IT9021565A1

IT9021565A1 - ANTI-PARALLEL OLIGOPEPTIDES, CHROMATOGRAPHIC MATRICES WHICH CONTAIN THEM AND THEIR USE FOR THE PURIFICATION OF HUMAN BETA-INTERFERONE

Info

Publication number: IT9021565A1
Application number: IT021565A
Authority: IT
Inventors: Antonello Pessi; Paolo Rappuoli; Lucia Scapol; Giuseppe Claudio Viscomi
Original assignee: Sclavo Spa
Priority date: 1990-09-25
Filing date: 1990-09-25
Publication date: 1992-03-25
Also published as: IT9021565A0; IT1243419B

Description

Descrizione dell'Invenzione Industriale dal. titolo: Oligopeptidi antiparalleli, matrici cromatografiche che li contengono e loro uso per la purificazione di Beta-Interferone Description of the Industrial Invention from. title: Antiparallel oligopeptides, chromatographic matrices containing them and their use for the purification of Beta-Interferon

Campo dell'invenzione Field of the invention

La presente invenzione si riferisce ad oligopeptidi antiparalleli che risultano affini per la proteina Hu-IFN β. The present invention relates to antiparallel oligopeptides which are related to the Hu-IFN β protein.

Stato dell'arte State of the art

Il Beta Interferone umano (Hu-IFN β) è una glicoproteina di peso molecolare MW 23-000 Daltons, la cui sequenza amminoacidica è stata determinata da K.Hosai et al. Human Beta Interferon (Hu-IFN β) is a glycoprotein of molecular weight MW 23-000 Daltons, whose amino acid sequence was determined by K. Hosai et al.

[J.Interferon Res. 8, Ρ-375 - 384 (1988)] mentre quella glucosidica è stata riportata da Y.Kagawa et al. [J.Biol.Chem. [J.Interferon Res. 8, Ρ-375 - 384 (1988)] while the glucosidic one was reported by Y. Kagawa et al. [J.Biol.Chem.

263, p.17508 - 17515 (1988)]. 263, p. 17508 - 17515 (1988)].

E' una proteina secreta dai fibroblasti in risposta ad un'infezione virale, batterica o all'esposizione a cellule, macromolecole e RNA estranei. It is a protein secreted by fibroblasts in response to a viral or bacterial infection or exposure to foreign cells, macromolecules and RNA.

In particolare inibisce la proliferazione delle cellule infettate ed ha un'attività stimolatoria sul sistema immunitario. A causa della sua attività HU-IFN β è ritenuto un promettente principio attivo non solo nel trattamento e profilassi di malattie virali come l'epatite B., l’herpes, l'influenza ecc. ma anche nel trattamento di situazioni tumorali come l'encefaloma, l'osteosàrcoma e la leucemia. In particular, it inhibits the proliferation of infected cells and has a stimulatory activity on the immune system. Due to its activity, HU-IFN β is considered a promising active ingredient not only in the treatment and prophylaxis of viral diseases such as hepatitis B., herpes, flu, etc. but also in the treatment of tumor situations such as encephaloma, osteosarcoma and leukemia.

Alla luce di quanto detto è evidente l'importanza di disporre di processi che consentano di ottenere questa proteina con buone rese ed elevata purezza. In light of the above, it is evident the importance of having processes that allow to obtain this protein with good yields and high purity.

Tra le tecniche più utilizzate nella purificazione di proteine, sia naturali che ricombinanti, c'è la cromatografia per immunoaffinità con anticorpi monoclonali. In particolare nel caso di Hu-IFN β alcune applicazioni sono riportate nella letteratura scientifica e brevettuale (vedi ad esempio JP-A-61/242593, JP-A-61/51000, EP-A-119859) Among the most used techniques in the purification of proteins, both natural and recombinant, there is chromatography for immunoaffinity with monoclonal antibodies. In particular in the case of Hu-IFN β some applications are reported in the scientific and patent literature (see for example JP-A-61/242593, JP-A-61/51000, EP-A-119859)

