療法の概念を 試験するために、焦点はヘリコバクター ピロリ感染動物における経口免疫の効 果に置かれる。動物 メスのＳＰＦ ＢＡＬＢ／ｃマウスをＢｏｍｈｏｌｔ Ｂｒｅｅｄｉｎｇセン ター（Ｄｅｎｍａｒｋ）から購入した。水及び食物を自由に与えて通常のマクロ ロン（ｍａｋｒｏｌｏｎ）檻で飼育した。これらの動物は到着時に４−６週の年 齢であった。感染 最低１週の順応化後に、これらの動物にヘリコバクター ピロリ（潰瘍患者か ら最初単離された、株２４４）の２型株（ＶａｃＡ陰性）を感染させた。我々の ところでは、この株がマウスの胃によくコロニーを形成することが前以て分かっ ていた。このバクテリアを１０％ウシ胎仔血清を補足したＢｒｕｃｅｌｌａ培地 中で微好気性菌の大気（１０％ＣＯ₂、５％Ｏ₂）中３７℃で一晩生育させた。経 口服用量のオメプラゾール（４００μｍｏｌ／ｋｇ）を動物に与え、この３−５ 時間後に培地中のヘリコバクター ピロリを経口接種した（約１０⁸ｃｆｕ／動 物）。接種後２−３週で幾匹かの動物で感染の陽性の取り込みを調べた。抗原 外部に露出したヘリコバクター ピロリ細胞膜との結合に基づいて組み換えヘ リコバクター ピロリ抗原を選択した。これらの抗原を以下の群、すなわち、（ １.）外膜タンパク質；（２.）周辺細胞質／分泌タンパク質；（３.）外側の表 面タンパク質；及び（４.）内膜タンパク質から選択した。全ての組み換えタン パク質を精製の理由からヘキサ−ＨＩ Ｓタグと共に構築し、非ヘリコバクター ピロリコントロールタンパク質（大腸 菌からのβ−ガラクトシダーゼ；ＬａｃＺ）を同じように構築した。 全ての抗 原を可溶形態で与え、すなわち、ＨＥＰＥＳバッファーまたは０．５％デオキシ コール酸塩（ＤＯＣ）を含有するバッファーのいずれかに溶解した。 抗原を以下の表８に挙げる。表８ ヘリコバクター ピロリタンパク質 外膜タンパク質 タンパク質１ タンパク質２ タンパク質３ タンパク質４ タンパク質５ 周辺細胞質／分泌タンパク質 タンパク質６ 他の細胞エンベロープタンパク質 タンパク質７ タンパク質８ 鞭毛結合タンパク質 タンパク質９ コントロールタンパク質 β−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）免疫 各群で１０匹の動物を３４日の期間にわたって４回免疫した（１、１５、２５ 及び３５日目）。溶液または懸濁液中の精製した抗原を１００μｇ／マウスの服 用量で与えた。アジュバントとして、各免疫で１０μｇ／マウスのコレラ毒素（ ＣＴ）も動物に与えた。抗原を酸分解から保護する手段として免疫の３−５時間 前にオメプラゾール（４００μｍｏｌ／ｋｇ）を経口で動物に与えた。感染コン トロール動物にはＨＥＰＥＳバッファー ＋ ＣＴまたはＤＯＣバッファー ＋ Ｃ Ｔを与えた。最後の免疫の２−４週後に動物を屠殺した。この試験の一般的な概 略を以下の表９に示す。表９ 試験概略、治療免疫 ３０日目にマウス全てにヘリコバクター ピロリ株Ａｈ２４４を感染させた。 マウス株 服用量 物質 ｎ＝１０ / マウス 服用日 １．コントロール、PBS Balb/c 0.3ml 0、14、24、34 ２．コレラ毒素、10μg Balb/c 0.3ml 0、14、24、34 ３．タンパク質１、100μg + CT 10μg Balb/c 0.3m1 0、14、24、34 ４．タンパク質５、100μg + CT 10μg Balb/c 0.3ml 0、14、24、34 ５．タンパク質10、100μg + CT 10μg Balb/c 0.3ml 0、14、24、34 ６．タンパク質９、100μg + CT 10μg Balb/c 0.3ml 0、14、24、34 ７．タンパク質２、100μg + CT 10μg Balb/c 0.3ml 0、14、24、34 ８．タンパク質６、100μg + CT 10μg Balb/c 0.3ml 0、14、24、34 ９．タンパク質４、100μg + CT 10μg Balb/c 0.3ml 0、14、24、34 10．タンパク質７、100μg + CT 10μg Balb/c 0.3ml 0、14、24、34 11．タンパク質８、100μg + CT 10μg Balb/c 0.3ml 0、14、24、34 12．タンパク質３、100μg + CT 10μg Balb/c 0.3ml 0、14、24、34感染の分析 粘膜感染 ：ＣＯ₂及び頸部脱きゅうによりマウスを屠殺した。腹部を開け、胃を 取り出した。胃を大弯に沿って切断した後、生理食塩水ですすいだ。２５ｍｍ² の面積の腔（ａｎｔｒｕｍ）及び内体（ｃｏｒｐｕｓ）から粘膜を外科用メスで 別個にこすり取った。粘膜をこすり取ったものをＢｒｕｃｅｌｌａ培地に懸濁し 、Ｂｌｏｏｄ Ｓｋｉｒｒｏｗ選択プレート上で培養した。これらのプレートを 微好気性菌の条件下で３−５日間インキュベートし、コロニーの数を数えた。ヘ リコバクター ピロリであることをウレアーゼ及びカタラーゼ試験により、そし て直接顕微鏡検査またはグラム染色により確かめた。 ウレアーゼ試験を本質的に以下のように実施した。試薬、尿素寒天ベース濃縮 物（Ｕｒｅａ Ａｇａｒ Ｂａｓｅ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ）をＤＩＦＣＯ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｄｅｔｒｏｉ、ＭＩ（カタログ番号０２８４−６１ −３から購入した。尿素寒天ベース濃縮物を水で１：１０に希釈した。希釈した 濃縮物の場合の１ｍｌを１００−２００μｌの活発に生育しているヘリコバクタ ー ピロリ細胞と混合した。深紅色への色の変化は、細胞がウレアーゼ陽性であ ることを示した。 カタラーゼ試験を本質的に以下のように実施した。試薬のＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’ −テトラメチル−ｐ−フェニレンジアミンをＳｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍ Ｏ（カタログ番号Ｔ３１３４）から購入した。試薬の溶液（水中１％ ｗ／ｖ） を調製した。ヘリコバクター ピロリ細胞をワッ トマン（Ｗｈａｔｍａｎ）濾紙上に吸い取り、１％溶液で覆った。暗青色への色 の変化は、細胞がカタラーゼ陽性であることを示した。血清抗体 ：全てのマウスから血清を心臓穿刺により抜き出した血液から調製した 。ヘリコバクター ピロリの特定の抗原をプレートに置いた通常のＥＬＩＳＡ技 術により血清抗体を同定した。粘膜抗体 ：粘膜中の抗体の存在を検出するために、５０％のマウスで内体の特定 の部分及び４ｃｍの十二指腸を穏やかにこすり取った。抗体価を血清抗体のよう に通常のＥＬＩＳＡ技術により測定した。統計的分析 ：Ｗｉｌｃｏｘｏｎ−Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ符号ランク検定をヘ リコバクター ピロリのコロニー形成に対する抗原の有意な効果を測定するため に用いた。ｐ＜０．０５を有意であるとみなした。腔はヘリコバクターの主要な コロニー形成部位であるので、腔のコロニー形成の変化を最も重要視した。結果 血清中の抗体 ：ＣＴと一緒に与えられた試験した全ての抗原は、血清中に測定可 能な特異的力価を生じた。最も高い反応はタンパク質３、４、９、１及び７で見 られた（図１参照）。粘膜中の抗体 ：粘膜をこすりとったものでは、試験した全ての抗原に対して特異 的な抗体が見られた。明らかに最も強い反応がタンパク質６、続いて１、３及び ９で見られた（図２参照）。治療免疫効果 ： 全てのコントロール動物（ＢＡＬＢ／ｃマウス）では胃の腔及び内体の両方で ヘリコバクター ピロリ（株ＡＨ２４４）がよくコロニー形成した。試験した抗 原のうち３つのタンパク質（タンパク質４、７及び１） はヘリコバクター ピロリ感染の十分で顕著な減少及び／または根絶を生じた。 腔のコロニー形成の程度はコントロールに比較してタンパク質８、９及び３での 免疫後に低かった。タンパク質５、２及び６の効果はコントロールと異ならなか った。コントロールタンパク質ＬａｃＺ、すなわち、非ヘリコバクター ピロリ タンパク質は根絶効果がなく、実際ＨＥＰＥＳ＋ＣＴコントロールに比べてより 高いヘリコバクターコロニー形成であった。ＨＥＰＥＳ及びＤＯＣにそれぞれ溶 解したタンパク質の全てのデータを図３及び４に示す。データは相乗平均値とし て示される。ｎ＝８−１０ Ｗｉｌｃｏｘｏｎ−Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ符号 ランク検定 ＊＝ｐ＜０．０５；ｘ／１０＝調べたマウスの総数に対するヘリコ バクター ピロリの根絶を示すマウスの数。 示したデータは、本試験に含まれるヘリコバクター ピロリ関連タンパク質の 全てが、経口アジュバントＣＴと共に経口免疫原として用いられた場合に、特異 的な血清及び粘膜の抗体により測定されるように免疫反応の刺激をもたらしたこ とを示す。これらのタンパク質の大部分はこの動物モデルにおいてヘリコバクタ ー ピロリのコロニー形成の減少を、そしてある場合には完全な除去をもたらし た。この減少または除去が同種起源の防護よりむしろ異種起源の防護によるもの であったことに注目すべきである（ポリペプチドはヘリコバクター ピロリＪ９ ９株配列に基づき、これを異なる（ＡＨ２４４）攻撃株に対する治療免疫試験に 用いた）、多種多様なヘリコバクター ピロリ株に対する可能性のあるワクチン を表している。 非ヘリコバクター ピロリタンパク質ＬａｃＺで処理された動物では腔の最も 多量のコロニー形成が見られ、ヘリコバクター ピロリ抗原で 見られた効果が特異的であったことを示している。 総合するとこれらの効果は、ヘリコバクター ピロリ感染を処置及び／または 防護するためにヒトで使用する製薬学的配合物におけるこれらのヘリコバクター ピロリタンパク質の使用を強く支持する。VI ．ヘリコバクター ピロリ株の遺伝子の配列変動分析 ヘリコバクター ピロリの数株から４遺伝子をクローン化し、シークエンスし てＤＮＡ及び推定アミノ酸配列を比較した。この情報を用いてヘリコバクター ピロリ株Ｊ９９とヒト患者から単離された他のヘリコバクター ピロリ株間の配 列の変動を測定した。染色体ＤＮＡの調製 （表１２に挙げた）ヘリコバクター ピロリ株の培養物をＢＬＢＢ（１％トリ プトン、１％ペプタミン、０．１％グルコース、０．２％酵母抽出物、０．５％ 塩化ナトリウム、５％ウシ胎仔血清）中で０．２のＯＤ₆₀₀まで生育させた。細 胞をＳｏｒｖａｌｌ ＲＣ−３Ｂで４℃で３５００ ｘ ｇで１５分間遠心分離し 、ペレットを０．９５ｍｌの１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ （ＴＥ）に再懸濁した。１％の最終濃度までのＳＤＳ並びにそれぞれ０．５ｍｇ ／ｍｌ及び５ユニット／ｍｌの最終濃度までのＲＮＡｓｅＡ＋Ｔ１と共にリゾチ ームを１ｍｇ／ｍｌの最終濃度まで添加し、３７℃で１時間インキュベートした 。次に、プロテイナーゼＫを０．４ｍｇ／ｍｌの最終濃度まで添加し、このサン プルを５５℃で１時間以上インキュベートした。サンプルにＮａＣｌを０．６５ Ｍの濃度まで添加し、注意深く混合し、０．７Ｍ ＮａＣｌ中１０％のＣＴＡＢ ０．１５ｍｌ（最終物は１％ ＣＴＡＢ／７０ｍＭ ＮａＣｌ）を添加し、続いて ６５℃で２０分間インキュベートし た。この時点で、サンプルをクロロホルム：イソアミルアルコールで抽出し、フ ェノールで抽出し、そしてクロロホルム：イソアミルアルコールで再び抽出した 。ＥｔＯＨ（１．５ｘ容量）またはイソプロパノール（０．６ｘ容量）のいずれ かでＤＮＡを−７０℃で１０分間沈殿させ、７０％ ＥｔＯＨで洗浄し、ＴＥに 再懸濁した。ＰＣＲ増幅及びクローニング ヘリコバクター ピロリの１２株から調製されたゲノムＤＮＡをＰＣＲ増幅反 応の鋳型ＤＮＡの供給源として用いた（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌ等、編集、１９９４）。ヘリコバクタ ー ピロリＯＲＦを含有するＤＮＡ配列を増幅するために、１対の反応で２０μ ｌの最終容量中に２ｍＭ ＭｇＣｌ₂、特定されたヘリコバクター ピロリＯＲＦ に相補的でこれに隣接する１μＭの合成オリゴヌクレオチドプライマー（フォワ ード及びリバースプライマー、表１０参照）、０．２ｍＭの各デオキシヌクレオ チド三リン酸；ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ及び０．５ユニットの 熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｍｐｌｉｔａｑ、Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌ ａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ．、Ｂｒａｎｃｈｂｕｒｇ、ＮＪ、ＵＳＡ）を含 有する反応バイアル中にゲノムＤＮＡ（１０ｎｇ）を入れた。 Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ／ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔ ｅｍ ９６００サーマルサイクラーを用いて各ＯＲＦの増幅ＤＮＡ産物を得るた めに以下のサーマルサイクリング条件を用いた。 タンパク質１２及び１４の配列； ９４℃２分間で変性 ９４℃１５秒間、３０℃１５秒間及び７２℃１．５分間で２サイクル ９４℃１５秒間、５５℃１５秒間及び７２℃１．５間分で２３サイクル ７２℃６分間で反応を終了した。 株ＡＨ５、５１５５、７９５８、ＡＨ２４及びＪ９９のタンパク質１１の配列； ９４℃２分間で変性 ９４℃１５秒間、３０℃１５秒間及び７２℃１．５分間で２サイクル ９４℃１５秒間、５５℃１５秒間及び７２℃１．５間分で２５サイクル ７２℃６分間で反応を終了した。 株ＡＨ４、ＡＨ１５、ＡＨ６１、５２９４、５６４０、ＡＨ１８及びＨｐ２４４ のタンパク質１１及びタンパク質１３の配列； ９４℃２分間で変性 ９４℃１５秒間、３０℃２０秒間及び７２℃２分間で２サイクル ９４℃１５秒間、５５℃２０秒間及び７２℃２間分で２５サイクル ７２℃６分間で反応を終了した。 サーマルサイクリング反応の終了時に、各サンプル対を合わせ、以下に記述す るようにｐＣＲクローニングベクターへのクローニングのために直接用いた。ｐＣＲ ＴＡクローニングベクターへのヘリコバクター ピロリＤＮＡ配列のク ローニング Ｏｒｉｇｉｎａｌ ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）に記述された方法により、全ての増幅されたインサートを ｐＣＲ２．１ベクター中へクローン化した。次に、ライゲーション反応の生成物 を用いて以下に記述するように大腸菌のＴＯＰ１０Ｆ’（ヘリコバクター ピロ リ配列３５０の場合はＩｎＶａＦ’）株を形質転換した。。組み換えプラスミドでのコンピテントバクテリアの形質転換 標準的な方法に従って、クローン化されたヘリコバクター ピロリ配列を保有 する組み換えｐＣＲ発現プラスミドでコンピテントバクテリアの大腸菌株ＴＯＰ １０Ｆ’または大腸菌株ＩｎＶａＦ’を形質転換した（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏ ｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌ ｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌ等、編集、１９９４） 。簡潔に言えば、２μｌの０．５μＭ ＢＭＥを５０μｌのコンピテント細胞の 各バイアルに添加した。続いて、２μｌのライゲーション反応液をコンピテント 細胞と混合し、氷上で３０分間インキュベートした。次に、細胞及びライゲーシ ョン混 合物を４２℃で３０秒間「熱ショック」に付し、続いて氷上にさらに２分間置き 、その後、サンプルを０．４５ｍｌのＳＯＣ培地（０．５％酵母抽出物、２．０ ％トリプトン、１０ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、 １０ｍＭ ＭｇＳＯ₄及び２０ｍＭグルコース）中３７℃で振盪しながら１時間イ ンキュベートした。次に、サンプルを２５μｇ／ｍｌのカナマイシン硫酸塩また は１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地上に広げ、一晩生育 させた。次に、ＴＯＰ１０Ｆ’またはＩｎＶａＦ’の形質転換コロニーを選び、 以下に記述するようにクローン化されたインサートを評価するために分析した。ヘリコバクター ピロリ配列を保有する組み換えｐＣＲプラスミドの同定 最初のＰＣＲ増幅クローニング反応に用いた、各ヘリコバクター ピロリ配列 に特異的な同じフォワード及びリバースプライマーを用いてクローン化されたイ ンサートを増幅することにより、組み換え体ｐＣＲ−ヘリコバクター ピロリＯ ＲＦで形質転換された個々のＴＯＰ１０Ｆ’またはＩｎＶａＦ’クローンを分析 した。成功した増幅により、クローニングベクターにヘリコバクター ピロリ配 列が組込まれたことが確かめられた（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉ ｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓ ｏｎｓ、Ｉｎｃ．、Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌ等、編集、１９９４）。 正しくクローン化されたヘリコバクター ピロリＯＲＦを保有する組み換えｐ ＣＲベクターの個々のクローンを配列分析のために選択した。（ＰＣＲIIまたは ｐＣＲ２．１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡに見られるよ うな）ベクター特異的プライマー及び以下の 表１１に挙げるようなＯＲＦに特異的なシークエンシングプライマーを用いて標 準的なプロトコル（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いてＡＢＩシーケンサーで 配列分析を実施した。 結果 これらの実験におけるＰＣＲエラー率を定めるために、ヘリコバクター ピロ リ株Ｊ９９からの５つの別個のＰＣＲ反応混合物から調製したタンパク質１１の ５個の個々のクローンを８９７ヌクレオチドの全長にわたって累積して合計４４ ８５塩基のＤＮＡ配列をシークエンスした。５個のクローンのＤＮＡ配列を異な る方法、すなわち、ランダムショットガンクローニング及びシークエンシングに より以前に得られたタンパク質１１のＤＮＡ配列と比較した。本明細書に記述さ れる実験のＰＣＲエラー率は４４８５塩基のうち２塩基の変化であると決定され 、これは０．０４％またはそれ未満という概算されるエラー率と同等である。 遺伝子として同定され、細菌ヘリコバクター ピロリの１２の異なる株からＰ ＣＲ法により増幅された４つの異なる読み枠に対してＤＮＡ配列分析を実施した 。この試験のために選択された４つの読み枠のうち３つの推定アミノ酸配列は、 他の細菌種に存在する特定のタンパク質に対して統計的に有意なＢＬＡＳＴ相同 性を示した。それらのＯＲＦはＦ．ｎｏｖｉｃｉｄａのＡＢＣトランスポーター をコードするｖａｌ Ａ ＆ Ｂ遺伝子に相同なタンパク質１１；Ｈ．Ｉｎｆｌｕ ｅｎｚａｅの外膜に存在するリポタンパク質ｅ（Ｐ４）に相同なタンパク質１２ ；エシェリキアコリの二クエン酸鉄（III）輸送の外膜レセプターであるｆｅｃ Ａに相同なタンパク質１３を含んだ。タンパク質１４は公開データベースの配列 と低い相同性を示したので未知の読み枠として同定された。 ヘリコバクター ピロリの各種株にわたるこれらのＯＲＦの保存または変動の 程度を評価するために、ＤＮＡ配列及びその推定タンパク質配列の変動をヘリコ バクター ピロリのＪ９９株に見いだされるＤＮＡ及 び推定タンパク質配列と比較した（以下の表１２を参照）。結果をランダムショ ットガンクローニングによりシークエンスされたヘリコバクター ピロリのＪ９ ９株に対する同一性パーセントとして示す。Ｊ９９配列のあらゆる変異を制御す るために、Ｊ９９細菌株から再び４つの読み枠の各々をクローン化し、シークエ ンスし、その配列情報をＪ９９株のランダムショットガンシークエンシングによ りクローン化されたインサートから集められた配列情報と比較した。データは０ ．１２％の差（タンパク質１４、Ｊ９９株）程から約７％の変動（タンパク質１ １、株ＡＨ５）までのＤＮＡ配列の変動があることを示す。推定タンパク質配列 は変動なし（タンパク質１４、株ＡＨ１８及びＡＨ２４）または７．６６％もの アミノ酸変化（タンパク質１１、株ＡＨ５）までを示す。 VII ．可能性のある治療標的としてヘリコバクター ピロリ必須遺伝子を 決定するための実験的ノックアウトプロトコル タンパク質産物が細胞エンベロープ合成、ＤＮＡ合成、転写、翻訳、調節及び コロニー形成／毒性のような必須の細胞経路において重要な役割をはたすと思わ れる遺伝子から治療標的を選択した。 ヘリコバクター ピロリ遺伝子／ＯＲＦの一部の欠失及びカナマイシン耐性カ セットの挿入突然変異生成のためのプロトコルを以前に発表された方法（Ｌａｂ ｉｇｎｅ−Ｒｏｕｓｓｅｌ等、１９８８、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １７ ０、ｐｐ.１７０４−１７０８；Ｃｏｖｅｒ等、１９９４、Ｊ．Ｂｉｏｌｏｇｉ ｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６９、ｐｐ.１０５６６−１０５７３；Ｒｅｙ ｒａｔ等、１９９５、Ｐｒｏｔ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９２、ｐｐ８７ ６８−８７７２））から修正した。ヘリコバクター ピロリ遺伝子配列の同定及びクローニング ノックアウト標的として選択される遺伝子またはＯＲＦ（読み枠）の配列をヘ リコバクター ピロリゲノム配列から同定し、遺伝子／ＯＲＦを特異的に増幅す るようにプライマーを設計するために用いた。全ての合成オリゴヌクレオチドプ ライマー（表１３）をＯＬＩＧＯプログラム（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉ ｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｐｌｙｍｏｕｔｈ、ＭＮ ５５４４７、ＵＳＡ）の助け により設計し、Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｇ ａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ、ＵＳＡ）から購入した。