ITMI962313A1

ITMI962313A1 - Procedimento per la separazione e purificazione di fsh e lh

Info

Publication number: ITMI962313A1
Application number: IT96MI002313A
Authority: IT
Inventors: Paolo Lualdi; Elisabetta Donati; Irina Rapaport
Original assignee: Ibsa Inst Biochimique Sa
Priority date: 1996-11-07
Filing date: 1996-11-07
Publication date: 1998-05-07
Also published as: ATE236931T1; PT882064E; CA2242325A1; DE69720693T2; IL125225A; ES2196380T3; IT1287138B1; AU719560B2; WO1998020039A1; DE69720693D1; AU5316298A; ITMI962313A0; IL125225A0; EP0882064A1; EP0882064B1; CA2242325C

Description

Domanda di brevetto per Invenzione Industriale dal titolo:

"Procedimento per la separazione e la purificazione di FSH e LH."

CAMPO DELL’INVENZIONE

La presente invenzione si riferisce ad un nuovo procedimento, particolarmente semplice ed economico, per la separazione e la purificazione di FSH e LH a partire da HMG grezzo, ed in particolare da concentrati di urine di donne in menopausa o postmenopausa.

STATO DALLA TECNICA

Follicle Stimulating Hormone (FSH) e Luteinizing Hormone (LH) sono comunemente noti come ormoni gonadotropi o ormoni della fertilità umana. Tali composti, il cui effetto fisiologico primario è diretto alla promozione della gametogenesi e/o alla produzione degli steroidi coinvolti in tale processo biologico, sono abbondantemente presenti in natura nelle ghiandole pituitarie e nel plasma umani ed animali, nonché nelle urine di donne in menopausa o post-menopausa.

Gli ormoni FSH e LH vengono recuperati da tali fonti naturali sotto forma di una miscela, comunemente nota come HMG (Human Menopausal Gonadotropin) , disponibile sul marcato anche come estratto grezzo; tale miscela comprende FSH e LH in rapporto di circa 1:1, insieme ad altre proteine urinarie. Tuttavia, tali estratti presentano bassi gradi di purezza, incompatibili con la loro somministrazione nell'uomo a scopi terapeutici, soprattutto a causa della contaminazione di proteine estranee.

Allo scopo di ridurre le suddette contaminazioni proteiche, sono stati sviluppati nello stato dell'arte diversi procedimenti di purificazione di FSH e LH, basati essenzialmente su tecniche di centrifugazione, precipitazione, cromatografia e filtrazione, a partire da prodotti di origine naturale ghiandole pituitarie, plasma o urine).

Il brevetto americano US 3.674,865 descrive la purificazione di FSH da estratti urinari; tale procedimento, comprendente ben 21 stadi differenti, porta sempre all'ottenimento di una miscela di FSH e LH, in rapporto variabile da 3:1 a 6:1.

Il brevetto americano US 3.973.004 (estratto Derwent) descrive la separazione di FSH dalle ghiandole pituitarie, per precipitazione selettiva con ammonio solfato, mentre il brevetto US 4,115,375 (estratto Claims U.S. Patent) utilizza come agente precipitante polietilenglicol .

Tuttavia, i suddetti procedimenti presentano l'inconveniente di condurre all'ottenimento di prodotti ad attività specifica e purezza non soddisfacenti. In particolare, la presenza di contaminazioni proteiche provoca l'insorgenza di reazioni allergiche, che permettono l'assunzione dei suddetti ormoni solo mediante particolari vie di somministrazione, quali le iniezioni intramuscolari, con notevoli difficoltà di applicazione.

Più recentemente sono stati messi a punto dei processi di purificazione che utilizzano tecniche di cromatografia di iramunoaffinità e specifici anticorpi monoclonali (brevetto europeo EP 0 322 438; domanda di brevetto europeo EPA 0 328 248, estratto Derwent) o tecniche di DNA ricombinante (domanda di brevetto internazionale WO 85/01958). Tali procedimenti, nonostante consentano di ottenere prodotti ad elevata attività specifica, presentano il grave problema di possibili contaminazioni da parte di virus, proteine eterologhe e residui di DNA della cellula ospite; pertanto, prima dell'uso terapeutico, i prodotti ottenuti con tali processi devono essere accuratamente purificati e sottoposti a controlli volti a verificare l'assenza di possibili contaminanti.

E' quindi evidente la necessità di poter disporre di un processo che consenta l'ottenimento di prodotti a maggiore purezza ed attività specifica, senza incorrere negli inconvenienti sopra descritti.

