JP2001330581A

JP2001330581A - 基質濃度定量法

Info

Publication number: JP2001330581A
Application number: JP2000147688A
Authority: JP
Inventors: Makoto Ikeda; 信池田; Shiro Nankai; 史朗南海
Original assignee: Matsushita Electric Industrial Co Ltd
Current assignee: Panasonic Holdings Corp
Priority date: 2000-05-19
Filing date: 2000-05-19
Publication date: 2001-11-30

Abstract

(57)【要約】【課題】試料液の供給状態を容易かつ確実に判別する
ことができ、高精度で、ばらつきが少ない基質濃度定量
法を提供する。【解決手段】作用極５、対極８、液絡検知電極７、試
薬層及び試料液供給口１１を備え、液絡検知電極７が、
作用極５及び対極８よりも試料液供給口１１から離れた
位置に配置されているバイオセンサを用い、試料液が作
用極５及び対極８に接触してから液絡検知電極７に接触
するまでの時間に基づいて、基質濃度定量工程の実施の
要否を判断する工程を含む、基質濃度定量法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、バイオセンサを用
いた基質濃度定量法に関する。

【０００２】

【従来の技術】スクロース、グルコースなど糖類の定量
分析法として、施光度計法、比色法、還元滴定法および
各種クロマトグラフィーを用いた方法等が開発されてい
る。しかし、これらの方法はいずれも、糖類に対する特
異性があまり高くないので精度が悪い。また、これらの
方法のうち施光度計法は、操作は簡便ではあるが、操作
時の温度の影響を大きく受ける。従って、施光度計法
は、一般の人々が家庭などで簡易に糖類を定量する方法
としては適切でない。

【０００３】ところで、近年、酵素の有する特異的触媒
作用を利用した種々のタイプのバイオセンサが開発され
ている。

【０００４】以下に、試料液中の基質の定量法の一例と
してグルコースの定量法について説明する。電気化学的
なグルコースの定量法としては、グルコースオキシダー
ゼ（ＥＣ１．１．３．４：以下ＧＯＤと略す）と酸素電
極あるいは過酸化水素電極とを使用して行う方法が一般
に知られている（例えば、鈴木周一編「バイオセンサ
ー」講談社）。

【０００５】ＧＯＤは、酸素を電子伝達体として、基質
であるβ−Ｄ−グルコースをＤ−グルコノ−δ−ラクト
ンに選択的に酸化する。酸素の存在下で、ＧＯＤによる
酸化反応過程において、酸素が過酸化水素に還元され
る。酸素電極によって、この酸素の減少量を計測する
か、あるいは過酸化水素電極によって過酸化水素の増加
量を計る。酸素の減少量及び過酸化水素の増加量は、試
料液中のグルコースの含有量に比例するので、酸素の減
少量または過酸化水素の増加量からグルコースの定量が
行われる。

【０００６】上記方法では、その反応過程からも推測で
きるように、測定結果は試料液に含まれる酸素濃度の影
響を大きく受ける欠点があり、また試料液に酸素が存在
しない場合では測定が不可能となる。

【０００７】そこで、酸素を電子伝達体として用いず、
フェリシアン化カリウム、フェロセン誘導体、キノン誘
導体等の有機化合物や金属錯体を電子伝達体として用い
る新しいタイプのグルコースセンサが開発されてきた。
このタイプのセンサでは、酵素反応の結果生じた電子伝
達体の還元体を電極上で酸化することにより、その酸化
電流量から試料液中に含まれるグルコース濃度が求めら
れる。このような有機化合物や金属錯体を酸素の代わり
に電子伝達体として用いることで、既知量のＧＯＤとそ
れらの電子伝達体を安定な状態で正確に電極上に担持さ
せて試薬層を形成することが可能となる。この場合、試
薬層を乾燥状態に近い状態で電極系と一体化させること
もできるので、この技術に基づいた使い捨て型のバイオ
センサが近年多くの注目を集めている。その代表的な例
が、特許第２５１７１５３号公報に示されるバイオセン
サである。このバイオセンサにおいては、測定器に着脱
可能に接続されたセンサに試料液を導入するだけで容易
にグルコース濃度を測定器で測定することができる。こ
のような手法は、グルコースの定量だけに限らず、試料
液中に含まれる他の基質の定量にも応用可能である。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】上記のようなバイオセ
ンサでは、二電極間（作用極と対極間）の抵抗値の変化
に基づいて試料液の供給を検知し、検知をトリガーとし
て基質の測定を開始する場合が多い。しかしながらこの
ような検知法の場合、二電極間に試料液が達すれば、試
料液の供給量が不十分で、両電極が十分に試料液に接し
ていない状態でも基質の測定が開始する場合があり、測
定結果にばらつきが生ずる場合があった。