L'uso di queste tecniche presenta però una serie di svantaggi che ne limitano le applicazioni : difficoltà di produrre anticorpi monoclonali in larga quantità e bassi costi, estrema difficoltà di gestione di una colonna cromatografica con anticorpi monoclonali causa il rischio di perdita di attività, onerosi controlli analitici sul prodotto finale per accertare l'assenza di anticorpo monoclonale eventualmente rilasciato dalla colonna o di suoi frammenti o di proteine e agenti virali che provengano dall'ibridoma e dalle linee cellulari usate per formare l'ibridoma. However, the use of these techniques has a number of disadvantages that limit their applications: difficulty in producing monoclonal antibodies in large quantities and low costs, extreme difficulty in managing a chromatographic column with monoclonal antibodies causes the risk of loss of activity, costly analytical checks on the final product to ascertain the absence of any monoclonal antibody released from the column or of its fragments or of proteins and viral agents that come from the hybridoma and from the cell lines used to form the hybridoma.

D'altro canto è noto che codoni che esprimono amminoacidi idrofili ed idrofobici in una sequenza di DNA corrispondono, nella sequenza antiparallela di DNA a codoni che esprimono amminoacidi idrofobici ed idrofili rispettivamente [J.E.Blalock et al., Biochem.Biophys.Res.Comm. 121, p.203 (1984)]. On the other hand, it is known that codons expressing hydrophilic and hydrophobic amino acids in a DNA sequence correspond, in the antiparallel DNA sequence, to codons expressing hydrophobic and hydrophilic amino acids respectively [J.E.Blalock et al., Biochem.Biophys.Res.Comm. 121, p.203 (1984)].

E' riportato in letteratura che i peptidi codificati da una sequenza di DNA sono affini per quelli codificati dalla sequenza antiparallela corrispondente, questi ultimi sono detti "peptidi AP" [K.L.Bost et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 82, p.1372 {1985)]· Dalle prime osservazioni di Blalock del 1984 numerosi sono stati gli esempi in cui è stata dimostrata l'affinità tra sequenze peptidiche ed i corrispondenti peptidi AP. Un'applicazione di tali studi è stata fatta nella purificazione della proteina ricombinante c-raf ottenuta da E.coli, dove un peptide AP corrispondente alla sequenza 356 -375 della proteina c-raf è stato sintetizzato, purificato ed immobilizzato su una matrice inerte ed usato in un processo di purificazione. Così facendo, partendo da una miscela grezza di una fermentazione di E.coli, e con un solo passaggio, la proteina cercata è stata purificata al 95% (G.Fassina et al., J.Biol.Chem. 264, p.11252 (1989)]. It is reported in the literature that the peptides encoded by a DNA sequence are similar to those encoded by the corresponding antiparallel sequence, the latter being called "AP peptides" [K.L.Bost et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 82, p.1372 {1985)] · From the first observations of Blalock in 1984 there have been numerous examples in which the affinity between peptide sequences and the corresponding AP peptides has been demonstrated. An application of these studies was made in the purification of the recombinant c-raf protein obtained from E. coli, where an AP peptide corresponding to the 356 -375 sequence of the c-raf protein was synthesized, purified and immobilized on an inert matrix and used in a purification process. In this way, starting from a raw mixture of a fermentation of E.coli, and with a single step, the searched protein was purified to 95% (G.Fassina et al., J.Biol.Chem. 264, p.11252 (1989)].

Rispetto agli anticorpi monoclonali i peptidi AP mantengono la selettività per la proteina di interesse e mostrano una serie di vantaggi che li rendono particolarmente interessanti per una tecnica di purificazione cromatografica di proteine : sono di origine chimica, quindi più facilmente controllabili, sono meno costosi, sono più rapidi a prepararsi e consentono quindi screenings più veloci. E' quindi evidente l’importanza di sintetizzare sempre nuovi peptidi AP in modo da rispondere alle esigenze di purificazione di un numero sempre maggiore di proteine. Compared to monoclonal antibodies, AP peptides maintain selectivity for the protein of interest and show a series of advantages that make them particularly interesting for a protein chromatographic purification technique: they are of chemical origin, therefore more easily controlled, they are less expensive, they are quicker to prepare and therefore allow faster screenings. It is therefore evident the importance of always synthesizing new AP peptides in order to meet the purification needs of an increasing number of proteins.