SOMMARIO

Oggetto della presente invenzione è un procedimento di separazione e purificazione di FSH e LH, a partire da HMG grezzo, che consente l'ottenimento di tali ormoni ad elevata purezza ed attività specifica. Detto procedimento comprende i seguenti stadi:

1) eventuale devirazione di detto HMG grezzo in una soluzione acquosa di EtOH 80-90% v/v;

2) caricamento del prodotto ottenuto allo stadio (1) su una colonna cromatografica a scambio ionico, con resina anionica debolmente basica di tipo DEAE, eluendo selettivamente gli ormoni LH e FSH con soluzioni acquose di EtOH ^-15% v/v in tampone fosfato 10-50 mM, contenenti NaCl 0-70 mM a forza ionica crescente, a pH 7,0-8,0;

3) caricamento dell'eluato ottenuto allo stadio (2), contenente l'ormone LH o FSH, su una colonna cromatografica di affinità avente come ligante un derivato antrachinonico su supporto inerte, eluendo selettivamente le proteine contaminanti e l'ormone FSH o LH con soluzioni a pH alcalino, a forza ionica crescente da 0 a 3 M di KC1;

4) eventuale caricamento dell'ormone FSH, ottenuto allo stadio (3), su una colonna cromatografica a scambio ionico con resine anioniche fortemente basiche, contenenti gruppi ammonio quaternari, eluendo selettivamente le proteine contaminanti e FSH con soluzioni di NaCl 0-400 mM a forza ionica crescente, a pH alcalino.

Gli ormoni FSH ed LH, ottenuti dai suddetti stadi (3) o (4) possono venire successivamente depirogenati e liofilizzati o congelati.

DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL'INVENZIONE

Le caratteristiche ed i vantaggi del procedimento secondo la presente invenzione saranno maggiormente illustrati nel corso della seguente descrizione dettagliata.

Il procedimento dell'invenzione, mediante una semplice estrazione ed agevoli stadi di purificazione su resine a scambio ionico e di affinità, consente di ottenere FSH e LH ad elevata attività specifica, nonché elevata purezza, tali da renderne possibile la somministrazione nell'uomo a scopi terapeutici, senza necessità di ulteriori trattamenti di purificazione. Tale procedimento è particolarmente semplice ed economico e presenta il vantaggio di utilizzare quantità molto limitate di solventi organici, essendo prevalentemente condotto in ambiente acquoso.

HMG grezzo di partenza è preferibilmente costituito da un concentrato urinario, ottenuto da urine di donne in menopausa o post-menopausa; secondo una forma preferita di realizzazione dell'invenzione, detto HMG di partenza presenta un'attività specifica di FSH inferiore a 10 U.I./mg, ed ancora più preferibilmente compresa tra 2 e 10 U.I./mg, ed un'attività specifica di LH compresa tra 0,5 e 5 U.I./mg.

Nello stadio (1) del procedimento dell'invenzione, detto HMG grezzo viene sospeso in una soluzione acquosa di EtOH 80-90% v/v, preferibilmente ad una temperatura compresa tra -20“C e 5°C, per un tempo compreso tra 1 e 4 ore.

Tale trattamento viene condotto allo scopo di ottenere la devirazione dell'HMG grezzo, essenziale per qualsiasi impiego in campo farmaceutico dopo purificazione.

Nello stadio (2) del procedimento dell'invenzione, il residuo solido eventualmente devirato nello stadio (1) viene solubilizzato in una soluzione acquosa di EtOH al 5"15% v/v in tampone fosfato 5-50 mM, e preferibilmente contenente sodio fosfato 10-30 mM, a pH 7.3~7T6, ad una temperatura compresa tra 0°C e 8°C, e preferibilmente tra 0 e 6°C.

La soluzione così ottenuta viene caricata su una colonna cromatografica a scambio ionico, con resina anionica debolmente basica tipo DEAE, preferibilmente ad una temperatura di 0-8°C, utilizzando preferibilmente un tampone di condizionamento costituito da una soluzione acquosa di EtOH al 5-15% v/v, contenente in tampone fosfato 5"50 mM, preferibilmente contenente sodio fosfato 10-30 mM, a pH 7.3-7.6·

Detta resina anionica presenta preferibilmente dei gruppi amminici terziari, eventualmente anche in presenza di gruppi ammonio quaternari, su matrice di cellulosa, ed ancora più preferibilmente è DEAE-cellulosa (ad esempio DE52 Whatman).

Si opera preferibilmente ad una velocità di flusso pari a 10-30 ml/cmq-ora, con un rapporto diametro/altezza della colonna variabile da 0,3 a 0,6, con un carico di proteine totali variabile da 20 a 50 mg/ml di resina.