【０００９】また、作用極及び対極が、空間部を介して
相互に対向する位置に配置されている場合、目視によっ
ても、試料液のセンサへの供給が判別し難く、上記と同
様の問題が生じる場合があった。

【００１０】これらの問題を解決するため、作用極及び
対極に加えて、液絡検知用電極として使用される第３の
電極を、作用極及び対極よりも試料液供給口から離れた
位置に備えたバイオセンサ及びそれを用いた基質の定量
法が、特開平８−３２０３０４号公報に開示されてい
る。これによると、試料液の反応層への供給によって生
じた、対極と第３の電極との間の電気的変化を検知する
ことにより、試料液の供給を確実に検知することができ
る。

【００１１】しかし、このバイオセンサ及びそれを用い
た基質の定量法では、試料量不足を補うために再度試料
の供給を実施した場合であっても測定が開始するので、
正確な測定結果が得られないことがあった。

【００１２】さらに、妨害物質の影響や、参照極を用い
ないことにより生ずる印加電圧の摂動を抑制することが
要望されていた。

【００１３】そこで本発明は、上記の問題点に鑑み、試
料液の供給状態を容易に判別することができ、高精度
で、ばらつきが少ない基質濃度定量法を提供することを
目的とする。

【００１４】

【課題を解決するための手段】上記の課題を解決するた
めに、本発明による基質濃度定量法は、作用極、対極、
液絡検知電極、少なくとも酵素及び電子伝達体を包含す
る試薬層、並びに試料液供給口を備え、前記液絡検知電
極が、前記作用極及び前記対極よりも前記試料液供給口
から離れた位置に配置されているバイオセンサを用い、
前記作用極に前記電子伝達体を酸化する電位を印加する
工程（Ａ）及び前記作用極と前記対極間の電流値を測定
する工程（Ｂ）を有する基質濃度定量工程において得ら
れた前記電流値に基づいて試料液中の基質濃度を定量す
る基質濃度定量法であって、少なくとも、前記試料液供
給口から前記試料液を供給する工程（Ｃ）、前記試料液
が前記作用極及び前記対極に接触したことを検知する工
程（Ｄ）、前記試料液が前記液絡検知電極に接触したこ
とを検知する工程（Ｅ）、前記試料液が前記作用極及び
前記対極に接触してから、前記試料液が前記液絡検知電
極に接触するまでの時間（Ｔ１）を計測する工程
（Ｆ）、前記Ｔ１に基づいて前記基質濃度定量工程の実
施または中止を決定する工程（Ｇ）、及び前記決定に基
づいて前記基質濃度定量工程を実施または中止する工程
（Ｈ）を含むことを特徴とする。

【００１５】ここで、工程（Ｄ）において、作用極と対
極間の電気的信号の変化により、試料液が前記作用極及
び前記対極に接触したことを検知し、工程（Ｅ）におい
て、前記作用極と液絡検知電極間、または前記対極と前
記液絡検知電極間の電気的信号の変化により、前記試料
液が前記液絡検知電極に接触したことを検知し、工程
（Ｆ）において、前記作用極と前記対極間の電気的信号
の変化を検知してから、前記作用極と前記液絡検知電極
間、または前記対極と前記液絡検知電極間の電気的信号
の変化を検知するまでの時間（Ｔ２）を計測し、前記Ｔ
２をＴ１とすることが好ましい。

【００１６】また、少なくとも工程（Ｄ）の前に、作用
極と対極間に電圧を印加する工程を有し、かつ少なくと
も工程（Ｅ）の前に、前記作用極と液絡検知電極間、ま
たは前記対極と前記液絡検知電極間に電圧を印加する工
程を有することが好ましい。

【００１７】また、少なくとも工程（Ｄ）の前に、作用
極、対極及び液絡検知電極に電位を印加する工程を有し
ていてもよい。

【００１８】また、作用極、対極及び液絡検知電極が同
一基板上に配置されているバイオセンサを用いてもよ
い。

【００１９】また、作用極及び対極が、空間部を介して
相互に対向する位置に配置されているバイオセンサを用
いてもよい。

【００２０】また、試薬層及び液絡検知電極が、空間部
を介して相互に対向する位置に配置されているバイオセ
ンサを用い、対極と前記液絡検知電極間の電流値を測定
することにより妨害物質の検知を行う工程を有すること
が好ましい。

