[go: up one dir, main page]

HU222994B1 - Hidroxilaminszármazékok és azok alkalmazása sejtek molekuláris chaperon-termelésének fokozására alkalmas gyógyszerkészítmények előállítására - Google Patents

Hidroxilaminszármazékok és azok alkalmazása sejtek molekuláris chaperon-termelésének fokozására alkalmas gyógyszerkészítmények előállítására Download PDF

Info

Publication number
HU222994B1
HU222994B1 HU9503141A HU9503141A HU222994B1 HU 222994 B1 HU222994 B1 HU 222994B1 HU 9503141 A HU9503141 A HU 9503141A HU 9503141 A HU9503141 A HU 9503141A HU 222994 B1 HU222994 B1 HU 222994B1
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
substituted
alkyl
unsubstituted
group
aryl
Prior art date
Application number
HU9503141A
Other languages
English (en)
Other versions
HU9503141D0 (en
HUT76659A (en
Inventor
Nagy Péter Literáti
László Vígh
Jenő Szilbereky
László Ürögdi
László Jaszlits
Andrea Jednákovits
Mihály Barabás
Katalin Bíró
Ede Márványos
Erzsébet Hegedűs
László Korányi
Mária Kürthy
Gábor Balogh
Ibolya Horváth
Zsolt Török
György Dormán
Dénes Medzihradszky
Éva Udvardy
Bea Mézes
Ernő Duda
Eszter Kovács
Beatrix Farkas
Attila Glatz
Original Assignee
BIOREX Kutató és Fejlesztő Rt.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=27270113&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=HU222994(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by BIOREX Kutató és Fejlesztő Rt. filed Critical BIOREX Kutató és Fejlesztő Rt.
Priority to HU9503141A priority Critical patent/HU222994B1/hu
Publication of HU9503141D0 publication Critical patent/HU9503141D0/hu
Priority to UA97084081A priority patent/UA61050C2/uk
Priority to HR960508A priority patent/HRP960508B1/xx
Priority to EE9700146A priority patent/EE04239B1/xx
Priority to AU73263/96A priority patent/AU720195B2/en
Priority to RU97113758/14A priority patent/RU2206320C2/ru
Priority to ES96935195T priority patent/ES2176502T3/es
Priority to AT96935195T priority patent/ATE221880T1/de
Priority to CNB961923059A priority patent/CN1152871C/zh
Priority to SI9630518T priority patent/SI0801649T1/xx
Priority to US08/860,582 priority patent/US6653326B1/en
Priority to YUP-587/96A priority patent/RS49981B/sr
Priority to NZ320523A priority patent/NZ320523A/en
Priority to IL12112696A priority patent/IL121126A/en
Priority to EP96935195A priority patent/EP0801649B1/en
Priority to CA002209167A priority patent/CA2209167C/en
Priority to TR97/00574T priority patent/TR199700574T1/xx
Priority to JP51717697A priority patent/JP4531865B2/ja
Priority to PCT/HU1996/000064 priority patent/WO1997016439A1/en
Priority to DK96935195T priority patent/DK0801649T3/da
Priority to DE69622840T priority patent/DE69622840T2/de
Priority to SK881-97A priority patent/SK284823B6/sk
Priority to BRPI9607565-1A priority patent/BR9607565B1/pt
Priority to CZ19972072A priority patent/CZ295562B6/cs
Priority to PL96322015A priority patent/PL195634B1/pl
Priority to MX9704988A priority patent/MX9704988A/es
Priority to PT96935195T priority patent/PT801649E/pt
Priority to ZA9609249A priority patent/ZA969249B/xx
Priority to BG101713A priority patent/BG63944B1/bg
Priority to NO19973059A priority patent/NO321140B1/no
Priority to KR97070004575A priority patent/KR19980700976A/ko
Publication of HUT76659A publication Critical patent/HUT76659A/hu
Priority to US10/618,157 priority patent/US7148239B2/en
Priority to US10/618,162 priority patent/US7745465B2/en
Publication of HU222994B1 publication Critical patent/HU222994B1/hu
Priority to JP2008261964A priority patent/JP2009108048A/ja
Priority to US12/823,823 priority patent/US20100267711A1/en

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D213/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D213/02—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D213/04—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C07D213/60—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D213/78—Carbon atoms having three bonds to hetero atoms, with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/16—Central respiratory analeptics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/18—Antipsychotics, i.e. neuroleptics; Drugs for mania or schizophrenia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/02—Non-specific cardiovascular stimulants, e.g. drugs for syncope, antihypotensives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/08—Vasodilators for multiple indications
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C259/00—Compounds containing carboxyl groups, an oxygen atom of a carboxyl group being replaced by a nitrogen atom, this nitrogen atom being further bound to an oxygen atom and not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C259/02—Compounds containing carboxyl groups, an oxygen atom of a carboxyl group being replaced by a nitrogen atom, this nitrogen atom being further bound to an oxygen atom and not being part of nitro or nitroso groups with replacement of the other oxygen atom of the carboxyl group by halogen atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C259/00—Compounds containing carboxyl groups, an oxygen atom of a carboxyl group being replaced by a nitrogen atom, this nitrogen atom being further bound to an oxygen atom and not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C259/12—Compounds containing carboxyl groups, an oxygen atom of a carboxyl group being replaced by a nitrogen atom, this nitrogen atom being further bound to an oxygen atom and not being part of nitro or nitroso groups with replacement of the other oxygen atom of the carboxyl group by nitrogen atoms, e.g. N-hydroxyamidines
    • C07C259/18—Compounds containing carboxyl groups, an oxygen atom of a carboxyl group being replaced by a nitrogen atom, this nitrogen atom being further bound to an oxygen atom and not being part of nitro or nitroso groups with replacement of the other oxygen atom of the carboxyl group by nitrogen atoms, e.g. N-hydroxyamidines having carbon atoms of hydroxamidine groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C275/00—Derivatives of urea, i.e. compounds containing any of the groups, the nitrogen atoms not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C275/64—Derivatives of urea, i.e. compounds containing any of the groups, the nitrogen atoms not being part of nitro or nitroso groups having nitrogen atoms of urea groups singly-bound to oxygen atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C279/00—Derivatives of guanidine, i.e. compounds containing the group, the singly-bound nitrogen atoms not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C279/18—Derivatives of guanidine, i.e. compounds containing the group, the singly-bound nitrogen atoms not being part of nitro or nitroso groups having nitrogen atoms of guanidine groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D213/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D213/02—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D213/89—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with hetero atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D215/00—Heterocyclic compounds containing quinoline or hydrogenated quinoline ring systems
    • C07D215/02—Heterocyclic compounds containing quinoline or hydrogenated quinoline ring systems having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen atoms or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C07D215/16—Heterocyclic compounds containing quinoline or hydrogenated quinoline ring systems having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen atoms or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D215/48—Carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen
    • C07D215/54—Carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen attached in position 3
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D217/00—Heterocyclic compounds containing isoquinoline or hydrogenated isoquinoline ring systems
    • C07D217/22—Heterocyclic compounds containing isoquinoline or hydrogenated isoquinoline ring systems with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to carbon atoms of the nitrogen-containing ring
    • C07D217/26—Carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D295/00—Heterocyclic compounds containing polymethylene-imine rings with at least five ring members, 3-azabicyclo [3.2.2] nonane, piperazine, morpholine or thiomorpholine rings, having only hydrogen atoms directly attached to the ring carbon atoms
    • C07D295/04—Heterocyclic compounds containing polymethylene-imine rings with at least five ring members, 3-azabicyclo [3.2.2] nonane, piperazine, morpholine or thiomorpholine rings, having only hydrogen atoms directly attached to the ring carbon atoms with substituted hydrocarbon radicals attached to ring nitrogen atoms
    • C07D295/08—Heterocyclic compounds containing polymethylene-imine rings with at least five ring members, 3-azabicyclo [3.2.2] nonane, piperazine, morpholine or thiomorpholine rings, having only hydrogen atoms directly attached to the ring carbon atoms with substituted hydrocarbon radicals attached to ring nitrogen atoms substituted by singly bound oxygen or sulfur atoms
    • C07D295/084—Heterocyclic compounds containing polymethylene-imine rings with at least five ring members, 3-azabicyclo [3.2.2] nonane, piperazine, morpholine or thiomorpholine rings, having only hydrogen atoms directly attached to the ring carbon atoms with substituted hydrocarbon radicals attached to ring nitrogen atoms substituted by singly bound oxygen or sulfur atoms with the ring nitrogen atoms and the oxygen or sulfur atoms attached to the same carbon chain, which is not interrupted by carbocyclic rings
    • C07D295/088—Heterocyclic compounds containing polymethylene-imine rings with at least five ring members, 3-azabicyclo [3.2.2] nonane, piperazine, morpholine or thiomorpholine rings, having only hydrogen atoms directly attached to the ring carbon atoms with substituted hydrocarbon radicals attached to ring nitrogen atoms substituted by singly bound oxygen or sulfur atoms with the ring nitrogen atoms and the oxygen or sulfur atoms attached to the same carbon chain, which is not interrupted by carbocyclic rings to an acyclic saturated chain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D307/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom
    • C07D307/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings
    • C07D307/34—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings having two or three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D307/56—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings having two or three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D307/68—Carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D333/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one sulfur atom as the only ring hetero atom
    • C07D333/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one sulfur atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings
    • C07D333/04—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one sulfur atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings not substituted on the ring sulphur atom
    • C07D333/26—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one sulfur atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings not substituted on the ring sulphur atom with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D333/38—Carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D409/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D409/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms containing two hetero rings
    • C07D409/12—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms containing two hetero rings linked by a chain containing hetero atoms as chain links
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D413/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D413/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms containing two hetero rings
    • C07D413/04—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms containing two hetero rings directly linked by a ring-member-to-ring-member bond
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C2601/00—Systems containing only non-condensed rings
    • C07C2601/12—Systems containing only non-condensed rings with a six-membered ring
    • C07C2601/14—The ring being saturated

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Psychology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Nitrogen And Oxygen As The Only Ring Hetero Atoms (AREA)
  • Cosmetics (AREA)
  • Plural Heterocyclic Compounds (AREA)

Abstract

A találmány tárgya (I) általános képletű hidroxil-amin-származék vagy(II) általános képletű tautomer alakja vagy ezek sóinak és/vagyoptikailag aktív sztereoizomerjeinek, mely általános képletekben Ajelentése alkil-, szubsztituált alkil-, aralkil-, az aril- és/vagy azalkilrészében szubsztituált aralkil-, aril-, szubsztituált aril-,heteroaril- vagy szubsz- tituált heteroarilcsoport, Z jelentésekovalens kötés, oxigénatom vagy ?NR3-csoport, ahol R3 jelentésehidrogénatom, alkil-, szubsztituált alkil-, aril-, szubsztituáltaril-, aralkil- és az aril- és/vagy alkilrészében szubsztituáltaralkilcsoport lehet, R jelentése alkil- vagy szubsztituáltalkilcsoport, X jelentése az (I) általános képletű tautomerbenhalogénatom vagy szubsztituált hidroxilcsoport, amino-,monoszubsztituált vagy diszubsztituált aminocsoport, és X jelentése a(II) általános képletű tautomerben oxigénatom, imino- vagyszubsztituált iminocsoport, R' jelentése hidrogénatom, alkil- ,szubsztituált alkil-, aril-, szubsztituált aril-, aralkil-, az aril-és/vagy az alkilrészében szubsztituált aralkilcsoport, acil- vagyszubsztituált acilcsoport, és az (I) általános képletű vegyületekadott esetben egy intramolekuláris gyűrűs szerkezetet tartalmaznak Xés egy reaktív szubsztituens összekapcsolódása által, alkalmazásaolyan gyógyszerkészítmények előállítására, melyek fiziológiaistressznek kitett sejtek által kifejezett molekuláris chaperonexpresszióját, illetve a sejtekben azok aktivitását a fiziológiaistressz által indukált mennyiség fölé növelik. A találmány továbbá afentiek szerint alkalmazható új hidroxil-amin-származékokra isvonatkozik. ŕ