L'ormone LH, adsorbito sulla resina, viene preferibilmente eluito con una soluzione acquosa di EtOH 5—15% v/v in tampone fosfato 10-50 mM, preferibilmente contenente sodio fosfato 10-30 mM, a pH 7.3“7.6. Detta eluizione, che conduce al recupero del solo LH, viene preferibilmente condotta ad una temperatura di 0-8°C.

L'ormone FSH, adsorbito sulla resina, viene eluito successivamente con una soluzione acquosa di EtOH 5-15% v/v in tampone fosfato 10-50 mM, preferibilmente contenente sodio fosfato 10-30 mM, a pH 7.3“7.6, contenente NaCl in concentrazioni variabili da 30 a 50 mM, Tale eluizione viene preferibilmente effettuata ad una temperatura di 0-8°C.

La presenza di EtOH nelle soluzioni tampone di eluizione gioca un ruolo determinante in tale stadio, in quanto consente di ottenere una migliore separazione di LH e FSH, nonché delle rese più elevate nel recupero dei due ormoni.

Nello stadio (3) del procedimento dell'invenzione, gli eluati contenenti gli ormoni LH e FSH, ottenuti allo stadio (2), vengono ulteriormente purificati separatamente, mediante cromatografia di affinità contenente come ligante un derivato antrachinonico, preferibilmente Cibacron Blue, covalentemente legato ad un supporto inerte, preferibilmente agarosio; viene preferibilmente utilizzata una colonna cromatografica di affinità costituita da Agarose Blue.

Detti eluati vengono preferibilmente acidificati fino a pH 5.5-7.5 e caricati sulla suddetta colonna, previamente condizionata in tampone acetato 10-30 mM, preferibilmente contenente sodio acetato, a pH 5.5“7.5. ad una temperatura compresa tra 0 e 8°C.

Si opera preferibilmente ad una velocità di flusso di 7-14 ml/cmq-ora, con un rapporto diametro/altezza della colonna variabile da 0,5 a 0,9. con un carico di proteine totali variabile da 5 a 15 mg/ml di resina.

L'ormone FSH o LH, adsorbito sulla colonna, viene quindi eluito selettivamente rispetto alle proteine contaminanti con uno o più tamponi glicina-NaOH 40-60 mM, contenenti KC1 in concentrazioni comprese tra 0 e 3 M, eventualmente di forza ionica crescente, variando il pH da 8,5 a 11.

Gli ormoni così ottenuti possono venire quindi concentrati e desalificati per essere poi congelati o liofilizzati, secondo procedure note nello stato della tecnica.

Secondo un modo preferito di realizzazione del procedimento dell'invenzione, l'ormone LH desalificato viene liofilizzato e può essere successivamente sottoposto a depirogenazione, secondo procedure note nello stato della tecnica.

Secondo lo stadio (4), l'ormone FSH ottenuto allo stadio (3). dopo desalificazione, viene sottoposto ad un ulteriore stadio di purificazione mediante cromatografia a scambio ionico su resina anionica fortemente basica; detta resina presenta gruppi ammonio quaternari, eventualmente in associazione con gruppi amminici terziari, su matrice di cellulosa, ed è preferibilmente DE53 Whatman.

FSH viene preferibilmente equilibrato per dialisi in tampone Tris-HCl 10-50 mM, pH 9.0-9.5. e caricato su detta colonna, condizionata con lo stesso tampone. Si opera preferibilmente ad una velocità di flusso di 20-40 ml/cmq-ora, con un rapporto diametro/altezza della colonna variabile da 0,08 a 0,3. con un carico di proteine totali variabile da 0,5 a 10 mg/ml di resina. La colonna viene inizialmente eluita con una soluzione tampone Tris-HCl 10-50 mM, pH 9.0-9.5· contenente NaCl in concentrazione preferibilmente compresa tra 40 e 80 mM, ottenendo l'eluizione delle proteine contaminanti.

L'ormone FSH legato alla resina viene quindi successivamente eluito utilizzando un gradiente lineare di concentrazione di NaCl, variabile preferibilmente da 70-100 mM a 140-400 mM, in tampone Tris-HCl 10-50 mM, pH 9.0-9.5

L'ormone FSH purificato così ottenuto viene quindi desalificato per ultrafiltrazione, liofilizzato e depirogenato , secondo procedure note nello stato della tecnica.