Descrizione dell'invenzione Description of the invention

La presente invenzione si riferisce quindi ad oligopeptidi, la cui sequenza è stata opportunamente derivata da quella di segmenti della sequenza di HU-IFN β, che risultano affini per l’intera proteina Hu-IFN β per cui, immobilizzati su matrici inerti, possono essere utilizzati in cromatografie per affinità per la separazione di detta proteina. The present invention therefore refers to oligopeptides, the sequence of which has been appropriately derived from that of segments of the HU-IFN β sequence, which are similar for the entire Hu-IFN β protein and therefore, immobilized on inert matrices, can be used in affinity chromatography for the separation of said protein.

Un'ulteriore scopo della presente invenzione è costituito dalla preparazione di matrici per cromatografia sulle quali vengono immobilizzati i peptidi suddetti e da un processo per la purificazione di Hu-IFN β utilizzando dette matrici. A further object of the present invention is constituted by the preparation of matrices for chromatography on which the aforesaid peptides are immobilized and by a process for the purification of Hu-IFN β using said matrices.

Costituiscono un ulteriore scopo della presente invenzione composizioni farmaceutiche contenenti Hu-INF β purificato secondo il processo precedentemente detto. A further object of the present invention is pharmaceutical compositions containing Hu-INF β purified according to the process described above.

I segmenti di Hu-IFN β scelti per derivare i peptidi AP da sintetizzare sono : Hu-IFN β (1-14), Hu-IFN β (42-54), Hu-IFN β (103-115). The segments of Hu-IFN β chosen to derive the AP peptides to be synthesized are: Hu-IFN β (1-14), Hu-IFN β (42-54), Hu-IFN β (103-115).

La sequenza dei corrispondenti peptidi AP sintetizzati secondo la presente invenzione sono rispettivamente : The sequence of the corresponding AP peptides synthesized according to the present invention are respectively:

Nel processo per la preparazione delle matrici secondo la presente invenzione, invece di sintetizzare, purificare e quindi legare i peptidi alla matrice inerte che serve da supporto cromatografico (come si effettua normalmente secondo i metodi noti in letteratura) si sintetizzano i peptidi AP suddetti direttamente su matrici polimeriche da utilizzare poi in cromatografia di affinità. Si possono utilizzare ad esempio particelle di Kieselghur ricoperte con poliacrilammidi (ad esempio dimetilacrilammide e etilenbisacrilammide) opportunamente crosslinkate e funzionalizzate con acriloilsarcosinametilestere che sono già state utilizzate nella sintesi in fase solida di peptidi [(E.Atherton et al. , J.Chem.Soc.Perkin I, p-539. (1981); R.C.Sheppard, Chemistry in Britain, p.402 (1983)]· Per realizzare il processo di preparazione delle matrici secondo l'invenzione è necessario utilizzare composti chimici che permettano l'ancoraggio del peptide alla resina in modo da garantire un legame più stabile di quello consentito dai composti, come ad esempio i paraalcossibenzili , tipicamente usati nella sintesi in fase solida di peptidi. In particolare si preferiscono le alchildiammine lineari di formula generale :NH2-(CH2)n-NH2 ove n è un numero compreso fra 2 e 12. In particolare sono preferite le seguenti : 1,5-diamminopentano, 1,6-diamminoesano, 1,4-diamminobutano. L'introduzione di questo nuovo tipo di ancoraggio, sulla resina Kieselghur-poliacrilammide è ottenuto semplicemente mettendo in contatto un largo eccesso di alchildiammina con la resina rigonfiata in DMF, tipicamente 1 - 10 mi di alchildiammina per grammo di resina, a 50°C per 12 h. Si formano così dei legami ammidici sia con la resina che con il peptide, per cui l'ancoraggio è stabile tanto quanto il legame peptidico. In the process for the preparation of the matrices according to the present invention, instead of synthesizing, purifying and then binding the peptides to the inert matrix which serves as a chromatographic support (as is normally carried out according to the methods known in the literature), the aforementioned AP peptides are synthesized directly on polymeric matrices to be used later in affinity chromatography. For example, it is possible to use Kieselghur particles coated with polyacrylamides (for example dimethylacrylamide and ethylene bisacrylamide) suitably crosslinked and functionalized with acryloylsarcosinamethylester which have already been used in the solid phase synthesis of peptides [(E.Atherton et al., J.Chem.Soc . Perkin I, p-539. (1981); R.C.Sheppard, Chemistry in Britain, p.402 (1983)] peptide to the resin in order to ensure a more stable bond than that allowed by compounds, such as paraalkoxybenzyls, typically used in the solid phase synthesis of peptides. In particular, linear alkyldiamines of general formula are preferred: NH2- (CH2) n -NH2 where n is a number between 2 and 12. In particular, the following are preferred: 1,5-diaminopentane, 1,6-diaminohexane, 1,4-diaminobutane. This new type of anchoring on the Kieselghur-polyacrylamide resin is obtained simply by putting a large excess of alkyldiamine in contact with the resin swollen in DMF, typically 1 - 10 ml of alkyldiamine per gram of resin, at 50 ° C for 12 h. Amide bonds are thus formed with both the resin and the peptide, so that the anchor is as stable as the peptide bond.