ＯＲＦの大きさにより 、ＯＲＦの大部分または全てに隣接する特異的プライマー（Ｆ１及びＲ１）を選 択した。ＯＲＦが８００ないし１０００塩基対より小さい場合は、隣接プライマ ーを読み枠の外側で選択した。 ヘリコバクター ピロリＨｐＪ９９株（ＡＴＣＣ ５５６７９）から調製され たゲノムＤＮＡをＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）によるＯＲＦの増幅のために 鋳型ＤＮＡの供給源として用いた（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏ ｎｓ，Ｉｎｃ．、Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌ等、編集、１９９４）。ヘリコバクター ピロリからのゲノムＤＮＡの調製は実施例Ｉを参照。４０μｌの最終容量中に１ ０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．３、５０ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ₂、２μＭの 合成オリゴヌクレオチドプライマー（フォワード＝Ｆ１及びリバース＝Ｒ１）、 ０．２ｍＭの各デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ 、ｄＴＴＰ）及び１．２５ユニットの熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｍｐｌｉ ｔａｑ、Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、Ｂｒａ ｎｃｈｂｕｒｇ、ＮＪ、ＵＳＡ）を含有する反応バイアル中に１０ｎｇのＨｐＪ ９９ゲノムＤＮＡを入れることによりＰＣＲ増幅を実施した。Ｐｅｒｋｉｎ Ｅ ｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ／ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９６００サー マルサイクラーを用いてＰＣＲを実施した。各ノックアウト標的の増幅ＤＮＡ産 物を得るために用いたサーマルサイクリング条件を表１４に示す。 表１４ ＰＣＲ条件ＭｕｒＣ ９４℃２分間ｄｅ変性 ９４℃１５秒間、４８℃１５秒間、７２℃１分３０秒間で２５サイクル ７２℃２０分間の最終伸長Ｓｉｇ５４ ９４℃２分間で変性 ９４℃１５秒間、５０℃１５秒間、７２℃１分３０秒間で２５サイクル ７２℃２０分間の最終伸長ｌｐｘＣ ９４℃２分間で変性 ９４℃１５秒間、５０℃１５秒間、７２℃１分３０秒間で３２サイクル ７２℃２０分間の最終伸長ＫＯ２４、ＫＯ２６、ＫＯ２７ ９４℃２分間で変性 ９４℃１５秒間、５０．５℃２０秒間、７２℃２分間で２５サイクル ７２℃２０分間の最終伸長ＫＯ２９、２６ｋＤａタンパク質 ９４℃２分間で変性 ９４℃１５秒間、５０．５℃２０秒間、７２℃２分間で２８サイクル ７２℃２０分間の最終伸長ＤｎａＥ、Ｇｌｙｃｙｌ ９４℃２分間で変性 ９４℃１５秒間、５１℃１５秒間、７２℃１分３０秒間で２０サイクル ７２℃２０分間の最終伸長Ｇｌｔｘ ９４℃２分間で変性、 ９４℃１５秒間、５１℃１５秒間、７２℃１分３０秒間で２５サイクル ７２℃２０分間の最終伸長ＫＯ２８ ９４℃２分間で変性 ９４℃１５秒間、５１℃１５秒間、７２℃２分間で２５サイクル ７２℃２０分間の最終伸長ＫＯ３０ ９４℃２分間で変性 ９４℃１５秒間、５１．５℃１５秒間、７２℃１分４５秒間で２５サイクル ７２℃２０分間の最終伸長ＭｕｒＩ、ＭｕｒＧ ９４℃２分間で変性、 ９４℃１５秒間、５２℃１５秒間、７２℃１分３０秒間で２５サイクル ７２℃２０分間の最終伸長ＤｎａＢ、ＫｄｔＡ、ＬｐｘＢ ９４℃２分間で変性 ９４℃１５秒間、５２℃１５秒間、７２℃１分３０秒間で２７サイクル ７２℃２０分間の最終伸長Ｔｓｆ、ＦｌｇＥ、ＦｌｉＭ、Ｓｉｇ２８、ＭｕｒＢ ９４℃２分間で変性 ９４℃１５秒間、５２℃１５秒間、７２℃１分３０秒間で３０サイクル ７２℃２０分間の最終伸長ＰｐｉＢ ９４℃２分間で変性 ９４℃１５秒間、５２℃１５秒間、７２℃２分３０秒間で３０サイクル ７２℃２０分間の最終伸長ＭｕｒＤ、ＭｕｒＥ、ＡｌｇＡ、ＭｅｔＬ、ＦｕｓＡ、ＳｅｒＳ、Ｒｎｈ ９４℃２分間で変性 ９４℃１５秒間、５５℃１５秒間、７２℃１分３０秒間で３０サイクル ７２℃２０分間の最終伸長 サーマルサイクリング反応の終了時に、増幅されたＤＮＡの各サンプルを臭化 エチジウムで染色した２％ ＴＡＥアガロースゲルで可視化して（Ｃｕｒｒｅｎ ｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈ ｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌ等、編集、 １９９４）予想される大きさの単一生成物が反応から生じたことを確かめた。次 に、増幅されたＤＮＡを洗浄し、Ｑｉａｑｕｉｃｋ Ｓｐｉｎ ＰＣＲ精製キット （Ｑｉａｇｅｎ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ、ＵＳＡ）を用いて精製した 。 ＴＡクローニング法を用いてＰＣＲ生成物をｐＴ７Ｂｌｕｅ Ｔ−ベクター（ カタログ番号６９８２０−１、Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗ Ｉ、ＵＳＡ）中にクローン化した（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏ ｎｓ，Ｉｎｃ．、Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌ等、編集、１９９４）。６倍モル過剰のＰ ＣＲ産物、１０ｎｇのｐＴ７Ｂｌｕｅ−Ｔベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）、１μｌ のＴ４ ＤＮＡリガーゼバッファー（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ ）Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ、ＵＳＡ）及び２００ユニットのＴ４ ＤＮＡリガーセ （Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を１０μｌの最終反応容 量に混合することによりベクターへのＰＣＲ産物のライゲーションを実施した。 ライゲーションを１６℃で１６時間続けた。 ライゲーション生成物をエレクトロポレーションコンピテントＸＬ−１ Ｂｌ ｕｅまたはＤＨ５−α大腸菌細胞（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂ．，Ｉｎｃ．、Ｐ ａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）中にエレクトロポレーションした（Ｃｕｒｒ ｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊ ｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌ等、編 集、１９９４）。簡潔に言えば、１μｌのライゲーション反応物を４０μｌのエ レクトロコンピテント細胞と混合し、高電圧パルスに付し（２５μＦ、２．５ｋ Ｖ、２００オーム）、その後、サンプルを０．４５ｍｌのＳＯＣ培地（０．５％ 酵母抽出物、２％トリプトン、１０ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍ Ｍ ＭｇＣｌ₂、１０ｍＭ ＭｇＳＯ₄及び２０ｍＭグルコース）中３７℃で振盪し ながら１時間インキュベートした。次に、サンプルを１００μｇ／ｍｌのアンピ シリン、０．３％ Ｘ−ｇａｌ及び１００μｇ／ｍｌ ＩＰＴＧを含有するＬＢ（ １０ｇ／ｌバクトトリプトン、５ｇ／ｌバクト酵母抽出物、１０ｇ／ｌ塩化ナト リウム）プレート上に広げた。これらのプレートを３７℃で一晩インキュベート した。白色のアンピシリン耐性コロニーを選択し、１００μｇ／ｍｌのアンピシ リンを含有する５ｍｌの液体ＬＢ中で生育させ、プラスミドＤＮＡをＱｉａｇｅ ｎミニプレッププロトコル（Ｑｉａｇｅｎ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ、 ＵＳＡ）を用いて単離した。 正しいヘリコバクター ピロリＤＮＡインサートがクローン化されていること を確かめるために、Ｊ９９ヘリコバクター ピロリ配列の最初 の増幅のために用いた同じフォワード及びリバースプライマー（Ｆ１及びＲ１） を用いて、クローン化されたインサートをＰＣＲ増幅するための鋳型としてこれ らのｐＴ７ＢｌｕｅプラスミドＤＮＡを用いた。プライマーの認識及び２％ Ｔ ＡＥ、臭化エチジウム染色したアガロースゲルで視覚化した場合の正しい大きさ のＰＣＲ産物により正しいインサートがクローン化されたことが確かめられた。 各ノックアウト標的に対して２ないし６個のそのような確認クローンが得られ、 これらを保存のために−７０℃で凍結した。ＰＣＲによるエラーを最小限にする ために、これらの確認されたクローンからのプラスミドＤＮＡを集め、次のクロ ーニング工程で用いた。 ＯＲＦ内で遮断または除去される（２５０塩基対までの）ヘリコバクター ピ ロリＤＮＡの領域に隣接するが相互に外向きである第二のプライマー対（Ｆ２及 びＲ２）を設計するために遺伝子／ＯＲＦの配列を再び用いた。以前に単離され たクローンの環状プラスミドＤＮＡのプールを今回のＰＣＲの鋳型として用いた 。この欠失プライマー対の増幅の方向は相互に外向きであるので、プライマー間 のＯＲＦの部分は得られるＰＣＲ生成物に含まれない。ＰＣＲ産物は、各末端に ヘリコバクターＤＮＡ及びそれらの間にＴ７Ｂｌｕｅベクターバックボーンを有 する直鎖状の断片であり、本質的にＯＲＦの一部の欠失をもたらす。ＰＣＲ産物 を１％ ＴＡＥ、臭化エチジウム染色したアガロースゲルで可視化して正しい大 きさの単一生成物のみが増幅されたことを確かめた。 先に用いたＴＡクローニング法により、このＰＣＲ生成物にカナマイシン耐性 カセット（Ｌａｂｉｇｎｅ−Ｒｏｕｓｓｅｌ等、１９８８ Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉ ｏｌｏｇｙ １７０、１７０４−１７０８）を連結した （Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌ ｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、Ｆ．Ａｕｓｕｂ ｅｌ等、編集、１９９４）。組み換えプラスミドｐＣＴＢ８：ｋａｎ（Ｃｏｖｅ ｒ等、１９９４、Ｊ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６９、ｐ ｐ.１０５６６−１０５７３）のＥｃｏＲＩ消化を実施することにより、カンピ ロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）カナマイシン耐性遺伝子を含有する カナマイシンカセットを得た。適切なフラグメント（１．４ｋｂ）を１％ ＴＡ Ｅゲルで単離し、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｇａｉｔｈ ｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ、ＵＳＡ）を用いて単離した。Ｋｅｎｏｗ平滑末端化プロ トコルを用いてフラグメントを末端修復し、これは４μｇのＤＮＡフラグメント 、０．５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ １μｌ、２μｌのＫ ｌｅｎｏｗバッファー（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）及び５ユニ ットのＫｅｎｏｗ ＤＮＡポリメラーゼＩ大（クレノウ）フラグメント（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を２０μｌの反応液に混合し、３０℃で１ ５分間インキュベートし、そして７５℃に１０分間加熱することにより酵素を不 活性化することを含んだ。次に、ヌクレオチドを除くために、この平滑末端化カ ナマイシンカセットをＱｉａｑｕｉｃｋカラム（Ｑｉａｇｅｎ、Ｇａｉｔｈｅｒ ｓｂｕｒｇ、ＭＤ、ＵＳＡ）を通して精製した。次に、１００μ１の反応液中に ５μｇの平滑末端化カナマイシンカセット、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ ８．３、 ５０ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ₂、５ユニットのＤＮＡポリメラーゼ（Ａｍ ｐｌｉｔａｑ、Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｒｍ，Ｉｎｃ．、 Ｂｒａｎｃｈｂｕｒｇ、ＮＪ、 ＵＳＡ）、２０μｌの５ｍＭ ｄＴＴＰを混合し、この反応液を３７℃で２時間 インキュベートすることにより「Ｔ」突出を作製した。「Ｋａｎ−Ｔ」カセット をＱＩＡｑｕｉｃｋカラム（Ｑｉａｇｅｎ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ、 ＵＳＡ）を用いて精製した。１０μｌの反応液中に１０ないし２５μｇの欠失プ ライマーＰＣＲ産物、５０−７５ｎｇのＫａｎ−ＴカセットＤＮＡ、１μｌの１ ０ｘ Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ反応混合物、０．５μｌのＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｎ ｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ、ＵＳＡ））を 混合し、１６℃で１６時間インキュベートすることにより、欠失プライマー（Ｆ ２及びＲ２）のＰＣＲ生成物をＫａｎ−Ｔカセットに連結した。 先に記述したようにエレクトロポレーションによりライゲーション生成物をＸ Ｌ−１ ＢｌｕｅまたはＤＨ５−α大腸菌細胞に形質転換した。ＳＯＣでの回復 後に、細胞を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢプレート上にまき 、３７℃で一晩生育させた。次に、これらのプレートを２５μｇ／ｍｌのカナマ イシンを含有するプレート上にレプリカして一晩生育させた。得られたコロニー は、ｐＴ７Ｂｌｕｅベクター中に存在するアンピシリン耐性遺伝子及び新しく導 入されたカナマイシン遺伝子の両方を有した。コロニーを２５μｇ／ｍｌのカナ マイシンを含有するＬＢ中に選び取り、プラスミドＤＮＡをＱｉａｇｅｎミニプ レッププロトコル（Ｑｉａｇｅｎ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ、ＵＳＡ） を用いて単離した。 カナマイシンがヘリコバクター ピロリ遺伝子／ＯＲＦ中に挿入されたことを 確かめ、そしてヘリコバクター ピロリ遺伝子／ＯＲＦに対するカナマイシン耐 性遺伝子の挿入の方向を決定するために、ＰＣＲ増幅 によるいくつかの試験をこれらのプラスミドに対して実施した。カナマイシンカ セットがヘリコバクター ピロリ配列中に挿入されたことを確かめるために、プ ラスミドＤＮＡをヘリコバクター ピロリ遺伝子／ＯＲＦをクローン化するため に最初用いたプライマー組（Ｆ１及びＲ１）でのＰＣＲ増幅の鋳型として用いた 。正しいＰＣＲ産物は、欠失があるが１．４ｋｂのカナマイシンカセットの付加 により大きさが増した遺伝子／ＯＲＦの大きさである。ヘリコバクター ピロリ 遺伝子発現に対するカナマイシン耐性力セットの方向性の影響の可能性を避ける ために、ノックアウト遺伝子／ＯＲＦに対するカナマイシン耐性遺伝子の方向を 確かめ、結局、両方の方向のものをヘリコバクター ピロリ形質転換に用いた（ 以下参照）。カナマイシン耐性遺伝子の挿入の方向を確かめるために、プライマ ーをカナマイシン耐性遺伝子の末端から設計した（「Ｋａｎ−１」５’−ＡＴＣ ＴＴＡＣＣＴＡＴＣＡＣＣＴＣＡＡＡＴ−３’（配列番号１２８５）及び「ＫＡ Ｎ−２」５’−ＡＧＡＣＡＧＣＡＡＣＡＴＣＴＴＴＧＴＧＡＡ−３’（配列番号 １２８６））。Ｋａｎプライマーの各々と共にクローニングプライマー（Ｆ１及 びＲ１）の各々を用いることにより（プライマーの４通りの組み合わせ）、ヘリ コバクター ピロリ配列に対するカナマイシンカセットの方向を確かめた。陽性 クローンを「Ａ」方向（ヘリコバクター ピロリ遺伝子及びカナマイシン耐性遺 伝子の両方の同方向の転写が存在する）または「Ｂ」方向（ヘリコバクター ピ ロリ遺伝子の転写の方向がカナマイシン耐性遺伝子のものと反対である）のいず れかに分類した。同じ方向（ＡまたはＢ）を共有するクローンを次の実験のため に集め、別個にヘリコバクター ピロリに形質転換した。ヘリコバクター ピロリ細胞へのプラスミドＤＮＡの形質転換 ヘリコバクター ピロリ配列データベースが得られたＤＮＡを与えた臨床単離 体のＡＴＣＣ ５５６７９及びマウス胃で培養され、コロニー形成する能力を有 する単離体のＡＨ２４４の２株のヘリコバクター ピロリを形質転換に用いた。 形質転換のための細胞をヒッジ血液（Ｓｈｅｅｐ−Ｂｌｏｏｄ）寒天プレートま たはブルセラ培地（Ｂｒｕｃｅｌｌａ Ｂｒｏｔｈ）液のいずれかで、３７℃、 １０％ ＣＯ₂、１００％湿度で生育させた。細胞を指数増殖期まで生育させ、細 胞が「健康」（活発に動いている細胞）であり、汚染されていないことを確かめ るために顕微鏡で調べた。プレート上で生育させる場合、滅菌耳でプレートから 細胞をこすり取ることにより細胞を集め、１ｍｌのブルセラ培地に懸濁し、遠心 して落とし（１分、エッペンドルフ微量遠心機の最高速度）、２００μｌのブル セラ培地に再懸濁した。ブルセラ培地液中で生育させる場合、細胞を遠心分離（ Ｂｅｃｋｍａｎ ＴＪ６遠心機で３０００ｒｐｍで１５分）し、細胞ペレットを ２００μｌのブルセラ培地に再懸濁した。細胞の濃度を計算するために、細胞の アリコートを取り、６００ｎｍで吸光度を測定した。再懸濁した細胞のアリコー ト（１ないし５ＯＤ₆₀₀ユニット／２５μｌ）を前以て温めたヒツジ血液寒天プ レート上に置き、プレートを３７℃、６％ ＣＯ₂、１００％湿度でさらに４時間 インキュベートした。このインキュベーション後、１０μｌのプラスミドＤＮＡ （１μｌ当たり１００μｇ）をこれらの細胞上に置いた。陽性コントロール（カ ナマイシン耐性遺伝子により破壊されたリボヌクレアーゼＨ遺伝子を有するプラ スミドＤＮＡ）及び陰性コントロール（プラスミドＤＮＡなし）を同時に実施し た。これらのプレートを３７℃、 ６％ ＣＯ₂に戻しさらに４時間インキュベーションした。次に、ブルセラ培地に 湿らせた綿棒を用いて細胞をそのプレート上に広げ、３７℃、６％ ＣＯ₂で２０ 時間生育させた。次に、２５μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するヒツジ血液寒 天プレートに細胞を移し、３７℃、６％ ＣＯ₂、１００％湿度で３ないし５日間 生育させた。コロニーが生じた場合、それらを選び取り、２５μｇ／ｍｌのカナ マイシンを含有する新しいヒツジ血液寒天プレート上にパッチ（ｐａｔｃｈ）と して再生育させた。 形質転換体のコロニーが正しい染色体の位置での相同組み換えにより生じたこ とを確かめるために、３組のＰＣＲ（３試験）を実施した。ＰＣＲの鋳型（コロ ニーからのＤＮＡ）を迅速煮沸ＤＮＡ調製法により得た。コロニーのアリコート （つまようじでコロニーを刺したもの）を１００μｌの１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ− １００、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．５中に入れ、６分間煮沸した。等容量の フェノール：クロロホルム（１：１）を添加し、ボルテックスした。この混合物 を５分間微量遠心分離し、上清を以下のプライマーの組み合わせでのＰＣＲのＤ ＮＡ鋳型として用いて正しい染色体の位置での相同組み換えを確かめた。 試験１ Ｆ１及びＲ１プライマー（遺伝子／ＯＲＦを増幅するために最初に用 いたクローニングプライマー）でのＰＣＲ。正しい染色体の位置での相同組み換 えの陽性結果は、欠失があるが１．４ｋｂのカナマイシンカセットの付加により 大きさが増加した遺伝子／ＯＲＦの大きさであると予想される単一のＰＣＲ産物 を示すはずである。ちょうど遺伝子／ＯＲＦの大きさのＰＣＲ産物は、遺伝子が ノックアウトされておらず、形質転換体が正しい染色体の位置での相同組み換え の結果ではなかった 証拠である。 試験２ Ｆ３（遺伝子／ＯＲＦの上流の配列から設計されたプライマー）、及 び用いるプラスミドＤＮＡが「Ａ」または「Ｂ」方向であるかによりプライマー Ｋａｎ−１またはＫａｎ−２（カナマイシン耐性遺伝子の末端から設計されたプ ライマー）のいずれかでのＰＣＲ。カナマイシン耐性遺伝子の上流の遺伝子／Ｏ ＲＦの配列の正しい染色体の位置での相同組み換えの陽性結果は、予想される大 きさがＦ３の位置からカナマイシン耐性遺伝子の挿入部位までである単一のＰＣ Ｒ産物を示すはずである。ＰＣＲ産物がないかまたは正しくない大きさのＰＣＲ 産物は、プラスミドが正しい部位で組み込まれず、遺伝子がノックアウトされな かった証拠である。 試験３ Ｒ３（遺伝子／ＯＲＦの下流の配列から設計されたプライマー）、及 び用いるプラスミドＤＮＡが「Ａ」または「Ｂ」方向であるかによりプライマー Ｋａｎ−１またはＫａｎ−２のいずれかでのＰＣＲ。カナマイシン耐性遺伝子の 下流の正しい染色体の位置での相同組み換えの陽性結果は、予想される大きさが カナマイシン耐性遺伝子の挿入部位からＲ３の下流の位置までである単一のＰＣ Ｒ産物を示すはずである。ここでも、ＰＣＲ産物がないかまたは正しくない大き さのＰＣＲ産物は、プラスミドが正しい部位で組み込まれず、遺伝子がノックア ウトされなかった証拠である。 インビトロで生存のために必須でない遺伝子は、陽性コントロールのリボヌク レアーゼＨ遺伝子で見られたように通常多数の形質転換体を生じた。上記の３試 験全てに陽性の結果を示すあらゆる形質転換体は、その遺伝子がインビトロでの 生存のために必須でないという結論をもたら す。 インビトロで生存のために必須である遺伝子は通常非常に少数の形質転換体を 示した。