Secondo un modo preferito di realizzazione dell'invenzione, la procedura di depirogenazione di LH e FSH ottenuti agli stadi (3) o (4) viene condotta come descritto di seguito: l'ormone purificato in forma di polvere liofilizzata viene disciolto, ad una temperatura compresa tra -15 e 0°C, in una soluzione acquosa di EtOH 30-50% v/v, contenente ammonio acetato 5-15% p/v. Alla soluzione viene quindi aggiunto sodio fosfato tribasico 3-8 mM e calcio acetato 3-8 ®M; il pH viene portato a valori compresi tra 8 e 10 con sodio idrato. Dopo centrifugazione, al supernatante ottenuto vengono aggiunti 1.5-2.5 volumi di EtOH assoluto per ogni volume di supernatante, ad una temperatura compresa tra -20 e 0°C. Il precipitato ottenuto dopo ulteriore centrifugazione viene ridisciolto in acqua e dializzato, secondo metodologie note nello stato della tecnica.

La soluzione contenente l'ormone LH o FSH purificato può essere infine congelata come tale oppure liofilizzata secondo metodologie note nello stato della tecnica, mantenendo inalterata l'attività degli ormoni stessi per lunghi periodi di conservazione .

Il procedimento dell'invenzione consente di ottenere FSH e LH ad elevatissima purezza, e rispettivamente FSH con attività specifica superiore a 6.000 U.I./mg, esente da LH, e LH con attività specifica superiore a 500 U.I./mg.

A scopo illustrativo ma non limitativo della presente invenzione, vengono riportati i seguenti esempi.

ESEMPIO 1: Purificazione di FSH da HMG urinario grezzo.

1.1 Devirazione di HMG grezzo in EtOH acquoso.

Tutte le operazioni di seguito riportate sono state condotte alla temperatura di 0-6’C, se non altrimenti specificato.

200g di HMG grezzo, ottenuto da urine di donne in post-menopausa, sono stati sospesi in 101 di una miscela di etanolo/acqua (85:15 v/v), alla temperatura di -10°C; la sospensione così ottenuta è stata mantenuta sotto agitazione per 3 ore, alla temperatura di -10°C , e quindi centrifugata a 7-000 rpm per 20 minuti, utilizzando un rotore GS3 Sorvall ; dopo eliminazione del supernatante, il precipitato è stato recuperato.

1.2 Cromatografia a scambio ionico su DE52.

Il precipitato ottenuto allo stadio 1.1 è stato disciolto in 21 di EtOH al 10%, contenente sodio fosfato 20 mM, pH 7,3- La soluzione così ottenuta è stata centrifugata a 7-000 rpm per 30 minuti, utilizzando un rotore GS3 Sorvall, ed il supernatante ottenuto è stato caricato in una colonna a scambio ionico DE52 Whatman (Rif. Cat. 4057910, 1995). a base di dietilamminoetilcellulosa, avente diametro di 14 cm e altezza di 36 cm, equilibrata in tampone sodio fosfato 20mM, pH 7.3. contenente il 10% v/v di EtOH. Nel corso della cromatografia, la colonna è stata eluita ad un flusso di 3 l/ora, raccogliendo l'eluato in frazioni di circa 700ml.

Dopo aver caricato il campione, la colonna è stata eluita in successione con:

a) 101 di EtOH 10% v/v, contenente sodio fosfato 20mM, pH = 7.3: b) 40 1 di EtOH 10% v/v, contenente sodio fosfato 20mM e sodio cloruro 40mM, pH = 7.3-Dopo cromatografia, per ogni frazione di eluato sono state determinate la densità ottica a 280 nm (0D280) e le attività di LH e FSH. La Figura 1 riporta il cromatogramma ottenuto, in cui sono illustrate le attività specifiche di LH e FSH (U.I./ml) e la densità ottica delle frazioni di eluato.

Da tale cromatogramma si evince che LH è stato eluito dalla soluzione tampone (a), mentre FSH è stato eluito dalla soluzione tampone (b), contenente NaCl 40 mM. In particolare, le frazioni 6-20, contenenti LH, sono state riunite ed ulteriormente purificate, come descritto all'Esempio 2; le frazioni 28-41, contenenti FSH, sono state riunite ed ulteriormente purificate come descritto di seguito.