Terminata la sintesi la matrice su cui i peptidi AP sono legati è impaccata in una colonna cromatografica nella quale, a pH neutro, è passata una miscela di Hu-IFN β con un'attività specifica compresa fra 0.1 - 1 x 10 iu/mg (unità internazionali per milligrammo di proteine totali) e con una concentrazione compresa tra 0.1 - 5 x 10<6 >iu. At the end of the synthesis, the matrix on which the AP peptides are bound is packed in a chromatographic column in which, at neutral pH, a mixture of Hu-IFN β with a specific activity between 0.1 - 1 x 10 iu / mg is passed ( international units per milligram of total protein) and with a concentration between 0.1 - 5 x 10 <6> iu.

Dopo la carica la colonna è lavata con una soluzione di fosfati e cloruro di sodio a pH neutro e poi 1'Hu-IFN β adsorbito è eluito con una soluzione di acido citrico a concentrazione compresa tra 0.02 - 1 M a pH 2, raccogliendo un prodotto che è almeno 10 volte più puro del prodotto di partenza. Hu-IFN β così ottenuto è infine purificato all’omogeneità, tramite una cromatografia in fase inversa con una soluzione di acido trifluoroacetico 0.1£ e acetonitrile come eluente, le frazioni contenenti Hu-IFN β vengono immediatamente congelate prima della liofilizzazione. After charging, the column is washed with a solution of phosphates and sodium chloride at neutral pH and then the adsorbed Hu-IFN β is eluted with a solution of citric acid at a concentration between 0.02 - 1 M at pH 2, collecting a product that is at least 10 times purer than the starting product. Hu-IFN β thus obtained is finally purified to homogeneity, by reverse phase chromatography with a solution of 0.1 £ trifluoroacetic acid and acetonitrile as eluent, the fractions containing Hu-IFN β are immediately frozen before lyophilization.

Il prodotto purificato risulta in un unico picco in HPLC e un'unica banda in SDS-PAGE ed ha un'attività specifica 3x10<8 >iu/mg. The purified product results in a single peak in HPLC and a single band in SDS-PAGE and has a specific activity of 3x10 <8> iu / mg.

Alla soluzione, prima della liofilizzazione, è aggiunta albumina di siero umano in quantità di 0.5 mg per millilitro di soluzione . To the solution, before lyophilization, human serum albumin is added in a quantity of 0.5 mg per milliliter of solution.

Il prodotto cosi ottenuto risulta stabile ed adatto, per la preparazione dei prodotti farmaceutici. The product thus obtained is stable and suitable for the preparation of pharmaceutical products.

Tutte le operazioni, ove non diversamente indicato, sono effettuate a 4°C in condizioni sterili. All operations, unless otherwise indicated, are carried out at 4 ° C in sterile conditions.

L'attività antivirale di CHO-rHu-IFN β è calcolata in base alla riduzione dell'effetto citopatico utilizzando il virus VSV (vescicular stornatitis virus) e la linea cellulare umana HT-10x80 [(J.A.Armostrong.Meth. in Enziomol. 78, Ρ·381 - 387 (1981)]. The antiviral activity of CHO-rHu-IFN β is calculated based on the reduction of the cytopathic effect using the VSV virus (vescicular stornatitis virus) and the human cell line HT-10x80 [(J.A. Armostrong.Meth. In Enziomol. 78, Ρ 381 - 387 (1981)].