Description

A találmány tárgya (I) általános képletű hidroxil-aminszármazék vagy (II) általános képletű tautomer alakja vagy ezek sóinak és/vagy optikailag aktív sztereoizomeijeinek, mely általános képletekben A jelentése alkil-, szubsztituált alkil-, aralkil-, az aril- és/vagy az alkilrészében szubsztituált aralkil-, aril-, szubsztituált aril-, heteroaril- vagy szubsztituált heteroarilcsoport, Z A leírás terjedelme 94 oldal (ezen belül 32 lap ábra) jelentése kovalens kötés, oxigénatom vagy =NR3-csoport, ahol R3 jelentése hidrogénatom, alkil-, szubsztituált alkil-, aril-, szubsztituált aril-, aralkil- és az arilés/vagy alkilrészében szubsztituált aralkilcsoport lehet, R jelentése alkil- vagy szubsztituált alkilcsoport, X jelentése az (I) általános képletű tautomerben halogénatom vagy szubsztituált hidroxilcsoport, amino-, monoszubszHU 222 994 B1
HU 222 994 Bl tituált vagy diszubsztituált aminocsoport, és X jelentése a (II) általános képletű tautomerben oxigénatom, iminovagy szubsztituált iminocsoport, R’ jelentése hidrogénatom, alkil-, szubsztituált alkil-, aril-, szubsztituált aril-, aralkil-, az aril- és/vagy az alkilrészében szubsztituált aralkilcsoport, acil- vagy szubsztituált acilcsoport, és az (I) általános képletű vegyületek adott esetben egy intramolekuláris gyűrűs szerkezetet tartalmaznak X és egy reaktív szubsztituens összekapcsolódása által, alkalmazása olyan gyógyszerkészítmények előállítására, melyek fiziológiai stressznek kitett sejtek által kifejezett molekuláris chaperon expresszióját, illetve a sejtekben azok aktivitását a fiziológiai stressz által indukált mennyiség fölé növelik.
A találmány továbbá a fentiek szerint alkalmazható új hidroxil-amin-származékokra is vonatkozik.
A találmány tárgya eljárás molekuláris chaperonok celluláris expressziójának fokozására, továbbá hidroxilamin-származékok, melyek felhasználhatók a chaperontermelés növelésére és eljárás ezek előállítására.
1. A találmány háttere
A molekuláris chaperonok olyan fehérjék, amelyek a fehérjék harmadlagos szerkezetének kialakulását szabályozzák. Nem kovalensen kötődnek az újonnan szintetizálódott vagy denaturálódott vagy hibás konformációjú fehérjék szabadon levő felszínéhez, és elősegítik a korrekt konformációkba való szerveződésüket. A molekuláris chaperonok számos sejtfolyamatban is részt vesznek, így a fehérjeszintézisben, fehérjetranszlokációban és DNS-replikációban.
A molekuláris chaperonok közé tartoznak a hősokkfehérjék, vagyis olyan proteinek, melyek expressziója szignifikánsan megnő a sejtekben szokatlanul magas hőmérséklet (hősokk) hatására, vagy az igen különböző fiziológiai stresszek hatását követően. A molekulárischaperon-expresszió növekedése pedig védelmet nyújt a sejteknek a hipertermia káros hatásaival szemben. Ezt bizonyítja a sejtek letális hőmérsékletekkel szembeni termotoleranciája, mely kialakul, ha a sejteket előzőleg rövid ideig magas hőmérsékletnek tesszük ki.
A hősokkfehérje-expressziót indukáló fiziológiai stresszek közé tartoznak a különböző patológiás elváltozások, melyek számos betegséghez társulnak. Az ilyen stresszhatásoknak kitett sejtekben a hősokkfehérjék szintézise a sejtnek a fiziológiai stresszel szembeni védekezését jelzi ugyanúgy, mint a hősokkra adott válasz esetén.
A molekuláris chaperonok indukciójával kapcsolatos egyik ilyen patológiás elváltozás az ischaemiás sérülés. A szövetek ischaemiás léziója a vérellátás bármely okból történő romlása miatt alakul ki. így például egy hosszan tartó koronáriaelzáródás komoly veszélyt jelent a szívizom számára, miokardiális nekrózist okozva és veszélyeztetve a regenerálódás lehetőségét még akkor is, ha a vérkeringés helyreállt. Az agyban is gyakran alakul ki ischaemia maradandó károsodás, mely az agyszövet halálához vezet. Megfigyelték, hogy a hsp70 hősokkfehérje mennyisége megnő a szívizomban egy nekrózishoz vezető ischaemia során, de akkor is, ha az ischaemia rövid ideig tart. Ilyenkor, akárcsak a hősokk esetében, a sejtek megnövekedett hsp70-tartalma megvédi őket egy következő, egyébként nekrózist okozó ischaemia következményeitől. (DAS, D. K. és munkatársai: Cardiovascular Rés. 578, 1993). Ez történt akkor is, amikor patkányszívizomsejteket tenyészetben ér az ischaemia [J. Clin. Invest. 93, 759-767 (1994)]. Következésképpen a szívizomsejtek által szintetizált hősokkfehérjék védelmet nyújtanak az ischaemiás sérülésekkel szemben.
Hasonló a helyzet az agyban, ahol a cerebrális ischaemia a hősokkfehéije megnövekedett expresszióját eredményezi az agyszövetben. A kísérletek azt igazolták, hogy az állatok előkezelése egy szubletális ischaemiával hőstresszfehérjét (hsp70) indukál, és ez megvédi az agyat a még súlyosabb ezt követő ischaemiás sérüléstől [Simon és munkatársai: Neurosci. Lett. 163, 135-137 (1993)].
A molekulárischaperon-indukcióval kapcsolatban álló, a szövetekre és szervekre ható fiziológiai stresszre további példaként szolgálnak a gyulladásos megbetegedések. A gyulladás a gazdasejtek nem specifikus válasza az idegen anyag behatolására, mint például a különböző bakteriális és virális patogének által okozott fertőzések esetén, és magában foglalja a leukociták aggregációját és aktiválását a sérülés helyén, ami a reaktív oxigéngyökök és citokinek magas szintű termelését és felszabadulását eredményezi. Ezek a citokinek és reaktív oxigéngyökök megtámadják a kórokozót, de károsítják a gazdaszervezet szöveteit is [Jaquier. Sáriin, Experientia 50, 1031-1038 (1994)]. Úgy gondolják, hogy a gyulladás ilyen toxikus mediátorai ellen védekezésképpen a gazdaszövetek megnövelik a molekuláris chaperonok termelését. Az így termelődött molekuláris chaperonok megvédik a gazdasejtet attól a károsodástól, melyet a reaktív oxigéngyökök okoznak, és megvédik a sejteket a TNF és más citokinek és a reaktív oxigéngyökök citotoxicitásától. Az állatkísérletek azt bizonyították, hogy a hősokkal előkezelt állatokban a hősokkfehéije (hsp70) expressziójának megnövekedése a tüdőgyulladások észrevehető csökkenését eredményezte. Következésképpen, a molekuláris chaperonok gyulladáscsökkentő funkciót látnak el.
A fent említett példák a molekuláris chaperonok azon képességét illusztrálják, hogy megvédik a sejteket a különféle fiziológiai stresszekkel szemben, amelyek megzavarják a celluláris homeosztatikus egyensúlyt, és a sejtek sérülését okozzák. A molekuláris chaperonokról azt is kimutatták, hogy előnyösek a daganatok kezelésében. Például leírták, hogy amikor a tumorsejteket egy molekuláris chaperont (65 kd hsp) kódoló génnel transzfektálják, azok elveszítik tumorgenicitásukat, vagy csökkent tumor2
HU 222 994 Bl genicitást mutatnak (PCT/GB93/02339 számú PCT-beli szabadalmi bejelentés). Továbbá azt is közölték, hogy a tumorsejtek, a hőstresszre adott válaszban, megnövekedett mennyiségben expresszálnak molekuláris chaperonokat. Azonban ezek nem a citoplazmában, hanem a sejtmembránok felületén találhatók [Ferrarim M. és munkatársai: Int. J. Cancer 51, 613-619 (1992)]. A molekuláris chaperonok megnövekedett jelenléte a sejtfelületeken összefüggésben van az NK-sejteknek (natural killer) a tumorsejtek iránti fokozott érzékenységével, lehetővé téve a jobb célkiválasztást, behatolást, és a tumorsejtek NKsejtek általi elpusztítását [Kurosawa S. és munkatársai: Eur. J. Immunoi. 23,1029 (1993)].
Tekintve a sejtekben megnövekedett molekulárischaperon-expresszió előnyeit, nagyon kívánatos lenne egy olyan módszer, amely fokozza a chaperonexpressziót, vagy amely megnöveli a molekuláris chaperonok aktivitását.
2. A találmány összefoglalása
A találmány tehát molekuláris chaperonok sejt általi expressziójának fokozására vagy aktivitásának növelésére szolgáló eljárásokra vonatkozik. Közelebbről a találmány egyik tárgya eljárás, amelynek során egy fiziológiai stressznek kitett sejtbe a fiziológiai stressz alatt vagy azt megelőzően vagy követően egy hatékony mennyiségű kémiai vegyülettel kezelünk, amely megnöveli a molekuláris chaperon expresszióját a sejtben a fiziológiai stressz által indukált mennyiség fölé; ahol a kémiai vegyület egy hidroxil-amin-származék (I) és (II) általános képletű tautomer formája vagy ennek sója, amely képletekben
A jelentése alkil-, szubsztituált alkil-, aralkil-, az arilés/vagy az alkilrészében szubsztituált aralkil-, aril-, szubsztituált aril-, heteroaril- vagy szubsztituált heteroarilcsoport,
Z jelentése kovalens kötés, oxigénatom vagy —NR3, ahol R3 jelentése hidrogénatom, alkil-, szubsztituált alkil-, aril-, szubsztituált aril-, aralkil- és az aril- és/vagy alkilrészében szubsztituált aralkilcsoport lehet,
R jelentése alkil- vagy szubsztituált alkilcsoport,
X jelentése az (I) általános képletű tautomerben halogénatom vagy szubsztituált hidroxil- vagy amino-, monoszubsztituált amino- vagy diszubsztituált aminocsoport, és
X jelentése a (II) általános képletű tautomerben oxigénatom, imino- vagy szubsztituált iminocsoport, és R’ jelentése hidrogénatom, alkil-, szubsztituált alkil-, aril-, szubsztituált aril-, aralkil-, az aril- vagy alkilrészben szubsztituált aralkil-, acil- vagy szubsztituált acilcsoport, és az (I) általános képletű vegyületek adott esetben egy intramolekuláris gyűrűs szerkezetet tartalmaznak X és egy reaktív szubsztituens összekapcsolódása által.
A találmány tárgya továbbá eljárás egy molekuláris chaperon aktivitásának növelésére egy fiziológiai stressznek kitett sejtben, amit szintén úgy érünk el, hogy a sejtet egy fent definiált (I) vagy (II) általános képletű hidroxil-amin-vegyület hatásos mennyiségével kezeljük. Ennek következtében a molekuláris chaperon aktivitása a fiziológiai stressz által indukált aktivitást meghaladó mértékben növekedik.
A találmány szerinti eljárás során az említett hidroxil-amin-származékokkal eukariótasejteket kezelünk.
A találmány tárgyát képezi továbbá egy eljárás a chaperonrendszer működésével kapcsolatos betegség vagy egy sejt vagy sejtorganellum membránjának károsodásához társult betegség kezelésére, adott esetben megelőzésére, amelynek során a gazdaszervezetnek a patológiás állapot enyhítésére egy (I) vagy (II) általános képletű hidroxil-amin-származék hatásos mennyiségét adjuk be.
Ugyancsak a találmány tárgyát képezi az (I) vagy (II) általános képletű hidroxil-amin-származékok vagy sóik felhasználása kardiovaszkuláris, vaszkuláris, agyi, allergiás, immun-, autoimmun, vírus- vagy bakteriális fertőzés okozta betegségek, daganatos vagy kültakaróés/vagy nyálkahártya-betegségek vagy a vesetubulusok hámsejteredetű betegségei kezelésére használható gyógyászati készítmények, valamint adott esetben kozmetikai készítmények előállításában.
A találmány továbbá új hidroxil-amin-származékokra is vonatkozik, amelyek a biológiai hatások széles skálájával rendelkeznek, és felhasználhatók a szervezetek molekulárischaperon-szintjének növelésére vagy aktivitásának fokozására, továbbá erre a célra alkalmazható gyógyászati és kozmetikai készítmények előállítására.
A találmány tárgyát képezik továbbá olyan gyógyászati és kozmetikai készítmények, amelyek hatóanyagként az imént említett új hidroxil-amin-származékokat tartalmazzák a gyógyszerekben szokásos vivőanyagok és segédanyagok mellett.
A találmány alapja - legalábbis részben - az a váratlan felismerés, hogy a fenti struktúrával rendelkező hidroxil-amin-származékok, amikor a sejteket kezeljük velük, képesek ugyanazon sejt által termelt molekuláris chaperonok mennyiségét megnövelni vagy aktivitását fokozni. Ez a hatás különösen érvényesül akkor, ha a sejt egy fiziológiás stressz hatása alatt áll, amely a molekulárischaperon-expressziót indukálja. Ilyen esetekben a kémiai vegyület beadása fokozza a molekuláris chaperonok sejtes expresszióját azon mennyiség fölé, amely kizárólag a fiziológiai stressz által indukálódik.
Ez a felismerés igen jelentős a molekuláris chaperonok azon szerepének szempontjából, amelyet a különböző betegségekben a patológiás hatások ellen védekező sejtekben játszanak. így, ha egy vegyület képes megnövelni a sejtek által expresszált molekuláris chaperonok mennyiségét, vagy képes fokozni azok aktivitását, ez lehetővé teszi a sejtek védelmét a betegségek káros hatásaival szemben és az általuk okozott károsodások helyreállítását.
3. Az ábrák rövid ismertetése
Az 1. ábrán diagramon mutatjuk be a hsp-szint alakulását hőstressznek kitett H9c2 patkány-szívizomsejtvonalon az N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleáttal vég3
HU 222 994 Bl zett kezelés hatására. Ezt a vegyületet B vegyületként tüntettük fel ábráinkon, ezért itt, az ábrák ismertetésében is B vegyületnek nevezzük a továbbiakban.
A 2. ábrán az előbbi kísérletnek a Westem-blotanalízissel kapott eredményét mutatjuk be a denzitometriás kiértékelés alapján.
A 3. ábra a hsp70 mRNS Northem-blot-analízisének eredményeit mutatja, melyeket akkor kaptunk, amikor a B vegyületnek a hsp celluláris expressziójára gyakorolt hatását vizsgáltuk a transzkripció szintjén.
A 4. ábra a hsp26 mRNS Northem-blot-analízisének eredményeit mutatja be, melyeket Saccharomyces cerevisiae sejteken kaptuk, amikor azokon a B vegyületnek a hsp aktiválására kifejtett hatását vizsgáltuk.
Az 5. ábra diagramján látható a benzil-alkohol hatása az adenilát-ciklát aktivitására, illetve a plazmamembrán állapotára.
A 6. ábra a hsp-gén-expresszió mértékét mutatja diagramon, HeLa-sejteken, a vizsgálatokhoz luciferáz-riportergént használva.
A 7. ábra diagramja a B vegyület hatását mutatja a hsp72 sejtfelszíni expressziójára K562 sejtvonalon.
A 8. ábra a B vegyület és különböző lipidmembránok kölcsönhatásának diagramja, amely a felületi nyomásnövekedést mutatja.
A 9. ábra diagramjáról leolvasható 10 mM, illetve 100 mM B vegyület hatása dipalmitoil-foszfatidil-etanol-aminból gyártott nagy egyrétegű vesiculák (large unilamellar vesicules) bilayer (LJ Jhexagonális (Hn) fázisátmenetére.
A 10. ábra diagramján látható a B vegyület hatása a szérum-TNF mennyiségére egészséges és STZ-diabéteszes patkányokban.
All. ábra diagramja mutatja a B vegyület hatását a keratinociták cikloheximidnövekedést gátló hatásával szemben.
A 12. ábra diagramja mutatja a B vegyület hatását endoteliális sejteken a cikloheximid sejtkárosító hatásával szemben.
A 13. ábra a B vegyület citoprotektív hatását mutatja HeLa-sejtvonalon a cikloheximid sejtkárosító hatásával szemben.
A 14. ábra a B vegyület hatását mutatja H9c2 patkány-szívizomsejtvonalon a cikloheximid növekedésgátló hatásával szemben.
A 15. ábra mutatja a B vegyület hatását a Pl transzkripciós faktor aktivitására AB 1380 élesztősejtekben.
A16. ábra mutatja a B vegyület hatását az API transzkripciós faktor aktivitására JF1 élesztősejtekben.
A 17. ábra mutatja a B vegyület hatását AB 1380 élesztősejtekben a Pl transzkripciós faktor aktivitására.
A 18. ábra izolált működő ischaemiás patkányszívmodellen végzett kísérleteink eredményeit mutatja be, melyekben a modellt B vegyülettel kezeltük, az ischaemiát órával követő Westem-blot-analízis alapján.
A 19. ábra izolált működő ischaemiás patkányszívmodellen végzett kísérleteink eredményeit mutatja be, melyekben a modellt B vegyülettel kezeltük, az ischaemiát órával követő Westem-blot-analízis alapján.
A 20. ábra mutatja STZ-diabéteszes patkányon égetéses sebzés után 1% B vegyületet tartalmazó krémmel való kezelés hatására bekövetkező sebgyógyulást, a seb átmérőjének értékelése alapján.
A 21. ábra az előbbihez hasonló, de 2% B vegyületet tartalmazó krémmel végzett kísérletünk eredményét mutatja.
A 22. ábra az előbbihez hasonló, de 4% B vegyületet tartalmazó krémmel végzett kísérletünk eredményét mutatja.
A 23. ábra szintén az STZ-diabéteszes patkányon égetéses sebzés után 1% B vegyületet tartalmazó krémmel való kezelés hatására bekövetkező sebgyógyulást mutatja, ezúttal azonban a sebek vizuális kiértékelése alapján.
A 24. ábra az előzőhöz hasonló vizsgálati eredményeket mutat, melyeket 2% B vegyületet tartalmazó krémmel végzett kezeléssel kaptunk.
A 25. ábra szintén az előzőhöz hasonló vizsgálati eredményeket mutat, melyeket 4% B vegyületet tartalmazó krémmel végzett kezeléssel kaptunk.
A 26. ábrán az előbb említett kísérleteinkben epilumineszcens mikroszkópos felvétellel készített összehasonlító fényképeket (kezelt és kontroll) mutatjuk be.
A 27. ábrán bemutatjuk az előbbi kísérleteinkben a kivett minták hsp72-szintjének Westemblot-analízisével kapott eredményeket, szintén az 1%, a 2% és a 4% B vegyületet tartalmazó krémmel való kezelés esetében.
A 28. ábrán az UV-B-sugárzásnak kitett és B vegyülettel kezelt SCID-egerekben a hsp72szint immunhisztokémiai vizsgálatával kapott eredményeket (kezelt és kontroll) mutatjuk be.
A 29. ábrán mutatjuk be az UV-B-sugárzásnak kitett és B vegyülettel kezelt SCID-egerek bőrbiopsziás mintán végzett Westem-blot-analízis-eredményét a hsp72szintre vonatkozólag.
HU 222 994 Bl
4. A találmány részletes ismertetése
4.1. A találmány szerinti hidroxil-amin-származékok
Azok a hidroxil-amin-származékok, melyek tautomer formáit az (I) és (II) általános képletek jelentik, felhasználhatók a találmánnyal összhangban az itt leírt módon. A fenti képletben A jelentése alkil-, szubsztituált alkil-, aralkil-, az aril- és/vagy az alkilrészében szubsztituált aralkil-, aril-, szubsztituált aril-, heteroaril- vagy szubsztituált heteroarilcsoport,
Z jelentése kovalens kötés, oxigénatom vagy =NR3-csoport, ahol R3 jelentése hidrogénatom, alkil-, szubsztituált alkil-, aril-, szubsztituált aril-, aralkil- és az arilés/vagy alkilrészében szubsztituált aralkilcsoport lehet, R jelentése alkil- vagy szubsztituált alkilcsoport,
X jelentése az (I) általános képletű tautomerben halogénatom vagy szubsztituált hidroxil- vagy amino-, monoszubsztituált amino- vagy diszubsztituált aminocsoport, és
X jelentése a (II) általános képletű tautomerben oxigénatom, imino- vagy szubsztituált iminocsoport, és R’ jelentése hidrogénatom, alkil-, szubsztituált alkil-, aril-, szubsztituált aril-, aralkil-, az aril- vagy alkilrészben szubsztituált aralkil-, acil- vagy szubsztituált acilcsoport, és az (I) általános képletű vegyületek adott esetben egy intramolekuláris gyűrűs szerkezetet tartalmaznak X és egy reaktív szubsztituens összekapcsolódása révén.
Ahol az „alkil”-t említjük, az egyenes vagy elágazó, rövid és hosszú szénláncú alkilcsoportokat jelent. Az előnyös rövid szénláncú alkilcsoportokban a szénatomszám tipikusan 1 és 8 közötti, és ezek a következő csoportok lehetnek: metil-, etil-, propil-, izopropil-, butil-, izobutil-, szek-butil-, pentil-, terc-pentil, hexil-, heptil-, oktilcsoport és hasonlók; még előnyösebben 1-6 szénatomosak lehetnek, mint például metil-, etil-, propil-, izopropil-, butil-izobutil-, szek-butil-, pentil-, tercpentil- és hexilcsoport.
Az előnyös hosszú szénláncú alkilcsoportokban a tipikus szénatomszám 9 és 21 közötti, és ezek a következők lehetnek: nonil-, decil-, undecil-, dodecil-, tridecil-, tetradecil-, pentadecil-, hexadecil-, heptadecil-, oktadecil-, nonadecil-eikozil- és heneikozilcsoport és hasonlók; még előnyösebben 9-17 szénatomosak és nonil-, decil-, undecil-, dodecil-, tridecil-, tetradecil-, pentadecil-, hexadecil- és heptadecilcsoportok lehetnek.
Az előnyös cikloalkilcsoport egy rövid, 3-8 szénatomos cikloalkillánccal bíró cikloalkilcsoportot jelent, amely ciklopropil-, ciklobutil-, ciklopentil-, ciklohexil-, cikloheptil-, ciklooktil- és hasonló csoport lehet, még előnyösebben 3-7 szénatomos és ciklopropil-, ciklobutil-, ciklopentil-, ciklohexil- és cikloheptilcsoport lehet.
Az adott esetben szubsztituált aril vagy alkil olyan aril- vagy alkilcsoportot jelent, mely egy vagy több szubsztituenst hordoz, úgymint ciano-, hidroxil-, rövid szénláncú alkil- (például metil-, etil-, propil-, izopropil-, butil-, izobutil-, szek-butil-, pentil-, terc-pentil-, hexil-, heptil-, oktil- és hasonlók), rövid szénláncú alkoxi- (például metoxi-, etoxi-, propoxi-, izopropoxi-, butoxi-, izobutoxi-, szek-butoxi-, terc-butoxi-, pentiloxi-, terc-pentil-oxi-, hexil-oxi- és hasonlók), aril- (például fenil-, naftil- és hasonlók), nitro-, amino-, mono(rövid szénláncú alkil)-szubsztituált amino- (például metil-amino-, etil-amino-, propil-amino-, izopropil-amino-, terc-butil-amino- és hasonlók), di(rövid szénláncú alkil)-szubsztituált amino- (például dimetil-amino-, dietil-amino-, dipropil-amino- diizopropil-amino-, dibutil-amino-, dipentil-amino-, dihexil-amino- és hasonlók), monohalogén-, dihalogén- vagy trihalogén(rövid szénláncú)-alkil-csoport (például klór-metil-, 2,2-diklór-etil-, trifluor-metil-csoport és hasonlók) vagy halogénatom (például fluor-, klór-, bróm- és jódatom) és hasonlók.
Az előnyös aralkilcsoport egy, a fentiekben definiált rövid szénláncú alkilcsoportot jelent, mely egy vagy több, adott esetben szubsztituált arilcsoportot hordoz és benzil-, benzhidril-, tritil-, 1-fenil-etil-, 2-fenil-etil-,
2- benzhidril-etil-, 3-fenil-propil-, l-metil-2-fenil-etil-, 1-fenil-butil-, 4-tritil-butil-, l,l-dimetil-2-fenil-etil-, 4fenil-butil-, 5-fenil-pentil-6-fenil-hexil-csoport és hasonló lehet, még előnyösebben 1-4 szénatomos alkilcsoport egy fenilcsoporttal szubsztituálva, mely benzil-, 1fenil-etil-, 2-fenil-etil- és l-metil-2-fenil-etil-csoport lehet. Az előnyös arilcsoport fenil-, naftil-, pentalenil-, antracenilcsoport és hasonló lehet, még előnyösebben fenil- és naftilcsoport.
Az előnyös 3-8 tagú, még előnyösebben 5-8 tagú, N-tartalmú telített heterociklusos csoport egy telített heterociklusos csoportot jelent, amely 1-4 nitrogénatomot tartalmaz és aziridinil-, azetidinil-, oxaziranil-, pirrolidinil-, imidazolidinil-, pirazolidinil-, perhidrotiazolil-, perhidroizoxazolil-, piperidinil-, piperazinil-, perhidropirimidinil-, perhidropiridazinil-, morfolinil-, perhidro-lH-azepinil-csoport és hasonló lehet.
Az előnyös heteroarilcsoport egy telítetlen, 3-8 tagú, még előnyösebben 5-6 tagú, 1-4 nitrogénatomot tartalmazó telítetlen heteromonociklusos csoportot jelent, és pirrolil-pirrolinil-, imidazolil-, pirazolil-, piridilcsoport és ennek N-oxidja, pirimidinil-, pirazinil-, piridazinil-, triazolil-, tetrazolil-, dihidrotriazinilcsoport és hasonló lehet; vagy jelenthet egy telítetlen, 1-5 nitrogénatomot tartalmazó kondenzált heterociklusos csoportot, amely indolil-, izoindolil-, indolizinil-, benzimidazolil-, kinolil-, izokinolil-, indazolil-, benzotriazolil-, tetrazolopiridil-, tetrazolopiridazinil-, dihidrotriazolopiridazinilcsoport és hasonló lehet; vagy egy 3-6 tagú, még előnyösebben 5-6 tagú, 1-2 oxigén- és 1-3 nitrogénatomot tartalmazó telítetlen heterociklusos csoportot jelent és oxazolil-, izoxazolil-, oxadiazolil- (például 1,2,4-oxadiazolil- és mások) csoport és hasonló lehet; vagy egy telítetlen, 1-2 oxigén- és 1-3 nitrogénatomot tartalmazó kondenzált heterociklusos csoportot jelent és benzoxazolil-, benzoxadiazolilcsoport és hasonló lehet; vagy egy
3- 8 tagú, még előnyösebben 5-6 tagú, 1-2 kén- és 1-3 nitrogénatomot tartalmazó telítetlen heterociklusos csoportot jelent és tiazolil-, Ι-2-tiazolil-, tiazolinil-, tiadiazolilcsoport és hasonló lehet; vagy jelenthet egy 3-8 tagú, még előnyösebben 5-6 tagú, egy kénatomot tartalmazó telítetlen heteromonociklusos csoportot, mely tienilcsoport lehet; vagy egy oxigénatomot tartalmazó te5
HU 222 994 Bl lítetlen heteromonociklusos csoportot, mely furilcsoport lehet; vagy telítetlen, 1-2 kén- és 1-3 nitrogénatomot tartalmazó kondenzált heterociklusos csoportot jelent és benzotiazolil-, benzoditiazolilcsoport és hasonló lehet.
Az előnyös „acilcsoport”, amikor önmagában áll vagy egy acilált csoport részét képezi, egy olyan acilcsoportot jelent, amely rövid szénláncú alkanoil- (például formil-, acetil-, propionil-, butiril- és hasonló), rövid szénláncú alkoxi-karbonil- (például metoxi-karbonil-, etoxi-karbonil-, propoxi-karbonil-, butoxi-karbonil-, terc-butoxi-karbonil- és hasonló), rövid szénláncú alkil-szulfonil- (például metil-szulfonil-, etil-szulfonilés hasonló), aril-szulfonil- (például fenil-szulfonil- és hasonló), aroil- (például benzoil-, naftoil- és hasonló), aril- (rövid szénláncú alkanoil)- (például fenil-acetil-, fenil-propionil- és hasonló), ciklo- (rövid szénláncú alkil)-(rövid szénláncú alkanoil)- (például ciklohexil-acetil- és hasonló), aril- (rövid szénláncú alkoxi)-karbonil(például benzil-oxi-karbonil- és hasonló), aril-karbamoil- (például fenil-karbamoil-, naftil-karbamoil- és hasonló), cikloalkil-karbamoil- (például ciklohexil-karbamoil- és hasonló), heteromonociklusos szulfonilcsoport (például tienil-szulfonil-, furil-szulfonil- és hasonló); és az acilcsoport adott esetben 1-3 szubsztituenssel helyettesítve lehet, mint azt a fentiekben az „adott esetben szubsztituált” résznél ismertettük.
Az előnyös ω-amino-alkil-csoport egy olyan rövid szénláncú alkilcsoportot jelent, amely az alkillánc ωhelyzetében szubsztituált N-atomot tartalmaz, és amelyben az alkillánc adott esetben egy vagy több szubsztituenst hordoz, előnyösen egy vagy két halogénatomot (például klór-, bróm-, fluor- vagy jódatom), hidroxilvagy acilezett hidroxilcsoportot, ahol az acilcsoportot már korábban definiáltuk; még előnyösebben egy vagy két rövid szénláncú alkilcsoportot, ahol az „alkil” definíciója a fentiekben leírtakkal azonos. Az alkillánc ωhelyzetű N-atomja egy vagy két rövid szénláncú alkilcsoporttal lehet szubsztituálva, előnyösen metil-, etil-, terc-butil- és hasonló csoporttal; cikloalkil-karbamoil-csoporttal (például ciklohexil-karbamoil- és hasonló); még előnyösebben a N-atom része lehet egy telített heterociklusos csoportnak, amely 1-4 nitrogénatomot tartalmaz és aziridil-, azetidinil-, oxaziranil-, pirrolidinil-, imidazolidinil-, pirazolidinil-, perhidrotiazolil-, perhidroizoxazolil-, piperidinil-, piperazinil-, perhidropirimidinil-, perhidropiridazinil-, morfolinil-, perhidro-lH-azepinil-csoport és hasonló lehet; az ω-helyzetű N-atom szubsztituálva lehet egy arilcsoporttal (például fenil- és hasonló), és kvatemerizált lehet egy rövid szénláncú alkilcsoporttal, és oxidált is lehet.
Kívánt esetben az (I) és (II) általános képletű szabad bázisokat átalakíthatjuk savaddíciós sókká egy szerves savval reagáltatva, és így acetáthoz, maleáthoz és hasonló sókhoz jutunk; vagy egy szervetlen savval reagáltatva, és így hidrokloridot, hidrobromidot, hidrojodidot, szulfátot, foszfátot és hasonló sókat kapunk; vagy egy aminosavval reagáltatva, és ekkor argininsót, glutaminsavsót és hasonló sókat kapunk.
Az (I) általános képletű hidroxil-amin-származékok egyik nem korlátozó jellegű előnyös csoportjában Z jelentése kovalens kötés és X jelentése halogénatom, előnyösen klór- vagy brómatom. Ehhez a csoporthoz tartozó előnyös vegyületekben A jelentése (i) aralkil- vagy az arilrészben szubsztituált aralkilcsoport, előnyösen fenil-alkil- vagy egy vagy több, előnyösen alkoxiszubsztituenst hordozó fenil-alkil-csoport; (ii) aril- vagy szubsztituált aril-, előnyösen fenil- vagy szubsztituált fenil-, előnyösen egy vagy több halogénatommal, alkil-, halogén-alkil-, alkoxi- vagy nitrocsoporttal szubsztituált fenilcsoport; (iii) naftilcsoport; (iv) egy N-tartalmú heteroarilcsoport, beleértve azokat, melyek egy benzolgyűrűvel lehetnek kondenzálva, előnyösen piridilcsoport; (v) egy S-tartalmú heteroarilcsoport; (vi) egy O-tartalmú heteroarilcsoport. Ehhez a csoporthoz tartozó előnyös vegyületekben R jelentése (i) ω-amino-alkil-; (ii) az aminorészben egyszeresen vagy kétszeresen szubsztituált ω-amino-alkil-; (iii) az alkilrészben szubsztituált ω-amino-alkil-; (iv) az aminorészben mono- vagy diszubsztituált és az alkilrészben is, előnyösen egy hidroxi- vagy acil-oxi-csoporttal szubsztituált ω-amino-alkil-csoport. Az előnyös (i)-(iv) ω-amino-alkil-csoportok azok, melyekben az alkilrész 3-8 szénatomos.
Az (I) általános képletű hidroxil-amin-származékok egyes képviselőit, melyekben Z jelentése kovalens kötés és X halogénatom, az 5,147,879, 5,328,906 és az 5,296,606 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírások ismertetik. Ezek a vegyületek előállíthatok a fenti szabadalmi leírásokban ismertetett eljárásokkal, előnyösen a megfelelő X=NH2-származékok diazotálásával alkalmas hidrogén-halogenid jelenlétében. A kiindulási anyagokat ismert eljárásokkal kaphatjuk meg, például a 177 578 lajstromszámú magyar szabadalmi leírás (1976) szerint oly módon, hogy egy 1 képletű (R'=R2=H) amid-oxímot bázis jelenlétében összekapcsolunk egy 2 képletű vegyület reaktív származékával, és a kapott vegyületet diazotálhatjuk szokásosan izolálás és tisztítás nélkül. A vegyületek terminális A és R csoportjait kívánt esetben tovább módosíthatjuk és derivatizálhatjuk.
Az (I) általános képletű hidroxil-amin-származékok egy másik nem korlátozó jellegű előnyös csoportjában Z jelentése kovalens kötés és X egy OQ szubsztituált hidroxilcsoport, ahol Q egy szubsztituálatlan vagy szubsztituált alkil- vagy aralkilcsoportot jelent. Az előnyös vegyületekben Q egy lineáris vagy elágazó alkilcsoport. Ezekben a vegyületekben A aril- vagy heteroarilcsoport, előnyösen egy N-tartalmú heteroaromás csoport; és R előnyösen (i) ω-amino-alkil-; (ii) az aminorészben mono- vagy diszubsztituált ω-amino-alkil-; (iii) az alkilrészben szubsztituált ω-amino-alkil-; (iv) az aminorészben mono- vagy diszubsztituált és az alkilrészben is, előnyösen egy hidroxi- vagy acil-oxi-csoporttal szubsztituált ω-amino-alkil-csoport. Az előnyös (i)—(iv) ω-amino-alkil-csoportok azok, melyekben az alkilrész 3-8 szénatomos.
Az (I) általános képletű hidroxil-amin-származékok, melyekben Z kovalens kötést és X OQ képletű csoportot jelent, egy speciális csoportját képezik az (P) képletű vegyületek. Az (Γ) képlet egy hidroxilcsoporton keresztül bezárt gyűrűt tartalmaz. Ezek a vegyületek azon (I) általános képletű vegyületek ciklikus formáját repre6
HU 222 994 Bl zentálják, ahol R jelentése -(CH2)-CH(OH)-R”, R” pedig egy lineáris vagy elágazó alkil-, egy szubsztituált lineáris vagy elágazó alkilcsoport, előnyösen egy ωamino-alkil-csoport, amely adott esetben az aminocsoportján szubsztituálva van, és előnyösen 1-5 szénatomos egyenes vagy elágazó alkilláncot tartalmaz. R” jelentése különösen előnyösen az aminocsoporton monovagy diszubsztituált ω-amino-alkil-csoport, mely egymástól független aminoszubsztituensként egy vagy két lineáris vagy elágazó alkilcsoportot vagy cikloalkilcsoportot tartalmazhat, vagy amelynek két aminoszubsztituense a közrezárt N-atommal együtt egy 3-7 tagú, előnyösen 5-7 tagú, adott esetben további heteroatomot tartalmazó telített heterogyűrűt képez.
Előnyös vegyületek azok, melyekben A jelentése fenil-, szubsztituált fenil-, N-tartalmú heteroaril-, szubsztituált N-tartalmú heteroaril-, S-tartalmú heteroarilvagy szubsztituált S-tartalmú heteroarilcsoport.
Az (I) általános képletű hidroxil-amin-származékok közül azokat, melyekben Z jelentése kovalens kötés és X jelentése OQ-csoport, a 2385/1992 alapszámú magyar szabadalmi bejelentés ismerteti. Ezeket a vegyületeket előállíthatjuk a megfelelő halogénszármazékokból [az (I) képletű hidroxil-amin-származékok, ahol Z jelentése kovalens kötés és X halogénatom] fenti szabadalmi bejelentésben ismertetett eljárásokkal, például alkoxidokkal reagáltatva, vagy egy lúgos gyűrűzárással az (F) képletű ciklikus vegyületekké.
Az (I) általános képletű hidroxil-amin-származékok egy másik nem korlátozó jellegű előnyös csoportjában Z kovalens kötést és X -NR1R2-csoportot jelent, ahol R1 és R2 jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom, egy lineáris vagy elágazó szénláncú alkil-, szubsztituált lineáris vagy elágazó láncú alkil-, cikloalkilcsoport, vagy R1 és R2 a szomszédos nitrogénatommal együtt egy 3-7 tagú telített gyűrűt képez, előnyösen 5-7 tagú gyűrűt.
Ezen vegyületek közül különösen előnyösek azok, amelyekben R jelentése (i) ω-amino-alkil-; (ii) az aminorészben mono- vagy diszubsztituált ω-amino-alkil-;
(iii) az alkilrészben szubsztituált ω-amino-alkil-; (iv) az aminorészben mono- vagy diszubsztituált és az alkilrészben is, előnyösen egy hidroxi- vagy acil-oxi-csoporttal szubsztituált ω-amino-alkil-csoport. Az előnyös (i)—(iv) ω-amino-alkil-csoportok azok, melyekben az alkilrész 3-8 szénatomos. Ezen vegyületek közül továbbá előnyösek azok, melyekben A jelentése (i) aralkil- vagy az arilrészben szubsztituált aralkilcsoport, előnyösen fenil-alkil- vagy egy vagy több, előnyösen alkoxiszubsztituenst hordozó fenil-alkil-csoport; (ii) arilvagy szubsztituált aril-, előnyösen fenil- vagy szubsztituált fenil-, előnyösen egy vagy több halogénatommal, alkil-, halogén-alkil-, alkoxi-, nitro- vagy acil-aminocsoporttal szubsztituált fenil-csoport; (iii) naftilcsoport;
(iv) egy N-tartalmú heteroarilcsoport, beleértve azokat, melyek egy benzolgyűrűvel lehetnek kondenzálva, előnyösen piridilcsoport; (v) egy S-tartalmú heteroarilcsoport; (vi) egy O-tartalmú heteroarilcsoport.
Azon (I) általános képletű hidroxil-amin-származékok, melyekben Z jelentése kovalens kötés és X
-NR1R2-csoportot jelent, részben ismertek és részben újak. A 177 578 lajstromszámú magyar szabadalmi leírás ismerteti azokat a vegyületeket, ahol X -NH2-csoportot jelent, és ezeket megszintetizálhatjuk úgy, hogy az 1 képletű (az 1 képletben R*=R2=H) szubsztituálatlan amid-oxim-származékokat egy bázis jelenlétében alkilezzük egy 2 képletű vegyület reaktív származékával.
Azoknak az (I) általános képletű hidroxil-amin-származékoknak, melyekben Z jelentése kovalens kötés és X -NR'R2 képletű csoportot jelent, egy másik speciális csoportját az (I”) képletű vegyületek alkotják. Az (I”) képlet az (I) általános képlet olyan ciklikus formáját jelenti, amely az -NR*R2-csoporton keresztül bezárt gyűrűt tartalmaz. Ezeket a vegyületeket azon (I) általános képletű vegyületekből vezethetjük le, melyekben R2 hidrogénatom és R -CH2-CH(OH)-R” képletű csoportot jelent, ahol R” egy lineáris vagy elágazó szénláncú alkil- vagy egy szubsztituált lineáris vagy elágazó alkilcsoport.
Az (I”) általános képletű vegyületek közül előnyösek azok, melyekben A jelentése (i) aril- vagy szubsztituált aril-, előnyösen fenil- vagy szubsztituált fenil-, előnyösen egy vagy több halogénatommal, alkil-, halogénalkil-, alkoxi-, amino- vagy nitrocsoporttal szubsztituált fenilcsoport; (ii) naftilcsoport; (iii) egy N-tartalmú heteroarilcsoport, beleértve azokat, melyek egy benzolgyűrűvel lehetnek kondenzálva; (iv) egy S-tartalmú heteroarilcsoport; és (v) egy O-tartalmú heteroarilcsoport. Különösen előnyösek azok a vegyületek, melyekben R” jelentése (i) az aminorészben mono- vagy diszubsztituált ωamino-alkil-, vagy (ii) az aminorészben mono- vagy diszubsztituált és az alkilrészben is szubsztituált ω-amino-alkil-csoport, és előnyösen az (i) és (ii) ω-amino-alkil-csoport az alkilrészében 1-5 szénatomot tartalmaz. Különösen előnyös, ha az ω-amino-alkil-csoport aminocsoportja diszubsztituált, ahol a szubsztituensek a szomszédos nitrogénatommal együtt egy 3-7 tagú, előnyösen 5-7 tagú telített heterociklusos gyűrűt alkotnak. A heterociklusos gyűrű további heteroatom(oka)t tartalmazhat.
Ezekben az ω-amino-alkil-csoportokban az aminoszubsztituens előnyösen lineáris vagy elágazó láncú alkilcsoport vagy cikloalkilcsoport. Az (I”) általános képletű vegyületekben R1 jelentése hidrogénatom, szubsztituálatlan vagy szubsztituált egyenes vagy elágazó láncú alkilcsoport, cikloalkilcsoport, szubsztituálatlan vagy az alkil- és/vagy az arilrészében szubsztituált aralkilcsoport.
Az (I”) általános képletű vegyületeket az N(4)-C(5) atomok közötti gyűrűzárással állíthatjuk elő. A megfelelő nyílt szénláncú származékok olyan (I) általános képletű vegyületek, amelyekben Z jelentése kovalens kötés, X jelentése =NR1R2-csoport, ahol R1 jelentése azonos az (I”) általános képlettel kapcsolatban az imént megadottakkal, R2 jelentése pedig hidrogénatom, míg R jelentése egy -CH2-CHY5-R” képletű csoport, ahol Y5 egy kilépőcsoportot jelent, például halogénatomot. Ezeket a származékokat a megfelelő Y5=OH vegyületekből kaphatjuk meg egy szervetlen halogénezőszerrel, például tionil-kloriddal vagy foszfor-pentakloriddal. A halogéne7
HU 222 994 ΒΙ zést kivitelezhetjük egy inért oldószerben, például benzolban, kloroformban, tetrahidrofuránban stb. vagy anélkül, forralás közben. A reagensfelesleg eltávolítása után, például a tionil-klorid lepárlásával, a nyers halogénszármazékot ciklizáljuk - vagy izolálás és tisztítás nélkül vagy ezek után - egy erős bázissal történő kezeléssel, például t-butanolban kálium-butoxiddal, és így az (I”) képletű vegyülethez jutunk, melyet végül standard eljárásokkal izolálunk és tisztítunk (extrahálás, átkristályosítás stb.).
Az (I) általános képletű hidroxil-amin-származékok egy másik nem korlátozó jellegű előnyös csoportját azok a vegyületek alkotják, melyekben Z jelentése oxigénatom és X jelentése -OQ képletű csoport, ahol Q egy alkil-, szubsztituált alkil-, aralkil- vagy az arilvagy alkilrészben szubsztituált aralkilcsoportot jelent. Az alkil- vagy a szubsztituált alkilcsoport Q jelentésében előnyösen 1-4 szénatomos. Ezen vegyületek közül előnyösek azok, melyekben A egy alkil-, szubsztituált alkil-, előnyösen 1-4 szénatomos, vagy aralkil- vagy az aril- vagy alkilrészben szubsztituált aralkilcsoport. Előnyös vegyületek továbbá azok, melyekben R jelentése (i) ω-amino-alkil-; (ii) az aminorészben mono- vagy diszubsztituált ω-amino-alkil-; (iii) az alkilrészben szubsztituált ω-amino-alkil-; (iv) az aminorészben mono- vagy diszubsztituált és az alkilrészben is, előnyösen egy hidroxi- vagy acil-oxi-csoporttal szubsztituált ω-amino-alkil-csoport.
Azokat az (I) általános képletű hidroxil-amin-származékokat, melyekben Z jelentése oxigénatom és X -OQ-csoportot jelent, a 6 képletű O-szubsztituált hidroxil-aminok [lásd a 2,651,083 számú NSZK-beli közrebocsátási iratot (1976)] és a 7 képletű ortoészterek reakciójával állíthatjuk elő. A kondenzációt kivitelezhetjük a reagensekben önmagukban, mint oldószerekben, előnyösen a forrásponton. Bepárlás után kristályosítással a terméket izoláljuk, és adott esetben (ha az R oldalláncban aminfunkció van) savaddiciós sóvá alakítjuk.
Az (I) általános képletű hidroxil-amin-származékok egy másik nem korlátozó jellegű előnyös csoportját azon vegyületek képezik, melyekben Z oxigénatomot és X -NR*R2-csoportot jelent, ahol R1 és R2 jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom, egyenes vagy elágazó szénláncú alkil-, szubsztituált egyenes vagy elágazó láncú alkil-, cikloalkil-, aril-, szubsztituált arilcsoport, vagy R1 és R2 a szomszédos nitrogénatommal együtt egy telített 3-7 tagú, előnyösen 5-7 tagú telített gyűrűt képez. Ezen vegyületek közül különösen előnyösek azok, melyekben R jelentése (i) ω-amino-alkil-; (ii) az aminorészben mono- vagy diszubsztituált ω-aminoalkil-; (iii) az alkilrészben szubsztituált ω-amino-alkil-; (iv) az aminorészben mono- vagy diszubsztituált és alkilrészben is, előnyösen hidroxi- vagy acil-oxi-csoporttal szubsztituált ω-amino-alkil-csoport, és az (i)—(ív) ω-amino-alkil-csoportokban az alkilrész 3-8 szénatomos. Ezen vegyületek közül előnyösek azok, ahol A jelentése (i) alkil- vagy szubsztituált alkil-; (iii) aralkil-, vagy az aril- és/vagy alkilrészben szubsztituált aralkil-; vagy (iv) aril- vagy szubsztituált aril-, előnyösen fenil- vagy szubsztituált fenilcsoport.
Ezeket a következő bekezdésben leírt módon állíthatjuk elő, attól függően, hogy X jelentése egy szubsztituálatlan amino- (-NH2) vagy egy szubsztituált aminocsoport-e.
(i) Azon vegyületek előállítását, ahol X -NH2-csoport, a 6 képletű hidroxil-aminoknak egy A-O-CN képletű szerves cianátra történő addíciójával valósíthatjuk meg [lásd például Chem. Bér. 98, 144 (1965)]. A reakciót egy inért szerves oldószerben, rendszerint szobahőmérsékleten hajtjuk végre. Az izolálás gyakran kromatográfiás tisztítást tesz szükségessé.
(ii) Azokat a vegyületeket, ahol X jelentése monoszubsztituált aminocsoport (például -NHR1), egy 9 képletű ismert haloformimidátból [lásd Houben-Weil: „Methoden dér Organischen Chemie”, E/4 kötet, 544. o. (1983)] és egy 6 képletű vegyületből egy szerves bázis (például trietil-amin) vagy egy szervetlen bázis (például nátrium-karbonát) jelenlétében inért oldószerben, mint a benzol, tetrahidrofurán stb., ezt követő standard feldolgozási és tisztítási eljárásokkal állítjuk elő.
(iii) Azokat a vegyületeket, ahol X egy diszubsztituált aminocsoportot jelent, egy 5 képletű szekunder amin és (I) képletű vegyület - ahol Z oxigénatomot és X -OQ-csoportot jelent (ezek előállítását lásd fent) reakciójával állítjuk elő. Ezen aminálási reakciókat egy poláros, szerves oldószerben, például etanolban hajtjuk végre, és ha szükséges, az elegyet refluxáljuk.
Az (I) képletű hidroxil-amin-származékok egy további nem korlátozó jellegű előnyös csoportját azok a vegyületek alkotják, melyekben Z jelentése =NR3-csoport, ahol R3 jelentése hidrogénatom, alkil-, szubsztituált alkil-, aril-, szubsztituált aril-, aralkil- vagy az alkil- vagy arilrészben szubsztituált aralkilcsoport; és X jelentése -NR*R2, ahol R1 és R2 jelentése egymástól függetlenül H, egyenes vagy elágazó láncú alkil-, szubsztituált egyenes vagy elágazó láncú alkil-, aril- vagy szubsztituált aril-, cikloalkilcsoport, vagy R1 és R2 a szomszédos nitrogénatommal együtt egy 3-7 tagú, előnyösen 5-7 tagú telített gyűrűt képez.
Ezekben a vegyületekben továbbá előnyös, ha A jelentése alkil-, szubsztituált alkil, aralkil-, az aril- vagy alkilrészben szubsztituált aralkil-, aril- vagy szubsztituált arilcsoport. Ehhez a csoporthoz tartozó hidroxilamin-származékokban R előnyös jelentése (i) ω-amino-alkil-; (ii) az aminorészben mono- vagy diszubsztituált ω-amino-alkil-; (iii) az alkilrészben szubsztituált ω-amino-alkil-; (iv) az aminorészben mono- vagy diszubsztituált és alkilrészben is, előnyösen hidroxivagy acil-oxi-csoporttal szubsztituált ω-amino-alkilcsoport, és az (i)—(iv) ω-amino-alkil-csoportokban az alkilrész 3-8 szénatomos.
Azokat az (I) általános képletű hidroxil-amin-származékokat, ahol Z =NR3 és X -NR>R2-csoportot jelent, egy, a fent leírt csoporthoz tartozó [ez a csoport olyan (I) képletű hidroxil-amin-származéknak felel meg, ahol Z oxigénatom és X -NR'R2) megfelelő izokarbamidszármazék aminolízisével állítjuk elő ammóniával vagy egy primer vagy szekunder aminnal. A reakciót poláros oldószerben, például vízben vagy etanolban, aminfelesleg jelenlétében vitelezzük ki. Eljárhatunk úgy is, hogy a
HU 222 994 Bl képletű halogén-formamidokat [Houben-Weil: „Methoden dér Organischen Chemie”, E/4 kötet, 553. o. (1983)] reagáltathatjuk egy 6 képletű vegyülettel szerves vagy szervetlen bázis jelenlétében. A reakciót inért, szerves oldószerben, rendszerint szobahőmérsékleten hajtjuk végre.
Azokat a vegyületeket, ahol R jelentése (b) képletű csoport, amelyben R7 acilcsoportot jelent, a megfelelő R7=H-származékok észterifikálásával állítjuk elő. Az alkil- vagy aril-észtereket rendszerint egy tercier amin vagy egy szervetlen bázis jelenlétében egy savkloriddal vagy savanhidriddel kapjuk meg, előnyösen inért oldószerben.
A találmány szerinti hidroxil-amin-származékok egy másik, a jelen találmányban felhasználható csoportját a (II) általános képletű vegyületek képezik, melyek az (I) képletű vegyületek tautomer formáját reprezentálják. A (II) általános képletű vegyületek egyik nem korlátozó jellegű, előnyös csoportját azok a vegyületek alkotják, melyekben Z kovalens kötést és X oxigénatomot jelent. Ehhez a csoporthoz tartozó előnyös vegyületekben A jelentése (i) alkil-, aralkil- vagy az aril- vagy alkilrészben szubsztituált aralkil-; (ii) aril-, szubsztituált aril-, előnyösen fenil- vagy egy vagy több szubsztituenst hordozó fenil-, ahol az előnyös szubszituensek közé tartozik az alkil-, halogén-alkil vagy alkoxicsoport; (iii) N-tartalmú heteroaril-, előnyösen piridilcsoport; vagy (iv) S-tartalmú heteroarilcsoport. Ehhez a csoporthoz tartozó vegyületekben R jelentése előnyösen (i) ω-amino-alkil-; (ii) az aminorészben mono- vagy diszubsztituált ω-amino-alkil-; (iii) az alkilrészben szubsztituált ω-amino-alkil-; (iv) az aminorészben mono- vagy diszubsztituált és alkilrészben is, előnyösen hidroxi- vagy acil-oxi-csoporttal szubsztituált ω-amino-alkil-csoport, és az (i)—(iv) ω-amino-alkil-csoportokban az alkilrész 3-8 szénatomos. Előnyös vegyületek azok, amelyekben R’ jelentése hidrogénatom, alkil-, szubsztituált alkil-, aril-, szubsztituált aril-, aralkil- vagy az alkil- vagy arilrészben szubsztituált aralkilcsoport.
Ehhez a csoporthoz tartozó vegyületeket és az előállításukra szolgáló eljárásokat a 2385/1992 számú magyar szabadalmi bejelentés ismerteti. Legelőnyösebben ezeket a vegyületeket egy 6 képletű O-szubsztituált hidroxil-amin-származéknak (lásd például 2,651,083 számú NSZK-beli közrebocsátási irat) egy 11 képletű savkloriddal való acilezésével kaphatjuk meg. Ez az út alkalmazható azon új származékok előállítására is, melyekben R’ hidrogénatomtól eltérő jelentésű, ekkor a 6 képletű vegyület helyett egy 12 képletűt alkalmazunk kiindulási anyagként.
A (II) általános képletű hidroxil-amin-származékok egy másik nem korlátozó jellegű előnyös csoportját azok a vegyületek alkotják, melyekben Z kémiai kötést és X egy =NR4 képletű csoportot jelent, ahol R4 jelentése H, alkil-, szubsztituált alkil-, aril-, szubsztituált aril-, aralkil-, az aril- vagy alkilrészében szubsztituált aralkil- vagy cikloalkilcsoport; és R’ egy alkil-, szubsztituált alkil-, aril-, szubsztituált aril-, aralkil-, vagy az aril- vagy alkilrészében szubsztituált aralkilcsoportot jelent. Ezen vegyületek között előnyösek azok, melyekben A jelentése (i) aralkil- vagy az arilrészben szubsztituált aralkil-, előnyösen fenil-alkil- vagy egy vagy több szubsztituenst, előnyösen alkoxicsoportot hordozó fenil-alkil-csoport; (ii) aril- vagy szubsztituált aril-, előnyösen fenil- vagy szubsztituált fenil-, előnyösen egy vagy több alkil-, halogén-alkil- vagy nitrocsoporttal szubsztituált fenilcsoport; (iii) naftilcsoport; (iv) Ntartalmú heteroaril-, előnyösen piridilcsoport; vagy (v) S-tartalmú heteroarilcsoport. Ebbe a csoportba tartozó vegyületekben R jelentése előnyösen (i) ω-amino-alkil-; (ii) az aminorészben mono- vagy diszubsztituált ω-amino-alkil-; (iii) az alkilrészben szubsztituált ω-amino-alkil-; (iv) az aminorészben mono- vagy diszubsztituált és alkilrészben is, előnyösen hidroxi- vagy aciloxi-csoporttal szubsztituált ω-amino-alkil-csoport, és az (i)—(iv) ω-amino-alkil-csoportokban az alkilrész 3-8 szénatomos.
Ezeket a vegyületeket vagy egy 13 képletű N,N’diszubsztituált amid-oxim O-alkilezésével állíthatjuk elő egy 2 képletű vegyület segítségével [a reakciókörülményeket lásd azon (I) általános képletű vegyületek előállításánál, ahol Z kovalens kötést és X -NR'R2-csoportot jelent], vagy egy 12 képletű N,O-diszubsztituált hidroxil-amint egy 16 képletű imidoil-halogeniddel acilezünk, mely reakciót inért oldószerben, célszerűen szerves vagy szervetlen savkötő jelenlétében hajtunk végre.
Azokat a vegyületeket, ahol R jelentése (b) képletű csoport, amelyben R7 acilcsoportot jelent, a megfelelő R7=H-származékok észterifikálásával állítjuk elő. Az alkil- vagy aril-észtereket rendszerint egy tercier amin vagy egy szervetlen bázis jelenlétében egy savkloriddal vagy savanhidriddel kapjuk meg, előnyösen inért oldószerben.
A (II) általános képletű hidroxil-amin-származékok egy másik nem korlátozó jellegű előnyös csoportját azok a vegyületek alkotják, melyekben Z és X is oxigénatomot jelent. Ekkor A jelentése előnyösen alkil-, szubsztituált alkil-, aralkil- vagy az aril- vagy alkilrészben szubsztituált aralkilcsoport. R jelentése előnyösen (i) ω-amino-alkil-; (ii) az aminorészben mono- vagy diszubsztituált ω-amino-alkil-; (iii) az alkilrészben szubsztituált ω-amino-alkil-; (iv) az aminorészben mono- vagy diszubsztituált és alkilrészben is, előnyösen hidroxi- vagy acil-oxi-csoporttal szubsztituált ω-aminoalkil-csoport, és az (i)-(iv) ω-amino-alkil-csoportokban az alkilrész 3-8 szénatomos. Előnyös vegyületek azok, amelyekben R’ jelentése hidrogénatom, alkil-, szubsztituált alkil-, aril-, szubsztituált aril-, aralkil- vagy az alkil- vagy arilrészben szubsztituált aralkilcsoport.
Ehhez a csoporthoz tartozó vegyületeket ismertet az 1995. 06. 15-én benyújtott 1756/95 alapszámú magyar szabadalmi bejelentés. Előállíthatók egy 6 vagy 12 képletű hidroxil-amin acilezésével egy 14 képletű klórhangyasav-észterrel, hasonlóképpen, mint egy egyszerű savkloriddal, amint azt a (II) képletű vegyületek szintézisénél leírtuk, melyekben Z kovalens kötés és X oxigénatomot jelent. A reakcióhoz egy bázis szükséges, mely lehet szervetlen vagy szerves, és a reakciót egy
HU 222 994 Bl inért oldószerben, például kloroformban végezzük. A melléktermék sót például vizes extrakcióval eltávolítjuk, és a terméket a szerves fázisból izoláljuk.
A (II) általános képletű hidroxil-amin-származékok egy még további, nem korlátozó jellegű előnyös csoportját azok a vegyületek alkotják, melyekben Z oxigénatomot, és X egy =NR4 képletű csoportot jelent, ahol R4 jelentése alkil-, szubsztituált alkil-, aralkil-, az aril- vagy alkilrészben szubsztituált aralkil-, aril-, szubsztituált aril-, heteroaril- vagy szubsztituált heteroarilcsoportot jelent. Ezen vegyületek között előnyösek azok, melyekben A jelentése alkil-, szubsztituált alkil-, aril- vagy szubsztituált aril-, legelőnyösebben fenilvagy szubsztituált fenil-, aralkil- vagy az aril- vagy alkilrészben szubsztituált aralkilcsoport, és R jelentése előnyösen ω-amino-alkil-csoport, mely az alkilrészben egy hidroxi- vagy acil-oxi-csoportot tartalmaz, és adott esetben az amin nitrogénje is szubsztituált, ahol a nevezett ω-amino-alkil-csoport alkillánca 3-8 szénatomos. Ezen vegyületekben R’ előnyösen szubsztituálatlan vagy szubsztituált alkil-, aril- vagy aralkilcsoport.
Ezek a vegyületek N-szubsztituált analógjai azon (I) általános képletű vegyületeknek, ahol Z oxigénatomot és X -NR*R2 képletű csoportot jelent, és hasonló módon előállíthatok a 9 képletű haloformimidátokból és egy 12 képletű vegyületből inért oldószerben (például benzol, tetrahidrofurán stb.) egy szerves bázis (például trietil-amin) vagy szervetlen bázis, például nátrium-karbonát jelenlétében, majd ezt követő szokásos feldolgozási és tisztítási eljárásokkal.
A (II) általános képletű hidroxil-amin-származékok egy másik nem korlátozó jellegű előnyös csoportját alkotó vegyületekben Z jelentése -NR3 képletű csoport, ahol R3 jelentése hidrogénatom, alkil-, szubsztituált alkil-, aril-, szubsztituált aril-, aralkil- és az aril- vagy alkilrészben szubsztituált aralkilcsoport lehet; és X jelentése oxigénatom. Előnyösen A jelentése (i) aralkil-, vagy az alkil- vagy arilrészében szubsztituált aralkil, előnyösen fenil-alkil- vagy egy vagy több alkilszubsztituenst hordozó fenil-alkil-csoport; (ii) aril- vagy szubsztituált aril-, előnyösen fenil- vagy szubsztituált fenil-, előnyösen egy vagy több alkil-, alkoxi-, halogén-, halogén-alkil- vagy nitrocsoporttal szubsztituált fenilcsoport; (iii) N-tartalmú heteroarilcsoport; (iv) lineáris vagy elágazó láncú, előnyösen 4-12 szénatomos alkilvagy szubsztituált alkilcsoport; vagy (v) cikloalkilcsoport. Ehhez a csoporthoz tartozó vegyületekben R jelentése előnyösen (i) ω-amino-alkil-; (ii) az aminorészben mono- vagy diszubsztituált ω-amino-alkil-; (iii) az alkilrészben szubsztituált ω-amino-alkil-; (iv) az aminorészben mono- vagy diszubsztituált és alkilrészben is, előnyösen hidroxi- vagy acil-oxi-csoporttal szubsztituált ω-amino-alkil-csoport, és az (i)—(iv) ω-amino-alkil-csoportokban az alkilrész 3-8 szénatomos. Ezekben a vegyületekben R’ jelentése előnyösen hidrogénatom, alkil-, szubsztituált alkil-, aralkil- vagy az alkil- vagy arilrészben szubsztituált aralkil-, aril-, szubsztituált aril-, acil- vagy szubsztituált acilcsoport.
Ezeket a vegyületeket az 1765/95 alapszámú magyar szabadalmi bejelentés ismerteti, és egy 6 vagy képletű hidroxil-amin és egy 15 képletű izocianát reakciójával állíthatók elő inért oldószerben, a reakcióelegy keverésével, szobahőmérsékleten, 2-24 óra alatt. A reakció végén a termékeket izoláljuk - az oldószer bepárlása után - előnyösen kristályosítással.
A (II) általános képletű hidroxil-amin-származékok egy további nem korlátozó jellegű előnyös csoportját azok a vegyületek alkotják, melyekben Z jelentése =NR3-csoport, ahol R3 jelentése hidrogénatom, alkil-, szubsztituált alkil-, aril- szubsztituált aril-, aralkil vagy az aril- vagy alkilrészben szubsztituált aralkilcsoport; X =NR4-csoportot jelent, ahol R4 jelentése H, alkil-, szubsztituált alkil-, aril-, szubsztituált aril-, aralkil-, az arilvagy alkilrészben szubsztitutált aralkil-, cikloalkilcsoport; és R’ jelentése alkil-, szubsztituált alkil-, aralkilvagy az aril- vagy alkilrészben szubsztituált aralkilcsoport, vagy aril- vagy szubsztituált arilcsoport. Ebbe a csoportba tartozó vegyületekben előnyösen R3 jelentése hidrogénatom, alkil- vagy szubsztituált alkilcsoport, R4 jelentése hidrogénatom vagy arilcsoport, A jelentése alkil-, szubsztituált alkil, aril- vagy szubsztituált arilcsoport vagy aralkilcsoport, vagy az aril- és/vagy alkilrészben szubsztituált aralkilcsoport. Ezekben a vegyületekben R előnyösen (i) ω-amino-alkil-; (ii) az aminorészben mono- vagy diszubsztituált ω-amino-alkil-; (iii) az alkilrészben szubsztituált ω-amino-alkil-; (iv) az aminorészben mono- vagy diszubsztituált és alkilrészben is, előnyösen hidroxi- vagy acil-oxi-csoporttal szubsztituált ω-amino-alkil-csoport, és az (i)—(iv) ω-amino-alkil-csoportokban az alkilrész 3-8 szénatomos.
Ebbe a csoportba tartozó vegyületeket a megfelelő izokarbamidszármazék [olyan (II) képletű vegyület, ahol Z oxigénatom és X -NR4] egy primer vagy szekunder aminnal vagy ammóniával történő aminolízisével állíthatjuk elő. A reakciót poláros oldószerben (például etanol vagy víz) aminfelesleg jelenlétében vitelezzük ki. Megkaphatjuk ezeket a vegyületeket úgy is, hogy egy 10 képletű haloformamidint egy 12 képletű vegyülettel egy szerves vagy szervetlen bázis jelenlétében reagáltatunk inért oldószerben, rendszerint a forrásponton.
Az (I) általános képletű hidroxil-amin-származékok egyik nem korlátozó jellegű előnyös csoportját olyan új vegyületek alkotják, melyekben X jelentése halogénatom, előnyösen klór- vagy brómatom; Z jelentése kovalens kötés és A jelentése (a) képletű csoport, ahol Y1 jelentése halogénatom, alkoxi-, nitro- vagy halogén-alkil-, előnyösen 1-4 szénatomos halogén-alkil-csoport; és n jelentése 1, 2 vagy 3; vagy O-tartalmú heteroaril-, előnyösen fúril-, S-tartalmú heteroaril- (előnyösen tienil-) vagy N-tartalmú heteroaril- (előnyösen piridil-, kinolil- vagy izokinolil-) csoport, amely kondenzálva lehet egy benzolgyűrűvel, és R egy (b) képletű csoport, ahol R5 és R6 egymástól függetlenül H, egyenes vagy elágazó szénláncú alkil-, előnyösen 1-4 szénatomos alkil- vagy cikloalkilcsoportot jelent, vagy R5 és R6 a szomszédos nitrogénatommal együtt egy 3-7 tagú, előnyösen 5-7 tagú heterociklusos gyűrűt képez, Y6 jelentése -OR7-csoport, ahol R7 jelentése H vagy acilcsoport, előnyösen alkil-karbonil-, szubsztituált alkil-kar10
HU 222 994 Bl bonil-, aril-karbonil- vagy szubsztituált aril-karbonilcsoport vagy amino-acil- vagy szubsztituált aminoacil-csoport, k jelentése 1, 2 vagy 3; és m jelentése 1, 2 vagy 3, azzal a megkötéssel, hogy ha A jelentése piridil- vagy naftilcsoport, vagy olyan (a) képletű csoport, ahol Y1 jelentése halogénatom vagy alkoxicsoport, akkor R7 jelentése hidrogénatomtól eltérő. Ezek a vegyületek adott esetben A szubsztituensként 1-4 szénatomos alkilcsoporttal N-kvatemerezett vagy N-oxidált N-tartalmú heteroaromás csoportot és/vagy olyan R szubsztituenst tartalmazhatnak, amelyben az R5 és R6 terminális csoportokból képzett gyűrű N-kvatemerezett vagy N-oxidált telített heterociklusos gyűrű. Előnyösek e vegyületek között azok, amelyek képletében A olyan (a) képletű csoportot jelent, amelyben Y1 trifluor-metilcsoport. Az (I) általános képletű hidroxil-amin-származékoknak ebbe a csoportjába tartoznak az olyan vegyületek optikailag aktív sztereoizomeqei is, amelyek képletében X jelentése halogénatom, A jelentése piridilcsoport, Z jelentése kovalens kötés és R jelentése (b) képletű csoport, amelyben R5 és R6 jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom, egyenes vagy elágazó láncú alkilcsoport, előnyösen 1-4 szénatomos alkilcsoport vagy cikloalkilcsoport, vagy R5 és R6 a közrezárt nitrogénatommal együtt 3-7 tagú, előnyösen 5-7 tagú telített heterociklusos gyűrűt képez, Y6 jelentése -OR7csoport, ahol R7 jelentése amino-acil-csoport, k jelentése 1,2 vagy 3 és m jelentése 1,2 vagy 3.
Ezeket az új vegyületeket az 5,147,879, 5,328,906 és 5,296,606 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírásokban ismertetett eljárásokkal analóg módon állíthatjuk elő. így például:
(i) Azokat a származékokat, amelyekben R5 és R6 hidrogénatomtól eltérő jelentésű, a megfelelő aminoszármazék [(I) képletű hidroxil-amin-származékok, ahol Z jelentése kovalens kötés és X jelentése -NH2-csoport] diazotálásával egy alkalmas hídrogén-halogenid jelenlétében az 5,147,879, 5,328,906 és az 5,296,606 számú szabadalmi leírásokban leírt eljáráshoz hasonlóan állítjuk elő. A kiindulási vegyületeket szintén ismert eljárásokkal kaphatjuk meg, például a 177 578 lajstromszámú magyar szabadalmi leírás szerint, nevezetesen egy 1 képletű amid-oxim - ahol R1 és R2 hidrogén - és valamely 2 képletű reaktív származék összekapcsolásával egy bázis jelenlétében, és a kapott vegyület diazotálásával rendszerint izolálás és tisztítás nélkül.
(ii) Ha az előállítandó vegyületben R7 jelentése H és m 1, a szintézist egy 3 képletű oxirán és egy 4 képletű amin reagáltatásával valósíthatjuk meg. Ezzel az eljárással előállíthatjuk az R5=H-származékokat is.
(iii) Azokat a vegyületeket, ahol R jelentése (b) képletű csoport, amelyben R7 acilcsoportot jelent, a megfelelő R7=H-származékok észterifikálásával állítjuk elő. Az alkil- vagy aril-észtereket rendszerint egy tercier amin vagy egy szervetlen bázis jelenlétében egy savkloriddal vagy savanhidriddel kapjuk meg, előnyösen inért oldószerben, vagy bizonyos esetben Schotten-Bauman-féle eljárással kétfázisú rendszerben vizes szervetlen bázis alkalmazásával. Az amino-acil-észterek, karboxilaktivált N-védett aminosavszármazékok (például aktív észterek) előállítására alkalmazott reagensek és eljárások alapvetően ismertek a peptidkémiából. A kapcsolási reakciókhoz ugyancsak bázis jelenléte szükséges (például trietil-amin). A kapott termékek izolálását és tisztítását a szokásosan alkalmazott preparatív technikákkal végezzük; a végterméket gyakran egy alkalmas szervetlen vagy szerves savval sóvá alakítjuk. Királis aminosavakból kiindulva a termékek következésképpen az R csoportban egy második királis centrummal rendelkező diasztereomerek. Az izolálás során ezek a diasztereomerek gyakran elkülönülnek, és a terméket tiszta sztereoalakban kaphatjuk meg.
Az (I) általános képletű hidroxil-amin-származékok egy új csoportját alkotják azok, amelyekben Z jelentése kovalens kötés, X jelentése halogénatom, előnyösen klór- vagy brómatom; A jelentése (c) képletű csoport, és R jelentése (d) képletű csoport, és a tetszőleges Y2 és Y3 közül, melyek legalább egyike jelen van a molekulában, az egyik vagy mindkettő oxigénatom, vagy alkilvagy szubsztituált 1-4 szénatomos alkilcsoport; k és m jelentése 1, 2 vagy 3. Y2 és Y3 szaggatott vonallal kapcsolódnak, ami azt jelenti, hogy ezek a szubsztituensek adott esetben vannak jelen. Ha a vegyület egy- vagy kétértékű kation, akkor anionja egy vagy két halogenidion, előnyösen jodidion.
Ezeket a hidroxil-amin-származékokat a szubsztituálatlan prekurzorokban lévő terminális piridin- és/vagy piperidincsoportok kémiai módosításával (azaz Noxidáció vagy kvatemerizáció) állítjuk elő. Az oxidáláshoz persavakat (például szubsztituált perbenzoesavat) alkalmazunk egy inért oldószerben (például kloroform, diklór-metán). Ha két oxidálható csoport van jelen a molekulában, mono- vagy dioxidok képződnek attól függően, hogy milyen mennyiségű reagenst használunk. A reakció végén a reagensfelesleget elbontjuk, és a terméket bepárlással izoláljuk. A kvatemerizációt kivitelezhetjük alkil-halogenidekkel (például metil-jodid), előnyösen refluxolva a reagenseket egy alkalmas oldószerben, például acetonban. A kapott tennék gyakran oldhatatlan a közegben, és így egy egyszerű szűréssel izolálható.
Egy még további új csoportját képezik az (I) általános képlethez tartozó hidroxil-amin-származékoknak azok a vegyületek, amelyekben Z jelentése kovalens kötés, A jelentése aralkil-, szubsztituált aralkil-, előnyösen fenil-alkil-, mely egy vagy több alkoxi-, előnyösen 1-4 szénatomos alkoxicsoporttal szubsztituált, fenil-, egy vagy több szubsztituenst, előnyösen alkil-, előnyösen 1-4 szénatomos alkil- vagy halogén-alkil-, halogén-, acil-amino- vagy nitrocsoportot hordozó fenilcsoport; vagy egy N-tartalmú heteroarilcsoport, mely egy benzolgyűrűvel lehet kondenzálva, előnyösen pirrolil-, piridil-, izokinolil- vagy kinolilcsoport, vagy egy Startalmú heteroaromás csoport, előnyösen tienilcsoport, mely heteroaromás csoportokban a heteroarilcsoport egy vagy több alkil-, előnyösen 1-4 szénatomos alkilcsoporttal lehet helyettesítve; X jelentése -NR'R2 képletű csoport, ahol R' és R2 jelentése egymástól függetlenül H, egyenes vagy elágazó láncú alkil-, szubsztituált egyenes vagy elágazó láncú alkil-, előnyösen 1-6 szénatomos al11
HU 222 994 Bl kilcsoport vagy cikloalkilcsoport, vagy R1 és R2 együttesen a szomszédos nitrogénatommal együtt egy 3-7 tagú, előnyösen 5-7 tagú heterogyűrűt képez; R jelentése pedig (e) képletű csoport, ahol R5 és R6 egymástól függetlenül H, egyenes vagy elágazó láncú, adott esetben szubsztituált alkil-, előnyösen 1-4 szénatomos alkilcsoport vagy cikloalkilcsoport, vagy R5 és R6 a szomszédos nitrogénatommal együtt egy 3-7 tagú, előnyösen 5-7 tagú heterogyűrűt alkot, amely további heteroatomokat és szubsztituenseket is tartalmazhat, ahol a szubsztituensek előnyösen 1-4 szénatomos alkilcsoportok; Y4 jelentése H vagy 1-4 szénatomos alkil- vagy szubsztituált alkilcsoport; Y5 jelentése H vagy 1-4 szénatomos alkilvagy szubsztituált alkil-, vagy -OR7 képletű csoport, ahol R7 jelentése H vagy acilcsoport; k és m jelentése 1, 2 vagy 3, azzal a megkötéssel, hogy ha A jelentése szubsztituálatlan vagy halogénatommal vagy alkoxicsoporttal szubsztituált fenil-; vagy alkoxicsoporttal szubsztitutált fenil-alkil-; vagy piridilcsoport; és R7 jelentése H, akkor R1 és R2 közül legalább az egyik jelentése hidrogénatomtól eltérő, vagy ha A jelentése szubsztituálatlan vagy halogénatommal vagy alkoxicsoporttal szubsztituált fenil-; vagy alkoxicsoporttal szubsztituált fenil-alkil-; vagy piridilcsoport; és R1 és R2 közül az egyik hidrogénatomot jelent, akkor R7 jelentése hidrogénatomtól eltérő.
E vegyületek közül azokat, ahol X egy NH2-származék, a fent említett eljáráshoz hasonlóan a megfelelő 1 képletű intermedierek - ahol R1 és R2 hidrogénatom és egy 2 képletű vegyület reakciójával állítjuk elő. A 2 képletű alkilezőszer hidroxil- és/vagy aminoszubsztituenseket tartalmazhat. A reakcióhoz egy szervetlen vagy szerves bázis jelenléte szükséges, és előnyösen alkoholos alkoholátoldatot használunk közegként és bázisként. A termékeket gyakran egy szerves vagy szervetlen savval képzett só formájában izoláljuk.
Az imént meghatározott vegyületek egy másik csoportjára az jellemző, hogy R1 és R2 közül az egyik hidrogénatomtól eltérő jelentéssel bír. Az ilyen képletű vegyületeket kétféle módon állíthatjuk elő:
(i) olyan 1 képletű amid-oximokat, melyek már tartalmazzák a kívánt R'-et és/vagy R2-t, reagáltathatjuk egy 2 képletű reaktív vegyülettel hasonlóan az előző bekezdésben leírt eljáráshoz. Az 1 képletű szubsztituált amid-oxim kiindulási anyagok ismertek az irodalomból [Chem. Rév. 62, 155-183 (1962)].
(ii) Azon (I) általános képletű vegyületekben, ahol Z kovalens kötést és X halogénatomot jelent, a halogénatomnak egy 5 képletű aminnal való helyettesítése szintén ilyen vegyületeket eredményez. Az R csoportban OH szubsztituenst hordozó származékok esetében (Y4=OH) a hidroxilcsoportot védeni kell, és a helyettesítési reakció után a védőcsoportot eltávolítani, másképpen az (Γ) képletű ciklikus származékok képződése részesül előnyben. A védéshez az acetil típusú védőcsoportok (például tetrahidropiranilcsoport) bizonyultak a legelőnyösebbnek. A szabad vegyület védését kivitelezhetjük dihidropiránnal, ezt követően halogén/amin helyettesítéssel, amelyet rendszerint egy oldószerben, például alkoholban refluxálással végzünk. A termékről a védőcsoport eltávolítását végül savas kezeléssel végezhetjük, például etanolos oldatban p-toluolszulfonsav jelenlétében való forralással.
Mint említettük, az új vegyületeknek ehhez a csoportiához tartoznak azok is, amelyekben Y5 jelentése egy acil-oxi-csoport. Ezeket a megfelelő Y5=OH-származékok acilezésével állíthatjuk elő, melyek vagy ismertek az irodalomból (például 177 578 számú magyar szabadalmi leírás) vagy a jelen bejelentésben írtuk le őket. A reakciót azonos módon végezzük azzal, melyet az analóg halogénszármazékok átalakítására megadtunk, ahol R7 jelentése acilcsoport [lásd (iii) módszer].
Szintén az (I) általános képletű új hidroxil-amin-származékok oltalmi körébe esnek azok a vegyületek, amelyekben Z oxigénatom vagy egy =NR3 képletű csoport, ahol R3 jelentése szubsztituálatlan vagy szubsztituált alkilcsoport, X jelentése -NR'R2-csoport, ahol R1 és R2 jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom, szubsztituálatlan vagy szubsztituált egyenes vagy elágazó láncú alkil-, szubsztituálatlan vagy szubsztituált aril-, előnyösen fenil- vagy szubsztituálatlan vagy szubsztituált aralkilcsoport, vagy R1 és R2 a szomszédos nitrogénatommal együtt egy 3-7 tagú, előnyösen 5-7 tagú telített heterociklusos gyűrűt képez, mely adott esetben további heteroatomokat tartalmazhat. Ezekben a vegyületekben A szubsztituálatlan vagy szubsztituált alkil-, szubsztituálatlan vagy szubsztitutált aril-, előnyösen fenil- vagy szubsztituált fenilcsoportot, szubsztituálatlan vagy szubsztituált aralkilcsoportot jelent, és R jelentése (b) képletű csoport, melyben R5 és R6 jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom, egyenes vagy elágazó láncú alkilcsoport, előnyösen 1-4 szénatomos alkilcsoport vagy cikloalkilcsoport, vagy R5 és R6 a közrezárt N-atommal együtt 3-7 tagú, előnyösen 5-7 tagú telített heterociklusos gyűrűt képez, Y6 jelentése hidrogénatom vagy -OR7-csoport, ahol R7 jelentése hidrogénatom vagy acilcsoport, előnyösen helyettesítetlen vagy helyettesített alkil-karbonil- vagy aril-karbonil-csoport, k jelentése 1,2 vagy 3 és m jelentése 1,2 vagy 3.
Az (I) általános képletű új hidroxil-amin-származékok körébe tartoznak azok a vegyületek is, melyekben Z oxigénatomot jelent és X jelentése -OQ-csoport, ahol Q jelentése szubsztituálatlan vagy szubsztituált alkil-, szubsztituálatlan vagy szubsztituált aralkilcsoport, A jelentése szubsztituálatlan vagy szubsztituált alkil-, szubsztituálatlan vagy szubsztituált aralkilcsoport és R jelentése (b) képletű csoport, melyben R5 és R6 jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom, egyenes vagy elágazó láncú alkilcsoport, előnyösen 1-4 szénatomos alkilcsoport vagy cikloalkilcsoport, vagy R5 és R6 a közrezárt N-atommal együtt 3-7 tagú, előnyösen 5-7 tagú telített heterociklusos gyűrűt képez, Y6 jelentése hidrogénatom vagy -OR7-csoport, ahol R7 jelentése hidrogénatom vagy acilcsoport, előnyösen helyettesítetlen vagy helyettesített alkil-karbonil- vagy aril-karbonil-csoport, k jelentése 1,2 vagy 3 és m jelentése 1,2 vagy 3.
Ugyancsak az (I) általános képletű új hidroxilamin-származékok körébe tartoznak azok a vegyületek, amelyekben A jelentése helyettesítetlen vagy helyettesített arilcsoport, előnyösen fenilcsoport vagy nitrogéntar12
HU 222 994 Bl talmú heteroaromás csoport, előnyösen piridilcsoport vagy kéntartalmú heteroaromás csoport, Z jelentése kovalens kötés, X jelentése -OQ képletű csoport, ahol Q jelentése 1-4 szénatomos alkilcsoport, és R jelentése (b) képletű csoport, melyben R5 és R6 jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom, egyenes vagy elágazó láncú alkilcsoport, előnyösen 1-4 szénatomos alkilcsoport vagy cikloalkilcsoport, vagy R5 és R6 a közrezárt nitrogénatommal együtt 3-7 tagú, előnyösen 5-7 tagú telített heterociklusos gyűrűt képez, Y6 jelentése hidrogénatom, k jelentése 1, 2 vagy 3 és m jelentése 1, 2 vagy 3.
E vegyületeket a megfelelő, X helyén halogénatomot tartalmazó (I) általános képletű hidroxil-amin-származékok és megfelelő alkoholátok reakciójával állíthatjuk elő, célszerűen az alkoholátoknak megfelelő alkoholban, előnyösen visszafolyató hűtő alatt való melegítéssel. A reakcióelegyet szokásos módszerekkel feldolgozzuk, és a terméket kromatográfiával vagy sóképzéssel különítjük el.
A (II) általános képletű új hidroxil-amin-származékok oltalmi körébe tartoznak azok a vegyületek, amelyekben X jelentése oxigénatom, A jelentése
1-20 szénatomos egyenes vagy elágazó láncú alkilcsoport, helyettesítetlen vagy helyettesített arilcsoport, előnyösen fenil- vagy halogén-alkil-fenil-csoport, helyettesítetlen vagy helyettesített aralkilcsoport, naftilcsoport vagy nitrogéntartalmú heteroaromás csoport, előnyösen piridilcsoport,
Z jelentése kovalens kötés,
R’ jelentése hidrogénatom, 1 -4 szénatomos alkilcsoport vagy aralkilcsoport, előnyösen fenil-alkil-csoport,
R jelentése (b) képletű csoport, melyben R5 és R6 jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom, egyenes vagy elágazó láncú alkilcsoport, előnyösen 1-4 szénatomos alkilcsoport vagy cikloalkilcsoport, vagy R5 és R6 a közrezárt nitrogénatommal együtt 3-7 tagú, előnyösen 5-7 tagú telített heterociklusos gyűrűt képez, Y6 jelentése hidrogénatom vagy -OR7-csoport, ahol R7 jelentése hidrogénatom, k jelentése 1, 2 vagy 3 és m jelentése 1, 2 vagy 3, azzal a kikötéssel, hogy ha A jelentése alkilcsoporttól eltérő szubsztituens és R’ jelentése hidrogénatom, akkor Y6 hidrogénatomot jelent.
A (II) általános képletű hidroxil-amin-származékok oltalmi körébe tartoznak továbbá azok az új vegyületek, amelyekben Z jelentése kovalens kötés, oxigénatom vagy egy =NR3 képletű csoport, amelyben R3 jelentése hidrogénatom vagy szubsztituálatlan vagy szubsztituált alkilcsoport, X jelentése =NR4-csoport, ahol R4 jelentése hidrogénatom, szubsztituálatlan vagy szubsztituált alkil-, szubsztituálatlan vagy szubsztituált aril-, előnyösen fenilcsoport, vagy szubsztituálatlan vagy szubsztituált aralkilcsoport, előnyösen fenil-alkilcsoport. Ezekben a vegyületekben A jelentése szubsztituálatlan vagy szubsztituált alkil-, szubsztituálatlan vagy szubsztituált aril-, előnyösen fenil- vagy szubsztituált fenilcsoport, vagy szubsztituálatlan vagy szubsztituált aralkilcsoport, előnyösen fenil-alkil-csoport, vagy cikloalkilcsoport, R’ jelentése helyettesítetlen vagy helyettesített alkilcsoport vagy helyettesítetlen vagy helyettesített arilcsoport, előnyösen fenilcsoport, vagy helyettesítetlen vagy helyettesített aralkilcsoport, előnyösen fenil-alkil-csoport, és R jelentése (b) képletű csoport, melyben R5 és R6 jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom, egyenes vagy elágazó láncú alkilcsoport, előnyösen 1-4 szénatomos alkilcsoport vagy cikloalkilcsoport, vagy R5 és R6 a közrezárt nitrogénatommal együtt 3-7 tagú, előnyösen 5-7 tagú telített heterociklusos gyűrűt képez, Y6 jelentése hidrogénatom vagy -OR7csoport, ahol R7 jelentése hidrogénatom vagy acilcsoport, előnyösen helyettesítetlen vagy helyettesített alkil-karbonil- vagy aril-karbonil-csoport, k jelentése 1, vagy 3 és m jelentése 1,2 vagy 3.
