JP2000065778A - バイオセンサ - Google Patents
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Abstract
軽減し、信頼性の高いバイオセンサを提供する。 【解決手段】 作用極、対極、および妨害物質検知電極
として使用され得る第3の電極を有する電極系と、少な
くとも酸化還元酵素および電子伝達体を含有する試薬層
と、電極系および試薬層を支持する電気絶縁性基板とを
具備し、第3の電極が作用極および対極の少なくとも一
方と対向する位置に配置され、試薬層が第3の電極に接
しない所定の位置に配置されているバイオセンサ。
Description
いて、迅速かつ高精度な定量を簡便に実施するためのバ
イオセンサに関する。
分析法として、施光度計法、比色法、還元滴定法および
各種クロマトグラフィーを用いた方法等が開発されてい
る。しかし、これらの方法は、いずれも糖類に対する特
異性があまり高くないので精度が悪い。これらの方法の
うち上記施光度計法によれば、操作は簡便ではあるが、
操作時の温度の影響を大きく受ける。従って、施光度計
法は、一般の人々が家庭などで簡易に糖類を定量する方
法としては適切でない。ところで、近年、酵素の有する
特異的触媒作用を利用した種々のタイプのバイオセンサ
が開発されている。以下に、試料液中の基質の定量法の
一例として、グルコースの定量法について説明する。電
気化学的なグルコースの定量法としては、グルコースオ
キシダーゼ(EC1.1.3.4:以下GODと略す)
と酸素電極あるいは過酸化水素電極とを使用して行う方
法が一般に知られている(例えば、鈴木周一編「バイオ
センサー」講談社)。
であるβ−D−グルコースをD−グルコノ−δ−ラクト
ンに選択的に酸化する。酸素の存在下でのGODによる
酸化反応過程において、酸素が過酸化水素に還元され
る。酸素電極によって、この酸素の減少量を計測する
か、あるいは過酸化水素電極によって過酸化水素の増加
量を計測する。酸素の減少量および過酸化水素の増加量
は、試料液中のグルコースの含有量に比例するので、酸
素の減少量または過酸化水素の増加量からグルコースを
定量することができる。上記方法では、その反応過程か
らも推測できるように、測定結果は試料液に含まれる酸
素濃度の影響を大きく受ける欠点があり、試料液に酸素
が存在しない場合には測定が不可能となる。
フェリシアン化カリウム、フェロセン誘導体、キノン誘
導体等の有機化合物や金属錯体を電子伝達体として用い
る新しいタイプのグルコースセンサが開発されてきた。
このタイプのセンサでは、酵素反応の結果生じた電子伝
達体の還元体を電極上で酸化することにより、その酸化
電流量から試料液中に含まれるグルコース濃度が求めら
れる。このような有機化合物や金属錯体を酸素の代わり
に電子伝達体として用いることにより、既知量のGOD
とそれらの電子伝達体を安定な状態で正確に電極上に担
持させて試薬層を形成することが可能となる。この場
合、試薬層を乾燥状態に近い状態で電極系と一体化させ
ることもできるので、この技術に基づいた使い捨て型の
グルコースセンサが近年多くの注目を集めている。使い
捨て型のグルコースセンサにおいては、測定器に着脱可
能に接続されたセンサに試料液を導入するだけで容易に
グルコース濃度を測定器で測定することができる。この
ような手法は、グルコースの定量だけに限らず、試料液
中に含まれる他の基質の定量にも応用可能である。
いた測定では、還元型電子伝達体を作用極上にて酸化
し、その際に流れる酸化電流値に基づいて基質濃度が求
められる。しかしながら、血液や果汁等が試料として用
いられた場合、その試料中に含まれるアスコルビン酸、
尿酸等の易酸化性物質も、還元型電子伝達体と同時に作
用極上で酸化される。この易酸化性物質の酸化反応が、
測定結果に影響を与える場合があった。また、上記の様
なセンサを用いた測定では、試薬層に担持された電子伝
達体が還元されると同時に、溶存酸素を電子伝達体とし
て過酸化水素を生成する反応が同時に進行する。さら
に、この反応で生成した過酸化水素は、還元型電子伝達
体を再酸化する。結果として、還元型電子伝達体の酸化
電流に基づいて基質濃度を測定する場合、溶存酸素が測