I seguenti esempi riportano, a fine illustrativo ma non limitativo, la preparazione e l’uso dei peptidi secondo 1'invenzione. The following examples report, for illustrative but not limitative purposes, the preparation and use of the peptides according to the invention.

ESEMPIO 1 EXAMPLE 1

Preparazione della fase stazionaria contenente il peptide: Preparation of the stationary phase containing the peptide:

H-Ile-Ala-Ala-Ser-Leu-Gln-Glu-Ser-Lys-Gln-Val-Val-Ala-His-OH [(AP-Hu-IFN β (1-14)]. H-Ile-Ala-Ala-Ser-Leu-Gln-Glu-Ser-Lys-Gln-Val-Val-Ala-His-OH [(AP-Hu-IFN β (1-14)].

La sintesi del peptide è stata eseguita in fase solida con un sintetizzatore automatico a flusso Biolynx 4070 (Pharmacia, LKB). Peptide synthesis was performed in solid phase with a Biolynx 4070 automatic flow synthesizer (Pharmacia, LKB).

2 gr. di resina poliacrilammidica (Ultrosyn, Pharmacia LKB) sono stati messi a contatto con 20 mi di NH2-(CH2)6-NH2 a 50°C per 12 h. 2 gr. of polyacrylamide resin (Ultrosyn, Pharmacia LKB) were put in contact with 20 ml of NH2- (CH2) 6-NH2 at 50 ° C for 12 h.

1 gr della resina, con una funzionalizzazione di 0.1 meq/g, è posto in una colonna di vetro e lavato con DMF per 60 minuti al flusso di 4ml/min, tale flusso è poi mantenuto costante per tutte le operazioni successive. 1 gr of the resin, with a functionalization of 0.1 meq / g, is placed in a glass column and washed with DMF for 60 minutes at a flow of 4ml / min, this flow is then kept constant for all subsequent operations.

Tutti i residui araminoacidici sono stati introdotti, protetti al a -animinogruppo, con il fluorenilmetossicarbonile (FM0C) utilizzando come forma attiva i corrispondenti esteri di pentafluorofenolo (0.3 mM in 2 mi di DMF) in presenza di 0.3 mM di 1-idrossibenzotriazolo (Η0ΒΤ). All the araminoacidic residues were introduced, protected at the a -animinogroup, with the fluorenylmethoxycarbonyl (FM0C) using as active form the corresponding esters of pentafluorophenol (0.3 mM in 2 ml of DMF) in the presence of 0.3 mM of 1-hydroxybenzotriazole (Η0ΒΤ) .

Le funzioni in catena laterale dei residui dell'acido glutammico e aspartico, sono protette con tert-butilestere, quelle dell 'istidina e della lisina con tertbutilossicarbonile , quelle della serina con il tert-butiletere. Gli esteri attivi sono disciolti in DMF immediatamente prima dell'aggiunta alla resina, secondo una procedura automatica del sintetizzatore. The side chain functions of the glutamic and aspartic acid residues are protected with tert-butyl ester, those of histidine and lysine with tertbutyloxycarbonyl, those of serine with tert-butyl ether. Active esters are dissolved in DMF immediately prior to addition to the resin, according to an automatic synthesizer procedure.

La reazione di acilazione è condotta a temperatura ambiente per 60' con il sistema in posizione di riciclo. The acylation reaction is carried out at room temperature for 60 'with the system in the recycling position.

Fra una reazione di acilazione e la successiva, la resina è lavata con DMF per 10', poi è posta a contatto con una soluzione di piperidina in DMF (2/8, v/v) per 10' per rimuovere l'animino gruppo protettore FMOC, poi è lavata di nuovo con DMF per 10'. Between one acylation reaction and the next, the resin is washed with DMF for 10 ', then it is placed in contact with a solution of piperidine in DMF (2/8, v / v) for 10' to remove the animine protecting group FMOC, then it is washed again with DMF for 10 '.