全ての形質転換体をスクリーニングする。各形質転換体の上記の３試験 のいずれかの陰性結果は、遺伝子が破壊されず、その遺伝子がインビトロで生存 のために必須であったという結論をもたらす。 ２つの別個の形質転換からコロニーが生じず、一方、破壊されたリボヌクレア ーゼＨプラスミドＤＮＡを用いた陽性コントロールが形質転換体を生じた場合、 コロニー形成のためにまく前の形質転換体集団からのＤＮＡに対するＰＣＲによ りプラスミドＤＮＡをさらに分析して、それが細胞に入り、正しい部位で相同組 み換えを受けることができることを確かめた。簡潔に言えば、プラスミドＤＮＡ を上記の形質転換プロトコルに従ってインキュベーションした。プラスミドＤＮ Ａとのインキュベーション後すぐにヘリコバクター ピロリ細胞からＤＮＡを抽 出し、そのＤＮＡを上記の試験２及び試験３の鋳型として用いた。試験２及び試 験３の陽性結果は、プラスミドＤＮＡが細胞に入り、正しい染色体の位置で相同 組み換えを受けることができたことを証明する。試験２及び試験３が陽性である 場合、生存できる形質転換体を得ることができないことは、その遺伝子が必須で あり、そしてその遺伝子の破壊を受けている細胞がコロニー形成できないことを 示す。 これらの実験に用いた遺伝子は表１５に示されるように必須、非必須であるか またはなお進行中であると見いだされた。 VIII ．ヘリコバクター ピロリのペプチジル−プロピルシス−トランスイソメラ ーゼをコードする遺伝子のクローニング、精製及び特性化 ヘリコバクター ピロリゲノムは、シネココッカスエスピ（Ｓｙｎｅｃｈｏｃ ｏｃｃｕｓ ｓｐ ．）（株ＰＣＣ７９４２）ｐｐｉ遺伝子（ＮＣＢＩ登録番号Ｐ ２９８２０）と相同性を有することが見いだされた１７０アミノ酸の読み枠（Ｏ ＲＦ）を含む。それ故、このＯＲＦがＰＰｉａｓｅ活性を有するタンパク質をコ ードするかどうかを評価するために、この遺伝子をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣ Ｒ）増幅クローニングにより単離し、大腸菌で過剰発現させ、タンパク質を均一 になるまで精製した。精製を容易にするために、ポリヒスチジンタグをこのＯＲ ＦのＮ末端に付加した。タンパク質折りたたみ機能を評価するためのＰＰＩａｓ ｅを用いる簡単なアッセイを高処理量薬剤スクリーニングとしての将来の用途の ために開発した。 現在、ＰＰＩａｓｅの種類は３つの関係のないファミリー、すなわち、シクロ フィリン、ＦＫ５０６結合（ＦＫＢＰ）及びパルブリンに分けられる。ＰＰＩａ ｓｅの突然変異体は酵母及びショウジョウバエから報告されているけれども、大 腸菌における破壊突然変異体を単離する試みは成功しなかった（Ｓｈｉｅｈ、Ｂ ．Ｈ．等（１９８９）Ｎａｔｕｔｅ ３３８：６７−７０）。このことは、この 活性がバクテリアでの生存能力のために必須であることを示唆する。クローニング、発現及びタンパク質精製 ヘリコバクター ピロリからのｐｐｉのクローニング、発現及び精製を容易に するために、大腸菌における組み換えｐｐｉのクローニング及び発現のために強 力な遺伝子発現系のｐＥＴ系用いた。この試験では、 ヘリコバクター ピロリｐｐｉ遺伝子のタンパク質産物はシグナル配列を含まず 、サイトゾルタンパク質として発現されるので、この遺伝子の配列は全長の遺伝 子の５’末端に融合されたＨｉｓ−ＴａｇをコードするＤＮＡ配列を含む。 ｐｐｉ遺伝子の５’末端に特異的な合成オリゴヌクレオチドプライマー（５’ −ＴＴＡＴＧＧＡＴＣＣＡＡＡＣＣＡＡＴＴＡＡＡＡＣＴ−３’（配列番号１２ ８７）はその最も５’末端にＢａｍＨＩ部位をコードし、ｐｐｉ遺伝子の３’末 端に特異的なプライマー（５’−ＴＡＴＣＴＣＧＡＧＴＴＡＴＡＧＡＧＡＡＧＧ ＧＣ−３’（配列番号１２８８）はその最も５’末端にＸｈｏＩ部位をコードし た。ヘリコバクター ピロリのＪ９９株から調製したゲノムＤＮＡをＰＣＲ増幅 反応の鋳型ＤＮＡの供給源として用いた（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌ等、編集、１９９４）。ヘリコバク ター ピロリｐｐｉ遺伝子を含有するＤＮＡを増幅するために、１００μｌの最 終容量中に２ｍＭ ＭｇＣｌ₂、特定されたヘリコバクター ピロリＯＲＦに相補 的で隣接する１μＭの合成オリゴヌクレオチドプライマー（フォワード及びリバ ースプライマー）、０．２ｍＭの各デオキシヌクレオチド三リン酸；ｄＡＴＰ、 ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ及び２．５ユニットの熱安定性ＤＮＡポリメラー ゼ（Ａｍｐｌｉｔａｑ、Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉ ｎｃ．、Ｂｒａｎｃｈｂｕｒｇ、ＮＪ、ＵＳＡ）を含有する反応バイアル中にゲ ノムＤＮＡ（５０ｎｇ）を入れた。Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ／Ｇ ｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９６００サーマルサイク ラーを用いて各ＯＲＦの増幅ＤＮＡ生成物を得るために以下のサーマルサイクリ ング条件を用いた。ヘリコバクター ピロリｐｐｉＢの増幅条件 ９４℃２分間で変性 ９４℃１５秒間、３２℃１５秒間及び７２℃１．５分間で２サイクル ９４℃１５秒間、５６℃１５秒間及び７２℃１．５分間で２５サイクル ７２℃６分間で反応を終了した。 サーマルサイクリング反応の終了時に、増幅されたＤＮＡを洗浄し、Ｑｉａｑｕ ｉｃｋ Ｓｐｉｎ ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒ ｇ、ＭＤ、ＵＳＡ）を用いて精製した。増幅ＤＮＡサンプルを制限エンドヌクレ アーゼ、ＢａｍＨＩ及びＸｈｏｌ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、 Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ、ＵＳＡ）での消化に供した（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔ ｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、同章中）。ＤＮＡを １．０％ ＮｕＳｅｉｖｅ（ＦＭＣ ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ、Ｒｏｃｋｌａｎ ｄ、ＭＥ、ＵＳＡ）アガロースゲルでの電気泳動に供した。臭化エチジウム及び 長波長ｕｖ照射にさらすことによりＤＮＡを可視化した。アガロースゲルから単 離された切片に含まれるＤＮＡをＢｉｏ １０１ ＧｅｎｅＣｌｅａｎキットプ ロトコル（Ｂｉｏ １０１ Ｖｉｓｔａ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて精製した。 ＰＰＩ遺伝子のクローニング、形質転換、発現及び精製を本質的に上の実施例 II及びIIIに記述したように実施した。ＰＰＩａｓｅ活性のアッセイ ＰＰＩａｓｅのアッセイは本質的にＦｉｓｈｅｒにより記述されたよ うであった（Ｆｉｓｈｅｒ、Ｇ．等（１９８４）Ｂｉｏｍｅｄ．Ｂｉｏｃｈｉｍ ．Ａｃｔａ ４３：１１０１−１１１１）。このアッセイは試験ペプチドＮ−ス クシニル−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｐ−ニトロアニリド（Ｓｉｇｍａ 番号Ｓ−７３８８、ロット番号８４Ｈ５８０５）中のＡｌａ−Ｐｒｏ結合のシス −トランス異性化を測定する。Ａｌａ−Ｐｒｏ結合がトランスである場合にのみ 試験ペプチドを切断することができるα−キモトリプシンとこのアッセイを結び つける。アッセイにおける試験ペプチドのトランス異性体への転化をＢｅｃｋｍ ａｎ Ｍｏｄｅｌ ＤＵ−６５０分光光度計で３９０ｎｍで調べた。０．５秒の 平均走査時間で１秒ごとにデータを集めた。１０μＭのα−キモトリプシン（ウ シ膵臓からの１−５型、Ｓｉｇｍａ番号Ｃ−７７６２、ロット２３Ｈ７０２０） 及び１０ｎＭ ＰＰＩａｓｅを用いて４００μｌの最終容量で３５ｍＭ Ｈｅｐｅ ｓ、ｐＨ ８．０中でアッセイを実施した。反応を開始するために、１０μｌの 基質（ＤＭＳＯ中の２ｍＭ Ｎ−スクシニル−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ −ｐ−ニトロアニリド）を３９０μｌの反応混合物に室温で添加した。未精製のバクテリア抽出物におけるＰＰＩａｓｅアッセイ ブルセラ培地中のヘリコバクター ピロリ（株Ｊ９９）の５０ｍｌ培養物を対 数増殖期の中間（ＯＤ_600nm〜１）で集め、以下のプロテアーゼインヒビター、 すなわち、１ｍＭ ＰＭＳＦ並びに各々１０μｇ／ｍｌのアプロチニン、ロイペ プチン、ペプスタチン、ＴＬＣＫ、ＴＰＣＫ及びダイズトリプシンインヒビター を含む溶解バッファーに再懸濁した。この懸濁液を３回の凍結−融解（−７０℃ で１５分、次に室温で３０分）続いて超音波処理（３回の２０秒破壊）に供した 。ライセートを遠心分 離（１２，０００ｇｘ３０分）し、上清をＰＰＩａｓｅ活性に関してアッセイし た。結果 ヘリコバクター ピロリからのＰＰＩをＮｏｖａｇｅｎからのｐＥＴ−２８ｂ 発現ベクター（カタログ番号６９８６８−１）を用いて大腸菌で発現させた。ミ クロフルイディックス細胞破壊室（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ Ｃｅｌｌ ｄ ｉｓｒｕｐｔｉｏｎ ｃｈａｍｂｅｒ）におけるキャビテーションにより破壊し たバクテリア細胞の可溶性画分から発現された組み換えタンパク質を単離した。 組み換えＰＰＩの発現レベルは１００ｍｇのタンパク質を生じた。Ｎｉ²⁺キレー トクロマトグラフィー及びゲル濾過により組み換えタンパク質を均一になるまで 精製することができた。ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲルで、組 み換えタンパク質は遺伝子配列から推定される２０，９７５の予想分子量と一致 する２１ｋＤａの単一バンドとして移動する。 発色性テトラペプチド基質のスクシニル−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ− ｐ−ニトロアニリドを用いてＰＰＩａｓｅ活性をアッセイした。４．９μｍｏｌ ｅ／分／ｍｇタンパク質の初期速度が精製された酵素で測定された（図５）。こ れは１．６秒^-1のｋ_catに相当し、大腸菌ＰＰＩａｓｅ（Ｌｉｕ、Ｊ．及びＷａ ｌｓｈ、Ｃ．Ｔ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：４０２８−４０３２）及びブタ腎臓からのもの（Ｆｉｓｃｈｅｒ、Ｇ． （１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３３７：４７６−４７８）に対して得られたものと 類似する。 アッセイを２５℃で測定すると、組み換えタンパク質は２．０６ ｘ １０⁹Ｍ^-1ｓ^-1の高い触媒効率を有する。これらの値は他の特性化されたＰＰＩ ａｓｅに対して観察されたものより１ないし２桁高い。しかしながら、それらの 試験ではＰＰＩａｓｅアッセイは１０℃で実施されており、これにより相違を説 明することができる。この触媒効率は、「運動学上完全な」酵素の１ ｘ １０⁸ ないし１ ｘ １０⁹Ｍ^-1ｓ^-1の拡散上限（Ａｌｂｅｒｙ、Ｗ．Ｊ．及びＫｎｏｗ ｌｅｓ、Ｊ．Ｒ．（１９７６）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １５：５６３１−５ ６４０）に非常に近く、少なくとも１つの尺度により、ヘリコバクター ピロリ ＰＰＩａｓｅがオリゴペプチド基質中のＡｌａ−Ｐｒｏ結合のシス−トランス異 性化の非常に効率のよい触媒であることを示唆する。 ＰＰＩａｓｅの存在をヘリコバクター ピロリ抽出物においても測定した。組 み換えタンパク質のアッセイでのように、ＰＰＩａｓｅ活性を検出し、これは添 加した抽出物の濃度に依存した（図６）。 これらの結果は、ヘリコバクター ピロリ抽出物または大腸菌における組み換 えタンパク質でＰＰＩａｓｅ活性を測定できることを示す。また、高い触媒効率 は、ＰＰＩａｓｅのようなヘリコバクター ピロリ酵素を大腸菌において高レベ ルで且つ活性型で発現できることも示す。精製タンパク質のそのような高収量は 各種高処理量薬剤スクリーニングアッセイの設計をもたらす。IX ．ヘリコバクター ピロリのグルタメートラセマーゼをコードする遺伝子のク ローニング、精製及び特性化 ヘリコバクター ピロリゲノムは、スタヒロコッカスヘモリチカス（Ｓｔａｐ ｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ のグルタメートラセマーゼ遺 伝子（ｄｇａ）（ＮＣＢＩ登録番号Ｕ１２４０５）及び エシェリキアコリにおいてグルタメートラセマーゼ活性をコードするｍｕｒＩ遺 伝子に相同性を有することが見いだされた２５５アミノ酸の読み枠（ＯＲＦ）を 含む。このヘリコバクター ピロリＯＲＦがグルタメートラセマーゼ活性を有す るタンパク質をコードするかどうかを評価するために、この遺伝子をポリメラー ゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅クローニングにより単離し、大腸菌で過剰発現させ、 タンパク質を見かけ上均一になるまで精製した。精製を容易にし、そして高処理 量薬剤スクリーニングとして将来用いるために、Ｄ−グルタミン酸のＬ−グルタ ミン酸への異性化をもたらすグルタメートラセマーゼ活性の簡単なアッセイを開 発した。 ヘリコバクター ピロリのこのＯＲＦは、遺伝子破壊試験により実験室培養に おけるヘリコバクター ピロリ細胞の生存能力のために必須であることが見いだ されている（上記の実施例VIIを参照）。それ故、この酵素活性の阻害はその生 物に致死的であると予想され、そのようなインヒビターはヒト感染症の抗菌治療 における有用性を有する可能性がある。グルタメートラセマーゼをコードするヘリコバクター ピロリｍｕｒＩ遺伝子の クローニング ヘリコバクター ピロリのｍｕｒＩ遺伝子をコードする７６５塩基対のＤＮＡ 配列をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅クローニングにより単離した。ＰＣ Ｒ増幅反応の鋳型ＤＮＡとしてヘリコバクター ピロリのＪ９９株から調製した ゲノムＤＮＡを用いてヘリコバクター ピロリのｍｕｒＩ遺伝子を増幅するため にＮｄｅＩ制限部位及びｍｕｒＩ遺伝子の５’末端をコードする合成オリゴヌク レオチドプライマー（５’−ＡＡＡＴＡＧＴＣＡＴＡＴＧＡＡＡＡＴＡＧＧＣＧ ＴＴＴＴＴＧ−３ ’（配列番号１２８９）並びにＥｃｏＲＩ制限部位及びｍｕｒＩ遺伝子の３’末 端をコードするプライマー（５’−ＡＧＡＡＴＴＣＴＡＴＴＡＣＡＡＴＴＴＧＡ ＧＣＣＡＴＴＣＴ−３’（配列番号１２９０）を用いた（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒ ｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉ ｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌ等、編集、１９９４ ）。ｍｕｒＩ遺伝子を含有するＤＮＡ配列を増幅するために、５０μｌの最終容 量中に１．０μＭの各合成オリゴヌクレオチドプライマー、２．０ｍＭ ＭｇＣ ｌ₂、０．２ｍＭの各デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄ ＣＴＰ ＆ ｄＴＴＰ）及び１．２５ユニットの熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ（Ａ ｍｐｌｉｔａｑ、Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ． 、Ｂｒａｎｃｈｂｕｒｇ、ＮＪ、ＵＳＡ）を含有する２つの反応バイアルの各々 にゲノムＤＮＡ（２５ｎｇ）を入れた。Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ ／ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９６００サーマルサイクラーを用い てｍｕｒｌ遺伝子の増幅ＤＮＡ生成物を得るために以下のサーマルサイクリング 条件を用いた。ヘリコバクター ピロリｍｕｒＩの増幅条件 ９４℃２分間で変性 ９４℃１５秒間、３０℃３０秒間及び７２℃１５秒間で２サイクル ９４℃１５秒間、５３℃３０秒間及び７２℃１５秒間で２３サイクル ７２℃２０分間で反応を終了した。 サーマルサイクリング反応の終了時に、増幅されたＤＮＡを洗浄し、Ｑｉａｑ ｕｉｃｋ Ｓｐｉｎ ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕ ｒｇ、ＭＤ、ＵＳＡ）を用いて精製した。増幅された ＤＮＡサンプルを制限エンドヌクレアーゼ、ＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ、ＵＳＡ）での消化に 供した（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂ ｉｏｌｏｇｙ、同章中）。２つの反応混合物の各々からのＤＮＡサンプルを集め 、１．０％ ＳｅａＰｌａｑｕｅ（ＦＭＣ ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ、Ｒｏｃｋ ｌａｎｄ、ＭＥ、ＵＳＡ）アガロースゲルでの電気泳動に供した。臭化エチジウ ム及び長波長ｕｖ照射にさらすことによりＤＮＡを可視化した。アガロースゲル 切片からヘリコバクター ピロリｍｕｒＩ遺伝子をコードする増幅ＤＮＡを単離 し、Ｂｉｏ １０１ ＧｅｎｅＣｌｅａｎキットプロトコル（Ｂｉｏ １０１ Ｖｉｓｔａ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて精製した。ｐＥＴ−２３原核生物発現ベクターへのヘリコバクター ピロリＤＮＡ配列のク ローニング クローニングまたはプラスミド調製の目的のために、ｐＥＴ−２３ｂベクター をあらゆる大腸菌Ｋ−１２株、例えば、ＨＭＳ１７４、ＨＢ１０１、ＪＭ１０９ 、ＤＨ５α等で増やすことができる。発現のための宿主はＴ７ ＲＮＡポリメラ ーゼの遺伝子の染色体コピーを含有する大腸菌株を含む。これらの宿主はｌａｃ Ｉ遺伝子、ｌａｃＵＶ５プロモーター及びＴ７ ＲＮＡポリメラーゼの遺伝子を 保有するラムダ誘導体のバクテリオファージＤＥ３の溶原菌である。Ｔ７ ＲＮ Ａポリメラーゼはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）の添加 により誘導され、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼはｐＥＴ−２８ｂのような目的の遺 伝子を保有するあらゆる標的プラスミドを転写する。我々の実験で用いる株はＢ Ｌ２１（ＤＥ３）（Ｓｔｕｄｉｅｒ、Ｆ．Ｗ．、Ｒｏｓｅｎｂ ｅｒｇ、Ａ．Ｈ．、Ｄｕｎｎ、Ｊ．Ｊ．及びＤｕｂｅｎｄｏｒｆｆ、Ｊ．Ｗ．（ １９９０）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５、６０−８９）を含む。 ｐＥＴ−２３ｂベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ 、ＵＳＡ）をＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩでの消化によりクローニングのために調製 した（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉ ｏｌｏｇｙ、同章中）。消化後、増幅され、アガロースゲルで精製されたｍｕｒ Ｉ 遺伝子を保有するＤＮＡフラグメントを先に消化したｐＥＴ−２３ｂ発現ベク ター中にクローン化した（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌ ｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、同章中）。次に、ライゲーション反応の生成物 を用いて大腸菌のＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。組み換えプラスミドでのコンピテントバクテリアの形質転換 標準的な方法により、クローン化されたヘリコバクター ピロリ配列を保有す る組み換えｐＥＴ２３−ｍｕｒＩ発現プラスミドでコンピテントバクテリアの大 腸菌株ＢＬ２１または大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換した（Ｃｕｒｒｅ ｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、同章 中）。簡潔に言えば、１μｌのライゲーション反応液を５０μｌのエレクトロコ ンピテント細胞と混合し、高電圧パルスに付し、その後、サンプルを０．４５ｍ ｌのＳＯＣ培地（０．５％酵母抽出物、２．０％トリプトン、１０ｍＭ ＮａＣ ｌ、２．５ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１０ｍＭ ＭｇＳＯ₄及び２０ｍ Ｍグルコース）中３７℃で振盪しながら１時間インキュベートした。次に、サン プルを１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天プレー ト上に広げ、一晩生育させた。次に、ＢＬ２１の形質転換されたコロニーを選び 取り、以下に記述するようにクローン化されたインサートを評価するために分析 した。ヘリコバクター ピロリ配列を保有する組み換えｐＥＴ発現プラスミドの同定 最初のＰＣＲ増幅クローニング反応に用いた、各ヘリコバクター ピロリ配列 に特異的な同じフォワード及びリバースプライマーを用いてクローン化されたイ ンサートをＰＣＲ増幅することにより、組み換え体ｐＥＴ−２３−ｍｕｒＩで形 質転換された個々のＢＬ２１クローンを分析した。成功した増幅により、発現ベ クターにヘリコバクター ピロリ配列が組込まれたことが確かめられる（Ｃｕｒ ｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、 同章中）。