定結果に負の誤差を与える場合があった。
めに本発明は、電気絶縁性基板と、前記基板に形成され
た作用極、対極、および妨害物質検知電極として使用さ
れ得る第3の電極を有する電極系と、少なくとも酸化還
元酵素および電子伝達体を含有する試薬層とを具備する
バイオセンサにおいて、第3の電極が、作用極および対
極のどちらか一方、または、作用極および対極の双方と
対向する位置に配置されており、前記試薬層が、第3の
電極上以外の所定の位置に配置されていることを特徴と
するバイオセンサを提供するものである。レシチンを主
成分とする層が前記第3の電極に接しない所定の位置、
好ましくは試薬層に接して配置されていることが好まし
い。また、前記試薬層は、さらに親水性高分子を含有す
ることが好ましい。
および対極を含む電極系と、酸化還元酵素および電子伝
達体を含む試薬層と、これらを支持する電気絶縁性基板
とを具備し、前記試薬層に添加された試料液中での酵素
反応の結果生じた還元型電子伝達体を作用極上にて酸化
し、その際に流れる酸化電流値に基づいて基質濃度を求
めるバイオセンサを改良したものである。すなわち、妨
害物質検知電極として使用され得る第3の電極を付加
し、この第3の電極が作用極および対極の少なくとも一
方と対向するように配置し、かつ試薬層を第3の電極に
接しない所定の位置に配置するものである。本発明の好
ましい態様において、バイオセンサは、電気絶縁性基板
と、この基板との間に試料液供給路を形成する電気絶縁
性のカバー部材と、前記試料液供給路に露出するように
基板またはカバー部材に形成された電極系および試薬層
とからなり、試料液供給路内において第3の電極が作用
極および対極の少なくとも一方と対向し、かつ試薬層が
第3の電極と接触しない位置に配置されている。
カバー部材は、絶縁性基板と、試料液供給路を形成する
ためのスリットを有するスペーサとから構成される。す
なわち、センサは、2枚の電気絶縁性基板とスペーサか
ら構成される。この構成におけるさらに具体的な第1の
例では、一方の基板に作用極と対極を設け、他方の基板
に第3の電極を設ける。第2の例では、一方の基板に作
用極を設け、他方の基板に対極および第3の電極を設け
る。第3の例では、一方の基板に作用極および第3の電
極を設け、他方の基板に対極を設ける。試薬層は、前記
第1および第2の例では、作用極を有する一方の基板上
に、第3の例では対極を設けた他方の基板上にそれぞれ
形成される。試薬層は、第3の電極と対向する電極に接
して形成するのが好ましい。しかし、試料液供給路にお
いて、試薬層が供給された試料液に溶解することにより
酵素反応が生じその生成物が第3の電極に到達する前
に、ある時間差をもって、試料液が第3の電極に到達す
るように、試薬層が配置されていればよい。
物質を含む試料液の場合は、試料添加後の初期段階、す
なわち酵素反応により生成する還元型電子伝達体が第3
の電極に到達する前においては、第3の電極と対極との
間に流れる酸化電流は、易酸化性物質の濃度のみを反映
する。その後、十分な時間経過後に作用極と対極との間
に流れる酸化電流を測定すれば、これは、試料中に存在
していた易酸化性物質の酸化反応と、酵素反応の結果生
じた還元型電子伝達体の酸化反応とに起因する。したが
って、後に測定された酸化電流値を前に測定された酸化
電流値で補正すれば、正確な試料中の基質濃度を求める
ことができる。試料液中に溶存酸素を含む場合、前記と
同様の試料添加後の初期段階において、第3の電極に適
当な電位を印加することにより、溶存酸素濃度を反映し
た酸化電流を測定することができる。酵素反応の結果生
じた還元型電子伝達体を酸化する際の酸化電流により試
料液中の基質濃度を求める場合、試料液中の溶存酸素
は、その測定結果に負の誤差を与える。しかし、前記の
ように溶存酸素を反映した酸化電流値でこれを補正する
ことにより、溶存酸素に影響されずに正確な基質濃度を
求めることができる。
還元酵素としては、試料液に含まれる基質に応じて適切
なものが選択される。酸化還元酵素としては、例えば、
フルクトースデヒドロゲナーゼ、グルコースオキシダー
ゼ、アルコールオキシダーゼ、乳酸オキシダーゼ、コレ
ステロールオキシダーゼ、キサンチンオキシダーゼ、ア