Szintén az új (II) általános képletű hidroxil-aminszármazékok körébe tartoznak azok a vegyületek, amelyekben X jelentése oxigénatom, A jelentése helyettesítetlen vagy helyettesített alkilcsoport, helyettesítelen vagy helyettesített aralkilcsoport, előnyösen fenil-alkilcsoport, Z jelentése oxigénatom, R’ jelentése alkilcsoport vagy aralkilcsoport, előnyösen fenil-alkil-csoport, R jelentése (b) képletű csoport, melyben R5 és R6 jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom, egyenes vagy elágazó láncú alkilcsoport, előnyösen 1-4 szénatomos alkilcsoport vagy cikloalkilcsoport, vagy R5 és R6 a közrezárt nitrogénatommal együtt 3-7 tagú, előnyösen 5-7 tagú telített heterociklusos gyűrűt képez, Y6 jelentése hidrogénatom vagy -OR7-csoport, ahol R7 jelentése hidrogénatom vagy acilcsoport, előnyösen helyettesítetlen vagy helyettesített alkil-karbonil- vagy aril-karbonil-csoport, k jelentése 1,2 vagy 3 és m jelentése 1,2 vagy 3.
Ugyancsak a (II) általános képletű új hidroxil-aminszármazékok körébe tartoznak azok a vegyületek, amelyekben X jelentése oxigénatom és Z jelentése =NHcsoport.
Ezek első csoportját azok a vegyületek alkotják, amelyek képletében A jelentése helyettesítetlen vagy helyettesített alkilcsoport, cikloalkilcsoport, helyettesítetlen vagy helyettesített aralkilcsoport, előnyösen fenil-alkil-csoport, helyettesítetlen vagy halogénatommal, alkil-, halogén-alkil-, alkoxi- vagy nitrocsoporttal helyettesített fenilcsoport, R’ jelentése alkil- vagy aralkilcsoport, előnyösen fenil-alkil-csoport, és R jelentése (b) képletű csoport, melyben R5 és R6 jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom, egyenes vagy elágazó láncú alkilcsoport, előnyösen 1-4 szénatomos alkilcsoport vagy cikloalkilcsoport, vagy R5 és R6 a közrezárt nitrogénatommal együtt 3-7 tagú, előnyösen 5-7 tagú telített heterociklusos gyűrűt képez, Y6 jelentése hidrogénatom vagy hidroxilcsoport, k jelentése 1, 2 vagy és m jelentése 1, 2 vagy 3.
Az ilyen szerkezetű vegyületek második csoportjához azok tartoznak, amelyek képletében A jelentése (a) képletű csoport, ahol Y1 jelentése halogén-alkil-csoport, előnyösen trifluor-metil-csoport és n értéke 1, 2 vagy 3, R’ jelentése hidrogénatom, és R jelentése (b) képletű csoport, melyben R5 és R6 jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom, egyenes vagy elágazó láncú
HU 222 994 Bl alkilcsoport, előnyösen 1-4 szénatomos alkilcsoport vagy cikloalkilcsoport, vagy R5 és R6 a közrezárt nitrogénatommal együtt 3-7 tagú, előnyösen 5-7 tagú telített heterociklusos gyűrűt képez, Y6 jelentése -OR7csoport, ahol R7 jelentése hidrogénatom, k jelentése 1, 2 vagy 3 és m jelentése 1,2 vagy 3.
A találmány szerinti új hidroxil-amin-származékokhoz tartoznak azok a gyűrűs szerkezetű (I”) általános képletű vegyületek is, amelyek képletében
A jelentése helyettesítetlen vagy halogénatommal vagy nitrocsoporttal helyettesített fenilcsoport vagy Ntartalmú heteroarilcsoport, R1 jelentése hidrogénatom és R” jelentése az aminocsoporton adott esetben monovagy diszubsztituált ω-amino-alkil-csoport, amelynek alkillánca 1-5 szénatomos, és amely egymástól független aminoszubsztituensként egy vagy két egyenes vagy elágazó láncú alkilcsoportot vagy cikloalkilcsoportot tartalmazhat, vagy amelynek két aminoszubsztituense együttesen, a közrezárt nitrogénatommal együtt egy 3-7 tagú, előnyösen 5-7 tagú telített heterociklusos gyűrűt képez, vagy annak 1 -4 szénatomos alkilcsoporttal képzett N-kvatemerezett származéka, azzal a kikötéssel, hogy ha A jelentése 3-piridilcsoport, akkor R” 1-piperidinil-metil-csoporttól eltérő csoport.
4.2. Eljárás a molekulárischaperon-expresszió növelésére a sejtekben
A jelen találmány a molekuláris chaperonok sejtekben történő expressziójának fokozására szolgáló eljárásra vonatkozik, melynek során sejteket vagy szöveteket egy hidroxil-amin-származék hatásos mennyiségével kezelünk. Az erre a célra felhasználható hidroxil-aminszármazékok tautomer formáit az (I) vagy (II) általános képletek ábrázolják. Az (I) és (II) általános képletű vegyületeket részletesen a 4.1. fejezetben ismertettük.
A találmány tárgya továbbá egy olyan eljárás, mely a stressznek kitett sejtekben a molekulárischaperon-expresszió fokozására szolgál. Ez az eljárás abban áll, hogy a molekuláris chaperonok celluláris expresszióját indukáló fiziológiai stressznek kitett sejteket a stressz beállta után hidroxil-amin-származékok, melyek tautomer formáit az (I) és (II) általános képletek ábrázolják, hatékony mennyiségével kezeljük. A hidroxil-aminszármazékok megnövelik a molekuláris chaperonok expresszióját a sejtekben a fiziológiai stressz által indukált mennyiség fölé.
Ugyancsak a találmány tárgya egy olyan eljárás, melynek során a hidroxil-amin-származékokkal a fiziológiai stressz hatását megelőzően kezeljük a sejteket. A hidroxil-amin-származékok megnövelik a molekulárischaperon-expressziót a fiziológiai stressz által indukált mennyiségen túl.
A .molekuláris chaperon” kifejezés, amint itt használjuk, egy fehérjére vonatkozik, mely más fehérjék korrekt vagy aktív konformációba való térszerkezeti elrendeződését segíti elő rendszerint úgy, hogy nem kovalensen kötődik a fehérjékhez. A chaperonok nemcsak újonnan szintetizálódnak, hanem a denaturálódott és meghibásodott fehérjék szerkezetének javításában vagy helyreállításában is segédkeznek. A molekuláris chaperonok magukban foglalják többek között a hősokkfehérjéket (hsp), melyek közül a találmány szempontjából különösen jelentős a hsp70 és a hsp72, valamint az IgG nehézlánc-kötő fehérjét (BiP) és a glükóz által szabályozott fehérjéket (grp). A hsp- és grp-csoportba tartoznak, de nem korlátozódnak ezekre, például a következő osztályokba tartozó chaperonfehérjék: hsp70, hspőO, hsp90, grp94, grp80 és hsp27.
Előnyösen az eukariótasejtek, melyeket a hidroxilamin-származékokkal kezelünk, emlőssejtek, még előnyösebben humán sejtek. Az „eukariótasejt” meghatározás vonatkozik mind az in vitro sejtekre (amelyek az élő organizmuson kívüliek, például tenyésztett sejtek), mind az in vivő sejtekre (melyek az élő organizmuson belül, például a szövetekben és szervekben találhatók).
Az élő szervezet eukariótasejtjei közül különösen előnyösen kezelhetjük a találmány szerinti eljárással az idegsejteket, az izomsejteket, az érfal sejtjeit, különösen az endoteliális sejteket, az epiteliális sejteket és az immunrendszer sejtjeit. Előnyösen kezelhetjük továbbá a találmány szerinti eljárással a fiziológiai stressznek kitett növényi sejteket, ideértve az élő növényi szervezetek sejtjeit is.
A „fiziológiai stressz” kifejezés, amint itt használjuk, olyan sejtre ható állapotokat és faktorokat jelent, amelyek a sejtben „stresszválaszt” indukálhatnak, például a chaperonfehérje-szintézist indukálják. A fiziológiai stresszek közé tartoznak azok a faktorok, amelyek a sejtek sérülését okozzák, vagy a sejtek homeosztatikus egyensúlyát megzavarják. Ilyen például a metabolikus, oxidatív, lokális mechanikus stressz vagy a hipoxia, ischaemia, hőhatás, sugárzás vagy mérgező anyagok által okozott stressz. A metabolikus stressz egyik jelentős formája a diabetes mellitus által okozott stressz.
A fiziológiai stressz másik jelentős megjelenési formája az, ahol a fiziológiai stressz reaktív szabadgyökök képződéséhez vagy a sejt körüli citokinek mennyiségének növekedéséhez vezet. A sejteken történt károsodások, amelyek különböző patológiás állapotokhoz társulnak, szolgálnak példaként a fiziológiai stresszekre.
A találmány egyik, nem korlátozó jellegű példájában a fiziológiai stressz az a hatás, ami indukálja a sejteket, hogy molekuláris chaperont expresszáljanak válaszként az olyan fiziológiai stresszekre, amelyek kardiovaszkuláris, vaszkuláris, agyi, allergiás, immun-, autoimmun, vírus- vagy bakteriális fertőzés okozta betegségek, daganatos betegségek, kültakaró- és/vagy nyálkahártyabetegségek vagy a vesetubulusok hámsejteredetű betegségei kialakulásához vagy kozmetikai beavatkozással kezelhető állapothoz vezetnek.
Ilyen kardiovaszkuláris betegségek különösen a fiziológiai stressz által provokált atherosclerosis, koronárisartéria-betegség, hipertónia vagy kis vérköri hipertónia következményeként fellépő kardiovaszkuláris betegségek.
Jellemzően ilyen agyi betegségek a fiziológiai stressz által provokált cerebrovaszkuláris ischaemia, stroke, traumatikus fejsérülés, időskori neurodegeneratív betegség, különösen szenilis demenciák, AIDS-demencia, alkoholdemenciák, Alzheimer-kór, Parkinson-kór vagy epilepszia következményeként jelentkező agyi betegségek.
HU 222 994 Bl
A fiziológiai stressz által provokált kültakaró- vagy nyálkahártya-betegség jellemzően egy dermatológiai betegség vagy a gasztrointesztinális rendszer fekélyes betegsége lehet.
Az említett betegségek során a fiziológiai stressz indukálja a chaperonexpressziót a sejtekben, de ez a hatás elégtelen ahhoz, hogy a betegségek által okozott sejtkárosodást kivédje. Az említett hidroxil-amin-származékokkal való kezelés a chaperonexpresszió további fokozásával vagy a chaperonaktivitás növelésével már lehetővé teszi a betegség által okozott szerkezeti eltérések megszüntetését és ezzel a sejtek regenerálódását.
A találmány egy másik, nem korlátozó jellegű példájában a fiziológiai stressz a hősokk vagy a sejtek kitettsége szokatlanul magas hőmérsékletnek. Egy további, nem korlátozó jellegű példában a fiziológiai stressz az ischaemiával járó celluláris sérülés. A sejtek ischaemiás lézióját, különösen a szívizom- és agysejtekét az erek elzáródása vagy rupturája miatt kialakuló keringési zavar, mint koszorúér vagy agyi trombózis, illetve érelzáródás, agyvérzés, embólia, tartós érspazmus okozzák. Az ischaemia „stresszválaszt” indukál a sejtekben, mely a hsp megnövekedett mennyiségét jelenti, ami pedig megvédi a sejteket az ischaemia káros hatásaival szemben [Mestril R. és munkatársai: J. Mól. Cell Cardiol. 27, 45 (1995)].
Ha hidroxil-amin-származékok hatékony mennyiségével kezeljük ezeket a sejteket, megnövelhetjük a sejtekben a molekulárischaperon-expressziót az ischaemiás állapot által indukált mennyiségen túl, valamint felhasználhatjuk a molekuláris chaperonok aktivitását.
Ezzel összefüggésben, ha egy állati szervezetből egy szervet transzplantáció céljából eltávolítunk, ez az eltávolítás fiziológiai stresszt jelent a szervben lévő sejtek számára, azok sérülését okozza és chaperonexpressziót indukál. Ilyen esetben a hidroxil-amin-származékok beadása a szerv eltávolítása előtt vagy után megnövelheti a szerv sejtjei által termelt chaperon mennyiségét vagy aktivitását, és ezáltal citoprotektív hatást biztosit.
A neuronális léziókat az ischaemia mellett számos más neuronális stressz is kiválthatja, amelyek a neuronális sejtekben molekulárischaperon-termelést indukálnak. Továbbá, az excitotoxicikus neuronális sérülések is indukálják a molekulárischaperon-termelést a neuronális sejtekben, és ennélfogva beletartoznak a „fiziológiai stressz” fogalmába.
A találmány egy még további példájában a fiziológiai stresszt a gyulladás toxikus mediátorai jelentik, így például oxidatív gyökök és a citokininek, például a TNF, melyek a makrofágok által termelődnek. Úgy tűnik, hogy a sejtek ezen toxikus mediátorok megnövekedett mennyiségének a hatására fokozott mennyiségű hsp-t expresszálnak, amely azután megvédi ezeket a sejteket a toxicitással szemben [Kantengwa S. és munkatársai: Sémin. Immun. 3, 49-56 (1991)]. A különböző gyulladásos betegségek, beleértve a tüdőgyulladásos állapotokat, mint például a felnőttkori distresz-szindróma, a sejtben a hsp sejt általi expresszióját indukálják, amely citoprotektív hatást fejt ki [Jacquier-Salin M. R. és munkatársai: Experientia 50, 1030-1038 (1994)]. Amikor a molekuláris chaperonok mennyisége a sejtekben megnövekszik azon túl, amit a TNF és a reaktív oxigéngyökök indukáltak, a sejtek védettebbek lesznek ezen citotoxikus faktorokkal szemben, és jobban képesek helyrehozni az általuk okozott károsodásokat.
A sejtmembránok fiziológiai állapotára - beleértve a sejtmembrán átjárhatóságát - ható faktorok, szintén példák a fiziológiai stresszre. A molekulárischaperonexpresszió megnövekedése ezekben a sejtekben a sejtmembránok fiziológiai állapotának megváltozása által jobb védelmet jelenthet, és lehetővé teszi a sejtek számára a sejtmembránok regenerálását is.
A „hidroxil-amin-származékok hatásos mennyisége” kifejezés, amint azt itt a fiziológiai stressz hatása alatt álló, vagy a későbbiekben fiziológiai stressznek kitett sejtekben a molekulárischaperon-termelés fokozásával kapcsolatban használjuk, arra a mennyiségre vonatkozik, amely megnöveli a molekulárischaperon-expressziót azon szint fölé, mely kizárólag a fiziológiai stressz következtében jön létre. Ezt a mennyiséget könnyen meghatározhatja a területen jártas szakember. A hatásos mennyiség in vitro sejtek esetében előnyösen 10-6-10-3 M, még előnyösebben a hatékony mennyiség 10-6-5 χ 10-4 M.
Ha egy állatot kezelünk, a hatásos mennyiség különböző faktoroktól, mint például a beadás módjától függ, de a hatásos tartomány meghatározása a szakember köteles tudásához tartozik, és nem igényel további kísérletezést. így például, amikor a hidroxil-amin-származékokat intravénásán adjuk be, a hatékony mennyiség előnyösen 0,1-10 mg/kg (testtömeg), még előnyösebben 0,5-2,0 mg/kg (testtömeg); és ha a beadás orálisan történik, a hatásos mennyiség előnyösen 10-500 mg/kg (testtömeg), még előnyösebben 50-100 mg/testtömeg-kg.
A celluláris molekulárischaperon-expresszió növekedését jól kidolgozott laboratóriumi módszerekkel, így például Northern- vagy Westem-blot-eljárással határozhatjuk meg.
A Westem-blot-analízis egyik módszerét - melyet alkalmazhatunk - az alábbiakban ismertetjük.
A sejteket in vitro 37 °C-on, 5% CO2-tartalom mellett Dulbecco által módosított Eagle-féle tápoldatban (DMEM) tenyésztünk, melyet 10%-os magzati boíjúszérummal (GIBCO) egészítettünk ki. Hidroxil-aminszármazékokat, melyek tautomer formáit az (I) és (II) általános képletek reprezentálják, adunk a sejttenyészethez, például valamely vegyületet 10~5 M mennyiségben adunk a sejtekhez 16 órával a fiziológiai stressz előtt, vagy a fiziológiai stresszt követően egy bizonyos idő múlva. A hidroxil-amin-származék koncentrációja, valamint a vegyület beadásának időtartama a tervezett kísérletnek megfelelően változtatható.
Hat órával a hősokk után a sejteket foszfátpufferelt konyhasóoldatban (PBS) kétszer átmossuk, majd a tenyésztőlemezek felületéről PBS-be átvisszük. A sejteket ezután 1500 ford./perc sebességgel 5 percig centrifugáljuk, és 100 μΐ módosított szolubilizáló pufferben felvesszük [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, szerzők: Sambrook, Fritsche, Maniatis, kiadó: Bőid
HU 222 994 Bl
Spring Laboratory Press (1989)], amely a következőket tartalmazza: 50 mM Tris-HCl, pH=8,0; 5 mM EDTA; 150 mM NaCl; 15 Tritox N-100; 1 PMSF; 2 pg/ml aprotinin; 1 pg/ml kimosztatin; 1 pg/ml pepsztatin; és 3x20 másodpercig ultrahanggal kezeljük (2 perces intervallumokban).
A fehéijekoncentrációt ezután 5 pl-es mintákból Bradford-assay segítségével [Bradford Μ. M.: Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976)] határozzuk meg három párhuzamos mérésben. A mintákat 100 pg/30 pl fehéqekoncentrációra állítjuk be az alábbi pufferrel úgy, hogy a komponensek végkoncentrációja a mintában a következő legyen: 110 mM Tris-HCl, pH=6,8, 8,3 mM merkapto-etanol, 3% SDS, 3% glicerin és valamennyi brómfenolkék, és 30 percig szobahőmérsékleten rázatjuk. Az így előkészített mintát felhasználhatjuk gélelektroforézishez.
Amikor a találmány szerinti hidroxil-amin-származékok chaperonnövelő hatását vizsgáljuk a sejtekben in vivő, egy fiziológiai stresszt alkalmazunk egy államál, például ischaemia vagy STZ-indukált diabétesz. Ischaemia esetében, a myocardialis ischaemiát egy állatban a 8. biológiai példában leírtak szerint indukálhatjuk; a diabéteszes állapotot pedig a 10. példában leírtak szerint hozhatjuk létre. A találmány szerinti hidroxilamin-származékot az állatnak beadhatjuk a fiziológiai stresszhatás előtt, azzal egyidejűleg, vagy azután. Amint korábban megállapítottuk, a beadás időtartama a kísérleti tervnek megfelelően változtatható.
Az így kezelt állatból kapott szervekből a fehéqe kinyerésének következő lépéseit 0-4 °C-on hajtjuk végre. A szöveteket, mint például májszövet (kb. 15-20 g) homogenizáljuk egy háztartási mixelőgépben 2 percig 80 ml lizáló pufferoldatban, melynek összetétele: 50 mM Tris-HCl, pH=8,0, 5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 0,1% SDS, 1% Triton X-100 és 1-1 mM proteázinhibitor (PMSF, benzamidin, aminokapronsav). A homogenizált oldatot ezután lecentrifugáljuk (20 000 χ g, 30 perc, Sorvall 28S centrifuga). A preparátum fehéqekoncentrációját Bradford-assay segítségével határozzuk meg és 5 mg/ml-re állítjuk be. Az 1,8 mg fehéqét tartalmazó mintákat gélelektroforézis előtt 0,6 ml pufferben (110 mM Tris-HCl, pH=6,8, 8,3 mM merkapto-etanol, 3% SDS, 3% glicerin és bróm-fenolkék) szolubilizáljuk és szobahőmérsékleten 30 percig rázatjuk.
A sejttenyészetekből vagy az állati szövetekből kapott fehéijemintákat - mindkettőt a fentiekben ismertettük - elektroforézishez és ezt követő immun-blot-analízishez használjuk [mindkét eljárás a szakember számára jól ismert, és részletesen leírták az alábbi helyeken: Molecular Cloning, A Laboratory Manuel, Ed. Sambrook, Fritsche, Maniatis, Bőid Spring Harbor Laboratory Press (1989); Protein Blotting Protocols fór the Immobilon-P Transfer Membráné, 3. Laboratory Manual, Millipore; és U. K. Laemmli: Natúré 227, 680-685 (1970)].
így például, az elektroforézist kivitelezhetjük Laemmli szerint [U. K. Laemmli: Natúré 227,680-685 (1970)] 8-18%-os poliakrilamidgélen 50 V konstans feszültség mellett egy éjszakán át. A fehérjéket vagy megfestjük Coomassie Brilliant Blue R-250-nel, vagy átvisszük Immobilone PVDF-membránra (Millipore) konstans áramerősségnél (300 mA) 3 órán át 4 °C-on transzfer pufferben (10 mM CAPS, pH=ll, 10% metanol) (Protein Blotting Protocols fór the Immobilon-P Transfer Membráné, 3. Laboratory Manual, Millipore). Átvitel után a membrán nem specifikus helyeit 2% BSAval (bovine serum albumin) TPBS-ben (foszfáttal puffereit sóoldat 0,1% Tween 20-szal) blokkoljuk 4 °C-on egy éjszakán keresztül. Ezután a membránt egy molekuláris chaperon elleni antitesttel, például GRP94 monoklonális antitesttel (SPA-850, StressGen) 1:3000 hígításban, HSP60 monoklonális antitesttel (SPA-600, StressGen) 1:2700 hígításban, HSP72 monoklonális antitesttel (C92F34-5, StressGen) 1:1250 hígításban vagy HSP90 monoklonális antitesttel (AC88, StressGen) 1:2000 hígításban, inkubálhatjuk 1 órán át szobahőmérsékleten. A membránt ezután egy órán keresztül mossuk TPBS-pufferrel, és egy második, torma-peroxidázzal konjugált antipatkány- (Sigma, 1:4000 hígítás, grp-94hez) vagy antiegér- (Sigma, humán és patkányszérumproteinekhez adszorbeálva, 1:3000 hígítás, Hsp60-hoz, HSP72-höz vagy HSP90-hez) antitesttel inkubáljuk további egy órán át. Ezt követően a membránt TPBS-sel mossuk és erősített kemilumineszcenciás (enhanced chemiluminescence, ECL)-rendszerben kifejlesztjük (Amersham).
A stresszfehérje-tartalomban bekövetkezett változásokat Bio-Rad denzitométer segítségével (Model 1650) és egy Hewlett-Packard Integrátor (HP 3394A) segítségével mérhetjük.
Ismert mennyiségű chaperont tartalmazó fehéijeoldatból hígítási sort készítünk, a hígításokkal megismételjük a teljes fenti eljárást, és az értékekből kapott kalibrációs görbéhez hasonlítjuk az ismeretlen minták chaperonkoncentrációját.
A Northem-hibridizáció egy másik kísérletes eljárása alkalmas a találmány szerinti hidroxil-amin-származékok által okozott molekulárischaperon-növekedés szintjének meghatározására (mRNS mérésével). A sejteket vagy szöveteket éppúgy nyerhetjük, mint azt a Westem-blot-eljárással kapcsolatosan leírtuk. Ezekből a sejtekből és szövetekből extrahálhatjuk a totál RNS-t RNS-ágensek segítségével (Promega), a gyártó utasításai szerint eljárva (Protocols and Applications Guide, 2nd edition, 1991, Promega Corporation). A mintegy 50-100 mg tömegű fagyasztott szövetmintákat 1,0 ml +4 °C hőmérsékletű denaturálóoldatban homogenizáljuk (Brinkman-homogenizálás) (4 M guanidin-tiocianát; 42 mM nátrium-citrát; 0,83 mM β-merkapto-etanol, 0,1% Nénidét P-40). Majd 1/10 térfogatnyi 3 M nátrium-acetát-oldatot (pH=4,0) adunk hozzá, és savas fenollal (fenol: kloroform: izoamil-alkohol=25:24:1) extraháljuk 10 másodpercig vortex segítségével. A mintát 15 percig jégen inkubáljuk, majd lecentrifugáljuk (4 °C, 20 perc 10 000xg). A vizes fázist átvisszük egy új Eppendorf-csőbe, és az eljárást megismételjük, majd a vizes fázist azonos térfogatú izopropanollal egy éjszakán át -20 °C-on kicsapjuk. Centrifugálást követően a kapott csapadékot kétszer mossuk 95%-os etanollal, és
HU 222 994 Bl szobahőmérsékleten szárítjuk. Az RNS-t 20 μΐ DEPCvel (dietil-pirokarbonát) kezelt vízben szuszpendáljuk, és a koncentrátumot 260-280 nm-en spektrofotométerrel mérjük. A teljes RNS 8 pg-ját foimaldehid-agarózgélen futtatjuk kapilláris transzferrel, a gélen lévő RNS-t nejlonmembránra blottoljuk a gyártó utasításai szerint (Zeta-Probe GT, BioRad).
Az egyes mintákban a molekulárischaperonmRNS-tartalmat glicerinaldehid-3-foszfát-dehidrogenáz (GAPDH)-gén mRNS-szintjéhez hasonlítjuk. A cDNS-próbákat (például a teljes hosszúságú humán hsp70 cDNS, amikor a mért mRNS a hsp70, és a patkány GAPDH cDNS Apa-Ncol fragmense) alfa-32P CTP-vel jelezzük Random Prímé DNS Jelző Kit segítségével (USB). A radiojelzett DNS-ffagmenseket Sephadex G-50 oszlopon (Pharmacia) tisztítjuk Ausubel és munkatársai által leírtak szerint [Current Protocols in Molecular Biology: JOHN WILEY & SONS (1987)].
A prehibridizációt 65 °C-on H-pufferben (0,25 M Na2HPO4, pH=7,2, 7% SDS) 15 percig, a hibridizációt egy éjszakán át (65 °C, H-puffer) legalább 106 cpm/ml koncentrációjú izotóppal jelzett cDNS-próbával hajtjuk végre. A membránt ezután 20 mM Na2HPO4-tal (pH=7,2) és 5%-os SDS-sel mossuk (65 °C, 2x 15 perc) és autoradiográfiásan értékeljük. Ugyanezt a membránt használjuk fel a hsp70 mRNS-próbához és a belső standardként használt GAPDH- és mRNS-méréshez.
A találmány továbbá különféle patológiás állapotok, nevezetesen a chaperonrendszer működésével kapcsolatos betegségek vagy a sejtek vagy sejtorganellumok membránjának károsodásához társult betegségek kezelésére vagy megelőzésére szolgáló eljárásra is vonatkozik. Ennek során a gazdaszervezetnek egy hidroxil-amin-származék, melynek tautomer formáit az (I) és (II) általános képletek jelentik, hatékony mennyiségét adjuk be, hogy enyhítsük a patológiás állapotot a szervezetben. A patológiás állapotokban jellemzően molekulárischaperon-expresszió indukálódik a sejtekben. A megnövekedett molekulárischaperon-expresszió ezekben a sejtekben segíti a patológiás állapot által okozott károsodások kijavítását és a celluláris homeosztatikus egyensúly helyreállítását is. Az ilyen patológiás állapotok közé tartozik többek között az ischaemia, a daganatos betegségek, a patogén mikroorganizmusok által okozott fertőzések, az autoimmun betegségek és a dermatológiai megbetegedések.
A „kezelés” - amint itt használjuk - valamely egyén klinikai állapotában bekövetkezett javulásra irányul, de nem jelenti szükségszerűen, hogy teljes gyógyulást érünk el. A javulás a betegség enyhébb lefolyását jelentheti, a betegség súlyosságának csökkenését, vagy szubjektív javulást az egyén életének minőségében, vagy az egyén meghosszabbodott túlélését.
A kezeléshez alkalmazott találmány szerinti hidroxil-amin hatékony mennyisége egy olyan mennyiségre vonatkozik, amely a klinikai állapot fentiekben leírt jobbra fordulását eredményezi. A hatékony mennyiség különféle faktoroktól, így például a beadás módjától függ, és a szakember könnyen meg tudja határozni. A találmány szerinti hidroxil-amin-származékok beadhatók parenterálisan vagy orálisan, előnyösen orálisan adjuk be azokat, vagy helyileg alkalmazhatjuk őket, és a hatékony mennyiség körülbelül 10-500 mg/kg (testtömeg). Még előnyösebben a hatékony mennyiség 20-100 mg/kg (testtömeg).
A találmány szerinti kezelési eljárással megvédhetjük a szívizomzatot, az agyszövetet és a veséket az ischaemia által okozott szövetkárosodástól és/vagy -elhalástól, ahol az eljárás egy találmány szerinti hidroxil-amin-származék hatékony mennyiségének beadását jelenti egy alanynak a prolongált ischaemia káros hatásának csökkentésére, megelőzésére vagy visszafordítására.
A találmány továbbá a hidroxil-amin-származékok, melyek tautomer formáit az (I) és (II) általános képletek reprezentálják, felhasználására vonatkozik az itt leírt patológiás állapotok kezelésére szolgáló gyógyszerek előállításában.
A hidroxil-amin-származékok védőhatásának mérésére szolgáló egyik eljárásban állatokon végzett tesztet használunk fel, amit a következőkben ismertetünk. Patkányokat elaltattunk nátrium-pentobarbitállal (Nembutal 60 mg/testtömeg-kg, ip.) és mesterségesen lélegeztettünk szobalevegővel (2 ml/100 g; 54 érverés/perc) légcsőmetszés (tracheotomia) útján. A jobb oldali nyaki verőérbe katétert vezettünk, és a szisztémás artériás vérnyomást előerősítő (preamplifier; Hg-02, Experimetria) segítségével egy vérnyomásmérővel mértük (BPR-01, Stoelting). A találmány szerinti hidroxil-amin-származékot a nyaki vénába (iv.) kanülön keresztül vagy orálisan (po.) adtuk be. A szívfrekvenciát (HR) kardiotachométerrel (HR-01, Experimetria) mértük; és az elektrokardiogramot (EKG II standard elvezetés) szubkután acéltűelektródok segítségével egy EKG-készüléken (MR-12, Medicor) vettük fel. A mellkast a bal oldalon felnyitottuk, és a szívet a bordaporc jobb oldalán gyenge nyomással kiemeltük. A fő bal oldali szívkoszorúér alá leszorítást helyeztünk fel, amint azt Selye és munkatársai leírták (1960). A szívet óvatosan visszahelyeztük a mellkasba, és az állatot hagytuk magához térni. A hőmérsékletet a végbélben mértük és konstansan 37 °C-on tartottuk. A kísérleti protokollt egy 15 perces stabilizációs periódussal kezdtük. Ha a fenntartott vérnyomás 70 Hgmm alá esett, vagy aritmiák fordultak elő ezen periódus alatt, az állatot kizártuk a további kísérletből. A stabilizációs periódus után myocardialis ischaemiát indukáltunk a koronária 5 percig tartó leszorításával, és reperfúziót végeztünk 10 percen keresztül.
Az egész kísérlet alatt a vérnyomást, a szívfrekvenciát és az EKG-t folyamatosan regisztráltuk egy multiscriptoron (R61-6CH, Medicor). A hidroxil-amin-származékokat 5-60 perccel a leszorítás előtt adtuk iv. vagy po. adagolással. A hidroxil-amin-származék dózisai 0,5; 0,75; 1,0 mg/kg iv. és 100 mg/kg (testtömeg) voltak, míg a Bepridil referenciavegyületet 1,0 mg/kg iv. dózisban adtuk. A ventrikuláris (kamrai) tachikardia (VT) és/vagy a ventrikuláris fibrilláció (VF) átlagidőtartamát mértük és analizáltuk a reperfúzió első 3 percében.
A találmány továbbá magában foglal egy eljárást, mely fenntartja a sejtmembrán átjárhatóságát, amikor a sejtmembrán fluiditása egy fiziológiai stressz következ17
HU 222 994 Bl tében megsérül. Ez a módszer a megváltozott membránátjárhatósággal rendelkező sejt vagy sejtorganellum kezelését jelenti a találmány szerinti hidroxil-amin-származékok hatékony mennyiségével, hogy visszaállítsuk az említett membránfluiditását. A kísérleti protokollt a 9. fejezettel kapcsolatosan mutatjuk be (Steady State DPH fluoreszcens anizotrópia), melyet felhasználhatunk a találmány szerinti hidroxil-amin-származék sejtmembránfluiditásra gyakorolt hatásának meghatározására.
Mint említettük, a találmány szerinti eljárás a sejtmembrán- vagy sejtorganellummembrán-károsodással összefüggő patológiás állapotok kezelésének módszerére is vonatkozik. Az ilyen patológiás állapotra példaként szolgál a diabetes mellitus, valamint a mitokondriumsérüléssel járó betegségek, így az ALS (amiotrofikus laterális szklerózis), az Alzheimer-kór, a Parkinson-kór, a Huntington-kór (HD), a különféle kardiomiopátiák, mint a toxikus eredetű, az alkohol vagy nehézfémek által okozott kardiomiopátia, a gyulladásos vagy víruseredetű kardiomiopátia vagy az autoimmun eredetű kardiomiopátia. A hidroxil-amin-származékok, melyek tautomer formáit az (I) és (II) általános képletek reprezentálják, felhasználhatók ebben az eljárásban.
A találmány szerinti eljárás alkalmazható daganatos betegségek kezelésére, amely módszer magában foglalja a hidroxil-amin-származékok hatékony mennyiségének bejuttatását a daganatos szervezetbe, hogy gátoljuk a tumor kialakulását vagy növekedését. A hidroxilamin-származékok, melyek tautomer formáit az (1) és (II) általános képletek jellemzik, felhasználhatók ebben az eljárásban.
4.3. A hidroxil-amin-származékokat tartalmazó gyógyászati és kozmetikai készítmények
Mint a bevezetőben említettük, a találmány tárgyát képezi az (I) vagy (II) általános képletű hidroxil-aminszármazékok - ideértve azok optikailag aktív sztereoizomerjeit is - vagy sóik alkalmazása fiziológiai stressz által provokált kardiovaszkuláris, vaszkuláris, allergiás, immun-, autoimmun, vírus- vagy bakteriális fertőzés okozta betegségek, daganatos vagy kültakaróés/vagy nyálkahártya-betegségek, a vesetubulusokat károsító betegségek vagy kozmetikai beavatkozással kezelhető állapotok kezelésére szolgáló gyógyszerkészítmények, adott esetben kozmetikai készítmények előállításában, mely vegyületek tautomer formáinak (I) és (II) általános képletében
A jelentése alkil-, szubsztituált alkil-, aralkil-, az arilés/vagy az alkilrészében szubsztituált aralkil-, aril-, szubsztituált aril-, heteroaril- vagy szubsztituált heteroarilcsoport,
Z jelentése kovalens kötés, oxigénatom vagy =NR3-csoport, ahol R3 jelentése hidrogénatom, alkil-, szubsztituált alkil-, aril-, szubsztituált aril-, aralkil- és az arilés/vagy alkilrészében szubsztituált aralkilcsoport lehet, R jelentése alkil- vagy szubsztituált alkilcsoport,
X jelentése az (I) általános képletű tautomerben halogénatom vagy szubsztituált hidroxilcsoport, amino-, monoszubsztituált vagy diszubsztituált aminocsoport, és X jelentése a (II) általános képletű tautomerben oxigénatom, imino- vagy szubsztituált iminocsoport,
R’ jelentése hidrogénatom, alkil-, szubsztituált alkil-, aril-, szubsztiutált aril-, aralkil-, az aril- és/vagy az alkilrészében szubsztituált aralkilcsoport, acil- vagy szubsztituált acilcsoport, és az (I) általános képletű vegyületek adott esetben egy intramolekuláris gyűrűs szerkezetet tartalmaznak X és egy reaktív szubsztituens összekapcsolódása által.
E vegyületek alkalmazásával előállíthatunk mind preventív, mind kuratív célra alkalmazható készítményeket, melyeket az emberi vagy állati szervezetbe beadva megelőzhetjük vagy megszüntethetjük a felsorolt betegségek által okozott sejtkárosodást, és ezzel enyhíthetjük vagy megszüntethetjük a szervezet patológiás állapotát.
Az ilyen készítményeket a gyógyszerek, illetve kozmetikumok készítésében szokásos eljárással állíthatjuk elő a hatóanyag és megfelelő vivőanyagok és/vagy segédanyagok összekeverésével. A készítmények általában 0,5-99,5 tömeg% hatóanyagot tartalmaznak. A hatóanyag mennyiségét e határokon belül a betegség természete és súlyossága, a páciens kora és a készítmény alkalmazásának módja szabja meg. Előállíthatunk az (I) és (II) általános képletű hidroxil-amin-származékok alkalmazásával orálisan és parenterálisan, valamint topikálisan alkalmazható készítményeket.
A hatóanyag napi dózisa a páciens testtömegére számítva mintegy 10-500 mg/kg, előnyösen 20-100 mg/kg, amelyet - különösen orális készítmények esetében - célszerűen 2-3 beadásra osztunk el.
Orális beadásra tabletta, drazsé, por, kapszula, granulátum, adott esetben oldat vagy szuszpenzió formájú készítményeket állítunk elő. Parenterális használatra vizes szuszpenziót vagy steril injekciós oldatot készítünk. Rektális beadásra kúpot, topikális alkalmazásra kenőcsöt, krémet, emulziót vagy gélt készítünk.
Tabletta előállítására a hatóanyagot megfelelő vivőanyagokkal, így keményítővel, zselatinnal, laktózzal, magnézium-sztearáttal, talkummal, arabmézgával, szilikagéllel keveijük össze, a keveréket granuláljuk, majd tablettává préseljük.
Drazsé előállításakor az előbbiekhez hasonló keveréket készítünk a hatóanyagból és segédanyagokból, a keveréket granuláljuk, a granulátumból magot készítünk, és azt cukorbevonattal látjuk el megfelelő oldat, például cukrot tartalmazó vizes poli(vinil-pirrolidon)oldat felhasználásával.
Kapszula előállításakor a hatóanyagot összekeveqük segédanyagokkal, mint keményítővel, talkummal, szilícium-dioxiddal, mikrokristályos cellulózzal, és a keveréket kemény- vagy lágyzselatin-kapszulába töltjük.
Ezeket az orális készítményeket kiegészíthetjük továbbá felszívódást elősegítő vagy azt késleltető, retard hatású adalékokkal.
Előállíthatunk szirupot vagy elixírt vagy cseppeket, amihez a hatóanyag mellett édesítőszert, metil- vagy propil-parabént és adott esetben ízesítőszert használhatunk, és ezekkel összekeveqük a hatóanyag vizes oldatát.
Vízzel nedvesíthető porok és granulátumok előállítására a hatóanyagot diszpergáló-, nedvesítő-, szuszpen18
HU 222 994 Bl dáló- és dezintegrálószerekkel, mint poli(vinil-pirrolidon)-nal és kívánt esetben ízesítőszerrel keverjük össze.
Rektális beadásra kúpot készítünk megfelelő segédanyagok, mint kakaóvaj vagy polietilénglikol felhasználásával.
Parenterális beadásra készíthetünk injekciót, a hatóanyagot steril izotóniás sóoldatban feloldva, vagy vizes szuszpenziókat, megfelelő diszpergálószerek és nedvesítőszerek, így propilénglikol vagy butilénglikol felhasználásával.
Helyi kezelésre alkalmas kenőcsöt vagy krémet egy- vagy többértékű alkoholok, így cetil-alkohol, sztearil-alkohol, glicerin, természetes zsírok és olajok, így olívaolaj, búzacsíraolaj, lanolin, nagy szénatomszámú szénhidrogének, így vazelin, továbbá cellulózszármazékok felhasználásával készíthetünk a hatóanyag és a felsorolt vivőanyagok összekeverésével. Ezekhez a készítményekhez adalékként célszerűen tartósítószert, például metil-p-hidroxi-benzoátot adunk.
Hasonló módon állítunk elő kozmetikai vagy gyógykozmetikai alkalmazásra szánt készítményeket.
Előállításuk során célszerűen úgy járunk el, hogy a lipofil alkotórészeket összekevetjük, és a vízoldható alkotórészekből enyhe melegítéssel vizes oldatot készítünk. Szükség esetén ennek pH-ját a kívánt értékre állítjuk be, majd a kapott emulziót kihűlésig keverjük. A hatóanyagot vizes oldatban adjuk hozzá a többi alkotórész így elkészített keverékéhez.
A fenti eljárásokkal állítjuk elő azokat a gyógyászati és kozmetikai készítményeket is, melyek a 4.1. fejezetben részletesen ismertetett új hidroxil-amin-származékokat tartalmaznak hatóanyagként. Az ilyen készítmények szintén a találmány tárgyát képezik.
Az új hidroxil-amin-származékokat tartalmazó találmány szerinti gyógyászati és kozmetikai készítmények egyik csoportja hatóanyagként a gyógyászati és kozmetikai készítményekben szokásos vivőanyagok és segédanyagok mellett 0,5-99,5 tömeg% mennyiségben egy (I) általános képletű hídroxil-amin-származékot tartalmaz, amelynek képletében
a) X jelentése halogénatom, előnyösen klór- vagy brómatom,
Z jelentése kovalens kötés, és al) A jelentése (a) képletű csoport, ahol Y1 jelentése halogénatom, alkoxi-, halogén-alkil- vagy nitrocsoport, és n jelentése 1,2 vagy 3, vagy egy oxigéntartalmú heteroaril-, előnyösen furilcsoport, egy kéntartalmú heteroaril-, előnyösen tienilcsoport vagy egy nitrogéntartalmú heteroaromás csoport, amely adott esetben benzolgyűrűvel van kondenzálva, vagy annak 1-4 szénatomos alkilcsoporttal N-kvatemerezett vagy N-oxidált származéka, előnyösen piridil-, kinolilvagy izokinolilcsoport,
R jelentése egy (b) képletű csoport, melyben R5 és R6 jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom, egyenes vagy elágazó láncú alkilcsoport, előnyösen 1 -4 szénatomos alkilcsoport vagy cikloalkilcsoport, vagy R5 és R6 a közrezárt nitrogénatommal együtt 3-7 tagú, előnyösen 5-7 tagú telített heterociklusos gyűrűt képez, Y6 jelentése -OR7-csoport, ahol R7 jelentése hidrogénatom vagy acilcsoport, előnyösen helyettesítetlen vagy helyettesített alkil-karbonil-, aril-karbonil- vagy amino-acilcsoport, k jelentése 1, 2 vagy 3 és m jelentése 1, 2 vagy 3, vagy egy ilyen csoport 1-4 szénatomos alkilcsoporttal N-kvatemerezett vagy N-oxidált származéka, azzal a megkötéssel, hogy ha A jelentése piridil- vagy naftilcsoport, vagy olyan (a) képletű csoport, ahol Y1 jelentése halogénatom vagy alkoxicsoport, akkor R7 jelentése hidrogénatomtól eltérő, vagy a2) A jelentése (c) képletű csoport,
R jelentése (d) képletű csoport, és a tetszőleges Y2 és Y3 - melyek legalább egyike jelen van a molekulában oxigénatomot vagy 1-4 szénatomos alkilcsoportot jelent, és k jelentése 1,2 vagy 3 és m jelentése 1,2 vagy 3, és ha a vegyület egy- vagy kétértékű kation, anionja egy vagy két halogenidion, előnyösen jodidion, vagy
b) X jelentése -NR1R2-csoport, ahol R1 és R2 jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom vagy helyettesítetlen vagy helyettesített egyenes vagy elágazó láncú alkilcsoport, helyettesítetlen vagy helyettesített arilcsoport, előnyösen fenilcsoport, helyettesítetlen vagy helyettesített aralkilcsoport, vagy R1 és R2 a szomszédos nitrogénatommal együtt egy 3-7 tagú, előnyösen 5-7 tagú telített heterociklusos gyűrűt képez, mely adott esetben egy vagy több további heteroatomot tartalmaz,
A jelentése helyettesítetlen vagy helyettesített alkilcsoport, helyettesítetlen vagy helyettesített arilcsoport, előnyösen fenilcsoport, vagy helyettesítetlen vagy helyettesített aralkilcsoport,
Z jelentése oxigénatom vagy =NR3 képletű csoport, ahol R3 jelentése hidrogénatom vagy helyettesítetlen vagy helyettesített alkilcsoport, és
R jelentése (b) képletű csoport, melyben R5 és R6 jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom, egyenes vagy elágazó láncú alkilcsoport, előnyösen 1-4 szénatomos alkilcsoport vagy cikloalkilcsoport, vagy R5 és R6 a közrezárt nítrogénatommal együtt 3-7 tagú, előnyösen 5-7 tagú telített heterociklusos gyűrűt képez, Y6 jelentése hidrogénatom vagy -OR7-csoport, ahol R7 jelentése hidrogénatom vagy acilcsoport, előnyösen helyettesítetlen vagy helyettesített alkil-karbonil- vagy aril-karbonil-csoport, k jelentése 1,2 vagy 3 és m jelentése 1,2 vagy 3, vagy
c) X jelentése -OQ-csoport, ahol Q jelentése helyettesítetlen vagy helyettesített alkil- vagy aralkilcsoport,
A jelentése helyettesítetlen vagy helyettesített alkilvagy aralkilcsoport,
Z jelentése oxigénatom és
R jelentése (b) képletű csoport, melyben R5 és R6 jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom, egyenes vagy elágazó láncú alkilcsoport, előnyösen 1-4 szénatomos alkilcsoport vagy cikloalkilcsoport, vagy R5 és R6 a közrezárt nitrogénatommal együtt 3-7 tagú, előnyösen 5-7 tagú telített heterociklusos gyűrűt képez, Y6 jelentése hidrogénatom vagy -OR7-csoport, ahol R7 jelentése hidrogénatom vagy acilcsoport, előnyösen helyettesítetlen vagy helyettesített alkil-karbonil- vagy aril-karbonil-csoport, k jelentése 1,2 vagy 3 és m jelentése 1, 2 vagy 3, vagy
HU 222 994 Bl
d) A jelentése helyettesítetlen vagy helyettesített arilcsoport, előnyösen fenilcsoport vagy nitrogéntartalmú heteroaromás csoport, előnyösen piridilcsoport vagy kéntartalmú heteroaromás csoport,
Z jelentése kovalens kötés,
X jelentése -OQ képletű csoport, ahol Q jelentése 1-4 szénatomos alkilcsoport, és
R jelentése (b) képletű csoport, melyben R5 és R6 jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom, egyenes vagy elágazó láncú alkilcsoport, előnyösen 1-4 szénatomos alkilcsoport vagy cikloalkilcsoport, vagy R5 és R6 a közrezárt nitrogénatommal együtt 3-7 tagú, előnyösen 5-7 tagú telített heterociklusos gyűrűt képez, Y6 jelentése hidrogénatom, k jelentése 1,2 vagy 3 és m jelentése 1,2 vagy 3.
Az új hidroxil-amin-származékokat tartalmazó találmány szerinti gyógyászati és kozmetikai készítmények egy másik csoportja hatóanyagként a gyógyászati és kozmetikai készítményekben szokásos vivőanyagok és segédanyagok mellett 0,5-99,5 tömeg% mennyiségben egy (I) általános képletű hidroxil-amin-származékot tartalmaz, amelynek képletében
X jelentése -NR'R2 képletű csoport, ahol R1 és R2 egymástól függetlenül hidrogénatomot vagy helyettesítetlen vagy helyettesített egyenes vagy elágazó láncú alkilcsoportot, előnyösen 1-6 szénatomos alkilcsoportot vagy cikloalkilcsoportot jelent, vagy R1 és R2 az általuk közrezárt nitrogénatommal együtt 3-7 tagú, előnyösen 5-7 tagú telített heterogyűrűt képez,
A jelentése helyettesítetlen vagy helyettesített aralkilcsoport, előnyösen egy vagy több alkoxicsoporttal, előnyösen 1-4 szénatomos alkoxicsoporttal helyettesített fenil-alkil-csoport, helyettesítetlen vagy egy vagy több halogénatommal vagy alkil- vagy halogén-alkilcsoporttal, előnyösen 1-4 szénatomos alkil- vagy halogén-alkil-csoporttal vagy acil-amino- vagy nitrocsoporttal helyettesített fenilcsoport vagy egy helyettesítetlen vagy helyettesített nitrogéntartalmú, adott esetben benzolgyűrűvel kondenzált heteroaromás csoport, előnyösen pirrolil-, piridil-, izokinolil- vagy kinolilcsoport, vagy egy kéntartalmú heteroarilcsoport, előnyösen tienilcsoport, ahol a heteroarilcsoportok adott esetben szubsztituensként egy vagy több alkilcsoportot, előnyösen 1-4 szénatomos alkilcsoportot hordozhatnak,
Z jelentése kovalens kötés, és
R jelentése (e) képletű csoport, ahol R5 és R6 jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom vagy egyenes vagy elágazó láncú alkilcsoport, előnyösen 1-4 szénatomos alkilcsoport vagy cikloalkilcsoport, vagy R5 és R6 együttesen, az általuk közrezárt nitrogénatommal együtt 3-7 tagú, előnyösen 5-7 tagú telített heterogyűrűt képez, amely adott esetben további heteroatomokat tartalmazhat és adott esetben szubsztituenseket, előnyösen 1-4 szénatomos alkilcsoportot hordozhat, Y4 hidrogénatomot vagy helyettesítetlen vagy helyettesített 1-4 szénatomos alkilcsoportot, Y5 hidrogénatomot vagy helyettesítetlen vagy helyettesített 1-4 szénatomos alkilcsoportot vagy -OR7-csoportot jelent, ahol R7 jelentése hidrogénatom vagy arilcsoport, k értéke 1, 2 vagy 3 és m értéke 1,2 vagy 3, azzal a kikötéssel, hogy ha A helyettesítetlen vagy halogénatommal vagy alkoxicsoporttal helyettesített fenilcsoportot vagy alkoxicsoporttal helyettesített fenil-alkil-csoportot vagy piridilcsoportot jelent, és R7 jelentése hidrogénatom, akkor R1 és R2 közül legalább az egyik hidrogéntől eltérő szubsztituens, továbbá ha A helyettesítetlen vagy halogénatommal vagy alkoxicsoporttal helyettesített fenilcsoportot vagy alkoxicsoporttal helyettesített fenil-alkil-csoportot vagy piridilcsoportot jelent, és R1 és R2 jelentése hidrogénatom, akkor R7 jelentése hidrogéntől eltérő szubsztituens.
Az új hidroxil-amin-származékokat tartalmazó találmány szerinti gyógyászati és kozmetikai készítmények egy ismét más csoportját képezik azok, amelyek hatóanyagként a gyógyászati és kozmetikai készítményekben szokásos vivőanyagok és segédanyagok mellett 0,5-99,5 tömeg% mennyiségben egy (II) általános képletű hidroxil-amin-származékot tartalmaznak, amelynek képletében
a) X jelentése oxigénatom,
A jelentése 1 -20 szénatomos egyenes vagy elágazó láncú alkilcsoport, helyettesítetlen vagy helyettesített arilcsoport, előnyösen fenil- vagy halogén-alkil-fenilcsoport, helyettesítetlen vagy helyettesített aralkilcsoport, naftilcsoport vagy nitrogéntartalmú heteroaromás csoport, előnyösen piridilcsoport,
Z jelentése kovalens kötés,
R’ jelentése hidrogénatom, 1-4 szénatomos alkilcsoport vagy aralkilcsoport, előnyösen fenil-alkilcsoport,
R jelentése (b) képletű csoport, melyben R5 és R6 jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom, egyenes vagy elágazó láncú alkilcsoport, előnyösen 1-4 szénatomos alkilcsoport vagy cikloalkilcsoport, vagy R5 és R6 a közrezárt nitrogénatommal együtt 3-7 tagú, előnyösen 5-7 tagú telített heterociklusos gyűrűt képez, Y6 jelentése hidrogénatom vagy -OR7-csoport, ahol R7 jelentése hidrogénatom, k jelentése 1, 2 vagy 3 és m jelentése 1, 2 vagy 3, azzal a kikötéssel, hogy ha A jelentése alkilcsoporttól eltérő szubsztituens és R’ jelentése hidrogénatom, akkor Y6 hidrogénatomot jelent, vagy
b) X jelentése =NR4-csoport, ahol R4 jelentése hidrogénatom, helyettesítetlen vagy helyettesített alkilcsoport vagy helyettesítetlen vagy helyettesített arilcsoport, előnyösen fenilcsoport, vagy helyettesítetlen vagy helyettesített aralkilcsoport, előnyösen fenil-alkilcsoport,
A jelentése helyettesítetlen vagy helyettesített alkilcsoport vagy helyettesítetlen vagy helyettesített arilcsoport, előnyösen fenil- vagy helyettesített fenilcsoport, vagy helyettesítetlen vagy helyettesített aralkilcsoport, előnyösen fenil-alkil-csoport, vagy cikloalkilcsoport,
Z jelentése kovalens kötés, oxigénatom vagy =NR3csoport, ahol R3 jelentése hidrogénatom vagy helyettesítetlen vagy helyettesített alkilcsoport,
R’ jelentése helyettesítetlen vagy helyettesített alkilcsoport vagy helyettesítetlen vagy helyettesített
HU 222 994 Bl arilcsoport, előnyösen fenilcsoport, vagy helyettesítetlen vagy helyettesített aralkilcsoport, előnyösen fenil-alkil-csoport, és
R jelentése (b) képletű csoport, melyben R5 és R6 jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom, egyenes vagy elágazó láncú alkilcsoport, előnyösen 1-4 szénatomos alkilcsoport vagy cikloalkilcsoport, vagy R5 és R6 a közrezárt nitrogénatommal együtt 3-7 tagú, előnyösen 5-7 tagú telített heterociklusos gyűrűt képez, Y6 jelentése hidrogénatom vagy -OR7-csoport, ahol R7 jelentése hidrogénatom vagy acilcsoport, előnyösen helyettesítetlen vagy helyettesített alkil-karbonil- vagy aril-karbonil-csoport, k jelentése 1,2 vagy 3 és m jelentése 1,2 vagy 3, vagy
c) X jelentése oxigénatom,
A jelentése helyettesítetlen vagy helyettesített alkilcsoport, helyettesítetlen vagy helyettesített aralkilcsoport, előnyösen fenil-alkil-csoport,
Z jelentése oxigénatom,
R’ jelentése alkilcsoport vagy aralkilcsoport, előnyösen fenil-alkil-csoport,
R jelentése (b) képletű csoport, melyben R5 és R6 jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom, egyenes vagy elágazó láncú alkilcsoport, előnyösen 1-4 szénatomos alkilcsoport vagy cikloalkilcsoport, vagy R5 és R6 a közrezárt nitrogénatommal együtt 3-7 tagú, előnyösen 5-7 tagú telített heterociklusos gyűrűt képez, Y6 jelentése hidrogénatom vagy -OR7-csoport, ahol R7 jelentése hidrogénatom vagy acilcsoport, előnyösen helyettesítetlen vagy helyettesített alkil-karbonil- vagy aril-karbonil-csoport, k jelentése 1,2 vagy 3 és m jelentése 1,2 vagy 3, vagy
d) X jelentése oxigénatom,
Z jelentése =NH-csoport, és dl) A jelentése helyettesítetlen vagy helyettesített alkilcsoport, cikloalkilcsoport, helyettesítetlen vagy helyettesített aralkilcsoport, előnyösen fenil-alkil-csoport, helyettesítetlen vagy halogénatommal, alkil-, halogénalkil-, alkoxi- vagy nitrocsoporttal helyettesített fenilcsoport,
R’ jelentése alkil- vagy aralkilcsoport, előnyösen fenil-alkil-csoport, és
R jelentése (b) képletű csoport, melyben R5 és R6 jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom, egyenes vagy elágazó láncú alkilcsoport, előnyösen 1-4 szénatomos alkilcsoport vagy cikloalkilcsoport, vagy R5 és R6 a közrezárt nitrogénatommal együtt 3-7 tagú, előnyösen 5-7 tagú telített heterociklusos gyűrűt képez, Y6 jelentése hidrogénatom vagy hidroxilcsoport, k jelentése 1,2 vagy 3 és m jelentése 1, 2 vagy 3, vagy d2) A jelentése (a) képletű csoport, ahol Y1 jelentése halogén-alkil-csoport, előnyösen trifluor-metil-csoport és n értéke 1,2 vagy 3,
R’ jelentése hidrogénatom, és
R jelentése (b) képletű csoport, melyben R5 és R6 jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom, egyenes vagy elágazó láncú alkilcsoport, előnyösen 1-4 szénatomos alkilcsoport vagy cikloalkilcsoport, vagy R5 és R6 a közrezárt nitrogénatommal együtt 3-7 tagú, előnyösen 5-7 tagú telített heterociklusos gyűrűt képez,
Y6 jelentése -OR7-csoport, ahol R7 jelentése hidrogénatom, k jelentése 1,2 vagy 3 és m jelentése 1, 2 vagy 3.
Az új hidroxil-amin-származékokat tartalmazó találmány szerinti gyógyászati és kozmetikai készítmények egy további csoportját alkotják azok, amelyek hatóanyagként a gyógyászati és kozmetikai készítményekben szokásos vivőanyagok és segédanyagok mellett 0,5-99,5 tömeg% mennyiségben egy (I”) általános képletű hidroxilamin-száimazékot tartalmaznak, amelynek képletében
A jelentése helyettesítetlen vagy halogénatommal vagy nitrocsoporttal helyettesített fenilcsoport vagy Ntartalmú heteroarilcsoport, előnyösen piridilcsoport,
R1 jelentése hidrogénatom és
R” jelentése az aminocsoporton adott esetben monovagy diszubsztituált Ω-amino-alkil-csoport, amelynek alkillánca 1-5 szénatomos, és amely egymástól független aminoszubsztituensként egy vagy két egyenes vagy elágazó láncú alkilcsoportot vagy cikloalkilcsoportot tartalmazhat, vagy amelynek két aminoszubsztituense együttesen, a közrezárt nitrogénatommal együtt egy 3-7 tagú, előnyösen 5-7 tagú telített heterociklusos gyűrűt képez, vagy annak 1-4 szénatomos alkilcsoporttal képzett Nkvatemerezett származéka, azzal a kikötéssel, hogy ha A jelentése 3-piridilcsoport, akkor R” 1-piperidinil-metil-csoporttól eltérő csoport.
A találmányt - az itt leírtak jobb megértése céljából - az alábbi példákkal szemléltetjük. Ezek a példák azonban csak az illusztrálásra szolgálnak, és semmiképp sem korlátozó jellegűek.
5. Kémiai és készítménypéldák
5.1. Kémiai példák: hidroxil-amin-származékok
1. példa
N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-2-tiofén-karboximidoil-klorid-monohidroklorid
5,0 g (15,6 mmol) N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-2-tiofén-karboximid-amid-monohidrokloridot (44. példa) 19 ml vízben feloldunk, majd 6,1 ml koncentrált sósavat adunk hozzá. Az oldatot -5 °C-ra lehűtjük, majd
4,4 g (63,8 mmol) nátrium-nitrit 2,4 ml vízben készült hideg oldatát csepegtetjük hozzá. A reakció ideje alatt a belső hőmérsékletet 0 °C-on tartjuk. Amikor a csepegtetés befejeződött, az elegyet még egy órán át tovább kevertetjük. 60 ml hideg benzol hozzáadása után a reakcióelegyet 3,2 g (80 mmol) nátrium-hidroxid 45 ml vízben készített hideg oldatának lassú adagolásával meglúgosítjuk. A szerves fázist elkülönítjük, és addig mossuk 20 ml vízzel többször egymás után, amíg a pH<9 lesz (3-5ször). A szerves fázist vízmentes nátrium-szulfát fölött megszárítjuk, aktív szénnel kezeljük, szüljük és vákuumban 45 °C alatt bepároljuk, így 2,6 g olajat kapunk. Ezt a maradékot feloldjuk 5 ml izopropil-alkoholban, és megsavanyítjuk (pH=2) száraz sósavgázt tartalmazó izopropil-alkohollal. A kapott terméket n-hexánból átkristályosítva szürkésfehér anyagot nyerünk.
Hozam: 2,0 g (38%).
Olvadáspont: 115-123 °C.
Az 1. példa szerinti eljárást követve a következő vegyületeket állítottuk elő.
HU 222 994 Bl
2. példa
N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-l-izokinolinkarboximidoil-klorid-monohidroklorÍd Kiindulási anyag: 46. példa.
Hozam: 48%.
Olvadáspont: 168-172 °C.
IR (KBr): 3425, 3128, 2947, 2866, 2650, 2540, 1622, 1597,1556,1452,1385,1364,1329,1296,1281,1240, 1117, 1092, 1024, 1015, 978, 953, 903, 881, 795, 743, 718,658, 559 cm->.
3. példa
N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-kinolin-karboximidoil-klorid-(Z)-2-buténdioát (1:1)
Kiindulási anyag: 42. példa.
Ebben az esetben a végterméket a feldolgozási reakció végén úgy izoláljuk, hogy a nyersbázist acetonban feloldjuk, és ekvivalens mennyiségű maleinsavat adunk hozzá.
Hozam: 67%.
Olvadáspont: 159-162 °C.
IR (KBr): 3427, 3019, 2947, 2886, 2689, 1583, 1477, 1450, 1352, 1293, 1221, 1194, 1132, 1072, 1045, 939, 919, 872, 833, 754, 650, 557 cm-1.
4. példa
N-[2-hidroxi-3-(I -piperidinil)-propoxi]-3-nitro-benzol-karboximidoil-klorid-monohidroklorid Kiindulási anyag: 40. példa.
Hozam: 58%.
Olvadáspont: 185-189 °C.
5. példa
N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-4-nitro-benzol-karboximidoil-klorid-monohidroklorid Kiindulási anyag: 43. példa.
Hozam: 47%.
Op: 180-182 °C.
IR (KBr): 3331, 2953, 2853, 2735, 2654, 2577, 2548,
1605,1568,1516,1456,1348,1261,1165,1119,1072, 1059, 1007, 960, 933, 862, 849, 754, 719, 690, 673, 627, 581, 550,478 cm-1.
6. példa
N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-2-nitro-benzol-karboximidoil-klorid-monohidroklorid Kiindulási anyag: 45. példa.
Hozam: 50%.
Olvadáspont: 159-162 °C.
IR (KBr): 3298, 2983, 2932, 2746, 1593, 1574, 1535, 1445,1391,1354,1317,1288,1242,1198,1117,1092, 1069, 1020, 968, 947, 914, 852, 793, 756, 708, 577 cm-1.
7. példa
N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-2-furán-karboximidoil-klorid-monohidroklorid
3,0 g (116,9 mmol) l-klór-2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propánt [J. Org. Chem. 33 (2), 523-30 (1968)] feloldunk 1,8 ml vízben, majd 1,19 g (29,8 mmol) szilárd
NaOH-ot adunk hozzá, és az elegyet 1 órán át szobahőmérsékleten kevertetjük. Ezután 1,92 g (15,2 mmol) Nhidroxi-2-íúrán-karboximid-amidot adunk hozzá, és az elegyet egy éjszakán át szobahőmérsékleten kevertetjük. Koncentrált sósavval (2,1 ml) a pH-t körülbelül 4-re beállítjuk, és az oldatot vákuumban szárazra pároljuk. A maradékot (5,4 g) feloldjuk 37 ml cc. HCl-ban, lehűtjük 0-5 °C-ra, és 5,6 g (80 mmol) NaNO2 23 ml vízzel készült oldatát adjuk hozzá cseppenként 30 perc alatt. Ezután az oldat pH-ját 10-re beállítjuk 2 n NaOH-dal (102 ml), és extraháljuk 2 x 130 ml etil-acetáttal. Az egyesített szerves fázist vízzel mossuk, vízmentes Na2SO4 fölött szárítjuk és bepároljuk. A maradékot (2,0 g) újra oldjuk kis mennyiségű etil-acetátban (20 ml), és a terméket kicsapjuk izopropanolos sósavoldat hozzáadásával (3,2 n, 3 ml). A kapott csapadékot szüljük, mossuk és végül izopropanolból átkristályosítjuk.
Hozam: 11%.
Olvadáspont: 139-141 °C.
IR (KBr): 3427, 3267, 3094, 2955, 2922, 2964, 2745, 1637,1584,1479,1452,1391,1319,1281,1259,1157, 1117, 1074, 1024, 999, 980, 943, 887, 854, 843, 743, 710, 596 cm-1.
A következő vegyületet az előző példában leírt eljárás szerint állítottuk elő.
8. példa
N-[2-hidroxi-3-(1 -piperidinil)-propoxi]-4-piridin-karboximidoil-klorid-(Z)-buténdioát (1:1)
Ebben az esetben a végterméket a feldolgozási eljárás végén úgy izoláljuk, hogy a nyersbázist feloldjuk acetonban, és ekvivalens mennyiségű maleinsavat adunk hozzá.
Hozam: 25%.
Olvadáspont: 165,5-169 °C.
9. példa
N-{3-[(l,l-dimetil-etin-amino]-2-hidroxi-propoxi}-3trifluor-metil-benzimidoil-klorid-monohidroklorid
a) lépés: 50 g (0,245 mól) m-trifhior-metil-benzamid-oximot és 33,7 g (0,6 mól) kálium-hidroxidot feloldunk dimetil-szulfoxid és 170 ml víz elegyében, és az oldatot 0 °C-ra lehűtjük. 48 ml (0,6 mól) epiklórhidrint adunk hozzá, és a reakcióelegyet 5 órán át 0 °C-on kevertetjük, majd egy éjszakán át hűtőszekrényben tartjuk. A következő napon 250 ml vízzel meghígítjuk és 4x250 ml etil-acetáttal extraháljuk. Az egyesített szerves fázisokat vízzel mossuk, szárítjuk, aktív szénnel kezeljük és bepároljuk szárazra. így színtelen olaj formájában kapjuk az m-trifluor-metil-N-(2,3-epoxi-propoxi)-benzamidint.
Hozam: 61 g(96%).
b) lépés: Az a) lépésben kapott olajat feloldjuk 400 ml 18%-os sósavoldatban, 60 ml étert adunk hozzá, és lehűtjük -5 °C-ra keverés közben. 17,4 g (0,25 mól) nátrium-nitritet, melyet előzőleg 60 ml vízben feloldottunk, adagolunk lassanként 40 perc alatt, és a reakcióelegyet még további 20 percen át kevertetjük. Ezután 2x160 ml éterrel extraháljuk, és az egyesített szerves fázisokat kétszer vízzel mossuk. Az éteres ol22
HU 222 994 Bl dathoz 340 ml 20%-os nátrium-hidroxidot adunk, és a kétfázisú rendszert 1 órán át refluxáljuk, miközben keverjük. A fázisokat ezután elválasztjuk, a szerves fázist telített konyhasóoldattal mossuk, amíg neutrális lesz, majd szárítjuk és szárazra pároljuk. így színtelen olaj formájában kapjuk az m-trifluor-metil-N-(2,3-epoxipropoxij-benzimidoil-kloridot.
Hozam: 30,5 g (45%).
c) lépés: 1,19 g (4,2 mmol) N-[(2,3-epoxi)-propoxi]-3-trifluor-metil-benzimidoil-klorid és 0,89 ml (8,5 mmol) terc-butil-amin 12 ml izopropil-alkoholban készített elegyét 2 órán át refluxáljuk, majd az oldószert csökkentett nyomáson eltávolítjuk. A maradékot etil-acetátban oldjuk, 0,98 ml metanolos sósavoldatot (4,3 n) adunk hozzá, és az elegyet vákuumban kis térfogatra betöményítjük, majd éterrel meghígítjuk. A kivált csapadékot szűrjük, hideg éterrel mossuk és szárítjuk.
Hozam: 0,48 g (32%).
Olvadáspont: 150-153 °C.
IR (KBr): 3423, 3233, 2978, 2880, 2784, 1620, 1570, 1479,1441,1400,1383,1340,1238,1167,1128,1101, 1072,1038,982,930, 897, 804, 787, 714,694 cm-’.
Az előző példában leírt eljárást követve az alábbi vegyületeket állítottuk elő.
10. példa
N-[2-hidroxi-3-[(l-metil-etil)-amino]-propoxi]-3-trifluor-metil-benzimidoil-klorid-monohidroklorid Hozam: 30%.
Olvadáspont: 105-108 °C.
IR (KBr): 3358, 2984, 2883, 2804, 1595, 1441, 1383, 1335, 1238, 1184, 1171, 1121, 1099, 1074, 1011, 995, 947,906, 891,798, 779, 696, 681, 567 cm-’.
11. példa
N-[3-(ciklohexil-amino)-2-hidroxi-propoxi]-3-trifluormetil-benzimidoil-klorid-monohidroklorid Hozam: 35%.
Olvadáspont: 147-149,5 °C.
IR (KBr): 3381, 2951, 2860, 2820, 1580, 1439, 1344, 1246, 1161, 1126, 1099, 1074, 1003, 986, 932, 903, 872, 802,787,716, 692, 681, 648 cm-’.
12. példa
N-[3-(dietil-amino)-2-hidroxi-propoxi]-3-trifluor-metil-benzimidoil-klorid-monohidroklorid
Hozam: 21%.
Olvadáspont: 121-128 °C.
IR (KBr): 3425, 3289, 2951, 2667, 1818, 1443, 1337, 1238,1178,1115,1078,1049,997,910, 804, 781, 696, 683 cm-’.
13. példa
N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-trifluor-metil-benzimidoil-klorid-monohidroklorid
Hozam: 13%.
Olvadáspont: 119-123 °C.
IR (KBr): 3366, 2937, 2854, 2737, 2673, 2538, 1616, 1570,1439,1404,1337,1290,1236,1199,1165,1129,
1101, 1074, 1030, 984, 972, 933, 901, 829, 804, 788, 717,699, 685, 646 cm-’.
14. példa
N-[2-hidroxi-3-(piperidin-l-oxid-l-il)-propoxi]-N’oxi-3-piridin-karboximidoil-klorid
5,0 g (17,1 mmol) N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid 50 ml kloroformban készült oldatához kis részletekben 7,0 g (40 mmol) m-klór-perbenzoesavat adagolunk, és a reakcióelegyet 2 órán át szobahőmérsékleten keverjük. Az oldószert eltávolítjuk, és a maradékot feloldjuk 80 ml etil-acetátban, vízzel extraháljuk, szárítjuk és bepároljuk. A kapott olajos maradékot végül acetonból kristályosítjuk, és így egy majdnem fehér szilárd anyagot kapunk.
Hozam: 2,21 g (6,7 mmol; 40%).
Olvadáspont: 140-142 °C.
IR (KBr): 3437, 3071, 2943, 2882, 2590, 1801, 1578, 1475,1454,1433,1375,1294,1259,1194,1165,1121, 1088, 1043, 1011, 995, 924, 905, 888, 845, 808, 710, 671, 554, 513,413 cm-’.
75. példa
N-[2-hidroxi-3-(piperidin-l-oxid-l-il)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid
2,0 g (6,8 mmol) N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid 20 ml kloroformban készült oldatához 1,6 g (6,5 mmol) 70%-os tisztaságú m-klór-perbenzoesavat adunk, és az elegyet 30 percig szobahőmérsékleten keveijük. Az oldatot 10%-os nátrium-hidroxid-oldattal meglúgosítjuk, a két fázist elválasztjuk, és a szerves fázist telített konyhasóoldattal mossuk, szárítjuk és bepároljuk. A szilárd maradékot etil-acetátból átkristályosítjuk, a kristályokat kiszűrjük, mossuk, szárítjuk és ily módon egy fehér szilárd anyagot kapunk.
Hozam: 1,03 g (48%).
Olvadáspont: 127-130 °C.
IR (KBr): 3454, 2988, 2945, 2880, 2585, 1585, 1512, 1479,1443,1416,1393,1350,1331,1289,1183,1134, 1072, 1051, 1030, 997, 953, 939, 879, 847, 808, 702, 519,417cm-’.
16. példa
N’-[2-hidroxi-3-(l-metil-l-piperidinium-l-il)-propoxi]-N-metil-piridinium-3-karboximidoil-klorid-dijodid
1,0 g (3,4 mmol) N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid és 1,2 ml (20 mmol) metil-jodid elegyét 10 ml acetonban refluxoljuk nitrogén alatt 2 órán keresztül. A visszamaradó sötétsárga csapadékot kiszűrjük, acetonnal mossuk, és így 1,8 g nyersterméket kapunk, melyet 20 ml etanolból átkristályosítunk.
Hozam: 1,2 g (60%).
Olvadáspont: 153-157 °C.
IR (KBr): 3462, 3406, 3317, 3040, 2940, 2878, 2830, 1729,1636,1589,1504,1462,1378,1350,1290,1209, 1171, 1121, 1069, 1047, 1030, 1001, 941, 897, 868, 818, 706, 673, 635, 589 cm-’.
HU 222 994 Bl
17. példa
N-[2-acetoxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-(Z)-2-buténdioát (1:1)
1,48 g (5,0 mmol) N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)propoxi]-3-piridin-karboximidoil-kloridot feloldunk 5 ml ecetsavanhidridben. A reakció hőmérsékletét 40 °C-ra emeljük. 30 perc múlva az oldószert szobahőmérsékleten vákuumban teljesen eltávolítjuk, a maradékot 30 ml dietil-éterben feloldjuk, az oldatot csontszénnel kezeljük, és az oldószert csökkentett nyomáson eltávolítjuk, így 1,74 g narancssárga színű olajat kapunk. Ezt a maradékot 10 ml acetonban oldjuk, és 0,6 g (5,17 mmol) maleinsav 10 ml acetonnal készült oldatát adjuk hozzá. A kivált kristályos terméket kiszűrjük, acetonnal mossuk, és így 1,43 g törtfehér anyaghoz jutunk. 9 ml izopropil-alkoholból történő átkristályosítás és színtelenítés után a cím szerinti terméket kapjuk.
Hozam: 1,22 g (54%).
Olvadáspont: 143-144 °C.
18. példa (S)-N-{2-[2-(R)-(l,l-dimetil-etil-oxi-karbonil-amino)-3-fenil-propionil-oxi}-3-(l-piperidinil)propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-(Z)-2buténdioát (1:1)
6,7 g (25,5 mmol) N-(terc-butil-oxi-karbonil)-D-fenil-alanint feloldunk 50 ml diklór-metánban. Az oldatot lehűtjük 0 °C-ra, és 4 ml trietil-amint, majd 2,5 ml (26 mmol) klór-szénsav-etil-észtert csepegtetünk hozzá. Az elegyet még 20 percig kevertetjük 0 °C-on, majd
7,5 g (26 mmol) N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-kloridot adunk hozzá 50 ml diklór-metánban 30 perc alatt, és a reakcióelegyet még egy órán át szobahőmérsékleten kevertetjük. Az oldatot először 2x100 ml 10%-os ecetsavval, azután vízzel kirázzuk, vízmentes nátrium-szulfáton szárítjuk és szárazra pároljuk. A maradékot (10,7 g) 71 ml acetonban oldjuk, és 1,53 g (13 mmol) maleinsavat adunk hozzá. A kivált kristályos anyagot kiszűrjük és acetonnal mossuk.
Hozam: 4,0 g (6,0 mmol; 23%).
Olvadáspont: 146,5-148 °C.
[a]D=+21,5° (c=l, MeOH).
IR(KBr): 3393, 2978, 1744, 1697, 1582, 1518, 1468, 1454,1420,1381,1358,1313,1290,1256,1213,1169, 1126,1099,1084,1045,1016, 930,908, 870, 750, 690, 575 cm-1.
Az előző példában leírtak szerint eljárva a következő vegyületet állítottuk elő.
19. példa (R)-N-{2-[2-(S)-(l,l-dimetil-etil-oxi-karbonil-amino)-3-fenil-propionil-oxi]-3-(l-piperidinil)propoxi}-3-piridin-karboximidoil-klorid-(Z)-2buténdioát (1:1)
Hozam: 25%.
Ennek a vegyületnek a fizikai adatai (olvadáspont, IR) megegyeznek a 18. példa vegyületével.
[a]D=-23,6° (c=l, MeOH).
20. példa
N-[2-benzoil-oxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridinkarboximid-amid-(Z)-2-buténdioát (1:1)
20,9 g (75,0 mmol) N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)propoxi]-3-piridin-karboximid-amidot [177 578 számú magyar szabadalmi leírás (1976)] feloldunk 300 ml benzolban. Ehhez az oldathoz 150 ml 1 n nátrium-hidroxidot adunk, majd ezt követően becsepegtetünk
19,5 ml (168 mmol) benzoil-kloridot. 2 órán át intenzíven kevertetjük a reakcióelegyet, majd 7,1 g (67 mmol) nátrium-karbonátot és egy második adag benzoil-kloridot (9,75 ml; 84 mmol) adunk hozzá, és egy éjszakán át folyamatosan kevertetjük. A fázisokat elválasztjuk, a szerves fázist 1 n nátrium-hidroxid-oldattal és vízzel kirázzuk, majd szárítjuk és szárazra bepároljuk. A visszamaradó olajat (41 g) 150 ml acetonban oldjuk, és 8,7 g (75 mmol) maleinsavat adunk hozzá. A kivált csapadékot szűrjük, acetonnal mossuk és szárítjuk.
Hozam: 29,1 g (78%).
Olvadáspont: 194-195 °C.
Az előző példa szerint eljárva az alábbi vegyületet állítottuk elő.
21. példa
N-[2-benzoil-oxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridinkarboximidoil-klorid-(Z)-2-buténdioát (1:1)
Kiindulási anyag: US-PS 5,147,879 (1992).
Hozam: 64%.
Olvadáspont: 134-136 °C.
IR (KBr): 2955, 2939, 2517, 1718, 1583, 1477, 1452, 1410,1370,1354,1317,1268,1209,1173,1117,1057, 1043, 998, 968, 939, 903, 870, 748, 723, 714, 652, 582 cm-·.
22. példa
N-[2-palmitoil-oxi-3-(l-piperidinin-propoxi]-3-piridin-karboximid-amid-monohidroklorid
14,7 g (52,8 mmol) N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)propoxi]-3-piridin-karboximid-amidot feloldunk 160 ml kloroformban. 7,7 ml (55 mmol) trietil-amint, majd ezt követően cseppenként 14,7 g (56,5 mmol) palmitoil-klorid 85 ml kloroformos oldatát adjuk hozzá, és az elegyet egy éjszakán át szobahőmérsékleten kevertetjük. Másnap további 3,8 ml trietil-amint és 7,4 g palmitoil-kloridot adagolunk és a keverést még egy napig folytatjuk. Ezután az oldatot erőteljesen kirázzuk vízzel, 5%-os ecetsavval és vízzel, vízmentes nátrium-szulfáton szárítjuk és szárazra pároljuk. A maradékot (28,2 g olaj) feloldjuk etil-acetátban, és a terméket kicsapjuk 30 ml 1 n sósavas etil-acetáttal. A sűrű, fehér csapadékot kiszűrjük, etil-acetáttal mossuk és szárítjuk. Hozam: 10,9 g (37%).
Olvadáspont: 110-113 °C.
Az előző példában leírtak szerint eljárva a következő vegyületeket állítottuk elő.
23. példa
N-[2-palmitoil-oxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-dihidroklorid Kiindulási anyag: US-PS 5,147,879 (1992).
HU 222 994 ΒΙ
Megjegyzés: a reakciót refluxolással végezzük.
Hozam: 72%.
Olvadáspont: 69-73,5 °C.
IR (KBr): 3425, 2922, 2853, 2648, 2544, 1742, 1632, 1468, 1416, 1377, 1287, 1183, 1113, 1087, 1032, 984, 708,675 cm-i.
24. példa
N-[2-(2-furoil-oxi)-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximid-amid-(Z)-2-buténdioát (1:1) Megjegyzés: a terméket maleátsó formájában izoláljuk.
Hozam: 52%.
Olvadáspont: 167-171,5 °C.
25. példa
N-[2-(o-klór-benzoil-oxi)-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3piridin-karboximid-amid-monohidroklorid Megjegyzés: a reakciót refluxolással hajtjuk végre. Hozam: 50%.
Olvadáspont: 91-94 °C.
26. példa
N-[2-(p-metoxi-benzoil-oxi)-3-(l-piperidinil)propoxi]-3-piridin-karboximid-amid-monohidroklorid
Megjegyzés: a reakciót refluxolással hajtjuk végre. Hozam: 71%.
Olvadáspont: 152-155 °C.
27. példa
N-[2-(m-trifluor-metil-benzoil-oxi)-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximid-amid-monohidroklorid
Megjegyzés: a reakciót refluxolással hajtjuk végre. Hozam: 45%.
Olvadáspont: 144-147 °C.
28. példa
N-[2-(2-tienoil-oxi)-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximid-amid-(Z)-2-buténdioát (1:1) Megjegyzés: a reakciót refluxolással vitelezzük ki, és a terméket maleátsó formájában izoláljuk.
Hozam: 58%.
Olvadáspont: 168-176 °C.
29. példa
N-[2-acetoxi-3-(l -piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximid-amid-monohidroklorid
2,5 g (9,0 mmol) N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximid-amidot feloldunk 27 ml kloroformban, 1,6 g (16 mmol) ecetsavanhidridet adunk hozzá, és 1 órán át szobahőmérsékleten kevertetjük. A reakcióelegyet szárazra pároljuk, és feloldjuk ekvimoláris mennyiségű (9 mmol) száraz sósavgázt tartalmazó izopropil-alkoholban. Az oldatot lehűtjük, és a kivált anyagot kiszűrjük. Izopropil-alkoholból átkristályosítva fehér kristályos vegyületet kapunk.
Hozam: 1,9 g (59%).
Olvadáspont: 107 °C.
30. példa
N-[2-(3-piridin-karbonil-oxi)-3-(l-piperidinin-propoxi]3-piridin-karboximid-amid-(Z)-2-buténdioát (1:1)
1,68 g (6 mmol) N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximid-amid vízmentes piridinben készített oldatához 1,68 g (7,4 mmol) nikotinsavanhidridet adunk, és a reakcióelegyet egy éjszakán át szobahőmérsékleten tartjuk. Ezután csökkentett nyomáson bepároljuk, a maradékot felvesszük 30 ml etil-acetátban, szűrjük, a szűrletet 10%-os nátrium-hidrogén-karbonáttal kirázzuk, szárítjuk és csökkentett nyomáson bepároljuk. A kapott olajat 20 ml acetonban feloldjuk, és 0,53 g maleinsavat adunk hozzá. A kivált terméket kiszűrjük és acetonnal mossuk.
Hozam: 1,84 g (61%).
Olvadáspont: 157-160 °C.
31. példa
N-[3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidamid-dihidroklorid
2,86 g (51,1 mmol) kálium-hidroxidot feloldunk 20 ml absz. etanolban, majd 6,45 g (47,0 mmol) N-hidroxi-3-piridin-karboximid-amidot és 7,7 g (47,7 mmol) 1klór-3-(l-piperidinil)-propánt adunk hozzá, és 9 órán keresztül refluxoljuk az elegyet. A kivált szilárd anyagot szűréssel eltávolítjuk és a szűrletet bepároljuk. A nyersterméket 100 ml kloroformban feloldjuk, 1 n nátrium-hidroxid-oldattal, majd háromszor vízzel mossuk. A szerves fázist megszárítjuk nátrium-szulfáton, a szárítószert kiszűqük, a szűrletet pedig csökkentett nyomáson bepároljuk. A maradékot feloldjuk kis mennyiségű absz. etanolban, és száraz sósavgázt tartalmazó izopropil-alkoholt adunk hozzá (pH=2), így nyersfehér kristályokat kapunk. Hozam: 4,8 g (38%).
Olvadáspont: 95-100 °C (bomlás).
IR (KBr, bázis): 3422, 3294, 3107, 2984, 2937, 2870, 2818,1649,1616,1593,1479,1462,1441,1381,1309, 1194,1123,1094,1059,1042,982,910, 858, 816, 712, 559 cm*1.
Az előző példában leírtak szerint eljárva az alábbi vegyületeket állítottuk elő.
32. példa
N-[3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-trifluor-metil-benzamidin-monohidroklorid
Hozam: 42%.
Olvadáspont: 116-119 °C.
IR (KBr, bázis): 3412, 3082, 2949, 2874, 2827, 1655,
1485,1447,1383,1325,1283,1171,1121,1094,1072, 986,920, 905, 808, 700, 677, 627 cm-’.
33. példa
N-[3-(l-piperidinil)-propoxi]-(3,4-dimetoxi-fenil)-metán-karboximid-amid-dihidroklorid
Hozam: 35%.
Olvadáspont: 207-209 °C.
34. példa
N-[2,2-dimetil-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximid-amid
HU 222 994 Bl
Hozam: 38% (olaj).
IR (KBr): 3323, 2935, 2888, 2785, 1637, 1477, 1393, 1360, 1157, 1111, 1057, 995, 943, 860, 814, 789, 708, 627 cm-1.
35. példa
N-[3-(4-metil-l-piperazinil)-propoxi]-3-piridin-karboximid-amid-monohidroklorid
Hozam: 23%.
Olvadáspont: 127-130 °C.
IR (KBr): 3387, 2947, 2878, 2802, 1730, 1639, 1450, 1389, 1283, 1242, 1194, 1150, 1083, 1015, 964, 933, 814, 710 cm-1.
36. példa
N-[3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-nitro-benzamidin-monohidroklorid
Hozam: 51%.
Olvadáspont: 158-162 °C.
37. példa
N-[3-(l-piperidinil)-propoxi]-benzamidin-dihidroklorid
Hozam: 64%.
Olvadáspont: 207-209 °C.
38. példa
N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-2,4,6-trimetil-benzamidin
Hozam: 44%.
Olvadáspont: 199-201 °C.
IR (KBr): 3410, 3103, 2943, 2912, 2814, 2791, 1634, 1582,1441,1383,1350,1321,1304,1254,1204,1146, 1111, 1099, 1065, 993, 878, 851, 785, 754, 525 cm-1.
39. példa
N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-4-acetamino-benzamidin-monohidroklorid
Hozam: 25%.
Olvadáspont: 133-137 °C.
40. példa
N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-nitro-benzamidin-dihidroklorid
Hozam: 38%.
Olvadáspont: 190-193 °C.
41. példa
N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-2-(l,5-dimetil)-piirol-karboximid-amid-monohidroklorid Hozam: 20%.
Olvadáspont: 144-147 °C.
IR (KBr, bázis): 3458, 3369, 2930, 2849, 1622, 1587, 1502,1468,1437,1396,1354,1323,1279,1254,1200, 1157, 1078, 1042, 988, 962, 930, 870, 856, 758, 737, 694, 609 cm-1.
42. példa
N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-kinolin-karboximid-amid-dihidroklorid
Hozam: 36%.
Olvadáspont: 210-211 °C.
43. példa
N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-4-nitro-benzol-karboximid-amid-dihidroklorid
Hozam: 77%.
Olvadáspont: 184-189 °C.
44. példa
N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-2-tiofén-karboximid-amid-dihidroklorid
Hozam: 73%.
Olvadáspont: 157-170 °C.
IR (KBr): 3280 (b), 2940, 1655, 1420, 1120, 1018, 1002, 857, 710 cm-1.
45. példa
N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-2-nitro-benzamidin-dihidroklorid
Hozam: 47%.
Olvadáspont: 200-208 °C.
IR (KBr): 3300 (b), 2960, 1670, 1535, 1347, 1155, 1020, 960, 800, 753 cm-1.
46. példa
N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-l-izokinolinkarboximid-amid-dihidroklorid
Hozam: 56%.
Olvadáspont: 208-216 °C.
47. példa
N-{3-[l,l -dimetil-etil)-amino]-2-hidroxi-propoxi}-3trifluor-metil-benzamidin-dihidroklorid
21,0 g (80,8 mmol) m-trifluor-metil-N-(2,3-epoxipropoxi)-benzamidint [9. a) példa], 105 ml terc-butilamint, 210 ml étert és 84 ml 4 n nátrium-hidroxid-oldatot refluxolunk 5 órán keresztül. A fázisokat elválasztjuk, az éteres fázist telített sóoldattal mossuk, szárítjuk és bepároljuk. A kapott olajat (25,8 g) 250 ml acetonban feloldjuk, csontszénnel kezeljük, majd 39 ml 4 n sósavas etil-acetátot adunk hozzá keverés közben. A kivált fehér csapadékot kiszűqük és acetonnal mossuk. Hozam: 22,8 g (70%).