ＢＬ２１形質転換体からのプラスミドＤＮＡの単離及び調製 ｐＥＴ−２３−ｍｕｒＩベクターを保有するコロニーを選び、１００μｇ／ｍ ｌのアンピシリンを加えた５ｍｌのＬＢ培地中で一晩インキュベートした。次の 日に、Ｑｉａｇｅｎプラスミド精製プロトコル（Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．、Ｃｈ ａｔｓｗｏｒｔｈ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いてプラスミドＤＮＡを単離し、精製し た。大腸菌ｇｒｏＥオペロンのクローニング及び発現 大腸菌ｇｒｏＥオペロンの遺伝子と大腸菌ｍｕｒＩ遺伝子の同時発現が、組み 換えグルタメートラセメートを含有する不溶性の封入体の形成を減少することが 示されている（Ａｓｈｉｕｃｈｉ、Ｍ．、Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ、Ｔ．、Ｋｉｔａ ｍｕｒａ、Ｔ．、Ｋａｗａｔａ、Ｙ．、Ｎａｇａｉ、Ｊ．、Ｇｏｒｌａｔｏｖ、 Ｓ．、Ｅｓａｋｉ、Ｎ．及びＳｏｄ ａ、Ｋ．、１９９５、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ、１１７、４９５−４９８）。ｇｒｏ Ｅ オペロンは２つのタンパク質、ＧｒｏＥＳ（９７アミノ酸）及びＧｒｏＥＬ（ ５４８アミノ酸）をコードし、これらは分子シャペロンである。分子シャペロン は一緒になって新しいポリペプチド鎖の折りたたみを助ける（Ｆ．Ｕｌｒｉｃｈ Ｈａｒｔｌ、１９９６、Ｎａｔｕｒｅ Ｌｏｎｄｏｎ ３８１、ｐｐ．５７１ −５８０）。 大腸菌のｇｒｏＥオペロンをコードする２２１０ｂｐのＤＮＡ配列（ＮＣＢＩ 登録番号Ｘ０７８５０）をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅クローニングに より単離した。ＰＣＲ増幅反応の鋳型ＤＮＡとして大腸菌株ＭＧ１６５５から調 製したゲノムＤＮＡを用いて大腸菌のｇｒｏＥオペロンを増幅するためにＥｃｏ ＲＩ 制限部位及びｇｒｏＥオペロンの内因性プローモーター領域を含有するｇｒ ｏＥ オペロンの５’末端をコードする合成オリゴヌクレオチドプライマー（５’ −ＧＣＧＡＡＴＴＣＧＡＴＣＡＧＡＡＴＴＴＴＴＴＴＴＣＴ−３’（配列番号１ ２９１）並びにＳｃａＩ制限部位及びｇｒｏＥオペロンに含まれるｇｒｏＥＬ遺 伝子の３’末端をコードするプライマー（５’−ＡＴＡＡＧＴＡＣＴＴＧＴＧＡ ＡＴＣＴＴＡＴＡＣＴＡＧ−３’（配列番号１２９２）を用いた（Ｃｕｒｒｅｎ ｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、同章中 ）。大腸菌ｇｒｏＥオペロンを含有するＤＮＡ配列を増幅するために、５０μｌ の最終容量中に０．５μＭの各合成オリゴヌクレオチドプライマー、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ₂、０．２ｍＭの各デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＡＴＰ、ｄＧＴ Ｐ、ｄＣＴＰ ＆ ｄＴＴＰ）及び２．６ユニットの熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ （Ｅｘｐａｎｄｅｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｂ ｏ ｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、Ｉｎｄｉａ ｎａ）を含有する２つの反応バイアルの各々にゲノムＤＮＡ（１２．５ｎｇ）を 入れた。Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ／ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓ ｙｓｔｅｍ ９６００サーマルサイクラーを用いてｇｒｏＥオペロンの増幅ＤＮ Ａ生成物を得るために以下のサーマルサイクリング条件を用いた。大腸菌ｇｒｏＥオペロンの増幅及びクローニングのための条件 ９４℃２分間で変性 ９４℃１５秒間、３０℃３０秒間及び７２℃２分間で２サイクル ９４℃１５秒間、５５℃３０秒間及び７２℃２分間で２３サイクル ７２℃８分間で反応を終了した。 サーマルサイクリング反応の終了時に、増幅されたＤＮＡを洗浄し、Ｑｉａｑ ｕｉｃｋ Ｓｐｉｎ ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕ ｒｇ、ＭＤ、ＵＳＡ）を用いて精製した。増幅ＤＮＡサンプルを制限エンドヌク レアーゼ、ＥｃｏＲＩ及びＳｃａＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ 、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ、ＵＳＡ）での消化に供した（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏ ｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、同章中）。２つの 反応混合物の各々からのＤＮＡを集め、１．０％ ＳｅａＰｌａｑｕｅ（ＦＭＣ Ｂｉｏ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｒｏｃｋｌａｎｄ、ＭＥ、ＵＳＡ）アガロースゲ ルでの電気泳動に供した。臭化エチジウム及び長波長ｕｖ照射にさらすことによ りＤＮＡを可視化した。アガロースゲルから単離された切片に含まれるＤＮＡを Ｂｉｏ １０１ ＧｅｎｅＣｌｅａｎキットプロトコル（Ｂｉｏ １０１ Ｖｉ ｓｔａ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて精製した。 大腸菌ｇｒｏＥオペロンを含有するＤＮＡフラグメント、ＥｃｏＲＩないしＳ ｃａＩ をｐＡＣＹＣ１８４発現ベクター（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａ ｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ、ＵＳＡ）の対応する部位にクローン化してｐＡＣ ＹＣ−ｇｒｏＥを作製した。大腸菌のＢＬ２１（ＤＥ３）をｐＡＣＹＣ−ｇｒｏ Ｅ で形質転換した。Ｍ_r〜１４，０００（ＧｒｏＥＳ）及びＭ_r〜６０，０００（ ＧｒｏＥＬ）のタンパク質を過剰発現するテトラサイクリン耐性の形質転換体を 単離した。大腸菌のｐＡＣＹＣ−ｇｒｏＥプラスミドを保有する大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３ ）の形質転換 ｐＡＣＹＣ−ｇｒｏＥプラスミドを保有する株ＢＬ２１（ＤＥ３）のクローン から得られたコンピテントバクテリアを上記のように単離した５０ｎｇのｐＥＴ ２３−ｍｕｒＩプラスミドＤＮＡで形質転換した（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏ ｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、同章中）。ｐＡＣＹＣ −ｇｒｏＥ発現プラスミド及びｐＥＴ２３−ｍｕｒＩプラスミドの両方を保有す るＢＬ２１（ＤＥ３）のクローンを単離し、以下に記述するように組み換えグル タメートラセマーゼの発現のために用いた。組み換えヘリコバクター ピロリｍｕｒＩの発現 ｐＡＣＹＣ−ｇｒｏＥ発現プラスミド及びｐＥＴ２３−ｍｕｒＩプラスミドの 両方を保有するＢＬ２１（ＤＥ３）のバクテリアクローンを１．０ｍＭ Ｄ，Ｌ −グルタミン酸及び１００μｇ／ｍｌアンピシリン及び１００μｇ／ｍｌテトラ サイクリンを補足したＬＢ培地中で６００ｎｍで０．５ないし１．００．Ｄ．ユ ニットの吸光度に達するまで３０℃で培養し、その時点で、培養液にイソプロピ ル−β−Ｄ−チオガラクトシ ド（ＩＰＴＧ）を１．０ｍＭの最終濃度で添加した。細胞を一晩培養してヘリコ バクター ピロリ組み換えＤＮＡ構築物の遺伝子発現を誘導した。 ＩＰＴＧで 遺伝子発現の誘導後、バクテリアをＳｏｒｖａｌｌ ＲＣ−３Ｂ遠心機で４℃で ３０００ ｘ ｇで２０分間遠心分離することによりペレットにした。ペレットを ５０ｍｌの冷えた１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ ８．０、０．１Ｍ ＮａＣ ｌ及び０．１ｍＭ ＥＤＴＡ（ＳＴＥバッファー）に再懸濁した。次に、細胞を ４℃で２０００ ｘ ｇで２０分間遠心分離した。ペレットの重さを測り（平均湿 重量＝６ｇ／ｌ）、以下に記述するように処理して組み換えタンパク質を精製し た。可溶性グルタメートラセマーゼの精製 全ての工程を４℃で実施した。細胞を４容量の溶解バッファー（５０ｍＭリン 酸カリウム、ｐＨ ７．０、１００ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、２ｍＭ Ｅ ＧＴＡ、１０％グリセロール、１０ｍＭ Ｄ，Ｌ−グルタミン酸、０．１％ β− メルカプトエタノール、２００μｇ／ｍｌリゾチーム、１ｍＭ ＰＭＳＦ並びに 各々１０μｇ／ｍｌのロイペプチン、アプロチニン、ペプスタチン、Ｌ−１−ク ロロ−３−［４−トシルアミド］−７−アミノ−２−ヘプタノン（ＴＬＣＫ）、 Ｌ−１−クロロ−３−［４−トシルアミド］−４−フェニル−２−ブタノン（Ｔ ＰＣＫ）及びダイズトリプシンインヒビター）に懸濁し、少容量の微量流動化装 置（Ｍｏｄｅｌ Ｍ−１１０Ｓ、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ Ｉｎｔｅｒｎａ ｔｉｏｎａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｎｅｗｔｏｎ、ＭＡ）に３回通すこと により破壊した。得られたホモジネートを１容量のバッファーＡ（１０ｍＭ Ｔ ｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ７．０、０．１ｍＭ ＥＧ ＴＡ、１０％グリセロール、１ｍＭ Ｄ，Ｌ−グルタミン酸、１ｍＭ ＰＭＳＦ、 ０．１％ β−メルカプトエタノール）で希釈し、０．１％ Ｂｒｉｊ−３５にし 、遠心分離（１００，０００ ｘ ｇ、１時間）して澄んだ上清を生じた（粗抽出 物）。 ０．８０μｍフィルターを通して濾過した後、抽出物を１００ｍＭＮａＣｌ及 び０．０２％ Ｂｒｉｊ−３５を含有するバッファーＡで前以て平衡化した２０ ｍＬのＱ−セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）カラム上に直接添加した。カラ ムを１００ｍＭ ＮａＣｌ及び０．０２％Ｂｒｉｊ−３５を含有する１００ｍｌ （５ベッド容量）のバッファーＡで洗浄し、次に、バッファーＡ中の増加するＮ ａＣｌ（１００から５００ｍＭまで）の１００ｍｌの直線勾配で溶出した。組み 換えヘリコバクター ピロリｍｕｒＩ遺伝子の産物のグルタメートラセマーゼに 相当するＭ_r＝２８，０００のバンドは約２００−２８０ｍＭ ＮａＣｌの勾配濃 度で溶出した。次に、個々のカラム画分をグルタメートラセマーゼ活性に関して 特性化し（アッセイの説明に関しては以下を参照）、これらの画分のタンパク質 特性を１２％アクリルアミドＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分析した。 グルタメートラセマーゼを含有する画分を集め、固体（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄で７０ ％飽和にし、２０分間撹拌し、次に２７，０００ ｘ ｇで２０分間遠心分離した 。得られたペレットを８ｍｌの最終容量に溶解バッファーに再懸濁し、バッファ ーＢ（１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＥＧＴＡ、１０％グリセロール、１ｍＭ Ｄ，Ｌ−グルタミン酸、０．１ｍＭ Ｐ ＭＳＦ、０．１％ β−メルカプトエタノール）に平衡化したセファクリル（Ｓ ｅｐｈａｃｒｙｌ） Ｓ−１００ＨＲゲル濾過媒質の３５０ｍｌカラム（２．２ ｘ ９２ｃｍ）上に直 接添加し。３０ｍｌ／時間で流した。グルタメートラセマーゼ活性を含有すると 見いだされた画分を集め、（ＮａＣｌ濃度を１００ｍＭに減らすために）０．５ 容量のバッファーＣ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ ７．５、０．１ｍＭＥ ＧＴＡ、 １０％グリセロール、１ｍＭ Ｄ，Ｌ−グルタミン酸、０．１ｍＭ ＰＭＳＦ、０ ．１％ β−メルカプトエタノール）を添加し、１００ｍＭ ＮａＣｌを含有する バッファーＣに平衡化したＭｏｎｏ Ｑ１０／１０高速液体クロマトグラフィー カラムに添加した。カラムを５ベッド容量のこのバッファーで洗浄し、増加する ＮａＣｌ（１００から５００まで）の４０ｍｌの直線勾配で溶出した。グルタメ ートラセマーゼは３１０ｍＭ ＮａＣｌで鋭いピークとして溶出した。グルタメ ートラセマーゼ活性を含有する画分を集め、保存バッファー［５０％グリセロー ル、１０ｍＭ ３−（Ｎ−モルホリノ−プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）ｐＨ ７ ．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＥＧＴＡ、０．０２％ Ｂｒｉｊ−３ ５、１ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）］に対する透析により濃縮し、−２０ ℃で保存した。グルタメートラセマーゼ活性のアッセイ Ｄ−グルタメートのＬ−グルタメートへの転化（２酵素共役アッセイ） グルタメートラセマーゼの活性であるグルタミン酸の鏡像異性体の相互転化を Ｄ−グルタミン酸を基質として用いて測定した。ラクトバシラスファーメンチ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｉ ）のグルタメートラセマーゼ活 性を測定するために用いられたＧａｌｌｏ及びＫｎｏｗｌｅｓの方法（Ｇａｌｌ ｏ、Ｋ．Ａ．及びＫｎｏｗｌｅｓ、Ｊ．Ｒ．、１９９３、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ ｒｙ ３２、３９８１−３ ９９０）を大腸菌から組み換えタンパク質として単離されたヘリコバクター ピ ロリｍｕｒＩ遺伝子産物のグルタメートラセマーゼ活性の測定に適用した。この アッセイでは、グルタメートラセマーゼの活性の測定がＬ−グルタメートデヒド ロゲナーゼ（ＮＡＤのＮＡＤＨへの還元）及びジアホラーゼ（色素ｐ−ヨードニ トロテトラゾリウムバイオレット、ＩＮＴの還元）の活性への一連の共役反応に おける可視領域のＯＤ変化に連結される。５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ ７ ．８、４％ ｖ／ｖグリセロール、１０ｍＭ ＮＡＤ、２ｍＭ ＩＮＴ、６０ユニ ット／ｍｌ Ｌ−グルタメートデヒドロゲナーゼ、５ユニット／ｍｌジアホラー ゼ及び各種濃度の基質（０．０６３ｍＭから２５０ｍＭまでのＤ−グルタミン酸 ）または精製酵素（１μｇから５０μｇまで）のいずれかを含有する２００μｌ の反応容量で５００ｎｍの吸光度の増加を調べることにより初期速度を測定した 。基質（Ｄ−グルタミン酸）または酵素（ｍｕｒＩ遺伝子産物）を除いた全ての 試薬を５分の間プレインキュベーションした後、欠けている成分（すなわち、必 要な場合、酵素または基質）を添加することにより反応を開始し、５００ｎｍの 吸光度の増加をマイクロプレート分光光度計システム（Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｓｐｅｃｔｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄ ｅｖｉｃｅｓ、Ｓｐｅｃｔｒａ ＭＡＸ ２５０）で測定した。測定を２０分間 続け、吸光度の増加の最大勾配を計算することにより初期速度を得た。共役反応 を以下に示すように要約することができる。 1）Ｄ−グルタメート → Ｌ−グルタメート グルタメートラセマーゼ 2）Ｌ−グルタメート+H₂O+NAD⁺ → ２−オキソグルタレート+NH₃+NADH Ｌ−グルタメートデヒドロゲナーゼ 3）ＮＡＤＨ ＋ ＩＮＴ → ＮＡＤ⁺＋ ホルマザン（色） ジアホラーゼＤ−グルタメートのＬ−グルタメートへの転化（単一酵素共役アッセイ） このアッセイでは、Ｄ−グルタミン酸のＬ−グルタミン酸への転化がＬ−グル タメートデヒドロゲナーゼによるＬ−グルタミン酸及びＮＡＤ⁺の２−オキソグ ルタレート、アンモニアへの転化に組み合わされる。ＮＡＤＨの生成を３７℃で ３４０ｎｍの吸光度の増加（ＮＡＤ⁺のＮＡＤＨへの還元）として測定する。（ Ｃｈｏｉ、Ｓ−Ｙ．、Ｅｓａｋｉ、Ｎ．Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ、Ｔ．及びＳｏｄａ 、Ｋ．、１９９１、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉ ｆｉｃａｔｉｏｎ ２、９０−９３から適用した）標準アッセイ混合物は１０ｍ Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ ７．５、５ｍＭ ＮＡＤ⁺、５ユニット／ｍｌ Ｌ− グルタメートデヒドロゲナーゼ、各種濃度の基質Ｄ−グルタミン酸（０．０６３ ｍＭないし２５０ｍＭ）及び精製された組み換えヘリコバクター ピロリ酵素グ ルタメートラセマーゼ（１μｇないし５０μｇ）を含んだ。基質Ｄ−グルタミン 酸または組み換えグルタメートラセマーゼのいずれかを他のアッセイ成分の全て を３７℃で５分間プレインキュベーションした後に添加することにより反応を開 始した。３４０ｎｍの吸光度の変化をＳｐｅｃｔｒａ ＭＡＸ２５０で測定した 。初期速度を初期勾配から得た。共役反応を以下に示すように要約することがで きる。 1）Ｄ−グルタメート → Ｌ−グルタメート グルタメートラセマーゼ 2）Ｌ−グルタメート+H₂O+NAD⁺ → ２−オキソグルタレート+NH₃＋NADH Ｌ−グルタメートデヒドロゲナーゼ結果 １）大腸菌細胞におけるヘリコバクター ピロリｍｕｒＩ遺伝子の発現 ヘリコバクター ピロリグルタメートラセマーゼの生化学的特性を調べるため に、これを大腸菌で過剰発現させ、精製した。大腸菌シャペロンＧｒｏＥＳ及び ＧｒｏＥＬの存在下で、グルタメートラセマーゼは可溶性タンパク質として発現 された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のタンパク質バンドの強さで判断すると、１リット ルの培養当たり約２０ｍｇの可溶性ＭｕｒＩが生産された。ｍｕｒＩインサート を欠いたｐＥＴベクターで形質転換された細胞からの抽出物を含んでいるコント ロールゲルレーンではｍｕｒＩタンパク質の分子量に相当するバンドは見られな かった。発現細胞の培養中に１ｍＭ ＤＬ−グルタミン酸を添加すると見かけの 発現レベルが約５倍増加した。 ２）組み換えヘリコバクター ピロリｍｕｒＩタンパク質の精製 陽イオン交換クロマトグラフィー及びゲル濾過によりＭｕｒＩを精製した。Ｓ ＤＳ−ＰＡＧＥ分析の際に、精製されたタンパク質は２８，８５８の予想分子量 と一致する２９ｋＤａの見かけの分子量を有する単一のポリペプチド種として移 動した。 ３）組み換えヘリコバクター ピロリｍｕｒＩ酵素の速度論的特性 組み換えグルタメートラセマーゼの速度定数を上記のように各種濃度のタンパ ク質及びＤ−グルタミン酸でその活性をアッセイすることにより概算した。精製 された組み換えヘリコバクター ピロリグルタメートラセマーゼはＤ−グルタメ ートに対して〜３００ｎｍｏｌｅｓ／分／ｍ ｇタンパク質のＶ_max（ｋ_cat、＝８．６分^-1）及び〜１００μＭのＫｍを示す。 このＶ_max値は、いくつかの他のバクテリア種からの高度に精製されたグルタメ ートラセマーゼに対して観察されたものより低いけれども、Ｄ−グルタミン酸に 対するそのＫ_mは大部分の他の種からの酵素に対して観察されたものより高く、 大腸菌及びＰ．Ｐｅｎｔｏｃｏｃｃｕｓからの精製された調製物に特徴的な触媒 効率（ｋｃａｔ／Ｋｍ）を生じる。 ４）ＭｕｒＩの特性化：Ｌ−セリン−Ｏスルフェートによる阻害 大腸菌からのｍｕｒＩを阻害することが知られている自殺インヒビターのＬ− セリン−Ｏスルフェートでの不活性化に関してヘリコバクター ピロリグルタメ ートラセマーゼを試験した。２０ｍＭ Ｌ−セリン−Ｏスルフェートの存在下で 酵素をインキュベートし、異なる時間間隔でアリコートを取り出して残存活性を 測定した。２０ｍＭのインヒビターＬ−セリン−Ｏ−スルフェート（ＬＳＯＳ） と共にｘ軸に示される時間の間インキュベーションした後、精製された組み換え ヘリコバクターピロリｍｕｒＩタンパク質の初期速度を単一酵素共役アッセイで 測定した。コントロールを同様であるが、ＬＳＯＳを含まずにインキュベートし た。図７に示されるように、ヘリコバクター ピロリグルタメートラセマーゼを インヒビターにより容易に不活性化することができる。グルタメートラセマーゼ活性の高処理量薬剤スクリーニングアッセイにおける将 来の用途 上記のヘリコバクター ピロリグルタメートラセマーゼ活性の測定のためのア ッセイは９６ウェルプレートで実施されており、多数の反応を同時に実施した。 多数ウェル形態の活性の測定は容易にスケールアップ でき、グルタメートラセマーゼ活性の阻害に関して多数の化合物を迅速に分析で きる。グルタメートラセマーゼの活性を阻害する化合物は新規な抗生物質として の用途を有する可能性があり、そしてヒトにおける細菌（例えば、ヘリコバクタ ー ピロリ）の処置及び根絶のために好適である可能性がある。Ｌ−セリン−Ｏ −スルフェートのようなグルタメートラセマーゼの既知のインヒビターを新規化 合物ライブラリーの高処理量スクリーニングを基準化するために用いることがで き、インビボでのヒト治療法に適した特性を有する新規化合物の同定を容易にす る。同等物 当業者は通例の実験法のみを用いて本明細書に記述される特定の態様及び方法 に対する多数の同等物を認知するかまたは確かめることができる。そのような同 等物は以下の請求の範囲により包含されると考えられる。