ミノ酸オキシダーゼなどがあげられる。また、電子伝達
体としては、フェリシアン化カリウム、p−ベンゾキノ
ン、フェナジンメトサルフェート、メチレンブルー、フ
ェロセン誘導休などがあげられる。電子伝達体は、これ
らの一種または二種以上が使用される。上記酵素および
電子伝達体は、試料液に溶解させてもよく、試薬層を基
板などに固定することによって試料液に溶けないように
してもよい。酵素および電子伝達体を固定化する場合、
試薬層は、以下に挙げる親水性高分子を含有することが
好ましい。
のものが使用される。例えば、カルボキシメチルセルロ
ース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピ
ルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、
エチルヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチル
エチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニル
アルコール、ポリリジン等のポリアミノ酸、ポリスチレ
ンスルホン酸、ゼラチンおよびその誘導体、アクリル酸
またはその塩のポリマー、メタアクリル酸またはその塩
のポリマー、スターチおよびその誘導体、無水マレイン
酸またはその塩のポリマーなどがあげられる。その中で
も、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセ
ルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセル
ロース、エチルセルロース、エチルヒドロキシエチルセ
ルロース、カルボキシメチルエチルセルロースが好まし
い。
知、アスコルビン酸、あるいは溶存酸素検出のための第
3の電極への印加電位を500mV、あるいは−130
0mVとしたが、これに限定されることはない。また、
応答電流を得るための作用極への印加電位を500mV
としたが、これに限定されることはなく、一連の反応の
結果生じた電子伝達体の還元体を酸化できる電位であれ
ばよい。電流値を測定する時間についても、実施例に記
載の特定値に限定されることはない。また、実施例で
は、電極系の例を図示したが、電極形状、電極およびリ
ードの配置、センサ部材の組み合わせ方法等はこれらに
限定されるものではない。実施例では、第3の電極の電
極材料としてカーボンについて述べたが、これに限定さ
れることはなく、他の導電性材料や銀/塩化銀電極など
も使用できる。
サについて説明する。図1は、試薬層を除いたグルコー
スセンサの分解斜視図である。一方の絶縁性基板1に
は、作用極2および対極4が設けられ、さらにこれらに
電気的に接続されたリード3および5がそれぞれ設けら
れている。もう一方の絶縁性基板11には、第3の電極
7が設けられ、さらに電極7に電気的に接続されたリー
ド8が設けられている。基板1には、作用極2および対
極4を覆うように、外周が対極4の外周に沿った円形の
試薬層(図示しない)が設けられている。図中、6およ
び9は絶縁層である。このグルコースセンサは、ポリエ
チレンテレフタレートからなる2枚の絶縁性基板1およ
び11と、前記両基板の間にサンドイッチされるスペー
サ12とから組み立てられる。これらが図1の中の破線
で示すような位置関係をもって接着されてグルコースセ
ンサが構成される。スペーサ12には、試料液供給路を
形成するスリット13が形成され、また、一方の絶縁性
基板11には空気孔10が形成されている。両基板1、
11を間にスペーサ12を挟んで積層し接着すると、両
基板1、11、およびスペーサ12によって、試料液供
給路となる空間部(図示しない)が形成される。この空
間部は、始端部となるスリットの解放端部14が試料液
供給口となり、終端部は空気孔10に連通する。ここ
で、基板11とスペーサ12の組み合わせは、上記のカ
バー部材に相当するものであり、この例では2つの部材
で構成されているが、スペーサ12のスリット13に相
当する溝を設けた1つの部材で構成することもできる。
作製した。ポリエチレンテレフタレートからなる絶縁性
基板1上に、スクリーン印刷により銀ペーストを印刷し