【００２１】また、液絡検知電極が参照極として機能す
ることが好ましい。

【００２２】

【発明の実施の形態】以下、本発明の実施の形態を説明
する。

【００２３】上記の課題を解決するために、本発明によ
る基質濃度定量法は、作用極、対極、液絡検知電極、少
なくとも酵素及び電子伝達体を包含する試薬層、並びに
試料液供給口を備え、前記液絡検知電極が、前記作用極
及び前記対極よりも前記試料液供給口から離れた位置に
配置されているバイオセンサを用い、前記作用極に前記
電子伝達体を酸化する電位を印加する工程（Ａ）及び前
記作用極と前記対極間の電流値（以下、応答電流値と略
称する）を測定する工程（Ｂ）を有する基質濃度定量工
程において得られた前記応答電流値に基づいて試料液中
の基質濃度を定量する基質濃度定量法であって、少なく
とも、前記試料液供給口から前記試料液を供給する工程
（Ｃ）、前記試料液が前記作用極及び前記対極に接触し
たことを検知する工程（Ｄ）、前記試料液が前記液絡検
知電極に接触したことを検知する工程（Ｅ）、前記試料
液が前記作用極及び前記対極に接触してから、前記試料
液が前記液絡検知電極に接触するまでの時間（Ｔ１）を
計測する工程（Ｆ）、前記Ｔ１に基づいて前記基質濃度
定量工程の実施または中止を決定する工程（Ｇ）、及び
前記決定に基づいて前記基質濃度定量工程を実施または
中止する工程（Ｈ）を含むことを特徴とする。

【００２４】この方法によると、Ｔ１に基づいて試料液
の供給状態を容易かつ確実に判別することができ、試料
液が適切に供給された場合のみ、基質濃度定量工程が実
施されるので、高精度でばらつきの少ない測定を行うこ
とができる。

【００２５】本発明の好ましい態様においては、工程
（Ｄ）において、作用極と対極間の電気的信号の変化に
より、試料液が前記作用極及び前記対極に接触したこと
を検知し、工程（Ｅ）において、前記作用極と液絡検知
電極間、または前記対極と前記液絡検知電極間の電気的
信号の変化により、前記試料液が前記液絡検知電極に接
触したことを検知し、工程（Ｆ）において、前記作用極
と前記対極間の電気的信号の変化を検知してから、前記
作用極と前記液絡検知電極間、または前記対極と前記液
絡検知電極間の電気的信号の変化を検知するまでの時間
（Ｔ２）を計測し、前記Ｔ２をＴ１とする。

【００２６】この方法によると、試料液が各電極に接触
したことを電気的信号の変化から容易に検知することが
でき、かつ、Ｔ２をＴ１として用い、Ｔ２に基づいて試
料液の供給状態を容易かつ確実に判別することができ、
試料液が適切に供給された場合のみ、基質濃度定量工程
が実施されるので、高精度でばらつきの少ない測定を行
うことができる。

【００２７】また、本発明による基質濃度定量法は、少
なくとも工程（Ｄ）の前に、作用極と対極間に電圧を印
加する工程を有し、かつ少なくとも工程（Ｅ）の前に、
前記作用極と液絡検知電極間、または前記対極と前記液
絡検知電極間に電圧を印加する工程を有することが好ま
しい。

【００２８】また、少なくとも工程（Ｄ）の前に、作用
極、対極及び液絡検知電極に電位を印加する工程を有し
ていてもよい。このようにすると、電圧または電位を印
加する工程が少なくなり、工程数を低減することができ
る。

【００２９】本発明の基質濃度定量法において、作用
極、対極及び液絡検知電極が同一基板上に配置されてい
るバイオセンサを用いても良い。

【００３０】また、作用極及び対極が、空間部を介して
相互に対向する位置に配置されているバイオセンサを用
いても良い。

【００３１】また、試薬層及び液絡検知電極が、空間部
を介して相互に対向する位置に配置されているバイオセ
ンサを用い、対極と前記液絡検知電極間の電流値を測定
することにより妨害物質の検知を行う工程を有すること
が好ましい。ここで、妨害物質とは、基質濃度定量工程
において、作用極または対極上で電気化学的に反応する
ことにより、応答電流値に影響を与えて基質濃度の測定
結果に誤差を生じさせる物質のことであり、例えば、ア
スコルビン酸、尿酸等の易酸化性物質が挙げられる。こ
のようにすると、試料液中の基質と試薬層中の酵素及び
電子伝達体との反応により生じた反応物質が液絡検知電
極に到達する前に、試料液が液絡検知電極に接触するの
で、試料液が液絡検知電極に接触してから、前記反応物
質が液絡検知電極に到達するまでの間に、対極と液絡検
知電極間の電流値を測定することにより、容易に妨害物
質の検知を行うことができる。従って、試薬層妨害物質
検知用に新たに電極を追加することなく、測定結果から
妨害物質の影響を除くことができるので、センサ構成を
複雑にしたり製造工程を煩雑にしたりすることなく、高
精度な基質濃度の定量を行うことができる。