【手続補正書】 【提出日】１９９９年５月１８日（１９９９．５．１８） 【補正内容】 ［請求の範囲］ 『１． 配列番号４９２−配列番号７５９、配列番号７６１、配列番号７６３、 配列番号７６５−配列番号８１８、配列番号８２０−配列番号８４６、配列番号 ８４８−配列番号８９６、配列番号８９８−配列番号９６３、配列番号９６６− 配列番号９８２、配列番号１０３７、配列番号１０３８、配列番号１０４１−配 列番号１０８７、配列番号１０９０及び配列番号１２９６−配列番号１２９８か らなる群から選択されヘリコバクター ピロリポリペプチドをコードするヌクレ オチド配列を含んでなる単離された核酸。 ２． 転写調節成分に機能的に連結された請求の範囲１の核酸を含んでなる組 み換え発現ベクター。 ３． 請求の範囲２の組み換え発現ベクターを含んでなる細胞。 ４． ポリペプチドを発現させる条件下で請求の範囲３の細胞を培養すること を含んでなるヘリコバクター ピロリポリペプチドの製造方法。 ５． 配列番号１−配列番号２６８、配列番号２７０、配列番号２７２、配列 番号２７４−配列番号３２７、配列番号３２９−配列番号３６４、配列番号３６ ６−配列番号４０５、配列番号４０７−配列番号４７２、配列番号４７５−配列 番号４９１、配列番号９８３、配列番号９８４、配列番号９８７−配列番号１０ ３３、配列番号１０３６及び配列番号１２９３−配列番号１２９５またはこれら の相補体からなる群から選択されるヌクレオチド配列の少なくとも８ヌクレオチ ドからなるヌクレオチド配列を含んでなるプローブ。 ６． 少なくとも８ヌクレオチドの長さのヌクレオチド配列を含んで なる単離された核酸で、その配列が配列番号１−配列番号２６８、配列番号２７ ０、配列番号２７２、配列番号２７４−配列番号３２７、配列番号３２９−配列 番号３６４、配列番号３６６−配列番号４０５、配列番号４０７−配列番号４７ ２、配列番号４７５−配列番号４９１、配列番号９８３、配列番号９８４、配列 番号９８７−配列番号１０３３、配列番号１０３６及び配列番号１２９３−配列 番号１２９５またはこれらの相補体からなる群から選択されるヌクレオチド配列 を有する核酸にハイブリダイズできる核酸。 ７． ヘリコバクター ピロリポリペプチドまたはそのフラグメントをコード するヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸の有効量を含んでなるヘリコ バクター ピロリ感染の予防または処置のためのワクチン組成物で、該核酸が配 列番号１−配列番号２６８、配列番号２７０、配列番号２７２、配列番号２７４ −配列番号３２７、配列番号３２９−配列番号３６４、配列番号３６６−配列番 号４０５、配列番号４０７−配列番号４７２、配列番号４７５−配列番号４９１ 、配列番号９８３、配列番号９８４、配列番号９８７−配列番号１０３３、配列 番号１０３６及び配列番号１２９３−配列番号１２９５からなる群から選択され るヌクレオチド配列を含んでなるワクチン組成物。 ８． 製薬学的に受容しうる担体をさらに含んでなる、請求の範囲７のワクチ ン組成物。 ９． 製薬学的に受容しうる担体がアジュバントである、請求の範囲８のワク チン組成物。 １０． ヘリコバクター ピロリ感染の処置が生じるように、請求の範囲７の ワクチン組成物を患者に投与することを含んでなる患者のヘリ コバクター ピロリ感染の処置方法。 １１． 処置が予防処置である、請求の範囲１０の方法。 １２． 処置が治療処置である、請求の範囲１０の方法。 １３． （ａ）プローブとサンプル中のヘリコバクター核酸の間でハイブリッ ドが形成できる条件下で請求の範囲５のプローブとサンプルを接触させ、 （ｂ）工程（ａ）で形成されたハイブリッドを検出し、ここで、ハイ ブリッドの検出がサンプル中のヘリコバクター核酸の存在を示す、 ことを含んでなるサンプル中のヘリコバクター ピロリ核酸の存在の検出方法。 １４． 配列番号４９２−配列番号７５９、配列番号７６１、配列番号７６３ 、配列番号７６５−配列番号８１８、配列番号８２０−配列番号８４６、配列番 号８４８−配列番号８９６、配列番号８９８−配列番号９６３、配列番号９６６ −配列番号９８２、配列番号１０３７、配列番号１０３８、配列番号１０４１− 配列番号１０８７、配列番号１０９０及び配列番号１２９６−配列番号１２９８ からなる群から選択されるヘリコバクター ピロリポリペプチドの組み換え体ま たは実質的に純粋な調製物。 １５． 精製されたヘリコバクター ピロリポリペプチドまたはそのフラグメ ントの有効量を含んでなるヘリコバクター ピロリ感染の予防または処置のため のワクチン組成物であって、該ヘリコバクター ピロリポリペプチドが配列番号 ４９２−配列番号７５９、配列番号７６１、配列番号７６３、配列番号７６５− 配列番号８１８、配列番号８２０− 配列番号８４６、配列番号８４８−配列番号８９６、配列番号８９８−配列番号 ９６３、配列番号９６６−配列番号９８２、配列番号１０３７、配列番号１０３ ８、配列番号１０４１−配列番号１０８７、配列番号１０９０及び配列番号１２ ９６−配列番号１２９８からなる群から選択されるワクチン組成物。 １６． 製薬学的に受容しうる担体をさらに含んでなる、請求の範囲１５のワ クチン組成物。 １７． 製薬学的に受容しうる担体がアジュバントである、請求の範囲１６の ワクチン組成物。 １８． ヘリコバクター ピロリ感染の処置が生じるように、請求の範囲１５ のワクチン組成物を患者に投与することを含んでなる患者のヘリコバクター ピ ロリ感染の処置方法。 １９． 処置が予防処置である、請求の範囲１８の方法。 ２０． 処置が治療処置である、請求の範囲１８の方法。 ２１． ヘリコバクター ピロリ細胞エンベロープポリペプチドまたはそのフ ラグメントをコードするヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸であって 、配列番号２５５、配列番号２６３、配列番号２６６、配列番号２７７、配列番 号２８０、配列番号２８５、配列番号２９２、配列番号２９４、配列番号２９９ 、配列番号３１１、配列番号３１２、配列番号３１３、配列番号３２１、配列番 号３２７、配列番号３２９、配列番号３３１、配列番号３５３、配列番号３６４ 、配列番号３６６、配列番号３６８、配列番号３７５、配列番号３８４、配列番 号３９１、配列番号３９２、配列番号３９７、配列番号３９８、配列番号４０２ 、配列番号４０４、配列番号４０９、配列番号４１０、配列番号４１２、 配列番号４２７、配列番号４３３、配列番号４３４、配列番号４４１、配列番号 ４４４、配列番号４４５、配列番号４４９、配列番号４５０、配列番号４５２、 配列番号４５３、配列番号４６６、配列番号４６８、配列番号４６９、配列番号 ９８３、配列番号９８９、配列番号１００８、配列番号１０１１、配列番号１０ １４、配列番号１０１５、配列番号１０２９、配列番号１０３２、配列番号２５ ９、配列番号２８６、配列番号３２６、配列番号３７４、配列番号３９９、配列 番号４２２、配列番号４５４、配列番号４６５、配列番号９９８、配列番号１０ ０９、配列番号１０２３、配列番号１２９４、配列番号１２９５、配列番号３１ ９、配列番号３２５、配列番号４２５、配列番号４３７、配列番号４３８、配列 番号４４７、配列番号４４８、配列番号４６７、配列番号９９６、配列番号１０ ２７、配列番号１０３１、配列番号２５４、配列番号３５２、配列番号４１５、 配列番号１０１９、配列番号３８１、配列番号３８９、配列番号１０１０、配列 番号１０１２、配列番号３５４、配列番号３７２、配列番号４００、配列番号４ ２１、配列番号１０２２、配列番号４６３、配列番号２８１、配列番号９８８、 配列番号４１１、配列番号４０７、配列番号１０１７、配列番号２９０、配列番 号４１７、配列番号４３０、配列番号９９２、配列番号１０２５、配列番号４７ ７、配列番号４１４、配列番号２５３、配列番号２９３、配列番号３３４、配列 番号３４３、配列番号４１８、配列番号４２４及び配列番号４４３からなる群か ら選択される核酸。 ２２． 該ヘリコバクター ピロリ細胞エンベロープポリペプチドまたはその フラグメントが配列番号２５５、配列番号２６３、配列番号２６６、配列番号２ ７７、配列番号２８０、配列番号２８５、配列番号２ ９２、配列番号２９４、配列番号２９９、配列番号３１１、配列番号３１２、配 列番号３１３、配列番号３２１、配列番号３２７、配列番号３２９、配列番号３ ３１、配列番号３５３、配列番号３６４、配列番号３６６、配列番号３６８、配 列番号３７５、配列番号３８４、配列番号３９１、配列番号３９２、配列番号３ ９７、配列番号３９８、配列番号４０２、配列番号４０４、配列番号４０９、配 列番号４１０、配列番号４１２、配列番号４２７、配列番号４３３、配列番号４ ３４、配列番号４４１、配列番号４４４、配列番号４４５、配列番号４４９、配 列番号４５０、配列番号４５２、配列番号４５３、配列番号４６６、配列番号４ ６８、配列番号４６９、配列番号９８３、配列番号９８９、配列番号１００８、 配列番号１０１１、配列番号１０１４、配列番号１０１５、配列番号１０２９、 配列番号１０３２、配列番号２５９、配列番号２８６、配列番号３２６、配列番 号３７４、配列番号３９９、配列番号４２２、配列番号４５４、配列番号４６５ 、配列番号９９８、配列番号１００９、配列番号１０２３、配列番号１２９４、 配列番号１２９５、配列番号３１９、配列番号３２５、配列番号４２５、配列番 号４３７、配列番号４３８、配列番号４４７、配列番号４４８、配列番号４６７ 、配列番号９９６、配列番号１０２７、配列番号１０３１、配列番号２５４、配 列番号３５２、配列番号４１５、配列番号１０１９、配列番号３８１、配列番号 ３８９、配列番号１０１０及び配列番号１０１２からなる群から選択される核酸 によりコードされるヘリコバクター ピロリ外膜ポリペプチドまたはそのフラグ メントである、請求の範囲２１の精製された核酸。 ２３． 該ヘリコバクター ピロリ外膜ポリペプチドまたはそのフラグメント が配列番号２５５、配列番号２６３、配列番号２６６、配列番 号２７７、配列番号２８０、配列番号２８５、配列番号２９２、配列番号２９４ 、配列番号２９９、配列番号３１１、配列番号３１２、配列番号３１３、配列番 号３２１、配列番号３２７、配列番号３２９、配列番号３３１、配列番号３５３ 、配列番号３６４、配列番号３６６、配列番号３６８、配列番号３７５、配列番 号３８４、配列番号３９１、配列番号３９２、配列番号３９７、配列番号３９８ 、配列番号４０２、配列番号４０４、配列番号４０９、配列番号４１０、配列番 号４１２、配列番号４２７、配列番号４３３、配列番号４３４、配列番号４４１ 、配列番号４４４、配列番号４４５、配列番号４４９、配列番号４５０、配列番 号４５２、配列番号４５３、配列番号４６６、配列番号４６８、配列番号４６９ 、配列番号９８３、配列番号９８９、配列番号１００８、配列番号１０１１、配 列番号１０１４、配列番号１０１５、配列番号１０２９及び配列番号１０３２か らなる群から選択される核酸によりコードされる末端フェニルアラニン残基を有 するヘリコバクター ピロリポリペプチドまたはそのフラグメントである、請求 の範囲２２の精製された核酸。 ２４． 該ヘリコバクター ピロリ外膜ポリペプチドまたはそのフラグメント が配列番号２８６、配列番号３２６、配列番号３７４、配列番号３９９、配列番 号４２２、配列番号４５４、配列番号４６５、配列番号９９８、配列番号１００ ９、配列番号１０２３、配列番号１２９４及び配列番号１２９５からなる群から 選択される核酸によりコードされるＣ末端チロシンクラスターを有するヘリコバ クター ピロリポリペプチドまたはそのフラグメントである、請求の範囲２２の 精製された核酸。 ２５． 該ヘリコバクター ピロリ外膜ポリペプチドまたはそのフラ グメントが配列番号３１９、配列番号３２５、配列番号４２５、配列番号４３７ 、配列番号４３８、配列番号４４７、配列番号４４８、配列番号４６７、配列番 号９９６、配列番号１０２７及び配列番号１０３１からなる群から選択される核 酸によりコードされる末端フェニルアラニン残基及びＣ末端チロシンクラスター を有するヘリコバクター ピロリポリペプチドまたはそのフラグメントである、 請求の範囲２２の精製された核酸。 ２６． 該ヘリコバクター ピロリ細胞エンベロープポリペプチドまたはその フラグメントが配列番号３５４、配列番号３７２、配列番号４００、配列番号４ ２１、配列番号１０２２、配列番号４６３、配列番号２８１、配列番号９８８、 配列番号４１１、配列番号４０７、配列番号１０１７、配列番号２９０、配列番 号４１７、配列番号４３０、配列番号９９２及び配列番号１０２５からなる群か ら選択される核酸によりコードされるヘリコバクター ピロリ内膜ポリペプチド またはそのフラグメントである、請求の範囲２１の精製された核酸。 ２７． 該ヘリコバクター ピロリ内膜ポリペプチドまたはそのフラグメント が配列番号３５４のヌクレオチド配列を含んでなる核酸によりコードされる外膜 及び細胞壁合成に関与するヘリコバクター ピロリポリペプチドまたはそのフラ グメントである、請求の範囲２６の精製された核酸。 ２８． 該ヘリコバクター ピロリ内膜ポリペプチドまたはそのフラグメント が配列番号３７２、配列番号４００、配列番号４２１及び配列番号１０２２から なる群から選択される核酸によりコードされるエネルギー転化に関与するヘリコ バクター ピロリポリペプチドまたはそのフ ラグメントである、請求の範囲２６の精製された核酸。 ２９． 該ヘリコバクター ピロリ内膜ポリペプチドまたはそのフラグメント が配列番号４６３のヌクレオチド配列を含んでなる核酸によりコードされる補因 子代謝に関与するヘリコバクター ピロリポリペプチドまたはそのフラグメント である、請求の範囲２６の精製された核酸。 ３０． 該ヘリコバクター ピロリ内膜ポリペプチドまたはそのフラグメント が配列番号２８１及び配列番号９８８からなる群から選択される核酸によりコー ドされる分泌及び接着に関与するヘリコバクター ピロリポリペプチドまたはそ のフラグメントである、請求の範囲２６の精製された核酸。 ３１． 該ヘリコバクター ピロリ内膜ポリペプチドまたはそのフラグメント が配列番号４０７及び配列番号１０１７からなる群から選択される核酸によりコ ードされる輸送に関与するヘリコバクター ピロリポリペプチドまたはそのフラ グメントである、請求の範囲２６の精製された核酸。 ３２． 該ヘリコバクター ピロリ細胞エンベロープポリペプチドまたはその フラグメントが配列番号４７７のヌクレオチド配列を含んでなる核酸によりコー ドされるヘリコバクター ピロリ鞭毛ポリペプチドまたはそのフラグメントであ る、精製の範囲２１の精製された核酸。 ３３． 該ヘリコバクター ピロリ細胞エンベロープポリペプチドまたはその フラグメントが配列番号４１４のヌクレオチド配列を含んでなる核酸によりコー ドされるヘリコバクター ピロリ輸送ポリペプチドまたはそのフラグメントであ る、請求の範囲２１の精製された核酸。 ３４． 転写調節成分に機能的に連結された請求の範囲２１の核酸を 含んでなる組み換え発現ベクター。 ３５． 請求の範囲３４の組み換え発現ベクターを含んでなる細胞。 ３６． ポリペプチドを発現させる条件下で請求の範囲３５の細胞を培養する ことを含んでなるヘリコバクター ピロリポリペプチドの製造方法。 ３７． ヘリコバクター ピロリ分泌ポリペプチドまたはそのフラグメントを コードするヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸で、配列番号３５５、 配列番号１００６、配列番号２５７、配列番号２５８、配列番号２６０、配列番 号２６１、配列番号２６４、配列番号２６５、配列番号２６８、配列番号２７０ 、配列番号２７２、配列番号２７４、配列番号２７５、配列番号２７６、配列番 号２７９、配列番号２８３、配列番号２８４、配列番号２８７、配列番号２８８ 、配列番号２８９、配列番号２９１、配列番号２９５、配列番号２９６、配列番 号２９７、配列番号２９８、配列番号３００、配列番号３０１、配列番号３０２ 、配列番号３０３、配列番号３０４、配列番号３０５、配列番号３１４、配列番 号３１５、配列番号３２３、配列番号３３８、配列番号３４２、配列番号３４８ 、配列番号３４９、配列番号３５６、配列番号３５８、配列番号３５９、配列番 号３６０、配列番号３６１、配列番号３６２、配列番号３６３、配列番号３６７ 、配列番号３７０、配列番号３７１、配列番号３７３、配列番号３７７、配列番 号３７８、配列番号３７９、配列番号３８０、配列番号３８８、配列番号３９０ 、配列番号３９４、配列番号３９５、配列番号３９６、配列番号４０１、配列番 号４０３、配列番号４０５、配列番号４０８、配列番号４２０、配列番号４２６ 、配列番号４２８、配列番号４２９、配列番号４３２、配列番号４３９、 配列番号４４２、配列番号４５１、配列番号４７１、配列番号４７８、配列番号 ４８８、配列番号９８７、配列番号９９０、配列番号９９１、配列番号９９３、 配列番号１００１、配列番号１００２、配列番号１００７、配列番号１０１３、 配列番号１０１６、配列番号１０１８、配列番号１０２１及び配列番号１０２６ からなる群から選択される核酸。 ３８． 該ヘリコバクター ピロリ分泌ポリペプチドまたはそのフラグメント が配列番号３５５及び配列番号１００６からなる群から選択される核酸によりコ ードされる分泌及び接着に関与するヘリコバクターピロリポリペプチドまたはそ のフラグメントである、請求の範囲３７の精製された核酸。 ３９． 転写調節成分に機能的に連結された請求の範囲３８の核酸を含んでな る組み換え発現ベクター。 ４０． 請求の範囲３９の組み換え発現ベクターを含んでなる細胞。 ４１． ポリペプチドを発現させる条件下で請求の範囲４０の細胞を培養する ことを含んでなるヘリコバクター ピロリポリペプチドの製造方法。 ４２． ヘリコバクター ピロリ細胞質ポリペプチドまたはそのフラグメント をコードするヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸で、配列番号４７０ 、配列番号１０３３、配列番号３５７、配列番号４５７、配列番号４６１、配列 番号１０３０、配列番号３４５、配列番号３８３、配列番号３８７、配列番号４ ５５、配列番号１００３、配列番号３５１、配列番号４１６、配列番号２７８、 配列番号３３５、配列番号３４６、配列番号３５０、配列番号４１９、配列番号 ４６０、配列番号４７２、配列番号１０００、配列番号１００４、配列番号１０ ２０、配列番号１ ２９３、配列番号３１８、配列番号３２２、配列番号３２４、配列番号３３０、 配列番号３４７、配列番号４４０、配列番号４４６、配列番号４６４、配列番号 ４９０、配列番号４９１、配列番号９９５、配列番号９９７、配列番号１００５ 、配列番号１０２８からなる群から選択される核酸。 ４３． 該ヘリコバクター ピロリ細胞質ポリペプチドまたはそのフラグメン トが配列番号４７０及び配列番号１０３３からなる群から選択される核酸により コードされるエネルギー転化に関与するヘリコバクター ピロリポリペプチドま たはそのフラグメントである、請求の範囲４２の精製された核酸。 ４４． 該ヘリコバクター ピロリ細胞質ポリペプチドまたはそのフラグメン トが配列番号３５７及び配列番号４５７からなる群から選択される核酸によりコ ードされるアミノ酸代謝及び輸送に関与するヘリコバクター ピロリポリペプチ ドまたはそのフラグメントである、請求の範囲４２の精製された核酸。 ４５． 該ヘリコバクター ピロリ細胞質ポリペプチドまたはそのフラグメン トが配列番号４６１及び配列１０３０からなる群から選択される核酸によりコー ドされるヌクレオチド代謝及び輸送に関与するヘリコバクター ピロリポリペプ チドまたはそのフラグメントである、請求の範囲４２の精製された核酸。 ４６． 該ヘリコバクター ピロリ細胞質ポリペプチドまたはそのフラグメン トが配列番号３４５、配列番号３８３、配列番号３８７、配列番号４５５及び配 列１００３からなる群から選択される核酸によりコードされる補因子代謝に関与 するヘリコバクター ピロリポリペプチドま たはそのフラグメントである、請求の範囲４２の精製された核酸。 ４７． 該ヘリコバクター ピロリ細胞質ポリペプチドまたはそのフラグメン トが配列番号３５１及び配列番号４１６からなる群から選択される核酸によりコ ードされる脂質代謝に関与するヘリコバクター ピロリポリペプチドまたはその フラグメントである、請求の範囲４２の精製された核酸。 ４８． 該ヘリコバクター ピロリ細胞質ポリペプチドまたはそのフラグメン トが配列番号２７８、配列番号３３５、配列番号３４６、配列番号３５０、配列 番号４１９、配列番号４６０、配列番号４７２、配列番号１０００、配列番号１ ００４、配列番号１０２０及び配列番号１２９３からなる群から選択される核酸 によりコードされるゲノム複製、転写、組み換え及び修復に関与するヘリコバク ター ピロリポリペプチドまたはそのフラグメントである、請求の範囲４２の精 製された核酸。 ４９． 転写調節成分に機能的に連結された請求の範囲４２の核酸を含んでな る組み換え発現ベクター。 ５０． 請求の範囲４９の組み換え発現ベクターを含んでなる細胞。 ５１． ポリペプチドを発現させる条件下で請求の範囲５０の細胞を培養する ことを含んでなるヘリコバクター ピロリポリペプチドの製造方法。 ５２． ヘリコバクター ピロリ細胞ポリペプチドまたはそのフラグメントを コードするヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸であって、配列番号２ ５６、配列番号２６７、配列番号２８２、配列番号３０６、配列番号３０７、配 列番号３０８、配列番号３０９、配列番号３１０、配列番号３１６、配列番号３ １７、配列番号３３２、配列番号３３ ３、配列番号３３６、配列番号３３７、配列番号３３９、配列番号３４０、配列 番号３４１、配列番号３４４、配列番号３６９、配列番号３７６、配列番号３８ ２、配列番号３８６、配列番号４２３、配列番号４３１、配列番号４３５、配列 番号４３６、配列番号４５８、配列番号４６２、配列番号４７５、配列番号４７ ６、配列番号４７９、配列番号４８０、配列番号４８１、配列番号４８２、配列 番号４８３、配列番号４８４、配列番号４８５、配列番号４８６、配列番号４８ ７、配列番号４８９、配列番号９８４、配列番号９９４、配列番号１０２４及び 配列番号１０３６からなる群から選択される核酸。 ５３． 転写調節成分に機能的に連結された請求の範囲５２の核酸を含んでな る組み換え発現ベクター。 ５４． 請求の範囲５３の組み換え発現ベクターを含んでなる細胞。 ５５． ポリペプチドを発現させる条件下で請求の範囲５４の細胞を培養する ことを含んでなるヘリコバクター ピロリポリペプチドの製造方法。 ５６． 請求の範囲２１の核酸の有効量を含んでなるヘリコバクターピロリ感 染の予防または処置のためのワクチン組成物。 ５７． 製薬学的に受容しうる担体をさらに含んでなる、請求の範囲５６のワ クチン組成物。 ５８． 製薬学的に受容しうる担体がアジュバントである、請求の範囲５７の ワクチン組成物。 ５９． ヘリコバクター ピロリ感染の処置が生じるように、請求の範囲５６ のワクチン組成物を患者に投与することを含んでなる患者のヘリコバクター ピ ロリ感染の処理方法。 ６０． 処置が予防処置である、請求の範囲５９の方法。 ６１． 処置が治療処置である、請求の範囲５９の方法。 ６２． 請求の範囲３７の核酸の有効量を含んでなるヘリコバクターピロリ感 染の予防または処置のためのワクチン組成物。 ６３． 製薬学的に受容しうる担体をさらに含んでなる、請求の範囲６２のワ クチン組成物。 ６４． 製薬学的に受容しうる担体がアジュバントである、製薬の範囲６３の ワクチン組成物。 ６５． ヘリコバクター ピロリ感染の処置が生じるように、請求の範囲６２ のワクチン組成物を患者に投与することを含んでなる患者のヘリコバクター ピ ロリ感染の処置方法。 ６６． 処置が予防処置である、請求の範囲６５の方法。 ６７． 処置が治療処置である、請求の範囲６５の方法。 ６８． 請求の範囲４２の核酸の有効量を含んでなるヘリコバクターピロリ感 染の予防または処置のためのワクチン組成物。 ６９． 製薬学的に受容しうる担体をさらに含んでなる、請求の範囲６８のワ クチン組成物。 ７０． 製薬学的に受容しうる担体がアジュバントである、請求の範囲６９の ワクチン組成物。 ７１． ヘリコバクター ピロリ感染の処置が生じるように、請求の範囲６８ のワクチン組成物を患者に投与することを含んでなる患者のヘリコバクター ピ ロリ感染の処置方法。 ７２． 処置が予防処置である、請求の範囲７１の方法。 ７３． 処置が治療処置である、請求の範囲７１の方法。 ７４． 請求の範囲５２の核酸の有効量を含んでなるヘリコバクターピロリ感 染の予防または処置のためのワクチン組成物。 ７５． 製薬学的に受容しうる担体をさらに含んでなる、請求の範囲７４のワ クチン組成物。 ７６． 製薬学的に受容しうる担体がアジュバントである、請求の範囲７５の ワクチン組成物。 ７７． ヘリコバクター ピロリ感染の処置が生じるように、請求の範囲７４ のワクチン組成物を患者に投与することを含んでなる患者のヘリコバクター ピ ロリ感染の処置方法。 ７８． 処置が予防処置である、請求の範囲７７の方法。 ７９． 処置が治療処置である、請求の範囲７７の方法。 ８０． ポリペプチドが配列番号７４６、配列番号７５４、配列番号７５７、 配列番号７６８、配列番号７７１、配列番号７７６、配列番号７８３、配列番号 ７８５、配列番号７９０、配列番号８０２、配列番号８０３、配列番号８０４、 配列番号８１２、配列番号８１８、配列番号８２０、配列番号８８２、配列番号 ８４４、配列番号８５５、配列番号８５７、配列番号８５９、配列番号８６６、 配列番号８７５、配列番号８８２、配列番号８８３、配列番号８８８、配列番号 ８８９、配列番号８９３、配列番号８９５、配列番号９００、配列番号９０１、 配列番号９０３、配列番号９１８、配列番号９２４、配列番号９２５、配列番号 ９３２、配列番号９３５、配列番号９３６、配列番号９４０、配列番号９４１、 配列番号９４３、配列番号９４４、配列番号９５７、配列番号９５９、配列番号 ９６０、配列番号１０３７、配列番号１０４３、配列番号１０６２、配列番号１ ０６５、配列番号１０６８、配列番号１０６ ９、配列番号１０８３、配列番号１０８６、配列番号７５０、配列番号７７７、 配列番号８１７、配列番号８６５、配列番号８９０、配列番号９１３、配列番号 ９４５、配列番号９５６、配列番号１０５２、配列番号１０６３、配列番号１０ ７７、配列番号１２９７、配列番号１２９８、配列番号８１０、配列番号８１６ 、配列番号９１６、配列番号９２８、配列番号９２９、配列番号９３８、配列番 号９３９、配列番号９５８、配列番号１０５０、配列番号１０８１、配列番号１ ０８５、配列番号７４５、配列番号８４３、配列番号９０６、配列番号１０７３ 、配列番号８７２、配列番号８８０、配列番号１０６４、配列番号１０６６、配 列番号８４５、配列番号８６３、配列番号８９１、配列番号９１２、配列番号１ ０７６、配列番号９５４、配列番号７７２、配列番号１０４２、配列番号９０２ 、配列番号８９８、配列番号１０７１、配列番号７８１、配列番号９０８、配列 番号９２１、配列番号１０４６、配列番号１０７９、配列番号９６８、配列番号 ９０５、配列番号７４４、配列番号７８４、配列番号８２５、配列番号８３４、 配列番号９０９、配列番号９１５及び配列番号９３４からなる群から選択される 、精製されたヘリコバクター ピロリ細胞エンベロープポリペプチドまたはその フラグメント。 ８１． 該ヘリコバクター ピロリ細胞エンベロープポリペプチドまたはその フラグメントが配列番号７４６、配列番号７５４、配列番号７５７、配列番号７ ６８、配列番号７７１、配列番号７７６、配列番号７８３、配列番号７８５、配 列番号７９０、配列番号８０２、配列番号８０３、配列番号８０４、配列番号８ １２、配列番号８１８、配列番号８２０、配列番号８８２、配列番号８４４、配 列番号８５５、配列番号８５７、配列番号８５９、配列番号８６６、配列番号８ ７５、配列番号８ ８２、配列番号８８３、配列番号８８８、配列番号８８９、配列番号８９３、配 列番号８９５、配列番号９００、配列番号９０１、配列番号９０３、配列番号９ １８、配列番号９２４、配列番号９２５、配列番号９３２、配列番号９３５、配 列番号９３６、配列番号９４０、配列番号９４１、配列番号９４３、配列番号９ ４４、配列番号９５７、配列番号９５９、配列番号９６０、配列番号１０３７、 配列番号１０４３、配列番号１０６２、配列番号１０６５、配列番号１０６８、 配列番号１０６９、配列番号１０８３、配列番号１０８６、配列番号７５０、配 列番号７７７、配列番号８１７、配列番号８６５、配列番号８９０、配列番号９ １３、配列番号９４５、配列番号９５６、配列番号１０５２、配列番号１０６３ 、配列番号１０７７、配列番号１２９７、配列番号１２９８、配列番号８１０、 配列番号８１６、配列番号９１６、配列番号９２８、配列番号９２９、配列番号 ９３８、配列番号９３９、配列番号９５８、配列番号１０５０、配列番号１０８ １、配列番号１０８５、配列番号７４５、配列番号８４３、配列番号９０６、配 列番号１０７３、配列番号８７２、配列番号８８０、配列番号１０６４及び配列 番号１０６６からなる群から選択されるヘリコバクター ピロリ外膜ポリペプチ ドまたはそのフラグメントである、請求の範囲８０の精製されたポリペプチド。 ８２． 該ヘリコバクター ピロリ外膜ポリペプチドまたはそのフラグメント が配列番号７４６、配列番号７５４、配列番号７５７、配列番号７６８、配列番 号７７１、配列番号７７６、配列番号７８３、配列番号７８５、配列番号７９０ 、配列番号８０２、配列番号８０３、配列番号８０４、配列番号８１２、配列番 号８１８、配列番号８２０、配列番号８８２、配列番号８４４、配列番号８５５ 、配列番号８５７、配列番 号８５９、配列番号８６６、配列番号８７５、配列番号８８２、配列番号８８３ 、配列番号８８８、配列番号８８９、配列番号８９３、配列番号８９５、配列番 号９００、配列番号９０１、配列番号９０３、配列番号９１８、配列番号９２４ 、配列番号９２５、配列番号９３２、配列番号９３５、配列番号９３６、配列番 号９４０、配列番号９４１、配列番号９４３、配列番号９４４、配列番号９５７ 、配列番号９５９、配列番号９６０、配列番号１０３７、配列番号１０４３、配 列番号１０６２、配列番号１０６５、配列番号１０６８、配列番号１０６９、配 列番号１０８３及び配列番号１０８６からなる群から選択される末端フェニルア ラニン残基を有するヘリコバクター ピロリポリペプチドまたはそのフラグメン トである、請求の範囲８１の精製されたポリペプチド。 ８３． 該ヘリコバクター ピロリ外膜ポリペプチドまたはそのフラグメント が配列番号７７７、配列番号８１７、配列番号８６５、配列番号８９０、配列番 号９１３、配列番号９４５、配列番号９５６、配列番号１０５２、配列番号１０ ６３ 、配列番号１０７７、配列番号１２９７及び配列番号１２９８からなる群か ら選択されるＣ末端チロシンクラスターを有するヘリコバクター ピロリポリペ プチドまたはそのフラグメントである、請求の範囲８１の精製されたポリペプチ ド。 ８４． 該ヘリコバクター ピロリ外膜ポリペプチドまたはそのフラグメント が配列番号８１０、配列番号８１６、配列番号９１６、配列番号９２８、配列番 号９２９、配列番号９３８、配列番号９３９、配列番号９５８、配列番号１０５ ０、配列番号１０８１及び配列番号１０８５からなる群から選択される末端フェ ニルアラニン残基及びＣ末端チロシンクラスターを有するヘリコバクター ピロ リポリペプチドまたはその フラグメントである、請求の範囲８１の精製されたポリペプチド。 ８５． 該ヘリコバクター ピロリ細胞エンベロープポリペプチドまたはその フラグメントが配列番号８４５、配列番号８６３、配列番号８９１、配列番号９ １２、配列番号１０７６、配列番号９５４、配列番号７７２、配列番号１０４２ 、配列番号９０２、配列番号８９８、配列番号１０７１、配列番号７８１、配列 番号９０８、配列番号９２１、配列番号１０４６、配列番号１０７９からなる群 から選択されるヘリコバクター ピロリ内膜ポリペプチドまたはそのフラグメン トである、請求の範囲８０の精製されたポリペプチド。 ８６． 該ヘリコバクター ピロリ内膜ポリペプチドまたはそのフラグメント が配列番号８４５のアミノ酸配列を含んでなる外膜及び細胞壁合成に関与するヘ リコバクター ピロリポリペプチドまたはそのフラグメントである、請求の範囲 ８５の精製されたポリペプチド。 ８７． 該ヘリコバクター ピロリ内膜ポリペプチドまたはそのフラグメント が配列８６３、配列番号８９１、配列番号９１２及び配列番号１０７６からなる 群から選択されるエネルギー転化に関与するヘリコバクター ピロリポリペプチ ドまたはそのフラグメントである、請求の範囲８５の精製されたポリペプチド。 ８８． 該ヘリコバクター ピロリ内膜ポリペプチドまたはそのフラグメント が配列番号９５４のアミノ酸配列を含んでなる補因子代謝に関与するヘリコバク ター ピロリポリペプチドまたはそのフラグメントである、請求の範囲８５の精 製されたポリペプチド。 ８９． 該ヘリコバクター ピロリ内膜ポリペプチドまたはそのフラグメント が配列番号７７２及び配列番号１０４２からなる群から選択さ れる分泌及び接着に関与するヘリコバクター ピロリポリペプチドまたはそのフ ラグメントである、請求の範囲８５の精製されたポリペプチド。 ９０． 該ヘリコバクター ピロリ内膜ポリペプチドまたはそのフラグメント が配列番号８９８及び配列番号１０７１からなる群から選択される輸送に関与す るヘリコバクター ピロリポリペプチドまたはそのフラグメントである、請求の 範囲８５の精製されたポリペプチド。 ９１． 該ヘリコバクター ピロリ細胞エンベロープポリペプチドまたはその フラグメントが配列番号９６８のアミノ酸配列を含んでなるヘリコバクター ピ ロリ鞭毛ポリペプチドまたはそのフラグメントである、請求の範囲８０の精製さ れたポリペプチド。 ９２． 該ヘリコバクター ピロリ細胞エンベロープポリペプチドまたはその フラグメントが配列番号９０５のアミノ酸配列を含んでなるヘリコバクター ピ ロリ輸送ポリペプチドまたはそのフラグメントである、請求の範囲８０の精製さ れたポリペプチド。 ９３． ポリペプチドが配列番号７４７、配列番号７５８、配列番号７７３、 配列番号７９７、配列番号７９８、配列番号７９９、配列番号８００、配列番号 ８０１、配列番号８０７、配列番号８０８、配列番号８２３、配列番号８２４、 配列番号８２７、配列番号８２８、配列番号８３０、配列番号８３１、配列番号 ８３２、配列番号８３５、配列番号８６０、配列番号８６７、配列番号８７３、 配列番号８７７、配列番号９１４、配列番号９２２、配列番号９２６、配列番号 ９２７、配列番号９４９、配列番号９５３、配列番号９６６、配列番号９６７、 配列番号９７０、配列番号９７１、配列番号９７２、配列番号９７３、配列番号 ９７４、配列番号９７５、配列番号９７６、配列番号９７７、配列番号 ９７８、配列番号９８０、配列番号１０３８、配列番号１０４８、配列番号１０ ７８及び配列番号１０９０からなる群から選択される、精製されたヘリコバクタ ー ピロリ細胞ポリペプチドまたはそのフラグメント。 ９４． ポリペプチドが配列番号８４６、配列番号１０６０、配列番号７４８ 、配列番号７４９、配列番号７５１、配列番号７５２、配列番号７５５、配列番 号７５６、配列番号７５９、配列番号７６１、配列番号７６３、配列番号７６５ 、配列番号７６６、配列番号７６７、配列番号７７０、配列番号７７４、配列番 号７７５、配列番号７７８、配列番号７７９、配列番号７８０、配列番号７８２ 、配列番号７８６、配列番号７８７、配列番号７８８、配列番号７８９、配列番 号７９１、配列番号７９２、配列番号７９３、配列番号７９４、配列番号７９５ 、配列番号７９６、配列番号８０５、配列番号８０６、配列番号８１４、配列番 号８２９、配列番号８３３、配列番号８３９、配列番号８４０、配列番号８４９ 、配列番号８５０、配列番号８５１、配列番号８５２、配列番号８５３、配列番 号８５４、配列番号８５８、配列番号８６１、配列番号８６２、配列番号８６４ 、配列番号８６８、配列番号８６９、配列番号８７０、配列番号８７１、配列番 号８７９、配列番号８８１、配列番号８８５、配列番号８８６、配列番号８８７ 、配列番号８９２、配列番号８９４、配列番号８９６、配列番号８９９、配列番 号９１１、配列番号９１７、配列番号９１９、配列番号９２０、配列番号９２３ 、配列番号９３０、配列番号９３３、配列番号９４２、配列番号９６２、配列番 号９６９、配列番号９７９、配列番号１０４１、配列番号１０４４、配列番号１ ０４５、配列番号１０４７、配列番号１０５５、配列番号１０５６、配列番号１ ０６１、配列番号１０６７、配列番号１０７０、配列 番号１０７２、配列番号１０７５及び配列番号１０８０からなる群から選択され る、精製されたヘリコバクター ピロリ分泌ポリペプチドまたはそのフラグメン ト。 ９５． 該ヘリコバクター ピロリ分泌ポリペプチドまたはそのフラグメント が配列番号８４６及び配列番号１０６０からなる群から選択される分泌及び接着 に関与するヘリコバクター ピロリポリペプチドまたはそのフラグメントである 、請求の範囲９４の精製されたポリペプチド。 ９６． ポリペプチドが配列番号９６１、配列番号１０８７、配列番号８４８ 、配列番号９４８、配列番号９５２、配列番号１０８４、配列番号８３６、配列 番号８７４、配列番号８７８、配列番号９４６、配列番号１０５７、配列番号８ ４２、配列番号９０７、配列番号７６９、配列番号８２６、配列番号８３７、配 列番号８４１、配列番号９１０、配列番号９５１、配列番号９６３、配列番号１ ０５４、配列番号１０５８、配列番号１０７４、配列番号１２９６、配列番号８ ０９、配列番号８１３、配列番号８１５、配列番号８２１、配列番号８３８、配 列番号９３１、配列番号９３７、配列番号９５５、配列番号９８１、配列番号９ ８２、配列番号１０４９、配列番号１０５１、配列番号１０５９及び配列番号１ ０８２からなる群から選択される、精製されたヘリコバクターピロリ細胞質ポリ ペプチドまたはそのフラグメント。 ９７． 該ヘリコバクター ピロリ細胞質ポリペプチドまたはそのフラグメン トが配列番号９６１及び配列番号１０８７からなる群から選択されるエネルギ− 転化に関与するヘリコバクター ピロリポリペプチドまたはそのフラグメントで ある、請求の範囲９６の精製されたポリペプチド。 ９８． 該ヘリコバクター ピロリ細胞質ポリペプチドまたはそのフラグメン トが配列番号８４８及び配列番号９４８からなる群から選択されるアミノ酸代謝 及び輸送に関与するヘリコバクター ピロリポリペプチドまたはそのフラグメン トである、請求の範囲９６の精製されたポリペプチド。 ９９． 該ヘリコバクター ピロリ細胞質ポリペプチドまたはそのフラグメン トが配列番号９５２及び配列番号１０８４からなる群から選択されるヌクレオチ ド代謝及び輸送に関与するヘリコバクター ピロリポリペプチドまたはそのフラ グメントである、請求の範囲９６の精製されたポリペプチド。 １００． 該ヘリコバクター ピロリ細胞質ポリペプチドまたはそのフラグメ ントが配列番号８３６、配列番号８７４、配列番号８７８、配列番号９４６及び 配列番号１０５７からなる群から選択される補因子代謝に関与するヘリコバクタ ー ピロリポリペプチドまたはそのフラグメントである、請求の範囲９６の精製 されたポリペプチド。 １０１． 該ヘリコバクター ピロリ細胞質ポリペプチドまたはそのフラグメ ントが配列番号８４２及び配列番号９０７からなる群から選択される脂質代謝に 関与するヘリコバクター ピロリポリペプチドまたはそのフラグメントである、 請求の範囲９６の精製されたポリペプチド。 １０２． 該ヘリコバクター ピロリ細胞質ポリペプチドまたはそのフラグメ ントが配列番号７６９、配列番号８２６、配列番号８３７、配列番号８４１、配 列番号９１０、配列番号９５１、配列番号９６３、配列番号１０５４、配列番号 １０５８、配列番号１０７４及び配列番号１２９６からなる群から選択されるゲ ノム複製、転写、組み換え及び修復 に関与するヘリコバクター ピロリポリペプチドまたはそのフラグメントである 、請求の範囲９６の精製されたポリペプチド。 １０３． 請求の範囲８０のヘリコバクター ピロリポリペプチドの有効量を 含んでなるヘリコバクター ピロリ感染の予防または処置のためのワクチン組成 物。 １０４． 製薬学的に受容しうる担体をさらに含んでなる、請求の範囲１０３ のワクチン組成物。 １０５． 製薬学的に受容しうる担体がアジュバントである、請求の範囲１０ ４のワクチン組成物。 １０６． ヘリコバクター ピロリ感染の処置が生じるように、請求の範囲１ ０３のワクチン組成物を患者に投与することを含んでなる患者のヘリコバクター ピロリ感染の処置方法。 １０７． 処置が予防処置である、請求の範囲１０６の方法。 １０８． 処置が治療処置である、請求の範囲１０６の方法。 １０９． 請求の範囲９３のヘリコバクター ピロリポリペプチドの有効量を 含んでなるヘリコバクター ピロリ感染の予防または処置のためのワクチン組成 物。 １１０． 製薬学的に受容しうる担体をさらに含んでなる、請求の範囲１０９ のワクチン組成物。 １１１． 製薬学的に受容しうる担体がアジュバントである、請求の範囲１１ ０のワクチン組成物。 １１２． ヘリコバクター ピロリ感染の処置が生じるように、請求の範囲１ ０９のワクチン組成物を患者に投与することを含んでなる患者のヘリコバクター ピロリ感染の処置方法。 １１３． 処置が予防処置である、請求の範囲１１２の方法。 １１４． 処置が治療処置である、請求の範囲１１２の方法。 １１５． 請求の範囲９４のヘリコバクター ピロリポリペプチドの有効量を 含んでなるヘリコバクター ピロリ感染の予防または処置のためのワクチン組成 物。 １１６． 製薬学的に受容しうる担体をさらに含んでなる、請求の範囲１１５ のワクチン組成物。 １１７． 製薬学的に受容しうる担体がアジュバントである、請求の範囲１１ ６のワクチン組成物。 １１８． ヘリコバクター ピロリ感染の処置が生じるように、請求の範囲１ １５のワクチン組成物を患者に投与することを含んでなる患者のヘリコバクター ピロリ感染の処置方法。 １１９． 処置が予防処置である、請求の範囲１１８の方法。 １２０． 処置が治療処置である、請求の範囲１１８の方法。 １２１． 請求の範囲９６のヘリコバクター ピロリポリペプチドの有効量を 含んでなるヘリコバクター ピロリ感染の予防または処置のためのワクチン組成 物。 １２２． 製薬学的に受容しうる担体をさらに含んでなる、請求の範囲１２１ のワクチン組成物。 １２３． 製薬学的に受容しうる担体がアジュバントである、請求の範囲１２ ２のワクチン組成物。 １２４． ヘリコバクター ピロリ感染の処置が生じるように、請求の範囲１ ２１のワクチン組成物を患者に投与することを含んでなる患者のヘリコバクター ピロリ感染の処置方法。 １２５． 処置が予防処置である、請求の範囲１２４の方法。 １２６． 処置が治療処置である、請求の範囲１２４の方法。 １２７． （ａ）プローブとサンプル中のヘリコバクター核酸の間でハイブリ ッドが形成できる条件下で請求の範囲２１の核酸とサンプルを接触させ、そして （ｂ）工程（ａ）で形成されたハイブリッドを検出し、ここで、ハ イブリッドの検出がサンプル中のヘリコバクター核酸の存在を示す、 ことを含んでなるサンプル中のヘリコバクター核酸の存在の検出方法。 １２８． （ａ）プローブとサンプル中のヘリコバクター核酸の間でハイブリ ッドが形成できる条件下で請求の範囲３７の核酸とサンプルを接触させ、そして （ｂ）工程（ａ）で形成されたハイブリッドを検出し、ここで、ハ イブリッドの検出がサンプル中のヘリコバクター核酸の存在を示す、 ことを含んでなるサンプル中のヘリコバクター核酸の存在の検出方法。 １２９． （ａ）プローブとサンプル中のヘリコバクター核酸の間でハイブリ ッドが形成できる条件下で請求の範囲４２の核酸とサンプルを接触させ、そして （ｂ）工程（ａ）で形成されたハイブリッドを検出し、ここで、ハ イブリッドの検出がサンプル中のヘリコバクター核酸の存在を示す、 ことを含んでなるサンプル中のヘリコバクター核酸の存在の検出方法。 １３０． （ａ）プローブとサンプル中のヘリコバクター核酸の間で ハイブリッドが形成できる条件下で請求の範囲５２の核酸とサンプルを接触させ 、そして （ｂ）工程（ａ）で形成されたハイブリッドを検出し、ここで、ハ イブリッドの検出がサンプル中のヘリコバクター核酸の存在を示す、 ことを含んでなるサンプル中のヘリコバクター核酸の存在の検出方法。』