Per ciascuna reazione di acilazione, il completamento della reazione è stato verificato mediante il saggio della rinidrina [(E.Kaisen et al., Anal.Biochem. 34, Ρ·595 (1970)] ed il saggio dell'acido trinitrobenzosolfonico [(W.S.Hancock et al., Anal.Biochem 71. p.26l (1976)]. For each acylation reaction, the completion of the reaction was verified by the rhinhydrin assay [(E.Kaisen et al., Anal.Biochem. 34, Ρ · 595 (1970)] and the trinitrobenzosulfonic acid assay [(W.S. Hancock et al., Anal.Biochem 71. p.26l (1976)].

I campioni dopo 30' di acilazione hanno dato risultati positivi (cioè assenza di amminogruppi liberi sulla resina). All'analisi amminoacidica la resina-peptide ha dato i seguenti risultati : The samples after 30 'of acylation gave positive results (i.e. absence of free amino groups on the resin). On the amino acid analysis the resin-peptide gave the following results:

His 0.94 (1); Ala 3-00 (3); Val 0.86 (1); Glx 3-35 (3); Lys 1.1 (1); Ser 1.83 (2); Leu 0.95 (1); H e 0.90 (1). His 0.94 (1); Wing 3-00 (3); Val 0.86 (1); Glx 3-35 (3); Lys 1.1 (1); Ser 1.83 (2); Leu 0.95 (1); H and 0.90 (1).

I valori riportati fra parentesi sono i valori teorici. The values shown in brackets are the theoretical values.

ESEMPIO 2 EXAMPLE 2

Preparazione della fase stazionaria contenente il peptide H-Val-Leu-Leu-leu-Glu-Leu-Leu-Gln-leu-Leu-Asp-Leu-Leu-OH [AP-Hu-IFN β (42 -54)]. Preparation of the stationary phase containing the peptide H-Val-Leu-Leu-leu-Glu-Leu-Leu-Gln-leu-Leu-Asp-Leu-Leu-OH [AP-Hu-IFN β (42 -54)].

Le modalità di preparazione della resina e di sintesi del peptide sono identiche a quelle descritte nell'ESEMPIO 1. The methods of preparation of the resin and of synthesis of the peptide are identical to those described in EXAMPLE 1.

Le funzioni in catena laterale dei residui dell'acido aspartico e dell’acido glutammico sono protette con il tert-butil estere. All'analisi amminoacidica la resina-peptide ha dato i seguenti risultati : The side chain functions of the residues of aspartic acid and glutamic acid are protected with the tert-butyl ester. On the amino acid analysis the resin-peptide gave the following results:

Leu 8.3 (9); Asp 1.00 (1); Glx 2.21 (2); Val 0.9 (1). Leu 8.3 (9); Asp 1.00 (1); Glx 2.21 (2); Val 0.9 (1).

ESEMPIO 3 EXAMPLE 3

Preparazione della fase stazionaria contenente il peptide H-Phe-Ser-Pro-Gly-Glu-Ile-Phe-Phe-Leu-Gln-Phe-Phe-Phe-OH [AP-Hu-IFN β (103-115)]· Preparation of the stationary phase containing the peptide H-Phe-Ser-Pro-Gly-Glu-Ile-Phe-Phe-Leu-Gln-Phe-Phe-Phe-OH [AP-Hu-IFN β (103-115)] ·

La funzione in catena laterale del residuo di acido glutammico è protetta con il tert-butilestere, quella del residuo di serina con il tert-butiletere. The side chain function of the glutamic acid residue is protected with the tert-butyl ester, that of the serine residue with the tert-butyl ether.

L'analisi amminoacidica della resina-peptide ha dato i seguenti risultati : The amino acid analysis of the resin-peptide gave the following results:

Phe 5.7 (6); Glx 2.13 (2); Leu 1.00 (1); Ile 0.97 (1), Gly 0.9 (1); Pro 0.91 (1); Ser 0.94 (1). Phe 5.7 (6); Glx 2.13 (2); Leu 1.00 (1); Ile 0.97 (1), Gly 0.9 (1); Pro 0.91 (1); Ser 0.94 (1).