1.3 Purificazione di FSH mediante cromatografia di affinità su Agarose Blue.

E' stata utilizzata la resina di affinità Agarose Blue 3 GA {Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo, catalogo Cl4l0, 1995); tale resina, prima di essere impacchettata in colonna per la cromatografia, è stata lavata con i seguenti reagenti:

- 101 di una soluzione di KC12,5M in Na2C0^ 0,53» per 1 ora; - 101 di una soluzione di Na2C0^ 0,5# per 30 minuti;

- 101 di una soluzione di urea 6M per 2 ore;

- 101 di H2O per 30 minuti;

- 101 di una soluzione di Na2C0^ 0,5# per 30 minuti;

- 101 di H2O per 30 minuti;

- 101 di tampone sodio acetato 50mM, pH = 6,5. per 30 minuti; - 101 di tampone sodio acetato 20mM, pH = 6,5. per 30 minuti. La resina, condizionata in tampone sodio acetato 20mM, pH 6,5, è stata impacchettata in una colonna cromatografica fino ad ottenere un letto di resina di diametro pari a 11 cm ed altezza pari a 16 cm.

Il campione contenente FSH, ottenuto allo stadio 1.2, è stato portato a pH 6,5 con acido acetico 1,7 M e caricato in colonna.

Il caricamento del campione in colonna e le successive eluizioni sono state effettuate ad un flusso di 1 l/ora. L'eluato ottenuto durante il caricamento del campione in colonna è stato raccolto in un’unica frazione, mentre successivamente sono state raccolte frazioni da circa 700 mi.

Dopo aver caricato il campione, la colonna è stata prima eluita in successione con:

- 11 di tampone sodio acetato 20mM, pH = 6,5;

- 51 di tampone glicina-NaOH 50mM, pH 10;

- 31 di tampone glicina-NaOH 50mM, KC10,2 M, pH = 9;

e quindi con un gradiente lineare di KC1 in tampone glicina-NaOH preparato come segue:

camera 1) 91 di KC10,3M in tampone glicina-NaOH 50mM, pH = 9; camera 2) 91 di KC12,5M in tampone glicina-NaOH 50mM, pH = 9· Dopo cromatografia, per ogni frazione di eluato sono state determinate la densità ottica 280 nm (0D280) e l'attività specifica di FSH (U.I./ml). La Figura 2 riporta il cromatogramma ottenuto.

Durante l'applicazione del campione (non riportata nel grafico), FSH è stato trattenuto in colonna mentre la maggior parte delle proteine contaminanti è stata rinvenuta nell'eluato. Molte delle proteine contaminanti trattenute dalla resina sono state eluite mediante i primi lavaggi e mediante il tampone contenente KC10,3 M, mentre in queste condizioni non è stata osservata l'eluizione di FSH.

La successiva eluizione (dalla frazione l4) con gradiente di KC1 ha condotto prima all'eliminazione di altre proteine contaminanti (circa frazioni 15-2.0)’, l'eluizione di FSH è avvenuta con picco simmetrico a concentrazioni più elevate di KC1 (frazioni 22-29)· Le frazioni 23-28 sono state quindi riunite; il campione ottenuto è stato portato a pH 7.5 con acido acetico 1,7M, concentrato e desalificato mediante ultrafiltrazione, utilizzando una cella Amicon dotata di membrana Amicon PM10.

1.4 Cromatografia a scambio ionico su DE53-Il campione di FSH, concentrato e desalificato come descritto allo stadio 1.3. è stato dializzato per 18 ore contro 5 1 di tampone Tris-HCl 25mM, pH 9.3. ed è stato quindi caricato su una colonna cromatografica a scambio ionico DE53 Whatman (Rif. Cat.

4058910, 1995). avente 2 cm di diametro e 18 cm di altezza, equilibrata con tampone Tris-HCl 25mM, pH 9.3- La colonna è stata eluita ad un flusso di 100 ml/ora e l'eluato è stato raccolto in frazioni da circa 18 mi.

Dopo aver caricato il campione, la colonna è stata prima eluita con 450 mi di tampone Tris-HCl 25 mM, pH 9.3. contenente NaCl 80 mM, e successivamente con un gradiente lineare di NaCl preparato come segue:

camera 1) 600 mi di NaCl 90mM in Tris-HCl 25 mM, pH 9.3; camera 2) 600 mi di NaCl 160 mM in Tris-HCl 25 mM. pH 9.3.

La Figura 3 illustra il cromatogramma ottenuto, in cui sono riportate la densità ottica a 280 nm (0D280) e l'attività specifica di FSH (U.I./ml) di ogni frazione di eluato. Dal cromatogramma si può osservare che il lavaggio con il primo eluente, contenente NaCl 80 mM, porta all’eliminazione di alcune proteine contaminanti, mentre FSH viene ritenuto in colonna. FSH viene invece eluito selettivamente rispetto alle proteine contaminanti mediante il gradiente di NaCl, utilizzato dalla frazione 30 in poi. Le frazioni 31-il0 sono state riunite, concentrate, desalificate utilizzando una cella Amicon provvista di membrana Amicon PM10 ed infine liofilizzate.