Olvadáspont: 186-192 °C (bomlik).
IR (KBr): 3418, 2984, 2785, 2625, 2527, 2401, 1664, 1585,1487,1437,1381,1329,1173,1155,1130,1078, 905, 874, 820, 692,642, 594 cm-1.
48. példa
N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-N’-butil-3-piridin-karboximid-amid-monohidroklorid
a) lépés: N-[2-[(2-tetrahidro-piranil)-oxi]-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid előállítása
21,3 g (71,4 mmol) N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)propoxi]-3-piridin-karboximidoil-kloridot feloldunk 500 ml kloroformban, éteres sósavoldattal pH=3-ra savanyítjuk, majd 32,6 ml (0,357 mól) 3,4-dihidro-2Hpiránt adunk hozzá. A reakcióelegyet 20 órán át szoba26
HU 222 994 Bl hőmérsékleten kevertetjük, majd kirázzuk háromszor, egyenként 200 ml 2 n nátrium-hidroxid-oldattal és négyszer ugyanilyen mennyiségű vízzel. A szerves fázist nátrium-szulfáton szárítjuk, szűrjük és csökkentett nyomáson bepároljuk. Az olajos maradékot 600 ml etil-acetátban feloldjuk, és négyszer 150 ml pH=5 pufferoldattal kirázzuk. A szerves fázist szárítjuk, szűrjük és bepároljuk.
Hozam: 24,5 g (90%).
b) lépés: 3,7 g (9,68 mmol) N-[2-[(2-tetrahidropiranil)-oxi]-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid és 40 ml (0,41 mól) n-butil-amin elegyét 3 órán keresztül refluxoljuk. Az aminfelesleget vákuumban eltávolítjuk, miután egy sötétbarna olaj marad vissza, melyet 40 ml, 3,0 g 4-toluolszulfonsavat tartalmazó etanolban feloldunk, és az elegyet egy órán át 60 °C-on tartjuk. Az oldószert csökkentett nyomáson eltávolítjuk, a maradékot 2 n nátrium-hidroxid-oldattal meglúgosítjuk (pH=10), majd háromszor kloroformmal extraháljuk. A szerves fázist nátrium-szulfát fölött szárítjuk, szűrjük és az oldószert vákuumban lepároljuk. A sötét olajos maradékot kromatográfiával tisztítjuk, így tiszta bázishoz jutunk, melyet 20 ml etanolban feloldunk, és száraz sósavgázt tartalmazó izopropil-alkohollal megsavanyítunk. így halványsárga kristályok formájában a cím szerinti vegyületet kapjuk.
Hozam: 1,22 g (34%).
Olvadáspont: 120-122 °C.
IR (KBr, bázis): 3319, 3293, 3040, 2959, 2928, 2854, 2842,2552,1612,1580,1450,1427,1399,1333,1315, 1221, 1196, 1171, 1126, 1103, 1051, 1022, 964, 928, 899, 858, 829, 719, 692, 602 cm-1.
Az előző példában leírt eljárást követve az alábbi vegyületet állítottuk elő.
49. példa
N-[2-hidroxi-3-(l-piperidÍnil-propoxi]-N’-ciklohexil3-piridin-karboximid-amid-monohidroklorid Hozam: 0,89 g (24%).
Olvadáspont: 130-134 °C.
IR (KBr): 3280, 2935, 2853, 2640, 1720, 1619, 1551, 1514,1452,1404,1313,1236,1194,1155,1124,1111, 1090,1040,978, 828, 735, 627 cm-1.
50. példa
N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-N’-(l,l-dimetil-etil)-benzamidin
0,92 g (5,2 mmol) l-klór-2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propán 2 ml vízben készített oldatához 0,42 g (10,4 mmol) nátrium-hidroxidot adunk és egy órán át kevertetjük. Ehhez az elegyhez hozzáadunk 1,0 g (5,2 mmol) N-hidroxi-N’-(l,l-dimetil-etil)-benzamidint, melyet 20 ml etanolban feloldottunk, és 4 órán keresztül refluxoljuk a reakcióelegyet. Az oldószert lepároljuk, és 50 ml vizet adunk a maradékhoz, melyet háromszor 50 ml kloroformmal extrahálunk. A szerves fázist nátrium-szulfáton szárítjuk, szűrjük és az oldószert vákuumban bepároljuk. A sárga olajos maradék hűtőszekrényben lassan kikristályosodik. A kristályokat dietil-éterrel eldörzsöljük és szűrjük.
Hozam: 0,55 g (31%).
Olvadáspont: 134-137 °C.
IR (KBr): 3427, 3254, 2929, 2853, 2814, 1739, 1603, 1510,1445,1391,1367,1302,1281,1190,1140,1117, 1094, 1067, 1036, 993, 963, 922, 841, 789, 716, 675 cm-1.
51. példa
N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-N’,N’-dietil-3piridin-karboximid-amid-monohidroklorid
0,66 g (16,6 mmol) nátrium-hidroxidot feloldunk 25 ml absz. etanolban, majd 1,61 g (8,3 mmol) N-hidroxi-N ’ ,N ’-dietil-3 -piridin-karboximid-amidot és 1,48 g (8,3 mmol) l-klór-2-hidroxi-3-(l-piperidinil)propánt adunk hozzá, majd 5 órán keresztül refluxoljuk az elegyet. Az oldószer lepárlása után 50 ml vizet adunk a maradékhoz, és háromszor 50 ml etil-acetáttal extraháljuk. A szerves fázist nátrium-szulfáton szárítjuk, szűrjük és vákuumban bepároljuk. A sárga olajos maradékot kromatográfiával tisztítva tiszta bázist nyerünk, amelyet 20 ml etil-acetátban feloldunk, és ekvivalens mennyiségű száraz sósavgázt tartalmazó etil-acetáttal megsavanyítunk. így fehér kristályos anyag formájában a cím szerinti vegyületet kapjuk.
Hozam: 1,3 g (42%).
Olvadáspont: 113-117 °C.
52. példa
N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]hexadekánsavamid-monohidroklorid
1,74 g (10 mmol) l-amino-oxi-2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propánt feloldunk 20 ml kloroformban és lehűtjük 0 °C-ra. 2,85 g (10 mmol) palmitoil-klorid 10 ml kloroformban készített oldatát adjuk hozzá cseppenként 10 perc alatt. A reakcióelegyet 15 percen át kevertetjük, majd a kivált fehér csapadékot kiszűrjük, kloroformmal mossuk és szárítjuk.
Hozam: 3,2 g (71%).
Olvadáspont: 147-150 °C.
IR (KBr): 3242, 3090, 2951, 2916, 2849, 1730, 1653, 1520,1472,1439,1370,1300,1229,1169,1136,1099, 1070, 1009, 993, 962, 928, 858, 760, 719, 602, 471 cm-*.
Az előző példában leírtak szerint eljárva a következő vegyületeket állítottuk elő.
53. példa
N-[3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-trifluor-metíl-benzamid
Kiindulási anyag: EP 365,364 (1990).
Hozam: 69% (olaj).
IR (KBr): 3425, 2941, 2864, 2775, 1674, 1614, 1566, 1520,1483, 1441,1393,1337,1319,1277,1187,1129, 1072,922, 914, 750, 698, 650 cm-1.
54. példa
N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-naftalin-l-karboxamid
Hozam: 54%.
Olvadáspont: 104-107 °C.
HU 222 994 Bl
IR(KBr): 3375, 2934, 1641, 1593, 1564, 1439, 1340, 1325,1113,1026, 941, 810, 779 cm-1.
55. példa
N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-N’-heptilkarbamid
1,23 g (7,1 mmol) l-amino-oxi-2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propán 20 ml kloroformban készült oldatához 1,0 g (7,1 mmol) heptil-izocianátot adunk, és a reakcióelegyet 20 órán át kevertetjük. Az oldószert vákuumban lepároljuk, és a maradékot kromatográfiával tisztítjuk, így tiszta színtelen olajat kapunk. Ezt az olajat petroléterrel eldörzsölve fehér kristályos terméket nyerünk. Hozam: 81%.
Olvadáspont: 49-51 °C.
Az előző példában leírtak szerint eljárva a következő vegyületeket állítottuk elő.
56. példa
N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-N’-propilkarbamid
Hozam: 50% (olaj).
IR (KBr): 3319, 2934, 2878, 2802, 1666, 1551, 1456, 1393,1308,1155,1092,1040,993, 889, 793 cm-1.
57. példa
N-ciklohexil-N’-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]karbamid
Hozam: 67%.
Olvadáspont: 108-110 °C.
IR (KBr): 3319, 3287, 3188, 2930, 2853, 2797, 1637, 1574,1452,1354,1331,1300,1101,1098, 991 cm-’.
58. példa
N-hexil-N’-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]karbamid
Hozam: 27%.
Olvadáspont: 50-52 °C.
IR (KBr): 3310, 2932, 2858, 2804, 1666, 1551, 1454, 1377,1306,1092,1040, 995, 791, 725, 604 cm-1.
59. példa
N-(3-klór-fenil)-N’-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-karbamid Hozam: 34%.
Olvadáspont: 117-118 °C.
IR (KBr): 3250, 2939, 2900, 1670, 1597, 1551, 1491, 1429,1329,1252,1119, 972, 775, 718, 700 cm-1.
60. példa
N-ciklohexil-N’-{2-hidroxi-3-[N-ciklohexil-karbamoilN-(l,l-dimetil-etil)-amino]-propoxi}-karbamid Hozam: 44%.
Olvadáspont: 151-152 °C.
IR(KBr): 3312, 2932, 2854, 1668, 1616, 1555, 1450, 1393,1364,1354,1252,1220,1130,941, 891 cm-1.
61. példa
N-hexil-N’-[3-(l-piperidinil)-propoxi]-karbamid Hozam: 85% (olaj).
IR (KBr): 3354, 2932, 2856, 2810, 2777, 1666, 1543, 1486,1377,1308,1155,1134,1076 cm-1.
62. példa
N-terc-butil-N’-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]karbamid
Hozam: 38%.
Olvadáspont: 71-73 °C.
IR (KBr): 3314, 2945, 2916, 1651, 1555, 1460, 1393, 1384,1335,1254,1111, 988, 903, 839, 781 cm-1.
63. példa
N-(3-nitro-fenil)-N’-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-karbamid Hozam: 54%.
Olvadáspont: 137-139 °C.
IR (KBr): 3281, 2943, 2818, 1672, 1607, 1560, 1529, 1486,1437,1354,1283,1115, 802, 739 cm-1.
64. példa
5,6-Dihidro-5-(l -piperidinil)-metil-3-(3-piridil)-4H1,2,4-oxadiazin
a) lépés: 17,5 g (0,05 mól) N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximid-amid-dihidrokloridot feloldunk 50 ml tionil-kloridban, egy órán keresztül forraljuk, majd az elegyet szárazra pároljuk. A maradékot 300 ml metanolban oldjuk, csontszénnel kezeljük, és szűrés után az oldószert csökkentett nyomáson eltávolítjuk. A párlási maradékot minimális mennyiségű etanolban feloldjuk és hűtőszekrényben kristályosítjuk, így intermedierként kristályos N-[2klór-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidamid-dihidrokloridot kapunk.
Hozam: 13,2 g (71%).
Olvadáspont: 127-145 °C.
b) lépés: 13,2 g (35,7 mmol) N-[2-klór-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximid-amid-dihidrokloridot adunk 16,5 g (143,5 mmol) kálium-tercbutoxid 150 ml terc-butanolban készített oldatához. Az elegyet 6 órán át forraljuk, majd vákuumban bepároljuk. 100 ml 5%-os nátrium-hidroxid-oldatot adunk a maradékhoz, és az így kapott elegyet háromszor 300 ml etil-acetáttal extraháljuk. A szerves fázist nátrium-szulfát fölött megszárítjuk, szűrjük és szárazra pároljuk. A maradékot dietil-éterrel eldörzsöljük, így a cím szerinti terméket fehér kristályok formájában kapjuk. Hozam: 3,5 g (38%).
Olvadáspont: 157,5-158 °C.
65. példa
N- {3-[(l, 1 -dimetil-etil)-amino]-2-hidroxi-propoxi}-3trifluor-metil-benzamid
1,3 ml (15,2 mmol) epiklórhidrint adunk 1,6 ml (15,2 mmol) terc-butil-amin 8 ml etanolban készült oldatához 10 perc alatt, keverés közben, a hőmérsékletet pedig 20 °C alatt tartjuk, majd az elegyet 3 napig állni hagyjuk. Egy másik edényben feloldunk 0,8 g (14,3 mmol) kálium-hidroxidot 20 ml etanol és 3 ml víz elegyében, és ehhez az oldathoz 3,42 g (15,2 mmol) N-hidroxi-3-(trifluor-metil)-benzamid-kálium-sót és az
HU 222 994 Bl előzőleg elkészített epiklórhidrin és terc-butil-amin oldatát adjuk. A reakcióelegyet kevertetjük és 10 órán keresztül forraljuk, majd az oldószert bepároljuk. A maradékot 20 ml diklór-metánnal és 10 ml vízzel eldörzsöljük, a szerves fázist elkülönítjük, 5 ml vízzel és 5 ml telített nátrium-klorid-oldattal mossuk, nátrium-szulfáton szárítjuk, szüljük és bepároljuk. Az olajos maradékot aceton-hexán elegyéből kristályosítjuk, így fehér por alakjában kapjuk a cím szerinti vegyületet.
Hozam: 0,85 g (17,3%).
Olvadáspont: 156-158 °C.
IR(KBr): 2976, 2858, 1612, 1556, 1379, 1352, 1313,
1273,1165,1130,1072, 694 cm-’.
66. példa
Metil-N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidát-(Z)-2-buténdioát (1:1)
11.4 g (38,2 mmol) N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)propoxi]-3-piridin-karboximidoil-kloridot feloldunk 60 ml absz. metanolban, majd 5 perc alatt 25 ml (0,1 mól) nátrium-metilát 25%-os metanolos oldatát csepegtetjük hozzá. A reakcióelegyet fél óráig forraljuk, majd bepároljuk. A maradékot 210 ml diklór-metánnal fél órán át kevertetjük, a kivált nátrium-kloridot kiszűrjük, és a szűrletet 50 ml vízzel, majd 50 ml telített nátrium-klorid-oldattal mossuk, magnézium-szulfát fölött szárítjuk és csökkentett nyomáson bepároljuk. A nyersterméket (9,8 g) kromatográfíával tisztítjuk, így a cím szerinti vegyületet halványsárga olaj formájában kapjuk.
Hozam: 2,9 g (29%).
Elemanalízis a C15H23N3O3 képletre számolva: számított talált
C% 61,4 61,2
H% 79,0 79,1
N% 14,3 14,5
67. példa
Dietil-N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-iminokarbonát
0,87 g (5 mmol) l-amino-oxi-2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propán és 1,1 g (5,5 mmol) tetraetil-ortokarbonát elegyét katalitikus mennyiségű p-toluolszulfonsav jelenlétében 3 órán át 110 °C-on kevertetjük, majd az etanolt kidesztilláljuk. A maradék olajat oszlopkromatográfiával tisztítjuk (Kieselgel 60, eluens: kloroformmetanol-cc. NH4OH 30/5/0,2). 0,38 g halványsárga olajat kapunk.
Hozam: 27,7% (olaj).
’3C-NMR (d, CDC13): 154,9 (s, C=N), 76,5 (t, N-OCH2), 66,6 (d, CHOH), 64,5 (t, CH3CH2), 64,1 (t, CH3CH2), 61,5 (t, CHCH2N), 54,8 (t, piperidin), 26,0 (t, piperidin), 24,2 (t, piperidin), 14,9 (q, CH3), 14,1 (q, CH3).
68. példa
N-{3-[(l,l -dimetil-etil)-amino]-l-hidroxi-propoxi}O-etil-N ’-fenil-izokarbamid
18.4 g (0,1 mól) N-fenil-klór-formimidátot [F. Lengfeld és J. Stieglitz: Am. Chem. J. 16, 70 (1984)] és 16,2 g (0,1 mól) l-amino-oxi-2-hidroxi-3-[(l,l-dimetil-etil)-amino]-propánt (lásd 2 651 083 számú NSZKbeli közrebocsátási irat) feloldunk 200 ml tetrahidrofuránban, 13,9 ml (0,1 mól) trietil-amint adunk hozzá, és szobahőmérsékleten kevertetjük 10 órán keresztül. A kivált trietil-amin-hidrokloridot kiszűrjük, és a szűrletet vákuumban bepároljuk. A kapott maradékot 200 ml kloformban felvesszük és 50 ml vízzel kirázzuk. A szerves fázist nátrium-szulfáton szárítjuk, szűrjük és csökkentett nyomáson bepároljuk. A nyers olajos maradékot kromatográfíával tisztítva a cím szerinti vegyületet halványsárga olajként kapjuk.
Hozam: 18,5 g (59,8%).
Elemanalízis a C 16H27N3O3 képletre számolva
számított talált
C% 62,1 62,3
H% 8,8 8,5
N% 13,6 13,7
69. példa
N-[3-(l-piperidinil)-propoxi]-O-fenil-izokarbamid
3,16 g (20 mmol) l-amino-oxi-3-(l-piperidinil)-propánt 50 ml benzolban oldunk, és hozzáadunk 2,4 g (20 mmol) fenil-cianátot, majd az oldatot szobahőmérsékleten kevertetjük. 12 óra eltelte után további 0,16 g (1,3 mmol) cianátot adunk hozzá, és még további 12 órán át kevertetjük. A reakcióelegyet bepároljuk, metanolban felvesszük, csontszénnel derítjük, szűrjük, majd az oldószert bepároljuk. A kapott maradékot etilacetát-etanol elegyből kristályosítva hófehér anyagot kapunk.
Hozam: 46,9%.
Olvadáspont: 63-70 °C (etil-acetát).
«C-NMR (d, D2O): 152,4; 129,9; 125,8; 119,9; 70,3; 57,4; 54,3; 53,2; 23,0; 22,7; 21,0.
70. példa
N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-N’-pentametilén-O-etil-izokarbamid
2,7 g (0,01 mól) dietil-N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-imino-karbonátot (lásd 67. példát) és 0,99 ml (0,01 mól) piperidint feloldunk 40 ml tetrahidrofírránban, szobahőmérsékleten 2 órán át kevertetjük az elegyet, majd vákuumban szárazra bepároljuk. A maradékot kromatográfíával tisztítjuk, és így a cím szerinti vegyületet olaj formájában kapjuk.
Hozam: 2,1 g (67,1%).
Elemanalízis a C16H31N3O3 képletre számolva: számított talált
C% 61,3 61,1
H% 10,0 9,8
N% 13,4 13,6
71. példa
N,N-dimetil-N’-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]N’ ’-fenil-guanidin
1150 mg (6,58 mmol) l-amino-oxi-2-hidroxi-3-(lpiperidinil)-propán (2,651,083 számú NSZK-beli közrebocsátási irat) 10 ml-es kloroformos oldatához 750 mg Na2CO3-ot adunk. Intenzív keverés közben hozzáadjuk
HU 222 994 Bl
1206 mg (6,58 mmol) N,N-dimetil-N’-fenil-kloroformamidin [BR 888646 (1959), Bayer, szerzők: Kühle és Eue L.; CA 57, 136 961 (1962)] 10 ml kloroformos oldatát. 5 óra eltelte után a szilárd anyagot kiszűrjük. A kloroformot ledesztilláljuk, és a visszamaradt ~1800 mg sárga olajat 10 ml etil-acetátban felvesszük. Hozzáadunk 10,46 ml 0,54 M-os sósavas etil-acetátot, majd a hűtőben kivált sárga kristályokat szűrjük. A szennyeződést acetonos, majd etil-acetátos átkristályosítással távolítjuk el. Termékként 674 mg halványsárga port kapunk.
Hozam: 28%.
Olvadáspont: 127-129 °C.
IR (KBr): 3220, 2093, 2840, 2690, 2620, 1608, 1580, 1475, 1433, 1375, 1250, 1070, 1050, 1000, 925, 900, 760,705 cm-i.
72. példa
N-[3-[(l,l-dimetil-etil)-amino]-2-hidroxi-propoxi]-N‘fenil-guanidin
3,1 g (0,01 mól) N-[3-[(l,l-dimetil-etil)-amino]-2hidroxi-propoxi]-O-etil-N’-fenil-izokarbamidot (lásd 68. példa) feloldunk 20 ml tetrahidrofuránban, és 200 ml 25%-os ammónium-hidroxid-oldatot és 0,26 g (5 mmol) ammónium-kloridot adunk hozzá, majd az elegyet 15 órán keresztül szobahőmérsékleten tartjuk. Ezután az elegyet szárazra pároljuk, kromatográfiával tisztítjuk, és így olaj formájában a cím szerinti vegyületet kapjuk.
Hozam: 1,7 g (60,7%).
Elemanalízis a C14H24N4O2 képletre számolva: számított talált C% 60,0 60,2
H% 8,6 8,9
N% 20,0 19,8
73. példa
N,N’-difenil-N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-benzamidin-hidroklorid
3,55 g (20 mmol) piperidino-klór-propanolt feloldunk 2,5 ml vízben, hozzáadunk 0,8 g (20 mmol) nátrium-hidroxidot, és az így kapott elegyet 1 órán át szobahőfokon kevertetjük. 6,49 g (20 mmol) N,N’-difenilN-hidroxi-benzamidin-hidrokloridot feloldunk 60 ml etanolban, és az előző elegyhez csepegtetjük, majd hozzáadunk még 0,8 g (20 mmol) nátrium-hidroxidot. Az így kapott sárga szuszpenziót 2 órán át forraljuk, majd a kivált nátrium-kloridot szűrjük, etanollal mossuk és a szűrletet bepároljuk. A bepárlási maradékhoz hozzáadunk 40 ml etil-acetátot és 2 χ 40 ml desztillált vízzel mossuk. Az etil-acetátos fázist nátrium-szulfáton szárítjuk és szűrjük. Az etil-acetátos oldathoz kevertetés közben hozzáadunk 5,5 ml 3,67 n HCl/EtOAc-os oldatot, majd a kivált csapadékot leszűrjük. Termékként 3,1 g anyagot nyerünk.
Hozam: 42%.
Olvadáspont: 151-155 °C (metanol-éter).
UC-NMR (d, CDC13): 159,6, 148,0, 140,9, 131,0,
129.7, 129,3, 128,9, 128,5, 127,9, 127,5, 64,2, 60,2,
54.5.22.7, 21,9.
74. példa
N-[3-(l-piperidinil)-propoxi]-N-metil-N’-fenil-O-etilizokarbamid
Ezt a vegyületet a 68. példában leírt eljárással állítjuk elő, azzal az eltéréssel, hogy kiindulási anyagként N-metil-O-[3-(l-piperidinil)-propil]-hidroxil-amint és etil-N-fenil-klór-formimidátot alkalmazunk.
Hozam: 56% (olaj).
Elemanalízis a C17H29N3O3 képletre számolva: számított talált
C% 66,4 66,2
H% 9,5 8,9
N% 13,7 13,9
75. példa
N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-N-metil-N’-fenil-guanidin
Ezt a vegyületet a 72. példában leírt eljárással állítjuk elő, azzal az eltéréssel, hogy kiindulási anyagként az N[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-N-metil-N’-fenilO-etil-izokarbamidot (lásd 74. példa) használjuk. Hozam: 43% (olaj).
Elemanalízis a C 16H26N4O2 képletre számolva
számított talált
C% 62,7 62,2
H% 8,5 8,8
N% 18,3 18,4
76. példa
N,N,N’-trimetil-N”-fenil-N’-[3-(l-piperidinil)-propoxi]-guanidin
344 mg (2 mmol) N-metil-O-[3-(l-piperidinil)-propil]-hidroxil-amint 3 ml kloroformos oldatához 220 mg szilárd Na2CO3-ot adunk. Ebbe csepegtetjük bele intenzív kevertetés közben 438 mg (2 mmol) N,N-dimetilN’-fenil-kloroformamidin-hidroklorid 3 ml kloroformos oldatát. 8 óra kevertetés után leszűrjük a szilárd NaCl és Na2CO3 keverékét, majd a kloroform ledesztillálása után a maradékot feloldjuk etil-acetátban. pH=len a várt terméket átrázzuk vizes fázisba, majd pH=11 en visszarázzuk etil-acetátba. Oszlopkromatográfiás módszerrel tovább tisztítjuk. Termékként 70 mg sárga olajat kapunk.
Hozam: 10% (olaj).
«C-NMR (d, CDC13): 156,6, 150,5, 128,4, 121,4, 120,5, 70,0, 55,9, 54,4,40,6, 39,4,25,8, 25,6,24,3.
77. példa /R/(+)-N-[2-hidroxi-3-(l -piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-(Z)-2-buténdioát (1:1)
2,16 g (3,26 mmol) (S)-N-[2-[2-(R)-(l,l-dimetil-etil-oxi-karbonil-amino)-3-fenil-propionil-oxi]-3(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-(Z)-2-buténdioátot (1:1) (lásd 18. példa) 40 ml metanolban szuszpendálunk és egy órán keresztül forralunk, majd vákuumban szárazra párolunk. A maradékot 20 ml etil-acetáttal eldörzsöljük, a csapadékot szűrjük és etil-acetáttal mossuk. A nyersterméket izopropil-alkoholból átkristályosítjuk, és így a cím szerinti vegyülethez jutunk.
HU 222 994 Bl
Hozam: 1,16 g (85%).
Olvadáspont: 136-137 °C.
[a]D=+5,6° (c=l, MeOH, t=27 °C).
78. példa
N-(3-piperidino-l-propoxi)-3-piridin-karboximidoilklorid-dihidroklorid ml desztillált víz és 4,36 ml cc. sósav elegyét 0 °C-ra hűtjük, és keverés közben 2 g (7,62 mmol) N(3-piperidino-l-propoxi)-3-piridin-karboxamidint (lásd 31. példa) adunk hozzá. 2,7 g (3,81 mmol) nátrium-nitritet feloldunk 10 ml vízben, és ebbe a sárga oldatba csepegtetjük be -5 °C-on 30 perc alatt a fenti oldatot. A zöldes oldatot -5 °C-on másfél órán át kevertetjük, ezután a pH-t 1 n vizes nátrium-hidroxid-oldattal hűtés közben 10-re beállítjuk, majd az oldatot háromszor 40 ml kloformmal extraháljuk. A szerves fázist 20 ml vízzel kirázzuk, nátrium-szulfáton szárítjuk és vákuumban betöményítjük. A párlási maradékot oszlopkromatográfiával tisztítjuk (Merck Kieselgel 60; eluens: kloroform/metanol 1:1), így 1,7 g (79,2%) bázist kapunk, mely megfelel a cím szerinti vegyületnek.
A cím szerinti hidrokloridsót a bázisból etanolos sósav hozzáadásával állítjuk elő.
Olvadáspont: 165-167 °C.
IR (KBr): 3015, 2945, 2617, 2515, 2088, 1982, 1600, 1570,1437,1402,1200,1060, 988, 912, 808 cm-'.
A fenti kiindulási anyagot az alábbiak szerint állíthatjuk elő.
Miután feloldottunk 2,86 g (51,06 mmol) kálium-hidroxidot 20 ml absz. etanolban, 6,45 g (47,0 mmol) 3-piridin-karboxamid-oximot adunk hozzá részletekben keverés közben. 7,7 g (47,66 mmol) l-(3-klór-propil)-piperidint oldunk 5 ml etanolban, és az oxim oldódása után a fenti oldathoz csepegtetjük. 9 órás reakcióidő után a kivált kálium-kloridot kiszűijük, az etanolos oldatot aktív szénnel derítjük és bepároljuk. A párlási maradékot 100 ml kloroformban felvesszük, háromszor, egyenként 100 ml 1 n nátrium-hidroxid-oldattal, majd 50 ml vízzel kirázzuk. Elválasztás után a szerves fázist nátrium-szulfáton szárítjuk, szüljük és vákuumban bepároljuk. Az olajos maradékot hűtéssel kikristályosítjuk. A kristályokat 20 ml éterrel eldörzsöljük, szűqük és szárítjuk. így 4,8 g (38,9%) nyers színű terméket kapunk.
IR (KBr): 3422, 3107, 2937, 2870, 2819, 1640, 1479, 1391,1309,1194,1123,1059,1042,982, 916 cm-'.
Az előző példában leírt eljárással a következő vegyületet állítottuk elő.
79. példa
O-(3-piperidino-propil)-3-nitro-benzhidroxirnoil-klorid-hidroklorid
Hozam: 51%.
Olvadáspont: 173-175 °C.
IR (KBr): 3410, 2926, 2953, 2649, 2546, 1514, 1591, 1533,1452,1354,1259,1252,1049, 994, 733 cm-'.
80. példa
N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-pirazin-karboximidoil-klorid-monohidroklorid
Ezt a vegyületet a 7. példában leírt eljárással állítjuk elő; a nyersterméket oszlopkromatográfiás módszerrel tisztítottuk (Kieselgel 60, eluens: kloroform-metanolcc. NH4OH 30/5/0,2).
Hozam: 45%.
Olvadáspont: 162-167 °C.
IR (KBr): 3190, 2930, 2620, 2520, 1572, 1440, 1400, 1290, 1165, 1150, 1098, 1070, 1028, 1012, 982, 920, 860, 730 cm-1.
81. példa
Metil-{N-[3-(l-piperidinil)-propoxi]}-3-piridin-karboximidát-maleát
Ezt a vegyületet a 66. példában leírt eljárással állítjuk elő, azzal az eltérésseí, hogy kiindulási anyagként N-[3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoilkloridot (78. példa) alkalmaztunk, és a terméket éteres közegben maleátsóként izoláltuk.
Hozam: 58%.
Olvadáspont: 66-71 °C.
IR (KBr): 2900, 2608, 2510, 1600, 1560, 1465, 1372, 1355, 1320, 1190, 1120, 1062, 1050, 985, 875, 862, 708 cm-1.
82. példa
Etil-N-[(3-dietil-amino)-propoxi]-2-tiofén-karboximidát
Ezt a vegyületet a 66. példában leírt eljárással állítjuk elő, azzal az eltéréssel, hogy kiindulási anyagként N-[(3-dietil-amino)-propoxi]-2-tiofén-karboximidoilkloridot, reagensként pedig nátrium-etilátot alkalmaztunk.
Hozam: 41% (olaj).
Elemanalízis a Q4H24N2O2S képletre számolva: számított talált C% 59,1 58,7
H% 8,5 8,6
N% 9,8 9,9
A kiindulási anyagot a 31. és 78. példa szerint állítottuk elő. Olvadáspont: 120-133 °C (HCl-só).
83. példa
Metil-N-[3-(l-piperidinil)-propoxi]-benzimidát
Ezt a vegyületet a 66. példában leírt eljárással állítjuk elő, azzal az eltérésseí, hogy kiindulási anyagként N-[3-(l-piperidinil)-propoxi]-benzimidoil-kloridot alkalmaztunk.
Hozam: 20% (olaj).
Elemanalízis a Cj6H24N2O2 képletre számolva:
szám ított talált
C% 69,5 69,9
H% 8,7 8,4
N% 10,1 10,0
A kiindulási anyagot a 31. és 78. példa szerint állítottuk elő. Olvadáspont: 179-181 °C (HCl-só).
84. példa
N-[2-(l-piperidinil)-etoxi]-3-piridin-karboximid-amid Ezt a vegyületet a 31. példában leírt eljárással állítjuk elő, azzal az eltéréssel, hogy kiindulási anyagként
HU 222 994 Bl
3-piridin-amid-oximot és l-(2-klór-etil)-piperidin-hidrokloridot alkalmaztunk. A nyersterméket oszlopkromatográfiával tisztítjuk (Kieselgel 60, eluens: kloroformmetanol 3/1). Éterrel eldörzsölve halványsárga kristályos anyagot kapunk.
Hozam: 23,5%.
Olvadáspont: 81-83 °C.
IR (KBr): 3396, 3315, 2937, 2835, 1632, 1481, 1393, 1327, 1132, 1109, 1057, 1042, 1022, 930, 814, 708, 534 cm-1.
85. példa
N-[3-(l-piperidinil)-propoxi]-N’-tetrametilén-3-piridin-karboxamidin-hidroklorid
1,75 g (5 mmol) N-[3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-dihidrokloridot (78. példa) és 25 ml pirrolidint lombikba mérünk, és két órát refluxoltatjuk. A reakció végén az oldószert ledesztilláljuk, és a maradékot felvesszük éterben. Az oldatot szárazra pároljuk. Etil-acetátban oldva a maradékot sósavas etil-acetát-oldattal sót képzünk. A kivált halványdrapp csapadékot szűrjük, etil-acetáttal mossuk, és szárítjuk. A terméket THF-ből kristályosítjuk át. Termékként 0,94 g fehér port nyerünk.
Hozam: 56%.
Olvadáspont: 145-146 °C.
IR (KBr): 3400, 2920, 2620, 2530, 1590, 1560, 1475, 1430, 1268, 1230, 1140, 1090, 1070, 1020, 975, 950, 820,720 cnr1.
86. példa
Dibenzil-N-[3-dietil-amino-propoxi]-imino-karbonát
Ezt a vegyületet a 67. példában leírt eljárással állítjuk elő, azzal az eltéréssel, hogy kiindulási anyagként tetrabenzil-ortokarbonátot [Can. J. Chem., 67 (1) 143-147 (1989)] alkalmaztunk.
Hozam: 37%.
Elemanalízis a C; ί2Η30Ν2Ο3 képletre számolva
számított talált
C% 71,7 71,8
H% 8,2 8,3
N% 11,4 11,0
87. példa
N-[3-(l-piperidinil)-propoxi]-O-(4-klór-fenil)izokarbamid
Ezt a vegyületet a 69. példában leírt eljárással állítjuk elő, azzal az eltéréssel, hogy kiindulási anyagként 4-klór-fenil-cianátot alkalmaztunk.
Hozam: 19,5%.
Olvadáspont: 102-105 °C.
IR (KBr): 3390, 3100, 2930, 1670, 1603, 1480, 1380, 1305, 1220, 1135, 1110, 1087, 1060, 995, 943, 898, 840, 805, 790, 770,717 cm-1.
88. példa
N-benzil-N’-[3-(l-piperidinil)-propoxi]-N’ ’-fenil-guanidin
Ezt a vegyületet a 71. példában leírt eljárással állítjuk elő, azzal a különbséggel, hogy kiindulási anyagként N-fenil-N’-benzil-kloroformamidin-hidrokloridot [Ger. 1,119,258(1961); CA 56, 11450(1961)] és 1-amino-oxi-3-(l-piperidinil)-propánt használtunk, valamint a terméket bázis formában izoláltuk.
Hozam: 30% (olaj).
IR(KBr): 2890, 1620, 1580, 1518, 1483, 1428, 1337, 1295,1247,1120,1070, 860, 750,695 cm-i.
89. példa
N, N-dimetil-N’-[2-acetoxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]N”-fenil-guanidin-hidroklorid
224 mg (0,7 mmol) N,N-dimetil-N’-[2-hidroxi-3(l-piperidinil)-propoxi]-N”-fenil-guanidin'hidroklorid (71. példa) 15 ml-es kloroformos oldatához hozzáadunk 87 ml (0,7 mmol) ecetsavanhidridet. 2 órás kevertetés után az oldószert ledesztilláljuk, majd a maradékot 10 ml etil-acetátban oldjuk. Kevertetés közben 1,59 ml 0,54 M-os sósavas etil-acetátot adunk hozzá. Hűtőben állva drapp por válik ki. Acetonból átkristályosítva 46 mg világosdrapp por nyerhető.
Hozam: 20%.
Olvadáspont: 160 °C (dec.).
IR (KBr): 2900, 2650, 1700, 1590, 1570, 1545, 1425, 1360, 1230, 1090, 1085, 1057, 1030, 950, 905, 768, 703 cm-1.
90. példa
N-metil-N-[3-(l-piperidinil)-propoxi]-benzamid-hidroklorid
2,7 g (17,8 mmol) N-metil-benzhidroxámsavat feloldunk 10 ml etanolban, hozzáadunk 1,1 g (18 mmol) kálium-hidroxidot, majd az így kapott elegyhez becsepegtetjük 3 g (18 mmol) 3-klór-propil-piperidin 5 ml etanolos oldatát. 3 óra forralás után a kivált kálium-kloridot kiszűijük és a szűrletet bepároljuk. A bepárlási maradékot 20 ml kloroformban feloldjuk, és 2 χ 20 ml 2 n nátrium-hidroxid-oldattal mossuk. A kloroformos fázist nátrium-szulfáton szárítjuk, szűrjük és bepároljuk. A bepárlási maradékhoz (bázis) hozzáadunk 32 ml
O, 54 M HCl/EtOAc-ot, a kivált kristályokat nitrogén alatt szüljük és vákuumexszikkátorban szárítjuk. Hozam: 79%.
Olvadáspont: 86-93 °C.
iH-NMR (CDClj): 7,2-7,4; 3,7; 3,35; 2,1-2,4; 1,4-1,7 ppm.
13C-NMR (CDClj): 169,9; 134,3; 130,2; 128,1; 127,8; 72,3; 55,3; 54,3; 34,2; 25,8; 25,3; 24,25 ppm.
91. példa
N-metil-N-[3-(l-piperidinil)-propoxi]-izovajsavamid
Ezt a vegyületet az 52. példában leírt eljárással állítjuk elő, azzal a különbséggel, hogy kiindulási anyagként N-metil-O-[3-(l-piperidinil)-propil]-hidroxil-amint és izovajsav-kloridot használtunk.
Hozam: 70% (olaj).
Elemanalízis a C13H26N2O2 képletre számolva:
szám ított talált
C% 64,4 64,7
H% 10,8 10,5
N% 11,6 11,9
HU 222 994 Bl
A kiindulási anyagot (N-metil-0-[3-(l-piperidinil)propil]-hidroxil-amin) az alábbi módon állítottuk elő.
g N-metil-N-[3-(l-piperidinil)-propoxi]-benzamidot (90. példa) oldunk 200 ml 2 n HCl-oldatban és 2 órát forraljuk. A lehűtött oldatból leszűrjük a kivált benzoesavat, a szűrletet 40%-os NaOH-dal pH>10-re lúgosítjuk és 2x70 ml etil-acetáttal extraháljuk. Nátrium-szulfáton szárítjuk, szűrjük és bepároljuk.
Hozam: 53% (olaj).
92. példa
N-benzil-N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]dodekánsavamid
Ezt a vegyületet az 52. példában leírt eljárással állítjuk elő, azzal a különbséggel, hogy kiindulási anyagként N-benzil-O-[3-(l-piperidinil)-propil]-hidroxilamint és dodekanoil-kloridot használtunk.
Hozam: 47% (olaj).
Elemanalízis a C27H46N2O3 képletre számolva:
szám ított talált
C% 72,6 72,3
H% 10,4 10,4
N% 6,3 6,7
A kiindulási anyagot a 90-91. példák szerint állítottuk elő.
93. példa
N-benzil-N-[3-dietil-amino-propoxi]-3-trifluor-meíil-benzamid
Ezt a vegyületet az 52. példában leírt eljárással állítjuk elő, azzal a különbséggel, hogy kiindulási anyagként N-benzil-0-(3-dietil-amino-propil)-hidroxil-amint és 3-trifluor-metil-benzoil-kloridot használtunk. Hozam: 73% (olaj).
Elemanalízis a C22H27F3N2O3 képletre számolva:
szám ított talált
C% 64,7 65,0
H% 6,7 6,5
N% 6,9 6,6
A kiindulási anyagot a 90-91. példák szerint állítottuk elő.
94. példa
Etil-{N-metil-N-[3-(l-piperidinil)-propoxi]}-uretán 2,0 g (8,16 mmol) N-metil-O-[3-(l-piperidinil)-propil]-hidroxil-amint 40 ml kloroformban oldunk, és 0,78 ml (8,16 mmol) klór-hangyasav-etil-észter 10 mles kloroformos oldatát csepegtetjük hozzá 0 °C-on, keverés közben. Egy óra eltelte után 50 ml 10%-os nátrium-karbonát-oldattal lúgosítjuk, majd a kloroformos fázist vízzel mossuk, magnézium-szulfáton szárítjuk, és a szárítószer kiszűrése után az oldószert vákuumban bepároljuk. Halványsárga olajat kapunk.
Hozam: 78%.
13C-NMR (CDC13): 157,5; 72,6; 61,8; 55,7; 54,4; 36,2; 25,8; 25,5; 24,3; 14,4 ppm.
95. példa
Benzil-{N-benzil-N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]}-uretém
Ezt a vegyületet a 94. példában leírt eljárással állítjuk elő, azzal a különbséggel, hogy kiindulási anyagként N-benzil-0-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propil]hidroxil-amint és klór-hangyasav-benzil-észtert alkalmaztunk.
Hozam: 62% (olaj).
Elemanalízis a C 23H30N2O3 képletre számolva:
számított talált
C% 72,2 72,5
H% 7,9 8,0
N% 7,3 7,0
96. példa
N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-N’-3-trifluormetil-fenil-karbamid
Ezt a vegyületet az 55. példában leirt eljárással állítjuk elő, azzal a különbséggel, hogy kiindulási anyagként 3-trifluor-metil-fenil-izocianátot és 1-amino-oxi2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propánt használtunk. Hozam: 61%.
Olvadáspont: 108-110 °C.
IR (KBr): 3070, 2910, 1650, 1585, 1550, 1332, 1305, 1255,1233,1160,1115,1065,960, 888, 795 cm-'.
97. példa
N-metil-N’-(n-hexil)-N-[3-(l-piperidinil)-propoxi]karbamid
Ezt a vegyületet az 55. példában leírt eljárással állítjuk elő, azzal a különbséggel, hogy kiindulási anyagként N-metil-0-[3-(l-piperidinil)-propil]-hidroxilamint és n-hexil-izocianátot használtunk.
Hozam: 70% (olaj).
IR (KBr): 2900, 2825, 2740, 1645, 1505, 1450, 1440, 1430,1367,1295,1188,1120, 860, 765 cm-’.
98. példa
N-(n-hexil)-N'-benzil-N’-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)propoxi]-karbamid
Ezt a vegyületet az 55. példában leírt eljárással állítjuk elő, azzal a különbséggel, hogy kiindulási anyagként N-benzil-O-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propil]hidroxil-amint és n-hexil-izocianátot használtunk. Hozam: 65% (olaj).
13C-NMR (CDC13): 160,7; 137,3; 129,1; 128,2; 127,3; 77,9; 64,1; 59,8; 54,4; 53,8; 40,2; 31,4; 29,7; 26,4; 25,9; 24,0; 22,5; 13,9 ppm.
99. példa
N-(3-ldór-fenil)-N’-benzil-N’-[3-dietil-amino-propoxi]-karbamid
Ezt a vegyületet az 55. példában leirt eljárással állítjuk elő, azzal a különbséggel, hogy kiindulási anyagként N-benzil-O-(3-dietil-amino-propil)-hidroxil-amint és 3-klór-fenil-izocianátot használtunk.
Hozam: 60% (olaj).
Elemanalízis a C21H28C1N3O képletre számolva:
számított talált
C% 67,5 67,2
H% 7,6 7,8
N% 11,2 11,6
HU 222 994 Bl
A kiindulási anyagot a 90-91. példák szerint állítjuk elő.
100. példa
N-metil-N'-benzil-N’'-fenil-N-[3-(l-piperidinil)-propoxi] -guanidin
Ezt a vegyületet a 76. példában leírt eljárással állítjuk elő, azzal a különbséggel, hogy kiindulási anyagként N-fenil-N ’ -benzil-kloroformamidin-hidrokloridot használtunk.
Hozam: 56% (olaj).
IR (KBr): 3400-3100 (b), 2880,1600,1560,1480,1330, 1280,1250,1140,1110,1060,1030,740, 690 cm-·.
101. példa
N-fenil-N‘-benzil-N'-[3-dietil-amino-propoxi]-benzamidin
1,26 g (5 mmol) N-benzil-O-(3-dietil-amino-propil)hidroxil-amínt feloldunk 7,5 ml kloroformban. Az oldathoz szobahőmérsékleten becsepegtetünk 1,08 g (5 mmol) benzanilid-imid-kloridot 7,5 ml kloroformban oldva, majd 3 órát szobahőmérsékleten kevertetjük, 2x10 ml vízzel mossuk. A kloroformos fázist nátrium-szulfáton szárítjuk, szüljük és bepároljuk. A bepárlási maradékot 20 ml 2 n nátrium-hidroxid-oldatban feloldjuk, és 20 ml etil-acetáttal extraháljuk. Az etil-acetátos fázist nátriumszulfáton szárítjuk és szüljük, majd bepároljuk.
Hozam: 75% (olaj).
Elemanalízis a C23 H3oN203 képletre számolva
számított talált
C% 77,7 77,6
H% 8,0 8,3
N% 6,7 7,0
102. példa
N,N’-difenil-N'-[2-acetoxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-benzamidin-acetát
Ezt a vegyületet a 89. példában leírt eljárással állítjuk elő, kiindulási anyagként N,N’-difenil-N’-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-benzamidin (lásd a 73. példát) szolgál.
Hozam: 62% (olaj).
Elemanalízis a C23H30N2O3 képletre számolva: számított talált
C% 70,0 70,3
H% 7,0 6,7
N% 7,9 7,5
103. példa
5,6-Dihidro-3-fenil-5-[(l-piperidinil)-metil]-4H-l,2,4oxadiazin
Ezt a vegyületet a 64. példában leírt eljárással állítjuk elő, kiindulási anyagként N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-benzamidin-dihidroklorid [177 578 számú magyar szabadalmi leírás (1976)] szolgál.
Hozam: 29%.
Olvadáspont: 152-156 °C.
IR (KBr): 3280, 2900, 2760, 1580, 1558, 1510, 1473, 1425, 1313, 1285, 1269, 1148, 1072, 1062, 972, 855, 830, 765, 690cm-i.
104. példa
5.6- Dihidro-3-(3-nitro-fenil)-5-[(l-piperidinil)-metil]4H-1,2,4-oxadiazin
Ezt a vegyületet a 64. példában leírt eljárással állítjuk elő, kiindulási anyagként N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-nitro-benzamidin-dihidroklorid szolgál.
Hozam: 27%.
Olvadáspont: 129-132 °C.
IR (KBr): 3802, 2900, 2760, 1585, 1520, 1500, 1340, 1308,1286,1060, 970, 885, 815, 750,739 cm-·.
A kiindulási anyagot a 177 578 számú magyar szabadalmi bejelentésben (1976) leírt eljárással állítottuk elő. Olvadáspont: 190-193 °C (dihidrokloridsó).
105. példa
5.6- Dihidro-3-(4-klór-fenil)-5-[(1 -piperidinil)-metil]4H-1,2,4-oxadiazin
Ezt a vegyületet a 64. példában leírt eljárással állítjuk elő, kiindulási anyagként N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-4-klór-benzamidin-dihidroklorid [177 578 számú magyar szabadalmi leírás (1976)] szolgál.
Hozam: 36%.
Olvadáspont: 149-152 °C.
IR (KBr): 3310, 2905, 2750, 1585, 1500, 1470, 1305, 1288, 1270, 1118, 1088, 1062, 1010, 993, 972, 855, 830,735 cm-i.
106. példa
5.6- Dihidro-3-(4-klór-fenil)-5-[N-metil-piperidinium1 -il]-metil-4H-l, 2,4-oxadiazin-jodid
1,47 g (5 mmol) 5,6-dihidro-3-(4-klór-fenil)-5-[(lpiperidinil)-metil]-4H-l,2,4-oxadiazint (105. példa) 50 ml acetonban szuszpendálunk és 3,11 ml (50 mmol) metil-jodidot adunk hozzá, majd a reakcióelegyet 5 órán át forraljuk. A kivált fehér kristályos anyagot szűqük, acetonnal mossuk.
Hozam: 92%.
Olvadáspont: 206-210 °C (bomlik).
IR (KBr): 3170, 2900, 2835, 1585, 1495, 1460, 1360, 1333, 1310, 1087, 1040, 1025, 1008, 995, 896, 842, 833,720 cm-·.
107. példa
5.6- Dihidro-3-(3-piridil)-5-dietil-amino-4H-l,2,4oxadiazin
Ezt a vegyületet a 94. példában leírt eljárással állítjuk elő, kiindulási anyagként N-(2-hidroxi-3-dietil-amino-propoxi)-3-piridin-karboxamidin szolgál.
Hozam: 33%.
Elemanalízis a C13H2oN40 képletre számolva: számított talált
C% 62,9 63,1
H% 8,1 7,8
N% 22,6 22,5
A kiindulási anyagot a 177 578 számú magyar szabadalmi bejelentésben (1976) leírt eljárással állítottuk elő.
HU 222 994 Bl
5.2. Készitménypéldák
108. példa Tabletta mg-os tablettát készítünk az alábbi összetétellel:
N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]2-tiofén-karboximidoil-kloridmonohidroklorid 50,0 mg kukoricakeményítő 100,0 mg laktóz 95,0 mg talkum 4,5 mg magnézium-sztearát 0,5 mg
A hatóanyagot finomra őröljük, a segédanyagokkal összekeveqük, a keveréket homogenizáljuk, majd granuláljuk. A granulátumot tablettává préseljük.
109. példa
Tabletta mg-os tablettát készítünk az alábbi összetétellel:
N-[2-hidroxi-(3-piperidinil)-propoxi]2-nitro-benzimidoil-kloridmonohidroklorid 5,0 mg kukoricakeményítő 75,0 mg talkum 7,5 mg kolloid szilícium-dioxid 7,5 mg magnézium-sztearát 5,0 mg
A kompozíciót a 108. példa szerinti módon készítjük el a felsorolt komponensekből.
110. példa Tabletta mg-os tablettát készítünk az alábbi összetétellel:
N-[2-benzil-oxi-3-(l-piperidinil)propoxi]-3-piridin-karboximid-amid(Z)-2-buténdioát (1:1) 5 mg kukoricakeményítő 50 mg zselatin 7,5 mg mikrokristályos cellulóz (Avicel) 25 mg magnézium-sztearát 2,5 mg
A kompozíciót a 108. példa szerinti módon készítjük el a felsorolt komponensekből.
111. példa Kapszula mg-os kapszulát készítünk az alábbi összetétellel:
N-[2-palmitoil-oxi-3-(piperidinil)propoxi]-3-piridin-karboximid-amidmonohidroklorid 10 mg tejcukor 80 mg kukoricakeményítő 25 mg talkum 3 mg kolloid szilícium-dioxid 3 mg magnézium-sztearát 2 mg
A hatóanyagot összekeverjük a segédanyagokkal, a keveréket homogenizáljuk és zselatinkapszulába töltjük.
112. példa
Kapszula mg-os kapszulát készítünk az alábbi összetétellel:
N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)propoxi]-2-tiofén-karboximidoilklorid-monohidroklorid 20 mg mikrokristályos cellulóz (Avicel) 99 mg amorf szilícium-dioxid 1 mg
113. példa Drazsé mg-os drazsét készítünk az alábbi összetétellel:
N-{3-[(l,l-dimetil-etil)-amino]-2hidroxi-propoxi}-3-trifluor-metilbenzamidin-dihidroklorid 25 mg karboxi-metil-cellulóz 295 mg sztearinsav 20 mg cellulóz-acetát-ftalát 40 mg
A hatóanyagot összekeverjük a karboxi-metil-cellulózzal és a sztearinsawal, a keveréket cellulóz-acetát-ftalát 200 ml etil-acetát-etanol eleggyel készített oldatában granuláljuk. A granulátumból magot sajtolunk, amelyet bevonunk 5% cukrot tartalmazó vizes poli(vi-
nil-pirrolidon)-bevonóoldattal.
114. példa Injekció Injekciós oldatot készítünk az alábbi összetétellel
N-[2-hidroxi-3-piperidinil)-propoxi]- 2-nitro-benzimidoil-klorid- monohidroklorid 5 mg
steril fiziológiás sóoldat 2 ml
115. példa Kenőcs Kenőcsöt készítünk az alábbi összetétellel:
N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)- propoxi]-2-tiofén-karboximidoil- klorid-monohidroklorid 7,5 g
sztearinsav 18,0 g
cetil-sztearil-alkohol 15,0 g
glicerin-monosztearát 4,0 g
nátrium-lauril-szulfát 1,5 g
metil-p-hidroxi-benzoát 0,2 g
desztillált víz 150 ml
A sztearinsavat, a cetil-sztearil-alkoholt és a glicerin-monosztearátot felmelegítve összeolvasztjuk. A nátrium-lauril-szulfátot és a metil-p-hidroxi-benzoátot 100 ml vízben oldjuk enyhe melegítés közben, majd hozzáadjuk a lipofil komponensekhez, és kihűlésig folyamatosan keveijük. Ezután hozzáadjuk a hatóanyag 50 ml vízzel elkészített oldatát és alaposan összekeveqük.
116. példa
Kenőcs
Kenőcsöt készítünk az alábbi összetétellel:
N-[2-hidroxi-3-piperidinil)-propoxi]2-nitro-benzimidoil-kloridmonohidroklorid 7,0 g poliszorbát 4,0 g folyékony paraffin 4,0 g cetil-sztearil-alkohol 12,0 g fehér vazelin 20,0 g
HU 222 994 Bl metil-p-hidroxi-benzoát 0,2 g etil-alkohol 1,8 g desztillált víz 50 ml
A komponenseket a 115. példában részletezett eljárással egymáshoz adagolva, illetve összekeverve készítjük el a kompozíciót.
117. példa
Krém
Krémet készítünk az alábbi összetétellel:
N-[2-hidroxi-3-(piperidinil)-propoxi]4-piridin-karboximidoil-klorid-(Z)buténdioát (1:1) 10,Og fehér vazelin 90,0 g fehér viasz 3,0 g cetil-sztearil-alkohol 3,0 g nátrium-tetraborát 4,0 g metil-p-hidroxi-benzoát 0,2 g desztillált víz 90 ml
A lipofil komponensek felmelegített elegyéhez a 115. példa szerinti módon hozzáadjuk a vízoldható komponensek oldatát, végül a hatóanyag vizes oldatát hozzáadjuk a kész emulzióhoz.
Biológiai példák
6. Az N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleát hatása a HSP celluláris expressziójára (a transzláció szintjén vizsgálva)
6.1. Háttér
Az ebben a fejezetben bemutatott kísérleteket azért végeztük, hogy meghatározzuk, vajon az N-[2-hidroxi-3(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleát növeli-e a molekuláris chaperon celluláris expresszióját. Vizsgáltuk a különböző hősokkfehérjék felhalmozódását azt a periódust követően, amikor a sejteket egyedül csak hősokknak tettük ki, és amikor a hősokkot kombináltuk az N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]3-piridin-karboximidoil-klorid-maleát beadásával. Ez utóbbi esetben 10~5 M N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleátot adtunk be a szív miogén sejtjeinek (H9c2 sejtek) hipertermiás kezelése előtt, alatt vagy közvetlenül utána.
6.2. Anyagok és módszerek
6.2. (a) A sejttenyésztés körülményei
Az embrionális patkányszív-eredetű H9c2 sejtvonalat az Állati Sejttenyészetek Európai Gyűjteményéből (ECACC) szereztük be (88092904). A sejteket 37 °Con, JOUAN C02 termosztátban (5% CO2), Dulbecco által módosított Eagle-féle táptalajon (DMEM) tartottuk fent, melyet 10% magzati botjúszérummal (GIBCO) egészítettünk ki.
6.2. (b) Az N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxiJ3-piridin-karboximidoil-klorid-maleátos kezelés és a hősokk körülményei
A hősokkot 43 °C-on CO2-termosztátban egy adott időintervallumig (20, 40, 60, 90 és 120 perc) tartjuk fenn. Ezután a sejteket 6 órán keresztül ismét 37 °C-ra helyezzük vissza, és a fehéijéket SDS-PAGE-hez extraháljuk. Amikor N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleátot adunk a hősokk előtt, 10~5 M N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleátot adunk be 16 órával a hősokk előtt. Egy másik kísérletsorozatban N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleátot adunk 10~5 M koncentrációban a hőstressz után, a 6 órás regenerálódási periódus alatt. A kísérleteket háromszor megismételjük.
6.2. (c) Westem-blot-analízis
SDS-PAGE vizsgálathoz a sejteket 6 cm átmérőjű Petri-csészékben növesztjük. A kísérlet kezdetén a sejtek mennyisége 8 χ 105 és egészen összefolynak, amikor a fehéijéket extraháljuk. A hat óra után kapott sejteket kétszer PBS-ben mossuk, majd az edény felületéről PBS-be lekapaquk. Ezután a sejteket 5 percig 1500 ford./perc sebességgel forgatjuk, és 100 μΐ módosított szolubilizáló pufferben felvesszük [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Ed. Sambrook, Fritsche, Maniatis, Bőid Spring Harbor Laboratory Press (1989)], amely 50 mM TrisHCl-ot, pH=8,0; 5 mM EDTA-t, 150 mM NaCl-ot, 15 Tritox Ν-100-at, 1 PMSF-et, 2 pg/ml aprotinint, 1 pg/ml kimosztatint, 1 pg/ml pepsztatint tartalmaz; majd 3x20 másodpercig ultrahanggal kezeljük (2 perces intervallumok, elrendezés 8).
A fehérjekoncentrációt 5 μΐ-es mintákban Bradfordféle módszerrel [Μ- M. Bradford, Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976)] 3 párhuzamos kísérletben határozzuk meg. A mintákat a fenti pufferrel 100 pg/30 μΐ-re beállítjuk és a következő pufferrel úgy, hogy a puffer koncentrációja a mintában 110 mM Tris-HCl pH=6,8, 8,3 mM merkapto-etanol, 3% SDS, 3% glicerin és bróm-fenolkék legyen, és 30 percig szobahőmérsékleten rázatjuk.
Az elektroforézist kivitelezhetjük Laemmli szerint [U. K. Laemmli: Natúré 227, 680-685 (1970)] 8-18%-os poliakrilamidgélen 50 V konstans feszültség mellett egy éjszakán át. A fehéijéket vagy megfestjük Coomassie Brilliant Blue R-250-nel, vagy átvisszük Immobilone PVDF-membránra (Millipore) konstans áramerősségnél (300 mA) 3 órára 4 °C-on transzfer pufferben (10 mM CAPS, pH=ll, 10% metanol) (Protein Blotting Protocols fór the Immobilon-P Transfer Membráné, 3. Laboratory Manual, Millipore). Átvitel után a membrán nem specifikus helyeit 2% BSA-val TPBS-ben (foszfáttal puffereit sóoldat 0,1% Tween 20-szal) blokkoljuk 4 °C-on egy éjszakán keresztül. Ezután a foltot egy molekuláris chaperon elleni antitesttel, például GRP94 monoklonális antitesttel (SPA-850, StressGen) 1:3000 hígításban, HSP60 monoklonális antitesttel (SPA-600, StressGen) 1:2700 hígításban, HSP72 monoklonális antitesttel (C92F34-5, StressGen) 1:1250 hígításban vagy HSP90 monoklonális antitesttel (AC88, StressGen) 1:2000 hígításban, inkubáljuk 1 órán át szobahőmérsékleten. Ezután mossuk a foltot egy órán keresztül TPBS-puferrel, és egy második, torma-peroxidázzal konjugált antipatkány- (Sigma, 1:4000 hígítás, grp-94-hez) vagy antiegér- (Sigma, humán és patkányszérum-proteinekhez adszorbeálva, 1:3000 hígítás, Hsp60-hoz, HSP72-höz vagy HSP90hez) antitesttel inkubáljuk egy órán át. Ezt követően a
HU 222 994 Bl membránt alaposan átmossuk TPBS-sel és ECLrendszerben kifejlesztjük (Amersham).
A mintákkal párhuzamosan minden esetben egy teljesfehéqe-hígítási sorozatból foltot képzünk és kifejlesztjük, és egy kalibrációs görbét is kalkulálunk. A stresszfehéqe-tartalomban bekövetkezett változásokat Bio-Rad denzitométer segítségével (Model 1650) és egy Hewlett-Packard Integrátor (HP 3394A) segítségével mérjük, és a kalibrációs görbéhez viszonyítva korrigáljuk. Amikor a kalkulációkat végezzük, az adott fehérjesáv 37 °C-on, N-[2-hidroxi-3-(l -piperidinil)-propoxi]3-piridin-karboximidoil-klorid-maleát-kezelés nélkül kapott denzitometriás adatát vesszük 100%-nak, és az összes többi intenzitást ehhez a mintához hasonlítjuk.
6.2. (d) Statisztikai analízis
A közölt adatok középértékek±SE. A statisztikai összehasonlítást és kalkulációt a különbség one-wayanalízisével Posthoc Newman-Keuls-teszttel (Pharmacological Calculation System) végeztük. A statisztikai szignifikanciát P<0,05-nak határoztuk meg.
6.3. Eredmények
Hsp60: A 37 °C-on végrehajtott N-[2-hidroxi-3-(lpiperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleát-kezelésnek ezen hsp szintjére nincs mérhető hatása. A 20 percig tartó, 43 °C-os hősokk önmagában képes megemelni a hsp60 mennyiségét majdnem kétszeresére. A hőkezelés idejét kiterjesztve további emelkedést ezen fehérje szintjében nem lehetett megfigyelni. Amikor N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleátot adtunk 10~5 M koncentrációban a hőstressz előtt 16 órával, a hsp60 mennyisége megnövekedett körülbelül az ötszörösére (a 37 °Cos szinthez viszonyítva) még akkor is, ha a mintákat 20 percen át hőkezelésnek tettük ki. Az N-[2-hidroxi-3(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleátnak ez a hatása a hsp60 szintjére nyilvánvaló a mintákban a 40 és 60 percig tartó hőkezeléskor is, azonban ezután kezd csökkenni. Az N-[2-hidroxi-3-(lpiperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleát, ha a regenerálódási fázisban adtuk, szintén hatásos volt, de lényegesen kisebb mértékben, mint amikor ezt a vegyületet a stressz előtt adtuk.
Hsp72: A nyugalmi állapotban mért hsp72 mennyisége a H9c2 sejtekben lényegesen alacsonyabb, azonban a különböző kezelések hatása a hsp72 szintjére drámai volt. Szignifikáns növekedés lépett fel már 20 perces hősokknál, és 40 perces hőkezelésnél a hsp72 mennyisége majdnem 10-szer nagyobb volt, mint amit a kontrolisejtekben detektáltunk. Egy hosszabb ideig tartó hőkezelés nem okozott lényeges változást a 40 perces mintákhoz viszonyítva. Az N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleát beadása a hőstressz előtt nagyon erőteljes hatást eredményezett. A 60 perces hőstressznél a hsp72-szint körülbelül 50szeresére megemelkedett a 37 °C-os mintákhoz viszonyítva, de egy lényeges emelkedést lehetett detektálni már a 40 percig tartó hőstressznél is. A hsp72-nek ez az erőteljesen megnövekedett mennyisége stabil volt a 120 percig hősokkolt sejtekben is. Az N-[2-hidroxi-3-(lpiperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleát, a regenerálódási periódus alatt beadva, szintén hatásos volt, de kisebb mértékben.
Hsp90: A 20 perces hőkezelésnél a magas hőmérséklet önmagában képtelen egy megemelkedett Hsp90szintet indukálni, azonban, ha N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleátot adtunk a hőstressz előtt, a Hsp90-szint körülbelül az ötszörösére megnövekedett. A preinkubációs szer legnagyobb hatását akkor lehetett megfigyelni, amikor azt a 60 perces hőkezeléssel kombináltuk. Érdemes megjegyezni, hogy a Hsp90 esetében az N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleát adása a 43 °C-os 60 perces hőkezelést követően éppoly hatásos volt (de nem jobban), mint amikor azt a magashőmérséklet-stressz előtt adtuk be. Kézenfekvő, hogy a 90 percnél hosszabb ideig tartó magas hőmérsékletű inkubálásnál az N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleát hatása gyengül.
Grp94: A Grp94 stresszfehérje képződése egy 20 perces hősokkot követően indukálódott. Ez a hatás a 60 perces hőkezelésnél csúcsosodott ki, míg egy éles csökkenést lehetett már detektálni a 90 perces minták esetében. Az N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]3-piridin-karboximidoil-klorid-maleát azon képessége, hogy a grp94 szintjét indukálja, abban az esetben volt a legkifejezettebb, amikor a vegyületet a stressz előtt adtuk be, de szignifikáns emelkedést lehetett látni akkor is, ha a szer előzetes beadását egy 20 perces hősokkal kombináltuk (ahol négyszeres növekedést lehetett tapasztalni a 43 °C-os kezeléshez viszonyítva). Másrészről, ha a vegyület beadása a 40 vagy 60 percig tartó hősokk utáni regenerálódási periódus alatt történt, majdnem ugyanolyan hatásosnak bizonyult, mint amikor az N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleátot 16 órával a stressz előtt adtuk be.
A 2. ábra a H9c2 sejtekből származó fehérjék Westem-blot-analízisét mutatja be, amely a 6. részben leírt kísérletből kapott eredményeket reprezentálja {a 6. rész címe: N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleát hatása a Hsp celluláris expressziójára}. A kísérlet során a következő próbákat alkalmaztuk: hsp60 antitest, (l)-ben látható; hsp72 antitest, (2)-ben látható; hsp90 antitest, (3)-ban látható és gip94 antitest, (4)-ben látható. A (-) jelű sáv jelenti azokat a sejteket melyeket N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleát távollétében kaptunk 37 °C-on; és a (+) jelű sáv azokat a sejteket jelenti, melyeket a vegyület jelenlétében kaptunk (10-5 M koncentráció 16 órán át). A 43 °C-os hősokkot az ábrán megadott időtartamig tartottuk fent. AzN-[2-hidroxi-3-(l-piperidiml)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleátot ΙΟ-5 M koncentrációban adtuk 16 órán át a hőkezelés előtt (B jelű sáv) vagy a regenerálódási periódus alatt (A jelű sáv).
A különböző kezeléseknek a H9c2 szívsejtekben a különféle hsp-k mennyiségére gyakorolt hatásáról adunk áttekintést az 1. ábrán. A hőstressznek (43 °C) kitett sejtekben lévő stresszfehéqék mennyiségét mutat37
HU 222 994 Bl juk be az A ábrán; a hőkezelés előtt 10~5 M N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleáttal kezelt sejtekben lévő stresszfehérjék mennyiségét a B ábrán; és a hatórás regenerálódási periódus alatt 10~5 M N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleáttal kezelt sejtekben lévő stresszfehérjék mennyiségét a C ábrán. A vízszintes tengelyen a hőkezelés időtartamát, a függőleges tengelyen pedig a stresszfehérjék relatív mennyiségét ábrázoltuk.
A különböző kezeléseknek a H9c2 szívsejtekben a különféle hsp-k mennyiségére gyakorolt hatásáról adunk áttekintést az 1. ábrán. A hőkezelés önmagában indukálta a HSP-k összes fajtáját, melyeket ebben a kísérletben vizsgáltunk. A növekedés kevésbé volt kifejezett hspóO esetében. A hspóO szintje körülbelül kétszeresére megemelkedett azután, hogy a sejteket 20 percre hősokknak tettük ki, míg hosszabb hőkezelés során további növekedést nem tudtunk detektálni. A hőstressz legnagyobb hatással a hsp72-re volt, mivel annak mennyiségét körülbelül 12szeresére növelte. Amikor N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleátot adtunk 16 órával a hőkezelés előtt, az összes HSP szintje megemelkedett legalább kétszeresére a hőstressz alatt megfigyelt szinthez viszonyítva. Az is nyilvánvaló volt, hogy a hsp72 szintje sokkal nagyobb mértékben növekedett a HSP-k között, amikor a hőstresszt és az N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoilklorid-maleátot kombináltuk, ahhoz a szinthez viszonyítva, melyet a hőstressz önmagában indukált. Amikor az N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleátot a regenerálódási fázis alatt adtuk, majdnem minden esetben megfigyelhető volt a hsp/k/-tartalom növekedése, de ismét a hsp72 megemelkedése volt a legkifejezettebb.
6.4. Értékelés
A Westem-blot-analízis a különböző osztályokba tartozó HSP-k figyelemre méltó felhalmozódását mutatta ki a szívsejtekben, miután azokat hősokknak tettük ki. Az N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridinkarboximidoil-klorid-maleát adása akár a stressz (magas hőmérséklet) előtt vagy után, megsokszorozta a hőkezelés hatását a HSP-k termelésére. Ennek megfelelően az N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleát szinergista módon hat a hőstresszel együtt a molekuláris chaperonok összes osztályának képződését indukálva.
7. Az N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleát hatása a HSP celluláris expressziójára (a transzkripció szintjén vizsgálva)
7.1. Háttér
Egy rövid ideig tartó ischaemiával (például ismételt leszorítással) előkondicionálhatjuk a szívet, és megvédhetjük az ezt követő letális ischaemiától, ami megnyilvánul a kamrai fibrilláció ritkuló előfordulásában, az infarktus számának csökkenésében és a regionális miokardiális funkció jobb helyreállásában az ischaemiás szív reperfúziója által. Megfigyeltük, hogy az ilyen prekondicionálás a HSP-k expresszióját indukálja, különösen a hsp72-ét. Ebben a fejezetben az N-[2-hidroxi-3(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleát hatását vizsgáljuk a hsp72 expressziójára az mRNS sejtben történő felszaporodásának vizsgálatával az ischaemiát követően, és összehasonlítjuk azzal az állapottal, amikor az ischaemiát kombináljuk az N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleát beadásával.
7.2. Anyagok és módszerek
7.2. (a) Hőstressz indukálása
A kísérleteket SPRD hím patkányokon végezzük. Az állatokat Nembutallal 60 mg/kg/ip. dózisban elaltatjuk. A patkányok testhőmérsékletét egy, a hasi oldal fölött elhelyezett infralámpával tartjuk fenn, és a rektális hőmérsékletet méljük. 20-40 perc múlva a patkányok hőmérséklete 42,0-42,2 °C-ra emelkedik, és ezt a hőmérsékletet 15 percig fenntartjuk. A rehabilitációs periódus után (2 óra) szövetmintákat gyűjtünk a bal oldali és jobb oldali kamrákból.
7.2. (b) Cardialis ischaemia indukálása
A kísérleteket SPRD hím patkányokon végezzük. Az állatokat 60 mg/kg/ip. dózisban adott Nembutallal elaltatjuk. A mellkas és a szívburok felnyitása után a LAD szívkoszorú-artériát 5 percre leszorítjuk, majd a reperfuziós periódusban (10 perc) vizsgáljuk a ventrikuláris tachikardia és fibrilláció előfordulását és időtartamát. Szövetmintákat veszünk a bal és jobb oldali kamrákból.
7.3. (c) Northem-blot-analízis
A totál RNS-t extraháljuk RNS-kitek segítségével (Promega) a gyártó utasításai szerint (Protokols and Applications Guide, 2nd edition, 1991, Promega Corporation). Röviden, a fagyasztott szövetmintákat (a szövetmintákat a hőstressznek vagy a cardialis ischaemiának kitett patkányok bal és jobb oldali kamrájából nyertük. Az 50-100 mg tömegű szövetmintákat 1,0 ml +4 °C hőmérsékletű denaturálóoldatban homogenizáljuk, Brinkman-homogenizálással. Majd 1/10 térfogatnyi 3 M nátrium-acetát-oldatot (pH=4,0) adunk hozzá, és a homogenizátumot savas fenollal (fenol: kloroform: izoamil-alkohol=25:24:1) extraháljuk 10 másodpercig vortex segítségével. A mintát 15 percig jégen inkubáljuk, majd lecentrifugáljuk (4 °C, 20 perc 10 000xg). A vizes fázist átvisszük egy új Eppendorf-csőbe, és az eljárást megismételjük, majd a vizes fázist azonos térfogatú izopropanollal egy éjszakán át -20 °C-on kicsapjuk. Centrifugálást (4 °C, 20 perc, 10 000 x g) követően a kapott csapadékot kétszer mossuk 95%-os etanollal és szobahőmérsékleten szárítjuk. Az RNS-t 20 μΐ DEPC-vel kezelt vízben szuszpendáljuk. A teljes RNS 8 pg-ját formaldehidagaróz-gélen futtatjuk kapilláristranszferrel, a gélen lévő RNS-t nejlonmembránra blöfföljük a gyártó utasításai szerint (Zeta-Probe GT, BioRad).
A hsp72 mRNS-tartalmat az egyes mintákban az illető mintában lévő glicerin-aldehid-3-foszfát dehidrogenáz (GAPDH) gén mRNS-szintjéhez hasonlítjuk. A DNSpróbákat (a teljes hosszúságú humán hsp70 cDNS és a patkány GAPDH cDNS Apa-Ncol fragmense) alfa-32? CTP-vel jelezzük Random Prímed DNS Jelző Kit segítségével (USB). A radiojelzett DNS-fragmenseket Sepha38
HU 222 994 Bl dex G-50 oszlopon (Pharmacia) tisztítjuk Ausubel és munkatársai által leírtak szerint [Current Protocols in Molecular Biology: JOHN WILEY & SONS (1987)].
A prehibridizációt 65 °C-on H-puffeiben (0,25 M Na2HPO4, pH=7,2, 7% SDS) 15 percig, a hibridizációt egy éjszakán át (65 °C, H-puffer) legalább 106 cpm/ml koncentrációjú izotóppal jelzett cDNS-próbával hajtjuk végre. A membránt ezután 20 mM Na2HPO4-tal (pH=7,2) és 5%-os SDS-sel mossuk (65 °C, 2x 15 perc) és autoradiográfiásan értékeljük. Ugyanezt a membránt használjuk fel mind a hsp70 mRNS-próbához, mind a belső standardként használt GAPDH- és mRNS-méréshez.
7.4. Eredmények
A koronáira 5 percig tartó elzáródását reperfúzió követte, amely ventrikuláris tachikardiát és fibrillációt okozott a patkányokban. Az N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleáttal történő előkezelés (0,5, 0,75, 1,0 mg/testtömeg-kg iv. dózisban 5 perccel az elzáródás előtt) szignifikánsan csökkentette a ventrikuláris tachikardia átlagos időtartamát, és megemelte a túlélési arányt, megelőzve a ventrikuláris fibrillációt.
Míg a kontrollcsoportból az összes állat (n=6) elpusztult a reperfuzió fázisában, az N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleáttal kezelt (100 mg/kg po.) állatok közül csak egy nem élte túl az 5 perces elzáródást követő reperfúziót, de a hsp72 gén lényegesen megemelkedett expresszióját detektáltuk a szívizom preparátumaiban.
A 3. ábra a patkányszív bal kamrájából izolált teljes RNS Northem-blot-analízisét mutatja, a 7. részben leírt kísérletből kapott eredmények illusztrálására {a 7. rész címe: N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleát hatása a Hsp celluláris expressziójára (a transzkripció szintjén vizsgálva)}. Kontroll (1. sáv); hőkezelt (2. sáv); látszólag operált (3. sáv); ischaemia (4. sáv); N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleát plusz ischaemia (5. sáv); és N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleát (6. sáv). A GAPDH-t belső próbaként mértük. A hősokk azt jelentette, hogy a rektális hőmérsékletet 15 percen át 42 °C-on tartottuk.
Megjegyezzük, hogy stressz hiányában az N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleát beadása önmagában képtelen aktiválni a hsp72 gént.
8. A találmány szerinti hidroxil-amin-származékok védőhatása a cardialis ischaemiával szemben
Hím Sprague-Dawley-patkányokat (380-450 g testtömegű) elaltatunk nátrium-pentobarbitállal (Nembutal 60 mg/testtömeg-kg, ip.) és mesterségesen lélegeztetünk szobalevegővel (2 ml/100 g; 54 érverés/perc) légcsőmetszés (tracheotomia) útján. A jobb oldali nyaki verőérbe katétert vezetünk, és a szisztémás artériás vérnyomás mérése céljából hozzákapcsoljuk egy előerősítő (preamplifier; Hg-02, Experimetria) segítségével egy vérnyomásmérőhöz (BPR-01, Stoelting). Az 5. példa szerinti hidroxil-amin-származékot adjuk be a nyaki vénába (iv.) egy vénás kanülön keresztül és orálisan (po.). A szívfrekvenciát (HR) egy kardiotachométer (HR-01, Experimetria) segítségével méljük; és az elektrodiagramot (EKG II standard elvezetés) szubkután acéltűelektródok segítségével egy EKG-készüléken (MR-12, Medicor) vesszük fel. A mellkast a bal oldalon felnyitjuk, és a szívet a bordaporc jobb oldalán gyenge nyomással kiemeljük. Egy 4-0 ezüstkapcsot lehet ekkor gyorsan behelyezni a fő bal oldali szívkoszorúér alá, amint azt Selye és munkatársai leírták (1960). A szívet óvatosan visszahelyezzük a mellkasba, és az állatot hagyjuk magához térni. A hőmérsékletet a végbélben méljük és konstansan 37 °C-on tartjuk. A kísérleti protokollt egy 15 perces stabilizációs periódussal kezdjük. Ha a fenntartott vérnyomás 70 Hgmm alá esik, vagy aritmiák előfordulását figyelhetjük meg ezen periódus alatt, az állatot kivonjuk a további kísérletből. A stabilizációs periódus után myocardialis ischaemiát indukálunk a koronáira 5 percig tartó leszorításával, és reperfúziót végzünk 10 percen keresztül.
Az egész kísérlet alatt a BP-t, HR-et és EKG-t folyamatosan regisztráljuk egy multiscriptoron (R61-6CH, Medicor). A hidroxil-amin-származékokat, amelyek tautomer formáit az (I) és (II) általános képletek reprezentálják, 5-60 percen át adtuk a leszorítás előtt iv. vagy po. kezeléssel. Az 5. példa szerinti hidroxil-amin-származék dózisai 0,5; 0,75; 1,0 mg/kg iv. és 100 mg/kg (testtömeg) voltak, míg a Bepridil referenciavegyületet 1,0 mg/kg iv. dózisban adtuk.
A ventrikuláris (kamrai) tachikardia (VT) és/vagy a ventrikuláris fibrilláció (VF) átlagidőtartamát is méljük a reperfuzió első 3 percében és analizáljuk a különbség „one-way”-analízisével. A VF előfordulását a „chisquare”-teszt felhasználásával analizáljuk. A hemodinamikus különbségeket a „chi-square”-teszt alkalmazásával analizáljuk. A hemodinamikus különbségeket a Student-féle „t”-teszt felhasználásával analizáljuk. A szignifikancia kritikus szintje p<0,05. A kapott eredményeket az átlag±S. Ε. M. értékben fejezzük ki. A hatóanyagokat iv. 1 mg/testtömeg-kg dózisban adjuk 5 perccel az elzáródás előtt.
Azokat a hidroxil-amin-származékokat, amelyeket különösen előnyösnek találtunk egy állat ischaemiával/reperfúzióval szembeni védelmére, az alábbi táblázatban foglaltuk össze. A túlélés (%) azt mutatja, hogy az állatok hány százaléka élte túl az 5 perces koronáriaelzáródás hatásait.
1. táblázat
A példa száma Dózis Túlélés (%)
77. 1 mg/kg, iv. 67
78. »» 100
8. 100
13. Ϊ» 60
9. 100
10. 67
HU 222 994 Bl
1. táblázat (folytatás)
A példa száma Dózis Túlélés (%)
5. 1 mg/kg, iv. 80
6- »» 100
79. »» 100
1. >» 100
16. >» 67
65. »> 78
54. 80
20. »» 100
22. »» 100
47. ♦» 100
39. »♦ 60
51. »» 75
64. 100
56. » 67
57. 67
58. »» 100
| 59. 86
60. »» 60
61. 5» 83
55. 80
66. »* 57
62. »» 57
63. » 50
1 4· »» 50
Kontroll (nem kezelt) n=24 10
A fenti vegyületeken túlmenően a következő származékokra is előnyös eredményeket kaptunk: N-[2-hidroxi-3-(pirrolidin-l-il)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-(Z)-2-buténdioát (1:1) (US-PS 5,328,906,12. példa, 1 mg/kg iv., túlélés: 67%); N-[2-hidroxi-3-(dietil-amino)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-hidroklorid (1:1) (US-PS 5,328,906,
11. példa, 1 mg/kg iv., túlélés: 62%); N-[2-hidroxi-3-(prop-2-il-amino)-propoxi]-3-piridinkarboximidoil-klorid-(Z)-buténdioát (1:1) (US-PS 5,328,906,13/4. példa, 1 mg/kg iv., túlélés : 60%); N-[2-hidroxi-3-(morfolin-l-il)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-(Z)-2-buténdioát (1:1) (US-PS 5,328,906,12. példa, 1 mg/kg iv., túlélés: 71%); N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-a-(3,4-dimetoxi-fenil)-acetimidoil-klorid (US-PS 5,328,906, 14. példa, 1 mg/kg iv., túlélés: 67%); N-[2-hidroxi-3-(terc-butil-amino)-propoxi]-3-piridinkarboximidoil-klorid-(Z)-2-buténdioát (1:1) (US-PS 5,328,906,13/5. példa, 1 mg/kg iv., túlélés: 57%);
O-(3-piperidino-2-hidroxi-l-propil)-benzhidroximsavklorid-hidroklorid (US-PS 5,147,879,1. példa, 1 mg/kg iv., túlélés: 100%);
N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-(Z)-2-buténdioát (1:1) (US-PS 2. példa, 1 mg/kg iv., túlélés: 100%, 20 mg/kg po., túlélés: 100%).
9. Az N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleát hatása a sejtmembrán megjavításában és a membránfluiditás megőrzésében
9.1. A szérumelvonással okozott stressz által előidézett celluláris sérüléssel kapcsolatos változások a sejtmembrán fluiditásában és az N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleát hatása a fluiditásban bekövetkezett változások visszafordítására
9.1. (a) Háttér
Egyik megközelítésben, mely a metabolikus károsodást kísérő diabétesz stressze által okozott patológiás események modellezésére szolgál, csökkentjük az inzulin szintjét a tenyésztő tápközegben. Mivel az inzulint a kiegészítő szérumban adjuk, úgy tűnik, hogy a parciális vagy teljes elvonás egy optimális eszköz a sejt különböző szabályozó szintjeiben beálló változások detektálására.
A szérumelvonás elteqedten használt módszer a sejtfejlődés gátlására a Gl/S fázisban, azaz a sejtciklus szinkronizálásában [Ashihara T.: Methods of Enzymology 58, 248-249 (1979)]. Azt figyelték meg, hogy a tenyésztett sejtek szérumkiegészítés hiányában hanyatlásos folyamatokon mennek át [Cohen és munkatársai: Adv. In Immunology 50, 50-58 (1991)], és a staurosporin- vagy topoizomerázinhibitorokat alternatív sokként tanulmányozták Balb/3T3 sejteken [Kulkami G. V. és munkatársai: J. Cell. Sci. 107, 1169-1179 (1994)], vagy a hősokkot és glutaminelvonást Ehrilichsejteken [Rowlands A. G. és munkatársai: Eur. J. Biochem. 175, 93-99 (1988)], hogy megvizsgálják az eukarióta iniciációs faktor (eIF2alfa) foszforilálása által gátolt fehéqeszintézist. Ezen túlmenően azt is bizonyították, hogy a szérumhiányos sejtekben az extemális HSP72 adása citoprotektív hatást idéz elő [Johnson A. D. és munkatársai: In Vitro Cell Dev. Bioi. Anim. 29A, 807-812 (1993)]. Kimutatták azt is, hogy a szérumelvonás által a HSP82 és HSP72 relatív szintézisében növekedés következik be [Toye P. és munkatársai: Mól. Biochem. Párásítói. 35,11-10 (1989)].
A szívizom vagy más szervek ischaemiás és hipoxiás sérülését a progresszív membrándiszfunkció és -károsodás közvetíti. Azt is kimutatták, hogy a membránfluiditásban végbement átalakulás a szívizomsejtek folyamatos metabolikus károsodásában jelenik meg [Buja L. M. és munkatársai: In vivő 5, 233-238 (1991)]. A membránfluiditás elsődlegesen a membránt felépítő lipidek mozgásának orientációját és nagyságát tükrözi, és ezen a szinten végbement bármely változás erősen befolyásolja az alapvető membránfunkciót [Qiunn P. J. és munkatársai: Prog. Biophzs. Molec. Bioi. 53, 70-103 (1989);
HU 222 994 Bl
Schlame M. és munkatársai: Biochim. Biophys. Acta 1054,1-8 (1990)].
Ebben a kísérletben a vizsgálatokat abból a célból végeztük, hogy meghatározzuk, vajon a plazmamembránfluiditásban bekövetkezett változások részt vesznek-e a celluláris sérülés kifejlődésében, melyet a szérumelvonás okozott, és vajon a szérumelvonás által előidézett fluiditásváltozást vissza lehet-e fordítani az N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoilklorid-maleát adásával.
9.1. (b) Anyagok és módszerek
A kísérleteket WEH1 egérfibroszarkóma és H9c2 patkány-szívizomsejtvonalakon végeztük, melyeket három csoportba osztottunk:
kontroll (10% FCS magzati botjúszérum) szérumhiányos
N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridinkarboximidoil-klorid-maleáttal (10~5 M) kezelt és szérumhiányos
9.1. (b) (1) Szérumelvonás és MTT-teszt
A különböző sejtvonalakat, hatóanyag-koncentrációkat, az előkezelés és az elvonás idejét screeneltük, és úgy találtuk, hogy a legmegfelelőbb körülmények a következők: 5xl0-4/ml H9c2 patkányszívizomsejtet (n=6) és WEH1 egér-fibroszarkómasejtet (n=7) behelyezünk egy 24 üreges tenyésztőlemez mélyedéseibe, 10% FCS-t tartalmazó DMEM-tápközegben (Dulbecco által módosított Eagle-féle tápközeg), és 2 órán keresztül 37 °C-on, 5% CO2-tartalom mellett inkubáljuk. A tápközeget elöntjük és helyettesítjük 10% FCS DMEM-tápközeggel, amely 10~5 M N-[2-hidroxi-3(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleátot tartalmaz. A fenti körülmények között végzett további 6 órás inkubálás után a lemezeket intenzíven mossuk PBS-sel és szérumdepriváljuk. Az előkezelt sejteket a kísérlet végéig N-[2-hidroxi-3-(lpiperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleáttal kezeljük. 18 órás éhezést követően a sejtek legnagyobb része elkülönült, azaz elpusztult, mikroszkopikusan megfigyelve, a szérumhiányos tenyészetben, míg az N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridm-karboximidoil-klorid-maleáttal előkezelt tenyészetek hasonló képet mutattak a kontrolltenyészetekkel. A sejt életképességét MTT-teszttel mérjük, amely Plumb és munkatársai módszerén alapszik [Cancer Rés. 49, 4435-4444 (1989)]. A tetrazóliumsó-módszer magában foglalja az MTT (3-/4,5-dimetiltiazol-2-il/-2,5-difenil-tetrazólium-bromid) átalakítását az élő sejtek által színes formazánná, mely a sejt életképességének közvetett mérésére szolgál. Az MTT-t közvetlenül a tápközeghez adjuk 1 mg/ml koncentrációban. Kétórai inkubálás után (37 °C-on, sötétben) a felülúszót eltávolítjuk, és 200 μΐ 0,05 M sósavas izopropanolt adunk közvetlenül a sejtekhez. A lemezek OD-jét leolvassuk 570 nm-en egy ELISA lemezleolvasón (Labsystems Multiskan Biochromatic, típus: 348). A kísérleteket minden egyes esetben legalább háromszor megismételjük. A relatív sejtéletképességet a kontrollcsoporthoz viszonyítva kalkuláljuk, melyet 100%-nak veszünk.
9.1. (b) (2) Λζ egyensúlyi fluoreszcenciaanizotrópia meghatározása
DPH-PA {3-[p-(6-fenil)-l ,3,5-hexatrienil]-fenil-propionsav} hozzáadásával jelzett sejtszuszpenziót (1 χ 105 sejt/ml PBS-ben) feloldunk tetrahidrofuránban 0,1 μΜ végkoncentrációban, és 10 percen keresztül 37 °C-on inkubáljuk. A szerves oldószer mennyisége 0,05% voft, hogy elkerüljük a hatását a sejtmembránokon. A DPHPA membránpróbát választottuk ki a próba azon tulajdonságainak köszönhetően, amelyek képessé teszik a DPH-PA-t arra, hogy túlnyomóan a plazmamembrán külső rétegén belül helyezkedjen el, a difenil-hexatriéngyökkel beékelődve a zsírsavláncok felső részei közé [Kitagawa S. és munkatársai: J. Membráné Bioi. 119, 221-227 (1991)]. A DPH-PA erős fluoreszcencianövekedéssel rendelkezik a lipidekhez kötődve, így a kiértékelhető fluoreszcenciaanizotrópia eszközeként szolgál, mint a lipidelrendeződés egyik funkciója. A fluoreszcenciaméréseket 37 °C-on egy Quanta Master QM-1 T típusú lumineszcenciaspektrométer segítségével végeztük (Photon Technology Int. Inc., NJ, USA), amely polarizátorokkal van felszerelve a gerjesztésben és a két elnyelésifény-sávban. A gerjesztés és az emisszió hullámhosszai 360 nm (5 nm résszélesség) és 430 nm (5 nm résszélesség) voltak. A mért fluoreszcenciaintenzitásokat a háttér-fluoreszcenciával és a jelzetlen mintákból kapott fényvisszaverődéssel korrigáltuk. A fluoreszcenciaanizotrópiát az alábbi képlettel számoltuk:
rs=(lW-G.IVH)/(IVV+(2 χ G χ IVH)), ahol IW és IVH a párhuzamos, illetőleg merőleges polarizátorokkal mért intenzitások a vertikálisan polarizált gerjesztő sugárnyalábhoz viszonyítva. A G faktor azonos az IVH/IHH-val, és korrigálja a műszer azon tehetetlenségét, hogy a differenciáltan polarizált fényt azonosan továbbítsa, továbbá a különbségeket a két emissziós csatorna érzékenységében [Kitagawa S. és munkatársai: J. Membráné Bioi. 119, 221-227 (1991)]. Az IHV és IHH azon fluoreszcenciaintenzitások, melyeket az emissziós polarizátor függőleges és vízszintes pozícióinál határozunk meg, amikor a gerjesztési polarizátor vízszintesen helyezkedik el.