【００３２】また、液絡検知電極が参照極として機能す
ることが好ましい。このようにすると参照極用に新たに
電極を追加することなく、作用極の電位を安定させるこ
とができるため、センサ構成を複雑にしたり製造工程を
煩雑にしたりすることなく、基質濃度に対して良好な直
線性を有する応答電流値が得られるので、高精度な基質
濃度の定量を行うことができる。

【００３３】本発明において、試薬層に含有される酵素
としては、試料液に含まれる基質に応じて適切なものが
選択される。酵素としては、例えば、フルクトースデヒ
ドロゲナーゼ、グルコースオキシダーゼ、アルコールオ
キシダーゼ、乳酸オキシダーゼ、コレステロールオキシ
ダーゼ、キサンチンオキシダーゼ、アミノ酸オキシダー
ゼなどがあげられる。

【００３４】また、電子伝達体としては、フェリシアン
化カリウム、ｐ−ベンゾキノン、フェナジンメトサルフ
ェート、メチレンブルー、フェロセン誘導体などがあげ
られる。また、酸素を電子伝達体とした場合にも電流応
答が得られる。電子伝達体は、これらの一種または二種
以上が使用される。

【００３５】

【実施例】以下、本発明の実施例を、図１〜３を用いて
説明する。図１〜３は本発明の実施例におけるグルコー
スセンサの試薬層を除去した状態の分解斜視図である。

【００３６】（実施例１）バイオセンサの一例として、
グルコースセンサについて説明する。本実施例では図１
に示すグルコースセンサを使用した。このグルコースセ
ンサは、ポリエチレンテレフタレートからなる絶縁性の
基板１と、カバー９と、基板１およびカバー９の間に挟
まれるスペーサ１０とを有する。これらは図１の中の一
点鎖線で示すような位置関係をもって接着されてグルコ
ースセンサが構成される。

【００３７】スペーサ１０には試料液供給口１１が形成
され、また、カバー９には空気孔１２が形成されてい
る。基板１上にスペーサ１０を介してカバー９を積層接
着すると、基板１、スペーサ１０及びカバー９によって
試料液供給口１１に通じる空間部（図示しない）が形成
され、空間部の終端部は空気孔１２に連通する。

【００３８】基板１には、作用極５、対極８、及び液絡
検知電極７が設けられ、さらにこれらに電気接続される
リード２、３、４が設けられている。作用極５は、リン
グ状の対極８の内側に配置されている。液絡検知電極７
は、作用極５及び対極８よりも試料液供給口１１から離
れた位置に配置されている。

【００３９】上記グルコースセンサは以下のようにして
作製した。

【００４０】ポリエチレンテレフタレートからなる絶縁
性の基板１上に、スクリーン印刷により銀ペーストを印
刷しリード２、３、４をそれぞれ形成した。次に、樹脂
バインダーを含む導電性カーボンペーストを基板１上に
印刷して作用極５を形成した。作用極５はリード２と接
触している。

【００４１】次に、その基板１上に、絶縁性ペーストを
印刷して絶縁層６を形成した。絶縁層６は、作用極５の
外周部を覆っており、これによって作用極５の露出部分
の面積は一定に保たれる。絶縁層６は、リード２、３、
４の一部を覆っている。リード３の先端を露出させるこ
とにより、液絡検知電極７を形成した。

【００４２】次に、樹脂バインダーを含む導電性カーボ
ンペーストをリード４と接触するように基板１上に印刷
して対極８を形成した。

【００４３】次に、作用極５及び対極８上にカルボキシ
メチルセルロース（以下、ＣＭＣと略称する）水溶液を
滴下し、乾燥させることでＣＭＣ層を形成した。さら
に、ＣＭＣ層上に、酵素としてＧＯＤ、電子伝達体とし
てフェリシアン化カリウムを含有する水溶液を滴下し、
乾燥させることで試薬層を形成した。

【００４４】次に、上記試薬層上に、試料液の試薬層へ
の供給をより一層円滑にするために、レシチンのトルエ
ン溶液を、試料液供給口１１から試薬層上にわたって広
げ、乾燥させることでレシチン層を形成した。なお、レ
シチン層を形成するためにトルエンを用いたが、他の有
機溶媒を用いてもよい。次に、基板１に、カバー９及び
スペーサ１０を図１中の一点鎖線で示すような位置関係
をもって接着してグルコースセンサを作製した。