1.5 Depirogenazione di FSH.

109 mg di FSH liofilizzato, ottenuto allo stadio precedente, sono stati sciolti in 55 mi di una soluzione fredda di ammonio acetato al 10% (p/v) in etanolo 40% {v/v). Alla soluzione, mantenuta sotto agitazione magnetica alla temperatura di circa -10eC mediante bagno di ghiaccio e sale, sono stati quindi aggiunti: - 1,2 mi di una soluzione acquosa di sodio fosfato tribasico dodecaidrato al 7,6%;

- 1,4 mi di una soluzione acquosa di calcio acetato al 4,93⁄4-Dopo aver portato il pH a circa 8,5 con NaOH al 20% p/v, la soluzione è stata mantenuta sotto agitazione per 30 minuti, sempre alla temperatura di circa -10°C, ed è stata quindi centrifugata a 8.000 rpm in un rotore Sorvall SS34 per 30 minuti. Il precipitato è stato eliminato, mentre il supernatante raccolto (57 mi) è stato posto sotto agitazione e raffreddato a circa -10°C in un bagno di ghiaccio e sale.

Dopo aggiunta di 114 mi di EtOH al 95% v/v, previamente raffreddato a -20”C, la soluzione è stata mantenuta sotto agitazione per 30 minuti e poi lasciata a riposo per 12 ore, alla temperatura di -20°C.

Dopo centrifugazione a 8.000 rpm, per 30 minuti, in una centrifuga raffreddata a 0-4°C, il supernatante è stato eliminato ed il precipitato è stato ridisciolto in acqua apirogena (80 mi). La soluzione così ottenuta è stata dializzata per 18 ore contro 10 1 di acqua apirogena e quindi liofilizzata.

La Figura 4 riporta lo spettro di assorbimento di una soluzione contenente 1,1 mg/ml di FSH, purificato secondo il procedimento sopra riportato. L'attività di FSH così purificato, pari a 6.870 U.I./mg di proteine, è stata determinata con metodo immunoradiometrico, usando il kit Serono FSH Maiclone (Cat. Rif.

13101).

La concentrazione di proteine nell'FSH purificato è stata calcolata considerando che una soluzione acquosa contenente 1 mg/ml di FSH produce una densità ottica pari a 0,62 a 277 nm, in cuvette di quarzo aventi percorso ottico di 1 cm . Tale coefficiente è stato calcolato sperimentalmente nel corso delle preparazioni, determinando l'assorbimento a 277 nm in soluzioni contenenti quantità ponderate di ormone previamente liofilizzato, in assenza di sali. Per campioni di ormone purificato aventi attività specifica compresa tra 4.000 e 10.000 U.I./mg di FSH, tale coefficiente si è dimostrato più accurato di altri metodi di determinazione delle proteine.

La concentrazione proteica delle frazioni meno pure (ad esempio derivanti dallo stadio 1.2) è stata determinata con BCA Protein Assay Pierce (catalogo Pierce 23223 e 23224), utilizzando albumina di siero bovino come standard.

In Tabella 1 vengono riportati i dati relativi alla purificazione di FSH, effettuata come descritto agli stadi 1.1-1.5·

In Tabella 2 vengono riportati i risultati di ulteriori prove di purificazione di FSH, effettuate secondo le metodologie descritte all'Esempio 1.

ESEMPIO 2: Purificazione di LH da HMG urinario grezzo.

Gli stadi 2.1 e 2.2, relativi alla devirazione di HMG grezzo in EtOH acquoso ed alla cromatografia a scambio ionico su DE52, sono comuni per FSH e LH, e sono stati condotti come descritto ai punti 1.1. e 1.2 dell'Esempio 1.

2,3 Purificazione di LH mediante cromatografia di affinità su Agarose Blue.

La resina di affinità Agarose Blue Gk è stata preparata come descritto al punto 1.3· Essa è stata poi equilibrata in tampone sodio acetato 20 mM, pH 6,5· ed impacchettata in una colonna cromatografica fino ad avere un letto di resina di diametro pari a 11 cm ed altezza pari a 16 cm.

Al campione di LH, ottenuto come descritto al punto 1.2, è stato aggiunto acido acetico 1,7 M fino a pH 6,5. ed il campione stesso è stata caricato in colonna, ad un flusso di circa 1 l/ora. L'eluato ottenuto durante il caricamento del campione in colonna è stato raccolto in un'unica frazione, mentre successivamente sono state raccolte frazioni di circa 600 mi.