9.1. (b) (3) Statisztikai analízis A megadott adatok középértékek±SEM. A statisztikai összehasonlítást és számítást a különbség „oneway”-analízisével Posthoc Newman-Keuls-teszttel végeztük (Pharmacological Calculation System). A statisztikai szignifikanciát p<0,05-nak határoztuk meg.
9.1. (c) Eredmények
9.1. (c) (1) A szérumelvonás mint az N-[2-hidroxi3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleát citoprotektiv hatásának tesztelésére szolgáló modell
A szérumhiányos WEHI- és H9c2 sejtek 74,8%, illetve 50,5% relatív sejtéletképességet mutattak. Abban az esetben, ha 10~5 M N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleátot adtunk a tápközeghez, ez a WEHI-sejtek esetében majdnem teljes túlélést (93%) és a H9c2 szívizomsejtek esetében nagyarányú védelmet (82,75%) biztosított. A relatív sejtéletképesség csökkenése a szérumelvonás által
HU 222 994 Bl és az N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridinkarboximidoil-klorid-maleát citoprotektív hatása mindkét sejtvonal esetén szignifikáns.
9.1. (c) (2) Az N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleát hatása a szérumhiányos emlőssejtek fluiditására
Abból a célból, hogy megvizsgáljuk a szérumelvonás hatását a tenyésztett emlőssejtek plazmamembrán-fluiditására, DPH-PA plazmamembránpróba segítségével fluoreszcenciaanizotrópia-méréseket végeztünk. A sejtplazmamembránok fizikai tulajdonságai lényegesen megváltoztak a szérumelvonás következtében. A szérumelvonás egy kifejezett csökkenést okozott a DPH-PA fluoreszcenciaanizotrópiájában, azaz egy abnormális növekedést a plazmamembrán fluiditásában mindkét vizsgált sejtmodell esetében. Az N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]3-piridin-karboximidoil-klorid-maleát adása során a membrán fizikai állapotának majdnem teljes megőrzését figyeltük meg. Ezek a változások nyilvánvalóan megegyeztek a sejtéletképességre leírt tendenciákkal.
9. l.(d) Értékelés
A metabolikus károsodás következtében, a normál tenyésztőközeg depriválása mindkét tanulmányozott sejttípus esetében csökkentette a sejtek életképességét, amit MTT-módszerrel teszteltünk. Az N-[2-hidroxi-3(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleát adása alatt ez a hatás majdnem teljesen visszafordult. A szérum hiánya tehát prominens változásokat idéz elő a plazmamembránok fluiditásában, amelyről ismert, hogy hozzájárul a miokardiális sérüléssel kísért membrándiszfunkcióhoz. Ezzel ellentétben, azok a szérumhiányos sejtek, amelyek N-[2-hidroxi-3(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleát jelenlétében növekedtek, képesek részlegesen fenntartani (vagy megőrizni) a normális plazmamembrán fizikai állapotukat.
10. Az inzulin és az N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)propoxij-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleát hatása az STZ-diabéteszes patkány májában a GRP-94 szintjére
10.1. Háttér
Anoxia, glükózéheztetés és néhány egyéb körülmény, amelyek kedvezőtlenül hatnak az endoplazmás retikulum (ER) funkciójára, a stresszfehéijék (GRP-k) osztálya által szabályozott glükóz szintézisét indukálják [Lin Η. Y. és munkatársai: Mól. Bioi. Cell. 4, 1109-1119 (1993)]. A GRP-k 94 kDa-os tagja, a GRP-94,50%-ban homológ a 90 kDa-os stresszfehéqével, a luminális kalciumkötő egyik ER-fehéqével. Úgy tűnik, hogy a GRP-94 egyéb ER-fehéijékkel együtt, molekuláris chaperonként funkcionál [Nigem S. K. és munkatársai: J. Bioi. Chem. 263, 1744-1749 (1994)]. Azt feltételeztük, hogy a GRP-94 molekuláris chaperon felhalmozódása előnyös hatással lehetne az STZdiabétesz által előidézett celluláris károsodás kijavítására patkányokban. Ennek megfelelően kísérleteket végeztünk, amelyekben összehasonlítottuk a GRP-94 különböző szintjeit egészséges, diabéteszes, N-[2-hidroxi-3(1 -piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleáttal kezelt és inzulin plusz N-[2-hidroxi-3-(lpiperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleáttal kezelt patkányokból származó májakban.
10.2. Anyagok és módszerek
10.2. (a) Vizsgált vegyületek: N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleát (BIOREX Ltd.) inzulin (Protophane HM inj.)
10.2. (b) Állatok: Crl (VAF plusz) Wistar hím patkányok (250-300 g)
Az állatokat (ketrecenként 7-et) 23-25 °C-on tartottuk 50-60% relatív páratartalom mellett, 12/12 órai fény-sötétség ciklussal. Szabad bejárást hagytunk az eledelhez és a víztartályhoz.
10.2. (c) Diabétesz indukálása: Egyszeri STZ-dózist (45 mg/kg iv.) adtunk be a koplalás állapotában.
10.2. (d) Az állatokat a következő csoportokba osztottuk:
a) Egészséges állatok
1. Fiziológiás sóoldattal kezelt 1 hétig (n=5)
2. Fiziológiás sóoldattal kezelt 2 hétig (n=5)
3. Fiziológiás sóoldattal kezelt 4 hétig (n=5)
4. N-[2-hidroxi-3-( 1 -piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleáttal kezelt hétig (n=7)
5. N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleáttal kezelt hétig (n=7)
6. N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleáttal kezelt 4 hétig (n=7)
b) STZ-diabéteszes állatok
7. Fiziológiás sóoldattal kezelt 1 hétig (n=5)
8. Fiziológiás sóoldattal kezelt 2 hétig (n=5)
9. Fiziológiás sóoldattal kezelt 4 hétig (n=5)
10. N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleáttal kezelt hétig (n=7)
11. N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleáttal kezelt hétig (n=7)
12. N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleáttal kezelt 4 hétig (n=7)
c) Inzulinnal kezelt STZ-diabéteszes állatok
13.1 hétig inzulinnal kezelt diabéteszes (n=7)
14.2 hétig inzulinnal kezelt diabéteszes (n=7)
15.4 hétig inzulinnal kezelt diabéteszes (n=7)
d) N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleáttal és inzulinnal kezelt állatok
16. 1 hétig inzulinnal és N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoilklorid-maleáttal kezelt diabéteszes (n=7)
17. 2 hétig inzulinnal és N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoilklorid-maleáttal kezelt diabéteszes (n=7)
18.4 hétig inzulinnal és N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoilklorid-maleáttal kezelt diabéteszes (n=7)
HU 222 994 Bl
A kezelés után a májakat eltávolítottuk, és azonnal -70 °C-on folyékony nitrogénben lefagyasztottuk. Az N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleátot (bárhol alkalmaztuk) 20 mg/kg/nap dózisban po. adtuk. Az inzulinos kezelés: kétszer naponta a normális glükózszint fenntartásához szükséges dózisban.
10.2. (e) A GRP-94 szint meghatározása
Az összes oldható fehérje extrakciója patkánymájból
Minden lépést 0-4 °C-on hajtunk végre. A patkánymájakat (kb. 15-20 g) homogenizáljuk egy háztartási mixelógépben 2 percig 80 ml módosított, egyetlen detergenst tartalmazó lizáló pufferoldatban, melynek összetétele a következő: 50 mM Tris-HCl, pH=8,0, 5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 0,1% SDS, 1% Triton X-100 és 1-1 mM proteázinhibitor (PMSF, benzamidin, amino-kapronsav). A homogenizált oldatot ezután lecentrifugáljuk (20 000 xg, 30 perc, Sorvall 28S centrifuga). A felülúszó nagy részét -20 °C-on lefagyasztjuk (mintakészletként), és 1 ml-t használunk fel az analízishez. A fehéijekoncentrációt Bradford-assay segítségével határozzuk meg [Guide to Protein Purification, Methods in Enzimology, 182. kötet, Deutscher Μ. P. (szerk.), Academic Press (1990)] három paralel kísérletben, és 5 mg/ml-re állítjuk be.
Elektroforézis és immunfoltképzés
Az elektroforézis és az immun-blot-analízis laboratóriumi technikáit részletesen leírták az alábbi helyeken: Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Ed. Sambrook, Fritsche, Maniatis, Bőid Spring Harbor Laboratory Press (1989); Protein Blotting Protocols fór the Immobilon-P Transfer Membráné, 3. Laboratory Manual, Millipore; és U. K. Laemmli: Natúré 227, 680-685 (1970). Az egyes minták a gélelektroforézishez 1,8 mg 0,6 ml pufferrel (összetétele: 110 mM Tris-HCl, pH=6,8; 8,3 mM merkapto-etanol, 3% SDS, 3% glicerin és egy kevés bróm-fenolkék) szolubilizált fehérjét tartalmaznak, és a mintákat 30 percig szobahőmérsékleten rázatjuk.
Az elektroforézist 8%-os poliakrilamidgélen 50 V konstans feszültség mellett egy éjszakán át, csíkonként 30 pg fehétjével vitelezzük ki. A fehérjéket vagy megfestjük Coomassie Brilliant Blue R-250-nel, vagy átvisszük Immobilone PVDF-membránra (Millipore) konstans áramerősségnél (300 mA) 3 órán át 4 °C-on transzfer pufferben (10 mM CAPS, pH=ll, 10% metanol). Átvitel után a membrán nem specifikus helyeit 2% BSA-val TPBS-ben (foszfáttal puffereit sóoldat 0,1% Tween 20-szal) blokkoljuk 4 °C-on egy éjszakán keresztül. Ezután a foltot a GRP-94 molekuláris chaperon elleni antitesttel, például GRP94 monoklonális antitesttel (SPA-850, StressGen) 1:3000 hígításban inkubáljuk 1 órán át szobahőmérsékleten. Ezután mossuk a foltot egy órán keresztül TPBS-pufferrel, és egy második, torma-peroxidázzal konjugált antipatkány- (Sigma, 1:4000 hígítás) antitesttel inkubáljuk egy órán át. Ezt követően a membránt TPBS-sel alaposan átmossuk és ECL-rendszerben kifejlesztjük (Amersham).
A teljesfehéqe- (9/1 minta) hígítási sorozatból foltot képzünk és kifejlesztjük, és egy kalibrációs görbét is kalkulálunk. A stresszfehérje-tartalomban bekövetkezett változásokat egy Bio-Rad denzitométerrel (1650-es modell) és egy Hewlett-Packard integrátorral (IIP 3394A) mérjük, és a kalibrációs görbe szerint korrigáljuk.
Statisztikai analízis
A megadott adatok középértékek±SEM. A statisztikai összehasonlítást és számítást a különbség „oneway”-analízisével Posthoc Newman-Keuls-teszttel végeztük (Pharmacological Calculation System). A statisztikai szignifikanciát p<0,05-nak határoztuk meg.
10.3. Eredmények
A relatív GRP-94 szignifikáns csökkenését figyeltük meg 1 hetes, 2 hetes és 4 hetes diabéteszes patkányokban. Ez a hatás az 1 hetes és 2 hetes diabéteszes állatokban csaknem teljesen vissszafordítható N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleátos kezeléssel. Az inzulin adása önmagában vagy az N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]3-piridin-karboximidoil-klorid-maleáttal kombinálva az 1 és 2 hetes mintákban majdnem megkétszerezte a GRP-94 szintjét a kontrolihoz viszonyítva.
Ellentétben az előző megfigyelésekkel, a diabéteszes patkányok 4 hétig tartó kezelése egyedül N-[2-hidroxi-3(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleáttal nem hozott lényeges változást a GRP-94 relatív mennyiségében. Ezen túlmenően mindkét inzulinnal kezelt csoportban, függetlenül attól, hogy N-[2-hidroxi-3(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleáttal kezeltük-e vagy sem, a GRP-94 visszatérését figyeltük meg a kontrollszintre.
11. Az N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleát védőhatása az epidermális sejtekben a hő és UV fény által okozott károsodásokkal szemben
11.1. Anyagok és módszerek
A HaCaT-sejtvonal egy spontán immortalizált, „ancuploid” humán keratinocita-sejtvonal, amely normál humán felnőtt bőréből származik [Boukamp és munkatársai: J. Cell. Bioi. 106, 761-771 (1988)], a HaCaT-sejtvonal teljes epidermális dififerenciálóképességgel, normális keratinozációval és nem tumoros karakterrel rendelkező sejtvonal. Ezt a gyorsan sokszorozódó és nagy ditamolérzékenységű keratinocitavonalat szteroidreceptorok jelenlétével is jellemezhetjük. A HaCaT-sejteket (35 mm átmérőjű Petri-csészékben, csészénként 4xl05 sejtet) 5% magzati borjúszérummal kiegészített DMEMtápközegben (Gibco, katalógusszám 011-6290H), 5% CO2-atmoszférában, 37 °C-on tenyésztjük és növesztjük. 24 óra múlva a tenyészeteket PBS-sel átöblítjük és hővel vagy fénnyel kezeljük.
Az összefolyó sejttenyészeteket hőhatásnak (42, 44, 46, 47, 48 °C) tesszük ki, vagy megvilágítjuk UV fénnyel (UV-A 1,2,4,6 J/cm2). A hőhatást cirkuláló vízfürdővel biztosítjuk. UV fényforrásként egy Waldmann PUVA 4000 lámpát használunk, 320 és 390 nm közötti végső teljesítményű energiaspektrummal, melynek csúcsa 365 nm-nél van. A kijövőteljesítményt egy UV-A és UV-B szenzorral felszerelt IL-1700 radiométerrel szabályozzuk.
HU 222 994 Bl
A sejtek morfológiáját egy fáziskontraszt-mikroszkóp segítségével vizsgáljuk (Opton Axioplan Microscope, Plan-Apochromat Ph fáziskontraszt-objektívekkel). A következő faktorokat vettük tekintetbe a citotoxicitás indikátoraiként:
(a) az összetapadt sejtek csökkent denzitása (sűrűsége);
(b) a szabályos „cobble-stone” mintázat elvesztése az intercelluláris terek megnagyobbodásával;
(c) a sejtalak megváltozása, például gátolt sejtterjeszkedés, kidudorodás, fajsúlyos zsugorodás, fragmentálódás; és (d) citoplazmás változások, például kondenzáció vagy hólyagosodás (vakuolizáció).
A sejtéletképességet is vizsgáljuk tripánkék kizárásos teszt segítségével.
11.2. Eredmények
Meghatároztuk a HaCaT keratinociták hőstressz iránti érzékenységét életképességük vizsgálatával. Az eredmények azt mutatják, hogy 24 órával a 48 °C-os hősokk után gyakorlatilag nem maradt élő sejt (2,7%), a 37 °Cnál mért kontrolihoz (100%) viszonyítva. A HaCaT keratinociták életképessége 24 órával a 45 °C-os hősokk után 59%-nak bizonyult. Nem találtunk morfológiai elváltozásokat a HaCaT-tenyészetekben 1 órával a hősokk után. 24 órával a 46 °C-nál és a magasabb hőmérsékleten végzett kezelés után, szignifikáns (p<0,01) sejtkülönválást és morfológiai változásokat figyeltünk meg, úgymint a szabályos „cobble-stone” mintázat eltűnése az intercelluláris terek megnagyobbodásával, kidudorodás, fajsúlyos zsugorodás és a HaCaT keratinociták vakuolizációja. Az UV-megvilágítást követően azt találtuk, hogy az életképes sejtek számának csökkenése közvetlenül összefügg az UV-A dózisával.
A sejtek előkezelése hővel (42 °C, 1 órán át) vagy N[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleáttal (5χ105 M koncentrációban 1 órán át) megvédte a sejteket a 48 °C-os hősokkal szemben. Amikor a sejteket megvizsgáltuk 24 órával a 48 °Cos hőkezelés után, azt találtuk, hogy összehasonlítva azokkal a sejtekkel, melyeket nem kezeltünk, a sejtéletképesség 48%-ra (amikor 42 °C-kal előkezeltük) és 84%ra (amikor N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleáttal előkezeltük) megnővekedett. A legkifejezettebb védelmet abban az esetben lehetett megfigyelni, amikor kombinált kezelést (42 °C és N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleát) alkalmaztunk.
A 42 °C-os hővel való előkezelés, de nem a 44 és 45 °C-kal, a citotoxicitás kiemelkedő csökkenését idézte elő UV fénnyel szemben. A 42 °C-os kezelés védelmet nyújtott mind a 2, mind a 4 J/cm2 megvilágítással szemben. Az előkezelt HaCaT keratinociták életképessége 132%-ra (2 J/cm2 megvilágításnál) és 218%-ra (4 J/cm2 megvilágításnál) növekedett, összehasonlítva az UV fénynek kitett, előkezelés nélküli (100%) sejtekkel.
12. Az N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleát hatása humán bőrszövetekben a molekulárischaperon-expresszió indukálására
Az ultraviola UV-B fény (290-320 nm) a napfény komponenseinek egyike, és ismert, hogy bőrkárosodást okoz. Az N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleát szerepét vizsgáltuk az UV-B megvilágítás által a bőrszöveteken okozott károsodás csökkentésében, valamint az N-[2-hidroxi-3-(lpiperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleát hatását a bőrszövetekben a molekulárischaperon-expresszió növelésében.
12.1. Anyagok és módszerek
Humán bőrszöveteket ültetünk át immunhiányos (SCID)-egérbe. A kísérleti terv szerint az egerek egyik csoportját N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleáttal (5,0 mg/kg ip.) kezeljük, és egy másik csoportját NaCl-oldattal (300 pl) 7 napig. A 8. napon az egerek mindkét csoportját megvilágítjuk UV-B fénnyel (100 mJ/cm2) 24 órát az expozíciót követően, bőrbiopsziát végzünk hisztológiai (a szövetmintákat hematoxilinnel és eozinnal megfestjük) és immunhisztológiai vizsgálatokhoz (indirekt immunfluoreszcencia-módszer, mAB monoklonális antitesttel).
12.2. Eredmények
Az UV-besugárzott egérben, amelyet N-[2-hidroxi3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleáttal előkezeltünk, az UV-besugárzásra visszavezethető sérülések klinikai jeleit nem lehetett megfigyelni. Ezzel szemben, a kezeletlen állatok egyikében a transzplantált területen gennyes reakciót találtunk. Továbbá, az mAB-vei végzett, indirekt immunfluoreszcencia-vizsgálatokban a hsp72 egy intenzív, lineáris festődést mutatott az N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleáttal kezelt állatokban a humán és az egérbőr alapmembránzónája mentén. Ugyanezt a reakciót nem lehetett megfigyelni a kezeletlen állatok bőrén. Ráadásul, a granulociták festődő nukleáris típusa volt jelen a gennyes hólyagokban (gyulladásos bőrreakció) a kezeletlen állatoknál.
A fentiek alapján az N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleát beadása a bőrszövetbe a hsp72 megnövekedett képződését eredményezi a bőrszövetekben, és védelmet nyújt az UV-besugárzásból származó sérülésekkel szemben.
12.3. HSP—70 szintjének meghatározása bőrből: UVB-vel és UV-B+N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxij-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleáttal kezelt, SCID-egérbe átültetett humán bőrből származó fehérjék Westem-blot-analízise
Módszerek
a) Az összes oldható fehérje extrakciója bőrből
Minden lépést szobahőmérsékleten végzünk. A bőrt (kb. 9-35 mg) keskeny csíkokra vágjuk, és fagyasztott üveg mozsártörővei Eppendorf-csőben 2 percig (2 μΙ/pg bőr) kétszer koncentrált Laemmli-pufferben homogenizáljuk (65 mM Tris-HCl, pH=6,8; 5% β-merkapto-etanol; 2% SDS; 10% glicerin; 0,1% bróm-fenolkék; az összes anyag Sigma termék). Ezután szolubilizáljuk a mintákat másik 60 percig folyamatos rázással. A homogenizátumokat centrifugáljuk 10 000 ford./perc sebességgel 10 percig előzőén gélbe töltve.
HU 222 994 Bl
b) Elektroforézis és immunfoltképzés (5, 7, 8)
Az elektroforézist 8% poliakrilamidgélben, sávonként 10 μί mintával, konstans feszültségen (50 V) egy éjszakán át végezzük. A fehérjéket vagy Coomassie Brilliant Blue R-250-nel megfestjük vagy átvisszük egy Immobilone PVDF-membránra (Millipore) konstans áramerősséggel (300 mA) 3 órán keresztül 4 °C-on transzfer pufferrel (10 mM CAPS, pH=ll, 10% metanol). A membrán nem specifikus helyeit 2% BSA-val TPBS-ben (foszfáttal puffereit fiziológiás sóoldat 0,1% Tween 20-szal) blokkoljuk egy éjszakán át 4 °C-on. A foltot HSP-70 monoklonális antitesttel (SPA-8dc, StressGen, hígítás 1:1500) 1 órán át szobahőmérsékleten inkubáljuk. Ezután mossuk háromszor TPBS-pufferrel még egy órán át, és inkubáljuk egy második, torma-peroxidázzal konjugált antiegérantitesttel (Sigma, 1:1500 hígítás) 1 órán keresztül. Háromszori TPBS-sel végzett, intenzív mosás után a membránt ECL-rendszerrel (Amersham) kifejlesztjük.
13. Az N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleát hatása a HSP aktiválásában
Az oxidatív foszforilálás képződése és védelme
13.1. Háttér
Patriarca és munkatársai kimutatták, hogy ha a Saccharomyces cerevisiae sejteket hősokknak (5 perc 42-44 °C-on) tesszük ki, az az oxidatív foszforilálás és a mitokondriális elektrontranszport-rendszer kapcsolódásának károsodását eredményezi azáltal, hogy befolyásolja a sejtek ATP-szintetizáló képességét [Biochemistry and Cell Biology, 70, 207-214 (1992)]. Ha azonban a sejteket N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleáttal egy rövid ideig 37 °C-on előkezeljük a hősokkot megelőzően, az előkezelés csökkenti a kapcsolódás károsodását, és megvédi a mitokondriális ATP-szintézist. A citoplazmás RNS vagy a fehérjeszintézis gátlása hősokkal, úgy tűnik, hogy megakadályozza a mitokondriális aktivitásnak ezt a védelmét. A fentiek alapján a hsp szerepeinek egyike úgy látszik abban áll, hogy megvédje az oxidatív foszforilálás és a mitokondriális elektrontranszport-rendszer kapcsolatát, amelyben zavar áll be, amikor a sejteket fiziológiai stressznek, például hősokknak tesszük ki.
Ebben a fejezetben az N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleátot bejuttatjuk olyan sejtekbe, melyeket előzőleg hősokknak tettünk ki, és megvizsgáljuk hatását az oxidatív foszforilálás mitokondriális transzportrendszerrel való kapcsolódásának hőstresszel szembeni védelmében.
Továbbá megvizsgáljuk azt is, hogy az AP-1 és a P 1 transzkripciós faktorok modulálhatók-e N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleáttal a különféle stresszhatásoknak kitett élesztősejtekben.
13.2. Anyagok és módszerek
Az oxidatív foszforilálás és a mitokondriális ATPszintézis károsodásának Saccharomyces cerevisiaeben történő vizsgálatára a kísérleti tervet megtalálhatjuk Patriarca és munkatársainál a következő cikkben : Biochemistry and Cell Biology, 70,207-214 (1992), melyben leírtakat teljes terjedelmében beépítjük referenciaként a jelen leírásba.
S. cerevisiae sejtekbe, melyeket 25 °C-on tartunk fenn, különböző koncentrációban N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleátot juttatunk be (10-től 100 μΜ koncentrációban), majd a sejteket egy órán keresztül 25 °C-on inkubáljuk N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleát jelenlétében. Ezután a hőmérsékletet felemeljük 42 °C-ra, és oxigráf méréseket végzünk a Patriarca-cikkben leírtak szerint.
Az N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleáttal kezelt sejteket Northem-blot-eljárással teszteljük a hsp-gének indukciójára. A módszerek, melyek az eukariótasejtekből a mRNS-ek extrahálására, tisztítására és az így kapott RNS analízisére - Northem-blot-eljárással - szolgálnak, a szakember számára jól ismertek, és ismertetésre kerültek Maniatis és Maresca és munkatársai által [Archives Medical Research 24, 247-249 (1993)], mely referenciákat teljes terjedelmükben beépítjük bejelentésünkbe. A Northem-blot-eljárást a fentiekben, a 7. fejezetben ismertettük. A hsp26 és a hsp70 DNS-szekvenciákat használtuk próbaként.
13.3. Eredmények
13.3.1.
A 4. ábrán az S. cerevisiaeben indukált hsp26 mRNS Northem-blot-analízisét mutatjuk be, illusztrálva ezzel a
13. részben leírt kísérletben kapott eredményeket {a 13. rész címe: N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleát hatása a Hsp-képződés aktiválásában és az oxidatív foszforilezés védelmében}. A sejtekbe bejuttatott kémiai vegyület koncentrációját és az inkubálás időtartamát az ábrán jeleztük.
Azokban a sejtekben, melyeket N-[2-hidroxi-3-(lpiperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleát jelenlétében inkubáltunk (10-100 μΜ) 5 percig egy órán át 25 °C-on, a hsp26 indukcióját figyeltük meg. Az eredmények tehát azt mutatják, hogy az indukció megjelenik már 5 perces inkubáció után is.
Továbbá azt találtuk, hogy a vizsgált vegyület 10 és 100 μΜ közötti koncentrációkban hatékonyan csökkenti az oxidatív foszforilálás és a mitokondriális elektrontranszport-rendszer közötti kapcsolatban a hősokk hatására bekövetkezett károsodást. A mitokondriális ATPszintézis károsodásával szemben bizonyos mértékben védelmet kaptunk akkor, amikor termotoleranciát indukáltunk a sejtek előkezelésével oly módon, hogy közepes, 37 °C-os hőmérsékletnek tettük ki őket (40-60% védelem).
13.3.2.
Az 5. ábrán bemutatjuk a benzil-alkohol hatását az (a) adenilát-cikláz aktivitására és (b) a marha tiroid plazmamembránok fizikai állapotára. A benzil-alkohol hatása az adenilát-cikláz aktivitására (a) és a szarvasmarha tiroid plazmamembránok fizikai állapotára (b). Az adenilát-cikláz-aktivitás (a) változásait az alapra (o-o) vonatkoztatva következőképpen jelöljük: TSHstimulált (-), forskolinstimulált (Δ-Δ), kolera-toxin45
HU 222 994 Bl stimulált (V-V) és fluoridstimulált (0-0) enzimaktivitás. A membránokat a kapcsoló faktorok hozzáadása előtt inkubáljuk a szenei. A membrán fizikai állapotát néhány fluorofór egyensúlyi állapotban mért fluoreszcens anizotrópiájának (b) követésével határozzuk meg, melyek beágyazódtak a membránokban: DPH (o-o), 12-AS (-) és TMA-DPH (Δ-Δ). A méréseket 37 °Con végezzük. A fluorofór/lipid mólaránya minden esetben 1:500.
13.3.3.
Kísérleteink azt bizonyítják, hogy az N-[2-hidroxi3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleát szignifikánsan befolyásolja az AP-1 aktivitását, és hatása meghatározható a sejtek aktuális metabolikus állapotain keresztül. Míg az N-[2-hidroxi-3-(lpiperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleát növeli az AP-1 aktivitását, ha a tápanyagellátás nem kielégítő, addig gazdag tápközegben csökkenti a faktor aktivitását. A szer hatása a sűrű, késői logkultúrákban a legkifejezettebb. Ezzel ellentétes tendenciát lehetett megfigyelni a P-l faktornál, melynek aktivitása csökken, ha az N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleátot minimál tápközegben adjuk a sejtekhez. Az is elképzelhető, hogy a P-l lefelé szabályozását a sejtekben lévő antistresszmechanizmus sokféle változása idézte elő, melyet az N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleát által indukált AP-1aktiválás okozott. Megjegyezzük, hogy a P-1 minden típusú stresszre reagál, de a vizsgált anyag nem befolyásolja aktivitását. Jelentősek különösen az AP-l-gyel kapott eredményeink, mert meg tudják magyarázni a szer in vivő sokirányú aktivitását, melyeket részletesen tárgyalni fogunk.
Az N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleát (B) hatását a hsp-gén expressziójára szövettenyészetben a 6. ábrán mutatjuk be. HeLa-sejteket transzfektálunk egy riporter-plazmidszerkezettel, melyben a humán hsp70 gén promoterét fuzionáltuk a luciferáz-riportergénhez. A hősokk és/vagy az N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleát hatását a hsp-promoterre luminométerben a luciferáz aktivitásának mérésével és a hsp-fehéijeszint (a kromoszomális génből kifejeződő) Westem-blot-analízisével határozzuk meg. Minták
1: nincs DNS-kontroll; 2: 10 pg transzfektált DNS tónál, nincs hősokk; 3: 10 pg transzfektált DNS to-nál, 60 perces hősokk 24 órával később; 4: mint az előző + N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleát (B) to-nál; 5: 10 pg to-nál transzfektált DNS+N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleát (B) to-nál; 6: 10 pg transzfektált DNS to-nál, 60 perces hősokk 24 órával később, N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleát (B) adás a hősokk idején; 7: 10 pg transzfektált DNS t0-nál, 60 perces hősokk 24 órával később, N-[2-hidroxi-3-(lpiperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleát (B) adás a 0 időpontban és a hősokk idején;
8: 10 pg to-nál transzfektált DNS hősokk nélkül, N-[2hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleát (B) beadás a nulla időpontban és 24 órával később.
14. Az N-[2-hidraxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleát hatása tumorsejtekben a molekuláris chaperon indukálására
A nem letális hősokk másfélszeresére növeli az NKsejtek által szabályozott lízis iránti érzékenységet, és a hősokk plusz az N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]3-piridin-karboximidoil-klorid-maleáttal történő kezelés szinergetikus hatást fejt ki a K562 sejtek lizálhatóságára. Ez a többlethatás, amelyre magyarázatul az N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoilklorid-maleát szolgál, egyértelműen a hsp72 megemelkedett plazmamembrán-expressziójából származik, mivel az in vivő antitest-blokkolóvizsgálatok (felhasználva hsp72 monoklonális antitestet) az NK-lízis erős gátlását mutatják.
A 7. ábrán bemutatjuk az N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleát (B) hatását a hősokk által indukált hsp72-szintre. Az N[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleát önmagában nem növeli a hsp72szinteket, amíg hősokkal nem kombináljuk, és az N-[2hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleátos kezelés a hsp72-expresszió szignifikáns megnövekedését eredményezi a hősokkhoz önmagában viszonyítva.
14.1. Háttér
A hősokkfehérjékről ismert, hogy a citoplazmában helyezkednek el, ahol ellátják a különféle chaperonfünkciókat. A daganatos sejtekben azonban a hsp-ről azt közölték, hogy a sejtmembrán felszínén is kifejeződik [Ferrarim M. és munkatársai: Int. J. Cancer 51, 613-619 (1992)].
A kísérletek arra utalnak, hogy megnövekedett hsp (például a hsp70) indukálható a sejt felszínén azáltal, hogy a tumorsejteket nem letális hősokknak tesszük ki, és ez a növekedés korrelációban van az IL-2-specifikus, CD-3 természetes ölő- (killer) sejteknek (NK) a tumorsejtekkel szemben megnövekedett érzékenységével. Mivel az NK-sejtekről leírták, hogy részt vesznek a tumorsejtek infiltrációjában és dőlésében in vivő [Kurosawa S. és munkatársai: Eur. J. Immunoi. 23,1029 (1993)], az NK-sejteknek ez a megnövekedett érzékenysége a tumorsejtek irányában lehetővé teszi a tumorsejtek jobb megcélzását az NK-sejtek által. így, ha a hsp expresszióját indukálni tudjuk a tumorsejtekben megnövelt hsp-vel a sejtfelszínén, ez lehetővé teszi ezen sejteknek a jobb elérését és dőlését az NK-sejtek révén. Ebben a fejezetben az N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleát hatását vizsgáljuk a hsp72 expressziójának indukálására tumorsejtekben.
14.2. Anyagok és módszerek
K562 humán sejteket, egy mieloid tumorsejtvonalat (ATCC, CCL243) használunk fel, amely krónikus mielogén (csontvelőből kiinduló) leukémiablasztocita fázisában szenvedő betegből származik [Lozzio, BC an
HU 222 994 Bl
Lozzio, BB Blood 45, 321 (1975)]. Az exponenciálisan növő sejteket 5 χ 10~5 M N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleáttal kezeljük a nem letális hőmérsékleten (42 °C) 2 órán keresztül. Az ezt követő 16 órás rehabilitációs periódusban 37 °C-on, a sejteket megvizsgáljuk a hsp72-tartalom szintjére áramlásos citometriával [Multhoff és munkatársai: Int. J. Cancer 61, 272-279 (1995)]. Az N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoilklorid-maleáttal történő kezelés a tumorsejtekben a hsp72 szintjének megemelkedését eredményezte.
15. Az N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleát lipidmembránokkal való kölcsönhatása. Egyrétegvizsgálat
15.1. Háttér
Egy stressz (fizikai, patofiziológiai stb.) által kiváltott mechanizmus(ok) egy jelként történő detektálása és átalakítása egy átírókészülékkel más jelrendszerbe mind ez idáig ismeretlen volt. Feltételezik, hogy a membránlipidmátrix fizikai állapota, amely meghatározza a membránhoz kötött fehérjék szerkezetét és funkcióját, közvetlenül szerepet játszik a hőmérsékletváltozások érzékelésében, és hogy a hősokk (HS) körülményei alatt a membránszerkezet zavara a jel átalakítását okozza, amely a HS-gének transzkripcióját indukálja. A stressztolerancia indukálásával párhuzamosan, az N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleátról kimutattuk, hogy fokozza a sejtek hatékonyságát, hogy detektálják és jelezzék a különféle stresszállapotokat bizonyos chaperongének expressziójának felülszabályozása által.
Ismert, hogy az egysejtréteg- (monolayer) technika, felhasználva a levegő-víz határfelületnél elhelyezkedő monomolekuláris lipidrétegeket, hatékony eszköz a membránok és a membránaktív anyagok közötti kölcsönhatások meglétének bizonyítására. A kétrétegű rendszer viselkedése nagyon hasonló a megfelelő egyrétegű rendszerhez sok tekintetben (a membrán-alkotóelemek molekuláris területe, foszfolipázhatás, behelyezett fehérjék orientációja stb.). A felületi nyomásváltozások mérésével, melyeket az egysejtrétegekbe beépített molekulák okoznak, lehetővé válik betekintést kapni a kölcsönhatás molekuláris dimenziójába.
A feltevés döntő előfeltétele, hogy valamennyi N[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleátnak, amely szabályozza a stresszre adott válaszokban a korán kiváltódó jelenségeket, jelen legyen a sejtmembránban, hogy bizonyítékul szolgáljon az N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleát és a membránalkotók közötti direkt fizikai kölcsönhatásra. A jelen tanulmány célja, hogy megvizsgáljuk az N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleát membránokkal való kölcsönhatását felhasználva különböző lipidegysejtrétegeket, mint a biológiai membránok modellrendszerét.
15.2. Anyagok és módszerek
Az egyrétegvizsgálatokat egy 6,5 ml térfogatú, 8,8 cm2 területű teflonedényben, 25 °C-on, egy
KSV3000 Langmuir-Blodgett-készülékben (KSV Instruments Ltd., Helsinki, Finland) végeztük lényegében az alábbi leírás szerint. A monomolekuláris lipidrétegeket, melyek l,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-foszfokolinból (DPPC), tojássárgája-foszfatidil-glicerinből (EggpG) vagy marhaszív-kardiolipinből (BHCL) állnak, kloroformos lipidoldatokból szétterítjük, hogy a szükséges kezdeti felületi nyomást a 10 mM Na-foszfát (pH=7,0) szubfázisán hozzáadjuk. A szubfázist folyamatosan kevertetjük mágneses keverővei. Az N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleátot vízben feloldjuk, és az egyréteg alá beadjuk egy üregen keresztül a teflonkamrában, melyet a szubfázissal összekötöttünk. A beinjekciózott térfogat minden esetben kisebb, mint a szubfázis teljes térfogatának 1%-a. A felszíni nyomást egy platinalap segítségével Wilhelmy módszerével méijük. A felületi nyomásnövekedés-adatokat a feldolgozatlan adatbázisokból extraháljuk a Langmuir-Blodget mérési rendszer LB5000 szoftverének felhasználásával.
15.3 Eredmények
A különböző foszfolipidek és az N-[2-hidroxi-3-(lpiperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleát közötti kölcsönhatást teszteljük a levegő-víz határfelületnél elhelyezkedő lipidegyrétegek szer által indukált felszíni nyomásnövekedésének mérésével (8. ábra). Ehhez a vizsgálathoz az egyrétegeket DPPCből, EggPG-ből és BHCL-ből készítettük, és növelő mennyiségű N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleátot adunk két koncentrációban (10~6 Μ, 10-5 M) a szubfázishoz. A szer beadása a lipidegyréteg alá a felületi nyomás megnövekedését eredményezi, amely minden esetben a szubfázisban lévő N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleát koncentrációjától függ. Azonban, lényeges differencia van a különféle lipidegyrétegek felszíninyomás-profiljában. így a zwitterionos DPPC esetében a nyomás gyorsan megváltozik az N-[2-hidroxi-3(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-kloríd-maleát-injekció után, majd állandó szinten marad. Olyan egyrétegek alkalmazása során, melyek negatív töltésű BHCL-t tartalmaznak, a felszíninyomás-profil egy tipikus inszerciós kinetikát mutat, azaz a nyomás körülbelül 2 percig növekszik, miután elért egy egyensúlyi szintet. PG jelenlétében a szer inszerciós kinetikája hasonló ahhoz, mint amit a BHCL-nél megfigyeltünk, azonban egy bizonyos érték elérése után a nyomás csökkenni kezd. A nyomáscsökkenés mértéke függ a szubfázisban lévő szer koncentrációjától. Ennek a jelenségnek egyik lehetséges magyarázata az N-[2-hidroxi-3(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleát-EggPG-komplexek eltávolítása a határfelületről, mivel a nyomáscsökkenés folytatódik akkor is, ha a tiszta lipidegyréteg eléri a kezdeti nyomást.
Ahhoz, hogy további betekintést kapjunk az N-[2hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleát és a lipidegyrétegek közötti specifikus kölcsönhatásba, különböző kezdeti felületi nyomásoknál mérjük a szer által kiváltott felületi nyomásnövekedést (8. ábra). Az extrapolálás módszere a magas kez47
HU 222 994 ΒΙ deti felületi nyomásokra megengedi a korlátozó inszerciós nyomások megbecslését a molekulára, amelynél azt többé már nem lehet behelyezni az egyrétegbe. Az extrapolált limitáló kezdeti felületi nyomások 89 mN/m és 39 mN/m BHCL-re, illetőleg DPPC-re. A negatív töltésű BHCL-t tartalmazó egyrétegek esetén a nyomásnövekedések mindig magasabbak azoknál, melyeket a zwitterionos DPPC-nél találtunk, alátámasztva ezzel az elektrosztatikus kölcsönhatások jelentőségét.
Vizsgálataink először bizonyítják nyilvánvalóan, hogy az N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleát fiziológiailag lényeges koncentrációkban való beadása után képes kölcsönhatásba lépni a lipidmembránokkal, egy főcsoportspecifikus módon.
A 8. ábrán az N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleát (B) és a lipidegyrétegek közötti kölcsönhatást mutatjuk be. A nyilaknál a megadott koncentrációkban az N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleátot hozzáadjuk a szubfázishoz.
A 8. ábrán a felületi nyomásnövekedés látható a BHCL- vagy DPPC-egyrétegek alá beadott N-[2-hidroxi-3 -(1 -piperidinilj-propoxi]-3 -piridin-karboximidoil-klorid-maleát (B) injekció után különböző kezdeti nyomásoknál. Az N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleát koncentrációja a szubfázisban 10 pmol. A kísérleti adatok lineáris regressziós analízise BHCL-egyrétegekre 0,844, illetőleg DPPC-egyrétegekre 0,995 korrelációs koefficienst eredményezett.
16. Az N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3piridin-karboximidoil-klorid-maleát védőhatása a citotoxikus citokinekkel és cikloheximiddel szemben
16.1. Háttér
Ezeknek a kísérleteknek az a célja, hogy megvizsgáljuk a lehetséges kapcsolatot a citokinek termékei és a patológiás elváltozások között, melyekkel szemben úgy tűnik, hogy az N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleát védőhatást fejt ki.
A kapott kísérleti adatok azt sugallják, hogy az N[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleát egy citoprotektív szer a szöveti tenyésztett sejtekre, melyeket citotoxikus citokinekkel kezeltünk. Az N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]3-piridin-karboximidoil-klorid-maleát-kezelés megnöveli a TNF-fel kezelt WEHI 164 sejtek (és más emlőssejtek) túlélési rátáját. Ez a hatás koncentrációfüggő, de nem közvetlenül egyenesen arányos a szer koncentrációjával. Az N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3piridin-karboximidoil-klorid-maleát-kezelés által nyújtott védelem mértéke kisérletről kísérletre változik, bár a kezelt sejtek citotoxikus citokinek iránti megnövekedett rezisztenciája egyértelműen tendencia minden kísérletben. Az N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]3-piridin-karboximidoil-klorid-maleátos kezelés által nyújtott védelem nem túl nagy, élő állatban azonban a védelemnek ez a foka elegendő lehetne arra, hogy mérsékelje vagy megelőzze a patofiziológiás folyamatokat. 16.2 Módszer
A szérum-TNF-szinteket és az STZ-diabéteszes és kontrollállatokból származó makrofágok indukálhatóságát mérjük. Az LPS-sel kiváltott szérum-TNF-aktivitások szignifikánsan megemelkedtek az STZ-vel indukált diabéteszes patkányokban (6-18 hetes), összehasonlítva a nem diabéteszes patkányokban mért szintekkel a diabétesz első hónapjában.
16.3. Eredmények
A diabéteszes csoport átlagos szérum-TNF-koncentrációja (radioimmunoassay-vel mérve) lényegesen magasabb (480±96 U/ml), mint az egészséges kontrollokban mért (345±48 U/ml). [Foss és munkatársai: Braz. J. Med. Bioi. Rés. 25,238 (1992) irodalmi helyen közöltek humán betegekben mért hasonló eredményeket.] A diabéteszes csoporton belül nincs korreláció a szérum-TNFszintek és a diabétesz lefolyása között. Nem találtunk biológiailag aktiv TNF-et a diabéteszes állatok szérumában L929 sejteken végzett citotoxicitási vizsgálattal. A RIA és a citotoxicitási mérések közötti differencia az oldható TNF-receptor-antagonisták (egy protektív, gyulladáscsökkentő molekula) magas szintű jelenlétét mutatja, jelezve a diabéteszes komplikációkban a TNF meglétét.
Az N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridinkarboximidoil-klorid-maleát egy váratlan proliferatív hatással rendelkezik élesztősejteken (és különböző, tenyésztett, normál, diploid állati vagy humán sejteken). Az N[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleát befolyása különösen hatásos a növekedést gátló antibiotikus cikloheximid alacsony koncentrációi jelenlétében. Az élesztőkolóniák N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoilklorid-maleát jelenlétében növekednek, és a cikloheximid nem mutatta a genetikai változások fokozott előfordulását (antibiotikumrezisztencia-mutációk), csak magasabb metabolitikus rezisztenciát a cikloheximid gátló hatásával szemben a fehéijeszintézisben.
Méréseink szerint az N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleát hatásai visszavezethetők az AP-1 transzkripciós faktor fokozott aktivitására, amely szabályozza mind a mitogén faktorok, mind a stressz különböző típusú faktorainak hatásait. Az eredmények azt is jelzik, hogy a fenti tesztvegyület és a hasonló vegyületek befolyásolják az AP-1 és talán egyéb transzkripciós faktorok működését, a növekedési faktorok és a metabolitikus stresszállapotok hatásainak fenntartásával.
A 10. ábrán az STZ-diabéteszes (1) és egészséges (2) állatokból izolált makrofágok in vitro LPS által kiváltott TNF-termelését mutatjuk be.
All. ábrán a keratinociták N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleáttal indukált védése látható a cikloheximid növekedést gátló hatásával szemben.
A 12. ábra a sejtek (endoteliális sejtek) cikloheximid toxikus hatásaival szembeni, az N-[2-hidroxi-3(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleát (B) által indukált védelmét mutatja.
HU 222 994 Bl
A 13. ábra a humán méhnyaki HeLa-sejtek N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoilklorid-maleáttal (B) való védelmét mutatja be az antibiotikus cikloheximid toxikus hatásaival szemben.
A 14. ábrán a szívizomsejtek N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleát (B) által indukált megvédése látható az antibiotikus cikloheximid növekedést gátló hatása ellen.
A 15. ábra az N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridín-karboximidoil-klorid-maleát (B) hatását mutatja be a Pl transzkripciós faktor aktivitására AB1380 élesztősejtekben. A 6. sor az átlagértékeket mutatja, az 5. sor üres.
Aló. ábra az N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]3-piridin-karboximidoil-klorid-maleát hatását mutatja be az API transzkripciós faktor aktivitására JF1 élesztősejtekben. All. sor jelenti az átlagértékeket.
A 17. ábrán az N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleát (B) hatása látható a Pl transzkripciós faktor aktivitására AB 1380 élesztősejtekben. A 6. sor jelenti az átlagértékeket, az 5. sor üres.
17. Az N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleát kardioprotektív hatása izolált patkányszíven
17.1.
Ennek a kísérletnek az a célja, hogy megvizsgáljuk az N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridinkarboximidoil-klorid-maleát kardioprotektív és antiaritmiás hatását izolált működő patkányszíveken.
17.2. Módszerek
Egy tízperces oxigént igénylő perfúzió után a szíveket (n=10 minden egyes csoportban) egy tízperces szívkoszorúér-elzárásnak tesszük ki, melyet 3 perces reperfúzió követett 0,05, 0,5, 5,0, 20,0 és 50,0 mg/1 N[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleát jelenlétében.
A további kísérletekben a patkányokat előkezeljük az N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridinkarboximidoil-klorid-maleát leghatékonyabb dózisával (20 mg/kg) 1, illetve 5 órával a szívek izolálása előtt. A szívek kivágása után a szíveket alávetjük a fent részletezett szívkoszorúér-elzárási tervnek, míg a perfúzió 20 mg/1 N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleát jelenlétében, illetve távollétében történik.
Független kísérletekben tanulmányozzuk a hőstressz, az ischaemia, az N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleát és ezek kombinációjának hatásait a miokardiális HSP-70 fehérjetartalmon. Az izolált szíveket 15 percig hőstressznek (42 °C), globális normotermikus ischaemiának és N-[2hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleát-perfúziónak tesszük ki, melyet 120, illetve 180 perces reperfúzió követ.
17.3. Eredmények
Ischaemia előtt az N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleát megnöveli a szívkoszorúéren az átfolyást (CF) egy harang alakú koncentráció-válasz összefüggésben. A szív más funkcionális paraméterei nem változnak a szer alacsony koncentrációinál. Az N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleát 50 mg/1 koncentrációban szignifikáns bradikardiát okoz, csökkenést az aortán történő átfolyásban (AF) és +/-dP/dtmax -ot, és növekedést a bal oldali ventrikuláris végdiasztolikus nyomásban (LVEDP) az ischaemia előtt. A kontrollcsoportban a szívkoszorúér-elzáródás lényegesen csökkenti CF-et, AF-et, +/-dP/dtmax -ot, és növeli az LVEDP-t. Az N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleát enyhíti a szívfúnkció ischaemiaindukált rosszabbodását egy harang alakú koncentráció-hatás függvény szerint. Az N[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleát 20 mg/1 koncentrációban mutatja a legkifejezettebb antiischaemiás hatást. A tízperces koronáriaelzáródást követő reperfúzió ventrikuláris (kamrai) fibrillációt vált ki minden szívben a kontrollcsoportban. Az N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleát nagyobb dózisai dózisfüggő antiaritmiás hatást eredményeznek.
Egy órával az előkezelés után az N-[2-hidroxi-3-(lpiperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleát még kardioprotektív, és potenciálja a vegyület akut hatásait. Öt órával az előkezelés után kardioprotektív hatás nem figyelhető meg, azonban az N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoilklorid-maleát perfúzió néhány akut hatása fokozódik.
A vegyület önmagában nem növeli a miokardiális HSP-70-tartalmat. A stetyokardiális HSP-70-tartalom lényegesen megemelkedik a hőstressz hatására, az ischaemia azonban csak egy mérsékelt HSP-70-emelkedést eredményez. Mindazonáltal, amikor ischaemiát indukálunk 20 mg/1 N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3piridin-karboximidoil-klorid-maleát jelenlétében, a HSP-70-tartalom megnövekszik körülbelül ugyanarra a szintre, mint amilyent a hőstressz után találtunk.
A fentiek alapján tehát az N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleát antiischaemiás és antiaritmiás hatással rendelkezik. 20 mg/1 az a koncentráció, melyben mind az antiischaemiás, mind az antiaritmiás hatás kifejezett izolált patkányszíven. Amikor a szer közvetlen antiischaemiás hatása megjelenik egy óra múlva, az még növeli a védelem fokát, melyet az akut N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleátos kezelés biztosít. Az ischaemiás stressz és az N-[2-hidroxi-3-(lpiperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleát együttesen egy gyors de novo HSP-70szintézist indukál a patkányszívben. Az N-[2-hidroxi-3(1 -piperidinil)-propoxi]-3 -piridin-karboximidoil-klorid-maleát önmagában nem hat a HSP-70-szintézisre.
A 18. és 19. ábrán a hsp-fehéije-szintek láthatók, melyeket Westem-blot-analízissel határoztunk meg a kontroll, hősokkal kezelt, ischaemiássá tett, N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleáttal (B) kezelt és ischaemia+N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleáttal kezelt (ischaemia+B) patkányok49
HU 222 994 Bl ból a feltárást követő 2 órával (18. ábra) vagy 3 órával (19. ábra).
18. A chaperonerősitő N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleát a börsérülések megelőzésében és gyógyításában: az ultraibolya B fénnyel szembeni védelem humán bőrátültetésben SCID-egéren és gyorsított sebgyógyulás diabéteszes patkányban
15.1. Háttér
Úgy tűnik, hogy a hsp-k közös szerepet játszanak a bőr környezeti stresszel szembeni fiziológiai védelmében. Mint molekuláris chaperonok részt vesznek a különféle behatások, mint például mechanikai trauma, fény-, hő- és kémiai sérülések, fertőzések stb. [Ε. V. Maytin: JID 104, 448 (1995)] által okozott károsodások megelőzésében és kijavításában. Patológiás körülmények között, mint amilyen például a diabetes mellitus, bizonyos hsp-k csökkent funkcióját közölték [M. Cherian és E. C. Abraham: Biochem. Biophys. Rés. Com. 212, 184 (1995)]. Mivel az N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleátról kimutatták, hogy chaperonerősítőként hat (Vígh és munkatársai, közlésben), azt vártuk, hogy ez a szer képes lesz fokozni a legkülönfélébb védelmi és javító mechanizmusokat.
Ezeknek a kísérleteknek az volt a célja, hogy megvizsgáljuk az N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]3-piridin-karboximidoil-klorid-maleát hatását szisztematikus (i) és helyi (ii) beadás esetén:
(i) súlyos kombinált immunhiány-betegségben szenvedő (SCID)-egérre átültetett emberi bőrben UV-B fény által okozott bőrsérüléssel szembeni védelemben, és (ii) STZ-diabéteszes patkányokban a meghibásodott sebgyógyulási folyamat helyrehozásában.
(i) 5,0 mg/kg N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleáttal vagy hordozóval ip. kezelt SCID-egérbe transzplantált humán bőrt megvilágítunk 100 mJ/cm2 UV-B fénnyel. 24 óra elteltével bőrbiopsziákat végzünk hisztológiai vizsgálathoz és hsp72-meghatározáshoz immunhisztológiai, illetve Westem-blot-technikák alkalmazásával. Az N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoilklorid-maleáttal történő előkezelés megelőzi az UV-B fény által okozott, klinikailag és hisztológiailag meghatározott bőrsérülést. A lineáris alapmembránon intenzív hsp72-festést lehetett megfigyelni immunfluoreszcens módszerrel, és megnövekedett mennyiségű hsp72-t mértünk az N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleáttal kezelt bőrminták Westem-blot-analízisével.
18.2. Módszerek (ii) Sztreptozocinnal kiváltott (STZ) diabéteszes patkányokat, melyeken részleges vagy teljes bőrvastagságú égési sebeket kreálunk a kétoldali mellkasi szőrtelenített bőrön elektrokauterrel (3 mm átmérőjű, 60 °C; 30, 60 és 90 másodpercig) és helyileg kezelünk 1%, 2% vagy 4% N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleátot tartalmazó krémmel vagy hordozóval, alkalmazunk arra a célra, hogy meghatározzuk a sebgyógyulást önkontroll formájában, a sebszélek összehasonlításával. A seb bezáródását lefényképezzük, és digitális epilumineszcens mikroszkóptechnikát alkalmazunk. A sebek területét mérjük planimetriával 48 órával és 21 nappal az égési sérülés után. A bőrbiopszia-minták hsp72-szintjét Westem-blot-analízissel határozzuk meg.
18.3. Eredmények
A 4% N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleát-tartalmú kenőccsel történő kezelés szignifikánsan (p<0,01) gyorsítja a sebhegesedést, és növeli a hsp72-szintet a bőrbiopszia-mintákban a hordozó kontrollal összehasonlítva.
Eredményeinkből azt a következtetést vonhatjuk le, hogy az N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleátos kezelés védelmet nyújt az UV-behatásból származó sérülésekkel szemben, és potenciális terápiás alkalmazásokkal bír a kóros sebgyógyulással járó állapotok vagy a sebészeti beavatkozások utáni állapotok klinikai kezelésére.
A 20., 21. és 22. ábrákon bemutatjuk az 1%, 2% és 4% N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridinkarboximidoil-klorid-maleát-tartalmú kenőcs hatását a sebgyógyulásra.
A 23., 24. és 25. ábrákon az eredményeket az égési sebek foka szerint mutatjuk be.
A 26. ábrán a kezeletlen és az N-[2-hidroxi-3-(lpiperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleáttal kezelt sebek fényképei láthatók.
A 27. ábrán bemutatjuk a kontrollal és az N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleáttal (B) (1%, 2% és 4%) kezelt sebekből származó egyes biopsziák hsp72-fehéqe-szintjét.
A 28. ábrán a hsp72 fehéije immunhisztokémiai kiértékelése látható az N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleátos (B) kezelés után.
A 29. ábra a SCID-egérből származó, N-[2-hidroxi3-(l -piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleáttal (B) kezelt és kezeletlen (kontroll)bőrminták hsp72-szintjeit ábrázolja.
19. A találmány szerinti hidroxil-amin-származékok HSP72-expressziót növelő hatásának vizsgálata stressznek kitett sejteken
a) A sejttenyésztés körülményei
A vizsgálatokhoz 3T3 egérfíbroblasztsejteket, valamint L-929 egérfíbroblasztsejteket használtunk, mindkettőt MEM-tápfolyadékban egyrétegben tenyésztve, továbbá U-937 humán leukémiasejteket, melyeket RPMI-1640 tápfolyadékban szuszpenzióban tenyésztettünk, és HeLa humán epiteliális sejteket, melyeket DMEM-tápfolyadékban egyrétegben tenyésztettünk.
A sejttenyésztést a 6. példa 6.2. (a) pontja szerinti módon végeztük, azzal a különbséggel, hogy a vizsgálati sejteket az előbbi bekezdésében említett tápfolyadékokban tartottuk fenn.
b) A vizsgálat körülményei
A sejtekkel vizsgálatot végeztünk oly módon, hogy a sejteket a kezelés előtt, illetve az után tettük ki a stressz
HU 222 994 Bl hatásának. A stresszt hőhatással vagy kémiai behatással, higany(II)-klorid alkalmazásával idéztük elő. A hsp72szintet mindig 6 órával az alkalmazott stressz után határoztuk meg. A vizsgált vegyületeket minden esetben 10~5 M végkoncentrációban használtuk a kezelésekhez.
Citotoxicitási vizsgálataink szerint, melyeket 3 napos tesztben végeztünk MTT-kiértékeléssel (Cytotechnology 11:49-58), azt találtuk, hogy valamennyi kísérleti vegyület ID 50%-os gátló koncentrációja IO-4 mólnál nagyobb volt. így a vizsgálatban alkalmazott koncentrációban a vizsgált vegyületeknek nincs számottevő toxikus hatásuk.
19.1. Vizsgálatok hőstresszel
Ezekhez a vizsgálatokhoz 3T3 egérfibroblasztsejteket, továbbá U-937 humán leukémiasejteket és L-929 egérfibroblasztsejteket használtunk.
A 3T3 egérfibroblasztsejtek hőstresszes vizsgálatát a
6. példa 6.2. (c) pontjában leírtak szerint végeztük, azzal az eltéréssel, hogy a stresszt 43 °C-on 30 percig tartó behatással váltottuk ki, és a kísérleti vegyületekkel az egyik variációban 15 perccel a hőstressz előtt, a másik variációban 100 perccel a hőstressz után kezeltük a sejteket.
Az immundetektálás során a hsp72-t felismerő antitest az SPA 810 StressGene, a második antitest pedig a torma-peroxidázzal jelölt A9044 (Sigma) volt. A denzitometriás kiértékelést LKB Ultrascan XL denzitométerrel végeztük.
Az eredményeket a 2. táblázatban és a 3. táblázatban foglaljuk össze.
2. táblázat
A találmány szerinti hidroxil-amin-származékok hsp72-expressziót növelő hatása hőstressznek kitett 3T3 sejteken stresszhatás előtti kezeléssel
Vegyület Relatív hsp72-szint a stressznek kitett kontrolihoz képest
N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-pro- poxi]-3-piridin-karboximidoil-klo- rid-maleát + + +
5,6-Dihidro-5-(l-piperidinil)-metil- 3-(3-piridil)-4H-l,2,4-oxadiazin + + +
3-(3-Piridil)-5-[(l-piperidinil)-metil]-5,6-dihidro-6H-l,4,2-dioxazin(Z)-2-buténdioát (1:1) + +
N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-pro- poxi]-benzimidoil-klorid-monohid- roklorid +
N-[2-hidroxi-3 -(1 -piperidinil)-propoxi]-N’,N’-dietil-3-piridin-karboximid-amid-monohidroklorid + + +
3-(3-Piridil)-5-dietil-amino-metil5,6-dihidro-6H-1,4,2-dioxazin-hidroklorid +
3-Fenil-5-[(l-piperidinil)-metil]5,6-dihidro-6H-1,4,2-dioxazin-hidroklorid + +
Vegyület Relatív hsp72-szint a stressznek kitett kontrolihoz képest
/R/ (+)-N-[2-hidroxi-3-(l-piperidmil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-(Z)-2-buténdioát (1:1) + + +
(-) N-[2-hidroxi-3-( 1 -piperidinil)propoxi]-3 -piridin-karboximidoilklorid-(Z)-2-buténdioát (1:1) + + +
N-[2-hidroxi-3-(piperidinil)-propoxi]-naftalin-l -karboxamid + + +
3-(3-Piridil)-5-t-butil-amino-5,6-di- hidro-6H-l,4,2-dioxazin +
N-(2-hidroxi-3-piperidino-pro- poxi)-etil-uretán +
N-[2-palmitoil-oxi-3-(l-piperi- dinil)-propoxi]-3-piridin-karbo- ximid-amid-monohidroklorid + + +
N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-pro- poxi]-N’-propil-karbatnid + + +
N-(3-klór-fenil)-N’-[2-hidroxi3-( 1 -piperidinilj-propoxi]karbamid + + +
N-(3-piperidino-l-propoxi)-3-piri- din-karboximidoil-klo- rid-dihidroklorid + + +
0-(3-dietil-amino-propoxi)-3-piri- din-karboximidoil-klo- rid-hidroklorid + + +
0-(3-piperidino-propil)-3-nit- ro-benzhidroximoil-klo- 1 rid-hidroklorid + + +
1 - {[3-(t-Butil-amino)-2-hidroxipropoxi]-imino} -l-(m-trifluor-metil-fenil)-etán-acetát + + +
N-[2-hidroxi-3-( 1 -piperidinil)-pro1 poxi]-benzil-uretán 0
I N’-[2-hidroxi-3-(l-metil-l-piperidinium-1 -il)-propoxi]-N-metil-piridinium-3 -karboximidoil-klorid-dijodid + + +
N-hexil-N’-[3-(l-piperidinil)-pro- poxi]-karbamid + +
N-ciklohexil-N’-[2-acetoxi-3-(l-pi- peridinil)-propoxi]-karbamid-hid- roklorid 0
N-[2-hidroxi-3-( 1 -piperidinil)-pro- poxi]-2-nitro-benzimidoil-klorid- monohidroklorid + + +
N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3 -kinolin-karboximid-amiddihidroklorid + + +
N-[2-hidroxi-3-( 1 -piperidinil)-propoxi]-N,N’-difenil-benzamidin 0
HU 222 994 Bl
2. táblázat (folytatás)
Vegyület Relatív hsp72-szint a stressznek kitett kontrolihoz képest
N,N-dimetil-N’-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-N’ ’-fenil-guanidin 0
N,N-dimetil-N’-fenil-N”-[3-(l-pi- peridinil)-propoxi]-guanidin-hid- roklorid + +
N-metil-N-[3-(l-piperidinil)-pro- poxi]-benzamid-hidroklorid +
5,6-Dihidro-3-(4-klór-fenil)-5-[Nmetil-piperidinium-l-il]-metil-4H1,2,4-oxadiazin-jodid + +
Metil- {N-[3-(l-piperidinil)-pro- poxi]}-3-piridin-karboximidát-ma- leát 0
N-metil-N-[3 -(1 -piperidinil)-propoxi]-m-trifluor-metil-benzamid- | hidroklorid + + +
N-[3-(l-piperidinil)-propoxi]-N’- tetrametilén-3-piridin-kar- boxamidin-hidroklorid + + +
N-[3-(l-píperidinil)-propoxi]-N-me- til-N’-(n-hexil)-karbamid 0
3. táblázat
A találmány szerinti hidroxil-amin-származékok hsp72-expressziót növelő hatása hőstressznek kitett 3T3 sejtekre stresszhatás utáni kezeléssel
Vegyület Relatív hsp72-szint a stressznek kitett kontrolihoz képest
N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-pro- poxi]-3-piridin-karboximidoil-klo- rid-maleát 0
N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-pro- poxi]-2-nitro-benzimidoil-klorid- monohidroklorid 0
5,6-Dihidro-5-( 1 -piperidinil)-metil-3-(3-piridil)-4H-1,2,4-oxadiazin 0
O-(3-piperidino-propil)-3-nit- ro-benzhidroximoil-klo- rid-hidroklorid +
N-[2-palmitoil-oxi-3 -(1-piperi- dinil)-propoxi]-3-piridin-karbo- ximid-amid-monohidroklorid +
N-hexil-N’-[2-hidroxi-3-(l-piperi- dinil)-propoxi]-karbamid + + +
N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-naflalin-l-karboxamid + +
|- Vegyület Relatív hsp72-szint a stressznek kitett kontrolihoz képest
N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-4-piridin-karboximidoil-klorid-(Z)-buténdioát (1:1) + +
N ’-[2-hidroxi-3 -(1 -metil-1 -piperidinium-l-il)-propoxi]-N-metil-piridinium-3-karboximidoil-klorid-dijodid + + +
N-[2-hidroxi-3-( 1 -piperidinil)-propoxi]-3-kinolin-karboximid-amiddihidroklorid + + +
A táblázatokban 0 jellel jelöltük azt az esetet, amikor a vizsgált vegyülettel kezelt sejtekben a hsp72 szintje ±20%-kal tért el a stressznek kitett kontroll hsp72 szintjétől, míg a + jel a 21-50%-os, a ++ jel az 51-100%-os, a + + + jel pedig a 100%-ot meghaladó relatív hsp72-szint-növekedésnek felel meg.
Az U-937 humán leukémiasejteken és az L-929 egérfibroblasztsejteken az előbbiekhez hasonló módon végeztük a hőstresszvizsgálatokat, azonban ezúttal a kezelést minden esetben a hőstressz előtt végeztük. Kísérleti vegyületként N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleátot használtunk 10-5 M végkoncentrációban.
A kezelés mindkét esetben több mint 50%-kal fokozta a hőstressz által indukált hsp72-szintet.
19.2. Vizsgálatok kémiai stresszel
Ezeket a vizsgálatokat oly módon végeztük, hogy a stresszt higany(II)-kloriddal provokáltuk. A kísérletekhez HeLa humán epiteliális sejteket és U-937 humán leukémiasejteket használtunk. A kezelést a stresszhatás előtt végeztük. A tesztkultúrák készítése és a vegyületekkel végzett kezelések során ugyanúgy jártunk el, mint a 3T3 sejtekkel végzett vizsgálatoknál. A kezelések után 15 percig 37 °C-on folytattuk az inkubálást, majd a kultúrákat a két kontroll kivételével HgCl2 0,5 mg/ml végső koncentrációjával kezeltük, és az inkubálást tovább folytattuk. Az indukált hsp72 mennyiségét 6 órával a stressz után határoztuk meg. A HgCl2 alkalmazott koncentrációja a maximális kiváltható hspreakció 15—30%-át eredményezte.
A HeLa-sejteken végzett kísérletekben az N-[2-hidroxi-3-( 1 -piperidinil)-propoxi]-benzimidoil-klorid-monohidroklorid több mint 20%-kal, az N-[3-(l-piperidinil)propoxi]-3-nitro-benzimidoil-klorid-monohidroklorid több mint 50%-kal fokozta a stressz által indukált hsp72szintet a stressznek kitett kontrolihoz képest.
Az U-937 sejteken az N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleát több mint 20%-kal fokozta a stressz által indukált hsp72szintet a stressznek kitett kontrolihoz viszonyítva.
19.3. Vizsgálatok primer explantált szöveten
Ezeket a vizsgálatokat patkánylép- és -hereexplantátumokon végeztük, és a stresszt hőhatással idéztük elő a kísérleti vegyületekkel való kezelés után.
HU 222 994 Bl
A patkánylép-sejtszuszpenzióval folytatott kísérleteinket az alábbiak szerint végeztük.
200 g-os CFY-patkányok lépét steril körülmények között eltávolítottuk, és MEM-tápfolyadékban üveghomogenizálóban sejtszuszpenzióvá homogenizáltuk 10% fötális boíjúsavót tartalmazó MEM-tápfolyadékban. A szuszpenzió koncentrációját úgy állítottuk be, hogy 5 ml-je 50-100 mg szövetet tartalmazott. 6 cm átmérőjű szövettenyésztő edényekbe 5 ml sejtszuszpenziót adtunk, és az explantátumokat 5% CO2-0t tartalmazó párásított levegőjű termosztátban 37 °C-on 1 órán át inkubáltuk, majd a vizsgált anyagok 10~5 M koncentrációjával kezeltük a mintákat. További 15 percig tartó 37 °C-os inkubálás után az explantátumokat 30 percre 43 °C-os termosztátba helyezve hősokknak tettük ki. Az indukált hsp72 mennyiségét további 6 órás, 37 °C-os inkubálás után határoztuk meg.
Eredményeinket a 4. táblázat tartalmazza, ahol a hsp-szint-növekedést ugyanolyan skálán vettük fel, mint a 2. és 3. táblázatban.
4. táblázat
A találmány szerinti hidroxil-amin-származékok hsp72-expressziót növelő hatása hőstressznek kitett patkánylépszövet-explantátumon
I Vegyület Relatív hsp72-szint a stressznek kitett kontrolihoz képest
N-{3-[(l,l -dimetil-etil)-amino]-2hidroxi-propoxi} -3-trifluor-metíl-benzamid +
N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-pro- poxi]-N’-heptil-karbamid + + +
N-(3-klór-fenil)-N’-[2-hidroxi- 3-(l-piperidinil)-propoxi]- karbamid + + +
5,6-Dihidro-5-(l-piperidinil)- metil-3-(3-piridil)-4H-l,2,4- oxadiazin 0
A patkányhere-explantátummal folytatott kísérleteinket az alábbiak szerint végeztük.
200 g-os patkányok heréjét steril körülmények között eltávolítottuk, és a kiszabadított herecsatomákat 10% fötális boíjúsavót tartalmazó MEM-tápfolyadékban szuszpendáltuk, úgy, hogy 5 ml szuszpenzió 50-100 mg szövetet tartalmazott. Az explantátumokat 5% CO2-tartalmazó párásított levegőjű termosztátban 37 °C-on 1 órán keresztül inkubáltuk, majd a vizsgált anyagok 10~5 M koncentrációjával kezeltük a mintákat. További 15 percig, 37 °C-on végzett inkubálás után az explantátumokat 30 percre 43 °C-os termosztátba helyezve hősokknak tettük ki. Az indukált hsp72 mennyiségét további 6 órás, 37 °C-on végzett inkubálás után határoztuk meg.
A kapott eredményeket az 5. táblázatban foglaljuk össze, ahol a hsp-szint növekedését ugyanolyan skálán jelezzük, mint a 4. táblázatban.
5. táblázat
A találmány szerinti hidroxil-amin-származékok hsp72-expressziót növelő hatása hőstressznek kitett patkányhereszövet-explantátumon
p— Vegyület Relatív hsp72-szint a stressznek kitett kontrolihoz képest
N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-pro- poxi]-3-piridin-karboximidoil-klo- rid-maleát + + +
5,6-Dihidro-5-(l-piperidinil)-tnetil-3-(3-piridil)-4H-1,2,4-oxadiazin + +
N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-pro- poxi]-benzimidoil-klorid-monohid- roklorid + + +
N- {3-[(1 ,l-dimetil-etil)-amino]-2hidroxi-propoxi} -3-trifluor-metil-benzamid 0
N-[2-benzil-oxi-3-( 1 -piperidil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-(Z)-2-buténdioát (1:1) + +
3-(3-Piridil)-5-dietil-amino-metil5,6-dihidro-6H-1,4,2-dioxazin-hidroklorid + +
N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-pro- poxi]-4-acetamido-benzamidin-mo- nohidroklorid 0
3-(3-Piridil)-5-t-butil-amino-5,6-di| hidro-6H-l,4,2-dioxazin 0
N-[2-palmitoil-oxi-3-( 1-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karbo- | ximid-amid-monohidroklorid 0
N-hexil-N’ -[2-hidroxi-3-( 1 -piperidinil)-propoxi]-karbamid + +
N-(3-piperidino-l-propoxi)-3-piri- din-karboximidoil-klo- rid-dihidroklorid + +
O-(3-dietil-amino-propoxi)-3-piri- din-karboximidoil-klo- rid-hidroklorid 0
0-(3-piperidino-propil)-3-nit- ro-benzhidroximoil-klo- rid-hidroklorid + +
1 - {[3-(t-Butil-amino)-2-hidroxi- propoxi]-imino}-l-(m-trifluor-me- til-fenil)-etán-acetát +
Ν- {3-[ 1 ,l-dimetil-etil)-amino]-2hidroxi-propoxi} -3-tri-fluor-metil-benzimidoil- klorid-monohidroklorid +
N-[3-(dietil-amino)-2-hidroxi-pro- poxi]-3-trifluor-metil-benzimidoil- | klorid-monohidroklorid +
N-[2-palmitoil-oxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3 -piridin-karbo- 1 ximidoil-klorid-dihidroklorid + + +
HU 222 994 Bl
5. táblázat (folytatás)
Vegyület Relatív hsp72-szint a stressznek kitett kontrolihoz képest
N-hexil-N’-[3-(l-piperidinil)-pro- poxij-karbamid 0
N-[2-hidroxi-3 -(1 -piperidinil)-pro- poxi]-3-nitro-benzimidoil-klorid- monohidroklorid +
N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-pro- poxi]-2-nitro-benzimidoil-klorid- monohidroklorid + +
N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-pro- poxi]-N’-heptil-karbamid + +
N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-pro- poxi]-l-izokinolin-karboximid- amid-dihidroklorid + + +
N-metil-N-[3 -(1 -piperidinil)-propoxi]-benzamid-hidroklorid +
5,6-Dihidro-3-(4-klór-fenil)-5-[Nmetil-piperidinium-l-il]-metil-4H1,2,4-oxadiazin-jodid +
N-[3-(l-piperidinil)-propoxi]-tio- fén-2-karboximidoil-klorid- hidroklorid + +
20. Genetikusán hipertóniás patkányok torakális aortájának HSP70 mRNS-szint-mérése
a) A kezelések körülményei
A genetikusán hipertóniás patkányokat 4 csoportra osztottuk, és csoportonként 4-4 állatot kezeltünk.
Az első csoportot fiziológiás sóoldattal (kontroll), a másodikat N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleáttal (20 mg/kg) 8 napig, a harmadikat N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-benzimidoil-klorid-monohidrokloriddal (5 mg/kg) 20 napig, a negyediket N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-2tiofén-karboximidoil-klorid-monohidrokloriddal (5 mg/kg) 20 napig naponta orálisan kezeltük. Ezután az állatokat leöltük, aortájukat izoláltuk, és cseppfolyós nitrogénben azonnal lefagyasztottuk, és felhasználásig -70 °C-on tároltuk a felhasználásig.
b) A torakális aorták morfológiai vizsgálata
A vizsgálatot a szakirodalom szerinti módszerrel végeztük (Br. J. of Pharmacol., 1995; 115, 415-420). A patkányok torakális aortájából 1 mm2-es aortafaldarabokat vágtunk ki, amelyeket 2 órán át fixáltunk szobahőmérsékleten 2,5%-os glutáraldehiddel. Ezt követte egy 1%-os ozmium-tetroxidos utófixálás, amely 1 órán át tartott. Ezután a szövetdarabokat etanollal dehidratáltuk, és Durcupan ACM-be ágyaztuk. A metszeteket kvalitatív módon értékeltük ki Hitachi 7100-as elektronmikroszkópon készített felvétel alapján.
Azt találtuk, hogy a kezelés hatására az N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleát esetében közepes, az N-[2-hidroxi3-(l-piperidinil)-propoxi]-benzimidoil-klorid-monohidroklorid és az N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]2-tiofén-karboximidoil-klorid-monohidroklorid esetében kifejezetten erős mértékben regenerálódtak az aortafal sejtjei.
c) A hsp70-szint mennyiségi meghatározása
A vizsgálatokat a kvantitatív reverz transzkripció polimeráz-láncreakcó (QRT-PCR) elve alapján végeztük. Ennek lényege, hogy ha a polimeráz-láncreakció során azonos reakcióelegyben két egymáshoz nagyon hasonló, de valamilyen módon megkülönböztethető templátot sokszorozunk, akkor azok egymáshoz viszonyított aránya nem változik a reakció során. így, ha az egyik templát kiinduló mennyisége a polimeráz-láncreakció előtt ismert, és a két templátról származó termékek aránya a PCR-amplifikáció után megismerhető, akkor az ismeretlen templát mennyisége kiszámítható a kiindulási mintában. A leggyakrabban alkalmazott eljárás az, amikor az ismert templát (kompetitor) a meghatározni kívánt és templátként alkalmazott (target) nukleinsavtól csak annyiban különbözik, hogy a kompetitor rövidebb, mint a target, ezáltal a róla készült termék egyszerű, méret alapján történő szeparálással elkülöníthető a targetről készült terméktől.
A szervekből guanidinium-izotiocianátos módszerrel (Chomczynski P. and Sacchi N.: Anal. Biochem. 162: 156,1987) izoláltuk az RNS-t. A nukleinsav-koncentrációt spektrofotométerrel, minőségét agaróz-gélelektroforézissel, denaturáló körülmények között ellenőriztük (Shambrook J. et al.: Molecular Cloning. A Laboratory Manual. Cold Spring Harbour Laboratory Press, 1989). Az izolált RNS-t -70 °C-on tároltuk.
A hsp70 gént kódoló cDNS-ből olyan DNS-darabot állítottunk elő, amelyből egy intemális darabot kimetszettünk (PCR-splicing, például Riedy MC et al.: BioTechniques 18:70, 1995). A megrövidített DNS-t a fragment extemális részéhez specifikusan kapcsolódó oligonukleotidprimerek segítségével megsokszoroztuk (Erlich A.: PCR Technology. Principles and Applications fór DNA Amplification. Stockton Press, 1989), majd a koncentráció meghatározása után -70 °C-on tároltuk.
A reverz transzkripciót oligo-dT-primer (dT16) segítségével, mintánként 1 mg izolált RNS felhasználásával, standard körülmények között (Shambrook J. et al. id. műve) hajtottuk végre.
Az RNS-mintákból előállított cDNS-ekből azonos mennyiségeket változó mennyiségű (3,10-szeres hígítási sorozatból származó) szintetikus kompetitorral kevertük össze, és a polimeráz-láncreakcó segítségével megsokszoroztuk őket. A ciklusok (40-60) során alkalmazott hőmérsékletek és időtartamok a következők voltak: denaturálás (95 °C, 1 perc), összekapcsolódás (58 °C, 1 perc), szintézis (72 °C, 0,5 perc).
A PCR végén a termékeket agarózgélen (1%) szeparáltuk, és az egymástól elválasztott DNS-darabokat etidium-bromiddal megfestettük standard körülmények között (Sambrook J. et al. id. műve). A megfestett DNSdarabokat UV-transzilluminátoron láthatóvá téve lefényképeztük (Polaroid film, 665-ös típus). A PCR-termékek mennyiségét a fényképek negatívjának denzitometrálásával határoztuk meg.
HU 222 994 Bl
A denzitometrálás eredményei alapján meghatároztuk a target kompetitor arányokat, majd a kompetitor mennyiségének ismeretében grafikusan kiszámítottuk az egyes mintákban lévő target mennyiségét.
Azt tapasztaltuk, hogy az N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleáttal, az N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-benzimidoilklorid-monohidrokloriddal és az N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-2-tiofén-karboximidoil-kloridmonohidrokloriddal kezelt patkányok torakális aortájában a hsp70 szintje több mint 50%-kal haladta meg a kontrolinál talált hsp70-szintet.
21. Bőröregedés gátlásának vizsgálata tengerimalacon
A találmány szerinti hidroxil-amin-származékok bőröregedés-gátló hatását tengerimalacokon vizsgáltuk. 5-5 tengerimalac bőrét depiláltuk, majd az állatok mindkét oldalát 1 cm2 nagyságú területen 100 mJ/cm2 erősségű UV-B-sugárzásnak vetettük alá. A besugárzás után az állatok egyik oldalát a 10. példa szerinti összetételű krémmel kentük be, amely mintánként 5 tömeg% N-[2hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxi]-3-piridin-karboximidoil-klorid-maleátot, N-[2-hidroxi-3-(l-piperidinil)-propoxij-benzimidoil-klorid-monohidrokloridot, illetve N[2-hidroxi-3-piperidinil)-propoxi]-2-nitro-benzimidoilklorid-monohidrokloridot tartalmazott hatóanyagként, az állatok másik oldalát hatóanyag nélküli keverékkel kentük be. A kísérleti felállítás önkontrollos volt.
Az állatoknál a kezelést közvetlenül a besugárzás után megkezdtük, majd két héten át naponta kétszer megismételtük.
Az UV-B-besugárzás hatására a bőrfelület súlyosan károsodott (vesicula, bulla, hámsérülés, sebesedés), amely a találmány szerinti készítményekkel történt kezelés után 4 nappal hamarabb gyógyult, és a seb nagysága lényegesen kisebb volt, mint kezelés nélkül. A vegyületek hámosító hatást fejtettek ki.
A kísérlet azt mutatja, hogy a kezelt állatok bőrének UV-B-sugárzással szembeni ellenállása megnőtt, a bőr regenerálódása javult.