【００４５】このグルコースセンサを測定器（図示せ
ず）に装着し、まず、作用極５と対極８間に５００ｍＶ
の電圧を印加した。次にこのセンサに、試料液としてグ
ルコース濃度定量に十分な量の血液を試料液供給口１１
より供給した。毛管現象により血液が空間部に導入さ
れ、血液が作用極５まで達して作用極５に接触すると、
測定器が、作用極５と対極８間における電気的信号の変
化として、電気抵抗値の変化を検知した。この変化の検
知と同時に測定タイマーが始動し、次に、作用極５と液
絡検知電極７間に５００ｍＶの電圧を印加した。作用極
５、対極８に引き続き、血液が液絡検知電極７にまで到
達して液絡検知電極７に接触すると、作用極５と液絡検
知電極７間の電気抵抗値に変化が生じ、その変化を測定
器で検知した。ここで、測定タイマーが始動してから作
用極５と液絡検知電極７間の電気抵抗値に変化が生じる
までの時間（以下、Ｔ２と略称する）を、測定タイマー
により計測した。

【００４６】この試料供給検知工程に引き続き、基質濃
度定量工程を実施した。作用極５と液絡検知電極７間に
おける電気抵抗値の変化を検知してから２５秒経過後に
５００ｍＶの電位を作用極５に印加し、５秒後に作用極
５と対極８間の電流値を測定した。血液中のグルコース
と、試薬層から溶解したフェリシアン化イオン及びＧＯ
Ｄが反応し、その結果、グルコースがグルコノラクトン
に酸化され、フェリシアン化イオンがフェロシアン化イ
オンに還元される。このフェロシアン化イオンを作用極
５において酸化することで電流応答が得られる。その結
果、試料液中のグルコース濃度に依存した応答電流値が
得られた。

【００４７】電極配置、測定環境（温度、湿度等）、血
液性状（ヘマトクリット値、粘度等）の個人差等にもよ
るが、十分な量の血液が供給された場合、試料液が作用
極及び対極に接触してから、試料液が液絡検知電極に接
触するまでの時間（以下、Ｔ１と略称する）は長くても
１〜２秒程度である。またここで、Ｔ２はＴ１とほぼ等
しいとみなすことができる。そこで、Ｔ２が２秒以下の
場合に得られた定量結果と、Ｔ２が２秒を超えた場合に
得られた定量結果とを比較したところ、Ｔ２が２秒以下
の場合に得られた結果では、測定値の精度、ばらつきが
大幅に抑制されていた。Ｔ２が２秒を超えた場合は、１
回の試料供給で十分な量の試料が供給されなかった場
合、または試料量不足を補うため再度試料の供給を実施
した場合が考えられ、これにより定量結果に影響が生じ
たものと考えられる。

【００４８】このような試料量不足による測定誤差を軽
減するために、Ｔ２を計測する工程の後に、Ｔ２が２秒
以下の場合には以降の基質濃度定量工程を実施し、Ｔ２
が２秒よりも大きい場合には中止するように判断する工
程を測定器に組み込み、同様の測定を行った。その結
果、１回で十分な量の試料が供給された場合のみ測定が
実施されるようになったため、測定誤差は大幅に軽減さ
れた。

【００４９】（実施例２）本実施例では、実施例１と同
様のグルコースセンサを使用した。

【００５０】このグルコースセンサを測定器に装着し、
対極８を基準にして、作用極５と対極８間に５００ｍ
Ｖ、対極８と液絡検知電極７間に５００ｍＶの電圧を印
加した。次にこのセンサに、試料液としてグルコース濃
度定量に十分な量の血液を試料液供給口１１より供給し
た。毛管現象により血液が空間部に導入され、血液が作
用極５に達すると、測定器が作用極５と対極８間におけ
る電気抵抗値の変化を検知し、それと同時に測定タイマ
ーが始動した。作用極５、対極８に引き続き、血液が液
絡検知電極７にまで到達して液絡検知電極７に接触する
と、作用極５と液絡検知電極７間の電気抵抗値に変化が
生じ、その変化を測定器で検知した。ここで、測定タイ
マーが始動してから作用極５と液絡検知電極７間の電気
抵抗値に変化が生じるまでの時間（Ｔ２）を、測定タイ
マーにより計測した。

【００５１】この試料供給検知工程に引き続き、基質濃
度定量工程を実施した。対極８と液絡検知電極７間にお
ける電気的信号の変化を検知してから２５秒経過後に５
００ｍＶの電位を作用極５に印加し、５秒後に作用極５
と対極８間の電流値を測定した。その結果、実施例１と
同様に、試料液中のグルコース濃度に依存した応答電流
値が得られた。