リード端子3および5をそれぞれ形成した。もう一方の
絶縁性基板11上にも銀ペーストを印刷し、リード端子
8を形成した。次に、樹脂バインダーを含む導電性カー
ボンペーストを絶縁性基板1上に印刷して作用極2を形
成した。同様に、第3の電極7をもう一方の絶縁性基板
11上に形成した。作用極2および第3の電極7はそれ
ぞれリード端子3および8と電気的に接触している。次
に、絶縁性基板1および11上に、絶縁性ペーストを印
刷してそれぞれ絶縁層6および9を形成した。絶縁層6
および9は、それぞれ作用極2および第3の電極7の外
周部を覆っており、これによって作用極2および第3の
電極7の露出部分の面積は一定に保たれる。絶縁層6お
よび9は、それぞれリード端子3、5、および7の一部
を覆っている。次に、樹脂バインダーを含む導電性カー
ボンペーストを絶縁性基板1上に印刷して対極4を形成
した。対極4は、リード端子5と電気的に接触してい
る。次に、作用極2および対極4上に、酵素としてGO
D、電子伝達体としてフェリシアン化カリウムを含有す
る水溶液を滴下し、乾燥させることにより、試薬層を形
成した。
の供給をより一層円滑にするために、レシチンの有機溶
媒溶液、例えばトルエン溶液を、試料液供給口14から
試薬層上にわたって広げ、乾燥させることによりレシチ
ン層を形成した。しかしながら、レシチン層を第3の電
極7に接触するように配置した場合には、応答のばらつ
きが大きくなる。これは、第3の電極7の表面がレシチ
ン層により変化を来たし、それに起因するものと思われ
る。次に、両基板1、11およびスペーサ12を、図1
中の一点鎖線で示すような位置関係をもって接着するこ
とによりグルコースセンサを作製した。第3の電極7、
作用極2および対極4が同一平面上に配置された場合、
第3の電極7上の一部を試薬層が覆ってしまい、測定結
果に誤差を生じる場合があった。しかしながら、上記の
ようなセンサ系では、第3の電極7が、作用極2および
対極4と対向する位置に配置されるために、上記のよう
な試薬層形成に起因する誤差が大幅に低減される。
4を基準にして第3の電極7に500mVの電位を印加
した。この電位を印加した状態で、妨害物質としてアス
コルビン酸を含むグルコース水溶液3μlを、試料液と
して試料液供給口14より供給した。試料液は空間部を
通って空気孔10にまで達し、電極系上の試薬層が溶解
した。試料液の供給と同時に、第3の電極7と対極4間
の電気的変化に基づいて、すなわち、前記両電極が試料
液により液絡したことに基づいて、液の供給を検知する
システムが動作することにより、測定タイマーが始動し
た。この時、第3の電極7と対極4との間に電位は印加
され続けており、試料液の供給が検知されてから一定時
間経過後に、第3の電極7と対極4間の電流値を測定し
た。この電流値は、妨害物質として含まれるアスコルビ
ン酸の酸化反応に起因し、その濃度に対して比例関係を
与えた。第3の電極7と対極4間の電流値を測定した
後、両電極間の電圧印加を解除した。
2および対極4と対向する位置に配置されており、第3
の電極7上には試薬層が配置されていない。よって、酵
素反応の結果生成したフェロシアン化イオンが第3の電
極7近傍に到達するまでには、若干の時間を必要とす
る。すなわち、フェロシアン化イオン到達までの時間内
における第3の電極7と対極4間の電流値は、主にアス
コルビン酸の濃度のみを反映する。さらに、試料液の供
給を検知してから25秒後、対極4を基準にして作用極
2に500mVの電位を印加し、作用極2と対極4間に
流れる5秒後の電流値を測定した。試薬層を溶解した試
料液中のフェリシアン化イオン、グルコース、およびG
ODが反応し、その結果、グルコースがグルコノラクト
ンに酸化され、フェリシアン化イオンがフェロシアン化
イオンに還元される。このフェロシアン化イオンの濃度
は、グルコースの濃度に比例する。試料液の検知から3
0秒後の作用極2と対極4間の電流は、フェロシアン化
イオンと、あらかじめ存在するアスコルビン酸の酸化反
応に起因する。すなわち、アスコルビン酸が測定結果に
正の誤差を与えることとなる。しかしながら、上述した
ように、第3の電極7と対極4間の電流値は主にアスコ
ルビン酸の濃度のみを反映する。そこで、その結果に基