ESEMPIO 4 EXAMPLE 4

Purificazione di una miscela proteica contenente Hu-IFN β con una fase stazionaria contenente il peptide AP-Hu-IFN β (42-54) 800 mg della resina-peptide AP-Hu-IFN β (42-54) secca, sono rigonfiate in 5 ml di DMF e lavate con 5 ml di soluzioni di acqua-DMF a concentrazione decrescente di DMF fino a sola acqua, vale a dire : H20 / DMF : 2/8, 5/5, 8/2, 10/0 (v/v) rispettivamente . Purification of a protein mixture containing Hu-IFN β with a stationary phase containing the peptide AP-Hu-IFN β (42-54) 800 mg of the dry resin-peptide AP-Hu-IFN β (42-54), are swollen in 5 ml of DMF and washed with 5 ml of water-DMF solutions with decreasing concentration of DMF down to water only, i.e .: H20 / DMF: 2/8, 5/5, 8/2, 10/0 (v / v) respectively.

La resina è quindi impaccata in una colonna di vetro (0.5 id x 10 ml) e lavata con una soluzione di 0.15 M fosfato di sodio, 0.15 M NaCl, pH 7.5. The resin is then packed in a glass column (0.5 id x 10 ml) and washed with a solution of 0.15 M sodium phosphate, 0.15 M NaCl, pH 7.5.

Hu-IFN β proveniente da un supernatante di una coltura della linea cellulare Chiron CHOB-IFN g 454, derivate dalla transfezione della linea CHO DxBll con il plasmide pSAD 2B INF g 1, è stato purificato con metodi noti in letteratura quali cromatografia per affinità con Concanavalina A oppure con Blue Sepharose [{H.J.Friesen et al., Arch.Biochem.Biophys 206, p.432 (1981)] ottenendo cosi un prodotto parzialmente purificato con un'attività specifica di 8 xlO<6 >iu/mg e con una concentrazione di 1 x 10<6 >iu/ml. Hu-IFN β from a supernatant of a culture of the Chiron cell line CHOB-IFN g 454, derived from the transfection of the CHO DxBll line with the plasmid pSAD 2B INF g 1, was purified with methods known in the literature such as affinity chromatography with Concanavalin A or with Blue Sepharose [{H.J. Friesen et al., Arch.Biochem.Biophys 206, p.432 (1981)] thus obtaining a partially purified product with a specific activity of 8 xlO <6> iu / mg and with a concentration of 1 x 10 <6> iu / ml.

37 ml di questa soluzione contenente Hu-IFN β (pH 7>5) sono caricati al flusso di 0.12 ml/min sulla colonna con i peptidi AP. 37 ml of this solution containing Hu-IFN β (pH 7> 5) are loaded at a flow of 0.12 ml / min on the column with the AP peptides.

La colonna è quindi lavata con 5 volumi di una soluzione 0.15 M Na2HP04, 0.15 M NaCl. pH 7.5. The column is then washed with 5 volumes of a 0.15 M Na2HP04, 0.15 M NaCl solution. pH 7.5.

Il Hu-IFN β rimasto adsorbito è poi eluito con 0.1 M acido citrico pH 2.0 e raccolto in un'unica frazione. L'attività specifica di Hu-IFN B cosi purificato è di 1.0 x 10<8 >iu, il prodotto è raccolto in 7-2 mi a una concentrazione 5 x 10<6 >iu/ml. Resa cromatografica 97% · The remaining adsorbed Hu-IFN β is then eluted with 0.1 M citric acid pH 2.0 and collected in a single fraction. The specific activity of Hu-IFN B thus purified is 1.0 x 10 <8> iu, the product is collected in 7-2 ml at a concentration of 5 x 10 <6> iu / ml. Chromatographic yield 97%

ESEMPIO 5 EXAMPLE 5

Purificazione in fase inversa di una miscela proteica contenente Hu-IFN β proveniente da una cromatografia in affinità con peptidi AP. Reverse phase purification of a protein mixture containing Hu-IFN β from affinity chromatography with AP peptides.

500 mi della soluzione contenente Hu-IFN β proveniente dall'ESEMPIO 4 sono caricati su una colonna C-18 Baker Bond (100 x 4.6, 5 um, 300 A, Baker) utilizzando come eluenti : (A) 0.12.TFA, 52 CH3CN; (B) 0,12 TFA, 852 CH3CN. 500 ml of the solution containing Hu-IFN β from EXAMPLE 4 are loaded on a C-18 Baker Bond column (100 x 4.6, 5 um, 300 A, Baker) using as eluents: (A) 0.12.TFA, 52 CH3CN ; (B) 0.12 TFA, 852 CH3CN.