【００５２】実施例１と同様に、Ｔ２が２秒以下の場合
に得られた定量結果と、Ｔ２が２秒を超えた場合に得ら
れた定量結果とを比較したところ、Ｔ２が２秒以下の場
合に得られた結果では、測定値の精度、ばらつきが大幅
に抑制されていた。

【００５３】そこで、Ｔ２を計測する工程の後に、Ｔ２
が２秒以下の場合には以降の基質濃度定量工程を実施
し、Ｔ２が２秒よりも大きい場合には中止するように判
断する工程を測定器に組み込み、同様の測定を行った。
その結果、１回で十分な量の試料が供給された場合のみ
測定が実施されるようになったため、実施例１と同様
に、測定誤差は大幅に軽減された。

【００５４】（実施例３）本実施例では、図２に示すグ
ルコースセンサを用いた。

【００５５】ポリエチレンテレフタレ−トからなる絶縁
性の基板１上に、パラジウムからなる電極及びリードを
形成した。次に、試料供給口１１を有するスペーサ１０
を、図２中の一点鎖線で示すような位置関係をもって基
板１に接着し、作用極５、対極８、液絡検知電極７及び
リード２、３、４を区画した。区画内に実施例１と同様
に試薬層を作製した後、空気孔１２を有するカバー９を
貼り合わせることで、グルコースセンサを作製した。

【００５６】実施例１と同様に、試料供給検知工程及び
基質濃度定量工程により、血液中のグルコース濃度の測
定を行った結果、実施例１と同様の効果が得られ、Ｔ２
に基づいた判別を行うことで試料量不足による測定誤差
は大幅に抑制された。

【００５７】なお、本実施例におけるグルコースセンサ
の場合、試料供給口１１より供給された試料液は対極
８、作用極５を順次経て、最後に液絡検知電極７へと到
達するように各電極が配置されているが、これに限定さ
れず、対極８と作用極５の配置が逆で、作用極、対極、
液絡検知電極の順に試料が到達する場合においても、同
様の結果が得られた。

【００５８】（実施例４）本実施例では、図３に示すグ
ルコースセンサを用いた。

【００５９】ポリエチレンテレフタレ−トからなる絶縁
性の作用極基板１３上に、スクリ−ン印刷により銀ペー
ストを印刷し、リ−ド２を形成した。ついで、樹脂バイ
ンダーを含む導電性カーボンペーストを作用極基板１３
上に印刷して作用極５を形成した。この作用極５は、リ
−ド２と接触している。さらに、作用極基板１３上に、
絶縁性ペ−ストを印刷して絶縁層６を形成した。絶縁層
６は、作用極５の外周部を覆っており、これにより作用
極５の露出部分の面積を一定に保っている。

【００６０】同様の手順にて、絶縁性の対極基板１４上
に対極８及び液絡検知電極７を形成した。

【００６１】実施例１と同様にして作用極５上に試薬層
を作製した後、作用極基板１３、空気孔１２を備えた対
極基板１４及びスペーサ１０を図３中の一点鎖線で示す
ような位置関係をもって接着し、バイオセンサを作製し
た。スペーサ１０には、両基板間に試料液供給路を形成
するためのスリットが設けてある。試料供給口１１は、
その試料供給路の開口部に相当する。

【００６２】次いで、血液中のグルコースの測定を行っ
た。まず、作用極５と対極８間に５００ｍＶの電圧を印
加した。次にこのセンサに、試料液として、妨害物質で
あるアスコルビン酸を含むグルコース濃度定量に十分な
量の血液を試料液供給口１１より供給した。毛管現象に
より血液が空間部に導入され、血液が作用極５に達して
作用極５に接触すると、測定器が作用極５と対極８間に
おける電気抵抗値の変化を検知した。この電気抵抗値変
化の検知と同時に測定タイマーが始動し、次に、作用極
５と液絡検知電極７間に５００ｍＶの電圧を印加した。
作用極５、対極８に引き続き、血液が液絡検知電極７に
まで到達して液絡検知電極７に接触すると、作用極５と
液絡検知電極７間の電気抵抗値に変化が生じ、その変化
を測定器で検知した。ここで、測定タイマーが始動して
から作用極５と液絡検知電極７間の電気抵抗値に変化が
生じるまでの時間（Ｔ２）を、測定タイマーにより計測
した。次に、このＴ２が２秒以下であったことから以降
の基質濃度定量工程行うことを決定した。

【００６３】次に、作用極５と液絡検知電極７間の電気
抵抗値変化を検知するのとほぼ同時に、液絡検知電極７
と対極８間に５００ｍＶの電圧を１００ミリ秒間印加
し、両電極間の電流値（以下、Ｉ１と略称する）を測定
した。Ｉ１は、妨害物質として含まれるアスコルビン酸
の酸化反応に起因し、その濃度に対して比例関係を与え
た。Ｉ１の測定後、液絡検知電極７と対極８間の電圧印
加を解除した。