Claims (64)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. (I) általános képletű hidroxil-amin-származék vagy (II) általános képletű tautomer alakja vagy ezek sóinak és/vagy optikailag aktív sztereoizomeqeinek, mely általános képletekben
    A jelentése alkil-, szubsztituált alkil, aralkil-, az arilés/vagy az alkilrészében szubsztituált aralkil-, aril-, szubsztituált aril-, heteroaril- vagy szubsztituált heteroarilcsoport,
    Z jelentése kovalens kötés, oxigénatom vagy =NR3-csoport, ahol R3 jelentése hidrogénatom, alkil-, szubsztituált alkil-, aril-, szubsztituált aril-, aralkil- és az aril- és/vagy alkilrészében szubsztituált aralkilcsoport lehet,
    R jelentése alkil- vagy szubsztituált alkilcsoport,
    X jelentése az (I) általános képletű tautomerben halogénatom vagy szubsztituált hidroxilcsoport, amino-, monoszubsztituált vagy diszubsztituált aminocsoport, és
    X jelentése a (II) általános képletű tautomerben oxigénatom, imino- vagy szubsztituált iminocsoport,
    R’ jelentése hidrogénatom, alkil-, szubsztituált alkil-, aril-, szubsztiutált aril-, aralkil-, az aril- és/vagy az alkilrészében szubsztituált aralkilcsoport, acil- vagy szubsztituált acilcsoport, és az (I) általános képletű vegyületek adott esetben egy intramolekuláris gyűrűs szerkezetet tartalmaznak X és egy reaktív szubsztituens összekapcsolódása által, alkalmazása olyan gyógyszerkészítmények előállítására, melyek fiziológiai stressznek kitett sejtek által kifejezett molekuláris chaperon expresszióját a fiziológiai stressz által indukált mennyiség fölé növelik.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy az eukariótasejtnek a fiziológiai stressz beállta után történő kezelésére alkalmas gyógyszerkészítmény előállítására történik.
  3. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az eukariótasejtnek a fiziológiai stressz beállta előtt történő kezelésére alkalmas gyógyszerkészítmény előállítására történik.
  4. 4. (I) általános képletű hidroxil-amin-származék vagy (II) általános képletű tautomer alakja vagy ezek sóinak és/vagy optikailag aktív sztereoizomeqeinek, mely általános képletekben
    A jelentése alkil-, szubsztituált alkil, aralkil-, az arilés/vagy az alkilrészében szubsztituált aralkil-, aril-, szubsztituált aril-, heteroaril- vagy szubsztituált heteroarilcsoport,
    Z jelentése kovalens kötés, oxigénatom vagy =NR3-csoport, ahol R3 jelentése hidrogénatom, alkil-, szubsztituált alkil-, aril-, szubsztituált aril-, aralkil- és az arilés/vagy alkilrészében szubsztituált aralkilcsoport lehet, R jelentése alkil- vagy szubsztituált alkilcsoport,
    X jelentése az (I) általános képletű tautomerben halogénatom vagy szubsztituált hidroxilcsoport, amino-, monoszubsztituált vagy diszubsztituált aminocsoport és X jelentése a (II) általános képletű tautomerben oxigénatom, imino- vagy szubsztituált iminocsoport,
    R’ jelentése hidrogénatom, alkil-, szubsztituált alkil-, aril-, szubsztiutált aril-, aralkil-, az aril- és/vagy az alkilrészében szubsztituált aralkilcsoport, acil- vagy szubsztituált acilcsoport, és az (I) általános képletű vegyületek adott esetben egy intramolekuláris gyűrűs szerkezetet tartalmaznak X és egy reaktív szubsztituens összekapcsolódása által, alkalmazása olyan gyógyszerkészítmények előállítására, melyek fiziológiai stressznek kitett eukariótasejtekben a stressz által indukált molekuláris chaperon aktivitását a fiziológiai stressz által indukált aktivitás fölé növelik.
  5. 5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, amelyben a fiziológiai stressznek kitett eukariótasejt egy emlőssejt.
  6. 6. Az 5. igénypont szerint alkalmazás, amelyben az emlőssejt egy humán sejt.
  7. 7. Az 5. vagy 6. igénypont szerinti alkalmazás, amelyben az eukariótasejt egy élő szervezet sejtje.
    HU 222 994 Bl
  8. 8. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, amelyben a sejt egy idegsejt, izomsejt, az érfal sejtje, különösen endoteliális sejt, epiteliális sejt vagy az immunrendszer sejtje.
  9. 9. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, amelyben a fiziológiai stressznek kitett eukariótasejt egy növényi sejt.
  10. 10. A 9. igénypont szerinti alkalmazás, amelyben a növényi sejt egy élő növényi szervezet sejtje.
  11. 11. Az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol a fiziológiai stressz metabolikus, oxidatív, lokális mechanikus stressz vagy hipoxia, ischaemia, hőhatás, sugárzás vagy mérgező anyagok által okozott stressz.
  12. 12. All. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a metabolikus stressz diabetes mellitus által okozott stressz.
  13. 13. Az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol a fiziológiai stressz reaktív szabadgyökök képződéséhez vagy a sejt körüli citokinek mennyiségének növekedéséhez vezet.
  14. 14. Az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol a fiziológiai stressz kardiovaszkuláris, vaszkuláris, agyi, allergiás, immun-, autoimmun, vírusvagy bakteriális fertőzés okozta betegségek, daganatos vagy kültakaró- és/vagy nyálkahártya-betegségek vagy a vesetubulusok hámsejteredetű betegsége kialakulásához vagy kozmetikai beavatkozással kezelhető állapothoz vezet.
  15. 15. A 14. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a kardiovaszkuláris betegség fiziológiai stressz által provokált atherosclerosis, koronáriaartéria-betegség, hipertónia vagy kis vérköri hipertónia következménye.
  16. 16. A 14. igénypont szerinti alkalmazás, ahol az agyi betegség fiziológiai stressz által provokált cerebrovaszkuláris ischaemia, stroke, traumatikus fejsérülés, időskori neurodegeneratív betegség, különösen szenilis demenciák, AIDS-demencia, alkoholdemenciák, Alzheimer-kór, Parkinson-kór vagy epilepszia következménye.
  17. 17. A 14. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a kültakaró- és/vagy nyálkahártya-betegség fiziológiai stressz által provokált dermatológiai betegség vagy a gasztrointesztinális rendszer fiziológiai stressz által provokált fekélyes betegsége.
  18. 18. Az 1-17. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, amelyben a molekuláris chaperon egy hősokkfehéije (hsp).
  19. 19. A 18. igénypont szerinti alkalmazás, amelyben a molekuláris chaperon a hsp70 vagy hsp72.
  20. 20. (I) általános képletű hidroxil-amin-származék vagy (II) általános képletű tautomer alakja vagy ezek sóinak és/vagy optikailag aktív sztereoizomerjeinek, mely általános képletekben
    A jelentése alkil-, szubsztituált alkil, aralkil-, az arilés/vagy az alkilrészében szubsztituált aralkil-, aril-, szubsztituált aril-, heteroaril- vagy szubsztituált heteroarilcsoport,
    Z jelentése kovalens kötés, oxigénatom vagy =NR3-csoport, ahol R3 jelentése hidrogénatom, alkil-, szubsztituált alkil-, aril-, szubsztituált aril-, aralkil- és az arilés/vagy alkilrészében szubsztituált aralkilcsoport lehet,
    R jelentése alkil- vagy szubsztituált alkilcsoport,
    X jelentése az (I) általános képletű tautomerben halogénatom vagy szubsztituált hidroxilcsoport, amino-, monoszubsztituált vagy diszubsztituált aminocsoport és X jelentése a (II) általános képletű tautomerben oxigénatom, imino- vagy szubsztituált iminocsoport,
    R’ jelentése hidrogénatom, alkil-, szubsztituált alkil-, aril-, szubsztituált aril-, aralkil-, az aril- és/vagy az alkilrészében szubsztituált aralkilcsoport, acil- vagy szubsztituált acilcsoport, és az (I) általános képletű vegyületek adott esetben egy intramolekuláris gyűrűs szerkezetet tartalmaznak X és egy reaktív szubsztituens összekapcsolódása által, alkalmazása a chaperonrendszer működésével kapcsolatos betegség vagy egy sejt vagy egy sejtorganellum membránjának károsodásához társult betegség kezelésére, adott esetben megelőzésére alkalmas gyógyászati készítmények vagy adott esetben kozmetikai készítmények előállítására.
  21. 21. A 20. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a patológiás állapot ischaemia, daganatos betegség, patogén mikroorganizmus által okozott fertőzés, egy autoimmun betegség vagy egy dermatológiai megbetegedés.
  22. 22. A 20. igénypont szerinti alkalmazás a szívizomzat, az agyszövetek és a vese ischaemia által okozott szövetkárosodástól és/vagy szövetelhalástól való védelmére alkalmas gyógyászati készítmény előállítására.
  23. 23. A 20-22. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás humán szervezet kezelésére alkalmas gyógyászati vagy kozmetikai készítmény előállítására.
  24. 24. A 20-23. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás kardiovaszkuláris, vaszkuláris, agyi, allergiás, immun-, autoimmun, vírus- vagy bakteriális fertőzés okozta betegségek, daganatos vagy kültakaró- és/vagy nyálkahártya-betegségek vagy a vesetubulusok hámsejteredetű betegségei kezelésére szolgáló gyógyszerkészítmény, valamint adott esetben kozmetikai készítmény előállítására.
  25. 25. Az 1-24. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy olyan (I) általános képletű hidroxil-amin-származékokat használunk, amelyekben R jelentése alkilcsoport vagy szubsztituált alkilcsoport, és
    a) Z jelentése kovalens kötés és X jelentése halogénatom;
    b) Z jelentése kovalens kötés és X jelentése -OQ szubsztituált hidroxilcsoport, ahol Q jelentése egy szénhidrogéncsoport, és adott esetben a vegyület egy intramolekuláris gyűrűt képez X és egy reaktív R szubsztituens összekapcsolódásával,
    c) Z jelentése kovalens kötés és X jelentése -NRW-csoport, ahol R1 és R2 jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom, szubsztituálatlan vagy szubsztituált egyenes vagy elágazó láncú alkilcsoport, cikloalkilcsoport, vagy
    R1 és R2 együttesen, a szomszédos nitrogénatommal együtt 3-7 tagú telített gyűrűt képez, és adott esetben a vegyület egy intramolekuláris gyűrűt alkot X és egy reaktív szubsztituens összekapcsolódása révén;
    HU 222 994 Bl
    d) Z jelentése oxigénatom és X jelentése -OQ szubsztituált hidroxilcsoport, ahol Q jelentése egy szénhidrogéncsoport;
    e) Z jelentése oxigénatom és X jelentése -NR]R2csoport, ahol R1 és R2 jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom, szubsztituálatlan vagy szubsztituált egyenes vagy elágazó láncú alkilcsoport, cikloalkilcsoport, vagy
    R1 és R2 együttesen, a szomszédos nitrogénatommal együtt 3-7 tagú telített gyűrűt képez;
    f) Z jelentése =NR3 képletű csoport, ahol R3 jelentése hidrogénatom, szubsztituálatlan vagy szubsztituált alkilcsoport, szubsztituálatlan vagy szubsztituált arilcsoport vagy szubsztituálatlan vagy az alkil- és/vagy arilrészében szubsztituált aralkilcsoport, és X jelentése -NR'R^csoport, ahol R1 és R2 jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom, szubsztituálatlan vagy szubsztituált egyenes vagy elágazó láncú alkilcsoport, cikloalkilcsoport, vagy
    R1 és R2 együttesen, a szomszédos nitrogénatommal együtt 3-7 tagú telített gyűrűt képez.
  26. 26. A 25. igénypont szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy olyan (I) általános képletű vegyületeket használunk, amelyekben R jelentése Ω-amino-alkil-csoport, amely adott esetben az aminocsoportján és/vagy az alkilláncában szubsztituálva van, és alkillánca, amely előnyösen 3-8 szénatomos egyenes vagy elágazó alkillánc, adott esetben hidroxil- vagy acil-oxi-csoporttal van helyettesítve.
  27. 27. A 25. vagy 26. igénypont szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy olyan (I) általános képletű vegyületeket használunk, amelyekben R jelentése az aminocsoporton mono- vagy diszubsztituált Ω-amino-alkil-csoport, mely egymástól független aminoszubsztituensként egy vagy két lineáris vagy elágazó alkilcsoportot vagy cikloalkilcsoportot tartalmazhat, vagy amelynek két aminoszubsztituense együttesen, a közrezárt N-atommal együtt egy 3-7 tagú, előnyösen 5-7 tagú, adott esetben további heteroatomot tartalmazó telített heterogyűrűt képez.
  28. 28. A 25-27. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy olyan (I) általános képletű vegyületet használunk, amelyben Z jelentése kovalens kötés és X jelentése halogénatom, előnyösen klórvagy brómatom, és A jelentése szubsztituálatlan vagy az aril- és/vagy az alkilrészében szubsztituált aralkilcsoport, szubsztituálatlan vagy szubsztituált arilcsoport vagy heteroarilcsoport.
  29. 29. A 28. igénypont szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy olyan (I) általános képletű vegyületet használunk, amelyben A jelentése helyettesítetlen vagy helyettesített fenil-alkil-csoport, mely egy vagy több helyettesítőt, előnyösen alkoxicsoportot tartalmaz, vagy helyettesítetlen vagy halogénatommal, alkil-, alkoxivagy halogén-alkil-csoporttal vagy nitrocsoporttal helyettesített fenilcsoport, naftilcsoport vagy N-tartalmú heteroarilcsoport, mely adott esetben egy benzolgyűrűvel van kondenzálva, előnyösen piridilcsoport, vagy S-tartalmú heteroarilcsoport vagy O-tartalmú heteroarilcsoport.
  30. 30. A 25-27. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy olyan (I) általános képletű vegyületet használunk, amelyben Z jelentése kovalens kötés és X jelentése -OQ képletű szubsztituált hidroxilcsoport, ahol Q jelentése szubsztituálatlan vagy szubsztituált egyenes vagy elágazó láncú alkilcsoport vagy szubsztituálatlan vagy az aril- és/vagy az alkilrészében szubsztituált aralkilcsoport, és A jelentése heteroarilcsoport, előnyösen N-tartalmú heteroarilcsoport.
  31. 31. Az 1 -24. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy olyan (Γ) általános képletű hidroxil-amin-származékokat használunk, amelyekben R” jelentése alkilcsoport vagy szubsztituált alkilcsoport, és
    A jelentése szubsztituálatlan vagy szubsztituált arilcsoport vagy heteroarilcsoport.
  32. 32. A 31. igénypont szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy olyan (Γ) általános képletű vegyületet használunk, amelyben R” jelentése Ω-amino-alkil-csoport, amely adott esetben az aminocsoportján és/vagy az alkilláncában szubsztituálva van, és előnyösen 1-5 szénatomos egyenes vagy elágazó alkilláncot tartalmaz.
  33. 33. A 31. vagy 32. igénypont szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy olyan (Γ) általános képletű vegyületet használunk, amelyben R” jelentése az aminocsoporton mono- vagy diszubsztituált Ω-amino-alkil-csoport, mely egymástól független aminoszubsztituensként egy vagy két lineáris vagy elágazó alkilcsoportot vagy cikloalkilcsoportot tartalmazhat, vagy amelynek két aminoszubsztituense együttesen, a közrezárt N-atommal együtt egy 3-7 tagú, előnyösen 5-7 tagú, adott esetben további heteroatomot tartalmazó telített heterogyűrűt képez.
  34. 34. A 25-27. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy olyan (I) általános képletű vegyületet használunk, amelyben Z jelentése kovalens kötés és X jelentése -NR'R^csoport, ahol R1 és R2 jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom, szubsztituálatlan vagy szubsztituált egyenes vagy elágazó láncú alkilcsoport, cikloalkilcsoport, vagy
    R1 és R2 együttesen, a szomszédos nitrogénatommal együtt 3-7 tagú, előnyösen 5-7 tagú telített gyűrűt képez, és
    A jelentése szubsztituálatlan vagy az aril- és/vagy az alkilrészében szubsztituált aralkilcsoport vagy szubsztituálatlan vagy szubsztituált arilcsoport vagy heteroarilcsoport.
  35. 35. A 34. igénypont szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy olyan (I) általános képletű vegyületet használunk, amelyben A szubsztituálatlan vagy egy vagy több szubsztituenssel, előnyösen a fenilrészben alkoxicsoporttal szubsztituált fenil-alkil-csoport, vagy szubsztituálatlan vagy egy vagy több alkilcsoporttal, halogénatommal, alkoxi-, halogén-alkil-, nitro- vagy acil-amino-csoporttal szubsztituált fenilcsoport, vagy naftilcsoport, vagy N-tartalmú heteroarilcsoport, mely adott esetben egy benzolgyűrűvel van kondenzálva, előnyösen piridilcsoport, vagy S-tartalmú heteroaril- vagy O-tartalmú heteroarilcsoport.
  36. 36. Az 1 -24. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy olyan (I”) általános kép57
    HU 222 994 Bl letű hidroxil-amin-származékokat használunk, amelyekben A jelentése szubsztituálatlan vagy szubsztituált arilcsoport vagy heteroarilcsoport, R” jelentése alkilcsoport vagy szubsztituált alkilcsoport, és
    R1 jelentése hidrogénatom, szubsztituálatlan vagy szubsztituált egyenes vagy elágazó láncú alkilcsoport, cikloalkilcsoport, szubsztituálatlan vagy az alkil- és/vagy az arilrészében szubsztituált aralkilcsoport.
  37. 37. A 36. igénypont szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy olyan (I”) általános képletű vegyületet használunk, amelyben R” jelentése Ω-amino-alkil-csoport, amely adott esetben az aminocsoportján és/vagy az alkilláncában szubsztituálva van, és előnyösen 1-5 szénatomos egyenes vagy elágazó alkilláncot tartalmaz.
  38. 38. A 36. vagy 37. igénypont szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy olyan (I”) általános képletű vegyületet használunk, amelyben R” jelentése az aminocsoporton mono- vagy diszubsztituált Ω-amino-alkil-csoport, mely egymástól független aminoszubsztituensként egy vagy két lineáris vagy elágazó alkilcsoportot vagy cikloalkilcsoportot tartalmazhat, vagy amelynek két aminoszubsztituense együttesen, a közrezárt N-atommal együtt egy 3-7 tagú, előnyösen 5-7 tagú, adott esetben további heteroatomot tartalmazó telített heterogyűrűt képez.
  39. 39. A 36-38. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy olyan (I”) általános képletű vegyületet használunk, amelyben
    A jelentése szubsztituálatlan vagy egy vagy több alkilcsoporttal, halogénatommal, alkoxi-, amino-, halogén-alkil- vagy nitrocsoporttal szubsztituált fenilcsoport, naftilcsoport, vagy adott esetben egy benzolgyűrűvel kondenzált N-tartalmú heteroarilcsoport, O-tartalmú heteroarilcsoport vagy S-tartalmú heteroarilcsoport.
  40. 40. A 25-27. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy olyan (I) általános képletű vegyületet használunk, amelyben Z jelentése oxigénatom és X jelentése egy -OQ szubsztituált hidroxilcsoport, amelyben Q jelentése szubsztituálatlan vagy szubsztituált egyenes vagy elágazó láncú alkilcsoport, előnyösen egy 1-4 szénatomos alkilcsoport vagy szubsztituálatlan vagy az aril- és/vagy az alkilrészében szubsztituált aralkilcsoport, és
    A jelentése szubsztituálatlan vagy szubsztituált egyenes vagy elágazó láncú alkilcsoport vagy szubsztituálatlan vagy az aril- és/vagy az alkilrészében szubsztituált aralkilcsoport.
  41. 41. A 25-27. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy olyan (I) általános képletű vegyületet használunk, amelyben Z jelentése oxigénatom és X jelentése -NR'R2-csoport, ahol R1 és R2 jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom, szubsztituálatlan vagy szubsztituált egyenes vagy elágazó láncú alkilcsoport, cikloalkilcsoport vagy szubsztituálatlan vagy szubsztituált arilcsoport, előnyösen fenilcsoport, vagy R1 és R2 együttesen, a szomszédos nitrogénatommal együtt
    3-7 tagú, előnyösen 5-7 tagú telített gyűrűt képez, és
    A jelentése szubsztituálatlan vagy szubsztituált egyenes vagy elágazó láncú alkilcsoport, szubsztituálatlan vagy szubsztituált arilcsoport, előnyösen fenilcsoport vagy szubsztituálatlan vagy az aril- és/vagy az alkilrészében szubsztituált aralkilcsoport.
  42. 42. A 25-27. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy olyan (I) általános képletű vegyületet használunk, amelyben Z jelentése =NR3 képletű csoport, ahol R3 jelentése hidrogénatom, szubsztituálatlan vagy szubsztituált egyenes vagy elágazó láncú alkilcsoport, szubsztituálatlan vagy szubsztituált arilcsoport vagy szubsztituálatlan vagy az alkil- és/vagy arilrészében szubsztituált aralkilcsoport, és X jelentése -NR'R2-csoport, ahol R1 és R2 jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom, szubsztituálatlan vagy szubsztituált egyenes vagy elágazó láncú alkilcsoport, cikloalkilcsoport vagy szubsztituálatlan vagy szubsztituált arilcsoport, előnyösen fenilcsoport, vagy R1 és R2 együttesen, a szomszédos nitrogénatommal együtt 3-7 tagú, előnyösen 5-7 tagú telített gyűrűt képez, és
    A jelentése szubsztituálatlan vagy szubsztituált egyenes vagy elágazó láncú alkilcsoport, szubsztituálatlan vagy szubsztituált arilcsoport vagy szubsztituálatlan vagy az aril- és/vagy az alkilrészében szubsztituált aralkilcsoport.
  43. 43. Az 1-24. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy olyan (II) általános képletű hidroxil-amin-származékokat használunk, amelyekben R jelentése alkilcsoport vagy szubsztituált alkilcsoport, és
    a) Z jelentése kovalens kötés és X jelentése oxigénatom;
    b) Z jelentése kovalens kötés és X jelentése =NR4 képletű csoport, ahol R4 jelentése hidrogénatom vagy szubsztituálatlan vagy szubsztituált alkil- vagy aralkilcsoport vagy cikloalkilcsoport;
    c) Z jelentése oxigénatom és X jelentése oxigénatom;
    d) Z jelentése oxigénatom és X jelentése =NR4 képletű csoport, ahol R4 jelentése szubsztituálatlan vagy szubsztituált alkil-, aralkil- vagy arilcsoport vagy heteroarilcsoport;
    e) Z jelentése =NR3 képletű csoport, ahol R3 jelentése hidrogénatom, szubsztituálatlan vagy szubsztituált alkil-, aril- vagy aralkilcsoport, és X jelentése oxigénatom;
    f) Z jelentése =NR3 képletű csoport, ahol R3 jelentése hidrogénatom, szubsztituálatlan vagy szubsztituált alkil-, aril- vagy aralkilcsoport, és X jelentése =NR4 képletű csoport, ahol R4 jelentése hidrogénatom vagy szubsztituálatlan vagy szubsztituált alkil- vagy aralkilcsoport vagy cikloalkilcsoport.
  44. 44. A 43. igénypont szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy olyan (II) általános képletű vegyületeket használunk, amelyekben R jelentése Ω-amino-alkil-csoport, amely adott esetben az aminocsoportján és/vagy az alkilláncában szubsztituálva van, és alkillánca, amely előnyösen 3-8 szénatomos egyenes vagy elágazó alkillánc, adott esetben hidroxil- vagy acil-oxi-csoporttal van helyettesítve.
  45. 45. A 43. vagy 44. igénypont szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy olyan (II) általános képletű ve58
    HU 222 994 Bl gyületeket használunk, amelyekben R jelentése az aminocsoporton mono- vagy diszubsztituált Ω-amino-alkil-csoport, mely egymástól független aminoszubsztituensként egy vagy két lineáris vagy elágazó alkilcsoportot vagy cikloalkilcsoportot tartalmazhat, vagy amelynek két aminoszubsztituense együttesen, a közrezárt N-atommal együtt egy 3-7 tagú, előnyösen 5-7 tagú, adott esetben további heteroatomot tartalmazó telített heterogyűrűt képez.
  46. 46. A 43-45. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy olyan (II) általános képletű vegyületet használunk, amelyben Z jelentése kovalens kötés, X jelentése oxigénatom és R’ jelentése hidrogénatom vagy szubsztituálatlan vagy szubsztituált egyenes vagy elágazó láncú alkilcsoport, szubsztituálatlan vagy szubsztituált arilcsoport vagy szubsztituálatlan vagy az aril- és/vagy az alkilrészében szubsztituált aralkilcsoport, és
    A jelentése szubsztituálatlan vagy szubsztituált arilvagy aralkilcsoport vagy heteroarilcsoport.
  47. 47. A 46. igénypont szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy olyan (II) általános képletű vegyületet használunk, amelyben A jelentése szubsztituálatlan vagy egy vagy több alkil-, halogén-alkil- vagy alkoxicsoporttal szubsztituált fenilcsoport, szubsztituálatlan vagy az aril- és/vagy az alkilrészében szubsztituált aralkilcsoport vagy egy N-tartalmú heteroarilcsoport vagy egy Startalmú heteroarilcsoport.
  48. 48. A 43-45. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan (II) általános képletű vegyületet használunk, amelyben Z jelentése kovalens kötés és X jelentése =NR4 képletű csoport, ahol R4 jelentése hidrogénatom vagy szubsztituálatlan vagy szubsztituált egyenes vagy elágazó láncú alkilcsoport, szubsztituálatlan vagy szubsztituált arilcsoport, előnyösen fenilcsoport vagy szubsztituálatlan vagy az aril- és/vagy az alkilrészében szubsztituált aralkilcsoport vagy cikloalkilcsoport, és R’ jelentése szubsztituálatlan vagy szubsztituált egyenes vagy elágazó láncú alkilcsoport, szubsztituálatlan vagy szubsztituált arilcsoport vagy szubsztituálatlan vagy az aril- és/vagy az alkilrészében szubsztituált aralkilcsoport, és
    A jelentése szubsztituálatlan vagy az aril- és/vagy az alkilrészében szubsztituált aralkilcsoport vagy szubsztituálatlan vagy szubsztituált arilcsoport vagy heteroarilcsoport.
  49. 49. A 48. igénypont szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy olyan (II) általános képletű vegyületet használunk, amelyben A jelentése szubsztituálatlan vagy a fenilrészben egy vagy több alkoxicsoporttal szubsztituált fenil-alkil-csoport, szubsztituálatlan vagy egy vagy több alkil-, halogén-alkil- vagy nitrocsoporttal szubsztituált fenilcsoport, vagy naftilcsoport, vagy egy N-tartalmú heteroaril-, előnyösen piridilcsoport, vagy egy S-tartalmú heteroarilcsoport.
  50. 50. A 43-45. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy olyan (II) általános képletű vegyületet használunk, amelyben Z jelentése oxigénatom, X jelentése oxigénatom, R’ jelentése hidrogénatom vagy szubsztituálatlan vagy szubsztituált egyenes vagy elágazó láncú alkilcsoport, szubsztituálatlan vagy szubsztituált arilcsoport vagy szubsztituálatlan vagy az aril- és/vagy az alkilrészében szubsztituált aralkilcsoport, és
    A jelentése szubsztituálatlan vagy szubsztituált egyenes vagy elágazó láncú alkilcsoport vagy szubsztituálatlan vagy az aril- és/vagy az alkilrészében szubsztituált aralkilcsoport.
  51. 51. A 43-45. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy olyan (II) általános képletű vegyületet használunk, amelyben Z jelentése oxigénatom és X jelentése =NR4 képletű csoport, ahol R4 jelentése szubsztituálatlan vagy szubsztituált egyenes vagy elágazó láncú alkilcsoport, szubsztituálatlan vagy az aril- és/vagy az alkilrészében szubsztituált aralkilcsoport, szubsztituálatlan vagy szubsztituált aril-, előnyösen fenilcsoport vagy egy szubsztituálatlan vagy szubsztituált heteroarilcsoport, és R’ jelentése szubsztituálatlan vagy szubsztituált egyenes vagy elágazó láncú alkilcsoport, szubsztituálatlan vagy szubsztituált arilcsoport vagy szubsztituálatlan vagy az alkil- és/vagy az arilrészében szubsztituált aralkilcsoport, és
    A jelentése szubsztituálatlan vagy szubsztituált egyenes vagy elágazó láncú alkilcsoport, szubsztituálatlan vagy szubsztituált aril-, előnyösen fenilcsoport vagy szubsztituálatlan vagy az aril- és/vagy az alkilrészében szubsztituált aralkilcsoport.
  52. 52. A 43-45. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy olyan (II) általános képletű vegyületet használunk, amelyben Z jelentése =NR3 képletű csoport, ahol R3 jelentése hidrogénatom vagy szubsztituálatlan vagy szubsztituált egyenes vagy elágazó láncú alkilcsoport, szubsztituálatlan vagy szubsztituált arilcsoport vagy szubsztituálatlan vagy az arilés/vagy az alkilrészében szubsztituált aralkilcsoport, X jelentése oxigénatom és R’ jelentése hidrogénatom vagy szubsztituálatlan vagy szubsztituált egyenes vagy elágazó láncú alkilcsoport, szubsztituálatlan vagy szubsztituált arilcsoport, szubsztituálatlan vagy az aril- és/vagy az alkilrészében szubsztituált aralkilcsoport vagy acilcsoport, és
    A jelentése szubsztituálatlan vagy szubsztituált alkil-, aralkil-, aril- vagy heteroarilcsoport vagy cikloalkilcsoport.
  53. 53. Az 52. igénypont szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy olyan (Π) általános képletű vegyületet használunk, amelyben A jelentése szubsztituálatlan vagy szubsztituált egyenes vagy elágazó láncú, előnyösen
    4-12 szénatomos alkilcsoport, cikloalkilcsoport, szubsztituálatlan vagy szubsztituált fenil-alkil-csoport, szubsztituálatlan vagy egy vagy több halogénatommal, alkil-, halogén-alkil-, alkoxi- vagy nitrocsoporttal szubsztituált fenilcsoport vagy egy N-tartalmú heterociklusos csoport.
  54. 54. A 43-45. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, azzaljellemezve, hogy olyan (II) általános képletű vegyületet használunk, amelyben Z jelentése =NR3 képletű csoport, ahol R3 jelentése hidrogénatom vagy szubsztituálatlan vagy szubsztituált egyenes vagy elágazó láncú alkilcsoport, szubsztituálatlan vagy szubsztituált arilcsoport vagy szubsztituálatlan vagy az aril59
    HU 222 994 Bl és/vagy az alkilrészében szubsztituált aralkilcsoport, X jelentése =NR4 képletű csoport, ahol R4 jelentése hidrogénatom vagy szubsztituálatlan vagy szubsztituált egyenes vagy elágazó láncú alkilcsoport, szubsztituálatlan vagy szubsztituált arilcsoport, előnyösen fenilcsoport vagy szubsztituálatlan vagy az aril- és/vagy az alkilrészében szubsztituált aralkilcsoport vagy cikloalkilcsoport, előnyösen hidrogénatom vagy alkilcsoport, és R’ jelentése szubsztituálatlan vagy szubsztituált egyenes vagy elágazó láncú alkilcsoport, szubsztituálatlan vagy szubsztituált arilcsoport vagy szubsztituálatlan vagy az aril- és/vagy az alkilrészében szubsztituált aralkilcsoport, és
    A jelentése szubsztituálatlan vagy szubsztituált egyenes vagy elágazó láncú alkilcsoport vagy szubsztituálatlan vagy szubsztituált arilcsoport, előnyösen fenilcsoport vagy szubsztituált fenilcsoport.
  55. 55. (I) általános képletű hidroxil-amin-származékok, amelyekben
    a) X jelentése halogénatom, előnyösen klór- vagy brómatom,
    Z jelentése kovalens kötés, és al) A jelentése (a) képletű csoport, ahol Y1 jelentése halogénatom, alkoxi-, halogén-alkil- vagy nitrocsoport, és n jelentése 1,2 vagy 3, vagy egy oxigéntartalmú heteroaril-, előnyösen fúrilcsoport, egy kéntartalmú heteroaril-, előnyösen tienilcsoport vagy egy nitrogéntartalmú heteroaromás csoport, amely adott esetben benzolgyűrűvel van kondenzálva, vagy annak 1-4 szénatomos alkilcsoporttal N-kvaternerezett vagy N-oxidált származéka, előnyösen piridil-, kinolil- vagy izokinolilcsoport,
    R jelentése egy (b) képletű csoport, melyben R5 és R6 jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom, egyenes vagy elágazó láncú alkilcsoport, előnyösen 1-4 szénatomos alkilcsoport vagy cikloalkilcsoport, vagy R5 és R6 a közrezárt nitrogénatommal együtt 3-7 tagú, előnyösen 5-7 tagú telített heterociklusos gyűrűt képez, Y6 jelentése -OR7-csoport, ahol R7 jelentése hidrogénatom vagy acilcsoport, előnyösen helyettesítetlen vagy helyettesített alkil-karbonil-, aril-karbonil- vagy amino-acilcsoport, k jelentése 1,2 vagy 3 és m jelentése 1, 2 vagy 3, vagy egy ilyen csoport 1-4 szénatomos alkilcsoporttal N-kvatemerezett vagy N-oxidált származéka, azzal a megkötéssel, hogy ha A jelentése piridil- vagy naftilcsoport, vagy olyan (a) képletű csoport, ahol Y1 jelentése halogénatom vagy alkoxicsoport, akkor R7 jelentése hidrogénatomtól eltérő vagy a2) A jelentése (c) képletű csoport,
    R jelentése (d) képletű csoport, és a tetszőleges Y2 és Y3 - melyek legalább egyike jelen van a molekulában oxigénatomot vagy 1-4 szénatomos alkilcsoportot jelent, és k jelentése 1,2 vagy 3 és m jelentése 1,2 vagy 3, és ha a vegyület egy- vagy kétértékű kation, anionja egy vagy két halogenidion, előnyösen jodidion, vagy
    b) X jelentése -NR1R2-csoport, ahol R1 és R2 jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom vagy helyettesítetlen vagy helyettesített egyenes vagy elágazó láncú alkilcsoport, helyettesítetlen vagy helyettesített arilcsoport, előnyösen fenilcsoport, helyettesítetlen vagy helyettesített aralkilcsoport, vagy R1 és R2 a szomszédos nitrogénatommal együtt egy 3-7 tagú, előnyösen
    5-7 tagú telített heterociklusos gyűrűt képez, mely adott esetben egy vagy több további heteroatomot tartalmaz,
    A jelentése helyettesítetlen vagy helyettesített alkilcsoport, helyettesítetlen vagy helyettesített arilcsoport, előnyösen fenilcsoport, vagy helyettesítetlen vagy helyettesített aralkilcsoport,
    Z jelentése oxigénatom vagy =NR3 képletű csoport, ahol R3 jelentése hidrogénatom vagy helyettesítetlen vagy helyettesített alkilcsoport, és
    R jelentése (b) képletű csoport, melyben R5 és R6 jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom, egyenes vagy elágazó láncú alkilcsoport, előnyösen 1-4 szénatomos alkilcsoport vagy cikloalkilcsoport, vagy R5 és R6 a közrezárt nitrogénatommal együtt 3-7 tagú, előnyösen 5-7 tagú telített heterociklusos gyűrűt képez, Y6 jelentése hidrogénatom vagy -OR7-csoport, ahol R7 jelentése hidrogénatom vagy acilcsoport, előnyösen helyettesítetlen vagy helyettesített alkil-karbonil- vagy aril-karbonil-csoport, k jelentése 1,2 vagy 3 és m jelentése 1,2 vagy 3 vagy
    c) X jelentése -OQ-csoport, ahol Q jelentése helyettesítetlen vagy helyettesített alkil- vagy aralkilcsoport,
    A jelentése helyettesítetlen vagy helyettesített alkilvagy aralkilcsoport,
    Z jelentése oxigénatom és
    R jelentése (b) képletű csoport, melyben R5 és R6 jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom, egyenes vagy elágazó láncú alkilcsoport, előnyösen 1-4 szénatomos alkilcsoport vagy cikloalkilcsoport, vagy R5 és R6 a közrezárt nitrogénatommal együtt 3-7 tagú, előnyösen 5-7 tagú telített heterociklusos gyűrűt képez, Y6 jelentése hidrogénatom vagy -OR7-csoport, ahol R7 jelentése hidrogénatom vagy acilcsoport, előnyösen helyettesítetlen vagy helyettesített alkil-karbonil- vagy aril-karbonil-csoport, k jelentése 1,2 vagy 3 és m jelentése 1, 2 vagy 3, vagy
    d) A jelentése helyettesítetlen vagy helyettesített arilcsoport, előnyösen fenilcsoport vagy nitrogéntartalmú heteroaromás csoport, előnyösen piridilcsoport vagy kéntartalmú heteroaromás csoport,
    Z jelentése kovalens kötés,
    X jelentése -OQ képletű csoport, ahol Q jelentése 1-4 szénatomos alkilcsoport, és
    R jelentése (b) képletű csoport, melyben R5 és R6 jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom, egyenes vagy elágazó láncú alkilcsoport, előnyösen 1-4 szénatomos alkilcsoport vagy cikloalkilcsoport, vagy R5 és R6 a közrezárt nitrogénatommal együtt 3-7 tagú, előnyösen 5-7 tagú telített heterociklusos gyűrűt képez, Y6 jelentése hidrogénatom, k jelentése 1,2 vagy 3 és m jelentése 1,2 vagy 3.
  56. 56. Egy 55. igénypont szerinti hidroxil-amin-származék, ahol A jelentése (a) képletű csoport, melyben Y1 jelentése 1-4 szénatomos halogén-alkil-csoport, előnyösen trifluor-metil-csoport.
  57. 57. Egy 55. igénypont szerinti hidroxil-amin-származék - ahol X jelentése halogénatom, A jelentése piri60
    HU 222 994 Bl dilcsoport, Z jelentése kovalens kötés és R jelentése (b) képletű csoport, melyben R5 és R6 jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom, egyenes vagy elágazó láncú alkilcsoport, előnyösen 1-4 szénatomos alkilcsoport vagy cikloalkilcsoport, vagy R5 és R6 a közrezárt nitrogénatommal együtt 3-7 tagú, előnyösen 5-7 tagú telített heterociklusos gyűrűt képez, Y6 jelentése -OR7csoport, ahol R7 jelentése amino-acil-csoport, k jelentése 1,2 vagy 3 és m jelentése 1,2 vagy 3 - optikailag aktív sztereoizomerje.
  58. 58. (I) általános képletű hidroxil-amin-származékok, amelyekben
    X jelentése -NR!R2 képletű csoport, ahol R1 és R2 egymástól függetlenül hidrogénatomot vagy helyettesítetlen vagy helyettesített egyenes vagy elágazó láncú alkilcsoportot, előnyösen 1-6 szénatomos alkilcsoportot vagy cikloalkilcsoportot jelent, vagy R1 és R2 az általuk közrezárt nitrogénatommal együtt 3-7 tagú, előnyösen 5-7 tagú telített heterogyűrűt képez,
    A jelentése helyettesítetlen vagy helyettesített aralkilcsoport, előnyösen egy vagy több alkoxicsoporttal, előnyösen 1-4 szénatomos alkoxicsoporttal helyettesített fenil-alkil-csoport, helyettesítetlen vagy egy vagy több halogénatommal vagy alkil- vagy halogén-alkil-csoporttal, előnyösen 1-4 szénatomos alkil- vagy halogénalkil-csoporttal vagy acil-amino- vagy nitrocsoporttal helyettesített fenilcsoport vagy egy helyettesítetlen vagy helyettesített nitrogéntartalmú, adott esetben benzolgyűrűvel kondenzált heteroaromás csoport, előnyösen pirrolil-, piridil-, izokinolil- vagy kinolilcsoport, vagy egy kéntartalmú heteroarilcsoport, előnyösen tienilcsoport, ahol a heteroarilcsoportok adott esetben szubsztituensként egy vagy több alkilcsoportot, előnyösen 1-4 szénatomos alkilcsoportot hordozhatnak,
    Z jelentése kovalens kötés, és
    R jelentése (e) képletű csoport, ahol R5 és R6 jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom vagy egyenes vagy elágazó láncú alkilcsoport, előnyösen 1 -4 szénatomos alkilcsoport vagy cikloalkilcsoport, vagy R5 és R6 együttesen, az általuk közrezárt nitrogénatommal együtt 3-7 tagú, előnyösen 5-7 tagú telített heterogyűrűt képez, amely adott esetben további heteroatomokat tartalmazhat és adott esetben szubsztituenseket, előnyösen 1-4 szénatomos alkilcsoportot hordozhat, Y4 hidrogénatomot vagy helyettesítetlen vagy helyettesített 1-4 szénatomos alkilcsoportot, Y5 hidrogénatomot vagy helyettesítetlen vagy helyettesített 1-4 szénatomos alkilcsoportot vagy -OR7-csoportot jelent, ahol R7 jelentése hidrogénatom vagy acilcsoport, k értéke 1, 2 vagy 3 és m értéke 1, 2 vagy 3, azzal a kikötéssel, hogy ha A helyettesítetlen vagy halogénatommal vagy alkoxicsoporttal helyettesített fenilcsoportot vagy alkoxicsoporttal helyettesített fenil-alkil-csoportot vagy piridilcsoportot jelent, és R7 jelentése hidrogénatom, akkor R1 és R2 közül legalább az egyik hidrogéntől eltérő szubsztituens, továbbá ha A helyettesítetlen vagy halogénatommal vagy alkoxicsoporttal helyettesített fenilcsoportot vagy alkoxicsoporttal helyettesített fenil-alkil-csoportot vagy piridilcsoportot jelent, és R1 és R2 jelentése hidrogénatom, akkor R7 jelentése hidrogéntől eltérő szubsztituens.
  59. 59. (II) általános képletű hidroxil-amin-származékok, amelyekben
    a) X jelentése oxigénatom,
    A jelentése 1 -20 szénatomos egyenes vagy elágazó láncú alkilcsoport, helyettesítetlen vagy helyettesített arilcsoport, előnyösen fenil- vagy halogén-alkil-fenilcsoport, helyettesítetlen vagy helyettesített aralkilcsoport, naftilcsoport vagy nitrogéntartalmú heteroaromás csoport, előnyösen piridilcsoport,
    Z jelentése kovalens kötés,
    R’ jelentése hidrogénatom, 1-4 szénatomos alkilcsoport vagy aralkilcsoport, előnyösen fenil-alkil-csoport,
    R jelentése (b) képletű csoport, melyben R5 és R6 jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom, egyenes vagy elágazó láncú alkilcsoport, előnyösen 1-4 szénatomos alkilcsoport vagy cikloalkilcsoport, vagy R5 és R6 a közrezárt nitrogénatommal együtt 3-7 tagú, előnyösen 5-7 tagú telített heterociklusos gyűrűt képez, Y6 jelentése hidrogénatom vagy -OR7-csoport, ahol R7 jelentése hidrogénatom, k jelentése 1, 2 vagy 3 és m jelentése 1, 2 vagy 3, azzal a kikötéssel, hogy ha A jelentése alkilcsoporttól eltérő szubsztituens és R’ jelentése hidrogénatom, akkor Y6 hidrogénatomot jelent, vagy
    b) X jelentése =NR4-csoport, ahol R4 jelentése hidrogénatom, helyettesítetlen vagy helyettesített alkilcsoport vagy helyettesítetlen vagy helyettesített arilcsoport, előnyösen fenilcsoport, vagy helyettesítetlen vagy helyettesített aralkilcsoport, előnyösen fenil-alkil-csoport,
    A jelentése helyettesítetlen vagy helyettesített alkilcsoport vagy helyettesítetlen vagy helyettesített arilcsoport, előnyösen fenil- vagy helyettesített fenilcsoport, vagy helyettesítetlen vagy helyettesített aralkilcsoport, előnyösen fenil-alkil-csoport, vagy cikloalkilcsoport,
    Z jelentése kovalens kötés, oxigénatom vagy =NR3csoport, ahol R3 jelentése hidrogénatom vagy helyettesítetlen vagy helyettesített alkilcsoport,
    R’ jelentése helyettesítetlen vagy helyettesített alkilcsoport vagy helyettesítetlen vagy helyettesített arilcsoport, előnyösen fenilcsoport, vagy helyettesítetlen vagy helyettesített aralkilcsoport, előnyösen fenil-alkil-csoport, és
    R jelentése (b) képletű csoport, melyben R5 és R6 jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom, egyenes vagy elágazó láncú alkilcsoport, előnyösen 1-4 szénatomos alkilcsoport vagy cikloalkilcsoport, vagy Rs és R6 a közrezárt nitrogénatommal együtt 3-7 tagú, előnyösen 5-7 tagú telített heterociklusos gyűrűt képez, Y6 jelentése hidrogénatom vagy -OR7-csoport, ahol R7 jelentése hidrogénatom vagy acilcsoport, előnyösen helyettesítetlen vagy helyettesített alkil-karbonil- vagy aril-karbonil-csoport, k jelentése 1,2 vagy 3 és m jelentése 1,2 vagy 3, vagy
    c) X jelentése oxigénatom,
    A jelentése helyettesítetlen vagy helyettesített alkilcsoport, helyettesítetlen vagy helyettesített aralkilcsoport, előnyösen fenil-alkil-csoport,
    HU 222 994 Bl
    Z jelentése oxigénatom,
    R’ jelentése alkilcsoport vagy aralkilcsoport, előnyösen fenil-alkil-csoport,
    R jelentése (b) képletű csoport, melyben R5 és R6 jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom, egyenes vagy elágazó láncú alkilcsoport, előnyösen 1-4 szénatomos alkilcsoport vagy cikloalkilcsoport, vagy R5 és R6 a közrezárt nitrogénatommal együtt 3-7 tagú, előnyösen 5-7 tagú telített heterociklusos gyűrűt képez, Y6 jelentése hidrogénatom vagy -OR7-csoport, ahol R7 jelentése hidrogénatom vagy acilcsoport, előnyösen helyettesítetlen vagy helyettesített alkil-karbonil- vagy aril-karbonil-csoport, k jelentése 1,2 vagy 3 és m jelentése 1,2 vagy 3, vagy
    d) X jelentése oxigénatom,
    Z jelentése =NH-csoport, és dl) A jelentése helyettesítetlen vagy helyettesített alkilcsoport, cikloalkilcsoport, helyettesítetlen vagy helyettesített aralkilcsoport, előnyösen fenil-alkil-csoport, helyettesítetlen vagy halogénatommal, alkil-, halogén-alkil-, alkoxi- vagy nitrocsoporttal helyettesített fenilcsoport,
    R’ jelentése alkil- vagy aralkilcsoport, előnyösen fenil-alkil-csoport, és
    R jelentése (b) képletű csoport, melyben R5 és R6 jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom, egyenes vagy elágazó láncú alkilcsoport, előnyösen 1-4 szénatomos alkilcsoport vagy cikloalkilcsoport, vagy R5 és R6 a közrezárt nitrogénatommal együtt 3-7 tagú, előnyösen 5-7 tagú telített heterociklusos gyűrűt képez, Y6 jelentése hidrogénatom vagy hidroxilcsoport, k jelentése 1,2 vagy 3 és m jelentése 1, 2 vagy 3, vagy d2) A jelentése (a) képletű csoport, ahol Y1 jelentése halogén-alkil-csoport, előnyösen trifluor-metil-csoport és n értéke 1,2 vagy 3,
    R’ jelentése hidrogénatom és
    R jelentése (b) képletű csoport, melyben R5 és R6 jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom, egyenes vagy elágazó láncú alkilcsoport, előnyösen 1-4 szénatomos alkilcsoport vagy cikloalkilcsoport, vagy R5 és R6 a közrezárt nitrogénatommal együtt 3-7 tagú, előnyösen 5-7 tagú telített heterociklusos gyűrűt képez, Y6 jelentése -OR7-csoport, ahol R7 jelentése hidrogénatom, k jelentése 1,2 vagy 3 és m jelentése 1,2 vagy 3.
  60. 60. (I”) általános képletű hidroxil-amin-származékok, amelyekben
    A jelentése helyettesítetlen vagy halogénatommal vagy nitrocsoporttal helyettesített fenilcsoport vagy Ntartalmú heteroarilcsoport, előnyösen piridilcsoport,
    R1 jelentése hidrogénatom és
    R” jelentése az aminocsoporton adott esetben mono- vagy diszubsztituált Ω-amino-alkil-csoport, amelynek alkillánca 1-5 szénatomos, és amely egymástól független aminoszubsztituensként egy vagy két egyenes vagy elágazó láncú alkilcsoportot vagy cikloalkilcsoportot tartalmazhat, vagy amelynek két aminoszubsztituense együttesen, a közrezárt nitrogénatommal együtt egy 3-7 tagú, előnyösen 5-7 tagú telített heterociklusos gyűrűt képez, vagy annak 1-4 szénatomos alkilcsoporttal képzett N-kvatemerezett származéka, azzal a kikötéssel, hogy ha A jelentése 3-piridilcsoport, akkor R” 1-piperidinil-metil-csoporttól eltérő csoport.
  61. 61. Gyógyászati, adott esetben kozmetikai készítmény kardiovaszkuláris, vaszkuláris, agyi, allergiás, immun-, autoimmun, vírus- vagy bakteriális fertőzés okozta betegségek, daganatos vagy kültakaró- vagy nyálkahártya-betegségek kezelésére, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként a gyógyászati vagy kozmetikai készítményekben szokásos vivőanyagok és segédanyagok mellett 0,5-99,5 tömeg% mennyiségben egy (I) általános képletű hidroxil-amin-származékot tartalmaznak, ahol A, Z, X és R jelentése az 55. igénypont szerinti.
  62. 62. Gyógyászati, adott esetben kozmetikai készítmény kardiovaszkuláris, vaszkuláris, agyi, allergiás, immun-, autoimmun, vírus- vagy bakteriális fertőzés okozta betegségek, daganatos vagy kültakaró- vagy nyálkahártya-betegségek kezelésére, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként a gyógyászati vagy kozmetikai készítményekben szokásos vivőanyagok és segédanyagok mellett 0,5-99,5 tömeg% mennyiségben egy (I) általános képletű hidroxil-amin-származékot tartalmaznak, ahol A, Z, X és R jelentése az 58. igénypont szerinti.
  63. 63. Gyógyászati, adott esetben kozmetikai készítmény kardiovaszkuláris, vaszkuláris, agyi, allergiás, immun-, autoimmun, vírus- vagy bakteriális fertőzés okozta betegségek, daganatos vagy kültakaró- vagy nyálkahártya-betegségek kezelésére, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként a gyógyászati vagy kozmetikai készítményekben szokásos vivőanyagok és segédanyagok mellett 0,5-99,5 tömeg% mennyiségben egy (II) általános képletű hidroxil-amin-származékot tartalmaznak, ahol A, Z, X, R és R’ jelentése az 59. igénypont szerinti.
  64. 64. Gyógyászati, adott esetben kozmetikai készítmény kardiovaszkuláris, vaszkuláris, agyi, allergiás, immun-, autoimmun, vírus- vagy bakteriális fertőzés okozta betegségek, daganatos vagy kültakaró- vagy nyálkahártya-betegségek kezelésére, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként a gyógyászati vagy kozmetikai készítményekben szokásos vivőanyagok és segédanyagok mellett 0,5-99,5 tömeg% mennyiségben egy (I”) általános képletű hidroxil-amin-származékot tartalmaznak, ahol A, R1 és R” jelentése a 60. igénypont szerinti.
HU9503141A 1995-11-02 1995-11-02 Hidroxilaminszármazékok és azok alkalmazása sejtek molekuláris chaperon-termelésének fokozására alkalmas gyógyszerkészítmények előállítására HU222994B1 (hu)