- 11 di tampone sodio acetato 20mM, pH = 6,5;

- 51 di tampone glicina-NaOH 50mm, pH = 10;

- 21 di tampone glicina-NaOH 50mM, KC1 0,15 M, pH = 10;

camera 1) 8 1 di KC1 0,15 M in tampone glicina-NaOH 50mM, pH = 10; camera 2) 8 1 di KC1 1,7 M in tampone glicina-NaOH 50mM, pH = 10. Dopo cromatografia, per ogni frazione di eluato sono state determinate la densità ottica a 280 nm (D0280) e l’attività specifica di LH (U.I./ml). La Figura 5 riporta il cromatogramma di eluizione, ottenuto come sopra descritto; durante il caricamento del campione in colonna, l'ormone LH è stato trattenuto dalla resina, mentre gran parte delle proteine contaminanti è stata raccolta nell'eluato (non illustrato nel grafico) . Le proteine contaminanti legate dalla resina sono state eliminate mediante i lavaggi effettuati con i due tamponi a pH 10, prima dell'eluizione con il gradiente. L'ormone LH è stato eluito dal gradiente di KC1: a basse concentrazioni di KC1 sono state eluite ulteriori proteine contaminanti, mentre l'ormone è stato eluito a concentrazioni ioniche superiori. Le frazioni 17-25 sono state riunite ed il pH è stato portato a 7.5 con acido acetico 1,7 M. La soluzione è stata quindi concentrata, desalificata mediante ultrafiltrazione su membrana Amicon PM10 ed infine liofilizzata.

2.4 Depirogenazione di LH.

205 mg di LH liofilizzato, ottenuto allo stadio precedente, sono stati sciolti in 102 mi di una soluzione contenente EtOH 4θ3⁄4 v/v ed ammonio acetato 10% p/v. Alla soluzione, mantenuta sotto agitazione magnetica alla temperatura di circa -10°C mediante bagno di ghiaccio e sale, sono stati quindi aggiunti:

2,25 mi di una soluzione acquosa di sodio fosfato tribasico dodecaidrato al 7.6%;

- 2,7 mi di una soluzione acquosa di calcio acetato al 4,9#. Dopo aver portato il pH a circa 8,5 con NaOH al 20# ρ/v, la soluzione è stata mantenuta sotto agitazione per 30 minuti alla temperatura di circa -10 “C ed è stata quindi centrifugata a 8.000 rpm in un rotore Sorvall SS34, per 30 minuti. Il precipitato è stato eliminato, mentre il supem atante raccolto (107 mi) è stato posto sotto agitazione, mantenendo la temperatura a circa -10°C in un bagno di ghiaccio e sale.

Dopo aggiunta di 214 mi di EtOH al 95# v/v, previamente raffreddato a -20°C, la soluzione è stata mantenuta sotto agitazione per 30 minuti e poi lasciata a riposo per 12 ore, alla temperatura di -20"C.

Dopo centrifugazione a 8.000 rpm, per 30 minuti, in una centrifuga raffreddata a 0-4°C, il supernatante è stato eliminato ed il precipitato è stato ridisciolto in acqua apirogena (125 mi). La soluzione cosi ottenuta è stata dializzata per 18 ore contro 101 di acqua apirogena e quindi liofilizzata.

La Figura 6 riporta lo spettro U.V. di una soluzione acquosa contenente 2,8 mg/ml di LH, purificato secondo il procedimento sopra riportato. L'attività specifica di LH purificato, pari a 521 U.I./mg di proteine, è stata determinata con metodo immunoradiometrico, usando il kit Serono LH Maiclone (Rif. Cat.

13201).

La concentrazione proteica è stata determinata con BCA Protein Assay Pierce (catalogo Pierce 23223 e 23224), utilizzando albumina di siero bovino come standard.

In Tabella 3 vengono riportati i dati relativi alla purificazione di LH, effettuata secondo gli stadi sopra descritti.

In Tabella vengono riportati i risultati di ulteriori purificazioni di LH, secondo le metodologie descritte all'Es. 2.