【００６４】上述したように、液絡検知電極７は、試薬
層が配置されていない対極基板１４上に配置されてい
る。よって、酵素反応の結果生成したフェロシアン化イ
オンが液絡検知電極７近傍に到達するまでには、若干の
時間を必要とする。すなわち、フェロシアン化イオン到
達までの時間内における液絡検知電極７と対極８間の電
流値Ｉ１は、主にアスコルビン酸の濃度のみを反映す
る。

【００６５】Ｉ１を測定してから約２５秒経過後に、５
００ｍＶの電位を作用極５に印加し、５秒後の応答電流
値Ｉ２を測定した。この応答電流値Ｉ２は、試料中のグ
ルコース濃度に比例するフェロシアン化イオンと、試料
中にあらかじめ存在するアスコルビン酸の酸化反応に起
因する。すなわち、アスコルビン酸が測定結果に正の誤
差を与えることとなる。そこで、電流値Ｉ１に基づいて
応答電流値Ｉ２を補正することにより得られた電流値Ｉ
３より、アスコルビン酸の影響を除去し正確なグルコー
ス濃度を求めることができる。

【００６６】本実施例によれば、液絡検知電極７が妨害
物質検知電極としても機能することにより、妨害物質の
影響を補正することができるので、妨害物質検知用に新
たに電極を追加することなく、より高精度な基質の測定
が可能となった。

【００６７】（実施例５）実施例４と同様のグルコース
センサを用い、実施例４と同様の手順にて、血液中のグ
ルコースの測定を行った。但し、作用極５と対極８間の
応答電流値を得るために電位印加を行う際、液絡検知電
極７を基準にして、７００ｍＶの電位を作用極５に印加
し、２００ｍＶの電位を対極８に印加した。すなわち、
液絡検知電極７を参照極として用いた三電極式での測定
を行った。

【００６８】その結果、作用極５の電位が安定したこと
により電位摂動の影響が抑制されたため、グルコース濃
度に対する応答電流値の直線性が向上した。

【００６９】本実施例によれば、液絡検知電極７は、妨
害物質検知電極及び参照極としての併用ができるので、
妨害物質検知電極または参照極用として新たに電極を追
加することなく、より高精度な基質の測定が可能となっ
た。

【００７０】なお、上記の実施例において、試料液検
知、妨害物質検知及び基質濃度定量のために電極系へ印
加する電位または電圧値を記載したが、これに限定され
ることはない。試料液検知の際には電気的信号の変化が
観察される電位または電圧、妨害物質検知の際には妨害
物質が電極上で反応する電位または電圧、また基質濃度
定量の際には一連の反応の結果生じた電子伝達体の還元
体が酸化される電位または電圧であればよい。

【００７１】また、基質濃度定量工程の実施または中止
を判断する工程において、Ｔ２と比較する時間を２秒に
設定しているが、これに限定されることはない。Ｔ２
は、電極間距離、試料の粘度、温度等を因子とする値で
あり、これらの因子に応じて適切な時間が設定される。
また、電流値を測定する時間についても、実施例に記載
の特定値に限定されることはない。

【００７２】実施例１及び実施例３〜５では、試料液が
液絡検知電極に接触したことを確認するために、作用極
と液絡検知電極間に電圧を印加し、作用極と液絡検知電
極間の電気的信号の変化を検知したが、これに代えて、
対極と液絡検知電極間に電圧を印加し、対極と液絡検知
電極間の電気的信号の変化を検知してもよい。また、実
施例２では、試料液が液絡検知電極に到達したことを確
認するために、作用極と液絡検知電極間の電気的信号の
変化を検知したが、これに代えて、対極と液絡検知電極
間の電気的信号の変化を検知してもよい。

【００７３】また、上記実施例では、試料液が各電極に
接触したことを確認するために、電気的信号として、電
気抵抗値の変化を検知したが、これに限定されず、電流
値、電極電位、容量成分等の変化を検知してもよい。

【００７４】上記実施例では、センサ構造の例を図示し
たが、電極及びリードの形状、電極及びリードの配置、
センサ部材の組み合わせ方法等はこれらに限定されるも
のではない。

【００７５】また、上記実施例では、電極材料としてカ
ーボンまたはパラジウムについて述べたが、これに限定
されることはない。作用極材料としては、電子伝達体を
酸化する際にそれ自身が酸化されない導電性材料であれ
ば使用できる。また、対極材料としては、銀、白金等の
一般的に用いられる導電性材料であれば使用できる。ま
た電極系の作製法もスクリーン印刷法、スパッタリング
法に限定されず、蒸着法等、他の手法にて作製された電
極系でも使用できる。