La corsa cromatografica è eseguita in gradiente con (B) che va dal 202 al 552 in 15' e poi rimane al 552 per 3'· The chromatographic run is performed in gradient with (B) which goes from 202 to 552 in 15 'and then remains at 552 for 3'

Il picco contenente Hu-IFN β è eluito al tempo di ritenzione di l6'8". The peak containing Hu-IFN β is eluted at a retention time of 16'8 ".

Albumina di siero umano è subito aggiunta in ragione di 0.5 mg/ml nelle frazioni raccolte, che sono poi immediatamente congelate e liofilizzate. Human serum albumin is immediately added at a rate of 0.5 mg / ml in the collected fractions, which are then immediately frozen and lyophilized.

Hu-IFN β cosi ottenuto ha un'attività specifica di 3-6 x 10<8 >iu/mg e mostra un'unica banda in SDS-PAGE. Hu-IFN β thus obtained has a specific activity of 3-6 x 10 <8> iu / mg and shows a single band in SDS-PAGE.

Claims

CLAIMS 1. Antiparalel oligopeptides which are related to the Hu-IFN β protein.

2. Oligopeptide according to claim 1 of sequence: H-Ile-Ala-Ala-Ser-Leu-Gln-Glu-Ser-Lys-Gln-Val-Val-Ala-His-OH.

3- Oligopeptide according to claim 1 of sequence: H-Val-Leu-Leu-Leu-Glu-Leu-Leu-Gln-Leu-Leu-Asp-Leu-Leu-OH.

4. Oligopeptide according to claim 1 of sequence: H-Phe-Ser-Pro-Gly-Glu-Ile-Phe-Phe-Leu-Gln-Phe-Phe-Phe-OH.

5. Affinity chromatography matrices for purification of human interferon containing oligopeptides according to claims 1 - 4.

6. Affinity chromatography matrices for purification of human interferon containing the peptide according to claim 2.

7. Affinity chromatography matrices for purification of human interferon containing the peptide according to claim 3-

8. Matrices according to claims 5 ~ 7 wherein the peptide is fixed to an inert substrate consisting of a polymeric resin.

9. Matrices according to claim 8 wherein the polymeric resin is constituted by an inert, hydrophilic resin and functionalized with ester groups.

10. Matrices according to claim 9 obtained by copolymerization of dimethiacrylamide, ethylene bisacrylamide and acryloylsarcosin methyl ester.

11. Matrices according to claims 8 - 10 in which the polymeric resin is applied to a rigid support.

12. Matrices according to claim 11 wherein the rigid support used is Kieselghur.

13. Matrices according to claims 8 - 12 in which the peptide is anchored to the polymeric resin through an alkyldiamine of general formula NH2- (CH2) n-NH2 in which n is a number between 2 and 12.

14. Matrices according to claim 13 wherein the alkyldiamine is: 1,4-diaraminobutane, 1,5-diaminopentane, 1,6-diaminohexane.

15-Matrix according to claim 14 consisting of a Kieselghur support on which dimethylacrylamide, ethylene bisacrylamide and acroylsarcosinamethylester and one of the peptides according to claims 1 - 4 are copolymerized, using 1,6-diaminohexane as anchor.

16. The matrix according to claim 13 wherein the peptide and the peptide according to claim 2.

17. The matrix according to claim 13 wherein the peptide and the peptide according to claim 3-

18. The matrix according to claim 13 wherein the peptide and the peptide according to claim 4.

19. Process for preparing the matrices according to claims 14 - 18 in which the peptide is synthesized directly on the polymeric matrix.

20. Process according to claim 19 in which the polymeric resin is put directly in contact with an excess of alkyldiamine of formula NH2- (CH2) -NH2 in the presence of DMF and the single amino acid residues, which constitute the peptide to be anchored to the matrix , are introduced protecting the a-amino group.

21. Hu-IFN β purified according to the process of claim 20.

22. Hu-IFN P according to claim 21.

23 · Use of Hu-IFN β according to claim 22 for the preparation of pharmaceutical compositions.

24. Pharmaceutical compositions according to claim 23 for the treatment and prophylaxis of viral diseases or for the treatment of tumor diseases.