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 14/195 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｇ０１Ｎ 33/566 Ｇ０１Ｎ 33/566 33/569 Ｆ 33/569 Ａ６１Ｋ 37/02 //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:01） (31)優先権主張番号 ０８／７３６，９０５ (32)優先日 平成８年10月25日(1996．10．25) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ０８／７３８，８５９ (32)優先日 平成８年10月28日(1996．10．28) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ０８／７６１，３１８ (32)優先日 平成８年12月６日(1996．12．6) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ， ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ， ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，Ｎ Ｚ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ， ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 配列番号４９２−配列番号７５９、配列番号７６１、配列番号７６３、 配列番号７６５−配列番号８１８、配列番号８２０−配列番号８４６、配列番号 ８４８−配列番号８９６、配列番号８９８−配列番号９６３、配列番号９６６− 配列番号９８２、配列番号１０３７、配列番号１０３８、配列番号１０４１−配 列番号１０８７、配列番号１０９０及び配列番号１２９６−配列番号１２９８か らなる群から選択されヘリコバクター ピロリポリペプチドをコードするヌクレ オチド配列を含んでなる単離された核酸。 ２． 転写調節成分に機能的に連結された請求の範囲１の核酸を含んでなる組 み換え発現ベクター。 ３． 請求の範囲２の組み換え発現ベクターを含んでなる細胞。 ４． ポリペプチドを発現させる条件下で請求の範囲３の細胞を培養すること を含んでなるヘリコバクター ピロリポリペプチドの製造方法。 ５． 配列番号１−配列番号２６８、配列番号２７０、配列番号２７２、配列 番号２７４−配列番号３２７、配列番号３２９−配列番号３６４、配列番号３６ ６−配列番号４０５、配列番号４０７−配列番号４７２、配列番号４７５−配列 番号４９１、配列番号９８３、配列番号９８４、配列番号９８７−配列番号１０ ３３、配列番号１０３６及び配列番号１２９３−配列番号１２９５またはこれら の相補体からなる群から選択されるヌクレオチド配列の少なくとも８ヌクレオチ ドからなるヌクレオチド配列を含んでなるプローブ。 ６． 少なくとも８ヌクレオチドの長さのヌクレオチド配列を含んでなる単離 された核酸で、その配列が配列番号１−配列番号２６８、配列 番号２７０、配列番号２７２、配列番号２７４−配列番号３２７、配列番号３２ ９−配列番号３６４、配列番号３６６−配列番号４０５、配列番号４０７−配列 番号４７２、配列番号４７５−配列番号４９１、配列番号９８３、配列番号９８ ４、配列番号９８７−配列番号１０３３、配列番号１０３６及び配列番号１２９ ３−配列番号１２９５またはこれらの相補体からなる群から選択されるヌクレオ チド配列を有する核酸にハイブリダイズできる核酸。 ７． ヘリコバクター ピロリポリペプチドまたはそのフラグメントをコード するヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸の有効量を含んでなるヘリコ バクター ピロリ感染の予防または処置のためのワクチン組成物で、該核酸が配 列番号１−配列番号２６８、配列番号２７０、配列番号２７２、配列番号２７４ −配列番号３２７、配列番号３２９−配列番号３６４、配列番号３６６−配列番 号４０５、配列番号４０７−配列番号４７２、配列番号４７５−配列番号４９１ 、配列番号９８３、配列番号９８４、配列番号９８７−配列番号１０３３、配列 番号１０３６及び配列番号１２９３−配列番号１２９５からなる群から選択され るヌクレオチド配列を含んでなるワクチン組成物。 ８． 製薬学的に受容しうる担体をさらに含んでなる、請求の範囲７のワクチ ン組成物。 ９． 製薬学的に受容しうる担体がアジュバントである、請求の範囲８のワク チン組成物。 １０． ヘリコバクター ピロリ感染の処置が生じるように、請求の範囲７の ワクチン組成物を患者に投与することを含んでなる患者のヘリコバクター ピロ リ感染の処置方法。 １１． 処置が予防処置である、請求の範囲１０の方法。 １２． 処置が治療処置である、請求の範囲１０の方法。 １３． （ａ）プローブとサンプル中のヘリコバクター核酸の間でハイブリッ ドが形成できる条件下で請求の範囲５のプローブとサンプルを接触させ、 （ｂ）工程（ａ）で形成されたハイブリッドを検出し、ここで、ハイ ブリッドの検出がサンプル中のヘリコバクター核酸の存在を示す、 ことを含んでなるサンプル中のヘリコバクター ピロリ核酸の存在の検出方法。 １４． 配列番号４９２−配列番号７５９、配列番号７６１、配列番号７６３ 、配列番号７６５−配列番号８１８、配列番号８２０−配列番号８４６、配列番 号８４８−配列番号８９６、配列番号８９８−配列番号９６３、配列番号９６６ −配列番号９８２、配列番号１０３７、配列番号１０３８、配列番号１０４１− 配列番号１０８７、配列番号１０９０及び配列番号１２９６−配列番号１２９８ からなる群から選択されるヘリコバクター ピロリポリペプチドの組み換え体ま たは実質的に純粋な調製物。 １５． 精製されたヘリコバクター ピロリポリペプチドまたはそのフラグメ ントの有効量を含んでなるヘリコバクター ピロリ感染の予防または処置のため のワクチン組成物であって、該ヘリコバクター ピロリポリペプチドが配列番号 ４９２−配列番号７５９、配列番号７６１、配列番号７６３、配列番号７６５− 配列番号８１８、配列番号８２０−配列番号８４６、配列番号８４８−配列番号 ８９６、配列番号８９８− 配列番号９６３、配列番号９６６−配列番号９８２、配列番号１０３７、配列番 号１０３８、配列番号１０４１−配列番号１０８７、配列番号１０９０及び配列 番号１２９６−配列番号１２９８からなる群から選択されるワクチン組成物。 １６． 製薬学的に受容しうる担体をさらに含んでなる、請求の範囲１５のワ クチン組成物。 １７． 製薬学的に受容しうる担体がアジュバントである、請求の範囲１６の ワクチン組成物。 １８． ヘリコバクター ピロリ感染の処置が生じるように、請求の範囲１５ のワクチン組成物を患者に投与することを含んでなる患者のヘリコバクター ピ ロリ感染の処置方法。 １９． 処置が予防処置である、請求の範囲１８の方法。 ２０． 処置が治療処置である、請求の範囲１８の方法。 ２１． ヘリコバクター ピロリ細胞エンベロープポリペプチドまたはそのフ ラグメントをコードするヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸であって 、配列番号２５５、配列番号２６３、配列番号２６６、配列番号２７７、配列番 号２８０、配列番号２８５、配列番号２９２、配列番号２９４、配列番号２９９ 、配列番号３１１、配列番号３１２、配列番号３１３、配列番号３２１、配列番 号３２７、配列番号３２９、配列番号３３１、配列番号３５３、配列番号３６４ 、配列番号３６６、配列番号３６８、配列番号３７５、配列番号３８４、配列番 号３９１、配列番号３９２、配列番号３９７、配列番号３９８、配列番号４０２ 、配列番号４０４、配列番号４０９、配列番号４１０、配列番号４１２、配列番 号４２７、配列番号４３３、配列番号４３４、配列番号４４１、 配列番号４４４、配列番号４４５、配列番号４４９、配列番号４５０、配列番号 ４５２、配列番号４５３、配列番号４６６、配列番号４６８、配列番号４６９、 配列番号９８３、配列番号９８９、配列番号１００８、配列番号１０１１、配列 番号１０１４、配列番号１０１５、配列番号１０２９、配列番号１０３２、配列 番号２５９、配列番号２８６、配列番号３２６、配列番号３７４、配列番号３９ ９、配列番号４２２、配列番号４５４、配列番号４６５、配列番号９９８、配列 番号１００９、配列番号１０２３、配列番号１２９４、配列番号１２９５、配列 番号３１９、配列番号３２５、配列番号４２５、配列番号４３７、配列番号４３ ８、配列番号４４７、配列番号４４８、配列番号４６７、配列番号９９６、配列 番号１０２７、配列番号１０３１、配列番号２５４、配列番号３５２、配列番号 ４１５、配列番号１０１９、配列番号３８１、配列番号３８９、配列番号１０１ ０、配列番号１０１２、配列番号３５４、配列番号３７２、配列番号４００、配 列番号４２１、配列番号１０２２、配列番号４６３、配列番号２８１、配列番号 ９８８、配列番号４１１、配列番号４０７、配列番号１０１７、配列番号２９０ 、配列番号４１７、配列番号４３０、配列番号９９２、配列番号１０２５、配列 番号４７７、配列番号４１４、配列番号２５３、配列番号２９３、配列番号３３ ４、配列番号３４３、配列番号４１８、配列番号４２４及び配列番号４４３から なる群から選択される核酸。 ２２． 該ヘリコバクター ピロリ細胞エンベロープポリペプチドまたはその フラグメントが配列番号２５５、配列番号２６３、配列番号２６６、配列番号２ ７７、配列番号２８０、配列番号２８５、配列番号２９２、配列番号２９４、配 列番号２９９、配列番号３１１、配列番号３ １２、配列番号３１３、配列番号３２１、配列番号３２７、配列番号３２９、配 列番号３３１、配列番号３５３、配列番号３６４、配列番号３６６、配列番号３ ６８、配列番号３７５、配列番号３８４、配列番号３９１、配列番号３９２、配 列番号３９７、配列番号３９８、配列番号４０２、配列番号４０４、配列番号４ ０９、配列番号４１０、配列番号４１２、配列番号４２７、配列番号４３３、配 列番号４３４、配列番号４４１、配列番号４４４、配列番号４４５、配列番号４ ４９、配列番号４５０、配列番号４５２、配列番号４５３、配列番号４６６、配 列番号４６８、配列番号４６９、配列番号９８３、配列番号９８９、配列番号１ ００８、配列番号１０１１、配列番号１０１４、配列番号１０１５、配列番号１ ０２９、配列番号１０３２、配列番号２５９、配列番号２８６、配列番号３２６ 、配列番号３７４、配列番号３９９、配列番号４２２、配列番号４５４、配列番 号４６５、配列番号９９８、配列番号１００９、配列番号１０２３、配列番号１ ２９４、配列番号１２９５、配列番号３１９、配列番号３２５、配列番号４２５ 、配列番号４３７、配列番号４３８、配列番号４４７、配列番号４４８、配列番 号４６７、配列番号９９６、配列番号１０２７、配列番号１０３１、配列番号２ ５４、配列番号３５２、配列番号４１５、配列番号１０１９、配列番号３８１、 配列番号３８９、配列番号１０１０及び配列番号１０１２からなる群から選択さ れる核酸によりコードされるヘリコバクター ピロリ外膜ポリペプチドまたはそ のフラグメントである、請求の範囲２１の精製された核酸。 ２３． 該ヘリコバクター ピロリ外膜ポリペプチドまたはそのフラグメント が配列番号２５５、配列番号２６３、配列番号２６６、配列番号２７７、配列番 号２８０、配列番号２８５、配列番号２９２、配列番 号２９４、配列番号２９９、配列番号３１１、配列番号３１２、配列番号３１３ 、配列番号３２１、配列番号３２７、配列番号３２９、配列番号３３１、配列番 号３５３、配列番号３６４、配列番号３６６、配列番号３６８、配列番号３７５ 、配列番号３８４、配列番号３９１、配列番号３９２、配列番号３９７、配列番 号３９８、配列番号４０２、配列番号４０４、配列番号４０９、配列番号４１０ 、配列番号４１２、配列番号４２７、配列番号４３３、配列番号４３４、配列番 号４４１、配列番号４４４、配列番号４４５、配列番号４４９、配列番号４５０ 、配列番号４５２、配列番号４５３、配列番号４６６、配列番号４６８、配列番 号４６９、配列番号９８３、配列番号９８９、配列番号１００８、配列番号１０ １１、配列番号１０１４、配列番号１０１５、配列番号１０２９及び配列番号１ ０３２からなる群から選択される核酸によりコードされる末端フェニルアラニン 残基を有するヘリコバクター ピロリポリペプチドまたはそのフラグメントであ る、請求の範囲２２の精製された核酸。 ２４． 該ヘリコバクター ピロリ外膜ポリペプチドまたはそのフラグメント が配列番号２８６、配列番号３２６、配列番号３７４、配列番号３９９、配列番 号４２２、配列番号４５４、配列番号４６５、配列番号９９８、配列番号１００ ９、配列番号１０２３、配列番号１２９４及び配列番号１２９５からなる群から 選択される核酸によりコードされるＣ末端チロシンクラスターを有するヘリコバ クター ピロリポリペプチドまたはそのフラグメントである、請求の範囲２２の 精製された核酸。 ２５． 該ヘリコバクター ピロリ外膜ポリペプチドまたはそのフラグメント が配列番号３１９、配列番号３２５、配列番号４２５、配列番 号４３７、配列番号４３８、配列番号４４７、配列番号４４８、配列番号４６７ 、配列番号９９６、配列番号１０２７及び配列番号１０３１からなる群から選択 される核酸によりコードされる末端フェニルアラニン残基及びＣ末端チロシンク ラスターを有するヘリコバクター ピロリポリペプチドまたはそのフラグメント である、請求の範囲２２の精製された核酸。 ２６． 該ヘリコバクター ピロリ細胞エンベロープポリペプチドまたはその フラグメントが配列番号３５４、配列番号３７２、配列番号４００、配列番号４ ２１、配列番号１０２２、配列番号４６３、配列番号２８１、配列番号９８８、 配列番号４１１、配列番号４０７、配列番号１０１７、配列番号２９０、配列番 号４１７、配列番号４３０、配列番号９９２及び配列番号１０２５からなる群か ら選択される核酸によりコードされるヘリコバクター ピロリ内膜ポリペプチド またはそのフラグメントである、請求の範囲２１の精製された核酸。 ２７． 該ヘリコバクター ピロリ内膜ポリペプチドまたはそのフラグメント が配列番号３５４のヌクレオチド配列を含んでなる核酸によりコードされる外膜 及び細胞壁合成に関与するヘリコバクター ピロリポリペプチドまたはそのフラ グメントである、請求の範囲２６の精製された核酸。 ２８． 該ヘリコバクター ピロリ内膜ポリペプチドまたはそのフラグメント が配列番号３７２、配列番号４００、配列番号４２１及び配列番号１０２２から なる群から選択される核酸によりコードされるエネルギー転化に関与するヘリコ バクター ピロリポリペプチドまたはそのフラグメントである、請求の範囲２６ の精製された核酸。 ２９． 該ヘリコバクター ピロリ内膜ポリペプチドまたはそのフラグメント が配列番号４６３のヌクレオチド配列を含んでなる核酸によりコードされる補因 子代謝に関与するヘリコバクター ピロリポリペプチドまたはそのフラグメント である、請求の範囲２６の精製された核酸。 ３０． 該ヘリコバクター ピロリ内膜ポリペプチドまたはそのフラグメント が配列番号２８１及び配列番号９８８からなる群から選択される核酸によりコー ドされる分泌及び接着に関与するヘリコバクター ピロリポリペプチドまたはそ のフラグメントである、請求の範囲２６の精製された核酸。 ３１． 該ヘリコバクター ピロリ内膜ポリペプチドまたはそのフラグメント が配列番号４０７及び配列番号１０１７からなる群から選択される核酸によりコ ードされる輸送に関与するヘリコバクター ピロリポリペプチドまたはそのフラ グメントである、請求の範囲２６の精製された核酸。 ３２． 該ヘリコバクター ピロリ細胞エンベロープポリペプチドまたはその フラグメントが配列番号４７７のヌクレオチド配列を含んでなる核酸によりコー ドされるヘリコバクター ピロリ鞭毛ポリペプチドまたはそのフラグメントであ る、精製の範囲２１の精製された核酸。 ３３． 該ヘリコバクター ピロリ細胞エンベロープポリペプチドまたはその フラグメントが配列番号４１４のヌクレオチド配列を含んでなる核酸によりコー ドされるヘリコバクター ピロリ輸送ポリペプチドまたはそのフラグメントであ る、請求の範囲２１の精製された核酸。 ３４． 転写調節成分に機能的に連結された請求の範囲２１の核酸を含んでな る組み換え発現ベクター。 ３５． 請求の範囲３４の組み換え発現ベクターを含んでなる細胞。 ３６． ポリペプチドを発現させる条件下で請求の範囲３５の細胞を培養する ことを含んでなるヘリコバクター ピロリポリペプチドの製造方法。 ３７． ヘリコバクター ピロリ分泌ポリペプチドまたはそのフラグメントを コードするヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸で、配列番号３５５、 配列番号１００６、配列番号２５７、配列番号２５８、配列番号２６０、配列番 号２６１、配列番号２６４、配列番号２６５、配列番号２６８、配列番号２７０ 、配列番号２７２、配列番号２７４、配列番号２７５、配列番号２７６、配列番 号２７９、配列番号２８３、配列番号２８４、配列番号２８７、配列番号２８８ 、配列番号２８９、配列番号２９１、配列番号２９５、配列番号２９６、配列番 号２９７、配列番号２９８、配列番号３００、配列番号３０１、配列番号３０２ 、配列番号３０３、配列番号３０４、配列番号３０５、配列番号３１４、配列番 号３１５、配列番号３２３、配列番号３３８、配列番号３４２、配列番号３４８ 、配列番号３４９、配列番号３５６、配列番号３５８、配列番号３５９、配列番 号３６０、配列番号３６１、配列番号３６２、配列番号３６３、配列番号３６７ 、配列番号３７０、配列番号３７１、配列番号３７３、配列番号３７７、配列番 号３７８、配列番号３７９、配列番号３８０、配列番号３８８、配列番号３９０ 、配列番号３９４、配列番号３９５、配列番号３９６、配列番号４０１、配列番 号４０３、配列番号４０５、配列番号４０８、配列番号４２０、配列番号４２６ 、配列番号４２８、配列番号４２９、配列番号４３２、配列番号４３９、配列番 号４４２、配列番号４５１、配列番号４７１、配列番号４７８、 配列番号４８８、配列番号９８７、配列番号９９０、配列番号９９１、配列番号 ９９３、配列番号１００１、配列番号１００２、配列番号１００７、配列番号１ ０１３、配列番号１０１６、配列番号１０１８、配列番号１０２１及び配列番号 １０２６からなる群から選択される核酸。 ３８． 該ヘリコバクター ピロリ分泌ポリペプチドまたはそのフラグメント が配列番号３５５及び配列番号１００６からなる群から選択される核酸によりコ ードされる分泌及び接着に関与するヘリコバクターピロリポリペプチドまたはそ のフラグメントである、請求の範囲３７の精製された核酸。 ３９． 転写調節成分に機能的に連結された請求の範囲３８の核酸を含んでな る組み換え発現ベクター。 ４０． 請求の範囲３９の組み換え発現ベクターを含んでなる細胞。 ４１． ポリペプチドを発現させる条件下で請求の範囲４０の細胞を培養する ことを含んでなるヘリコバクター ピロリポリペプチドの製造方法。 ４２． ヘリコバクター ピロリ細胞質ポリペプチドまたはそのフラグメント をコードするヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸で、配列番号４７０ 、配列番号１０３３、配列番号３５７、配列番号４５７、配列番号４６１、配列 番号１０３０、配列番号３４５、配列番号３８３、配列番号３８７、配列番号４ ５５、配列番号１００３、配列番号３５１、配列番号４１６、配列番号２７８、 配列番号３３５、配列番号３４６、配列番号３５０、配列番号４１９、配列番号 ４６０、配列番号４７２、配列番号１０００、配列番号１００４、配列番号１０ ２０、配列番号１２９３、配列番号３１８、配列番号３２２、配列番号３２４、 配列番号 ３３０、配列番号３４７、配列番号４４０、配列番号４４６、配列番号４６４、 配列番号４９０、配列番号４９１、配列番号９９５、配列番号９９７、配列番号 １００５、配列番号１０２８からなる群から選択される核酸。 ４３． 該ヘリコバクター ピロリ細胞質ポリペプチドまたはそのフラグメン トが配列番号４７０及び配列番号１０３３からなる群から選択される核酸により コードされるエネルギー転化に関与するヘリコバクター ピロリポリペプチドま たはそのフラグメントである、請求の範囲４２の精製された核酸。 ４４． 該ヘリコバクター ピロリ細胞質ポリペプチドまたはそのフラグメン トが配列番号３５７及び配列番号４５７からなる群から選択される核酸によりコ ードされるアミノ酸代謝及び輸送に関与するヘリコバクター ピロリポリペプチ ドまたはそのフラグメントである、請求の範囲４２の精製された核酸。 ４５． 該ヘリコバクター ピロリ細胞質ポリペプチドまたはそのフラグメン トが配列番号４６１及び配列１０３０からなる群から選択される核酸によりコー ドされるヌクレオチド代謝及び輸送に関与するヘリコバクター ピロリポリペプ チドまたはそのフラグメントである、請求の範囲４２の精製された核酸。 ４６． 該ヘリコバクター ピロリ細胞質ポリペプチドまたはそのフラグメン トが配列番号３４５、配列番号３８３、配列番号３８７、配列番号４５５及び配 列１００３からなる群から選択される核酸によりコードされる補因子代謝に関与 するヘリコバクター ピロリポリペプチドまたはそのフラグメントである、請求 の範囲４２の精製された核酸。 ４７． 該ヘリコバクター ピロリ細胞質ポリペプチドまたはそのフラグメン トが配列番号３５１及び配列番号４１６からなる群から選択される核酸によりコ ードされる脂質代謝に関与するヘリコバクター ピロリポリペプチドまたはその フラグメントである、請求の範囲４２の精製された核酸。 ４８． 該ヘリコバクター ピロリ細胞質ポリペプチドまたはそのフラグメン トが配列番号２７８、配列番号３３５、配列番号３４６、配列番号３５０、配列 番号４１９、配列番号４６０、配列番号４７２、配列番号１０００、配列番号１ ００４、配列番号１０２０及び配列番号１２９３からなる群から選択される核酸 によりコードされるゲノム複製、転写、組み換え及び修復に関与するヘリコバク ター ピロリポリペプチドまたはそのフラグメントである、請求の範囲４２の精 製された核酸。 ４９． 転写調節成分に機能的に連結された請求の範囲４２の核酸を含んでな る組み換え発現ベクター。 ５０． 請求の範囲４９の組み換え発現ベクターを含んでなる細胞。 ５１． ポリペプチドを発現させる条件下で請求の範囲５０の細胞を培養する ことを含んでなるヘリコバクター ピロリポリペプチドの製造方法。 ５２． ヘリコバクター ピロリ細胞ポリペプチドまたはそのフラグメントを コードするヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸であって、配列番号２ ５６、配列番号２６７、配列番号２８２、配列番号３０６、配列番号３０７、配 列番号３０８、配列番号３０９、配列番号３１０、配列番号３１６、配列番号３ １７、配列番号３３２、配列番号３３３、配列番号３３６、配列番号３３７、配 列番号３３９、配列番号３４ ０、配列番号３４１、配列番号３４４、配列番号３６９、配列番号３７６、配列 番号３８２、配列番号３８６、配列番号４２３、配列番号４３１、配列番号４３ ５、配列番号４３６、配列番号４５８、配列番号４６２、配列番号４７５、配列 番号４７６、配列番号４７９、配列番号４８０、配列番号４８１、配列番号４８ ２、配列番号４８３、配列番号４８４、配列番号４８５、配列番号４８６、配列 番号４８７、配列番号４８９、配列番号９８４、配列番号９９４、配列番号１０ ２４及び配列番号１０３６からなる群から選択される核酸。 ５３． 転写調節成分に機能的に連結された請求の範囲５２の核酸を含んでな る組み換え発現ベクター。 ５４． 請求の範囲５３の組み換え発現ベクターを含んでなる細胞。 ５５． ポリペプチドを発現させる条件下で請求の範囲５４の細胞を培養する ことを含んでなるヘリコバクター ピロリポリペプチドの製造方法。 ５６． 請求の範囲２１の核酸の有効量を含んでなるヘリコバクターピロリ感 染の予防または処置のためのワクチン組成物。 ５７． 製薬学的に受容しうる担体をさらに含んでなる、請求の範囲５６のワ クチン組成物。 ５８． 製薬学的に受容しうる担体がアジュバントである、請求の範囲５７の ワクチン組成物。 ５９． ヘリコバクター ピロリ感染の処置が生じるように、請求の範囲５６ のワクチン組成物を患者に投与することを含んでなる患者のヘリコバクター ピ ロリ感染の処理方法。 ６０． 処置が予防処置である、請求の範囲５９の方法。 ６１． 処置が治療処置である、請求の範囲５９の方法。 ６２． 請求の範囲３７の核酸の有効量を含んでなるヘリコバクターピロリ感 染の予防または処置のためのワクチン組成物。 ６３． 製薬学的に受容しうる担体をさらに含んでなる、請求の範囲６２のワ クチン組成物。 ６４． 製薬学的に受容しうる担体がアジュバントである、製薬の範囲６３の ワクチン組成物。 ６５． ヘリコバクター ピロリ感染の処置が生じるように、請求の範囲６２ のワクチン組成物を患者に投与することを含んでなる患者のヘリコバクター ピ ロリ感染の処置方法。 ６６． 処置が予防処置である、請求の範囲６５の方法。 ６７． 処置が治療処置である、請求の範囲６５の方法。 ６８． 請求の範囲４２の核酸の有効量を含んでなるヘリコバクターピロリ感 染の予防または処置のためのワクチン組成物。 ６９． 製薬学的に受容しうる担体をさらに含んでなる、請求の範囲６８のワ クチン組成物。 ７０． 製薬学的に受容しうる担体がアジュバントである、請求の範囲６９の ワクチン組成物。 ７１． ヘリコバクター ピロリ感染の処置が生じるように、請求の範囲６８ のワクチン組成物を患者に投与することを含んでなる患者のヘリコバクター ピ ロリ感染の処置方法。 ７２． 処置が予防処置である、請求の範囲７１の方法。 ７３． 処置が治療処置である、請求の範囲７１の方法。 ７４． 請求の範囲５２の核酸の有効量を含んでなるヘリコバクター ピロリ感染の予防または処置のためのワクチン組成物。 ７５． 製薬学的に受容しうる担体をさらに含んでなる、請求の範囲７４のワ クチン組成物。 ７６． 製薬学的に受容しうる担体がアジュバントである、請求の範囲７５の ワクチン組成物。 ７７． ヘリコバクター ピロリ感染の処置が生じるように、請求の範囲７４ のワクチン組成物を患者に投与することを含んでなる患者のヘリコバクター ピ ロリ感染の処置方法。 ７８． 処置が予防処置である、請求の範囲７７の方法。 ７９． 処置が治療処置である、請求の範囲７７の方法。 ８０． ポリペプチドが配列番号７４６、配列番号７５４、配列番号７５７、 配列番号７６８、配列番号７７１、配列番号７７６、配列番号７８３、配列番号 ７８５、配列番号７９０、配列番号８０２、配列番号８０３、配列番号８０４、 配列番号８１２、配列番号８１８、配列番号８２０、配列番号８８２、配列番号 ８４４、配列番号８５５、配列番号８５７、配列番号８５９、配列番号８６６、 配列番号８７５、配列番号８８２、配列番号８８３、配列番号８８８、配列番号 ８８９、配列番号８９３、配列番号８９５、配列番号９００、配列番号９０１、 配列番号９０３、配列番号９１８、配列番号９２４、配列番号９２５、配列番号 ９３２、配列番号９３５、配列番号９３６、配列番号９４０、配列番号９４１、 配列番号９４３、配列番号９４４、配列番号９５７、配列番号９５９、配列番号 ９６０、配列番号１０３７、配列番号１０４３、配列番号１０６２、配列番号１ ０６５、配列番号１０６８、配列番号１０６９、配列番号１０８３、配列番号１ ０８６、配列番号７５０、配列番号 ７７７、配列番号８１７、配列番号８６５、配列番号８９０、配列番号９１３、 配列番号９４５、配列番号９５６、配列番号１０５２、配列番号１０６３、配列 番号１０７７、配列番号１２９７、配列番号１２９８、配列番号８１０、配列番 号８１６、配列番号９１６、配列番号９２８、配列番号９２９、配列番号９３８ 、配列番号９３９、配列番号９５８、配列番号１０５０、配列番号１０８１、配 列番号１０８５、配列番号７４５、配列番号８４３、配列番号９０６、配列番号 １０７３、配列番号８７２、配列番号８８０、配列番号１０６４、配列番号１０ ６６、配列番号８４５、配列番号８６３、配列番号８９１、配列番号９１２、配 列番号１０７６、配列番号９５４、配列番号７７２、配列番号１０４２、配列番 号９０２、配列番号８９８、配列番号１０７１、配列番号７８１、配列番号９０ ８、配列番号９２１、配列番号１０４６、配列番号１０７９、配列番号９６８、 配列番号９０５、配列番号７４４、配列番号７８４、配列番号８２５、配列番号 ８３４、配列番号９０９、配列番号９１５及び配列番号９３４からなる群から選 択される、精製されたヘリコバクター ピロリ細胞エンベロープポリペプチドま たはそのフラグメント。 ８１． 該ヘリコバクター ピロリ細胞エンベロープポリペプチドまたはその フラグメントが配列番号７４６、配列番号７５４、配列番号７５７、配列番号７ ６８、配列番号７７１、配列番号７７６、配列番号７８３、配列番号７８５、配 列番号７９０、配列番号８０２、配列番号８０３、配列番号８０４、配列番号８ １２、配列番号８１８、配列番号８２０、配列番号８８２、配列番号８４４、配 列番号８５５、配列番号８５７、配列番号８５９、配列番号８６６、配列番号８ ７５、配列番号８８２、配列番号８８３、配列番号８８８、配列番号８８９、配 列番号８ ９３、配列番号８９５、配列番号９００、配列番号９０１、配列番号９０３、配 列番号９１８、配列番号９２４、配列番号９２５、配列番号９３２、配列番号９ ３５、配列番号９３６、配列番号９４０、配列番号９４１、配列番号９４３、配 列番号９４４、配列番号９５７、配列番号９５９、配列番号９６０、配列番号１ ０３７、配列番号１０４３、配列番号１０６２、配列番号１０６５、配列番号１ ０６８、配列番号１０６９、配列番号１０８３、配列番号１０８６、配列番号７ ５０、配列番号７７７、配列番号８１７、配列番号８６５、配列番号８９０、配 列番号９１３、配列番号９４５、配列番号９５６、配列番号１０５２、配列番号 １０６３、配列番号１０７７、配列番号１２９７、配列番号１２９８、配列番号 ８１０、配列番号８１６、配列番号９１６、配列番号９２８、配列番号９２９、 配列番号９３８、配列番号９３９、配列番号９５８、配列番号１０５０、配列番 号１０８１、配列番号１０８５、配列番号７４５、配列番号８４３、配列番号９ ０６、配列番号１０７３、配列番号８７２、配列番号８８０、配列番号１０６４ 及び配列番号１０６６からなる群から選択されるヘリコバクター ピロリ外膜ポ リペプチドまたはそのフラグメントである、請求の範囲８０の精製されたポリペ プチド。 ８２． 該ヘリコバクター ピロリ外膜ポリペプチドまたはそのフラグメント が配列番号７４６、配列番号７５４、配列番号７５７、配列番号７６８、配列番 号７７１、配列番号７７６、配列番号７８３、配列番号７８５、配列番号７９０ 、配列番号８０２、配列番号８０３、配列番号８０４、配列番号８１２、配列番 号８１８、配列番号８２０、配列番号８８２、配列番号８４４、配列番号８５５ 、配列番号８５７、配列番号８５９、配列番号８６６、配列番号８７５、配列番 号８８２、配列番 号８８３、配列番号８８８、配列番号８８９、配列番号８９３、配列番号８９５ 、配列番号９００、配列番号９０１、配列番号９０３、配列番号９１８、配列番 号９２４、配列番号９２５、配列番号９３２、配列番号９３５、配列番号９３６ 、配列番号９４０、配列番号９４１、配列番号９４３、配列番号９４４、配列番 号９５７、配列番号９５９、配列番号９６０、配列番号１０３７、配列番号１０ ４３、配列番号１０６２、配列番号１０６５、配列番号１０６８、配列番号１０ ６９、配列番号１０８３及び配列番号１０８６からなる群から選択される末端フ ェニルアラニン残基を有するヘリコバクター ピロリポリペプチドまたはそのフ ラグメントである、請求の範囲８１の精製されたポリペプチド。 ８３． 該ヘリコバクター ピロリ外膜ポリペプチドまたはそのフラグメント が配列番号７４６、配列番号７５４、配列番号７５７、配列番号７６８、配列番 号７７１、配列番号７７６、配列番号７８３、配列番号７８５、配列番号７９０ 、配列番号８０２、配列番号８０３、配列番号８０４、配列番号８１２、配列番 号８１８、配列番号８２０、配列番号８８２、配列番号８４４、配列番号８５５ 、配列番号８５７、配列番号８５９、配列番号８６６、配列番号８７５、配列番 号８８２、配列番号８８３、配列番号８８８、配列番号８８９、配列番号８９３ 、配列番号８９５、配列番号９００、配列番号９０１、配列番号９０３、配列番 号９１８、配列番号９２４、配列番号９２５、配列番号９３２、配列番号９３５ 、配列番号９３６、配列番号９４０、配列番号９４１、配列番号９４３、配列番 号９４４、配列番号９５７、配列番号９５９、配列番号９６０、配列番号１０３ ７、配列番号１０４３、配列番号１０６２、配列番号１０６５、配列番号１０６ ８、配列番号１０６９、配列番号１ ０８３及び配列番号１０８６からなる群から選択されるＣ末端チロシンクラスタ ーを有するヘリコバクター ピロリポリペプチドまたはそのフラグメントである 、請求の範囲８１の精製されたポリペプチド。 ８４． 該ヘリコバクター ピロリ外膜ポリペプチドまたはそのフラグメント が配列番号８１０、配列番号８１６、配列番号９１６、配列番号９２８、配列番 号９２９、配列番号９３８、配列番号９３９、配列番号９５８、配列番号１０５ ０、配列番号１０８１及び配列番号１０８５からなる群から選択される末端フェ ニルアラニン残基及びＣ末端チロシンクラスターを有するヘリコバクター ピロ リポリペプチドまたはそのフラグメントである、請求の範囲８１の精製されたポ リペプチド。 ８５． 該ヘリコバクター ピロリ細胞エンベロープポリペプチドまたはその フラグメントが配列番号８４５、配列番号８６３、配列番号８９１、配列番号９ １２、配列番号１０７６、配列番号９５４、配列番号７７２、配列番号１０４２ 、配列番号９０２、配列番号８９８、配列番号１０７１、配列番号７８１、配列 番号９０８、配列番号９２１、配列番号１０４６、配列番号１０７９からなる群 から選択されるヘリコバクター ピロリ内膜ポリペプチドまたはそのフラグメン トである、請求の範囲８０の精製されたポリペプチド。 ８６． 該ヘリコバクター ピロリ内膜ポリペプチドまたはそのフラグメント が配列番号８４５のアミノ酸配列を含んでなる外膜及び細胞壁合成に関与するヘ リコバクター ピロリポリペプチドまたはそのフラグメントである、請求の範囲 ８５の精製されたポリペプチド。 ８７． 該ヘリコバクター ピロリ内膜ポリペプチドまたはそのフラグメント が配列８６３、配列番号８９１、配列番号９１２及び配列番号 １０７６からなる群から選択されるエネルギー転化に関与するヘリコバクター ピロリポリペプチドまたはそのフラグメントである、請求の範囲８５の精製され たポリペプチド。 ８８． 該ヘリコバクター ピロリ内膜ポリペプチドまたはそのフラグメント が配列番号９５４のアミノ酸配列を含んでなる補因子代謝に関与するヘリコバク ター ピロリポリペプチドまたはそのフラグメントである、請求の範囲８５の精 製されたポリペプチド。 ８９． 該ヘリコバクター ピロリ内膜ポリペプチドまたはそのフラグメント が配列番号７７２及び配列番号１０４２からなる群から選択される分泌及び接着 に関与するヘリコバクター ピロリポリペプチドまたはそのフラグメントである 、請求の範囲８５の精製されたポリペプチド。 ９０． 該ヘリコバクター ピロリ内膜ポリペプチドまたはそのフラグメント が配列番号８９８及び配列番号１０７１からなる群から選択される輸送に関与す るヘリコバクター ピロリポリペプチドまたはそのフラグメントである、請求の 範囲８５の精製されたポリペプチド。 ９１． 該ヘリコバクター ピロリ細胞エンベロープポリペプチドまたはその フラグメントが配列番号９６８のアミノ酸配列を含んでなるヘリコバクター ピ ロリ鞭毛ポリペプチドまたはそのフラグメントである、請求の範囲８０の精製さ れたポリペプチド。 ９２． 該ヘリコバクター ピロリ細胞エンベロープポリペプチドまたはその フラグメントが配列番号９０５のアミノ酸配列を含んでなるヘリコバクター ピ ロリ輸送ポリペプチドまたはそのフラグメントである、請求の範囲８０の精製さ れたポリペプチド。 ９３． ポリペプチドが配列番号７４７、配列番号７５８、配列番号 ７７３、配列番号７９７、配列番号７９８、配列番号７９９、配列番号８００、 配列番号８０１、配列番号８０７、配列番号８０８、配列番号８２３、配列番号 ８２４、配列番号８２７、配列番号８２８、配列番号８３０、配列番号８３１、 配列番号８３２、配列番号８３５、配列番号８６０、配列番号８６７、配列番号 ８７３、配列番号８７７、配列番号９１４、配列番号９２２、配列番号９２６、 配列番号９２７、配列番号９４９、配列番号９５３、配列番号９６６、配列番号 ９６７、配列番号９７０、配列番号９７１、配列番号９７２、配列番号９７３、 配列番号９７４、配列番号９７５、配列番号９７６、配列番号９７７、配列番号 ９７８、配列番号９８０、配列番号１０３８、配列番号１０４８、配列番号１０ ７８及び配列番号１０９０からなる群から選択される、精製されたヘリコバクタ ー ピロリ細胞ポリペプチドまたはそのフラグメント。 ９４． ポリペプチドが配列番号８４６、配列番号１０６０、配列番号７４８ 、配列番号７４９、配列番号７５１、配列番号７５２、配列番号７５５、配列番 号７５６、配列番号７５９、配列番号７６１、配列番号７６３、配列番号７６５ 、配列番号７６６、配列番号７６７、配列番号７７０、配列番号７７４、配列番 号７７５、配列番号７７８、配列番号７７９、配列番号７８０、配列番号７８２ 、配列番号７８６、配列番号７８７、配列番号７８８、配列番号７８９、配列番 号７９１、配列番号７９２、配列番号７９３、配列番号７９４、配列番号７９５ 、配列番号７９６、配列番号８０５、配列番号８０６、配列番号８１４、配列番 号８２９、配列番号８３３、配列番号８３９、配列番号８４０、配列番号８４９ 、配列番号８５０、配列番号８５１、配列番号８５２、配列番号８５３、配列番 号８５４、配列番号８５８、配列番号８６１、配列番 号８６２、配列番号８６４、配列番号８６８、配列番号８６９、配列番号８７０ 、配列番号８７１、配列番号８７９、配列番号８８１、配列番号８８５、配列番 号８８６、配列番号８８７、配列番号８９２、配列番号８９４、配列番号８９６ 、配列番号８９９、配列番号９１１、配列番号９１７、配列番号９１９、配列番 号９２０、配列番号９２３、配列番号９３０、配列番号９３３、配列番号９４２ 、配列番号９６２、配列番号９６９、配列番号９７９、配列番号１０４１、配列 番号１０４４、配列番号１０４５、配列番号１０４７、配列番号１０５５、配列 番号１０５６、配列番号１０６１、配列番号１０６７、配列番号１０７０、配列 番号１０７２、配列番号１０７５及び配列番号１０８０からなる群から選択され る、精製されたヘリコバクター ピロリ分泌ポリペプチドまたはそのフラグメン ト。 ９５． 該ヘリコバクター ピロリ分泌ポリペプチドまたはそのフラグメント が配列番号８４６及び配列番号１０６０からなる群から選択される分泌及び接着 に関与するヘリコバクター ピロリポリペプチドまたはそのフラグメントである 、請求の範囲９４の精製されたポリペプチド。 ９６． ポリペプチドが配列番号９６１、配列番号１０８７、配列番号８４８ 、配列番号９４８、配列番号９５２、配列番号１０８４、配列番号８３６、配列 番号８７４、配列番号８７８、配列番号９４６、配列番号１０５７、配列番号８ ４２、配列番号９０７、配列番号７６９、配列番号８２６、配列番号８３７、配 列番号８４１、配列番号９１０、配列番号９５１、配列番号９６３、配列番号１ ０５４、配列番号１０５８、配列番号１０７４、配列番号１２９６、配列番号８ ０９、配列番号８１３、配列番号８１５、配列番号８２１、配列番号８３８、配 列番号９３ １、配列番号９３７、配列番号９５５、配列番号９８１、配列番号９８２、配列 番号１０４９、配列番号１０５１、配列番号１０５９及び配列番号１０８２から なる群から選択される、精製されたヘリコバクターピロリ細胞質ポリペプチドま たはそのフラグメント。 ９７． 該ヘリコバクター ピロリ細胞質ポリペプチドまたはそのフラグメン トが配列番号９６１及び配列番号１０８７からなる群から選択されるエネルギ− 転化に関与するヘリコバクター ピロリポリペプチドまたはそのフラグメントで ある、請求の範囲９６の精製されたポリペプチド。 ９８． 該ヘリコバクター ピロリ細胞質ポリペプチドまたはそのフラグメン トが配列番号８４８及び配列番号９４８からなる群から選択されるアミノ酸代謝 及び輸送に関与するヘリコバクター ピロリポリペプチドまたはそのフラグメン トである、請求の範囲９６の精製されたポリペプチド。 ９９． 該ヘリコバクター ピロリ細胞質ポリペプチドまたはそのフラグメン トが配列番号９５２及び配列番号１０８４からなる群から選択されるヌクレオチ ド代謝及び輸送に関与するヘリコバクター ピロリポリペプチドまたはそのフラ グメントである、請求の範囲９６の精製されたポリペプチド。 １００． 該ヘリコバクター ピロリ細胞質ポリペプチドまたはそのフラグメ ントが配列番号８３６、配列番号８７４、配列番号８７８、配列番号９４６及び 配列番号１０５７からなる群から選択される補因子代謝に関与するヘリコバクタ ー ピロリポリペプチドまたはそのフラグメントである、請求の範囲９６の精製 されたポリペプチド。 １０１． 該ヘリコバクター ピロリ細胞質ポリペプチドまたはそのフラグメ ントが配列番号８４２及び配列番号９０７からなる群から選択される脂質代謝に 関与するヘリコバクター ピロリポリペプチドまたはそのフラグメントである、 請求の範囲９６の精製されたポリペプチド。 １０２． 該ヘリコバクター ピロリ細胞質ポリペプチドまたはそのフラグメ ントが配列番号７６９、配列番号８２６、配列番号８３７、配列番号８４１、配 列番号９１０、配列番号９５１、配列番号９６３、配列番号１０５４、配列番号 １０５８、配列番号１０７４及び配列番号１２９６からなる群から選択されるゲ ノム複製、転写、組み換え及び修復に関与するヘリコバクター ピロリポリペプ チドまたはそのフラグメントである、請求の範囲９６の精製されたポリペプチド 。 １０３． 請求の範囲８０のヘリコバクター ピロリポリペプチドの有効量を 含んでなるヘリコバクター ピロリ感染の予防または処置のためのワクチン組成 物。 １０４． 製薬学的に受容しうる担体をさらに含んでなる、請求の範囲１０３ のワクチン組成物。 １０５． 製薬学的に受容しうる担体がアジュバントである、請求の範囲１０ ４のワクチン組成物。 １０６． ヘリコバクター ピロリ感染の処置が生じるように、請求の範囲１ ０３のワクチン組成物を患者に投与することを含んでなる患者のヘリコバクター ピロリ感染の処置方法。 １０７． 処置が予防処置である、請求の範囲１０６の方法。 １０８． 処置が治療処置である、請求の範囲１０６の方法。 １０９． 請求の範囲９３のヘリコバクター ピロリポリペプチドの 有効量を含んでなるヘリコバクター ピロリ感染の予防または処置のためのワク チン組成物。 １１０． 製薬学的に受容しうる担体をさらに含んでなる、請求の範囲１０９ のワクチン組成物。 １１１． 製薬学的に受容しうる担体がアジュバントである、請求の範囲１１ ０のワクチン組成物。 １１２． ヘリコバクター ピロリ感染の処置が生じるように、請求の範囲１ ０９のワクチン組成物を患者に投与することを含んでなる患者のヘリコバクター ピロリ感染の処置方法。 １１３． 処置が予防処置である、請求の範囲１１２の方法。 １１４． 処置が治療処置である、請求の範囲１１２の方法。 １１５． 請求の範囲９４のヘリコバクター ピロリポリペプチドの有効量を 含んでなるヘリコバクター ピロリ感染の予防または処置のためのワクチン組成 物。 １１６． 製薬学的に受容しうる担体をさらに含んでなる、請求の範囲１１５ のワクチン組成物。 １１７． 製薬学的に受容しうる担体がアジュバントである、請求の範囲１１ ６のワクチン組成物。 １１８． ヘリコバクター ピロリ感染の処置が生じるように、請求の範囲１ １５のワクチン組成物を患者に投与することを含んでなる患者のヘリコバクター ピロリ感染の処置方法。 １１９． 処置が予防処置である、請求の範囲１１８の方法。 １２０． 処置が治療処置である、請求の範囲１１８の方法。 １２１． 請求の範囲９６のヘリコバクター ピロリポリペプチドの 有効量を含んでなるヘリコバクター ピロリ感染の予防または処置のためのワク チン組成物。 １２２． 製薬学的に受容しうる担体をさらに含んでなる、請求の範囲１２１ のワクチン組成物。 １２３． 製薬学的に受容しうる担体がアジュバントである、請求の範囲１２ ２のワクチン組成物。 １２４． ヘリコバクター ピロリ感染の処置が生じるように、請求の範囲１ ２１のワクチン組成物を患者に投与することを含んでなる患者のヘリコバクター ピロリ感染の処置方法。 １２５． 処置が予防処置である、請求の範囲１２４の方法。 １２６． 処置が治療処置である、請求の範囲１２４の方法。 １２７． （ａ）プローブとサンプル中のヘリコバクター核酸の間でハイブリ ッドが形成できる条件下で請求の範囲２１の核酸とサンプルを接触させ、そして （ｂ）工程（ａ）で形成されたハイブリッドを検出し、ここで、ハ イブリッドの検出がサンプル中のヘリコバクター核酸の存在を示す、 ことを含んでなるサンプル中のヘリコバクター核酸の存在の検出方法。 １２８． （ａ）プローブとサンプル中のヘリコバクター核酸の間でハイブリ ッドが形成できる条件下で請求の範囲３７の核酸とサンプルを接触させ、そして （ｂ）工程（ａ）で形成されたハイブリッドを検出し、ここで、ハ イブリッドの検出がサンプル中のヘリコバクター核酸の存在を示す、 ことを含んでなるサンプル中のヘリコバクター核酸の存在の検出方法。 １２９． （ａ）プローブとサンプル中のヘリコバクター核酸の間でハイブリ ッドが形成できる条件下で請求の範囲４２の核酸とサンプルを接触させ、そして （ｂ）工程（ａ）で形成されたハイブリッドを検出し、ここで、ハ イブリッドの検出がサンプル中のヘリコバクター核酸の存在を示す、 ことを含んでなるサンプル中のヘリコバクター核酸の存在の検出方法。 １３０． （ａ）プローブとサンプル中のヘリコバクター核酸の間でハイブリ ッドが形成できる条件下で請求の範囲５２の核酸とサンプルを接触させ、そして （ｂ）工程（ａ）で形成されたハイブリッドを検出し、ここで、ハ イブリッドの検出がサンプル中のヘリコバクター核酸の存在を示す、 ことを含んでなるサンプル中のヘリコバクター核酸の存在の検出方法。