【００７６】また、試薬層を作用極に固定化することに
よって、酵素や電子伝達体を不溶化させてもよい。固定
化する場合は、架橋固定法あるいは吸着法が好ましい。
また、酵素や電子伝達体を電極材料中に混合させてもよ
い。

【００７７】

【発明の効果】以上のように本発明によると、試料液の
供給状態を容易かつ確実に判別することができ、高精度
で、ばらつきが少ない基質濃度定量法を提供することが
できる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の一実施例におけるグルコースセンサの
試薬層を除去した状態の分解斜視図

【図２】本発明の他の実施例におけるグルコースセンサ
の試薬層を除去した状態の分解斜視図

【図３】本発明のさらに他の実施例におけるグルコース
センサの試薬層を除去した状態の分解斜視図

【符号の説明】

１基板２，３，４リ−ド５作用極６絶縁層７液絡検知電極８対極９カバー１０スペーサ１１試料液供給口１２空気孔１３作用極基板１４対極基板

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】作用極、対極、液絡検知電極、少なくとも
酵素及び電子伝達体を包含する試薬層、並びに試料液供
給口を備え、前記液絡検知電極が、前記作用極及び前記
対極よりも前記試料液供給口から離れた位置に配置され
ているバイオセンサを用い、前記作用極に前記電子伝達
体を酸化する電位を印加する工程（Ａ）及び前記作用極
と前記対極間の電流値を測定する工程（Ｂ）を有する基
質濃度定量工程において得られた前記電流値に基づいて
試料液中の基質濃度を定量する基質濃度定量法であっ
て、少なくとも、前記試料液供給口から前記試料液を供
給する工程（Ｃ）、前記試料液が前記作用極及び前記対
極に接触したことを検知する工程（Ｄ）、前記試料液が
前記液絡検知電極に接触したことを検知する工程
（Ｅ）、前記試料液が前記作用極及び前記対極に接触し
てから、前記試料液が前記液絡検知電極に接触するまで
の時間（Ｔ１）を計測する工程（Ｆ）、前記Ｔ１に基づ
いて前記基質濃度定量工程の実施または中止を決定する
工程（Ｇ）、及び前記決定に基づいて前記基質濃度定量
工程を実施または中止する工程（Ｈ）を含むことを特徴
とする基質濃度定量法。
【請求項２】工程（Ｄ）において、作用極と対極間の電
気的信号の変化により、試料液が前記作用極及び前記対
極に接触したことを検知し、工程（Ｅ）において、前記
作用極と液絡検知電極間、または前記対極と前記液絡検
知電極間の電気的信号の変化により、前記試料液が前記
液絡検知電極に接触したことを検知し、工程（Ｆ）にお
いて、前記作用極と前記対極間の電気的信号の変化を検
知してから、前記作用極と前記液絡検知電極間、または
前記対極と前記液絡検知電極間の電気的信号の変化を検
知するまでの時間（Ｔ２）を計測し、前記Ｔ２をＴ１と
することを特徴とする、請求項１記載の基質濃度定量
法。
【請求項３】少なくとも工程（Ｄ）の前に、作用極と対
極間に電圧を印加する工程を有し、かつ少なくとも工程
（Ｅ）の前に、前記作用極と液絡検知電極間、または前
記対極と前記液絡検知電極間に電圧を印加する工程を有
することを特徴とする、請求項２記載の基質濃度定量
法。
【請求項４】少なくとも工程（Ｄ）の前に、作用極、対
極及び液絡検知電極に電位を印加する工程を有すること
を特徴とする、請求項２記載の基質濃度定量法。
【請求項５】作用極、対極及び液絡検知電極が同一基板
上に配置されているバイオセンサを用いることを特徴と
する、請求項１〜４のいずれかに記載の基質濃度定量
法。
【請求項６】作用極及び対極が、空間部を介して相互に
対向する位置に配置されているバイオセンサを用いるこ
とを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の基質
濃度定量法。
【請求項７】試薬層及び液絡検知電極が、空間部を介し
て相互に対向する位置に配置されているバイオセンサを
用い、対極と前記液絡検知電極間の電流値を測定するこ
とにより妨害物質の検知を行う工程を有することを特徴
とする、請求項１〜６のいずれかに記載の基質濃度定量
法。
【請求項８】液絡検知電極が参照極として機能すること
を特徴とする、請求項１〜７のいずれかに記載の基質濃
度定量法。