Priority Applications (35)

Application Number Priority Date Filing Date Title
HU9503141A HU222994B1 (hu) 1995-11-02 1995-11-02 Hidroxilaminszármazékok és azok alkalmazása sejtek molekuláris chaperon-termelésének fokozására alkalmas gyógyszerkészítmények előállítására
UA97084081A UA61050C2 (en) 1995-11-02 1996-01-11 Method of increasing expression of molecular chaperons using hydroxylamine derivatives, drug formulations (variants)
HR960508A HRP960508B1 (en) 1995-11-02 1996-10-31 A method of enhancing cellular production of molecular chaperon,hydroxalamine derivatives useful for enhancing the chaperon production and the preparation thereof
MX9704988A MX9704988A (es) 1995-11-02 1996-11-01 Derivados de hidroxilamina utiles para mejorar la produccion del acompañante molecular y la preparacion de los mismos.
PT96935195T PT801649E (pt) 1995-11-02 1996-11-01 Derivados de hidroxilamina uteis para aumentar a producao de proteinas moleculares adventicias e sua preparacao
JP51717697A JP4531865B2 (ja) 1995-11-02 1996-11-01 分子シャペロン産生を増強するのに有用なヒドロキシルアミン誘導体およびそれの調製
DE69622840T DE69622840T2 (de) 1995-11-02 1996-11-01 Hydroxylamin derivate verwendbar für die verbesserung der erzeugung von molekularen kappen und deren herstellung
RU97113758/14A RU2206320C2 (ru) 1995-11-02 1996-11-01 Производные гидроксиламина, пригодные для усиления образования молекулярного шаперона, и их получение
ES96935195T ES2176502T3 (es) 1995-11-02 1996-11-01 Derivados de hidroxilamina utiles para mejorar la pproduccion de chaperonas moleculares su su preparacion.
AT96935195T ATE221880T1 (de) 1995-11-02 1996-11-01 Hydroxylamin derivate verwendbar für die verbesserung der erzeugung von molekularen kappen und deren herstellung
CNB961923059A CN1152871C (zh) 1995-11-02 1996-11-01 用于增强分子伴娘素产生的羟胺衍生物及其制备
SI9630518T SI0801649T1 (en) 1995-11-02 1996-11-01 Hydroxylamine derivatives useful for enhancing the molecular chaperon production and the preparation thereof
US08/860,582 US6653326B1 (en) 1995-11-02 1996-11-01 Hydroxylamine derivatives useful for enhancing the molecular chaperon production and the preparation thereof
YUP-587/96A RS49981B (sr) 1995-11-02 1996-11-01 Upotreba derivata hidroksilamina za dobijanje farmaceutskih kompozicija korisnih za povećanje ekspresije i aktivnosti molekulskih šaperona
NZ320523A NZ320523A (en) 1995-11-02 1996-11-01 Hydroxylamine derivatives and pharmaceutical and cosmetic compositions thereof
IL12112696A IL121126A (en) 1995-11-02 1996-11-01 Hydroxylamine derivatives useful for enhancing the molecular chaperon production and pharmaceutical compositions comprising such derivatives
EP96935195A EP0801649B1 (en) 1995-11-02 1996-11-01 Hydroxylamine derivatives useful for enhancing the molecular chaperon production and the preparation thereof
CA002209167A CA2209167C (en) 1995-11-02 1996-11-01 Hydroxylamine derivatives useful for enhancing the molecular chaperon production and the preparation thereof
TR97/00574T TR199700574T1 (xx) 1995-11-02 1996-11-01 Molek�ler �aperon �retiminin haz�rlanmas� i�in yararl� hidroksilamin t�revleri ve bu t�revlerin haz�rlanmas�.
EE9700146A EE04239B1 (et) 1995-11-02 1996-11-01 Hüdroksüülamiini derivaadid, mis on kasutatavad molekulaarse seostusvalgu moodustumise suurendamiseks, ja nende valmistamine
PCT/HU1996/000064 WO1997016439A1 (en) 1995-11-02 1996-11-01 Hydroxylamine derivatives useful for enhancing the molecular chaperon production and the preparation thereof
DK96935195T DK0801649T3 (da) 1995-11-02 1996-11-01 Hydroxylaminderivater, der er nyttige til forøgelse af molekylærchaperonproduktion, og fremstilling deraf
AU73263/96A AU720195B2 (en) 1995-11-02 1996-11-01 Hydroxylamine derivatives useful for enhancing the molecular chaperon production and the preparation thereof
SK881-97A SK284823B6 (sk) 1995-11-02 1996-11-01 Použitie hydroxylamínového derivátu na prípravu farmaceutického alebo kozmetického prostriedku na zvýšenie produkcie molekulových chaperónov, hydroxylamínový derivát a farmaceutické alebo kozmetické prostriedky s jeho obsahom
BRPI9607565-1A BR9607565B1 (pt) 1995-11-02 1996-11-01 derivados de hidroxilamina úteis para produção de protetores moleculares e composições que os contêm.
CZ19972072A CZ295562B6 (cs) 1995-11-02 1996-11-01 Hydroxylaminové deriváty užitečné ke zvýšení produkce molekulárních chaperonů a jejich výroba
PL96322015A PL195634B1 (pl) 1995-11-02 1996-11-01 Zastosowanie pochodnych hydroksyloaminy do wytwarzania środka farmaceutycznego, pochodne hydroksyloaminy i środek farmaceutyczny je zawierający
ZA9609249A ZA969249B (en) 1995-11-02 1996-11-04 A method of enhancing cellular production of molecular chaperon, hydroxylamine derivatives useful for enhancing the chaperon production and the preparation thereof.
NO19973059A NO321140B1 (no) 1995-11-02 1997-07-01 Anvendelse av hydroksylaminderivater som oker den molekylaere chaperonproduksjon, for fremstilling av farmasoytiske preparater, samt nye slike hydroksylaminderivater og farmasoytiske preparater som inneholder de nye hydroksylaminderivater.
BG101713A BG63944B1 (bg) 1995-11-02 1997-07-01 Производни на хидроксиламина, които се използват за повишаване продуцирането на молекулен чаперон исъстав
KR97070004575A KR19980700976A (hu) 1995-11-02 1997-07-02
US10/618,157 US7148239B2 (en) 1995-11-02 2003-07-10 Method of enhancing cellular production of molecular chaperon, hydroxylamine derivatives useful for enhancing the chaperon production and the preparation thereof
US10/618,162 US7745465B2 (en) 1995-11-02 2003-07-10 Method of enhancing cellular production of molecular chaperone, hydroxylamine derivatives useful for enhancing the chaperone production and the preparation thereof
JP2008261964A JP2009108048A (ja) 1995-11-02 2008-10-08 分子シャペロン産生を増強するのに有用なヒドロキシルアミン誘導体およびそれの調製
US12/823,823 US20100267711A1 (en) 1995-11-02 2010-06-25 Method of enhancing cellular production of molecular chaperone, hydroxylamine derivatives useful for enhancing the chaperone production and the preparation thereof