Claims

RIVENDICAZIONI 1. Procedimento per la separazione e la purificazione di FSH e LH da HMG grezzo, comprendente i seguenti stadi: 1) eventuale devirazlone di detto HMG grezzo in una soluzione acquosa di EtOH 80-90% v/v; 2) caricamento del prodotto ottenuto allo stadio (1) su una colonna cromatografica a scambio ionico, con resina anionica debolmente basica di tipo DEAE, eluendo selettivamente gli ormoni LH e FSH con soluzioni acquose di EtOH 5"153⁄4 v/v in tampone fosfato 10-50 mM, contenenti NaCl O-7O mM a forza ionica crescente, a pH 7,0-8,0; 3) caricamento dell'eluato ottenuto allo stadio (2), contenente l'ormone LH o FSH, su una colonna cromatografica di affinità avente come ligante un derivato antrachinonico , eluendo selettivamente le proteine contaminanti e l’ormone FSH o LH con soluzioni a pH alcalino, a forza ionica crescente da 0 a 3 M di KC1; 4) eventuale caricamento dell'ormone FSH, ottenuto allo stadio (3). su una colonna cromatografica a scambio ionico con resine anioniche fortemente basiche, eluendo selettivamente le proteine contaminanti e FSH con soluzioni di NaCl 0-400 mM a forza ionica crescente, a pH alcalino.
2. Il procedimento secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che detto HMG grezzo viene ottenuto da urine di donne in menopausa o post-menopausa.
3. Il procedimento secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che, nello stadio (1), detto HMG grezzo viene trattato con detta soluzione acquosa di EtOH ad una temperatura compresa tra -20 e 5’C, per un tempo compreso tra 1 e 4 ore.
4 . Il procedimento secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che, nello stadio (2), detta resina anionica debolmente basica è DEAE-cellulosa.
5. Il procedimento secondo la rivendicazione 1 o 4, caratterizzato dal fatto che, nello stadio (2), detta colonna cromatografica a scambio ionico viene previamente condizionata con una soluzione acquosa di EtOH al 5-15% v/v in tampone fosfato 5-50 mM, a pH 7.3“7»6, ad una temperatura compresa tra 0"C e 8“C.
6. Il procedimento secondo le rivendicazioni 1, 4 e/o 5 caratterizzato dal fatto che, nello stadio (2), detto ormone LH viene eluito da detta colonna con una soluzione acquosa di EtOH 5~15% v/v contenente sodio fosfato 10-30 mM, a pH 7.3“7.6, alla temperatura di 0-8 “C.
7- Il procedimento secondo le rivendicazioni 1, 4 e/o 5· caratterizzato dal fatto che, nello stadio (2), detto ormone FSH viene eluito da detta colonna con una soluzione acquosa di EtOH 5-15% v/v contenente sodio fosfato 10-30 mM e sodio cloruro 30-50 mM, a pH 7.3~7.6, alla temperatura di 0-8 “C.
8. Il procedimento secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che, nello stadio (3). detto derivato antrachinonico è Cibacron Blue.
9. Il procedimento secondo le rivendicazioni 1 e 8, caratterizzato dal fatto che, nello stadio (3) detta colonna cromatografica di affinità è costituita da Agarose Blue.
10. Il procedimento secondo le rivendicazioni 1, 8 e/o 9. caratterizzato dal fatto che, nello stadio (3)> detta colonna cromatografica di affinità viene previamente condizionata con un tampone acetato 10-30 mM, a ρΗ 5·5-7,5·
11. Il procedimento secondo le rivendicazioni 1, 8, 9 e/o 10, caratterizzato dal fatto che, nello stadio (3), detto ormone LH o FSH viene eluito selettivamente con uno o più tamponi glicina-NaOH 40-60 mM, contenenti KC1 in concentrazioni comprese tra 0 e 3 M, variando il pH da 8,5 a 11.
12. Il procedimento secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che, nello stadio (4), detta resina anionica fortemente basica presenta gruppi ammonio quaternari su matrice di cellulosa.
13. Il procedimento secondo la rivendicazione 1 o 12, caratterizzato dal fatto che, nello stadio (4), detta colonna cromatografica a scambio ionico viene previamente condizionata con un tampone Tris-HCl 10-50 mM, a pH 9,0-9,5.
14. Il procedimento secondo le rivendicazioni 1, 12 e/o 13, caratterizzato dal fatto che, nello stadio (4), dette proteine contaminanti vengono eluite con un tampone Tris-HCl 10-50 mM contenente NaCl 40-80 mM, a pH 9.0-9,5» e che detto ormone FSH viene eluito selettivamente rispetto alle proteine contaminanti con un gradiente di NaCl in concentrazione variabile da 70 a 400 mM, in tampone Tris-HCl 10-50 mM, pH 9,0~9,5·
15. Il procedimento secondo una delle rivendicazioni da 1 a 14, caratterizzato dal fatto che detto ormone FSH o LH, ottenuto dagli stadi (3) o (4), viene successivamente liofilizzato o congelato, e depirogenato.