づき測定結果を補正することにより、アスコルビン酸の
影響を除去し正確なグルコース濃度を求めることができ
る。
シメチルセルロース(以下CMCと略称する)を含むこ
と以外は全て実施例1と同様にしてグルコースセンサを
作製し、実施例1と同様の測定を行った。まず、基板1
の作用極2および対極4上に、CMCの水溶液を滴下
し、乾燥することによりCMC層を形成した。次に、酵
素および電子伝達体の混合水溶液を前記CMC層上に滴
下すると、CMC層は一度溶解し、その後の乾燥過程で
酵素などと混合された形で試薬層を形成する。しかし、
攪拌等を伴わないため完全な混合状態とはならず、電極
系表面はCMCのみによって被覆された状態となる。す
なわち、酵素および電子伝達体などが電極系表面に接触
しないので、電極系表面へのタンパク質の吸着などを防
ぐことができる。その結果、センサ応答のばらつきが減
少した。
コースセンサの分解斜視図である。一方の絶縁性基板1
上には作用極2およびカーボン層15を、もう一方の絶
縁性基板11上には第3の電極7および対極4を、実施
例1と同様の方法にてそれぞれ形成した。さらに、試薬
層およびレシチン層を作用極2およびカーボン層15上
に実施例2と同様にして形成した。ここで、カーボン層
15は、電極としては機能していない。しかしながら、
作用極2の周囲にカーボン層15を配置することによ
り、試薬層の形成が容易になる。実施例1と同様に、両
基板1、11およびスペーサ12を貼り合わせることに
より、グルコースセンサを作製した。次に、実施例1と
同様に、アスコルビン酸が混在するグルコース溶液を用
いて、グルコース濃度の測定を行った。その結果、アス
コルビン酸の影響を除去し正確なグルコース濃度を求め
ることができた。グルコース濃度が高濃度域(約1000mg
/dl以上)の場合は、作用極2−対極4間の電流値も増
加する。すなわち、対極4上で生成する副生成物も多量
になるために、作用極の周囲に対極を配置した場合、副
生成物がセンサ応答に影響を与える場合がある。本実施
例のような電極配置を導入すると、そのような影響が軽
減される。
コースセンサの分解斜視図である。一方の絶縁性基板1
上には作用極2および第3の電極7を、もう一方の絶縁
性基板11上には対極4dを、実施例1と同様の方法に
てそれぞれ形成した。さらに、試薬層およびレシチン層
を実施例2と同様にして対極4d上に形成した。実施例
1と同様に、両基板1、11およびスペーサ12を貼り
合わせることにより、グルコースセンサを作製した。次
に、実施例1と同様に、アスコルビン酸が混在するグル
コース水溶液を用いて、グルコース濃度の測定を行っ
た。その結果、アスコルビン酸の影響を除去し正確なグ
ルコース濃度を求めることができた。本実施例の場合
は、対極4dの電極面積を作用極2および第3の電極7
に比べてより広く保つことができる。また、対極4d上
に試薬層が配置されているために、電位印加時の基準電
極電位がより安定する。これらの効果により、センサ応
答のばらつきが軽減された。
ースセンサを作製した。専用測定器にセンサを装着し、
対極4を基準にして第3の電極7に−1300mVの電
位を印加した。この電位を印加した状態で、空気飽和状
態のグルコース水溶液3μlを、試料液として試料液供
給口14より供給した。試料液は空間部を通って空気孔
10にまで達し、電極系上の試薬層が溶解した。試料液
の供給と同時に、対極4と第3の電極7間の電気的変化
に基づいて液の供給を検知するシステムが動作すること
により、測定タイマーが始動した。この時、対極4と第
3の電極7間に電位は印加され続けており、試料液の供
給を検知してから一定時間経過後に、対極4と第3の電
極7間の電流値を測定した。この電流値は溶存酸素の還
元反応に起因し、アルゴンにて脱気したグルコース溶液
を供給した場合には、その還元電流は激減した。対極4
と第3の電極7間の電流値を測定した後、両電極間の電
圧印加を解除した。
層が配置されていない。よって、試薬層に含有するフェ
リシアン化イオンが第3の電極7近傍に到達するまでに
は、若干の時間を必要とする。すなわち、フェリシアン
化イオン到達までの時間内における対極4と第3の電極
7間の電流値は、主に溶存酸素濃度のみを反映する。さ
らに、試料液検知から25秒後、第3の電極7を基準に
して作用極2に500mVの電位を印加し、対極4と作
用極2間の5秒後の電流値を測定した。液中のフェリシ
アン化イオン、グルコース、およびGODが反応し、そ
の結果、グルコースがグルコノラクトンに酸化され、フ
ェリシアン化イオンがフェロシアン化イオンに還元され
る。一方、この反応の競争反応として、グルコノラクト
ンと過酸化水素が生成する酵素反応が、酸素を電子伝達
体として同時に進行する。さらに、この反応にて生成す
る過酸化水素は、フェロシアン化イオンをフェリシアン
化イオンに再酸化する。結果として、フェロシアン化イ
オンの酸化電流に基づいてグルコース濃度を測定する場
合、溶存酸素は測定結果に負の誤差を与える。しかしな
がら、上述したように、対極4と第3の電極7間の電流
値は主に溶存酸素濃度のみを反映する。そこで、その結
果に基づき測定結果を補正することで、溶存酸素の影響
を除去し正確なグルコース濃度を求めることができる。
ースセンサを作製した。専用測定器にセンサを装着し、
対極4を基準にして第3の電極7に500mVの電位を
印加した。この電位を印加した状態で、空気飽和状態の
アスコルビン酸を含むグルコース水溶液3μlを、試料
液として試料液供給口14より供給した。試料液は空間
部を通って空気孔10にまで達し、電極系上の試薬層が
溶解した。試料液の供給と同時に、電極系の対極4と第
3の電極7間の電気的変化に基づいて液の供給を検知す
るシステムが動作することにより、測定タイマーが始動
した。この時、対極4と第3の電極7間に電位は印加さ
れ続けている。
経過後、第3の電極7への印加電位を−1300mVに
ステップした。−1300mVに電位をステップする直
前、および−1300mVにステップしてから3秒後
の、二点における対極4と第3の電極7間の電流値を測
定した。−1300mVに電位をステップする直前の電
流値は、主としてアスコルビン酸濃度に依存する。一
方、−1300mVにステップしてから3秒後の電流値
は、主として溶存酸素濃度に依存する。試料液供給から
2秒後、および5秒後の対極4と第3の電極7間の電流
値を測定した後、両電極間の電圧印加を解除した。さら
に、試料液検知から25秒後、第3の電極7を基準にし
て作用極2に500mVの電位を印加し、対極4と作用
極2間の5秒後の電流値を測定した。上述したように、
対極4と第3の電極7間の電流値は主にアスコルビン酸
および溶存酸素濃度を反映するため、その電流値に基づ
き両物質の濃度を求めることができる。そこで、その結
果に基づき測定結果を補正することにより、アスコルビ
ン酸および溶存酸素の影響を除去し、正確なグルコース
濃度を求めることができる。
性を有するバイオセンサを提供することができる。
試薬層を除去した状態の分解斜視図である。
の試薬層を除去した状態の分解斜視図である。
センサの試薬層を除去した状態の分解斜視図である。
Claims (4)
- 【請求項1】 作用極、対極、および妨害物質検知電極
として使用され得る第3の電極を有する電極系と、少な
くとも酸化還元酵素および電子伝達体を含有する試薬層
と、前記電極系および試薬層を支持する電気絶縁性基板
とを具備し、第3の電極が作用極および対極の少なくと
も一方と対向する位置に配置されており、前記試薬層が
第3の電極に接しない所定の位置に配置されていること
を特徴とするバイオセンサ。 - 【請求項2】 電気絶縁性基板と、この基板との間に試
料液供給路を形成する電気絶縁性のカバー部材と、前記
試料液供給路に露出するように基板またはカバー部材に
形成された電極系および試薬層とを具備し、試料液供給
路内において第3の電極が作用極および対極の少なくと
も一方と対向し、かつ試薬層が第3の電極と接触しない
位置に配置されていることを特徴とするバイオセンサ。 - 【請求項3】 レシチンを主成分とする層が、前記第3
の電極以外の所定の位置に配置されている請求項1また
は2に記載のバイオセンサ。 - 【請求項4】 前記試薬層が、さらに親水性高分子を含
有する請求項1または2に記載のバイオセンサ。
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