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
HU9503141A HU222994B1 (hu) 1995-11-02 1995-11-02 Hidroxilaminszármazékok és azok alkalmazása sejtek molekuláris chaperon-termelésének fokozására alkalmas gyógyszerkészítmények előállítására
HU9603919 1996-02-09
HU9629820 1996-10-04
PCT/HU1996/000064 WO1997016439A1 (en) 1995-11-02 1996-11-01 Hydroxylamine derivatives useful for enhancing the molecular chaperon production and the preparation thereof

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HU9503141D0 HU9503141D0 (en) 1995-12-28
HUT76659A HUT76659A (en) 1997-10-28
HU222994B1 true HU222994B1 (hu) 2004-01-28

Family

ID=27270113

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9503141A HU222994B1 (hu) 1995-11-02 1995-11-02 Hidroxilaminszármazékok és azok alkalmazása sejtek molekuláris chaperon-termelésének fokozására alkalmas gyógyszerkészítmények előállítására

Country Status (31)

Country Link
US (4) US6653326B1 (hu)
EP (1) EP0801649B1 (hu)
JP (2) JP4531865B2 (hu)
KR (1) KR19980700976A (hu)
CN (1) CN1152871C (hu)
AT (1) ATE221880T1 (hu)
AU (1) AU720195B2 (hu)
BG (1) BG63944B1 (hu)
BR (1) BR9607565B1 (hu)
CA (1) CA2209167C (hu)
CZ (1) CZ295562B6 (hu)
DE (1) DE69622840T2 (hu)
DK (1) DK0801649T3 (hu)
EE (1) EE04239B1 (hu)
ES (1) ES2176502T3 (hu)
HR (1) HRP960508B1 (hu)
HU (1) HU222994B1 (hu)
IL (1) IL121126A (hu)
MX (1) MX9704988A (hu)
NO (1) NO321140B1 (hu)
NZ (1) NZ320523A (hu)
PL (1) PL195634B1 (hu)
PT (1) PT801649E (hu)
RS (1) RS49981B (hu)
RU (1) RU2206320C2 (hu)
SI (1) SI0801649T1 (hu)
SK (1) SK284823B6 (hu)
TR (1) TR199700574T1 (hu)
UA (1) UA61050C2 (hu)
WO (1) WO1997016439A1 (hu)
ZA (1) ZA969249B (hu)

Families Citing this family (41)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
HUT78139A (hu) * 1995-12-22 2000-11-28 BIOREX Kutató és Fejlesztő Rt. Készítmény, különösen a bőr öregedési folyamatainak mérséklésére
UA64716C2 (en) * 1996-08-09 2004-03-15 Pharmaceuticals for therapy or prevention of illnesses connected with dysfunction of vascular endothelial cells
AU5296799A (en) * 1998-08-03 2000-02-28 N-Gene Kutato Kft. Pharmaceutical compositions against autoimmune diseases
HU226617B1 (en) * 1998-12-14 2009-04-28 Cytrx Corp Optically active pyridyl-4h-1,2,4-oxadiazine derivatives, and pharmaceutical composition containing the compound as active ingredient
HUP9900475D0 (en) * 1999-02-26 1999-04-28 Biorex Kutato Fejlesztoe Kft O-(3-piperidino-2-hydroxy-1-propyl)-hiyroximic acid-halogenid derivative, it's use for treating insulin resistance, and pharmaceutical compositions containing them as active component
FR2792832B1 (fr) * 1999-04-28 2002-05-10 Codif Internat Sa Procede de protection de la peau pour la prevenir de son vieillissement cellulaire
HUP0001583A2 (hu) * 2000-04-18 2002-11-28 BIOREX Kutató és Fejlesztő Rt. Egy piridin-1-oxid-származék és eljárás annak átalakítására gyógyászati hatású vegyületekké
CA2451247A1 (en) * 2001-06-22 2003-01-03 The Regents Of The University Of California Eukaryotic genes involved in adult lifespan regulation
HUP0105205A2 (hu) * 2001-11-29 2003-08-28 BIOREX Kutató és Fejlesztő Rt. Metformint és egy hidroxilaminszármazékot tartalmazó, gyógyászati készítmény
WO2003057664A1 (en) * 2002-01-11 2003-07-17 Biorex Kutató És Fejlesztö Rt. Carboxamidine derivatives and their use in the treatment of vascular diseases
EP2083270B1 (en) * 2003-03-27 2019-06-12 Children's Hospital Medical Center A method and kit for detecting the early onset of renal tubular cell injury
HUP0303584A3 (en) 2003-10-30 2009-12-28 Cytrx Corp Use of a hydroximic acid halide derivative in the treatment of neurodegenerative diseases
AU2005232159B2 (en) * 2004-04-12 2008-10-16 Torrent Pharmaceuticals Ltd. 2-propene-1-ones as HSP 70 inducers
US7786093B2 (en) * 2004-07-07 2010-08-31 Health Wellness Foods Corporation Antistress agent
FR2880022B1 (fr) * 2004-12-24 2007-08-24 Mayoly Spindler Soc Par Action Nouveaux derives de la n-hydroxy-n'-phenyluree et de la n-hydroxy-n'-phenylthiouree et leur utilisation comme inhibiteurs de la synthese de la melanine
WO2008039514A1 (en) * 2006-09-26 2008-04-03 Cytrx Corporation Pharmaceutical compositions and methods for treating diseases associated with neurodegeneration
AU2007328280A1 (en) * 2006-12-01 2008-06-12 Cytrx Corporation Hydroxylamine derivatives for the treatment of stroke
TW200901958A (en) * 2007-05-04 2009-01-16 Cytrx Corp Diabetic wound healing
AU2008272437A1 (en) * 2007-06-29 2009-01-08 Torrent Pharmaceuticals Ltd. Novel substituted piperidones as HSP inducers
WO2009155936A1 (en) * 2008-06-26 2009-12-30 Orphazyme Aps Use of hsp70 as a regulator of enzymatic activity
KR101645937B1 (ko) * 2008-11-11 2016-08-08 (주)아모레퍼시픽 육음외사에 의한 피부 변화를 정량하는 방법 및 이를 이용한 피부 개선 물질의 스크리닝 방법
CN102215842A (zh) * 2008-11-18 2011-10-12 参天制药株式会社 含有吡啶-3-甲醛o-(哌啶-1-基-丙基)-肟衍生物作为有效成分的脉络膜视网膜变性疾病的治疗剂
US20110123473A1 (en) * 2009-11-26 2011-05-26 Basf Se Use of highly-branched polycarbonates in cosmetic and dermatological formulations
PT2646044T (pt) 2010-11-30 2019-11-12 Orphazyme As Métodos para aumentar a atividade intracelular de hsp70
KR101275264B1 (ko) * 2011-08-24 2013-06-17 포항공과대학교 산학협력단 샤프로닌 단백질의 조절 물질 탐색 방법
HUP1100534A2 (en) 2011-09-26 2013-04-29 Balazs Dr Hazay Pharmaceutical composition for the treatment of muscle atrophy
HUP1100535A2 (en) 2011-09-26 2013-04-29 Bracelia Invest Ltd Pharmaceutical composition for enhancement of stem cell treatment
RU2495928C2 (ru) * 2012-01-30 2013-10-20 Сергей Юрьевич Лешков Средство для стимуляции синтеза белков теплового шока hsp 70 в клетках человека и животных; косметическое средство для стимуляции репаративных процессов; косметическое средство для снижения побочных эффектов агрессивных косметологических процедур; биологически активная добавка; пищевой продукт; способ снижения побочных эффектов агрессивных косметологических процедур
KR20250069686A (ko) 2014-09-15 2025-05-19 제브라 덴마크 에이/에스 아리모클로몰 제제
WO2017178029A1 (en) 2016-04-13 2017-10-19 Orphazyme Aps Heat shock proteins and cholesterol homeostasis
CA3287846A1 (en) * 2016-04-29 2025-11-29 Zevra Denmark A/S Arimoclomol for treating glucocerebrosidase associated disorders
BR112019024667A2 (pt) 2017-05-24 2020-06-16 Orphazyme A/S Uso de um agente bioativo, e, de uma composição
CN108314630B (zh) * 2018-02-08 2020-11-06 广西民族大学 一种肟醚类衍生物及其制备方法与应用
MX2020012480A (es) 2018-05-28 2021-03-25 Orphazyme As Niveles de la proteina de choque termico 70 (hsp70) en las muestras de celulas mononucleares de la sangre periferica (pbmc) como biomarcador para enfermedades.
HUP1800298A1 (hu) 2018-08-30 2020-05-28 N Gene Res Laboratories Inc Gyógyszerkombináció béta-receptor blokkolók hatásának módosítására és a mellékhatások csökkentésére
CN110048418B (zh) * 2019-05-08 2023-03-24 辽宁工程技术大学 一种基于细胞-组织算法的微电网经济调度方法及装置
MX2023000033A (es) 2020-06-24 2023-04-10 Kempharm Denmark As Arimoclomol para tratar la enfermedad de gaucher.
CN112094878A (zh) * 2020-08-18 2020-12-18 周银根 一种二步酶提取香菇多糖的方法、香菇多糖提取物及其应用
AU2021380947C1 (en) 2020-11-19 2025-02-20 Zevra Denmark A/S Processes for preparing arimoclomol citrate and intermediates thereof
WO2022136640A1 (en) 2020-12-24 2022-06-30 Orphazyme A/S Arimoclomol for the treatment of niemann pick disease, type c, in patients with er type missense mutations
CN118076599A (zh) * 2021-09-28 2024-05-24 泽拉丹麦有限公司 二噁嗪类及其在治疗gba相关疾病中的用途

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
HU177578B (en) * 1976-08-27 1981-11-28 Chinoin Gyogyszer Es Vegyeszet Process for preparing new 0-/3-amino-2-hydroxy-propyl/-amidoxime derivatives
DE2651083A1 (de) * 1976-11-09 1978-05-18 Hoechst Ag Neue o-alkylierte hydroxylamine, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung
HU207988B (en) 1988-10-20 1993-07-28 Biorex Kutato Fejlesztoe Kft Process for producing halogenides of o-/3-amino-2-hydroxy-propyl/hydroximic acid and pharmaceutical compositions containing them as active components
HUT54347A (en) 1989-01-10 1991-02-28 Chinoin Gyogyszer Es Vegyeszet Improved process for producing amidoximes
US5334600A (en) * 1991-07-30 1994-08-02 Ciba-Geigy Corporation Isoquinolyl substituted hydroxylamine derivatives
HU216830B (hu) 1992-07-21 1999-09-28 BIOREX Kutató és Fejlesztő Rt., N-[2-Hidroxi-3-amino-propoxi]-amidok és -imidátok, valamint dioxazinok, eljárás ezek előállítására, és a vegyületeket tartalmazó gyógyszerkészítmények
EP0758315B1 (en) * 1994-05-06 1998-08-26 Biorex Kutato Es Fejlesztö Rt. Novel hydroximic acid derivatives, pharmaceutical compositions containing them and process for preparing same
HU9502843D0 (en) * 1995-09-29 1995-11-28 Livigene Ltd Pharmaceutical composition

Also Published As

Publication number Publication date
YU58796A (sh) 1999-09-27
KR19980700976A (hu) 1998-04-30
NO973059D0 (no) 1997-07-01
IL121126A (en) 2002-07-25
NZ320523A (en) 2001-05-25
DE69622840D1 (de) 2002-09-12
TR199700574T1 (xx) 1999-08-23
CN1177351A (zh) 1998-03-25
DK0801649T3 (da) 2002-12-02
NO973059L (no) 1997-09-02
SI0801649T1 (en) 2002-12-31
RS49981B (sr) 2008-09-29
ATE221880T1 (de) 2002-08-15
HRP960508A2 (en) 1998-06-30
HRP960508B1 (en) 2004-10-31
EE04239B1 (et) 2004-02-16
US7745465B2 (en) 2010-06-29
JP4531865B2 (ja) 2010-08-25
HU9503141D0 (en) 1995-12-28
CZ295562B6 (cs) 2005-08-17
US20040019103A1 (en) 2004-01-29
US20100267711A1 (en) 2010-10-21
IL121126A0 (en) 1997-11-20
BG63944B1 (bg) 2003-07-31
CA2209167A1 (en) 1997-05-09
EP0801649A2 (en) 1997-10-22
BR9607565B1 (pt) 2011-08-23
DE69622840T2 (de) 2003-04-30
US20040067940A1 (en) 2004-04-08
AU7326396A (en) 1997-05-22
US7148239B2 (en) 2006-12-12
PT801649E (pt) 2002-12-31
NO321140B1 (no) 2006-03-27
SK88197A3 (en) 1998-04-08
CN1152871C (zh) 2004-06-09
JPH10512590A (ja) 1998-12-02
AU720195B2 (en) 2000-05-25
US6653326B1 (en) 2003-11-25
JP2009108048A (ja) 2009-05-21
MX9704988A (es) 1998-07-31
BG101713A (en) 1998-03-31
EP0801649B1 (en) 2002-08-07
PL195634B1 (pl) 2007-10-31
WO1997016439A1 (en) 1997-05-09
RU2206320C2 (ru) 2003-06-20
BR9607565A (pt) 1999-07-20
CZ207297A3 (cs) 1998-03-18
EE9700146A (et) 1997-12-15
HUT76659A (en) 1997-10-28
ZA969249B (en) 1998-03-02
UA61050C2 (en) 2003-11-17
CA2209167C (en) 2009-05-19
SK284823B6 (sk) 2005-12-01
PL322015A1 (en) 1998-01-05
ES2176502T3 (es) 2002-12-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU222994B1 (hu) Hidroxilaminszármazékok és azok alkalmazása sejtek molekuláris chaperon-termelésének fokozására alkalmas gyógyszerkészítmények előállítására
CN102647905B (zh) 用于预防和/或治疗溶酶体贮积失调的新颖组合物
US5869501A (en) Amidinonaphthyl derivative or salt thereof
KR100275603B1 (ko) 아미노-치환된 벤조일구아니딘, 이의 제조방법 및 이를 함유하는 약제학적 조성물
EP0576941A1 (en) N-benzoylamino acid derivatives, pharmaceutical compositions containing them and process for preparing same
KR20160047598A (ko) 신규의 생리적으로 유용한 니트록실 도너로서 ｎ-히드록실술폰아미드 유도체
JPH0776566A (ja) 尿素置換ベンゾイルグアニジン、その製造方法、医薬または診断剤としてのその使用およびそれを含有する医薬
EP3456712B1 (en) Novel 2,4,6-trisubstituted s-triazine compound, preparation method therefor, and use thereof
EP0748795A2 (de) Substituierte Benzyloxycarbonylguanidine als Natrium-protonen Antiporter-Inhibitoren, Verfahren zu ihrer Herstellung, ihre Verwendung als Medikament oder Diagnostikum, sowie sie enthaltendes Medikament
BG64456B1 (bg) Фармацевтични продукти за лечение и предпазване от болести, свързани с дисфункцията на васкуларни ендотелиални клетки
DE69620175T2 (de) Hydroxylamin-derivate mit anti-ischämischer wirkung und pharmazeutische zusammensetzungen diese enthaltend
JP5249918B2 (ja) 置換された１−アミノ−４−フェニル−ジヒドロイソキノリン、それらの製造法、それらの薬剤としての使用、およびそれらを含有する薬剤
US12162856B2 (en) β-catenin and B-cell lymphoma 9 (BCL9) inhibitors
JP4162100B2 (ja) フェノキシピリジン誘導体
DE69107851T2 (de) Phenolische thioetheramide als 5-lipoxygenase-inhibitoren.
JP2009530324A (ja) 置換された２−アミノ−４−フェニル−ジヒドロキノリン、それらの製造法、それらの薬剤としての使用、およびそれらを含有する薬剤
TW200305408A (en) Substituted imidazolidines, process for their preparation, their use as medicament or diagnostic, and medicament comprising them
CN103387551B (zh) 噻唑类化合物及其用途

Legal Events

Date Code Title Description
HFG4 Patent granted, date of granting

Effective date: 20031128

GB9A Succession in title

Owner name: CYTRX CORPORATION, US

Free format text: FORMER OWNER(S): BIOREX KUTATO ES FEJLESZTOE RT., HU

MM4A Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees